JP2020515269A

JP2020515269A - α−アミラーゼ組み合わせ変異体

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Publication number: JP2020515269A
Application number: JP2019553847A
Authority: JP
Inventors: ラッシーラ、ジョナサン; ダブリューレイマー、サンドラ
Original assignee: ダニスコ・ユーエス・インク
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-04-02
Publication date: 2020-05-28
Anticipated expiration: 2038-04-02
Also published as: MX2019011375A; CN110662836A; WO2018184004A1; CN110662836B; JP7672197B2; US20210095268A1; CA3057713A1; EP3601553A1

Abstract

変異α−アミラーゼに関連する組成物及び方法が開示される。変異α−アミラーゼは、例えば、デンプンの液化及び糖化のため、洗濯、食器洗浄及び他の用途におけるデンプン質の染みを洗浄するため、繊維加工（例えば、糊抜き）のため、消化性を改善するための動物飼料において、並びに製パン及び醸造のために有用である。【選択図】図１

Description

優先権
本出願は、これにより参照して全体として本明細書に組み込まれる、２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４７９，７２６号明細書の利益を主張するものである。

複数の組み合わせ可能な突然変異を含有する変異α−アミラーゼに関連する組成物及び方法が開示される。変異α−アミラーゼは、例えば、デンプンの液化及び糖化、デンプン質の染みの洗浄、布地の糊抜き、製パン及び醸造のために有用である。

デンプンは、アミロース（１５〜３０重量／重量％）及びアミロペクチン（７０〜８５重量／重量％）の混合物からなる。アミロースは、約６０，０００〜約８００，０００の分子量（ＭＷ）を有するα−１，４−結合グルコース単位の直鎖からなる。アミロペクチンは、各２４〜３０グルコース単位毎にα−１，６分岐点を含有する分岐状ポリマーであり、そのＭＷは１億の高さであり得る。

濃縮デキストロースシロップの形態にあるデンプン由来の糖は、現在、（１）α−アミラーゼを用いた固体デンプンの約７〜１０の平均重合度を有するデキストリンへのゼラチン化及び液化（又は粘度低下）と、（２）生じた液化デンプン（すなわち、デンプン加水分解物）のアミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ又はＧＡとも呼ばれる）を用いた糖化とを含む、酵素触媒プロセスによって製造されている。生じたシロップは、グルコース含量が高い。商業的に製造されるグルコースシロップの多くは、引き続きイソシロップとして公知のデキストロース／フルクトース混合物へ酵素的に異性化される。結果として生じるシロップは、例えば、エタノール、クエン酸、乳酸、コハク酸、イタコン酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸塩、リシン、他の有機酸、他のアミノ酸及び他の生化学物質を含む市販の製品を製造するために、例えば酵母などの微生物を用いて発酵させることもできる。発酵及び糖化は、より大きい経済性及び効率を達成するために同時に実施することができる（すなわち、ＳＳＦプロセス）。

α−アミラーゼは、無作為に内部α−１，４−グルコシド結合を切断することによってデンプン、グリコーゲン及び関連する多糖類を加水分解する。特にバチルス（Ｂａｃｉｌｌ）属由来のα−アミラーゼは、デンプンの液化及び糖化、布地の糊抜き、紙パルプ産業におけるデンプン改質、醸造、製パン、食品工業のためのシロップの製造、発酵プロセスのための供給原料の製造並びに消化性を上昇させるための動物用飼料を含む、広範囲の様々な目的のために使用されてきた。これらの酵素は、食器洗浄及び洗濯洗浄中にデンプン質の汚れ及び染みを除去するために使用することもできる。

多くの刊行物は、α−アミラーゼにおける突然変異について記載してきた。しかし、全ての突然変異が異なる分子において同一の作用を生成するわけではなく、全ての突然変異が組み合わされ得るわけでもない。さらに、多くの突然変異は、他の特性を犠牲にして所定の望ましい性質を有する分子を生成する。強固な改変α−アミラーゼ分子に対する必要が存在する。

本組成物及び方法は、変異アミラーゼポリペプチド及びそれらの使用方法に関する。本組成物及び方法の態様及び実施形態は、以下の個別にナンバリングした段落で要約する。
１．１つの態様では、親α−アミラーゼの組み換え変異体であって：
（ａ）配列番号１を使用して、Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｔ１８３及びＧ１８４に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、及び任意選択的に、Ｔ１８３、Ｅ１９０、Ｍ２０２、Ｑ１７２、Ａ１８６及び／又はＩ３２４に対応するアミノ酸残基での突然変異であって、変異α−アミラーゼ又は親α−アミラーゼが、ナンバリングのために使用される配列番号１に対して、少なくとも９１％、任意選択的に９２％、任意選択的に９３％、任意選択的に９４％、任意選択的に９５％、任意選択的に９６％、任意選択的に９７％、任意選択的に９８％又は任意選択的に９９％のアミノ酸配列同一性を有し、変異体が、親α−アミラーゼ又は変異α−アミラーゼとは突然変異が非存在であることだけが異なる参照α−アミラーゼと比較して、自動食器洗浄において改良された洗浄性能を有する欠失及び突然変異、又は、
（ｂ）（ａ）における変異体のアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加を含み、及び（ａ）における変異体の活性を有する、親α−アミラーゼの組み換え変異体が提供される。
２．一部の実施形態では、段落１の変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｒ１８１及びＧ１８２、又はＴ１８３及びＧ１８４に対応するアミノ酸残基の欠失を含む。
３．一部の実施形態では、段落１〜２のいずれかの変異α−アミラーゼは、下記の位置：
Ｔ１８３及びＥ１９０、
Ｔ１８３及びＭ２０２、
Ｅ１９０及びＭ２０２、
Ｔ１８３、Ｅ１９０及びＭ２０２、
Ｑ１７２及びＡ１８６、
Ａ１８６及びＩ３２４、
Ｑ１７２及びＩ３２４、
Ｑ１７２、Ａ１８６及びＩ３２４、
Ｑ１７２、Ａ１８６及びＭ２０２、
Ａ１８６、Ｉ３２４及びＭ２０２、
Ｑ１７２、Ｉ３２４及びＭ２０２又は
Ｑ１７２、Ａ１８６、Ｉ３２４及びＭ２０２
で突然変異を有する。
４．一部の実施形態では、段落１〜３のいずれかの変異α−アミラーゼは、下記の突然変異：
Ｔ１８３Ｄ及びＥ１９０Ｐ、
Ｔ１８３Ｄ及びＭ２０２Ｌ、
Ｔ１８３Ｄ、Ｅ１９０Ｐ及びＭ２０２Ｌ、
Ｑ１７２Ｒ及びＡ１８６Ｇ、
Ａ１８６Ｇ及びＩ３２４Ｍ、
Ｑ１７２Ｒ及びＩ３２４Ｍ、
Ｑ１７２Ｒ、Ａ１８６Ｇ及びＩ３２４Ｍ、
Ｑ１７２Ｒ、Ａ１８６Ｇ及びＭ２０２Ｌ、
Ａ１８６Ｇ、Ｉ３２４Ｍ及びＭ２０２Ｌ、
Ｑ１７２Ｒ、Ｉ３２４Ｍ及びＭ２０２Ｌ又は
Ｑ１７２Ｒ、Ａ１８６Ｇ、Ｉ３２４Ｍ及びＭ２０２Ｌを有する。
５．段落１〜４のいずれかの変異α−アミラーゼの一部の実施形態では、変異体は、ストリンジェントな条件下で、配列番号２のポリヌクレオチド又はその補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。
６．また別の態様では、段落１〜５のいずれかの変異アミラーゼをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又はそのポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む発現宿主が提供される。
７．また別の態様では、段落１〜５のいずれかの変異アミラーゼを含む、デンプンを液化するための組成物が提供される。
８．また別の態様では、段落１〜５のいずれかの変異アミラーゼを含む洗剤組成物が提供される。
９．また別の態様では、デンプンをオリゴ糖へ変換するための方法であって、デンプンを有効量の段落１〜５のいずれかの変異アミラーゼと接触させる工程を含む方法が提供される。
１０．また別の態様では、表面からデンプン質の染み又は汚れを除去するための方法であって、その表面を、有効量の段落１〜４のいずれかの変異アミラーゼと接触させる工程と、水性組成物中で溶解するより小さいデンプン由来分子を生成し、それにより表面からデンプン質の染みを除去するために、ポリペプチドがデンプン質の染み中に存在するデンプン成分を加水分解することを可能にする工程とを含む方法が提供される。

本組成物及び方法のこれらや他の態様及び実施形態は、本明細書の説明及び図面から明白になるであろう。

不活性化酵素を含むＣＡＳＣＡＤＥ（登録商標）ＰＬＡＴＩＮＵＭ（商標）食洗機用洗剤配合中の酵素のデンプン洗浄性能を示すグラフである。

不活性化酵素を含むＦＩＮＩＳＨ（登録商標）ＱＵＡＮＴＵＭ（商標）食洗機用洗剤配合中の酵素のデンプン洗浄性能を示すグラフである。

変異α−アミラーゼ酵素に関連する組成物及び方法について記載する。変異アミラーゼ酵素の典型的な用途は、デンプンの液化及び糖化のため、洗濯、食器洗浄及び他の用途におけるデンプン質の染みを洗浄するため、繊維加工産業（例えば、糊抜き）のため、動物飼料において消化性を改善するため、並びに製パン及び醸造のためである。以下では、本組成物及び方法のこれら及び他の態様について詳細に記載する。

本組成物及び方法の様々な態様及び実施形態について説明する前に、以下の定義及び略語について説明する。

１．定義及び略語
この詳細な説明によると、以下の略語及び定義が適用される。文脈が明白に他のことを指示していない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、複数の対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「酵素」という言及は、複数のそのような酵素を含み、「用量」という言及は、１つ以上の用量及び当業者であれば公知であるその同等物を含む。

本明細書は、読み易くするために多くのセクションで編成されている。しかしながら、読者は、１つのセクションでなされた記載を他のセクションに適用できることを理解できるであろう。このように、本開示の異なるセクションで使用された見出しを限定的であると解釈すべきではない。

他に特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解される意味と同一の意味を有する。下記では、以下の用語を提供する。

１．１．略語及び頭字語
以下の略語／頭字語は、他に特に規定しない限り、以下の意味を有する。
ＤＮＡデオキシリボ核酸
ＥＣ酵素委員会
ＦＨフランス硬度
ＧＡグルコアミラーゼ
ＧＨ一般硬度
ＨＤＬ高密度液体洗剤
ＨＤＤ強力粉末洗剤
ＨＳＧ高泡立ち顆粒洗剤
ＨＦＣＳ高フルクトースコーンシロップ
ＩＲＳ不溶性残留デンプン
ｋＤａキロダルトン
ＭＷ分子量
ＭＷＵ修正ウォルゲムート単位；１．６×１０^−５ｍｇ／ＭＷＵ＝活性の単位
ＮＣＢＩ全米バイオテクノロジー情報センター
ＰＩ性能指数
ｐｐｍ百万分の１、例えば乾燥固体１ｇ当たりのタンパク質（μｇ）
ＲＣＦ相対遠心力／求心力（すなわち、ｘ重力）
ＲＮＡリボ核酸
ｓｐ．種
Ｔｍ融解温度
ｗ／ｖ重量／体積
ｗ／ｗ重量／重量
ｖ／ｖ体積／体積
ｗｔ％重量％
℃ 摂氏温度
Ｈ_２Ｏ水
ｄＨ_２Ｏ又はＤＩ脱イオン水
ｄＩＨ_２Ｏ脱イオン水、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ濾過
ｇ又はｇｍグラム
μｇマイクログラム
ｍｇミリグラム
ｋｇキログラム
μＬ及びμｌマイクロリットル
ｍＬ及びｍｌミリリットル
ｍｍミリメートル
μｍマイクロメートル
Ｍモル
ｍＭミリモル
μＭマイクロモル
Ｕ単位
ｓｅｃ秒
ｍｉｎ（ｓ）分
ｈｒ（ｓ）時間
ＥＴＯＨエタノール
Ｎ規定の
ＭＷＣＯ分子量カットオフ
ＣＡＺｙ糖質関連酵素データベース

１．２．用語の定義
用語「アミラーゼ」又は「デンプン分解酵素」は、特にデンプンの分解を触媒できる酵素を指す。α−アミラーゼは、デンプン中のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グリコシド結合を切断するヒドロラーゼである。一般に、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１；α−Ｄ−（１→４）−グルカングルカノヒドロラーゼ）は、無作為方法でデンプン分子内のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グリコシド結合を切断して、３つ以上の（１−４）−α−結合Ｄ−グルコース単位を含有する多糖類を生成するエンド作用性酵素であると定義されている。これとは対照的に、エキソ作用性デンプン分解酵素、例えばβ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２；α−Ｄ−（１→４）−グルカンマルトヒドロラーゼ）及びマルトジェニックα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）のような一部の生成物特異的アミラーゼは、基質の非還元末端から多糖分子を切断する。β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０；α−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３；α−Ｄ−（１→４）−グルカングルコヒドロラーゼ）並びにマルトテトラオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）及びマルトヘキサオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９８）のような生成物特異的アミラーゼは、特定の長さのマルト−オリゴ糖又は特定のマルトオリゴ糖の濃縮シロップを生成することができる。

用語「デンプン」は、式（Ｃ_６Ｈ_１０Ｏ_５）_Ｘ（式中、Ｘは任意の数であり得る）を有するアミロース及びアミロペクチンから構成される植物の複合多糖炭水化物から構成される、任意の物質を指す。この用語には、植物系物質、例えば穀物、穀草類、草類、塊茎及び根、並びにより詳細には小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、米、ソルガム、フスマ、キャッサバ、キビ、ミロ、ジャガイモ、サツマイモ及びタピオカから得られた物質が含まれる。用語「デンプン」には、粒状デンプンが含まれる。用語「粒状デンプン」は、生の、すなわち未調理デンプン、例えば糊化を受けていないデンプンを指す。

ポリペプチドに関連する「野生型」、「親」又は「参照」という用語は、１つ以上のアミノ酸の位置での人為的な置換、挿入又は欠失を含まない天然型ポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関連する「野生型」、「親」又は「参照」という用語は、人為的なヌクレオシド変化を含まない天然型ポリヌクレオチドを指す。しかし、野生型、親又は参照のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然型ポリヌクレオチドに限定されず、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを包含することに留意されたい。

野生型ポリペプチドへの言及は、ポリペプチドの成熟形を含むと理解される。「成熟」ポリペプチド又はその変異体は、例えば、そのポリペプチドの発現中又は発現後のポリペプチドの未熟系から切断されて、その中にシグナル配列が非存在であるポリペプチド又は変異体である。

ポリペプチドに関する用語「変異体」は、アミノ酸の１つ以上の天然型又は人為的置換、挿入又は欠失を含むという点で特定の野生型、親又は参照ポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する用語「変異体」は、ヌクレオチド配列において特定の野生型、親又は参照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドを指す。野生型、親又は参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドの同一性は、文脈から明らかになるであろう。

本α−アミラーゼの場合、「活性」は、本明細書で記載するように測定できるα−アミラーゼ活性を指す。

用語「性能の利点」は、分子の望ましい特性における改良を意味する。典型的な性能の利点には、デンプン基質の増加した加水分解、増加した穀物、穀草類又は他のデンプン基質の液化性能、増加した洗浄性能、増加した耐熱性、増加した洗剤安定性、増加した貯蔵安定性、増加した溶解性、変化したｐＨプロファイル、減少したカルシウム依存性、増加した比活性、改質された基質特異性、改質された基質結合、改質されたｐＨ依存性活性、改質されたｐＨ依存性安定性、増加した酸化安定性及び増加した発現が含まれるがそれらに限定されない。一部の場合には、性能利点は、相当に低い温度で実現される。一部の場合には、性能利点は、相当に高い温度で実現される。

用語「プロテアーゼ」及び「プロテイナーゼ」は、タンパク質を形成するペプチド又はポリペプチド鎖内でアミノ酸を一緒に結合するペプチド結合の加水分解を意味する、「タンパク質分解」又は「タンパク質分解的切断」を実施する能力を有する酵素タンパク質を指す。タンパク質消化酵素としてのプロテアーゼのこの活性は、「タンパク質分解活性」と呼ばれる。

用語「セリンプロテアーゼ」は、それらの酵素中でセリンが酵素活性部位で求核性アミノ酸として機能するタンパク質中のペプチド結合を切断する酵素を指す。セリンプロテアーゼは、それらの構造に基づいて、キモトリプシン様（トリプシン様）又はサブチリシン様の２つの広義のカテゴリーに分類される。洗濯用洗剤及び食器洗浄用洗剤中で最も一般的に使用されるのは、セリンプロテアーゼ、特にサブチリシン類である。

「組み合わせ変異体」は、２つ以上の突然変異、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれを超える置換、欠失及び／又は挿入を含む変異体である。

「組み合わせ可能な突然変異」は、組み合わせ変異体を作成するために使用できる任意のアミノ酸位置での突然変異である。組み合わせ可能な突然変異は、発現、活性又は安定性のいずれも有意には減少させずに、分子（この場合にはアミラーゼ）の少なくとも１つの所望の特性を改良する。

用語「組み換え」は、対象細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関して使用した場合、対象がその自然状態から修飾されていることを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）形内で見いだされない遺伝子を発現するか、又は異なるレベル若しくは自然で見いだされる条件と異なる条件下で天然遺伝子を発現する。組み換え核酸は、天然配列と１つ以上のヌクレオチドが相違する、及び／又は、例えば発現ベクター内の異種プロモーターなどの異種配列と機能的に連結している。組み換えタンパク質は、天然配列とは１つ以上のアミノ酸が異なることがある、及び／又は異種配列と融合している。アミラーゼをコードする核酸を含むベクターは、組み換えベクターである。

用語「回収（された）」、「単離（された）」及び「分離（された）」は、自然に見いだされるようにそれが自然に結び付いている少なくとも１つの他の物質又は構成成分から除去されている化合物、タンパク質（ポリペプチド）、細胞、核酸、アミノ酸又は他の特定の物質又は構成成分を指す。それらの「単離（された）」ポリペプチドには、異種宿主細胞内で発現した分泌ポリペプチドを含有する細胞培養ブロスが含まれるが、それには限定されない。

用語「精製（された）」は、相当に純粋な状態、例えば、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋又は少なくとも約９９％純粋でさえある物質（例えば、単離ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を指す。

用語「濃縮（された）」は、約５０％純粋、少なくとも約６０％純粋、少なくとも約７０％純粋又は少なくとも約７０％純粋でさえある物質（例えば、単離ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を指す。

酵素に関連する用語「熱安定性の」及び「熱安定性」は、酵素が高温への曝露後に活性を保持する能力を指す。酵素、例えばアミラーゼ酵素の熱安定性は、その時間中に規定条件下で酵素活性の半分が失われる、分、時間又は日数で与えられるその半減期（ｔ１／２）によって測定される。半減期は、高温への曝露（すなわち、高温によるチャレンジ）後の残留α−アミラーゼ活性を測定することによって計算され得る。

酵素に関連する「ｐＨ範囲」は、酵素が触媒活性を示すｐＨ値の範囲を指す。

酵素に関連する用語「ｐＨ安定性の」及び「ｐＨ安定性」は、酵素が規定の時間（例えば、１５分間、３０分間、１時間）にわたって広範囲のｐＨ範囲にわたり活性を保持する能力に関する。

用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」と同義語であり、互換的に使用される。そのようなアミノ酸配列が活性を示す場合、それらは「酵素」と呼ぶことができる。アミノ酸残基に対しては従来型の１文字コード又は３文字コードが使用され、アミノ酸配列は、標準のアミノからカルボキシ末端方向（すなわち、Ｎ→Ｃ）で表示される。

用語「核酸」は、ポリペプチドをコードできるＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二本鎖及び合成分子を含む。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、化学修飾を含有することができる。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用される。遺伝コードは縮重しているため、特定のアミノ酸をコードするために２個以上のコドンを使用することができ、本組成物及び方法は、特定アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。他に規定しない限り、核酸配列は、５’−から３’−の方向に表示される。

「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション技術及びＰＣＲ技術中に発生するので、それにより核酸の１本の鎖が相補鎖との二本鎖を、すなわち塩基対を形成するプロセスを指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、下記の条件：６５℃及び０．１×ＳＳＣ（式中、１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０）でのハイブリダイゼーションによって例示される。ハイブリダイズした二本鎖核酸は、ハイブリダイズした核酸の２分の１が相補的鎖と対にならない融解温度（Ｔｍ）を特徴とする。二本鎖内のミスマッチヌクレオチドは、Ｔｍを低下させる。変異α−アミラーゼをコードする核酸は、配列番号２のヌクレオチドとその同一相補体との間で形成された二本鎖と比較して１℃〜３℃以上低いＴｍを有する可能性がある。

「合成」分子は、生物によってではなく、むしろｉｎｖｉｔｒｏ化学合成又は酵素合成によって生成される。

細胞に関して使用される用語「形質転換（された）」、「安定性で形質転換された」及び「トランスジェニック」は、細胞が、そのゲノム内に組み込まれた非天然の（例えば、異種の）核酸配列を含有するか、又は複数世代を通して維持されるエピソームとして運ばれることを意味する。

細胞内へ核酸配列を挿入することに関連して、用語「導入（された）」は、当技術分野において公知であるように「トランスフェクション」、「形質転換」又は「形質導入」を意味する。

「宿主株」又は「宿主細胞」は、その中に関心対象のポリペプチド（例えば、アミラーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター、ファージ、ウイルス又は他のＤＮＡ構築物が導入されている生物である。典型的な宿主株は、関心対象のポリペプチドを発現することができる、及び／又は糖類を発酵させられる微生物細胞（例えば、細菌、糸状菌及び酵母）である。用語「宿主細胞」には、細胞から作成されたプロトプラストが含まれる。

ポリヌクレオチド又はタンパク質に関連した用語「異種の」は、宿主細胞中で自然には発生しないポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。

ポリヌクレオチド又はタンパク質に関連した用語「内在性の」は、宿主細胞中で自然に発生するポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。

用語「発現」は、それによりポリペプチドが核酸配列に基づいて生成されるプロセスに関する。このプロセスには、転写及び翻訳の両方が含まれる。

「選択的マーカー」又は「選択可能なマーカー」は、遺伝子を運ぶ宿主細胞の選択を容易にするために宿主内で発現させることのできる遺伝子を指す。選択可能なマーカーの例としては、抗生物質（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン又はクロラムフェニコール）及び／又は宿主細胞に代謝上の利点、例えば栄養上の利点を付与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

「ベクター」は、核酸を１種以上の細胞型に導入するように設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセットなどが含まれる。

「発現ベクター」は、関心対象のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味するが、そのコーディング配列は、好適な宿主内のＤＮＡの発現を実施できる好適な制御配列に機能的に連結している。そのような制御配列には、転写を生じさせるプロモーター、転写を制御する任意選択的オペレーター配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列が含まれ得る。

用語「機能的に連結した」は、特定の構成成分が意図された方法で機能することを許容する関係（並列を含むがそれには限定されない）にあることを指す。例えば、調節配列は、コーディング配列の発現が調節配列の制御下にあるようにコーディング配列に機能的に連結している。

「シグナル配列」は、細胞外部へのタンパク質の分泌を容易にする、タンパク質のＮ末端部分に付着しているアミノ酸の配列である。細胞外タンパク質の成熟形は、分泌プロセス中に切断して除かれるシグナル配列を欠如している。

「生物活性」は、例えば酵素活性などの特定の生物活性を有する配列を指す。

用語「比活性」は、特定条件下で単位時間当たりの酵素又は酵素調製物によって生成物に変化させることのできる基質のモル数を指す。比活性は、一般に単位（Ｕ）／ｍｇ（タンパク質）として表示される。

本明細書で使用する「水の硬度」は、水中に存在する無機質（例えば、カルシウム及びマグネシウム）の尺度である。

「材料見本」は、そこに適用された染みを有する織物などの一片の材料である。材料は、例えば、綿、ポリエステル又は天然繊維と合成繊維の混合物から製造された織物であり得る。材料見本は、さらに、紙、例えば濾紙若しくはニトロセルロース、又は例えば陶器、金属若しくはガラスなどの一片の硬質材料であってもよい。アミラーゼについて、染みは、デンプンベースであるが、血液、牛乳、インク、草、茶、ワイン、ホウレンソウ、グレイビー、チョコレート、卵、チーズ、粘土、顔料、油又はこれらの化合物の混合物を含むことができる。

「小さい材料見本」は、単一孔穿孔機を用いて切断された、又は注文製造された９６孔穿孔装置を用いて切断された１切片の材料見本であり、ここで、多孔パンチのパターンは、標準９６ウエルマイクロタイタープレートに適合しているか、又はその切片が別の方法で材料見本から取り除かれている。材料見本は、布地、紙、金属又は他の好適な材料の材料見本であってよい。小さい材料見本は、それが２４ウエル、４８ウエル若しくは９６ウエルマイクロタイタープレートのウエル内に配置される前又は配置された後のいずれかに付着された染みを有する可能性がある。小さい材料見本は、材料の小片に染みを適用することによって作成することもできる。例えば、小さい材料見本は、直径が５／８’’又は０．２５’’の織物の染み付き片であってよい。注文製造された穿孔機は、９６ウエルプレートの全ウエルに９６片の材料見本を同時に送達する方法で設計される。この装置は、同一の９６ウエルプレートに単純に複数回装填することによって１ウエル当たり２個以上の材料見本の送達を可能にする。多孔穿孔機は、２４ウエル、４８ウエル又は９６ウエルプレートを含むがそれらに限定されない任意のフォーマットプレートに材料見本を同時に送達することを想定され得る。また別の想定可能な方法では、汚れ試験プラットフォームは、金属、プラスチック、ガラス、陶器又は固体基質でコーティングされている他の好適な物質から製造されたビーズであり得る。１つ以上のコーティングされたビーズは、次に好適なバッファー及び酵素を含有する、９６ウエル、４８ウエル若しくは２４ウエルプレート以上の大きいフォーマットのウエル内に配置される。

「アミラーゼを含む培養細胞物質」又は類似の用語は、構成成分としてアミラーゼを含む細胞溶解物又は上清（培地を含む）を指す。細胞物質は、アミラーゼを生成する目的のために培養中で増殖される異種宿主由来であり得る。

「配列同一性率（％）」は、特定配列が、デフォルトパラメーターを備えるＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムを使用して整列させた場合、特定参照配列内のアミノ酸残基と同一である少なくとも所定のパーセンテージのアミノ酸残基を有することを意味する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．（１９９４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：４６７３−４６８０を参照されたい。ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムのためのデフォルトパラメーターは、次の通りである：
ギャップ開始ペナルティ：１０．０
ギャップ伸張ペナルティ：０．０５
タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭシリーズ
ＤＮＡ重量マトリックス：ＩＵＢ
ディレイ発散配列（％）：４０
ギャップ分離距離：８
ＤＮＡ遷移重量：０．５０
親水性残基のリスト：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ
負のマトリックスの使用：ＯＦＦ
トグル残基特異的ペナルティ：ＯＮ
トグル親水性ペナルティ：ＯＮ
トグル末端ギャップ分離ペナルティ：ＯＦＦ

欠失は、参照配列と比較して非同一の残基として計数される。

「融合（した）」ポリペプチド配列は、２つの対象ポリペプチド配列間のペプチド結合によって接続されている、すなわち機能的に連結されている。

用語「糸状菌」は、ユウミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての糸状体、特にペジゾミコチナ（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）種を指す。

用語「乾燥固体含量」（ｄｓ）は、乾燥重量％ベースでのスラリーの総固体に関する。用語「スラリー」は、不溶性固体を含有する水性混合物を指す。

語句「同時の糖化及び発酵（ＳＳＦ）」は、例えばエタノール産生微生物などの微生物有機体及びアミラーゼなどの少なくとも１種の酵素が同一プロセス工程中に存在する生化学薬品の製造におけるプロセスを指す。ＳＳＦには、（顆粒状、液化又は可溶化）デンプン基質のグルコースを含む糖類への同時の加水分解、及び同一反応容器内でのアルコール又は他の生化学物質若しくは生体物質への糖類の発酵が含まれる。

「エタノール産生微生物」は、糖又はオリゴ糖をエタノールに変換させる能力を備える微生物を指す。

用語「発酵飲料」は、発酵プロセス、例えば微生物発酵、例えば細菌及び／又は真菌発酵などを含む方法によって生成された任意の飲料を指す。「ビール」は、そのような発酵飲料の一例であり、用語「ビール」は、デンプン含有植物性物質の発酵／醸造によって製造された任意の発酵麦芽汁を含むことが意図されている。ビールは、麦芽若しくは添加剤又は麦芽及び添加剤の任意の組み合わせからのみ製造されることが多い。

用語「麦芽」は、任意の麦芽入り穀物、例えば麦芽入り大麦又は小麦を指す。

用語「添加剤」は、例えば大麦麦芽又は小麦麦芽などの麦芽ではない植物性物質を含有する任意のデンプン及び／又は糖を指す。添加剤の例としては、一般的なコーングリッツ、精製コーングリッツ、醸造用粉砕酵母、米、ソルガム、精製コーンスターチ、大麦、大麦デンプン、脱穀大麦、小麦、小麦デンプン、焙焼穀物、穀物フレーク、ライ麦、オート麦、ジャガイモ、タピオカ、キャッサバ並びに例えばコーンシロップ、サトウキビシロップ、転化糖、大麦及び／又は小麦シロップなどのシロップが挙げられる。

用語「マッシュ」は、後に麦芽汁と使用済み穀物とに分離される、水と混和された植物性物質、例えば製粉用穀物、例えば破砕大麦麦芽、破砕大麦及び／又は他の添加剤若しくはそれらの組み合わせを含有する任意のデンプン及び／又は糖の水性スラリーを指す。

用語「麦芽汁」は、マッシュ化中に挽いた穀物を抽出した後に放出される未発酵酒を指す。

用語「約」は、参照値の±１５％を指す。

２．α−アミラーゼ変異体
本組成物及び方法の１つの態様は、工業用途におけるそれらの性能を改良する突然変異の組み合わせを含む変異α−アミラーゼ酵素である。組み合わせ変異体は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）由来のα−アミラーゼに基づき、本明細書では「ＢｓｐＡｍｙ２４」と呼ぶ。ＢｓｐＡｍｙ２４ α−アミラーゼポリペプチドの成熟形のアミノ酸配列は、下記に配列番号１として示した。

出発点として配列番号１を使用して、多数の組み合わせ変異体を作成し、北米自動食器洗浄（ＡＤＷ）条件下で高レベルの洗浄性能を備える変異体を同定することに重点を置いて試験した。優秀な洗浄性能を有した幾つかの変異体が同定された。

最高に機能する変異ＢｓｐＡｍｙ２４ α−アミラーゼの全部ではないが一部は、ナンバリングのために配列番号１（上記で、下線を付した）を使用すると、Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｔ１８３及びＧ１８４に対応するカルシウム結合ループに隣接するＸ_１Ｇ／Ｓ_１Ｘ_２Ｇ_２モチーフ内に欠失を含有していた。Ｒ１８１及びＧ１８２又はＴ１８３及びＧ１８４に対応するアミノ酸残基のペアワイズ欠失は、Ｘ_１Ｇ／Ｓ_１Ｘ_２Ｇ_２モチーフの性質を有するために、一般に、安定性を改良すること、及びカルシウム依存性を低下させることに同等に有効である。Ｒ１８１及びＧ１８２に対応するアミノ酸残基の欠失は、「ΔＲＧ」と呼ぶことができるが、他方、Ｔ１８３及びＧ１８４に対応するアミノ酸残基内の欠失は、「ΔＴＧ」と呼ぶことができる。

最高に機能する変異体内に存在する他の突然変異は、ナンバリングのために配列番号１を使用すると、下記の：
Ｔ１８３、Ｅ１９０、Ｍ２０２、Ｑ１７２、Ａ１８６及び／又はＩ３２４、例えば、
Ｔ１８３＋Ｅ１９０、
Ｔ１８３＋Ｍ２０２、
Ｔ１８３＋Ｅ１９０＋Ｍ２０２、
Ｑ１７２＋Ａ１８６＋Ｉ３２４及び
Ａ１８６＋Ｉ３２４に示した位置にある。

最高に機能する変異体内に存在する特異的突然変異は、ナンバリングのために配列番号１を使用すると、
Ｔ１８３Ｄ、Ｅ１９０Ｐ、Ｍ２０２Ｌ、Ｑ１７２Ｒ、Ａ１８６Ｇ及び／又はＩ３２４Ｍ、例えば、
Ｔ１８３Ｄ＋Ｅ１９０Ｐ、
Ｔ１８３Ｄ＋Ｍ２０２Ｌ、
Ｔ１８３Ｄ＋Ｅ１９０Ｐ＋Ｍ２０２Ｌ、
Ｑ１７２Ｒ＋Ａ１８６Ｇ＋Ｉ３２４Ｍ及び
Ａ１８６Ｇ＋Ｉ３２４Ｍに示した。

これらの突然変異の組み合わせは、Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｔ１８３及び／又はＧ１８４に対応する位置で上記の欠失と結び付けて使用され得る。置換Ｔ１８３Ｄは、溶解度に大きな影響を及ぼす可能性があるが、性能に有意に寄与するとは思われない。上記の突然変異は、α−アミラーゼにおいて記載された他の突然変異と結び付いている可能性が高く、それについてはかなりの量の公開特許文献が存在する。

一部の実施形態では、本α−アミラーゼ変異体は、突然変異の指示された組み合わせ及び配列番号１との規定程度のアミノ酸配列相同性／同一性、例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％さえのアミノ酸配列相同性／同一性を有する。

一部の実施形態では、本α−アミラーゼ変異体は、指示された突然変異の組み合わせを有し、配列番号１との規定程度のアミノ酸配列相同性／同一性、例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％さえのアミノ酸配列相同性／同一性を有する親アミラーゼに由来する。

さらに、本アミラーゼは、任意の数の保存的アミノ酸置換を含み得る。典型的な保存的アミノ酸置換は、表１に列挙した。

本アミラーゼは、さらにアミノ酸配列内の１個若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加、例えば１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満又は２個未満さえの置換、欠失若しくは付加による上記に記載したアミラーゼ変異体のいずれかに由来してもよい。そのような変異体は、それからそれらが由来したアミラーゼと同一の活性を有するはずである。

読者は、上述の保存的突然変異の一部を遺伝子操作によって生成することができ、他の保存的突然変異が、遺伝的又は他の手段によって合成アミノ酸をポリペプチド内に導入することによって生成されることを理解するであろう。

本アミラーゼは、その場合にはシグナル配列を含む「前駆体」、「未成熟」若しくは「全長」、又はその場合にはシグナル配列を欠如している「成熟」である可能性がある。ポリペプチドの成熟形態が、一般に、最も有用である。他に特に規定されていない限り、本明細書で使用するアミノ酸残基のナンバリングは、各アミラーゼポリペプチドの成熟形態を指す。本アミラーゼポリペプチドは、結果として生じたポリペプチドがアミラーゼ活性を保持する限り、Ｎ末端又はＣ末端を除去するために先端が切断されてもよい。

本アミラーゼは、それが第１アミラーゼポリペプチドの少なくとも一部分及び第２アミラーゼポリペプチドの少なくとも一部分を含むという点で、「キメラ」又は「ハイブリッド」ポリペプチドであり得る（そのようなキメラアミラーゼは、近年、ドメイン−スワップアミラーゼとして「再発見」されている）。本アミラーゼは、異種シグナル配列、トラッキング又は精製を可能にするエピトープなどをさらに含んでいてもよい。典型的な異種シグナル配列は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ（ＬＡＴ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡｍｙＥ又はＡｐｒＥ）及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属ＣｅｌＡ由来である。

２．５．変異アミラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド
また別の態様では、変異アミラーゼポリペプチドをコードする核酸が提供される。この核酸は、特定のアミラーゼポリペプチド、又は特定のアミラーゼとの規定程度のアミノ酸配列同一性を有するアミラーゼをコードする可能性がある。

一部の実施形態では、核酸は、配列番号１（シグナル配列をコードする核酸の部分を除く）との少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％さえの相同性／同一性を有するアミラーゼをコードする。遺伝子コードの縮重に起因して、複数の核酸が同一ポリペプチドをコードする可能性があることは理解されるであろう。

一部の実施形態では、核酸は、配列番号１（シグナル配列をコードする核酸の部分を除く）との少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％さえの相同性／同一性を有するアミラーゼをコードする（又はコードする核酸に相補的である）核酸にとってストリンジェント又は極めてストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。

一部の実施形態では、核酸は、配列番号２との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％さえの同一性を有する。一部の実施形態では、核酸は、配列番号２の核酸にとって、又はこの核酸の相補体にとってストリンジェント又は極めてストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。

３．変異アミラーゼの生成
本変異アミラーゼは、宿主細胞中において、例えば当技術分野で周知の方法を使用して、分泌又は細胞内発現によって生成することができる。発酵、分離及び濃縮技術は、当技術分野において周知であり、従来型の方法を使用すると、濃縮した変異α−アミラーゼポリペプチド含有溶液を調製することができる。

生産規模を回復するためには、変異α−アミラーゼポリペプチドは、ポリマーを用いた綿状沈殿を介して細胞を除去することによって、一般に上記に記載したように濃縮又は部分的に精製することができる。又は、酵素は、精密濾過と、その後に利用可能な膜及び装置を使用する限外濾過による濃縮とによって濃縮又は精製することができる。しかし、一部の用途では、酵素は濃縮又は精製する必要がなく、全ブロス培養を溶解させ、それ以上の処理を行わずに使用することができる。酵素は、次に、例えば顆粒に加工処理することができる。

４．変異アミラーゼの組成物及び使用
変異アミラーゼは、様々な工業用途のために有用である。例えば、変異アミラーゼは、デンプン変換プロセスにおいて、特に液化を受けているデンプンの糖化プロセスにおいて有用である。所望の最終生成物は、デンプン基質の酵素的変換によって生成できる任意の製品であり得る。例えば、所望の生成物は、例えばＨＦＣＳの調製などの他のプロセスにおいて使用できる、又は例えばアスコルビン酸中間物（例えば、グルコン酸塩；２−ケト−Ｌ−グロン酸；５−ケト−グルコン酸；及び２，５−ジケトグルコン酸塩）；１，３−プロパンジオール；芳香族アミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン及びトリプトファン）；有機酸（例えば、乳酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、イソクエン酸塩及びオキサロ酢酸塩）；アミノ酸（例えば、セリン及びグリシン）；抗生物質；抗菌剤；酵素；ビタミン剤；及びホルモン剤などの多数の有用な製品に変換させることができるグルコース及びマルトースが豊富なシロップであり得る。

デンプン変換プロセスは、燃料用又は飲料用のアルコール（飲用アルコール）のためのアルコールを生成するために設計された発酵プロセスの前又はそれと同時に行われてよい。当業者であれば、これらの最終生成物の製造において使用することができる様々な発酵条件を認識している。変異アミラーゼは、食品調製物の組成物及び方法でも有用である。以下では、変異アミラーゼのこれらの様々な使用についてより詳細に説明する。

４．１．デンプン基質の調製
当業者であれば、本明細書に開示したプロセスで使用するためのデンプン基質を調製するために使用できる利用可能な方法を明確に認識している。例えば、有用なデンプン基質は、塊茎、根、茎、豆果、穀草類又は全穀物から得ることができる。より具体的には、粒状デンプンは、トウモロコシ、トウモロコシ穂軸、小麦、大麦、ライ麦、ライ小麦、ミロ、サゴ、キビ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、米、エンドウマメ、マメ、バナナ又はジャガイモから得ることができる。トウモロコシは、約６０〜６８％のデンプンを含有し、大麦は、約５５〜６５％のデンプンを含有し、キビは、約７５〜８０％のデンプンを含有し、小麦は、約６０〜６５％のデンプンを含有し、及び精白米は、７０〜７２％のデンプンを含有する。特に企図されるデンプン基質は、コーンスターチ及び小麦デンプンである。穀物からのデンプンは、粉砕されているか又は全粒であり得、例えば核種、フスマ及び／又は穂軸などのトウモロコシ固体が含まれる。デンプンは、高度に精製された生デンプン又はデンプン精製プロセスからの供給原料でもあり得る。様々なデンプンは、市販でも入手できる。例えば、コーンスターチは、Ｃｅｒｅｓｔａｒ、Ｓｉｇｍａ及びＫａｔａｙａｍａＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙＣｏ．（日本）から入手でき、小麦デンプンは、Ｓｉｇｍａから入手でき、サツマイモデンプンは、ＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙＣｏ．（日本）から入手でき、及びジャガイモデンプンは、ＮａｋａａｒｉＣｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．（日本）から入手できる。

デンプン基質は、非デンプン分画、例えば胚残渣及び繊維を含有する粉砕全穀物からの粗デンプンであり得る。製粉工程は、湿式製粉又は乾式製粉又は粉砕のいずれかを含むことができる。湿式製粉では、全穀物は、穀粒をその構成成分、例えばデンプン、タンパク質、胚、油、核繊維に分離するために水又は希酸中に浸漬される。湿式製粉は、胚と粉（すなわち、デンプン顆粒及びタンパク質）を効率的に分離し、シロップを製造するために特に好適である。コーン油の約９０％は、胚内に含まれる。乾式製粉又は粉砕では、全核は、微粉末に粉砕され、穀物は、その構成成分に分画せずに加工処理されることが多い。一部の場合、核由来の油及び／又は繊維が回収される。したがって、乾式粉砕穀物は、デンプンに加えて、有意な量の非デンプン炭水化物化合物を含むであろう。デンプン基質の乾式粉砕は、エタノール及び他の生化学物質の製造のために使用できる。加工処理すべきデンプンは、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９．５％純粋の高度に精製されたデンプン品質であり得る。

４．２．デンプンのゼラチン化及び液化
本明細書で使用する用語「液化」又は「液化する」は、それによってデンプンが低粘性及びより短鎖のデキストリンに変換されるプロセスを意味する。一般に、このプロセスは、α−アミラーゼの添加と同時の又はそれが後に続くデンプンのゼラチン化を含むが、追加の液化誘導酵素を任意選択的に添加することができる。一部の実施形態では、上述したように調製したデンプン基質は、水を用いてスラリー化される。デンプンスラリーは、約１０〜５５％、約２０〜４５％、約３０〜４５％、約３０〜４０％又は約３０〜３５％の重量％の乾燥固体としてデンプンを含有することができる。α−アミラーゼは、例えば、計量型ポンプを用いてスラリーに添加され得る。この用途のために典型的に使用されるα−アミラーゼは、熱安定性の細菌α−アミラーゼ、例えばゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼである。α−アミラーゼは、通常、例えば約１，５００単位／ｋｇ（デンプンの乾燥物質）で供給される。α−アミラーゼの安定性及び活性を最適化するために、スラリーのｐＨは、典型的には約ｐＨ４．５〜６．５に調整され、約１ｍＭのカルシウム（約４０ｐｐｍの遊離カルシウムイオン）を、使用するアミラーゼの特性に依存して添加することもできる。液化後にスラリー内に残留している細菌α−アミラーゼは、その後の反応工程においてｐＨを低下させる工程、又は酵素がカルシウム依存性である場合、スラリーからカルシウムを除去する工程を含む多数の方法によって非活性化することができる。

デンプン＋α−アミラーゼのスラリーは、１０５℃へ蒸気加熱されるジェットクッカーを通して継続的にポンプ輸送され得る。ゼラチン化は、これらの条件下で迅速に発生し、有意な剪断力と結合された酵素活性は、デンプン基質の加水分解を開始させる。ジェットクッカー内の滞留時間は短い。部分的にゼラチン化されたデンプンを１０５〜１１０℃に維持された一連の保持管内に通過させ、５〜８分間保持するとゼラチン化プロセスを完了することができる（「一次液化」）。必要とされるＤＥの加水分解は、約１〜２時間にわたり８５〜９５℃以上の高温において保持タンク内で完了する（「二次液化」）。これらのタンクは、逆混和を防止するためにバッフルを含有していてよい。本明細書で使用する用語「二次液化の分数」は、二次液化の開始からデキストロース当量（ＤＥ）が測定される時間まで経過した時間を指す。スラリーは、次に室温に冷却される。この冷却工程は、３０分間〜１８０分間、例えば９０分間〜１２０分間であり得る。液化デンプンは、典型的には、約１０〜５０％；約１０〜４５％；約１５〜４０％；約２０〜４０％；約２５〜４０％；又は約２５〜３５％の乾燥固体含量（重量／重量）を有するスラリーの形態である。

変異アミラーゼを用いた液化は、有利には、ｐＨを約ｐＨ５．５〜６．５に調整するための要件を排除する低ｐＨで実施することができる。変異アミラーゼは、２〜７のｐＨ範囲、例えばｐＨ３．０〜７．５、ｐＨ４．０〜６．０又はｐＨ４．５〜５．８での液化のために使用できる。変異アミラーゼは、約８５℃〜９５℃、例えば８５℃、９０℃又は９５℃の温度範囲で液化活性を維持することができる。例えば、液化は、２５％のＤＳコーンスターチ溶液中の８００μｇのアミラーゼを用いて、例えばｐＨ５．８及び８５℃、又はｐＨ４．５及び９５℃で１０分間にわたり実施することができる。液化活性は、当技術分野における公知の多数の粘度アッセイのいずれかを使用してアッセイすることができる。

本アミラーゼ変異体を使用する特定の実施形態では、デンプンの液化は、例えば、高純度グルコースシロップ、ＨＦＣＳ、マルトデキストリンなどを生成するために９０〜１１５℃の温度範囲で実施される。

４．３．糖化
液化デンプンは、任意選択的に別の酵素の存在下で変異アミラーゼを使用して、低ＤＰ（例えば、ＤＰ１＋ＤＰ２）糖が富裕なシロップに糖化することができる。糖化の生成物の正確な組成は、使用する酵素の組み合わせ及び加工処理される粒状デンプンのタイプに依存する。有利には、提供される変異アミラーゼを使用して入手できるシロップは、糖化デンプン中の全オリゴ糖の３０％を超える、例えば４５％〜６５％又は５５％〜６５％の重量％のＤＰ２を含有する可能性がある。糖化デンプン中の（ＤＰ１＋ＤＰ２）の重量％は、約７０％、例えば７５％〜８５％又は８０％〜８５％を超える可能性がある。本アミラーゼは、シロップ生成物中でグルコースの相当に高い、例えば２０％を超えるＤＰ１の収率も生じさせる。

液化は、一般に連続プロセスとして実施されるが、糖化は、バッチプロセスとして実施されることが多い。糖化は、典型的には約６０〜６５℃の温度及び約４．０〜４．５のｐＨ、例えばｐＨ４．３で最も効果的であるため、液化デンプンを冷却してｐＨを調整することが必要になる。温度及びｐＨ範囲は、酵素の特性に依存して変動する可能性がある。糖化は、例えば、約４０℃、約５０℃又は約５５℃〜約６０℃又は約６５℃の温度で実施することができる。糖化は、通常は撹拌槽内で実施され、これは充填又は空にするために数時間を要することがある。酵素は、典型的には、タンクに充填される場合の乾燥固体に対する固定比率において、又は充填段階の開始時に１回量として添加される場合のいずれかで添加される。シロップを製造するための糖化反応は、典型的には約２４〜７２時間、例えば２４〜４８時間にわたり実施される。最高又は所望のＤＥに達すると、反応は、例えば、５分間にわたり８５℃に加熱することによって停止される。その後のインキュベーションは、蓄積されたグルコースが、イソマルトース及び／又は酵素的復帰反応及び／又は熱力学的平衡のアプローチを用いた他の復帰生成物へ再重合するにつれて、より低いＤＥ、最終的には約９０ＤＥまでを生じさせるであろう。アミラーゼを使用する場合、糖化は、最適には約３０℃〜約７５℃、例えば４５℃〜７５℃又は４７℃〜７４℃の温度範囲で実施される。糖化する工程は、約ｐＨ３〜約ｐＨ７、例えばｐＨ３．０〜ｐＨ７．５、ｐＨ３．５〜ｐＨ５．５、ｐＨ３．５、ｐＨ３．８又はｐＨ４．５のｐＨ範囲にわたって実施され得る。

α−アミラーゼは、組成物の形態でスラリーに添加され得る。α−アミラーゼは、約０．６〜１０ｐｐｍ（ｄｓ）、例えば２ｐｐｍ（ｄｓ）の量で粒状デンプン基質のスラリーに添加することができる。α−アミラーゼは、全ブロス、浄化、濃縮、部分精製又は精製酵素として添加することができる。アミラーゼの比活性は、例えば、ＰＡＨＢＡＨアッセイを用いて測定して約３００Ｕ／ｍｇ（酵素）であり得る。α−アミラーゼは、全プロス生成物として添加することもできる。

α−アミラーゼは、単離酵素溶液としてスラリーに添加され得る。例えば、α−アミラーゼは、アミラーゼを発現する宿主細胞によって生成された培養細胞物質の形態で添加することができる。α−アミラーゼは、この酵素が反応内に連続的に提供されるように、発酵又はＳＳＦプロセス中の反応培地中に宿主細胞によって分泌されてもよい。アミラーゼを生成及び分泌する宿主細胞は、例えば、グルコアミラーゼなどの追加の酵素を発現することもできる。例えば、米国特許第５，４２２，２６７号明細書は、アルコール飲料の製造における酵母中のグルコアミラーゼの使用について開示している。例えば、宿主細胞、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）又はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）は、糖化中にα−アミラーゼ及びグルコアミラーゼ、例えばＨｇＧＡ、ＴｒＧＡ又はＴｒＧＡ変異体を共発現するように改変することができる。宿主細胞は、その内在性グルコアミラーゼ及び／又は他の酵素、タンパク質若しくは他の物質を発現しないように遺伝子操作することができる。宿主細胞は、広範囲の様々な糖分解酵素を発現するように改変することができる。例えば、組み換え酵母宿主細胞は、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、ペントース糖を利用する酵素、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ及び／又はイソプルラナーゼをコードする核酸を含むことができる。例えば、国際公開第２０１１／１５３５１６Ａ２号パンフレットを参照されたい。

４．４．異性化
アミラーゼを用いた処理により生成される可溶性デンプン加水分解物は、高フルクトースデンプン系シロップ（ＨＦＳＳ）、例えば高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）に変換され得る。この変換は、グルコースイソメラーゼ、特に固体担体上に固定されたグルコースイソメラーゼを使用して達成できる。ｐＨは、（イソメラーゼに依存して）約６．０〜約８．０、例えばｐＨ７．５に上昇させられ、Ｃａ^２＋は、イオン交換によって除去される。好適なイソメラーゼには、ＳＷＥＥＴＺＹＭＥ（登録商標）、ＩＴ（ＮｏｖｏｚｙｍｅｓＡ／Ｓ）；Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）ＩＭＧＩ並びにＧ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９３、ＫＥＴＯＭＡＸ（登録商標）、Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９３、Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９３液及びＧＥＮＳＷＥＥＴ（登録商標）ＩＧＩが含まれる。異性化後、混合物は、典型的には約４０〜４５％のフルクトース、例えば４２％のフルクトースを含有する。

４．５．発酵
可溶性デンプン加水分解物、特に高グルコースシロップは、デンプン加水分解物を発酵生物と、典型的には約３２℃の、例えばアルコール産生酵母のためには３０℃〜３５℃の温度で接触させることによって発酵させることができる。発酵の温度及びｐＨは、発酵生物に依存するであろう。ＥＯＦ生成物には、代謝産物、例えばクエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、イタコン酸及び他のカルボン酸、グルコノΔ−ラクトン、エリソルビン酸ナトリウム、リシン及び他のアミノ酸、Ω３脂肪酸、ブタノール、イソプレン、１，３−プロパンジオール並びに他の生体物質が含まれる。

エタノール産生微生物としては、酵母、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び細菌、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを発現するザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｌｉｓ）が挙げられる。エタノール産生微生物は、キシロースをキシルロースに変換させるキシロースレダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼを発現することができる。例えば、高温に抵抗できるエタノール産生微生物の改良株は、当技術分野において公知であり、使用できる。Ｌｉｕｅｔａｌ．（２０１１）ＳｈｅｎｇＷｕＧｏｎｇＣｈｅｎｇＸｕｅＢａｏ２７：１０４９−５６を参照されたい。酵母の商業的供給源には、ＥＴＨＡＮＯＬＲＥＤ（登録商標）（ＬｅＳａｆｆｒｅ）；ＦＥＲＭＡＸ（商標）（Ｍａｒｔｒｅｘ）、ＴＨＥＲＭＯＳＡＣＣ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）；ＲＥＤＳＴＡＲ（登録商標）（ＲｅｄＳｔａｒ）；ＦＥＲＭＩＯＬ（登録商標）（ＤＳＭＳｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）；及びＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（登録商標）（Ａｌｌｔｅｃｈ）が含まれる。発酵によって例えばクエン酸及び乳酸などの他の代謝産物を生産する微生物も当技術分野において公知である。例えば、Ｐａｐａｇｉａｎｎｉ（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２５：２４４−６３；Ｊｏｈｎｅｔａｌ．（２００９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２７：１４５−５２を参照されたい。

糖化及び発酵プロセスは、ＳＳＦプロセスとして実施され得る。発酵は、例えば、その後のエタノールの濃縮、精製及び回収を含むことができる。発酵中、ブロス又は「ビール」のエタノール含量は、約８〜１８体積／体積％、例えば１４〜１５体積／体積％に達する場合がある。ブロスは、エタノールの濃縮された、例えば９６％純粋の溶液を生成するために蒸留され得る。さらに、発酵によって生成したＣＯ_２は、ＣＯ_２スクラバーを用いて収集し、圧縮し、例えば、炭酸飲料又はドライアイスの製造などの他の使用のために市場に出すことができる。発酵プロセスからの固形廃棄物は、高タンパク質生成物、例えば家畜の飼料として使用できる。

上述のように、ＳＳＦプロセスは、ＳＳＦを通してアミラーゼを連続的に発現して分泌する真菌細胞を用いて実施することができる。アミラーゼを発現する真菌細胞は、発酵微生物、例えばエタノール産生微生物でもあり得る。したがって、エタノールの製造は、外部から酵素を添加する必要がほとんどないように十分なアミラーゼを発現する真菌細胞を使用して実施することができる。真菌宿主細胞は、適切に改変された真菌株由来であり得る。アミラーゼに加えて、他の酵素を発現及び分泌する真菌宿主細胞も使用できる。そのような細胞は、グルコアミラーゼ及び／又はプルラナーゼ、フィターゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、β−アミラーゼセルラーゼ、キシラナーゼ、他のヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、β−グルコシダーゼ、ペクチナーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ又は他の酵素を発現する場合がある。

このプロセスの変形は、基質が発酵の進行につれて少しずつ添加される「フェドバッチ発酵」システムである。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を抑制できる場合、及び培地中で限定量の基質を有することが所望である場合に有用である。フェドバッチシステム内での実際の基質濃度は、例えばｐＨ、溶存酸素及びＣＯ_２などの排気ガスの部分圧などの測定可能な因子の変化よって推定される。バッチ発酵及び流加発酵は、当該技術分野において一般的であり、よく知られている。

連続発酵は規定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に添加し、処理のために等量の馴化培地を同時に除去するオープンシステムである。連続発酵は、一般に、細胞が主として対数期増殖にある一定の高密度で培養を維持する。連続発酵は、細胞増殖及び／又は生成物濃度の調節を許容する。例えば、炭素源又は窒素源などの制限栄養因子は、一定比率に維持され、他の全てのパラメーターは調節することが許容される。増殖は定常状態で維持されるため、除去される培地に起因する細胞消失は、発酵中の細胞増殖率に対してバランスが取られなければならない。連続発酵プロセスを最適化して生成物形成速度を最大化するための方法は、工業微生物学の分野において周知である。

４．６．変異アミラーゼを含む組成物
変異アミラーゼは、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属グルコアミラーゼ又はその変異体と組み合わせることができる。典型的なグルコアミラーゼは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）及び優れた比活性及び熱安定性を有するその変異体である。米国特許出願公開第２００６／００９４０８０号明細書、同第２００７／０００４０１８号明細書及び同第２００７／００１５２６６号明細書（ＤａｎｉｓｃｏＵＳＩｎｃ．）を参照されたい。ＴｒＧＡの好適な変異体には、グルコアミラーゼ活性及び野生型ＴｒＧＡとの少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を備える変異体が含まれる。変異アミラーゼは、有利には、ＴｒＧＡによって触媒される糖化プロセスにおいて生成されるグルコースの収率を増加させる。

又は、グルコアミラーゼは、植物（藻類を含む）、真菌又は細菌に由来する別のグルコアミラーゼであり得る。例えば、グルコアミラーゼは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）Ｇ１又はＧ２グルコアミラーゼ又はその変異体（例えば、Ｂｏｅｌｅｔａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯＪ．３：１０９７−１１０２；国際公開第９２／００３８１号パンフレット；同第００／０４１３６号パンフレット（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ））；及びＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（例えば、同第８４／０２９２１号パンフレット（ＣｅｔｕｓＣｏｒｐ．）を参照されたい）であってよい。その他の企図されたアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属グルコアミラーゼには、強化された熱安定性を備える変異体、例えば、Ｇ１３７Ａ及びＧ１３９Ａ（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９−５０５）；Ｄ２５７Ｅ及びＤ２９３Ｅ／Ｑ（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８：５７５−５８２）；Ｎ１８２（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０１：２７５−２８１）；Ａ２４６Ｃ（Ｆｉｅｒｏｂｅｅｔａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：８６９８−８７０４）；並びにＡ４３５及びＳ４３６位にあるＰｒｏ残基を含む変異体（Ｌｉｅｔａｌ．（１９９７）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．１０：１１９９−１２０４）が含まれる。他の企図されるグルコアミラーゼには、特に、Ｔ．エメルソニイ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（例えば、国際公開第９９／２８４４８号パンフレット（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ）、Ｔ．レイセタヌス（Ｔ．ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ）（例えば、米国再発行特許第３２，１５３号明細書（ＣＰＣＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．））、Ｔ．デュポンティ（Ｔ．ｄｕｐｏｎｔｉ）又はＴ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、米国特許第４，５８７，２１５号明細書）に由来するタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属グルコアミラーゼが含まれる。企図された細菌グルコアミラーゼには、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、特にＣ．サーモアミロリチクム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）（例えば、欧州特許第１３５，１３８号明細書）（ＣＰＣＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）及びＣ．サーモヒドロスルフリクム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）（例えば、国際公開第８６／０１８３１号パンフレット（ＭｉｃｈｉｇａｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅ））由来のグルコアミラーゼが含まれる。好適なグルコアミラーゼには、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）に由来するグルコアミラーゼ、例えば国際公開第００／０４１３６号パンフレット（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ）に記載のグルコアミラーゼが含まれる。また好適であるのは、市販のグルコアミラーゼ、例えばＡＭＧ２００Ｌ；ＡＭＧ３００Ｌ；ＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲ及びＡＭＧ（商標）Ｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＯＰＴＩＤＥＸ（登録商標）３００及びＯＰＴＩＤＥＸＬ−４００（ＤａｎｉｓｃｏＵＳＩｎｃ．）；ＡＭＩＧＡＳＥ（商標）及びＡＭＩＧＡＳＥ（商標）ＰＬＵＳ（ＤＳＭ）；Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９００（ＥｎｚｙｍｅＢｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）；並びにＧ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９０ＺＲ（低プロテアーゼ含量を備えるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ）である。さらに他の好適なグルコアミラーゼには、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）グルコアミラーゼ、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属グルコアミラーゼ、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属グルコアミラーゼ、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属グルコアミラーゼ、サーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属グルコアミラーゼ、アテリア（Ａｔｈｅｌｉａ）属グルコアミラーゼ、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属グルコアミラーゼ（例えば、ＨｇＧＡ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属グルコアミラーゼ、アルトミセス（Ａｒｔｏｍｙｃｅｓ）属グルコアミラーゼ、グレエオフィルム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属グルコアミラーゼ、ピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属グルコアミラーゼ又はステチェリナム（Ｓｔｅｃｃｈｅｒｉｎｕｍ）属グルコアミラーゼが含まれる。グルコアミラーゼは、典型的には、約０．１〜２グルコアミラーゼ単位（ＧＡＵ）／ｇ（ｄｓ）、例えば約０．１６ＧＡＵ／ｇ（ｄｓ）、０．２３ＧＡＵ／ｇ（ｄｓ）又は０．３３ＧＡＵ／ｇ（ｄｓ）の量で添加される。

アミラーゼとともに使用できる他の好適な酵素には、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、異なるα−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、他のヘミセルラーゼ、β−グルコシダーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素又はそれらの組み合わせが含まれる。例えば、イソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）などの脱分枝酵素は、当業者に周知の有効量で添加することができる。プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、例えばＰＲＯＭＯＺＹＭＥ（登録商標）も好適である。プルラナーゼは、典型的には１００Ｕ／ｋｇ（ｄｓ）で添加される。別の好適な酵素には、プロテアーゼ、例えば真菌プロテアーゼ及び細菌プロテアーゼが含まれる。真菌プロテアーゼには、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）；ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属（例えば、Ｍ．ミエヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ））；リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属；及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属から得られた真菌プロテアーゼが含まれる。

β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）は、アミロペクチン及び関連グルコースポリマー内の１，４−α−グルコシド結合の加水分解を触媒し、それによりマルトースを放出するエキソ作用性麦芽産生アミラーゼである。β−アミラーゼは、様々な植物及び微生物から単離されている。Ｆｏｇａｒｔｙｅｔａｌ．（１９７９）ｉｎＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１１２−１１５を参照されたい。これらのβ−アミラーゼの最適温度は、４０℃〜６５℃の範囲内であり、最適ｐＨは、約４．５〜約７．０の範囲内である。企図されたβ−アミラーゼには、大麦ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＢＢＡ１５００、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＤＢＡ、ＯＰＴＩＭＡＬＴ（商標）ＭＥ、ＯＰＴＩＭＡＬＴ（商標）ＢＢＡ（ＤａｎｉｓｃｏＵＳＩｎｃ．）；及びＮＯＶＯＺＹＭ（商標）ＷＢＡ（ＮｏｖｏｚｙｍｅｓＡ／Ｓ）由来のβ−アミラーゼが含まれるがそれらに限定されない。

本アミラーゼを含む組成物は、バッファー、塩、保存料、水、共溶媒、界面活性剤などと一緒に、本明細書に列挙した追加の酵素の任意の１つ以上をさらに含んでいてよい水性又は非水性製剤、顆粒、粉末、ゲル、スラリー、ペーストなどであり得る。そのような組成物は、スラリー、水浴、洗濯機、食品又は飲料製品などの中に既に存在する内在性酵素又は他の成分、例えば、内在性植物（藻類を含む）酵素、先行する加工処理工程からの残留酵素などと組み合わせて機能することができる。

５．製パン及び食品調製のための組成物及び方法
本発明は、アミラーゼを含む食品、動物飼料及び／又は食品／飼料添加物を含むがそれらに限定されない「食品組成物」及び変異アミラーゼを１つ以上の食品成分と混和する工程を含む、そのような食品組成物を調製するための方法又はそれらの使用にも関する。

さらに、本発明は、食品組成物の調製におけるアミラーゼの使用であって、食品組成物が、本発明のポリペプチドの添加に続いて焼成される使用に関する。本明細書で使用する用語「製パン組成物」は、パン用粉、ドウ、製パン用添加物及び／又はベークド製品を含むがそれらに限定されない焼成食品を提供するプロセスにおいて調製される組成物及び／又は添加物を意味する。食品組成物又は添加物は、液体又は固体であり得る。

６．布地の糊抜き組成物及び使用
さらに、企図されているのは、アミラーゼを使用して織物を処理する（例えば、布地を糊抜きする）組成物及び方法である。織物の処理方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号明細書を参照されたい）。例えば、織物の感触及び外観は、布地を溶液中のアミラーゼと接触させる工程を含む方法によって改良することができる。織物は、加圧下で溶液を用いて処理することができる。

アミラーゼは、織物の機織り中又は機織り後、糊抜き段階又は１つ以上の追加の織物加工処理工程中に適用することができる。布地の機織り中、糸は、相当に強い機械的歪みに曝される。織機で織る前に、縦糸は、それらの引張強度を増加させるため、及び破壊を防止するために糊付けデンプン又はデンプン誘導体でコーティングされることが多い。アミラーゼは、これらの糊付けデンプン又はデンプン誘導体を除去するために機織り中又は機織り後に適用することができる。製織後、均質で抗洗濯性の結果を保証するために、織物のさらなる加工処理前に、糊付けコーティングを除去するためにアミラーゼを使用することができる。

アミラーゼは、単独で又は他の糊抜き化学試薬及び／又は糊抜き酵素とともに使用して、洗剤添加物として綿含有織物を含む織物を、例えば水性組成物中で糊抜きすることができる。アミラーゼは、インジゴ染色デニム織物及び衣服上にストーンウォッシュ外観を作り出すための組成物及び方法に使用することもできる。衣類を製造するために、織物を裁断して衣類又は衣服に縫製することができ、それらは後に仕上げ処理される。特にデニムのジーンズを製造するために、様々な酵素による仕上げ法が開発されている。デニム衣類の仕上げは、通常、酵素による糊抜きで開始され、その間に衣服は織物に柔らかさを提供し、綿にその後の酵素による仕上げ工程をより受け易くさせるためにタンパク質分解酵素の作用を受けさせる。アミラーゼは、デニムの衣服を仕上げ（例えば、「バイオストーン加工」）、酵素による糊抜き及び織物への柔らかさの付与及び／又は仕上げプロセスの方法において使用することができる。

７．洗浄組成物
本組成物及び方法の１つの態様は、構成成分としてアミラーゼを含む洗浄組成物である。アミラーゼポリペプチドは、例えば、手洗い洗浄、洗濯機洗浄、食器洗浄及び他の硬質表面を洗浄するための洗剤組成物中の構成成分として使用できる。そのような組成物には、単位用量フォーマットの洗濯用洗剤組成物を含む強力液体（ＨＤＬ）、強力乾燥（ＨＤＤ）及び手洗い（手作業）洗濯用洗剤組成物並びに単位用量フォーマットの食器洗浄組成物を含む自動食器洗浄（ＡＤＷ）及び手洗い（手作業）食器洗浄組成物が含まれる。

７．１．概説
好ましくは、アミラーゼは、洗剤中のアミラーゼのために従来より使用される濃度又はそれに近い濃度で洗剤に組み込まれる。例えば、アミラーゼポリペプチドは、洗液／食器洗浄洗液１Ｌ当たり（純粋酵素タンパク質として計算して）０．００００１〜１ｍｇのアミラーゼに相当する量で添加され得る。下記に例示するように、本明細書では、典型的な調製物を提供する。

アミラーゼポリペプチドは、唯一の酵素として、又は他のデンプン分解活性酵素を含む他の酵素とともに、洗剤組成物の構成成分であり得る。したがって、アミラーゼポリペプチドは、非粉化顆粒、安定化液又は保護酵素の形態で洗剤組成物中に含まれてよい。非粉化顆粒は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書及び同第４，６６１，４５２号明細書に開示されたように製造することができ、任意選択的に当技術分野において公知の方法によってコーティングすることができる。ワックス状コーティング物質の例は、１，０００〜２０，０００の平均分子量を備えるポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有し、さらに１５〜８０エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；脂肪酸のモノグリセリド及びジグリセリド及びトリグリセリドである。流動層技術による塗布のために好適なフィルム形成コーティング物質の例は、例えば、英国特許第１４８３５９１号明細書に記載されている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従ってプロピレングリコールなどのポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することによって安定化させることができる。他の酵素安定剤は、当技術分野において公知である。保護酵素は、例えば欧州特許第２３８２１６号明細書に開示された方法に従って調製することができる。ポリオールは、長年にわたりタンパク質の安定剤として、同様にタンパク質溶解性を改良すると認識されてきた。

本洗剤組成物は、例えば、粉末、顆粒、ペースト、バー又は液体などの任意の有用な形態であり得る。液体洗剤は、典型的には、約７０％までの水及び０％〜３０％の有機溶媒を含有する水性であり得る。液体洗剤は、水を約３０％しか含有しないコンパクトゲルタイプの形態であってもよい。

本洗剤組成物は、それらの各々がアニオン性、非イオン性、カチオン性又は両性イオン性であり得る１種以上の界面活性剤を含む。本洗剤は、通常、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）；α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）；アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）（ＡＳ）；アルコールエトキシスルフェート（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）；第２級アルカンスルホン酸塩（ＳＡＳ）；α−スルホ脂肪酸メチルエステル；アルキルコハク酸又はアルケニルコハク酸；又は石鹸などのアニオン性界面活性剤を０％〜約５０％含有するであろう。本組成物は、例えば、アルコールエトキシレート（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、国際公開第９２／０６１５４号パンフレットに記載されている）などの非イオン性界面活性剤を０％〜約４０％含有することもできる。

本洗剤組成物は、追加して１種以上の他の酵素、例えばプロテアーゼ、別のデンプン分解酵素、クチナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペルヒドロラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ及び／又はラッカーゼを任意の組み合わせで含むことができる。

本洗剤は、例えばゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキルコハク酸及びアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製のＳＫＳ−６）などの洗剤ビルダー又は錯化剤を約１％〜約６５％含有することができる。洗剤は、アンビルト、すなわち洗剤ビルダーを実質的に含んでいなくてもよい。酵素は、酵素の安定性と適合する任意の組成物中で使用することができる。酵素は、一般には、公知のカプセル化の形態により、例えば顆粒化又はヒドロゲル内への隔離により、有害な構成成分から保護することができる。酵素及び特にアミラーゼは、デンプン結合ドメインとともに、又はデンプン結合ドメインを伴わずに、洗濯及び食器洗浄用途、表面清浄剤を含む様々な組成物中、並びにデンプン又はバイオマスからのエタノール生産のための組成物中で使用できる。

本洗剤は、１種以上のポリマーを含むことができる。例としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー及びメタクリル酸／アクリル酸ラウリルコポリマーが挙げられる。

本洗剤は、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）又はノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（ＮＯＢＳ）などの過酸形成漂白活性剤と組み合わせることができ、例えば、過ホウ酸塩又は過炭酸塩などのＨ_２Ｏ_２源を含むことのできる漂白系を含有することができる。又は、漂白系は、ペルオキシ酸（例えば、アミド型、イミド型若しくはスルホン型ペルオキシ酸）を含んでいてもよい。漂白系は、酵素漂白系、例えば、国際公開第２００５／０５６７８３号パンフレットに記載されたようなペルヒドロラーゼであってもよい。

本洗剤組成物の酵素は、従来型の安定剤、例えばプロピレングリコール若しくはグリセロールなどのポリオール；糖若しくは糖アルコール；乳酸；ホウ酸若しくは芳香族ホウ酸エステルなどのホウ酸誘導体を使用して安定化させることができ、及び組成物は、例えば国際公開第９２／１９７０９号パンフレット及び同第９２／１９７０８号パンフレットに記載されたように調製することができる。

本洗剤は、他の従来型の洗剤成分、例えば粘土、発泡増強剤、起泡抑制剤、抗腐食剤、汚れ懸濁化剤、汚れ再付着防止剤、染料、殺菌剤、変色防止剤、蛍光増白剤又は香料を含む柔軟剤なども含有することができる。

ｐＨ（使用濃度の水溶液中で測定）は、通常、中性又はアルカリ性、例えば約７．０〜約１１．０のｐＨである。

以下では、本α−アミラーゼを包含するための洗剤組成物の特定の形態について記載する。これらの組成物の多くは、使用の容易さのために単位用量フォーマットで提供され得る。単位用量調製物及び包装については、例えば、米国特許出願公開第２００９０２０９４４５Ａ１号明細書、同第２０１０００８１５９８Ａ１号明細書、米国特許第７００１８７８Ｂ２号明細書、欧州特許第１５０４９９４Ｂ１号明細書、国際公開第２００１０８５８８８Ａ２号パンフレット、同第２００３０８９５６２Ａ１号パンフレット、同第２００９０９８６５９Ａ１号パンフレット、同第２００９０９８６６０Ａ１号パンフレット、同第２００９１１２９９２Ａ１号パンフレット、同第２００９１２４１６０Ａ１号パンフレット、同第２００９１５２０３１Ａ１号パンフレット、同第２０１００５９４８３Ａ１号パンフレット、同第２０１００８８１１２Ａ１号パンフレット、同第２０１００９０９１５Ａ１号パンフレット、同第２０１０１３５２３８Ａ１号パンフレット、同第２０１１０９４６８７Ａ１号パンフレット、同第２０１１０９４６９０Ａ１号パンフレット、同第２０１１１２７１０２Ａ１号パンフレット、同第２０１１１６３４２８Ａ１号パンフレット、同第２００８０００５６７Ａ１号パンフレット、同第２００６０４５３９１Ａ１号パンフレット、同第２００６００７９１１Ａ１号パンフレット、同第２０１２０２７４０４Ａ１号パンフレット、欧州特許第１７４０６９０Ｂ１号明細書、国際公開第２０１２０５９３３６Ａ１号パンフレット、米国特許第６７３０６４６Ｂ１号明細書、国際公開第２００８０８７４２６Ａ１号パンフレット、同第２０１０１１６１３９Ａ１号パンフレット及び同第２０１２１０４６１３Ａ１号パンフレットに記載されている。

７．２．強力液体（ＨＤＬ）洗濯用洗剤組成物
典型的なＨＤＬ洗濯用洗剤組成物は、アニオン性洗浄性界面活性剤（直鎖、分岐鎖若しくはランダム鎖の置換若しくは非置換アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルコキシル化アルキル硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩及び／又はそれらの混合物の群から選択される）、及び任意選択的に、非イオン性界面活性剤（直鎖、分岐鎖若しくはランダム鎖の置換若しくは非置換アルコキシル化アルキルアルコール、例えばＣ８〜Ｃ１８エトキシル化アルキルアルコール及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートの群から選択される）を含む洗浄性界面活性剤（１０重量／重量％〜４０重量／重量％）を含み、ここで、洗浄性アニオン性界面活性剤（６．０〜９の親水性指数（ＨＩｃ）を有する）対洗浄性非イオン性界面活性剤の重量比は１：１より大きい。好適な洗浄性界面活性剤としてはまた、カチオン性洗浄性界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル三元スルホニウム化合物及び／又はこれらの混合物の群から選択される）；双性イオン性及び／又は両性洗浄性界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインの群から選択される）；両性界面活性剤；半極性非イオン性界面活性剤、並びにこれらの混合物が挙げられる。

本組成物は、任意選択的に、両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー（分岐鎖親水性及び疎水性を有するアルコキシル化ポリマー、例えば０．０５重量％〜１０重量％の範囲内にあるアルコキシル化ポリアルキレンイミンの群から選択される）及び／又はランダムグラフトポリマー（典型的には不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、マレイン酸無水物、飽和ポリアルコール、例えばグリセロール及びそれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む親水性主鎖；並びにＣ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ１〜Ｃ６モノ−カルボン酸のビニルエステル、アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル及びそれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖を含む）からなる界面活性増強性ポリマーを含んでいてよい。

本組成物は、例えば、防汚ポリマー（非イオン性末端キャップ化ポリエステル、例えばＳＲＰ１、ランダム若しくはブロック構造にある糖、ジカルボン酸、ポリオール及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのモノマー単位を含むポリマー、ランダム又はブロック構造にあるエチレンテレフタレート系ポリマー及びそれらのコポリマー、例えばＲｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘＳＦ、ＳＦ−２及びＳＲＰ６、ＴｅｘｃａｒｅＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００及びＳＲＮ３２５、ＭａｒｌｏｑｕｅｓｔＳＬを含む）、再付着防止ポリマー（０．１重量％〜１０重量％、５００〜１００，０００Ｄａの範囲内の分子量において、カルボン酸ポリマー、例えばアクリル酸、マレイン酸（又はマレイン酸無水物）、フマル酸、イタコン酸、アコニット酸、メサコン酸、シトラコン酸、メチレンマロン酸及びそれらの任意の混合物、ビニルピロリドンホモポリマー及び／又はポリエチレングリコールなどから選択される少なくとも１つのモノマーを含むポリマーなどのカルボン酸ポリマーを含む）；セルロースポリマー（アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、その例にはカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース及びそれらの混合物が含まれるアルキルカルボキシアルキルセルロースから選択されるポリマーを含む）並びにポリマーカルボキシレート（例えば、マレイン酸／アクリル酸ランダムコポリマー又はポリアクリレートホモポリマー）などの追加のポリマーを含むことができる。

本組成物は、飽和又は不飽和脂肪酸、好ましくは飽和又は不飽和Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸（０重量％〜１０重量％）；沈着助剤（それらの例には、多糖類、好ましくはセルロースポリマー、ポリジアリルジメチルアンモニウムハロゲン化物（ＤＡＤＭＡＣ）及びランダム又はブロック構造にあるＤＡＤＭＡＣとビニルピロリドン、アクリルアミド、イミダゾール、イミダゾリニウムハロゲン化物及びそれらの混合物とのコポリマー、カチオン性グアールガム、例えばカチオン性ヒドキシエチルセルロースなどのカチオン性セルロース、カチオン性デンプン、カチオン性ポリアクリルアミド及びそれらの混合物が含まれる）をさらに含むことができる。

本組成物は、その例にマンガンフタロシアニン、ペルオキシダーゼ、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール及び／又はそれらの混合物が含まれる染料移動阻害剤；その例にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシエタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム塩（ＧＬＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、４，５−ジヒドロキシ−ｍ−ベンゼンジスルホン酸、クエン酸及びそれらの任意の塩、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）及びそれらの誘導体が含まれるキレート剤をさらに含むことができる。

本組成物は、好ましくは、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リソホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ及びそれらの任意の混合物から選択される酵素（一般に、活性酵素約０．０１重量％〜活性酵素０．０３重量％）を含んでいた。本組成物は、酵素安定剤（その例としては、プロピレングリコール若しくはグリセロールなどのポリオール、糖若しくは糖アルコール、乳酸、可逆性プロテアーゼ阻害剤、ホウ酸若しくはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステル又は４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体が挙げられる）を含むことができる。

本組成物は、任意選択的に、シリコーン系又は脂肪酸系起泡抑制剤；色相染料（ｈｕｅｉｎｇｄｙｅｓ）、カルシウムカチオン及びマグネシウムカチオン、視覚信号成分、消泡剤（０．００１重量％〜約４．０重量％）及び／又は構造化剤／増粘剤（０．０１重量％〜約５重量％、ジグリセリド及びトリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微結晶セルロース、セルロース系物質、マイクロファイバーセルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガム及びそれらの混合物からなる群から選択される）を含む。

本組成物は、任意の液体形態、例えば、液体若しくはゲル形態又はそれらの任意の組み合わせであり得る。本組成物は、任意の単位用量形態、例えばパウチであり得る。

７．３．強力乾燥／固体（ＨＤＤ）洗濯用洗剤組成物
典型的なＨＤＤ洗濯用洗剤組成物には、アニオン性洗浄性界面活性剤（例えば、直鎖若しくは分岐鎖若しくはランダム鎖の置換若しくは非置換アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩及び／又はそれらの混合物）、非イオン性洗浄性界面活性剤（例えば、直鎖若しくは分岐鎖若しくはランダム鎖の置換若しくは非置換Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシレート及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレート）、カチオン性洗浄性界面活性剤（例えば、アルキルピリジニウム化合物、アルキル第４級アンモニウム化合物、アルキル第４級ホスホニウム化合物、アルキル三元スルホニウム化合物及びこれらの混合物）、両性イオン性及び／又は両性洗浄性界面活性剤（例えば、アルカノールアミンスルホベタイン）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤及びそれらの混合物を含む洗浄性界面活性剤；リン酸非含有ビルダー（例えば、その例には０重量％〜１０重量％未満の範囲内のゼオライトＡ、ゼオライトＸ、ゼオライトＰ及びゼオライトＭＡＰが含まれるゼオライトビルダー）、リン酸塩ビルダー（例えば、０重量％〜１０重量％未満の範囲内のトリポリリン酸ナトリウム）、クエン酸、クエン酸塩及びニトリロ三酢酸、ケイ酸塩（例えば、０重量％〜１０重量％未満の範囲内のケイ酸ナトリウム若しくはケイ酸カリウム又はメタケイ酸ナトリウム、又は層状ケイ酸塩（ＳＫＳ−６））を含むビルダー；炭酸塩（例えば、０重量％〜８０重量％未満の範囲内の炭酸ナトリウム及び／又は重炭酸ナトリウム）；並びに光退色剤（例えば、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン染料及びそれらの混合物）、疎水性若しくは親水性漂白活性剤（例えば、ドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシ安息香酸若しくはその塩、３，５，５−トリメチヘキサノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、テトラアセチルエチレンジアミン−ＴＡＥＤ、ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩−ＮＯＢＳ、ニトリルクワット及びそれらの混合物）；過酸化水素源（例えば、その例には、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩若しくは過ケイ酸塩のナトリウム塩一水和物若しくは四水和物が含まれる無機過水和塩）、予備形成親水性及び／又は疎水性過酸（例えば、過カルボン酸及び塩、過炭酸及び塩、ペリミド酸及び塩、ペルオキシモノ硫酸及び塩及びそれらの混合物）及び／又は漂白触媒（例えば、イミン漂白増強剤（その例にはイミニウムカチオン及びポリイオンが含まれる）、イミニウム両性イオン、変性アミン、変性アミンオキシド、Ｎ−スルホニルイミン、Ｎ−ホスホニルイミン、Ｎ−アシルイミン、チアジアゾール二酸化物、ペルフルオロイミン、環状糖ケトン及びそれらの混合物並びに金属含有漂白触媒（例えば、例えば亜鉛若しくはアルミニウム及び封鎖剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）及びその水溶性塩などの補助金属カチオンと一緒に、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン若しくはマンガンカチオン）を含む漂白剤が含まれる。

本組成物は、好ましくは、酵素、例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リソホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ及びそれらの混合物を含む。

本組成物は、任意選択的に、香料マイクロカプセル、デンプンカプセル化香料アコード、色相剤、織物完全性及びカチオン性ポリマーを含む追加のポリマー、ダイロック成分、織物柔軟剤、増白剤（例えば、Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤）、凝集剤、キレート剤、アルコキシル化ポリアミン、織物沈着助剤及び／又はシクロデキストリンを含む追加の洗剤成分を含む場合がある。

７．４．自動食器洗浄（ＡＤＷ）洗剤組成物
上述のように、本α−アミラーゼ変異体は、ＡＤＷ用途において特に効果的である。典型的なＡＤＷ洗剤組成物には、０〜１０重量％の量で存在するエトキシル化非イオン性界面活性剤、アルコールアルコキシル化界面活性剤、エポキシキャップ化ポリ（オキシアルキル化）アルコール若しくはアミンオキシド界面活性剤を含む非イオン性界面活性剤；リン酸塩ビルダー（例えば、一リン酸塩、二リン酸塩、三ポリリン酸塩、他のオリゴマーポリリン酸塩、トリポリリン酸ナトリウム−ＳＴＰＰ）及びリン酸非含有ビルダー（例えば、０．５重量％〜５０重量％の範囲内のメチル−グリシン−二酢酸（ＭＧＤＡ）並びにその塩及び誘導体、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）並びにその塩及び誘導体、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）並びにその塩及び誘導体、カルボキシメチルイヌリン並びにその塩及び誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｂ−アラニン二酢酸（Ｂ−ＡＤＡ）及びそれらの塩、ポリ−カルボン酸のホモポリマー及びコポリマー並びにそれらの部分的若しくは完全中和塩、モノマーのポリカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸並びにそれらの塩を含むアミノ酸をベースとする化合物）を含む５〜６０％の範囲内のビルダー；寸法安定性を提供するために約０．１重量％〜約５０重量％の範囲内のスルホン化／カルボキシル化ポリマー；約０．１重量％〜約１０重量％の範囲内の乾燥助剤（例えば、ポリエステル、特にアニオン性ポリエステル、任意選択的に別の３〜６官能基を有するさらなるモノマーと一緒に − 典型的には重縮合を促進する酸、アルコール若しくはエステル官能基、ポリカーボネート、ポリウレタン及び／又はポリ尿素ポリオルガノシロキサン化合物若しくはそれらの、特に反応性環状炭酸塩及び尿素タイプの前駆体化合物）；約１重量％〜約２０重量％の範囲内のケイ酸塩（ケイ酸ナトリウム若しくはカリウム、例えば二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム及び結晶性フィロケイ酸塩を含む）；無機漂白剤（例えば、過水和物塩、例えば過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩及び過ケイ酸塩）及び有機漂白剤（例えば、ジアシル及びテトラアシルペルオキシドを含む有機ペルオキシ酸、特にジペルオキシドデカン二酸、ジペルオキシテトラデカン二酸及びジペルオキシヘキサデカン二酸）；漂白活性剤（すなわち、約０．１重量％〜約１０重量％の範囲内の有機過酸前駆体）；漂白触媒（例えば、トリアザシクロノナンマンガン及び関連錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ及びＦｅビスピリジルアミン及び関連錯体並びに酢酸ペンタミンコバルト（ＩＩＩ）及び関連錯体）；約０．１重量％〜５重量％の範囲内の金属ケア剤（例えば、ベンザトリアゾール、金属塩及び錯体及び／又はケイ酸塩）；自動食洗機用洗剤組成物１ｇ当たり約０．０１〜５．０ｍｇの活性酵素の範囲内の酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リソホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ及びそれらの混合物）；並びに酵素安定剤成分（例えば、オリゴ糖、多糖及び無機二価金属塩）が含まれる。

７．５．追加の洗剤組成物
以下では、本アミラーゼを添加することができる追加の典型的な洗剤調製物について、ナンバリングした段落に記載する。

１）（酸として計算して）約７％〜約１２％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約１％〜約４％のアルコールエトキシスルフェート（例えば、Ｃ１２〜１８アルコール、１〜２エチレンオキシド（ＥＯ））若しくは硫酸アルキル（例えば、Ｃ１６〜１８）；約５％〜約９％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１４〜１５アルコール、７ＥＯ）；約１４％〜約２０％の炭酸ナトリウム；約２〜約６％の可溶性ケイ酸塩；約１５％〜約２２％のゼオライト；０％〜約６％の硫酸ナトリウム；約０％〜約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸；約１１％〜約１８％の過ホウ酸ナトリウム；約２％〜約６％のＴＡＥＤ；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０〜３％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸、コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；（純粋酵素として計算して）０．０００１〜０．１％タンパク質の酵素；並びに０〜５％の微量成分（例えば、起泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、光退色剤）を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。

２）（酸として計算して）約６％〜約１１％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約１％〜約３％のアルコールエトキシスルフェート（例えば、Ｃ１２〜１８アルコール、１〜２ＥＯ））又は硫酸アルキル（例えば、Ｃ１６〜１８）；約５％〜約９％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１４〜１５アルコール、７ＥＯ）；約１５％〜約２１％の炭酸ナトリウム；約１％〜約４％の可溶性ケイ酸塩；約２４％〜約３４％のゼオライト；約４％〜約１０％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ_２ＳＯ_４）；０％〜約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；１〜６％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；０〜５％の微量成分（例えば、起泡抑制剤、香料）を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。

３）（酸として計算して）約５％〜約９％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約７％〜約１４％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ）；約１〜約３％の脂肪酸（例えば、Ｃ１６〜２２脂肪酸）としての石鹸；約１０％〜約１７％の炭酸ナトリウム；約３〜約９％の可溶性ケイ酸塩；約２３％〜約３３％のゼオライト；０％〜約４％の硫酸ナトリウム；約８％〜約１６％の過ホウ酸ナトリウム；約２％〜約８％のＴＡＥＤ；０％〜約１％のホスホン酸塩（例えば、ＥＤＴＭＰＡ）；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０〜３％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；及び０〜５％の微量成分（例えば、起泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。

４）（酸として計算して）約８％〜約１２％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約１０％〜約２５％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ）；約１４％〜約２２％の炭酸ナトリウム；約１％〜約５％の可溶性ケイ酸塩；約２５％〜約３５％のゼオライト；０％〜約１０％の硫酸ナトリウム；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；１〜３％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；及び０〜５％の微量成分（例えば、起泡抑制剤、香料）を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。

５）（酸として計算して）約１５％〜約２１％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約１２％〜約１８％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）；約３％〜約１３％の脂肪酸（例えば、オレイン酸）としての石鹸；０％〜約１３％のアルケニルコハク酸（Ｃ１２〜１４）；約８％〜約１８％のアミノエタノール；約２％〜約８％のクエン酸；０％〜約３％のホスホン酸塩；０％〜約３％のポリマー（例えば、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；０％〜約２％のホウ酸塩；０％〜約３％のエタノール；約８％〜約１４％のプロピレングリコール；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；及び０〜５％の微量成分（例えば、分散剤、起泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。

６）（酸として計算して）約１５％〜約２１％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；３〜９％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ、又はＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）；約３％〜約１０％の脂肪酸（例えば、オレイン酸）としての石鹸；約１４％〜約２２％のゼオライト；約９％〜約１８％のクエン酸カリウム；０％〜約２％のホウ酸塩；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０％〜約３％のポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＶＰ）；０％〜約３％のアンカリングポリマー、例えば、ラウリルメタクリル酸／アクリル酸コポリマー；モル比２５：１、ＭＷ３８００）；０％〜約５％のグリセロール；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；及び０〜５％の微量成分（例えば、分散剤、起泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性構造化液体洗剤組成物。

７）約５％〜約１０％の脂肪アルコール硫酸塩；約３％〜約９％のエトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド；０〜３％の脂肪酸としての石鹸；約５％〜約１０％の炭酸ナトリウム；約１％〜約４％の可溶性ケイ酸塩；約２０％〜約４０％のゼオライト；約２％〜約８％の硫酸ナトリウム；約１２％〜約１８％の過ホウ酸ナトリウム；約２％〜約７％のＴＡＥＤ；約１％〜約５％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；及び０〜５％の微量成分（例えば、蛍光増白剤、起泡抑制剤、香料）を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。

８）（酸として計算して）約８％〜約１４％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約５％〜約１１％のエトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド；０％〜約３％の脂肪酸としての石鹸；約４％〜約１０％の炭酸ナトリウム；約１％〜約４％の可溶性ケイ酸塩；約３０％〜約５０％のゼオライト；約３％〜約１１％の硫酸ナトリウム；約５％〜約１２％のクエン酸ナトリウム；約１％〜約５％のポリマー（例えば、ＰＶＰ、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；及び０〜５％の微量成分（例えば、起泡抑制剤、香料）を含む顆粒として調製された洗剤組成物。

９）（酸として計算して）約６％〜約１２％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約１％〜約４％の非イオン性界面活性剤；約２％〜約６％の脂肪酸としての石鹸；約１４％〜約２２％の炭酸ナトリウム；約１８％〜約３２％のゼオライト；約５％〜約２０％の硫酸ナトリウム；約３％〜約８％のクエン酸ナトリウム；約４％〜約９％の過ホウ酸ナトリウム；約１％〜約５％の漂白活性剤（例えば、ＮＯＢＳ又はＴＡＥＤ）；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；約１％〜約５％のポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩又はＰＥＧ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；及び０〜５％の微量成分（例えば、蛍光増白剤、香料）を含む顆粒として調製された洗剤組成物。

１０）（酸として計算して）約１５％〜約２３％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約８％〜約１５％のアルコールエトキシスルフェート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、２〜３ＥＯ）；約３％〜約９％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）；０％〜約３％の脂肪酸（例えば、ラウリン酸）としての石鹸；約１％〜約５％のアミノエタノール；約５％〜約１０％のクエン酸ナトリウム；約２％〜約６％のヒドロトロープ（例えば、トルエンスルホン酸ナトリウム）；０％〜約２％のホウ酸塩；０％〜約１％のカルボキシメチルセルロース；約１％〜約３％のエタノール；約２％〜約５％のプロピレングリコール；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；及び０〜５％の微量成分（例えば、ポリマー、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。

１１）（酸として計算して）約２０％〜約３２％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；６〜１２％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）；約２％〜約６％のアミノエタノール；約８％〜約１４％のクエン酸；約１％〜約３％のホウ酸塩；０％〜約３％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、アンカリングポリマー、例えば、ラウリルメタクリル酸／アクリル酸コポリマー）；約３％〜約８％のグリセロール；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；及び０〜５％の微量成分（例えば、ヒドロトロープ、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。

１２）約２５％〜約４０％のアニオン性界面活性剤（直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、スルホン酸アルキル、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸塩、石鹸）；約１％〜約１０％の非イオン性界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）；約８％〜約２５％の炭酸ナトリウム；約５％〜約１５％の可溶性ケイ酸塩；０％〜約５％の硫酸ナトリウム；約１５％〜約２８％のゼオライト；０％〜約２０％の過ホウ酸ナトリウム；約０％〜約５％の漂白活性剤（ＴＡＥＤ又はＮＯＢＳ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；０〜３％の微量成分（例えば、香料、蛍光増白剤）を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。

１３）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩の全部又は一部が（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩で置換されている、上記の組成物（１）〜（１２）に記載された洗剤組成物。

１４）約９％〜約１５％の（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩；約３％〜約６％のアルコールエトキシレート；約１％〜約５％のポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド；約１０％〜約２０％のゼオライト；約１０％〜約２０％の層状二ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製のＳＫ５６）；約３％〜約１２％の炭酸ナトリウム；０％〜約６％の可溶性ケイ酸塩；約４％〜約８％のクエン酸ナトリウム；約１３％〜約２２％の過炭酸ナトリウム；約３％〜約８％のＴＡＥＤ；０％〜約５％のポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩及びＰＶＰ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；及び０〜５％の微量成分（例えば、蛍光増白剤、光退色剤、香料、起泡抑制剤）を含む、少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。

１５）約４％〜約８％の（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩；約１１％〜約１５％のアルコールエトキシレート；約１％〜約４％の石鹸；約３５％〜約４５％のゼオライトＭＡＰ又はゼオライトＡ；約２％〜約８％の炭酸ナトリウム；０％〜約４％の可溶性ケイ酸塩；約１３％〜約２２％の過炭酸ナトリウム；１〜８％のＴＡＥＤ；０％〜約３％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０％〜約３％のポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩及びＰＶＰ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；及び０〜３％の微量成分（例えば、蛍光増白剤、ホスホン酸塩、香料）を含む、少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。

１６）追加の成分又は既に特定した漂白系の代替物のいずれかとして安定化又はカプセル封入過酸を含有する、上記の１）〜１５）に記載した洗剤調製物。

１７）過ホウ酸が過炭酸塩と置換されている、上記の１）、３）、７）、９）及び１２）に記載した洗剤組成物。

１８）追加してマンガン触媒を含有する、上記の１）、３）、７）、９）、１２）、１４）及び１５）に記載した洗剤組成物。例えば、マンガン触媒は、Ｈａｇｅｅｔａｌ．（（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６９：６３７−６３９）によって記載された化合物の１つである。

１９）液体非イオン性界面活性剤、例えば直鎖アルコキシル化第１級アルコール、ビルダー系（例えば、リン酸塩）、酵素及びアルカリを含む非水性洗剤液として調製された洗剤組成物。本洗剤は、アニオン性界面活性剤及び／又は漂白系も含むことができる。

上述のように、本アミラーゼポリペプチドは、洗剤中で従来法により使用される濃度で組み込むことができる。現在は、洗剤組成物中には、酵素は洗液１リットル当たり（純粋酵素タンパク質として計算して）０．００００１〜１．０ｍｇのアミラーゼポリペプチドに相当する量で添加できることは企図されている。

本洗剤組成物は、他の従来法による洗剤成分、例えば、脱凝集性物質、充填剤、泡抑制剤、抗腐食剤、汚れ懸濁化剤、金属イオン封鎖剤、汚れ再付着防止剤、脱水剤、染料、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤及び香料も含有することができる。

本洗剤組成物は、染みの付いた織物の前処置のために好適な洗濯用添加組成物及びすすぎに添加される織物柔軟剤組成物を含む手洗い（手作業）若しくは機械（自動）洗濯用洗剤組成物として調製でき、又は一般の家庭用硬質表面洗浄作業に使用するための洗剤組成物として調製できる、又は手洗い若しくは自動食器洗浄作用のために調製できる。

本明細書に記載した洗浄組成物はいずれも、任意の数の追加の酵素を含むことができる。一般に、酵素は、選択された洗剤と（例えば、最適ｐＨ、他の酵素性及び非酵素性成分などとの適合性に関して）適合しなければならず、酵素は、有効量で存在しなければならない。例として、下記の酵素を挙げる。

プロテアーゼ：好適なプロテアーゼとしては、動物、野菜又は微生物起源のものが挙げられる。化学修飾又はタンパク質改変突然変異体並びに自然に処理されたタンパク質が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又は金属プロテアーゼ、アルカリ性微生物プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ又はキモトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、サブチリシン、特にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のプロテアーゼ（例えば、サブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７及びサブチリシン１６８（例えば、国際公開第８９／０６２７９号パンフレットを参照されたい）である。典型的なプロテアーゼの例としてはまた、限定はされないが、国際公開第９５／２３２２１号パンフレット、同第９２／２１７６０号パンフレット、同第２００８０１０９２５号パンフレット、同第２０１００５６６３５６号パンフレット、同第２０１１０７２０９９号パンフレット、同第２０１１１３０２２号パンフレット、同第２０１１１４０３６４号パンフレット、同第２０１２１５１５３４号パンフレット、同第２０１５０３８７９２号パンフレット、同第２０１５０８９４４１号パンフレット、同第２０１５０８９４４７号パンフレット、同第２０１５１４３３６０号パンフレット、同第２０１６００１４４９号パンフレット、同第２０１６００１４５０号パンフレット、同第２０１６０６１４３８号パンフレット、同第２０１６０６９５４４号パンフレット、同第２０１６０６９５４８号パンフレット、同第２０１６０６９５５２号パンフレット、同第２０１６０６９５５７号パンフレット、同第２０１６０６９５６３号パンフレット、同第２０１６０６９５６９号パンフレット、同第２０１６０８７６１７号パンフレット、同第２０１６０８７６１９号パンフレット、同第２０１６１４５４２８号パンフレット、同第２０１６１７４２３４号パンフレット、同第２０１６１８３５０９号パンフレット、同第２０１６２０２８３５号パンフレット、同第２０１６２０５７５５号パンフレット、米国特許出願公開第２００８／００９０７４７号明細書、米国特許第５，８０１，０３９号明細書、同第５，３４０，７３５号明細書、同第５，５００，３６４号明細書、同第５，８５５，６２５号明細書、再発行特許第３４，６０６号明細書、米国特許第５，９５５，３４０号明細書、同第５，７００，６７６号明細書、同第６，３１２，９３６号明細書、同第６，４８２，６２８号明細書、同第８５３０２１９号明細書；米国仮特許出願第６２／３３１２８２号明細書、同第６２／３４３６１８号明細書、同第６２／３５１６４９号明細書、同第６２／４３７１７１号明細書、同第６２／４３７１７４号明細書及び同第６２／４３７５０９号明細書；及びＰＣＴ出願のＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０７６７４９号明細書に記載されているもの、並びに国際公開第２００７／０４４９９３号パンフレット、同第２００９／０５８３０３号パンフレット、同第２００９／０５８６６１号パンフレット、同第２０１４／０７１４１０号パンフレット、同第２０１４／１９４０３２号パンフレット、同第２０１４／１９４０３４号パンフレット、同第２０１４／１９４０５４号パンフレット及び同第２０１４／１９４１１７号パンフレットに記載されているメタロプロテアーゼが挙げられる。

典型的な市販のプロテアーゼには、ＭＡＸＡＴＡＳＥ、ＭＡＸＡＣＡＬ、ＭＡＸＡＰＥＭ、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（登録商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ２８０）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１０００、Ｐ１０５０、Ｐ２０００）、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１０００）、ＵＬＴＩＭＡＳＥ（登録商標）及びＰＵＲＡＦＡＳＴ（ＤａｎｉｓｃｏＵＳ）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ、ＢＬＡＺＥ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）１６Ｌ、ＣＯＲＯＮＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＥＶＥＲＩＳ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ、ＤＵＲＡＺＹＭ、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＥＶＥＲＩＳ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＧＲＥＳＳＵＮＯ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＢＬＡＰ（商標）及びＢＬＡＰ（商標）変異体（Ｈｅｎｋｅｌ）；ＬＡＶＥＲＧＹ（商標）ＰＲＯ１０４Ｌ（ＢＡＳＦ）及びＫＡＰ（登録商標）（Ｂ．アルカロフィルス・サブチシリン（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ））（Ｋａｏ）が挙げられる。好適なプロテアーゼには、天然型プロテアーゼ又は相当に低い温度で機能するように特異的に選択又は改変された組み換え変異体が含まれる。

リパーゼ：好適なリパーゼには、細菌起源又は真菌起源のリパーゼが含まれる。化学修飾、タンパク質分解修飾又はタンパク質組み換え突然変異体が含まれる。有用なリパーゼの例としては、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属（同義語、サーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属）由来の、例えば、Ｈ．ラヌギノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ．ラヌギノサ（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ））由来（例えば、欧州特許第２５８０６８号明細書及び同第３０５２１６号明細書を参照されたい）、Ｈ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来（例えば、国際公開第９６／１３５８０号パンフレットを参照されたい）のリパーゼ；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属リパーゼ（例えば、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）若しくはＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）由来；例えば、欧州特許第２１８２７２号明細書を参照されたい）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（例えば、欧州特許第３３１３７６号明細書を参照されたい）、Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号明細書を参照されたい）、Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）菌株ＳＤ７０５（例えば、国際公開第９５／０６７２０号パンフレット及び同第９６／２７００２号パンフレットを参照されたい）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（例えば、国際公開第９６／１２０１２号パンフレットを参照されたい）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属リパーゼ（例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来；例えば、Ｄａｒｔｏｉｓｅｔａｌ（１９９３）．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，１１３１：２５３−３６０を参照されたい）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、特開昭６４／７４４９９２号公報）又はＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）（例えば、国際公開第９１／１６４２２号パンフレットを参照されたい）が挙げられるがそれらに限定されない。本調製物において使用するために企図された追加のリパーゼ変異体には、例えば、：国際公開第９２／０５２４９号パンフレット、国際公開第９４／０１５４１号パンフレット、国際公開第９５／３５３８１号パンフレット、国際公開第９６／００２９２号パンフレット、国際公開第９５／３０７４４号パンフレット、国際公開第９４／２５５７８号パンフレット、国際公開第９５／１４７８３号パンフレット、国際公開第９５／２２６１５号パンフレット、国際公開第９７／０４０７９号パンフレット、国際公開第９７／０７２０２号パンフレット、欧州特許第４０７２２５号明細書及び同第２６０１０５号明細書に記載されたものが含まれる。

典型的な市販のリパーゼとしては、Ｍ１ＬＩＰＡＳＥ、ＬＵＭＡＦＡＳＴ及びＬＩＰＯＭＡＸ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＬＩＰＥＸ（登録商標）、ＬＩＰＯＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；並びにＬＩＰＡＳＥＰ（ＡｍａｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．Ｌｔｄ）が挙げられるが、それらに限定されない。

ポリエステラーゼ：本組成物中には、例えば国際公開第０１／３４８９９号パンフレット、同第０１／１４６２９号パンフレット及び米国特許第６９３３１４０号明細書に記載されたような好適なポリエステラーゼを含めることができる。

アミラーゼ：本組成物は、他のα−アミラーゼを含む他のアミラーゼと組み合わせることができる。そのような組み合わせは、異なるα−アミラーゼが異なる性能特性を示し、複数の異なるα−アミラーゼの組み合わせが異なるα−アミラーゼの利点を提供する組成物を結果として生じさせる場合に特に望ましい。他のアミラーゼには、市販で入手できるアミラーゼ、例えばＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）及びＢＡＮ（商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓＡ／Ｓ）；ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＳＴＡＲ（登録商標）並びにＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）（ＤｕＰｏｎｔＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）などが含まれるがそれらに限定されない。典型的なα−アミラーゼは、国際公開第９４１８３１４Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２００８０２９３６０７号明細書、国際公開第２０１３０６３４６０号パンフレット、同第１０１１５０２８号パンフレット、同第２００９０６１３８０Ａ２号パンフレット、同第２０１４０９９５２３号パンフレット、同第２０１５０７７１２６Ａ１号パンフレット、同第２０１３１８４５７７号パンフレット、同第２０１４１６４７７７号パンフレット、同第９５１０６０３号パンフレット、同第９５２６３９７号パンフレット、同第９６２３８７４号パンフレット、同第９６２３８７３号パンフレット、同第９７４１２１３号パンフレット、同第９９１９４６７号パンフレット、同第００６００６０号パンフレット、同第００２９５６０号パンフレット、同第９９２３２１１号パンフレット、同第９９４６３９９号パンフレット、同第００６００５８号パンフレット、同第００６００５９号パンフレット、同第９９４２５６７号パンフレット、同第０１１４５３２号パンフレット、同第０２０９２７９７号パンフレット、同第０１６６７１２号パンフレット、同第０１８８１０７号パンフレット、同第０１９６５３７号パンフレット、同第０２１０３５５号パンフレット、同第２００６００２６４３号パンフレット、同第２００４０５５１７８号パンフレット及び同第９８１３４８１号パンフレットに記載されている。

セルラーゼ：セルラーゼは、本組成物に添加され得る。好適なセルラーゼには、細菌又は真菌起源のセルラーゼが含まれる。化学修飾又はタンパク質改変突然変異体が含まれる。好適なセルラーゼには、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書；同第５，６４８，２６３号明細書；同第５，６９１，１７８号明細書；同第５，７７６，７５７号明細書；及び国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されたフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）及びフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生成された真菌セルラーゼが含まれる。使用するために企図された典型的なセルラーゼは、布地にとってカラーケア利点を有するセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、例えば、欧州特許第０４９５２５７号明細書、同第０５３１３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、同第９６／２９３９７号パンフレット及び同第９８／０８９４０号パンフレットに記載されたセルラーゼである。他の例は、例えば、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット；同第９８／１２３０７号パンフレット；同第９５／２４４７１号パンフレット；ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号明細書；欧州特許第５３１３１５号明細書；米国特許第５，４５７，０４６号明細書；同第５，６８６，５９３号明細書；及び同第５，７６３，２５４号明細書に記載されたセルラーゼ変異体である。典型的なセルラーゼには、国際公開第２００５０５４４７５号パンフレット、同第２００５０５６７８７号パンフレット、米国特許第７，４４９，３１８号明細書、同第７，８３３，７７３号明細書、同第４，４３５，３０７号明細書；欧州特許第０４９５２５７号明細書；及び米国仮特許出願第６２／２９６，６７８号明細書及び同第６２／４３５３４０号明細書に記載されたセルラーゼが含まれる。典型的な市販のセルラーゼには、ＣＥＬＬＵＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）ＰＲＥＭＩＵＭ、ＥＮＤＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＲＥＮＯＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（登録商標）１００、ＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（登録商標）２００／２２０及びＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（登録商標）２０００（ＤａｎｉｓｃｏＵＳ）；並びにＫＡＣ−５００（Ｂ）（ＫａｏＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が含まれるがそれらに限定されない。

マンナナーゼ：典型的なマンナナーゼとしては、限定はされないが、例えば、国際公開第２０１６００７９２９号パンフレット；米国特許第６５６６１１４号明細書、同第６６０２８４２号明細書及び同第６４４０９９１号明細書；並びに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０８５０号明細書及び同ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０８４４号明細書に記載されているような、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。典型的なマンナナーゼとしては、限定はされないが、例えば、国際公開第２０１６００７９２９号パンフレット；米国特許第６５６６１１４号明細書、同第６６０２８４２号明細書及び同第６４４０９９１号明細書；並びに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０８５０号明細書及び同ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０８４４号明細書に記載されているような、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。

ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：本組成物中で使用するために企図された好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには、植物起源、細菌起源又は真菌起源のものが含まれる。化学修飾突然変異体又はタンパク質改変突然変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、同第９５／１０６０２号パンフレット及び同第９８／１５２５７号パンフレットに記載されたようなコプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属由来、例えばＣ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のペルオキシダーゼ及びその変異体が挙げられる。市販で入手できるペルオキシダーゼには、例えば、ＧＵＡＲＤＺＹＭＥ（商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ製及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓＡ／Ｓ製）が含まれる。

本洗剤組成物は、家庭用及び／又は工業用布地／洗濯物上に存在するバイオフィルムを除去／洗浄するために有効である２，６−β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼも含むことができる。

本洗剤用酵素は、１種以上の酵素を含有する別個の添加物を添加する工程、又はこれらの酵素全部を含む複合添加物を添加する工程によって洗剤組成物中に含めることができる。洗剤添加物、すなわち別個の添加物又は複合添加物は、例えば、顆粒、液体、スラリーなどとして調製することができる。典型的な洗剤添加物調製物には、顆粒、特に非粉化顆粒、液体、特に安定化液体又はスラリーが含まれるがそれらに限定されない。

非粉化顆粒は、例えば米国特許第４，１０６，９９１号明細書及び同第４，６６１，４５２号明細書に開示されたように製造することができ、任意選択的に、当技術分野において公知の方法によってコーティングすることができる。ワックス状コーティング物質の例は、１，０００〜２０，０００の平均分子量を備えるポリ（エチレンオキシド）生成物（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有し、さらに１５〜８０エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；脂肪酸のモノグリセリド及びジグリセリド及びトリグリセリドである。流動層技術による塗布のために好適なフィルム形成コーティング物質の例は、例えば、英国特許第１４８３５９１号明細書に記載されている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従ってプロピレングリコールなどのポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することによって安定化させることができる。保護酵素は、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示された方法に従って調製することができる。

本洗剤組成物は、例えば、バー、錠剤、粉末、顆粒、ペースト又は液体などの任意の便宜的な形態であり得る。液体洗剤は、典型的には、約７０％までの水及び０％〜約３０％の有機溶媒を含有する水性であり得る。約３０％以下の水を含有するコンパクト洗剤ジェルも企図されている。本洗剤組成物は、任意選択的に、半極性及び／又はアニオン性及び／又はカチオン性及び／又は両性イオン性を含む非イオン性であり得る、１種以上の界面活性剤を含むことができる。界面活性剤は、約０．１重量％〜約６０重量％の広範囲内で存在してよい。

その中に含まれる場合、本洗剤は、典型的には、約１％〜約４０％の例えば直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）、アルコールエトキシスルフェート、第２級アルカンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキルコハク酸又はアルケニルコハク酸又は石鹸などのアニオン性界面活性剤を含有するであろう。

その中に含まれる場合、本洗剤は、通常、約０．２％〜約４０％の例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド又はグルコサミンのＮ−アシル−Ｎ−アルキル誘導体（「グルカミド」）などの非イオン性界面活性剤を含有するであろう。

本洗剤は、０％〜約６５％の例えばゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキルコハク酸及びアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製のＳＫＳ−６）などの洗剤ビルダー又は錯化剤を含有することができる。

本洗剤は、１種以上のポリマーを含むことができる。典型的なポリマーには、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー）及びメタクリル酸／アクリル酸ラウリルコポリマーが含まれる。

本洗剤組成物の酵素は、従来型の安定剤、例えばポリオール（例えば、プロピレングリコール又はグリセロール）、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸又はホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）又はフェニルボロン酸誘導体（例えば、４−ホルミルフェニルボロン酸）を使用して安定化させることができる。本組成物は、例えば国際公開第９２／１９７０９号パンフレット及び同第９２／１９７０８号パンフレットに記載されたように調製することができる。

本洗剤組成物中では、特に酵素変異体を洗液１Ｌ当たり酵素タンパク質約０．０１〜約１００ｍｇに相当する量（例えば、洗液１リットル当たり酵素タンパク質約０．０５〜約５．０ｍｇ又は洗液１リットル当たり酵素タンパク質０．１〜約１．０ｍｇ）で添加され得ることが企図されている。

本アミラーゼを添加できる（又は一部の場合にはその構成成分であると同定されている）多くの典型的な洗剤調製物は、国際公開第２０１３０６３４６０号パンフレットに記載されている。これらには、ＰＵＲＥＸ（登録商標）ＵｌｔｒａＰａｃｋｓ（Ｈｅｎｋｅｌ）、ＦＩＮＩＳＨ（登録商標）Ｑｕａｎｔｕｍ（ＲｅｃｋｉｔｔＢｅｎｃｋｉｓｅｒ）、ＣＬＯＲＯＸ（商標）２Ｐａｃｋｓ（Ｃｌｏｒｏｘ）、ＯｘｉＣｌｅａｎＭａｘＦｏｒｃｅＰｏｗｅｒＰａｋｓ（Ｃｈｕｒｃｈ＆Ｄｗｉｇｈｔ）、ＴＩＤＥ（登録商標）ＳｔａｉｎＲｅｌｅａｓｅ、ＣＡＳＣＡＤＥ（登録商標）ＡｃｔｉｏｎＰａｃｓ及びＴＩＤＥ（登録商標）Ｐｏｄｓ（Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ）、ＰＳなどの市販で入手できる単位用量洗剤調製物／包装が含まれる。

７．６．洗剤組成物中のアミラーゼ活性を評価する方法
当技術分野では、材料見本及びミクロ材料見本アッセイを含む多くのα−アミラーゼ洗浄アッセイが公知である。添付の実施例では、ごく少数のそのようなアッセイについて記載する。

本組成物及び方法並びにそれらの利点について詳細に説明するために、下記の特定の実施例は、それらが限定的ではなくむしろ例示的であるとの理解の下で提供されている。

８．醸造組成物
本変異アミラーゼは、醸造のプロセスにおいて、すなわち発酵麦芽飲料を製造する際に使用される醸造組成物の構成成分であり得る。非発酵性炭水化物は、最終ビール中の溶存固形分の大半を形成する。この残渣は、麦芽アミラーゼがデンプンのα−１，６−結合を加水分解することができないために残留する。非発酵性炭水化物は、ビール１２オンス当たり約５０カロリーに寄与する。アミラーゼは、グルコアミラーゼ並びに任意選択的にプルラナーゼ及び／又はイソアミラーゼと組み合わせて、デンプンをデキストリン及び発酵性糖に変換させ、最終ビール中の残留非発酵性炭水化物を減少させることを支援する。

９．ヨウ素陽性デンプンの減少
変異アミラーゼは、液化及び／又は糖化の方法において使用される場合、ヨウ素陽性デンプン（ＩＰＳ）を減少させることができる。ＩＰＳの１つの起源は、加水分解を回避するアミロース及び／又は老化デンプンポリマーである。デンプン老化は、デンプン分子に相互に結合して、その後に結晶化度の増加が続く傾向があるために、デンプンペースト中又は老化進行中のゲル中で自然に発生する。低濃度の溶液は、デンプン分子のより大きい物体への進行性会合に起因してますます濁る。自然な沈殿が発生し、沈殿したデンプンは、冷水不溶性の最初の状態に復帰する傾向を示すと思われる。ゲルへの冷却硬化後のより高濃度のペーストは、老化するとデンプン分子の会合が増加するために着実に堅固さを増す。これは、隣接デンプン分子上のヒドロキシル基間で水素結合が生じる傾向が強くあるために生じる。Ｊ．Ａ．Ｒａｄｌｅｙ，ｅｄ．，ＳｔａｒｃｈａｎｄｉｔｓＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ１９４−２０１（ＣｈａｐｍａｎａｎｄＨａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９６８））を参照されたい。変異アミラーゼの使用は、ＩＰＳの量を減少させることによってプロセス全体の性能を改善すると予想される。

本明細書で言及した全ての参考文献は、あらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。本組成物及び方法並びにそれらの利点について詳細に説明するために、下記の特定の実施例は、それらが限定的ではなくむしろ例示的であるとの理解の下で提供されている。

ＢｓｐＡｍｙ２４変異体の生成
タンパク質は、下記の通りに調製した。関心対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、分泌のためのシグナルペプチド並びに増幅及びサブクローニングのための追加の５’及び３’配列は、商業的供給業者から取り寄せた。標準的手技を使用して、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞内で分泌タンパク質を発現させるために細菌ベクター内にこれらのＤＮＡ配列を挿入した。構築物は、ＤＮＡケーシングによって検証した。細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の分泌タンパク質発現のために好適な発現培地中で６８時間にわたり増殖させた。細胞は、遠心分離後に０．４５μｍの膜（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通しての濾過によってタンパク質含有上清から分離した。追加の精製は、ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるイオン交換クロマトグラフィーを通して達成した。タンパク質濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。発現及び精製したＢｓｐＡｍｙ２４の変異体（配列番号１）は、表２に示した。

本変異体のデンプン洗浄活性は、５．５ｍｍの円形材料見本に切断した市販の木綿の試験織物（ＣＳ２８、ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＴｅｓｔＭａｔｅｒｉａｌｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上で米デンプンを用いて評価した。２片の材料見本を９６ウエルＣｏｒｎｉｎｇ９０１７平底ポリスチレン製マイクロタイタープレートの各ウエル内に配置した。この試験織物に不活性化酵素を含む市販の自動食洗機用洗剤配合中のタンパク質溶液を加えた。この溶液を５０℃で１５分間振とうした。上清の試料は、分光光度計を用いて４８８ｎｍでの溶液の吸光度を測定することによって染料の遊離について評価した。

不活性化酵素を含む市販の自動食洗機用洗剤配合は、下記のように調製した。個別包装の１パケットのＣＡＳＣＡＤＥ（登録商標）ＰＬＡＴＩＮＵＭ（商標）又はＦＩＮＩＳＨ（登録商標）ＱＵＡＮＴＵＭ（商標）食洗機用洗剤配合を１Ｌの蒸留水中に入れ、このパケットを溶解させるために撹拌した。この溶液を８５〜９０℃で１０時間にわたりインキュベートした。冷却後、溶液の容量は、蒸留水を用いて北米の食洗機のおおよその容積（３．３Ｌ）まで増加させると、水の硬度は、３：１のカルシウム対マグネシウム比を備える１５０ＰＰＭ（８．７６ＧＰＧ）に上昇させられた。洗浄アッセイの結果は、図１〜４に示した。ＢｓｐＡｍｙ２４変異体は、周知の洗剤用アミラーゼであるＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）と比較して良好に機能した。

本明細書で言及した全ての刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のために、及び個別の各刊行物、特許又は特許出願が参照により組み込まれると特に且つ個別に指示されている場合と同程度までこれにより参照して全体として本明細書に組み込まれる。

Claims

親α−アミラーゼの組み換え変異体である変異α−アミラーゼであって：
（ａ）配列番号１を使用して、Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｔ１８３及びＧ１８４に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、及び任意選択的に、Ｔ１８３、Ｅ１９０、Ｍ２０２、Ｑ１７２、Ａ１８６及び／又はＩ３２４に対応するアミノ酸残基での突然変異であって、前記変異α−アミラーゼ若しくは前記親α−アミラーゼが、ナンバリングのために使用される配列番号１に対して、少なくとも９１％、任意選択的に９２％、任意選択的に９３％、任意選択的に９４％、任意選択的に９５％、任意選択的に９６％、任意選択的に９７％、任意選択的に９８％若しくは任意選択的に９９％のアミノ酸配列同一性を有し、前記変異体が、前記親α−アミラーゼ又は前記変異α−アミラーゼとは前記突然変異が非存在であることだけが異なる参照α−アミラーゼと比較して、自動食器洗浄において改良された洗浄性能を有する欠失及び突然変異、又は
（ｂ）（ａ）における前記変異体のアミノ酸配列における１個若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を含み、及び（ａ）における変異体の前記性能を有する、変異α−アミラーゼ。
ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｒ１８１及びＧ１８２又はＴ１８３及びＧ１８４に対応するアミノ酸残基の欠失を含む、請求項１に記載の変異α−アミラーゼ。
下記の位置：
Ｔ１８３及びＥ１９０、Ｔ１８３及びＭ２０２、Ｅ１９０及びＭ２０２、Ｔ１８３、Ｅ１９０及びＭ２０２、Ｑ１７２及びＡ１８６、Ａ１８６及びＩ３２４、Ｑ１７２及びＩ３２４、Ｑ１７２、Ａ１８６及びＩ３２４、Ｑ１７２、Ａ１８６及びＭ２０２、Ａ１８６、Ｉ３２４及びＭ２０２、Ｑ１７２、Ｉ３２４及びＭ２０２又はＱ１７２、Ａ１８６、Ｉ３２４及びＭ２０２で突然変異を有する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の変異α−アミラーゼ。
下記の突然変異：
Ｔ１８３Ｄ及びＥ１９０Ｐ、Ｔ１８３Ｄ及びＭ２０２Ｌ、Ｔ１８３Ｄ、Ｅ１９０Ｐ及びＭ２０２Ｌ、Ｑ１７２Ｒ及びＡ１８６Ｇ、Ａ１８６Ｇ及びＩ３２４Ｍ、Ｑ１７２Ｒ及びＩ３２４Ｍ、Ｑ１７２Ｒ、Ａ１８６Ｇ及びＩ３２４Ｍ、Ｑ１７２Ｒ、Ａ１８６Ｇ及びＭ２０２Ｌ、Ａ１８６Ｇ、Ｉ３２４Ｍ及びＭ２０２Ｌ、Ｑ１７２Ｒ、Ｉ３２４Ｍ及びＭ２０２Ｌ又はＱ１７２Ｒ、Ａ１８６Ｇ、Ｉ３２４Ｍ及びＭ２０２Ｌを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異α−アミラーゼ。
前記変異α−アミラーゼは、ストリンジェントな条件下で、配列番号２のポリヌクレオチド又はその補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異α−アミラーゼ。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記変異α−アミラーゼをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター又は前記ポリヌクレオチド若しくは前記発現ベクターを含む発現宿主。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記変異α−アミラーゼを含む、デンプンを液化するための組成物。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記変異α−アミラーゼを含む洗剤組成物。
デンプンをオリゴ糖に変換させるための方法であって、デンプンを有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記変異α−アミラーゼと接触させる工程を含む方法。
表面からデンプン質の染み又は汚れを除去するための方法であって、前記表面を有効量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記変異α−アミラーゼと接触させる工程と、水性組成物中で溶解するより小さいデンプン由来分子を生成し、それにより前記表面から前記デンプン質の染みを除去するために、前記変異α−アミラーゼが前記デンプン質の染み中に存在するデンプン成分を加水分解することを可能にする工程とを含む方法。