JP2020511143A

JP2020511143A - Ｃｄ８０バリアント免疫調節タンパク質及びその使用

Info

Publication number: JP2020511143A
Application number: JP2019551327A
Authority: JP
Inventors: ライアンスワンソン; マイケルコルナッカー; マークエフ．マウラー; ダンアルドーレル; ダニエルウィリアムデモンテ; ヨセフエル．カウペル
Original assignee: アルパインイミューンサイエンシズインコーポレイテッド
Priority date: 2017-03-16
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2020-04-16
Anticipated expiration: 2038-03-13
Also published as: US11117950B2; MX2019010887A; JP7386083B2; EP3596114A2; US20210171603A1; NZ756395A; WO2018170026A2; KR20190140924A; US20210188942A1; WO2018170026A3; KR20250083578A; JP2025076434A; US11230588B2; US20210130436A1; US20210155669A1; KR102813967B1; AU2018235838A1; CN110662758A; JP7702928B2; US11096988B2

Abstract

本明細書では、バリアントＣＤ８０ポリペプチド、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む免疫調節タンパク質、及びそのようなタンパク質をコードする核酸を提供する。該免疫調節タンパク質は、多種多様な免疫学的及び腫瘍学的状態に治療的有用性を提供する。そのようなタンパク質を作製及び使用するための組成物及び方法を提供する。
【選択図】図３Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／４７２，５５８号、２０１７年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／４７２，５６９号、２０１７年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／４７２，５５４号、２０１７年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／４７２，５７２号、２０１７年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４７２，５７３号、２０１７年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／４７５，２０４号、２０１７年７月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／５３７，９３９号、２０１７年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５７４，１６５号、及び２０１７年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５８２，２６６号からの優先権を主張するものであり、それらの各々の内容は、参照によりその全体が組み込まれる。

配列表の参照による組み込み
本出願は電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、２０１８年３月１２日に作成された７６１６１２００１６４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ＴＸＴという表題の４，８８８，５７６バイトサイズのファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、参照によりその全体が組み込まれる。

分野
本開示は、がん及び免疫疾患の治療における免疫応答を調節するための治療用組成物に関する。いくつかの態様では、本開示は、コグネイト結合パートナーに対する結合親和性または選択性など、例えばＣＴＬＡ−４及び／またはＰＤ−Ｌ１への親和性の増加、及び／またはＣＤ２８への親和性の減少などの、変化した結合を示すＣＤ８０の特定のバリアントに関する。

背景
抗原提示細胞（ＡＰＣ）または標的細胞とリンパ球との間で形成される免疫学的シナプス（ＩＳ）で起こるプロセスに介入することによる免疫応答の調節に関して医学的関心が高まっている。機械論的には、ＩＳの細胞表面タンパク質は、複数のタンパク質標的と、それらが結合する単一タンパク質との、協調的でありかつ同時に起こることが多い相互作用を、伴うことができる。ＩＳ相互作用は、２つの細胞の接合部と密接に関連して起こり、この構造体中の単一タンパク質が、同じ細胞上のタンパク質（シス）及び関連細胞上のタンパク質（トランス）の両方と、恐らく同時に相互作用することができる。ＩＳを調節できる治療薬は知られているが、改善された治療薬が必要である。そのようなニーズを満たす、細胞上で発現可能な可溶性タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質を含む免疫調節タンパク質が提供される。

概要
いくつかの実施形態では、本明細書では、ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片、またはその両方を含有するバリアントＣＤ８０ポリペプチドが提供され、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた７、２３、２６、３０、３４、３５、４６、５１、５５、５７、５８、６５、７１、７３、７８、７９、８２、及び／または８４位に対応する、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含有する。いくつかの実施形態では、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片の１つまたは複数のアミノ酸改変は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた２６、３５、４６、５７、及び／または７１位に対応する。任意の実施形態において、アミノ酸改変は、アミノ酸の置換、挿入、または欠失である。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片の、１つまたは複数の位置に、Ｅ７Ｄ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｇ、Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｐ、Ａ２６Ｓ、Ａ２６Ｔ、Ｉ３０Ｆ、Ｉ３０Ｔ、Ｉ３０Ｖ、Ｋ３４Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｐ５１Ａ、Ｎ５５Ｄ、Ｎ５５Ｉ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｌ６５Ｐ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｒ７３Ｈ、Ｒ７３Ｓ、Ｇ７８Ａ、Ｔ７９Ａ、Ｔ７９Ｉ、Ｔ７９Ｌ、Ｔ７９Ｍ、Ｔ７９Ｐ、Ｃ８２Ｒ、Ｖ８４Ａ，及びＶ８４Ｉの中から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含有し、該アミノ酸改変の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置の番号付けに対応する。

いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた７、１２、１３、１５、１６、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３８、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５１、５４、５５、５７、５８、６１、６２、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、及び／または９７位に対応する１つまたは複数の位置に１つまたは複数のさらなる改変を含有する。いくつかの実施形態では、さらなる改変には、Ｅ７Ｄ、Ｔ１３Ａ、Ｔ１３Ｒ、Ｓ１５Ｐ、Ｓ１５Ｔ、Ｃ１６Ｒ、Ｖ２０Ａ、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２２Ｄ、Ｖ２２Ｉ、Ｖ２２Ｌ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｇ、Ｅ２４Ｄ、Ｌ２５Ｓ、Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｐ、Ａ２６Ｓ、Ａ２６Ｔ、Ｑ２７Ｈ、Ｑ２７Ｌ、Ｉ３０Ｆ、Ｉ３０Ｔ、Ｉ３０Ｖ、Ｙ３１Ｓ、Ｑ３３Ｅ、Ｑ３３Ｋ、Ｑ３３Ｌ、Ｑ３３Ｒ、Ｋ３４Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｋ３６Ｒ、Ｔ４１Ｓ、Ｍ４２Ｉ、Ｍ４２Ｖ、Ｍ４３Ｌ、Ｍ４３Ｔ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｎ４８Ｈ、Ｎ４８Ｄ、Ｎ４８Ｈ、Ｎ４８Ｋ、Ｎ４８Ｒ、Ｎ４８Ｓ、Ｎ４８Ｔ、Ｎ４８Ｙ、Ｐ５１Ａ、Ｙ５３Ｆ、Ｋ５４Ｅ、Ｋ５４Ｎ、Ｋ５４Ｒ、Ｎ５５Ｄ、Ｎ５５Ｉ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｉ６１Ｆ、Ｉ６１Ｖ、Ｔ６２Ａ、Ｔ６２Ｎ、Ｌ６５Ｐ、Ｉ６７Ｌ、Ｉ６７Ｖ、Ｖ６８Ｅ、Ｖ６８Ｌ、Ｉ６９Ｆ、Ｌ７０Ｍ、Ｌ７０Ｐ、Ｌ７０Ｑ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｌ７２Ｖ、Ｒ７３Ｈ、Ｒ７３Ｓ、Ｐ７４Ｓ、Ｄ７６Ｈ、Ｅ７７Ａ、Ｇ７８Ａ、Ｔ７９Ａ、Ｔ７９Ｉ、Ｔ７９Ｌ、Ｔ７９Ｍ、Ｔ７９Ｐ、Ｅ８１Ｇ、Ｅ８１Ｋ、Ｃ８２Ｒ、Ｖ８４Ａ、Ｖ８４Ｉ、Ｌ８５Ｅ、Ｌ８５Ｍ、Ｌ８５Ｑ、Ｋ８６Ｍ、Ｙ８７Ｃ、Ｙ８７Ｄ、Ｙ８７Ｈ、Ｅ８８Ｖ、Ｆ９２Ｓ、Ｆ９２Ｖ、Ｒ９４Ｑ、Ｒ９４Ｗ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５Ｖ、Ｌ９７Ｍ、及びＬ９７Ｑの中から選択される、ＣＤ８０またはその特異的結合断片における１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置の番号付けに対応する。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、

の中から選択され、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する。

いくつかの実施形態では、本明細書では、ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片、またはその両方を含有するバリアントＣＤ８０ポリペプチドが提供され、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、

の中から選択される、１つまたは複数のアミノ酸置換を含有し、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置の番号付けに対応する。

いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた７、１２、１３、１５、１６、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５７、５８、６１、６２、６３、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、及び／または９７位に対応する１つまたは複数の位置に１つまたは複数のさらなる改変を含有する。いくつかの実施形態では、さらなる改変には、

の中から選択される、ＣＤ８０またはその特異的結合断片における１つまたは複数のアミノ酸置換が含まれ、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置の番号付けに対応する。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２２Ｉ、Ｖ２２Ｌ、Ａ２６Ｅ、Ｑ２７Ｈ、Ｑ３３Ｌ、Ｑ３３Ｒ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｔ４１Ｓ、Ｍ４３Ｌ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｎ５５Ｄ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ６１Ｖ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｌ７２Ｖ、及びＬ８５Ｍ、Ｌ８５Ｑ、Ｒ９４Ｗ、及びＬ９７Ｑの中から選択され、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２２Ｌ、Ａ２６Ｅ、Ｑ２７Ｈ、Ｑ３３Ｌ、Ｑ３３Ｒ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｍ４７Ｉ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｔ５７Ｉ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｌ７２Ｖ、及びＬ８５Ｍ、Ｌ８５Ｑ、Ｌ９７Ｑの中から選択される；または１つもしくは複数のアミノ酸改変はＡ２６Ｅ、Ｑ３３Ｌ、Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｔ５７Ｉ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、及びＬ８５Ｑの中から選択される；または１つもしくは複数のアミノ酸改変はＡ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｇ、及びＬ８５Ｑの中から選択される；または１つもしくは複数のアミノ酸改変はＡ２６Ｅを含む；または１つもしくは複数のアミノ酸改変はＥ３５Ｄを含む；または１つもしくは複数のアミノ酸改変はＤ４６Ｖを含む；または１つもしくは複数のアミノ酸改変はＭ４７Ｌを含む；または１つもしくは複数のアミノ酸改変はＭ４７Ｖを含む；または１つもしくは複数のアミノ酸改変はＡ７１Ｇを含み、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置の番号付けに対応する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２６Ｅ、Ｑ３３Ｌ，Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｔ５７Ｉ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、及びＬ８５Ｑの中から選択され、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する。

いくつかの実施形態では、ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片、またはその両方を含有するバリアントＣＤ８０ポリペプチドが本明細書において提供され、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片にアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変は、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｅ、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ、Ｅ３５Ｄ／Ｖ６８Ｍ、Ｅ３５Ｄ／Ａ７１ＧもしくはＥ３５Ｄ／Ｄ９０Ｇ；Ｄ４６Ｅ／Ｍ４７Ｉ、Ｄ４６Ｅ／Ｍ４７Ｌ、Ｄ４６Ｅ／Ｍ４７Ｖ、Ｄ４６Ｅ／Ｖ６８Ｍ、Ｄ４６Ｅ／Ａ７１ＧもしくはＤ４６Ｅ／Ｄ９０Ｇ；Ｍ４７Ｉ／Ｖ６８Ｍ、Ｍ４７Ｉ／Ａ７１Ｇ、Ｍ４８Ｉ／Ｄ９０Ｇ；Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ、Ｍ４７Ｌ／Ａ７１Ｇ、Ｍ４７Ｌ／Ｄ９０Ｇ；Ｍ４７Ｖ／Ｖ６８Ｍ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｇ、Ｍ４７Ｖ／Ｄ９０Ｇ；Ｖ６８Ｍ／Ａ７１ＧもしくはＶ６８Ｍ／Ｄ９０Ｇ；Ａ７１Ｇ／Ｄ９０Ｇ；またはＥ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｖ６８Ｍ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ／Ｖ６８Ｍを含み、該アミノ酸改変の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置の番号付けに対応する。

いくつかの実施形態では、ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片、またはその両方を含有するバリアントＣＤ８０ポリペプチドが本明細書において提供され、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドは１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、１つまたは複数のアミノ酸置換は少なくともアミノ酸置換Ｌ７０Ｐを含有するがアミノ酸置換Ｖ６８Ｍ、Ｌ７２Ｐ及び／またはＫ８６Ｅを含まず、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ７０Ｐ、Ｉ３０Ｆ／Ｌ７０Ｐ、Ｉ３０Ｖ／Ｔ５７Ｉ／Ｌ７０Ｐ／Ａ７１Ｄ／Ａ９１Ｔ、Ｎ５５Ｄ／Ｌ７０Ｐ／Ｅ７７Ｇ、及びＬ７０Ｐ／Ｆ９２Ｓから選択される。

いくつかの実施形態では、非改変ＣＤ８０は、哺乳動物ＣＤ８０である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０は、ヒトＣＤ８０である。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片、及びＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片を含有する。

いくつかの実施形態では、非改変ＣＤ８０は、（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のアミノ酸の配列を含有するか、（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含有するか、または（ｉｉｉ）ＩｇＶドメインもしくはＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片を含有するそれらの一部分である。いくつかの実施形態では、ＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインの特異的結合断片は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０以上のアミノ酸長を有するか、ＩｇＶドメインの特異的結合断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸３５〜１３５、３５〜１３８、３７〜１３８または３５〜１４１として記載されるＩｇＶドメインの長さの少なくとも８０％である長さを含有するか、または、ＩｇＣドメインの特異的結合断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸１４５〜２３０、１５４〜２３２または１４２〜２３２として記載されるＩｇＣドメインの長さの少なくとも８０％である長さを含有する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸改変、任意でアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列もしくはその特異的結合断片を含有する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合と比較して、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＤ２８のエクトドメインに対して変化した結合を示す。いくつかの実施形態では、変化した結合とは、変化した結合親和性及び／または変化した結合選択性である。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメインまたはその特異的断片、及びＩｇＣドメインまたはその特異的断片を含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３〜７５、２００９〜２１０４、２２９７〜２５０７、及び２９３０〜２９６０のいずれかに記載のアミノ酸の配列もしくはその特異的結合断片、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３〜７５、２００９〜２１０４、２２９７〜２５０７、及び２９３０〜２９６０のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示し、１つもしくは複数のアミノ酸置換を含有するアミノ酸の配列もしくはその特異的結合断片、を含有するかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片を含有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの唯一のＣＤ８０部分である。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：７７〜１４９、１５１〜２２３、２１０５〜２２９６、２５０８〜２９２９、及び２９６１〜３０２２のいずれかに記載のアミノ酸の配列もしくはその特異的結合断片、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７７〜１４９、１５１〜２２３、２１０５〜２２９６、２５０８〜２９２９、及び２９６１〜３０２２のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示し、１つもしくは複数のアミノ酸置換を含有するアミノ酸の配列もしくはその特異的結合断片、を含有する。

いくつかの実施形態では、ＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの唯一のＣＤ８０部分である。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−Ｌ１またはＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合特異性と比較して、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−Ｌ１またはＣＤ２８のエクトドメインに対して変化した結合親和性及び／または変化した結合選択性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４は、ヒトＣＴＬＡ−４である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、ヒトＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、ヒトＰＤ−Ｌ１である。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０は、ＣＴＬＡ４のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＣＴＬＡ４のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対する増加した親和性は、ＣＴＬＡ−４のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または６０倍より多く増加する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた７、２３、２６、３０、３５、４６、５７、５８、７１、７３、７９及び／または８４位に対応する、１つまたは複数のアミノ酸改変を含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、Ｅ７Ｄ、Ｔ１３Ａ、Ｔ１３Ｒ、Ｓ１５Ｔ、Ｃ１６Ｒ、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２２Ｄ、Ｖ２２Ｌ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｇ、Ｅ２４Ｄ、Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｐ、Ａ２６Ｓ、Ａ２６Ｔ、Ｑ２７Ｈ、Ｑ２７Ｌ、Ｉ３０Ｖ、Ｑ３３Ｌ、Ｑ３３Ｒ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｔ４１Ｓ、Ｍ４２Ｖ、Ｍ４３Ｌ、Ｍ４３Ｔ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｎ４８Ｄ、Ｎ４８Ｈ、Ｎ４８Ｋ、Ｎ４８Ｒ、Ｎ４８Ｓ、Ｎ４８Ｔ、Ｎ４８Ｙ、Ｙ５３Ｆ、Ｋ５４Ｅ、Ｋ５４Ｒ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｉ６１Ｆ、Ｉ６１Ｖ、Ｔ６２Ａ、Ｔ６２Ｎ、Ｉ６７Ｌ、Ｖ６８Ｅ、Ｉ６９Ｆ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｌ７２Ｖ、Ｒ７３Ｈ、Ｐ７４Ｓ、Ｔ７９Ｉ、Ｔ７９Ｍ、Ｅ８１Ｇ、Ｅ８１Ｋ、Ｖ８４Ｉ、Ｌ８５Ｍ、Ｌ８５Ｑ、Ｙ８７Ｃ、Ｙ８７Ｄ、Ｅ８８Ｖ、Ｆ９２Ｖ、Ｒ９４Ｑ、Ｒ９４Ｗ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５Ｖ、及びＬ９７Ｑの中から選択される、１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する。

提供される任意の実施形態において、ＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＣＤ２８のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示すことができる。このような実施形態のいくつかでは、ＣＤ２８のエクトドメインに対する増加した親和性は、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、または２００倍より多く増加する。このような実施形態のいくつかでは、ＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた２３、２６、３５、４６、５５、５７、５８、７１、７９及び／または８４位に対応する、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に１つまたは複数のアミノ酸改変を含有する。このような実施形態のいくつかでは、ＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、Ｔ１３Ｒ、Ｓ１５Ｔ、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２２Ｄ、Ｖ２２Ｌ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｇ、Ｅ２４Ｄ、Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｐ、Ａ２６Ｓ、Ａ２６Ｔ、Ｑ２７Ｈ、Ｑ２７Ｌ、Ｑ３３Ｒ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｔ４１Ｓ、Ｍ４２Ｖ、Ｍ４３Ｌ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｎ４８Ｋ、Ｎ４８Ｙ、Ｙ５３Ｆ、Ｋ５４Ｅ、Ｎ５５Ｉ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｉ６１Ｆ、Ｉ６１Ｖ、Ｔ６２Ａ、Ｔ６２Ｎ、Ｉ６７Ｌ、Ｖ６８Ｅ、Ｖ６８Ｌ、Ｉ６９Ｆ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｌ７２Ｖ、Ｔ７９Ｉ、Ｔ７９Ｍ、Ｖ８４Ｉ、Ｌ８５Ｍ、Ｌ８５Ｑ、Ｙ８７Ｃ、Ｙ８７Ｄ、Ｅ８８Ｖ、Ｒ９４Ｑ、Ｒ９４Ｗ、Ｅ９５Ｖ、及びＬ９７Ｑの中から選択される、１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す。このような実施形態のいくつかでは、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対する増加した親和性は、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、または４５０倍より多く増加する。このような実施形態のいくつかでは、ＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた７、２３、２６、３０、３４、３５、４６、５１、５５、５７、５８、６５、７１、７３、７８、７９、８２、及び／または８４位に対応する、１つまたは複数のアミノ酸改変を含有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、Ｅ７Ｄ、Ｔ１３Ａ、Ｔ１３Ｒ、Ｓ１５Ｔ、Ｃ１６Ｒ、Ｖ２０Ａ、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２２Ｄ、Ｖ２２Ｉ、Ｖ２２Ｌ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｇ、Ｅ２４Ｄ、Ｌ２５Ｓ、Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｐ、Ａ２６Ｓ、Ａ２６Ｔ、Ｑ２７Ｈ、Ｑ２７Ｌ、Ｉ３０Ｔ、Ｉ３０Ｖ、Ｑ３３Ｅ、Ｑ３３Ｋ、Ｑ３３Ｌ、Ｑ３３Ｒ、Ｋ３４Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｋ３６Ｒ、Ｔ４１Ｓ、Ｍ４２Ｉ、Ｍ４２Ｖ、Ｍ４３Ｌ、Ｍ４３Ｔ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｎ４８Ｄ、Ｎ４８Ｈ、Ｎ４８Ｋ、Ｎ４８Ｒ、Ｎ４８Ｓ、Ｎ４８Ｔ、Ｎ４８Ｙ、Ｐ５１Ａ、Ｙ５３Ｆ、Ｋ５４Ｒ、Ｎ５５Ｄ、Ｎ５５Ｉ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｉ６１Ｆ、Ｉ６１Ｖ、Ｔ６２Ａ、Ｔ６２Ｎ、Ｌ６５Ｐ、Ｉ６７Ｌ、Ｖ６８Ｌ、Ｉ６９Ｆ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｌ７２Ｖ、Ｒ７３Ｓ、Ｐ７４Ｓ、Ｄ７６Ｈ、Ｇ７８Ａ、Ｔ７９Ａ、Ｔ７９Ｉ、Ｔ７９Ｌ、Ｔ７９Ｍ、Ｔ７９Ｐ、Ｅ８１Ｇ、Ｅ８１Ｋ、Ｃ８２Ｒ、Ｖ８４Ａ、Ｖ８４Ｉ、Ｌ８５Ｅ、Ｌ８５Ｍ、Ｌ８５Ｑ、Ｋ８６Ｍ、Ｙ８７Ｃ、Ｙ８７Ｄ、Ｆ９２Ｓ、Ｆ９２Ｖ、Ｒ９４Ｑ、Ｒ９４Ｗ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５Ｖ、Ｌ９７Ｍ、及びＬ９７Ｑの中から選択される、１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０は、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＣＤ２８のエクトドメインに対して減少した結合親和性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８のエクトドメインに対する減少した親和性は、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または６０倍より多い。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０と比較して、増加した選択性を伴ってＣＴＬＡ−４のエクトドメインに特異的に結合する。このような実施形態のいくつかでは、選択性の増加は、非改変ＣＤ８０ポリペプチドのＣＴＬＡ−４への結合対ＣＤ２８への結合の結合比と比較して、ＣＴＬＡ−４対ＣＤ２８へのバリアントポリペプチドのより大きな結合比を含む。このような実施形態のいくつかでは、ＣＴＬＡ−４対ＣＤ２８結合比は、少なくとも１．５倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれ以上だけ、または少なくとも約１．５倍、約２．０倍、約３．０倍、約４．０倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍もしくはそれ以上だけ大きい。

提供される任意の実施形態において、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインの非改変ＣＤ８０と比較して、増加した選択性を伴ってＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに特異的に結合する。このような実施形態のいくつかでは、選択性の増加は、ＰＤ−Ｌ１対ＣＤ２８への非改変ＣＤ８０ポリペプチドの結合比と比較して、ＰＤ−Ｌ１対ＣＤ２８へのバリアントポリペプチドのより大きな結合比を含む。このような実施形態のいくつかでは、該比率は、少なくとも１．５倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれ以上だけ、または少なくとも約１．５倍、約２．０倍、約３．０倍、約４．０倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍もしくはそれ以上より大きい。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、可溶性タンパク質である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、多量体化ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、多量体化ドメインに連結された第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び多量体化ドメインに連結された第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する多量体ポリペプチド、任意で二量体ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、同一である。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、異なる。

いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、Ｆｃドメインであるか、または低下したエフェクター機能を有するそのバリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ポリペプチドの生物学的半減期を延長する部分に連結される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｆｃドメインに連結されるか、または低下したエフェクター機能を有するそのバリアントに連結される。

いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは哺乳動物、任意でヒトである；またはバリアントＦｃドメインは、哺乳動物、任意でヒトである非改変Ｆｃドメインと比較して１つまたは複数のアミノ酸改変を含有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインまたはそのバリアントは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５９、もしくはＳＥＱＩＤＮＯ：１７１２に記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２７７、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５９、もしくはＳＥＱＩＤＮＯ：１７１２に対して少なくとも８５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｇ２３７Ａ、Ｓ２６７Ｋ、Ｎ２９７Ｇ，Ｖ３０２Ｃ、及びＫ４４７ｄｅｌ（それぞれＥＵ番号付けによる）の中から選択される１つもしくは複数のアミノ酸改変を含有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、変異Ｒ２９２Ｃ、Ｎ２９７Ｇ及びＶ３０２Ｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７に記載の野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃに基づくとＲ７７Ｃ、Ｎ８２Ｇ及びＶ８７Ｃに対応する）を含有するヒトＩｇＧ１Ｆｃではない。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５６に記載のＦｃではない。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸改変Ｃ２２０Ｓ（ＥＵ番号付けによる）を含有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５６〜３５８、３７６、及び１７１３〜１７１５のいずれかに記載のアミノ酸配列またはＳＥＱＩＤＮＯ：３５６〜３５８、３７６、及び１７１３〜１７１５のいずれかに対して少なくとも８５％の配列同一性を示し、かつ低下したエフェクター機能を示すアミノ酸の配列を含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、リンカー、任意でＧＳＧ_４Ｓリンカー（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１６）を介して間接的に多量体化ドメインまたはＦｃに連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、３つのアラニン（ＡＡＡ）で構成されない。

いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか及び半減期延長部分を含有する免疫調節タンパク質が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、半減期延長部分には、多量体化ドメイン、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｓｅｒ（ＰＡＳ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのベータサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アミノ酸の長い非構造化親水性配列（ＸＴＥＮ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはこれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｓｅｒ（ＰＡＳ）であるか、またはこれを含み、バリアントＣＤ８０ポリペプチドはＰＡＳ化される。いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、多量体化ドメインであるか、またはこれを含有する。いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域、ロイシンジッパー、イソロイシンジッパーまたはジンクフィンガーから選択される。

いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、第１の多量体化ドメインに連結された第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２の多量体化ドメインに連結された第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する多量体であり、第１及び第２の多量体化ドメインは、相互作用して第１及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する多量体を形成する。いくつかの実施形態では、多量体は二量体である。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、同一である。いくつかの実施形態では、二量体はホモ二量体である。いくつかの実施形態では、二量体はヘテロ二量体である。

いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域であるか、またはそれを含有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）または免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）タンパク質のものである。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンタンパク質はヒトである、及び／またはＦｃ領域はヒトである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７８に記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２７８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すそのバリアントを含有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７に記載のアミノ酸配列またはＳＥＱＩＤＮＯ：２７７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すそのバリアントを含有する。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、１つまたは複数のエフェクター機能を示す。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、Ｆｃ依存性ＣＤ２８共刺激を、任意で抗原提示細胞の存在下でのＴ細胞刺激アッセイにおいて示し、任意でＴ細胞は、ＩＬ−２レポーターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して低下した１つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で野生型Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のエフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害、プログラム細胞死及び細胞食作用の中から選択される。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を含有するバリアントＦｃ領域である。このような実施形態のいくつかでは、バリアントＦｃ領域の１つまたは複数のアミノ酸置換は、ＦｃＮ２９７Ｇ、Ｒ２９２Ｃ／Ｎ２９７Ｇ／Ｖ３０２Ｃ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７ＫまたはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａから選択され、該残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ領域は、アミノ酸置換Ｃ２２０Ｓをさらに含み、該残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５６〜３５８のいずれかに記載のアミノ酸配列の配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３５６〜３５８のいずれかに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含有するかつアミノ酸置換を含有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｋ４４７ｄｅｌを含み、該残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１３〜１７１５のいずれかに記載のアミノ酸配列の配列またはＳＥＱＩＤＮＯ：１７１３〜１７１５のいずれかに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含有し、アミノ酸置換を含有する。

いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１に対する増加した親和性を示す本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれかを含有する。

いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激を、任意で、ＰＤ−Ｌ１を発現する抗原提示細胞の存在下でのＴ細胞刺激アッセイにおいて示し、任意でＴ細胞は、ＩＬ−２レポーターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞またはＩＬ−２などの炎症性サイトカインを産生する初代ヒトＴ細胞を含む。

免疫調節タンパク質のいくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、直接的またはリンカーを介して間接的に多量体化ドメインに連結される。このような実施形態のいくつかでは、リンカーは、１〜１０アミノ酸を含有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＡＡＡ、Ｇ４Ｓ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１７）または（Ｇ_４Ｓ）_２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３０）から選択される。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはその特異的結合断片に連結された膜貫通ドメインをさらに含有する膜貫通型免疫調節タンパク質である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基２４３〜２６３として記載されるアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基２４３〜２６３に対して少なくとも８５％の配列同一性を示すその機能的バリアントを含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、膜貫通ドメインに連結された細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含有する。いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基２６４〜２８８として記載されるアミノ酸配列または、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基２５４〜２８８に対して少なくとも８５％の配列同一性を示すその機能的バリアントを含有する。

提供される実施形態の任意のいくつかでは、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｔ細胞などの免疫細胞の応答を調節する。いくつかの実施形態では、応答、例えばＴ細胞応答は増加または減少する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０は、ｉｎｖｉｔｒｏ初代Ｔ細胞アッセイにおいて非改変ＣＤ８０と比較してＩＦＮ−γ（インターフェロン−ガンマ）発現を増加させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０は、ｉｎｖｉｔｒｏ初代Ｔ細胞アッセイにおいて非改変ＣＤ８０と比較してＩＦＮ−γ（インターフェロン−ガンマ）発現を減少させる。本明細書に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドの任意の１つのいくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩＬ−２プロモーターに作動可能に接続されたレポーター（例えばルシフェラーゼ）で操作されたＴ細胞（例えばＪｕｒｋａｔ）を含むレポーターアッセイを使用して決定して、非改変ＣＤ８０と比較してＴ細胞シグナル伝達を増加させる。本明細書に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドの任意の１つのいくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩＬ−２プロモーターに作動可能に接続されたレポーター（例えばルシフェラーゼ）で操作されたＴ細胞（例えばＪｕｒｋａｔ）を含むレポーターアッセイを使用して決定して、非改変ＣＤ８０と比較してＴ細胞シグナル伝達を減少させる。任意のこのような実施形態のいくつかでは、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、可溶性または固定化（プレート結合など）など、任意の多種多様なフォーマットで提供される。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、脱グリコシル化される。

いくつかの実施形態では、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインを含有する第２のポリペプチドに連結されたいずれかの提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦドメインは、親和性改変され、非改変または野生型ＩｇＳＦドメインと比較して１つまたは複数のそのコグネイト結合パートナー（複数可）への変化した結合を示す。いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦドメインは、非改変または野生型ＩｇＳＦドメインと比較して１つまたは複数のそのコグネイト結合パートナー（複数可）への増加した結合を示す。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０は第１のＣＤ８０バリアントポリペプチドであり、第２のポリペプチドのＩｇＳＦドメインは、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれかである第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドに由来するＩｇＳＦドメインであり、第１及び第２のＣＤ８０バリアントは同一または異なる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドはＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができ、第２のポリペプチドのＩｇＳＦドメインはＣＤ８０バリアントポリペプチドによって特異的に結合されるもの以外のコグネイト結合パートナーに結合することができる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドのＩｇＳＦドメインは、腫瘍に発現するリガンドに結合する腫瘍局在化部分である。いくつかの実施形態では、腫瘍に発現するリガンドはＢ７Ｈ６である。

いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦドメインはＮＫｐ３０由来である。

いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドのＩｇＳＦドメインは、阻害性受容体に結合するリガンドのＩｇＳＦドメイン、またはその親和性改変ＩｇＳＦドメインである。いくつかの実施形態では、親和性改変ＩｇＳＦドメインは、非改変ＩｇＳＦドメインの阻害性受容体への結合と比較して、阻害性受容体に対する結合親和性及び／または結合選択性の増加を示す。いくつかの実施形態では、阻害性受容体はＴＩＧＩＴもしくはＰＤ−１；または阻害性受容体のリガンドはＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２である。

いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドのＩｇＳＦドメインは、以下を含有する親和性改変ＩｇＳＦドメインである：（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６９、７３４または８２９のいずれかに記載のＩｇＳＦドメインを含有する野生型ＣＤ１１２、または表３に記載のＳＥＱＩＤＮＯ：のいずれか、任意でＳＥＱＩＤＮＯ：７３５〜８２８、８３０〜９１７、９１８〜９９９、１４３０〜１５０１のいずれかのＩｇＳＦドメインを含むバリアントＣＤ１１２ポリペプチド、（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６８、３７８または４２１のいずれかに記載のＩｇＳＦを含有する野生型ＣＤ１５５、または表４に記載のＳＥＱＩＤＮＯ：のいずれか、任意でＳＥＱＩＤＮＯ：３７９〜４２０、４２２〜５３９、５４０〜７３３、１５０２〜１５７３、１５４８〜１７１１のいずれかのＩｇＳＦドメインを含むバリアントＣＤ１５５ポリペプチド、（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５１、１０００、１７２１または１１９６のいずれかに記載のＩｇＳＦを含有する野生型ＰＤ−Ｌ１、または表５に記載のＳＥＱＩＤＮＯ：のいずれか、任意でＳＥＱＩＤＮＯ：１００１〜１０６５、１７１８〜１９００、１９３１〜１９９６のいずれかのＩｇＳＦを含むバリアントＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、（ｉｖ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５２、１１９７または１２５７のいずれかに記載のＩｇＳＦを含有する野生型ＰＤ−Ｌ２、または表６に記載のＳＥＱＩＤＮＯ：のいずれか、任意でＳＥＱＩＤＮＯ：１１９８〜１２４８、１２５０〜１３２５、１３２７〜１４０１、１４０３〜１４２６１７１９、１７２０、１９０１〜１９３０のいずれかのＩｇＳＦドメインを含むバリアントＰＤ−Ｌ２ポリペプチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＳＥＱＩＤＮＯ：のいずれかに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示し、アミノ酸置換を含有するアミノ酸配列、または（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）のいずれかの特異的結合断片。いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦドメインは、ＩｇＶドメインであるか、またはそれを含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメインであるか、またはそれを含有する。

いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、バリアントＣＤ８０ポリペプチド、及び第２のポリペプチドのＩｇＳＦドメインの一方または両方に連結された多量体化ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、Ｆｃドメインであるか、または低下したエフェクター機能を有するそのバリアントである。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、二量体である。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、ホモ二量体である。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、ヘテロ二量体である。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは部分に連結された本明細書で提供される免疫調節ポリペプチドを含有するコンジュゲートが本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、当該部分は、細胞表面の分子に特異的に結合するターゲティング部分である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、免疫細胞表面の分子に特異的に結合し、任意で該免疫細胞は、抗原提示細胞またはリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、抗原提示細胞またはリンパ球である。いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、腫瘍表面の分子に結合する腫瘍局在化部分である。いくつかの実施形態では、当該部分は、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子またはナノ粒子である。いくつかの実施形態では、当該部分は、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、二価、四価、六価、または八価である。このようなコンジュゲートの例示的な描写は、図６Ａ及び図６Ｂに提示される。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、融合タンパク質である。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド、本明細書で提供される免疫調節ポリペプチド、または本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれかを含有する融合タンパク質であるコンジュゲートをコードする核酸分子（複数可）が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、合成核酸である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｃＤＮＡである。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸分子を含有するベクターが本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターまたはウイルスベクターである。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるベクターを含有する細胞が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸分子または本明細書で提供されるベクターを細胞内でタンパク質を発現する条件下で宿主細胞に導入することを含む、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質を産生する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、方法は、細胞からバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質を単離または精製することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドをコードする核酸分子を、細胞内でポリペプチドが発現される条件下で宿主細胞に導入することを含む、バリアントＣＤ８０バリアントポリペプチドを発現する細胞を操作する方法が本明細書において提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド、本明細書で提供される免疫調節タンパク質、本明細書で提供されるコンジュゲート、本明細書で提供される核酸分子または本明細書で提供されるベクターを発現する操作された細胞が本明細書において提供される。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、シグナルペプチドを含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインを含まない、及び／または細胞の表面に発現しない。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、操作された細胞から分泌される。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、膜貫通ドメインを含有する、及び／または本明細書で提供される膜貫通型免疫調節タンパク質であるバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、細胞の表面に発現する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはリンパ球である。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であるリンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、人工ＡＰＣであるＡＰＣである。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体をさらに含有する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド、本明細書で提供される免疫調節ポリペプチド、または本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０融合コンジュゲートをコードする核酸分子を含有する感染性物質が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、コードされたバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節ポリペプチドは、膜貫通ドメインを含まない、及び／またはそれが発現される細胞の表面に発現しない。いくつかの実施形態では、コードされたバリアントＣＤ８０ポリペプチド、免疫調節ポリペプチド、またはコンジュゲートは、それが発現される細胞から分泌される。

いくつかの実施形態では、感染性物質内に含まれるコードされたバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、膜貫通ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、コードされたバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、それが発現される細胞の表面に発現する。

いくつかの実施形態では、感染性物質は、細菌またはウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスはレンチウイルスまたはレトロウイルス構築物またはそれらのハイブリッドである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスである。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、コクサッキーウイルスまたはワクシニアウイルスである。

いくつかの実施形態では、感染性物質は、樹状細胞（ＤＣ）を特異的に標的とするウイルス、及び／または樹状細胞指向性のウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、改変されたシンドビスウイルスエンベロープ産物でシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターである。

いくつかの実施形態では、感染性物質は、標的細胞の死をもたらす、または免疫応答を増強もしくは強化することができるさらなる遺伝子産物をコードする核酸分子をさらに含有する。いくつかの実施形態では、さらなる遺伝子産物は、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、免疫チェックポイント阻害剤、抗体、サイトカイン、成長因子、抗原、細胞傷害性遺伝子産物、プロアポトーシス遺伝子産物、抗アポトーシス遺伝子産物、細胞マトリックス分解性遺伝子、組織再生及びヒト体細胞をリプログラミングして多能性にするための遺伝子から選択される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド、本明細書で提供される免疫調節タンパク質、本明細書で提供されるコンジュゲート、本明細書で提供される操作された細胞、または本明細書で提供される感染性物質を含有する薬学的組成物が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、無菌である。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物をバイアルに含有する製造物品が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、バイアルは密封される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物、及び使用説明書を含有するキットが本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される製造物品、及び使用説明書を含有するキットが本明細書において提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物を対象に投与することを含む、免疫応答を増加または低下させるなど、対象において免疫応答を調節する方法が本明細書において提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される免疫調節タンパク質、例えばＰＤ−Ｌ１に対する増加した結合親和性を示す免疫調節タンパク質を投与することを含む、対象において免疫応答を調節する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、免疫応答は増加される。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、Ｆｃ依存性ＣＤ２８共刺激を示す本明細書で提供される免疫調節タンパク質である。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激を示す本明細書で提供される免疫調節タンパク質であり、任意で免疫調節タンパク質は、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作された細胞を投与することを含む、対象において免疫応答を調節する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象に対して自家である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象に対して同種他家である。

また、例えば、バリアントＣＤ８０ポリペプチド、またはバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質もしくはコンジュゲート、または操作された細胞、またはバリアントＣＤ８０ポリペプチドを分泌もしくは発現する感染性物質の対象への投与を含む、免疫応答の増加または低下などの対象において免疫応答を調節する方法も本明細書において提供され、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４に対する非改変ＣＤ８０の結合と比較して、増加した親和性または選択性を伴ってＣＴＬＡ−４に結合する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、本明細書に記載される１つまたは複数の改変を含有する。

この方法のいくつかの実施形態では、バリアントＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置に基づいて１２、１３、１６、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３８、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５１、５４、５５、５７、５８、６１、６２、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８８、９０、９１、９２、９３、９４，及び／または９５から選択される位置に対応する非改変ＣＤ８０ポリペプチドまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた２３、２６、３０、３４、３５、４６、５１、５５、５７、５８、６５、７１、７３、７８、７９、８２または８４位に対応する、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含有する。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数の改変は、Ａ１２Ｔ、Ａ１２Ｖ、Ｔ１３Ｒ、Ｃ１６Ｒ、Ｈ１８Ｙ、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２２Ｉ、Ｖ２２Ｌ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｇ、Ｅ２４Ｄ、Ｌ２５Ｓ、Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｐ、Ａ２６Ｓ、Ａ２６Ｔ、Ｑ２７Ｈ、Ｑ２７Ｌ、３０Ｆ、Ｉ３０Ｔ、Ｉ３０Ｖ、Ｙ３１Ｈ、Ｑ３３Ｅ、Ｋ３４Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｋ３６Ｒ、Ｍ３８Ｖ、Ｔ４１Ａ、Ｔ４１Ｓ、Ｍ４２Ｉ、Ｍ４２Ｖ、Ｍ４３Ｉ、Ｍ４３Ｌ、Ｓ４４Ｐ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｔ、Ｍ４７Ｖ、Ｎ４８Ｈ、Ｐ５１Ａ、Ｋ５４Ｅ、Ｎ５５Ｄ、Ｎ５５Ｉ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｉ６１Ｖ、Ｔ６２Ｎ、Ｌ６５Ｐ、Ｉ６７Ｌ、Ｖ６８Ａ、Ｖ６８Ｌ、Ｖ６８Ｍ、Ｉ６９Ｆ、Ｉ６９Ｔ、Ｌ７０Ｍ、Ｌ７０Ｐ、Ｌ７０Ｑ、Ｌ７０Ｒ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｌ７２Ｐ、Ｌ７２Ｖ、Ｒ７３Ｓ、Ｄ７６Ｈ、Ｅ７７Ｇ、Ｇ７８Ａ、Ｔ７９Ｉ、Ｔ７９Ｐ、Ｅ８１Ｋ、Ｃ８２Ｒ、Ｖ８３Ｉ、Ｖ８４Ａ、Ｖ８４Ｉ、Ｌ８５Ｍ、Ｌ８５Ｑ、Ｋ８６Ｍ、Ｅ８８Ｄ、Ｅ８８Ｖ、Ｄ９０Ｎ、Ａ９１Ｓ、Ａ９１Ｔ、Ｆ９２Ｓ、Ｋ９３Ｒ、Ｒ９４Ｗ、Ｅ９５Ｋ及びＥ９５Ｖから選択される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｇ、Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｐ、Ａ２６Ｓ、Ａ２６Ｔ、Ｉ３０Ｆ、Ｉ３０Ｔ、Ｉ３０Ｖ、Ｋ３４Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｐ５１Ａ、Ｎ５５Ｄ、Ｎ５５Ｉ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｌ６５Ｐ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｒ７３Ｓ、Ｇ７８Ａ、Ｔ７９Ｉ、Ｔ７９Ｐ、Ｃ８２Ｒ、Ｖ８４Ａ、Ｖ８４Ｉの中から選択される、１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置の番号付けに対応する。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数の改変は、

から選択される。

いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによる可溶性バリアントＣＤ８０ポリペプチド、記載の実施形態のいずれか１つによる免疫調節タンパク質、または本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるコンジュゲートを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによるバリアントＣＤ８０ポリペプチドをコードする感染性物質を対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、免疫応答を調節することにより、対象の疾患または状態を治療する。いくつかの実施形態では、免疫応答は増加される。バリアントＣＤ８０の拮抗フォーマットなど、免疫応答を増加させるように対象に投与するためにバリアントＣＤ８０ポリペプチドの様々なフォーマットが企図される。場合によっては、このような方法は、阻害性受容体ＣＴＬＡ−４によるシグナル伝達が、投与により遮断または減弱化した条件下で実施される。

いくつかの実施形態では、提供される、免疫応答を調節する方法では、可溶性のバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質が対象に投与される。いくつかの実施形態では、可溶性免疫調節タンパク質は、免疫調節Ｆｃ融合タンパク質である。

いくつかの実施形態では、提供される方法は、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド、または本明細書で提供される免疫調節タンパク質を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される分泌可能なバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する操作された細胞が対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作された細胞は、対象に投与される。

提供される方法のいくつかの実施形態では、分泌可能な免疫調節タンパク質であるバリアントＣＤ８０ポリペプチドをコードする感染性物質が、任意で感染性物質が腫瘍細胞または免疫細胞に感染し、分泌可能な免疫調節タンパク質が感染細胞から分泌される条件下で対象に投与される。

提供される方法のいくつかの実施形態では、疾患または状態は、腫瘍またはがんである。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、黒色腫、肺癌、膀胱癌、血液学的悪性疾患、肝臓癌、脳癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、脾臓癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、筋骨格癌、頭頸部癌、消化管癌、生殖細胞癌、または内分泌及び神経内分泌癌から選択される。任意のこのような実施形態のいくつかでは、バリアントＣＤ８０は、対象の免疫応答を増加させる形式で投与される。

バリアントＣＤ８０の作動フォーマットなど、免疫応答を減少させるように対象に投与するためにバリアントＣＤ８０ポリペプチドの様々なフォーマットが企図される。場合によっては、このような方法は、阻害性受容体ＣＴＬＡ−４によるシグナル伝達が、投与により活性化または刺激または誘導される条件下で実施される。

提供される方法のいくつかの実施形態では、免疫応答は減少される。提供される方法のいくつかの実施形態では、炎症環境の細胞または組織に局在化する部分に連結されたバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質またはコンジュゲートが対象に投与される。いくつかの実施形態では、結合分子は、抗体またはその抗原結合断片を含有するか、野生型ＩｇＳＦドメインまたはそのバリアントを含有する第２のポリペプチドを含有する。

提供される方法のいくつかの実施形態では、本明細書で提供される免疫調節タンパク質または本明細書で提供されるコンジュゲートが対象に投与される。提供される方法のいくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質であるバリアントＣＤ８０ポリペプチドが対象に投与される。提供される方法のいくつかの実施形態では、本明細書で提供される膜貫通型免疫調節タンパク質であるバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する操作された細胞が対象に投与される。

提供される方法のいくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質であるバリアントＣＤ８０ポリペプチドをコードする感染性物質が、任意で感染性物質が腫瘍細胞または免疫細胞に感染し、膜貫通型免疫調節タンパク質が感染細胞の表面に発現する条件下で対象に投与される。

提供される方法のいくつかの実施形態では、疾患または状態は、炎症性または自己免疫性疾患または状態である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、血管炎、自己免疫性皮膚疾患、移植、リウマチ性疾患、炎症性消化管疾患、炎症性眼疾患、炎症性神経疾患、炎症性肺疾患、炎症性内分泌疾患、または自己免疫性血液疾患である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、炎症性腸疾患、移植、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬から選択される。任意のこのような実施形態のいくつかでは、バリアントＣＤ８０が、対象の免疫応答を減少させる形式で投与される。

いくつかの実施形態では、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含有するバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含み、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激を示す免疫調節タンパク質を投与することを含む疾患または状態の治療方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す。いくつかの実施形態では、対象においてＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激によりＣＤ２８作動作用を媒介する方法が本明細書において提供され、該方法は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む免疫調節タンパク質を投与することを含み、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す。任意の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対する増加した親和性は、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または６０倍より多く増加する。

いくつかの実施形態では、方法は、疾患または状態の治療に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激が、ＰＤ−Ｌ１を発現する抗原提示細胞の存在下でのＴ細胞刺激アッセイにおいて評価され、任意でＴ細胞刺激アッセイはｉｎｖｉｔｒｏアッセイであり、任意でＴ細胞は、ＩＬ−２レポーターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞またはＩＬ−２などの炎症性サイトカインを産生する初代ヒトＴ細胞を含む。

提供される方法のいくつかの実施形態では、投与の前に、表面ＰＤ−Ｌ１に陽性の細胞を含む腫瘍を有する治療対象が選択され、任意で細胞は腫瘍細胞もしくは腫瘍浸潤免疫細胞である；または対象はＰＤ−Ｌ１に陽性の細胞表面を含む腫瘍を有するものとして選択されており、任意で細胞は腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞である。

いくつかの実施形態では、対象の選択は、（ａ）対象の腫瘍組織試料をＰＤ−Ｌ１のエクトドメインと特異的に結合することができる結合試薬と接触させることと、（ｂ）腫瘍組織試料の細胞内または細胞上に結合した結合試薬の存在を検出することであって、任意で該細胞が腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞である、検出することと、（ｃ）腫瘍組織試料が検出可能レベルのＰＤ−Ｌ１に陽性の細胞表面を含む場合に、その対象を治療のすることと、を含む。

提供される方法のいくつかの実施形態では、投与の前に、ＣＤ２８に陽性の細胞表面を含む腫瘍を有する治療対象が選択され、任意で細胞は腫瘍浸潤リンパ球であり、任意でリンパ球はＴ細胞、任意でＣＤ８＋Ｔ細胞である；または対象はＣＤ２８に陽性の細胞表面を含む腫瘍を有するものとして選択されており、任意で細胞は腫瘍浸潤リンパ球であり、任意でリンパ球はＴ細胞、任意でＣＤ８＋Ｔ細胞である。

いくつかの実施形態では、対象の選択は、（ａ）対象の腫瘍組織試料をＣＤ２８のエクトドメインと特異的に結合することができる結合試薬と接触させることと、（ｂ）腫瘍組織試料の細胞内または細胞上に結合した結合試薬の存在を検出することであって、任意で該細胞が腫瘍浸潤リンパ球であり、任意でリンパ球はＴ細胞、任意でＣＤ８＋Ｔ細胞である、検出ことと、（ｃ）腫瘍組織試料が検出可能レベルのＣＤ２８に陽性の細胞表面を含む場合に、その対象を治療のために選択することと、を含む。

いくつかの実施形態では、（ａ）対象の腫瘍組織試料をＰＤ−Ｌ１と特異的に結合することができる結合試薬と接触させることと、（ｂ）腫瘍組織試料の細胞内または細胞上に結合した結合試薬の存在を検出することであって、任意で該細胞が腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞である、検出することと、（ｃ）腫瘍試料が検出可能レベルのＰＤ−Ｌ１に陽性の細胞表面を含む場合、その対象を、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む免疫調節タンパク質による治療のために選択することと、を含む治療対象を選択する方法が本明細書において提供され、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す。

いくつかの実施形態では、該方法は、腫瘍組織試料をＣＤ２８と特異的に結合することができる結合試薬と接触させることをさらに含み、対象は、腫瘍組織試料が検出可能レベルのＣＤ２８に陽性の腫瘍浸潤リンパ球をさらに含む場合に選択され、任意でリンパ球はＴ細胞、任意でＣＤ８＋Ｔ細胞である。

いくつかの実施形態では、腫瘍組織試料は、腫瘍浸潤免疫細胞、腫瘍細胞、間質細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含有する。

いくつかの実施形態では、結合試薬は、抗体もしくは抗原結合断片、タンパク質リガンドもしくは結合パートナー、アプタマー、アフィマー、ペプチド、またはハプテンである。いくつかの実施形態では、結合試薬は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、結合試薬は、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片は、結合試薬の唯一のＣＤ８０部分である。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較してＰＤ−Ｌ１への結合に対する増加した親和性を示す。

いくつかの実施形態では、結合試薬は、検出可能部分または検出することのできる部分である部分に直接または間接的に連結される。いくつかの実施形態では、該部分は、Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、非ヒト、任意でマウスまたはウサギである。

いくつかの実施形態では、結合した結合試薬の存在の検出は、免疫組織化学、偽免疫組織化学、免疫蛍光、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、または免疫ブロッティングによる。

いくつかの実施形態では、方法は、免疫調節タンパク質を対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象である。

いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、第１の多量体化ドメインに連結された第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２の多量体化ドメインに連結された第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む多量体であり、第１及び第２の多量体化ドメインは、相互作用して第１及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む多量体を形成する。いくつかの実施形態では、多量体は二量体である。いくつかの実施形態では、第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、同一である。

いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、Ｆｃ領域であるかまたはそれを含み、任意で、野生型Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を含有するバリアントＦｃ領域であり、Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して低下した１つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で野生型Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１である。

このような実施形態のいくつかでは、ＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた７、１２、１３、１５、１６、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５７、５８、６１、６２、６３、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、及び／または９７位に対応する１つまたは複数のアミノ酸改変を含有する。このような実施形態のいくつかでは、ＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、

の中から選択される、１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該アミノ酸置換の位置（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＤ２８への結合を保持する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＤ２８のエクトドメインに対する非改変ＣＤ８０ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＣＤ２８のエクトドメインに対する親和性の、少なくとも２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％、または少なくとも約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％もしくは約９５％を保持する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＣＤ２８のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す。このような実施形態のいくつかでは、ＣＤ２８のエクトドメインに対する増加した親和性は、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または６０倍より多く増加する。

いくつかの実施形態では、免疫応答を増加させることにより、対象の疾患または状態を治療する。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、腫瘍またはがんである。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、黒色腫、肺癌、膀胱癌、血液学的悪性疾患、肝臓癌、脳癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、脾臓癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、筋骨格癌、頭頸部癌、消化管癌、生殖細胞癌、または内分泌及び神経内分泌癌から選択される。

いくつかの実施形態では、（ａ）生体試料を本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれかを含む結合試薬と接触させることと、（ｂ）生体試料の細胞内または細胞上に結合した結合試薬の存在を検出することと、を含む生体試料中のＣＤ８０結合パートナーを検出する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、結合パートナーは、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはこれらの組み合わせである。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す。

いくつかの実施形態では、生体試料は、血清、血漿もしくは尿である体液、または腫瘍組織試料である組織体試料などの、体液、細胞または組織試料であるかまたはそれらを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍組織試料は、腫瘍浸潤免疫細胞、腫瘍細胞、間質細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含有する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片は、結合試薬の唯一のＣＤ８０部分である。

いくつかの実施形態では、結合試薬は、検出可能部分である標識または検出することのできる部分に直接または間接的に連結される。いくつかの実施形態では、該部分はＦｃ領域であり、任意でマウスまたはウサギＦｃ領域など非ヒトである。いくつかの実施形態では、結合した結合試薬の存在の検出は、免疫組織化学、偽免疫組織化学、免疫蛍光、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、または免疫ブロッティングによる。

提供されるバリアントＩｇＳＦドメイン分子の様々なフォーマットを示す。（１）Ｆｃ鎖に融合したバリアントＩｇＳＦドメイン（ｖＩｇＤ）、（２）第１のバリアントＩｇＳＦドメイン（第１ｖＩｇＤ）、及び第２のバリアントＩｇＳＦドメイン（第２ｖＩｇＤ）などの第２のＩｇＳＦドメインを含有するスタック分子、（３）第１のバリアントＩｇＳＦドメイン（ｖＩｇＤ）、及びＮＫＰ３０ＩｇＳＦドメインなどの腫瘍抗原を標的とするＩｇＳＦドメインを含有する腫瘍標的指向性ＩｇＳＦ分子、ならびに（４）抗体に連結されたバリアントＩｇＳＦドメイン（ｖＩｇＤ）（Ｖ−ｍＡｂ）を含む可溶性分子を示す。提供されるバリアントＩｇＳＦドメイン分子の様々なフォーマットを示す。細胞の表面に発現したバリアントＩｇＳＦドメイン（ｖＩｇＤ）を含有する膜貫通型免疫調節タンパク質（ＴＩＰ）を示す。例示的な実施形態では、膜貫通型結合ｖＩｇＤのコグネイト結合パートナーは阻害性受容体（例えば、ＣＴＬＡ−４）であり、ｖＩｇＤ（例えば、ＣＤ８０ｖＩｇＤ）を含有するＴＩＰは阻害性受容体の負のシグナル伝達に拮抗またはこれを遮断し、これにより、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞が得られる。場合によっては、阻害性受容体（ＣＴＬＡ−４）のクラスタリングが活性化受容体（例えば、ＣＤ２８）に近接する場合、ＴＩＰによる作動活性が実現する場合がある。提供されるバリアントＩｇＳＦドメイン分子の様々なフォーマットを示す。バリアントＩｇＳＦドメイン（ｖＩｇＤ）が第１のＴ細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）などの細胞から分泌される分泌型免疫調節タンパク質（ＳＩＰ）を示す。例示的な実施形態では、分泌型ｖＩｇＤのコグネイト結合パートナーは阻害性受容体（例えば、ＣＴＬＡ−４）であり、これは、第１の細胞によって（例えば、ＣＡＲＴ細胞などのＴ細胞）及び／または第２の細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞などの内在性または操作されたＴ細胞）で発現され得る。コグネイト結合パートナーとＳＩＰが結合すると、ＳＩＰは、阻害性受容体を介して負のシグナル伝達に拮抗またはこれを遮断し、これにより、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞が得られる。全ての場合において、ｖＩｇＤは、Ｖドメイン（ＩｇＶ）のみ、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）全体を含むＶドメイン（ＩｇＶ）とＣドメイン（ＩｇＣ）の組み合わせ、またはＩｇＳＦスーパーファミリーメンバーのＩｇドメインの任意の組み合わせであり得る。Ｆｃに融合したバリアントＩｇＳＦドメイン（ｖＩｇＤ）（ｖＩｇＤ−Ｆｃ）の活性の例示的な概略図を示し、ここで該ｖＩｇＤはＣＤ８０のＩｇＳＦドメインのバリアントである。図示のように、ＣＤ８０の可溶性ｖＩｇＤは、そのコグネイト結合パートナーと相互作用して、ＣＤ８０とＣＴＬＡ−４の相互作用を遮断し、これによりＣＴＬＡ−４阻害性受容体を遮断し、場合によっては、Ｔ細胞がエフェクター表現型へと分化できるようにする。ＦｃにコンジュゲートしたバリアントＩｇＳＦドメイン（ｖＩｇＤ）の活性の例示的な概略図を示し、ここで該ＣＤ８０−Ｆｃは、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８作動活性をもたらす。図示のように、腫瘍細胞の表面に発現したＰＤ−Ｌ１へのＣＤ８０−Ｆｃの結合は、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１とＴ細胞の表面に発現する阻害性ＰＤ−１受容体の会合を防ぐことができる。加えて、ＣＤ８０−Ｆｃは、Ｔ細胞表面の共刺激ＣＤ２８受容体と結合するために利用でき、これによりＴＣＲシグナルのＣＤ２８共刺激を介してＴ細胞活性化を促進しながらＴ細胞を腫瘍に局在化させる。ＦｃにコンジュゲートしたＣＤ８０バリアントＩｇＳＦドメイン（ｖＩｇＤ）の活性の例示的な概略図を示し、ここで該ＣＤ８０−Ｆｃは、ＣＴＬＡ−４阻害活性を遮断する。図示のように、Ｔ細胞（例えばＴ_ｒｅｇ及びＴ_ｅｆｆ細胞）の表面に発現したＣＴＬＡ−４へのＣＤ８０ｖＩｇＤ−Ｆｃの結合は、これにより、ＣＴＬＡ−４のそのコグネイト結合パートナーＣＤ８０（Ｂ７−１）及びＣＤ８６（Ｂ７−２）（Ｂ７として示される）への結合に拮抗し、ＣＴＬＡ−４阻害性シグナル伝達を遮断し、ＴＣＲシグナル伝達の閾値を低下させ、Ｔ細胞活性化を促進する。ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２ｖＩｇＤである第１のバリアントＩｇＳＦドメイン（第１のｖＩｇＤ）と、第２の阻害性受容体に結合する第２のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２のｖＩｇＤ）を含有するマルチターゲットチェックポイント拮抗物質であるスタック分子の例示的な概略図を示す。例示的な概略図では、第２のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２のｖＩｇＤ）はＣＤ８０ｖＩｇＤである。図示のように、第１のｖＩｇＤ及び第２のｖＩｇＤは、そのコグネイト結合パートナーと相互作用し、それぞれＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２とＰＤ−１及びＣＤ８０とＣＴＬＡ−４阻害性受容体との相互作用を遮断する。バリアントＩｇＳＦ（ｖＩｇＤ）を腫瘍細胞に局在化させるためのスタック分子の例示的な概略図を示す。このフォーマットでは、スタック分子は、第１のバリアントＩｇＳＦドメイン（第１のｖＩｇＤ）及び第２のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２のｖＩｇＤ）を含み、ここで第２のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２のｖＩｇＤ）は、腫瘍抗原に結合する腫瘍標的指向性ＩｇＳＦドメインである。例示的な腫瘍標的指向性ＩｇＳＦドメインは、ＮＫｐ３０のＩｇＳＦドメインであり、腫瘍抗原Ｂ７−Ｈ６に結合する。この描写では、第１のバリアントＩｇＳＦドメイン（ｖＩｇＤ）は、ＣＤ８０のＩｇＳＦドメインのバリアントである。図示のように、腫瘍細胞表面への腫瘍標的指向性ＩｇＳＦドメインの結合は、腫瘍細胞表面上の第１のバリアントＩｇＳＦドメインを局在化させ、そこで該第１のバリアントＩｇＳＦドメインは、隣接する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の表面に発現するコグネイト結合パートナーの１つまたは複数と相互作用することができ、コグネイトな阻害性受容体ＣＴＬＡ−４に拮抗する。第１のバリアントＩｇＳＦドメイン（第１のｖＩｇＤ）、及び第２のバリアントＩｇＳＦドメイン（第２のｖＩｇＤ）などの第２のＩｇＳＦドメインを含有するスタック分子の様々な例示的な配置を示す。図示のように、第１のｖＩｇＤ及び第２のＩｇＳＦドメインは、Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端に直接または間接的に独立して連結される。ホモ二量体Ｆｃ分子を生成する場合、Ｆｃ領域は、細胞内の個々のＦｃ領域の共発現により、適合Ｆｃ領域とホモ二量体を形成することができるものである。ヘテロ二量体Ｆｃ分子を生成する場合、個々のＦｃ領域には変異（例えば、ＣＨ３ドメインの「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」変異）が含まれており、個々のＦｃ領域が細胞内で共発現している場合、ホモ二量体と比較してヘテロ二量体の形成が有利となっている。第１のバリアントＩｇＳＦドメイン（第１のｖＩｇＤ）、及び第２のバリアントＩｇＳＦドメイン（第２のｖＩｇＤ）などの第２のＩｇＳＦドメイン、及び第３のバリアントＩｇＳＦドメイン（第３のｖＩｇＤ）などの第３のＩｇＳＦドメインを含有するスタック分子の様々な例示的な配置を示す。図示のように、第１のｖＩｇＤ、第２のＩｇＳＦドメイン、及び第３のＩｇＳＦドメインは、Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端に直接または間接的に独立して連結される。ホモ二量体Ｆｃ分子を生成する場合、Ｆｃ領域は、細胞内の個々のＦｃ領域の共発現により、適合Ｆｃ領域とホモ二量体を形成することができるものである。抗体にコンジュゲートしたバリアントＩｇＳＦドメイン（ｖＩｇＤ）（Ｖ−Ｍａｂ）の活性の例示的な概略図を示し、そこでは、該抗体（例えば、抗ＨＥＲ２抗体）は腫瘍細胞の表面の抗原に結合してｖＩｇＤを細胞に局在化する。図示のように、腫瘍細胞表面への抗体の結合は、腫瘍細胞表面上にｖＩｇＤを局在化させ、そこでは、ｖＩｇＤは隣接する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の表面に発現する１つまたは複数のそのコグネイト結合パートナーと相互作用することができ、受容体シグナル伝達を作動させるか、またはそれに拮抗する。示される例示的な実施形態では、バリアントＩｇＳＦドメイン（ｖＩｇＤ）は、阻害性受容体ＣＴＬＡ−４に対して結合する（例えば、親和性が増加した）ＣＤ８０のＩｇＳＦドメインのバリアントである。ＣＤ８０ｖＩｇＤのＣＴＬＡ−４阻害性受容体への結合は、阻害性受容体の負のシグナル伝達に拮抗またはこれを遮断し、これにより、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞が得られる。場合によっては、阻害性受容体（ＣＴＬＡ−４）のクラスタリングが活性化受容体（例えば、ＣＤ２８）に近接する場合、ＴＩＰによる阻害性受容体活性の作動が実現する場合がある。バリアントＩｇＳＦ抗体コンジュゲート（Ｖ−Ｍａｂ）の様々な例示的な配置を示す。バリアントＩｇＳＦドメインが、抗体の軽鎖のＮ末端及び／またはＣ末端に直接的または間接的に連結する様々な配置を示す。バリアントＩｇＳＦ抗体コンジュゲート（Ｖ−Ｍａｂ）の様々な例示的な配置を示す。バリアントＩｇＳＦドメインが、抗体の重鎖のＮ末端及び／またはＣ末端に直接的または間接的に連結する様々な配置を示す。バリアントＩｇＳＦ抗体コンジュゲート（Ｖ−Ｍａｂ）の様々な例示的な配置を示す。図８Ａの軽鎖及び図８Ｂの重鎖が細胞内で共発現される場合の結果のＶ−Ｍａｂ配置を示す。例示的なＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃバリアントの細胞表面発現ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８及びＣＴＬ４４リガンドへの結合を示す。例示的なＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃバリアントによって誘導されるＪｕｒｋａｔ／ＩＬ−２レポーター系統における用量依存のＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激を示す。例示的なＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃバリアントにより誘導されるＰＤ−Ｌ１依存性共刺激に続くヒト初代Ｔ細胞サイトカイン産生を示す。例示的なＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ候補がＰＤ−Ｌ１に結合し、蛍光コンジュゲートしたＰＤ−１結合を遮断する能力を示す。例示的なバリアントＣＤ８０−ＦｃバリアントのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用及びその後の機能的活性拮抗的活性を示す。野生型ＩｇＧ１Ｆｃ（ＷＴＦｃ）または不活性ＩｇＧ１Ｆｃ（不活性Ｆｃ）に融合した例示的なバリアントＣＤ８０ポリペプチドのｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す。５０μｇ、１００μｇ、及び５００μｇの例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）及び１００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体（デュルバルマブ）による処置後のマウスモデルの腫瘍体積の中央値（左パネル）及び平均値（右パネル）を示す。５０μｇ、１００μｇ、及び５００μｇの例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）及び１００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体（デュルバルマブ）によるｉｎｖｉｖｏ処置後のｈＰＤ−Ｌ１ＭＣ３８腫瘍溶解液中のＩＦＮγの濃度を示す。複数の例示的なＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）バリアント及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体（デュルバルマブ）による処置後のマウスモデルの腫瘍体積の中央値（左パネル）及び平均値（右パネル）を示す。例示的なＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）バリアント及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体（デュルバルマブ）による処置後に腫瘍なしと指定された、ｈｕＰＤ−Ｌ１／ＭＣ３８腫瘍細胞による再刺激後のマウスにおける腫瘍体積の中央値（左パネル）及び平均値（右パネル）を示す。生きたＣＤ４５陰性（ＣＤ４５陰性；ＣＤ４５−）腫瘍細胞の単一細胞懸濁液でのフローサイトメトリーによる結合陰性対照Ｆｃ、ＣＤ８０バリアント−Ｆｃ、及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体の検出を示す。例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体（デュルバルマブ）による処置後のマウスモデルにおける腫瘍体積の中央値（左パネル）及び平均値（右パネル）を示す。Ａ及びＢは、陰性対照Ｆｃ、ＣＤ８０バリアント−Ｆｃ、及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体で処置したマウスの腫瘍流入領域リンパ節（Ａ）及び腫瘍（Ｂ）でのフローサイトメトリーにより検出されたＣＤ８細胞の割合（％）を示す。Ｃは、陰性対照Ｆｃ、ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ、及びヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体によりｉｎｖｉｖｏで処置したＣＤ４５陰性腫瘍上の抗ヒトＦｃ検出試薬の割合（％）を表す。ｈｕＰＤ−Ｌ１形質導入ＭＣ３８腫瘍細胞に対してあるが、非形質導入親ＭＣ３８に対してではない、ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃバリアントの特異的細胞傷害活性を示し、ｈｕＰＤＬ１の特異的殺傷を示す。ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃバリアントの初代ヒトＴ細胞への結合を示す。ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃバリアントの初代ヒト単球への結合を示す。酵素相補アッセイを用いたＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１媒介性ＳＨＰ−２動員のＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃバリアント拮抗作用を示す。ＣＤ８０／ＣＴＬＡ−４結合のＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃバリアント拮抗作用を示す。

詳細な説明
本明細書では、少なくとも１つの標的リガンドコグネイト結合パートナー（カウンター構造体リガンドタンパク質とも呼ばれる）に対する変化した結合活性または親和性を示すＣＤ８０及びその特異的結合断片のバリアントまたは変異体であるか、それらを含有する免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、非改変または野生型ＣＤ８０ポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換、欠失、または付加）を含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、非改変または野生型ＣＤ８０ポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、非改変または野生型ＣＤ８０ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）においてである。

いくつかの実施形態では、結合親和性及び／または結合選択性などの結合活性の変化、例えば、結合親和性または選択性の増加または減少は、少なくとも１つの結合パートナータンパク質ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４に対する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数の改変を含まない、非改変または野生型ＣＤ８０と比較して、ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４のうちの１つまたは複数に対する結合活性または親和性の増加または減少などの変化を示す。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数の改変を含まない、非改変または野生型ＣＤ８０と比較して、ＣＴＬＡ−４及び／またはＰＤ−Ｌ１に対して増加した結合親和性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数の改変を含まない、非改変または野生型ＣＤ８０と比較して、ＣＤ２８に対して減少した結合親和性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数の改変を含まない、非改変または野生型ＣＤ８０と比較して、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１の一方または両方に対する結合親和性の増加、ならびにＣＤ２８に対する結合親和性の減少を示す。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数の改変を含まない、非改変または野生型ＣＤ８０の、ＣＤ２８と比べたＣＴＬＡ−４への結合の選択性と比較して、ＣＤ２８と比べたＣＴＬＡ−４への結合の選択性の増加を示す。選択性の増加は、非改変または野生型ＣＤ８０の、ＣＴＬＡ−４への結合の、ＣＤ２８への結合に対する比率、例えば結合親和性の比率と比較した、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの、ＣＴＬＡ−４への結合の、ＣＤ２８への結合に対するより大きな比率、例えば結合親和性のより大きな比率として特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、比率は、１．２倍、１．５倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、１０．０倍、１５．０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍もしくはそれ以上大きく、または約１．２倍、約１．５倍、約２．０倍、約３．０倍、約４．０倍、約５．０倍、約６．０倍、約７．０倍、約８．０倍、約９．０倍、約１０．０倍、約１５．０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍もしくはそれ以上大きく増加する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数の改変を含まない、非改変または野生型ＣＤ８０の、ＣＤ２８と比べたＰＤ−Ｌ１への結合の選択性と比較して、ＣＤ２８と比べたＰＤ−Ｌ１への結合の選択性の増加を示す。選択性の増加は、非改変または野生型ＣＤ８０の、ＰＤ−Ｌ１への結合の、ＣＤ２８への結合に対する比率、例えば結合親和性の比率と比較した、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの、ＰＤ−Ｌ１への結合の、ＣＤ２８への結合に対するより大きな比率、例えば結合親和性のより大きな比率として特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、比率は、１．２倍、１．５倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、１０．０倍、１５．０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍もしくはそれ以上大きく、または約１．２倍、約１．５倍、約２．０倍、約３．０倍、約４．０倍、約５．０倍、約６．０倍、約７．０倍、約８．０倍、約９．０倍、約１０．０倍、約１５．０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍もしくはそれ以上大きく増加する。

いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、可溶性である。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、細胞の表面に発現できる膜貫通型免疫調節タンパク質である。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、それが発現される細胞から分泌されることができる分泌可能な免疫調節タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び１つまたは複数の他の部分またはポリペプチドを含有するコンジュゲートまたは融合体である１つまたは複数の他の免疫調節タンパク質も本明細書において提供される。いくつかの態様では、膜貫通型免疫調節タンパク質または分泌可能な免疫調節タンパク質を含有する操作された細胞が提供される。いくつかの態様では、感染性物質であって、発現のために膜貫通型免疫調節タンパク質または分泌可能な免疫調節タンパク質を感染性物質が感染する細胞に送達できる感染性物質が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び１つまたは複数の他の部分またはポリペプチドを含有するコンジュゲートまたは融合体である１つまたは複数の他の免疫調節タンパク質も本明細書において提供される。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチド及び免疫調節タンパク質は、免疫応答の増加または減少などの免疫学的免疫応答を調節する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び免疫調節タンパク質は、免疫応答の調節不全に関連する疾患または状態の治療に使用することができる。

いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、共刺激シグナル伝達分子との相互作用を介してＴ細胞の活性化、拡大、分化、及び生存を調節する。概して、抗原特異的Ｔ細胞の活性化には、一般的に２つの異なるシグナルが必要である。第１のシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）関連抗原とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の相互作用によって提供される。第２のシグナルは、ＴＣＲ関与に対する共刺激、例えばＣＤ２８共刺激シグナルであり、Ｔ細胞のアポトーシスまたはアネルギーを避けるために必要である。

いくつかの実施形態では、通常の生理的条件下では、Ｔ細胞媒介性免疫応答は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による抗原認識によって開始され、共刺激シグナル及び阻害性シグナルのバランスによって調節される（例えば、免疫チェックポイントタンパク質）。免疫システムは、免疫チェックポイントに依存して自己免疫（すなわち、自己寛容）を防ぎ、免疫応答時、例えば病原性感染に対する攻撃時に過度の損傷から組織を保護する。しかしながら、場合によっては、これらの免疫調節タンパク質は、免疫系を回避するためのメカニズムとして、腫瘍を含む疾患及び状態で調節不全になり得る。

いくつかの実施形態では、既知のＴ細胞共刺激受容体の中にはＣＤ２８があり、これは、ＡＰＣに両方とも存在するリガンドＢ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）のＴ細胞共刺激受容体である。これらの同じリガンドは、ＣＤ２８よりも高い親和性で阻害性Ｔ細胞受容体ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）にも結合できる；ＣＴＬＡ４への結合は、免疫応答を下方調節するように作用する。

いくつかの実施形態では、ＣＤ８０は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合することができる。ＣＤ８０は、ＣＤ２８に関してＰＤ−Ｌ１と同様の親和性を有する。ＰＤ−Ｌ１は、阻害性免疫受容体、プログラム死１（ＰＤ−１）の２つのリガンドの１つである。ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の相互作用は、Ｔ細胞の不活性化を促進し、Ｔ細胞の活性を下方調節することにより、免疫活性を負に調節する。Ｔ細胞のＰＤ−１発現は、Ｔ細胞の過剰活性を防ぐ戦略として、Ｔ細胞が活性化された後に誘導され得る。多くの腫瘍細胞は表面にＰＤ−Ｌ１を発現し、潜在的にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用、及び腫瘍に対するＴ細胞応答の阻害をもたらす。ＣＤ８０のＰＤ−Ｌ１への結合は、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の間の相互作用を遮断でき、これにより、例えば腫瘍部位でのＴ細胞応答の阻害を防ぎ、免疫応答を効果的に増強または高める。しかしながら、同時に、ＣＤ８０はまた、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４受容体に結合し、Ｔ細胞応答の誘導または阻害に関与する可能性もあり得る。したがって、場合によっては、ＣＤ８０と、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８、及びＣＴＬＡ−４との相互作用により、重複した補完的な効果を得ることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８及びＰＤ−Ｌ１は、免疫応答のモデリングにおいて補完的な役割を果たす可能性がある。

いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、阻害性受容体ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１負の調節複合体及び／または共刺激受容体ＣＤ２８によって誘導またはこれらと関連する免疫学的活性を調節する（例えば、増加または減少させる）。例えば、いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ８０ポリペプチド、例えば、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドの可溶性形態は、ＣＴＬＡ−４阻害性受容体と結合し、ＡＰＣ上で発現されるＣＤ８０とのその相互作用を遮断し、これにより、図２に示すように、ＣＤ８０が結合したＣＴＬＡ−４受容体の負の調節シグナル伝達を防ぐ。いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ８０ポリペプチド、例えば、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドの可溶性形態は、腫瘍細胞またはＡＰＣ上のＰＤ−Ｌ１と結合することができ、これにより、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１阻害性受容体の相互作用を遮断し、これにより、さもなければＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用から得られたであろう負の調節シグナル伝達を防ぐ。いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ８０ポリペプチド、例えば、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドの可溶性形態は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断しながら、局在化したＴ細胞上のＣＤ２８受容体と結合及びそれを共刺激し、これにより、免疫応答を促進する（図３Ａ）。いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ８０ポリペプチド、例えば、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドの可溶性形態は、Ｂ７／ＣＴＬＡ−４結合に拮抗することができ、ＣＴＬＡ−４阻害性シグナル伝達を防止し、ＴＣＲシグナル伝達閾値を低下させ、これにより、Ｔ細胞活性化及び免疫応答を促進する（図３Ｂ）。いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ８０バリアントポリペプチドは、免疫活性をさらに調節するために他の免疫調節ポリペプチドとスタックもしくは結合することができる（図４）、または免疫活性を局在化するために標的分子と束ねるもしくはコンジュゲートとすることができる（図５及び図７）。したがって、いくつかの実施形態では、提供されるポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４及び／またはＰＤ−Ｌ１の両方、場合によっては、ＣＤ２８に独立した結合親和性を持つバリアントＣＤ８０を提供することにより、これらの制約を克服し、これにより、受容体による共刺激の補完的効果を作動させるか、または拮抗させる。これらのバリアントＣＤ８０の作製及び使用方法も提供される。

また、提供されるバリアントポリペプチドの様々なフォーマットも提供される。本明細書に示されるように、別のフォーマットは、免疫応答の操作を促すことができ、したがって治療的に応用される。状況に応じてバリアントポリペプチドを様々な構成のフォーマットとし、免疫応答に拮抗またはこれを作動させる能力は、結合パートナーに対するバリアントＣＤ８０の同じ増加した結合及び活性に基づいて治療用途に柔軟性をもたらす。一例として、バリアントＣＤ８０タンパク質を表面につなぐと、局所化された共刺激シグナルを伝達できるが、他の場合、非局在化可溶性形態でＣＤ８０を提示すると、拮抗的活性が付与される。例えば、ＣＴＬＡ−４及び／またはＰＤ−Ｌ１への親和性が増加した可溶性フォーマットでの増強したＣＤ８０タンパク質の送達は、活性化刺激、例えば、ＣＤ３及び／またはＣＤ２８共刺激シグナルまたは分裂促進シグナルに対する応答を減少させるために起こり得る細胞内の阻害性シグナルを遮断するなど、阻害性受容体のシグナル伝達に拮抗することができる。場合によっては、この結果、免疫応答が増加する可能性がある。

加えて、ある種のフォーマットは、場合によっては、ＣＤ２８作動作用を媒介することもできる。場合によっては、ＣＤ２８作動作用は、ＰＤ−Ｌ１への結合の増加を示すある特定のバリアントＣＤ８０ポリペプチドによって媒介され、これによりＣＤ２８との相互作用のための免疫シナプス表面へのバリアントＣＤ８０分子のつなぎまたは架橋を促し、これにより共刺激シグナルをもたらすことにより、Ｔ細胞の活性化を促進する。ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激と本明細書で呼ばれるこの活性は、いくつかの態様では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドが非競合的様式で及び／またはバリアントＣＤ８０ポリペプチドの二量体フォーマットを提供することによって（例えば図３を参照）ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ８０の両方と結合する能力による。場合によっては、このようなＰＤ−Ｌ１依存性共刺激は、エフェクター機能を備えたＦｃを必要とせず、エフェクターなし、または不活性なＦｃ分子を含有するＦｃ融合タンパク質によって媒介され得る。いくつかの態様では、これに加えてまたはこれに代えて、つなぎまたは架橋も、バリアントＣＤ８０ポリペプチドがエフェクター機能を保持または示す免疫グロブリンの野生型Ｆｃ領域との融合タンパク質として提供される場合、Ｆｃ受容体を介して達成することができ、本明細書ではＦｃ受容体依存性ＣＤ２８共刺激と呼ばれる。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体の架橋により抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介性エフェクター機能が開始され得、これにより、ＣＴＬＡ−４発現細胞（例えばＣＴＬＡ−４発現Ｔ制御性細胞）またはＰＤ−Ｌ１発現細胞（例えばＰＤ−Ｌ１^ｈｉ腫瘍）などのコグネイト結合パートナーを発現する標的細胞の枯渇をもたらす。

これらの受容体の活性の増強または抑制は、炎症性及び自己免疫性障害、がん、及びウイルス感染の処置に臨床的意義を有する。しかしながら、場合によっては、両方の受容体の共刺激効果に介入してそれを変化させる治療法は、免疫学的シナプスの範囲によって課される空間配向要件に加えてサイズ制限によって制約される。いくつかの態様では、抗体薬を含む既存の治療薬は、これらの相互作用の調節に関与する複数の標的タンパク質と同時に相互作用できない場合がある。加えて、場合によっては、既存の治療薬は、免疫応答に拮抗するだけで、作動させる能力を持たない場合がある。加えて、これら２つの受容体の一方または他方を独立して標的とする薬物間の薬物動態の違いは、治療の過程を通してそのような薬物の組み合わせの所望の血中濃度を適切に維持するのに困難をもたらし得る。提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び免疫調節タンパク質、及び記載される他のフォーマットは、そのような問題に対処する。

本明細書で言及される特許、特許出願科学論文及びデータベースを含む全ての出版物は、特許、特許出願、科学論文またはデータベースを含む個々の出版物が参照によって組み込まれると具体的にかつ個別に示されるのと同程度に、あらゆる目的のためにそれら全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願、及び他の出版物に記載の定義に反する、または矛盾する場合、本明細書に記載の定義は、参照により本明細書に組み込まれる定義に優先する。

本明細書において使用されるセクションの見出しは、単に構成を目的としたものであって、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。

Ｉ．定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての専門用語、表記、ならびに他の技術及び科学用語または術語は、請求される主題が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有することを意図する。場合によっては、通常理解されている意味を有する用語は、明確化のため及び／またはすぐに参照できるように本明細書において定義され、そして本明細書におけるこのような定義の包含は、必ずしも一般的に当技術分野において理解されているものと大きな差異をなすと解釈されるべきではない。

本明細書を通して使用される用語は、特定の事例において別段限定されない限り、以下のとおり定義される。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上、別段の明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含む。別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語、頭字語、ならびに略語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。別段の指示のない限り、化学名及び生化学名の略称及び記号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法による。別段の指示のない限り、全ての数値範囲は、その範囲を規定する値だけでなくその間の全ての整数値も含む。

「親和性が改変された（親和性改変）」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインの文脈において使用される場合、親の野生型または非改変の（すなわち、非親和性改変）ＩｇＳＦ対照ドメインと比較してそのコグネイト結合パートナー（あるいは「カウンター構造体」）のうちの少なくとも１つに対する結合親和性または結合活性が増加または減少するように変化したアミノ酸配列（対応する野生型の親または非改変ＩｇＳＦドメインと比べて）を有する哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインを意味する。この文脈では、親和性改変ＣＤ８０ＩｇＳＦドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、親和性改変ＩｇＳＦドメインは、野生型または非改変ＩｇＳＦドメイン中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または以上のアミノ酸差異、例えばアミノ酸置換を含有することができる。結合親和性または結合活性の増加または減少は、フローサイトメトリーなどの周知の結合アッセイを使用して決定することができる。Ｌａｒｓｅｎｅｔａｌ．，ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ５：４４３−４５３（２００５）。Ｌｉｎｓｌｅｙｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ１（９：７９３−８０１（１９９４）も参照のこと。タンパク質のそのコグネイト結合パートナー（複数可）に対する結合親和性または結合活性の増加は、野生型ＩｇＳＦドメイン対照よりも少なくとも１０％大きい値となり、いくつかの実施形態では、野生型ＩｇＳＦドメイン対照値よりも少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、３００％、５００％、１０００％、５０００％、または１００００％大きい値となる。タンパク質のそのコグネイト結合パートナーのうちの少なくとも１つに対する結合親和性または結合活性の減少は、対照の９０％以下であるが野生型ＩｇＳＦドメイン対照値の１０％以上の値となり、いくつかの実施形態では、野生型ＩｇＳＦドメイン対照値の８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、または２０％以下であるが１０％以上の値となる。親和性改変タンパク質は、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって一次アミノ酸配列が変化している。「親和性改変ＩｇＳＦドメイン」という用語は、親和性改変ＩｇＳＦドメインが作製される、いかなる特定の出発組成物または方法のいかなる条件も課すものと解釈されるべきではない。したがって、本発明の親和性改変ＩｇＳＦドメインは、任意の特定の親和性改変プロセスによって親和性改変ＩｇＳＦドメインへと変換された野生型ＩｇＳＦドメインに限定されない。親和性改変ＩｇＳＦドメインポリペプチドは、例えば、野生型哺乳動物ＩｇＳＦドメイン配列情報から開始して生成され、次いで、そのコグネイト結合パートナーに対する結合性についてｉｎｓｉｌｉｃｏでモデル化され、そして最後に組換えまたは化学合成されて、主題の親和性改変ＩｇＳＦドメイン組成物を得ることができる。しかし別の一例では、親和性改変ＩｇＳＦドメインは、野生型ＩｇＳＦドメインの部位特異的変異誘発によって作製することができる。したがって、親和性改変ＩｇＳＦドメインは、産物を意味するが、必ずしもいずれかの所与のプロセスによって産生される産物を意味するわけではない。組換え法、化学合成、またはその組み合わせを含む多種多様な技術を用いてもよい。

「同種（の）」という用語は、本明細書において使用される場合、ある生物から取り出され、次いで同じ種の遺伝的に異なる生物に注入または養子移入される、細胞または組織を意味する。本発明のいくつかの実施形態では、種は、ネズミまたはヒトである。

「自家（の）」という用語は、本明細書において使用される場合、同じ生物から取り出され、後に該生物に注入または養子移入される、細胞または組織を意味する。自家の細胞または組織を、例えば、組換えＤＮＡ法によって、生物から取り出される天然の細胞または天然の組織とはもはや遺伝的に同一ではないように変化させることができる。例えば、天然の自家Ｔ細胞を、膜貫通型免疫調節タンパク質及び／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する自家の操作された細胞となるように組換えＤＮＡ技術によって遺伝子操作することができ、これは、場合によっては、Ｔ細胞またはＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）を操作することを伴う。次いで、操作された細胞を、天然のＴ細胞が単離された患者へ注入する。いくつかの実施形態では、生物は、ヒトまたはネズミである。

「結合親和性」及び「結合活性」という用語は、本明細書において使用される場合、それぞれ、特異的結合条件下での、あるタンパク質のそのカウンター構造体に対する、特異的結合親和性及び特異的結合活性を意味する。生化学動態では、結合活性は、ＣＤ８０とそのカウンター構造体ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８、及び／またはＣＴＬＡ−４との間のような、個々の非共有結合相互作用の複数の親和性の累積強度を指す。そのため、結合活性は、単一の相互作用の強度を表す親和性とは異なる。親和性が改変されたＣＤ８０ＩｇＳＦドメインを含有するバリアントＣＤ８０のそのカウンター構造体に対する結合親和性の増加または減弱化は、非改変ＣＤ８０（例えば、天然または野生型ＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶドメイン）を含有する非改変ＣＤ８０）の結合親和性と比較して決定される。結合親和性または結合活性を決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｌａｒｓｅｎｅｔａｌ．，ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ５：４４３−４５３（２００５）を参照のこと。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０（例えば、親和性改変ＩｇＳＦドメインを含有する）は、フローサイトメトリーによって測定され、実施例６に記載される結合アッセイにおいて非改変ＣＤ８０対照よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％より大きい平均蛍光強度（ＭＦＩ）値をもたらす結合親和性でＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＴＬＡ−４に特異的に結合する。

「生物学的半減期」という用語は、ある物質（例えば、本発明のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する免疫調節ポリペプチド）が、その薬理学的もしくは生理学的活性または濃度の半分を喪失するのに要する時間を指す。生物学的半減期は、物質の排除、排出、分解（例えば、酵素的）、または体の特定の臓器もしくは組織における吸収及び濃縮によって影響を受け得る。いくつかの実施形態では、生物学的半減期は、物質の血漿中濃度がその定常状態レベルの半分に達するのに要する時間（「血漿半減期」）を決定することによって評価することができる。本発明のポリペプチドを誘導体化してその生物学的半減期を延長するために使用することができるコンジュゲートは、当技術分野において公知であり、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ＸＴＥＮ（伸長組換えペプチド；ＷＯ２０１３１３０６８３を参照のこと）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脂質（アシル化）、及びポリ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ＰＡＳ）、ポリグルタミン酸（グルタミル化）を含む。

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、本明細書において使用される場合、少なくともエクトドメイン、膜貫通、及びエンドドメインを含む、哺乳動物細胞上に発現する人工の（すなわち、人造の）膜貫通型タンパク質を指す。任意で、ＣＡＲタンパク質は、エクトドメインを膜貫通ドメインに共有結合的に連結する「スペーサー」を含む。スペーサーは、多くの場合、ペプチド結合を介してエクトドメインを膜貫通ドメインに連結するポリペプチドである。ＣＡＲは、典型的には、哺乳動物リンパ球上に発現する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｔ細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの哺乳動物細胞上に発現する。Ｔ細胞上に発現するＣＡＲは、本明細書において「ＣＡＲＴ細胞」または「ＣＡＲ−Ｔ」と称される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔは、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、またはγδＴ細胞である。例えば養子細胞移入において臨床的に使用される場合、患者の腫瘍に対する抗原結合特異性を有するＣＡＲ−Ｔは、典型的には、患者から得られる天然Ｔ細胞上に発現するように操作されている。ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞は、次いで注入により患者に戻される。したがって、ＣＡＲ−Ｔは、多くの場合、自家ＣＡＲ−Ｔではあるが、同種ＣＡＲ−Ｔも本発明の範囲内に含まれる。ＣＡＲのエクトドメインは、生理的条件下で標的抗原（例えば、腫瘍特異的抗原）と特異的に結合する抗原結合領域（例えば、抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ））を含有する。特異的に結合すると、一連の生化学的事象（すなわち、シグナルトランスダクション）は、ＣＡＲ−Ｔの免疫活性の調節をもたらす。したがって、例えば、ＣＡＲ−Ｔの抗原結合領域によるその標的抗原への特異的結合によって、細胞傷害性、増殖、またはサイトカイン産生の変化によって反映されるように、Ｔ細胞活性の免疫活性の変化を導くことができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ活性化によるシグナルトランスダクションは、天然の哺乳動物Ｔ細胞におけるシグナルトランスダクションに関与するＣＤ３ζ鎖（「ＣＤ３−ｚ」）によって達成される。ＣＡＲ−Ｔは、Ｔ細胞の免疫調節応答をさらに調節する複数のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、またはＯＸ４０）をさらに含有することができる。ＣＤ３−ｚは、Ｔ細胞受容体シグナルトランスダクションに関与する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られている保存されたモチーフを含有する。

「総合して」または「総合的」という用語は、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおいて２つ以上のバリアントＣＤ８０ポリペプチドの存在によって誘導されるサイトカイン産生に関して使用される場合、個々のバリアントＣＤ８０ポリペプチドによって誘導されるサイトカイン産生に関係なく、サイトカイン発現レベル全体を意味する。いくつかの実施形態では、アッセイされるサイトカインは、例えば実施例７に記載されるｉｎｖｉｔｒｏ初代Ｔ細胞アッセイにおけるＩＦＮ−γである。

「コグネイト結合パートナー」という用語（「カウンター構造体」と互換的に使用される）は、ポリペプチド（例えば、バリアントＣＤ８０のＩｇＳＦドメイン）に関して、言及されているポリペプチドが特異的結合条件下で特異的に結合する少なくとも１つの分子（典型的には、天然の哺乳動物タンパク質）を指す。いくつかの態様では、親和性改変ＩｇＳＦドメインを含有するバリアントＣＤ８０は、対応する天然または野生型ＣＤ８０のカウンター構造体に特異的に結合するが、増加または減弱化した親和性で結合する。特異的結合条件下で認識されてそのコグネイト受容体に特異的に結合するリガンドの一種は、その受容体のカウンター構造体またはコグネイト結合パートナーの一例である。「細胞表面コグネイト結合パートナー」は、哺乳動物細胞表面上に発現するコグネイト結合パートナーである。「細胞表面分子種」は、免疫学的シナプス（ＩＳ）を形成する細胞（例えば、哺乳動物細胞）上に発現する及び該細胞によって発現する、免疫学的シナプスのリガンドのコグネイト結合パートナーである。

本明細書において使用される場合、「コンジュゲート」、「コンジュゲーション」またはそれらの文法上の変形は、当技術分野において公知の任意の接続または連結法によって、２つ以上の化合物を一緒に接続または連結して、別の化合物の形成をもたらすことを指す。それはまた、２つ以上の化合物を一緒に接続または連結することによって生成される化合物を指すこともできる。例えば、１つまたは複数の化学部分またはポリペプチドに直接的または間接的に連結されたバリアントＣＤ８０ポリペプチドが例示的なコンジュゲートである。そのようなコンジュゲートは、融合タンパク質、化学的コンジュゲートによって産生されるもの、及び任意の他の方法によって産生されるものを含む。

「競合的結合」という用語は、本明細書において使用される場合、あるタンパク質が、少なくとも２種のコグネイト結合パートナーに特異的に結合することができるが、１つのコグネイト結合パートナーの特異的結合が第２のコグネイト結合パートナーの同時結合を阻害する（例えば、防止するまたは妨げる）ことを意味する。したがって、場合によっては、あるタンパク質は、２つのコグネイト結合パートナーに同時に結合することはできない。一般的に、競合結合物は、特異的結合のための同じまたは重複した結合部位を含有するが、これは必須要件ではない。いくつかの実施形態では、競合的結合は、第２のコグネイト結合パートナーの特異的結合に起因して、そのコグネイト結合パートナーの１つへのタンパク質の特異的結合の測定可能な（部分的または完全な）阻害を引き起こす。ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）アッセイなどの競合的結合を定量する多種多様な方法が公知である。

「保存的アミノ酸置換」という用語は、本明細書において使用される場合、あるアミノ酸残基が類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を備える側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によって置換されている、アミノ酸置換を意味する。類似の化学特性を備える側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、ならびに、７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換の群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。

タンパク質の位置に関して「対応する」という用語、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置が、例えば配列表に記載の開示された配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置に「対応する」という記述は、構造配列アラインメントに基づいてまたは標準的なアラインメントアルゴリズム（例えば、ＧＡＰアルゴリズム）を使用して、開示された配列とのアラインメントによって特定される、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を指す。例えば、本明細書に記載される構造アラインメント法による、ＳＥＱＩＤＮＯ：２（ＥＣＤドメイン）に記載された、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７６、３０３０または３０３１（ＩｇＶドメイン）に記載の野生型ＣＤ８０の配列を有する参照配列のアライメントによって、対応する残基を決定することができる。配列をアライメントすることによって、当業者は、例えば保存されているアミノ酸残基及び同一のアミノ酸残基を、基準として使用して、対応する残基を特定することができる。

「低下（減少）させる」または「減弱（化）する」または「抑制する」という用語は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量の低下（減少）を意味する。低下（減少）は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であることができる。

「誘導体」または「誘導体化されている」という用語は、その治療効果を保持または増強させながら、生物学的半減期、バイオアベイラビリティ、免疫原性、溶解性、毒性、効力、または有効性などの特性を変化させるために、タンパク質を直接または間接的に組成物に共有結合的に連結させることによる、タンパク質の改変を指す。本発明の免疫調節ポリペプチドの誘導体は、本発明の範囲内であり、例えば、グリコシル化、ＰＥＧ化、脂質化、またはＦｃ融合によって作製することができる。

本明細書において使用される場合、検出は、タンパク質の可視化（目または機器による）を可能にする方法が含まれる。タンパク質は、そのタンパク質に特異的な抗体を使用して可視化できる。タンパク質の検出はまた、検出可能な標識を含むタグとタンパク質の融合によって、または検出可能な標識を含む二次抗体などのタンパク質に特異的な第２の試薬との接触によっても促され得る。

本明細書において使用される場合、ドメイン（典型的には、３以上、一般的に５または７以上のアミノ酸、例えば１０〜２００のアミノ酸残基の配列）は、分子の他の部分と構造的及び／または機能的に異なりかつ特定可能な分子（例えば、タンパク質またはコーディング核酸）の一部分を指す。例えば、ドメインは、１つまたは複数の構造モチーフで構成されているタンパク質内で独立してフォールド構造を形成することができ、及び／または結合活性などの機能活性によって認識される、ポリペプチド鎖の部分を含む。タンパク質は、１つ、または２つ以上の別個のドメインを有することができる。例えば、ドメインは、関連ファミリーメンバーに対する一次配列または構造の相同性、例えばモチーフに対する相同性によって、特定、定義、または識別することができる。別の例では、ドメインは、その機能（例えば、コグネイト結合パートナーなどの生体分子と相互作用する能力）によって識別することができる。ドメインが独立してまたは別の分子に融合して活動する（例えば、結合）ことができるように、ドメインは、独立して生物学的機能または活性を示すことができる。ドメインは、線状アミノ酸配列または非線状アミノ酸配列であることができる。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含有する。このようなドメインは、公知であり、かつ、当業者によって特定することができる。本明細書における例示のため、定義が提供されるが、名称によって特定のドメインを認識することは十分に当技術分野の技能の範囲内であると理解される。必要であれば、ドメインを特定するために適切なソフトウェアを用いることができる。

「エクトドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、膜タンパク質（例えば、膜貫通型タンパク質）の、小胞膜の外側にある領域を指す。エクトドメインは、多くの場合、リガンドまたは細胞表面受容体に、例えば当該リガンドまたは当該細胞表面受容体に特異的に結合する結合ドメインを介して特異的に結合する結合ドメインを含む。細胞の膜貫通型タンパク質のエクトドメインは、代替的に細胞外ドメインと称される。

「有効量」または「治療的有効量」という用語は、単独（すなわち、単剤療法として）または追加の治療用物質との組み合わせのいずれかでｅｘｖｉｖｏ（患者由来の細胞との接触による）またはｉｎｖｉｖｏ（患者への投与による）で投与された場合、例えば疾患の症状及び／または病因を改善または排除することによって疾患進行の統計的に有意な減少をもたらす、本発明の治療用組成物（タンパク質組成物または細胞組成物を含む）の量及び／または濃度を指す。有効量は、疾患または障害と関連する少なくとも１つの症状または生物学的応答もしくは影響を緩和する、低下させる、または軽減する、疾患もしくは障害の進行を防止する、または患者の身体機能を改善する量であり得る。細胞療法の場合、有効量は、養子細胞療法により患者に投与される細胞の有効用量または有効数である。いくつかの実施形態では、患者は、哺乳動物、例えば非ヒト霊長類またはヒト患者である。

「エンドドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、いくつかの膜タンパク質（例えば、膜貫通型タンパク質）において見いだされる、細胞表面膜によって画定される内部空間内に延びる領域を指す。哺乳動物細胞では、エンドドメインは、膜タンパク質の細胞質領域である。細胞では、エンドドメインは、細胞内構成成分と相互作用し、かつシグナルトランスダクションにおいて役割を果たすことができ、したがって、場合によっては、細胞内シグナル伝達ドメインであることができる。細胞の膜貫通型タンパク質のエンドドメインは、代替的に細胞質ドメインと称され、これは、場合によっては、細胞質シグナル伝達ドメインであることができる。

「増強された」または「増加（向上）した」という用語は、本明細書において哺乳動物リンパ球の免疫活性の増加の文脈で使用される場合、リンパ球の１つまたは複数の活性の増加を意味する。活性の増加は、例えば統計的に有意な量などでの、細胞生存、細胞増殖、サイトカイン産生、またはＴ細胞の細胞傷害性のうちの１つまたは複数の増加であり得る。いくつかの実施形態では、増加した免疫活性への言及は、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生を、例えば統計的に有意な量、増加させることを意味する。いくつかの実施形態では、免疫活性を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて評価することができる。ＭＬＲアッセイを実行する方法は、当技術分野において公知である。Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ．２０１４Ｓｅｐ：２（９）：８４６−５６。リンパ球の活性を評価する他の方法は、本明細書に記載される任意のアッセイを含め、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、増強は、非ゼロ対照値よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％大きい増加であることができる。

「操作された細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒトによる介入（例えば、組換えＤＮＡ法またはウイルス形質導入法）によって遺伝子操作された哺乳動物細胞を指す。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えばリンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）または抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。細胞は、患者由来の初代細胞であってもよいし、細胞株であってもよい。いくつかの実施形態では、本発明の操作された細胞は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドが特異的に結合するＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＴＬＡ−４を発現するＴ細胞、またはＰＤ−Ｌ１を発現するＡＰＣの免疫活性を調節するように操作された本発明のバリアントＣＤ８０を含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０は、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８０膜貫通ドメイン）に連結されたＩｇＶドメインを含有する細胞外ドメインまたはその一部分を含有し、任意で細胞内シグナル伝達ドメインを含有する、膜貫通型免疫調節タンパク質（以下「ＴＩＰ」と称される）である。場合によっては、ＴＩＰは、異種の細胞質シグナル伝達ドメインまたはエンドドメインを含有するキメラ受容体としてフォーマットされる。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、本明細書に記載される免疫調節タンパク質を発現及び分泌することができる。提供される操作された細胞の中には、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含有する細胞もある。

「操作されたＴ細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒトによる介入（例えば、組換えＤＮＡ法またはウイルス形質導入法）によって遺伝子操作されたＴ細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（あるいは、細胞傷害性Ｔリンパ球またはＣＴＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはγδＴ細胞）を指す。操作されたＴ細胞は、本発明のバリアントＣＤ８０膜貫通型免疫調節タンパク質（ＴＩＰ）または分泌型免疫調節タンパク質（ＳＩＰ）を含有し、本発明のバリアントＣＤ８０膜貫通型免疫調節タンパク質（ＴＩＰ）または分泌型免疫調節タンパク質（ＳＩＰ）は、該Ｔ細胞上に発現し、操作されたＴ細胞自体の免疫活性を調節するか、または該Ｔ細胞上に発現するバリアントＣＤ８０が特異的に結合する哺乳動物細胞の免疫活性を調節するように操作される。

「操作されたＴ細胞受容体」または「操作されたＴＣＲ」という用語は、選択され、クローニングされ、及び／またはその後Ｔ細胞の集団に導入される（多くの場合、養子免疫療法に使用される）、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）／ペプチド標的抗原に対して所望の親和性で特異的に結合するように操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を指す。操作されたＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、ＭＨＣ依存的に標的抗原と結合するように操作される。

「〜上に発現する」という用語は、本明細書において使用される場合、細胞（例えば哺乳動物細胞）の表面に発現するタンパク質に関して使用される。したがって、当該タンパク質は膜タンパク質として発現する。いくつかの実施形態では、発現する当該タンパク質は、膜貫通型タンパク質である。いくつかの実施形態では、当該タンパク質は、小分子部分（例えば、薬物または検出可能標識）にコンジュゲートされる。細胞の表面に発現するタンパク質は、哺乳動物細胞上に発現する細胞表面タンパク質（例えば細胞表面受容体）を含むことができる。

「半減期延長部分」という用語は、ポリペプチド融合体または化学的コンジュゲートの一部分であって、そのように該部分にコンジュゲートされていないタンパク質の半減期と比較して、哺乳動物血清中に循環するタンパク質の半減期を延長する部分を指す。いくつかの実施形態では、半減期は、１．２倍、１．５倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、もしくは６．０倍より長く、または約１．２倍、約１．５倍、約２．０倍、約３．０倍、約４．０倍、約５．０倍、もしくは約６．０倍より長く延長される。いくつかの実施形態では、半減期は、半減期延長部分を有さないタンパク質と比較して、ｉｎｖｉｖｏ投与後、６時間超、１２時間超、２４時間超、４８時間超、７２時間超、９６時間超、または１週間超延長される。半減期は、タンパク質がその濃度、量、または活性の半分を喪失するのに要する時間を指す。半減期は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたは活性アッセイを使用することによって決定することができる。例示的な半減期延長部分には、Ｆｃドメイン、多量体化ドメイン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ＸＴＥＮ（伸長組換えペプチド；ＷＯ２０１３１３０６８３を参照のこと）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脂質（アシル化）、及びポリ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ＰＡＳ）、及びポリグルタミン酸（グルタミル化）が含まれる。

「免疫学的シナプス」または「免疫シナプス」という用語は、本明細書において使用される場合、ＭＨＣＩ（主要組織適合複合体）またはＭＨＣＩＩを発現する哺乳動物細胞（例えば、抗原提示細胞または腫瘍細胞）と、哺乳動物リンパ球（例えば、エフェクターＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）との間の界面を意味する。

免疫グロブリン分子のＦｃ（結晶性断片）領域またはドメイン（Ｆｃポリペプチドとも呼ばれる）は、主に免疫グロブリン重鎖の定常領域に相当し、抗体のエフェクター機能（複数可）を含む様々な機能に関与している。Ｆｃドメインは、免疫グロブリン分子のヒンジドメインの一部分または全てとＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとを含有する。Ｆｃドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって接続された２つのポリペプチド鎖の二量体を形成することができる。例示的な二量体化ポリペプチドを図６Ａ及び６Ｂに示す。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、エフェクター機能を促す活性が低減された（例えば、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、またはそれ以上低減された）バリアントＦｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域中のアミノ酸置換への参照は、特定のＳＥＱＩＤＮＯ：に基づいて記載されない限りは、ＥＵ番号付けシステムによる。ＥＵ番号付けは公知であり、最近更新されたＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ（ＩＭＧＴ（登録商標）、すなわちｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html（作成日：２００１年５月１７日、最終更新日：２０１３年１月１０日）及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔａｌ．ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈｅｄ．ＵＳＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１−３２４２（１９９１）に報告されているＥＵインデックスに従う。

免疫グロブリンＦｃ融合体（「Ｆｃ融合体」）、例えば免疫調節Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域に作動可能に連結された１つまたは複数のポリペプチド（または１つまたは複数の小分子）を含む分子である。Ｆｃ融合体は、例えば抗体のＦｃ領域（薬物動態を促す）及びバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含み得る。免疫グロブリンＦｃ領域は、１つまたは複数のバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは小分子（融合パートナー）に間接的または直接的に連結され得る。様々なリンカーが当技術分野において公知であり、任意でこれを使用して、Ｆｃを融合パートナーに連結させてＦｃ融合体を生成することができる。同一種のＦｃ融合体を、二量体化してＦｃ融合ホモ二量体を形成することも、非同一種を使用してＦｃ融合ヘテロ二量体を形成することもできる。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、哺乳動物Ｆｃ、例えばネズミ、ウサギまたはヒトＦｃである。

「宿主細胞」という用語は、組換え発現ベクターによってコードされているタンパク質を発現させるために使用することができる細胞を指す。宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）であってよく、または真核生物、例えば単細胞真核生物（例えば酵母または他の真菌類）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えばヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）、またはハイブリドーマであってよい。宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはそれらの誘導体、例えば無血清培地で成長するＶｅｇｇｉｅＣＨＯ、ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ、もしくはＣＨＯＺＮ及び関連細胞株またはＤＨＦＲ欠損したＣＨＯ系統ＤＸ−Ｂ１１が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）であってよい。

「免疫グロブリン」という用語（「Ｉｇ」と略記される）は、本明細書において使用される場合、５種のヒトクラスの抗体、すなわちＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む）、及びＩｇＭのいずれかを含む哺乳動物免疫グロブリンタンパク質を指す。該用語はまた、完全または部分的合成（例えば、組換えまたは化学合成）であろうと天然に産生されようと完全長未満である免疫グロブリン、例えば抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌを含有する可変断片（Ｆｖ）、１つの鎖中で一緒に連結されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含有する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ならびに他の抗体Ｖ領域断片、例えば、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆ（ａｂ′）_２、ｄｓＦｖダイアボディ、Ｆｃ、及びＦｄポリペプチド断片を含む。ホモ二重特異性及びヘテロ二重特異性の二重特異性抗体は、該用語の意味の範囲内に含まれる。

「免疫グロブリンスーパーファミリー」または「ＩｇＳＦ」という用語は、本明細書において使用される場合、細胞の、認識、結合、または接着プロセスに関与する、細胞表面及び可溶性タンパク質の群を意味する。分子は、免疫グロブリン（すなわち、抗体）と共通の構造的特徴に基づいて、このスーパーファミリーのメンバーとして類別され、これらは全て、免疫グロブリンドメインまたはフォールドとして公知のドメインを保有する。ＩｇＳＦのメンバーは、免疫系の、細胞表面抗原受容体、共受容体及び共刺激分子、リンパ球への抗原提示に関与する分子、細胞接着分子、ある種のサイトカイン受容体ならびに細胞内筋タンパク質を含む。これらは、通常、免疫系における役割と関連する。免疫学的シナプス中のタンパク質は、ＩｇＳＦのメンバーであることが多い。ＩｇＳＦはまた、機能のような共通の特性に基づいて「サブファミリー」に分類することができる。このようなサブファミリーは、典型的には、４〜３０のＩｇＳＦメンバーからなる。

「ＩｇＳＦドメイン」または「免疫グロブリンドメイン」または「Ｉｇドメイン」という用語は、本明細書において使用される場合、ＩｇＳＦタンパク質の構造ドメインを指す。Ｉｇドメインは、免疫グロブリン分子に因んで命名されている。これらは、約７０〜１１０アミノ酸を含有し、それらのサイズ及び機能に従って類別される。Ｉｇドメインは、逆平行β鎖の２つのシートによって形成されるサンドイッチ様構造を有する特徴的なＩｇフォールドを保有する。サンドイッチの内側の疎水性アミノ酸間の相互作用ならびにＢ及びＦ鎖中のシステイン残基間で形成される高度に保存されているジスルフィド結合が、Ｉｇフォールドを安定化させる。Ｉｇドメインの一端は、抗体のそれらのリガンドに対する特異性にとって重要な相補性決定領域と呼ばれる部分を有する。Ｉｇ様ドメインは、ＩｇＶ、ＩｇＣ１、ＩｇＣ２、またはＩｇＩとして（クラスに）分類することができる。ほとんどのＩｇドメインは、可変（ＩｇＶ）ドメインまたは定常（ＩｇＣ）ドメインのいずれかである。９つのβ鎖を有するＩｇＶドメインは、一般的に７つのβ鎖を有するＩｇＣドメインより長い。ＩｇＳＦのいくつかのメンバーのＩｇドメインは、アミノ酸配列中のＩｇＶドメインと似ているが、ＩｇＣドメインとサイズが類似している。これらは、ＩｇＣ２ドメインと呼ばれ、一方で、標準的なＩｇＣドメインは、ＩｇＣ１ドメインと呼ばれる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖は、細胞外部分における２つのＩｇドメイン（１つはＮ末端におけるＩｇＶドメイン及び１つは細胞膜に隣接するＩｇＣ１ドメイン）を含有する。ＣＤ８０は、２つのＩｇドメイン、すなわちＩｇＶ及びＩｇＣを含有する。

「ＩｇＳＦ種」という用語は、本明細書において使用される場合、同一のまたは実質的に同一の一次アミノ酸配列を有するＩｇＳＦメンバータンパク質の集団を意味する。各哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）メンバーは、そのＩｇＳＦメンバーに属する全てのＩｇＳＦ種に固有の識別を規定する。したがって、各ＩｇＳＦファミリーメンバーは、他のＩｇＳＦファミリーメンバーと比べて固有であり、したがって、特定のＩｇＳＦファミリーメンバーの各種は、別のＩｇＳＦファミリーメンバー種と比べて固有である。それにもかかわらず、同じＩｇＳＦ種の分子間の相違が、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、及び脂質化などの翻訳後修飾の差異が原因で生じ得る。加えて、遺伝子多型が原因の単一のＩｇＳＦ種内の小さな配列差異は、例えばタンパク質分解的切断が原因のＩｇＳＦ種の野生型短縮形態と同様、単一のＩｇＳＦ種内の別の形態の相違を成す。「細胞表面ＩｇＳＦ種」は、細胞（一般的に哺乳動物細胞）の表面に発現するＩｇＳＦ種である。

「免疫活性」という用語は、本明細書においてＴ細胞のような哺乳動物リンパ球の文脈で使用される場合、１つまたは複数の細胞生存、細胞増殖、サイトカイン産生（例えば、インターフェロン−γ）、またはＴ細胞傷害性活性を指す。場合によっては、免疫活性は、ケモカインまたはインターロイキンのようなサイトカインのそれらの発現を意味することができる。免疫活性の増強または抑制を決定するためのアッセイは、培養上清中のインターフェロン−γサイトカインレベルを測定するＭＬＲ（混合リンパ球反応）アッセイ（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ．２０１４Ｓｅｐ：２（９）：８４６−５６）、ＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＢ））Ｔ細胞刺激アッセイ（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ．２０１４Ｓｅｐ：２（９）：８４６−５６）、及び抗ＣＤ３Ｔ細胞刺激アッセイ（ＬｉａｎｄＫｕｒｌａｎｄｅｒ，ＪＴｒａｎｓｌＭｅｄ．２０１０：８：１０４）を含む。Ｔ細胞活性化は、ＩＦＮ−γサイトカインの分泌と関連するため、これらのｉｎｖｉｔｒｏヒトＴ細胞アッセイからの培養上清中のＩＦＮ−γレベルの検出は、市販のＥＬＩＳＡキットを使用してアッセイすることができる（Ｗｕｅｔａｌ，ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ２００８Ａｐｒ１５；１１７（１）：５７−６２）。免疫応答の誘導は、静止リンパ球と比べて免疫活性の増加をもたらす。本明細書において提供されるとおりの免疫調節タンパク質（例えば、親和性改変ＩｇＳＦドメインを含有するバリアントＣＤ８０ポリペプチド）は、初代Ｔ細胞アッセイにおいて、野生型ＩｇＳＦメンバーまたはＩｇＳＦドメイン対照と比べてＩＦＮ−γ（インターフェロン−γ）発現を、いくつかの実施形態において増加させることができ、または、その他の実施形態において減少させることができる。当業者は、ＩＦＮ−γ発現の増加を決定するために使用される初代Ｔ細胞アッセイのフォーマットが、ＩＦＮ−γ発現の減少についてアッセイするために用いられるフォーマットと異なることを理解するだろう。初代Ｔ細胞アッセイにおいてＩＦＮ−γ発現を減少させる本発明の免疫調節タンパク質または親和性改変ＩｇＳＦドメインの能力についてアッセイする際に、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを実施例６に記載されるように使用することができる。好都合なことに、本発明の可溶性形態の親和性改変ＩｇＳＦドメインを用いて、同じく実施例６に記載されるとおり、ＩＦＮ−γ発現に拮抗することによりその発現を減少させるその能力をＭＬＲにおいて決定することができる。あるいは、初代Ｔ細胞アッセイにおいてＩＦＮ−γ発現を増加させる本発明の免疫調節タンパク質または親和性改変ＩｇＳＦドメインの能力についてアッセイする際に、共固定アッセイを使用することができる。共固定アッセイでは、Ｔ細胞受容体シグナル（いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体によって提供される）を共固定された親和性改変ＩｇＳＦドメイン、例えばバリアントＣＤ８０と併用して、野生型ＩｇＳＦドメイン対照と比べてＩＦＮ−γ発現を増加させる能力を決定する。バリアントＣＤ８０膜貫通型免疫調節タンパク質の活性を評価することを含む、操作された細胞の免疫活性をアッセイする方法は、当技術分野において公知であり、限定されないが、抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でＴ細胞の増殖を持続する能力、及び適切な動物モデルにおける抗がん活性を含む。アッセイはまた、標準的な^５１Ｃｒ放出アッセイ（例えば、Ｍｉｌｏｎｅｅｔａｌ．，（２００９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ１７；１４５３−１４６４を参照のこと）もしくはフローベース細胞傷害性アッセイ、またはインピーダンスベース細胞傷害性アッセイ（Ｐｅｐｅｒｅｔａｌ．（２０１４）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，４０５：１９２−１９８）を含む、細胞傷害性を評価するアッセイを含む。

「免疫調節ポリペプチド」または「免疫調節タンパク質」は、免疫活性を調節するポリペプチドまたはタンパク質分子である。免疫応答の「調節」または「調節すること」とは、免疫活性の増加または低減のいずれかを意味する。免疫調節タンパク質は、単一のポリペプチド鎖であるか、または（例えば、鎖間ジスルフィド結合によって）互いに共有結合された少なくとも２つのポリペプチド鎖の多量体（二量体またはより高次の多量体）であることができる。したがって、単量体、二量体、及びより高次の多量体ポリペプチドは、その定義された用語の範囲内である。多量体ポリペプチドは、（同一ポリペプチド鎖の）ホモ多量体または（非同一ポリペプチド鎖の）ヘテロ多量体であることができる。本発明の免疫調節タンパク質は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含むことができる。

「増加（向上）させる」という用語は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量増加（向上）させることを意味する。増加（向上）は、非ゼロ対照値よりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、またはより大きい増加（向上）であることができる。

ＣＤ８０の「アイソフォーム」は、アミノ酸配列が異なる、複数の天然に存在するＣＤ８０ポリペプチドのうちの１つである。アイソフォームは、単一の遺伝子によって発現されるＲＮＡ転写物のスプライスバリアントの産物であることも、遺伝子重複から生じ得るような機能的に類似のタンパク質を生成する高度に類似するが異なる遺伝子の発現産物であることもできる。本明細書において使用される場合、ＣＤ８０の「アイソフォーム」と言う用語は、ＣＤ８０遺伝子の異なるアレルの産物も指す。

「標識」という用語は、検出可能シグナルを提供するために直接もしくは間接的に結合もしくは連結できる、または検出可能シグナルを改変するために第２の標識と相互作用できる化合物もしくは組成物を指す。標識は、標識されたポリペプチドを生成するために、ポリペプチドに直接または間接的にコンジュゲートされ得る。標識は、それ自体で検出可能（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）であり得るか、酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物組成の化学変化を触媒することができる。標識の非限定的な例としては、蛍光発生部分、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼが挙げられる。

「リンパ球」という用語は、本明細書において使用される場合、哺乳動物免疫系における白血球の３つのサブタイプのいずれかを意味する。これらは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）（細胞媒介性の細胞傷害性自然免疫において機能する）、Ｔ細胞（細胞媒介性の細胞傷害性獲得免疫に関する）、及びＢ細胞（体液性の抗体による適応免疫に関する）を含む。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、またはγδＴ細胞を含む。また、自然リンパ球（ＩＬＣ）もリンパ球の定義の範囲内に含まれる。

「哺乳動物」または「患者」という用語は、具体的に、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、カニクイザル、イヌ、ネコ、マウス、またはラットのうちの少なくとも１つへの言及を含む。

「膜タンパク質」という用語は、本明細書において使用される場合、生理的条件下で脂質二重層に直接または間接的に結合するタンパク質を意味する。膜を形成する脂質二重層は、生体膜、例えば真核生物（例えば、哺乳動物）の細胞膜または人工の（すなわち、人造の）膜、例えばリポソーム上に見いだされる膜であることができる。脂質二重層への膜タンパク質の結合は、共有結合によるか、または非共有結合的相互作用（例えば、疎水性相互作用もしくは静電相互作用）によるものであることができる。膜タンパク質は、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質であることができる。表在性膜タンパク質である膜タンパク質は、脂質二重層に非共有結合するか、または内在性膜タンパク質に非共有結合する。表在性膜タンパク質は、哺乳動物において生理的な範囲の条件下で表在性膜タンパク質が脂質二重層と会合する及び／または脂質二重層から解離することができるように、脂質二重層への一時的な結合を形成する。表在性膜タンパク質とは対照的に、内在性膜タンパク質は、哺乳動物において生理的な範囲の条件下で内在性膜タンパク質が脂質二重層への結合から解離しないように、膜の脂質二重層への事実上恒久的な結合を形成する。膜タンパク質は、脂質二重層の一層によって膜への結合を形成することができる（モノトピック型）か、または膜の両方の層によって結合することができる（ポリトピック型）。１つの脂質二重層とだけ相互作用する内在性膜タンパク質は、「内在性モノトピック型タンパク質」である。脂質二重層の両方と相互作用する内在性膜タンパク質は、「内在性ポリトピック型タンパク質」であり、あるいは、本明細書において「膜貫通型タンパク質」と称される。

「調節すること」または「調節する」という用語は、本明細書において免疫応答（例えば哺乳動物の免疫応答）の文脈で使用される場合、本発明のバリアントＣＤ８０を含む免疫調節ポリペプチドの投与の結果としてまたは本発明の免疫調節タンパク質（例えば、バリアントＣＤ８０膜貫通型免疫調節タンパク質）を発現する操作された細胞の投与の結果として起こる、既存のまたは潜在的な免疫応答の任意の変化（例えば、増加または減少）を指す。したがって、調節は、バリアントＣＤ８０を含む免疫調節タンパク質の投与の非存在下で起こるまたは存在する免疫応答と比較した、免疫応答の変化（例えば、増加または減少）を指す。そのような調節は、免疫細胞の免疫活性の度合いもしくは程度の任意の誘導、活性化、抑制、または変化を含む。免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、ＮＫＴ細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、及び非プロフェッショナル抗原提示細胞、ならびに炎症細胞（好中球、マクロファージ、単球、好酸球、及び好塩基球）を含む。調節は、既存の免疫応答、発生段階にある免疫応答、潜在的な免疫応答に、または免疫応答を誘導する、調節する、それに影響を及ぼす、もしくは応答する能力に付与される任意の変化を含む。調節は、免疫応答の一部としての、免疫細胞における遺伝子、タンパク質及び／または他の分子の発現及び／または機能の任意の変化を含む。免疫応答の調節または免疫活性の調節は、例えば、以下を含む：免疫細胞の排除、欠失、または隔離；自己反応性リンパ球、抗原提示細胞、または炎症細胞のような他の細胞の機能的能力を調節することができる免疫細胞の誘導または生成；免疫細胞における不応答状態（すなわち、アネルギー）の誘導；免疫細胞の活性または機能を増強または抑制すること（これらの細胞によって発現されるタンパク質のパターンを変化させることを非限定的に含む）。例としては、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、転写因子、キナーゼ、共刺激分子、もしくは他の細胞表面受容体などの特定の分子クラスの産生及び／または分泌の変化、またはこれらの調節事象の任意の組み合わせが挙げられる。調節は、例えば、初代Ｔ細胞アッセイにおける野生型または非改変ＣＤ８０対照と比べたＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）発現の変化によって評価することができる（ＺｈａｏａｎｄＪｉ，ＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ．２０１６Ｊａｎ１；３４０（１）：１３２−１３８を参照のこと）。調節は、例えば、野生型ＣＤ８０膜貫通型タンパク質によって操作された細胞と比べた、操作された細胞の免疫活性の変化、例えば操作された細胞の細胞傷害性活性の変化または操作された細胞のサイトカイン分泌の変化によって、評価することができる。

「多量体化ドメイン」という用語は、それぞれが同じまたは異なる多量体化ドメインであることができる相補的多量体化ドメイン（例えば、第１の多量体化ドメイン及び第２の多量体化ドメイン）を含有する、ポリペプチド分子と１つまたは複数の追加のポリペプチド分子との安定した相互作用を促進するアミノ酸配列を指す。相補的多量体化ドメイン間の相互作用、例えば、第１の多量体化ドメインと第２の多量体化ドメイン間の相互作用は、安定なタンパク質−タンパク質相互作用を形成して、ポリペプチド分子と追加のポリペプチド分子の多量体を産生する。場合によっては、多量体化ドメインは同じであり、それ自体と相互作用して２つのポリペプチド鎖間に安定したタンパク質−タンパク質相互作用を形成する。一般的に、ポリペプチドは、多量体化ドメインに直接的または間接的に接続される。例示的な多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列またはその部分、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、及び適合性のあるタンパク質−タンパク質相互作用ドメインを含む。多量体化ドメインは、例えば、免疫グロブリン定常領域またはドメイン、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ及びＩｇＭならびにそれらの改変形態由来の、Ｆｃドメインまたはその部分であることができる。

「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の核酸残基（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）のポリマーを指す。特に限定されない限り、該用語は、公知の天然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸、及びそれと類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様な様式で代謝される核酸を包含する。別段の指示のない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示されている配列（「参照配列」）だけでなく、保存的に改変されたそれらのバリアント（例えば、縮重コドン置換）及び相補的ヌクレオチド配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成してもよい。核酸またはポリヌクレオチドという用語は、遺伝子によってコードされているｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを包含する。

「分子種」という用語は、本明細書において使用される場合、同一のまたは実質的に同一の一次アミノ酸配列を備えたタンパク質の集団を意味する。各哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）メンバーは、同一のまたは実質的に同一の分子種の集合体を規定する。したがって、例えば、ヒトＣＤ８０はＩｇＳＦメンバーであり、各ヒトＣＤ８０分子はＣＤ８０の一分子種である。同じ分子種の分子間の相違が、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、及び脂質化などの翻訳後修飾の差異が原因で起こり得る。加えて、遺伝子多型が原因の単一の分子種内の小さな配列差異は、単一の分子種内の別の形態の相違を成し、例えばタンパク質分解的切断が原因の単一の分子種の野生型短縮形態も同様である。「細胞表面分子種」は、哺乳動物細胞の表面に発現する分子種である。各々がＩＳを形成する２つの哺乳動物細胞のうちの一方のみ、またはもう一方のみに存在する（しかし両方ではない）、２つ以上の異なるタンパク質種は、互いに「シス」または「シス配置」にあると言われる。第１のものがＩＳを形成する２つの哺乳動物細胞のうちの第１の細胞のみに存在し、第２のものがＩＳを形成する２つの哺乳動物細胞のうちの第２の細胞のみに存在する、２つの異なるタンパク質種は、「トランス」または「トランス配置」にあると言われる。各々がＩＳを形成する２つの哺乳動物細胞の両方に存在する、２つの異なるタンパク質種は、これらの細胞上でシス及びトランスの両配置にある。

「非競合的結合」という用語は、本明細書において使用される場合、少なくとも２つのコグネイト結合パートナーに同時に特異的に結合するタンパク質の能力を意味する。したがって、タンパク質は、少なくとも２つの異なるコグネイト結合パートナーに同時に結合することができるが、結合相互作用は、同じ期間である必要はないため、場合によっては、タンパク質は、コグネイト結合パートナーの１つにのみ特異的に結合される。いくつかの実施形態では、結合は、特定の結合条件下で起こる。いくつかの実施形態では、同時結合は、１つのコグネイト結合パートナーの結合が第２のコグネイト結合パートナーへの同時結合を実質的に阻害しないようなものである。いくつかの実施形態では、非競合的結合は、タンパク質上のその結合部位への第２のコグネイト結合パートナーの結合が、タンパク質上のその結合部位への第１のコグネイト結合パートナーの結合に置き換わらないことを意味する。非競合的結合を評価する方法は、ＰｅｒｅｚｄｅＬａＬａｓｔｒａｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９９Ａｐｒ：９６（４）：６６３−６７０に記載されている方法など、当技術分野において周知である。場合によっては、非競合的相互作用において、第１のコグネイト結合パートナーは、第２のコグネイト結合パートナーの相互作用部位と重複しない相互作用部位で、第２のコグネイト結合パートナーの結合が第１のコグネイト結合パートナーの結合と直接干渉しないように、特異的に結合する。したがって、第２のコグネイト結合パートナーの結合によるコグネイト結合パートナーの結合へのいかなる影響も、第１のコグネイト結合パートナーの結合との直接的な干渉以外の機序を介するものである。例えば、酵素−基質相互作用においては、非競合的阻害剤は、酵素の活性部位以外の部位に結合する。非競合的結合は、第２のコグネイト結合パートナーが、第１のコグネイト結合パートナーの結合と重複しない相互作用部位で特異的に結合するが、第１の相互作用部位が第１のコグネイト結合パートナーに占有されているときだけ第２の相互作用部位に結合する、非競合的な結合相互作用を包含する。

「薬学的組成物」という用語は、哺乳動物対象、多くの場合ヒトにおける、薬学的用途に好適な組成物を指す。薬学的組成物は、典型的には、有効量の活性剤（例えば、バリアントＣＤ８０を含む免疫調節ポリペプチドまたはバリアントＣＤ８０膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する操作された細胞）、及び担体、賦形剤、または希釈剤を含む。担体、賦形剤、または希釈剤は、それぞれ、典型的には、薬学的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤である。

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、かつ、ペプチド結合を介して連結されている２つ以上のアミノ酸の分子鎖を指す。該用語は、その産物の特定の長さを指すわけではない。したがって、「ペプチド」及び「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義内に含まれる。該用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。該用語はまた、合成することができるか、または公知のタンパク質操作技術を使用して組換え発現することができる、１つまたは複数のアミノ酸類似体または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸の分子も含む。加えて、タンパク質は誘導体化されていてもよい。

「初代Ｔ細胞アッセイ」という用語は、本明細書において使用される場合、インターフェロン−γ（「ＩＦＮ−γ」）発現を測定するためのｉｎｖｉｔｒｏアッセイを指す。実施例６に記載されるアッセイのような多種多様なこのような初代Ｔ細胞アッセイが当技術分野において公知である。好ましい実施形態では、使用されるアッセイは、抗ＣＤ３共固定アッセイである。このアッセイでは、初代Ｔ細胞が、追加の組換えタンパク質と共にまたはそれなしで固定された抗ＣＤ３によって刺激される。ある時点（通常２４〜７２時間）で培養上清を採取する。別の実施形態では、使用されるアッセイは混合リンパ球反応（ＭＬＲ）である。このアッセイでは、初代Ｔ細胞が、同種他家ＡＰＣで刺激される。ある時点（通常２４〜７２時間）で培養上清を採取する。標準的なＥＬＩＳＡ技術によって培養上清中のヒトＩＦＮ−γレベルを測定する。市販のキットが供給業者から入手可能であり、製造業者の推奨に従ってアッセイを実施する。

「精製された」という用語は、核酸（例えば、本発明の免疫調節タンパク質をコードする）に適用される場合、一般的に、当技術分野において周知の分析技術によって決定した他の成分を実質的に含まない核酸またはポリペプチドを意味する（例えば、精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフ溶出液、及び／または密度勾配遠心分離に供した媒体中で、別個のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲル中で基本的に１つのバンドを生じる核酸またはポリペプチドは、「精製されている」。精製された本発明の核酸またはタンパク質は、少なくとも約５０％純粋、通常、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９９％以上純粋（例えば、重量パーセントまたはモルベース）である。

「組換え」という用語は、物質（例えば、核酸またはポリペプチド）がヒトの介入によって人工的に（すなわち、非天然に）変えられていることを示す。該変化は、その天然の環境もしくは状態内のまたはそこから取り出された物質に対して実施することができる。例えば、「組換え核酸」は、例えば、クローニング、親和性改変、ＤＮＡシャッフリングまたは他の周知の分子生物学的手順の間に、核酸を組換えることによって作製されるものである。「組換えＤＮＡ分子」は、このような分子生物学的技術によって一緒に接続されたＤＮＡの断片から構成される。「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」という用語は、本明細書において使用される場合、組換えＤＮＡ分子を使用して発現されるタンパク質分子を指す。「組換え宿主細胞」は、組換え核酸を含有する及び／または発現する細胞であるか、または別様に遺伝子操作（例えば、組換えタンパク質（例えば、本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質）をコードする核酸分子を細胞に導入することによって）により変化された細胞である。真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」及び「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーター及びエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いＤＮＡ配列アレイからなる。プロモーター及びエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞ならびにウイルス中の遺伝子を含む多種多様な真核生物源から単離されている（類似した制御エレメント、すなわちプロモーターはまた原核生物中にも見いだされる）。特定のプロモーター及びエンハンサーの選択は、関心対象のタンパク質を発現させるためにどんな細胞タイプが使用されるかによる。「作動可能な組み合わせにある」、「作動可能な順序にある」及び「作動可能に連結されている」という用語は、本明細書において使用される場合、所与の遺伝子の転写及び／または所望のタンパク質分子の合成を指令することが可能な核酸分子が産生される様式または配向での核酸配列の連結を指す。

「組換え発現ベクター」という用語は、本明細書において使用される場合、所望のコード配列とその作動可能に連結されているコード配列の特定の宿主細胞における発現に必要な適切な核酸配列とを含有するＤＮＡ分子を指す。原核生物において発現に必要な核酸配列は、プロモーター、任意でオペレーター配列、リボソーム結合部位、及び場合によっては他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終止シグナル及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。所望により、細胞からの融合タンパク質のより簡易な単離のため、発現された融合タンパク質が組換え宿主細胞によって分泌されることができるように、分泌シグナルペプチド配列がまた、任意で、組換えタンパク質（例えば、組換え融合タンパク質）のコード配列に作動可能に連結されている組換え発現ベクターによってコードされることができる。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ベクターの中には、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターがある。

「選択性」という用語は、コグネイト結合パートナーなどのある基質の特異的結合に関して、対象タンパク質またはポリペプチドの、当該対象タンパク質の異なるコグネイト結合パートナーなどの別の基質に対する特異的結合と比較した、優先度を指す。選択性は、対象タンパク質と第１の基質（例えば第１のコグネイト結合パートナー）との結合活性（例えば、結合親和性）（例えば、Ｋ_ｄ１）と、同じ対象タンパク質と第２のコグネイト結合パートナーとの結合活性（例えば、結合親和性）（例えば、Ｋ_ｄ２）との比率として反映することができる。

「配列同一性」という用語は、本明細書において使用される場合、遺伝子またはタンパク質間の、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの配列同一性を指す。「配列同一性」は、アミノ酸レベルでのタンパク質間の同一性の尺度及びヌクレオチドレベルでの核酸間の同一性の尺度である。タンパク質の配列同一性は、配列を整列したときの各配列中の所与の位置におけるアミノ酸配列を比較することによって決定され得る。同様に、核酸の配列同一性は、配列を整列したときの各配列中の所与の位置におけるヌクレオチド配列を比較することによって決定され得る。比較のための配列のアラインメントのための方法は、当技術分野において周知であり、そのような方法には、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡが挙げられる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列同一性パーセントを計算し、２つの配列間の類似性の統計解析を実施する。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを通じて公的に利用可能である。

「可溶性」という用語は、タンパク質に関して本明細書において使用される場合、タンパク質が膜タンパク質ではないことを意味する。概して、可溶性タンパク質は、ＩｇＳＦドメイン（複数可）またはその特異的結合断片を含有するＩｇＳＦファミリーメンバー受容体の細胞外ドメインまたはその一部分のみを含有するが、膜貫通ドメインを含有しない。場合によっては、Ｆｃドメインへ直接またはリンカーを介して間接的に連結または結合させることによってタンパク質の溶解性を改善することができ、これは、場合によっては、タンパク質の安定性及び／または半減期も改善することができる。いくつかの態様では、可溶性タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質である。

「種」という用語は、ポリペプチドまたは核酸に関して本明細書において使用される場合、同一のまたは実質的に同一の配列を有する分子の集団を意味する。同じ種のポリペプチド間の相違が、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、及び脂質化などの翻訳後修飾の差異が原因で起こり得る。アミノ末端またはカルボキシ末端において完全長種とわずか１、２、または３アミノ酸残基以下異なる（または差異をコードする）わずかに短縮されたポリペプチド配列は、単一種の配列であるとみなされる。そのような微小不均一性は、製造されたタンパク質の共通の特徴である。

「特異的結合断片」という用語は、本明細書において完全長野生型哺乳動物ＣＤ８０ポリペプチドまたはそのＩｇＶもしくはＩｇＣドメインに関して使用される場合、ＩｇＶ及び／またはＩｇＣドメインの部分配列を有し、ｉｎｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎｖｉｖｏで哺乳動物ＣＤ２８、哺乳動物ＰＤ−Ｌ１及び／または哺乳動物ＣＴＬＡ−４（例えば、ヒトまたはネズミＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＴＬＡ−４）に特異的に結合する、ポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０ＩｇＶまたはＣＤ８０ＩｇＣの特異的結合断片は、完全長野生型配列の配列長の少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。バリアントＣＤ８０を形成するために、特異的結合断片の配列を変化させることができる。

「特異的に結合する」という用語は、本明細書において使用される場合、その親和性または結合活性が、十分な統計的サイズのランダムペプチドまたはポリペプチドの集合体に対する同じタンパク質の平均親和性または結合活性の少なくとも５倍大きく、しかし任意で少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２５０または５００倍大きく、またはさらに少なくとも１０００倍大きくなるように、特異的結合条件下で、標的タンパク質に結合するタンパク質の能力を意味する。特異的に結合するタンパク質は、単一の標的分子のみに結合する必要はなく、標的と非標的（例えば、パラログまたはオーソログ）との間の構造形態の類似性に起因して非標的分子に特異的に結合し得る。当業者は、異なる動物種において同じ機能を有する分子（すなわち、オーソログ）への特異的結合または標的分子と実質的に類似のエピトープを有する非標的分子（例えば、パラログ）への特異的結合が可能であり、かつ、固有の非標的（例えば、ランダムポリペプチド）の統計的に有効な集合体に対して決定される結合の特異性を損なわないことを認識するだろう。したがって、本発明のポリペプチドは、交差反応性に起因して、２つ以上の別個の標的分子種に特異的に結合し得る。固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイまたは表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）測定を使用して、２つのタンパク質間の特異的結合を決定することができる。一般的に、２つの結合タンパク質間の相互作用は、１×１０^−５Ｍ未満、多くの場合１×１０^−１２Ｍの低さの解離定数（Ｋ_ｄ）を有する。本開示のある種の実施形態では、２つの結合タンパク質間の相互作用は、１×１０^−６Ｍ、１×１０^−７Ｍ、１×１０^−８Ｍ、１×１０^−９Ｍ、１×１０^−１０Ｍまたは１×１０^−１１Ｍの解離定数を有する。

ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞に関して、「表面発現する」または「表面発現」という用語は、当該ポリペプチドが膜タンパク質として発現することを意味する。いくつかの実施形態では、膜タンパク質は、膜貫通型タンパク質である。

本明細書において使用される場合、「合成の」は、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関して、組換え法及び／または化学合成法によって産生される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。

「ターゲティング部分」という用語は、本明細書において使用される場合、バリアントＣＤ８０を含むポリペプチドに共有結合もしくは非共有結合されるか、またはそれを物理的にカプセル化する組成物を指す。ターゲティング部分は、細胞表面受容体（例えば、Ｂ７ファミリーメンバーＰＤ−Ｌ１）、または腫瘍抗原（例えば、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）もしくは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えばＢ７−Ｈ６）のような所望のカウンター構造体に対して特異的結合親和性を有する。典型的には、所望のカウンター構造体は、特定の組織または細胞タイプ上に局在化される。ターゲティング部分は、抗体、抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌを含有する可変断片（Ｆｖ）、１つの鎖中で一緒に連結されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含有する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ならびに他の抗体Ｖ領域断片、例えばＦａｂ′、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆ（ａｂ′）_２、ｄｓＦｖダイアボディ、ナノボディ、可溶性受容体、受容体リガンド、親和性成熟された受容体もしくはリガンド、ならびに小分子（５００ダルトン未満）組成物（例えば、特異的結合受容体組成物）を含む。ターゲティング部分はまた、本発明のポリペプチドをカプセル化するリポソームの脂質膜に共有結合または非共有結合させることもできる。

「膜貫通型タンパク質」という用語は、本明細書において使用される場合、脂質二重層を実質的にまたは完全に貫通する膜タンパク質を意味し、脂質二重層は、例えば、哺乳動物細胞などの生体膜中に、またはリポソームなどの人工構築物中に見いだされる。膜貫通型タンパク質は、脂質二重層に統合され、その統合が生理的条件下で熱力学的に安定である、膜貫通ドメイン（「膜貫通ドメイン」）を含む。膜貫通ドメインは、一般的に、水性環境（例えば、サイトゾル、細胞外液）と相互作用するタンパク質の領域と比較してその疎水性が高いことに基づいて、任意の数の市販のバイオインフォマティクスソフトウェアアプリケーションを介して膜貫通ドメインのアミノ酸配列から予測可能である。膜貫通ドメインは多くの場合、膜を貫通する疎水性αヘリックスである。膜貫通型タンパク質は、脂質二重層の両方の層を１回または複数回貫通することができる。本明細書に記載の提供される膜貫通型免疫調節タンパク質は、膜貫通型タンパク質に含まれる。膜貫通ドメインに加えて、本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質は、エクトドメインをさらに含み、いくつかの実施形態ではエンドドメインをさらに含む。

疾患または障害の「治療すること」、「治療」または「治療法」という用語は、本明細書において使用される場合、本発明の治療用組成物（例えば、免疫調節タンパク質または操作された細胞を含有する）を、単独、または本明細書に記載される別の化合物との組み合わせのいずれかで投与することによる臨床または診断症状のいずれかの低減、停止、または排除によって証明される、疾患または障害の進行を遅延、中断、または回復させることを意味する。「治療すること」、「治療」または「治療法」はまた、急性もしくは慢性疾患もしくは障害における症状の重症度の低下、または再発率の低下（例えば、自己免疫疾患経過を再発するまたは寛解する場合において）、または自己免疫疾患の炎症態様の場合における炎症の低減も意味する。がんの文脈において本明細書で使用される場合、がんの「治療」、がんを「阻害する」、がんを「阻害すること」またはがんの「阻害」という用語は、限定されないがＲｅｓｐｏｎｓｅＥｖａｌｕａｔｉｏｎＣｒｉｔｅｒｉａｆｏｒＳｏｌｉｄＴｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）のような標準的な基準によって測定した場合の、腫瘍成長率の統計的に有意な低下、腫瘍成長の停止、または腫瘍のサイズ、質量、代謝活性もしくは体積の低下、または無増悪生存期間（ＰＦＳ）もしくは全生存期間（ＯＳ）の統計的に有意な向上のうちの少なくとも１つを指す。疾患もしくは障害を「予防する」、疾患もしくは障害の「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」または疾患もしくは障害の「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、本発明の文脈において使用される場合、疾患もしくは障害の出現もしくは発症または疾患もしくは障害の症状の一部もしくは全てを予防するか、または疾患もしくは障害の発症の可能性を低下させるための、本発明の免疫調節ポリペプチドまたは操作された細胞を単独または別の化合物との組み合わせのいずれかで投与することを指す。

「腫瘍特異的抗原」または「ＴＳＡ」という用語は、本明細書において使用される場合、哺乳動物対象の腫瘍細胞上に主に存在するが一般的に哺乳動物対象の正常細胞上には見いだされないカウンター構造体を指す。腫瘍特異的抗原は腫瘍細胞のみに存在する必要はないが、腫瘍特異的抗原を有する特定の哺乳動物の細胞の割合が十分に高いか、または腫瘍の表面の腫瘍特異的抗原のレベルが十分に高いため、それにより抗腫瘍治療薬（例えば、本発明の免疫調節ポリペプチド）でターゲティングでき、そして腫瘍の影響から哺乳動物を予防または治療することを提供する。いくつかの実施形態では、腫瘍を有する哺乳動物由来の細胞のランダム統計試料では、ＴＳＡを提示する細胞の少なくとも５０％ががん性である。他の実施形態では、ＴＳＡを提示する細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％ががん性である。

「バリアント」（また「改変された」または「変異体」）という用語は、バリアントＣＤ８０に関して使用される場合、ヒト介入によって作製されたＣＤ８０、例えば哺乳動物（例えば、ヒトまたはネズミ）ＣＤ８０を意味する。バリアントＣＤ８０は、非改変または野生型ＣＤ８０と比べて、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドである。バリアントＣＤ８０は、野生型ＣＤ８０アイソフォーム配列と１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、またはそれらの組み合わせが異なるポリペプチドである。本明細書における目的のために、バリアントＣＤ８０は少なくとも１つの親和性改変ドメインを含有し、それにより１つまたは複数のアミノ酸差異がＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶドメイン）に生じる。バリアントＣＤ８０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸差異、例えばアミノ酸置換を含有することができる。バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、一般的に、対応する野生型または非改変ＣＤ８０、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１の配列、その成熟配列またはその細胞外ドメインもしくはＩｇＳＦドメインを含有するそれらの部分に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１５０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３０、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３０３１に記載の配列を含む、対応する野生型または非改変ＣＤ８０に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示す。

天然には存在しないアミノ酸及び天然に存在するアミノ酸が、許容される置換または付加の範囲内に含まれる。バリアントＣＤ８０は、任意の特定の作製方法に限定されることはなく、例えばデノボ化学合成、デノボ組換えＤＮＡ技術、またはそれらの組み合わせを含む。本発明のバリアントＣＤ８０は、哺乳動物種のＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＴＬＡ−４のうちの少なくとも１つまたは複数に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、変化したアミノ酸配列は、非改変または野生型ＣＤ８０タンパク質と比較して、ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＴＬＡ−４に対する結合親和性または結合活性の変化（すなわち、増加または減少）をもたらす。結合親和性または結合活性の増加または減少は、フローサイトメトリーなどの周知の結合アッセイを使用して決定することができる。Ｌａｒｓｅｎｅｔａｌ．，ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ５：４４３−４５３（２００５）。また、Ｌｉｎｓｌｅｙｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ１（９）：７９３−８０１（１９９４）も参照のこと。ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＴＬＡ−４へのバリアントＣＤ８０の結合親和性または結合活性の増加は、非改変または野生型ＣＤ８０の値よりも少なくとも５％大きい値であることができ、いくつかの実施形態では、非改変または野生型ＣＤ８０対照値の値よりも少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％大きい値であることができる。ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＴＬＡ−４に対するＣＤ８０の結合親和性または結合活性の減少は、非改変または野生型ＣＤ８０対照値の９５％以下の値までであり、いくつかの実施形態では、非改変または野生型ＣＤ８０対照値の結合親和性または結合活性の８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％以下または、検出不可能の値までである。バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって一次アミノ酸配列が変化している。バリアントＣＤ８０ポリペプチドの文脈における「バリアント」という用語は、バリアントＣＤ８０が作製される任意の特定の出発組成物または方法のいかなる条件も強要するものと解釈されるべきではない。バリアントＣＤ８０は、例えば、野生型哺乳動物ＣＤ８０配列情報から開始して生成され、次いでＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＴＬＡ−４への結合についてｉｎｓｉｌｉｃｏでモデル化され、そして最後に組換えまたは化学合成されて、バリアントＣＤ８０を得ることができる。しかし別の一例では、バリアントＣＤ８０は、非改変または野生型ＣＤ８０の部位特異的変異誘発によって作製することができる。したがって、バリアントＣＤ８０は、組成物を意味するが、必ずしも任意の所与のプロセスによって産生される産物である必要はない。組換え法、化学合成、またはその組み合わせを含む多種多様な技術を用いてもよい。

「野生型」または「自然」または「天然」という用語は、本明細書において使用される場合、核酸分子、タンパク質（例えば、ＣＤ８０）、ＩｇＳＦメンバー、宿主細胞などの生体物質に関して用いられ、天然に見いだされかつヒトの介入によって改変されていないものを指す。

ＩＩ．バリアントＣＤ８０ポリペプチド
１つまたは複数のＣＤ８０結合パートナーに対して変化した（増加または減少した）結合活性または親和性を示すバリアントＣＤ８０ポリペプチドが本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０結合パートナーは、ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメイン（ＩｇＤ）において、野生型もしくは非改変ＣＤ８０ポリペプチド、またはＩｇＤを含有する野生型もしくは非改変ＣＤ８０の一部分、またはそれらの特異的結合断片と比べて、１つまたは複数のアミノ酸改変、例えば１つまたは複数の置換（あるいは、「変異」または「交換」）、欠失、または付加を含有する。したがって、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）がＩｇＤにある、バリアントＩｇＤ（以下「ｖＩｇＤ」と呼ばれる）であるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、ＩｇＤは、ＩｇＶドメインもしくはＩｇＣ（例えば、ＩｇＣ２）ドメイン、またはＩｇＶドメインもしくはＩｇＣ（例えば、ＩｇＣ２）ドメインの特異的結合断片、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＤは、ＩｇＶのみ、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）全体を含むＩｇＶとＩｇＣの組み合わせ、またはＣＤ８０のＩｇドメインの任意の組み合わせであり得る。表２は、ＣＤ８０のＩｇＶまたはＩｇＣ領域に対応する例示的な残基を提供する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換）がＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはそれらの特異的結合断片にある、ＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはそれらの特異的結合断片を含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換）がＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片にある、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片を含有する。いくつかの実施形態では、変化した結合活性または親和性によって、変化したＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインは、親和性改変ＩｇＳＦドメインである。

いくつかの実施形態では、バリアントは、非改変ＣＤ８０配列の配列と比べて、もう１つのＩｇＳＦドメインが改変されている。いくつかの実施形態では、非改変ＣＤ８０配列は、野生型ＣＤ８０である。いくつかの実施形態では、非改変または野生型ＣＤ８０は、天然ＣＤ８０またはそのオーソログの配列を有する。いくつかの実施形態では、非改変ＣＤ８０は、１つまたは複数のＩｇＳＦドメイン（表２を参照のこと）を含有するＣＤ８０の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはその一部分であるか、またはそれを含む。例えば、非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸３５〜１３５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸３５〜１３８（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３０を参照）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸３５〜１４１として記載されるＩｇＶドメインであるか、またはそれを含む。場合によっては、非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸１４５〜２３０またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸１４２〜２３２として記載されるＩｇＣドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、非改変または野生型ＣＤ８０ポリペプチドの細胞外ドメインは、ＩｇＶドメイン及びＩｇＣドメイン（複数可）を含む。しかしながら、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメイン及びＩｇＣドメイン（複数可）の両方を含む必要はない。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片を含むかまたは本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片を含むかまたは本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０は、可溶性であり、かつ膜貫通ドメインを欠く。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０はさらに、膜貫通ドメインを含み、場合によっては細胞質ドメインも含む。

いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、哺乳動物ＣＤ８０ポリペプチド、例えば、限定されないがヒト、マウス、カニクイザル、またはラットＣＤ８０ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０配列は、ヒトである。

いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に記載のアミノ酸配列もしくはシグナル配列を欠くその成熟形態を有するか、（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列もしくはその成熟形態を有するか、または（ｉｉｉ）ＩｇＶドメインもしくはＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片を含有する（ｉ）または（ｉｉ）の一部分である。

いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＤ８０の細胞外ドメインまたはその一部分であるか、またはそれを含む。例えば、いくつかの実施形態では、非改変または野生型ＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のアミノ酸配列、またはそのオーソログを含む。例えば、非改変または野生型ＣＤ８０ポリペプチドは、（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のアミノ酸の配列を含むことができるか、（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができるか、または（ｉｉｉ）ＩｇＶドメインもしくはＩｇＣドメインを含む（ｉ）もしくは（ｉｉ）の特異的結合断片である。いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０の細胞外ドメインは、１つまたは複数のＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１またはＣＤ２８などの１つまたは複数のＣＤ８０結合タンパク質に結合することができる。

いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片を含有する。いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドのＩｇＶドメインは、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、１５０、３０３０もしくは３０３１に記載のアミノ酸配列またはそのオーソログを含む。例えば、非改変または野生型ＣＤ８０ポリペプチドのＩｇＶドメインは、（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、１５０、３０３０もしくは３０３１に記載のアミノ酸配列を含有することができる、または（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７６、１５０、３０３０もしくは３０３１に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有することができる、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の特異的結合断片である。いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＩｇＶドメインは、１つまたは複数のＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１またはＣＤ２８などの１つまたは複数のＣＤ８０結合タンパク質に結合することができる。

いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドのＩｇＣドメインは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基１４５〜２３０、１５４〜２３２、または１４２〜２３２として記載されるアミノ酸配列、またはそのオーソログを含む。例えば、非改変または野生型ＣＤ８０ポリペプチドのＩｇＣドメインは、（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基１４５〜２３０、１５４〜２３２、もしくは１４２〜２３２として記載されるアミノ酸配列を含有することができる、または（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基１４５〜２３０、１５４〜２３２、もしくは１４２〜２３２に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有することができる、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の特異的結合断片である。いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＩｇＣドメインは、１つまたは複数のＣＤ８０結合タンパク質と結合することができる。

いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＤ８０の特異的結合断片、例えばＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインの特異的結合断片を含有する。いくつかの実施形態では、特異的結合断片は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＤ２８と結合することができる。特異的結合断片は、少なくとも５０アミノ酸、例えば少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、または１１０アミノ酸のアミノ酸長を有することができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＶドメインの特異的結合断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸３５〜１３５、３５〜１３８、３７〜１３８または３５〜１４１として記載されるＩｇＶドメインの長さの少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％であるアミノ酸配列を含有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＣドメインの特異的結合断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸１４５〜２３０、１５４〜２３２、または１４２〜２３２として記載されるＩｇＣドメインの長さの少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数の親和性改変ＩｇＳＦドメインを含むＥＣＤドメインまたはその一部分を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、少なくとも１つのＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインが１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有する、ＩｇＶドメインもしくはＩｇＣドメイン、またはＩｇＶドメインの特異的結合断片もしくはＩｇＣドメインの特異的結合断片を含むことができる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメイン及びＩｇＣドメイン、またはＩｇＶドメインの特異的結合断片及びＩｇＣドメインの特異的結合断片を含むことができる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、完全長ＩｇＶドメインを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、完全長ＩｇＣドメインを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメインの特異的結合断片を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＣドメインの特異的結合断片を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、完全長ＩｇＶドメイン及び完全長ＩｇＣドメインを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、完全長ＩｇＶドメイン、及びＩｇＣドメインの特異的結合断片を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメインの特異的結合断片及び完全長ＩｇＣドメインを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメインの特異的結合断片及びＩｇＣドメインの特異的結合断片を含む。

このような実施形態のいずれかでは、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）は、ＣＤ８０ポリペプチドドメインのいずれか１つまたは複数に位置することができる。例えば、いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの細胞外ドメインに位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）は、ＩｇＶドメインまたはＩｇＶドメインの特異的結合断片に位置する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）は、ＩｇＣドメインまたはＩｇＣドメインの特異的結合断片に位置する。

一般的に、ポリペプチドの様々な属性のそれぞれ（例えば、可溶性及び膜結合ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＤ２８に対するＣＤ８０の親和性、ポリペプチド鎖当たりの変異の数、連結ポリペプチド鎖の数、バリアントＣＤ８０当たりのアミノ酸変化の数及び性質など）が、以下に個別に開示される。しかしながら、当業者に明らかであるとおり、任意の特定のポリペプチドが、これらの独立した属性の組み合わせを含むことができる。ＩｇＳＦドメインのドメイン構成を説明するために使用されるＳＥＱＩＤＮＯ：として記載される特定の配列への言及を含むアミノ酸についての言及は、例示を目的としており、提供される実施形態の範囲を限定することを意味していないことが理解されよう。ポリペプチド、及びそのドメインの説明は、類似の分子との相同性分析及びアラインメントに基づいて理論的に導出されることが理解されよう。したがって、正確な遺伝子座にはばらつきがあり得、必ずしもタンパク質毎に同じとは限らない。よって、特定のＩｇＳＦドメイン（例えば、特定のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメイン）は、いくつか（例えば、１、２、３、または４個）のアミノ酸分長いかまたは短い場合がある。

さらに、以下で考察されるような本発明の各種実施形態は、上に開示したとおりに定義された用語の意味の範囲内で頻繁に提供される。したがって、特定の定義において記載される実施形態は、定義された用語が本明細書に記載の様々な態様及び属性の考察において利用される場合、参照によって組み込まれると解釈されるべきである。したがって、見出し、様々な態様及び実施形態の提示の順序、ならびに各々独立した属性の別々の開示は、本開示の範囲に限定されることを意味するものではない。

Ａ．例示的な改変
野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドに含有されるＩｇＳＦドメインと比べて、少なくとも１つの親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶまたはＩｇＣ）またはその特異的結合断片を含有し、その結果、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、１つまたは複数のコグネイト結合パートナーＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１またはＣＤ２８に対して変化した（増加または減少した）結合活性または親和性を示すバリアントＣＤ８０ポリペプチドが本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えば固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、フローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイによって測定した場合に、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチド対照配列のものとは異なる、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１またはＣＤ２８に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＤ２８に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＴＬＡ−４に対して減少した結合親和性を有する。ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＴＬＡ−４は、哺乳動物タンパク質、例えばヒトタンパク質またはネズミタンパク質であることができる。

ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＤ２８に対する、変化した（例えば増加または減少した）結合活性または親和性は、野生型または非改変ＩｇＳＦドメインのＩｇＳＦドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸改変によって付与される。野生型または非改変ＣＤ８０配列は、本明細書に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを生成するために、必ずしも出発組成物として使用される必要はない。したがって、「置換」という用語の使用は、提供される実施形態がバリアントＣＤ８０ポリペプチドの特定の作製法に限定されることを暗示するものではない。バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えば、デノボペプチド合成によって作製されることができ、したがって、置換のためにコードするコドンを変えるという意味で、必ずしも「置換」を必要とするわけではない。この原則はまた、アミノ酸残基の「付加」及び「欠失」という用語にも及び、これも同じく特定の作製法を暗示するものではない。バリアントＣＤ８０ポリペプチドが設計または作製される手段は、いかなる特定の方法にも限定されない。しかしながら、いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０をコードする核酸が、実施例に開示された方法または当業者に知られている他の方法に従って、野生型または非改変ＣＤ８０遺伝物質から変異誘発され、所望の特異的結合親和性及び／またはＩＦＮ−γ発現もしくは他の機能的活性の誘導についてスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、任意の数の公的に利用可能なデータベースで利用可能なタンパク質または核酸配列を利用してデノボ合成され、次いで、その後スクリーニングされる。国立生物工学情報センターは、そのような情報を提供し、そのウェブサイトは、前述したようにＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースと同じくインターネットを介して公的にアクセス可能である。

特に明記しない限り、本開示を通して示すとおり、アミノ酸改変（複数可）は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の非改変ＥＣＤ配列、または適用可能な場合は、以下のとおりＳＥＱＩＤＮＯ：７６、１５０、３０３０または３０３１に記載の非改変ＩｇＶ配列の位置の番号付けに対応するアミノ酸位置番号によって指定される。

ＣＤ８０ポリペプチド（そのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）を含有するその一部分を含む）における改変（例えば、アミノ酸置換）の対応する位置を、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはＳＥＱＩＤＮＯ：７６またはＳＥＱＩＤＮＯ：１５０またはＳＥＱＩＤＮＯ：３０３０またはＳＥＱＩＤＮＯ：３０３１を有する参照配列のアラインメントによって特定することは、当業者のレベルの範囲内である。本開示全体での改変の記載において、アミノ酸位置が中央に示され、対応する非改変（例えば、野生型）アミノ酸が番号の前に列挙され、特定されたバリアントのアミノ酸置換が番号の後に列挙される。改変が該位置の欠失である場合は「ｄｅｌ」と表示され、改変が該位置における挿入である場合は「ｉｎｓ」と表示される。場合によっては、挿入が、中央に示されたアミノ酸位置と共に記載され、対応する非改変（例えば、野生型）アミノ酸が番号の前及び後に列挙され、特定されたバリアントのアミノ酸挿入が非改変（例えば、野生型）アミノ酸の後に列挙される。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０配列に１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）は、野生型または非改変ＣＤ８０配列のエクトドメイン（細胞外ドメイン）、例えば細胞外ドメインにあることができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）は、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片にある。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）は、ＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片にある。バリアントＣＤ８０ポリペプチドのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）のいくつかは、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片にあり、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）のいくつかは、ＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片にある。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。改変（例えば、置換）は、ＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインにあることができる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドまたはその特異的結合断片（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０または３０３１のアミノ酸配列）と少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた７、１３、１５、１６、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３８、４１、４２、４３、４６、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５７、５８、６１、６２、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８４、８５、８６、８７、８８、９２、９４、９５及び／または９７位（複数可）に対応する、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた７、２３、２６、３０、３４、３５、４６、５１、５５、５７、５８、６５、７１、７３、７８、７９、８２または８４位に対応する、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、任意の２つ以上の前述の位置、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の位置に改変、例えばアミノ酸置換を有する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、

の中から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｅ７Ｄ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｇ、Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｐ、Ａ２６Ｓ、Ａ２６Ｔ、Ｉ３０Ｆ、Ｉ３０Ｔ、Ｉ３０Ｖ、Ｋ３４Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｐ５１Ａ、Ｎ５５Ｄ、Ｎ５５Ｉ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｌ６５Ｐ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｒ７３Ｓ、Ｇ７８Ａ、Ｔ７９Ａ、Ｔ７９Ｉ、Ｔ７９Ｌ、Ｔ７９Ｐ、Ｃ８２Ｒ、Ｖ８４Ａ、Ｖ８４Ｉ、Ｌ８５Ｑから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、任意の２つ以上の前述のアミノ酸置換、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１つのみの前述のアミノ酸置換を含む非改変または野生型ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、１つのみのアミノ酸差異を含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた１２、１８、２９、３１、３７、３８、４１、４３、４４、４７、６１、６７、６８、６９、７０、７２、７７、８３、８８、８９、９０、９１または９３位に対応する、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に１つまたは複数の追加のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ａ１２Ｔ、Ａ１２Ｖ、Ｈ１８Ｌ、Ｈ１８Ｙ、Ｒ２９Ｈ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３７Ｅ、Ｍ３８Ｔ、Ｔ４１Ａ、Ｍ４３Ｉ、Ｓ４４Ｐ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｔ、Ｉ６７Ｔ、Ｖ６８Ａ、Ｖ６８Ｍ、Ｉ６９Ｔ、Ｌ７０Ｐ、Ｌ７０Ｒ、Ｌ７０Ｑ、Ｌ７２Ｐ、Ｅ７７Ｇ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｉ、Ｅ８８Ｄ、Ｋ８９Ｅ、Ｋ８９Ｎ、Ｄ９０Ｇ、Ｄ９０Ｎ、Ａ９１Ｔ、Ｋ９３Ｒの中から選択される１つまたは複数の追加のアミノ酸置換を有する。

保存的アミノ酸置換は、野生型または非改変アミノ酸以外の、置換されたアミノ酸と同じクラスのアミノ酸に属する任意のアミノ酸である。アミノ酸のクラスは、脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン）、ヒドロキシルまたは硫黄含有（セリン、システイン、スレオニン、及びメチオニン）、環状（プロリン）、芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、塩基性（ヒスチジン、リジン、及びアルギニン）、及び酸性／アミド（アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、及びグルタミン）である。したがって、例えば、Ａ２６Ｅ置換の保存的アミノ酸置換には、Ａ２６Ｄ、Ａ２６Ｎ、及びＡ２６Ｑアミノ酸置換が含まれる。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた１８位に対応する位置に非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換Ｈ１８Ｙ、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、２６、３５、４６、４７、６８、７１、８５または９０の１つまたは複数の位置に、１つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｖ６８Ｍ、Ａ７１Ｇ、Ｌ８５ＱまたはＤ９０Ｇの１つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ／Ａ２６Ｅ、Ｈ１８Ｙ／Ｅ３５Ｄ、Ｈ１８Ｙ／Ｄ４６Ｅ、Ｈ１８Ｙ／Ｄ４６Ｖ、Ｈ１８Ｙ／Ｍ４７Ｉ、Ｈ１８Ｙ／Ｍ４７Ｌ、Ｈ１８Ｙ／Ｖ６８Ｍ、Ｈ１８Ｙ／Ａ７１Ｇ、Ｈ１８Ｙ／Ｌ８５Ｑ、Ｈ１８Ｙ／Ｄ９０Ｇを含む。バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、提供される実施形態に従ってさらなるアミノ酸改変を提供することができる。表１は、記載される例示的なアミノ酸改変及びバリアントＣＤ８０ポリペプチドについて記載する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた２６位に対応する位置に非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換Ａ２６Ｅ、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１８、３５、４６、４７、６８、７１、８５または９０の１つまたは複数の位置に、１つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、Ｈ１８Ｙ、Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｖ６８Ｍ、Ａ７１Ｇ、Ｌ８５ＱまたはＤ９０Ｇの１つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ／Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ、Ａ２６Ｅ／Ｄ４６Ｅ、Ａ２６Ｅ／Ｄ４６Ｖ、Ａ２６Ｅ／Ｍ４７Ｉ、Ａ２６Ｅ／Ｍ４７Ｌ、Ａ２６Ｅ／Ｖ６８Ｍ、Ａ２６Ｅ／Ａ７１Ｇ、Ａ２６Ｅ／Ｌ８５Ｑ、Ａ２６Ｅ／Ｄ９０Ｇを含む。バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、提供される実施形態に従って、本明細書に記載されるものなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表１は、記載される例示的なアミノ酸改変及びバリアントＣＤ８０ポリペプチドについて記載する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた３５位に対応する位置に非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換Ｅ３５Ｄ、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１８、２６、４６、４７、６８、７１、８５または９０の１つまたは複数の位置に、１つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｖ６８Ｍ、Ａ７１Ｇ、Ｌ８５ＱまたはＤ９０Ｇの１つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ／Ｅ３５Ｄ、Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｅ、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ、Ｅ３５Ｄ／Ｖ６８Ｍ、Ｅ３５Ｄ／Ａ７１Ｇ、Ｅ３５Ｄ／Ｌ８５Ｑ、Ｅ３５Ｄ／Ｄ９０Ｇを含む。バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、提供される実施形態に従って、本明細書に記載されるものなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表１は、記載される例示的なアミノ酸改変及びバリアントＣＤ８０ポリペプチドについて記載する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた４６位に対応する位置に非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換Ｄ４６ＥまたはＤ４６Ｖ、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１８、２６、３５、４７、６８、７１、８５または９０の１つまたは複数の位置に、１つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｖ６８Ｍ、Ａ７１Ｇ、Ｌ８５ＱまたはＤ９０Ｇの１つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ／Ｄ４６Ｅ、Ａ２６Ｅ／Ｄ４６Ｅ、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｅ／Ｍ４７Ｉ、Ｄ４６Ｅ／Ｍ４７Ｌ、Ｄ４６Ｅ／Ｖ６８Ｍ、Ｄ４６Ｅ／Ａ７１Ｇ、Ｄ４６Ｅ／Ｌ８５Ｑ、Ｄ４６Ｅ／Ｄ９０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ／Ｄ４６Ｖ、Ａ２６Ｅ／Ｄ４６Ｖ、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ、Ｄ４６Ｖ／Ｍ４７Ｉ、Ｄ４６Ｖ／Ｍ４７Ｌ、Ｄ４６Ｖ／Ｖ６８Ｍ、Ｄ４６Ｖ／Ａ７１Ｇ、Ｄ４６Ｖ／Ｌ８５Ｑ、Ｄ４６Ｖ／Ｄ９０Ｇを含む。バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、提供される実施形態に従って、本明細書に記載されるものなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表１は、記載される例示的なアミノ酸改変及びバリアントＣＤ８０ポリペプチドについて記載する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた４７位に対応する位置に非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換Ｍ４７ＩまたはＭ４７Ｌ、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１８、２６、３５、４６、６８、７１、８５または９０の１つまたは複数の位置に、１つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｖ６８Ｍ、Ａ７１Ｇ、Ｌ８５ＱまたはＤ９０Ｇの１つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ／Ｍ４７Ｉ、Ａ２６Ｅ／Ｍ４７Ｉ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｉ／Ｄ４６Ｅ、Ｍ４７Ｉ／Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ／Ｖ６８Ｍ、Ｍ４７Ｉ／Ａ７１Ｇ、Ｍ４７Ｉ／Ｌ８５ＱまたはＭ４７Ｉ／Ｄ９０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ／Ｍ４７Ｌ、Ａ２６Ｅ／Ｍ４７Ｌ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｌ／Ｄ４６Ｅ、Ｍ４７Ｌ／Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ、Ｍ４７Ｌ／Ａ７１Ｇ、Ｍ４７Ｌ／Ｌ８５ＱまたはＭ４７Ｌ／Ｄ９０Ｇを含む。バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、提供される実施形態に従って、本明細書に記載されるものなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表１は、記載される例示的なアミノ酸改変及びバリアントＣＤ８０ポリペプチドについて記載する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた６８位に対応する位置に非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換Ｖ６８Ｍ、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１８、２６、３５、４６、４７、７１、８５または９０の１つまたは複数の位置に、１つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ａ７１Ｇ、Ｌ８５ＱまたはＤ９０Ｇの１つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ／Ｖ６８Ｍ、Ａ２６Ｅ／Ｖ６８Ｍ、Ｅ３５Ｄ／Ｖ６８Ｍ、Ｄ４６Ｅ／Ｖ６８Ｍ、Ｄ４６Ｖ／Ｄ６８Ｍ、Ｍ４７Ｉ／Ｖ６８Ｍ、Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ、Ｖ６８Ｍ／Ａ７１Ｇ、Ｖ６８Ｍ／Ｌ８５Ｑ、Ｖ６８Ｍ／Ｄ９０Ｇを含む。バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、提供される実施形態に従って、本明細書に記載されるものなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表１は、記載される例示的なアミノ酸改変及びバリアントＣＤ８０ポリペプチドについて記載する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた７１位に対応する位置に非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換Ａ７１Ｇ、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１８、２６、３５、４６、４７、６８、８５または９０の１つまたは複数の位置に、１つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｖ６８Ｍ、Ｌ８５ＱまたはＤ９０Ｇの１つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ／Ａ７１Ｇ、Ａ２６Ｅ／Ａ７１Ｇ、Ｅ３５Ｄ／Ａ７１Ｇ、Ｄ４６Ｅ／Ａ７１Ｇ、Ｄ４６Ｖ／Ｄ６８Ｍ、Ｍ４７Ｉ／Ａ７１Ｇ、Ｍ４７Ｌ／Ａ７１Ｇ、Ｖ６８Ｍ／Ａ７１Ｇ、Ａ７１Ｇ／Ｌ８５Ｑ、Ａ７１Ｇ／Ｄ９０Ｇを含む。バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、提供される実施形態に従って、本明細書に記載されるものなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表１は、記載される例示的なアミノ酸改変及びバリアントＣＤ８０ポリペプチドについて記載する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた８５位に対応する位置に非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換Ｌ８５Ｑ、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１８、２６、３５、４６、４７、６８、７１または９０の１つまたは複数の位置に、１つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｖ６８Ｍ、Ａ７１ＧまたはＤ９０Ｇの１つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ／Ｌ８５Ｑ、Ａ２６Ｅ／Ｌ８５Ｑ、Ｅ３５Ｄ／Ｌ８５Ｑ、Ｄ４６Ｅ／Ｌ８５Ｑ、Ｄ４６Ｖ／Ｄ６８Ｍ、Ｍ４７Ｉ／Ｌ８５Ｑ、Ｍ４７Ｌ／Ｌ８５Ｑ、Ｖ６８Ｍ／Ｌ８５Ｑ、Ａ７１Ｇ／Ｌ８５Ｑ、Ｌ８５Ｑ／Ｄ９０Ｇを含む。バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、提供される実施形態に従って、本明細書に記載されるものなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表１は、記載される例示的なアミノ酸改変及びバリアントＣＤ８０ポリペプチドについて記載する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた９０位に対応する位置に非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、アミノ酸置換Ｄ９０Ｇ、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１８、２６、３５、４６、４７、６８、７１または８５の１つまたは複数の位置に、１つまたは複数のアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｖ６８Ｍ、Ａ７１ＧまたはＬ８５Ｑの１つまたは複数のアミノ酸置換、またはその保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ／Ｄ９０Ｇ、Ａ２６Ｅ／Ｄ９０Ｇ、Ｅ３５Ｄ／Ｄ９０Ｇ、Ｄ４６Ｅ／Ｄ９０Ｇ、Ｄ４６Ｖ／Ｄ６８Ｍ、Ｍ４７Ｉ／Ｄ９０Ｇ、Ｍ４７Ｌ／Ｄ９０Ｇ、Ｖ６８Ｍ／Ｄ９０Ｇ、Ａ７１Ｇ／Ｄ９０Ｇ、Ｌ８５Ｑ／Ｄ９０Ｇを含む。バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、提供される実施形態に従って、本明細書に記載されるものなどのさらなるアミノ酸改変を含むことができる。表１は、記載される例示的なアミノ酸改変及びバリアントＣＤ８０ポリペプチドについて記載する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６または１５０に記載の非改変ＣＤ８０ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、Ｈ１８Ｙ／Ｍ４７Ｉ／Ｔ５７Ｉ／Ａ７１Ｇ、Ｈ１８Ｙ／Ａ２６Ｔ／Ｅ３５Ｄ／Ａ７１Ｄ／Ｌ８５ＱまたはＨ１８Ｙ／Ａ７１Ｄ／Ｌ７２Ｐ／Ｅ８８Ｖのみである。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１、５９、６６、１１５、１３３、１４０、１８９、２０７または２１４に記載のポリペプチドではない。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６または１５０に記載の非改変ＣＤ８０ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｌ８５Ｑのみである。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：７３、１４７または２２１に記載のポリペプチドではない。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６または１５０に記載の非改変ＣＤ８０ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｌ６５Ｐ／Ｄ９０Ｎ、Ｌ２５Ｓ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｄ９０Ｎ、Ｅ３５Ｄ／Ａ７１Ｄ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ、Ｅ３５Ｄ／Ｔ５７Ｉ／Ｌ７０Ｑ／Ａ７１Ｄ、Ｅ３５Ｄ／Ａ７１Ｄ、Ｅ３５Ｄ／Ｉ６７Ｌ／Ａ７１Ｄ．Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｌ７０Ｍ、Ｅ３５Ｄ／Ａ７１Ｄ／Ｌ７２Ｖ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４３Ｌ／Ｌ７０Ｍ、Ａ２６Ｐ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４３Ｉ／Ｌ８５Ｑ／Ｅ８８Ｄ、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ／Ｌ８５Ｑ、Ｑ２７Ｌ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｔ５７Ｉ／Ｌ７０Ｑ／Ｅ８８Ｄ、Ｅ３５Ｄ／Ｔ５７Ａ／Ａ７１Ｄ／Ｌ８５Ｑ、Ｈ１８Ｙ／Ａ２６Ｔ／Ｅ３５Ｄ／Ａ７１Ｄ／Ｌ８５Ｑ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４３Ｉ／Ａ７１Ｄ、Ｅ２３Ｇ／Ａ２６Ｓ／Ｅ３５Ｄ／Ｔ６２Ｎ／Ａ７１Ｄ／Ｌ７２Ｖ／Ｌ８５Ｍ、Ａ１２Ｔ／Ｅ２４Ｄ／Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ／Ｉ６１Ｖ／Ｌ７２Ｐ／Ｅ９５Ｖ、Ｖ２２Ｌ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４３Ｌ／Ａ７１Ｇ／Ｄ７６Ｈ、Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｌ８５Ｑ、Ｙ３１Ｈ／Ｅ３５Ｄ／Ｔ４１Ｓ／Ｖ６８Ｌ／Ｋ９３Ｒ／Ｒ９４Ｗのみである。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９、２０、２８、２９、３７、４６、４７、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６４、６８、６９，７０、７３、７５、９３、９４、１０２、１０３、１１１、１２０、１２１、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３２、１３３、１３４、１３８、１４２、１４３、１４４、１４７、１４９、１６７、１６８、１７６、１７７、１８５、１９４、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０７、２０８、２１２、２１６、２１７、２１８、２２１または２２３に記載のポリペプチドではない。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６または１５０に記載の非改変ＣＤ８０ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ／Ｌ８５Ｑ、Ａ１２Ｔ／Ｅ２４Ｄ／Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ／Ｉ６１Ｖ／Ｌ７２Ｐ／Ｅ９５ＶまたはＤ４６Ｅ／Ａ７１Ｄのみである。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：５５、６９、７４、１２９、１４３、１４８、２０３、２１７または２２２に記載のポリペプチドではない。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６または１５０に記載の非改変ＣＤ８０ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｌ６５Ｐ／Ｄ９０Ｎ、Ｌ２５Ｓ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｄ９０Ｎ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ａ、Ｍ４７Ｉ／Ｅ８８Ｄ、Ｈ１８Ｙ／Ｍ４７Ｉ／Ｔ５７Ｉ／Ａ７１Ｇ、Ｔ１３Ｒ／Ｍ４２Ｖ／Ｍ４７Ｉ／Ａ７１Ｄ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｌ７０Ｍ、Ｑ２７Ｌ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｔ５７Ｉ／Ｌ７０Ｑ／Ｅ８８Ｄ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ、Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｌ８５Ｑのみである。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９、２０、２９、３３、３８、４１、４９、５１、５６、６０、７３、９３、９４、１０３、１０７、１１２、１１５、１２３、１２５、１３０、１３４、１４７、１６７、１６８、１７７、１８１、１８６、１８９、１９７、１９９、２０４、２０８、２２１に記載のポリペプチドではない。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６または１５０に記載の非改変ＣＤ８０ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｌ８５Ｑのみである。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２、１３６、２１０に記載のポリペプチドではない。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６または１５０に記載の非改変ＣＤ８０ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、Ｈ１８Ｙ／Ｍ４７Ｉ／Ｔ５７Ｉ／Ａ７１ＧまたはＶ２２Ｌ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４３Ｌ／Ａ７１Ｇ／Ｄ７６Ｈのみである。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１、７０、１１５、１４４、１８９または２１８に記載のポリペプチドではない。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６または１５０に記載の非改変ＣＤ８０ポリペプチドにアミノ酸改変を含有せず、アミノ酸改変は、Ａ２６Ｐ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４３Ｉ／Ｌ８５Ｑ／Ｅ８８Ｄ、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ／Ｌ８５Ｑ、Ｅ３５Ｄ／Ｔ５７Ａ／Ａ７１Ｄ／Ｌ８５Ｑ、Ｈ１８Ｙ／Ａ２６Ｔ／Ｅ３５Ｄ／Ａ７１Ｄ／Ｌ８５ＱまたはＡ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｌ８５Ｑのみである。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４、５５、５８、５９、７３、１２８、１２９、１３２、１３３、１４７、２０２、２０３、２０６、２０７または２２１に記載のポリペプチドではない。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｅ３５Ｄ及びＭ４７Ｌに対応する位置に、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片にアミノ酸改変を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｅ３５Ｄ及びＭ４７Ｌに対応するアミノ酸改変を、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｅ３５Ｄ及びＡ７１Ｇに対応するアミノ酸改変を、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｅ３５Ｄ及びＭ４７Ｖに対応するアミノ酸改変を、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｅ３５Ｄ及びＶ６８Ｍに対応するアミノ酸改変を、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｈ１８Ｙ及びＥ３５Ｄに対応するアミノ酸改変を、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸改変を含み、該少なくとも３つの改変には、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた１８、２６、３５、４６、４７、６８、７１、８５または９０位に対応する３つ以上の位置での改変が含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのアミノ酸改変は、Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｖ６８Ｍ、Ａ７１Ｇ、Ｌ８５Ｑ、またはＤ９０Ｇ、またはその保存的アミノ酸置換に対応するアミノ酸改変を、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍに対応するアミノ酸改変を、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ／Ｖ６８Ｍに対応するアミノ酸改変を、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｌ８５Ｑに対応するアミノ酸改変を、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｈ１８Ｙ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉに対応するアミノ酸改変を、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、表１に列挙された置換（変異）のいずれかを含む。表１はまた、野生型ＣＤ８０または例示的なバリアントＣＤ８０ポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＩｇＶドメインについてＳＥＱＩＤＮＯ：を参照することにより例示的な配列を提供する。示されるように、所与のドメインに対応する正確な遺伝子座または残基は、ドメインの特定または分類に使用される方法などに応じて異なる場合がある。さらに、場合によっては、所与のドメイン（例えば、ＩｇＶ）の隣接するＮ末端及び／またはＣ末端アミノ酸も、例えば発現されたときにドメインの適切なフォールディングを確実にするために、バリアントＩｇＳＦポリペプチドの配列に含めることができる。したがって、表１におけるＳＥＱＩＤＮＯ：の例示は、限定するものと解釈されるべきではないことが理解されよう。例えば、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの特定のドメイン（例えば、ＩｇＶドメイン）は、それぞれのＳＥＱＩＤＮＯ：に記載のアミノ酸配列よりもいくつかのアミノ酸分長いかまたは短く、例えば１〜１０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸分長いかまたは短い場合がある。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、表１に列挙された細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列のうちのいずれか（すなわち、ＳＥＱＩＤＮＯ：３〜７５、２００９〜２１０４、２２９７〜２５０７、２９３０〜２９６０のうちのいずれか１つ）を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、表１に列挙された細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列のうちのいずれか（すなわち、ＳＥＱＩＤＮＯ：３〜７５、２００９〜２１０４、２２９７〜２５０７、２９３０〜２９６０のうちのいずれか１つ）に対して少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性、または９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、野生型または非改変ＣＤ８０には存在しないアミノ酸改変（例えば、置換）（複数可）を含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、表１に列挙された細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列のうちのいずれか（すなわち、ＳＥＱＩＤＮＯ：３〜７５、２００９〜２１０４、２２９７〜２５０７、２９３０〜２９６０のうちのいずれか１つ）の特異的結合断片を含み、野生型または非改変ＣＤ８０には存在しないアミノ酸改変（例えば、置換）（複数可）を含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、表１に列挙されたＩｇＶ配列のうちのいずれか（すなわち、ＳＥＱＩＤＮＯ：７７〜１４９、１５１〜２２３、２１０５〜２２９６、２５０８〜２９２９、２９６１〜３０２２のうちのいずれか１つ）を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、表１に列挙されたＩｇＶ配列のうちのいずれか（すなわち、ＳＥＱＩＤＮＯ：７７〜１４９、１５１〜２２３、２１０５〜２２９６、２５０８〜２９２９、２９６１〜３０２２のうちのいずれか１つ）に対して少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性、または９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、野生型または非改変ＣＤ８０には存在しないアミノ酸改変（例えば、置換）（複数可）を含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、表１に列挙されたＩｇＶ配列のうちのいずれか（すなわち、ＳＥＱＩＤＮＯ：７７〜１４９、１５１〜２２３、２１０５〜２２９６、２５０８〜２９２９、２９６１〜３０２２のうちのいずれか１つ）の特異的結合断片を含み、野生型または非改変ＣＤ８０には存在しないアミノ酸改変（例えば、置換）（複数可）を含有する。

表１はまた、野生型ＣＤ８０または例示的なバリアントＣＤ８０ポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＩｇＶドメインについてＳＥＱＩＤＮＯ：を参照することにより例示的な配列を提供する。示されるように、所与のドメインに対応する正確な遺伝子座または残基は、ドメインの特定または分類に使用される方法などに応じて異なる場合がある。さらに、場合によっては、所与のドメイン（例えば、ＥＣＤ）の隣接するＮ末端及び／またはＣ末端アミノ酸も、例えば発現されたときにドメインの適切なフォールディングを確実にするために、バリアントＩｇＳＦポリペプチドの配列に含めることができる。したがって、表１におけるＳＥＱＩＤＮＯ：の例示は、限定するものと解釈されるべきではないことが理解されよう。例えば、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの特定のドメイン（例えば、ＩｇＶドメイン）は、それぞれのＳＥＱＩＤＮＯ：に記載のアミノ酸配列よりもいくつかのアミノ酸分長いかまたは短く、例えば１〜１０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸分長いかまたは短い場合がある。

（表１）例示的なバリアントＣＤ８０ポリペプチド

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸改変は、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、１つまたは複数の結合パートナー、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＤ２８に対して変化した（増加または減少した）結合活性または親和性を示すように、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドに含有されるＩｇＳＦドメインと比べて少なくとも１つの親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶまたはＩｇＣなど）またはその特異的結合断片を産生する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えば固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、フローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイによって測定した場合に、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチド対照配列のものとは異なる、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１またはＣＤ２８に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＤ２８に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＴＬＡ−４に対して減少した結合親和性を有する。ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＴＬＡ−４は、哺乳動物タンパク質、例えばヒトタンパク質またはネズミタンパク質であることができる。

結合パートナーのそれぞれの結合親和性は独立しており、つまり、いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＴＬＡ−４のうちの１つ、２つ、または３つに対する増加した結合親和性を有し、及び／またはＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＴＬＡ−４のうちの１つ、２つまたは３つに対する減少した結合親和性を有する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＰＤ−Ｌ１に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＤ２８に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＤ２８に対して減少した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＰＤ−Ｌ１に対して減少した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４に対して減少した結合親和性を有する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４に対して増加した結合親和性を有し、ＰＤ−Ｌ１に対して減少した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１に対して減少した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４に対して減少した結合親和性を有し、ＰＤ−Ｌ１に対して増加した結合親和性を有する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４に対して増加した結合親和性を有し、ＣＤ２８に対して減少した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８に対して減少した結合親和性を有する。これらの実施形態では、

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ２８に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＰＤ−Ｌ１に対して増加した結合親和性を有し、ＣＤ２８に対して減少した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ２８に対して減少した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＰＤ−Ｌ１に対して減少した結合親和性を有し、ＣＤ２８に対して増加した結合親和性を有する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ヒトＣＴＬＡ−４のエクトドメインへの非改変または野生型ＣＤ８０の結合親和性以下である、ヒトＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対する結合親和性を示す。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ２８に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１に対して増加した結合親和性を有し、ＣＤ２８に対して減少した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８に対して増加した結合親和性を有し、ＰＤ−Ｌ１に対して減少した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１に対して減少した結合親和性を有し、ＣＤ２８に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４に対して減少した結合親和性を有し、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ２８に対して増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４に対して増加した結合親和性を有し、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ２８に対して減少した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ２８に対して減少した結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４に対して減少した結合親和性を有し、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ−２８に対して増加した結合親和性を有する。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＴＬＡ−４に対する結合親和性が増加した、またはより大きいバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチド対照と比べて、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＤ２８結合パートナー（複数可）に対して少なくとも約５％、例えば少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３５％、または約５０％の結合親和性の増加を有する。いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べた結合親和性の増加は、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍より多い。このような例では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有しないこと以外は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドと同じ配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＤ２８に対する結合親和性が減少した、または低下したバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチド対照と比べて、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＤ２８への少なくとも５％、例えば少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％以上の結合親和性の減少を有する。いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べた結合親和性の減少は、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍より多い。このような例では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有しないこと以外は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドと同じ配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＤ２８に対する前述の実施形態のいずれかの平衡解離定数（Ｋ_ｄ）は、少なくとも１×１０^−５Ｍ、１×１０^−６Ｍ、１×１０^−７Ｍ、１×１０^−８Ｍ、１×１０^−９Ｍ、１×１０^−１０Ｍまたは１×１０^−１１Ｍ、または１×１０^−１２Ｍであることができる。

いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドに含有されるＩｇＳＦドメインと比べて少なくとも１つの親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶまたはＩｇＣなど）またはその特異的結合断片を含有する提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数の結合パートナーに結合時に野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、細胞内シグナルに応答してサイトカインを放出することができるＴ細胞などのシグナル伝達可能な細胞の表面に発現したＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８などの、１つまたは複数の機能的結合パートナーによって誘導される変化した（増加する／刺激するまたは減少する／阻害する）シグナル伝達を示す。いくつかの実施形態では、変化したシグナル伝達は、同じフォーマットにおいて、特定のバリアント及び／または野生型もしくは非改変ＣＤ８０ポリペプチドとのインキュベーション後に、例えばサイトカイン放出（例えばＩＬ−２放出）を測定するアッセイによって決定されるような、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチド対照配列によってもたらされるものとは異なる。例示的なアッセイが実施例８〜１０に記載されている。例示的なアッセイでは、サイトカイン放出は、サイトカイン放出細胞の表面に発現する機能的結合パートナーのシグナル伝達活性の合計の関数である。本書の他の場所で説明されているように、いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのフォーマットが、活性のタイプ（例えば作動または拮抗）に影響を与える可能性がある。

ＣＴＬＡ−４は阻害性シグナル伝達を誘導するため、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達の増加により、いくつかの例示的なアッセイでサイトカイン放出の減少をもたらす。逆に、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達の減少により阻害性シグナル伝達が減少するが、サイトカイン放出は減少せず、これにより、いくつかのアッセイではサイトカイン放出が増加する場合がある。ＣＤ２８シグナル伝達はサイトカイン放出を刺激するため、ＣＤ２８シグナル伝達の増加により、例示的なアッセイでサイトカイン放出の増加をもたらす。逆に、ＣＤ２８シグナル伝達の減少により、例示的なアッセイでサイトカイン放出の減少をもたらす。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＤ２８媒介性シグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＴＬＡ−４媒介性シグナル伝達を減少させる。

コグネイト結合パートナーのそれぞれの結合親和性は独立しており、したがって、いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＴＬＡ−４のうちの１つ、２つ、または３つにより誘導されるシグナル伝達を増加させることができ、及び／またはＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＴＬＡ−４のうちの１つ、２つまたは３つにより誘導されるシグナル伝達を減少させることができる。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４により誘導されるシグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１により誘導されるシグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、結合時にＣＤ２８により誘導されるシグナル伝達を増加させる。いくつかの好ましい実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、結合時にＣＤ２８により誘導されるシグナル伝達を減少させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０は、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１により誘導されるシグナル伝達を減少させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４により誘導されるシグナル伝達を減少させる。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８により誘導されるシグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４により誘導されるシグナル伝達を増加させ、ＣＤ２８により誘導されるシグナル伝達を減少させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８により誘導されるシグナル伝達を減少させる。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８により誘導されるシグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４により誘導されるシグナル伝達を増加させ、ＣＤ２８により誘導されるシグナル伝達を減少させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８により誘導されるシグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４により誘導されるシグナル伝達を減少させ、ＣＤ２８により誘導されるシグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４により誘導されるシグナル伝達を減少させ、ＣＤ２８により誘導されるシグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比べて、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８により誘導されるシグナル伝達を減少させる。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４により誘導される阻害性シグナル伝達を刺激または増加させるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドにより誘導されるシグナルよりも９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、またはそれ以下であるシグナルを生成する。このような例では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有しないこと以外は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドと同じ配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２８により誘導されるシグナル伝達を刺激または増加させるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドにより誘導されるシグナルの少なくとも１０５％、１１０％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、またはそれ以上であるシグナルを生成する。このような例では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有しないこと以外は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドと同じ配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４により誘導される阻害性シグナル伝達を阻害または減少させるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドにより誘導されるシグナルの少なくとも１０５％、１１０％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、またはそれ以上であるシグナルを生成する。このような例では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有しないこと以外は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドと同じ配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２８により誘導される阻害性シグナル伝達を阻害または減少させるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドにより誘導されるシグナルの、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、またはそれ以下であるシグナルを生成する。このような例では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有しないこと以外は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドと同じ配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４により誘導される阻害性シグナル伝達に影響を与える、及び／またはＣＤ２８によるシグナル伝達に影響を与えるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、対応する野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドによりもたらされるＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８シグナル伝達の合計より少ない、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８シグナル伝達の合計をもたらす。かかる実施形態では、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８シグナル伝達の合計は、対応する野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドによりもたらされるシグナルの、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％以下である。このような例では、対応する野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有しないこと以外は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドと同じ配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４により誘導される阻害性シグナル伝達に影響を与える、及び／またはＣＤ２８によるシグナル伝達に影響を与えるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、対応する野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドにより影響を受けたＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８シグナル伝達の合計より大きいＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８シグナル伝達の合計をもたらす。かかる実施形態では、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８シグナル伝達の合計は、対応する野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドにより影響を受けたシグナルの少なくとも１０５％、１１０％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、またはそれ以上である。このような例では、対応する野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有しないこと以外は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドと同じ配列を有する。

１．ＣＴＬＡ４
いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１に記載の配列を含む、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドなどの野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較してＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１に記載の配列を含む、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対して増加した親和性、及びＣＤ２８のエクトドメインに対して減少した親和性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対する増加した親和性は、ＣＴＬＡ−４のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または６０倍より大きく増加する。

これらの実施形態のいくつかでは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較してＣＴＬＡ−４に対して増加した結合親和性を示すバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１の７、１２、１３、１６、１８、２０、２２、２３、２４、２６、２７、３０、３３、３５、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５２、５３、５４、５７、５８、６１、６２、６３、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７７、７９、８１、８３、８４、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、及び／または９７位に対応する、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。これらの実施形態のいくつかでは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較してＣＴＬＡ−４に対して増加した結合親和性を示すバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１の７、２３、２６、３０、３５、４６、５７、５８、７１、７３、７９及び／または８４位に対応する、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。

からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、

からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。

である。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１より大きいＣＴＬＡ−４結合とＣＤ２８結合の比（ＣＴＬＡ４：ＣＤ２８結合比）によって示されるように、非改変ＣＤ８０ポリペプチド（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１に記載される）へのＣＴＬＡ−４の結合対ＣＤ２８への結合の結合比と比較して、ＣＴＬＡ−４対ＣＤ２８の増加した選択性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくはそれ以上より大きい、または約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、もしくはそれ以上より大きい、または１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくはそれ以上のＣＴＬＡ−４対ＣＤ２８の結合比を示す。これらの実施形態のいくつかでは、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１の３０、３５、５７、７１、または８４位に対応する、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｔ１３Ａ、Ｔ１３Ｒ、Ｓ１５Ｔ、Ｖ２２Ｉ、Ｖ２２Ｌ、Ｑ２７Ｈ、Ｉ３０Ｖ、Ｑ３３Ｒ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｔ４１Ｓ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｎ４８Ｙ、Ｙ５３Ｆ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ６１Ｆ、Ｉ６１Ｖ、Ｉ６７Ｌ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｌ７２Ｖ、Ｔ７９Ｍ、Ｅ８１Ｇ、Ｅ８１Ｋ、Ｖ８４Ａ、Ｖ８４Ｉ、及びＬ８５Ｍ、Ｙ８７Ｃ、Ｙ８７Ｄからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、

である。

２．ＣＤ２８
いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＣＤ２８のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１に記載の配列を含む、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＣＤ２８のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８のエクトドメインに対する増加した親和性は、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、または２００倍より大きく増加する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１に記載の配列を含む、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＣＤ２８のエクトドメイン及びＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１に記載の配列を含む、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＣＤ２８のエクトドメイン、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメイン、及びＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ならびにＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１の一方または両方のエクトドメインに対する増加した親和性は、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、または４５０倍より大きく別々に増加する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１に記載の配列を含む、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＣＤ２８のエクトドメインに対して増加した親和性、及びＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対して減少した親和性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１に記載の配列を含む、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＣＤ２８のエクトドメイン及びＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した親和性、ならびにＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対して減少した親和性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対する減少した親和性は、ＣＴＬＡ−４のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または６０倍より大きく減少する。

これらの実施形態のいくつかでは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＣＤ２８に対して増加した結合親和性を示すバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１の１２、１３、１８、２０、２２、２３、２４、２６、２７、３１、３５、４１、４２、４３、４６、４７、５４、５５、５７、５８、６１、６２、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７９、８３、８４、８５、８８、９０、９３、９４、及び／または９５位に対応する、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。これらの実施形態のいくつかでは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較してＣＤ２８に対して増加した結合親和性を示すバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１の２３、２６、３５、４６、５５、５７、５８、７１、７９及び／または８４位に対応する、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ａ１２Ｔ、Ｔ１３Ｒ、Ｓ１５Ｔ、Ｈ１８Ａ、Ｈ１８Ｃ、Ｈ１８Ｆ、Ｈ１８Ｉ、Ｈ１８Ｔ、Ｈ１８Ｖ、Ｈ１８Ｙ、Ｖ２０Ｉ、Ｓ２１Ｐ、Ｖ２２Ａ、Ｖ２２Ｄ、Ｖ２２Ｌ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｇ、Ｅ２４Ｄ、Ａ２６Ｄ、Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｇ、Ａ２６Ｈ、Ａ２６Ｋ、Ａ２６Ｎ、Ａ２６Ｐ、Ａ２６Ｑ、Ａ２６Ｒ、Ａ２６Ｓ、Ａ２６Ｔ、Ｑ２７Ｈ、Ｑ２７Ｌ、Ｑ２７Ｒ、Ｙ３１Ｈ、Ｑ３３Ｒ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｋ３７Ｅ、Ｍ３８Ｉ、Ｔ４１Ｓ、Ｍ４２Ｖ、Ｍ４３Ｉ、Ｍ４３Ｌ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｎ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｍ４７Ｙ、Ｎ４８Ｋ、Ｎ４８Ｙ、Ｙ５３Ｆ、Ｋ５４Ｅ、Ｎ５５Ｉ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｉ６１Ｆ、Ｉ６１Ｖ、Ｔ６２Ａ、Ｔ６２Ｎ、Ｔ６２Ｓ、Ｎ６４Ｓ、Ｉ６７Ｌ、Ｖ６８Ｅ、Ｖ６８Ｉ、Ｖ６８Ｌ、Ｖ６８Ｍ、Ｉ６９Ｆ、Ｌ７０Ｍ、Ｌ７０Ｑ、Ｌ７０Ｒ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｌ７２Ｐ、Ｌ７２Ｖ、Ｔ７９Ｉ、Ｔ７９Ｍ、Ｖ８３Ｉ、Ｖ８４Ｉ、Ｌ８５Ｍ、Ｌ８５Ｑ、Ｙ８７Ｃ、Ｙ８７Ｄ、Ｙ８７Ｎ、Ｅ８８Ｄ、Ｅ８８Ｖ、Ｄ９０Ｇ、Ｄ９０Ｎ、Ｄ９０Ｐ、Ａ９１Ｇ、Ａ９１Ｓ、Ｋ９３Ｅ、Ｋ９３Ｒ、Ｒ９４Ｌ、Ｒ９４Ｑ、Ｒ９４Ｗ、Ｅ９５Ｋ、Ｅ９５Ｖ、及びＬ９７Ｑからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｔ１３Ｒ、Ｓ１５Ｔ、Ｈ１８Ａ、Ｈ１８Ｃ、Ｈ１８Ｆ、Ｈ１８Ｉ、Ｈ１８Ｔ、Ｈ１８Ｖ，Ｖ２０Ｉ、Ｖ２２Ｄ、Ｖ２２Ｌ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｇ、Ｅ２４Ｄ、Ａ２６Ｄ，Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｇ、Ａ２６Ｈ、Ａ２６Ｋ、Ａ２６Ｎ、Ａ２６Ｐ、Ａ２６Ｑ、Ａ２６Ｒ、Ａ２６Ｓ、Ａ２６Ｔ、Ｑ２７Ｈ、Ｑ２７Ｌ、Ｑ３３Ｒ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｔ４１Ｓ、Ｍ４２Ｖ、Ｍ４３Ｌ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｎ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｍ４７Ｙ、Ｎ４８Ｋ、Ｎ４８Ｙ、Ｙ５３Ｆ、Ｋ５４Ｅ、Ｎ５５Ｉ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｉ６１Ｆ、Ｉ６１Ｖ、Ｔ６２Ａ、Ｔ６２Ｎ、Ｉ６７Ｌ、Ｖ６８Ｅ、Ｖ６８Ｉ、Ｖ６８Ｌ、Ｉ６９Ｆ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｌ７２Ｖ、Ｔ７９Ｉ、Ｔ７９Ｍ、Ｖ８４Ｉ、Ｌ８５Ｍ、Ｌ８５Ｑ、Ｙ８７Ｃ、Ｙ８７Ｄ、Ｅ８８Ｖ、Ｄ９０Ｐ、Ｒ９４Ｑ、Ｒ９４Ｗ、Ｅ９５Ｖ、Ｌ９７Ｑからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。

である。

３．ＰＤ−Ｌ１
いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＰＤ−Ｌ１に対して増加した親和性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１に記載の配列を含む、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメイン及びＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対して増加した親和性を示す。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対する増加した親和性は、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、または４５０倍より大きく増加する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１に記載の配列を含む、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した親和性、及びＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対して減少した親和性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１に記載の配列を含む、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した親和性、及びＣＤ２８のエクトドメインに対して減少した親和性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８のエクトドメインに対する減少した親和性は、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または６０倍より大きく減少する。

これらの実施形態のいくつかでは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較してＰＤ−Ｌ１に対して増加した結合親和性を示すバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１の７、１２、１３、１５、１６、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５７、５８、６１、６２、６３、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、及び／または９７位に対応する、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。これらの実施形態のいくつかでは、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較してＰＤ−Ｌ１に対して増加した結合親和性を示すバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６、１５０、３０３０、または３０３１の７、２３、２６、３０、３４、３５、４６、５１、５５、５７、５８、６５、７１、７３、７８、７９、８２及び／または８４位に対応する、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する。

である。

いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した親和性を示す本明細書において提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激を示すことができるか、またはＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激活性をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激活性を媒介するか、またはこれをもたらし、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの親和性は、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、または４５０倍増加する。

いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激活性を示し、媒介し、またはそれをもたらす本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、野生型または非改変ＣＤ８０と比較して、ＣＤ２８のエクトドメインに対する結合を保持する。例えば、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＤ２８のエクトドメインに対する非改変ＣＤ８０ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＣＤ２８のエクトドメインに対する親和性の、少なくとも２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％、または少なくとも約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％もしくは約９５％を保持することができる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激活性を示し、媒介し、またはそれをもたらす本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較してＣＤ２８のエクトドメインに対する増加した親和性を示す。例えば、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、または２００倍より大きく増加するＣＤ２８のエクトドメインに対する増加した親和性を示すことができる。

ＩＩＩ．バリアントポリペプチドのフォーマット
ｖＩｇＤが含まれる本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０を含む免疫調節ポリペプチドは、可溶性タンパク質、膜結合タンパク質または分泌タンパク質などを含む多種多様な方法でフォーマットをとることができる。いくつかの実施形態では、特定のフォーマットは、所望の治療用途に合わせて選択できる。場合によっては、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む免疫調節ポリペプチドは、その結合パートナー、例えばＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、及び／またはＰＤ−Ｌ１の活性に拮抗するかまたはそれを遮断するフォーマットで提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１の拮抗作用は、腫瘍学における免疫の促進において有用であり得る。場合によっては、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む免疫調節ポリペプチドは、その結合パートナー、例えばＣＴＬＡ−４及び／またはＣＤ２８の活性を作動させるまたは刺激するフォーマットで提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の作動作用は、腫瘍学における免疫の促進において有用であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の作動作用は、ＰＤ−Ｌ１のＣＤ８０結合に依存し得るか、またはそれにより増強され得る。このようなＣＤ２８のＰＤ−Ｌ１依存性作動作用は、腫瘍学における免疫の促進において有用であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４の作動作用は、炎症または自己免疫の治療において有用であり得る。当業者は、例えば１つまたは複数の特異的コグネイト結合パートナーに拮抗するかまたはそれを作動させるための特定のフォーマットの活性を容易に決定することができる。そのような活性を評価するための例示的な方法は、実施例を含む、本明細書において提供される。

いくつかの態様では、可溶性であるＣＤ８０のｖＩｇＤを含む免疫調節タンパク質（例えばＦｃ鎖に融合する）が提供される。いくつかの態様では、１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、１つまたは複数の追加のｖＩｇＤ）は、本明細書において提供されるとおりのＣＤ８０のｖＩｇＤに連結され得る（以下「スタック」または「スタックされた」免疫調節タンパク質と呼ばれる）。いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質のモジュールフォーマットは、複数のカウンター構造体（複数のコグネイト結合パートナー）の活性を調節するための、免疫調節タンパク質を操作または生成するための柔軟性を提供する。いくつかの実施形態では、そのような「スタック」分子を、可溶性フォーマットで提供することができ、場合によっては、膜結合または分泌型タンパク質として提供してもよい。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０免疫調節タンパク質は、例えば対象に投与されたときに、例えばｖＩｇＤを特定の環境または細胞にターゲティングまたは局在化するために、リガンド（例えば、抗原）に特異的に結合するターゲティング物質または部分（例えば、抗体または他の結合分子）に直接的または間接的に連結されたＣＤ８０のｖＩｇＤを含有するコンジュゲートとして提供される。いくつかの実施形態では、ターゲティング物質、例えば、抗体または他の結合分子は、腫瘍抗原に結合し、それによりｖＩｇＤを含有するバリアントＣＤ８０を腫瘍微小環境に局在化させ、例えば、腫瘍微小環境に特異的な腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の活性を調節する。

いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、細胞において発現され、操作された細胞療法（ＥＣＴ）の一部として提供される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、細胞、例えば免疫細胞（例えば、Ｔ細胞または抗原提示細胞）において、膜結合形態で発現し、それにより膜貫通型免疫調節タンパク質（以下「ＴＩＰ」とも呼ばれる）を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＰによって認識されるコグネイト結合パートナーに応じて、ＴＩＰを発現する操作された細胞は、他の操作された細胞及び／または内在性Ｔ細胞に陽性または陰性のいずれかの共刺激シグナルを提供することによって、コグネイト結合パートナーを作動させることができる。いくつかの態様では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、細胞、例えば免疫細胞（例えば、Ｔ細胞または抗原提示細胞）において分泌可能形態で発現し、それにより例えば細胞が対象に投与されたときに、分泌または可溶性形態のバリアントＣＤ８０ポリペプチド（以下「ＳＩＰ」とも呼ばれる）を産生する。いくつかの態様では、ＳＩＰは、それが分泌される環境（例えば、腫瘍微小環境）において、コグネイト結合パートナーに拮抗することができる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、細胞中でのバリアントポリペプチドのＴＩＰまたはＳＩＰとしての送達または発現のために、対象への投与によって、細胞、例えば免疫細胞（例えば、Ｔ細胞または抗原提示細胞）にｉｎｖｉｖｏで感染することができる感染性物質（例えば、ウイルス性または細菌性物質）中で発現される。

いくつかの実施形態では、可溶性免疫調節ポリペプチド、例えばｖＩｇＤを含有するバリアントＣＤ８０は、提供されるコンジュゲートのいずれか１つまたは任意の組み合わせ（例えば、ターゲティング部分）にそれ自体コンジュゲートされることができるリポソーム内にカプセル化されることができる。いくつかの実施形態では、本発明の可溶性または膜結合型免疫調節ポリペプチドは、脱グリコシル化される。より具体的な実施形態では、バリアントＣＤ８０配列は脱グリコシル化される。さらにより具体的な実施形態では、バリアントＣＤ８０のＩｇＶ及び／またはＩｇＣ（例えば、ＩｇＣ２）ドメイン（複数可）は脱グリコシル化される。

提供されるフォーマットの非限定的な例を図１Ａ〜１Ｃに記載し、以下にさらに記載する。

Ａ．可溶性タンパク質
いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質は、可溶性タンパク質である。当業者であれば、細胞表面タンパク質が、典型的には、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を有すること、ならびに、細胞外ドメインまたはその免疫学的に活性な配列を使用してそのようなタンパク質の可溶性形態を作製することができることを認識するだろう。したがって、いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインまたは膜貫通ドメインの一部分を欠く。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０を含有する免疫調節タンパク質は、細胞内（細胞質）ドメインを欠いているか、または細胞内ドメインの一部分を欠く。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質は、アミノ酸改変（複数可）を含有するＩｇＶドメイン及び／またはＩｇＣ（例えば、ＩｇＣ２）ドメイン（複数可）またはその特異的結合断片を含有するＥＣＤドメインまたはその一部分を含有するｖＩｇＤ部分のみを含有する。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０を含む免疫調節ポリペプチドは、本発明の１つまたは複数のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、正確に１、２、３、４、５つのバリアントＣＤ８０配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０配列のうちの少なくとも２つは、同一のバリアントＣＤ８０配列である。

いくつかの実施形態では、提供される免疫調節ポリペプチドは、ＣＤ８０の２つ以上のｖＩｇＤ配列を含む。ポリペプチド鎖内の複数のバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、互いに同一（すなわち、同種）または非同一（すなわち、異種）のバリアントＣＤ８０配列であることができる。単一のポリペプチド鎖の実施形態に加えて、いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドの２つ、３つ、４つ、またはより多くが、互いに共有結合または非共有結合していてもよい。したがって、単量体、二量体、及びより高次の（例えば、３、４、５、またはより高次の）多量体タンパク質が本明細書において提供される。例えば、いくつかの実施形態では、正確に２つの本発明のポリペプチドが、互いに共有結合または非共有結合して二量体を形成することができる。いくつかの実施形態では、結合は、鎖間システインジスルフィド結合を介してなされる。本発明の２つ以上のポリペプチドを含む組成物は、同一種もしくは実質的に同一種のポリペプチド（例えば、ホモ二量体）または非同一種のポリペプチド（例えば、ヘテロ二量体）のものであることができる。本発明の複数の連結されたポリペプチドを有する組成物は、上に述べたとおり、各ポリペプチド鎖に１つまたは複数の同一または非同一の本発明のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを有することができる。

いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、単量体形態である及び／またはその結合パートナーへの１価の結合を示すバリアントＣＤ８０ポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの態様では、可溶性である及び／または膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを欠くバリアントＣＤ８０などの、記載されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、さらなる部分に直接的または間接的に連結される。いくつかの実施形態では、さらなる部分は、タンパク質、ペプチド、小分子または核酸である。いくつかの実施形態では、１価の免疫調節タンパク質は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、部分は、半減期延長部分である。このような半減期延長部分の例には、限定されないが、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｓｅｒ（ＰＡＳ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのベータサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アミノ酸の長い非構造化親水性配列（ＸＴＥＮ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはこれらの組み合わせが含まれる。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０を含む免疫調節ポリペプチドは、アミノ酸Ｐｒｏ、Ａｌａ、及びＳｅｒから構成される立体構造的に乱れたポリペプチド配列を含む部分に連結することができる（例えば、ＷＯ２００８／１５５１３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：９０４を参照）。場合によっては、アミノ酸リピートは少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のアミノ酸残基であり、各リピートは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、及びＰｒｏ残基（複数可）を含む。したがって、ＰＡＳ化タンパク質である免疫調節タンパク質が本明細書で提供され、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、直接的またはリンカーを介して間接的にＰｒｏ／Ａｌａ／Ｓｅｒ（ＰＡＳ）に連結する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加のリンカー構造が使用され得る。

いくつかの実施形態では、該部分は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの検出または精製を促す。場合によっては、免疫調節ポリペプチドは、ＣＤ８０ポリペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に直接または間接的に連結されたタグまたは融合ドメイン、例えば親和性または精製タグを含む。様々な好適なポリペプチドタグ及び／または融合ドメインが知られており、これらに限定されないが、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３７）、Ｍｙｃタグ、及び蛍光タンパク質タグ（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３３〜３０３５に記載のＥＧＦＰ）が挙げられる。場合によっては、バリアントＣＤ８０を含む免疫調節ポリペプチドは、少なくとも６つのヒスチジン残基を含む（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３８に記載）。場合によっては、バリアントＣＤ８０を含む免疫調節ポリペプチドは、部分の様々な組み合わせをさらに含む。例えば、バリアントＣＤ８０を含む免疫調節ポリペプチドは、１つまたは複数のポリヒスチジンタグ及びＦＬＡＧタグをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７４に記載されるような１価形態のままである改変免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）に連結される。

いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、直接的またはリンカーを介して間接的に多量体化ドメインに連結されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する。いくつかの態様では、多量体化ドメインは、分子の半減期を延長する。２つ以上のバリアントＣＤ８０ポリペプチドの相互作用は、直接的または間接的に、それらのそれ自体が相互作用して安定な構造を形成できる任意の部分または他のポリペプチドに対する連結により促され得る。例えば、別々のコードされたバリアントＣＤ８０ポリペプチド鎖は、多量体化により結合され得、そのポリペプチドの多量体化は、多量体化ドメインによって媒介される。典型的には、多量体化ドメインは、第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチドと第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドとの間の安定したタンパク質−タンパク質相互作用の形成を提供する。

ホモまたはヘテロ多量体ポリペプチドは、別々のバリアントＣＤ８０ポリペプチドの共発現から生成することができる。第１及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、同一であっても異なっていてもよい。特定の実施形態では、第１及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ホモ二量体では同じであり、それぞれが同じ多量体化ドメインに連結されている。他の実施形態では、ヘテロ二量体を、異なる第１及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを連結することにより形成することができる。このような実施形態のいくつかでは、第１及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ヘテロ二量体形成を促進することができる異なる多量体化ドメインに連結される。

いくつかの実施形態では、多量体化ドメインには、安定したタンパク質−タンパク質相互作用を形成可能な任意のものが含まれる。多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列（例えば、Ｆｃドメイン；例えば、国際特許公開ＷＯ９３／１０１５１及びＷＯ２００５／０６３８１６ＵＳ；米国特許番号第２００６／００２４２９８号；米国特許番号第５，４５７，０３５号を参照）；ロイシンジッパー（例えば、核転写タンパク質ｆｏｓ及びｊｕｎもしくはがん原遺伝子ｃ−ｍｙｃ由来または窒素の一般制御（ＧＣＮ４）由来）（例えば、ＢｕｓｃｈａｎｄＳａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ（１９９０）ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔｉｃｓ，６：３６−４０；Ｇｅｎｔｚｅｔａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：１６９５−１６９９を参照）；疎水性領域；親水性領域；またはホモもしくはヘテロ多量体のキメラ分子間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール、を介して相互作用することができる。加えて、多量体化ドメインは、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；国際特許公開ＷＯ９８／５０４３１及びＷＯ２００５／０６３８１６；Ｒｉｄｇｗａｙｅｔａｌ．（１９９６）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９：６１７−６２１に記載されているような、穴を含むアミノ酸配列に相補的な突起を含むアミノ酸配列を含むことができる。そのような多量体化領域は、立体相互作用が安定した相互作用を促進するだけでなく、キメラ単量体の混合物からのホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成をさらに促進するように操作することができる。一般的に、突起は、第１のポリペプチドの界面の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることにより構築される。突起と同一または類似のサイズの代償性の空洞は、より大きなアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの界面に任意で作製される。例示的な多量体化ドメインについて以下に説明する。

バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、任意の場所で結合できるが、典型的にはそのＮ末端またはＣ末端を介して多量体化ドメインのＮ末端またはＣ末端に結合してキメラポリペプチドを形成できる。連結は、直接的またはリンカーを介して間接的であり得る。キメラポリペプチドは、融合タンパク質であり得るか、または共有または非共有相互作用などによる化学的連結により形成され得る。例えば、多量体化ドメインを含有するキメラポリペプチドを調製する場合、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの全てまたは一部をコードする核酸は、直接的または間接的または任意でリンカードメインを介して、多量体化ドメイン配列をコードする核酸に作動可能に連結できる。場合によっては、構築物は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドのＣ末端が多量体化ドメインのＮ末端に結合しているキメラタンパク質をコードする。場合によっては、構築物は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドのＮ末端が多量体化ドメインのＣ末端に結合しているキメラタンパク質をコードすることができる。

ポリペプチド多量体は、同一または異なるバリアントＣＤ８０ポリペプチドの２つを、直接的または間接的に多量体化ドメインに直接または間接的に連結することにより作製された複数の（例えば２つの）キメラタンパク質を含有する。いくつかの実施例では、多量体化ドメインがポリペプチドである場合、バリアントＣＤ８０ポリペプチド及び多量体化ドメインをコードする遺伝子融合体が適切な発現ベクターに挿入される。得られたキメラまたは融合タンパク質は、組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞で発現させることができ、会合して多量体となることが可能にされ、多量体化ドメインは相互作用して多価ポリペプチドを形成する。バリアントＣＤ８０ポリペプチドに対する多量体化ドメインの化学的連結は、ヘテロ二官能性リンカーを使用して実施することができる。

融合タンパク質などの得られたキメラポリペプチド、及びそれから形成された多量体は、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでのアフィニティークロマトグラフィーなどの任意の適切な方法によって精製することができる。異なるポリペプチドをコードする２つの核酸分子が細胞に形質転換される場合、ホモ及びヘテロ二量体の形成が起こる。発現条件は、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成が優先されるように調整できる。

いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、免疫グロブリン由来のＦｃドメインまたはその一部分である。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、免疫グロブリンＦｃに結合したバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む（ＣＤ８０ｖＩｇＤ−Ｆｃ融合体とも呼ばれる「バリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合体」などの「免疫調節Ｆｃ融合体」を得る）。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの結合は、ＦｃのＮ末端である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの結合は、ＦｃのＣ末端である。いくつかの実施形態では、２つ以上のＣＤ８０バリアントポリペプチド（同一または異なる）は、Ｎ末端及びＣ末端に独立して結合している。

いくつかの実施形態では、ＦｃはネズミまたはヒトＦｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、哺乳動物またはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ１、例えばヒトＩｇＧ１に由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７、３５９、または１７１２に記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２７７、３５９または１７１２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、１つまたは複数の通常の機能を変化（例えば、低減）させるためのもう１つの改変を含有する。概して、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンの主な機能である抗原結合能力に加えて、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能に関与する。加えて、Ｆｃ領域に存在するＦｃＲｎ配列は、ｉｎｖｉｖｏＦｃＲｎ受容体へのコンジュゲーションによりｉｎｖｉｖｏ半減期を延長することにより、血清中のＩｇＧレベルを調節する役割を果たす。いくつかの実施形態では、そのような機能は、提供されるＦｃ融合タンパク質とともに使用するために、Ｆｃにおいて低下または変化させることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体のＦｃ領域に１つまたは複数のアミノ酸改変を導入することができ、これにより、Ｆｃ領域バリアントが生成される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域バリアントは、エフェクター機能が低下している。エフェクター機能を変化させる可能性があるＦｃ配列に対する変更または変異の例は数多くある。例えば、ＷＯ００／４２０７２、ＷＯ２００６０１９４４７、ＷＯ２０１２１２５８５０、ＷＯ２０１５／１０７０２６、ＵＳ２０１６／００１７０４１及びＳｈｉｅｌｄｓｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）は、ＦｃＲへの結合が改善または減少した例示的なＦｃバリアントについて記載する。これらの刊行物の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれている。

いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合体は、エフェクター機能の低下を示すＦｃ領域を含み、これにより、ｉｎｖｉｖｏでのＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（ＣＤＣ及びＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途に対する望ましい候補となる。ｉｎｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎｖｉｖｏ細胞傷害アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、ＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体がＦｃγＲ結合を欠く（したがってＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力は保持することを確認できる。ＡＤＣＣを媒介する主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈａｎｄＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照のこと）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を参照のこと）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはこれに加えて、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて、ｉｎｖｉｖｏで評価され得る。ＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体がＣ１ｑに結合できず、したがってＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０１：１０４５−１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ１０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照のこと）。また、当技術分野において公知の方法を使用してＦｃＲｎ結合及びｉｎｖｉｖｏクリアランス／半減期決定を実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照のこと）。

エフェクター機能が低下しているＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体には、ＥＵ番号付けによるＦｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つまたは複数の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、ＥＵ番号付けによるアミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が含まれ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されたいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。

いくつかの実施形態では、ＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体のＦｃ領域は、位置２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２７０、２９７、２９８、３２５、及び３２９（ＥＵ番号付けによって示される）におけるアミノ酸のいずれか１つまたは複数が、天然Ｆｃ領域と比較して異なるアミノ酸で置換されている、Ｆｃ領域を有する。そのようなＦｃ領域の変化は、上記の変化に限定されず、例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００９）２０（６），６８５−６９１に記載されている脱グリコシル化鎖（Ｎ２９７Ａ及びＮ２９７Ｑ）、ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ｇ、ＩｇＧ１−Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ１−Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１−Ａ３２５Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１−Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ、ＩｇＧ１−Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ１− Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＩｇＧ１−Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１−Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ２−Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ２−Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ、ＩｇＧ４−Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｅ３１８Ａ、及びＩｇＧ４−Ｌ２３６Ｅなどの変化；ＷＯ２００８／０９２１１７に記載されているＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｌ２３５Ｇ／Ｇ２３６Ｒ、Ｎ３２５Ａ／Ｌ３２８Ｒ、及びＮ３２５ＬＬ３２８Ｒなどの変化；２３３、２３４、２３５、及び２３７位（ＥＵ番号付けによって示される）におけるアミノ酸挿入；ならびにＷＯ２０００／０４２０７２に記載されている部位における変化を含む。

ＦｃＲへの結合が改善または減少した、ある特定のＦｃバリアントが記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、ＷＯ２００６０１９４４７及びＳｈｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、半減期を延長させる及び／または新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を改善する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントＦｃ領域を含む、ＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体が提供される。半減期が延長された及びＦｃＲｎに対する結合が改善された抗体が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）またはＷＯ２０１５１０７０２６に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つまたは複数の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントは、ＥＵ番号付けによるＦｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４の１つまたは複数に置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換、を有するものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。

いくつかの実施形態では、ＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体のＦｃ領域は、１つまたは複数のアミノ酸置換Ｅ３５６Ｄ及びＭ３５８Ｌ（ＥＵ番号付けによる）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体のＦｃ領域は、１つまたは複数のアミノ酸置換Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ及び／またはＣ２２９Ｓ（ＥＵ番号付けによる）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０バリアント融合体のＦｃ領域は、１つまたは複数のアミノ酸置換Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃを含む。また、Ｆｃ領域バリアントの他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。

いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載される低下したＣ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変化がＦｃ領域でなされる。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むバリアントＦｃ領域を含み、該バリアントＦｃ領域がＩｇＧ１、例えばヒトＩｇＧ１に由来する、ＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体が提供される。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７に記載のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７の番号付けによるＮ８２Ｇ（ＥＵ番号付けによるＮ２９７Ｇに対応する）である少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７の番号付けによるＲ７７ＣまたはＶ８７Ｃ（ＥＵ番号付けによるＲ２９２ＣまたはＶ３０２Ｃに対応する）である少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含有する。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２９に記載のＦｃ領域のような、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７の番号付けによるＣ５Ｓ（ＥＵ番号付けによるＣ２２０Ｓに対応する）アミノ酸改変をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ領域は、以下のアミノ酸改変：ＥＵ番号付けによる、Ｖ２９７Ｇ及び次のアミノ酸改変Ｃ２２０Ｓ、Ｒ２９２ＣまたはＶ３０２Ｃの１つまたは複数（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７に基づいて、Ｎ８２Ｇ及び次のアミノ酸改変Ｃ５Ｓ、Ｒ７７ＣまたはＶ８７Ｃの１つまたは複数に対応する）を含み、例えば、該Ｆｃ領域はＳＥＱＩＤＮＯ：３５６に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ領域は、アミノ酸改変Ｃ２２０Ｓ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥまたはＧ２３７Ａの１つまたは複数を含み、例えば、該Ｆｃ領域はＳＥＱＩＤＮＯ：３５７に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ領域は、アミノ酸改変Ｃ２２０Ｓ、Ｌ２３５Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６ｄｅｌまたはＳ２６７Ｋの１つまたは複数を含み、例えば、該Ｆｃ領域はＳＥＱＩＤＮＯ：３５８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃは、アミノ酸改変Ｃ２２０Ｓ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３５６ＤまたはＭ３５８Ｌの１つまたは複数を含み、例えば、該Ｆｃ領域はＳＥＱＩＤＮＯ：３７６に記載の配列を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体は、上記セクションＩＩに記載の説明に従ってバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ領域に連結された記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか１つを含み、該バリアントＦｃ領域が、変異Ｒ２９２Ｃ、Ｎ２９７Ｇ及びＶ３０２Ｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：ｘｘｘに記載の野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃに基づくとＲ７７Ｃ、Ｎ８２Ｇ及びＶ８７Ｃに対応する）を含有するヒトＩｇＧ１Ｆｃではない、ＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体が提供される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域またはバリアントＦｃ領域に連結されたバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか１つを含み、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、３つのアラニンからなるリンカーによってＦｃに連結していない、ＣＤ８０−Ｆｃバリアントが提供される。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７に記載の野生型または非改変Ｆｃの２３２位に対応するＣ末端リジンを欠く（ＥＵ番号付けによるＫ４４７ｄｅｌに対応）。いくつかの態様では、そのようなＦｃ領域は、１つまたは複数の追加の改変、例えば、記載されたものなどのアミノ酸置換をさらに含むことができる。そのようなＦｃ領域の例は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５６〜３５８、３７６、または１７１３〜１７１５に記載される。

いくつかの実施形態では、バリアントＦｃ領域を含み、該バリアントＦｃは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７６、３５６、３５７、３５８、１４２９、もしくは１７１３〜１７１５のいずれかに記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３７６、３５６、３５７、３５８、１４２９、もしくは１７１３〜１７１５のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、ＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体が提供される。

いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ２、例えばヒトＩｇＧ２に由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７８に記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２７８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。

いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２７に記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１４２７に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４Ｆｃは、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメインがヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインで置換されており、阻害された凝集体形成を示す安定化されたＦｃ、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３及びＣＨ２ドメインがそれぞれヒトＩｇＧ１のＣＨ３及びＣＨ２ドメインで置換されている抗体、またはヒトＩｇＧ４のＫａｂａｔらによって提案されたＥＵインデックスで示される位置４０９においてアルギニンがリジンで置換されており、阻害された凝集体形成を示す抗体である（例えば、米国特許第８，９１１，７２６号を参照のこと）。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、Ｆａｂアーム交換によって治療用抗体と内在性ＩｇＧ４との間の組換えを防止すると示されている、Ｓ２２８Ｐ変異を含有するＩｇＧ４である（例えば、Ｌａｂｒｉｊｉｎｅｔａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７（８）７６７−７１を参照のこと）。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２８に記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１４２８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、例えばリンカーを介して、Ｆｃ配列に間接的に連結されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の「ペプチドリンカー」がバリアントＣＤ８０ポリペプチドとＦｃドメインを連結する。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、単一アミノ酸残基またはそれより大きい長さであることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１つのアミノ酸残基を有するが、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸残基長以下である。いくつかの実施形態では、リンカーは柔軟なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、（一文字アミノ酸コードで）ＧＧＧＧＳ（「４ＧＳ」または「Ｇ_４Ｓ」；ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１７）または４ＧＳリンカーの多量体、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：３３０に記載されるような（２ｘＧＧＧＧＳ；（Ｇ_４Ｓ）_２）またはＳＥＱＩＤＮＯ：３２９に記載されるような（３ｘＧＧＧＧＳ；（Ｇ_４Ｓ）_３）例えば２つ、３つ、４つ、または５つの４ＧＳリンカーの繰り返しである。いくつかの実施形態では、リンカーは、一連のアラニン残基を単独で、または別のペプチドリンカー（ａ４ＧＳリンカーまたはその多量体など）に加えて含むことができる。いくつかの実施形態では、各連のアラニン残基の数は、２、３、４、５、または６個のアラニンである。いくつかの実施形態では、リンカーは、３つのアラニン（ＡＡＡ）である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、リンカーを介してＦｃ配列に間接的に連結されており、該リンカーは、３つのアラニン（ＡＡＡ）で構成されていない。いくつかの実施例では、リンカーは、２ｘＧＧＧＧＳの後に３つのアラニンが続く（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡ；ＳＥＱＩＤＮＯ：３３１）。いくつかの実施形態では、リンカーは、クローニングによって及び／または制限部位から導入されたアミノ酸をさらに含むことができ、例えば、リンカーは、制限部位ＢＡＭＨＩの使用によって導入されたアミノ酸ＧＳ（１文字のアミノ酸コード）を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、リンカー（１文字のアミノ酸コード）は、ＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１６）、ＧＳ（Ｇ_４Ｓ）_３（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０２８）、またはＧＳ（Ｇ_４Ｓ）_５（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０２９）である。いくつかの実施形態では、リンカーは剛性リンカーである。例えば、リンカーはαヘリックスリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、（一文字アミノ酸コードで）ＥＡＡＡＫまたはＥＡＡＡＫリンカーの多量体、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：３０２６に記載されるような（１ｘＥＡＡＡＫ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０２７に記載されるような（３ｘＥＡＡＡＫ）またはＳＥＱＩＤＮＯ：３０３６に記載されるような（５ｘＥＡＡＡＫ）例えば２つ、３つ、４つ、または５つのＥＡＡＡＫリンカーの繰り返しである。場合によっては、バリアントＣＤ８０を含む免疫調節ポリペプチドは、ペプチドリンカーの様々な組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｆｃ配列に直接的に連結される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ヒンジ領域の全てまたは一部をさらに欠いていた不活性ＦｃなどのＦｃに直接的に連結している。ヒンジ領域の一部（６アミノ酸）を欠く例示的なＦｃは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０２５に記載されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０ポリペプチドは、Ｆｃ配列に直接的に連結される場合、該ＣＤ８０ポリペプチドは、Ｃ末端において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のアミノ酸分切断され得る。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＩｇＶ領域をＩｇＣ領域に接続する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸を除去するために切断される。例えば、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３０に記載の例示的な野生型ＣＤ８０主鎖に改変を含有することができる。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃドメインに連結された２つのバリアントＣＤ８０Ｆｃポリペプチドによって形成される二量体である。いくつかの特定の実施形態では、ＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合ポリペプチドの同一または実質的に同一の種（３つ以下のＮ末端またはＣ末端アミノ酸配列の差異を可能にする）は、二量体化してホモ二量体を作成する。いくつかの実施形態では、二量体は、２つのバリアントＣＤ８０Ｆｃポリペプチドが同一であるホモ二量体である。あるいは、異なる種のＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合ポリペプチドを二量体化してヘテロ二量体を得ることができる。したがって、いくつかの実施形態では、二量体は、２つのバリアントＣＤ８０Ｆｃポリペプチドが異なるヘテロ二量体である。

また、バリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子も提供される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質の産生のために、バリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子が適切な発現ベクターに挿入される。得られたバリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ部分間に形成された鎖間ジスルフィド結合によりＦｃドメイン間のアセンブリが起こり、二量体、例えば二価のバリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合タンパク質を生じさせる発現を伴う形質転換された宿主細胞で発現されることができる。

得られたＦｃ融合タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製することができる。ヘテロ二量体の生成の場合、精製のために追加ステップが必要になる可能性がある。例えば、異なるバリアントＣＤ８０ポリペプチドをコードする２つの核酸が細胞に形質転換される場合、Ｆｃドメインを保持するバリアントＣＤ８０分子はジスルフィド連結ホモ二量体としても発現されるため、ヘテロ二量体の形成は生化学的に達成されなければならない。したがって、ホモ二量体は、鎖間ジスルフィドの破壊に有利であるが、鎖内ジスルフィドには影響しない条件下で減らすことができる。場合によっては、異なるバリアントＣＤ８０Ｆｃ単量体を等モル量で混合し、酸化させてホモ二量体及びヘテロ二量体の混合物を形成する。この混合物の成分は、クロマトグラフ技術によって分離される。あるいは、以下に説明するノブ・イントゥ・ホール法を使用してバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有するＦｃ融合分子を遺伝子操作し、発現させることにより、このタイプのヘテロ二量体の形成は偏り得る。

Ｂ．追加のＩｇＳＦドメインを有するスタック分子
いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、１つまたは複数の他の免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインに直接的または間接的に連結された本明細書において提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれかを含有することができる（「スタックされた」免疫調節タンパク質構築物、また「ＩＩ型」免疫調節タンパク質とも呼ばれる）。いくつかの態様では、これは、２つ以上、例えば３つ以上のコグネイト結合パートナーと結合することによって免疫シナプスの多ターゲティング調節を提供する、固有のマルチドメイン免疫調節タンパク質を作製することができる。

いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、バリアントＣＤ８０ドメインと、野生型ＩｇＳＦファミリーメンバーに見いだされない別のＩｇＳＦファミリーメンバー（例えば、哺乳動物ＩｇＳＦファミリーメンバー）の１つまたは複数の他の親和性改変ＩｇＳＦドメイン配列及び／または非親和性改変ＩｇＳＦドメイン配列との組み合わせ（「非野生型組み合わせ」）及び／または配置（「非野生型配置」または「非野生型順列」）を含む。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインを含有し、該ＩｇＳＦドメインの少なくとも１つは、提供される記載によるバリアントＣＤ８０ＩｇＳＦドメイン（ＣＤ８０のｖＩｇＤ）である。

いくつかの実施形態では、追加のＩｇＳＦドメインの配列は、野生型または非改変ＩｇＳＦドメインと比較して１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有する改変されたＩｇＳＦドメインであることができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦドメインは、非親和性改変であってもよく（例えば、野生型）、または親和性が改変されていてもよい。いくつかの実施形態では、非改変または野生型ＩｇＳＦドメインは、マウス、ラット、カニクイザル、もしくはヒト起源、またはそれらの組み合わせ由来であることができる。いくつかの実施形態では、追加のＩｇＳＦドメインは、表２に記載のＩｇＳＦファミリーメンバーのＩｇＳＦドメインであることができる。いくつかの実施形態では、追加のＩｇＳＦドメインは、表２に記載のＩｇＳＦファミリーメンバーに含有されるＩｇＳＦドメインと比較して、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換）を含有する親和性改変ＩｇＳＦドメインであることができる。

いくつかの実施形態では、追加のＩｇＳＦドメインは、以下から選択されるファミリーのＩｇＳＦファミリーメンバーに含有される、親和性改変または非親和性改変ＩｇＳＦドメインである：シグナル制御タンパク質（ＳＩＲＰ）ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様（ＴＲＥＭＬ）ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリー、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン（ＳＩＧＬＥＣ）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、Ｂ７ファミリー、ＣＤ２８ファミリー、Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有（ＶＳＩＧ）ファミリー、Ｖセット膜貫通ドメイン（ＶＳＴＭ）ファミリー、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＲ）、ネクチン（Ｎｅｃ）ファミリー、ネクチン様（ＮＥＣＬ）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（ＰＶＲ）ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体（ＮＣＲ）ファミリー、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチン（ＴＩＭ）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリー。いくつかの実施形態では、追加のＩｇＳＦドメインは独立して、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１，Ｂ７−Ｈ１）、ＰＤＣＤ１ＬＧ２（ＰＤ−Ｌ２，ＣＤ２７３）、ＩＣＯＳＬＧ（Ｂ７ＲＰ１，ＣＤ２７５，ＩＣＯＳＬ、Ｂ７−Ｈ２）、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、ＶＴＣＮ１（Ｂ７−Ｈ４）、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１（ＰＤ−１）、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ（ＣＤ８−α）、ＣＤ８Ｂ（ＣＤ８−β）、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ−３）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＰＶＲＬ２（ＣＤ１１２）、ＣＤ２２６、ＣＤ２、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ１（ＣＤ２００Ｒ）、及びＮＣＲ３（ＮＫｐ３０）からなる群より選択されるＩｇＳＦタンパク質に由来する。

表２の１列目は、その特定のＩｇＳＦメンバーについての名称、及び任意でいくつかの可能な別名を提供する。２列目は、ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇでインターネットを介してアクセス可能な公的に利用可能なデータベースである、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのタンパク質識別子を提供し、場合によっては、ＧｅｎＢａｎｋ番号を提供する。ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）は、タンパク質配列及び注釈データ用の包括的リソースである。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースは、ＵｎｉＰｒｏｔ知識ベース（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）を含む。ＵｎｉＰｒｏｔは、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）、ＳＩＢスイスバイオインフォマティクス研究所、及びタンパク質情報リソース（ＰＩＲ）の間の共同組織であり、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の寄付金によって主に支援されている。ＧｅｎＢａｎｋは、ＮＩＨの遺伝子配列データベースであり、全ての公的に利用可能なＤＮＡ配列が注釈付きで集められている（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１３Ｊａｎ；４１（Ｄ１）：Ｄ３６−４２）。３列目は、表示のＩｇＳＦドメインが位置している領域を提供する。該領域は、ドメインが範囲を規定している残基を包含する範囲として特定される。３列目はまた、特定のＩｇＳＦ領域のＩｇＳＦドメインクラスを示す。４列目は、表示の追加のドメインが位置している領域を提供する（シグナルペプチドはＳ、細胞外ドメインはＥ、膜貫通ドメインはＴ、細胞質ドメインはＣ）。ドメインの記載は、当該ドメインの特定または分類に用いる方法に応じて異なり得ること、及び異なる源から異なって特定され得ることを理解されたい。表２のドメインに対応する残基の記載は、例示ものにすぎず、アミノ酸数個（例えば、１個、２個、３個、または４個）分長いまたは短い場合がある。５列目は、列挙されたＩｇＳＦメンバーのうちのいくつか（そのコグネイトな細胞表面結合パートナーのうちのいくつか）を示す。

（表２）本開示によるＩｇＳＦメンバー

「スタックされた」免疫調節タンパク質構築物に存在するそのような非親和性改変または親和性改変ＩｇＳＦドメイン（非野生型組み合わせまたは非野生型配置にかかわらず）の数は、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ、そして、いくつかの実施形態では、正確に２つ、３つ、４つ、または５つのＩｇＳＦドメインである（その親和性改変ＩｇＳＦドメインの数の決定は、あらゆるその非特異的結合部分配列及び／または実質的に免疫学的に不活性なその部分配列を無視する）。

本明細書において提供されるスタックされた免疫調節タンパク質のいくつかの実施形態では、ＩｇＳＦドメインの数は少なくとも２つであり、親和性改変ＩｇＳＦドメインの数及び非親和性改変ＩｇＳＦドメインの数は、それぞれ独立して、少なくとも０、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つである。したがって、親和性改変ＩｇＳＦドメインの数及び非親和性改変ＩｇＳＦドメインの数はそれぞれ（親和性改変ＩｇＳＦドメイン：非親和性改変ＩｇＳＦドメイン）、正確にまたは少なくとも２：０（親和性改変：野生型）、０：２、２：１、１：２、２：２、２：３、３：２、２：４、４：２、１：１、１：３、３：１、１：４、４：１、１：５、または５：１であることができる。

スタックされた免疫調節タンパク質のいくつかの実施形態では、非親和性改変ＩｇＳＦドメイン及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインの少なくとも２つは、同一のＩｇＳＦドメインである。

いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるスタックされた免疫調節タンパク質は、単一のＩｇＳＦメンバー由来であるが非野生型配置（あるいは「順列」）の、少なくとも２つの親和性改変ＩｇＳＦドメイン及び／または非親和性改変ＩｇＳＦドメインを含む。非野生型配置または順列の１つの実例は、そのＩｇＳＦドメイン配列が本明細書において提供されるとおりのバリアントＩｇＳＦドメインの供給源としての役割を果たす野生型ＣＤ８０に見いだされるものと比べて、非野生型順序の親和性改変ＩｇＳＦドメイン配列及び／または非親和性改変ＩｇＳＦドメイン配列を含む免疫調節タンパク質である。したがって、一例では、免疫調節タンパク質は、非親和性改変形態及び／または親和性改変形態にかかわらず、膜貫通ドメインに近位のＩｇＶ及び膜貫通ドメインから遠位のＩｇＣを含むことができる。非親和性改変ＩｇＳＦドメイン及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインの非野生型組み合わせ及び非野生型配置の両方が、本明細書において提供される免疫調節タンパク質に存在することも、提供される主題の範囲内である。

スタックされた免疫調節タンパク質のいくつかの実施形態では、非親和性改変ＩｇＳＦドメイン及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインは、非同一（すなわち、異なる）ＩｇＳＦドメインである。非同一親和性改変ＩｇＳＦドメインは、特異的結合条件下で、異なるコグネイト結合パートナーと特異的に結合し、これらが操作される野生型または非改変ＩｇＳＦドメインが同じあったか否かに関係なく「非同一」である。したがって、例えば、免疫調節タンパク質における少なくとも２つの非同一ＩｇＳＦドメインの非野生型組み合わせは、その起源が１つのＣＤ８０に由来しかつこれに固有である少なくとも１つのＩｇＳＦドメイン配列、及びその起源がＣＤ８０ではない別のＩｇＳＦファミリーメンバーに由来しかつこれに固有である少なくとも１つの第２のＩｇＳＦドメイン配列を含むことができ、該免疫調節タンパク質のＩｇＳＦドメインは、非親和性改変形態及び／または親和性改変形態である。しかしながら、その他の実施形態では、２つの非同一ＩｇＳＦドメインは、同じＩｇＳＦドメイン配列に由来するが、少なくとも１つは、該非同一ＩｇＳＦドメインが異なるコグネイト結合パートナーに特異的に結合するように親和性が改変されている。

いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有することに加えて、少なくとも１、２、３、４、５または６個の追加の免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメイン、例えば表２に記載のＩｇＳＦファミリーメンバーのＩｇＤドメインも含有する。いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、少なくとも１つの追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２のＩｇＳＦドメイン）を含有する。いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、少なくとも２つの追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２及び第３のＩｇＳＦドメイン）を含有する。いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、少なくとも３つの追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２、第３、及び第４）を含有する。いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、少なくとも４つの追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２、第３、第４、及び第５）を含有する。いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、少なくとも５つの追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２、第３、第４、第５、及び第６）を含有する。いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、少なくとも６つの追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２、第３、第４、第５、第６、及び第７）を含有する。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質のＩｇＳＦドメインのそれぞれは異なる。いくつかの実施形態では、追加のＩｇＳＦドメインの少なくとも１つは、免疫調節タンパク質の少なくとも１つの他のＩｇＳＦドメインと同じである。いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦドメインのそれぞれは、異なるＩｇＳＦファミリーメンバーに由来するか、または異なるＩｇＳＦファミリーメンバーから誘導される。いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦドメインの少なくとも２つは、同一のＩｇＳＦファミリーメンバーに由来するか、または同一のＩｇＳＦファミリーメンバーから誘導される。

いくつかの実施形態では、追加のＩｇＳＦドメインは、ＩｇＶドメインもしくはＩｇＣ（例えば、ＩｇＣ２）ドメイン（複数可）、またはＩｇＶドメインの特異的結合断片もしくはＩｇＣ（例えば、ＩｇＣ２）ドメイン（複数可）の特異的結合断片を含む。いくつかの実施形態では、追加のＩｇＳＦドメインは、完全長ＩｇＶドメインであるか、それを含む。いくつかの実施形態では、追加のＩｇＳＦドメインは、完全長ＩｇＣ（例えば、ＩｇＣ２）ドメイン（複数可）であるか、それを含む。いくつかの実施形態では、追加のＩｇＳＦドメインは、ＩｇＶドメインの特異的結合断片であるか、それを含む。いくつかの実施形態では、追加のＩｇＳＦドメインは、ＩｇＣ（例えば、ＩｇＣ２）ドメイン（複数可）の特異的結合断片であるか、それを含む。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、単一の（同じ）ＩｇＳＦメンバー由来の少なくとも２つの追加のＩｇＳＦドメインを含有する。例えば、いくつかの態様では、免疫調節タンパク質は、完全長ＩｇＶドメイン及び完全長ＩｇＣ（例えば、ＩｇＣ２）ドメイン（複数可）またはその特異的結合断片を含有するＩｇＳＦメンバーのＥＣＤまたはその一部分を含有する。

いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、少なくとも１つの追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２の、または場合によっては、第３のＩｇＳＦドメインなども）を含有し、少なくとも１つの追加のまたは第２のＩｇＳＦドメインは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２４〜２４９及び３０６のいずれかに記載のアミノ酸配列に含有される野生型または非改変ＩｇＳＦドメインまたはその特異的結合断片に記載のＩｇＳＦドメインである。いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＩｇＳＦドメインは、ＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメイン、例えばＩｇＣ１またはＩｇＣ２ドメインである。

いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有することに加えて、少なくとも１つの追加の親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えば、第２の、または場合によっては、第３の親和性改変ＩｇＳＦドメインなども）も含有し、少なくとも１つの追加のＩｇＳＦドメインは、野生型または非改変ＩｇＳＦドメイン内のＩｇＳＦドメイン、例えば表２に記載のＩｇＳＦファミリーメンバーのＩｇＳＦドメインと比較して、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失または変異）を含有するｖＩｇＤである。いくつかの実施形態では、追加の、例えば第２または第３の親和性改変ＩｇＳＦドメインは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２４〜２４９及び３０６のいずれかに記載のアミノ酸配列に含有される野生型または非改変ＩｇＳＦドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、野生型または非改変ＩｇＳＦドメインは、ＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメイン、例えばＩｇＣ１またはＩｇＣ２ドメインである。いくつかの実施形態では、追加の、例えば第２または第３のＩｇＳＦドメインは、親和性改変ＩｇＶドメイン及び／またはＩｇＣドメインである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメインは、ＩｇＶドメイン及び／またはＩｇＣ（例えば、ＩｇＣ２）ドメイン（複数可）、またはＩｇＶドメインの特異的結合断片及び／またはＩｇＣ（例えば、ＩｇＣ２）ドメイン（複数可）の特異的結合断片を含有する親和性改変ＩｇＳＦドメインであり、該ＩｇＶドメイン及び／またはＩｇＣドメインは、アミノ酸改変（例えば、置換）（複数可）を含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加の親和性改変ＩｇＳＦドメインは、アミノ酸改変（例えば、置換）（複数可）を含有するＩｇＶドメインを含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加の親和性改変ＩｇＳＦドメインは、対応する非改変ＩｇＳＦファミリーメンバーのＥＣＤまたはＥＣＤの一部分に存在するＩｇＳＦドメイン、例えば、完全長ＩｇＶドメイン及び完全長ＩｇＣ（例えば、ＩｇＣ２）ドメイン（複数可）またはその特異的結合断片を含み、該ＩｇＶ及びＩｇＣの一方または両方は、アミノ酸改変（例えば、置換）（複数可）を含有する。

いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、ＣＤ８０以外の野生型または非改変ＩｇＳＦドメインのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）と比較して、１つまたは複数のアミノ酸置換を含有するｖＩｇＤである少なくとも１つの追加のまたは第２のＩｇＳＦドメインを含有する。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２または第３のＩｇＳＦ）ドメインは、それ自体も阻害性受容体に結合する別のＩｇＳＦファミリーメンバーのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）である。いくつかの態様では、１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２または第３のＩｇＳＦ）ドメインは、阻害性受容体に結合し、ＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）に１つまたは複数のアミノ酸置換を含有するＩｇＳＦファミリーメンバーのバリアントＩｇＳＦドメイン（ｖＩｇＤ）である親和性改変ＩｇＳＦドメインであり、場合によっては、該１つまたは複数のアミノ酸改変により阻害性受容体への結合が増加する。いくつかの実施形態では、ｖＩｇＤは、阻害性受容体に結合するＩｇＳＦファミリーメンバーの野生型または非改変ＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）に１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失または付加）を含有する。ＣＴＬＡ−４に加えて、そのような阻害性受容体の例は、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、またはＢＴＬＡである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメインは、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはＣＥＡＣＡＭ１から選択されるＩｇＳＦファミリーメンバー由来である。したがって、いくつかの態様では、２つ以上の阻害性受容体の活性を標的とする、または遮断するマルチターゲットチェックポイント拮抗物質が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つ、３つ、４つ以上の阻害性受容体の活性を標的とする、または遮断するマルチターゲットチェックポイント拮抗物質における免疫調節タンパク質である。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか１つ、及び野生型または非改変阻害性受容体などの阻害性受容体の１つまたは複数のＩｇＳＦドメインを含有する免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか１つ、及びＣＤ１１２、例えば野生型または非改変ＣＤ１１２の１つまたは複数のＩｇＳＦドメイン、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：７３４もしくは８２９に記載のＩｇＶドメイン、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２６９またはその一部分に記載のＥＣＤもしくはその一部分（ＩｇＶ及びＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片を含有する）を含有する免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか１つ、及びＣＤ１５５、例えば野生型または非改変ＣＤ１５５の１つまたは複数のＩｇＳＦドメイン、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７８もしくは４２１に記載のＩｇＶドメイン、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２６８またはその一部分に記載のＥＣＤもしくはその一部分（ＩｇＶ及びＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片を含有する）を含有する免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか１つ、及びＰＤ−Ｌ１、例えば野生型または非改変ＰＤ−Ｌ１の１つまたは複数のＩｇＳＦドメイン、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０００もしくは１１９６に記載のＩｇＶドメイン、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２５１もしくは１７２１またはその一部分に記載のＥＣＤもしくはその一部分（ＩｇＶ及びＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片を含有する）を含有する免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか１つ、及びＰＤ−Ｌ２、例えば野生型または非改変ＰＤ−Ｌ２の１つまたは複数のＩｇＳＦドメイン、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１９７もしくは１２５７に記載のＩｇＶドメイン、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２５２またはその一部分に記載のＥＣＤもしくはその一部分（ＩｇＶ及びＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片を含有する）を含有する免疫調節タンパク質が提供される。

いくつかの実施形態では、阻害性受容体に結合するＩｇＳＦファミリーメンバーのｖＩｇＤである１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２または第３のＩｇＳＦ）を含有する免疫調節タンパク質が提供され、ＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）の１つまたは複数のアミノ酸改変により、非改変ＩｇＳＦドメインと比較して、ｖＩｇＤ、または該ｖＩｇＤを含有する融合体または免疫調節タンパク質の、その阻害性受容体コグネイト結合パートナーに対する結合親和性が増加し、例えば、結合親和性は１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍より大きく増加する。いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）の１つまたは複数のアミノ酸改変により、非改変ＩｇＳＦドメインと比較して、ｖＩｇＤ、または該ｖＩｇＤを含有する融合体または免疫調節タンパク質の、その阻害性受容体に対する選択性が増加する。いくつかの実施形態では、選択性の増加は、阻害性受容体へのｖＩｇＤの結合と阻害性受容体ではないコグネイト結合パートナーなどの別のコグネイト結合パートナーへのｖＩｇＤの結合の比が、阻害性受容体への非改変ＩｇＳＦの結合と別のコグネイト結合パートナーへの非改変ＩｇＳＦの結合の比と比較して大きい。いくつかの実施形態では、該比率は、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍４０倍もしくは５０倍、または少なくとも約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍約４０倍もしくは約５０倍大きい。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加（例えば、第２または第３）ｖＩｇＤは、非改変または野生型ＣＤ１１２と比較して、ＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）に１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失または付加）を含有するバリアントＣＤ１１２ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）であり、阻害性受容体ＴＩＧＩＴに結合するＩｇＳＦファミリーメンバーである。バリアントＣＤ１１２ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ、またはＩｇＶ及びＩｇＣを含有するＥＣＤ）における置換、欠失または付加などの例示的なアミノ酸改変を表３に記載する。いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか、及び表３に記載のアミノ酸改変のいずれかを含むＩｇＶドメイン、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：７８２〜８２８、８３０〜８７６、９１８〜９９９、１４５４〜１５０１のいずれかに記載のＩｇＶドメイン、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７８２〜８２８、８３０〜８７６、９１８〜９９９、１４５４〜１５０１のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を有し、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むＩｇＶドメインを含有するバリアントＣＤ１１２ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか、ならびに表３に記載のアミノ酸改変のいずれかが含まれるＩｇＶドメイン及び／またはＩｇＣドメインを含有するＥＣＤまたはその一部分、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：７３５〜７８１、８７７〜９１７、１４３０〜１４５３のいずれかに記載のＥＣＤ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７３５〜７８１、８７７〜９１７、１４３０〜１４５３のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を含有し、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むＥＣＤを含有するバリアントＣＤ１１２ポリペプチド、を含有する免疫調節タンパク質が提供される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加（例えば、第２または第３）ｖＩｇＤは、非改変または野生型ＣＤ１５５と比較して、ＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）に１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失または付加）を含有するバリアントＣＤ１５５ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）であり、阻害性受容体ＴＩＧＩＴに結合するＩｇＳＦファミリーメンバーである。バリアントＣＤ１５５ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ、またはＩｇＶ及びＩｇＣを含有するＥＣＤ）における置換、欠失または付加などの例示的なアミノ酸改変を表４に記載する。いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか、及び表４に記載のアミノ酸改変のいずれかを含むＩｇＶドメイン、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：４００〜４２０、４２２〜４４２、５４０〜７３３、１５０２〜１５４７、１５７２、１５７３、１６２０〜１７１１のいずれかに記載のＩｇＶドメイン、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４００〜４２０、４２２〜４４２、５４０〜７３３、１５０２〜１５４７、１５７２、１５７３、１６２０〜１７１１のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を有し、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むＩｇＶドメインを含有するバリアントＣＤ１５５ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか、ならびに表４に記載のアミノ酸改変のいずれかを含有するＩｇＶドメイン及び／またはＩｇＣドメインを含有するＥＣＤまたはその一部分、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７９〜３９９、４４３〜５３９、１５４８〜１５７１、１５７４〜１６１９のいずれかに記載のＥＣＤ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３７９〜３９９、４４３〜５３９、１５４８〜１５７１、１５７４〜１６１９のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を含有し、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むＥＣＤを含有するバリアントＣＤ１５５ポリペプチド、を含有する免疫調節タンパク質が提供される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加（例えば、第２または第３）ｖＩｇＤは、非改変または野生型ＰＤ−Ｌ１と比較して、ＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶまたはＥＣＤ）に１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失または付加）を含有するバリアントＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）であり、これにより、いくつかの態様では、阻害性受容体ＰＤ−１への結合が増加する。バリアントＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ、またはＩｇＶ及びＩｇＣを含有するＥＣＤ）における置換、欠失または付加などの例示的なアミノ酸改変を表５に記載する。いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか、及び表５に記載のアミノ酸改変のいずれかを含むＩｇＶドメイン、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６６〜１１９５、１７１９、１７２０、１９０１〜１９３０のいずれかに記載のＩｇＶドメイン、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１０６６〜１１９５、１７１９、１７２０、１９０１〜１９３０のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を有し、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むＩｇＶドメインを含有するバリアントＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ１８０ポリペプチドのいずれか、ならびに表５に記載のアミノ酸改変のいずれかを含有するＩｇＶドメイン及び／またはＩｇＣドメインを含有するＥＣＤまたはその一部分、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１００１〜１０６５、１７１８、１７２２〜１９００、１９３１〜１９９６のいずれかに記載のＥＣＤ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１００１〜１０６５、１７１８、１７２２〜１９００、１９３１〜１９９６のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を含有し、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むＥＣＤを含有するバリアントＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質が提供される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加（例えば、第２または第３）ｖＩｇＤは、非改変または野生型ＰＤ−Ｌ２と比較して、ＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）に１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失または付加）を含有するバリアントＰＤ−Ｌ２ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）でありこれにより、いくつかの態様では、阻害性受容体ＰＤ−１への結合が増加する。バリアントＰＤ−Ｌ２ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ、またはＩｇＶ及びＩｇＣを含有するＥＣＤ）における置換、欠失または付加などの例示的なアミノ酸改変を表６に記載する。いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか、及び表６に記載のアミノ酸改変のいずれかを含むＩｇＶドメイン、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２７５〜１３２５、１３２７〜１４０１、１４０３〜１４２６のいずれかに記載のＩｇＶドメイン、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１２７５〜１３２５、１３２７〜１４０１、１４０３〜１４２６のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を有し、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むＩｇＶドメインを含有するバリアントＰＤ−Ｌ２ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか、ならびに表６に記載のアミノ酸改変のいずれかを含有するＩｇＶドメイン及び／またはＩｇＣドメインを含有するＥＣＤまたはその一部分、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１９８〜１２４８、１２５０〜１２５６、１２５８〜１２７４のいずれかに記載のＥＣＤ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１１９８〜１２４８、１２５０〜１２５６、１２５８〜１２７４のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を含有し、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むＥＣＤを含有するバリアントＰＤ−Ｌ２ポリペプチド、を含有する免疫調節タンパク質が提供される。

いくつかの実施形態では、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２または前述のいずれかのバリアントのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）を含有する本明細書で提供される免疫調節タンパク質は、上記セクションＩＩに記載の説明に従ってバリアントＣＤ８０ポリペプチドが含まれたものである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２または前述のいずれかのバリアントのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）及びバリアントＣＤ８０ポリペプチドのＩｇＳＦドメインを含有する提供される免疫調節タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、７６または１５０に記載の非改変ＣＤ８０ポリペプチドにアミノ酸改変を含まず、唯一のアミノ酸改変が

であるバリアントＣＤ８０ポリペプチドが含まれたものである。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３〜７５、７７〜１４９または１５１〜２２３に記載のポリペプチドではない。

いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、ＣＤ１５５またはそのいずれかのバリアントのＩｇＳＦドメインを含有しない。いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、ＣＤ１１２またはそのいずれかのバリアントのＩｇＳＦドメインを含有しない。いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１またはそのいずれかのバリアントのＩｇＳＦドメインを含有しない。いくつかの実施形態では、提供される免疫調節タンパク質は、ＰＤ−Ｌ２またはそのいずれかのバリアントのＩｇＳＦドメインを含有しない。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２または第３のＩｇＳＦ）ドメインは、腫瘍抗原と結合またはそれを認識する別のＩｇＳＦファミリーメンバーのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）である。かかる実施形態では、ＩｇＳＦファミリーメンバーは腫瘍局在化部分として機能し、これによりＣＤ８０のｖＩｇＤを腫瘍微小環境内の免疫細胞に極めて接近させる。いくつかの実施形態では、追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２のＩｇＳＦ）ドメインは、ＮＫｐ３０のＩｇＳＦドメインであり、腫瘍細胞に発現するＢ７−Ｈ６と結合またはそれを認識する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の（例えば、第２の）ＩｇＳＦドメイン、例えばＮＫｐ３０は、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失または付加）を含有する親和性改変ＩｇＳＦドメインまたはｖＩｇＤである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、非改変ＩｇＳＦドメイン、例えばＮＫｐ３０と比較して、Ｂ７−Ｈ６に対する結合親和性及び／または選択性を、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍４０倍もしくは５０倍、または少なくとも約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍約４０倍もしくは約５０倍増加させる。バリアントＮＫｐ３０ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＣ様または完全ＥＣＤ）における置換、欠失または付加などの例示的なアミノ酸改変を表７に記載する。例示的なポリペプチドの中には、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７５に記載の位置に対応するＮＫｐ３０細胞外ドメインの位置に基づいて変異Ｌ３０Ｖ／Ａ６０Ｖ／Ｓ６４Ｐ／Ｓ８６Ｇを含有するＮＫｐ３０バリアントがある。いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか、及び表７に記載のアミノ酸改変のいずれかを含むＩｇＣ様ドメイン、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：３４４〜３４８のいずれかに記載のＩｇＣ様ドメイン、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３４４〜３４８のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を有し、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むＩｇＶドメインを含有するバリアントＮＫｐ３０ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ１８０ポリペプチドのいずれか、ならびに表７に記載のアミノ酸改変のいずれかを含有するＩｇＳＦドメイン（複数可）を含有するＥＣＤまたはその一部分、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３４〜３３８のいずれかに記載のＥＣＤ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３３４〜３３８のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を含有し、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むＥＣＤを含有するバリアントＮＫｐ３０ポリペプチド、を含有する免疫調節タンパク質が提供される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加（例えば、第２または第３）ｖＩｇＤは、非改変または野生型ＣＤ８６と比較して、ＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）に１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失または付加）を含有するバリアントＣＤ８６ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ）であり、これにより、いくつかの態様では、そのコグネイト結合受容体への結合が増加する。バリアントＣＤ８６ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶ、またはＩｇＶ及びＩｇＣを含有するＥＣＤ）における置換、欠失または付加などの例示的なアミノ酸改変を表８に記載する。例示的なポリペプチドの中には、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５０に記載の位置に対応するＣＤ８６細胞外ドメインの位置に基づいた変異Ｑ３５Ｈ／Ｈ９０Ｌ／Ｑ１０２Ｈを含有するＣＤ８６バリアントがある。いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか、及び表８に記載のアミノ酸改変のいずれかを含むＩｇＶドメイン、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５０〜３５３のいずれかに記載のＩｇＶドメイン、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３５０〜３５３のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を有し、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むＩｇＶドメインを含有するバリアントＣＤ８６ポリペプチドを含有する免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれか、ならびに表８に記載のアミノ酸改変のいずれかを含有するＩｇＶドメイン及び／またはＩｇＣドメインを含有するＥＣＤまたはその一部分、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３９〜３４２のいずれかに記載のＥＣＤ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３３９〜３４２のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を含有し、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むＥＣＤを含有するバリアントＣＤ８６ポリペプチド、を含有する免疫調節タンパク質が提供される。

表３〜８は、本明細書で提供されるスタック構築物で使用することができる１つまたは複数の親和性改変ＩｇＳＦドメインを含有する例示的なポリペプチドを提供する。

（表３）例示的なバリアントＣＤ１１２ポリペプチド

（表４）例示的なバリアントＣＤ１５５ポリペプチド

（表５）例示的なバリアントＰＤ−Ｌ１ポリペプチド

（表６）例示的なバリアントＰＤ−Ｌ２ポリペプチド

（表７）例示的なバリアントＮＫｐ３０ポリペプチド

（表８）例示的なバリアントＣＤ８６ポリペプチド

いくつかの実施形態では、ＣＤ８０のｖＩｇＤを含む２つ以上のＩｇＳＦドメイン、及び別のＩｇＳＦファミリーメンバーの１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２または第３のバリアントＩｇＳＦドメイン）は、共有結合または非共有結合的に連結する。スタックされた免疫調節タンパク質ポリペプチド鎖における複数の非親和性改変ＩｇＳＦドメイン及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインは、互いに直接共有結合的に連結する必要はない。いくつかの実施形態では、２つ以上のＩｇＳＦドメインは、直接、または、例えばリンカーを介して間接的に連結される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基の介在範囲は、ＩｇＳＦドメインを互いに間接的に共有結合する。連結は、Ｎ末端からＣ末端残基を介して行うことができる。いくつかの実施形態では、連結は、ＩｇＳＦドメイン（複数可）のＮ末端またはＣ末端に位置しないアミノ酸残基の側鎖を介してなされ得る。したがって、連結は、末端または内部アミノ酸残基またはそれらの組み合わせを介してなされ得る。

いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、少なくとも２つのＩｇＳＦドメインを含有し、それぞれ直接またはリンカーを介して間接的に連結されている。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、少なくとも３つの免疫調節タンパク質を含有し、それぞれ直接またはリンカーを介して間接的に連結されている。様々な配置が図５Ａ及び５Ｂに示される。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数の「ペプチドリンカー」は、ＣＤ８０のｖＩｇＤ及び１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２または第３のバリアントＩｇＳＦドメイン）を連結する。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、単一アミノ酸残基またはそれより大きい長さであることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１つのアミノ酸残基を有するが、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸残基長以下である。いくつかの実施形態では、リンカーは柔軟なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、（一文字アミノ酸コードで）ＧＧＧＧＳ（「４ＧＳ」）または４ＧＳリンカーの多量体、例えば２つ、３つ、４つ、または５つの４ＧＳリンカーの繰り返しである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３０）または（ＧＧＧＧＳ）_３（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２９）である。いくつかの実施形態では、リンカーはまた、一連のアラニン残基を単独で、または別のペプチドリンカー（４ＧＳリンカーまたはその多量体など）に加えて含むこともできる。いくつかの実施形態では、各連のアラニン残基の数は、２、３、４、５、または６個のアラニンである。いくつかの実施形態では、リンカーはまた、一連のアラニン残基を単独で、または別のペプチドリンカー（４ＧＳリンカーまたはその多量体など）に加えて含むこともできる。いくつかの実施形態では、各連のアラニン残基の数は、２、３、４、５、または６個のアラニンである。いくつかの実施形態では、リンカーは剛性リンカーである。例えば、リンカーはαヘリックスリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、（一文字アミノ酸コードで）ＥＡＡＡＫまたはＥＡＡＡＫリンカーの多量体、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：３０２６に記載されるような（１ｘＥＡＡＡＫ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０２７に記載されるような（３ｘＥＡＡＡＫ）またはＳＥＱＩＤＮＯ：３０３６に記載されるような（５ｘＥＡＡＡＫ）例えば２つ、３つ、４つ、または５つのＥＡＡＡＫリンカーの繰り返しである。いくつかの実施形態では、リンカーは、クローニングによって及び／または制限部位から導入されたアミノ酸をさらに含むことができ、例えば、リンカーは、制限部位ＢＡＭＨＩの使用によって導入されたアミノ酸ＧＳ（１文字のアミノ酸コード）を含むことができる。いくつかの実施例では、リンカーは、２ｘＧＧＧＧＳの後に３つのアラニンが続く（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡ；ＳＥＱＩＤＮＯ：３３１）。

いくつかの実施形態では、非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインは、非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインのＮ末端及び／またはＣ末端に挿入された「野生型ペプチドリンカー」によって連結されている。これらのリンカーは、前方（ｌｅａｄｉｎｇ）配列（Ｎ末端から非親和性改変または親和性改変ＩｇＳＦドメイン）または後方（ｔｒａｉｌｉｎｇ）配列（Ｃ末端から非親和性改変または親和性改変ＩｇＳＦドメイン）とも呼ばれ、ＩｇＳＦのＩｇフォールドの構造予測のすぐ外側に伸びる野生型タンパク質に存在する配列である。いくつかの実施形態では、「野生型リンカー」とは、野生型タンパク質のアミノ酸配列において、シグナル配列の後であるが定義されたＩｇＶドメインなどのＩｇＳＦドメインの前に存在するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、「野生型」リンカーとは、野生型タンパク質のアミノ酸配列において、ＩｇＳＦドメインの直後、例えば定義されたＩｇＶドメインの直後であるがＩｇＣドメインの前に存在するアミノ酸配列である。これらのリンカー配列は、隣接するＩｇＳＦドメイン（複数可）の適切なフォールディング及び機能に寄与することができる。いくつかの実施形態では、第１のＩｇＳＦドメインのＮ末端に挿入された前方ペプチドリンカー、及び／または第１の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインのＣ末端に挿入された後方配列が存在する。いくつかの実施形態では、第２のＩｇＳＦドメインのＮ末端に挿入された第２の前方ペプチドリンカー、及び／または第２の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインのＣ末端に挿入された第２の後方配列が存在する。第１及び第２の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインが同じ親タンパク質に由来し、同一方向に接続される場合、第１及び第２の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメイン間の野生型ペプチドリンカーは複製されない。例えば、第１の後方の野生型ペプチドリンカーと第２の前方の野生型ペプチドリンカーが同じ場合、タイプＩＩ免疫調節タンパク質は、第１の後方の野生型ペプチドリンカーまたは第２の前方の野生型ペプチドリンカーのいずれも含まない。

いくつかの実施形態では、タイプＩＩ免疫調節タンパク質は、第１の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインのＮ末端に挿入された第１の前方の野生型ペプチドリンカーを含み、該第１の前方の野生型ペプチドリンカーは、第１の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインが親ＩｇＳＦドメインと直前のドメイン（シグナルペプチドまたはＩｇＳＦドメインなど）の間に生じる野生型タンパク質の介在配列の少なくとも５個（少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のいずれかなど）の連続アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、第１の前方の野生型ペプチドリンカーは、第１の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインが親ＩｇＳＦドメインと直前のドメイン（シグナルペプチドまたはＩｇＳＦドメインなど）の間に生じる野生型タンパク質の完全な介在配列を含む。

いくつかの実施形態では、タイプＩＩ免疫調節タンパク質はさらに、第１の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインのＣ末端に挿入された第１の後方の野生型ペプチドリンカーを含み、該第１の後方の野生型ペプチドリンカーは、第１の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインが親ＩｇＳＦドメインと直後のドメイン（ＩｇＳＦドメインまたは膜貫通ドメインなど）の間に生じる野生型タンパク質の介在配列の少なくとも５個（少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のいずれかなど）の連続アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、第１の後方の野生型ペプチドリンカーは、第１の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインが親ＩｇＳＦドメインと直後のドメイン（ＩｇＳＦドメインまたは膜貫通ドメインなど）の間に生じる野生型タンパク質の完全な介在配列を含む。

いくつかの実施形態では、タイプＩＩ免疫調節タンパク質はさらに、第２の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインのＮ末端に挿入された第２の前方の野生型ペプチドリンカーを含み、該第２の前方の野生型ペプチドリンカーは、第２の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインが親ＩｇＳＦドメインと直前のドメイン（シグナルペプチドまたはＩｇＳＦドメインなど）の間に生じる野生型タンパク質の介在配列の少なくとも５個（少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のいずれかなど）の連続アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、第２の前方の野生型ペプチドリンカーは、第２の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインが親ＩｇＳＦドメインと直前のドメイン（シグナルペプチドまたはＩｇＳＦドメインなど）の間に生じる野生型タンパク質の完全な介在配列を含む。

いくつかの実施形態では、タイプＩＩ免疫調節タンパク質はさらに、第２の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインのＣ末端に挿入された第２の後方の野生型ペプチドリンカーを含み、該第２の後方の野生型ペプチドリンカーは、第２の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインが親ＩｇＳＦドメインと直後のドメイン（ＩｇＳＦドメインまたは膜貫通ドメインなど）の間に生じる野生型タンパク質の介在配列の少なくとも５個（少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のいずれかなど）の連続アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、第２の後方の野生型ペプチドリンカーは、第２の非親和性改変及び／または親和性改変ＩｇＳＦドメインが親ＩｇＳＦドメインと直後のドメイン（ＩｇＳＦドメインまたは膜貫通ドメインなど）の間に生じる野生型タンパク質の完全な介在配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＤ８０のｖＩｇＤを含む２つ以上のＩｇＳＦドメインと、別のＩｇＳＦファミリーメンバーの１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２及び／または第３のバリアントＩｇＳＦドメイン）が、Ｆｃに連結または結合してＦｃ融合体（細胞内で発現すると、いくつかの態様では、二量体のマルチドメインスタック免疫調節タンパク質を産生し得る）を形成する。したがって、二量体のマルチドメイン免疫調節タンパク質も提供される。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチド及び１つまたは複数のＩｇＳＦドメインは、Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端に、直接的または間接的に独立して連結される。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチド及び１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメインの少なくとも１つは直接的または間接的に連結され、バリアントＣＤ８０の１つ及び１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメインの１つもＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に直接的または間接的に連結される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端はバリアントＣＤ８０ポリペプチドに連結される、または、１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメイン及びＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の他方は、もう一方のＣＤ８０バリアントまたは１つもしくは複数の追加のＩｇＳＦドメインの他方に連結される。いくつかの実施形態では、Ｆｃへの連結は、ペプチドリンカー、例えば上記のようなペプチドリンカーを介する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０と１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメインとの間の連結は、ペプチドリンカー、例えば上記のようなペプチドリンカーを介する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０のｖＩｇＤ、１つまたは複数の追加のＩｇＳＦドメイン、及びＦｃドメインは、図５Ａ及び５Ｂに示されるように、多数の配置のいずれかで一緒に連結され得る。例示的な配置が、実施例に記載される。

いくつかの実施形態では、スタック免疫調節タンパク質は、２つの免疫調節性Ｆｃ融合ポリペプチドによって形成される二量体である。また、スタック免疫調節タンパク質のいずれかをコードする核酸分子も提供される。いくつかの実施形態では、二量体マルチドメインスタック免疫調節タンパク質は、二量体Ｆｃ融合タンパク質の生成に応じて上記のようなスタック免疫調節Ｆｃ融合ポリペプチドの発現、または場合によっては共発現によって細胞内で産生され得る。

いくつかの実施形態では、二量体マルチドメインスタック免疫調節タンパク質は、各Ｆｃ領域で二価、各サブユニットで一価、または一方のサブユニットで二価そしてもう一方のサブユニットで四価である。

いくつかの実施形態では、二量体マルチドメインスタック免疫調節タンパク質は、ホモ二量体マルチドメインスタックＦｃタンパク質である。いくつかの実施形態では、二量体マルチドメインスタック免疫調節タンパク質は、第１のスタック免疫調節Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに第１及び第２のポリペプチドが同じである第２のスタック免疫調節Ｆｃ融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、マルチドメインスタック分子は、バリアントＣＤ８０及び第２のＩｇＳＦドメインを含有する第１のＦｃ融合ポリペプチド、ならびにバリアントＣＤ８０及び第２のＩｇＳＦドメインを含有する第２のＦｃ融合ポリペプチドを含有する。いくつかの実施形態では、マルチドメインスタック分子は、バリアントＣＤ８０、第２のＩｇＳＦドメイン、及び第３のＩｇＳＦドメインを含有する第１のＦｃ融合ポリペプチド、ならびにバリアントＣＤ８０、第２のＩｇＳＦドメイン、及び第３のＩｇＳＦドメインを含有する第２のＦｃ融合ポリペプチドを含有する。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の融合ポリペプチドのＦｃ部分は、上記のような任意のＦｃであり得る。いくつかの実施形態では、第１及び第２の融合ポリペプチドのＦｃ部分または領域は同じである。

いくつかの実施形態では、マルチドメインスタック分子はヘテロ二量体であり、２つの異なるＦｃ融合ポリペプチド、例えば、第１及び第２のＦｃ融合ポリペプチドを含み、少なくとも１つは、少なくとも１つのバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有するＦｃ融合ポリペプチドであり、及び／または少なくとも１つは、第２のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２のバリアントＩｇＳＦドメイン）を含有するＦｃ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第１または第２のＦｃ融合ポリペプチドは、第３のＩｇＳＦドメイン（例えば、第３のバリアントＩｇＳＦドメイン）をさらに含有する。いくつかの実施形態では、マルチドメインスタック分子は、バリアントＣＤ８０を含有する第１のＦｃ融合ポリペプチドと、第２のＩｇＳＦドメインを含有する第２のＦｃ融合ポリペプチドを含み、場合によっては、第１または第２のＦｃ融合ポリペプチドはさらに、第３のＩｇＳＦドメインを含有する。いくつかの実施形態では、マルチドメインスタック分子は、バリアントＣＤ８０、第２のＩｇＳＦドメインを含有する第１のＦｃ融合ポリペプチド、場合によっては、第３のＩｇＳＦドメイン、及びバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは追加のＩｇＳＦドメインのいずれにも連結されていない第２のＦｃ融合ポリペプチドを含有する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の融合ポリペプチドのＦｃ部分または領域は同じである。いくつかの実施形態では、第１及び第２の融合ポリペプチドのＦｃ部分または領域は異なる。

いくつかの実施形態では、マルチドメインスタック分子は、１、２、３、４、またはそれ以上のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び１、２、３、４、またはそれ以上の追加のＩｇＳＦドメインを含有する第１のＦｃ融合ポリペプチドを含有し、該第１のスタックＦｃ融合ポリペプチド中のＩｇＳＦドメインの総数は、２、３、４、５、６、またはそれ以上よりも多い。そのような実施形態の一例では、第２のスタックＦｃ融合ポリペプチドは、１、２、３、４、またはそれ以上のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び１、２、３、４、またはそれ以上の追加のＩｇＳＦドメインを含有し、該第１のスタックＦｃ融合ポリペプチド中のＩｇＳＦドメインの総数は、２、３、４、５、６、またはそれ以上よりも多い。そのような実施形態の別の例では、第２のＦｃ融合ポリペプチドは、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは追加のＩｇＳＦドメインのいずれにも連結されていない。

いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体スタック分子は、第１及び第２のポリペプチドが異なる第１スタック免疫調節Ｆｃ融合ポリペプチド及び第２のスタック免疫調節Ｆｃ融合ポリペプチドを含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体スタック分子は、Ｆｃ領域及び第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び／または第２のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２のバリアントＩｇＳＦドメイン）を含有する第１のＦｃポリペプチド融合体ならびにＦｃ領域及びもう一方の第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは第２のＩｇＳＦドメインを含有する第２のＦｃポリペプチド融合体を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体スタック分子は、Ｆｃ領域及び第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び／または第２のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２のバリアントＩｇＳＦドメイン）を含有する第１のＦｃポリペプチド融合体、ならびにＦｃ領域及び第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチドと第２のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２のバリアントＩｇＳＦドメイン）の両方を含有するが第１のＦｃ領域とは異なる方向または配置である第２のＦｃポリペプチド融合体を含有する。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のＦｃ融合ポリペプチドはまた、第３のＩｇＳＦドメイン（例えば、第３のバリアントＩｇＳＦドメイン）を含有する。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のスタック免疫調節Ｆｃ融合ポリペプチドの一方または両方のＦｃドメインは、Ｆｃ分子の界面がヘテロ二量体化を促す及び／または促進するように改変されるような改変（例えば、置換）を含む。いくつかの実施形態では、改変には、第１のＦｃポリペプチドへの突起（ノブ）の導入、及び第２のＦｃポリペプチドへの空洞（ホール）の導入が含まれ、これにより突起が空洞内に配置され、第１及び第２のＦｃ含有ポリペプチドの複合体形成が促進される。ポリペプチドに突起または空洞を作製するための置換及び／または改変の標的となるアミノ酸は、典型的には、第２のポリペプチドの界面の１つまたは複数のアミノ酸と相互作用または接触する界面アミノ酸である。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ配列が配列のＮ末端部分である構築物の場合、Ｆｃ配列の前にアミノ酸の配列が付加される。場合によっては、アミノ酸配列ＨＭＳＳＶＳＡＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７７）が、Ｆｃ配列が配列のＮ末端部分である構築物のＦｃ配列の直前に付加される。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体スタック分子は、Ｆｃ領域（ノブ；例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７４に記載のＦｃ配列）及び第１のバリアントポリペプチド及び／または第２のＩｇＳＦドメイン（例えば、第２のバリアントＩｇＳＦドメイン）を含有する第１のＦｃポリペプチド融合体、ならびにＦｃ領域（ホール；例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７５に記載のＦｃ配列）及びスタッファー配列ＨＭＳＳＶＳＡＱ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７７）を含有する第２のＦｃポリペプチド融合体が、第１及び第２のＦｃポリペプチド融合体の両方のＦｃ領域の直前に付加される。

いくつかの実施形態では、突起（ホール）アミノ酸を含有するように改変された第１のポリペプチドは、天然または元のアミノ酸の、第１のポリペプチドの界面から突出する少なくとも１つの側鎖を有するアミノ酸による置換を含み、その結果、第２のポリペプチドの隣接界面の代償性の空洞（ホール）に配置可能である。ほとんどの場合、置換アミノ酸は、元のアミノ酸残基よりも大きな側鎖体積を有するものである。当業者は、アミノ酸残基の特性を決定及び／または評価して、突起を作製するための理想的な置換アミノ酸を特定する方法を知っている。いくつかの実施形態では、突起の形成のための置換残基は、天然に存在するアミノ酸残基であり、例えば、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）が挙げられる。いくつかの実施例では、置換のために特定された元の残基は、例えばアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、スレオニン、またはバリンなどの小さな側鎖を有するアミノ酸残基である。

いくつかの実施形態では、空洞（ホール）を含有するように改変された第２のポリペプチドは、天然または元のアミノ酸の、第２のポリペプチドの界面からくぼんだ少なくとも１つの側鎖を有するアミノ酸による置換を含み、これにより、第１のポリペプチドの界面の対応する突起に適合可能である。ほとんどの場合、置換アミノ酸は、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するものである。当業者は、アミノ酸残基の特性を決定及び／または評価して、空洞を形成するための理想的な置換残基を特定する方法を知っている。一般的に、空洞の形成のための置換残基は、天然に存在するアミノ酸であり、例えば、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）が挙げられる。いくつかの実施例では、置換のために特定された元のアミノ酸は、例えば、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンなどの大きな側鎖を有するアミノ酸である。

例えば、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３界面には、各表面から１０９０Å^２埋め込まれる４つの逆平行βストランド上に位置する各ドメインに１６残基が含まれる（例えば、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒｅｔａｌ．（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０：２３６１−２３７０；Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，（１９９０）ＪＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１６，９６５−９７３；Ｒｉｄｇｗａｙｅｔａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．９：６１７−６２１；米国特許第５，７３１，１６８号参照のこと）。突起または空洞を作製するためのＣＨ３ドメインの改変は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；国際特許出願ＷＯ９８／５０４３１及びＷＯ２００５／０６３８１６；及びＲｉｄｇｗａｙｅｔａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．９：６１７−６２１に記載されている。いくつかの実施例では、突起または空洞を作製するためのＣＨ３ドメインの改変は、典型的には２つの中央の逆平行βストランドに位置する残基を標的としている。その目的は、作製された突起が、パートナーＣＨ３ドメインの代償性の空洞により適合されるのではなく、周囲の溶媒へと突出することにより適合され得るリスクを最小限に抑えることである。

いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ変異を、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含有する。場合によっては、ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋も、例えば「ノブ」または「ホール」鎖のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異、及び他方の鎖のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ変異またはＳ３５４Ｃ変異を導入することによって、使用することができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７−６８１）。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は、２つのＣＨ３ドメインのうちの１つにＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインのうちの他方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は、２つのＣＨ３ドメインのうちの１つにＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインのうちの他方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は、２つのＣＨ３ドメインのうちの１つにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインのうちの他方にＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は、２つのＣＨ３ドメインのうちの１つにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインのうちの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。他のノブ・イン・ホール技術の例は、例えば欧州特許第１８７０４５９Ａ１に記載されるように、当技術分野において公知である。

いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子のＦｃ領域はさらに、上記のいずれかのような１つまたは複数の他のＦｃ変異を含有することができる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体分子は、エフェクター機能を低下させる変異を有するＦｃ領域を含有する。

いくつかの実施形態では、ＣＨ３突起（ノブ）または空洞（ホール）改変を含有するＦｃバリアントは、どこでも、ただし、典型的には、そのＮ末端またはＣ末端を介して、融合ポリペプチドを形成するなどのために、第１及び／または第２のスタック免疫調節ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にスタック免疫調節ポリペプチドに結合できる。連結は、直接的またはリンカーを介して間接的であり得る。典型的には、ノブ分子及びホール分子は、ＣＨ３突起改変（複数可）を含有するＦｃバリアントに連結された第１のスタック免疫調節ポリペプチドと、ＣＨ３空洞改変（複数可）を含有するＦｃバリアントに連結された第２のスタック免疫調節ポリペプチドとの共発現によって生成される。

本明細書では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン、例えばＩｇＶドメイン、及びバリアントＣＤ１５５ポリペプチドの第２のＩｇＳＦドメイン、例えばＩｇＶを含有するスタック免疫調節Ｆｃ融合ポリペプチドから産生されるホモ二量体マルチドメインスタック分子が提供される。いくつかの実施形態では、得られたマルチドメインスタック分子は、ＣＴＬＡ−４及びＴＩＧＩＴの両方に結合する。いくつかの態様では、ＴＩＧＩＴへの結合は、非改変または野生型ＣＤ１５５の対応するＩｇＳＦドメインのＴＩＧＩＴへの結合と比較して、同程度または類似の程度、または、場合によっては、増加する。いくつかの態様では、ＣＴＬＡ−４への結合は、非改変または野生型ＣＤ８０の対応するＩｇＳＦドメインのＣＴＬＡ−４への結合と比較して、同程度または類似の程度、または、場合によっては、増加する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴまたはＣＴＬＡ−４への結合は、非スタック形態のバリアントＣＤ８０ＩｇＳＦ−ＦｃのＴＩＧＩＴまたはＣＴＬＡ−４への結合の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴへの結合は、非スタック形態のバリアントＣＤ１５５ＩｇＳＦ−ＦｃのＴＩＧＩＴへの結合の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、得られたマルチドメインスタック分子は、レポーターアッセイで測定されるように、非スタックバリアントＣＤ８０ＩｇＳＦ−Ｆｃ及び／またはバリアントＣＤ１５５−ＩｇＳＦ−Ｆｃと比較して、Ｔ細胞免疫応答を増加させる。いくつかの実施形態では、増加は、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、またはそれ以上より大きい。

本明細書では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン、例えばＩｇＶドメイン、及びバリアントＣＤ１１２ポリペプチドの第２のＩｇＳＦドメイン、例えばＩｇＶを含有するスタック免疫調節Ｆｃ融合ポリペプチドから産生されるホモ二量体マルチドメインスタック分子が提供される。いくつかの実施形態では、得られたマルチドメインスタック分子は、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ１１２Ｒの両方に結合する。いくつかの態様では、ＣＤ１１２Ｒへの結合は、非改変または野生型ＣＤ１１２の対応するＩｇＳＦドメインのＣＤ１１２Ｒへの結合と比較して、同程度または類似の程度、または、場合によっては、増加する。いくつかの態様では、ＣＴＬＡ−４への結合は、非改変または野生型ＣＤ８０の対応するＩｇＳＦドメインのＣＴＬＡ−４への結合と比較して、同程度または類似の程度、または、場合によっては、増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１１２ＲまたはＣＴＬＡ−４への結合は、非スタック形態のバリアントＣＤ８０ＩｇＳＦ−ＦｃのＣＤ１１２ＲまたはＣＴＬＡ−４への結合の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１１２Ｒへの結合は、非スタック形態のバリアントＣＤ１１２ＩｇＳＦ−ＦｃのＣＤ１１２Ｒへの結合の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、得られたマルチドメインスタック分子は、レポーターアッセイで測定されるように、非スタックバリアントＣＤ８０ＩｇＳＦ−Ｆｃ及び／またはバリアントＣＤ１１２−ＩｇＳＦ−Ｆｃと比較して、Ｔ細胞免疫応答を増加させる。いくつかの実施形態では、増加は、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、またはそれ以上より大きい。

本明細書では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドのＩｇＳＦドメイン、例えばＩｇＶドメイン、バリアントＣＤ１５５またはＣＤ１１２ポリペプチドの第２のＩｇＳＦドメイン、例えばＩｇＶ、及びバリアントＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２ポリペプチドの第３のＩｇＳＦドメイン、例えばＩｇＶを含有するスタック免疫調節Ｆｃ融合ポリペプチドから産生されるホモ二量体マルチドメインスタック分子が提供される。いくつかの実施形態では、得られたマルチドメインスタック分子は、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２Ｒ及びＰＤ−１に結合する。いくつかの態様では、ＣＴＬＡ−４への結合は、非改変または野生型ＣＤ８０の対応するＩｇＳＦドメインのＣＴＬＡ−４への結合と比較して同程度または類似の程度である、または場合によっては増加する。いくつかの態様では、ＴＩＧＩＴへの結合は、非改変または野生型ＣＤ１５５の対応するＩｇＳＦドメインのＴＩＧＩＴへの結合と比較して同程度または類似の程度である、または場合によっては増加する。いくつかの態様では、ＣＤ１１２Ｒへの結合は、非改変または野生型ＣＤ１１２の対応するＩｇＳＦドメインのＣＤ１１２Ｒへの結合と比較して、同程度または類似の程度である、または場合によっては増加する。いくつかの態様では、ＰＤ−１への結合は、非改変または野生型ＰＤ−Ｌ１の対応するＩｇＳＦドメインのＰＤ−１への結合と比較して、同程度または類似の程度、または、場合によっては、増加する。いくつかの態様では、ＰＤ−１への結合は、非改変または野生型ＰＤ−Ｌ２の対応するＩｇＳＦドメインのＰＤ−１への結合と比較して、同程度または類似の程度、または、場合によっては、増加する。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４への結合は、非スタック形態のバリアントＣＤ８０ＩｇＳＦ−ＦｃのＣＴＬＡ−４への結合の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴまたはＣＤ１１２Ｒへの結合は、非スタック形態のバリアントＣＤ１１２ＩｇＳＦ−ＦｃのＴＩＧＩＴまたはＣＤ１１２Ｒへの結合の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴへの結合は、非スタック形態のバリアントＣＤ１５５ＩｇＳＦ−ＦｃのＴＩＧＩＴへの結合の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１への結合は、非スタック形態のバリアントＰＤ−１ＩｇＳＦ−ＦｃのＰＤ−１への結合の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、得られたマルチドメインスタック分子は、レポーターアッセイで測定されるように、非スタックバリアントＣＤ８０ＩｇＳＦ−Ｆｃ、バリアントＣＤ１１２ＩｇＳＦ−Ｆｃ、バリアントＣＤ１５５−ＩｇＳＦ−Ｆｃ、ＰＤ−Ｌ１−ＩｇＳＦ−Ｆｃ、及び／またはバリアントＰＤ−Ｌ２−ＩｇＳＦ−Ｆｃと比較して、Ｔ細胞免疫応答を増加させる。いくつかの実施形態では、増加は、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、またはそれ以上より大きい。

Ｃ．バリアントポリペプチドと免疫調節タンパク質のコンジュゲート及び融合体
いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦファミリーのＩｇドメイン（ｖＩｇＤ）のバリアントを含む免疫調節タンパク質である本明細書において提供されるバリアントポリペプチドは、部分、例えばエフェクター部分、例えば別のタンパク質と、直接的または間接的に、コンジュゲートまたは融合して、コンジュゲートを形成することができる（「ＩｇＳＦコンジュゲート」）。いくつかの実施形態では、結合は、共有結合または非共有結合（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン非共有結合性相互作用を介したもの）であることができる。ＣＤ８０−Ｆｃバリアント融合体のいくつかの実施形態では、任意の２つ以上の前述のコンジュゲートのいずれか１つまたは組み合わせを、ＦｃまたはバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは両方に結合させることができる。

いくつかの実施形態では、部分は、ターゲティング部分、小分子薬物（５００ダルトンモル質量未満の非ポリペプチド薬物）、毒素、細胞増殖抑制剤、細胞傷害剤、免疫抑制剤、診断目的に好適な放射性物質、治療目的の放射性金属イオン、プロドラッグ活性化酵素、生物学的半減期を延長させる物質、または診断用もしくは検出可能物質であることができる。

いくつかの実施形態では、エフェクター部分は、治療用物質、例えばがん治療用物質であり、細胞傷害性、細胞増殖抑制性であるか、またはさもなければいくらかの治療効果をもたらす。いくつかの実施形態では、エフェクター部分は、ターゲティング部分または物質、例えば、細胞表面抗原、例えば腫瘍細胞の表面上の抗原を標的とする物質である。いくつかの実施形態では、エフェクター部分は、検出可能シグナルを直接的または間接的のいずれかで生成することができる標識である。いくつかの実施形態では、エフェクター部分は、毒素である。いくつかの実施形態では、エフェクター部分は、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子またはナノ粒子である。

いくつかの実施形態では、同一であっても異なっていてもよい１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上のエフェクター部分は、バリアントポリペプチドまたはタンパク質にコンジュゲート、連結、または融合してＩｇＳＦコンジュゲートを形成する。いくつかの実施形態では、そのようなエフェクター部分を、当技術分野において公知かつ以下に記載される様々な分子生物学的または化学的コンジュゲーション及び連結法を使用して、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質に結合させることができる。いくつかの実施形態では、リンカー、例えばペプチドリンカー、切断可能リンカー、非切断可能リンカー、またはコンジュゲーション反応を助けるリンカーを使用して、エフェクター部分をバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質に連結するまたはコンジュゲートすることができる。

いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦコンジュゲートは、以下の成分、すなわち（タンパク質またはポリペプチド）、（Ｌ）_ｑ及び（エフェクター部分）_ｍを含み、該タンパク質またはポリペプチドは、記載される１つまたは複数のコグネイトカウンター構造体リガンドと結合することができる記載のバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質のいずれかであり；Ｌは、タンパク質またはポリペプチドを部分に連結するためのリンカーであり；ｍは、少なくとも１であり；ｑは、０以上であり；得られたＩｇＳＦコンジュゲートは、１つまたは複数のカウンター構造体リガンドに結合する。特定の実施形態では、ｍは１〜４であり、ｑは０〜８である。

いくつかの実施形態では、細胞表面分子に結合するターゲティング物質とコンジュゲートされた本明細書において提供されるバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質を含むＩｇＳＦコンジュゲートであって、例えば、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質を特定の細胞へターゲティング送達するための、ＩｇＳＦコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、ターゲティング物質は、対象における正常な細胞／組織及び／または腫瘍細胞／腫瘍上に存在する分子を局在化してそれに結合する能力を有する分子（複数可）である。言い換えると、ターゲティング物質を含むＩｇＳＦコンジュゲートは、細胞、例えば腫瘍細胞上に存在するリガンドに結合（直接的または間接的に）することができる。使用が企図される本発明のターゲティング物質は、標的細胞または分子の成分と結合することができる、抗体、ポリペプチド、ペプチド、アプタマー、他のリガンド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、ターゲティング物質は、対象への投与後に、腫瘍細胞（複数可）と結合するか、または腫瘍細胞（複数可）の近く（例えば、腫瘍血管系または腫瘍微小環境）に結合することができる。ターゲティング物質は、がん細胞の表面上の受容体またはリガンドに結合し得る。本発明の別の態様において、非がん性細胞または組織に特異的であるターゲティング物質が選択される。例えば、ターゲティング物質は、特定の細胞または組織上に通常存在する分子に特異的であることができる。さらに、いくつかの実施形態では、同じ分子が正常細胞及びがん細胞上に存在することができる。様々な細胞成分及び分子が公知である。例えば、ターゲティング物質がＥＧＦＲに特異的である場合、得られたＩｇＳＦコンジュゲートは、ＥＧＦＲを発現するがん細胞もＥＧＦＲを発現する正常な皮膚上皮細胞も標的とすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＩｇＳＦコンジュゲートは、２つの別々の機序（がん細胞及び非がん細胞を標的とする）によって作用することができる。

本明細書に開示される本発明の種々の態様において、本発明のＩｇＳＦコンジュゲートは、細胞成分、例えば腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、真菌抗原、プリオン抗原、寄生生物由来の抗原と結合する／標的とすることができる、ターゲティング物質を含む。いくつかの態様では、細胞成分、抗原または分子は各々、ターゲティング物質の所望の標的を意味するために使用することができる。例えば、各種実施形態では、ターゲティング物質は、限定されないが、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲｌ）、ＥｒｂＢ−２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ−３／ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ−４／ＨＥＲ４、ＥＧＦＲリガンドファミリー；インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）ファミリー、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、ＩＧＦＲリガンドファミリー；血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）ファミリー、ＰＤＧＦＲリガンドファミリー；線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）ファミリー、ＦＧＦＲリガンドファミリー、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリー、ＶＥＧＦファミリー；ＨＧＦ受容体ファミリー；ＴＲＫ受容体ファミリー；エフリン（ＥＰＨ）受容体ファミリー；ＡＸＬ受容体ファミリー；白血球チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）受容体ファミリー；ＴＩＥ受容体ファミリー、アンジオポエチン１，２；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体（ＲＯＲ）受容体ファミリー、例えば、ＲＯＲ１；ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）；Ｂ７−Ｈ６（ＮＣＲ３ＬＧ１）；ＣＤ８０、腫瘍グリコシル化抗原、例えば、ｓＴｎまたはＴｎ、例えばＭＵＣ１のｓＴｎＡｇ；ＬＨＲ（ＬＨＣＧＲ）；ホスファチジルセリン、ジスコイジンドメイン受容体（ＤＤＲ）ファミリー；ＲＥＴ受容体ファミリー；ＫＬＧ受容体ファミリー；ＲＹＫ受容体ファミリー；ＭｕＳＫ受容体ファミリー；トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）受容体、ＴＧＦ−β；サイトカイン受容体、クラスＩ（ヘマトポエチンファミリー）及びクラスＩＩ（インターフェロン／ＩＬ−１０ファミリー）受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）、死受容体ファミリー；がん−精巣（ＣＴ）抗原、系列特異的抗原、分化抗原、α−アクチニン−４、ＡＲＴＣｌ、切断点クラスタ領域−アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）（Ｂｃｒ−ａｂｌ）融合産物、Ｂ−ＲＡＦ、カスパーゼ−５（ＣＡＳＰ−５）、カスパーゼ−８（ＣＡＳＰ−８）、β−カテニン（ＣＴＮＮＢｌ）、細胞分裂周期２７（ＣＤＣ２７）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＯＡ−Ｉ、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ−２、伸長因子２（ＥＬＦ２）、Ｅｔｓバリアント遺伝子６／急性骨髄性白血病１遺伝子ＥＴＳ（ＥＴＣ６−ＡＭＬ１）融合タンパク質、フィブロネクチン（ＦＮ）、例えば、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）、ＧＰＮＭＢ、低密度脂質受容体／ＧＤＰ−Ｌフコース：β−Ｄガラクトース２−α−Ｌフコシルトランスフェラーゼ（ＬＤＬＲ／ＦＵＴ）融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２．ＨＬＡ−Ａ２遺伝子におけるα２ドメインのαヘリックスの残基１７０におけるアルギニン−イソロイシン交換（ＨＬＡ−Ａ＊２０１−Ｒ１７０Ｉ）、ＨＬＡ−Ａｌ１、熱ショックタンパク質７０−２変異型（ＨＳＰ７０−２Ｍ）、Ｋ１ＡＡ０２０５、ＭＡＲＴ２、黒色腫遍在性変異型１、２、３（ＭＵＭ−Ｉ、２、３）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ネオ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ（ＫＲＡＳ２）、Ｎ−ｒａｓ（ＮＲＡＳ）、ＨＲＡＳ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤｌ、ＳＹＴ−ＳＳＸｌまたは−ＳＳＸ２融合タンパク質、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ、ＢＡＧＫ−１、ＢＡＧＥ−２，３，４，５、ＧＡＧＥ−１，２，３，４，５，６，７，８、ＧｎＴ−Ｖ（異常なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ、ＭＧＡＴ５）、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＫＫ−ＬＣ、ＫＭ−ＨＮ−Ｉ、ＬＡＧＥ、ＬＡＧＥ−Ｉ、黒色腫上のＣＴＬ認識抗原（ＣＡＭＥＬ）、ＭＡＧＥ−Ａｌ（ＭＡＧＥ−Ｉ）、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−ＡｌＯ、ＭＡＧＥ−ＡＩｌ、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−Ｂｌ、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＭＡＧＥ−Ｂ５、ＭＡＧＥ−Ｂ６、ＭＡＧＥ−Ｃｌ、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ムチン１（ＭＵＣｌ）、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ（ＭＬＡＮＡ）、ｇｐｌＯＯ、ｇｐｌＯＯ／Ｐｍｅｌｌ７（ＳＩＬＶ）、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、ＴＲＰ−Ｉ、ＨＡＧＥ、ＮＡ−８８、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＮＹ−ＥＳＯ−ｌ／ＬＡＧＥ−２、ＳＡＧＥ、Ｓｐｌ７、ＳＳＸ−１，２，３，４、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、カリクレイン４、マンマグロビン−Ａ、ＯＡｌ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、アディポフィリン、黒色腫には存在しないインターフェロン誘導性タンパク質２（ＡＩＭ−２）、ＢＩＮＧ−４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤｌ、上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）、ＥｐｈＡ３、線維芽細胞成長因子−５（ＦＧＦ−５）、糖タンパク質２５０（ｇｐ２５０）、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢｌ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）、インターロイキン１３受容体α２鎖（ＩＬ１３Ｒα２）、ＩＬ−６受容体、腸カルボキシルエステラーゼ（ｉＣＥ）、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、Ｍ−ＣＳＦ、ｍｄｍ−２、ＭＵＣｌ、ｐ５３（ＴＰ５３）、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−Ｉ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＯＸｌＯ、ＳＴＥＡＰｌ、サバイビン（ＢＩＲＣ５）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、テロメラーゼ、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴｌ）、ＳＹＣＰｌ、ＢＲＤＴ、ＳＰＡＮＸ、ＸＡＧＥ、ＡＤＡＭ２、ＰＡＧＥ−５、ＬＩＰｌ、ＣＴＡＧＥ−Ｉ、ＣＳＡＧＥ、ＭＭＡｌ、ＣＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ＡＦ１５ｑｌ４、ＨＣＡ６６１、ＬＤＨＣ、ＭＯＲＣ、ＳＧＹ−Ｉ、ＳＰＯｌ１、ＴＰＸｌ、ＮＹ−ＳＡＲ−３５、ＦＴＨＬ１７、ＮＸＦ２、ＴＤＲＤｌ、ＴＥＸ１５、ＦＡＴＥ、ＴＰＴＥ、免疫グロブリンイディオタイプ、ベンスジョーンズタンパク質、エストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３３、がん抗原７２−４（ＣＡ７２−４）、がん抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、がん抗原２７−２９（ＣＡ２７−２９）、がん抗原１２５（ＣＡ１２５）、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、β−２ミクログロブリン、扁平上皮がん抗原、神経特異的エノラーゼ、熱ショックタンパク質ｇｐ９６、ＧＭ２、サルグラモスチム、ＣＴＬＡ−４、７０７アラニンプロリン（７０７−ＡＰ）、Ｔ細胞によって認識される腺がん抗原４（ＡＲＴ−４）、がん胎児性抗原ペプチド−１（ＣＡＰ−Ｉ）、カルシウム活性化クロライドチャネル−２（ＣＬＣＡ２）、シクロフィリンＢ（Ｃｙｐ−Ｂ）、ヒト印環腫瘍−２（ＨＳＴ−２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質（ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＰＶ−Ｅ７、メジャーまたはマイナーカプシド抗原、他）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）タンパク質（ＥＢＶ潜伏膜タンパク質−ＬＭＰｌ、ＬＭＰ２；他）、ＢまたはＣ型肝炎ウイルスタンパク質、ならびにＨＩＶタンパク質を含む成分に特異的であるかまたはそれに結合する。

いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦコンジュゲートは、そのターゲティング物質により、腫瘍細胞、腫瘍血管系または腫瘍微小環境の細胞成分と結合し、それにより免疫応答の調節（例えば、共刺激分子の活性化または免疫細胞活性化の負の調節分子の阻害による）、生存シグナルの阻害（例えば、成長因子またはサイトカインまたはホルモン受容体拮抗物質）、死シグナルの活性化、及び／または免疫媒介性細胞傷害性（例えば、抗体依存性細胞傷害性による）を介して、標的とした細胞の殺傷を促進する。このようなＩｇＳＦコンジュゲートは、例えばＩｇＳＦコンジュゲートの受容体媒介性エンドサイトーシスにより、例えば、コンジュゲートされたエフェクター部分の腫瘍標的への送達を促すなど、腫瘍細胞を抑制、低減または排除するようにいくつかの機序によって機能することができる；または、そのようなコンジュゲートは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）を動員、それと結合、及び／またはそれを活性化することができる。さらに、場合によっては、前述の経路の１つまたは複数が、本発明の１つまたは複数のＩｇＳＦコンジュゲートの投与によって作用し得る。

いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦコンジュゲートは、そのターゲティング物質により、腫瘍細胞、腫瘍血管系または腫瘍微小環境の細胞成分に局在化、例えば結合し、これにより腫瘍の近くで免疫応答の細胞を調節する。いくつかの実施形態では、ターゲティング物質は、コンジュゲートされたＩｇＳＦ（例えば、ｖＩｇＤ）の腫瘍標的への送達を促し、例えばそのコグネイト結合パートナーと相互作用して、コグネイト結合パートナーを保有する免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）のシグナル伝達を変化させる。いくつかの実施形態では、局在化送達は、ＣＴＬＡ−４阻害性受容体の拮抗作用または遮断作用を媒介する。いくつかの実施形態では、局在化送達は、ＣＴＬＡ−４阻害性受容体を作動させ、これは場合により、活性化受容体のクラスタリングが近接する場合に起こる可能性がある。

いくつかの実施形態では、ターゲティング物質は、免疫グロブリンである。本明細書において使用される場合、「免疫グロブリン」という用語は、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生される断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、及び上のいずれかのエピトープ結合断片を含む、天然または人工の一価または多価抗体を含む。「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）またはサブクラスの免疫グロブリン分子であることができる。

いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦコンジュゲートは、その抗体ターゲティング部分により、腫瘍細胞、腫瘍血管系または腫瘍微小環境の細胞成分と結合し、それにより免疫応答の調節（例えば、共刺激分子の活性化または免疫細胞活性化の負の調節分子の阻害による）、生存シグナルの阻害（例えば、成長因子またはサイトカインまたはホルモン受容体拮抗物質）、死シグナルの活性化、及び／または免疫媒介性細胞傷害性（例えば、抗体依存性細胞傷害性による）を介して、標的とした細胞のアポ卜ーシスを促進する。このようなＩｇＳＦコンジュゲートは、例えばＩｇＳＦコンジュゲートの受容体媒介性エンドサイトーシスにより、例えば、コンジュゲートされたエフェクター部分の腫瘍標的への送達を促すなど、腫瘍細胞を抑制、低減または排除するようにいくつかの機序によって機能することができる；または、そのようなコンジュゲートは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）を動員、それと結合、及び／またはそれを活性化することができる。

いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦコンジュゲートは、その抗体ターゲティング部分により、腫瘍細胞、腫瘍血管系または腫瘍微小環境の細胞成分と結合し、それにより免疫応答を調節する（例えば、共刺激分子の活性化または免疫細胞活性化の負の調節分子の阻害による）。いくつかの実施形態では、そのようなコンジュゲートは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）を認識し、それと結合し、及び／またそれを調節（例えば、阻害または活性化）することができる。

本発明の抗体ターゲティング部分は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片を含む抗体断片を含む。単鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、可変領域（複数可）を、単独でまたは以下：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインの全体もしくは一部分と組み合わせて含み得る。また、可変領域（複数可）とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインの任意の組み合わせをまた含む抗原結合断片も本発明に含まれる。また、Ｆｃ断片、抗原−Ｆｃ融合タンパク質、及びＦｃ−ターゲティング部分コンジュゲートまたは融合産物（Ｆｃ−ペプチド、Ｆｃ−アプタマー）も本発明に含まれる。本発明の抗体ターゲティング部分は、鳥類及び哺乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。一態様では、抗体ターゲティング部分は、ヒト、ネズミ（例えば、マウス及びラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。さらに、そのような抗体は、動物抗体のヒト化バージョンであってもよい。本発明の抗体ターゲティング部分は、単一特異性、二重特異性、三重特異性であっても、より高次の多重特異性のものであってもよい。

各種実施形態では、抗体／ターゲティング部分は、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞）を、Ｆｃ（抗体内）とＦｃ受容体（免疫細胞上）との間の相互作用を介して及び本明細書において提供されるコンジュゲートされたバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質を介して、動員、結合、及び／または活性化する。いくつかの実施形態では、抗体／ターゲティング部分は、本明細書において提供されるコンジュゲートされたバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質を介して、腫瘍物質を認識するまたはそれと結合して、それを腫瘍細胞に局在化し、腫瘍の近くで免疫細胞の調節を促す。

ＩｇＳＦコンジュゲートに組み込むことができる抗体の例は、限定されないが、抗体、例えばセツキシマブ（ＩＭＣ−Ｃ２２５；Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）；ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）；Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（登録商標）；Ｍａｂｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ；Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、トシツモマブ、ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、カツマキソマブ（Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標））、ゲムツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、アバタセプト（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ；Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、ベラタセプト（Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ；ＬＥＡ２９Ｙ；ＬＥＡ）、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０；ＭＤＸ−１０１）、トレメリムマブ（チシリムマブ；ＣＰ−６７５，２０６）、ＰＲＳ−０１０、ＰＲＳ−０５０、アフリベルセプト（ＶＥＧＦＴｒａｐ、ＡＶＥ００５）、ボロシキシマブ（Ｍ２００）、Ｆ２００、ＭＯＲＡｂ−００９、ＳＳ１Ｐ（ＣＡＴ−５００１）、シクスツムマブ（ＩＭＣ−Ａ１２）、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）、ニモツズマブ（ｈ−Ｒ３）、ザルツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＥＧＦＲ）、ネシツムマブＩＭＣ−１１Ｆ８、ｍＡｂ８０６／ｃｈ８０６、Ｓｙｍ００４、ｍＡｂ−４２５、Ｐａｎｏｒｅｘ＠（１７−１Ａ）（ネズミモノクローナル抗体）；Ｐａｎｏｒｅｘ＠（１７−１Ａ）（キメラネズミモノクローナル抗体）；ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８（ネズミ、抗ＣＤ２ＯＭＡｂ）；ＢＥＣ２（抗イディオタイプＭＡｂ、ＧＤエピトープを模倣）（ＢＣＧを含む）；Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１モノクローナル抗体）；ＳＭＡＲＴＭＩ９５Ａｂ、ヒト化１３’ＩＬＹＭ−Ｉ（Ｏｎｃｏｌｙｍ）、Ｏｖａｒｅｘ（Ｂ４３．１３、抗イディオタイプマウスＭＡｂ）；ＭＤＸ−２１０（ヒト化抗ＨＥＲ−２二重特異性抗体）；腺がん上のＥＧＰ４０（１７−１Ａ）汎がん腫（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原に結合する３６２２Ｗ９４Ｍａｂ；抗ＶＥＧＦ、Ｚｅｎａｐａｘ（ＳＭＡＲＴ抗Ｔａｃ（ＩＬ−２受容体）；ＳＭＡＲＴＭＩ９５Ａｂ、ヒト化Ａｂ、ヒト化）；ＭＤＸ−２１０（ヒト化抗ＨＥＲ−２二重特異性抗体）；ＭＤＸ−４４７（ヒト化抗ＥＧＦ受容体二重特異性抗体）；ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２（汎がん腫特異的Ａｂ）；ＴＮＴ（ヒストン抗原に対するキメラＭＡｂ）；ＴＮＴ（ヒストン抗原に対するキメラＭＡｂ）；Ｇｌｉｏｍａｂ−Ｈ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎｓ−ヒト化Ａｂ）；ＧＮＩ−２５０Ｍａｂ；ＥＭＤ−７２０００（キメラ−ＥＧＦ拮抗物質）；ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（ヒト化ＬＬ２抗体）；及びＭＤＸ−２６０二重特異性、標的ＧＤ−２、ＡＮＡＡｂ、ＳＭＡＲＴＩＤｌＯＡｂ、ＳＭＡＲＴＡＢＬ３６４ＡｂまたはＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡを含む。前述のリストに例示されるとおり、特定の標的エピトープに対する抗体を作製することは慣用的である。

いくつかの実施形態では、抗体ターゲティング部分は、Ｆｃドメインを含有する、完全長抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、例えば抗体のＦｃ部分のＮ末端へのコンジュゲーションによって、抗体ターゲティング部分のＦｃ部分にコンジュゲートされる。

いくつかの実施形態では、ｖＩｇＤは、直接的または間接的に、抗体の軽鎖及び／または重鎖のＮ末端またはＣ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、連結は、ペプチドリンカー、例えば上記のいずれかを介した連結であることができる。様々な配置を構築することができる。図８Ａ〜８Ｃは、例示的な配置を示す。いくつかの実施形態では、抗体コンジュゲートを、細胞において抗体の重鎖及び軽鎖の共発現によって産生することができる。

本発明の一態様では、ターゲティング物質は、アプタマー分子である。例えば、いくつかの実施形態では、アプタマーは、ターゲティング物質として機能する核酸からなる。様々な実施形態では、本発明のＩｇＳＦコンジュゲートは、腫瘍細胞、腫瘍血管系、及び／または腫瘍微小環境上の分子に特異的なアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、アプタマーはそれ自体が、ターゲティングモジュール（配列）に加えて、生物学的に活性な配列を含むことができ、該生物学的に活性な配列は、標的細胞に対する免疫応答を誘導することができる。言い換えれば、そのようなアプタマー分子は、二重使用物質である。いくつかの実施形態では、本発明のＩｇＳＦコンジュゲートは、アプタマーの抗体へのコンジュゲーションを含み、該アプタマー及び抗体は、腫瘍細胞、腫瘍血管系、腫瘍微小環境、及び／または免疫細胞上の別々の分子への結合に特異的である。

「アプタマー」という用語は、特定の分子への特異的結合特性に基づいて選択された、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドを含む。例えば、本明細書に開示されるとおりの腫瘍細胞、腫瘍血管系、腫瘍微小環境、及び／または免疫細胞内の特定の遺伝子または遺伝子産物と結合するように、アプタマー（複数可）を選択することができ、この場合、選択は、当技術分野において公知及び当業者によく知られている方法によってなされる。

本発明のいくつかの態様では、ターゲティング物質はペプチドである。例えば、本明細書において提供されるバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、がんまたは腫瘍細胞の成分と結合することができるペプチドにコンジュゲートすることができる。したがって、本発明のそのようなＩｇＳＦコンジュゲートは、腫瘍細胞、腫瘍血管系の細胞成分、及び／または腫瘍微小環境の成分に結合するペプチドターゲティング物質を含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング物質ペプチドは、インテグリンの拮抗物質または作動物質であることができる。α及びβサブユニットを含むインテグリンは、当業者に周知の多数のタイプを含む。

一実施形態では、ターゲティング物質はＶｖβ３である。インテグリンＶｖβ３は、多種多様な細胞上に発現され、骨マトリックスへの破骨細胞の接着、血管平滑筋細胞の遊走、及び血管新生を含むいくつかの生物学的に関連するプロセスを媒介することが示されている。インテグリンに対する好適なターゲティング分子は、他のインテグリン、例えばＶ４．βｉ（ＶＬＡ−４）、Ｖ４−Ｐ７（例えば、米国特許第６，３６５，６１９号；Ｃｈａｎｇｅｔａｌ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍＬｅｔｔ，１２：１５９−１６３（２００２）；Ｌｉｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍＬｅｔｔ，１２：１３３−１３６（２００２）を参照のこと）などに対する、ＲＧＤペプチドまたはペプチドミメティック及び非ＲＧＤペプチドまたはペプチドミメティック（例えば、米国特許第５，７６７，０７１号及び第５，７８０，４２６号を参照のこと）を含む。

いくつかの実施形態では、治療用物質とコンジュゲートした本明細書において提供されるバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質を含むＩｇＳＦコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、治療用物質は、例えば、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンデシンを含む（Ｒｏｗｌａｎｄｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２１：１８３−１８７，１９８６）。いくつかの実施形態では、治療用物質は、細胞内活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦコンジュゲートは内在化され、治療用物質は、細胞のタンパク質合成を遮断し、その中で細胞死を導く細胞毒素である。いくつかの実施形態では、治療用物質は、例えば、ゲロニン、ボウガニン、サポリン、リシン、リシンＡ鎖、ブリオジン、ジフテリア毒素、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ及びそのバリアントを含む、リボソーム不活性化活性を有するポリペプチドを含む細胞毒素である。いくつかの実施形態では、治療用物質がリボソーム不活性化活性を有するポリペプチドを含む細胞毒素である場合、タンパク質が細胞に対して細胞傷害性となるために、ＩｇＳＦコンジュゲートは標的細胞に結合したときに内在化されなければならない。

いくつかの実施形態では、毒素とコンジュゲートした本明細書において提供されるバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質を含むＩｇＳＦコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、毒素は、例えば、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、植物毒素、例えばリシン、小分子毒素、例えばゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１（２０００）；Ｍａｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１０：１０２５−１０２８（２０００）；Ｍａｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１３：７８６−７９１（２００２））、メイタンシノイド（欧州特許第１３９１２１３号；Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３（１９９６））、及びカリケアミシン（Ｌｏｄｅｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５８：２９２８（１９９８）；Ｈｉｎｍａｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３））を含む。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機序によって、それらの細胞傷害性及び細胞増殖阻害効果を発揮し得る。

いくつかの実施形態では、間接的または直接的に検出可能なシグナルを生成できる標識とコンジュゲートした本明細書において提供されるバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質を含むＩｇＳＦコンジュゲートが提供される。これらのＩｇＳＦコンジュゲートを、研究または診断用途に、例えばがんのｉｎｖｉｖｏ検出に使用することができる。標識は、好ましくは、直接的または間接的のいずれかで、検出可能シグナルを産生することができる。例えば、標識は、放射線不透過性または放射性同位体、例えば^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ；蛍光（フルオロフォア）もしくは化学発光（クロモフォア）化合物、例えばフルオレセインイソチオシアナート、ローダミンもしくはルシフェリン；酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ；イメージング剤；または金属イオンであり得る。いくつかの実施形態では、標識は、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えば^９９Ｔｃもしくは^１２３Ｉ、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても公知）用のスピン標識、例えばジルコニウム−８９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄である。ジルコニウム−８９を、例えばＰＥＴイメージング用に、様々な金属キレート剤に錯体化して抗体にコンジュゲートしてよい（ＷＯ２０１１／０５６９８３）。いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦコンジュゲートは、間接的に検出可能である。例えば、ＩｇＳＦコンジュゲートに特異的でかつ検出可能標識を含有する二次抗体を使用して、ＩｇＳＦコンジュゲートを検出することができる。

ＩｇＳＦコンジュゲートを、当技術分野において公知の任意の方法を使用して調製してよい。例えば、ＷＯ２００９／０６７８００、ＷＯ２０１１／１３３８８６、及び米国特許出願公開第２０１４３２２１２９号（その全体が本明細書に参照により組み込まれる）を参照のこと。

ＩｇＳＦコンジュゲートのバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質がエフェクター部分と会合またはそれに連結できる任意の手段によって、エフェクター部分に「結合」され得る。例えば、ＩｇＳＦコンジュゲートのバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、化学的または組換え手段によって、エフェクター部分に結合され得る。融合体またはコンジュゲートを調製するための化学的手段は、当技術分野において公知であり、これを使用してＩｇＳＦコンジュゲートを調製することができる。バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質とエフェクター部分をコンジュゲートするために使用される方法は、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質のそれらの１つまたは複数のカウンター構造体リガンドに結合する能力に干渉することなく、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質とエフェクター部分とを接続できなければならない。

ＩｇＳＦコンジュゲートのバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、エフェクター部分に間接的に連結してよい。例えば、ＩｇＳＦコンジュゲートのバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、数種類のうちの１種のエフェクター部分を含有するリポソームに直接連結してよい。エフェクター部分（複数可）及び／またはバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、固体表面に結合させてもよい。

いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦコンジュゲートのバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質とエフェクター部分は共にタンパク質であり、当技術分野において周知の技術を使用してこれらをコンジュゲートすることができる。２つのタンパク質をコンジュゲートできる利用可能な数百のクロスリンカーがある。（例えば、”ＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎａｎｄＣｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，”１９９１，ＳｈａｎｓＷｏｎｇ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＡｎｎＡｒｂｏｒを参照のこと）。クロスリンカーは、一般的に、バリアントポリペプチドもしくは免疫調節タンパク質及び／またはエフェクター部分上で利用可能であるかまたはそこに挿入される反応性官能基に基づいて選択される。加えて、反応性基がない場合、光活性化可能クロスリンカーを使用することができる。場合によっては、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質とエフェクター部分との間にスペーサーを含むことが望ましい場合がある。当技術分野に公知の架橋剤は、ホモ二官能性物質：グルタルアルデヒド、ジメチルアジピミデート及びビス（ジアゾベンジジン）、ならびにヘテロ二官能性物質：ｍマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びスルホ−ｍマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを含む。

いくつかの実施形態では、ＩｇＳＦコンジュゲートのバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、エフェクター部分の化学的結合のために特定の残基で操作してよい。当技術分野に公知の分子の化学的結合に使用される特定の残基は、リジン及びシステインを含む。クロスリンカーは、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質上に挿入される及びエフェクター部分上で利用可能な反応性官能基に基づいて選択される。

ＩｇＳＦコンジュゲートをまた、組換えＤＮＡ技術を使用して調製してもよい。そのような場合、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、エフェクター部分をコードするＤＮＡ配列に融合させることで、キメラＤＮＡ分子が得られる。キメラＤＮＡ配列は、融合タンパク質を発現する宿主細胞にトランスフェクトされる。細胞培養物から融合タンパク質を回収し、当技術分野において公知の技術を使用して精製することができる。

標識であるエフェクター部分をバリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質に結合させる例は、Ｈｕｎｔｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；Ｎｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２）；ＷｅｎｓｅｌａｎｄＭｅａｒｅｓ，ＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇＡｎｄＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）；及びＣｏｌｃｈｅｒｅｔａｌ．，“ＵｓｅＯｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡｓＲａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＦｏｒＴｈｅＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎＯｆＨｕｍａｎＣａｒｃｉｎｏｍａＸｅｎｏｇｒａｆｔｓＩｎＡｔｈｙｍｉｃＭｉｃｅ”，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：８０２−１６（１９８６）に記載されている方法を含む。

放射性標識または他の標識を公知の方法でコンジュゲートに組み込んでよい。例えば、ペプチドを、生合成しても、例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を使用する化学アミノ酸合成によって合成してもよい。^９９Ｔｃまたは^１２３Ｉ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ及び^１１１Ｉｎのような標識を、ペプチド内のシステイン残基を介して結合させることができる。イットリウム−９０を、リジン残基を介して結合させることができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７（１９７８））を使用してヨウ素−１２３を組み込むことができる。“ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎＩｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ”（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ１９８９）は、他の方法を詳細に記載している。

バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質と細胞傷害性物質のコンジュゲートを、多種多様な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣＩ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアナート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製してよい。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１０９８（１９８７）に記載のとおりリシン免疫毒素を調製することができる。炭素−１４で標識された１−ｐ−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。リンカーは、細胞中での細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光分解性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してよい。

本発明のＩｇＳＦコンジュゲートは、限定されないが、クロスリンカー試薬：市販（例えば、ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａから）のＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾアート）によって調製された薬物コンジュゲートを明示的に企図する。２００３−２００４ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＨａｎｄｂｏｏｋａｎｄＣａｔａｌｏｇの４６７〜４９８頁を参照されたい。

Ｄ．膜貫通型及び分泌可能な免疫調節タンパク質ならびに操作された細胞
免疫調節バリアントＣＤ８０ポリペプチドを発現する操作された細胞（あるいは、「操作された細胞」）が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、発現する免疫調節バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、膜貫通型タンパク質であり、かつ表面に発現する。いくつかの実施形態では、発現する免疫調節バリアントＣＤ８０ポリペプチドは発現して、細胞から分泌される。

１．膜貫通型免疫調節タンパク質
いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０を含む免疫調節ポリペプチドは、膜結合タンパク質であることができる。以下でより詳細に記載のとおり、免疫調節ポリペプチドは、少なくとも１つの親和性改変ＩｇＳＦドメイン（ＩｇＶまたはＩｇＣ）を含有するエクトドメイン、膜貫通ドメイン、及び任意で、細胞質ドメインを含有する、バリアントＣＤ８０を含む膜貫通型免疫調節ポリペプチドであることができる。いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質は、リンパ球（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）または抗原提示細胞の表面を含む、免疫細胞、例えば哺乳動物細胞の表面上に発現され得る。いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（あるいは、細胞傷害性Ｔリンパ球またはＣＴＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはγδＴ細胞のようなＴ細胞を含む、哺乳動物Ｔ細胞の表面上に発現する。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。典型的には、しかし限定するものではないが、エクトドメイン（あるいは、「細胞外ドメイン」）は、本発明のバリアントＣＤ８０の１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含む。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、膜貫通型タンパク質は、本発明のバリアントＣＤ８０の１つまたは複数のアミノ酸置換を含むエクトドメインを含む。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、膜貫通型タンパク質のような膜タンパク質であることができる膜貫通型免疫調節ポリペプチド（ＴＩＰ）であるバリアントＣＤ８０ポリペプチドを発現する。典型的な実施形態では、膜タンパク質のエクトドメインは、記載される少なくとも１つのＩｇＳＦドメインに１つまたは複数のアミノ酸置換を含有する、本明細書において提供されるバリアントＣＤ８０の細胞外ドメインまたはそのＩｇＳＦドメインを含む。本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質は、エクトドメインに連結された膜貫通ドメインをさらに含有する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞上の細胞表面発現のためにコードされたタンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、エクトドメインに直接連結されている。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、１つまたは複数のリンカーまたはスペーサーを介して、エクトドメインに間接的に連結されている。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、主に疎水性アミノ酸残基、例えばロイシン及びバリンを含有する。

いくつかの実施形態では、完全長膜貫通アンカードメインを使用して、確実にＴＩＰが操作された細胞、例えば操作されたＴ細胞の表面上に発現するようにすることができる。好都合なことに、これは、親和性が改変されている特定の天然タンパク質（例えば、ＣＤ８０または他の天然ＩｇＳＦタンパク質）由来であることもでき、天然ＩｇＳＦタンパク質（例えば、ＣＤ８０）と同じ様式で第１の膜近位ドメインの配列に簡単に融合させることもできる。いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質は、対応する野生型または非改変ＩｇＳＦメンバーの膜貫通ドメイン、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に記載のアミノ酸配列に含有される膜貫通ドメイン（表３）を含む。いくつかの実施形態では、膜結合形態は、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基２４３〜２６３に対応する、対応する野生型または非改変ポリペプチドの膜貫通ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然ＣＤ８０の膜貫通ドメインではない非天然膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、膜結合タンパク質であるかまたは膜貫通型タンパク質である別の非ＣＤ８０ファミリーメンバーポリペプチド由来の膜貫通ドメインに由来する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞上の別のタンパク質由来の膜貫通アンカードメインを使用することができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、スペーサードメインとして機能するＣＤ８の細胞外部分をさらに含有することができる。例示的なＣＤ８由来膜貫通ドメインは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３２、３６４もしくは１９９７に記載される、またはＣＤ８膜貫通ドメインを含有するその一部分である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、合成膜貫通ドメインである。

いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインに連結されたエンドドメイン、例えば細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含有する。いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、細胞シグナル伝達を誘導する。いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質のエンドドメインは、対応する野生型または非改変ポリペプチドの細胞質ドメイン、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に記載のアミノ酸配列に含有される細胞質ドメイン（表３を参照のこと）を含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０であるか、それを含む提供される膜貫通型免疫調節タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７９に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、記載される少なくとも１つの親和性改変ＣＤ８０ＩｇＳＦドメインを含むエクトドメイン及び膜貫通ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質は、表１に記載のいずれかを含む、記載されるＩｇＳＦドメイン（例えば、ＩｇＶドメイン）に任意の１つまたは複数のアミノ酸置換を含有する。いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質は、記載される細胞質ドメインをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含有することができる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１に記載のアミノ酸配列に含有される、野生型ＩｇＳＦメンバーの天然シグナルペプチドである（例えば、表３を参照のこと）。

また、膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸分子も提供される。いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸分子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７９に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、記載される少なくとも１つの親和性改変ＩｇＳＦドメインを含むエクトドメイン、膜貫通ドメイン、及び任意で、細胞質ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチドの配列をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、対応する野生型ＩｇＳＦメンバーの天然シグナルペプチドである（例えば、表３を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質のエンドドメインが、少なくとも１つのＩＴＡＭ（免疫受容体チロシン活性化モチーフ）含有シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲ関連膜貫通型免疫調節タンパク質が提供される。ＩＴＡＭは、Ｔ細胞受容体シグナルトランスダクションに関与するＣＤ３−ζ鎖（「ＣＤ３−ｚ」）を含む、免疫細胞のシグナルトランスダクションに関与する多数のタンパク質シグナル伝達ドメインに見いだされる保存モチーフである。いくつかの実施形態では、エンドドメインは、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３３に記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３３３に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を示すアミノ酸の配列を含み、かつＴ細胞シグナル伝達の活性を保持する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ関連膜貫通型免疫調節タンパク質のエンドドメインは、Ｔ細胞の免疫調節応答をさらに調節する共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４１ＢＢまたはＯＸ４０である。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８または４−１ＢＢに由来し、かつＳＥＱＩＤＮＯ：３６５〜３６８のいずれかに記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３６５〜３６８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を示すアミノ酸の配列を含み、かつＴ細胞共刺激シグナル伝達の活性を保持する。いくつかの実施形態では、提供されるＣＡＲ関連膜貫通型免疫調節タンパク質は、コグネイト結合パートナーまたはカウンター構造体への親和性改変ＩｇＳＦドメインの結合によってＴ細胞シグナル伝達を刺激する、ＣＡＲの特徴を有する。いくつかの実施形態では、親和性改変ＩｇＳＦドメインによるそのカウンター構造体への特異的結合によって、細胞傷害性、増殖またはサイトカイン産生の変化によって反映されるとおり、Ｔ細胞活性の免疫活性の変化をもたらすことができる。

いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質は、細胞質シグナル伝達を媒介することができるエンドドメインを含有しない。いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質は、野生型または非改変ポリペプチドのシグナルトランスダクション機序を欠いており、したがって、それ自体は細胞シグナル伝達を誘導しない。いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質は、対応する野生型または非改変ポリペプチドの細胞内（細胞質）ドメインまたは該細胞内ドメインの一部分、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１に記載のアミノ酸配列に含有される細胞質シグナル伝達ドメインを欠いている（表２を参照のこと）。いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質は、例えばＩｇＳＦファミリーの阻害性受容体（例えば、ＰＤ−１またはＴＩＧＩＴ）を含む特定の阻害性受容体に含有されるＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン阻害性モチーフ）を含有しない。したがって、いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質は、エクトドメイン及び膜貫通ドメイン（例えば、記載のとおりのいずれか）のみを含有する。

２．分泌型免疫調節タンパク質及び操作された細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるアミノ酸変異のいずれか１つまたは複数を含有するＣＤ８０バリアント免疫調節ポリペプチドは、例えば細胞に発現する際に分泌可能である。そのようなバリアントＣＤ８０免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０免疫調節タンパク質は、半減期延長部分（例えば、Ｆｃドメインまたは多量体化ドメイン）にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０免疫調節タンパク質は、ドメインを細胞外に出すシグナルペプチド、例えば抗体シグナルペプチドまたは他の有効なシグナル配列を含む。免疫調節タンパク質がシグナルペプチドを含み、操作された細胞によって発現される場合、該シグナルペプチドは、免疫調節タンパク質が操作された細胞によって分泌されるようにする。一般的に、シグナルペプチド、または該シグナルペプチドの一部分は、分泌と共に免疫調節タンパク質から切断される。免疫調節タンパク質は、核酸（発現ベクターの一部分であることができる）によってコードされることができる。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、細胞（例えば免疫細胞、例えば初代免疫細胞）によって発現及び分泌される。

したがって、いくつかの実施形態では、シグナルペプチドをさらに含むバリアントＣＤ８０免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドをコードする分泌配列に機能的に接続されたバリアントＣＤ８０免疫調節タンパク質をコードする核酸分子が本明細書において提供される。

シグナルペプチドは、細胞からの免疫調節タンパク質の分泌を合図する免疫調節タンパク質のＮ末端上の配列である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、約５〜約４０アミノ酸長（例えば、約５〜約７、約７〜約１０、約１０〜約１５、約１５〜約２０、約２０〜約２５、または約２５〜約３０、約３０〜約３５、または約３５〜約４０アミノ酸長）である。

いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、対応する野生型ＣＤ８０由来の天然シグナルペプチドである（表２を参照のこと）。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、非天然シグナルペプチドである。例えば、いくつかの実施形態では、非天然シグナルペプチドは、対応する野生型ＣＤ８０由来の変異した天然シグナルペプチドであり、かつ、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上）の置換、挿入、または欠失を含むことができる。いくつかの実施形態では、非天然シグナルペプチドは、野生型ＩｇＳＦファミリーメンバーと同じＩｇＳＦファミリー由来のファミリーメンバーのシグナルペプチドまたはその変異体である。いくつかの実施形態では、非天然シグナルペプチドは、野生型ＩｇＳＦファミリーメンバーとは異なるＩｇＳＦファミリー由来のＩｇＳＦファミリーメンバー由来のシグナルペプチドまたはその変異体である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、非ＩｇＳＦタンパク質ファミリー由来のシグナルペプチドまたはその変異体、例えば免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ重鎖またはＩｇＧκ軽鎖）、サイトカイン（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはＣＤ３３）、血清アルブミンタンパク質（例えば、ＨＳＡまたはアルブミン）、ヒトアズロシジンプレタンパク質シグナル配列、ルシフェラーゼ、トリプシノーゲン（例えば、キモトリプシノーゲンまたはトリプシノーゲン）由来のシグナルペプチド、または細胞からタンパク質を効率的に分泌することができる他のシグナルペプチドである。例示的なシグナルペプチドは、表９に記載のいずれかを含む。

（表９）例示的なシグナルペプチド

分泌可能なバリアントＣＤ８０免疫調節タンパク質のいくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、発現された際にシグナルペプチドを含み、そしてシグナルペプチド（またはその一部分）は、分泌によって免疫調節タンパク質から切断される。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、細胞から分泌されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、そのようなバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、分泌のためのシグナル配列の操作可能な制御下で、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、コードされる免疫調節タンパク質は、細胞から発現された際に分泌される。いくつかの実施形態では、核酸分子によってコードされる免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、核酸分子によってコードされる免疫調節タンパク質は、半減期延長部分（例えば、Ｆｃドメインまたは多量体化ドメイン）を含まない。いくつかの実施形態では、核酸分子によってコードされる免疫調節タンパク質は、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、免疫調節タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された分泌性またはシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、それにより免疫調節タンパク質の分泌が可能となる。

３．細胞及び細胞の操作
提供される免疫調節ポリペプチドのいずれかを発現する操作された細胞が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、それらの表面上に、提供される膜貫通型免疫調節ポリペプチドのいずれかを発現する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、免疫調節タンパク質を発現して、タンパク質の分泌に好適な条件下で細胞から分泌可能であるか、または分泌することができる。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、リンパ球、例えば腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞上、または骨髄系細胞上に発現する。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、改変された哺乳動物Ｔ細胞または改変された哺乳動物抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞またはＡＰＣは、ヒトまたはネズミ細胞である。

いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、限定されないが、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（あるいは、細胞傷害性Ｔリンパ球またはＣＴＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはγδＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋である。ＭＨＣのシグナルに加えて、改変されたＴ細胞はまた、共刺激シグナルを必要とする。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、阻害性シグナルによっても調整でき、これは、場合によっては、前述したように膜結合形態で発現したバリアントＣＤ８０膜貫通型免疫調節ポリペプチドによって提供される。

いくつかの実施形態では、操作されたＡＰＣは、例えば、ＭＨＣＩＩを発現するＡＰＣ、例えばマクロファージ、Ｂ細胞、及び樹状細胞、ならびに細胞及び無細胞（例えば、生分解性高分子微粒子）ａＡＰＣの両方を含む人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）を含む。人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）は、これらが抗原をＴ細胞に提示し、それらを活性化するという点でＡＰＣと類似の様式で作用することができる、ＡＰＣの合成バージョンである。抗原提示は、ＭＨＣ（クラスＩまたはクラスＩＩ）によって実施される。いくつかの実施形態では、ａＡＰＣのような操作されたＡＰＣでは、ＭＨＣ上に負荷される抗原は、いくつかの実施形態では、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原である。ＭＨＣ上に負荷される抗原は、いくつかの場合ではＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１または本明細書において提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドによって認識される他の分子を発現することができる、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ａＡＰＣを操作するために使用することができる材料は、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、酸化鉄、リポソーム、脂質二重層、セファロース、及びポリスチレンが挙げられる。

いくつかの実施形態では、養子細胞療法で使用されるＴＩＰ及びＴＣＲ作動物質を含有するように操作することができる。いくつかの実施形態では、細胞のａＡＰＣは、例えば患者への再導入のために、投与前などに、ヒトＴ細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖に使用されるＴＩＰ及びＴＣＲ作動物質を含有するように操作することができる。いくつかの態様では、ａＡＰＣは、例えば、ＯＫＴ３及び／またはＵＣＨＴ１などの少なくとも１つの抗ＣＤ３抗体クローンの発現を含み得る。いくつかの態様では、ａＡＰＣは不活性化（例えば、照射）されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＴＩＰは、Ｔ細胞上のコグネイト結合パートナーに対して結合親和性を示す任意のバリアントＩｇＳＦドメインを含むことができる。

いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質または分泌可能な免疫調節タンパク質などの本明細書で提供される免疫調節タンパク質は、共発現または操作されて、抗原結合受容体、例えば組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞になる。いくつかの実施形態では、操作された細胞、例えば操作されたＴ細胞は、がん、炎症性及び自己免疫性障害、またはウイルス感染に関連する所望の抗原を認識する。特定の実施形態では、抗原結合受容体は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含有する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原などの抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）を含有するＣＡＲ（キメラ抗原受容体）Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＩＰタンパク質は、操作されたＴ細胞受容体細胞または操作されたキメラ抗原受容体細胞で発現する。かかる実施形態では、操作された細胞はＴＩＰとＣＡＲまたはＴＣＲを共発現する。いくつかの実施形態では、ＳＩＰタンパク質は、操作されたＴ細胞受容体細胞または操作されたキメラ抗原受容体細胞で発現する。かかる実施形態では、操作された細胞は、ＳＩＰとＣＡＲまたはＴＣＲを共発現する。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原結合ドメイン（エクトドメイン）、膜貫通ドメイン、及び抗原の結合後にＴ細胞への活性化シグナルを誘導または媒介できる細胞内シグナル伝達領域（エンドドメイン）を含む組換え受容体である。いくつかの実施例では、ＣＡＲ発現細胞は、活性化ドメイン、及び場合によっては共刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達部分に連結された特定の腫瘍抗原に対して特異性を有する細胞外単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を発現するように操作される。共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）に由来し得る。活性化ドメインは、例えば、ＣＤ３、例えばＣＤ３ζ、ε、δ、γなどに由来し得る。ある種の実施形態では、ＣＡＲは、２つ、３つ、４つ以上の共刺激ドメインを持つように設計される。ＣＡＲｓｃＦｖは、疾患または状態に関連する細胞、例えば腫瘍抗原、例えばＣＤ１９などで発現する抗原を標的とするように設計することができ、これはＢ細胞系の細胞（ＮＨＬ、ＣＬＬ、及び非Ｔ細胞ＡＬＬを含むがこれらに限定されない全ての正常なＢ細胞及びＢ細胞悪性腫瘍を含む）によって発現される膜貫通型タンパク質である。例示的なＣＡＲ＋Ｔ細胞療法及び構築物は、米国特許公開第２０１３／０２８７７４８号、第２０１４／０２２７２３７号、第２０１４／００９９３０９号、及び第２０１４／００５０７０８号に記載されており、これらの参考文献はその全体が参照により組み込まれる。

いくつかの態様では、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片、例えば単鎖断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍またはがん細胞で発現する。抗原の例はＣＤ１９である。ＣＡＲの例は、抗ＣＤ１９ＣＡＲ、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：３６３に記載の抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを含有するＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、スペーサー、膜貫通ドメイン、及びＩＴＡＭシグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインまたは領域をさらに含有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、スペーサー及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来するヒンジ及び膜貫通ドメインであり、例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３２、３６４、１９９７に記載の例示的な配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３３２、３６４、１９９７に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。いくつかの実施形態では、エンドドメインは、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３３に記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３３３に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み、かつＴ細胞シグナル伝達の活性を保持する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのエンドドメインは、Ｔ細胞の免疫調節応答をさらに調節する共刺激シグナル伝達ドメインまたは領域をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激領域であるか、またはそれを含むか、またはＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４１ＢＢまたはＯＸ４０の共刺激領域に由来する。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８または４−１ＢＢに由来し、かつＳＥＱＩＤＮＯ：３６５〜３６８のいずれかに記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３６５〜３６８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、またはそれ以上の配列同一性を示し、かつＴ細胞共刺激シグナル伝達の活性を保持するアミノ酸の配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物は、自己切断ペプチド配列によってＣＡＲから分離されたマーカー、例えば検出可能なタンパク質などの第２のタンパク質をさらにコードする。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチド配列は、Ｆ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＰ２Ａ自己切断ペプチドである。Ｔ２Ａ自己切断ペプチドの例示的な配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６９、２００４、２００８のいずれか１つ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３６９、２００４、２００８のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列に記載される。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２００８に記載のヌクレオチド配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２００８のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、またはそれ以上の配列同一性を示す配列によってコードされる。Ｐ２Ａ自己切断ペプチドの例示的な配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０３８、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３０３２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列において設定される。場合によっては、核酸構築物は２つ以上のＰ２Ａ自己切断ペプチド（例えばＰ２Ａ１及びＰ２Ａ２）をコードし、ヌクレオチド配列Ｐ２Ａ１及びＰ２Ａ２はそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：３０３２に記載のＰ２Ａをコードし、該ヌクレオチド配列は配列間の組換えを避けるため異なっていてもよい。

いくつかの実施形態では、マーカーは、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などの検出可能なタンパク質である。蛍光タンパク質マーカーの例示的な配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７０、２００３、３０３３〜３０３５、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３７０、２００３、３０３３〜３０３５に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列に記載されている。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６０、３７１、３７２、３７３、１９９８、１９９９、２００１、２００２のいずれかに記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３６０、３７１、３７２、３７３、１９９８、１９９９、２００１、２００２のいずれか１つに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０００または２００６に記載のヌクレオチド配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２０００または２００６のいずれか１つに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列によってコードされる。

別の実施形態では、操作されたＴ細胞は、組換えまたは操作されたＴＣＲを含むＴＣＲを有する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、天然ＴＣＲであることができる。当業者は、一般的に天然の哺乳動物Ｔ細胞受容体が、抗原特異的認識及び結合に関与するα及びβ鎖（またはγ及びδ鎖）を含むことを認識するだろう。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、改変されている操作されたＴＣＲである。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞のＴＣＲは、ＡＰＣによって提示された腫瘍関連または腫瘍特異的抗原に特異的に結合する。

いくつかの実施形態では、免疫調節ポリペプチド、例えば膜貫通型免疫調節ポリペプチドまたは分泌可能な免疫調節ポリペプチドを、組換え宿主細胞に採用されるもののような多種多様な方法によって、操作された細胞、例えば操作されたＴ細胞または操作されたＡＰＣに組み込むことができる。ＤＮＡ構築物を初代Ｔ細胞に導入するための多種多様な方法が当技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、ウイルス形質導入またはプラスミドエレクトロポレーションが採用される。典型的な実施形態では、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子、または発現ベクターは、発現された膜貫通型免疫調節タンパク質を細胞膜に局在化させるかまたは分泌のためのシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸は、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターにサブクローニングされ、これにより宿主哺乳動物細胞での発現が可能になる。発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入することができ、宿主細胞培養条件下で、免疫調節タンパク質が表面上に発現するかまたは分泌される。

例示的な例では、初代Ｔ細胞を、ｅｘｖｉｖｏで精製して（ＣＤ４細胞またはＣＤ８細胞または両方）、様々なＴＣＲ／ＣＤ２８作動物質、例えば抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コートビーズからなる活性化プロトコルで刺激することができる。２または３日の活性化プロセス後、免疫調節ポリペプチドを含有する組換え発現ベクターを、当技術分野で標準的なレンチウイルスもしくはレトロウイルス形質導入プロトコルまたはプラスミドエレクトロポレーション法により、初代Ｔ細胞に安定的に導入することができる。細胞を、例えば、バリアントＣＤ８０を含む天然親分子及びポリペプチドと交差反応する抗エピトープタグまたは抗体を使用するフローサイトメトリーによって、免疫調節ポリペプチド発現についてモニタリングすることができる。免疫調節ポリペプチドを発現するＴ細胞を、用途に応じて、抗エピトープタグ抗体を用いたソーティングにより濃縮することも、高または低発現のために濃縮することもできる。

免疫調節ポリペプチドが発現されると、操作されたＴ細胞を多種多様な手段によって、適切な機能についてアッセイすることができる。操作されたＣＡＲまたはＴＣＲ共発現を検証して、操作されたＴ細胞のこの部分が免疫調節タンパク質の発現による影響をほとんど受けなかったことを示すことができる。検証すると、標準的なｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害性、増殖、またはサイトカインアッセイ（例えば、ＩＦＮ−γ発現）を使用して、操作されたＴ細胞の機能を評価することができる。例示的な標準エンドポイントは、腫瘍株の溶解率、操作されたＴ細胞の増殖率、または培養上清中のＩＦＮ−γタンパク質発現率である。対照構築物に対して、統計的に有意な腫瘍株の溶解の増加、操作されたＴ細胞の増殖の増加、またはＩＦＮ−γ発現の増加をもたらす操作された構築物を選択することができる。加えて、操作されていない細胞、例えば天然の初代または内在性Ｔ細胞を同じｉｎｖｉｔｒｏアッセイに組み込んで、操作された細胞、例えば操作されたＴ細胞上に発現する免疫調節ポリペプチド構築物の、活性を調節する（いくつかの場合では、バイスタンダー天然Ｔ細胞におけるエフェクター機能を活性化及び生成することを含む）能力を測定することもできる。活性化マーカー、例えばＣＤ６９、ＣＤ４４、またはＣＤ６２Ｌの増加した発現を内在性Ｔ細胞上でモニタリングすることもでき、増加した増殖及び／またはサイトカイン産生は、改変されたＴ細胞上に発現する免疫調節タンパク質の所望の活性を示すこともできる。

いくつかの実施形態では、類似のアッセイを使用して、ＣＡＲまたはＴＣＲ単独を含有する操作されたＴ細胞の機能を、ＣＡＲまたはＴＣＲ及びＴＩＰ構築物を含有するものと比較することができる。典型的には、これらのｉｎｖｉｔｒｏアッセイは、様々な比率の操作されたＴ細胞及びコグネイトＣＡＲまたはＴＣＲ抗原を含有する「腫瘍」細胞株を一緒に培養下でプレーティングすることによって実施される。標準エンドポイントは、腫瘍株の溶解率、操作されたＴ細胞の増殖率、または培養上清中のＩＦＮ−γ産生率である。同じＴＣＲまたはＣＡＲ構築物単独に対して、統計的に有意な腫瘍株の溶解の増加、操作されたＴ細胞の増殖の増加、またはＩＦＮ−γ産生の増加をもたらした操作された免疫調節タンパク質を選択することができる。操作されたヒトＴ細胞を、マウスのＴ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞を欠いているＮＳＧ系統のような免疫不全マウスで分析することができる。ＣＡＲまたはＴＣＲが異種移植片上の標的カウンター構造体に結合しかつＴＩＰの親和性改変ＩｇＳＦドメインと共発現する操作されたヒトＴ細胞を、異種移植片と比較して異なる細胞数及び比率にてｉｎｖｉｖｏで養子移入することができる。例えば、ルシフェラーゼ／ＧＦＰベクターを含有するＣＤ１９＋白血病腫瘍株の生着を、生物発光によりまたはｅｘｖｉｖｏでフローサイトメトリーによってモニタリングすることができる。ある共通の実施形態では、異種移植片がネズミモデルに導入され、続いて数日後に操作されたＴ細胞が導入される。免疫調節タンパク質を含有する操作されたＴ細胞を、ＣＡＲまたはＴＣＲ単独を含有する操作されたＴ細胞と比べて、増加した生存、腫瘍クリアランス、または操作されたＴ細胞の増殖数についてアッセイすることができる。ｉｎｖｉｔｒｏアッセイと同様に、内在性の天然（すなわち、操作されていない）ヒトＴ細胞を共養子移入して、その集団において、より良好な生存または腫瘍クリアランスをもたらすエピトープ拡大の成功を予測することができる。

Ｅ．バリアントポリペプチド及び免疫調節タンパク質を発現する感染性物質
また、本明細書に記載の分泌可能な免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質を含むバリアントポリペプチド、例えばＣＤ８０ｖＩｇＤポリペプチドのいずれかをコードする核酸を含有する感染性物質も提供される。いくつかの実施形態では、そのような感染性物質は、本明細書に記載のバリアント免疫調節ポリペプチド、例えばＣＤ８０ｖＩｇＤポリペプチドをコードする核酸を、対象の標的細胞、例えば対象の免疫細胞及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）または腫瘍細胞に送達することができる。また、そのような感染性物質に含有される核酸、及び／または、そのような感染性物質の生成もしくは改変のための核酸、例えばベクター及び／またはプラスミド、ならびにそのような感染性物質を含有する組成物が提供される。

いくつかの実施形態では、感染性物質は、微生物または病原菌である。いくつかの実施形態では、感染性物質は、ウイルスまたは細菌である。いくつかの実施形態では、感染性物質は、ウイルスである。いくつかの実施形態では、感染性物質は、細菌である。いくつかの実施形態では、そのような感染性物質は、本明細書に記載の分泌可能な免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質を含むバリアントポリペプチド、例えばＣＤ８０ｖＩｇＤポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を送達することができる。したがって、いくつかの実施形態では、感染性物質に感染されるまたは接触される対象の細胞は、バリアント免疫調節ポリペプチドを細胞表面上に発現させるかまたは分泌させることができる。いくつかの実施形態では、感染性物質はまた、１つまたは複数の他の治療薬または他の治療薬をコードする核酸を対象内の細胞及び／または環境に送達することもできる。いくつかの実施形態では、感染性物質によって送達されることができる他の治療薬は、サイトカインまたは他の免疫調節分子を含む。

いくつかの実施形態では、感染性物質、例えば、ウイルスまたは細菌は、本明細書に記載の分泌可能な免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質を含むバリアントポリペプチド、例えばＣＤ８０ｖＩｇＤポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含有し、対象の細胞の接触及び／または感染によって、該細胞は、感染性物質に含有される核酸配列によってコードされた分泌可能な免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質を含むバリアントポリペプチド、例えばＣＤ８０ｖＩｇＤポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、感染性物質を対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、感染性物質を対象由来の細胞とｅｘｖｉｖｏで接触させることができる。

いくつかの実施形態では、感染性物質によって感染された細胞によって発現する膜貫通型免疫調節タンパク質を含むバリアントポリペプチド、例えばＣＤ８０ｖＩｇＤポリペプチドは、膜貫通型タンパク質であり、表面に発現する。いくつかの実施形態では、感染性物質によって感染された細胞によって発現される分泌可能な免疫調節タンパク質を含むバリアントポリペプチド、例えばＣＤ８０ｖＩｇＤポリペプチドは、細胞から発現されかつ分泌される。膜貫通型免疫調節タンパク質または分泌型免疫調節タンパク質は、本明細書に記載のいずれかであることができる。

いくつかの実施形態では、感染性物質によって標的とされる対象の細胞は、腫瘍細胞、免疫細胞、及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、感染性物質は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）にある細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、感染性物質は、分泌可能な免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質を含むバリアントポリペプチド、例えばＣＤ８０ｖＩｇＤポリペプチドをコードする核酸を、適切な細胞（例えば、ＡＰＣ、例えばペプチド／ＭＨＣ複合体をその細胞表面上に提示する細胞、例えば樹状細胞）または組織（例えば、リンパ組織）に送達し、それにより、所望の効果、例えば免疫調節及び／または特異的な細胞媒介性免疫応答、例えばＣＤ４及び／またはＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導する及び／または増強させ、そのＣＤ８Ｔ細胞応答は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を含み得る。いくつかの実施形態では、感染性物質は、ＡＰＣ、例えば樹状細胞（ＤＣ）を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の感染性物質によって送達される核酸分子は、特定の標的細胞において、バリアント免疫調節ポリペプチドをコードする作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切な核酸配列、例えば、調節エレメント、例えばプロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、免疫調節ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する感染性物質はまた、１つまたは複数の追加の遺伝子産物、例えば、サイトカイン、プロドラッグ変換酵素、細胞毒素及び／または検出可能遺伝子産物をコードする核酸配列を含有することもできる。例えば、いくつかの実施形態では、感染性物質は、腫瘍溶解性ウイルスであり、該ウイルスは、追加の治療用遺伝子産物をコードする核酸配列を含むことができる（例えば、Ｋｉｒｎｅｔａｌ．，（２００９）ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ９：６４−７１；Ｇａｒｃｉａ−Ａｒａｇｏｎｃｉｌｌｏｅｔａｌ．，（２０１０）ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｏｌＴｈｅｒ１２：４０３−４１１を参照のこと；米国特許第７，５８８，７６７号、第７，５８８，７７１号、第７，６６２，３９８号及び第７，７５４，２２１号、ならびに米国特許出願公開第２００７／０２０２５７２号、第２００７／０２１２７２７号、第２０１０／００６２０１６号、第２００９／００９８５２９号、第２００９／００５３２４４号、第２００９／０１５５２８７号、第２００９／０１１７０３４号、第２０１０／０２３３０７８号、第２００９／０１６２２８８号、第２０１０／０１９６３２５号、第２００９／０１３６９１７号及び第２０１１／００６４６５０号を参照のこと。いくつかの実施形態では、追加の遺伝子産物は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の死をもたらすことができる治療用遺伝子産物、または免疫応答を増強もしくは強化もしくは調節できる遺伝子産物（例えば、サイトカイン）であることができる。例示的な遺伝子産物はまた、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、免疫チェックポイント阻害剤、抗体、サイトカイン、成長因子、抗原、細胞傷害性遺伝子産物、プロアポトーシス遺伝子産物、抗アポトーシス遺伝子産物、細胞マトリックス分解性遺伝子、組織再生またはヒト体細胞をリプログラミングして多能性にするための遺伝子ならびに本明細書に記載のまたは当業者に公知の他の遺伝子の中に含まれる。いくつかの実施形態では、追加の遺伝子産物は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。

１．ウイルス
いくつかの実施形態では、感染性物質は、ウイルスである。いくつかの実施形態では、感染性物質は、腫瘍溶解性ウイルス、または、特定の細胞、例えば免疫細胞を標的とするウイルスである。いくつかの実施形態では、感染性物質は、対象の腫瘍細胞及び／またはがん細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、感染性物質は、免疫細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とする。

いくつかの実施形態では、感染性物質は、腫瘍溶解性ウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に蓄積しかつ腫瘍細胞において複製するウイルスである。該細胞における複製、及び本明細書に記載のバリアント免疫調節バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質をコードする核酸の任意の送達によって、腫瘍細胞は溶解され、腫瘍は縮小し、排除されることができる。腫瘍溶解性ウイルスは、広範な宿主及び細胞タイプの範囲を有することができる。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍及び／または転移を含み、かつ創傷組織及び細胞も含む、免疫特権を有する細胞または免疫特権を有する組織に蓄積し、これにより本明細書に記載のバリアント免疫調節ポリペプチドをコードする核酸の、広範な細胞タイプにおける送達及び発現が可能となる。腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞特異的に複製することもでき、その結果、腫瘍細胞溶解及び効率的な腫瘍退縮をもたらすことができる。

例示的な腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、コクサッキーウイルス及びワクシニアウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、他の臓器に感染することなく固体腫瘍に特異的に定着することができ、感染性物質として使用して、本明細書に記載のバリアント免疫調節ポリペプチドをコードする核酸をそのような固体腫瘍に送達することができる。

本明細書に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質をコードする核酸の送達に使用するための腫瘍溶解性ウイルスは、当業者に公知のもののいずれかであることができ、例えば、水疱性口内炎ウイルス（例えば、米国特許第７，７３１，９７４号、第７，１５３，５１０号、第６，６５３，１０３号、及び米国特許出願公開第２０１０／０１７８６８４号、第２０１０／０１７２８７７号、第２０１０／０１１３５６７号、第２００７／００９８７４３号、第２００５０２６０６０１号、第２００５０２２０８１８号、及び欧州特許第１３８５４６６号、第１６０６４１１号及び第１５２０１７５号を参照のこと）；単純ヘルペスウイルス（例えば、米国特許第７，８９７，１４６号、第７，７３１，９５２号、第７，５５０，２９６号、第７，５３７，９２４号、第６，７２３，３１６号、第６，４２８，９６８号、及び米国特許出願公開第２０１４／０１５４２１６号、第２０１１／０１７７０３２号、第２０１１／０１５８９４８号、第２０１０／００９２５１５号、第２００９／０２７４７２８号、第２００９／０２８５８６０号、第２００９／０２１５１４７号、第２００９／００１０８８９号、第２００７／０１１０７２０号、第２００６／００３９８９４号、第２００４／０００９６０４号、第２００４／００６３０９４号、国際特許公開ＷＯ２００７／０５２０２９、ＷＯ１９９９／０３８９５５を参照のこと）；レトロウイルス（例えば、米国特許第６，６８９，８７１号、第６，６３５，４７２号、第５，８５１，５２９号、第５，７１６，８２６号、第５，７１６，６１３号及び米国特許出願公開第２０１１０２１２５３０号を参照のこと）；ワクシニアウイルス（例えば、２０１６／０３３９０６６号を参照のこと）、及びアデノ随伴ウイルス（例えば、米国特許第８，００７，７８０号、第７，９６８，３４０号、第７，９４３，３７４号、第７，９０６，１１１号、第７，９２７，５８５号、第７，８１１，８１４号、第７，６６２，６２７号、第７，２４１，４４７号、第７，２３８，５２６号、第７，１７２，８９３号、第７，０３３，８２６号、第７，００１，７６５号、第６，８９７，０４５号、及び第６，６３２，６７０号を参照のこと）が挙げられる。

腫瘍溶解性ウイルスはまた、それらの病原性を減弱し、それらの安全性プロファイルを改善し、それらの腫瘍特異性を増強するように遺伝子が変化されたウイルスを含み、そして、これらはまた、ウイルスの有効性全体を改善する追加の遺伝子、例えば細胞毒素、サイトカイン、プロドラッグ変換酵素を備えている（例えば、Ｋｉｒｎｅｔａｌ．，（２００９）ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ９：６４−７１；Ｇａｒｃｉａ−Ａｒａｇｏｎｃｉｌｌｏｅｔａｌ．，（２０１０）ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｏｌＴｈｅｒ１２：４０３−４１１を参照のこと；米国特許第第７，５８８，７６７号、第７，５８８，７７１号、第７，６６２，３９８号及び第７，７５４，２２１号、ならびに米国特許出願公開第２００７／０２０２５７２号、第２００７／０２１２７２７号、第２０１０／００６２０１６号、第２００９／００９８５２９号、第２００９／００５３２４４号、第２００９／０１５５２８７号、第２００９／０１１７０３４号、第２０１０／０２３３０７８号、第２００９／０１６２２８８号、第２０１０／０１９６３２５号、第２００９／０１３６９１７号及び第２０１１／００６４６５０号を参照のこと）。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、がん性細胞において選択的に複製するように改変されているもの、したがって腫瘍溶解性である、ウイルスであることができる。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍治療のため、及びまた遺伝子治療ベクターとして、改変された指向性を有するように操作されているアデノウイルスである。その例は、ＯＮＹＸ−０１５、Ｈ１０１及びＡｄ５ΔＣＲ（ＨａｌｌｄｅｎａｎｄＰｏｒｔｅｌｌａ（２０１２）ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＴｈｅｒＴａｒｇｅｔｓ，１６：９４５−５８）及びＴＮＦｅｒａｄｅ（ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．（２００５）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１２：８２５−３０）、または制限増殖型アデノウイルスＯｎｃｏｒｉｎｅ（登録商標）である。

いくつかの実施形態では、感染性物質は、改変された単純ヘルペスウイルスである。いくつかの実施形態では、感染性物質は、本明細書に記載のバリアント免疫調節ポリペプチドのいずれか、例えば本明細書に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質のいずれかをコードする核酸を含有するように改変された、タリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ−Ｖｅｃ、ＩｍｌｙｇｉｃまたはＯｎｃｏＶｅｘＧＭ−ＣＳＦとしても公知）の改変されたバージョンである。いくつかの実施形態では、感染性物質は、例えば、ＷＯ２００７／０５２０２９、ＷＯ１９９９／０３８９５５、ＵＳ２００４／００６３０９４、ＵＳ２０１４／０１５４２１６に記載されている改変された単純ヘルペスウイルス、またはそのバリアントである。

いくつかの実施形態では、感染性物質は、ウイルスが投与される対象において特定タイプの細胞を標的とするウイルス、例えば免疫細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とするウイルスである。樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答の開始及び制御に必須のＡＰＣである。ＤＣは、抗原を捕捉及びプロセシングすることができ、末梢からリンパ系臓器へ遊走し、抗原を静止Ｔ細胞に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）拘束様式で提示することができる。いくつかの実施形態では、感染性物質は、ＤＣを特異的に標的としてＤＣにおける発現のためにバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質をコードする核酸を送達できるウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、レンチウイルスまたはそのバリアントもしくは誘導体、例えば組み込み欠損型レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、細胞表面マーカーである樹状細胞特異的細胞間接着分子−３−捕捉ノンインテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）を発現する細胞、例えばＤＣに効率的に結合して生産的に感染するようシュードタイプ化されたレンチウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質またはその改変された形態でシュードタイプ化されたレンチウイルス、例えばＷＯ２０１３／１４９１６７に記載されているものである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、関心対象の配列（例えば、本明細書に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質のいずれかをコードする核酸）のＤＣへの送達及び発現を可能にする。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＷＯ２００８／０１１６３６またはＵＳ２０１１／００６４７６３、Ｔａｒｅｅｎｅｔａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２２：５７５−５８７に記載されているもの、またはそのバリアントを含む。樹状細胞指向性ベクタープラットフォームの例は、ＺＶｅｘ（商標）である。

２．細菌
いくつかの実施形態では、感染性物質は、細菌である。例えば、いくつかの実施形態では、細菌は、本明細書に記載のバリアント免疫調節ポリペプチドのいずれか、例えば、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質をコードする核酸を、対象の標的細胞、例えば腫瘍細胞、免疫細胞、抗原提示細胞及び／またはド貪食細胞に送達することができる。いくつかの実施形態では、細菌は、バリアント免疫調節ポリペプチドの発現及び／または分泌のため、及び／または、バリアント免疫調節ポリペプチドの発現のための環境において特定の細胞を標的とするため、対象内の特定の環境、例えば腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に優先的に標的とされることができる。

いくつかの実施形態では、細菌は、哺乳動物細胞へのプラスミドＤＮＡの細菌媒介性移送（「バクトフェクション」とも称される）を介して核酸を細胞に送達する。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝物質の送達は、細菌全体の標的細胞への侵入により達成される。いくつかの実施形態では、自発的なまたは誘導された溶菌が、その後の真核細胞発現のためのプラスミドの放出をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、細菌は、非貪食哺乳動物細胞（例えば、腫瘍細胞）及び／または貪食細胞、例えば、特定の免疫細胞及び／またはＡＰＣに、核酸を送達することができる。いくつかの実施形態では、細菌によって送達される核酸を、発現のために対象の細胞の核に移すことができる。いくつかの実施形態では、核酸はまた、特定の宿主細胞において、バリアント免疫調節ポリペプチドをコードする作動可能に連結された配列の発現に必要な適切な核酸配列、例えば、調節エレメント、例えばプロモーターまたはエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、細菌である感染性物質は、免疫調節タンパク質をコードする核酸を、標的細胞の機構により翻訳のために標的細胞の細胞質に送達されるＲＮＡ、例えば予め作製された翻訳能力のあるＲＮＡの形態で送達することができる。

いくつかの実施形態では、細菌は、標的細胞、例えば腫瘍細胞において複製し、該細胞を溶解することができる。いくつかの実施形態では、細菌は、標的細胞の細胞質で核酸配列及び／または遺伝子産物を含有及び／または放出することができ、それにより、標的細胞、例えば腫瘍細胞を殺傷することができる。いくつかの実施形態では、感染性物質は、対象の特定の環境、例えば、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）で特異的に複製することができる細菌である。例えば、いくつかの実施形態では、細菌は、嫌気性または低酸素微小環境で特異的に複製することができる。いくつかの実施形態では、特定の環境に存在する条件または因子、例えばＴＭＥにおいて細胞によって産生されるアスパラギン酸、セリン、クエン酸、リボースまたはガラクトースは、細菌を該環境に誘引する化学誘引物質として作用することができる。いくつかの実施形態では、細菌は、本明細書に記載の免疫調節タンパク質を、環境、例えばＴＭＥにおいて、発現及び／または分泌することができる。

いくつかの実施形態では、感染性物質は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｄｉｕｍ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、またはＹｅｒｓｉｎｉａ属である細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｎｏｖｙｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓの１つまたは複数の中から選択される。いくつかの実施形態では、細菌は、操作された細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は、操作された細菌、例えば、ＳｅｏｗａｎｄＷｏｏｄ（２００９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ１７（５）：７６７−７７７；Ｂａｂａｎｅｔａｌ．（２０１０）ＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＢｕｇｓ１：６，３８５−３９４；Ｐａｔｙａｒｅｔａｌ．（２０１０）ＪＢｉｏｍｅｄＳｃｉ１７：２１；Ｔａｎｇｎｅｙｅｔａｌ．（２０１０）ＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＢｕｇｓ１：４，２８４−２８７；ｖａｎＰｉｊｋｅｒｅｎｅｔａｌ．（２０１０）ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．２１（４）：４０５−４１６；ＷＯ２０１２／１４９３６４；ＷＯ２０１４／１９８００２；ＵＳ９１０３８３１；ＵＳ９４５３２２７；ＵＳ２０１４／０１８６４０１；ＵＳ２００４／０１４６４８８；ＵＳ２０１１／０２９３７０５；ＵＳ２０１５／０３５９９０９及びＥＰ３０２０８１６に記載されているものである。細菌は、本明細書において提供されるバリアント免疫調節ポリペプチド、コンジュゲート及び／または融合体のいずれかをコードする核酸配列を送達するように、及び／またはそのようなバリアント免疫調節ポリペプチドを対象において発現するように、改変されることができる。

Ｆ．ポリペプチドまたは細胞を産生するための核酸、ベクター及び方法
本明細書において提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節ポリペプチドの種々の提供される態様のいずれかをコードする、単離された核酸または組換え核酸（まとめて「核酸」と称される）が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、後述の全てを含む本明細書において提供される核酸は、本明細書において提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節ポリペプチドの組換え産生（例えば、発現）に有用である。いくつかの実施形態では、後述の全てを含む本明細書において提供される核酸は、細胞、例えば操作された細胞、例えば免疫細胞、または感染性物質細胞における、本明細書において提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節ポリペプチドの発現に有用である。本明細書において提供される核酸は、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であることができ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、組換えまたは合成ＲＮＡ及びＤＮＡ、ならびにｃＤＮＡを含むことができる。本明細書において提供される核酸は、典型的には、ＤＮＡ分子、通常二本鎖のＤＮＡ分子である。しかしながら、本発明のヌクレオチド配列のうちのいずれかを含む、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、及びハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ核酸またはその組み合わせも提供される。

また、本明細書において提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節ポリペプチドを産生する際に有用な、組換え発現ベクター及び組換え宿主細胞も本明細書において提供される。

また、提供される免疫調節ポリペプチドのいずれか、例えば膜貫通型免疫調節ポリペプチドまたは分泌可能な免疫調節ポリペプチドのいずれかを含有する、操作された細胞、例えば操作された免疫細胞も本明細書において提供される。

また、提供される免疫調節ポリペプチドのいずれか、例えば膜貫通型免疫調節ポリペプチドまたは分泌可能な免疫調節ポリペプチドのいずれかを含有する、感染性物質、例えば細菌細胞またはウイルス細胞も本明細書において提供される。

上に提供される実施形態のいずれかでは、本明細書において提供される免疫調節ポリペプチドをコードする核酸を、組換えＤＮＡ及びクローニング技術を使用して細胞に導入することができる。そのようにするために、免疫調節ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子が調製される。そのようなＤＮＡ分子を調製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、ペプチドをコードする配列を好適な制限酵素を使用してＤＮＡから切り取ることができる。あるいは、ホスホロアミダイト法のような化学合成技術を使用してＤＮＡ分子を合成することができる。また、これらの技術の組み合わせを使用することができる。場合によっては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により組換えまたは合成核酸を生成してもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの親和性改変ＩｇＳＦドメインと、いくつかの実施形態では、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、及び／またはエンドドメインを含有する１つまたは複数のバリアントＣＤ８０ポリペプチドをコードするＤＮＡインサートを、提供される説明に従って生成することができる。このＤＮＡインサートを、当業者に公知のとおり、適切な形質導入／トランスフェクションベクターにクローニングすることができる。また、該核酸分子を含有する発現ベクターも提供される。

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、タンパク質の発現に適する条件下で免疫調節タンパク質を適切な細胞において発現することができる。いくつかの態様では、核酸分子または発現ベクターは、適切な発現制御配列に作動可能に連結された免疫調節タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子がベクターに挿入される前または後のいずれかに、この機能的連結を達成する方法は周知である。発現制御配列は、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルを含む。

いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質の発現は、プロモーターまたはエンハンサーによって制御されて、発現を制御または調節する。プロモーターは、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質をコードする核酸分子の部分に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（例えば、組織特異的な構成的に活性なプロモーターまたは他の構成的プロモーター）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導物質（例えば、Ｔ細胞活性化シグナル）に応答性であり得る誘導性プロモーターである。

いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結されている。例示的な構成的プロモーターは、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、及びＥＦ−１α（ＥＦ１ａ）プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、組織特異的である。例えば、いくつかの実施形態では、プロモーターは、特定の組織、例えば免疫細胞、リンパ球、またはＴ細胞における免疫調節タンパク質の構成的発現を可能にする。例えば、フェトタンパク質、ＤＦ３、チロシナーゼ、ＣＥＡ、界面活性タンパク質、及びＥｒｂＢ２プロモーターを含む、例示的な組織特異的プロモーターが米国特許第５，９９８，２０５号に記載されている。

いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、転写の適切な誘導因子の有無を制御することによって核酸の発現が制御可能であるように、バリアントポリペプチドまたは免疫調節タンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、コードされたポリペプチドの調節された発現を可能にする、調節されたプロモーター及び転写因子発現系、例えば公開されているテトラサイクリン調節系または他の調節可能な系（例えば、公開されている国際ＰＣＴ出願ＷＯ０１／３０８４３を参照のこと）であることができる。例示的な調節可能なプロモーター系は、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）から入手可能なＴｅｔ−Ｏｎ（及びＴｅｔ−Ｏｆｆ）系である。このプロモーター系は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体、例えばドキシサイクリンによって制御される、導入遺伝子の調節された発現を可能にする。他の調節可能なプロモーター系が公知である（例えば、リガンド結合ドメイン及び転写調節ドメイン、例えばホルモン受容体由来のものを含有する遺伝子スイッチを説明している「ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＵｓｉｎｇＳｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ，Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ，ＬｉｇａｎｄＤｅｐｅｎｄｅｎｔＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅＳｗｉｔｃｈｅｓ」という表題の公開されている米国特許出願第２００２−０１６８７１４号を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｔ細胞活性化シグナル伝達に応答性のエレメントに応答性である。単なる一例として、いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、免疫調節タンパク質、及び免疫調節タンパク質の発現を制御するために作動可能に連結されたプロモーターをコードする発現ベクターを含む。操作されたＴ細胞を、例えば操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によるシグナル伝達によって活性化することができ、それにより応答性プロモーターによる免疫調節タンパク質の発現及び分泌を引き起こすことができる。

いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、免疫調節タンパク質が活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）または活性化Ｂ細胞の核因子κ軽鎖エンハンサー（ＮＦ−κＢ）に応答して発現するように、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結されている。例えば、いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴまたはＮＦ−κＢの結合部位を含む。例えば、いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＮＦＡＴもしくはＮＦ−κＢプロモーター、またはその機能的バリアントである。したがって、いくつかの実施形態では、核酸は、免疫調節タンパク質の毒性を低減または排除もしながら、免疫調節タンパク質の発現を制御することを可能にする。具体的には、本発明の核酸を含む操作された免疫細胞は、細胞（例えば、該細胞によって発現されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））が抗原によって特異的に刺激される際、及び／または、細胞（例えば、細胞のカルシウムシグナル伝達経路）が、例えばホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）／イオノマイシンによって非特異的に刺激される際にのみ、免疫調節タンパク質を発現及び分泌する。したがって、免疫調節タンパク質の発現、及び場合によっては分泌を、それが必要な時及び場合にのみ（例えば、感染症惹起物質、がんの存在下、または腫瘍部位で）起こるように制御することができ、それにより望ましくない免疫調節タンパク質相互作用を減少または回避することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫調節タンパク質をコードする核酸は、ＮＦＡＴプロモーター、ＮＦ−κＢプロモーター、またはその機能的バリアントをコードする好適なヌクレオチド配列を含む。「ＮＦＡＴプロモーター」は、本明細書において使用される場合、最小プロモーターに連結された１つまたは複数のＮＦＡＴ応答性エレメントを意味する。「ＮＦ−κＢプロモーター」は、最小プロモーターに連結された１つまたは複数のＮＦ−κＢ応答性エレメントを指す。いくつかの実施形態では、遺伝子の最小プロモーターは、最小ヒトＩＬ−２プロモーターまたはＣＭＶプロモーターである。ＮＦＡＴ応答性エレメントは、例えば、ＮＦＡＴ１、ＮＦＡＴ２、ＮＦＡＴ３、及び／またはＮＦＡＴ４応答性エレメントを含み得る。ＮＦＡＴプロモーター、ＮＦ−κＢプロモーター、またはその機能的バリアントは、任意の数の結合モチーフ、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または最大で１２個の結合モチーフを含み得る。

ＤＮＡ分子をその上に有する、得られた組換え発現ベクターを使用して、適切な宿主を形質転換する。当技術分野において周知の方法を使用して、この形質転換を実施することができる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される核酸は、得られる可溶性免疫調節ポリペプチドが培養培地、宿主細胞、または宿主細胞ペリプラズムから回収されるように、免疫調節ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された分泌型またはシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。他の実施形態では、免疫調節ポリペプチドの膜発現が可能となるように適切な発現制御シグナルが選択される。さらに、市販のキット及び委託製造会社を利用して、本明細書において提供される操作された細胞または組換え宿主細胞を作製することもできる。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子をその上に有する得られた発現ベクターを使用して、適切な細胞を形質転換、例えば形質導入する。導入は、当技術分野において周知の方法を使用して実施することができる。例示的な方法は、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス、形質導入、トランスポゾン、及びエレクトロポレーションを介することを含む、受容体をコードする核酸の移送のためのものを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、核酸は、レンチウイルスまたはレトロウイルス形質導入法によって細胞に移送される。

哺乳動物Ｔ細胞またはＡＰＣを含む、多数の公的に入手可能かつ周知の哺乳動物宿主細胞のいずれかを、ポリペプチドまたは操作された細胞の調製に使用することができる。細胞の選択は、当技術分野によって認識される多数の要因に依存する。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされたペプチドの毒性、形質転換率、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、生物安全性及びコストが含まれる。全ての細胞が特定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効であるとは限らないという理解をもって、これらの要因のバランスをとらねばならない。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞のような多種多様な真核細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくはＨＥＫ２９３細胞のような哺乳動物細胞であることができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は懸濁細胞であり、ポリペプチドは培養浮遊ＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ−Ｓ細胞などの培養懸濁液で操作または産生される。いくつかの実施例では、細胞株は、ＤＨＦＲが欠損している（ＤＨＦＲ−）ＣＨＯ細胞株、例えばＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１である。いくつかの実施形態では、細胞は、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、例えばＣＨＯ−Ｓ細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、及びＣＨＯＺＮ（（Ｒ））ＧＳ−／−細胞を欠損している。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞、例えば浮遊ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ−Ｓ−２Ｈ２細胞、ＣＨＯ−Ｓ−クローン１４細胞、またはＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞であってもよい。

いくつかの実施形態では、宿主細胞はまた、原核細胞、例えば大腸菌であることもできる。形質転換された組換え宿主は、ポリペプチドを発現する条件下で培養され、次いで精製されて可溶性タンパク質を得る。組換え宿主細胞を、所望のポリペプチドを発現するような従来の発酵条件下で培養することができる。そのような発酵条件は、当技術分野において周知である。最後に、本明細書において提供されるポリペプチドを、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び親和性クロマトグラフィーを含む当技術分野において周知の多数の方法のいずれかによって、組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。所望の場合、成熟タンパク質の配置を完了する際にタンパク質のリフォールディングステップを使用することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製ステップに用いることができる。

いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば操作された細胞の調製と関連して上記のいずれかである。いくつかの実施形態では、そのような操作された細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象に対して自家である。操作された細胞は、対象に対して同種である。いくつかの実施形態では、操作された細胞を、対象から、例えば白血球除去療法によって得て、これを免疫調節ポリペプチド、例えば膜貫通型免疫調節ポリペプチドまたは分泌可能な免疫調節ポリペプチドの発現のためにｅｘｖｉｖｏで形質転換する。

また、本明細書に記載の感染性物質に含有されるバリアント免疫調節ポリペプチドのいずれかをコードする核酸も提供される。いくつかの実施形態では、感染性物質は、核酸を対象の細胞に送達し、及び／または細胞においてコードされたバリアントポリペプチドの発現を可能にする。また、そのような感染性物質を生成する、産生する、または改変するために使用される核酸も提供される。例えば、いくつかの実施形態では、感染性物質の生成、対象の細胞への送達、及び／または対象の細胞におけるバリアント免疫調節ポリペプチドの発現のための、バリアント免疫調節ポリペプチドをコードする核酸を含有するベクター及び／またはプラスミドが提供される。

いくつかの実施形態では、提供される核酸は、バリアント免疫調節ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する、組換えウイルスまたは細菌ベクターである。いくつかの実施形態では、組換えベクターを使用して、バリアント免疫調節ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する感染性物質を産生することができる、及び／または、標的細胞による発現のために対象の標的細胞に送達することができる。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、感染性物質の生成及び／または産生ならびに標的細胞における発現に必要な適切な配列を含む。

いくつかの実施形態では、組換えベクターは、プラスミドまたはコスミドである。本明細書に記載されるバリアント免疫調節ポリペプチドをコードする核酸配列を含有するプラスミドまたはコスミドは、当技術分野において周知の標準的な技術を使用して容易に構築される。感染性物質の生成のために、ベクターまたはゲノムをプラスミド形態で構築することができ、これを次いで、パッケージングもしくは産生細胞株または宿主細菌へトランスフェクトすることができる。組換えベクターは、当技術分野において公知の組換え技術のいずれかを使用して生成することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、原核生物の複製起点、及び／または、発現が検出可能または選択可能マーカー（例えば原核生物系における伝播及び／または選択のための薬剤耐性）を付与する遺伝子を含むことができる。

いくつかの実施形態では、組換えベクターは、ウイルスベクターである。例示的な組換えウイルスベクターは、レンチウイルスベクターゲノム、ポックスウイルスベクターゲノム、ワクシニアウイルスベクターゲノム、アデノウイルスベクターゲノム、アデノウイルス随伴ウイルスベクターゲノム、ヘルペスウイルスベクターゲノム、及びアルファウイルスベクターゲノムを含む。ウイルスベクターは、生ウイルスベクター、弱毒化ウイルスベクター、複製条件付き（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）もしくは複製欠損ウイルスベクター、非病原性（欠陥）ウイルスベクター、複製能力のあるウイルスベクターであることができ、及び／または、異種の遺伝子産物、例えば、本明細書において提供されるバリアント免疫調節ポリペプチドを発現するように改変される。ウイルスの生成のためのベクターはまた、転写または翻訳負荷を増加または低減する任意の方法を含む、ウイルスの弱毒化を変化させるように改変することもできる。

使用することができる例示的なウイルスベクターは、改変されたワクシニアウイルスベクター（例えば、Ｇｕｅｒｒａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：９８５−９８（２００６）；Ｔａｒｔａｇｌｉａｅｔａｌ．，ＡＩＤＳＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ８：１４４５−４７（１９９２）；Ｇｈｅｒａｄｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２９２５−３６（２００５）；Ｍａｙｒｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ３：６−１４（１９７５）；Ｈｕｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０３００−３０８（２００１）；米国特許第５，６９８，５３０号、第６，９９８，２５２号、第５，４４３，９６４号、第７，２４７，６１５号及び第７，３６８，１１６号を参照のこと）；アデノウイルスベクターまたはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（例えば、Ｍｏｌｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８３５８−６１（１９９８）；Ｎａｒｕｍｉｅｔａｌ．，ＡｍＪ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：９３６−４１（１９９８）；Ｍｅｒｃｉｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：６１８８−９３（２００４）；米国特許第６，１４３，２９０号；第６，５９６，５３５号；第６，８５５，３１７号；第６，９３６，２５７号；第７，１２５，７１７号；第７，３７８，０８７号；第７，５５０，２９６号を参照のこと）；ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、エコトロピックレトロウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及び組み合わせに基づくものを含むレトロウイルスベクター（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２４（１９９１）；Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０：４２３９（１９９０）；Ｋｏｌｂｅｒｇ，ＮＩＨＲｅｓ．４：４３１９９２；Ｃｏｒｎｅｔｔａｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２：２１５（１９９１）を参照のこと）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、馬伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、及びマエディ／ビスナウイルスに基づくものを含むレンチウイルスベクター（例えば、Ｐｆｅｉｆｅｒｅｔａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＧｅｎｏｍｉｃｓＨｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２：１７７−２１１（２００１）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３，１９９８；Ｍｉｙｏｓｈｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０，１９９８；ＰｈｉｌｐｏｔｔａｎｄＴｈｒａｓｈｅｒ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１８：４８３，２００７；Ｅｎｇｅｌｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２７２９，１９９５；Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，１３：１１２１，２００６；Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９０１１（１９９９）；ＷＯ２００９／０７６５２４；ＷＯ２０１２／１４１９８４；ＷＯ２０１６／０１１０８３；ＭｃＷｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１１５０，２００３；Ｐｏｗｅｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２８８，１９９６を参照のこと）もしくはその任意のバリアント、及び／または上記のウイルスのいずれかを生成するために使用することができるベクターを含む。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、例えばＲＮＡウイルスの場合、パッケージング細胞株において、ウイルスゲノムの発現を調節することができる、調節配列、例えばプロモーターまたはエンハンサー配列を含むことができる（例えば、米国特許第５，３８５，８３９号及び第５，１６８，０６２号を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、組換えベクターは、発現ベクター、例えば、標的細胞、例えば対象の細胞、例えば腫瘍細胞、免疫細胞及び／またはＡＰＣに送達された際にコードされた遺伝子産物の発現を可能にする発現ベクターである。いくつかの実施形態では、感染性物質に含有される組換え発現ベクターは、タンパク質の発現に適する条件下で、対象の標的細胞において免疫調節タンパク質を発現することができる。

いくつかの態様では、核酸または発現ベクターは、適切な発現制御配列に作動可能に連結された免疫調節タンパク質をコードする核酸配列を含む。免疫調節タンパク質をコードする核酸配列がベクターに挿入される前または後のいずれかに、この機能的連結に作用する方法は周知である。発現制御配列は、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルを含む。プロモーターは、免疫調節タンパク質をコードする核酸配列の部分に作動可能に連結されることができる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、標的細胞における構成的に活性なプロモーター（例えば、組織特異的な構成的に活性なプロモーターまたは他の構成的プロモーター）である。例えば、組換え発現ベクターはまた、リンパ組織特異的な転写調節エレメント（ＴＲＥ）、例えばＢリンパ球、Ｔリンパ球、または樹状細胞特異的なＴＲＥも含み得る。リンパ組織特異的ＴＲＥは、当技術分野において公知である（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：１０４３−５３（１９９２）；Ｔｏｄｄｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１６６３−７４（１９９３）；Ｐｅｎｉｘｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１４８３−９６（１９９３）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導物質（例えば、Ｔ細胞活性化シグナル）に応答性であり得る誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、対象の標的細胞、例えば腫瘍細胞、免疫細胞及び／またはＡＰＣに送達される核酸は、上記の調節エレメントのいずれかに作動可能に連結されることができる。

いくつかの実施形態では、ベクターは、細菌ベクター、例えば細菌プラスミドまたはコスミドである。いくつかの実施形態では、細菌ベクターは、哺乳動物細胞へのプラスミドＤＮＡの細菌媒介性移送（「バクトフェクション」とも称される）を介して、標的細胞、例えば腫瘍細胞、免疫細胞及び／またはＡＰＣに送達される。いくつかの実施形態では、送達される細菌ベクターはまた、標的細胞における発現のための適切な発現制御配列、例えばプロモーター配列及び／またはエンハンサー配列、または上記の任意の調節もしくは制御配列のうちのいずれかを含有する。いくつかの実施形態では、細菌ベクターは、感染性物質、例えば、細菌におけるコードされたバリアントポリペプチドの発現及び／または分泌のための適切な発現制御配列を含有する。

いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるポリペプチドは、合成法によって作製することもできる。固相合成は、小ペプチドを作製する最も費用効果の高い方法であるので、個々のペプチドを作製する好ましい技術である。例えば、周知の固相合成技術は、保護基、リンカー、及び固相支持体の使用、ならびに特定の保護及び脱保護反応条件、リンカー切断条件、スカベンジャーの使用、及び固相ペプチド合成の他の態様を含む。次いで、ペプチドは本明細書において提供されるとおりポリペプチドへと会合することができる。

ＩＶ．バリアントＣＤ８０ポリペプチド及び免疫調節タンパク質の免疫調節活性を評価する方法
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド（その完全長及び／または特異的結合断片またはコンジュゲート、スタック構築物または誘導体または操作された細胞）は、Ｔ細胞活性化を調節する免疫調節活性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０ポリペプチドは、Ｔ細胞アッセイにおいて、野生型または非改変ＣＤ８０対照と比べてＩＦＮ−γ発現を調節する。場合によっては、ＩＦＮ−γ発現の調節は、対照と比べて、ＩＦＮ−γ発現を増加または減少させることができる。特異的結合及びＩＦＮ−γ発現を決定するアッセイは、当技術分野において周知であり、培養上清中のインターフェロン−γサイトカインレベルを測定するＭＬＲ（混合リンパ球反応）アッセイ（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ．２０１４Ｓｅｐ：２（９）：８４６−５６）、ＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＢ））Ｔ細胞刺激アッセイ（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ．２０１４Ｓｅｐ：２（９）：８４６−５６）、及び抗ＣＤ３Ｔ細胞刺激アッセイ（ＬｉａｎｄＫｕｒｌａｎｄｅｒ，ＪＴｒａｎｓｌＭｅｄ．２０１０：８：１０４）を含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、初代Ｔ細胞アッセイにおいて、野生型ＣＤ８０対照と比べてＩＦＮ−γ（インターフェロン−γ）発現を、いくつかの実施形態において増加させることができ、またはその他の実施形態において減少させることができる。いくつかの実施形態では、そのような活性は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドが拮抗活性の形態で提供されるか、または作動活性の形態で提供されるかに依存し得る。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、活性化刺激、例えばＣＤ３及び／またはＣＤ２８共刺激シグナルまたは分裂促進シグナルに対する応答を低下させるために起こり得る細胞内の阻害性シグナルを遮断するなど、阻害性受容体の拮抗物質である。当業者は、ＩＦＮ−γ発現の増減を決定するために使用される初代Ｔ細胞アッセイの異なるフォーマットを認識するだろう。

初代Ｔ細胞アッセイにおいてＩＦＮ−γ発現を増減させるバリアントＣＤ８０の能力をアッセイする際に、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用することができる。いくつかの実施形態では、拮抗物質形態、例えば可溶性形態で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質、例えばバリアントＣＤ８０−Ｆｃまたは分泌可能な免疫調節タンパク質は、ＣＴＬＡ−４阻害性受容体またはＰＤ−Ｌ１の活性を遮断し、これによりアッセイにおいてＩＦＮ−γの産生の増加によって観察されるようにアッセイにおいてＭＬＲ活性アッセイを増加させる。いくつかの実施形態では、作動物質形態で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質、例えば腫瘍局在化部分または提供される膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する操作された細胞を含有する局在化ｖＩｇＤスタックまたはコンジュゲートは、ＣＴＬＡ−４阻害性受容体の活性を刺激し得、これによりＩＦＮ−γ産生の減少によって明らかであるようにＭＬＲ活性を減少させる。いくつかの実施形態では、作動物質形態で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質、例えば腫瘍局在化部分または提供される膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する操作された細胞を含有する局在化ｖＩｇＤスタックまたはコンジュゲートは、ＣＴＬＡ−４阻害性受容体の活性を遮断し得、これによりＩＦＮ−γ産生の増加など、ＭＬＲ活性を増加させる。

あるいは、初代Ｔ細胞アッセイにおいてＩＦＮ−γ発現の増減を調節するバリアントＣＤ８０の能力をアッセイする際に、共固定アッセイを使用することができる。共固定アッセイでは、ＴＣＲシグナル（いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体によって提供される）を共固定されたバリアントＣＤ８０と併用して、ＣＤ８０の非改変または野生型対照と比べたＩＦＮ−γ発現を増減させる能力を決定する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質、例えば、共固定されたバリアントＣＤ８０（例えば、ＣＤ８０−Ｆｃ）は、共固定アッセイにおいてＩＦＮ−γの産生を増加させる。

いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−γ発現の増減を調節するバリアントＣＤ８０の能力をアッセイする際に、Ｔ細胞レポーターアッセイを使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＪｕｒｋａｔＴ細胞株であるか、またはＪｕｒｋａｔＴ細胞株に由来する。レポーターアッセイでは、レポーター細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞）も生成され、バリアントＩｇＳＦドメインポリペプチドのコグネイト結合パートナーである阻害性受容体を過剰発現する。例えば、バリアントＣＤ８０の場合、レポーター細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞）が生成され、ＣＴＬＡ−４を過剰発現する。いくつかの実施形態では、レポーターＴ細胞はまた、レポーターに作動可能に連結されたＴ細胞活性化に応答する誘導性プロモーターをレポーター構築物も含有する。いくつかの実施形態では、レポーターは、蛍光または発光レポーターである。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＤ３シグナル伝達に応答する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、共刺激シグナル伝達、例えばＣＤ２８共刺激シグナル伝達に応答する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＩＬ−２プロモーターである。

レポーターアッセイの態様では、レポーター細胞株は、阻害性受容体の野生型リガンド、例えばＣＤ８０を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）との共インキュベーションなどにより刺激される。いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、人工ＡＰＣである。人工ＡＰＣは、当業者に周知である。いくつかの実施形態では、人工ＡＰＣは、１つまたは複数の哺乳動物細胞株、例えばＫ５６２、ＣＨＯ、２９３細胞に由来する。いくつかの実施形態では、人工ＡＰＣは、抗ＣＤ３抗体を発現するように操作されており、場合によっては、共刺激リガンドである。いくつかの実施形態では、人工ＡＰＣは、バリアントＩｇＳＦドメインポリペプチドのコグネイト結合パートナーを過剰発現するために生成される。例えば、バリアントＣＤ８０の場合、レポーター細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞）は、阻害性リガンドＰＤ−Ｌ１を過剰発現するために生成される。

いくつかの実施形態では、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞は、バリアントＩｇＳＦドメイン分子または免疫調節タンパク質、例えばバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質の存在下で阻害性リガンドを過剰発現する人工ＡＰＣと共インキュベートされる。いくつかの実施形態では、レポーターの発現は、細胞の発光または蛍光を測定するなどして監視される。いくつかの実施形態では、阻害性受容体とリガンド間の正常な相互作用により、対照（例えば、阻害性受容体及びリガンドの相互作用が存在しない対照Ｔ細胞とＡＰＣ（例えば、ＣＤ８０を過剰発現しないＡＰＣ）の共インキュベーションによるレポーター発現など）と比較してレポーターシグナルの阻害または減少がもたらされる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、例えばバリアントＣＤ８０−Ｆｃとして可溶性形態で提供される場合、または分泌可能な免疫調節タンパク質としてＡＰＣから発現される場合、相互作用に拮抗し、これにより、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質が存在しない場合と比較して、レポーターシグナルが増加する。本明細書で提供される、ある特定の実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、例えばバリアントＣＤ８０−Ｆｃとして可溶性形態で提供される場合、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激などのＣＤ２８作動作用を媒介し、これにより、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質が存在しない場合と比較して、レポーターシグナルが増加する。場合によっては、本明細書で提供されるようなバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質の特定のフォーマットは、阻害性受容体の作動活性をもたらし得、これにより、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質が存在しない場合と比較して、レポーター発現が減少する。

適切な対照の使用は当業者に公知であるが、前述の実施形態では、対照は、典型的には、非改変ＣＤ８０、例えばバリアントＣＤ８０が由来したまたは発生したのと同じ哺乳動物種由来の野生型の天然ＣＤ８０アイソフォームの使用を伴う。いくつかの実施形態では、野生型または天然ＣＤ８０は、バリアントと同じ形態または対応する形態のものである。例えば、バリアントＣＤ８０がＦｃタンパク質に融合したバリアントＥＣＤを含有する可溶性形態である場合、対照はＦｃタンパク質に融合したＣＤ８０の野生型または天然ＥＣＤを含有する可溶性形態である。１つまたは複数のＣＴＬＡ−４及びＣＤ８０のいずれかに対する結合親和性及び／または選択性が増加または減少するかどうかに関係なく、バリアントＣＤ８０は、Ｔ細胞アッセイにおいて、野生型ＣＤ８０対照と比べてＩＦＮ−γ発現を、いくつかの実施形態において増加させ、そしてその他の実施形態において減少させる。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質は、野生型または非改変ＣＤ８０対照と比べて、ＩＦＮ−γ発現（すなわち、タンパク質発現）を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはより多く増加させる。他の実施形態では、バリアントＣＤ８０または免疫調節タンパク質は、野生型または非改変ＣＤ８０対照と比べて、ＩＦＮ−γ発現（すなわち、タンパク質発現）を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはより多く減少させる。いくつかの実施形態では、野生型ＣＤ８０対照は、野生型ネズミＣＤ８０配列の配列から配列が変化したバリアントＣＤ８０に典型的に使用されるような、ネズミＣＤ８０である。いくつかの実施形態では、野生型ＣＤ８０対照は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはＳＥＱＩＤＮＯ：７６またはＳＥＱＩＤＮＯ：１５０またはＳＥＱＩＤＮＯ：３０３０またはＳＥＱＩＤＮＯ：３０３１のアミノ酸配列を含むＣＤ８０配列などの対応する野生型ヒトＣＤ８０配列の配列から配列が変化したバリアントＣＤ８０に典型的に使用されるような、ヒトＣＤ８０である。

Ｖ．薬学的製剤
本明細書に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、免疫調節タンパク質、コンジュゲート、操作された細胞または感染性物質のいずれかを含有する組成物が本明細書において提供される。薬学的組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含むことができる。例えば、薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または浸透を、修正、維持、または保存するための１つまたは複数の賦形剤を含有することができる。いくつかの態様では、当業者は、細胞を含有する薬学的組成物がタンパク質を含有する薬学的組成物と異なってよいことを理解する。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、固体、例えば散剤、カプセル剤、または錠剤である。例えば、薬学的組成物の成分は、凍結乾燥することができる。いくつかの実施形態では、固体薬学的組成物は、投与の前に液体中で再構成されるかまたは溶解される。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、液体、例えば、水溶液（例えば、生理食塩水またはリンゲル液）に溶解されたバリアントＣＤ８０ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬学的組成物のｐＨは、約４．０〜約８．５（例えば、約４．０〜約５．０、約４．５〜約５．５、約５．０〜約６．０、約５．５〜約６．５、約６．０〜約７．０、約６．５〜約７．５、約７．０〜約８．０、または約７．５〜約８．５）である。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤、例えば充填剤、結合剤、コーティング剤、保存剤、滑沢剤、着香料、甘味剤、着色剤、溶媒、緩衝剤、キレート剤、または安定剤を含む。薬学的に許容し得る充填剤の例は、セルロース、第二リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、微結晶セルロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、マルトール、アルファ化デンプン、トウモロコシデンプン、またはジャガイモデンプンを含む。薬学的に許容し得る結合剤の例は、ポリビニルピロリドン、デンプン、ラクトース、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ゼラチン、スクロース、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、またはセルロースを含む。薬学的に許容し得るコーティング剤の例は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、シェラック、トウモロコシタンパク質ゼイン、またはゼラチンを含む。薬学的に許容し得る崩壊剤の例は、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、またはデンプングリコール酸ナトリウムを含む。薬学的に許容し得る滑沢剤の例は、ポリエチレングリコール、ステアリン酸マグネシウム、またはステアリン酸を含む。薬学的に許容し得る保存剤の例は、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、またはソルビン酸を含む。薬学的に許容し得る甘味剤の例は、スクロース、サッカリン、アスパルテーム、またはソルビトールを含む。薬学的に許容し得る緩衝剤の例は、炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、または酒石酸塩を含む。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、産物の制御放出または徐放性のための物質、例えば注射用マイクロスフェア、生体内分解性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームをさらに含む。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、滅菌されている。滅菌は、滅菌濾過膜に通す濾過、または照射によって達成してよい。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前に実行してもその後に実行してもよい。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態で貯蔵しても溶液で貯蔵してもよい。加えて、非経口組成物は、一般的に滅菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静注液バッグまたはバイアルへと入れられる。

いくつかの実施形態では、膜貫通型免疫調節タンパク質であって、そのような膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する操作された細胞を含む、膜貫通型免疫調節タンパク質を含有する薬学的組成物が提供される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物及び製剤は、１つまたは複数の任意の薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む。そのような組成物は、緩衝剤、例えば中性の緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など；糖質、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；酸化防止剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン；補助剤（例えば、水酸化アルミニウム）；及び保存剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。

そのような製剤は、例えば、静脈内注射に好適な形態であり得る。薬学的に許容し得る担体は、１つの組織、臓器、または身体の一部から別の組織、臓器、または身体の一部への関心対象の細胞の運搬または輸送に関与する、薬学的に許容し得る材料、組成物、またはビヒクルであり得る。例えば、担体は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくは封入材料、またはいくつかのそれらの組み合わせであり得る。担体の各成分は、製剤のその他の有効成分と適合可能でなければならないという点で「薬学的に許容し得る」でなければならない。それはまた、その治療効果を過度に上回る毒性、刺激、アレルギー応答、免疫原性、または任意の他の合併症のリスクを有するべきではないという意味で、直面し得るあらゆる組織、臓器、または身体の一部との接触に好適でなければならない。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対象に投与される。一般的に、薬学的組成物の投与量及び投与経路は、対象のサイズ及び状態に応じて、標準的な薬務に従って決定される。例えば、最初に、細胞培養アッセイまたはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、もしくはサルのような動物モデルのいずれかで治療的有効用量を推定することができる。適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために動物モデルを使用してもよい。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定することができる。正確な投与量は、対象が必要とする治療に関連する要因に照らして決定される。投与量及び投与は、活性化合物の十分なレベルを提供するように、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る要因は、疾患状態の重症度、対象の通常の健康状態、対象の年齢、体重、及び性別、投与の時間及び頻度、薬物併用、反応感受性、ならびに治療への応答を含む。

長時間作用性薬学的組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度に応じて、３〜４日毎、毎週、または隔週で投与してもよい。投薬頻度は、使用される製剤中の分子の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、組成物は、所望の効果を達成する投与量に達するまで投与される。したがって、該組成物を単回用量としてまたは複数回用量として（同じまたは異なる濃度／投与量で）経時的に、または持続注入として投与してよい。適切な投与量のさらなる改良が日常的になされる。適切な投与量は、適切な用量―応答データを使用することによって確認され得る。Ｔ細胞活性化もしくは増殖、サイトカイン合成もしくは産生（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２の産生）、様々な活性化マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＩＬ−２受容体）の誘導、炎症、関節の腫脹もしくは圧痛、Ｃ−反応性タンパク質の血清レベル、抗コラーゲン抗体産生、及び／またはＴ細胞依存性抗体応答を含む、治療効果についての多数のバイオマーカーまたは生理学的マーカーをモニタリングすることができる。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、経口、経皮、吸入による、静脈内、動脈内、筋肉内、創傷部位への直接適用、手術部位への適用、腹腔内、坐剤による、皮下、皮内、経皮、噴霧による、胸膜内、脳室内、関節内、眼内、または髄腔内を含む、任意の経路を通して対象に投与される。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物の投与は、単回投与または反復投与である。いくつかの実施形態では、１日１回、１日２回、１日３回、または１日４回以上、対象に投与される。いくつかの実施形態では、１週間に約１用量以上（例えば、約２用量以上、約３用量以上、約４用量以上、約５用量以上、約６用量以上、または約７用量以上）が与えられる。いくつかの実施形態では、複数回用量が、数日、数週間、数ヶ月間、または数年間にわたって与えられる。いくつかの実施形態では、一連の処置は、約１用量以上（例えば、約２用量以上、約３用量以上、約４用量以上、約５用量以上、約７用量以上、約１０用量以上、約１５用量以上、約２５用量以上、約４０用量以上、約５０用量以上、または約１００用量以上）である。

いくつかの実施形態では、投与される薬学的組成物の用量は、対象の体重１ｋｇ当たりタンパク質約１μｇ以上（例えば、対象の体重１ｋｇ当たりタンパク質約２μｇ以上、対象の体重１ｋｇ当たりタンパク質約５μｇ以上、対象の体重１ｋｇ当たりタンパク質約１０μｇ以上、対象の体重１ｋｇ当たりタンパク質約２５μｇ以上、対象の体重１ｋｇ当たりタンパク質約５０μｇ以上、対象の体重１ｋｇ当たりタンパク質約１００μｇ以上、対象の体重１ｋｇ当たりタンパク質約２５０μｇ以上、対象の体重１ｋｇ当たりタンパク質約５００μｇ以上、対象の体重１ｋｇ当たりタンパク質約１ｍｇ以上、対象の体重１ｋｇ当たりタンパク質約２ｍｇ以上、または対象の体重１ｋｇ当たりタンパク質約５ｍｇ以上）である。

いくつかの実施形態では、細胞組成物の治療量が投与される。典型的には、投与されるべき本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の範囲、及び状態の個々の違いを考慮して医師が決定することができる。一般的に、本明細書に記載される操作された細胞、例えばＴ細胞を含む薬学的組成物を、１０^４〜１０^９個の細胞／ｋｇ体重、例えば１０^５〜１０^６個の細胞／ｋｇ体重の投与量（これらの範囲内の全ての整数値を含む）で投与してよいと記載することができる。操作された細胞組成物、例えばＴ細胞組成物をこれらの投与量で複数回投与してもよい。該細胞を、免疫療法において通常知られている注入技術を使用することによって投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ，ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ．ｏｆＭｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照のこと）。特定の患者に対する最適な投与量及び処置レジメンは、医薬分野の当業者が、患者の疾患の兆候をモニタリングし、それに応じて処置を調整することによって、容易に決定することができる。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、免疫調節バリアントポリペプチドをコードする核酸配列を含有する感染性物質を含有する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、処置に好適である対象への投与に好適な感染性物質の用量を含有する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ウイルスである感染性物質を、１×１０^５〜１×１０^１２もしくは約１×１０^５〜約１×１０^１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）、１×１０^６〜１×１０^１０ｐｆｕもしくは約１×１０^６〜約１×１０^１０ｐｆｕ、または１×１０^７〜１×１０^１０ｐｆｕもしくは約１×１０^７〜約１×１０^１０ｐｆｕ各々包含する、例えば、少なくとも、または少なくとも約、または約１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９ｐｆｕまたは約１×１０^１０ｐｆｕの単一または複数の投与量で含有する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１０^５〜１０^１０もしくは約１０^５〜約１０^１０ｐｆｕ／ｍＬ、例えば、５×１０^６〜５×１０^９もしくは約５×１０^６〜約５×１０^９、または１×１０^７〜１×１０^９もしくは約１×１０^７〜約１×１０^９ｐｆｕ／ｍＬ、例えば、少なくとも、または少なくとも約、または約、１０^６ｐｆｕ／ｍＬ、１０^７ｐｆｕ／ｍＬ、１０^８ｐｆｕ／ｍＬまたは１０^９ｐｆｕ／ｍＬのウイルス濃度を含有することができる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、細菌である感染性物質を、１×１０^３〜１×１０^９もしくは約１×１０^３〜約１×１０^９コロニー形成単位（ｃｆｕ）、１×１０^４〜１×１０^９ｃｆｕもしくは約１×１０^４〜約１×１０^９ｃｆｕ、または１×１０^５〜１×１０^７ｃｆｕもしくは約１×１０^５〜約１×１０^７ｃｆｕを各々包含する、例えば、少なくとも、または少なくとも約、または約、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８または１×１０^９ｃｆｕの単一または複数の投与量で含有する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１０^３〜１０^８もしくは約１０^３〜約１０^８ｃｆｕ／ｍＬ、例えば、５×１０^５〜５×１０^７もしくは約５×１０^５〜約５×１０^７、または１×１０^６〜１×１０^７もしくは約１×１０^６〜約１×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ、例えば、少なくとも、または少なくとも約、または約、１０^５ｃｆｕ／ｍＬ、１０^６ｃｆｕ／ｍＬ、１０^７ｃｆｕ／ｍＬまたは１０^８ｃｆｕ／ｍＬの細菌濃度を含有することができる。

望ましくない免疫応答を媒介するもしくは媒介することができる免疫細胞を排除、隔離、もしくは不活性化すること；防御免疫応答を媒介するもしくは媒介することができる免疫細胞を誘導、生成、もしくは刺激すること；免疫細胞の物理的もしくは機能的特性を変化させること；またはこれらの効果の組み合わせによって、本発明の治療用組成物の投与が免疫活性を十分に調節するかどうかを決定するための多種多様な手段が公知である。免疫活性の調節の測定例は、限定されないが、免疫細胞集団の有無の検査（フローサイトメトリー、免疫組織化学、組織診、電子顕微鏡法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する）；シグナルに応答して増殖もしくは分化する能力または増殖もしくは分化への抵抗性を含む、免疫細胞の機能的能力の測定（例えば、Ｔ細胞増殖アッセイ、及び抗ＣＤ３抗体、抗Ｔ細胞受容体抗体、抗ＣＤ２８抗体、カルシウムイオノフォア、ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート）、ペプチドまたはタンパク質抗原を負荷した抗原提示細胞で刺激後の３Ｈ−チミジン取り込みに基づいたｐｅｐｓｃａｎ分析；Ｂ細胞増殖アッセイを使用する）；他の細胞を殺傷または溶解する能力の測定（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ）；サイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、抗体及び細胞の他の産物の測定（例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ、ウェスタンブロット分析、タンパク質マイクロアレイ分析、免疫沈降分析による）；免疫細胞または免疫細胞内のシグナル伝達経路の活性化の生化学マーカーの測定（例えば、チロシン、セリンまたはスレオニンのリン酸化、ポリペプチド切断、及びタンパク質複合体の形成または解離のウェスタンブロット及び免疫沈降分析；タンパク質アレイ分析；ＤＮＡアレイまたはサブトラクティブハイブリダイザーションを使用するＤＮＡ転写プロファイリング）；アポトーシス、壊死または他の機序による細胞死の測定（例えば、アネキシンＶ染色、ＴＵＮＥＬアッセイ、ＤＮＡラダリングを測定するゲル電気泳動、組織診；蛍光発生カスパーゼアッセイ、カスパーゼ基質のウェスタンブロット分析）；免疫細胞によって産生される遺伝子、タンパク質、及び他の分子の測定（例えば、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、２次元ゲル電気泳動、ウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着アッセイ、フローサイトメトリー）；ならびに自己タンパク質または自己ポリペプチドが関与する自己免疫疾患、神経変性性疾患、及び他の疾患の臨床症状または転帰（例えば改善）の、例えば多発性硬化症の場合には再発率または疾患重症度を測定することによる（当業者に公知の臨床スコアを使用する）、Ｉ型糖尿病の場合には血糖を、または関節リウマチの場合には関節の炎症を測定することによる測定（臨床スコア、追加の治療法を使用する要件、機能的状態、画像研究）を含む。

ＶＩ．製造品及びキット
また、本明細書に記載の薬学的組成物を好適な包装に含む製造物品が本明細書において提供される。本明細書に記載の組成物（例えば、眼科用組成物）用の好適な包装は、当技術分野において公知であり、例えば、バイアル（例えば、密封バイアル）、容器（ｖｅｓｓｅｌｓ）、アンプル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装（例えば、密封マイラーまたはプラスチック袋）などを含む。これらの製造物品は、さらに滅菌及び／または密封されてよい。

さらに、本明細書に記載の薬学的組成物（または製造物品）を含むキットが提供され、該キットは、本明細書に記載の用途のような組成物の使用方法に関する説明書（複数可）をさらに含んでよい。本明細書に記載のキットはまた、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び本明細書に記載の任意の方法を実施するための説明書を含む添付文書を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を含んでもよい。

ＶＩＩ．治療用途
本明細書に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド免疫調節タンパク質、操作された細胞または感染性物質を含有する提供される薬学的組成物を使用して、ヒト患者などの対象の疾患または状態の治療に関連することを含む免疫応答を調節する方法が本明細書において提供される。本明細書に記載の薬学的組成物（本明細書に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、免疫調節タンパク質、コンジュゲート、及び操作された細胞を含む薬学的組成物を含む）を、多種多様な治療用途、例えば疾患の治療に使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、薬学的組成物を使用して、哺乳動物において炎症性または自己免疫性障害、がん、臓器移植、ウイルス感染、及び／または細菌感染が治療される。薬学的組成物は、免疫応答を調節（例えば増加または減少）して、疾患を治療することができる。いくつかの実施形態では、この方法は、対象の免疫応答を増加させるフォーマットのバリアントＣＤ８０ポリペプチドを用いて実施される。いくつかのそのような態様では、免疫応答を増加させることにより、腫瘍またはがんなどの対象の疾患または状態を治療する。いくつかの実施形態では、この方法は、対象の免疫応答を減少させるフォーマットのバリアントＣＤ８０ポリペプチドを用いて実施される。いくつかのそのような態様では、免疫応答を低下することにより、炎症性疾患または状態、例えば自己免疫疾患などの対象の疾患または状態を治療する。

いくつかの実施形態では、提供される方法は、本明細書に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、免疫調節タンパク質、コンジュゲート、操作された細胞、及び感染性物質の治療的投与に適用可能である。提供される開示を考慮して、免疫応答の調節のタイプ（例えば所望により増加または減少）に応じて適応症に対してフォーマットを選択することは、当業者のレベル内である。

いくつかの実施形態では、例えば、がん、ウイルス感染または細菌感染の治療において有用であることができる、免疫応答を刺激するまたは増加させる本明細書において提供される薬学的組成物が投与される。提供される方法の中には、ＣＴＬＡ−４及び／またはＰＤ−Ｌ１への親和性が増加した可溶性フォーマットなどのバリアントＣＤ８０ポリペプチドの送達を伴う方法があり、これは、活性化刺激、例えばＣＤ３及び／またはＣＤ２８共刺激シグナルまたは分裂促進シグナルに対する応答を減少させるために起こり得る細胞内の阻害性シグナルを遮断するなど、阻害性受容体のシグナル伝達に拮抗し得る。場合によっては、この結果、免疫応答が増加する可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１の拮抗作用は、腫瘍学、例えば腫瘍またはがんの処置における免疫の促進において有用であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１に共結合するＣＤ８０に依存またはこれにより増強されるＣＤ２８の作動作用は、腫瘍学、例えば腫瘍またはがんの治療における免疫の促進において有用であり得る。

野生型ＣＤ８０ポリペプチドと比較して増加した親和性でＣＴＬＡ−４に結合するなど、ＣＴＬＡ−４に結合するバリアントＣＤ８０ポリペプチドの送達により免疫応答を増加させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを、そのコグネイト結合パートナーＣＴＬＡ−４の拮抗活性を示す及び／またはＣＴＬＡ−４を介したシグナル伝達を阻害するフォーマットで含有する。そのような治療用途に関連して使用するためのＣＤ８０ポリペプチドの例示的なフォーマットは、例えば、可溶性のバリアントＣＤ８０ポリペプチド（例えば、バリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合タンパク質）、免疫調節タンパク質、またはバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び別のＩｇＳＦドメイン（Ｆｃ融合物であるその可溶性形態を含む）の「スタック」、分泌可能な免疫調節タンパク質を発現する操作された細胞、または感染細胞（例えば、腫瘍細胞またはＡＰＣ、例えば樹状細胞）における分泌可能な免疫調節タンパク質の発現及び分泌などのための分泌可能な免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を含む感染性物質を含む。そのような方法の中には、可溶性フォーマットのバリアントＣＤ８０ポリペプチドの送達によって実施される方法があり、これは、ＣＴＬＡ−４阻害性受容体を結合し、ＡＰＣに発現するＣＤ８０またはＣＤ８６との相互作用を遮断することにより、ＣＴＬＡ−４阻害性受容体のシグナル伝達に拮抗することができ、それにより、ＣＤ８０／ＣＤ８６結合ＣＴＬＡ−４受容体の負の調節シグナル伝達を防ぐ。場合によっては、この結果、免疫応答が増加する可能性があり、いくつかの態様では、これにより、腫瘍またはがんなどの対象の疾患または状態を治療することができる。例示的な可溶性フォーマットには、記載される任意のものが含まれる。そのような治療用物質に含まれるものは、親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）を含有するＣＤ８０バリアントポリペプチドの細胞外部分が、直接的または間接的に多量体化ドメイン、例えばＦｃドメインまたは領域に連結されるフォーマットである。いくつかの実施形態では、そのような治療用物質は、バリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合タンパク質である。

非改変または野生型ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、増加した親和性でＰＤ−Ｌ１に結合するなど、ＰＤ−Ｌ１に結合するバリアントＣＤ８０ポリペプチドの送達により免疫応答を増加させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ８０ポリペプチド、例えば、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドの可溶性形態は、腫瘍細胞またはＡＰＣ上のＰＤ−Ｌ１に結合することができ、これにより、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１阻害性受容体の相互作用を遮断し、さもなければＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用から得られたであろう負の調節シグナル伝達を防ぐ。場合によっては、この結果、免疫応答が増加する可能性があり、いくつかの態様では、これにより、腫瘍またはがんなどの対象の疾患または状態を治療することができる。例示的な可溶性フォーマットには、記載される任意のものが含まれる。そのような治療用物質に含まれるものは、親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）を含有するＣＤ８０バリアントポリペプチドの細胞外部分が、直接的または間接的に多量体化ドメイン、例えばＦｃドメインまたは領域に連結されるフォーマットである。いくつかの実施形態では、そのような治療用物質は、バリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合タンパク質である。

また、提供される実施形態の中には、非改変または野生型ＣＤ８０ポリペプチドと比較して、ＰＤ−Ｌ１への増加した結合を示すバリアントＣＤ８０ポリペプチドを使用するＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激によるＣＤ２８の作動作用を媒介する方法がある。いくつかの態様では、そのような方法は、分子を投与された対象の免疫応答を増加させるために使用でき、いくつかの態様では、これにより、腫瘍またはがんなどの対象の疾患または状態を治療することができる。そのような方法の中には、可溶性フォーマットのバリアントＣＤ８０ポリペプチドの送達によって実施される方法がある。例示的な可溶性フォーマットは本明細書に記載されており、親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）を含有するＣＤ８０バリアントポリペプチドの細胞外部分が、直接的または間接的に多量体化ドメイン、例えばＦｃドメインまたは領域に連結されるフォーマットを含む。いくつかの実施形態では、そのような治療用物質は、バリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合タンパク質である。このようなＰＤ−Ｌ１依存性共刺激は、エフェクター機能を備えたＦｃを必要とせず、エフェクターなし、または不活性なＦｃ分子を含有するＦｃ融合タンパク質によって媒介され得る。場合によっては、そのようなバリアントＣＤ８０ポリペプチド、例えば可溶性形態は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断しつつ、局在化Ｔ細胞上のＣＤ２８受容体を結合及び共刺激することにより、提供される治療法に関連して免疫応答の促進を促すこともできる。

いくつかの実施形態では、エフェクター機能を保持または示すＦｃに直接的または間接的に連結されたバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＤ２８作動作用を媒介するために対象に投与される。ＣＤ２８へ結合する本明細書で提供するバリアントＣＤ８０ポリペプチドを使用して、受容体依存性ＣＤ２８共刺激によりＣＤ２８の作動作用を媒介する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８のそのような作動作用は、腫瘍学、例えば腫瘍またはがんの治療における免疫の促進において有用であり得る。場合によっては、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ１とも結合し、例えばＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ１への結合の増加を示す。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体の架橋により抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介性エフェクター機能が開始され得、これにより、ＣＴＬＡ−４発現細胞（例えばＣＴＬＡ−４発現Ｔ制御性細胞）またはＰＤ−Ｌ１発現細胞（例えばＰＤ−Ｌ１^ｈｉ腫瘍）などのコグネイト結合パートナーを発現する標的細胞の枯渇をもたらす。免疫応答を調節するために提供される方法は、腫瘍またはがんなどの疾患または状態を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、哺乳動物がん細胞（ヒトがん細胞など）の成長を阻害するために使用することができる。がんの治療方法は、有効量の本明細書に記載の薬学的組成物のいずれかをがんを有する対象に投与することを含むことができる。有効量の薬学的組成物を投与して、がんの進行を阻害、停止、または回複することができる。ヒトがん細胞は、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで治療できる。ヒト患者のｅｘｖｉｖｏ治療では、がん細胞を含む組織または体液が体外で処理され、その後、当該組織または体液が患者に再導入される。いくつかの実施形態では、がんは、患者に治療用組成物を投与することにより、ｉｎｖｉｖｏでヒト患者において治療される。したがって、本発明は、対照による処置と比較して、腫瘍の進行を阻害、停止、または回復させるか、そうでなければ無増悪生存期間（すなわち、患者が悪化しないがんを患いながら生存している治療中及び治療後の期間）または全生存期間（「生存率」とも呼ばれる；すなわち、がんと診断後またはこれを治療後、一定期間生存する試験群または処置群の人々の割合））の統計的に優位な延長をもたらすｅｘｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｖｏの方法を提供する。

本明細書に記載の薬学的組成物及び治療法によって治療できるがんは、限定されないが、黒色腫、膀胱癌、血液学的悪性腫瘍（白血病、リンパ腫、骨髄腫）、肝臓癌、脳癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌（腺癌）、大腸癌、肺癌（小細胞肺癌及び非小細胞肺癌）、脾臓癌、胸腺もしくは血液細胞の癌（すなわち、白血病）、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、筋骨格癌、頭頸部癌、消化管癌、生殖細胞癌、または内分泌及び神経内分泌癌を含む。いくつかの実施形態では、がんは、ユーイング肉腫である。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、肺癌、膀胱癌、及び血液学的悪性腫瘍から選択される。いくつかの実施形態では、がんは、リンパ腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、子宮頸癌、神経芽細胞腫、または多発性骨髄腫である。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単剤療法として（すなわち、単一の薬剤として）、または併用療法として（すなわち、１つまたは複数の追加の抗がん剤、例えば化学療法剤、がんワクチン、または免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて）投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物をまた、放射線療法と共に投与することもできる。本開示のいくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、トレメリムマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブなどである。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、免疫応答を抑制し、炎症性または自己免疫性障害の治療、または臓器移植に有用であることができる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを、そのコグネイト結合パートナーＣＴＬＡ−４の作動活性を示す及び／またはＣＴＬＡ−４を介した阻害性シグナル伝達を刺激するフォーマットで含有する。そのような治療用途に関連して使用するためのＣＤ８０ポリペプチドの例示的なフォーマットは、例えば、炎症環境の細胞または組織に局在する、免疫調節タンパク質、またはバリアントＣＤ８０ポリペプチド及びＩｇＳＦドメインもしくはそのバリアントの「スタック」、炎症環境の細胞または組織に局在する部分に連結されたバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有するコンジュゲート、膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する操作された細胞、または感染細胞における膜貫通型免疫調節タンパク質の発現などのための膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を含む感染性物質を含む。

いくつかの実施形態では、炎症性または自己免疫性障害は、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、血管炎、自己免疫性皮膚疾患、移植、リウマチ性疾患、炎症性消化管疾患、炎症性眼疾患、炎症性神経疾患、炎症性肺疾患、炎症性内分泌疾患、または自己免疫性血液疾患である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物によって治療できる炎症性及び自己免疫性障害は、アジソン病、アレルギー、円形脱毛症、アルツハイマー病、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ヒューズ症候群）、喘息、アテローム性動脈硬化、関節リウマチ、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、無精子症、ベーチェット病、ベルジェ病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心血管疾患、セリアックスプルー／シリアック病、慢性疲労免疫不全症侯群（ＣＦＩＤＳ）、慢性特発性多発神経炎、慢性炎症性脱髄性多発根ニューロパチー（ｃｈｒｏｎｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ，ｐｏｌｙｒａｄｉｃａｌｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）（ＣＩＰＤ）、慢性再発性多発ニューロパチー（ギラン・バレー症候群）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、皮膚炎、疱疹状（ｈｅｒｐｅｔｉｆｏｒｍｕｓ）、皮膚筋炎、糖尿病、円板状ループス、湿疹、後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンス症候群、眼球突出、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫増殖性疾患もしくは障害、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、間質性肺疾患、若年性関節炎、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、川崎病、ランバート・イートン筋無力症症候群、扁平苔癬、ループス腎炎、リンパ球性下垂体炎、メニエール病、ミラー・フィッシャー症候群／急性散在性脳脊髄神経根障害（ａｃｕｔｅｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｏｒａｄｉｃｕｌｏｐａｔｈｙ）、混合性結合組織病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋肉リウマチ、筋痛性脳脊髄炎（ＭＥ）、重症筋無力症、眼炎症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）（ウィテカー症候群（Ｗｈｉｔａｋｅｒ’ｓｓｙｎｄｒｏｍｅ））、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変／自己免疫性胆管症、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群／反応性関節炎、再狭窄、リウマチ熱、リウマチ性疾患、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性強皮症、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、甲状腺炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、間質性腸疾患またはウェゲナー肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、炎症性または自己免疫性障害は、間質性腸疾患、移植、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、及び乾癬から選択される。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、自己免疫状態を調節するために投与される。例えば、免疫応答を抑制することは、レシピエントによるドナーからの、組織、細胞、または臓器移植の拒絶反応を阻害するための方法において有益であることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、移植片関連または移植関連疾患または障害、例えば移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を制限または予防するために使用される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、移植されたまたは生着された（ｇｒａｆｔｅｄ）骨髄、臓器、皮膚、筋肉、ニューロン、膵島、または実質細胞の自己免疫拒絶反応を抑制するために使用される。

本明細書に記載の、操作された細胞を含む薬学的組成物及び方法を、養子細胞移入用途において使用することができる。いくつかの実施形態では、操作された細胞を含む細胞組成物を、関連する方法において使用して、例えば免疫活性を、例えば哺乳動物がんの治療、または他の実施形態では自己免疫性障害の治療への免疫療法アプローチにおいて調節することができる。用いられる方法は、一般的に、本発明のＴＩＰと哺乳動物細胞とを、親和性改変ＩｇＳＦドメインの特異的結合及び哺乳動物細胞の免疫活性の調節に対して許容的な条件下で、接触させる方法を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｔ細胞（ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含む）、またはＡＰＣ）は、本明細書に記載される膜タンパク質として及び／または可溶性バリアントＣＤ８０ポリペプチド、免疫調節タンパク質、もしくはコンジュゲートとして発現するように操作される。次いで、操作された細胞を、免疫活性の調節が望まれるＡＰＣ、第２のリンパ球または腫瘍細胞のような哺乳動物細胞と、哺乳動物細胞において免疫活性が調節され得るような哺乳動物細胞上のカウンター構造体への親和性改変ＩｇＳＦドメインの特異的結合を許容する条件下で接触させることができる。細胞は、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで接触させることができる。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象に対して自家である。他の実施形態では、細胞は同種である。いくつかの実施形態では、細胞は、それが単離された哺乳動物に再注入される自家操作された細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物に注入される同種操作された細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、患者の血液または腫瘍から採取し、ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド、免疫調節タンパク質、またはコンジュゲート）を発現するように操作し、ｉｎｖｉｔｒｏ培養系で増殖させ（例えば、細胞を刺激することによって）、そして患者に再注入して腫瘍破壊を媒介する。いくつかの実施形態では、該方法は、ＴＩＰを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）を患者に注入して戻す養子細胞移入によって実施される。いくつかの実施形態では、本発明の治療用組成物及び方法は、リンパ腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、子宮頸癌、神経芽細胞腫、または多発性骨髄腫のようながんの哺乳動物患者の処置において使用される。

治療対象
いくつかの実施形態では、提供される方法は、治療用途が対象とする疾患または状態を有する、または有すると疑われる対象を治療するためのものである。場合によっては、治療対象は、提供される実施形態のいずれかに従って、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド、免疫調節タンパク質、コンジュゲート、操作された細胞、または感染性物質のいずれかによる治療を含む治療適合性の判断または治療対象の識別または選択などのため１つまたは複数の特徴またはパラメータに基づいて治療前に選択することができる。

いくつかの態様では、記載されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する薬学的組成物の投与時またはその直前に、対象がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２の拮抗物質による治療後の寛解後に再発したか、治療に抵抗性になったか、または治療に反応しない場合、治療のために対象が選択される。いくつかの実施形態では、拮抗物質は、治療方法において使用される提供されたバリアントＣＤ８０ポリペプチドとＰＤ−Ｌ１への結合について競合しないものである。いくつかの実施形態では、拮抗物質は抗ＰＤ−１抗体である。例示的な抗ＰＤ−１抗体は公知であり、これらに限定されないが、ニボルマブまたはペンブロリズマブ、またはその抗原結合断片を含む。

いくつかの実施形態では、提供される方法には、既知であるか、疑われるか、または提供される実施形態による治療の候補となり得る疾患または状態を有する患者の様々な生体試料における結合アッセイを利用する診断方法、予後診断方法またはモニタリング方法が含まれる。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＴＬＡ−４を検出することができる試薬を用いて実施され、治療方法に利用されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドの１つまたは複数の結合パートナーを発現する腫瘍または腫瘍細胞浸潤物を有する対象を選択する。そのような試薬は、提供される分子または薬学的組成物による治療の恩恵を受ける可能性が最も高い対象を選択するための、及び／または治療の有効性を予測するためのコンパニオン診断として使用できる。

いくつかの実施形態では、疾患または状態を治療するための、及び／または腫瘍またはがんを治療するための免疫応答を増加させる方法に含まれる、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用に拮抗する作用に基づく、及び／またはＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激などのＣＤ２８作動作用に基づく提供された治療法による治療の対象の選択及び／または効果の予測のための方法が提供される。いくつかの実施形態では、試薬は、細胞の表面、例えば腫瘍環境に存在する腫瘍細胞または骨髄細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するＰＤ−Ｌ１結合試薬である。いくつかの実施形態では、試薬は、細胞の表面、例えばリンパ球、例えばＴ細胞などの浸潤免疫細胞の表面上のＣＤ２８に特異的に結合するＣＤ２８結合試薬である。いくつかの実施形態では、結合試薬は、抗体もしくは抗原結合断片、タンパク質リガンドもしくは結合パートナー、アプタマー、アフィマー、ペプチド、またはハプテンであり得る。いくつかの実施形態では、そのような試薬は、免疫調節タンパク質またはコンジュゲートを含む、非改変または野生型ＣＤ８０と比較してＰＤ−Ｌ１への増加した結合を示すＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）であるかまたはこれを含有するバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する本明細書で提供される治療用物質または薬学的組成物で治療する対象を選択または識別するためのコンパニオン診断として使用することができる。そのような治療用物質に含まれるものは、親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）を含有するＣＤ８０バリアントポリペプチドの細胞外部分が、直接的または間接的に多量体化ドメイン、例えばＦｃドメインまたは領域に連結されるフォーマットである。いくつかの実施形態では、そのような治療用物質は、バリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合タンパク質である。

いくつかの実施形態では、結合試薬は、ＰＤ−Ｌ１と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。細胞内または細胞外ＰＤ−Ｌ１を含むＰＤ−Ｌ１を検出するための様々なコンパニオン診断試薬が公知である、例えばＲｏａｃｈｅｔａｌ．（２０１６）Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．，Ｍｏｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．，２４：３９２−３９７；Ｃｏｇｓｗｅｌｌｅｔａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．２１：８５−９３；国際公開特許出願第ＷＯ２０１５／１８１３４３もしくはＷＯ２０１７／０８５３０７、または米国特許出願公開ＵＳ２０１６／０００９８０５もしくはＵＳ２０１７／０２８５０３７である。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の非限定的な例には、これらに限定されないが、マウス抗ＰＤ−Ｌ１クローン２２Ｃ３（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１クローン２８−８（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１クローンＳＰ２６３またはＳＰ１４２（ＳｐｒｉｎｇＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びウサギ抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンＥ１Ｌ３Ｎが挙げられる。このような結合試薬は、ＤａｋｏＰＤ−Ｌ１ＩＨＣ２２Ｃ３ｐｈａｒｍＤｘアッセイ、ＰＤ−Ｌ１ＩＨＣ２８−８ｐｈａｒｍＤｘアッセイ、ＶｅｎｔａｎａＰＤ−Ｌ１（ＳＰ２６３）アッセイ、またはＶｅｎｔａｎａＰＤ−Ｌ１（ＳＰ１４２）アッセイとして利用可能なものを含む組織化学法で使用することができる。

いくつかの実施形態では、結合試薬は、非改変または野生型ＣＤ８０ポリペプチドと比較してＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８、及び／またはＣＴＬＡ−４に対して変化した（例えば、増加した）結合親和性を示すものを含む、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドであるか、またはこれを含有する。したがって、本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれかを含有するコンパニオン診断として使用するための結合試薬もまた提供される。生体試料と本明細書で提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドのいずれかを含む結合試薬とを接触させることにより、生体試料中のＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ−４を検出する方法もまた提供される。いくつかの態様では、本明細書で提供される免疫調節タンパク質またはコンジュゲートを含むバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する結合試薬は、既知であるか、疑われるか、または提供される実施形態による治療の候補となり得る疾患または状態を有する患者の様々な生体試料における結合アッセイを利用する診断方法、予後診断方法またはモニタリング方法で、個別にまたは組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０結合試薬及びバリアントＣＤ８０結合試薬を使用する方法は、提供されるバリアントＣＤ８０ポリペプチド、免疫調節タンパク質、コンジュゲート、操作された細胞または感染性物質のいずれかによる治療対象を選択するために使用することができる。いくつかの実施形態では、結合試薬のバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、治療に使用されるバリアントＣＤ８０ポリペプチドと同じであるか、または同じ親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶドメイン）を含有する。他の実施形態では、結合試薬のバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、治療のためのバリアントｃＤ８０ポリペプチドとは異なるか、または異なる親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶドメイン）を含有する。

バリアントＣＤ８０ポリペプチドであるか、またはそれを含有する結合試薬は、セクションＩＩに記載されているものを含む、本明細書に記載されているアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換、欠失または挿入）のいずれか１つまたは複数を含有することができる。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０結合試薬は、任意の所望の結合活性に基づいて選択することができ、場合によっては、生体試料中の細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４のエクトドメインの１つ、２つ、または場合によってはそれぞれを特異的に結合または検出する能力に基づくことを含む。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドであるか、またはそれを含有する結合試薬は、Ｔｒｅｇ細胞の表面などの細胞の表面上のＣＴＬＡ−４のエクトドメインに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、本明細書で提供されるものなどの非改変または野生型ＣＤ８０と比較してＣＴＬＡ−４に対して増加した結合親和性を示す親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）であるか、またはそれを含有する。そのようなバリアントＣＤ８０ポリペプチドの例には、セクションＩＩ．Ａ．１に記載されるＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）にアミノ酸改変（複数可）を含有するものが含まれる。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドであるか、またはそれを含有する結合試薬は、腫瘍浸潤細胞の表面などの細胞の表面上のＣＤ２８のエクトドメインに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、本明細書で提供されるものなどの非改変または野生型ＣＤ８０と比較してＣＤ２８に対して増加した結合親和性を示す親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）であるか、またはそれを含有する。そのようなバリアントＣＤ８０ポリペプチドの例には、セクションＩＩ．Ａ．２に記載されるＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）にアミノ酸改変（複数可）を含有するものが含まれる。

いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドであるか、またはそれを含有する結合試薬は、腫瘍環境に存在する腫瘍細胞またはメロイド細胞（ｍｅｌｏｉｄｃｅｌｌ）の表面などの細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＤ８０ポリペプチドは、本明細書で提供されるものなどの非改変または野生型ＣＤ８０と比較してＰＤ−Ｌ１に対して増加した結合親和性を示す親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）であるか、またはそれを含有する。そのようなバリアントＣＤ８０ポリペプチドの例には、セクションＩＩ．Ａ．３に記載されるＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）にアミノ酸改変（複数可）を含有するものが含まれる。

バリアントＣＤ８０結合試薬は、結合アッセイ及び検出方法での使用に適した本明細書に記載されるいずれかのフォーマットを含む任意のフォーマットで提供することができる。いくつかの実施形態では、結合試薬は、免疫調節タンパク質またはコンジュゲートを含むＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）であるか、またはそれを含有するバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む。そのような治療用物質に含まれるものは、親和性改変ＩｇＳＦドメイン（例えばＩｇＶ）を含有するＣＤ８０バリアントポリペプチドの細胞外部分が、直接的または間接的に多量体化ドメイン、例えばＦｃドメインまたは領域に連結されるフォーマットである。いくつかの実施形態では、そのような結合試薬は、バリアントＣＤ８０−Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは非ヒトＦｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、マウスＦｃ、例えばマウスＩｇＧ、例えばマウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａまたはマウスＩｇＧ２ｂまたは他のマウスアイソタイプのものである。いくつかの実施形態では、マウスＦｃは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０４０に記載の配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３０４０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、マウスＦｃは、抗マウスＩｇＧ二次抗体（例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧ）によって検出可能である。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ウサギＦｃ、例えばウサギＩｇＧのものである。いくつかの実施形態では、ウサギＦｃは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３９に記載の配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３０３９に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ウサギＦｃは、抗ウサギＩｇＧ二次抗体（例えば、ヤギ抗ウサギＩｇＧ）によって検出可能である。提供される結合試薬のバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、Ｆｃドメインなどの多量体化ドメインに直接的または間接的に連結することができる。いくつかの態様では、提供される結合試薬のバリアントＣＤ８０ポリペプチドは、セクションＩＩに記載されているものを含むリンカーを介するなどして、Ｆｃ配列に間接的に連結される。

結合試薬は、検出のために検出可能な標識に直接的または間接的に融合するなど、コンジュゲートさせることができる。場合によっては、結合試薬は、直接検出、または試薬もしくは試薬の一部に結合するかつ検出可能な標識に連結する抗体を介するなどの二次物質による検出のいずれかを可能にする部分に連結または結合する。例示的な検出可能な標識には、例えば、化学発光部分、生物発光部分、蛍光部分、放射性核種、及び金属が含まれる。標識を検出する方法は、当技術分野において周知である。そのような標識は、例えば、目視検査、蛍光分光法、反射率測定、フローサイトメトリー、Ｘ線、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）及び磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）などの多種多様な磁気共鳴法によって検出することができる。検出方法には、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、コンピューター体軸断層撮影（ＣＡＴ）、電子ビームコンピューター断層撮影（ＥＢＣＴ）、高解像度コンピューター断層撮影（ＨＲＣＴ）、ハイポサイクロイド断層撮影、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射型コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、スパイラルコンピューター断層撮影、及び超音波断層撮影を含む多種多様な断層撮影法のいずれかが含まれる。例示的な検出可能な標識には、例えば、化学発光部分、生物発光部分、蛍光部分、放射性核種、及び金属が含まれる。検出可能な標識には、蛍光プローブまたは検出可能な酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼがある。

結合試薬は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏアッセイを含む当業者に既知の任意の結合アッセイを使用して、結合パートナー、例えばＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を検出することができる。試料中で結合パートナー、例えばＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の発現またはレベルを、評価、決定、定量及び／またはそうでなければ特異的に検出するために使用することができる例示的な結合アッセイには、これらに限定されないが、固相結合アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量法、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、ウェスタンブロット、及び免疫組織化学（ＩＨＣ）または非抗体結合物質を使用した偽免疫組織化学などの組織化学法が含まれる。例えば、ＥＬＩＳＡ法などの固相結合アッセイ法では、アッセイは、サンドイッチフォーマットまたは競合阻害フォーマットであることができる。他の実施例では、ｉｎｖｉｖｏイメージング法を使用することができる。結合アッセイは、血漿、尿、腫瘍、または疑わしい腫瘍組織（新鮮な、凍結した、かつ固定またはパラフィン包埋した組織を含む）、リンパ節または骨髄を含むあらゆる種類の患者の体液、細胞、または組織試料から得られた試料で実施することができる。本明細書で提供される治療方法に従って治療する対象を選択する例示的な方法では、試料、例えば腫瘍組織の採取は、対象の治療の前に実施される。

いくつかの実施形態では、結合アッセイは、組織または細胞試料中の結合パートナーの発現またはレベルを検出する組織染色アッセイである。組織染色法には、限定されないが、免疫組織化学（ＩＨＣ）または非抗体結合物質を使用した組織化学（例、偽免疫組織化学）などの細胞化学的または組織化学的方法が含まれる。そのような組織化学的方法は、腫瘍組織試料などの試料中の結合パートナーの量の定量的または半定量的検出を可能にする。かかる方法では、組織試料を結合試薬、例えばＰＤ−Ｌ１結合試薬、特に、組織または細胞関連結合パートナーへの結合を可能にする条件下で、検出可能に標識された、または検出可能なものと接触させることができる。

組織化学によって決定される本明細書で提供される方法で使用するための試料は、組織または細胞試料など、疾患または状態に関連する任意の生体試料であり得る。例えば、組織試料は、新鮮、凍結及び／または保存された臓器または組織試料または生検材料または吸引液または細胞を含む固形組織であり得る。いくつかの実施例では、組織試料は、限定されないが、乳房、結腸、直腸、肺、胃、卵巣、頸部、子宮頸部、精巣、膀胱、前立腺、甲状腺、及び肺癌腫瘍を含む固形腫瘍、例えば原発性腫瘍及び転移性腫瘍から得られた組織または細胞である。特定の実施例では、試料は、後期癌、転移性癌、未分化癌、卵巣癌、上皮内癌（ＩＳＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌である癌からの組織試料である。

いくつかの態様では、腫瘍が固形腫瘍の場合、腫瘍細胞の単離は、外科的生検によって達成することができる。対象から腫瘍細胞を採取するために使用することができる生検技術には、これらに限定されないが、針生検、ＣＴガイド下針生検、吸引生検、内視鏡生検、気管支鏡生検、気管支洗浄、切開生検、切除生検、パンチ生検、シェーブ生検、皮膚生検、骨髄生検、及びループ電気外科切除法（ＬＥＥＰ）が含まれる。典型的には、１００ｍｇより大きな非壊死性の滅菌生検または試験片が得られるが、これは例えば１００ｍｇ未満、５０ｍｇ以下、１０ｍｇ以下もしくは５ｍｇ以下などより小さくてもよく、または例えば１００ｍｇを超える、２００ｍｇ以上、もしくは５００ｍｇ以上、１ｇｍ以上、２ｇｍ以上、３ｇｍ以上、４ｇｍ以上、もしくは５ｇｍ以上などより大きくてもよい。アッセイのために摘出される試料サイズは、限定されないが、実行するアッセイ数、組織試料の健康状態、がんの種類、及び対象の状態を含む多くの要因に依存し得る。腫瘍組織は、滅菌容器、例えば滅菌チューブまたは培養皿に入れられ、任意で適切な培地に浸漬することができる。

いくつかの実施形態では、生検が固定された後、患者から得られた組織は、ホルマリン（ホルムアルデヒド）またはグルタルアルデヒドなどによって、または例えばアルコール浸漬によって固定される。組織化学的方法では、腫瘍試料は、脱水、及び腫瘍組織をパラフィンワックスまたは当業者に既知の他の固体支持体に包埋し（Ｐｌｅｎａｔｅｔａｈ，（２００１）ＡｎｎＰａｔｈｏｌ．Ｊａｎｕａｒｙ２１（ｌ）：２９−４７）を参照のこと）、該組織を染色に適した切片にスライスし、そして選択された組織化学染色法に従って染色するために切片を処理する（例えば有機溶媒による包埋のための固体支持体の除去、及び保存された組織の再水和を含む）などの既知の技術を使用して処理することができる。

いくつかの実施形態では、組織化学法が用いられる。場合によっては、結合試薬は、直接的または間接的な検出のために、検出可能な標識または他の部分に直接結合または連結される。例示的な検出可能試薬には、限定されないが、ビオチン、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、または酵素が含まれる。他の実施例では、結合試薬は、標識された結合パートナーまたは抗体を介して検出することができるペプチドまたはタンパク質にコンジュゲート、例えば融合する。いくつかの実施例では、結合パートナーは、結合試薬の１つまたは複数の領域、例えばエピトープを認識する標識抗体などの標識二次試薬を使用するＨＣ法によって検出することができる。

いくつかの実施形態では、得られた染色試験片（例えば組織化学法によって得られた）は、検出可能なシグナルを表示し、染色のデジタル画像などの画像を取得するシステムを使用してそれぞれ画像化する。画像取得の方法は、当業者に周知である。例えば、試料を染色すると、例えば、正立または倒立光学顕微鏡、走査型共焦点顕微鏡、カメラ、走査型またはトンネル電子顕微鏡、キャニングプローブ顕微鏡（ｃａｎｎｉｎｇｐｒｏｂｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ）、及びイメージング赤外線検出器などの光学または非光学イメージング装置を使用して、染色またはバイオマーカー標識を検出することができる。いくつかの実施例では、画像はデジタルでキャプチャできる。得られた画像は、結合パートナー、例えば試料中のＰＤ−Ｌ１の量を定量的または半定量的に決定するために使用することができる。免疫組織化学での使用に適した様々な自動化された試料の処理、走査及び分析システムが当技術分野で利用可能である。このようなシステムには、試料（組織切片が置かれたスライドなど）の、自動染色及び顕微鏡走査、コンピューター制御された画像分析、連続切片比較（試料の向き及びサイズの変動を制御する）、デジタルレポート生成、ならびにアーカイブ及び追跡が含まれる。従来の光学顕微鏡とデジタル画像処理システムを組み合わせて、免疫染色試料を含む細胞及び組織の定量分析を実施する細胞イメージングシステムが市販されている。例えば、ＣＡＳ−２００システム（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．）を参照のこと。具体的には、検出は、手動で、またはコンピュータープロセッサ及びソフトウェアを含む画像処理技術によってなされることができる。そのようなソフトウェアを使用して、例えば、画像は、当業者に既知の手順を使用して、例えば染色品質または染色強度を含む要因に基づいて、構成、較正、正規化、及び／または検証することができる（例えば、公開米国特許出願ＵＳ２０１００１３６５４９を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、生体試料は、細胞の少なくとも、または少なくとも約、または約１％、細胞の少なくともまたは少なくとも約または約５％、細胞の少なくとも、または少なくとも約、または約１０％、細胞の少なくとも、または少なくとも約、または約２０％、細胞の少なくとも、または少なくとも約、または約４０％以上において結合パートナーの検出可能な発現レベルがある場合（例えば、結合試薬との接触及び結合した結合試薬の検出後）、結合パートナー、例えばＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４に対して表面陽性の細胞について検出される。

いくつかの実施形態では、生体試料は、間質細胞、腫瘍細胞、または腫瘍浸潤免疫細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球などの腫瘍浸潤細胞を含む腫瘍組織試料である。いくつかの実施形態では、腫瘍組織試料は、細胞の少なくとも、または少なくとも約、または約１％、細胞の少なくともまたは少なくとも約または約５％、細胞の少なくとも、または少なくとも約、または約１０％、細胞の少なくとも、または少なくとも約、または約２０％、細胞の少なくとも、または少なくとも約、または約４０％以上において結合パートナーの検出可能な発現レベルがある場合（例えば、結合試薬との接触及び結合した結合試薬の検出後）、ＰＤ−Ｌ１に対して表面陽性の細胞について検出される。いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍組織試料は、細胞の少なくとも、または少なくとも約、または約１％、細胞の少なくともまたは少なくとも約または約５％、細胞の少なくとも、または少なくとも約、または約１０％、細胞の少なくとも、または少なくとも約、または約２０％、細胞の少なくとも、または少なくとも約、または約４０％以上において結合パートナーの検出可能な発現レベルがある場合（例えば、結合試薬との接触及び結合した結合試薬の検出後）、ＣＤ２８に対して表面陽性の細胞について検出される。いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍浸潤免疫リンパ球である。

ＶＩＩＩ．例示的な実施形態
提供される実施形態としては、以下の実施形態が挙げられる。

１．ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片、またはその両方を含むバリアントＣＤ８０ポリペプチドであって、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた７、２３、２６、３０、３４、３５、４６、５１、５５、５７、５８、６５、７１、７３、７８、７９、８２または８４位に対応する、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、バリアントＣＤ８０ポリペプチド。

２．ＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた２６、３５、４６、５７、または７１位に対応する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、実施形態１に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

３．１つまたは複数のアミノ酸改変が、アミノ酸の置換、挿入、または欠失である、実施形態１または実施形態２に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

４．非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、Ｅ７Ｄ、Ｅ２３Ｄ、Ｅ２３Ｇ、Ａ２６Ｄ、Ａ２６Ｅ、Ａ２６Ｇ、Ａ２６Ｈ、Ａ２６Ｋ、Ａ２６Ｎ、Ａ２６Ｐ、Ａ２６Ｑ、Ａ２６Ｒ、Ａ２６Ｓ、Ａ２６Ｔ、Ｉ３０Ｆ、Ｉ３０Ｔ、Ｉ３０Ｖ、Ｋ３４Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｎ、Ｄ４６Ｖ、Ｐ５１Ａ、Ｎ５５Ｄ、Ｎ５５Ｉ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ５８Ｖ、Ｌ６５Ｐ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｒ７３Ｈ、Ｒ７３Ｓ、Ｇ７８Ａ、Ｔ７９Ａ、Ｔ７９Ｉ、Ｔ７９Ｌ、Ｔ７９Ｍ、Ｔ７９Ｐ、Ｃ８２Ｒ、Ｖ８４Ａ、及びＶ８４Ｉの中から選択される、１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変の位置（複数可）が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置の番号付けに対応する、実施形態１〜３のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

５．１つまたは複数のアミノ酸改変が、

の中から選択され、該アミノ酸置換の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する、実施形態１〜４のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

６．ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片、またはその両方を含むバリアントＣＤ８０ポリペプチドであって、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、

の中から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該アミノ酸置換の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置の番号付けに対応する、バリアントＣＤ８０ポリペプチド。

７．１つまたは複数のアミノ酸改変が、

の中から選択され、該アミノ酸置換の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する、実施形態６に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

８．１つまたは複数のアミノ酸改変が、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２２Ｉ、Ｖ２２Ｌ、Ａ２６Ｅ、Ｑ２７Ｈ、Ｑ３３Ｌ、Ｑ３３Ｒ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｔ４１Ｓ、Ｍ４３Ｌ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｎ５５Ｄ、Ｔ５７Ｉ、Ｉ６１Ｖ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｌ７２Ｖ、Ｌ８５Ｍ、Ｌ８５Ｑ、Ｒ９４Ｗ、及びＬ９７Ｑの中から選択され、
任意で１つまたは複数のアミノ酸改変が、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２２Ｌ、Ａ２６Ｅ、Ｑ２７Ｈ、Ｑ３３Ｌ、Ｑ３３Ｒ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｇ、Ｍ４７Ｉ、Ｄ４６Ｅ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｔ５７Ｉ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、Ｌ７２Ｖ、Ｌ８５Ｍ、Ｌ８５Ｑ、及びＬ９７Ｑの中から選択され、
任意で１つまたは複数のアミノ酸改変が、Ａ２６Ｅ、Ｑ３３Ｌ、Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｉ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｔ５７Ｉ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｄ、Ａ７１Ｇ、及びＬ８５Ｑの中から選択され、任意で１つまたは複数のアミノ酸改変が、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｌ、Ｍ４７Ｖ、Ｌ７０Ｍ、Ａ７１Ｇ、及びＬ８５Ｑの中から選択され、
該アミノ酸置換の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する、
実施形態６または実施形態７に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

９．１つまたは複数のアミノ酸改変が、Ａ２６Ｅを含む、
１つまたは複数のアミノ酸改変が、Ｅ３５Ｄを含む、
１つまたは複数のアミノ酸改変が、Ｄ４６Ｖを含む、
１つまたは複数のアミノ酸改変が、Ｍ４７Ｌを含む、
１つまたは複数のアミノ酸改変が、Ｍ４７Ｖを含む、及び／または
１つまたは複数のアミノ酸改変が、Ａ７１Ｇを含み、
該アミノ酸改変の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置の番号付けに対応する、
実施形態６〜８のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

１０．アミノ酸改変が、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｅ、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ、Ｅ３５Ｄ／Ｖ６８Ｍ、Ｅ３５Ｄ／Ａ７１Ｇ、Ｅ３５Ｄ／Ｄ９０Ｇ；Ｄ４６Ｅ／Ｍ４７Ｉ、Ｄ４６Ｅ／Ｍ４７Ｌ、Ｄ４６Ｅ／Ｍ４７Ｖ、Ｄ４６Ｅ／Ｖ６８Ｍ、Ｄ４６Ｅ／Ａ７１ＧｏｒＤ４６Ｅ／Ｄ９０Ｇ；Ｍ４７Ｉ／Ｖ６８Ｍ、Ｍ４７Ｉ／Ａ７１Ｇ、Ｍ４８Ｉ／Ｄ９０Ｇ；Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ、Ｍ４７Ｌ／Ａ７１Ｇ、Ｍ４７Ｌ／Ｄ９０Ｇ；Ｍ４７Ｖ／Ｖ６８Ｍ、Ｍ４７Ｖ／Ａ７１Ｇ、Ｍ４７Ｖ／Ｄ９０Ｇ；Ｖ６８Ｍ／Ａ７１ＧまたはＶ６８Ｍ／Ｄ９０Ｇ、Ａ７１Ｇ／Ｄ９０Ｇから選択され、任意で該アミノ酸改変が、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｖ６８Ｍ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ／Ｖ６８Ｍであり、
該アミノ酸改変の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置の番号付けに対応する、実施形態６〜９のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

１１．ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片、またはその両方を含むバリアントＣＤ８０ポリペプチドであって、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、該１つまたは複数のアミノ酸置換は少なくともアミノ酸置換Ｌ７０Ｐを含むが、アミノ酸置換Ｖ６８Ｍ、Ｌ７２Ｐ及び／またはＫ８６Ｅを含まず、該アミノ酸改変の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する、バリアントＣＤ８０ポリペプチド。

１２．１つまたは複数のアミノ酸改変が、Ｌ７０Ｐ、Ｉ３０Ｆ／Ｌ７０Ｐ、Ｉ３０Ｖ／Ｔ５７Ｉ／Ｌ７０Ｐ／Ａ７１Ｄ／Ａ９１Ｔ、Ｎ５５Ｄ／Ｌ７０Ｐ／Ｅ７７Ｇ、及びＬ７０Ｐ／Ｆ９２Ｓの中から選択される、実施形態１１に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

１３．非改変ＣＤ８０が、哺乳動物ＣＤ８０である、実施形態１〜１２のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

１４．ＣＤ８０が、ヒトＣＤ８０である、実施形態１〜１３のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

１５．ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ならびに
ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片を含む、
実施形態１〜１４のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

１６．非改変ＣＤ８０が、（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のアミノ酸の配列、（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列、または（ｉｉｉ）ＩｇＶドメインもしくはＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片を含むそれらの一部分である、実施形態１〜１５のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

１７．ＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインの特異的結合断片が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０以上のアミノ酸長を有するか、
ＩｇＶドメインの特異的結合断片がＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸３５〜１３５、３５〜１３８、３７〜１３８または３５〜１４１として記載されるＩｇＶドメインの長さの少なくとも８０％である長さを含むか、または、
ＩｇＣドメインの特異的結合断片がＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸１４５〜２３０、１５４〜２３２または１４２〜２３２として記載されるＩｇＣドメインの長さの少なくとも８０％である長さを含む、
実施形態１〜１５のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

１８．最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸改変、任意でアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を含む、実施形態１〜１７のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

１９．ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列またはその特異的結合断片を含む、実施形態１〜１８のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

２０．ＩｇＶドメインもしくはその特異的断片、及びＩｇＣドメインもしくはその特異的断片を含む、実施形態１〜１９のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

２１．ＳＥＱＩＤＮＯ：３〜７５、２００９〜２１０４、２２９７〜２５０７、及び２９３０〜２９６０のいずれかに記載のアミノ酸配列もしくはその特異的結合断片、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３〜７５、２００９〜２１０４、２２９７〜２５０７、及び２９３０〜２９６０のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示し、かつ１つまたは複数のそれらのアミノ酸改変を含有する、アミノ酸配列もしくはその特異的結合断片、を含むかまたはそれからなる、実施形態１〜２０のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

２２．ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片を含む、実施形態１〜１９のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

２３．ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片が、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの唯一のＣＤ８０部分である、実施形態１〜１９及び２２のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

２４．ＳＥＱＩＤＮＯ：７７〜１４９、１５１〜２２３、２１０５〜２２９６、２５０８〜２９２９、及び２９６１〜３０２２のいずれかに記載のアミノ酸配列もしくはその特異的結合断片、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７７〜１４９、１５１〜２２３、２１０５〜２２９６、２５０８〜２９２９、及び２９６１〜３０２２のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示し、かつ１つまたは複数のそれらのアミノ酸改変を含有する、アミノ酸の配列もしくはその特異的結合断片、を含むまたはそれからなる、実施形態１〜１９、２２及び２３のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

２５．ＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片が、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの唯一のＣＤ８０部分である、実施形態１〜１９のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

２６．エクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合と比較して、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、及び／またはＣＤ２８のエクトドメインに対して変化した結合を示す、実施形態１〜２５のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

２７．変化した結合が、変化した結合親和性及び／または変化した結合選択性である、実施形態２６に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

２８．ＣＴＬＡ−４が、ヒトＣＴＬＡ−４である、実施形態２６または実施形態２７に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

２９．ＣＤ２８が、ヒトＣＤ２８である、実施形態２６〜２８のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

３０．ＰＤ−Ｌ１が、ヒトＰＤ−Ｌ１である、実施形態２６〜２９のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

３１．ＣＴＬＡ４のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＣＴＬＡ４のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、実施形態１〜３０のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

３２．非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた７、２３、２６、３０、３５、４６、５７、５８、７１、７３、７９及び／または８４位に対応する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、実施形態１〜３１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

３３．非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、

の中から選択される、１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変の位置（複数可）が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する、実施形態１〜３１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

３４．１つまたは複数のアミノ酸改変が、

の中から選択され、該アミノ酸置換の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する、実施形態１〜３３のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

３５．ＣＴＬＡ−４のエクトドメインに対する増加した親和性が、ＣＴＬＡ−４のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または６０倍より大きく増加する、実施形態３１〜３４のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

３６．ＣＴＬＡ−４のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０と比較して、増加した選択性を伴ってＣＴＬＡ−４のエクトドメインに特異的に結合する、実施形態１〜３５のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

３７．選択性の増加が、非改変ＣＤ８０ポリペプチドのＣＴＬＡ−４への結合対ＣＤ２８への結合比と比較してＣＴＬＡ−４対ＣＤ２８へのバリアントポリペプチドのより大きな結合比を含む、実施形態３６に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

３８．該比率が、少なくとも１．５倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれ以上、または少なくとも約１．５倍、約２．０倍、約３．０倍、約４．０倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍もしくはそれ以上より大きい、実施形態３７に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

３９．ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＣＤ２８のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、実施形態１〜３１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

４０．非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた２３、２６、３５、４６、５５、５７、５８、７１、７９及び／または８４位に対応する、１つまたは複数のアミノ酸改変を含む実施形態１〜３１及び３９のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

４１．非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、

の中から選択される、１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該アミノ酸置換の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する、実施形態１〜３１、３９及び４０のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

４２．１つまたは複数のアミノ酸改変が、

の中から選択され、該アミノ酸置換の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する、実施形態１〜３１及び３９〜４１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

４３．ＣＤ２８のエクトドメインに対する増加した親和性が、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、または２００倍より大きく増加する、実施形態３９〜４２のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

４４．ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、実施形態１〜３１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

４５．非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた７、２３、２６、３０、３４、３５、４６、５１、５５、５７、５８、６５、７１、７３、７８、７９、８２、及び／または８４位に対応する、１つまたは複数のアミノ酸改変を含む実施形態１〜３１、及び４４のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

４６．非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、

の中から選択される、１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該アミノ酸置換の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する、実施形態１〜３１、及び４４のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

４７．１つまたは複数のアミノ酸改変が、

の中から選択され、該アミノ酸置換の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する、実施形態１〜３１及び４４〜４６のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

４８．ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対する増加した親和性が、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、または４５０倍より大きく増加する、実施形態４４〜４７のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

４９．ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＣＤ２８のエクトドメインに対して減少した結合親和性を示す、実施形態１〜３８及び４４〜４８のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

５０．ＣＤ２８のエクトドメインに対する減少した親和性が、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または６０倍より大きく増加する、実施形態１〜３８及び４４〜４９のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

５１．バリアントポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインの非改変ＣＤ８０と比較して、増加した選択性を伴ってＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに特異的に結合する、実施形態１〜５０のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

５２．非改変ＣＤ８０ポリペプチドのＰＤ−Ｌ１への結合対ＣＤ２８への結合比と比較して、ＰＤ−Ｌ１対ＣＤ２８へのバリアントポリペプチドのより大きな結合比を含む、実施形態５１に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

５３．該比率が、少なくとも１．５倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくはそれ以上、または少なくとも約１．５倍、約２．０倍、約３．０倍、約４．０倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍もしくはそれ以上より大きい、実施形態５２に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

５４．可溶性タンパク質である、実施形態１〜５３のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

５５．ＣＤ８０膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを欠き；及び／または
細胞表面に発現することができない、
実施形態１〜５４のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

５６．ポリペプチドの生物学的半減期を延長する部分に連結された、実施形態１〜５５のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

５７．多量体化ドメインに連結された、実施形態１〜５６のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

５８．多量体化ドメインがＦｃドメインであるか、または低下したエフェクター機能を有するバリアントＦｃドメインである、実施形態５７に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

５９．Ｆｃドメインが哺乳動物、任意でヒト、マウスまたはウサギであるか、
またはバリアントＦｃドメインが、哺乳動物、任意でヒトである非改変Ｆｃドメインと比較して１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、
実施形態５８に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

６０．Ｆｃドメインもしくはそのバリアントが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５９、もしくはＳＥＱＩＤＮＯ：１７１２に記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２７７、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５９、もしくはＳＥＱＩＤＮＯ：１７１２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、または
該Ｆｃドメインが、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３９もしくは３０４０に記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３０３９もしくは３０４０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、
実施形態５８または実施形態５９に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

６１．Ｆｃドメインが、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｇ２３７Ａ、Ｓ２６７Ｋ、Ｎ２９７Ｇ，Ｖ３０２Ｃ、及びＫ４４７ｄｅｌ（それぞれＥＵ番号付けによる）の中から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、任意で該１つまたは複数のアミノ酸改変がヒトＩｇＧ１にある、実施形態５８〜６０のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

６２．Ｆｃドメインが、アミノ酸改変Ｃ２２０Ｓ（ＥＵ番号付けによる）を含む、実施形態５８〜６０のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

６３．Ｆｃドメインが、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５６〜３５８、３７６、及び１７１２〜１７１５のいずれかに記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３５６〜３５８、３７６、及び１７１２〜１７１５のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示し、かつ低下したエフェクター機能を示すアミノ酸配列を含む、実施形態５８〜６２のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

６４．リンカー、任意でＧ４Ｓリンカーを介して間接的に多量体化ドメインまたはＦｃに連結する、実施形態５７〜６３のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

６５．膜貫通ドメインをさらに含む膜貫通型免疫調節タンパク質であり、任意で該膜貫通ドメインが、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはその特異的結合断片に直接的または間接的に連結されている、実施形態１〜５３のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

６６．膜貫通ドメインが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基２４３〜２６３として記載されるアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基２４３〜２６３に対して少なくとも８５％の配列同一性を示すその機能的バリアントを含む、実施形態６５に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

６７．細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含み、任意で該細胞質シグナル伝達ドメインが膜貫通ドメインに直接的または間接的に連結される、実施形態６５または実施形態６６に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

６８．細胞質シグナル伝達ドメインが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基２６４〜２８８として記載されるアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基２５４〜２８８に対して少なくとも８５％の配列同一性を示すその機能的バリアントを含む、実施形態６７に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

６９．バリアントＣＤ８０が、ｉｎｖｉｔｒｏ初代Ｔ細胞アッセイにおいて非改変ＣＤ８０に対してＩＦＮ−γ（インターフェロン−ガンマ）発現を増加させる、実施形態１〜６８のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

７０．ｉｎｖｉｔｒｏ初代Ｔ細胞アッセイにおいて非改変ＣＤ８０に対してＩＦＮ−γ（インターフェロン−ガンマ）発現を減少させる、実施形態１〜６８のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

７１．脱グリコシル化した、実施形態１〜７０のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。

７２．実施形態１〜７１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び半減期延長部分を含む免疫調節タンパク質。

７３．半減期延長部分が、多量体化ドメイン、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｓｅｒ（ＰＡＳ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのベータサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アミノ酸の長い非構造化親水性配列（ＸＴＥＮ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはこれらの組み合わせを含む、実施形態７２に記載の免疫調節タンパク質。

７４．半減期延長部分がＰｒｏ／Ａｌａ／Ｓｅｒ（ＰＡＳ）であるか、またはそれを含み、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドがＰＡＳ化される、実施形態７２または実施形態７３に記載の免疫調節タンパク質。

７５．半減期延長部分が多量体化ドメインであるか、またはそれを含む、実施形態７２または実施形態７３に記載の免疫調節タンパク質。

７６．多量体化ドメインが、免疫グロブリンのＦｃ領域、ロイシンジッパー、イソロイシンジッパーまたはジンクフィンガーから選択される、実施形態７５に記載の免疫調節タンパク質。

７７．第１の多量体化ドメインに連結された第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２の多量体化ドメインに連結された第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む多量体であり、該第１及び第２の多量体化ドメインが相互作用して第１及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む多量体を形成する、実施形態７５または実施形態７６に記載の免疫調節タンパク質。

７８．多量体が二量体である、実施形態７７に記載の免疫調節タンパク質。

７９．第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドが同一である、実施形態７７または実施形態７８に記載の免疫調節タンパク質。

８０．二量体がホモ二量体である、実施形態７８または実施形態７９に記載の免疫調節タンパク質。

８１．二量体がヘテロ二量体である、実施形態７８に記載の免疫調節タンパク質。

８２．多量体化ドメインが免疫グロブリンのＦｃ領域であるか、またはそれを含む、実施形態７５〜８１のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

８３．Ｆｃ領域が、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）または免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）タンパク質のものである、実施形態８２に記載の免疫調節タンパク質。

８４．免疫調節タンパク質がヒトである及び／またはＦｃ領域がヒトである、実施形態８２または実施形態８３に記載の免疫調節タンパク質。

８５．Ｆｃ領域が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７８に記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２７８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すそのバリアントを含む、実施形態８２〜８４のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

８６．Ｆｃ領域が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７に記載のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２７７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すそのバリアントを含む、実施形態８２〜８５のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

８７．Ｆｃ領域が、１つまたは複数のエフェクター機能を示す、実施形態８２〜８６のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

８８．Ｆｃ依存性ＣＤ２８共刺激を、任意で抗原提示細胞の存在下でのＴ細胞刺激アッセイにおいて示し、任意で該Ｔ細胞がＩＬ−２レポーターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞またはＩＬ−２などの炎症性サイトカインを産生する初代ヒトＴ細胞を含む、実施形態８２〜８７のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

８９．Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比較して低下した１つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で野生型Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃである、実施形態８２〜８６のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

９０．１つまたは複数のエフェクター機能が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害、プログラム細胞死及び細胞食作用の中から選択される、実施形態８７〜８９のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

９１．Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントＦｃ領域である、実施形態８９または実施形態９０に記載の免疫調節タンパク質。

９２．バリアントＦｃ領域の１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ｎ２９７Ｇ、Ｒ２９２Ｃ／Ｎ２９７Ｇ／Ｖ３０２Ｃ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７ＫまたはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａから選択され、該残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる、実施形態９１に記載の免疫調節タンパク質。

９３．バリアントＦｃ領域が、アミノ酸置換Ｃ２２０Ｓをさらに含み、該残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる、実施形態９２に記載の免疫調節タンパク質。

９４．Ｆｃ領域が、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５６〜３５８のいずれかに記載のアミノ酸配列の配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３５６〜３５８のいずれかに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を示し、かつアミノ酸置換を含有するアミノ酸配列を含む、実施形態８９〜９３のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

９５．Ｆｃ領域が、Ｋ４４７ｄｅｌを含み、該残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる、実施形態８９〜９４のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

９６．Ｆｃ領域が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１３〜１７１５のいずれかに記載のアミノ酸配列の配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１７１３〜１７１５のいずれかに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を示し、かつアミノ酸置換を含有するアミノ酸配列を含む、実施形態８９〜９３及び９５のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

９７．バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、実施形態４４〜４８のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドである、実施形態８２〜９６のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

９８．ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激を、任意で、ＰＤ−Ｌ１を発現する抗原提示細胞の存在下でのＴ細胞刺激アッセイにおいて示し、任意で該Ｔ細胞がＩＬ−２レポーターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞またはＩＬ−２などの炎症性サイトカインを産生する初代ヒトＴ細胞を含む、実施形態７２〜９７のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

９９．バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、直接的またはリンカーを介して間接的に、半減期延長部分に、任意で多量体化ドメインに連結される、実施形態７２〜９８のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１００．リンカーが１〜１０アミノ酸を含む、実施形態９９に記載の免疫調節タンパク質。

１０１．リンカーが、ＡＡＡ、Ｇ４Ｓ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１７）または（Ｇ_４Ｓ）_２（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３０）から選択される、実施形態１００に記載の免疫調節タンパク質。

１０２．直接的またはリンカーを介して間接的にＩｇＳＦファミリーメンバーの免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインを含む第２のポリペプチドに連結された実施形態１〜７１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む、免疫調節タンパク質。

１０３．ＩｇＳＦドメインが、親和性改変ＩｇＳＦドメインであり、該親和性改変ＩｇＳＦドメインが、該ＩｇＳＦファミリーメンバーの非改変または野生型ＩｇＳＦドメインと比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、実施形態１０２に記載の免疫調節タンパク質。

１０４．ＩｇＳＦドメインが、ＩｇＳＦファミリーメンバーの非改変または野生型ＩｇＳＦドメインの同一の１つまたは複数のコグネイト結合パートナー（複数可）への結合と比較して、１つまたは複数のそのコグネイト結合パートナー（複数可）への変化した結合を示す親和性改変ＩｇＳＦドメインである、実施形態１０３に記載の免疫調節タンパク質。

１０５．ＩｇＳＦドメインが、ＩｇＳＦファミリーメンバーの非改変または野生型ＩｇＳＦドメインの同一の１つまたは複数のコグネイト結合パートナー（複数可）への結合と比較して、１つまたは複数のそのコグネイト結合パートナー（複数可）への増加した結合を示す、実施形態１０４に記載の免疫調節タンパク質。

１０６．バリアントＣＤ８０ポリペプチドが第１のＣＤ８０バリアントポリペプチドであり、第２のポリペプチドのＩｇＳＦドメインが実施形態１〜７１のいずれかに記載の第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドに由来するＩｇＳＦドメインであり、該第１及び第２のＣＤ８０バリアントポリペプチドが同一または異なる、実施形態１０２〜１０５のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１０７．バリアントＣＤ８０ポリペプチドがＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができ、第２のポリペプチドのＩｇＳＦドメインがＣＤ８０バリアントポリペプチドによって特異的に結合されるもの以外のコグネイト結合パートナーに結合することができる、実施形態１０２〜１０６のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１０８．第２のポリペプチドのＩｇＳＦドメインが、腫瘍に発現するリガンドに結合する、または腫瘍に発現するリガンドに結合する腫瘍局在化部分であるか、または炎症環境に関連する細胞もしくは組織に結合する炎症局在化部分である、実施形態１０２〜１０７のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１０９．リガンドがＢ７Ｈ６である、実施形態１０８に記載の免疫調節ポリペプチド。

１１０．ＩｇＳＦドメインがＮＫｐ３０由来である、実施形態１０８または実施形態１０９に記載の免疫調節ポリペプチド。

１１１．第２のポリペプチドのＩｇＳＦドメインが、阻害性受容体に結合するリガンドのＩｇＳＦドメイン、またはその親和性改変ＩｇＳＦドメインである、実施形態１０２〜１０７のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１１２．親和性改変ＩｇＳＦドメインが、同じ阻害性受容体への非改変ＩｇＳＦドメインの結合と比較して、阻害性受容体に対する結合親和性及び／または結合選択性の増加を示す、実施形態１１１に記載の免疫調節タンパク質。

１１３．阻害性受容体がＴＩＧＩＴもしくはＰＤ−１；または阻害性受容体のリガンドがＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２である、実施形態１１１または１１２に記載の免疫調節タンパク質。

１１４．第２のポリペプチドが、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６９、７３４もしくは８２９のいずれかに記載のＩｇＳＦドメインを含む野生型ＣＤ１１２、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７３５〜８２８、８３０〜９９９、１４３０〜１５０１のいずれかに記載のＩｇＳＦドメインを含むバリアントＣＤ１１２ポリペプチド、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６８、３７８もしくは４２１のいずれかに記載のＩｇＳＦを含む野生型ＣＤ１５５、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３７９〜４２０、４２２〜７３３、１５０２〜１７１１のいずれかに記載のＩｇＳＦドメインを含むバリアントＣＤ１５５ポリペプチド、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５１、１０００、１７２１もしくは１１９６のいずれかに記載のＩｇＳＦを含む野生型ＰＤ−Ｌ１、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１００１〜１１９５、１７１８〜１７２０、１７２２〜１９９６のいずれかに記載のＩｇＳＦを含むバリアントＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、
（ｉｖ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５２、１１９７もしくは１２５７のいずれかに記載のＩｇＳＦを含む野生型ＰＤ−Ｌ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１９８〜１２４８、１２５０〜１２５６、１２５８〜１３２５、１３２７〜１４０１、１４０３〜１４２６のいずれかに記載のＩｇＳＦドメインを含むバリアントＰＤ−Ｌ２ポリペプチド、
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＳＥＱＩＤＮＯ：のいずれかに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸配列、または
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）のいずれかの特異的結合断片
から選択される、実施形態１０２〜１０７及び１１１〜１１３のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１１５．ＩｇＳＦファミリーメンバーのＩｇＳＦドメインまたはその親和性改変ＩｇＳＦドメインを含む第３のポリペプチドをさらに含み、該親和性改変ＩｇＳＦドメインが、該ＩｇＳＦファミリーメンバーの非改変または野生型ＩｇＳＦドメインと比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、実施形態１０２〜１１４のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１１６．第３のポリペプチドが、
第１及び／または第２のポリペプチドと同一である；または
第３のポリペプチドが第１及び／または第２のポリペプチドとは異なる、
実施形態１１５に記載の免疫調節タンパク質。

１１７．第３のポリペプチドが、
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６９、７３４もしくは８２９のいずれかに記載のＩｇＳＦドメインを含む野生型ＣＤ１１２、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７３５〜８２８、８３０〜９９９、１４３０〜１５０１のいずれかに記載のＩｇＳＦドメインを含むバリアントＣＤ１１２ポリペプチド、
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６８、３７８もしくは４２１のいずれかに記載のＩｇＳＦを含む野生型ＣＤ１５５、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３７９〜４２０、４２２〜７３３、１５０２〜１７１１のいずれかに記載のＩｇＳＦドメインを含むバリアントＣＤ１５５ポリペプチド、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５１、１０００、１７２１もしくは１１９６のいずれかに記載のＩｇＳＦを含む野生型ＰＤ−Ｌ１、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１００１〜１１９５、１７１８〜１７２０、１７２２〜１９９６のいずれかに記載のＩｇＳＦを含むバリアントＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、
（ｉｖ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５２、１１９７もしくは１２５７のいずれかに記載のＩｇＳＦを含む野生型ＰＤ−Ｌ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１９８〜１２４８、１２５０〜１２５６、１２５８〜１３２５、１３２７〜１４０１、１４０３〜１４２６のいずれかに記載のＩｇＳＦドメインを含むバリアントＰＤ−Ｌ２ポリペプチド、
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＳＥＱＩＤＮＯ：のいずれかに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸配列、または
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）のいずれかの特異的結合断片
から選択される、実施形態１１５及び実施形態１１６に記載の免疫調節タンパク質。

１１８．任意で第２または第３のポリペプチドの、ＩｇＳＦドメインまたはその親和性改変ＩｇＳＦドメインが、ＩｇＶドメインであるか、またはそれを含む、実施形態１０２〜１１７のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１１９．バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＩｇＶドメインであるか、またはそれを含む、実施形態１０２〜１１８のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１２０．ＩｇＳＦファミリーメンバーのＩｇＳＦドメインまたはその親和性改変ＩｇＳＦドメインを含む少なくとも１つの追加のポリペプチドをさらに含み、該親和性改変ＩｇＳＦドメインが、該ＩｇＳＦファミリーメンバーの非改変または野生型ＩｇＳＦドメインと比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、実施形態１１５〜１１９のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１２１．バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは第２のポリペプチドの少なくとも１つに連結された多量体化ドメインをさらに含む、実施形態１０２〜１２０のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１２２．バリアントＣＤ８０ポリペプチド、第２のポリペプチド、及び／または第３のポリペプチドの少なくとも１つに連結された多量体化ドメインをさらに含む、実施形態１１５〜１２０のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１２３．多量体化ドメインがＦｃドメインであるか、または低下したエフェクター機能を有するそのバリアントである、実施形態１２１または１２２に記載の免疫調節タンパク質。

１２４．多量体化ドメインがヘテロ二量体の形成を促進する、実施形態１２１〜１２３のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１２５．多量体化ドメインが第１の多量体化ドメインである実施形態５７〜６４のいずれかに記載の第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、ならびに多量体化ドメインが第２の多量体化ドメインである実施形態５７〜６４のいずれかに記載の第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含み、該第１及び第２の多量体化ドメインが相互作用して第１及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含有する多量体を形成する、免疫調節タンパク質。

１２６．多量体化ドメインが第１の多量体化ドメインであり、第２の多量体化ドメインと相互作用して免疫調節タンパク質を含む多量体を形成する、実施形態７７〜８１のいずれかに記載の免疫調節タンパク質を含む免疫調節タンパク質。

１２７．免疫調節タンパク質が第１の免疫調節タンパク質であり、第２の免疫調節タンパク質が第２の多量体化ドメインに直接的またはリンカーを介して間接的に連結され、該多量体が第１及び第２の免疫調節タンパク質を含む、実施形態１２６に記載の免疫調節タンパク質。

１２８．第２の免疫調節タンパク質が実施形態７７〜８１のいずれかに記載の免疫調節タンパク質であり、該多量体化ドメインが第２の多量体化ドメインである、実施形態１２７に記載の免疫調節タンパク質。

１２９．多量体が二量体である、実施形態１２５〜１２８のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１３０．ホモ二量体である、実施形態１２５〜１２９のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１３１．ヘテロ二量体である、実施形態１２５〜１２９のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１３２．第１及び／または第２の多量体化ドメインがＦｃドメインであるか、または低下したエフェクター機能を有するそのバリアントである、実施形態１２５〜１３１のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１３３．第１及び第２の多量体化ドメインが同一または異なる、実施形態１２５〜１３２のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。

１３４．実施形態１〜７１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、または部分に連結された実施形態７２〜１３３のいずれかに記載の免疫調節タンパク質を含み、任意で融合タンパク質である、コンジュゲート。

１３５．部分が、細胞表面の分子に特異的に結合するターゲティング部分である、実施形態１３４に記載のコンジュゲート。

１３６．ターゲティング部分が、免疫細胞表面の分子に特異的に結合し、任意で該免疫細胞が、抗原提示細胞またはリンパ球である、実施形態１３５に記載のコンジュゲート。

１３７．ターゲティング部分が、腫瘍表面の分子に結合する腫瘍局在化部分である、実施形態１３５に記載のコンジュゲート。

１３８．部分が、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子またはナノ粒子である、実施形態１３４〜１３７のいずれかに記載のコンジュゲート。

１３９．部分が、抗体または抗原結合断片である、実施形態１３４〜１３８のいずれかに記載のコンジュゲート。

１４０．コンジュゲートが、二価、四価、六価、または八価である、実施形態１３４〜１３９のいずれかに記載のコンジュゲート。

１４１．融合タンパク質である、実施形態１３４〜１３９のいずれかに記載のコンジュゲート。

１４２．実施形態１〜７１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、実施形態７２〜１３３のいずれかに記載の免疫調節タンパク質、または実施形態１３４〜１４１のいずれかに記載の融合タンパク質であるコンジュゲートをコードする核酸分子（複数可）。

１４３．合成核酸である、実施形態１４２に記載の核酸分子。

１４４．ｃＤＮＡである、実施形態１４２または実施形態１４３に記載の核酸分子。

１４５．実施形態１４２〜１４４のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。

１４６．発現ベクターである、実施形態１４５に記載のベクター。

１４７．哺乳動物発現ベクターまたはウイルスベクターである、実施形態１４５または実施形態１４６に記載のベクター。

１４８．実施形態１４６または実施形態１４７に記載のベクターを含む、細胞。

１４９．哺乳動物細胞である、実施形態１４８の細胞。

１５０．ヒト細胞である、実施形態１４８または実施形態１４９に記載の細胞。

１５１．実施形態１４２〜１４４のいずれかに記載の核酸分子または実施形態１４５〜１４７のいずれかに記載のベクターを宿主細胞に、該細胞内でタンパク質を発現する条件下で導入することを含む、バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質の産生方法。

１５２．細胞からバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質を単離または精製することをさらに含む、実施形態１５１に記載の方法。

１５３．実施形態１〜７１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドをコードする核酸分子を宿主細胞に、該ポリペプチドが該細胞内で発現される条件下で導入することを含む、バリアントＣＤ８０バリアントポリペプチドを発現する細胞を操作する方法。

１５４．実施形態１〜７１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、実施形態７２〜１３３のいずれかに記載の免疫調節タンパク質、実施形態１３４〜１４１のいずれかに記載の融合タンパク質であるコンジュゲート、実施形態１４２〜１４５のいずれかに記載の核酸分子、または実施形態１４５〜１４７のいずれかに記載のベクターを発現する、操作された細胞。

１５５．バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質が、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、実施形態１５４に記載の操作された細胞。

１５６．バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質が、膜貫通ドメインを含まない、及び／または細胞の表面に発現しない、実施形態１５４または実施形態１５５に記載の操作された細胞。

１５７．バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質が、操作された細胞から分泌される、または分泌されることができる、実施形態１５４〜１５６のいずれかに記載の操作された細胞。

１５８．膜貫通ドメインを含むバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む、及び／または実施形態６５〜７１のいずれかに記載の膜貫通型免疫調節タンパク質である、実施形態１５４または実施形態１５５に記載の操作された細胞。

１５９．バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、細胞の表面に発現する、実施形態１５４、実施形態１５５または実施形態１５８に記載の操作された細胞。

１６０．免疫細胞である、実施形態１５４〜１５９のいずれかに記載の操作された細胞。

１６１．免疫細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはリンパ球である、実施形態１６０に記載の操作された細胞。

１６２．初代細胞である、実施形態１５９〜１６１のいずれかに記載の操作された細胞。

１６３．哺乳動物細胞である、実施形態１５９〜１６２のいずれかに記載の操作された細胞。

１６４．ヒト細胞である、実施形態１５９〜１６３のいずれかに記載の操作された細胞。

１６５．リンパ球であり、該リンパ球がＴ細胞である、実施形態１５９〜１６４のいずれかに記載の操作された細胞。

１６６．ＡＰＣであり、該ＡＰＣが人工ＡＰＣである、実施形態１６１に記載の操作された細胞。

１６７．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体をさらに含む、実施形態１５４〜１６６のいずれかに記載の操作された細胞。

１６８．実施形態１〜７１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、実施形態７２〜１３３のいずれかに記載の免疫調節タンパク質、または実施形態１３４〜１４１のいずれかに記載の融合タンパク質であるコンジュゲートをコードする核酸分子を含む、感染性物質。

１６９．コードされたバリアントＣＤ８０ポリペプチド、免疫調節タンパク質、またはコンジュゲートが、膜貫通ドメインを含まない、及び／またはそれが発現される細胞の表面に発現しない、実施形態１６８に記載の感染性物質。

１７０．コードされたバリアントＣＤ８０ポリペプチド、免疫調節ポリペプチド、またはコンジュゲートが、それが発現される細胞から分泌される、または分泌されることができる、実施形態１６８または実施形態１６９に記載の感染性物質。

１７１．コードされたバリアントＣＤ８０ポリペプチドが、膜貫通ドメインを含む、実施形態１６８に記載の感染性物質。

１７２．コードされたバリアントＣＤ８０ポリペプチドが、それが発現される細胞の表面に発現する、実施形態１６８または実施形態１７１に記載の感染性物質。

１７３．細菌またはウイルスである、実施形態１６８〜１７２のいずれかに記載の感染性物質。

１７４．ウイルスであり、該ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、実施形態１７３に記載の感染性物質。

１７５．腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、コクサッキーウイルスまたはワクシニアウイルスである、実施形態１７４に記載の感染性物質。

１７６．ウイルスが、樹状細胞（ＤＣ）を特異的に標的とするウイルス、及び／または樹状細胞指向性である、実施形態１７５に記載の感染性物質。

１７７．ウイルスが、改変されたシンドビスウイルスエンベロープ産物でシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターである、実施形態１７６に記載の感染性物質。

１７８．標的細胞の死をもたらす、または免疫応答を増強もしくは強化することができるさらなる遺伝子産物をコードする核酸分子をさらに含む、実施形態１６８〜１７７のいずれかに記載の感染性物質。

１７９．さらなる遺伝子産物が、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、免疫チェックポイント阻害剤、抗体、サイトカイン、成長因子、抗原、細胞傷害性遺伝子産物、プロアポトーシス遺伝子産物、抗アポトーシス遺伝子産物、細胞マトリックス分解性遺伝子、組織再生またはヒト体細胞をリプログラミングして多能性にするための遺伝子から選択される、実施形態１７８に記載の感染性物質。

１８０．実施形態１〜７１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、実施形態７２〜１３３のいずれかに記載の免疫調節タンパク質、実施形態１３４〜１４１のいずれかに記載のコンジュゲート、実施形態１５４〜１６７のいずれかに記載の操作された細胞、または実施形態１６８〜１７９のいずれかに記載の感染性物質を含む、薬学的組成物。

１８１．薬学的に許容し得る賦形剤を含む、実施形態１８０に記載の薬学的組成物。

１８２．薬学的組成物が無菌である、実施形態１７９または１８０に記載の薬学的組成物。

１８３．バイアル内に実施形態１７９〜１８２のいずれかに記載の薬学的組成物を含む製造物品。

１８４．バイアルが密封された、実施形態１８３に記載の製造物品。

１８５．実施形態１７９〜１８２のいずれかに記載の薬学的組成物及び使用説明書を含むキット。

１８６．実施形態１８３及び１８４に従った製造物品及び使用説明書を含むキット。

１８７．実施形態１８０〜１８２のいずれかに記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、対象において免疫応答を調節する方法。

１８８．実施形態７２〜１０１のいずれかに記載の免疫調節タンパク質を投与することを含む、対象において免疫応答を調節する方法。

１８９．免疫応答が増加される、実施形態１８７または１８８に記載の方法。

１９０．免疫調節タンパク質が、Ｆｃ依存性ＣＤ２８共刺激を示す実施形態８８に記載の免疫調節タンパク質である、実施形態１８８または実施形態１８９に記載の方法。

１９１．免疫調節タンパク質が、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激を示す実施形態９８に記載の免疫調節タンパク質であり、任意で該免疫調節タンパク質が、請求項のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む、実施形態１８６〜１８８のいずれかに記載の方法。

１９２．実施形態１５４〜１６７のいずれかに記載の操作された細胞を投与することを含む、対象における免疫応答を調節する方法。

１９３．操作された細胞が、対象に対して自家である、実施形態１９２に記載の方法。

１９４．操作された細胞が、対象に対して同種他家である、実施形態１９２に記載の方法。

１９５．免疫応答を調節することにより、対象の疾患または状態を治療する、実施形態１８７〜１９４のいずれかに記載の方法。

１９６．免疫応答が増加される、実施形態１８７〜１９５のいずれかに記載の方法。

１９７．可溶性であり、任意でＣＤ８０膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを欠くバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質が対象に投与される、実施形態１８７〜１９１、１９５、または１９６のいずれかに記載の方法。

１９８．バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質がＦｃ融合タンパク質である、実施形態１９７に記載の方法。

１９９．実施形態１〜６８及び７１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、または実施形態７２〜１３３のいずれかに記載の免疫調節タンパク質が対象に投与される、実施形態１８７〜１９８のいずれかに記載の方法。

２００．分泌可能なバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む操作された細胞が、対象に投与される、実施形態１９２〜１９６のいずれかに記載の方法。

２０１．実施形態１５４〜１６７のいずれかに記載の操作された細胞が、対象に投与される、実施形態１９２〜１９６及び２００のいずれかに記載の方法。

２０２．分泌可能な免疫調節タンパク質であるバリアントＣＤ８０ポリペプチドをコードする感染性物質が、任意で感染性物質が腫瘍細胞または免疫細胞に感染し、分泌可能な免疫調節タンパク質が感染細胞から分泌される条件下で対象に投与される、実施形態１８７〜１９１、１９５、及び１９６のいずれかに記載の方法。

２０３．疾患または状態が、腫瘍またはがんである、実施形態１８７〜２０２のいずれかに記載の方法。

２０４．疾患または状態が、黒色腫、肺癌、膀胱癌、血液学的悪性疾患、肝臓癌、脳癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、脾臓癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、筋骨格癌、頭頸部癌、消化管癌、生殖細胞癌、または内分泌及び神経内分泌癌から選択される、実施形態１８７〜２０３のいずれか１つに記載の方法。

２０５．免疫応答が減少される、実施形態１８７、１８８、及び１９２〜１９５のいずれかに記載の方法。

２０６．炎症環境の細胞または組織に局在化する部分に連結されたバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む免疫調節タンパク質またはコンジュゲートが対象に投与される、実施形態１８７、１８８、１９２〜１９５、及び２０５のいずれかに記載の方法。

２０７．部分が、抗体またはその抗原結合断片を含む、または野生型ＩｇＳＦドメインまたはそのバリアントを含む第２のポリペプチドを含む、実施形態２０６に記載の方法。

２０８．実施形態７２〜１３３のいずれかに記載の免疫調節タンパク質または実施形態１３４〜１４１のいずれかに記載のコンジュゲートが対象に投与され、任意で該免疫調節タンパク質またはコンジュゲートが、ＣＴＬＡ−４への増加した結合親和性を示すバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む、実施形態１８７〜１９１、１９５、及び２０５〜２０７のいずれかに記載の方法。

２０９．膜貫通ドメインを含むバリアントＣＤ８０ポリペプチドが、対象に投与される、実施形態１８７〜１９５及び２０５のいずれかに記載の方法。

２１０．実施形態１５８〜１６７のいずれかに記載される膜貫通型免疫調節タンパク質であるバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む操作された細胞が、対象に投与される、実施形態１９２〜１９５、２０５、及び２０９のいずれかに記載の方法。

２１１．膜貫通型免疫調節タンパク質であるバリアントＣＤ８０ポリペプチドをコードする感染性物質が、任意で該感染性物質が腫瘍細胞または免疫細胞に感染し、該膜貫通型免疫調節タンパク質が感染細胞の表面に発現する条件下で対象に投与される、実施形態１８７、１９５及び２０５のいずれかに記載の方法。

２１２．疾患または状態が、炎症性または自己免疫性疾患または状態である、実施形態１９５、及び２０５〜２１１のいずれかに記載の方法。

２１３．疾患または状態が、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、血管炎、自己免疫性皮膚疾患、移植、リウマチ性疾患、炎症性消化管疾患、炎症性眼疾患、炎症性神経疾患、炎症性肺疾患、炎症性内分泌疾患、または自己免疫性血液疾患である、実施形態１９５、及び２０５〜２１２のいずれかに記載の方法。

２１４．疾患または状態が、炎症性腸疾患、移植、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬から選択される、実施形態１９５、及び２０５〜２１３のいずれかに記載の方法。

２１５．バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む免疫調節タンパク質を投与することを含む、対象において免疫応答を増加させる方法であって、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該免疫調節タンパク質が、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激を示す、方法。

２１６．該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、実施形態２１５に記載の方法。

２１７．バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む免疫調節タンパク質を投与することを含む、対象においてＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激によりＣＤ２８作動作用を媒介する方法であって、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、方法。

２１８．ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対する増加した親和性が、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、または４５０倍より大きく増加する、実施形態２１６または実施形態２１７に記載の方法。

２１９．疾患または状態の治療に使用するための、実施形態２１５〜２１９のいずれかに記載の方法。

２２０．ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激が、ＰＤ−Ｌ１を発現する抗原提示細胞の存在下でのＴ細胞刺激アッセイにおいて評価され、任意で該Ｔ細胞刺激アッセイがｉｎｖｉｔｒｏアッセイであり、任意で該Ｔ細胞がＩＬ−２レポーターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を含む、実施形態２１７〜２１９のいずれかに記載の方法。

２２１．投与の前に表面ＰＤ−Ｌ１に陽性の細胞を含む腫瘍を有する治療対象を選択し、任意で該細胞が腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞であるか、または
ＰＤ−Ｌ１に陽性の細胞表面を含む腫瘍を有するものとして対象が選択されており、任意で該細胞が腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞である、
実施形態１８７〜２２０のいずれかに記載の方法。

２２２．対象の選択が、
（ａ）対象の腫瘍組織試料をＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに特異的に結合することができる結合試薬と接触させることと、
（ｂ）該腫瘍組織試料の細胞内または細胞上に結合した結合試薬の存在を検出することであって、任意で該細胞が腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞である、検出することと、
（ｃ）腫瘍組織試料が検出可能レベルのＰＤ−Ｌ１に陽性の細胞表面を含む場合に、治療のために対象を選択することと、
を含む、実施形態２２１に記載の方法。

２２３．投与の前に、ＣＤ２８に陽性の細胞表面を含む腫瘍を有する治療対象を選択し、任意で該細胞が腫瘍浸潤リンパ球であり、任意で該リンパ球がＴ細胞、任意でＣＤ８＋Ｔ細胞であるか、または
ＣＤ２８に陽性の細胞表面を含む腫瘍を有するものとして対象が選択されており、任意で該細胞が腫瘍浸潤リンパ球であり、任意で該リンパ球がＴ細胞、任意でＣＤ８＋Ｔ細胞である、
実施形態１８７〜２２２のいずれかに記載の方法。

２２４．対象の選択が、
（ａ）対象の腫瘍組織試料をＣＤ２８のエクトドメインに特異的に結合することができる結合試薬と接触させることと、
（ｂ）該腫瘍組織試料の細胞内または細胞上に結合した結合試薬の存在を検出することであって、任意で該細胞が腫瘍浸潤リンパ球であり、任意で該リンパ球がＴ細胞、任意でＣＤ８＋Ｔ細胞である、検出することと、
（ｃ）腫瘍組織試料が検出可能レベルのＣＤ２８に陽性の細胞表面を含む場合に、治療のために対象を選択することと、
を含む、実施形態２２３に記載の方法。

２２５．（ａ）対象の腫瘍組織試料をＰＤ−Ｌ１に特異的に結合することができる結合試薬と接触させることと、
（ｂ）該腫瘍組織試料の細胞内または細胞上に結合した結合試薬の存在を検出することであって、任意で該細胞が腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞である、検出することと、
（ｃ）腫瘍試料が検出可能レベルのＰＤ−Ｌ１に陽性の細胞表面を含む場合に、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む免疫調節タンパク質による治療のために対象を選択することであって、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、選択することと
を含む、治療対象を選択する方法。

２２６．該腫瘍組織試料をＣＤ２８と特異的に結合することができる結合試薬と接触させることを含み、該対象は、該腫瘍組織試料が検出可能レベルのＣＤ２８に陽性の腫瘍浸潤リンパ球をさらに含む場合に選択され、任意で該リンパ球がＴ細胞、任意でＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態２２５に記載の方法。

２２７．該腫瘍組織試料が、腫瘍浸潤免疫細胞、腫瘍細胞、間質細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２２２及び２２４〜２２６のいずれかに記載の方法。

２２８．該結合試薬が、抗体もしくは抗原結合断片、タンパク質リガンドもしくは結合パートナー、アプタマー、アフィマー、ペプチド、またはハプテンである、実施形態２２２及び２２４〜２２７のいずれかに記載の方法。

２２９．該結合試薬が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合断片である、実施形態２２２、２２４、２２７または２２８に記載の方法。

２３０．該結合試薬が、実施形態１〜７１のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む、実施形態２２２〜２２９のいずれかに記載の方法。

２３１．該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、該ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片を含む、実施形態２３０に記載の方法。

２３２．該ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片が、該結合試薬の唯一のＣＤ８０部分である、実施形態２３０または実施形態２３１に記載の方法。

２３３．該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、該野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較してＰＤ−Ｌ１への結合に対する増加した親和性を示す、実施形態２３０〜２３２のいずれかに記載の方法。

２３４．該結合試薬が、検出可能部分または検出することのできる部分である部分に直接的または間接的に連結される、実施形態２２２及び２２４〜２３３のいずれかに記載の方法。

２３５．該部分がＦｃ領域である、実施形態２３４に記載の方法。

２３６．該Ｆｃ領域が非ヒト、任意でマウスまたはウサギである、実施形態２３５に記載の方法。

２３７．結合した結合試薬の存在の検出が、免疫組織化学、偽免疫組織化学、免疫蛍光、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、または免疫ブロッティングによる、実施形態２２２及び２２４〜２３６のいずれかに記載の方法。

２３８．免疫調節タンパク質を対象に投与することをさらに含む、実施形態２２５〜２３７のいずれかに記載の方法。

２３９．対象がヒト対象である、実施形態１８７〜２３８のいずれかに記載の方法。

２４０．免疫調節タンパク質が、第１の多量体化ドメインに連結された第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２の多量体化ドメインに連結された第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む多量体であり、該第１及び第２の多量体化ドメインが、相互作用して第１及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む多量体を形成する、実施形態２１５〜２３９のいずれかに記載の方法。

２４１．多量体が二量体である、実施形態２４０に記載の方法。

２４２．第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドが同一である、実施形態２４０または実施形態２４１に記載の方法。

２４３．多量体化ドメインが、Ｆｃ領域であるか、またはそれを含む、実施形態２４０〜２４２のいずれかに記載の方法。

２４４．Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントＦｃ領域であり、該Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比較して低下した１つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で該野生型ＦｃがヒトＩｇＧ１である、実施形態２４３に記載の方法。

２４５．ＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた７、１２、１３、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５７、５８、６１、６２、６３、６４、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５，及び／または９７位に対応する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、実施形態２１５〜２４４のいずれかに記載の方法。

２４６．ＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、

の中から選択される、１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該アミノ酸置換の位置（複数可）がＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のＣＤ８０の位置に対応する、実施形態２１５〜２４５のいずれかに記載の方法。

２４７．１つまたは複数のアミノ酸改変が、

の中から選択される、実施形態２１５〜２４５のいずれかに記載の方法。

２４８．バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＣＤ２８への結合を保持する、実施形態２１５〜２４７のいずれかに記載の方法。

２４９．バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＣＤ２８のエクトドメインに対する非改変ＣＤ８０ポリペプチドの結合親和性と比較して、ＣＤ２８のエクトドメインに対する親和性の、少なくとも２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％、または少なくとも約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％もしくは約９５％を保持する、実施形態２４８に記載の方法。

２５０．バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較してＣＤ２８のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、実施形態２１５〜２４９のいずれかに記載の方法。

２５１．ＣＤ２８のエクトドメインに対する増加した親和性が、ＣＤ２８のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、または２００倍より大きく増加する、実施形態２５０に記載の方法。

２５２．免疫応答を増加させることにより、対象の疾患または状態を治療する、実施形態２１９〜２５１のいずれかに記載の方法。

２５３．疾患または状態が、腫瘍またはがんである、実施形態２１９〜２５２のいずれかに記載の方法。

２５４．疾患または状態が、黒色腫、肺癌、膀胱癌、血液学的悪性疾患、肝臓癌、脳癌、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、脾臓癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、筋骨格癌、頭頸部癌、消化管癌、生殖細胞癌、または内分泌及び神経内分泌癌から選択される、実施形態２１９〜２５３のいずれかに記載の方法。

２５５．（ａ）生体試料を請求項１〜７１のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む結合試薬と接触させることと、
（ｂ）生体試料の細胞内または細胞上に結合した結合試薬の存在を検出することと、
を含む、生体試料中のＣＤ８０結合パートナーを検出する方法。

２５６．結合パートナーが、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはこれらの組み合わせである、実施形態２５５に記載の方法。

２５７．バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、該バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較してＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、実施形態２５５または実施形態２５６に記載の方法。

２５８．生体試料が、体液、細胞、もしくは組織試料であるか、またはそれを含む、実施形態２５５〜２５７のいずれかに記載の方法。

２５９．体液が、血清、血漿、または尿である、実施形態２５８に記載の方法。

２６０．組織試料が、腫瘍組織試料である、実施形態２５８に記載の方法。

２６１．腫瘍組織試料が、腫瘍浸潤免疫細胞、腫瘍細胞、間質細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２６０に記載の方法。

２６２．バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片を含む、実施形態２５５〜２６１のいずれかに記載の方法。

２６３．ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片が、結合試薬の唯一のＣＤ８０部分である、実施形態２６２に記載の方法。

２６４．結合試薬が、検出可能部分である標識または検出することのできる部分に直接または間接的に連結される、実施形態２５５〜２６３のいずれかに記載の方法。

２６５．該部分がＦｃ領域である、実施形態２６４に記載の方法。

２６６．該Ｆｃ領域が非ヒト、任意でマウスまたはウサギである、実施形態２６５に記載の方法。

２６７．結合した結合試薬の存在の検出が、免疫組織化学、偽免疫組織化学、免疫蛍光、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、または免疫ブロッティングによる、実施形態２５５〜２６６のいずれかに記載の方法。

ＩＸ．実施例
以下の実施例は、単に例示を目的に含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１
ＩｇＳＦドメインの変異体ＤＮＡ構築物の生成
実施例１は、酵母ディスプレイライブラリーとしての酵母の表面上での翻訳及び発現のための、ヒトＣＤ８０ＩｇＳＦドメインの変異体ＤＮＡ構築物の生成について記載する。

Ａ．縮重ライブラリー
以下の免疫グロブリン様Ｖ型（ＩｇＶ）ドメインを含有する、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３１に記載の野生型ヒトＣＤ８０配列：

に基づいて構築物を生成した。

縮重コドンによる完全または部分的ランダム化の特定の残基を標的とするライブラリーのために、様々なアミノ酸置換をコードする特定の混合塩基セットなどの縮重コドンを、ＵＲＬ：rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/におけるアルゴリズムを使用して生成した。一般的に、変異させる位置はＵＲＬ：rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1I8Lにおける、ＣＴＬＡ４に結合されたＣＤ８０の結晶構造情報から選択し、ターゲットライブラリーを、ＣＴＬＡ４への改善された結合物質を選択するために、ＣＤ８０：：ＣＴＬＡ４界面に基づいて設計した。例えば、構造情報を使用して、縮重コドンを用いた変異誘発の、接触または非接触界面残基を特定した。この分析は、ＵＲＬ：spdbv.vital-it.chで利用可能な構造ビューアを使用して実施した。

ライブラリー設計の次のステップは、変異誘発のために選択した残基のどれが保存された残基であったかを特定するためのヒト、マウス、ラット、及びサルのＣＤ８０配列のアラインメントであった。この分析をふまえると、保存された標的残基は、保存的アミノ酸変化と野生型残基のみを指定した縮重コドンによって変異した。保存されていない残基はより積極的に変異したが、野生型残基も含まれた。標的タンパク質の過剰な変異誘発を避けるために、野生型残基もコードする縮重コドンを配置した。同じ理由で、最大２０位置のみを各ライブラリーの変異誘発の標的とした。変異分析は、リガンド／カウンター構造に向かう側鎖との結合表面の６Å以内にある接触及び非接触界面残基に焦点を当てた。

ターゲットライブラリーをコードするＤＮＡを生成するために、長さが最大８０ヌクレオチドであり、変異誘発の標的となる残基位置に縮重コドンを含有する重複オリゴを、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）から注文した。オリゴヌクレオチドを滅菌水に溶解し、等モル比で混合し、９５℃で５分間加熱し、アニーリングのために室温までゆっくりと冷却した。次にＩｇＶドメイン遺伝子配列の開始及び末端にアニールするＩｇＶドメイン特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ産物を生成した。次に、ｐＢＹＤＳ０３クローニングベクター（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）と、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩクローニングサイト以外及び以内で４０ｂｐ重複するＩｇＶドメイン特異的オリゴヌクレオチドを使用して、前ステップの１００ｎｇのＰＣＲ産物を増幅し、エレクトロポレーション毎に少なくとも合計１２μｇのＤＮＡを産生した。両方のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＯｎｅＴａｑ２ｘＰＣＲマスターミックス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）を使用した。第２のＰＣＲの産物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製し、滅菌脱イオン水に再懸濁した。あるいは、最大２００ｂｐの長さのＵｌｔｒａｍｅｒｓ（登録商標）（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をメガプライマーＰＣＲと併用し（ＵＲＬ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC146891/pdf/253371.pdf）、複数の小さな重複プライマーを使用して容易に組み込むことができなかった縮重コドンの大きなストレッチを生成した。メガプライマーＰＣＲを使用した完全長産物の生成後、酵母への相同組換えのためのｐＢＹＤＳ０３クローニングバリアントとの４０ｂｐ重複領域を含有するＤＮＡプライマーを使用して、変異体ＩｇＶドメインライブラリーを再度ＰＣＲ増幅した。

ライブラリー挿入を準備するために、ｐＢＹＤＳ０３ベクターをＢａｍＨ１及びＫｐｎ１制限酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）で消化し、大きなベクター断片をゲル精製して、滅菌脱イオン水に溶解させた。総量５０μＬの脱イオン水及び滅菌水中で１２μｇのライブラリーＤＮＡインサートと４μｇの線状ベクターを混合することで次ステップのためのエレクトロポレーション可能ＤＮＡを生成した。標的ライブラリーを生成するための別の方法は、縮重コドンを含有するオリゴヌクレオチドを用いて標的ＩｇＶドメインの部位特異的突然変異誘発（Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅｋｉｔ，Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）を行うことであった。このアプローチを使用して、変異誘発のためにＤＮＡのいくつかの特定のストレッチのみを標的とするサブライブラリーを生成した。これらの場合、選択ステップに進む前にサブライブラリーを混合した。一般に、ライブラリーサイズは１０Ｅ７〜１０Ｅ８個のクローンの範囲であったが、ただし、サブライブラリーは１０Ｅ４〜１０Ｅ５の範囲でしかなかった。

Ｂ．ランダムライブラリー
ランダムライブラリーもまた構築して、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３１（ＩｇＶドメインを含有する）に記載のＣＤ８０のＩｇＶドメインのバリアントを特定した。野生型ＣＤ８０ＩｇＶドメインをコードするＤＮＡを、酵母ディスプレイベクターｐＢＹＤＳ０３のＢａｍＨ１とＫｐｎ１部位との間にクローニングし、次いで、同じ制限酵素を使用して切り離した。次に、切り離したＤＮＡをＧｅｎｅｍｏｒｐｈＩＩＫｉｔ（ＡｇｉｌｅｎｔＧｅｎｏｍｉｃｓ、ＵＳＡ）で変異誘発させて、ライブラリーバリアント当たり平均３〜５個のアミノ酸変化を生成した。次いで、変異誘発させたＤＮＡを２ステップＰＣＲによって増幅し、ターゲティングライブラリーについて上記のとおりさらに処理した。

ビーズ及び反復ＦＡＣＳを使用して数回の選択を完了後、クローンのプールを、エラープローンＰＣＲによってさらに変異した。したがって、第２世代の変異体ライブラリーは、テンプレートとして野生型ＩｇＶプラスミド配列ではなくテンプレートとして選択出力ＤＮＡを使用しているが、上記の手順に従って作成した。

実施例２
酵母へのＤＮＡライブラリーの導入
縮重及びランダムＣＤ８０ライブラリーＤＮＡを酵母に導入するために、酵母ＢＪ５４６４株（ＡＴＣＣ．ｏｒｇ；ＡＴＣＣｎｕｍｂｅｒ２０８２８８）のエレクトロポレーションコンピテント細胞を調製し、基本的に記載されるように上記ステップのエレクトロポレーション可能ＤＮＡを用いてＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳＡ）でエレクトロポレーションした（Ｃｏｌｂｙ，Ｄ．Ｗ．ｅｔａｌ．２００４ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ３８８，３４８−３５８）。唯一の例外は、改変プラスミドｐＢＹＤＳ０３によって担持されるＬＥＵ２選択マーカーに対応するために形質転換細胞を非誘導最小選択ＳＣＤ−Ｌｅｕ培地中で成長させたことであった。１リットルのＳＣＤ−Ｌｅｕ培地は、１４．７グラムのクエン酸ナトリウム、４．２９グラムのクエン酸一水和物、２０グラムのデキストロース、６．７グラムの酵母窒素ベース、及び１．６グラムのロイシン不含酵母用合成ドロップアウト培地サプリメントからなる。０．２２μＭの真空濾過装置を使用して、使用前に培地を滅菌濾過した。

ライブラリーサイズは、新たに回収した細胞の希釈物をＳＣＤ−Ｌｅｕ寒天プレート上にプレーティングし、次いで、１プレート当たり少なくとも５０個のコロニーを生成したプレーティング由来の単一コロニーの数からライブラリーサイズを推定することによって決定した。エレクトロポレーションした培養物の残りを飽和まで増殖させ、この培養物に由来する細胞をもう一度同じ培地中で１／１００で継代培養して、非形質転換細胞の割合を最小限に抑え、２つ以上のライブラリーバリアントを含有し得る細胞からプラスミドの分離を可能にした。ライブラリーの多様性を維持するために、計算したライブラリーサイズよりも少なくとも１０×以上の細胞を含有する接種源を使用してこの継代培養ステップを行った。第２の飽和培養物に由来する細胞を、滅菌２５％（重量／体積）グリセロールを含有する新鮮培地に１０Ｅ１０個／ｍｌの密度に再懸濁して、−８０℃で凍結及び保存した（凍結ライブラリーストック）。

実施例３
酵母の選択
実施例３は、ＣＤ８０の親和性改変バリアントを発現する酵母細胞の選択を記載する。ＣＤ８０へのＣＴＬＡ４の結合がＣＤ８０へのＣＤ２８の結合に拮抗することは確立している（ＳｃｈｗａｒｔｚＪ．Ｃ．ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４１０，６０４−０８，２００１）。ＣＤ２８よりもＣＴＬＡ４に選択的に結合するＣＤ８０変異体を特定するため、ＣＤ８０変異体ライブラリーの細胞に、反復回の正及び負のＦＡＣＳソーティングならびに変異誘発を実施した。

推定したライブラリーサイズの少なくとも１０倍に等しい数の細胞を、個々のライブラリーストックから解凍し、非誘導ＳＣＤ−Ｌｅｕ培地中１．０×１０Ｅ６個の細胞／ｍｌに懸濁し、一晩増殖させた。翌日、ライブラリーサイズの１０倍に等しい数の細胞を２０００ＲＰＭで２分間遠心分離し、誘導ＳＣＤＧ−Ｌｅｕ培地中０．５×１０Ｅ６個の細胞／ｍｌに再懸濁した。１リットルのＳＣＤＧ−Ｌｅｕ誘導培地は、水に溶解させて０．２２μｍの膜濾過装置に通して滅菌した、Ｎａ_２ＨＰＯ_４５．４グラム、ＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２０８．５６グラム、ガラクトース２０グラム、デキストロース２．０グラム、酵母窒素ベース６．７グラム、及びロイシン不含酵母用合成ドロップアウト培地サプリメント１．６グラムからなる。培養物を室温で１日誘導培地中で増殖させて、酵母細胞表面でライブラリータンパク質の発現を誘導した。

細胞は、コグネイトリガンドを負荷したプロテインＡ磁気ビーズ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）を使用して２回選別し、非結合物質を減らし、その外因性組換えカウンター構造体タンパク質に結合する能力を有する全てのＣＤ８０バリアントを濃縮した。これに続いて、外因性カウンター構造体タンパク質染色を使用した複数回の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を行って、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）への改善された結合を示す酵母細胞の画分を濃縮した。これらの正の選択を負のＦＡＣＳ選択と交互に行い、ＣＤ２８−Ｆｃに結合したＣＤ８０クローンを除去した。磁気ビーズの濃縮及びフローサイトメトリーによる選択は、基本的にＭｉｌｌｅｒＫ．Ｄ．，ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＣｙｔｏｍｅｔｒｙ４．７．１−４．７．３０，Ｊｕｌｙ２００８に記載されるように実施した。

ＣＤ８０ライブラリーと共に、標的リガンドタンパク質は、以下のとおり使用した：内部産生ヒトｒＣＴＬＡ４−Ｆｃ、ヒトｒＣＤ２８−Ｆｃ、及びヒトｒＰＤ−Ｌ１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）。磁気プロテインＡビーズは、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡから得た。２色フローサイトメトリーソーティングのために、Ｂｉｏ−ＲａｄＳ３ｅｓｏｒｔｅｒを使用した。ＣＤ８０提示レベルを、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）で標識した抗ヘマグルチニン（ＨＡ）抗体でモニタリングした。Ｆｃ融合タンパク質ｒＣＴＬＡ４Ｆｃ、ｒＰＤ−Ｌ１またはｒＣＤ２８Ｆｃのリガンド結合を、ＰＥコンジュゲートヒトＩｇ特異的ヤギＦａｂ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）で検出した。ダブレット酵母を前方散乱（ＦＳＣ）／側方散乱（ＳＳＣ）パラメータを使用して除去し、そしてソートゲートは、ＦＬ１でより限定されたタグ発現結合を保持するＦＬ２で検出されたより高いリガンド結合に基づいた。

フローサイトメトリーソートからの酵母アウトプットを、より高い特異的結合親和性についてアッセイした。ソートアウトプット酵母を増殖及び再誘導して、これらがコードする特定のＩｇＳＦ親和性改変ドメインバリアントを発現させた。次いで、この集団を、フローサイトメトリーによって、親の野生型酵母株、またはビーズアウトプット酵母集団のような任意の他の選択されたアウトプットと比較することができる。

ＣＤ８０について、各集団を抗ＨＡ（ヘマグルチニン）タグ発現及び抗ヒトＦｃ二次で二重染色してリガンド結合を検出することによって、ｒＣＴＬＡ４Ｆｃ、ｒＰＤ−Ｌ１、またはｒＣＤ２８Ｆｃの結合について第２のＦＡＣＳアウトプット（Ｆ２）を親ＣＤ８０酵母と比較した。

選択したバリアントＣＤ８０ＩｇＶドメインをさらに融合タンパク質としてフォーマット化し、以下に記載されるように結合活性及び機能活性について試験した。

実施例４
Ｆｃ融合物として及び様々な免疫調節タンパク質タイプにおける選択アウトプットの再フォーマット化
実施例４は、Ｆｃ分子に融合したＣＤ８０の親和性改変（バリアント）免疫グロブリン様Ｖタイプ（ＩｇＶ）ドメイン（バリアントＩｇＶドメイン−Ｆｃ融合分子）を含有する免疫調節タンパク質として実施例３で同定された選択アウトプットの再フォーマット化を記載する。

最終フローサイトメトリーＣＤ８０ソートからのアウトプット細胞プールをＳＣＤ−Ｌｅｕ培地中末端密度まで増殖させた。各アウトプットからのプラスミドＤＮＡを、酵母プラスミドＤＮＡ単離キット（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を使用して単離した。Ｆｃ融合物について、最適なＦｃ融合ベクターへのクローニングに好適な制限部位を付加したＰＣＲプライマーを使用して、プラスミドＤＮＡプレップから変異体標的ＩｇＶドメインのコーディングＤＮＡをバッチ増幅させた。制限消化後、ＰＣＲ産物を、Ｆｃ融合ベクターにライゲーションし、続いて大腸菌株のＸＬ１Ｂｌｕｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）またはＮＥＢ５ａｌｐｈａ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）に、供給者の指示どおりヒートショック形質転換した。あるいは、アウトプットは、ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙＭａｓｔｅｒｍｉｘ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用してｉｎｖｉｔｒｏ組換えを実施するためにＦｃ融合ベクターといずれかの端に４０塩基対のオーバーラップ領域を含有するプライマーによってＰＣＲ増幅し、その後、大腸菌系統ＮＥＢ５ａｌｐｈａへのヒートショック形質転換に使用した。Ｆｃ融合ベクターの例は、ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＵＳＡ）である。

形質転換反応の希釈物を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ，ＵＳＡ）を含有するＬＢ−寒天上にプレーティングして、選択のために単一コロニーを単離した。次いで、各形質転換からの最大９６個のコロニーを、９６ウェルプレート内、ＬＢ−カルベニシリンブロス（Ｔｅｋｎｏｖａｃａｔ＃Ｌ８１１２）中３７℃で一晩飽和まで増殖させ、そして、全てのクローン中の変異（複数可）を特定するために各ウェルからの小アリコートをＩｇＶドメインインサートのＤＮＡ配列決定に供した。サービス提供会社（Ｇｅｎｅｗｉｚ；ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）によって提供されるプロトコルを使用して、ＤＮＡ配列決定用の試料調製を実施した。ＤＮＡ配列決定用の試料を取り出した後、次いで残りの培養物にグリセロールを最終グリセロール含量２５％まで加え、そして、後で使用するためプレートをマスタープレート（以下参照）として−２０℃で保存した。あるいは、ＤＮＡ配列決定用の試料を、ディスポーザブル９６ウェルレプリケーター（ＶＷＲ，ＵＳＡ）を使用して、増殖させた液体培養物から固体寒天プレートへのレプリカプレーティングによって生成した。これらのプレートを一晩インキュベートして成長パッチを生成し、そして、プレートをＧｅｎｅｗｉｚの指示どおりＧｅｎｅｗｉｚに送った。

Ｇｅｎｅｗｉｚで生成されたＤＮＡ配列決定データの分析からの関心対象のクローンの特定後、関心対象のクローンをマスタープレートから回収し、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ，ＵＳＡ）を含有する液体ＬＢ−ブロス中で密度まで個々に増殖させ、次いで、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＭｉｄｉＰｌｕｓｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）のような標準キットを使用して、各クローンの約１０μｇのプラスミドＤＮＡの調製に培養物を使用した。Ｇｅｎｅｗｉｚ配列決定データからの関心対象のクローンの同定は、一般に以下のステップを包含する。最初に、ＤＮＡ配列データファイルをＧｅｎｅｗｉｚウェブサイトからダウンロードした。次いで、ＩｇＶドメインコード領域の開始点で始まるように全ての配列を手動でキュレーションした。次いで、ＵＲＬ：www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/で利用可能な好適なプログラムを使用して、キュレーションした配列をバッチ翻訳した。次いで、翻訳した配列を、ＵＲＬ：multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.htmlで利用可能な好適なプログラムを使用してアライメントした。あるいは、Ｇｅｎｅｗｉｚで配列決定されたものを、Ｕｇｅｎｅソフトウェア（http://ugene.net）を使用してアライメントを生成するために処理した。

次いで、関心対象のクローンを以下の基準を使用してアラインメントから特定した：１）同一のクローンがアライメント中に少なくとも２回生じる、及び２）変異がアライメント中に少なくとも２回、好ましくは別個のクローンで生じる。これらの基準のうちの少なくとも１つを満たしたクローンは、改善された結合に起因してソーティングプロセスによって濃縮されたクローンとみなした。

少なくとも１つの親和性改変ドメインを有するＣＤ８０のＩｇＶドメインを含有するＦｃ融合タンパク質である組換え免疫調節タンパク質（例えば、バリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ）を生成するために、バリアントをコードするＤＮＡは、以下のタンパク質をコードするために生成した：バリアント（変異体）ＣＤ８０ＩｇＶドメイン、続いて３つのアラニン（ＡＡＡ）のリンカー、続いてＥＵ番号付けによる変異Ｃ２２０Ｓ、Ｒ２９２Ｃ、Ｎ２９７Ｇ及びＶ３０２Ｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７に記載の野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃを基準としたＣ５Ｓ、Ｒ７７Ｃ、Ｎ８２Ｇ及びＶ８７Ｃに対応）を含有するＳＥＱＩＤＮＯ：１７１３、またはＥＵ番号付けによる変異Ｃ２２０Ｓ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ及びＧ２３７Ａを含有するＳＥＱＩＤＮＯ：１７１４に記載のエフェクター機能を欠く不活性Ｆｃ。あるいは、ＣＤ８０ＩｇＶドメインは類似の様式で融合されたが、アミノ酸（ＧＳＧＧＧＧＳ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１６）を含有するリンカー、続いてＳＥＱＩＤＮＯ：１７１４に記載のエフェクター機能を欠く不活性Ｆｃと融合した。場合によっては、ＣＤ８０ＩｇＶドメインは類似の様式で融合されたが、エフェクター活性が可能なヒトＩｇＧ１Ｆｃ（エフェクター）と融合した。該構築物はシステインと共有結合を形成できる抗体軽鎖を含まないため、そのような例示的なヒトＩｇＧ１Ｆｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２９に記載）は、ＥＵ番号付けによる２２０位のシステイン残基のセリン残基への置換（Ｃ２２０Ｓ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７７に記載の野生型または非改変Ｆｃを基準とした５位（Ｃ５Ｓ）に対応）を含有した。

実施例５
Ｆｃ融合物の発現及び精製
実施例５は、上記実施例に記載されるようなバリアントＩｇＶＣＤ８０を含有するＦｃ融合タンパク質のハイスループット発現及び精製を記載する。

組換えバリアントＦｃ融合タンパク質をＥｘｐｉ２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して浮遊適応化（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ａｄａｐｔｅｄ）ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞から産生した。先のステップからの各プラスミドＤＮＡ４μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）２００μｌに加え、同時にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ１０．８μｌを別のＯｐｔｉ−ＭＥＭ２００μｌに別々に加えた。５分後、プラスミドＤＮＡ２００μｌをＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２００μｌと混合し、この混合物を細胞に加える前に追加で２０分間さらにインキュベートした。１０００万個のＥｘｐｉ２９３細胞を、１０ｍｌの滅菌円錐底ディープ２４ウェル増殖プレート（ＴｈｏｍｓｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）の別々のウェルのＥｘｐｉ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）容量４ｍｌ中に分注した。プレートを、湿度９５％及び８％ＣＯ_２に設定された哺乳動物細胞培養インキュベーター内で１２０ＲＰＭで５日間振盪した。５日間のインキュベーション後、細胞はペレット化し、培養上清は保持した。

ハイスループット９６ウェルフィルタープレート（ＴｈｏｍｓｏｎＣａｔａｌｏｇｎｕｍｂｅｒ９３１９１９）を使用して（各ウェルには６０μＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ沈降ビーズ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅｃａｔ．ｎｏ．１７５４３８０１）を負荷した）上清からタンパク質を精製した。タンパク質は４つの連続した２００μｌ画分の５０ｍＭの酢酸ｐＨ３．３で溶出した。各画分のｐＨは、４μＬの２μＭＴｒｉｓｐＨ８．０でｐＨ５．０を上回るように調節した。画分をプールし、Ｎａｎｏｄｒｏｐ機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）によって測定した２８０ｎｍの吸光度を使用して定量し、Ｍｉｎｉ−ＰｒｏｔｅａｎＴＧＸＳｔａｉｎ−Ｆｒｅｅゲルに５μｇの非還元タンパク質を負荷することによりタンパク質純度を評価した。次いで、タンパク質をＢｉｏＲａｄＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳゲルイメージャーで視覚化した。

実施例６
親和性成熟ＩｇＳＦドメイン含有分子の結合の評価
この実施例は、細胞発現ＣＴＬＡ４、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＤ２８カウンター構造体への上記の実施例の精製タンパク質のＦｃ融合結合試験を記載し、ＣＤ８０ドメインバリアント免疫調節タンパク質の特異性及び親和性を評価する。ヒトＣＴＬＡ４、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＤ２８のそれぞれの完全長哺乳動物表面発現構築物は、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で設計され、これはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＵＳＡから供給された。結合試験は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ一過性トランスフェクションシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を使用して、完全長哺乳動物表面リガンドを発現するために生成されたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞で実施した。対照として、モック（非トランスフェクト）細胞への結合も評価した。実験に必要な細胞数を決定し、そして製造業者の推奨プロトコルを使用して、適切な３０ｍｌスケールのトランスフェクションを実施した。ＣＴＬＡ４、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８またはモックの３０ｍｌトランスフェクション毎に、７５００万個のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を発現構築物ＤＮＡ３０μｇ及び希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３試薬１．５ｍｌと４８時間インキュベートし、その時点で染色用に細胞を採取した。

染色及びフローサイトメトリーによる分析のために、適切な一過性トランスフェクションまたは陰性対照（モック）の１００，０００個の細胞を９６ウェル丸底プレート中にプレーティングした。細胞をスピンダウンし、染色緩衝液（ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、及び０．１％アジ化ナトリウム）中に２０分間再懸濁して非特異的結合を遮断した。その後、細胞を遠心分離し、これを５０μｌの各候補バリアントＣＤ８０Ｆｃタンパク質の実験に応じて、２００ｎＭ〜９１ｐＭの各候補バリアントＣＤ８０Ｆｃを含有する染色緩衝液に再懸濁した。対照として、野生型ＣＤ８０−ＥＣＤ−Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、野生型ＣＤ８０−ＥＣＤ−Ｆｃ（不活性）、野生型ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）及び／またはヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）の結合活性も評価した。一次染色を氷上で４５分間実施した後、染色緩衝液中で細胞を２回洗浄した。ＰＥコンジュゲート抗ヒトＦｃ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を染色緩衝液５０μｌ中１：１５０に希釈し、細胞に加えて氷上でさらに３０分間インキュベートした。二次抗体を２回洗い流し、細胞を４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し、そして、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔフローサイトメーター（ＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔＣｏｒｐ，ＵＳＡ）で試料を分析した。トランスフェクタント及びモックトランスフェクトＨＥＫ２９３毎に、ＦｌｏｗＪｏＶｅｒｓｉｏｎ１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏＬＬＣ，ＵＳＡ）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。

例示的なＣＤ８０バリアントの２つの結合試験の結果を表１０及び１１に示す。当該表において、例示的なアミノ酸置換は、それぞれの参照非改変ＥＣＤ配列の番号付けに対応するアミノ酸位置番号によって指定される。例えば、参照非改変ＥＣＤ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の非改変ＣＤ８０ＥＣＤ配列である。アミノ酸位置が中央に示され、対応する非改変（例えば、野生型）アミノ酸が番号の前に列挙され、特定されたバリアントのアミノ酸置換が番号の後に列挙される。２列目は、各バリアントＩｇＶ−Ｆｃ融合分子のバリアントＩｇＶの配列番号識別子を記載する。

また、明記したコグネイトカウンター構造体リガンド（すなわち、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１またはＣＤ２８）を発現するように操作された細胞への各バリアントＣＤ８０Ｆｃ融合分子の結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値によって測定した結合活性、及び同じ細胞発現カウンター構造体リガンドへのアミノ酸置換を含有しない対応する非改変ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ融合分子の結合と比較したバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−ＦｃのＭＦＩ比も示した。バリアントＣＤ８０ＩｇＶ−ＦｃのＣＤ２８カウンター構造体リガンドへの結合と比較したバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−ＦｃのＣＴＬＡ−４カウンター構造体リガンドへの結合との比率もまた、表の最後の列に示されている。

表１０及び１１に示すように、選択によりＣＴＬＡ−４及び／またはＰＤ−Ｌ１カウンター構造体リガンドに対して結合の増加を示すように親和性改変された多くのＣＤ８０ＩｇＶドメインバリアントを特定した。加えて、この結果は、ＣＤ２８カウンター構造体リガンドと比較してＣＴＬＡ−４カウンター構造体リガンドへの結合（ＣＴＬＡ４：ＣＤ２８の比率）の増加を示すいくつかのＣＤ８０ＩｇＶドメインバリアントを含むＣＤ２８への結合の低下を示す多くのバリアントが選択されたことを示す。

（表１０）ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＰＤ−Ｌ１でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞へのバリアントＣＤ８０の結合

（表１１）ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＰＤ−Ｌ１でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞へのバリアントＣＤ８０の結合

実施例７
追加のバリアントＣＤ８０ＩｇＶドメインの選択と結合活性の評価
カウンター構造体ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、及びＰＤＬ１とのＣＤ８０ＩｇＶバリアント相互作用の親和性及び機能的効力を改善するため、第２及び第３世代（Ｇｅｎ）のランダム変異誘発及び選択を実施例１〜３に実質的に記載された手順を使用して実行した。簡潔に述べると、酵母プラスミドＤＮＡをＦＡＣＳ選択後の成長した酵母から単離し、変異誘発性ＰＣＲのテンプレートとして使用した。多様性を最大化するために、特性決定された個々のバリアント及びＦＡＣＳ選択されたバリアントのプールの両方をテンプレートとして使用した。得られたライブラリーは、反復回のＦＡＣＳ選択及び成長に供した。ＣＤ２８親和性を維持しながらＰＤＬ１の親和性を増加させるため、複数のＦＡＳＣソート進行経路を取った。アウトプットを生成するＣＤ２８−及びＣＴＬＡ４＋の選択を交互にする４つのＦＡＣＳ選択を行った第２世代の変異誘発性ライブラリーは、カウンター構造体に対して滴定すると、Ｆｃベクターに再フォーマット化するように選択した。次のＦＡＣＳ選択経路を使用して酵母アウトプットをもたらした第３世代の変異誘発性ライブラリーは、カウンター構造体に対して滴定すると、Ｆｃベクターに再フォーマット化するように選択した：１．５０ｎＭＰＤＬ１＋、２ａ．１ｎＭＣＴＬＡ４＋、２ｂ．２０ｎＭＣＴＬＡ４−、２ａ３．１０ｎＭＰＤＬ１＋、２ｂ３．１０ｎＭＰＤＬ１＋、２ｂ３４．２５ｎＭＣＤ２８＋。ＣＤ８０の親和性改変バリアントを発現する酵母の選択後、選択したバリアントをＩｇＶＣＤ８０バリアントを含有する追加のＦｃ融合タンパク質を生成するためのＦｃ融合として再フォーマット化した。配列分析後、タンパク質の産生、結合、及び機能的アッセイのために、個々のバリアントを選択した。第１世代の変異誘発のバリアントを表１０に示し、第２世代を表１１に示し、第３世代を表１２及び１３に示す。

選択した免疫調節融合タンパク質の、コグネイト結合パートナーへの結合を評価した。ＣＤ８０コグネイト結合パートナーを発現する細胞の産生のため、ｈｕＣＴＬＡ４及びｈｕＰＤ−Ｌ１、完全長哺乳動物表面発現構築物を生成し、レンチウイルスに組み込み、ＣＨＯ細胞に形質導入した。Ｂｉｏ−ＲａｄＳ３細胞ソーター（Ｂｉｏ−ＲａｄＣｏｒｐ．，ＵＳＡ）で、９８％超の純度まで細胞を選別した。ＣＤ２８を内因的に発現するＪｕｒｋａｔ／ＩＬ２レポーター細胞を使用してＣＤ２８への結合を検出した。

フローサイトメトリーによる染色及び分析のため、適切なトランスフェクト細胞の１００，０００個の細胞を９６ウェル丸底プレート中にプレーティングした。細胞をスピンダウンし、染色緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び０．１％アジ化ナトリウム）中に２０分間再懸濁して非特異的結合を遮断した。その後、細胞を遠心分離し、５０μｌの各候補バリアントＣＤ８０−Ｆｃタンパク質の６点連続希釈物（１００ｎＭ〜４１ｐＭの範囲の濃度）を含有する染色緩衝液に再懸濁した。一次染色を氷上で４５分間実施した後、染色緩衝液中で細胞を２回洗浄した。フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ヒトＦｃ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を１：１５０に希釈し、細胞に加えて氷上でさらに３０分間インキュベートした。次に、細胞を１５０μＬ／ウェルの染色緩衝液で２回洗浄し、２％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、そしてＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔフローサイトメーター（ＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔＣｏｒｐ．，ＵＳＡ）で分析した。ＰＥ平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦｌｏｗＪｏＶｅｒｓｉｏｎ１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏＬＬＣ，ＵＳＡ）で各細胞タイプについて計算した。

例示的なＣＤ８０バリアントの２つの結合研究の結果を表１２及び１３に示す。当該表において、例示的なアミノ酸置換が、それぞれの参照非改変ＩｇＶ配列の番号付けに対応するアミノ酸位置番号によって指定される。例えば、参照非改変ＥＣＤ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の非改変ＣＤ８０ＥＣＤ配列である。アミノ酸位置が中央に示され、対応する非改変（例えば、野生型）アミノ酸が番号の前に列挙され、特定されたバリアントのアミノ酸置換が番号の後に列挙される。２列目は、各バリアントＩｇＶ−Ｆｃ融合分子のバリアントＩｇＶの配列番号識別子を示す。

また、明記したコグネイトカウンター構造体リガンド（すなわち、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１またはＣＤ２８）を発現するように操作された細胞への３３ｎＭの各バリアントＣＤ８０Ｆｃ融合分子の結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値によって測定した結合活性、及び同じ細胞発現カウンター構造体リガンドへのアミノ酸置換を含有しない非改変ＣＤ８０−ＥＣＤ−Ｆｃ融合分子（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）の結合と比較したバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−ＦｃのＭＦＩ比も示した。バリアントＣＤ８０ＩｇＶ−ＦｃのＣＤ２８カウンター構造体リガンドへの結合と比較したバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−ＦｃのＰＤ−Ｌ１カウンター構造体リガンドへの結合との比率もまた、表の最後の列に示されている。

示すように、選択によりＰＤ−Ｌ１及び／またはＣＤ２８カウンター構造体に対して結合の増加を示すように親和性改変されたいくつかのＣＤ８０ＩｇＶドメインバリアントを特定した。いくつかのバリアントがまたＣＴＬＡ−４への結合を維持または増加させる一方で、他のものはＣＴＬＡ−４への減少した結合を示した。加えて、この結果は、ＣＤ２８カウンター構造体リガンドと比較してＰＤ−Ｌ１カウンター構造体リガンドへの結合（ＰＤ−Ｌ１：ＣＤ２８の比率）の増加を示すいくつかのＣＤ８０ＩｇＶドメインバリアントを含むＣＤ２８への結合の低下を示す多くのバリアントが選択されたことを示す。したがって、バリアントは、フローサイトメトリーにより測定された細胞表面ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、及びＰＤ−Ｌ１の結合に固有のプロファイルを有する。

（表１２）ＣＴＬＡ４またはＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２８）及びＣＨＯ細胞へのバリアントＣＤ８０フロー結合

（表１３）ＣＴＬＡ４またはＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２８）及びＣＨＯ細胞へのバリアントＣＤ８０フロー結合

結合をさらに比較するため、様々な濃度の例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子を評価し、細胞表面発現ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４に対する結合について野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃと比較した。例示的な試験したバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃには以下が含まれた：

上記のように、ＣＤ２８への結合はＣＤ２８を発現するＪｕｒｋａｔ／ＩＬ２レポーター細胞を使用して評価し、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１への結合はｈｕＣＴＬＡ−４またはｈｕＰＤ−Ｌ１を発現するように安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を使用して評価した。明記したトランスフェクタントまたは細胞株がプレーティングされ、滴定量のＣＤ８０ｖＩｇＤ−Ｆｃまたは野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃで染色した。結合タンパク質は、蛍光色素コンジュゲート抗ｈｕＦｃ、及びフローサイトメトリーにより測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）で検出した。図９Ａにて示すように、いくつかの試験したＣＤ８０ｖＩｇＤ−Ｆｃは、野生型ＣＤ８０よりも高い親和性でヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＣＴＬＡ−４、及びヒトＣＤ２８に結合した。

実施例８
Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ２レポーターアッセイを用いた親和性成熟ＣＤ８０ＩｇＳＦドメイン含有分子の生理活性の評価
この実施例は、ＣＤ２８共刺激の遮断に対するＣＤ８０ドメインバリアント免疫調節タンパク質の生理活性を評価するためのＪｕｒｋａｔ／ＩＬ２レポーターアッセイを記載する。

アッセイの前日、アッセイプレートを調製した。アッセイプレートを調製するため、ＰＢＳ中の、１０ｎＭの抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，カタログ番号３１７３１５）及び２０ｎＭのＣＤ８６−Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号１４１−Ｂ２）を１００μＬ／ウェルで白い平底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に分取した。プレートを４℃で一晩インキュベートして、抗体及びＣＤ８６−Ｆｃタンパク質をプレートの表面に付着させた。翌日、アッセイプレートのウェルを、アッセイの前に１５０μＬのＰＢＳで２回洗浄した。

アッセイの日、６０μＬの例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ融合分子及び対照、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃまたは野生型ＣＤ８０（ＥＣＤ）−Ｆｃ、分子、または陰性対照Ｆｃ単独は、アッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））または緩衝液のみで４０ｎＭの濃度に希釈し、新鮮な９６ウェルポリプロピレンプレートのウェルに加えた。ＩＬ−２−ルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞をカウントし、アッセイ緩衝液に再懸濁して、２ｘ１０^６細胞／ｍＬの濃度にした。次に、Ｊｕｒｋａｔ細胞懸濁液６０μＬをＣＤ８０−Ｆｃ融合分子または対照を含有するウェルに加えた。該細胞及びＣＤ８０タンパク質を室温で１５分間インキュベートし、次いで、調製した抗ＣＤ３／ＣＤ８６−Ｆｃアッセイプレートのウェル毎に細胞／ＣＤ８０タンパク質混合物１００μＬを移した。

アッセイプレートを短時間スピンダウンし（１２００ＲＰＭで１０秒）、３７℃で５時間インキュベートした。５時間のインキュベーション後、プレートを取り外し、室温で１５分間平衡化した。１００μＬのＢｉｏ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をアッセイプレートのウェル毎に追加し、次いで、１０分間オービタルシェーカーに置いた。ＢｉｏＴｅｋＣｙｔａｔｉｏｎ３ルミノメーターを使用して、積分時間１秒／ウェルで発光を測定した。

各バリアントＣＤ８０ＩｇＶＦｃについて平均相対発光値を決定し、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃタンパク質と比較して各バリアントについてＩＬ−２レポーターシグナルの倍率増加を計算した。結果は以下の表１４に提供する。

表１４に示すように、例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子のほとんどは、ＩＬ−２−ルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞と共培養すると、緩衝液のみまたはＦｃのみの陰性対照と比較してＣＤ２８共刺激が減少した（すなわち、遮断）。対照的に、バリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子のいくつかは、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子と比較してＣＤ２８共刺激シグナルを増加させるようであり、作動活性の可能性を示唆した。

（表１４）Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ２レポーターアッセイ：ＣＤ２８共刺激の遮断

実施例９
Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ２レポーターアッセイを用いた、ＰＤ−Ｌ１の存在下及び非存在下での親和性成熟ＣＤ８０ＩｇＳＦドメイン含有分子の生理活性の評価
この実施例は、不活性Ｆｃ分子（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１４）またはエフェクター活性を媒介することができるＦｃ分子（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２９）のいずれかに融合し、ＰＤ−Ｌ１発現抗原提示細胞の存在下または非存在下でＣＤ２８共刺激シグナルを調節するＣＤ８０ドメインバリアント免疫調節タンパク質の能力を評価するＪｕｒｋａｔ／ＩＬ２レポーターアッセイを記載する。

Ａ．ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激
ＩＬ−２−ルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，ＵＳＡから購入）をＪｕｒｋａｔアッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ）に２ｘ１０^６細胞／ｍＬで懸濁した。次にＪｕｒｋａｔ細胞を５０μＬ／ウェルで、ウェル当たり合計１００，０００細胞をプレーティングした。

各ウェルに、２５μＬの試験タンパク質をＪｕｒｋａｔ細胞に加えた。試験タンパク質には、バリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）融合分子または完全ＣＤ８０−ＥＣＤ−Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）または野生型ＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）が含まれた。全てのタンパク質を、２００ｎＭ、６６．７ｎＭ、及び２２．２ｎＭ（ＰＤ−Ｌ１なし）または２００ｎＭ、６６．７ｎＭ、２２．２ｎＭ、７．４ｎＭ、及び２．５ｎＭ（＋ＰＤ−Ｌ１）で加えた。試験タンパク質または対照タンパク質とＪｕｒｋａｔ細胞を室温で１５分間インキュベートした。形質導入細胞表面抗ＣＤ３単鎖Ｆｖ（ＯＫＴ３）（すなわちＰＤ−Ｌ１なし）またはＯＫＴ３及びＰＤ−Ｌ１（すなわち＋ＰＤ−Ｌ１）を提示するＣＨＯ由来人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を０．８ｘ１０^６細胞／ｍＬにし、２５μＬの細胞を各ウェルに加え、各ウェルの最終容量を１００μＬにした。各ウェルの最終比は５：１Ｊｕｒｋａｔ：ＣＨＯ細胞であり、試験タンパク質濃度は５０、１６．７または５．６ｎＭ（ＰＤ−Ｌ１なし）、または５０、１６．７、５．６、１．９、及び０．６ｎＭ（＋ＰＤ−Ｌ１）であった。Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＣＨＯ細胞を、加湿した５％ＣＯ_２インキュベーションチャンバーで、摂氏３７度で５時間インキュベートした。次に、プレートをインキュベーターから取り出し、１５分間室温に順応させた。１００μＬの細胞溶解及びルシフェラーゼ基質溶液（ＢｉｏＧｌｏルシフェラーゼ試薬，Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加え、プレートをオービタルシェーカーで１０分間インキュベートした。ＢｉｏＴｅｋＣｙｔａｔｉｏｎルミノメーターを使用して、積分時間１秒／ウェルで発光を測定し、各試験試料について相対発光値（ＲＬＵ）を決定した。結果を表１５に提供する。

ａＡＰＣにＰＤ−Ｌ１が存在しない場合、不活性Ｆｃに融合したバリアントＣＤ８０分子はＣＤ２８を介して共刺激シグナルを誘導できないという観察と一致して、共刺激シグナルはほとんどまたは全く観察されなかった。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１の存在下では、試験したいくつかのバリアントＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）分子は、バリアント分子のＣＤ２８及び／またはＰＤ−Ｌ１結合親和性と相関した濃度依存性のＣＤ２８共刺激を示した。この結果は、ＰＤ−Ｌ１に対する親和性が増加したバリアントＣＤ８０分子がＣＤ２８のＰＤ−Ｌ１依存性共刺激を媒介できることを示している。

（表１５）ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激

さらなる実験において、他のバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）融合タンパク質を、各試験タンパク質の最終濃度が５０ｎＭ及び５ｎＭであるのを除いて上記のようにａＡＰＣ＋／−ＰＤ−Ｌ１の非存在下でＣＤ２８刺激について試験した。各試験試料について相対発光値（ＲＬＵ）を決定し、各バリアントＣＤ８０−ＩｇＶ分子についてＩＬ−２レポーターシグナルの倍率増加（または減少）を計算し、野生型ＣＤ８０−ＥＣＤ−Ｆｃ（不活性）及びＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）タンパク質と比較した。

表１６及び１７に示すように、Ｋ５６２／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１ａＡＰＣ及び５０ｎＭのＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）分子と共培養したＪｕｒｋａｔエフェクター細胞のルシフェラーゼ活性は、試験したいくつかの分子で変化（増加または減少）した。ａＡＰＣ上のＰＤ−Ｌ１及びＪｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ２８の同時結合により、ＣＤ２８共刺激及び下流のＩＬ−２シグナル伝達が増加した。野生型ＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）と比べて発光の倍率増加（または減少）も示されている。当該表において、最初の列は変異（複数可）を記載し、第２の列は、試験したＣＤ８０−ＩｇＶＦｃ（不活性）バリアントの各ＣＤ８０−ＩｇＶの配列番号識別子を記載する。

（表１６）Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ２＋Ｋ５６２／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位(RLU)

（表１７）Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ２＋Ｋ５６２／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位(RLU)

活性をさらに比較するため、上記のＫ５６２／ＯＫＴ３／ＰＤＬ１ａＡＰＣ細胞株を使用して様々な濃度の例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）をＪｕｒｋａｔ／ＩＬ２レポーター細胞におけるルシフェラーゼ活性の誘導について評価し、活性を野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）と比較した。試験した例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ分子は、

を含有した。図９Ｂにて示すように、例示的な試験したバリアントＣＤ８０ＩｇＶドメイン含有分子は、用量依存的にＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激を誘導した。評価した濃度のいずれかにおいても、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−ＦｃによるＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激は観察されなかった。

Ｂ．ＰＤ−Ｌ１依存性共刺激後のサイトカイン産生
上記のＫ５６２／ＯＫＴ３／ＰＤＬ１ａＡＰＣ細胞をマイトマイシンｃで処置し、滴定した漸増濃度のＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）または野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）の存在下で初代ヒトｐａｎＴ細胞と共培養した。試験した例示的なバリアントＣＤ８０−Ｆｃは、

を含有した。さらなる対照として、初代ヒトｐａｎＴ細胞もまた、例示的な抗ＰＤ−Ｌ１デュルバルマブまたはＦｃ（不活性）のみ対照とともに培養した。図９Ｃに記載の結果は、試験したバリアントＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ分子が、培養上清中にＩＬ−２分泌をもたらしたことを示し、これは試験した例示的なバリアントＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ分子によってＰＤ−Ｌ１依存性共刺激が誘導されたという観察と一致する。野生型ＣＤ８０−ＩｇＶＦｃまたは他の試験対照とインキュベートした場合、Ｔ細胞培養物ではＩＬ−２産生は観察されなかった。

Ｃ．Ｆｃ依存性ＣＤ２８共刺激＋／−ＰＤ−Ｌ１
さらなる実験において、バリアントＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ融合タンパク質（そのＦｃはＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合を介してエフェクター活性を媒介できるＩｇＧ１Ｆｃ（例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１４２９）であった）についてＣＤ２８共刺激を評価した。実験は上記のパートＡで説明したように実施したが、ただしＣＨＯ／ＯＫＴ３及びＣＨＯ／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１細胞の代わりにＯＫＴ３（Ｋ５６２／ＯＫＴ３）またはＯＫＴ３及びＰＤ−Ｌ１（Ｋ５６２／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１）で安定的に形質導入したＣＤ３２発現Ｋ５６２細胞を使用した。その結果を表１８に示す。

（表１８）Ｆｃ受容体またはＰＤ−Ｌ１依存性架橋を介したＣＤ２８共刺激

Ｅ３５Ｄ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４３Ｌ／Ｌ７０Ｍ、及びＡ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｌ８５Ｑを含む、例示的な評価したバリアントＣＤ８０−ＩｇＶＦｃ（エフェクター）免疫調節タンパク質のいくつかは、ＦｃＲへの結合により架橋された場合、ＣＤ２８共刺激をもたらさなかった。しかしながら、結果は、ＦｃＲ（エフェクター）に結合可能なＦｃを有するいくつかの例示的な評価したバリアントは、ＦｃＲ架橋によってトランスでのＣＤ２８共刺激を提供できることを示した。これらのうち、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉなどの例示的な評価したＣＤ８０−ＩｇＶＦｃ（エフェクター）免疫調節タンパク質のいくつかは、ＰＤ−Ｌ１とＦｃＲの両方の架橋を介してＣＤ２８共刺激を増強した。場合によっては、この結果は、ＦｃＲとＰＤ−Ｌ１の架橋によるＣＤ２８共刺激の増強が、ＰＤ−Ｌ１単独の架橋よりも強力であることを示した。

実施例１０
Ｔ細胞刺激アッセイを用いた親和性成熟ＣＤ８０ＩｇＳＦドメイン含有分子の生理活性の評価
不活性ＦｃまたはエフェクターＦｃのいずれかを含有するＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ分子を、サイトカイン放出（ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２）及びＴ細胞増殖により決定した、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）Ｋ５６２／ＯＫＴ３＋／−ＰＤ−Ｌ１の存在下でのＴ細胞を刺激するそれらの能力について、１ｎＭ、１０ｎＭ及び１００ｎＭの３つの濃度で試験した。

１００，０００個の単離したＰａｎＴ細胞を、８，０００個のＫ５６２／ＯＫＴ３またはＫ５６２／ＯＴＫ３／ＰＤ−Ｌ１細胞（１２．５：１の比率）及び１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭのＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ（エフェクター）またはＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）とインキュベートした。細胞混合物はまた、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、野生型ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ（不活性）、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（エフェクター）、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）、野生型ＣＤ８０ＥＣＤ−Ｆｃ（不活性）、野生型ＣＤ８０ＥＣＤ−Ｆｃ（エフェクター）、または対照として処理なし、とインキュベートした。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及び増殖は７２時間のインキュベーション後に測定した。

ＩＬ−２放出の結果を表１９に記載する。最初の実験では、ある特定の例示的な評価したバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（エフェクター）分子の存在下でのＴ細胞及びＫ５６２／ＯＫＴ３ａＡＰＣ（ＰＤ−Ｌ１を発現しない）の共培養がＩＬ−２産生の増加をもたらした。第２の実験では、Ｔ細胞とＫ５６２／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１ａＡＰＣの共培養時に、特定のバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）分子の存在下でＣＤ２８共刺激が増加し、これは、これらのバリアントのＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激活性と一致した。ＰＤ−Ｌ１にほとんど結合しないＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子（すなわち、Ｅ３５Ｇ／Ｋ５４Ｅ／Ａ７１Ｄ／Ｌ７２Ｐ）は、有意な共刺激及びＩＬ−２産生をもたらさなかった。場合によっては、Ｅ３５Ｄのような、ある特定のバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（エフェクター）分子は、ＰＤ−Ｌ１発現ａＡＰＣの存在下でのみＣＤ２８共刺激をもたらすことができた。ＩＦＮ−γ及び増殖の結果は、ＩＬ−２の放出で観察された結果と同様だった。

（表１９）ＣＤ８０−ＩｇＣ−Ｆｃ分子のＦｃ受容体またはＰＤ−Ｌ１媒介性架橋を介した初代Ｔ細胞ＣＤ２８共刺激

実施例１１
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用またはＰＤ−Ｌ１依存性共刺激を遮断するバリアントＣＤ８０ポリペプチドの評価
Ａ．ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１結合及び遮断
ＰＤ−Ｌ１発現細胞への選択された免疫調節融合タンパク質の結合を評価して、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用の遮断について試験した。ＣＨＯ／ＰＤ−Ｌ１細胞をバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃドメイン含有分子の滴定によって染色し、洗浄し、次いで蛍光コンジュゲートＰＤ−１−Ｆｃとインキュベートした。試験した例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶドメイン含有分子は、

を含有した。対照として、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃもまた評価した。試料をフローサイトメーターで取り込み、蛍光標識ＰＤ−１のＭＦＩをＦｌｏｗｊｏソフトウェア分析によって決定した。図９Ｄにて示すように、試験した例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を拮抗またはこれを遮断することが示された。

Ｂ．活性
例示的なバリアントＣＤ８０−Ｆｃポリペプチドを、上記のＰＤ−１を発現するＪｕｒｋａｔ／ＩＬ−２レポーター細胞を使用してそれらのＰＤ−Ｌ１依存性共刺激を送達する能力について評価した。Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ−２レポーター細胞を、上記のＫ５６２／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と、滴定量（４０ｐＭ〜１００ｎＭの範囲）の例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃポリペプチドの存在下でインキュベートした。例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃポリペプチドには、例示的なＦｃ（ＥＵ番号付けによるＣ２２０Ｓ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１４）に融合した、

のいずれかのバリアントＩｇＶを含有する分子がある。他の試験したバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃポリペプチドは、野生型ＩｇＧ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２９）に融合したＥ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｌ７０Ｍ，ＳＥＱＩＤＮＯ：１９９；またはＥ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ，ＳＥＱＩＤＮＯ：２０８）のいずれかのバリアントＩｇＶを含有した。対照として、ＰＤ−Ｌ１発現細胞はまた、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３１）または抗ＰＤＬ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＵＳＡ）とインキュベートした。

Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ−２／ＰＤ−１レポーター細胞を、Ｊｕｒｋａｔアッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ）にウェル当たり１００，０００個の細胞をプレーティングした。次いで、Ｊｕｒｋａｔ細胞を室温で１５分間、試験または対照タンパク質とともにインキュベートした。次いで、Ｋ５６２／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１細胞を加えて、各ウェルが最終比５：１のＪｕｒｋａｔ：Ｋ５６２細胞になるようにした。Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、及び試験または対照タンパク質を、加湿した５％ＣＯ_２インキュベーションチャンバーで、摂氏３７度で５時間インキュベートした。次に、プレートをインキュベーターから取り出し、１５分間室温に順応させた。１００μＬの細胞溶解及びルシフェラーゼ基質溶液（ＢｉｏＧｌｏルシフェラーゼ試薬，Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加え、プレートをオービタルシェーカーで１０分間インキュベートした。ＢｉｏＴｅｋＣｙｔａｔｉｏｎルミノメーターを使用して、積分時間１秒／ウェルで発光を測定し、各試験試料について相対発光値（ＲＬＵ）の倍率増加を決定した。

図９Ｅにて示すように、例示的な評価したバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃの追加によりＴＣＲ活性化のＰＤ−Ｌ１媒介性抑制を遮断し、及び／またはＣＤ２８を作動させ、発光の増加をもたらした。ＰＤ−Ｌ１に対する結合親和性の増加が確認されたバリアント分子は、Ｔ細胞活性化の作動においてより大きな活性を示す。

実施例１２
バリアントＣＤ８０ポリペプチドのＩｎＶｉｖｏ抗腫瘍活性
Ａ．ＣＤ８０バリアントの抗腫瘍活性
マウスＭＣ３８腫瘍細胞にヒトＰＤ−Ｌ１（ＭＣ３８ｈＰＤ−Ｌ１）を安定的にトランスフェクトし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植した。不活性Ｆｃ対照、または不活性Ｆｃ分子（例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１７１４）もしくはエフェクター活性を媒介できるＦｃ分子（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２９）のいずれかを融合したバリアントＩｇＶ（Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｌ７０Ｍ，ＳＥＱＩＤＮＯ：１９９；またはＥ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ，ＳＥＱＩＤＮＯ：２０８）を含有する例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子を、移植後８、１０、１３、１５、及び１７日目に１００μｇ／マウスを腹腔内注射した。腫瘍体積を経時的に追跡した。

図１０にて示すように、Ｆｃ対照と比較して腫瘍増殖の抑制がＣＤ８０−ＩｇＶで処置した全てのマウスにおいて観察され、このことはバリアントＣＤ８０−ＩｇＶ分子がｉｎｖｉｖｏで機能的に活性であることを示す。

Ｂ．抗腫瘍活性の用量依存性
１．腫瘍体積（５０ｕｇ、１００ｕｇ、及び５００ｕｇ）
ＭＣ３８ｈＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞の移植後、約５０〜５１ｍｍ^３の類似した腫瘍体積を含有する７０匹の雌Ｃ５７ＣＬ／６マウスを分類し、それぞれ１４匹のマウスを含む５つの処置群に分けた。８、１０、及び１２日目に、群１（アイソタイプ対照）には、７５μｇのＦｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１４）のみを与え；群２、３、及び４には、ＧＳＧ_４Ｓリンカー（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１６）を介して、不活性なヒトＦｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１４）に融合したＣＤ８０バリアントＥ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０８）をそれぞれ５０、１００、及び５００μｇ与え；群５には、１００μｇのヒト抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ（デュルバルマブ）を与えた。腫瘍体積は、７、１０、及び１２日目に測定した。１３日目に、以下のセクションで説明するように、分析のために５匹の動物を屠殺した。１７、２０、及び２７日目に各群の残りの９匹のマウスの腫瘍測定を再開した。２６、２８、及び３１日目に、群１の動物（Ｆｃアイソタイプ対照）に、１００μｇのＥ３５Ｄ／Ｍ４７ＬＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃの腫瘍内注射を与えた。

腫瘍体積の中央値及び平均値を図１１に示す。図示のように、Ｆｃ対照と比較して、ＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃで処置した場合、用量依存的な腫瘍体積の減少が観察された。この研究では、１００μｇ〜５００μｇのＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃで処置したマウスにおいて観察された腫瘍体積の中央値は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照で処置したマウスと同様であった。

２．サイトカイン分析
ＭＣ３８腫瘍の酵素消化後、溶解液を遠心分離し、上清を収集し、アッセイの準備ができるまで−８０℃で保存した。次に、各試料のマウスＩＦＮγの濃度を、製造元の指示に従って市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して測定し、腫瘍重量または腫瘍から単離した総細胞数のいずれかに基づいて濃度を正規化した。図１２に記載の結果は、最高用量（５００μｇ）のＥ３５Ｄ／Ｍ４７ＬＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃが腫瘍溶解物中の最高濃度のＩＦＮγをもたらしたことを示し、このことは、ＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃがその処置の結果としてＩＦＮγを産生していることを示唆しており、これは抗腫瘍免疫を促進することが知られている機序である。

Ｃ．ＣＤ８０選択バリアントの抗腫瘍及び再刺激活性
９５匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣ３８ｈＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞を移植した。腫瘍を７日目に分類し、約６０ｍｍ^３の類似の腫瘍体積を持つ７７匹のマウスを、それぞれ１１匹のマウスを含む７つの処置群に分けた。７、９、及び１１日目に、群１（アイソタイプ対照）には、７５μｇの不活性Ｆｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１４）のみを与え；群２には、１００μｇのＣＤ８０バリアントＥ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ／Ｎ４８Ｋ／Ｖ６８Ｍ／Ｋ８９ＮＩｇＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２５０）−Ｆｃ（不活性）を与え；群３には、１００μｇのＣＤ８０バリアントＨ１８Ｙ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ａ７１Ｇ／Ｄ９０ＧＩｇＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２７６）−Ｆｃ（不活性）を与え；群４には、１００μｇのＣＤ８０バリアントＥ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ｌ８５Ｑ／Ｅ８８ＤＩｇＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２８０）−Ｆｃ（不活性）を与え；群５には、１００μｇのＣＤ８０バリアントＥ３５Ｄ／Ｄ４６Ｅ／Ｍ４７Ｖ／Ｖ６８Ｍ／Ｄ９０Ｇ／Ｋ９３ＥＩｇＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２８４）−Ｆｃ（不活性）を与え；群６には、１００μｇのＣＤ８０バリアントＥ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０８）−Ｆｃ（不活性）を与え；群７には、１００μｇのヒト抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ（デュルバルマブ）を与えた。バリアントＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ分子の場合、ＣＤ８０ＩｇＶドメインは、ＧＳＧ_４Ｓリンカー（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１６）を介して、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１４に記載の不活性なヒトＦｃに融合した。腫瘍体積を１４、１７、２１、２４、２８、３１、及び３７日目に測定した。Ｆｃアイソタイプ対照を投与した動物は、過剰な腫瘍量のために２８日目までに死んだ。

腫瘍体積の中央値及び平均値を図１３に示す。これは、全ての試験したＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ分子が、抗ＰＤ−Ｌ１対照と比較して、類似の、または場合によっては大幅に改善された活性を示したことを示す。試験が完了すると、群３の８匹のマウス、群４の２匹のマウス、群６の１匹のマウス、及び群７の２匹のマウスは、もはや腫瘍を検出できず、「腫瘍なし」と指定した。

４９日目に、群３、４、６、及び７の腫瘍なしマウスならびに２匹のナイーブＣ５７ＣＬ／６マウスを、ｈＰＤ−Ｌ１ＭＣ３８細胞の追加注射で再刺激した。腫瘍体積を５６、５９、及び６３日目に測定した。結果を図１４に示す。ナイーブマウスは、予想どおり急速な腫瘍成長を示した。５９日目に、群３の８／８匹のマウス、群４の１／２匹のマウス、群６の１／１匹のマウス、群７の２／２匹のマウスには腫瘍がなく、そして、６３日目まで群３、群４、群６、及び群７の全てのマウスには腫瘍がなかった。この結果は、ＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ分子を含む試験物質が、長期間持続性、耐久性のある免疫、抗腫瘍効果を提供することができたことと一致する。

２回目の用量が消化されてから３日後に屠殺したマウスの腫瘍及び生きたＣＤ４５−腫瘍細胞を、結合した不活性Ｆｃ、ＣＤ８０バリアント−Ｆｃ、及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在についてフローサイトメトリーにより分析した。群１、３、６、及び７の結果を図１５に提供する。上記の研究と同様に、結果は、ＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ分子が抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照と比較して腫瘍への結合が少ないことを示した。これにもかかわらず、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２７６（Ｈ１８Ｙ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ａ７１Ｇ／Ｄ９０Ｇ）に記載の例示的なＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃで処置したマウスによって示されるようなＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃによる優れた活性を、ＣＤ２８作動作用（ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激）及び／またはＣＴＬＡ−４拮抗作用による活性における分化因子と一致して達成することができた。

Ｄ．ＣＤ８０バリアント及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体の抗腫瘍活性
ｈＰＤ−Ｌ１ＭＣ３８腫瘍細胞を移植してから７日後に、７５匹の動物を３つの処置群に分類した。群１には７５μｇの不活性Ｆｃ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１４）を３回注射し、群２には１００μｇのＣＤ８０バリアントＨ１８Ｙ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ａ７１Ｇ／Ｄ９０ＧＩｇＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２７６）−Ｆｃ（不活性）を３回注射し、群３には１００μｇのヒト抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ（デュルバルマブ）を３回注射した（これらの注射は移植後８、１０、及び１２日目に行った）。１１日目〜３５日目まで、３〜４日毎に腫瘍体積を測定した。１回目、２回目、及び３回目の投与の３日後、各群から４匹のマウスを腫瘍及びＬＮ分析のために屠殺し、１３匹のマウスを研究期間を通して腫瘍体積を測定するために残した。

図１６では、抗ＰＤ−Ｌ１対照と比較して、例示的なＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃによってこの試験で処置したマウスの中央値及び平均腫瘍体積においてより大きな減少が示される。１８日目に、群１（Ｆｃ対照処置）の０／１３匹のマウスには腫瘍がなく、群２（ＣＤ８０バリアントＩｇＶ−Ｆｃ処置）の６／１３匹のマウスには腫瘍がなく、群３（デュルバルマブ処置）の３／１３匹のマウスには腫瘍がなかった。３５日目に、それぞれ群１、２、及び３の、１／１３、６／１３、及び３／１３匹のマウスは腫瘍がなかった。バリアントＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃで処置したマウスは、抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体または不活性Ｆｃ対照で処置したマウスの腫瘍と比較して、平均してサイズが縮小した腫瘍を示した。

１．腫瘍細胞の特性決定
Ｆｃ対照、ＣＤ８０バリアントＩｇＶ−Ｆｃ、及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体（デュルバルマブ）の２回目の投与の３日後、腫瘍及び流入領域リンパ節（ＬＮ）を各処置群の３〜４匹のマウスから採取した。組織は単一細胞懸濁液に処理され（腫瘍は処理の一部として酵素的に消化されたが、流入領域ＬＮは酵素的に処理しなかった）、ＣＤ４５＋細胞サブセット（ＬＮまたは腫瘍のいずれかの免疫細胞）でのＣＤ８＋Ｔ細胞のマルチカラーフローサイトメトリー分析、及び腫瘍細胞に結合した分子（ＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃまたは抗ＰＤ−Ｌ１）を検出するためのＣＤ４５−細胞サブセット（腫瘍細胞）での％ｈＩｇＧ＋染色に供した。結果は図１７Ａ〜Ｃに提供する。

ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）は、Ｆｃ対照または抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置（図１７Ａ（ＬＮ）及び図１７Ｂ（腫瘍）と比較して、Ｈ１８Ｙ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ａ７１Ｇ／Ｄ９０ＧＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃで処置したマウスのＴＩＬ及びＬＮの両方で有意に大きかった（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）。これは、Ｈ１８Ｙ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ａ７１Ｇ／Ｄ９０ＧＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃ処置が抗腫瘍免疫の重要な寄与因子であるｉｎｖｉｖｏでのＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を促進できることを示している。さらに、Ｈ１８Ｙ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ａ７１Ｇ／Ｄ９０ＧＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃは腫瘍上で検出された（ＣＤ４５−細胞でのｈＩｇＧ＋染色によってｅｘｖｉｖｏで）が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のレベルと比較して低下したレベルであった（図１７Ｃ）。腫瘍上のＥ３５Ｄ／Ｍ４７ＬＣＤ８０−Ｆｃの存在は低下しているにもかかわらず、検出された抗ＰＤ−Ｌ１と比較して、抗腫瘍活性は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と比較してＣＤ８０−Ｆｃに対して優れていた（上記セクションＢ１を参照のこと）。これらの結果は、ＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃの活性がＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１拮抗作用に対してだけでない可能性があるが、分化因子がＣＤ２８作動作用（ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激）及び／またはＣＴＬＡ４拮抗作用の活性に関連している可能性があるという観察と一致する。

実施例１３
追加のバリアントＣＤ８０ＩｇＶドメインの生成
Ａ．追加のＣＤ８０ＩｇＶ結合ドメイン及び結合評価
追加のＣＤ８０バリアントを生成し、基本的に実施例２〜５に記載されるようにＦｃ融合タンパク質として発現させた。バリアントを、実質的に実施例７に記載されるように結合について試験し、実質的に実施例９に記載される生理活性について試験した。結合及び活性研究の結果を表２０〜２３に提供する。

１．結合評価
（表２０）ＣＴＬＡ４またはＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（ＣＤ２８）及びＣＨＯ細胞へのフロー結合

（表２１）ＣＴＬＡ４またはＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（ＣＤ２８）及びＣＨＯ細胞へのフロー結合

２．生理活性評価
（表２２）Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ２＋ＣＨＯ／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）

（表２３）ＪＵＲＫＡＴ／ＩＬ２＋ＣＨＯ／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）

Ｂ．バリアントＣＤ８０ＩｇＶ結合ドメインの生成及びハイスループット選択
実施例７に記載した酵母アウトプットから３００個のＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ構築物を生成した後、追加のＣＤ８０ＩｇＶバリアントを選択した。次に、ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃタンパク質を含有する上清を、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システムを使用して、９６ウェルプレートフォーマットでＰＤ−Ｌ１結合についてスクリーニングした。上記の実施例７に記載されるように、高いＰＤ−Ｌ１結合を示すバリアントを選択し、結合について再スクリーニングし、高いＰＤ−Ｌ１結合を示したバリアントを選択した。例示的なバリアント及びＦＡＣＳ結合データを表２４に提供する。選択したバリアントはまた、実質的に実施例９に記載される方法を使用して生理活性について評価し、その結果は表２５に示されている。

（表２４）ＣＴＬＡ４またはＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（ＣＤ２８）及びＣＨＯ細胞へのフロー結合

（表２５）Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ２＋ＣＨＯ／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）

Ｃ．ＣＤ８０ＩｇＶコンセンサスバリアントの生成
ＣＤ８０ＩｇＶバリアントのコンセンサスバリアントは、上記の全ての酵母選択からのアウトプットのアラインメントに基づいて設計した。次いで、コンセンサス配列を使用してＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃタンパク質を生成し、次いで、上記のように結合及び生理活性について試験した。結合及び生理活性の結果を、それぞれ表２６及び２７に提供する。

（表２６）ＣＴＬＡ４またはＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（ＣＤ２８）及びＣＨＯ細胞へのフロー結合

（表２７）Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ２＋ＣＨＯ／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）

実施例１４
ＣＤ８０ＩｇＶバリアントのパネルの結合活性の評価
ＳＥＱＩＤＮＯ：２２５０、２２７６、及び２２８０に記載の選択したバリアントのセットを参照して、結合及び活性に関与する残基を特定するため、復帰（逆）変異のパネルを設計し、実質的に実施例４及び５に記載されるようにＦｃ融合タンパク質として発現させた。生成したバリアントは、表２８に記載の様々な組み合わせでＳＥＱＩＤＮＯ：２２５０、２２７６、及び２２８０に見いだされた１〜６個の変異を含んだ。

（表２８）追加のＣＤ８０バリアント

上記のように、結合及び生理活性についてバリアントを試験した。結合結果は表２９及び３０に記載されており、生理活性結果は表３１及び３２に記載されている。

（表２９）ＣＴＬＡ４またはＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（ＣＤ２８）及びＣＨＯ細胞へのフロー結合

（表３０）ＣＴＬＡ４またはＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（ＣＤ２８）及びＣＨＯ細胞へのフロー結合

（表３１）Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ２＋ＣＨＯ／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）

（表３２）Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ２＋ＣＨＯ／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）

実施例１５
ＮＮＫライブラリー選択によるバリアント最適化
ＳＥＱＩＤＮＯ：２２５０、２２７６、及び２２８０に記載の位置に基づいて１８、２６、３５、４７、４８、６８、７１、８５、８８、９０、及び９３位に変異の組み合わせを有する追加のバリアントＣＤ８０ＩｇＶドメイン含有分子を生成した。縮重コドンが全ての潜在的なアミノ酸をコードするが、２つの停止残基ＴＡＡ及びＴＧＡのコードを防止するように、バリアントを選択した位置でＮＮＫライブラリー（Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ、Ｋ＝ＴまたはＧ）から生成した。実質的に実施例２に記載されるようにＤＮＡを含有するＮＮＫを酵母に導入し、酵母ライブラリーを生成した。該ライブラリーを使用して、実質的に実施例３に記載されるようにＣＤ８０の親和性改変バリアントを発現する酵母を選択した。

実質的に実施例４に記載されるようなｒｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃによる３回のＦＡＣＳ選択からのアウトプットを、実質的に実施例５に記載されるような不活性Ｆｃ融合タンパク質としてさらにフォーマット化し、選択し、発現させた。Ｆｃ−融合タンパク質を、実質的に実施例７に記載されるように結合について試験し、実質的に実施例９に記載される生理活性について試験した。野生型ＣＤ８０ＥＣＤ−Ｆｃ（不活性）、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）、Ｈ１８Ｙ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ａ７１Ｇ／Ｄ９０Ｇ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２７６）ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）及び不活性Ｆｃのみの結合及び生理活性も参考のために測定した。結合及び活性研究の結果は、それぞれ表３３及び３４に提供する。

（表３３）ＣＴＬＡ４またはＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（ＣＤ２８）及びＣＨＯ細胞へのフロー結合

（表３４）Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ２＋ＣＨＯ／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイ：相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）

実施例１６
ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃリンカーバリアント
ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃバリアントを、ＩｇＶとＦｃドメイン間の異なるリンク領域（リンカー）によって構築し、結合及び／または生理活性を評価した。ＣＤ８０Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ／Ｎ４８Ｋ／Ｖ６８Ｍ／Ｋ８９ＮＩｇＶ−Ｆｃ及びＥ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ｌ８５Ｑ／Ｅ８８ＤＩｇＶ−Ｆｃタンパク質を含有する融合タンパク質を、ＥＡＡＡＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０２６）、（ＥＡＡＡＫ）_３（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０２７）、ＧＳ（Ｇ_４Ｓ）_３（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０２８）、ＧＳ（Ｇ_４Ｓ）_５（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０２９）リンカーを含有して生成した。

野生型ＣＤ８０（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３０に記載の骨格配列）においてＩｇＶをＩｇＣに接続する３つのアミノ酸が欠失したＣＤ８０ＩｇＶ骨格配列にＥ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ／Ｎ４８Ｋ／Ｖ６８Ｍ／Ｋ８９ＮまたはＥ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ｌ８５Ｑ／Ｅ８８Ｄ改変を含有するＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃタンパク質もまた生成した。次いで、生成したバリアントＣＤ８０ＩｇＶを、ヒンジ領域の６アミノ酸をさらに欠く不活性Ｆｃに融合させた（ＦｃはＳＥＱＩＤＮＯ：３０２５に記載）。この戦略によって生成した分子は、「デルタ」リンカーと呼ばれる追加のリンカーなしでＦｃに直接融合した。

次いで、実施例７及び９に記載されるように、結合及び生理活性についてＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃバリアントを試験した。ＧＳＧ_４Ｓリンカー（ＳＥＱＩＤＮＯ：：１７１６）を含有する、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０３１）−Ｆｃ（不活性）、ＣＤ８０ＥＣＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）−Ｆｃ（不活性）及び不活性Ｆｃのみの結合及び生理活性も比較のために測定した。結果を、それぞれ表３４及び３５に提供する。

（表３４）ＣＴＬＡ４またはＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（ＣＤ２８）及びＣＨＯ細胞へのフロー結合

（表３５）ＣＴＬＡ４またはＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ（ＣＤ２８）及びＣＨＯ細胞へのフロー結合

実施例１７
追加の親和性改変ＩｇＳＦドメイン
本実施例は、免疫活性化及び阻害の両方で実証された二重の役割を有する免疫シナプス（ＩＳ）の他の構成成分である追加の親和性改変ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、及びＣＤ８６（Ｂ７−２）免疫調節タンパク質の設計、作成、及びスクリーニングについて記載する。親和性改変ＮＫｐ３０バリアントもまた生成及びスクリーニングした。これらの実施例は、ＩｇＳＦドメインの親和性改変により、免疫学的活性の増加及び減少の両方に作用できるタンパク質が生成されることを証明する。これらのドメインの様々な組み合わせは、バリアント親和性改変ＣＤ８０とペアで融合（すなわち、スタック状）し、ＩＩ型免疫調節タンパク質を形成し、免疫調節活性を達成する。

酵母ディスプレイライブラリーとしての翻訳及び発現のためのヒトＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ８０、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２のＩｇＶドメインのバリアントをコードする変異体ＤＮＡ構築物を、実質的に実施例１に記載されるように生成した。縮重コドンによる完全または部分的ランダム化のための特定の残基を標的とする標的ライブラリー及び／またはランダムライブラリーを構築して、ＣＤ１１２（ＳＥＱＩＤＮＯ：８２９）、ＣＤ１５５（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２１）、ＰＤ−Ｌ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１９６）のＩｇＶのバリアント、及び実質的に実施例１に記載されるようにＰＤ−Ｌ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２５７）のＩｇＶのバリアントを同定した。同様の方法をさらに使用して、ＮＫｐ３０（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５５）のＩｇＣ様ドメインのライブラリーを生成した。

縮重またはランダムライブラリーＤＮＡを実質的に実施例２に記載されるように酵母に導入して、酵母ライブラリーを生成した。該ライブラリーを使用して、実質的に実施例３に記載されるように、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、及びＮＫｐ３０の親和性改変バリアントを発現する酵母を選択した。実質的に実施例３に記載されるように、細胞を処理して非結合物質を減らし、外因性組換えカウンター構造体タンパク質に結合する能力を有するＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２バリアントを濃縮した。

ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＮＫｐ３０ライブラリーによって、標的リガンドタンパク質は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（ＵＳＡ）から供給され、以下のとおりである：ヒトｒＣＤ２８．Ｆｃ（すなわち、組換えＣＤ２８−Ｆｃ融合タンパク質）、ｒＰＤＬ１．Ｆｃ、ｒＣＴＬＡ４．Ｆｃ、及びｒＢ７Ｈ６．Ｆｃ。実質的に実施例３に記載されるように、２色フローサイトメトリーを実施した。フローサイトメトリーソートからの酵母アウトプットを、より高い特異的結合親和性についてアッセイした。ソートアウトプット酵母を増殖及び再誘導して、これらがコードする特定のＩｇＳＦ親和性改変ドメインバリアントを発現させた。次いで、この集団を、フローサイトメトリーによって、親の野生型酵母系統、またはビーズアウトプット酵母集団のような任意の他の選択したアウトプットと比較することができる。

Ｂ７−Ｈ６への結合のために選択したＮＫｐ３０酵母バリアントの場合、Ｆ２ソートアウトプットは、１６．６ｎＭのｒＢ７Ｈ６．Ｆｃで染色した場合、５３３のＭＦＩ値を示した一方、同じ濃度のｒＢ７Ｈ６．Ｆｃで染色した場合、親ＮＫｐ３０系統のＭＦＩは９０と測定された（６倍の改善）。

特定したＮＫｐ３０バリアントの中には、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７５に記載の位置に対応するＮＫｐ３０細胞外ドメインの位置置に基づいて変異Ｌ３０Ｖ／Ａ６０Ｖ／Ｓ６４Ｐ／Ｓ８６Ｇを含有するバリアントがあった。

表２０Ａで提供されるＣＤ１５５バリアントの場合、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、及びＣＤ２２６のそれぞれに対して個別にＣＤ１５５ライブラリーを選択した。表２０Ｂ−Ｆで提供されるＣＤ１５５バリアントの場合、選択は、所望のカウンター構造体ＴＩＧＩＴ及びＣＤ９６を使用した２つのポジティブ選択と、それに続いてＣＤ２２６を除いて選択するカウンター構造体ＣＤ２２６を使用した１つの負の選択を伴い、バリアントＣＤ１５５の結合特異性を改善した。選択は、カウンター構造体（ＴＩＧＩＴ／ＣＤ９６）の濃縮物を除き、基本的に上記の実施例３に記載されるように実施し、リードの同定を最適化するために、正のソートの選択ストリンジェンシーを変更した。負の選択のためのＣＤ２２６の濃度は１００ｎＭに保たれた。

表２１Ａで提供されるＣＤ１１２バリアントの場合、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２Ｒ、及びＣＤ２２６のそれぞれに対して個別にＣＤ１１２ライブラリーを選択した。表２１Ｂ−Ｃで提供される追加のＣＤ１１２バリアントの場合、選択は、所望のカウンター構造体ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒを使用した２つの正の選択と、それに続いてＣＤ２２６を除いて選択するカウンター構造体ＣＤ２２６を使用した１つの負の選択を伴い、バリアントＣＤ１１２の結合特異性を改善した。選択は、カウンター構造体（ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１１２Ｒ）の濃度を除き、基本的に上記の実施例３に記載されるように実施した。リードの同定を最適化するために、正のソートの選択ストリンジェンシーを変更した。負の選択のためのＣＤ２２６の濃度は１００ｎＭに保たれた。

それぞれ表２２Ａ−Ｃまたは表２３Ａ及び２３Ｂに示されるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の場合、ＰＤ−１に対して酵母ディスプレイターゲットライブラリーまたはランダムＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２ライブラリーを選択した。これに続いて、外因性カウンター構造体タンパク質染色を使用した２〜３回のフローサイトメトリーソーティングを行って、改善された結合物質を示す酵母細胞の画分を濃縮した。あるいは、ＰＤ−Ｌ１の場合、選択は、ヒトｒＣＤ８０．Ｆｃ（すなわち、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡのヒト組換えＣＤ８０Ｆｃ融合タンパク質）によって実施した。主として上記のＰＤ−１について記載されるように選択を実施した。磁気ビーズの濃縮及びフローサイトメトリーによる選択は、基本的にＭｉｌｌｅｒＫ．Ｄ．，ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＣｙｔｏｍｅｔｒｙ４．７．１−４．７．３０，Ｊｕｌｙ２００８に記載のとおりである。表２２Ａ〜ＢのＰＤ−Ｌ１バリアントを、細胞発現カウンター構造体への結合について評価した。上記のスクリーニングで特定した追加のＰＤ−Ｌ１バリアントを、表２２Ｃに記載する。

実質的に実施例４に記載されるように、例示的な選択アウトプットは、それぞれがＦｃ分子に融合したＣＤ１５５の親和性改変（バリアント）ＩｇＶ、ＣＤ１１２のバリアントＩｇＶ、ＰＤ−Ｌ１のバリアントＩｇＶ、ＰＤ−Ｌ２のバリアントＩｇＶ（バリアントＩｇＶ−Ｆｃ融合分子）を含有する免疫調節タンパク質として再フォーマット化し、Ｆｃ融合タンパク質は、実質的に実施例５に記載されるように発現及び精製した。

次に、実質的に実施例６に記載されるように、例示的なＩｇＳＦドメインバリアントの細胞発現カウンター構造体への結合を評価した。コグネイト結合パートナーを発現する細胞を産生し、実質的に実施例６に記載されるように結合研究及びフローサイトメトリーを実施した。加えて、Ｆｃ融合バリアントタンパク質の生理活性を、実質的に実施例６に記載される混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイまたは抗ＣＤ３共固定化アッセイのいずれかによって特性決定した。

上記のように、各表について、例示的なアミノ酸置換は、それぞれの参照非改変ＥＣＤ配列に対応するアミノ酸位置番号によって指定される（表２）。アミノ酸位置が中央に示され、対応する非改変（例えば、野生型）アミノ酸が番号の前に列挙され、特定したバリアントのアミノ酸置換が番号の後に列挙（または番号によって指定されて挿入）される。

また、コグネイトカウンター構造体リガンドを発現するように操作した細胞への各バリアントＦｃ融合分子の結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値によって測定した結合活性、及び同じ細胞発現カウンター構造体リガンドへのアミノ酸置換を含有しない対応する非改変Ｆｃ融合分子の結合と比較したＭＦＩ比も示す。Ｔ細胞の活性を調節するＰＤ−Ｌ２バリアントＦｃ融合分子の機能的活性も、ＭＬＲアッセイにおいて、記載のバリアントＦｃ融合分子によって生成した培養上清中のＩＦＮ−γの算出レベル（ｐｇ／ｍＬ）に基づいて示される。表２３Ｂは、ＭＬＲアッセイにおいて対応する非改変ＩｇＶ−Ｆｃと比較した各バリアントＩｇＶ−Ｆｃによって産生されたＩＦＮ−γの比率も示す。示すように、選択により少なくとも１つの、場合によっては２つ以上のコグネイトカウンター構造体リガンドの増加した結合を示すように親和性を改変した多数のＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２ＩｇＳＦドメインバリアントを特定した。加えて、結果は、バリアント分子の親和性改変もまた、免疫学的活性を増加及び減少させる改善された活性を示したことを示した。

（表２０Ａ）コグネイト結合パートナーに対して選択したバリアントＣＤ１５５分子配列、結合データ、及び共刺激生理活性データ

（表２０Ｂ）追加のＣＤ１５５バリアント及び結合データ

（表２０Ｃ）追加のＣＤ１５５バリアント及び結合データ

（表２０Ｄ）追加のＣＤ１５５バリアント及び結合データ

（表２０Ｅ）追加のＣＤ１５５バリアント及び結合データ

（表２０Ｆ）追加のＣＤ１５５バリアント及び結合データ

（表２１Ａ）コグネイト結合パートナーに対して選択したバリアントＣＤ１１２。分子配列／結合データ／及び共刺激生理活性データ

（表２１Ｂ）追加のＣＤ１１２バリアント及び結合データ

（表２１Ｃ）追加のＣＤ１１２バリアント及び結合データ

（表２２Ａ）選択したＰＤ−Ｌ１バリアント及び結合データ

（表２２Ｂ）ＰＤ−１またはＣＤ８０を発現する細胞へのフロー結合

（表２２Ｃ）追加の親和性成熟ＩｇＳＦドメイン含有分子

（表２３Ａ）ＰＤ−１に対して選択したバリアントＰＤ−Ｌ２分子配列及び結合データ

（表２３Ｂ）ＭＬＲにおいてＰＤ−１に対して選択したＰＤ−Ｌ２バリアントの生理活性データ

実施例１８
抗ＰＤ−Ｌ１抗体と比較したＨｕＰＤ−Ｌ１形質導入ＭＣ３８腫瘍細胞に対する細胞傷害性
本実施例は、ｈｕＰＤ−Ｌ１形質導入ＭＣ３８腫瘍細胞のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害性の評価を記載している。非形質導入またはｈｕＰＤ−Ｌ１によって形質導入したＭＣ３８腫瘍細胞をマイトマイシン−Ｃで処理し、１：５の比率でＣＦＳＥで標識したヒトｐａｎＴ細胞でプレーティングした。ＷＴＩｇＧ１Ｆｃまたは不活性Ｆｃのいずれかとともに、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｌ７０Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２５）を含有するバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−ＦｃをＭＣ３８腫瘍細胞に１００ｎＭまたは１０ｎＭで添加し、細胞とともに７２時間培養した。対照として、例示的な抗ＰＤ−１抗体ニボルマブまたはＦｃ（不活性）のみの対照もまた評価した。次に、細胞を採取し、７−ＡＡＤ生存性色素で染色した。フローサイトメーターで試料を取り込んだ後、死細胞の割合を、ＣＦＳＥ−ゲートにおいて７−ＡＡＤ＋細胞をゲーティングすることによってＦｌｏｗｊｏ分析を使用して計算した。図１８にて示すように、ｈｕＰＤ−Ｌ１形質導入ＭＣ３８腫瘍細胞（ただし非形質導入ＭＣ３８親細胞ではない）に対する細胞傷害性の増加を、例示的な評価したバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子により観察した。このアッセイでは、細胞傷害活性は、対照抗ＰＤ−１抗体の存在下では観察されず、バリアントＣＤ８０ＩｇＶＦｃ分子が抗ＰＤ−１抗体対照と比較して改善された活性を示すことを示した。

実施例１９
初代ヒトＴ細胞及び単球へのＣＤ８０バリアント結合
例示的なバリアントＣＤ８０−ＩｇＶＦｃ分子の初代ＣＤ２８＋ヒトＣＤ４Ｔ細胞及びヒトＰＤ−Ｌ１＋単球への結合を評価した。評価した例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子は、

を含有した。

非活性化ヒト汎Ｔ細胞を、様々な濃度のバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃとインキュベート後、次いで抗ＣＤ４、抗ＣＤ８及び抗ヒトＩｇＧで染色して、ＣＤ８０ＩｇＶ−ＦｃのＦｃ部分を検出した。対照として、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ、Ｆｃのみの陰性対照、及びＣＤ２８結合ＩＣＯＳＬｖＩｇＤ−Ｆｃの結合も評価した。結合はフローサイトメトリーによって評価し、ＭＦＩはＦｌｏｗｊｏ分析ソフトウェアを使用して決定した。図１９Ａにて示すように、試験したバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子は、初代ヒトＴ細胞への異なる結合を示し、これは場合によっては野生型ＣＤ８０−ＩｇＶ−Ｆｃよりも大きかった。

ヒト単球発現ＰＤ−Ｌ１への結合の場合、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の存在下で、ヒトＰＢＭＣを一晩プレーティングした。翌日、細胞を採取し、様々な濃度のバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照（デュルバルマブ）とインキュベートし、次いで、単球及び抗ヒトＩｇＧを特定するために抗ＣＤ１４で染色し、ＣＤ８０ＩｇＶ分子のＦｃ部分を検出した。結合はフローサイトメトリーによって評価し、ＭＦＩはＦｌｏｗｊｏ分析ソフトウェアを使用して決定した。図１９Ｂにて示すように、試験した全てのバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子は、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃよりも初代ヒト単球への実質的により大きな結合を示した。

実施例２０
ＰＤ−Ｌ１媒介性ＰＤ−１ＳＨＰ２動員のバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ拮抗作用
本実施例では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断することによりＰＤ−１への細胞質タンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ−２の動員に拮抗するバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子の効果を評価するためのＪｕｒｋａｔ／ＰＤ−１／ＳＨＰ２シグナル伝達アッセイについて説明する。例示的なアッセイでは、組換えβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）断片酵素ドナー（ＥＤ）タグ付きＰＤ−１受容体及び酵素アクセプター（ＥＡ）タグ付きＳＨＰ−２ドメインを含有するＪｕｒｋａｔ細胞株を使用した（例：ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ，ＵＳＡ；ｃａｔ．９３−１１０６Ｃ１９）。アッセイでは、ＰＤ−１へのＳＨＰ−２動員により、ＥＡ及びＥＤが極めて近接し、この２つの酵素断片の相補が基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する機能的β−ｇａｌ酵素の形成を可能にする。

Ｋ５６２／ＯＫＴ３／ＰＤ−Ｌ１ａＡＰＣを様々な濃度の例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）と３０分間プレインキュベートした。評価した例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子は、

を含有した。対照として、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ（不活性）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、及びＦｃ（不活性）のみの対照も評価した。Ｊｕｒｋａｔ／ＰＤ−１／ＳＨＰ２細胞（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸＰａｔｈｈｕｎｔｅｒ酵素相補断片動員株）を加え、細胞を２時間インキュベートした。β−ｇａｌの基質（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸバイオアッセイ検出試薬）をウェルに加え、暗所で室温で１時間インキュベートし、ルシフェラーゼをマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋＣｙｔａｔｉｏｎ）で測定した。

図２０にて示すように、例示的なバリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子は、ルシフェラーゼ活性を減少させ、これは、バリアントＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子がＰＤ−Ｌ１媒介性ＰＤ−１ＳＨＰ２の動員に拮抗する強力な活性を示したという観察と一致する。強力な拮抗活性は、抗ＰＤ−Ｌ１陽性対照でも観察されたが、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子の存在下でルシフェラーゼシグナルの減少が検出されないことから明らかなように、野生型ＣＤ８０ＩｇＶ−Ｆｃ分子はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１拮抗活性を示さなかった。

実施例２１
Ｂ７／ＣＴＬＡ−４結合のＣＤ８０バリアント拮抗作用
ＣＴＬＡ−４及びＢ７結合の相互作用に拮抗するＣＤ８０ｖＩｇＤ−Ｆｃの能力を評価するため、表面ヒトＣＴＬＡ−４を安定して発現するＣＨＯ細胞に

または野生型ＣＤ８０ｖＩｇＤ−Ｆｃ、または陽性対照としての抗ＣＴＬＡ−４抗体（イピリムマブ）を滴定してプレーティングした。洗浄後、細胞を２５ｎＭの蛍光色素コンジュゲート野生型ＣＤ８０−Ｆｃとインキュベートした。結合した蛍光競合タンパク質が検出され、フローサイトメトリーで測定した。図２１にて示すように、全てのＣＤ８０ｖＩｇＤ−Ｆｃバリアント（ただし野生型ＣＤ８０−Ｆｃではない）がＣＴＬＡ−４へのＣＤ８０の結合に拮抗した。

本発明は、例えば本発明の様々な態様を例示するために提供される、特定の開示された実施形態に範囲が限定されることを意図していない。記載の組成物及び方法に対する様々な修正が、本明細書の説明及び教示から明らかになるであろう。そのような変形は、本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく実践されてよく、これが本開示の範囲内にあると意図される。

Claims

ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片、またはその両方を含むバリアントＣＤ８０ポリペプチドであって、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた３５、４６、７１、７、２３、２６、３０、３４、５１、５５、５７、５８、６５、７３、７８、７９、８２、または８４に対応する、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に、１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、
最大１４個のアミノ酸改変を含む、
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチド。
ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片、またはその両方を含むバリアントＣＤ８０ポリペプチドであって、
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた３５、４６、７１、７、２３、２６、３０、３４、５１、５５、５７、５８、６５、７３、７８、７９、８２、または８４に対応する、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に、１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、
前記ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片が、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの唯一のＣＤ８０部分である、
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた１つまたは複数の位置２６、３５、４６、５７、または７１位に対応する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、請求項１または請求項２に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片、またはその両方を含むバリアントＣＤ８０ポリペプチドであって、
非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた

に対応する１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、
最大１４個のアミノ酸改変を含む、
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチド。
ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片、またはその両方を含むバリアントＣＤ８０ポリペプチドであって、
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた

に対応するアミノ酸改変を含み、
前記ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片が、バリアントＣＤ８０ポリペプチドの唯一のＣＤ８０部分である、
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチド。
アミノ酸改変Ａ２６Ｅ、
アミノ酸改変Ｅ３５Ｄ、
アミノ酸改変Ｄ４６Ｅ、
アミノ酸改変Ｄ４６Ｖ、または
アミノ酸改変Ａ７１Ｇ
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、
アミノ酸改変Ｍ４７Ｌを含む、請求項４または請求項５に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片、ＩｇＣドメインもしくはその特異的結合断片、またはその両方を含むバリアントＣＤ８０ポリペプチドであって、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた

から選択されるアミノ酸改変を含む、
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチド。
アミノ酸改変

を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
アミノ酸改変Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ、またはＥ３５Ｄ／Ｖ６８Ｍを含む、請求項４〜９のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
アミノ酸改変Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８ＭまたはＥ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ／Ｖ６８Ｍを含む、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
ヒトＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ヒトＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
前記親和性が、前記ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの前記非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、４００倍、または４５０倍より多く増加する、請求項１２に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいたアミノ酸改変

を含む、請求項４〜１３のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
前記アミノ酸改変が、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｌ７０Ｍを含む、請求項４〜９及び１１〜１３のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
前記アミノ酸改変が、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ／Ｎ４８Ｋ／Ｖ６８Ｍ／Ｋ８９Ｎを含む、請求項４〜１３のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
前記アミノ酸改変が、Ｈ１８Ｙ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ａ７１Ｇ／Ｄ９０Ｇを含む、請求項４〜１３のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
前記アミノ酸改変が、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｅ／Ｍ４７Ｖ／Ｖ６８Ｍ／Ｄ９０Ｇ／Ｋ９３Ｅを含む、請求項４〜１３のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
前記アミノ酸改変が、Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ｌ８５Ｑ／Ｅ８８Ｄを含む、請求項４〜１３のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
前記非改変ＣＤ８０が、（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のアミノ酸の配列を含むか、（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むか、または（ｉｉｉ）ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片を含む（ｉ）もしくは（ｉｉ）の一部分である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
前記ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片であるか、またはそれを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
前記ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片が、前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドの唯一のＣＤ８０部分である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸改変を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３〜７５、２００９〜２１０４、２２９７〜２５０７、または２９３０〜２９６０のいずれかに記載のアミノ酸の配列もしくはその特異的結合断片、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３〜７５、２００９〜２１０４、２２９７〜２５０７、または２９３０〜２９６０のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示し、かつ１つまたは複数のそれらのアミノ酸改変を含有する、アミノ酸の配列もしくはその特異的結合断片、または
ＳＥＱＩＤＮＯ：７７〜１４９、１５１〜２２３、２１０５〜２２９６、２５０８〜２９２９、もしくは２９６１〜３０２２のいずれかに記載のアミノ酸の配列もしくはその特異的結合断片、ＳＥＱＩＤＮＯ：７７〜１４９、１５１〜２２３、２１０５〜２２９６、２５０８〜２９２９、もしくは２９６１〜３０２２のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を示し、かつ１つまたは複数のそれらのアミノ酸改変を含有する、アミノ酸の配列もしくはその特異的結合断片
を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１９９、２０８、２２５０、２２７６、２２８０、または２２８４のいずれかに記載のアミノ酸の配列を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
ＣＤ８０膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、かつ／または
細胞表面に発現することができない、
実施形態１〜２５のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
前記ポリペプチドの生物学的半減期を延長する部分に連結された、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
多量体化ドメインに連結された、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
前記多量体化ドメインが、Ｆｃドメインであるか、または低下したエフェクター機能を有するバリアントＦｃドメインである、請求項２８に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
膜貫通ドメイン及び／または細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む、膜貫通型免疫調節タンパク質である請求項１〜２９のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
第１の多量体化ドメインに連結された請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２の多量体化ドメインに連結された請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む多量体であり、前記第１及び第２の多量体化ドメインが、相互作用して第１及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む多量体を形成する、免疫調節タンパク質。
前記多量体が、二量体、任意でホモ二量体である、請求項３１に記載の免疫調節タンパク質。
前記第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドが同一である、請求項３１または請求項３２に記載の免疫調節タンパク質。
前記多量体化ドメインが、免疫グロブリンのＦｃ領域であるかまたはそれを含み、任意で、前記免疫グロブリンタンパク質がヒトである、及び／または前記Ｆｃ領域がヒトである、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の免疫調節タンパク質。
前記Ｆｃ領域が、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）または免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）タンパク質のものである、請求項３４に記載の免疫調節タンパク質。
前記Ｆｃ領域が、１つまたは複数のエフェクター機能を示す、請求項３４または請求項３５に記載の免疫調節タンパク質。
Ｆｃ依存性ＣＤ２８共刺激を示す、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の免疫調節タンパク質。
前記Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域に１つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントＦｃ領域であり、前記バリアントＦｃ領域が、前記野生型Ｆｃ領域と比較して低下した１つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で、野生型ヒトＦｃがヒトＩｇＧ１のものである、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の免疫調節タンパク質。
前記Ｆｃ領域が、アミノ酸置換Ｎ２９７Ｇを含み、前記残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる、請求項３８に記載の免疫調節タンパク質。
前記Ｆｃ領域が、アミノ酸置換Ｒ２９２Ｃ／Ｎ２９７Ｇ／Ｖ３０２Ｃを含み、前記残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる、請求項３８に記載の免疫調節タンパク質。
前記Ｆｃ領域が、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａを含み、前記残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる、請求項３８に記載の免疫調節タンパク質。
前記バリアントＦｃ領域が、アミノ酸置換Ｃ２２０Ｓをさらに含み、前記残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の免疫調節タンパク質。
前記Ｆｃ領域が、Ｋ４４７ｄｅｌを含み、前記残基が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の免疫調節タンパク質。
請求項１２〜２９のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の免疫調節タンパク質。
ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激を示す、請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の免疫調節タンパク質。
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）メンバーのＩｇＳＦドメインを含む第２のポリペプチドに直接的またはリンカーを介して間接的に連結された請求項１〜２９のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む、免疫調節タンパク質。
前記ＩｇＳＦドメインが、親和性改変ＩｇＳＦドメインであり、前記親和性改変ＩｇＳＦドメインが、前記ＩｇＳＦファミリーメンバーの非改変または野生型ＩｇＳＦドメインと比較して１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、請求項４６に記載の免疫調節タンパク質。
前記ＩｇＳＦドメインが、前記ＩｇＳＦファミリーメンバーの非改変または野生型ＩｇＳＦドメインの同一の１つまたは複数のコグネイト結合パートナー（複数可）への結合と比較して、１つまたは複数のそのコグネイト結合パートナー（複数可）への増加した結合を示す親和性改変ＩｇＳＦドメインである、請求項４７に記載の免疫調節タンパク質。
細胞表面の分子に特異的に結合するターゲティング部分に連結された請求項１〜２９のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む、コンジュゲート。
前記細胞が、免疫細胞または腫瘍細胞である、請求項４９に記載のコンジュゲート。
前記部分が、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子またはナノ粒子である、請求項４９または請求項５０に記載のコンジュゲート。
前記部分が、抗体または抗原結合断片である、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
融合タンパク質である、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
請求項１〜３０のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、請求項３１〜４８のいずれか１項に記載の免疫調節タンパク質、または請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の融合タンパク質であるコンジュゲート、をコードする核酸分子。
請求項５４に記載の核酸分子を含む、ベクター。
発現ベクターである、請求項５５に記載のベクター。
請求項５５または請求項５６に記載のベクターを含む、細胞。
バリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質の産生方法であって、請求項５４に記載の核酸分子または請求項５５もしくは請求項５６に記載のベクターを宿主細胞に、前記細胞内で前記タンパク質を発現する条件下で導入することを含む、前記産生方法。
前記細胞からバリアントＣＤ８０ポリペプチドまたは免疫調節タンパク質を単離または精製することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
バリアントＣＤ８０バリアントポリペプチドを発現する細胞を操作する方法であって、実施形態１〜３０のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドをコードする核酸分子を宿主細胞に、前記ポリペプチドが前記細胞内で発現される条件下で導入することを含む、前記方法。
請求項１〜３０のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、請求項３１〜４８のいずれか１項に記載の免疫調節タンパク質、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の融合タンパク質であるコンジュゲート、請求項５４に記載の核酸分子、または請求項５５もしくは５６に記載のベクターを含む、操作された細胞。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、膜貫通ドメインを含まない、及び／または前記細胞の表面に発現しない；及び／または
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、発現した際に前記操作された細胞から分泌されることができる、
請求項６１に記載の操作された細胞。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、膜貫通ドメインを含むか、請求項２９に記載の膜貫通型免疫調節タンパク質であり；及び／または
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、前記細胞の表面に発現する、
請求項６１に記載の操作された細胞。
前記細胞が免疫細胞であり、任意で抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはリンパ球、任意でＴ細胞である、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の操作された細胞。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をさらに含む、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の操作された細胞。
実施形態１〜３０のいずれかに記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、実施形態３１〜４７のいずれかに記載の免疫調節タンパク質、または実施形態４８〜５２のいずれかに記載の融合タンパク質であるコンジュゲート、をコードする核酸分子を含む、感染性物質。
細菌またはウイルスである、請求項６６に記載の感染性物質。
前記感染性物質がウイルスであり、前記ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、請求項６７に記載の感染性物質。
請求項１〜３０のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド、請求項３１〜４８のいずれか１項に記載の免疫調節タンパク質、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載のコンジュゲート、請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の操作された細胞、または請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の感染性物質を含む、薬学的組成物。
薬学的に許容し得る賦形剤を含む、請求項６９に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物が無菌である、請求項６９または請求項７０に記載の薬学的組成物。
バイアル内に請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の薬学的組成物を含む製造物品。
前記バイアルが密封された、請求項７２に記載の製造物品。
請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の薬学的組成物、または請求項７２もしくは請求項７３に記載の製造物品、及び使用説明書を含む、キット。
請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与することを含む、対象において免疫応答を調節する方法。
請求項３１〜４８のいずれか１項に記載の免疫調節タンパク質を投与することを含む、対象において免疫応答を調節する方法。
前記免疫調節タンパク質が、Ｆｃ依存性ＣＤ２８共刺激を示す請求項３７に記載の免疫調節タンパク質である、請求項７６に記載の方法。
前記免疫調節タンパク質が、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激を示す請求項４４に記載の免疫調節タンパク質であり、任意で前記免疫調節タンパク質が、請求項１２〜２９のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む、請求項７４に記載の方法。
請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の操作された細胞を投与することを含む、対象において免疫応答を調節する方法。
前記操作された細胞が、前記対象に対して自家である、請求項７９に記載の方法。
前記免疫応答を調節することにより、前記対象の疾患または状態を治療する、請求項７５〜８０のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫応答が増加される、請求項７５〜８１のいずれか１項に記載の方法。
バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む免疫調節タンパク質を投与することを含む、対象において免疫応答を増加させる方法であって、前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、前記免疫調節タンパク質が、ＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激を示す、前記方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、請求項８３に記載の方法。
バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む免疫調節タンパク質を投与することを含む、対象においてＰＤ−Ｌ１依存性ＣＤ２８共刺激によりＣＤ２８作動作用を媒介する方法であって、前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、
ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、前記方法。
疾患または状態の治療に使用するためのものである、請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
前記投与の前に、表面ＰＤ−Ｌ１に陽性の細胞を含む腫瘍を有する治療対象を選択し、任意で、前記細胞が腫瘍細胞もしくは腫瘍浸潤免疫細胞である；または
前記対象がＰＤ−Ｌ１に陽性の細胞表面を含む腫瘍を有するものとして選択され、任意で、前記細胞が腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞である、
請求項７５〜８６のいずれか１項に記載の方法。
対象の選択が、
（ａ）対象由来の腫瘍組織試料を、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに特異的に結合することができる結合試薬と接触させることと、
（ｂ）前記腫瘍組織試料の細胞内または細胞上に結合した結合試薬の存在を検出することであって、任意で前記細胞が腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞である、前記検出することと、
（ｃ）前記腫瘍組織試料が検出可能レベルのＰＤ−Ｌ１に陽性の細胞表面を含む場合に、治療のために前記対象を選択することと
を含む、請求項８７に記載の方法。
前記投与の前に、ＣＤ２８に陽性の細胞表面を含む腫瘍を有する治療対象を選択し、任意で前記細胞が腫瘍浸潤リンパ球であり、任意で前記リンパ球がＴ細胞、任意でＣＤ８＋Ｔ細胞である；または
前記対象が、ＣＤ２８に陽性の細胞表面を含む腫瘍を有するものとして選択され、任意で前記細胞が腫瘍浸潤リンパ球であり、任意で前記リンパ球がＴ細胞、任意でＣＤ８＋Ｔ細胞である、
請求項７５〜８８のいずれか１項に記載の方法。
前記対象の選択が、
（ａ）対象由来の腫瘍組織試料を、ＣＤ２８のエクトドメインに特異的に結合することができる結合試薬と接触させることと、
（ｂ）前記腫瘍組織試料の細胞内または細胞上に結合した結合試薬の存在を検出することであって、任意で前記細胞が腫瘍浸潤リンパ球であり、任意で前記リンパ球がＴ細胞、任意でＣＤ８＋Ｔ細胞である、前記検出することと、
（ｃ）前記腫瘍組織試料が検出可能レベルのＣＤ２８に陽性の細胞表面を含む場合に、治療のために前記対象を選択することと
を含む、請求項８９に記載の方法。
（ａ）対象由来の腫瘍組織試料を、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合することができる結合試薬と接触させることと、
（ｂ）前記腫瘍組織試料の細胞内または細胞上に結合した結合試薬の存在を検出することであって、任意で前記細胞が腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞である、前記検出することと、
（ｃ）前記腫瘍試料が検出可能レベルのＰＤ−Ｌ１に陽性の細胞表面を含む場合、バリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む免疫調節タンパク質による治療のための対象を選択することであって、前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較して、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、前記選択することと
を含む、治療対象を選択する方法。
前記腫瘍組織試料を、ＣＤ２８に特異的に結合することができる結合試薬と接触させることを含み、前記腫瘍組織試料が、検出可能レベルのＣＤ２８に陽性の腫瘍浸潤リンパ球をさらに含む場合に、前記対象が選択され、任意で前記リンパ球がＴ細胞、任意でＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項９１に記載の方法。
前記腫瘍組織試料が、腫瘍浸潤免疫細胞、腫瘍細胞、間質細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８８及び９０〜９２のいずれか１項に記載の方法。
前記結合試薬が、抗体もしくは抗原結合断片、タンパク質リガンドもしくは結合パートナー、アプタマー、アフィマー、ペプチド、またはハプテンである、請求項８８及び９０〜９３に記載の方法。
前記結合試薬が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合断片である、請求項８８、９１、９３または９４に記載の方法。
前記結合試薬が、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む、請求項８８〜９４のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、前記ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片を含む、請求項９６に記載の方法。
前記ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片が、前記結合試薬の唯一のＣＤ８０部分である請求項９６または９７に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、前記野生型または非改変ＣＤ８０ポリペプチドと比較してＰＤ−Ｌ１への結合に対する増加した親和性を示す、請求項９６〜９８のいずれか１項に記載の方法。
前記結合試薬が、検出可能部分または検出することのできる部分である部分に直接または間接的に連結される、請求項８８及び９０〜９９のいずれか１項に記載の方法。
前記部分がＦｃ領域である、請求項１００に記載の方法。
前記Ｆｃ領域が非ヒト、任意でマウスまたはウサギである、請求項１０１に記載の方法。
結合した結合試薬の存在の検出が、免疫組織化学、偽免疫組織化学、免疫蛍光、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、または免疫ブロッティングによる、請求項８８及び９０〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫調節タンパク質を前記対象に投与することをさらに含む、請求項９１〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫調節タンパク質が、第１の多量体化ドメインに連結された第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び第２の多量体化ドメインに連結された第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む多量体であり、前記第１及び第２の多量体化ドメインが、相互作用して前記第１及び第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む多量体を形成する、請求項８３〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
前記多量体が二量体である、請求項１０５に記載の方法。
前記第１のバリアントＣＤ８０ポリペプチド及び前記第２のバリアントＣＤ８０ポリペプチドが同一である、請求項１０５または請求項１０６に記載の方法。
前記多量体化ドメインが、Ｆｃ領域であるか、またはそれを含む、請求項１０５〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントＦｃ領域であり、前記Ｆｃ領域が、前記野生型Ｆｃ領域と比較して低下した１つまたは複数のエフェクター機能を示し、任意で前記野生型Ｆｃが、ヒトＩｇＧ１である、請求項１０８に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた７、１２、１３、１５、１６、１８、２１、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４１、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５１、５３、５４、５５、５７、５８、６１、６２、６３、６４、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、及び／または９７に対応する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、請求項８３〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた

に対応する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、請求項８３〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、１つまたは複数の位置１３、１８、２１、２２、２４、２６、２７、３３、３５、３７、３８、４１、４３、４６、４７、４８、５３、６１、６２、６８、７０、７１、７９、８５、８７、８８、９０、９１、９３、９４、９５または９７位に対応する１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、任意で前記１つまたは複数のアミノ酸改変が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに基づいた

から選択される、請求項８３〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
前記１つまたは複数のアミノ酸改変が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載の位置の番号付けに基づいた

から選択される、請求項８３〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、
アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ、
アミノ酸改変Ａ２６Ｅ、
アミノ酸改変Ｅ３５Ｄ、
アミノ酸改変Ｄ４６Ｅ、
アミノ酸改変Ｄ４６Ｖ、
アミノ酸改変Ｍ４７Ｉ、
アミノ酸改変Ｍ４７Ｌ、
アミノ酸改変Ｖ６８Ｍ、
アミノ酸改変Ａ７１Ｇ、
アミノ酸改変Ｌ８５Ｑ、または
アミノ酸改変Ｄ９０Ｇ
を含む、請求項８３〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、アミノ酸改変

を含む、請求項８３〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、アミノ酸改変Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ、Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ、またはＥ３５Ｄ／Ｖ６８Ｍを含む、請求項８３〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、アミノ酸改変Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８ＭまたはＥ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ／Ｖ６８Ｍを含む、請求項８３〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、アミノ酸改変Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｉ／Ｌ７０Ｍを含む、請求項８３〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、アミノ酸改変Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｖ／Ｎ４８Ｋ／Ｖ６８Ｍ／Ｋ８９Ｎを含む、請求項８３〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、アミノ酸改変Ｈ１８Ｙ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３５Ｄ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ａ７１Ｇ／Ｄ９０Ｇを含む、請求項８３〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、アミノ酸改変Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｅ／Ｍ４７Ｖ／Ｖ６８Ｍ／Ｄ９０Ｇ／Ｋ９３Ｅを含む、請求項８３〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、アミノ酸改変Ｅ３５Ｄ／Ｄ４６Ｖ／Ｍ４７Ｌ／Ｖ６８Ｍ／Ｌ８５Ｑ／Ｅ８８Ｄを含む、請求項８３〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫調節タンパク質が可溶性であり、任意で、前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＣＤ８０膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを欠く、請求項８３〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
前記非改変ＣＤ８０が、（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に記載のアミノ酸の配列を含むか、（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むか、または（ｉｉｉ）ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片を含む（ｉ）もしくは（ｉｉ）の一部分である、請求項８３〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＩｇＶドメインもしくはその特異的結合断片であるか、またはそれを含む、請求項８３〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
前記ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片が、前記免疫調節タンパク質の唯一のＣＤ８０部分である、請求項８３〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸改変を含む、請求項８３〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫調節タンパク質がＦｃ融合タンパク質である、請求項８３〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
前記疾患または状態が、腫瘍またはがんである、請求項８１、８２、及び８６〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
前記対象が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２の拮抗物質による治療後、寛解後に再発したか、不応性になったか、またはノンレスポンダーである、請求項７５〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
前記拮抗物質が抗ＰＤ−１抗体、任意でニボルマブまたはペンブロリズマブである、請求項１３０に記載の方法。
前記免疫応答が減少される、請求項７５〜８１のいずれか１項に記載の方法。
前記疾患または状態が、炎症性または自己免疫性疾患または状態である、請求項７５〜８１及び１３２のいずれか１項に記載の方法。
生体試料中のＣＤ８０結合パートナーを検出する方法であって、
（ａ）生体試料を、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチドを含む結合試薬と接触させることと、
（ｂ）前記生体試料の細胞内または細胞上に結合した前記結合試薬の存在を検出することと
を含む、前記方法。
前記結合パートナーが、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはこれらの組み合わせである、請求項１３４に記載の方法。
前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、非改変ＣＤ８０またはその特異的結合断片のＩｇＶドメインまたはＩｇＣドメインまたはその特異的結合断片の１つまたは複数の位置に１つまたは複数のアミノ酸改変を含み、前記バリアントＣＤ８０ポリペプチドが、ＰＤ−Ｌ１のエクトドメインへの非改変ＣＤ８０の結合親和性と比較してＰＤ−Ｌ１のエクトドメインに対して増加した結合親和性を示す、請求項１３４または請求項１３５に記載の方法。
前記生体試料が、体液、細胞、もしくは組織試料であるか、またはそれを含む、請求項１３４〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
前記体液が、血清、血漿、または尿である、請求項１３７に記載の方法。
前記組織試料が、腫瘍組織試料である、請求項１３７に記載の方法。
前記腫瘍組織試料が、腫瘍浸潤免疫細胞、腫瘍細胞、間質細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１３９に記載の方法。
前記ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片を含む、請求項１３４〜１４０のいずれか１項に記載のバリアントＣＤ８０ポリペプチド。
前記ＩｇＶドメインまたはその特異的結合断片が、前記結合試薬の唯一のＣＤ８０部分である、請求項１４１に記載の方法。
前記結合試薬が、検出可能部分である標識にまたは検出することのできる部分に直接または間接的に連結される、請求項１３４〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
前記部分がＦｃ領域である、請求項１４３に記載の方法。
前記Ｆｃ領域が非ヒト、任意でマウスまたはウサギである、請求項１４４に記載の方法。
結合した結合試薬の存在の検出が、免疫組織化学、偽免疫組織化学、免疫蛍光、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、または免疫ブロッティングによる、請求項１３４〜１４５のいずれか１項に記載の方法。