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JP2020516620A - フェロポーチン阻害剤塩 - Google Patents

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Abstract

本発明は、一般式（Ｉ）の化合物の新規塩、それらを含む医薬組成物、ならびに、特にフェロポーチン阻害剤としての使用のための、より具体的には特にサラセミア、鎌状赤血球症、ヘモクロマトーシスなどの鉄過剰状態のような、ヘプシジンまたは鉄代謝障害の欠如によって引き起こされる疾患の予防および／または治療における使用のための医薬としてのそれらの使用に関する。

Description

本発明は、一般式（Ｉ）の化合物の新規塩、それらを含む医薬組成物、ならびに、特にフェロポーチン阻害剤としての使用のための、より具体的には特にサラセミア、鎌状赤血球症、ヘモクロマトーシスなどの鉄過剰状態のような、ヘプシジンまたは鉄代謝障害の欠如によって引き起こされる疾患の予防および／または治療における使用のための医薬としてのそれらの使用に関する。
鉄は、ほとんどすべての生物にとって不可欠な微量元素であり、特に成長と血液の形成に関連している。この場合、鉄代謝のバランスは、主に老化した赤血球のヘモグロビンからの鉄の回収レベルと食事性鉄の十二指腸吸収によって調節される。放出された鉄は腸を介して、特に特定の輸送システム（ＤＭＴ−１、フェロポーチン）を介して取り込まれ、血液循環に移行され、それによって適切な組織および器官（トランスフェリン、トランスフェリン受容体）に運ばれる。
人体において、鉄元素は、とりわけ酸素輸送、酸素摂取、ミトコンドリア電子輸送などの細胞機能、認知機能など、そして最終的にはエネルギー代謝全体にとって非常に重要である。
人体には平均して鉄が４〜５ｇ含まれており、酵素、ヘモグロビンおよびミオグロビン、ならびにフェリチンおよびヘモシデリンの形態の貯蔵または貯蔵鉄に含まれている。この鉄の約半分、約２ｇはヘム鉄として存在し、赤血球のヘモグロビンに結合している。これらの赤血球の寿命は限られているため（７５〜１５０日）、新しいものを継続的に形成し、古いものを分解する必要がある（１秒間に２００万を超える赤血球が形成されている）。この高い再生能力は、マクロファージが老化した赤血球を貪食し、それらを溶解し、こうして得られた鉄を鉄代謝のためにリサイクルすることによって達成される。赤血球生成に必要な鉄の大部分、１日あたり約２５ｍｇは、この方法で提供される。
成人の鉄の必要量は１日あたり０．５〜１．５ｍｇで、乳児と妊娠中の女性は１日あたり２〜５ｍｇの鉄を必要とする。例えば皮膚および上皮細胞の落屑による毎日の鉄の損失は低い。鉄の損失の増加は、例えば、女性の月経出血中に起こる。一般に、血液２ｍｌあたり約１ｍｇの鉄が失われるため、失血により鉄濃度が大幅に低下する可能性がある。健康な成人において、通常の１日約１ｍｇの鉄の損失は、通常、毎日の食物摂取によって置き換えられ、したがって、毎日の鉄の必要量が適切なレベルに再調整される。
鉄濃度は吸収によって調節され、食品中に存在する鉄の吸収率は６〜１２％で、鉄欠乏の場合には最大２５％である。吸収率は、鉄の必要量と鉄の貯蔵場所の大きさに応じて生物によって調節されている。その過程で、人間は二価と三価の両方の鉄イオンを利用する。通常、鉄（ＩＩＩ）化合物は十分に酸性のｐＨ値で胃に溶解するため、吸収に利用できる。鉄の吸収は、粘膜細胞によって上部小腸で行われる。このプロセスでは、三価の非ヘム鉄が最初に腸細胞膜でＦｅ（ＩＩ）に還元されて、例えば鉄還元酵素（膜結合十二指腸チトクロームｂ）によって吸収され、輸送タンパク質ＤＭＴ１（二価金属輸送体１）によって腸細胞に輸送される。対照的に、ヘム鉄は変化せずに細胞膜を通って腸細胞に入る。腸細胞では、鉄はデポ鉄としてフェリチンに保存されるか、または輸送タンパク質フェロポーチンによって血液に放出される。ヘプシジンは鉄吸収の重要な調節因子であるため、このプロセスで中心的な役割を果たす。フェロポーチンによって血中に運ばれた二価の鉄は、オキシダーゼ（セルロプラスミン、ヘフェスチン）によって三価の鉄に変換され、その後、トランスフェリンによって生体内の関連する場所に輸送される（例えば、“Ｂａｌａｎｃｉｎｇ ａｃｔｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｉｒｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ”．Ｍ．Ｗ．Ｈｅｎｔｚｅ，Ｃｅｌｌ １１７，２００４，２８５−２９７を参照）。
哺乳類生物は鉄を積極的に排出することができない。鉄代謝は、マクロファージ、肝細胞および腸細胞からの鉄の細胞放出を介してヘプシジンによって実質的に制御される。
ヘプシジンは、肝臓で産生されるペプチドホルモンである。アミノ末端で短縮されているヘプシジン−２２およびヘプシジン−２０が発見されているが、主要な活性型には２５アミノ酸がある（例えば、“Ｈｅｐｃｉｄｉｎ， ａ ｋｅｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｒｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ａｎａｅｍｉａ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ”．Ｔ．Ｇａｎｚ，Ｂｌｏｏｄ，１０２，２００３，７８３−８を参照）。ヘプシジンは、腸および胎盤を介した鉄の吸収、ならびに細網内皮系からの鉄の放出に作用する。体内において、ヘプシジンはプロヘプシジンとして知られているものから肝臓で合成され、プロヘプシジンはＨＡＭＰ遺伝子として知られる遺伝子によってコードされている。ヘプシジンの形成は、生物の鉄濃度と直接相関して調節される。つまり、生物に十分な鉄と酸素が供給される場合、鉄と酸素の濃度が低いと形成されるヘプシジンが増加し、または赤血球生成が増大すると形成されるヘプシジンが減少する。小腸粘膜細胞およびマクロファージでは、ヘプシジンは輸送タンパク質フェロポーチンと結合する。このフェロポーチンは、食作用によりリサイクルされた鉄を細胞の内部から血液に従来通りに輸送する。
輸送タンパク質フェロポーチンは、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、腸および胎盤で形成される５７１個のアミノ酸からなる膜貫通タンパク質である。特に、フェロポーチンは腸上皮細胞の基底外側膜に局在している。このように結合したフェロポーチンは、鉄を血中に排出するように作用する。この場合、フェロポーチンは鉄をＦｅ２＋として輸送する可能性が最も高い。ヘプシジンがフェロポーチンに結合すると、フェロポーチンは細胞の内部に輸送され、そこで分解されて、細胞からの食作用によりリサイクルされた鉄の放出がほぼ完全に遮断される。フェロポーチンが、例えばヘプシジンにより不活性化され、粘膜細胞に貯蔵されている鉄を輸出できない場合、貯蔵された鉄は便を介した細胞の自然な脱落により失われる。したがって、例えばヘプシジンによってフェロポーチンが不活性化または阻害されると、腸での鉄の吸収が減少する。更に、フェロポーチンは細網内皮系（ＲＥＳ）に著しく局在しており、マクロファージもそれに属する。ヘプシジンは、鉄の代謝が慢性炎症によって損なわれる場合に重要な役割を果たす。炎症の場合、特にインターロイキン−６が増加し、ヘプシジンレベルの増大を誘発する。その結果、より多くのヘプシジンがマクロファージのフェロポーチンに結合し、したがって貯蔵された鉄の放出を遮断し、最終的に炎症の貧血（ＡＣＤまたはＡＩ）を引き起こす。
一方、血清鉄濃度が低下すると、肝臓の肝細胞でのヘプシジン産生が低下し、放出されるヘプシジンが減少し、それに応じて不活化されるフェロポーチンが減少し、大量の貯蔵鉄が血清に輸送される。
それから、ヘプシジン−フェロポーチン系が鉄代謝を直接調節し、したがってヘプシジン調節機構の障害が生物の鉄代謝に直接影響することが明らかになる。原則として、ヘプシジン−フェロポーチン調節メカニズムは、以下の２つの反対の原則により作用する。
一方では、ヘプシジンの増加は、フェロポーチンの不活性化をもたらし、したがって、細胞から血清への貯蔵鉄の放出を遮断し、したがって、血清鉄濃度を低下させる。病理学的症例では、血清鉄濃度の低下はヘモグロビン濃度の低下、赤血球産生の低下、ひいては鉄欠乏性貧血につながる。
一方、ヘプシジンの減少は、活性フェロポーチンの増加をもたらし、したがって、貯蔵鉄の放出の強化および食物などからの鉄の取り込みの強化を可能にし、それにより、血清鉄濃度が増大する。病理学的な場合、鉄濃度の増大は鉄過剰につながる。
鉄過剰状態および鉄過剰症は、過剰な鉄濃度を特徴とする。そこでは、トランスフェリン非結合鉄（ＮＴＢＩ）につながる過剰な血清鉄濃度から問題が生じる。ＮＴＢＩは器官によって急速に非特異的に取り込まれ、組織や器官に鉄が蓄積する。鉄過剰は、心臓、肝臓および内分泌の損傷を含む多くの病気と望ましくない病状を引き起こす。更に、脳内の鉄の蓄積は、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患に罹患している患者で観察されている。過剰な遊離鉄の特定の有害な側面として、ラジカルの望ましくない形成について言及しなければならない。特に、鉄（ＩＩ）イオンは、活性酸素種（ＲＯＳ）の形成（特にフェントン反応を介して）を触媒する。これらのＲＯＳはＤＮＡ、脂質、タンパク質および炭水化物に損傷を引き起こし、細胞、組織および臓器に広範囲に影響を及ぼす。ＲＯＳの形成はよく知られており、文献ではいわゆる酸化ストレスを引き起こすことが記載されている。
鉄過剰を治療するためのこれまでに確立された既存の方法は、身体から鉄をより多く除去することにより血清中の鉄の量を減らすという概念に基づいている。それ以外の場合は健康な人における、最も古くから知られており、いまだ日常的な治療法は、定期的に予定される静脈切開（瀉血）からなる。最初に診断されると、静脈切開は通常かなり頻繁、例えば、週に１回、鉄濃度が正常範囲内になるまで予定され、その後、患者の鉄負荷率に応じて月に１回または３か月ごとに予定される静脈切開が行われる。
通常の採血に耐えられない患者には、使用可能なキレート剤がある。例えば、デフェロキサミン（デスフェリオキサミンＢとも呼ばれる、Ｎ’−｛５−［アセチル（ヒドロキシ）アミノ］ペンチル｝−Ｎ−［５−（｛４−［（５−アミノペンチル）（ヒドロキシ）アミノ］−４−オキソブタノイル｝アミノ）ペンチル］−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドまたはＤｅｓｆｅｒａｌ（登録商標））は、細菌のシデロフォアであり、キレート療法で使用される確立された薬物である。デフェロキサミンは、キレート剤として血流中の鉄に結合し、尿および糞便を介してその排出を促進する。慢性的な鉄過剰の典型的な治療には、毎日８〜１２時間の期間にわたる皮下注射が必要である。デスフェリオキサミン−Ｂ塩の非経口的に注射可能な組成物は、例えば国際公開第１９９８／２５８８７号に記載されている。
鉄過剰の発症をもたらすサラセミアを治療するために定期的な輸血を受けている患者での使用が認可されている２つの新しい薬は、デフェラシロクスとデフェリプロンである。
デフェラシロクス（例えば国際公開第１９９７／４９３９５号に記載されるＥｘｊａｄｅ（登録商標）、４−（３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）安息香酸）、およびデフェリプロン（Ｆｅｒｒｉｐｒｏｘ（登録商標）、３−ヒドロキシ−１，２−ジメチルピリジン−４（１Ｈ）−オン）は鉄キレート剤として同様に作用しているため、鉄キレート療法の薬物として適している。
鉄過剰の治療に使用するための鉄キレート剤として作用する更なる化合物が記載されている。例えば、国際公開第２０１３／１４２２５８号は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）および亜鉛塩のカプセル化粒子に関する。国際公開第２００３／０４１７０９号は、鉄キレート剤としての４−ヒドロキシ−２−ノニルキノリンなどの４−ヒドロキシ−２−アルキルキノリンに関する。国際公開第１９９８／０９６２６号は、ジチオカルバメート含有組成物に基づいて鉄過剰状態を治療するためのキレート剤に関する。
国際公開第２０１５／０７７６５５号は、鉄過剰症の治療における使用のための、式（Ａ）または（Ｊ）：
Figure 2020516620
のデスフェリチオシン誘導体に関する。国際公開第２０１５／０７７６５５号によると、上記デスフェリチオシン誘導体は鉄キレート剤として作用することがわかっている。
国際公開第２００５／０５１４１１号は、式：
Figure 2020516620
によるオキサケリンおよびその誘導体に基づく新規抗生物質または抗真菌薬に関し、これらオキサケリンおよびその誘導体は、鉄キレート剤として作用し、鉄過剰症の治療に使用されると説明されている。
キレート療法による鉄過剰の治療の不利な点は、障害の発生を防ぐのではなく、鉄過剰がすでに発生している場合に身体からキレート鉄が除去されることである。更に、鉄キレート療法のために確立された薬物は、毒性の可能性を示すことが知られている。
特に基礎となるメカニズムに関する知識が増え、そのような知識に基づいて適切な治療方法が開発されるにつれて、ますます現代のアプローチがこの方法に取って代わることが予想され得る。鉄代謝における生化学的調節経路に対して阻害または支持効果を有するヘプシジン作動薬または化合物は、基本的に先行技術から知られている。
例えば、既知の鉄過剰症ヘモクロマトーシスなどの遺伝的欠陥によりヘプシジンの発現が妨げられた場合、鉄過剰が起こりうる。ヘモクロマトーシスは、ヘプシジン合成を制御する遺伝子またはヘプシジン遺伝子自体の突然変異によって引き起こされる鉄過剰の疾患である。これらの患者のヘプシジンレベルが低いか、または存在しないと、活性フェロポーチンの量が増加し、食事性鉄の吸収が増加し、重度の鉄過剰につながり、これが、心臓、肝臓および内分泌の損傷を引き起こす。ヘプシジン模倣薬ペプチド、すなわちフェロポーチンを同様に結合および不活性化するペプチドは、２型（若年性）ヘモクロマトーシスのモデルであるヘプシジンノックアウトマウスにおける組織鉄の蓄積を効果的に逆転させることが示されている（Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１２）。
既知の鉄過剰症βサラセミアでは、βグロビン遺伝子の突然変異により、ヘモグロビン産生の低下と無効赤血球生成が引き起こされ、骨髄の発達中の赤血球の損傷および死により、適切な数の赤血球を産生することができない。これにより、赤血球生成速度の上方制御とヘプシジンレベルの低下が引き起こされ、赤血球生成活性の増大により多くの鉄が利用可能になる。この不適応反応により、ヘプシジンレベルが低下するため鉄が過剰になり、活性フェロポーチンの量が増加し、上記のように食事性鉄の吸収が増加する。サラセミアにおける赤血球は、αおよびβヘモグロビンサブユニットの不均衡な比の毒性のために、半減期が短くなっている。また、βサラセミアの治療において、ヘプシジン模倣薬ペプチドの使用が記載されており、治療的根拠はヘプシジン活性の増大に基づいており、鉄制限および赤血球における鉄媒介損傷の減少をもたらす。非輸血依存性βサラセミアのモデルであるｔｈ３／＋マウスへのヘプシジン模倣薬ペプチドの投与は、無効赤血球生成の軽減、赤血球生存時間の延長、および貧血の改善をもたらした。このモデルでは、食事性鉄の吸収の減少による鉄過剰の予防が、ヘプシジン模倣薬療法の追加の利点として判明した（Ｇａｒｄｅｎｇｈｉ ｅｔ ａｌ，２０１０；Ｃａｓｕ ｅｔ ａｌ ２０１３）。
記載された治療アプローチは、ヘプシジン模倣薬またはヘプシジン作動薬を提供することによって主要な調節ヘプシジンを介して直接作用することによる、すなわち一種のヘプシジン代替物または供給の意味で作用することによる、妨害された鉄代謝経路への直接の関与に基づいている。このアプローチは、ヘプシジン不活性化メカニズムを介してフェロポーチンを阻害することにより鉄過剰、すなわち過剰な血清鉄濃度を治療し、それにより過剰な鉄吸収を遮断する治療原理に基づいている。
更に知られている鉄過剰関連疾患は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳまたは骨髄異形成とも呼ばれる）、真性赤血球増加症などの無効赤血球生成に関連する疾患である。
更に、ヘプシジン（Ｈａｍｐ１）、ヘモクロマトーシスタンパク質（ＨＦＥ）、ヘモジュベリン（ＨＪＶ）およびトランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）などの全身性鉄貯蔵の感知に関与する遺伝子の突然変異は、マウスおよび男性に鉄過剰を引き起こす。したがって、ＨＦＥおよび遺伝子突然変異に関連する疾患、慢性溶血関連疾患、鎌状赤血球症、赤血球膜障害、ならびにグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症（Ｇ６ＰＤ欠損症）、赤血球性ポルフィリン症およびフリードリヒ運動失調症が挙げられる。更に、鉄過剰のサブグループには、輸血鉄過剰、鉄中毒、肺ヘモジデローシス、オステオペニア、インスリン抵抗性、アフリカ鉄過剰、ハラーボルダン・スパッツ病、高フェリチン血症、セルロプラスミン欠乏症、新生児ヘモクロマトーシス、およびサラセミア、αサラセミア、中間型サラセミアを含む赤血球障害、鎌状赤血球症および骨髄異形成症候群が含まれる。
鉄濃度の上昇に関連する更なる疾患および／または障害および／または病状には、運動失調、フリードリヒ運動失調、加齢黄斑変性、加齢白内障、加齢網膜疾患および神経変性疾患を含む、鉄濃度の上昇を伴う疾患が含まれるが、これらに限定されず、このような神経変性疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、下肢静止不能症候群およびハンチントン病が含まれる。
ヘプシジンは宿主防御ペプチドであり、侵入生物に応答する自然免疫系の成分を表す。
多くの細菌は、宿主（いわゆる親鉄性生物）からの鉄の供給に大きく依存しており、局所組織から鉄を捕捉するメカニズムを進化させたことが記載されている。フェロポーチン阻害剤によってそのような生物が利用できる鉄の量を制限する能力は、効果的な補助療法を表す場合がある。そのような親鉄性生物の１つはビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）であり、これは沿岸コミュニティ、多くの場合鉄過剰が未診断である被験者に、まれではあるが非常に重度の感染を引き起こす。致死量のビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）を接種した動物での研究では、ヘプシジン模倣薬ペプチドによる治療に応答してほぼ１００％の生存率が示されており、感染が開始される前または後に治療が開始されるかどうかに関係なく、フェロポーチンを不活性化する（Ａｒｅｚｅｓ ｅｔ ａｌ ２０１５）。
既知のヘプシジン模倣薬として、いわゆるミニヘプシジンを挙げることができ、例えば国際公開第２０１３／０８６１４３号に記載されている。ミニヘプシジンは、ヘプシジンとフェロポーチンとの相互作用に重要なヘプシジンＮ末端の小型合成ペプチド類似体である。ミニヘプシジンは、ヘプシジンの最初の９アミノ酸（ＤＴＨＦＰＩＣＩＦ）がインビトロ活性（フェロポーチン−ＧＦＰ分解として測定）に十分であることが判明したことに基づいて開発された。ミニヘプシジンは、タンパク質分解に対する耐性の向上とフェロポーチンとの生物物理学的相互作用の強化を示すために、修飾されたヘプシジン−９アミノ酸配列を有する。ミニヘプシジンは、ヘプシジン欠乏によって引き起こされるヒト鉄過剰状態の治療に有用であると説明されている。
国際公開第２０１５／０６９６６０号は、改変された鉄結合／放出トランスフェリンを投与することにより非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）を減少させることにより鉄過剰障害を治療するためのヘプシジン発現を増加させる方法を記載している。
ヘプシジン作動薬、ヘプシジン模倣薬またはフェロポーチン阻害剤などとして作用する記載された化合物はすべて、比較的高分子量の化合物、特に遺伝子工学によって主に入手可能なものである。生体分子相互作用および生体分子に基づいた様々な更なるアプローチが記載されている。欠点は、そのような生体分子化合物の複雑な調製と高感度である。特に、フェロポーチン抗体に基づく方法は、抗体阻害フェロポーチンが生物によって永続的に再現されるため、十分な効率ではなく、したがって、阻害は所望の治療効果を達成するのに十分長く持続しない。
鉄代謝に関与し、阻害または促進効果を有することができる低分子量化合物も知られている。
例えば、国際公開第２００８／１５１２８８号、国際公開第２００８／１１８７９０号、国際公開第２００８／１１５９９９号および国際公開第２００８／１０９８４０号は、二価金属輸送体−１（ＤＭＴ１）阻害剤として作用する化合物、およびサラセミアまたはヘモクロマトーシスなどの鉄障害の治療のためのそれらの使用を記載している。
国際公開第２００８／１２３０９３号は、２２個のβ−メトキシオレアン−１２−エン−３β，２４（４β）−ジオールを含む鉄過剰障害の予防または治療剤に関する。
欧州特許出願公開第１０７４２５４号および同第１０７２２６５号は、鉄過剰を治療するためのカテキンおよびフラボノイド構造植物ポリフェノールの使用に関する。
国際公開第２０１１／０２９８３２号は、ヘプシジン拮抗薬として作用し、したがって鉄欠乏疾患の治療のための使用に適していると記載されているチアゾールおよびオキサゾール化合物に関する。その中で、ヘプシジン拮抗活性は、ヘプシジンによるフェロポーチンの阻害を阻害すると記載されており、これは、本明細書に記載の新規チアゾールおよびオキサゾール化合物について本発明の発明者らによって見出された反対の効果である。
未公開の国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５３０５号および同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５３０６号は、本発明の式（Ｉ）による化合物の特定の選択と重複するフェロポーチン阻害剤としての活性を有し、一般に、遊離塩基および／またはその医薬的に許容される塩である化合物について記載している。当該国際出願は、医薬的に許容される塩の可能な酸の一般的なリストについて言及している。更に、当該国際出願は、２ＨＣｌ塩、３ＨＣｌ塩または４ＨＣｌ塩の形態のいくつかの特定の例示化合物について言及しており、ＨＣｌ塩の上記特定例の一部のみが、本発明の式（Ｉ）による化合物の特定の選択からカバーされている。したがって、本発明は、式（Ｉ）で定義され、塩の形態（遊離塩基または塩と遊離塩基の混合物の代わり）であり、更に対イオンの特定の比（遊離塩基／化合物（Ｉ）：酸）の新規選択により定義される極めて特定的な化合物群の新規選択を構成する。
本発明の一般式（Ｉ）の構造に基づく化合物およびそれらの塩は、フェロポーチン阻害剤としてのそれらの活性に関連して、または鉄過剰などの鉄濃度の増大に関連する鉄代謝障害の予防および治療における使用に関してはこれまで開示されていない。
米国特許出願公開第２００４／０１３８２６８ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０２２４１３６ Ａ１号、中国特許公開第１０３５０８９５７号、国際公開第２００６／０６２２２４ Ａ１号、国際公開第２０１５／０５１３６２ Ａ１号、欧州特許出願公開第１９５３１４５ Ａ１号、国際公開第２００９／１５４７３９ Ａ２号、英国特許出願公開第９３７８７８号、国際公開第２０１１／０２３７２２ Ａ１号、国際公開第２０１０／０２０５５６ Ａ１号、国際公開第２００５／０１１６８５ Ａ１号、国際公開第００／５６７２４ Ａ１号、国際公開第２０１０／０３６６３２ Ａ１号、国際公開第２００５／０１４５７６ Ａ１号、国際公開第２０１３／０６７５７８ Ａ１号、国際公開第２００５／１１６３５５ Ａ１号、欧州特許出願公開第１８８９８４２ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／３０３５０８ Ａ１号、国際公開第９８／２７１０８ Ａ２号、国際公開第２００６／０４０６４６ Ａ１号、国際公開第２０１０／０７８４０８ Ａ１号、またはＡｓｈｉｓｈ Ｋ．Ｐａｔｈａｋ ｅｔ ａｌ．“Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−Ｐｈａｓｅ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ Ｐｕｒｉｎｅ，Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ，ａｎｄ Ｔｒｉａｚｏｌｅ Ａｃｅｔａｍｉｄｅｓ”，ＡＣＳ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．９，ｐａｇｅｓ４８５−４９３，２０１４、Ｚｏｕ Ｙｉｑｕａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｙｒａｚｏｌｅ ａｓ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＢＡＣＥ１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”；Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６８（２０１３）２７０−２８３、Ｔｕｓｓｉｎｇ−Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｔｈｉｎｋｉｎｇ Ｉｒｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｉｎ Ｉｒｏｎ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ａｎｅｍｉａ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｈｅｐｃｉｄｉｎ”Ｊ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｅｔｅｔｉｃｓ（２０１２），Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３，３９１−４００、Ｒｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ
ａｎａｌｏｇｓ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｎ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒａｌ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｉａｚｏｌｅ ａｍｉｄｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２（１）”；Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１８，１２１３（１９８１）、Ｈｉｄｅａｋｉ Ｓａｓａｋｉ“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｓ（２，４’−ｂｉｔｈｉａｚｏｌｅ） ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ａｓ ａ Ｃｏ（ＩＩ）−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖｉｎｇ ａｇｅｎｔ”；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４２（８）１６８５−１６８７（１９９４）、およびＢａｌｌｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｆｕｅｌｉｎｇ ｏｐｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．１７７ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｌｅａｄｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ”；ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ ２０１３，８，３１３−３２１は、様々な医療用途および作用機序の化合物について説明している。
国際公開第１９９８／２５８８７号 国際公開第１９９７／４９３９５号 国際公開第２０１３／１４２２５８号 国際公開第２００３／０４１７０９号 国際公開第１９９８／０９６２６号 国際公開第２０１５／０７７６５５号 国際公開第２００５／０５１４１１号 国際公開第２０１３／０８６１４３号 国際公開第２０１５／０６９６６０号 国際公開第２００８／１５１２８８号 国際公開第２００８／１１８７９０号 国際公開第２００８／１１５９９９号 国際公開第２００８／１０９８４０号 国際公開第２００８／１２３０９３号 欧州特許出願公開第１０７４２５４号 欧州特許出願公開第１０７２２６５号 国際公開第２０１１／０２９８３２号 国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５３０５号 国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５３０６号 米国特許出願公開第２００４／０１３８２６８ Ａ１号 米国特許出願公開第２０１１／０２２４１３６ Ａ１号 中国特許公開第１０３５０８９５７号 国際公開第２００６／０６２２２４ Ａ１号 国際公開第２０１５／０５１３６２ Ａ１号 欧州特許出願公開第１９５３１４５ Ａ１号 国際公開第２００９／１５４７３９ Ａ２号 英国特許出願公開第９３７８７８号 国際公開第２０１１／０２３７２２ Ａ１号 国際公開第２０１０／０２０５５６ Ａ１号 国際公開第２００５／０１１６８５ Ａ１号 国際公開第００／５６７２４ Ａ１号 国際公開第２０１０／０３６６３２ Ａ１号 国際公開第２００５／０１４５７６ Ａ１号 国際公開第２０１３／０６７５７８ Ａ１号 国際公開第２００５／１１６３５５ Ａ１号 欧州特許出願公開第１８８９８４２ Ａ１号 米国特許出願公開第２０１３／３０３５０８ Ａ１号 国際公開第９８／２７１０８ Ａ２号 国際公開第２００６／０４０６４６ Ａ１号 国際公開第２０１０／０７８４０８ Ａ１号
Ｍ．Ｗ．Ｈｅｎｔｚｅ，Ｃｅｌｌ １１７，２００４，２８５−２９７ Ｔ．Ｇａｎｚ，Ｂｌｏｏｄ，１０２，２００３，７８３−８ Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１２ Ｇａｒｄｅｎｇｈｉ ｅｔ ａｌ，２０１０ Ｃａｓｕ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ａｒｅｚｅｓ ｅｔ ａｌ ２０１５ Ａｓｈｉｓｈ Ｋ．Ｐａｔｈａｋ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．９，ｐａｇｅｓ４８５−４９３，２０１４ Ｚｏｕ Ｙｉｑｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６８（２０１３）２７０−２８３ Ｔｕｓｓｉｎｇ−Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｅｔｅｔｉｃｓ（２０１２），Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３，３９１−４００ Ｒｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１８，１２１３（１９８１） Ｈｉｄｅａｋｉ Ｓａｓａｋｉ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４２（８）１６８５−１６８７（１９９４） Ｂａｌｌｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ ２０１３，８，３１３−３２１
目的
本発明の目的は、特に、特に鉄過剰などの鉄濃度の増大に関連する鉄代謝障害の予防および治療のための効果的な療法のために使用できる治療上有効な新規化合物を提供することであった。更なる目的において、当該新規化合物は副作用がほとんどなく、毒性が非常に低く、生物学的利用能と適合性が良好であるべきである。更に、これらの新規化合物は、既知の鉄キレート化合物とは対照的に、鉄過剰がすでに発生しているときに身体から過剰な鉄を取り除くのではなく、鉄濃度の増大、したがって関連障害の発生を防ぐのに適している必要がある。更なる目的では、新規化合物は定義された構造（化学量論）を有し、かつ、抗体などの既知の生体分子化合物と比較して、単純な合成プロセスによって調製可能であって、感度が低く、向上した持続効率を呈する必要がある。
本発明の更なる態様において、新規化合物は、それらの物理的、化学的および物理化学的特性に関して最適な安定性を示さなければならない。特に、医薬品用途では、長期安定性（貯蔵寿命安定性）が良好または改善されていることが、物理的、化学的および物理化学的特性、ならびに薬理学的および生理学的活性を長期にわたって維持する新規医薬活性化合物を提供する重要な側面である。また、溶解性の安定性（すなわち、安定した溶解性プロファイル）は、製薬用途において重要である。この点で、本発明の更なる目的は、例えば低または無溶媒放出および／もしくは温度上昇下での質量損失を含む、良好なまたは改善された長期安定性を有し、低または無吸湿性であり、異なる温度および／または湿度条件下での長期保存時における固体構造の維持、結晶形の真空乾燥耐性、調製方法での高純度および低サイドまたは分解生成物との高い再現性、異なる温度および湿度条件下での長期保存時での溶解度プロファイルの維持、ならびにそれらの組み合わせの、本明細書に記載される新規化合物を提供することに関する。
この目標は、フェロポーチン阻害剤として作用し、したがって鉄輸送の阻害における使用に適していることが見出され、特に鉄過剰などの鉄濃度の増大に関連する鉄代謝障害の予防および治療において、ならびにヘプシジンの不足によって引き起こされる疾患、鉄濃度または鉄過剰の増大に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患、および無効赤血球生成に関連する疾患の予防および治療において効果的な、本明細書に定義される式（Ｉ）による化合物の新規塩の開発によって達成された。
本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に定義される一般構造式（Ｉ）を有する選択された化合物の特定の塩がフェロポーチン阻害剤として作用し、したがって鉄輸送を効果的に阻害し、したがって医薬としての使用、特に、ヘプシジンの欠如によって引き起こされる疾患、無効赤血球生成に関連する疾患、または、特にサラセミア、鎌状赤血球症およびヘモクロマトーシスなどの鉄過剰状態などの鉄濃度の増大につながる鉄代謝障害の治療および／もしくは予防における使用に特に適していることを発見した。非常に特に、新規塩化合物は、サラセミア、鎌状赤血球症およびヘモクロマトーシスの治療に適していることが判明した。新規塩化合物は、病理学的に低いヘプシジンレベルによって引き起こされる疾患の治療および鉄輸送の阻害における使用にも適している。
したがって、本発明は、一般式（Ｉ）：
Figure 2020516620
ここで、
Ｘ１はＮもしくはＯであり、
Ｘ２はＮ、ＳもしくはＯであり、
ただし、Ｘ１とＸ２は異なる；
Ｒ１は、
−水素、および
−置換されていてもよいアルキル
からなる群から選択され、
ｎは１〜３の整数であり、
Ａ１およびＡ２はアルカンジイルの群から独立して選択され、
Ｒ２は
−水素、もしくは
−置換されていてもよいアルキルであるか、
または
Ａ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４〜６員環を形成し、
Ｒ３は、
−ハロゲン、
−シアノ、
−置換されていてもよいアルキル、
−置換されていてもよいアルコキシ、および
−カルボキシル基
からなる群から独立して選択され得る１、２または３個の任意の置換基を示し、
Ｒ４は、
−水素、
−ハロゲン、
−Ｃ１−Ｃ３−アルキル、および
−ハロゲン置換アルキル
以下からなる群から選択される、
の化合物の新規の塩であって、
式（Ｉ）の化合物と、安息香酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸およびトルエンスルホン酸からなる群からの酸との塩から選択され、化合物（Ｉ）：酸の比が１〜２：１〜３であることを特徴とし、かつ、
以下の３ＨＣｌ塩が除外される
塩に関する。
Figure 2020516620
Figure 2020516620
そこでおよび本発明を通して、上記の置換基は以下のように定義される：
置換されていてもよいアルキルは、好ましくは以下を含む：
好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜６個、特に好ましくは１〜４個、更により好ましくは１、２または３個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキル。Ｃ１−Ｃ４−アルキルまたはＣ１−Ｃ３−アルキルとしても示される。
置換されていてもよいアルキルは、好ましくは３〜８個、より好ましくは５または６個の炭素原子を含むシクロアルキルを更に含む。
１〜８個の炭素原子を含むアルキル残基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基、２−メチルブチル基、ｎ−ヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、３−エチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、１−エチル−１−メチルプロピル基、ｎ−ヘプチル基、１−メチルヘキシル基、２−メチルヘキシル基、３−メチルヘキシル基、４−メチルヘキシル基、５−メチルヘキシル基、１−エチルペンチル基、２−エチルペンチル基、３−エチルペンチル基、４−エチルペンチル基、１，１−ジメチルペンチル基、２，２−ジメチルペンチル基、３，３−ジメチルペンチル基、４，４−ジメチルペンチル基、１−プロピルブチル基、ｎ−オクチル基、１−メチルヘプチル基、２−メチルヘプチル基、３−メチルヘプチル基、４−メチルヘプチル基、５−メチルヘプチル基、６−メチルヘプチル基、１−エチルヘキシル基、２−エチルヘキシル基、３−エチルヘキシル基、４−エチルヘキシル基、５−エチルヘキシル基、１，１−ジメチルヘキシル基、２，２−ジメチルヘキシル基、３，３−ジメチルヘキシル基、４，４−ジメチルヘキシル基、５，５−ジメチルヘキシル基、１−プロピルペンチル基、２−プロピルペンチル基などが挙げられる。特にメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔ−ブチルなど、１〜４個の炭素原子を含むもの（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）が好ましい。Ｃ１−Ｃ３アルキル、特にメチル、エチル、プロピルおよびｉ−プロピルがより好ましい。最も好ましいのは、メチルおよびエチルなどのＣ１およびＣ２アルキルである。
３〜８個の炭素原子を含むシクロアルキル残基には、好ましくは、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基およびシクロオクチル基が含まれる。シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基およびシクロヘキシル基が好ましい。シクロプロピル基が特に好ましい。
上記に定義された置換されていてもよいアルキルの置換基としては、好ましくは、以下からなる群から選択される１、２または３個の同じまたは異なる置換基を含む：以下で定義されるハロゲン、例えば、好ましくはＦ；以下で定義されるシクロアルキル、例えば、好ましくはシクロプロピル；以下で定義される置換されていてもよいヘテロアリール、例えば、好ましくはベンズイミダゾリル基；以下で定義される置換されていてもよいアミノ、例えば、好ましくはアミノ基またはベンジルオキシカルボニルアミノ；カルボキシル基；以下で定義されるアミノカルボニル基、ならびにアルキレン基、例えば特に、メチレン置換エチル基（ＣＨ３−（Ｃ＝ＣＨ２）−または
Figure 2020516620
ここで、＊は結合部位を示す）
などを形成するメチレン基が挙げられる。
本発明の意味の範囲内で、ハロゲンにはフッ素、塩素、臭素およびヨウ素が含まれ、好ましくはフッ素または塩素であり、最も好ましいのはフッ素である。
ハロゲンで置換され、１〜８個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキル残基の例としては以下のものが含まれる：
フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、ブロモメチル基、ジブロモメチル基、トリブロモメチル基、１−フルオロエチル基、１−クロロエチル基、１−ブロモエチル基、２−フルオロエチル基、２−クロロエチル基、２−ブロモエチル基、１，２−ジフルオロエチル基などのジフルオロエチル基、１，２−ジクロロエチル基、１，２−ジブロモエチル基、２，２−ジフルオロエチル基、２，２−ジクロロエチル基、２，２−ジブロモエチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、ヘプタフルオロエチル基、１−フルオロプロピル基、１−クロロプロピル基、１−ブロモプロピル基、２−フルオロプロピル基、２−クロロプロピル基、２−ブロモプロピル基、３−フルオロプロピル基、３−クロロプロピル基、３−ブロモプロピル基、１，２−ジフルオロプロピル基、１，２−ジクロロプロピル基、１，２−ジブロモプロピル基、２，３−ジフルオロプロピル基、２，３−ジクロロプロピル基、２，３−ジブロモプロピル基、３，３，３−トリフルオロプロピル基、２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル基、２−フルオロブチル基、２−クロロブチル基、２−ブロモブチル基、４−フルオロブチル基、４−クロロブチル基、４−ブロモブチル基、４，４，４−トリフルオロブチル基、２，２，３，３，４，４，４−ヘプタフルオロブチル基、ペルフルオロブチル基、２−フルオロペンチル基、２−クロロペンチル基、２−ブロモペンチル基、５−フルオロペンチル基、５−クロロペンチル基、５−ブロモペンチル基、ペルフルオロペンチル基、２−フルオロヘキシル基、２−クロロヘキシル基、２−ブロモヘキシル基、６−フルオロヘキシル基、６−クロロヘキシル基、６−ブロモヘキシル基、ペルフルオロヘキシル基、２−フルオロヘプチル基、２−クロロヘプチル基、２−ブロモヘプトイル基、７−フルオロヘプチル基、７−クロロヘプチル基、７−ブロモヘプチル基、ペルフルオロヘプチル基など。フルオロアルキル、ジフルオロアルキルおよびトリフルオロアルキルが特について言及されており、トリフルオロメチルおよびモノおよびジフルオロエチルが好ましい。トリフルオロメチルが特に好ましい。
シクロアルキル置換アルキル基の例としては、例えば、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチルシクロヘキシルメチル、２−シクロプロピルエチル、２−シクロブチルエチル、２−シクロペンチルエチル、２−シクロヘキシルエチル、２−または３−シクロプロピルプロピル、２−または３−シクロブチルプロピル、２−または３−シクロペンチルプロピル、２−または３−シクロヘキシルプロピルなどの１〜３個、好ましくは１個のシクロアルキル基を含む上記アルキル残基が挙げられる。シクロプロピルメチルが好ましい。
ヘテロアリール置換アルキル基の例としては、例えば、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チオフェニル、またはオキサゾリル基、例えばピリジン−２−イル−メチル、ピリジン−３−イル−メチル、ピリジン−４−イル−メチル、２−ピリジン−２−イル−エチル、２−ピリジン−１−イル−エチル、２−ピリジン−３−イル−エチル、ピリダジン−３−イル−メチル、ピリミジン−２−イル−メチル、ピリミジン−４−イル−メチル、ピラジン−２−イル−メチル、ピラゾール−３−イル−メチル、ピラゾール−４−イル−メチル、ピラゾール−５−イル−メチル、イミダゾール−２−イル−メチル、イミダゾール−５−イル−メチル、ベンズイミダゾール−２−イル−メチル、チオフェン−２−イル−メチル、チオフェン−３−イル−メチル、１，３−オキサゾール−２−イル−メチルなどの１〜３個、好ましくは１個の（置換されていてもよい）ヘテロアリール基を含む上記のアルキル残基が挙げられる。
好ましいのは、ベンズイミダゾール−２−イル−メチルおよびベンズイミダゾール−２−イル−エチルなどのベンズイミダゾリル基で置換されたアルキル基である。
アミノ置換アルキル残基の例としては、例えばアミノアルキル（ＮＨ２−アルキル）またはモノまたはジアルキルアミノ−アルキルなどの、以下に定義される１〜３個、好ましくは１個の（置換されていてもよい）アミノ基を含む上記アルキル残基、例えば、アミノメチル、２−アミノエチル、２−または３−アミノプロピル、メチルアミノメチル、メチルアミノエチル、メチルアミノプロピル、２−エチルアミノメチル、３−エチルアミノメチル、２−エチルアミノエチル、３−エチルアミノエチル（３−アミノプロピルが好ましい）、または式：
Figure 2020516620
ここで、Ｒはフェニル基を定義し、ベンジルオキシカルボニルアミノプロピル基を形成する
による基などの、置換されていてもよいアルキルオキシカルボニルアミノ基で置換されていてもよいアルキル基が挙げられる。
本発明による置換されていてもよいアミノとしては、好ましくは：アミノ（−ＮＨ２）、置換されていてもよいモノ−またはジアルキルアミノ（アルキル−ＮＨ−、（アルキル）２Ｎ−）が挙げられ、ここで「アルキル」に関して、上記の置換されていてもよいアルキルの定義を参照することができる。モノまたはジメチルアミノ、モノまたはジエチルアミノおよびモノプロピルアミノが好ましい。アミノ基（−ＮＨ２）およびモノプロピルアミノが最も好ましい。
更に、本発明の意味において、カルボキシル基は基［−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＨ］を示し、アミノカルボニル基は基［ＮＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−］を示す。
置換されていてもよいアルコキシとしては、置換されていてもよいアルキル−Ｏ−基が挙げられ、ここでアルキル基の前述の定義を参照することができる。好ましいアルコキシ基は、最大６個の炭素原子を含む直鎖または分岐アルコキシ基、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、ｉ−プロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、ｉ−ブチルオキシ基、ｓｅｃ−ブチルオキシ基、ｔ−ブチルオキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｉ−ペンチルオキシ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシ基、ｔ−ペンチルオキシ基、２−メチルブトキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｉ−ヘキシルオキシ基、ｔ−ヘキシルオキシ基、ｓｅｃ−ヘキシルオキシ基、２−メチルペンチルオキシ基、３−メチルペンチルオキシ基、１−エチルブチルオキシ基、２−エチルブチルオキシ基、１，１−ジメチルブチルオキシ基、２，２−ジメチルブチルオキシ基、３，３−ジメチルブチルオキシ基、１−エチル−１−メチルプロピルオキシ基、ならびにシクロアルキルオキシ基、例えば、シクロペンチルオキシ基またはシクロヘキシルオキシ基などである。メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基およびｉ−プロピルオキシ基が好ましい。メトキシおよびエトキシ基がより好ましい。メトキシ基が特に好ましい。
本発明を通して、置換されていてもよいアルカンジイルは、好ましくは、１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２または３個の炭素原子を有する二価の直鎖または分岐アルカンジイルラジカルであり、任意にハロゲン、ヒドロキシル（−ＯＨ）、オキソ基（（＝Ｏ；カルボニルまたはアシル基［−（Ｃ＝Ｏ）−］を形成）、および上記定義のアルキル基、好ましくはメチルからなる群から選択される１〜３個、好ましくは１または２個の置換基を担持することができる。好ましい例として以下のものを挙げることができる：メチレン、エタン−１，２−ジイル、エタン−１，１−ジイル、プロパン−１，３−ジイル、プロパン−１，１−ジイル、プロパン−１，２−ジイル、プロパン−２，２−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ブタン−１，２−ジイル、ブタン−１，３−ジイル、ブタン−２，３−ジイル、ブタン−１，１−ジイル、ブタン−２，２−ジイル、ブタン−３，３−ジイル、ペンタン−１，５−ジイルなど。特に好ましいのは、メチレン、エタン−１，２−ジイル、エタン−１，１−ジイル、プロパン−１，３−ジイル、プロパン−２，２−ジイルおよびブタン−２，２−ジイルである。最も好ましいのは、メチレン、エタン−１，２−ジイルおよびプロパン−１，３−ジイルである。
好ましい置換アルカンジイルラジカルは、ヒドロキシ置換エタンジイルなどのヒドロキシ置換アルカンジイル；カルボニルまたはアシル（アセチル）基を形成する、オキソ置換メチレンまたはエタンジイルラジカルなどのオキソ置換アルカンジイル、ＦおよびＣｌから選択される１または２個のハロゲン原子で置換されたアルカンジイル基などのハロゲン置換アルカンジイル、好ましくは２，２−ジフルオロエタンジイル、またはメチル基で置換されたアルカンジイル基である。
本発明によれば、更に、上記に定義された直鎖または分岐アルカンジイル基の意味を有するＡ１、および上記に定義される置換されていてもよいアルキル基の意味を有するＲ２が、それらが結合する窒素原子と一緒に、置換されていてもよい４〜６員環を形成することができ、上記に定義された１〜３個の置換基で置換されていてもよい。したがって、Ａ１およびＲ２は、以下の式の１つによる基から一緒になり得る：
Figure 2020516620
および
Figure 2020516620
その中で、（置換されているか、または置換されていない）４員環形成、例えば非常に特に基
Figure 2020516620
が好ましい。その中で、左側の結合部位は、本発明の式（Ｉ）の位置Ｘ１とＸ２との間の複素環式５員環への直接結合部位を示す。右側の結合部位は、本明細書に定義されるアルカンジイル基の意味を有する基Ａ２への結合部位を示す。
本明細書に定義される式（Ｉ）において、ｎは１、２または３を含む１〜３の整数の意味を有し、したがってメチレン基、エタン−１，２−ジイル基またはプロパン−１，３−ジイル基を示す。より好ましくは、ｎは１または２であり、更により好ましくはｎは１であり、メチレン基を示す。
本発明において、上記式（Ｉ）の個々の置換基は以下の意味を有し得る：
Ａ）Ｘ１はＮもしくはＯであり、
Ｘ２はＮ、ＳもしくはＯであり、
ただし、Ｘ１とＸ２は異なる；
したがって、以下の式に従って５員複素環を形成する：
Figure 2020516620
または
Figure 2020516620
ここで、＊はアミノカルボニル基への結合部位を示し、＊＊はＡ１基への結合部位を示す。
Ｂ）ｎは１、２もしくは３の整数であり、好ましくはｎは１または２であり、より好ましくはｎは１である。
Ｃ）Ｒ１は、
−水素、および
−置換されていてもよいアルキル（上記で定義）
からなる群から選択され、
好ましくは、Ｒ１は水素またはメチルであり、より好ましくはＲ１は水素である。
Ｄ）Ｒ２は、
−水素、および
−置換されていてもよいアルキル（上記で定義）
からなる群から選択され、
好ましくは、Ｒ２は水素またはＣ１−Ｃ４−アルキルであり、より好ましくはＲ２は水素またはメチルであり、更により好ましくはＲ２は水素である。
Ｅ）Ｒ３は、１、２、または３個の任意の置換基を示し、これらは独立して、
−ハロゲン（上記で定義）、
−シアノ、
−置換されていてもよいアルキル（上記で定義）、
−置換されていてもよいアルコキシ（上記で定義）、および
−カルボキシル基（上記で定義）
からなる群から選択されてもよく、
好ましくは、Ｒ３は１または２個の任意の置換基を示し、これらは独立して、
−ハロゲン、
−シアノ、
−１、２または３個のハロゲン原子（上記で定義）で置換されていてもよいアルキル（上記で定義）、置換されていてもよいアルコキシ（上記で定義）、およびカルボキシル基（上記で定義）
からなる群から選択されてもよく、
より好ましくは、Ｒ３は、１または２個の任意の置換基を示し、これらは独立して、
−ＦおよびＣｌ、
−シアノ、
−トリフルオロメチル、
−メトキシ、および
−カルボキシル基
からなる群から選択されてもよく、
更により好ましくは、Ｒ３は水素であり、式（Ｉ）の置換されていない末端ベンズイミダゾリル環を示す。
Ｆ）Ｒ４は、
−水素、
−ハロゲン（上記で定義）、
−Ｃ１−Ｃ３−アルキル、および
−ハロゲン置換アルキル（上記で定義）
からなる群から選択され、
好ましくは、Ｒ４は、
−水素
−Ｃｌ、
−メチル、エチル、イソプロピル、および
−トリフルオロメチル
からなる群から選択され、
より好ましくは、Ｒ４は、
−水素、
−Ｃｌ、
−メチル、および
−トリフルオロメチル
からなる群から選択され、
より好ましくは、Ｒ４は、
−水素、
−Ｃｌ、そして
−メチル、
からなる群から選択され、
更により好ましくは、Ｒ４は水素である。
Ｇ）Ａ１はアルカンジイルであり、
好ましくはＡ１はメチレンまたはエタン−１，２−ジイルであり、より好ましくはＡ１はエタン−１，２−ジイルである。
Ｈ）Ａ２はアルカンジイルであり、
好ましくは、Ａ２はメチレン、エタン−１，２−ジイルまたはプロパン−１，３−ジイルであり、
より好ましくはＡ２はメチレンまたはエタン−１，２−ジイルであり、更により好ましくはＡ２はエタン−１，２−ジイルである。
Ｉ）または、Ａ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、上記に定義されたように、置換されていてもよい４〜６員環を形成し、
ここで、Ａ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、好ましくは、上記に定義された置換されていてもよい４員環を形成し、
その中で、Ａ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、より好ましくは置換されていない４員環（アゼチジニル環）を形成する。
その中で、以下（Ｉ）の化合物の置換基は特に以下の意味を有し得る：
ｎは、上記Ｂ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）およびＣ）〜Ｉ）で定義される意味のいずれかを有し得る。
Ｒ１は上記Ｃ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基はＡ）、Ｂ）およびＤ）〜Ｉ）で定義される意味のいずれかを有し得る。
Ｒ２は、上記Ｄ）による任意の意味を有し、残りの置換基は、Ａ）〜Ｃ）およびＥ）〜Ｈ）またはＩ）に定義された任意の意味を有し得る。
Ｒ３は、上記Ｅ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）〜Ｄ）およびＦ）〜Ｉ）で定義される意味のいずれかを有してもよい。
Ｒ４は、上記Ｆ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）〜Ｅ）およびＧ）〜Ｉ）で定義されるような意味のいずれかを有し得る。
Ａ１は、上記Ｇ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）〜Ｆ）およびＨ）またはＩ）で定義される意味のいずれかを有し得る。
Ａ２は、上記のＨ）による意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）〜Ｇ）およびＩ）で定義される意味のいずれかを有し得る。
Ｒ２およびＡ１は、Ｉ）に定義された意味のいずれかを有し、残りの置換基は、Ａ）〜Ｃ）、Ｅ）、Ｆ）およびＨ）に定義された意味のいずれかを有し得る。
本発明の好ましい実施形態は、上記に定義された一般式（Ｉ）の化合物の新規な塩であって、
Ｘ１はＮもしくはＯであり、
Ｘ２はＮ、ＳもしくはＯであり、
ただし、Ｘ１とＸ２は異なる；
Ｒ１は水素であり、
ｎは１、２または３であり、
Ａ１はメチレンもしくはエタン−１，２−ジイルであり、
Ａ２はメチレン、エタン−１，２−ジイルもしくはプロパン−１，３−ジイルであり、
Ｒ２は水素またはＣ１−Ｃ４−アルキルであり、
または
Ａ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４員環を形成し、
Ｒ３は、
−ハロゲン、
−シアノ、
−１、２または３個のハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル、
−置換されていてもよいアルコキシ、および
−カルボキシル基
からなる群から独立して選択され得る１または２個の任意の置換基を示し、
Ｒ４は、
−水素
−Ｃｌ、
−メチル、エチル、イソプロピル、および
−トリフルオロメチル
からなる群から選択され、
当該塩は、式（Ｉ）の化合物と、安息香酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸およびトルエンスルホン酸からなる群からの酸との塩から選択され、化合物（Ｉ）：酸の比が１〜２：１〜３であることを特徴とし、かつ、
上記に定義された３ＨＣｌ塩が除外される
塩に関する。
本発明の更に好ましい実施形態は、上記に定義された一般式（Ｉ）の化合物の新規な塩であって、
Ｘ１はＮもしくはＯであり、
Ｘ２はＮ、ＳもしくはＯであり、
ただし、Ｘ１とＸ２は異なる；
Ｒ１は水素であり、
ｎは１または２であり、
Ａ１はメチレンもしくはエタン−１，２−ジイルであり、
Ａ２はメチレン、エタン−１，２−ジイルもしくはプロパン−１，３−ジイルであり、
Ｒ２は水素またはメチルであり、
または
Ａ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていない４員環を形成し、
Ｒ３は、
−ＦおよびＣｌ、
−シアノ、
−トリフルオロメチル、
−メトキシ、および
−カルボキシル基
からなる群から独立して選択され得る１または２個の任意の置換基を示し、
Ｒ４は、
−水素
−Ｃｌ、
−メチル、および
−トリフルオロメチル
からなる群から選択され、
当該塩は、式（Ｉ）の化合物と、安息香酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸およびトルエンスルホン酸からなる群からの酸との塩から選択され、化合物（Ｉ）：酸の比が１〜２：１〜３であることを特徴とし、かつ、
上記に定義された３ＨＣｌ塩が除外される
塩に関する。
本発明の更に好ましい実施形態は、上記に定義された一般式（Ｉ）の化合物の新規な塩であって、
Ｘ１はＮもしくはＯであり、
Ｘ２はＮ、ＳもしくはＯであり、
ただし、Ｘ１とＸ２は異なる；
Ｒ１は水素であり、
ｎは１であり、
Ａ１はメチレンもしくはエタン−１，２−ジイルであり、
Ａ２はメチレン、エタン−１，２−ジイルもしくはプロパン−１，３−ジイルであり、
Ｒ２は水素であり、
または
Ａ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていない４員環を形成し、
Ｒ３は水素を示し、それにより置換されていない末端ベンズイミダゾリル環を形成し、
Ｒ４は、
−水素
−Ｃｌ、および
−メチル
からなる群から選択され、
当該塩は、式（Ｉ）の化合物と、安息香酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸およびトルエンスルホン酸からなる群からの酸との塩から選択され、化合物（Ｉ）：酸の比が１〜２：１〜３であることを特徴とし、かつ、
上記に定義された３ＨＣｌ塩が除外される
塩に関する。
本発明の更に好ましい実施形態は、上記に定義された一般式（Ｉ）の化合物の新規な塩であって、
Ｘ１はＮもしくはＯであり、
Ｘ２はＮ、ＳもしくはＯであり、
ただし、Ｘ１とＸ２は異なる；
Ｒ１は水素であり、
ｎは１であり、
Ａ１はメチレンもしくはエタン−１，２−ジイルであり、
Ａ２はメチレン、エタン−１，２−ジイルもしくはプロパン−１，３−ジイルであり、
Ｒ２は水素であり、
または
Ａ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていない４員環を形成し、
Ｒ３は水素を示し、それにより置換されていない末端ベンズイミダゾリル環を形成し、
Ｒ４は水素であり、
当該塩は、式（Ｉ）の化合物と、安息香酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸およびトルエンスルホン酸からなる群からの酸との塩から選択され、化合物（Ｉ）：酸の比が１〜２：１〜３であることを特徴とし、かつ、
上記に定義された３ＨＣｌ塩が除外される
塩に関する。
本発明の更に好ましい実施形態は、上記に定義された一般式（Ｉ）の化合物の新規塩に関し、
ｎ＝１；
Ｒ３＝水素；
Ｒ４＝水素；
Ａ１＝エタン−１，２−ジイル；
Ａ２＝メチレン、エタン−１，２−ジイルもしくはプロパン−１，３−ジイル；
Ｒ２＝水素；
または、Ａ１およびＲ２はそれらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４員環を形成し、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
Figure 2020516620
Figure 2020516620
（ＩＩＩ）
式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）中、
ｍは１、２もしくは３の整数であり、
Ｘ１、Ｘ２、およびＲ１は、式（Ｉ）の化合物を含む本発明の任意の実施形態において上記に定義された意味を有する
による化合物を形成する。
特に、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）において、Ｘ１およびＸ２はＡ）において上記に定義された意味を有する。
式（ＩＩ）中、Ｒ１およびＲ２は好ましくは水素である。
式（ＩＩＩ）中、Ｒ１は好ましくは水素であり、ｍは好ましくは２である。
本発明の更に好ましい実施形態は、上記に定義された一般式（ＩＩ）の化合物の新規な塩に関し、
Ｘ１およびＸ２はＮおよびＯから選択され、異なっており、
Ｒ１＝水素、
Ｒ２＝水素、および
ｍ＝２。
以下において、本発明の塩を形成する化合物（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）は、「塩基」または「遊離塩基」とも呼ばれる。遊離塩基形態における式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）による化合物は、酸性基が結合できるアミノ基などの少なくとも１つの塩基性基を有する。
本発明によれば、上記の本発明の実施形態のいずれかに定義される式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物の塩は、塩基（化合物（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ））：酸が１〜２：１〜３の比を有する塩から選択され得、ここで、塩を形成する酸に関しては、上記に定義された選択が参照される。
本発明はまた、塩基（化合物（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ））と１つ以上の上記酸との混合塩を包含し、これらは本発明による塩基：酸の同じまたは異なる比を有し得る。酸は、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のカチオン型の対アニオンを提供する。したがって、本発明の選択された酸は、以下の対アニオンを提供する：
Figure 2020516620
Figure 2020516620
本発明によれば、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の塩は、塩基：酸、すなわち化合物（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：上記に定義された酸の選択された比が１．０〜２．０（モル塩基）：１．０〜３．０（モル酸）の範囲であることを特徴とする。特定実施形態において、塩基：酸の選択された比は、１．０〜２．０（モル塩基）：１．０〜２．０（モル酸）である。
特定例は、以下の塩基：酸の比、すなわち化合物（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：上記に定義された酸の比を含む：
１．０（モル塩基）：１．０（モル酸）、
１．０（モル塩基）：１．２５（モル酸）、
１．０（モル塩基）：１．３５（モル酸）、
１．０（モル塩基）：１．５（モル酸）、
１．０（モル塩基）：１．７５（モル酸）、
１．０（モル塩基）：２．０（モル酸）、および
２．０（モル塩基）：１．０（モル酸）。
その中で、１：１の塩基：酸の比を有する塩は、「単塩」または「１：１塩」とも呼ばれる。例えば、ＨＣｌ単塩は１ＨＣｌまたは１ＨＣｌ塩とも呼ばれる。
その中で、１：２の塩基：酸の比を有する塩は、「二塩」または「１：２塩」とも呼ばれる。例えば、ジＨＣｌ塩は２ＨＣｌまたは２ＨＣｌ塩とも呼ばれる。
その中で、１：３の塩基：酸の比を有する塩は、「三塩」、「三重塩」または「１：３塩」とも呼ばれる。例えば、トリＨＣｌ塩は３ＨＣｌまたは３ＨＣｌ塩とも呼ばれる。
１：１．２５の塩基：酸の比を有する塩は、「１：１．２５塩」とも呼ばれる。
塩基：酸の比が１：１．３５の塩は、「１：１．３５塩」とも呼ばれる。
１：１．５の塩基：酸の比を有する塩は、「１：１．５塩」とも呼ばれる。
１：１．７５の塩基：酸の比を有する塩は、「１：１．７５塩」とも呼ばれる。
２：１の塩基：酸の比を有する塩は、「半塩」または「２：１塩」とも呼ばれる。
本発明の更に好ましい実施形態において、上記に定義された式（Ｉ）の化合物の塩は、上記に定義された酸の１つ以上を有する単塩（１：１塩）から選択される。
本発明の更なる実施形態は、酸がクエン酸、塩酸、マレイン酸、リン酸および硫酸からなる群から選択される、上記に定義された式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物の塩に関する。
本発明の更なる実施形態は、酸がリン酸および硫酸からなる群から選択される、上記に定義された式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物の塩に関する。
本発明による化合物の塩は、非晶質、多形、結晶および／または半結晶（部分結晶）形態、ならびに塩の溶媒和物の形態で存在し得る。
好ましくは、本発明の塩は、結晶および／もしくは半結晶（部分結晶）形態ならびに／またはその溶媒和物の形態で存在する。
本発明の塩または塩溶媒和物の好ましい結晶化度は、特に塩化合物の明確かつ簡単な分析を可能にする様々なＸ線法を使用するなど、従来の分析方法を使用することにより決定できる。特に、結晶化度のグレードは、例えば以下の実施例に記載される粉末Ｘ線回折（反射）法を使用することにより、または例えば以下の実施例に記載される粉末Ｘ線回折（透過）法（以下、両方ともＰＸＲＤと略する）を使用することにより決定または確認することができる。同一の化学組成を持つ結晶性固体の場合、結果として生じる異なる結晶格子は、多形という用語で要約される。
好ましくは、本発明の塩は、本明細書に記載のＰＸＲＤ法で測定して、３０％を超える、より好ましくは４０％を超える、更により好ましくは５０％を超える、例えば少なくとも５５〜６０％の結晶化度を示す。
本発明の塩は、本発明の塩の結晶格子中の溶媒分子の引力、会合、吸着、接着、包埋または錯化により形成され得る溶媒和物および／または水和物として存在し得る。結晶格子に埋め込まれている可能性のある溶媒分子は、結晶化に使用される溶媒および相対湿度に由来する水に由来し得る。
結晶化に使用される溶媒は、アセトニトリル；ジクロロメタン；特にメタノール、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）などのアルコール；アルデヒド；ケトン、特にアセトン；テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはジオキサンなどのエーテル；酢酸エチルなどのエステル；または特にペンタン、ヘキサン、ヘプタンまたはシクロヘキサンなどのアルカン；および水、ならびにそれらの混合物を含む。結晶化に使用される好ましい溶媒は、アセトニトリル、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、２−プロパノール、酢酸エチル、ＴＨＦ、水およびそれらの混合物からなる群から選択される。
結晶化に使用される特に好ましい溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、酢酸エチル、ＴＨＦ、水およびそれらの混合物からなる群から選択される。好ましい水／溶媒混合物は、水とアセトンの混合物、水とエタノールの混合物、ならびに水とメタノールの混合物を含み、水とエタノールの混合物および水とメタノールの混合物が好ましい。
特に好ましいのは、結晶化に使用される溶媒であり、これは、アセトニトリル、ジクロロメタン、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、アセトンおよび酢酸エチル、ならびにそれらと水の混合物、例えば特にエタノールと水の混合物およびアセトンと水の混合物からなる群から選択される。特に好ましい混合物は、以下の溶媒と水の混合物である（ここで指定された溶媒混合物の比は、常にｖｏｌ：ｖｏｌを指する）。
−アセトン：水＝９：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）
−アセトン：水＝９５：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）
−エタノール：水＝４：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）
−エタノール：水＝３：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）
−エタノール：水＝８：２（ｖｏｌ：ｖｏｌ）。
選択された溶媒または水が結晶化および後続のプロセス工程で溶媒和物または水和物をもたらすか、または遊離塩基を直接もたらす程度は一般に予測不可能であり、プロセス条件と、選択された化合物（Ｉ）、選択された酸からの対アニオンおよび選択された溶媒の間の様々な相互作用ならびに湿度条件の組み合わせに依存する。結晶構造内の溶媒または水分子は強い分子間力によって結合され、それによりこれらの結晶の構造形成の要素を表し、塩の安定性を部分的に改善し得るので、塩の溶媒和物または水和物が好ましい場合がある。しかしながら、溶媒および／または水分子は、かなり弱い分子間力によって結合される特定の結晶格子にも存在する。そのような分子は、結晶構造の形成に多かれ少なかれ統合されるが、エネルギー効果は低くなる。溶媒和物の溶媒および／または含水量は、乾燥および周囲条件（すなわち相対湿度）にも依存する。安定な溶媒和物または水和物の場合、通常、活性化合物（すなわち、本発明の塩）と溶媒または水との間に明確な化学量論比がある。多くの場合、これらの比は化学量論値を完全には満たしておらず、通常、特定の結晶欠陥のために理論に比べて低い値に近くなる。より弱い結合水に関する有機分子の溶媒または水分子に対する比は、かなりの範囲まで変化し得、例えば、二水和物、三水和物または四水和物に及ぶ。一方、非晶質固体では、溶媒および／または水の分子構造分類は化学量論的ではない。ただし、分類は偶然によってのみ化学量論的になる場合もある。場合によっては、層構造が形成されて、埋め込まれた溶媒または水分子を定義された形では決定できないため、溶媒または水分子の正確な化学量論を分類することは不可能である。
非晶質固体ならびに結晶性溶媒和物もしくは水和物中の溶媒および／または含水量は、一般に、例えば、従来の方法、例えば、以下の実施例で説明するように、よく知られたカールフィッシャー滴定法を使用して、動的蒸気収着（ＤＶＳ）測定を実行し、熱重量測定（ＴＧ−ＦＴＩＲ）を実行することによって決定できる。また、１Ｈ ＮＭＲ分光法やラマン分光法（ＦＴラマン分光法）などの元素分析または構造分析の方法により、溶媒和物または水和物の形成の程度に関する情報が得られ、カールフィッシャー（ＫＦ）、ＤＶＳまたはＴＧ−ＦＴＩＲ測定の結果を確認または検証するために使用される場合がある。
本発明による溶媒和物および／または水和物の例としては、例えば、ヘミ−（０．５）、モノ−、セスキ−（１．５）、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−、ヘキサ−、ヘプタ−、オクタ−、ノナ−、デカ−などの溶媒和物または水和物それぞれが挙げられる。２．５、３．５、４．５などの溶媒および／または水分子との溶媒和など、更なる中間溶媒和度も可能である。
溶媒和物および／または水和物の好ましい例は、約１．５、２．５、３、４および７個の水分子を含む水和物を含む。溶媒和物および／または水和物の更に好ましい例は、約０．５、１．５、２．５、３、４、６および７個の水分子を含む水和物を含む。無水塩も好ましい。更に、溶媒および／または水の残留物が非化学量論量で塩中に残る可能性がある。
更に、水と溶媒の混合物が塩にとどまり、いわゆる混合水和物／溶媒和物の形態を形成する可能性がある。そのような混合水和物／溶媒和物形態の例としては、特に
アセトン／水、好ましくは１〜４：１の比、特に４：１など；
メタノール／水、好ましくは３〜９：１の比、特に３：１、４：１、９：１など；
エタノール／水、好ましくは１〜４：１の比、特に３：１や４：１などが挙げられる。
本発明による塩についての本明細書の上記および下記のいずれの言及も、対応する溶媒和物、例えば水和物、溶媒和物および混合水和物／溶媒和物形態、ならびに多形修飾、ならびに非晶質形態についての適切かつ適当な言及でもあると理解されるべきである。
本発明の新規な塩は、良好な溶解性を示し、安定であり、貯蔵および流通中にも良好な品質である。
塩、溶媒和物および水和物（混合水和物／溶媒和物の形態を含む）の形で得られた結晶または非晶質固体、ならびに対応する塩溶媒和物または塩水和物のそれぞれの安定性は、従来の実験によって決定できる。安定性の向上には、吸湿性の向上、融解エンタルピーの向上が含まれる。乾燥、ふるい分け、粉砕などの物理化学的手順、および医薬賦形剤を使用して行われるガレヌスプロセス、つまり混合プロセス、造粒、スプレー乾燥、錠剤化などの両方で、純粋な活性物質の品質に不可欠な特徴は、問題の環境の温度と相対湿度に応じた、この活性物質の吸水または水分損失である。特定の製剤では、疑いもなく賦形剤とともに自由水および結合水が導入され、賦形剤および／または水をそれぞれの製剤プロセスに関連する理由のためにプロセスマスに追加される。このようにして、医薬活性物質は、異なる活性の温度に応じて、かなり長期間にわたって遊離水にさらされる（部分蒸気圧）。それから、特に安定で純粋な化合物は、すべてのガレヌスプロセス段階および様々な剤形で製剤化される点で、医薬−ガレヌス観点およびそれらの適合性の下で有利であることが明らかになる。
本発明による塩は、例えば、≧６５％、好ましくは≧７０％、より好ましくは≧７５％、より好ましくは≧８０％の純度で、単離された本質的に純粋な形態で存在し得る。
本発明の意味において、本明細書で使用される用語「塩」は、対応する溶媒和物、水和物および混合水和物／溶媒和物の形態など、ならびに、その異なる多形体、例えば特に本明細書に記載の特定の多形体を含む。
本発明の塩は、元素分析、熱重量測定（ＴＧ−ＦＴＩＲ）、１Ｈ ＮＭＲ分光法およびラマン分光法（ＦＴラマン分光法）、融点を決定するための示差走査熱量測定（ＤＳＣ）（それぞれ以下の実施例で説明）などの従来の方法により、ならびに、上記方法の組み合わせ、特に溶媒和物／水和物の程度を決定するための上記方法との組み合わせにより構造的に特徴付けることができる。
本発明の更なる実施形態は、本明細書に定義される塩を調製する方法に関する。塩の調製プロセスは次のように説明できる。
塩の形成は溶媒系で行われ、２つの反応物、すなわち塩基化合物（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）およびそれぞれの酸は十分に溶解する。結晶化または沈殿を達成するために、得られる塩がわずかにしか溶解しないか、またはまったく溶解しない溶媒または溶媒混合物を使用するのが適切である。本発明による塩形成の１つの変形は、それぞれの塩が非常に可溶性である溶媒を使用し、続いてこの溶液に貧溶媒、すなわち、得られる塩が低い溶解度しか持たない溶媒を添加することである。塩形成の更なる変形は、例えば加熱により、必要であれば減圧下で、または、例えば室温で溶媒をゆっくり蒸発させることにより、種結晶を加えて種を播くことにより、または水和物の形成に必要な水分活性を設定することにより、塩溶液を濃縮することを含む。その中で、上記に定義された溶媒を使用することができる。
水和物を生成するために、溶解および結晶化プロセス、または水平衡化結晶化プロセスを使用してもよい。
溶解および結晶化プロセスは、次の手順で説明できる：
（ｉ）遊離塩基としての化合物（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）を有機溶媒に溶解し、
（ｉｉ）上記で選択した酸を、好ましくは水溶液として、（ｉ）で得られた溶液に添加し、
（ｉｉｉ）溶液を放置して結晶化を誘発し、
（ｉｖ）結晶をろ過して乾燥し、塩を得る。
溶解プロセス（ｉ）において、使用される有機溶媒は、有利には、アセトニトリル、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、２−プロパノール、酢酸エチル、ＴＨＦ、水およびそれらの混合物であり、より好ましくは、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、酢酸エチル、ＴＨＦ、水またはそれらの混合物、例えば特に水との混合物、例えば水とエタノールの混合物、水とメタノールの混合物、または水とアセトンの混合物である。必要に応じて、溶媒を室温よりも高い温度、例えば２５〜６０℃、より好ましくは３０〜５０℃まで加熱してもよい。
プロセス工程（ｉｉ）において、使用される酸の水溶液は、有利には、それぞれの酸の５〜３０％、より好ましくは５〜２５％、例えば１０％の溶液である。特に、塩基：酸の比は１：１（ｍｏｌ：ｍｏｌ）である。リン酸または硫酸を使用する場合、１０：１（ｍｏｌ：ｍｏｌ）の塩基：酸の比も使用できる。
プロセス段階（ｉｉｉ）において、溶媒をゆっくり蒸発させるために、溶液を有利に静置する。これは、好ましくは室温以下、より好ましくは−１０〜２０℃、更に好ましくは−５〜１０℃、最も好ましくは０〜５℃に冷却することにより行われる。代わりに、溶液の濃縮は、室温よりも高い温度、例えば＞２５〜１００℃、より好ましくは３０〜７０℃まで加熱することによっても行うことができる。典型的には、溶液を８〜４８時間、好ましくは１７〜３６時間、より好ましくは２０〜３０時間放置する。
プロセス工程（ｉｖ）において、乾燥は、好ましくは高温、より好ましくは２０〜５０℃、最も好ましくは３０〜４０℃で行われる。いずれにせよ、乾燥はそれぞれの塩の融点未満の温度で行わなければならない。圧力は、好ましくは１〜１００ｍｂａｒ、好ましくは１０〜５０ｍｂａｒ、より好ましくは２０〜４０ｍｂａｒ、例えば３０ｍｂａｒになるように選択される。乾燥は通常、一定の質量が得られるまで行われる。乾燥条件に応じて、乾燥は５〜４８時間、好ましくは１０〜２４時間、例えば１５〜２０時間かかる場合がある。
また、適切な結晶化開始剤、例えば少なくとも１つの種結晶などを加えることにより、結晶化を促進することも可能である。
本発明の更に好ましい実施形態において、上記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の定義に該当する化合物の３ＨＣｌ（３ＨＣｌ）塩は除外される。
本発明の特定実施形態は、上記実施形態のいずれかに定義される式（Ｉ）の化合物の塩に関し、式（Ｉ）の化合物は、以下からなる群から選択される：
Figure 2020516620
Figure 2020516620
より好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、以下からなる群から選択される：
Figure 2020516620
更により好ましくは、本発明は、式（Ｉ）の化合物が
Figure 2020516620
および／または
Figure 2020516620
である、上記実施形態のいずれかに定義される塩に関する
本発明の更に特に好ましい実施形態は、酸がリン酸および硫酸からなる群から選択される、上記実施形態のいずれかに定義される式（Ｉ）の化合物の塩に関する。
本発明の更に特に好ましい実施形態は、結晶化用溶媒がアセトニトリル、ジクロロメタン、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、アセトンおよび酢酸エチル、ならびにそれらと水の混合物、例えば特にエタノールと水の混合物、およびアセトンと水の混合物、からなる群から選択される、上記実施形態のいずれかに定義される式（Ｉ）の化合物の塩に関する。特に好ましい混合物は、以下の溶媒と水の混合物である：
−アセトン：水＝９：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）
−アセトン：水＝９５：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）
−エタノール：水＝４：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）
−エタノール：水＝３：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）
−エタノール：水＝８：２（ｖｏｌ：ｖｏｌ）。
本発明の更に特に好ましい実施形態は、酸がリン酸であり、前記リン酸塩の化合物（Ｉ）：酸の比が１〜２：１、好ましくは化合物（Ｉ）：酸の比が１：１または２：１であることを特徴とする、上記実施形態のいずれかに定義される式（Ｉ）の化合物の塩に関する。
より好ましくは、そのような好ましいリン酸塩は、アセトニトリル、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、アセトンおよび酢酸エチル、ならびにそれらの水との混合物、例えば特にエタノールと水の混合物およびアセトンと水の混合物からなる群からの溶媒を使用する結晶化により得られる。その中で、特に好ましい混合物はエタノール：水＝８：２の混合物である。
本発明の更に特に好ましい実施形態は、酸が硫酸であり、前記硫酸塩が化合物（Ｉ）：酸の比が１：１であることを特徴とする、上記実施形態のいずれかに定義される式（Ｉ）の化合物の塩に関する。
より好ましくは、そのような好ましい硫酸塩は、アセトニトリル、ジクロロメタン、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）およびアセトン、ならびに、それらの水との混合物、例えば特にエタノールと水の混合物およびアセトンと水の混合物からなる群からの溶媒を使用する結晶化によって得られる。その中で、特に好ましい混合物は、以下の混合物から選択される：
−アセトン：水＝９：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）
−アセトン：水＝９５：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）
−エタノール：水＝４：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）
−エタノール：水＝３：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）。
上記好ましいリン酸塩および硫酸塩が、上記の表に示すような例示化合物Ｎｏ．１、２、４、４０、９４、１１８、１２６、１２７、１９３、２０６、２０８、２３３から選択される式（Ｉ）の化合物の塩であることが更に特に好ましい。より好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、例示化合物Ｎｏ．１、４０、９４、１２７、２０８から選択される。更により好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、例示化合物Ｎｏ．１および１２７から選択され、例示化合物Ｎｏ．１２７が最も好ましい。
したがって、以下の塩が特に好ましい：
Figure 2020516620
本発明の更に特に好ましい実施形態は、以下の実施例で詳細に定義される多形体ＰＭ２を特徴とする、化合物（Ｉ）：酸の比が１：１である例示化合物Ｎｏ．１２７の化合物のリン酸塩に関する。
本発明の更に特に好ましい実施形態は、以下の実施例で詳細に定義される多形体ＰＭ１を特徴とする、化合物（Ｉ）：酸の比が１：１である例示化合物Ｎｏ．１２７の化合物の硫酸塩に関する。
驚くべきことに、本明細書に記載されている化合物が、低または無溶媒放出および／もしくは温度上昇下での質量損失を含むことを含む、良好なまたは改善された長期安定性を有することが判明し、当該化合物が、低または無吸湿性であり、異なる温度および／または湿度条件下での長期保存時でも固体構造を維持し、結晶形が真空乾燥耐性であり、化合物が調製方法での高純度および低サイドまたは分解生成物との高い再現性を呈し、異なる温度および湿度条件下での長期保存時でさえ溶解度プロファイルを維持することが判明した。本発明の発明者らは、驚くべきことに、特に例示化合物Ｎｏ．１２７の上記好ましい硫酸塩およびリン酸塩（１：１塩）、特に本明細書において詳細に記載される多形体ＰＭ１（硫酸塩）およびＰＭ２（リン酸塩）が前記有利な特性を達成したことを発見した。これにより、これらの多形体は、本明細書に記載の予防および治療のための医薬調製物の有効成分として特に適したものになる。前記特定の好ましい多形体ＰＭ１（１：１硫酸塩）およびＰＭ２（１：１リン酸塩）は、そこで試験された他の多形体と比較してより少ない水を含み、これは所望の長期安定性に関して有利である。
それらの構造に応じて、本発明による塩は、不斉炭素原子の存在下で立体異性体（エナンチオマー、ジアステレオマー）として存在し得る。したがって、本発明は、エナンチオマーまたはジアステレオマーおよびそれらのそれぞれの混合物を含む。純粋なエナンチオマー形態は、光学活性化合物との反応によるそのジアステレオマーの分別結晶化などの、光学分割の従来のプロセスによって任意に得ることができる。本発明による化合物は互変異性体として発生し得るため、本発明はすべての互変異性体の使用を包含する。本発明の塩は、様々な可能な異性体、特に立体異性体、例えば、Ｅ−およびＺ−、ｓｙｎおよびａｎｔｉ、ならびに光学異性体の混合物として存在してもよい。Ｅ異性体およびＺ異性体ならびに光学異性体およびこれらの異性体の任意の混合物が特許請求されている。
本発明は更に、本明細書に記載の式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）による新規塩化合物の新規多形体に関する。
物質の同じ組成が異なる格子配列で結晶化する場合、多形体が発生し、特定の多形体に固有の異なる熱力学的特性および安定性をもたらす。
本発明の特定の一実施形態は、例示化合物Ｎｏ．１２７のクエン酸塩の多形体に関し、これは、２４．５および５．３±０．２５度、または±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度の角度２θで表される特徴的な結晶ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン（ＰＸＲＤパターン）を特徴とする。好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、約２４．３、２１．６、１７．１、５．９、２５．３、８．１、１５．１、２０．１、または１２．６±０．２５度または±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度から選択される角度２θで表される１つ以上の更なるピークを含む。
より好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、約２４．３、２１．６、１７．１、５．９、２５．３、８．１、１５．１、２０．１、または１２．６から選択される角度２θで表される１つ以上の更なるピークを含む。
より好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、２４．５、５．３、２４．３、２１．６、および１７．１のそれぞれ、および場合により５．９、２５．３、８．１、１５．１、２０．１、または１２．６±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度それぞれの１つ以上、２つ以上、３つ以上の角度２θで表される特徴的な結晶ピークを含む。
好ましくは、例示化合物Ｎｏ．１２７のクエン酸塩の前記多形体は、１：１塩の形態である。
本発明の更なる特定実施形態は、例示化合物Ｎｏ．１２７のマレイン酸塩の多形体に関し、これは、１９．０および２４．５±０．２５度、または±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度の角度２θで表される特徴的な結晶ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン（ＰＸＲＤパターン）を特徴とする。好ましくは、そのような多形体の実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、約２５．１、１７．５、１８．７、２５．７、１８．３、２１．９、９．６、または６．１±０．２５度または±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度から選択される角度２θで表される１つ以上の更なるピークを含む。
より好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、約２５．１、１７．５、１８．７、２５．７、１８．３、２１．９、９．６または６．１から選択される角度２θで表される１つ以上の更なるピークを含む。
より好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、１９．０、２４．５、２５．１、１７．５および１８．７のそれぞれ、および場合により２５．７、１８．３、２１．９、９．６または６．１±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度それぞれの１つ以上、２つ以上、３つ以上の角度２θで表される特徴的な結晶ピークを含む。
好ましくは、例示化合物Ｎｏ．１２７のマレイン酸塩の前記多形体は、１：１．７５塩の形態である。
本発明の更なる特定実施形態は、例示化合物Ｎｏ．１２７のリン酸塩の多形体に関し、これは、２７．２および４．６±０．２５度、または±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度の角度２θで表される特徴的な結晶ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン（ＰＸＲＤパターン）を特徴とする。好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、約１６．８、２２．０、２４．５、５．４、８．９、１３．１、１２．３、１９．７または１５．９±０．２５度、または±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度から選択される角度２θで表される１つ以上の更なるピークを含む。
より好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、約１６．８、２２．０、２４．５、５．４、８．９、１３．１、１２．３、１９．７、または１５．９から選択される角度２θで表される１つ以上の更なるピークを含む。
より好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、２７．２、４．６、１６．８、２２．０、および２４．５のそれぞれ、および場合により５．４、８．９、１３．１、１２．３、１９．７、または１５．９±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度それぞれの１つ以上、２つ以上、３つ以上の角度２θで表される特徴的な結晶ピークを含む。
好ましくは、例示化合物Ｎｏ．１２７のリン酸塩の前記多形体は、２：１塩の形態である。
本発明の更なる特定実施形態は、例示化合物Ｎｏ．１２７のリン酸塩の多形体に関し、これは、２６．１および１６．５±０．２５度、または±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度の角度２θで表される特徴的な結晶ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン（ＰＸＲＤパターン）を特徴とする。好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、約１５．５、１８．４、１７．４、１４．７、２５．４、２０．４、１３．２または２２．１±０．２５度、または±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度から選択される角度２θで表される１つ以上の更なるピークを含む。
より好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、約１５．５、１８．４、１７．４、１４．７、２５．４、２０．４、１３．２または２２．１から選択される角度２θで表される１つ以上の更なるピークを含む。
より好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、２６．１、１６．５、１５．５、１８．４および１７．４のそれぞれ、および場合により１４．７、２５．４、２０．４、１３．２または２２．１±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度それぞれの１つ以上、２つ以上、３つ以上の角度２θで表される特徴的な結晶ピークを含む。
好ましくは、例示化合物Ｎｏ．１２７のリン酸塩の前記多形体は、１：１塩の形態である。
本発明の更なる特定実施形態は、例示化合物Ｎｏ．１２７の硫酸塩の多形体に関し、これは、２５．４および１８．１±０．２５度、または±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度の角度２θで表される特徴的な結晶ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン（ＰＸＲＤパターン）を特徴とする。好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、約４．５、２５．１、１６．８、１８．５、１８．６、１４．９、１５．６または１７．６±０．２５度、または±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度から選択される角度２θで表される１つ以上の更なるピークを含む。
より好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、約４．５、２５．１、１６．８、１８．５、１８．６、１４．９、１５．６または１７．６から選択される角度２θで表される１つ以上の更なるピークを含む。
より好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、２５．４、１８．１、４．５、２５．１および１６．８のそれぞれ、および場合により１８．５、１８．６、１４．９、１５．６または１７．６±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度それぞれの１つ以上、２つ以上、３つ以上の角度２θで表される特徴的な結晶ピークを含む。
好ましくは、例示化合物Ｎｏ．１２７の硫酸塩の前記多形体は、１：１塩の形態である。
本発明の更なる特定実施形態は、例示化合物Ｎｏ．１２７の硫酸塩の多形体に関し、これは、２５．５および４．５±０．２５度、または±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度の角度２θで表される特徴的な結晶ピークを含む粉末Ｘ線回折パターン（ＰＸＲＤパターン）を特徴とする。好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、約１８．１、１８．４、１６．８、６．２、１４．９、２５．２、１５．６または１３．１±０．２５度、または±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度から選択される角度２θで表される１つ以上の更なるピークを含む。
より好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、約１８．１、１８．４、１６．８、６．２、１４．９、２５．２、１５．６または１３．１から選択される角度２θで表される１つ以上の更なるピークを含む。
より好ましくは、多形体のこのような実施形態において、ＰＸＲＤパターンは、２５．５、４．５、１８．１、１８．４および１６．８のそれぞれ、および場合により６．２、１４．９、２５．２、１５．６または１３．１±０．２０度または±０．１０度または±０．０５度それぞれの１つ以上、２つ以上、３つ以上の角度２θで表される特徴的な結晶ピークを含む。
好ましくは、例示化合物Ｎｏ．１２７の硫酸塩の前記多形体は、１：１塩の形態である。
非常に詳細には、本発明は、本明細書に記載の例示化合物Ｎｏ．１２７の以下の塩の多形体を含み、これらの多形は以下のＰＸＲＤピークパターンを有する：
例示化合物Ｎｏ．１２７のクエン酸塩（１：１塩）
Figure 2020516620
例示化合物Ｎｏ．１２７のマレイン酸塩（１：１．７５塩）
Figure 2020516620
例示化合物Ｎｏ．１２７のリン酸塩（２：１塩）
Figure 2020516620
Figure 2020516620
特に、
例示化合物Ｎｏ．１２７のリン酸塩（１：１塩）
Figure 2020516620
例示化合物Ｎｏ．１２７の硫酸塩（１：１塩）
Figure 2020516620
特に、
例示化合物Ｎｏ．１２７の硫酸塩（１：１塩）
Figure 2020516620
本発明によれば、前記新規塩化合物の総重量に基づいて、本発明のそれぞれの新規な塩（すなわち、活性化合物）の≧７０重量％、好ましくは≧７５重量％、≧８５重量％、≧９０重量％、≧９５重量％がそのような特定の多形体の形態であることが特に好ましい。したがって、本発明の特定実施形態は、以下に記載される組成物、医薬品または医薬製剤に関し、（前記新規活性化合物の総重量に基づき）活性化合物としてのそれぞれの新規塩の≧７０重量％、好ましくは≧７５重量％、≧８５重量％、≧９０重量％、≧９５重量％は、そのような特定の多形体の形態である。
本出願に記載されているすべての化合物（溶媒和物、水和物、混合水和物／溶媒和物形態および多形体などを含む遊離塩基または塩）はフェロポーチン阻害剤である。本特許出願に記載されているすべての新規塩は、フェロポーチン阻害活性を維持し、また、フェロポーチン阻害活性を改善し、および／または化合物の薬物動態プロファイルを改善し、および／または化合物の物理化学的特性を改善してガレヌス製剤への製剤化をより容易にし、および／または化合物の物理化学的特性を改善してガレヌス製剤への製剤化をより容易にするか、取り扱い／加工をより容易にするか、またはその安定性を改善する結晶の形態で単離されるという利点を有する。したがって、本発明による新規な塩は、特にフェロポーチン阻害剤としての使用など、医薬品としての使用に適している。
すでに上で説明したように、フェロポーチンは鉄輸送タンパク質であり、腸を介した放出された鉄の取り込みと血液循環への移動を担い、それにより鉄を適切な組織および器官に運ぶ。フェロポーチンの不活性化または阻害は、鉄の輸出を無効にし、それにより腸での鉄の吸収を減少させる。したがって、本発明の意味におけるフェロポーチン阻害は、細胞から血液循環への鉄輸送の阻害、および腸での鉄吸収の阻害を含む。その中で、鉄輸送および／または鉄逆流の阻害は、例えばフェロポーチンの鉄輸送活性の阻害、したがって鉄逆流の阻害、フェロポーチンのインターナリゼーション、分解および／または減少の誘発を含む異なる様式のメカニズムにより、ヘプシジン作動薬、すなわちヘプシジンと競合する化合物の投与により、またはヘプシジンのフェロポーチンへの結合を阻害する化合物によりもたらされる。
フェロポーチン阻害は、以下の実施例でより詳細に説明されるように、鉄応答アッセイ（ＢＬＡｚｅｒアッセイ）でフェロポーチン媒介鉄輸送活性の阻害を測定することにより決定できる。更に、フェロポーチンの阻害は、以下の実施例にそれぞれより詳細に記載されるように、フェロポーチンインターナリゼーションおよび分解アッセイ（ＦＡＣＳ）においてフェロポーチンのインターナリゼーションおよび／または分解を測定するか、またはフェロポーチンのユビキチン化および分解を調べることにより決定できる。更に、フェロポーチン阻害は、ヘプシジン作動薬としての活性を測定することにより、例えば、以下の実施例により詳細に記載されるように、ヘプシジンインターナリゼーションアッセイ（Ｊ７７４）でフェロポーチンへのヘプシジン結合能力を決定することにより決定できる。更に、フェロポーチン阻害は、以下の実施例でより詳細に説明するように、例えば生物物理学的フェロポーチン−ヘプシジン結合アッセイ（Ｈｅｐ Ｂｉｎｄ ＦＰ）でフェロポーチンへのヘプシジン結合の阻害を確認することにより決定できる。更に、フェロポーチン阻害は、以下の実施例でより詳細に説明するように、例えば鉄流出の阻害を測定するための試験により、フェロポーチンを介した鉄の排出を遮断する能力に関する化合物の活性を測定することにより決定できる。
したがって、本発明の意味におけるフェロポーチン阻害は、特に、以下によって示される前述の試験方法の少なくとも１つにおいてフェロポーチン阻害活性を示すことによって特に定義することができる。
鉄応答アッセイ（Ｂｌａｚｅｒアッセイ）におけるフェロポーチン媒介鉄輸送活性の阻害：１００以下（≦１００）、好ましくは５０以下（≦５０）、より好ましくは５０未満（＜５０）のＩＣ５０値［μｍ］。
フェロポーチンインターナリゼーションおよび分解アッセイ（ＦＡＣＳ）：１００以下（≦１００）、好ましくは５０以下（≦５０）、より好ましくは５０未満（＜５０）のＥＣ５０値［μｍ］。
フェロポーチンのユビキチン化および分解：「＋ヘプシジンに匹敵する」、「＋／−中間効果」および「＋／＋／−より強い中間効果」のウエスタンブロットで視覚的に検査された効果、好ましくは効果「＋」または「＋／＋／−」であり、最も好ましいのは効果「＋」である。
ヘプシジンインターナリゼーションアッセイ（Ｊ７７４）：１００以下（≦１００）、好ましくは５０以下（≦５０）、より好ましくは５０未満（＜５０）のＩＣ５０値。
生物物理学的フェロポーチン−ヘプシジン結合アッセイ：１００以下（≦１００）、好ましくは５０以下（≦５０）、より好ましくは５０未満（＜５０）のＩＣ５０値。
鉄流出の阻害：１００以下（≦１００）、好ましくは５０以下（≦５０）、より好ましくは５０未満（＜５０）のＩＣ５０値。
フェロポーチン阻害は、以下の実施例でより詳細に説明されるように、インビボモデルで更に決定できる。適切なインビボモデルには、例えば、血清鉄減少の測定によるナイーブマウスの低鉄血症の検査；血清鉄阻害の測定による貧血ラットにおける鉄吸収の防止の検査；血清鉄減少の測定によるβ２ミクログロブリン欠損マウスの高鉄血症の是正の検査；脾臓または肝臓の総鉄の測定によるβ２−ミクログロブリン欠損マウスにおける鉄過剰の予防の検査；β中間型サラセミアのマウスモデルにおける貧血、無効赤血球生成および鉄過剰の改善の検査が含まれる。
フェロポーチン阻害剤としての本発明の塩の活性は、特に以下の実施例に記載の方法により決定できる。
上記で更に説明したように、フェロポーチン阻害は、例えばヘプシジンによってもたらされる可能性があり、したがってヘプシジンは鉄吸収の必須調節因子であり、フェロポーチンを阻害し、したがって細胞から血液循環および鉄吸収への鉄輸送を遮断する。更に驚くべきことに、本明細書に定義される塩のいくつかがヘプシジン模倣薬またはヘプシジン作動薬として作用し、これも本発明の意味におけるフェロポーチン阻害に含まれることが見出された。
したがって、本発明で定義される塩は、細胞から血液循環への鉄輸送の阻害および腸における鉄吸収の阻害における使用、ならびにヘプシジン模倣薬またはヘプシジン作動薬としての使用にも適している。
本明細書でフェロポーチン阻害剤として定義される塩の活性のために、本発明の塩は、フェロポーチン媒介鉄輸送の阻害における使用、およびそれにより鉄濃度の増大をもたらす鉄代謝障害、鉄濃度の増大、鉄吸収の増大または鉄過剰に関連する疾患、例えば特に組織鉄過剰、無効赤血球生成不全に関連する疾患、またはヘプシジンレベルの低下に起因する疾患の予防および／もしくは治療における使用に更に特に適している。更に、本発明の化合物は、細菌ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）などの病原性微生物が利用できる鉄の量を制限することにより、前記病原性微生物によって引き起こされる感染を予防または治療する補助療法での使用に適している。
その中で、鉄濃度の増大、鉄吸収の増大、鉄過剰（例えば、組織鉄過剰）または無効赤血球生成に関連する、それに関する、それに起因する、またはそれをもたらす疾患は、サラセミア、ヘモグロビンＥ病（ＨｂＥ）、ヘモグロビンＨ病（ＨｂＨ）などのヘモグロビン症、ヘモクロマトーシス、鎌状赤血球貧血（鎌状赤血球症）などの溶血性貧血、および先天性赤血球形成異常性貧血を含む。
鎌状赤血球貧血（鎌状赤血球症）の治療における本発明の塩の活性は、例えばＹｕｌｉｎ ＺｈａｏらによってＭＥＫ１／２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ａｃｕｔｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ｄｉｓｅａｓｅ”；Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．３，ｐｐ１１７１−１１８６，２０１６に記載されているように、マウスモデルを使用することにより決定できる。前記マウスモデルは、鎌状赤血球貧血の治療における本発明の塩の活性を決定するために適切に適合させることができる。同様に、一般的に、鎌状赤血球貧血の治療における遊離塩基の形態および／または医薬的に許容される塩の形態でのフェロポーチン阻害剤としての活性を有する化合物に関する上記の未公開の国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５３０５号および同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５３０６号に記載されているような化合物の活性は、おそらく最適化された試験条件への適切な適応を伴う前記マウスモデルを使用することにより検査でき、これは当業者の日常業務の範囲内である。
鉄濃度の増大、鉄吸収の増大、鉄過剰（例えば、組織鉄過剰）に関連する、それに関する、それに起因する、またはそれにつながる疾患は、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患を更に含み、化合物は組織または細胞における鉄の沈着または増加を制限することにより、効果的であると考えられる。
本発明の塩は更に、過剰な鉄または鉄過剰によって生じるラジカル、活性酸素種（ＲＯＳ）および酸化ストレスの予防および／または治療、ならびに過剰な鉄または鉄過剰によって引き起こされる心臓、肝臓および内分泌の損傷の予防および／または治療、更には過剰な鉄または鉄過剰によって引き起こされる炎症の予防および／または治療における使用に適している。
無効赤血球形成に関連する疾患には、特に骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、骨髄異形成）および真性赤血球増加症、ならびに先天性赤血球形成異常性貧血が含まれる。
更なる疾患、障害および／または病状は、ヘプシジン（Ｈａｍｐ１）、ヘモクロマトーシスタンパク質（ＨＦＥ）、ヘモジュベリン（ＨＪＶ）およびトランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）などの全身性鉄貯蔵の感知に関与する遺伝子の突然変異によって引き起こされる鉄過剰を含み、これには例えば、特に、ＨＦＥおよびＨＪＶ遺伝子突然変異に関連する疾患、慢性溶血関連疾患、鎌状赤血球症、赤血球膜障害、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症（Ｇ６ＰＤ欠損症）、赤血球性ポルフィリン症、フリードリヒ運動失調症、ならびに輸血鉄過剰、鉄中毒、肺ヘモジデローシス、骨減少症、インスリン抵抗性、アフリカ鉄過剰などの鉄過剰のサブグループ、ハッラーボルダンスパッツ病、高フェリチン血症、セルロプラスミン欠乏症、新生児ヘモクロマトーシス、およびαサラセミア、βサラセミアおよびδサラセミアを含むサラセミア、中間型サラセミア、鎌状赤血球症および骨髄異形成症候群を含む赤血球障害が含まれる。
鉄濃度の上昇に関連する更なる疾患および／または障害および／または病状には、運動失調、フリードリヒ運動失調、加齢黄斑変性、加齢白内障、加齢網膜疾患、ならびにパントテン酸キナーゼ関連神経変性、下肢静止不能症候群およびハンチントン病などの神経変性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の塩は更に、ヘプシジンの欠如によって引き起こされる疾患の予防および治療における使用に適している可能性がある。
それを考慮して、本発明の更なる目的は、特に上記に定義された徴候、状態、障害または疾患のいずれかにおける予防および治療のための医薬など、上記の塩の１つ以上を含む医薬に関する。
本発明の更なる目的は、上記に定義された本発明による塩の１つ以上、ならびに場合により１つ以上の薬理学的に許容される担体および／または補助物質および／または溶媒を含む医薬組成物および医薬に関する。本発明の更なる目的は、上記に定義された本発明による塩の１つ以上、ならびに場合により１つ以上の更なる医薬的に有効な化合物を含む医薬組成物および医薬に関する。前記医薬組成物は、例えば、最大９９重量％または最大９０重量％または最大８０重量％または最大７０重量％の本発明の塩を含み、残りがそれぞれ薬理学的に許容される担体および／または助剤および／または溶媒および／または場合により更なる医薬活性化合物である。
その中で、医薬的に許容される担体、補助物質または溶媒は、一般的な医薬担体、補助物質または溶媒であり、医薬目的、特に固体医薬製剤に通常使用される場合には、様々な有機または無機担体および／または補助材料を含む。例としては、サッカロース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、グルコース、セルロース、タルカム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなどの賦形剤；セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、サッカロース、デンプンなどの結合剤；デンプン、加水分解デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースのカルシウム塩、ヒドロキシプロピルデンプン、ナトリウムグリコールデンプン、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウムなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルカム、ラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤；クエン酸、メントール、グリシン、オレンジパウダーなどの香味料；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、パラベン（例えば、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンなど）などの保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、および例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）などのｔｉｔｒｉｐｌｅｘシリーズのマルチカルボン酸などの安定剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウムなどの懸濁化剤；分散剤；水、有機溶剤などの希釈剤；蜜蝋、ココアバターなどのワックス、脂肪および油；ポリエチレングリコール；白色ワセリンなどが挙げられる。
溶液、懸濁液およびゲルなどの液体医薬製剤は、通常、水および／または医薬的に許容される有機溶媒などの液体担体を含む。更に、そのような液体製剤は、ｐＨ調整剤、乳化剤もしくは分散剤、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、ゼラチン化剤（例えばメチルセルロース）、染料および／または香味剤、例えば上記に定義されたものも含むことができる。組成物は等張性であり得る、すなわち、それらは血液と同じ浸透圧を有し得る。組成物の等張性は、塩化ナトリウムおよび他の医薬的に許容される薬剤、例えばデキストロース、マルトース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールおよび他の無機または有機可溶性物質を使用することにより調整できる。液体組成物の粘度は、メチルセルロースなどの医薬的に許容される増粘剤によって調整することができる。他の適切な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが含まれる。増粘剤の好ましい濃度は、選択した薬剤によって異なる。
液体組成物の貯蔵寿命を延ばすために、医薬的に許容される保存剤を使用できる。例えば、パラベン、チメロサール、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムを含む複数の保存剤を使用することもできるが、ベンジルアルコールが適切である。
上記の医薬組成物は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、膣内、頬内、経皮、皮下、粘膜皮膚、経口、直腸、経皮、局所、皮内、胃内、または皮内投与に適しており、例えば、丸薬、錠剤、腸溶性錠剤、フィルム錠剤、層錠、経口、皮下または皮膚投与用の徐放性製剤（特に石膏として）、デポー製剤、糖衣錠、坐薬、ゲル、軟膏、シロップ、顆粒、坐薬、乳剤、分散液、マイクロカプセル、微小製剤、ナノ製剤、リポソーム製剤、カプセル、腸溶性カプセル、粉末、吸入粉末、微結晶製剤、吸入スプレー、エピパスティック、ドロップ、点鼻薬、鼻スプレー、エアロゾル、アンプル、溶液、ジュース、懸濁液、注入液または注射液などの形態で提供される。
本発明の更なる目的は、上記に定義された塩の１つ以上と、少なくとも１つの更なる医薬活性化合物とを含む医薬または組み合わせ製剤に関し、少なくとも１つの更なる医薬活性化合物は、特に鉄過剰および関連症状の予防および治療のための化合物、好ましくは鉄キレート化合物、または特にサラセミア、ヘモクロマトーシス、鎌状赤血球症、神経変性疾患（アルツハイマー病およびパーキンソン病など）および関連する症状の予防および治療のための医薬活性化合物など、上記の状態、障害または疾患のいずれかの予防および治療のための化合物などを含む。
本発明の更なる目的は、１つまたは２つの他の有効成分（薬物）との併用療法（連続使用のための固定用量または自由用量の組み合わせ）における、上記で定義された塩それ自体の使用に関する。そのような併用療法は、本発明の塩と少なくとも１つの追加の医薬活性化合物（薬物）との共投与を含む。固定用量併用療法における併用療法は、本発明の塩と、固定用量製剤中の少なくとも１つの追加の医薬活性化合物との共投与を含む。自由用量併用療法における併用療法は、個々の化合物の同時投与または一定期間にわたって分布している個々の化合物の連続使用のいずれかによる、それぞれの化合物の自由用量における、本発明の塩と少なくとも１つの追加の医薬活性化合物との共投与を含む。少なくとも１つの追加の医薬活性化合物（薬物）は、特に鉄過剰を減少させる薬物（例えば、Ｔｍｐｒｓｓ６−ＡＳＯ）または鉄キレート剤、特にクルクミン、ＳＳＰ−００４１８４、デフェリトリン、デフェラシロクス、デフェロキサミンおよび／もしくはデフェリプロン、またはｎ−アセチルシステインなどの抗酸化剤、ＧＬＰ−１受容体作動薬などの抗糖尿病薬、バンコマイシン（Ｖａｎ）またはトブラマイシンなどの抗生物質、マラリア治療薬、抗がん剤、抗真菌薬、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患治療薬疾患（例えば、レボドパなどのドーパミン作動薬）、インターフェロン−αまたはリバビリンなどの抗ウイルス薬、または免疫抑制剤（シクロスポリンＡまたはシクロスポリンＡ誘導体）、鉄サプリメント、ビタミンサプリメント、赤血球産生刺激剤（例えば、エリスロポエチン、Ｅｐｏ）、抗炎症性生物薬、抗血栓薬、スタチン、昇圧剤および変力性化合物などを含む。
本発明の更なる目的は、特に本出願に記載されているサラセミア、鎌状赤血球症、ヘモクロマトーシスおよびその他の障害などの鉄過剰状態などの、ヘプシジンまたは鉄代謝障害の欠如によって引き起こされる疾患の予防および／または治療のための上記組み合わせの使用に関する。
本発明の更なる目的は、輸血と組み合わせた、本明細書に定義される塩それ自体または上記併用療法の使用に関する。
本発明の塩と他の治療薬（第２の薬剤）との潜在的な相乗効果または相加効果は、中間型サラセミア（Ｈｂｂｔｈ３／＋またはＨｂｂｔｈ１／ｔｈ１、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または重症型サラセミア（Ｃ５７−ＦＬＣｔｈ３／ｔｈ３のマウスモデルにおける併用試験によって評価することができ、それにより、貧血、造血、鉄過剰、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生、脾腫およびサラセミアモデルの他のバイオマーカーに対する効果について、本発明の塩自体（すなわち塩のみ）を、または追加の化合物と組み合わせた本発明の塩を評価する。前の段落ですでにリストされた併用療法に加えて、本発明による併用療法はまた、本発明の塩を以下の第２の薬剤の１つと組み合わせて含む：
・改変アクチビン受容体タイプＩＩＡまたはＩＩＢ融合タンパク質（Ｓｕｒａｇａｎｉ ＲＮ，ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩＢ ｌｉｇａｎｄ ｔｒａｐ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．”Ｂｌｏｏｄ．２０１４ Ｊｕｎ １９；１２３（２５）：３８６４−７２およびＤｕｓｓｉｏｔ Ｍ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎ ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩＡ ｌｉｇａｎｄ ｔｒａｐ ｃｏｒｒｅｃｔｓ ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．”Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１４ Ａｐｒ；２０（４）：３９８−４０７などに記載されているものなど）であって、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーメンバーに対するリガンドトラップとして作用するもの、例えばＲＡＰ−０１１もしくはＲＡＰ−５３６（ＡＣＥ−０１１ ＳｏｔａｔｅｒｃｅｐｔまたはＡＣＥ−５３６ Ｌｕｓｐａｔｅｒｃｅｐｔのマウス類似体（国際公開第２０１００１９２６１号に記載、または米国特許第８３６１９５７号にて特許請求）それぞれ、Ａｃｃｅｌｅｒｏｎ／Ｃｅｌｇｅｎｅ）、またはＴＧＦβスーパーファミリーメンバーの他の拮抗薬（抗体、抗体の断片、非抗体足場薬またはアクチビン受容体リガンドトラップを産生する細胞）。
・ルクスチリニブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ−米国特許第７，５９８，２５７号および同第８，４１５，３６２号にて特許請求）またはフェドラチニブ（Ｓａｎｏｆｉ）を含むが、これらに限定されないＪＡＫ１／２またはＪＡＫ２阻害剤（Ｃａｓｕ Ｃ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＪＡＫ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ａｎｄ ｍａｊｏｒ．”；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２０１７に記載）。
・Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ（ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国；米国特許第６，５５２，０６５号および同第６，８３３，３８４号にて特許請求）などのｐａｎ−ＨＤＡＣ阻害剤またはＨＤＡＣ３阻害剤ＲＧＦＰ９６６（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｐａｓｒｉｃｈａ ＳＲ ｅｔ ａｌ．“Ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＨＤＡＣ３．”Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７ Ｓｅｐ １；８（１）：４０３に記載されているものなど）。
・マウスＴｍｐｒｓｓ６をターゲットとする、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）−製剤化Ｔｍｐｒｓｓ６ ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などのマトリプターゼ−２（Ｔｍｐｒｓｓ６とも呼ばれる）の拮抗薬（Ｇｕｏ Ｓ ｅｔ ａｌ“Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ＴＭＰＲＳＳ６ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ ａｎｄ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎ ｍｉｃｅ．” Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３ Ａｐｒ；１２３（４）：１５３１−４１またはＳｃｈｍｉｄｔ ＰＪ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎ ＲＮＡｉ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｍｐｒｓｓ６ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｉｎ Ｈｆｅ（−／−） ｍｉｃｅ ａｎｄ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ａｎｅｍｉａ ａｎｄ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ．”Ｂｌｏｏｄ．２０１３ Ｆｅｂ １４；１２１（７）：１２００−８に記載）。
・外因性アポトランスフェリン（Ｌｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃ ｍｉｃｅ．“Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１０ Ｆｅｂ；１６（２）：１７７−８２に記載）。
・エピチオスタノール、プロゲステロンおよびミフェプリストンとしてのヘプシジン誘導ステロイド（ＨＩＳ）、またはプロゲステロン受容体膜成分−１（ＰＧＲＭＣ１）の拮抗薬（Ｒｅｆ．７）。
・抗体やリガンドトラップなどのエリスロフェロン拮抗薬
・組換えエリスロポエチン（ｅｐｏ）。本発明による治療薬として使用可能なエリスロポエチンは、細胞培養における組換えＤＮＡ技術により産生され、エポゲン／プロクリット（エポエチンα）およびアラネスプ（ダルベポエチンα）またはミルセラ（エポエチンβおよびメトキシポリエチレングリコール）が含まれる。
・ビトペルチン（Ｒｏｃｈｅ ＡＧ）などのグリシントランスポーター１（ＧｌｙＴ１）阻害剤。
本発明の塩は、１０、３０および６０ｍｇ／ｋｇで１日２回単一薬剤として、または上記の化合物の１つ（第２の薬剤）と組み合わせて経口投与することができる。より具体的には、第２の薬剤は、以下のように、単一の治療として投与されるか、または本発明の塩と同時投与される：
・ＲＡＰ−０１１またはＲＡＰ−５３６は、週に２回、１、１０、または３０ｍｇ／ｋｇで最大８週間皮下注射できる。
・ＪＡＫ１／２阻害剤は、本発明の塩の非存在下または存在下で１日２回経口投与することができる。
・ルキソチリニブ（６０または１８０ｍｇ／ｋｇ）またはフェドラチニブ（４０または１２０ｍｇ／ｋｇ）は、本発明の塩の非存在下または存在下で、２週間１日１回経口投与することができる。
・パノビノスタットまたはＲＧＦＰ９６６は、本発明の塩の非存在下または存在下で１日１回１０または２０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
・アポトランスフェリンは、１００または３００ｍｇ／ｋｇで８週間毎日腹腔内注射される。
・ミフェプリストン（３０または１００ｍｇ／ｋｇ）は、２週間毎日腹腔内注射できる
・エリスロフェロンに特異的な抗体またはリガンドトラップは、皮下注射により週２回投与できる。
・エリスロポエチンは、２週間、毎日２００ＩＵで腹腔内に注入できる。
・ビトペルチン（Ｒｏｃｈｅ ＡＧ）などのグリシントランスポーター１（ＧｌｙＴ１）阻害剤も、適切な経路で投与できる。
本発明による塩、医薬および／または組み合わせ製剤は、経口投与、非経口投与、および静脈内投与することができる。
この目的のために、本発明の塩は、好ましくは、丸剤、腸溶コーティング錠剤、フィルム錠剤および層錠などの錠剤、経口投与用徐放製剤、デポー製剤、糖衣錠、顆粒、乳剤、分散液、マイクロカプセル、マイクロ製剤、ナノ製剤、リポソーム製剤、カプセル、例えば腸溶性カプセル、粉末、微結晶製剤、エピパスティック、ドロップ、アンプル、溶液、懸濁液、注入溶液もしくは注射溶液の形態、または吸入に適した製剤の形態の医薬または医薬組成物で提供される。
本発明の好ましい実施形態において、塩は、上記に定義された錠剤またはカプセルの形態で投与される。これらは、例えば、耐酸性形態として、またはｐＨ依存性コーティングとともに存在し得る。
活性物質としての本発明の塩は、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の単位用量で、例えば１日１〜４回投与することができる。ただし、年齢、体重、患者の状態、疾患の重症度または投与の種類に応じて、用量を増減することができる。
したがって、本発明の更なる目的は、特に経口または非経口投与用の、特に上記に定義された徴候、状態、障害または疾患の予防および治療のための医薬を調製するための、上記に定義された塩、医薬、組成物および組み合わせ製剤に関する。
本発明の更なる目的は、特に、鉄濃度の増大、特に鉄過剰に関連するまたはそれをもたらす鉄代謝障害、鉄濃度または鉄過剰の増加に関連するまたは起因する疾患、鉄濃度の増大に関連する、または鉄濃度の増大につながる鉄貯蔵疾患、および無効赤血球生成に関連する疾患の予防および／または治療のための、上記で定義された予防および治療の方法であって、それを必要とする患者（ヒトまたは動物）に塩、医薬、組成物または上記に定義された組み合わせ調整物を投与することを含む方法に関する。
その中で、鉄濃度の増大または鉄過剰に関連する、それに関する、それによって引き起こされる、またはそれにつながる疾患は上記に定義されたとおりである。
本発明の更なる目的は、特に上記に定義された任意の徴候、状態、障害または疾患の予防および治療のための医薬を調製するための上記の塩の使用に関する。
本発明の式（Ｉ）。 適用されたＤＶＳ測定プログラムの視覚化例。 計算されたｐＫａ値を示す遊離塩基の形態の例示化合物Ｎｏ．１２７の構造。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１の１Ｈ ＮＭＲ。 ＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１の５０〜３５００ｃｍ−１のＦＴ−ラマンスペクトルの概要。 ＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１の５０〜１８００ｃｍ−１のＦＴ−ラマンスペクトルのフィンガープリント領域。 ＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１のＰＸＲＤパターン。 ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ１、ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ１（２）、ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ２、およびＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ３のＰＸＲＤパターンの比較。 ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ２のＴＧ−ＦＴＩＲサーモグラム。 ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ３のＤＳＣサーモグラム。 ５０〜３５００ｃｍ−１のＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ３とＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１のＦＴ−ラマンスペクトルの比較。 ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ３とＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１の５０〜１８００ｃｍ−１のＦＴ−ラマンスペクトルの比較。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ２の１Ｈ ＮＭＲ。 ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ３のサンプル質量（％）および相対湿度（％）対時間のプロットであり、サンプル質量（左ｙ軸）および測定プログラムにより設定されるｒ．ｈ．（右ｙ軸）を示す。 ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ３の水蒸気収着等温線プロット。 ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ１、ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ２、およびＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ３のＰＸＲＤパターンの比較。 ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ１のＴＧ−ＦＴＩＲサーモグラム。 ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ３のＤＳＣサーモグラム。 ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ３とＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１の５０〜３５００ｃｍ−１のＦＴ−ラマンスペクトルの比較。 ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ３とＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１の５０〜１８００ｃｍ−１のＦＴ−ラマンスペクトルの比較。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ１の１Ｈ ＮＭＲ。 ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ３のサンプル質量（％）および相対湿度（％）対時間のプロットであり、サンプル質量（左ｙ軸）および測定プログラムにより設定されるｒ．ｈ．（右ｙ軸）を示す。 ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ３の水蒸気収着等温線プロット。 ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ１とＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ２のＰＸＲＤパターンの比較。 ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ２のＴＧ−ＦＴＩＲサーモグラム。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ２の１Ｈ ＮＭＲ。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ２の３１Ｐ ＮＭＲ。 ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ２、ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ５、ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ６、ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ７、およびＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８のＰＸＲＤパターンの比較。 ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８とＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１の５０〜３５００ｃｍ−１のＦＴ−ラマンスペクトルの比較。 ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８とＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１の５０〜１８００ｃｍ−１のＦＴ−ラマンスペクトルの比較 ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８のＴＧ−ＦＴＩＲサーモグラム。 ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ６のＤＳＣサーモグラム。 ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８のＤＳＣサーモグラム。 ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８のサンプル質量（％）および相対湿度（％）対時間のプロットであり、サンプル質量（左ｙ軸）および測定プログラムにより設定されるｒ．ｈ．（右ｙ軸）を示す。 ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８の水蒸気収着等温線プロット。 ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ１とＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ３のＰＸＲＤパターンの比較。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ３の１Ｈ ＮＭＲ。 ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ４、ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ５、ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ６のＰＸＲＤパターンの比較。 ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ４のＴＧ−ＦＴＩＲサーモグラム。 ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ６のサンプル質量（％）および相対湿度（％）対時間のプロットであり、サンプル質量（左ｙ軸）および測定プログラムにより設定されるｒ．ｈ．（右ｙ軸）を示す。 ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ６の水蒸気収着等温線プロット。 ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ６のＤＳＣサーモグラム。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ４の１Ｈ ＮＭＲ。 ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ６とＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１の５０〜３５００ｃｍ−１のＦＴ−ラマンスペクトルの比較。 ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ６とＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１の５０〜１８００ｃｍ−１のＦＴ−ラマンスペクトルの比較。 ＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１の拡大ＨＰＬＣトレース。 ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ３の拡大ＨＰＬＣトレース。 ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ３の拡大ＨＰＬＣトレース。 ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８の拡大ＨＰＬＣトレース。 ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ６の拡大ＨＰＬＣトレース。 ＳＰ２３６−ＢＮＺ−Ｐ２のＰＸＲＤパターン。 ＳＰ２３６−ＢＮＺ−Ｐ２のＴＧ−ＦＴＩＲサーモグラム。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＢＮＺ−Ｐ２の１Ｈ ＮＭＲ。 ＳＰ２３６−ＦＵＭ−Ｐ１とＳＰ２３６−ＦＵＭ−Ｐ２のＰＸＲＤパターンの比較。 ＳＰ２３６−ＦＵＭ−Ｐ２のＴＧ−ＦＴＩＲサーモグラム。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＦＵＭ−Ｐ２の１Ｈ ＮＭＲ。 ＳＰ２３６−ＭＬＡ−Ｐ１とＳＰ２３６−ＭＬＡ−Ｐ２のＰＸＲＤパターンの比較。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＭＬＡ−Ｐ１の１Ｈ ＮＭＲ。 ＳＰ２３６−ＳＵＣ−Ｐ２のＰＸＲＤパターン。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＳＵＣ−Ｐ２の１Ｈ ＮＭＲ。 ＳＰ２３６−ＳＵＣ−Ｐ２のＴＧ−ＦＴＩＲサーモグラム。 ＳＰ２３６−ＬＴＡＲ−Ｐ１とＳＰ２３６−ＬＴＡＲ−Ｐ２のＰＸＲＤパターンの比較。 ＳＰ２３６−ＬＴＡＲ−Ｐ１のＴＧ−ＦＴＩＲサーモグラム。 ＳＰ２３６−ＬＴＡＲ−Ｐ２のＴＧ−ＦＴＩＲサーモグラム。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＬＴＡＲ−Ｐ１の１Ｈ ＮＭＲ。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＬＴＡＲ−Ｐ２の１Ｈ ＮＭＲ。 ＳＰ２３６−ＴＯＳ−Ｐ１とＳＰ２３６−ＴＯＳ−Ｐ２のＰＸＲＤパターンの比較。 ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＳＰ２３６−ＴＯＳ−Ｐ２の１Ｈ ＮＭＲ。 調製例７．２による例示化合物Ｎｏ．１２７のＨＣｌ単塩のＨＰＬＣ分析。 調製例７．２による例示化合物Ｎｏ．１２７のＨＣｌ単塩のＤＳＣサーモグラム。 ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ１の多形体ＰＭ１〜ＰＭ６のＰＸＲＤパターンの概要 （下から上へ：ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ２（ＰＭ１）、Ｐ５（ＰＭ２）、Ｐ６（ＰＭ３）、Ｐ８（ＰＭ４）、Ｐ１０（ＰＭ５）およびＰ１１（ＰＭ６））。 多形体ＰＭ１（ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ２）のＰＸＲＤパターン。 多形体ＰＭ１（ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ２）の１Ｈ ＮＭＲ。 ＰＭ１（ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ２）のＤＳＣサーモグラム。 ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ１のＰＭ１のＤＶＳ挙動。 ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１の多形体ＰＭ１〜ＰＭ１１のＰＸＲＤパターンの概要 （下から上へＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ４（ＰＭ１）、Ｐ４−ＤＲＹ（ＰＭ９）、Ｐ５（ＰＭ２）、Ｐ８（ＰＭ３）、Ｐ１０（ＰＭ４）、Ｐ１１（ＰＭ５）、Ｐ１３（ＰＭ６）、Ｐ１３−ＤＲＹ（ ＰＭ１０）、Ｐ１５（ＰＭ７）、Ｐ１５−ＤＲＹ（ＰＭ１１）およびＰ１９（ＰＭ８））。 多形体ＰＭ２（ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ５）のＰＸＲＤパターン。 多形体ＰＭ２（ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ５）の１Ｈ ＮＭＲ。 ＰＭ２（ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ５）のＴＧ−ＦＴＩＲサーモグラム。 ＰＭ２（ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１２）のＴＧ−ＦＴＩＲサーモグラム。 多形体ＰＭ２サンプルＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ２、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ９、Ｐ１２のＰＸＲＤパターンの概要（下から上：ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ２、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ９、およびＰ１２）。 ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ２（ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１２）のＤＶＳ挙動。 抗Ｆｐｎ抗体ＭＴＰ１による免疫沈降物の免疫ブロット。 ヘプシジン（ＩＣ５０：０．０８６μＭ）および例示化合物Ｎｏ．１２７（ＩＣ５０：０．０８０μＭ）の鉄流出阻害。 ヘプシジンおよび例示化合物９４（例示化合物Ｎｏ．９４）によるフェロポーチン阻害剤により誘導される血清鉄の減少。 合成ヘプシジン（５ｍｇ／ｋｇ）を指定時間内に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスでの血清鉄の動態。 指示量のヘプシジン（ｉ．ｐ．）または例示化合物９４（例示化合物Ｎｏ．９４）のいずれか（ｐ．ｏ．）で３時間処理したナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスでの血清鉄濃度。 フェロポーチン阻害剤である例示化合物Ｎｏ．４０／メチルセルロース（Ａ．）および例示化合物Ｎｏ．９４／クレモホールＥＬ（Ｂ．）での３時間の処理によるｂ２ｍ−／−マウスでの血清鉄濃度上昇の完全な是正。
［実施例］
以下の実施例により本発明をより詳細に説明する。実施例は単なる説明であり、当業者は、特定の実施例を、特に図１に示す式（Ｉ）の化合物で形成される本明細書に記載の更なる塩などの更なる特許請求の塩まで拡張することができる。
以下では、サンプルはＳＰ２３６−ＸＹＺ−Ｐｗの形式の識別コードで示される。ＸＹＺは塩／共結晶形成剤（すなわち酸の種類）を指定し、Ｐｗは特定のサンプル／実験（ｗ＝１、２、…ｎ）を示す。
出発化合物として、例示化合物Ｎｏ．１２７の遊離塩基を使用した。
Ｉ．例示化合物Ｎｏ．１２７の様々な塩の調製
１．略語
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＳＣ 示差走査熱量測定
ＤＶＳ 動的蒸気収着
ＥｔｏＡｃ 酢酸エチル
ＥｔＯＨ エタノール
ＦＴラマン フーリエ変換ラマン分光法
１Ｈ−ＮＭＲ 陽子核磁気共鳴
ｉ−ＰｒＯＨ イソプロパノール
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＭｅＯＨ メタノール
ｎ−ＢｕＯＨ １−ブタノール
ｒ．ｈ．／ＲＨ 相対湿度
ｒ．ｔ．／ＲＴ 室温（２２〜２５℃）
Ｔｇ ガラス転移温度
ＴＧ−ＦＴＩＲ フーリエ変換赤外分光法と組み合わせた熱重量分析
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＰＸＲＤ 粉末Ｘ線回折
２．一般的な実験の詳細
ＤＳＣ：示差走査熱量測定は、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｑ２０００装置で行った（閉じたまたは開いた金製またはアルミニウム製のサンプルパン、ピンホールありまたはなし）。一般に、加熱速度は１０Ｋ／ｍｉｎであった。ほとんどの場合、融点はピークの開始と理解される。
動的蒸気吸着：ＤＶＳ測定は、ＰｒｏＵｍｉｄ（旧「Ｐｒｏｊｅｋｔ Ｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ」）のＳＰＳ１１−１００ｎ「ＳｏｒｐｔｉｏｎｓＰｒｕｆｓｙｓｔｅｍ」、Ａｕｇｕｓｔ−Ｎａｇｅｌ−Ｓｔｒ．２３、８９０７９ Ｕｌｍ（ドイツ）、またはＳｕｒｆａｃｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ＳｙｓｔｅｍｓのＤＶＳ−１機器を使用して実行した。約５〜２０ｍｇのサンプルをアルミニウム製サンプルパンに入れた。１時間あたり５％の湿度変化率を使用した。適用された測定プログラムの例を図２に示す。有効な含水量を示すプレゼンテーションは、ＴＧＡで観測された質量損失に基づいて調整する。場合によっては、ダブルサイクルを実行した。
多形体評価試験では、サンプルを微量天秤の上のアルミニウムホルダーに置き、５０％ＲＨで平衡化させてから、事前に定義された湿度プログラムを開始した：
（１）相対湿度５０％で２時間
（２）５０→０％ＲＨ（５％／ｈ）；０％ＲＨで５時間
（３）０→９５％ＲＨ（５％／ｈ）；９５％ＲＨで５時間
（４）９５→５０％ＲＨ（５％／ｈ）；５０％ＲＨで２時間。
吸湿性の分類 吸湿性は、初期質量に対する相対湿度８５％での質量増加に基づいて、次のように分類された：潮解性（液体を形成するために十分な水を吸着）、非常に吸湿性（１５％以上の質量増加）、吸湿性（質量増加＜１５％、ただし２％以上）、わずかに吸湿性（質量増加＜２％、ただし０．２％以上）、または非吸湿性（質量増加＜０．２％）。
元素分析：元素分析は、Ｅｌｅｍｅｎｔａｒが製造した「ｖａｒｉｏ ＥＬキューブ」アナライザーで実行した。アナライザーは、燃焼を使用して元素をＣＯ２、Ｈ２Ｏ、Ｎ２などの単純ガスに変換する。生成ガスを、選択トラップカラムによって分離し、熱伝導率の関数として測定する。酸素は熱分解により一酸化炭素に変換され、その後、熱伝導率の関数として測定することもできる。
１Ｈ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ３００分光計；３００．１３ＭＨｚのプロトン周波数；３０°励起パルス；１秒のリサイクル遅延；１６スキャンの蓄積；溶媒としての重水素化ＤＭＳＯ；参照に使用される溶媒ピーク；ＴＭＳスケールで報告された化学シフト。
ＨＰＬＣ：Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎバージョン６．８ソフトウェアにより動作するＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙデガッサーを備えたＡｇｉｌｅｎｔシリーズ１１００ ＨＰＬＣシステム。
カールフィッシャー滴定：カールフィッシャー滴定は、例えばＩＳＯ ７６０−１９７８：水の測定−カールフィッシャー法（一般法）などの周知の方法に準拠して実施することができる。
ｐＫａ測定：シリウスＴ３滴定装置。水溶性の低いサンプルに共溶媒を使用して、光度分析または電位差分析を適用した。
粉末Ｘ線回折（反射）：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ Ａｄｖａｎｃｅ粉末Ｘ線回折計による測定は、反射（Ｂｒａｇｇ−Ｂｒｅｎｔａｎｏ）ジオメトリで実行した。２θ値は通常、±０．１〜０．２°の誤差内で正確である。通常、サンプルは、わずかな圧力を加えて平坦な表面を得る以外の特別な処理なしで準備した。深さ０．５ｍｍの多形体スクリーニング用のシリコン単結晶サンプルホルダー。通常、サンプルはカバーなしで測定された。管電圧は４０ｋＶで、電流は４０ｍＡであった。ＰＸＲＤ回折計には、ＬｙｎｘＥｙｅ検出器が装備されている。わずかな可変発散を３°のウィンドウで使用した。工程サイズは０．０２°２θで、工程時間は３７秒であった。サンプルは、測定中に０．５ｒｐｓで回転した。サンプルの準備と測定は、大気雰囲気で行った。
粉末Ｘ線回折（透過）：Ｍｙｔｈｅｎ１Ｋ検出器を備えたＳｔｏｅ ＳｔａｄｉＰ；Ｃｕ−Ｋα１放射線；標準測定条件：伝送；４０ｋＶおよび４０ｍＡの管出力；湾曲したＧｅモノクロメーター；０．０２°２θ工程サイズ；１２秒または４８秒工程時間；１．５−５０．５°２θスキャン範囲；検出器モード：工程スキャン；１°２θ検出器工程；標準的なサンプルの調製：１０〜２０ｍｇのサンプルを２つのアセテート箔の間に配置した；サンプルホルダー：ストー透過サンプルホルダー；サンプルは測定中に回転させた。すべてのサンプルの調製と測定は、大気雰囲気で行った。
多形体評価試験では、各サンプル（２５〜４０ｍｇの粉末）を、金属ワッシャー（厚さ０．４ｍｍ、内径１２ｍｍ）で間隔を空けた２つの酢酸セルロース箔の間に配置した。このサンドイッチ要素を、非常に強力な物質用の特別なサンプルホルダー（ＳＣｅｌｌ）に移し、再びアセテートホイルで密封した。サンプルの調製には特別な処理は使用しなかった。すべての測定に周囲空気雰囲気を使用し、測定中に各サンプルを回転させた。
ラマン分光法：ＦＴラマンスペクトルは、１０６４ｎｍで動作する近赤外Ｎｄ：ＹＡＧレーザーと液体窒素冷却ゲルマニウム検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ ＭｕｌｔｉＲＡＭ ＦＴ−ラマンシステムで記録された。２ｃｍ−１の解像度で６４スキャンが３５００〜−５０ｃｍ−１の範囲で蓄積された。ただし、フィルターのカットオフ効果により、１００ｃｍ−１を超えるデータのみが評価される。通常、公称レーザー出力は１００または３００ｍＷである。
溶解度：約１０ｍｇの化合物に溶媒を徐々に加えて、おおよその溶解度を決定した。合計で少なくとも１０ｍＬの溶媒を加えても物質が溶解しなかった場合、溶解度は＜１ｍｇ／ｍＬと示す。この方法に固有の実験誤差に起因して、溶解度の値は大まかな推定値とみなされることを意図しており、結晶化実験の設計にのみ使用される。
ＴＧ−ＦＴＩＲ：熱重量測定は、Ｂｒｕｋｅｒ ＦＴＩＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ ２２（ピンホールを有するサンプルパン、Ｎ２雰囲気、加熱速度１０Ｋ／分）に接続したＮｅｔｚｓｃｈ Ｔｈｅｒｍｏ−Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ ＴＧ ２０９を使用して実行した。
およその溶解度：約１０ｍｇの化合物に溶媒を徐々に加えて、およその溶解度を決定した。合計で少なくとも１０ｍＬの溶媒を加えても物質が溶解しなかった場合、溶解度は＜１ｍｇ／ｍＬと示した。この方法に固有の実験誤差に起因して、溶解度の値は大まかな推定値とみなされ、結晶化実験の設計にのみ使用された。
３．出発材料の特性決定
出発化合物（遊離塩基／ＦＢ）：
例示化合物Ｎｏ．１２７（ＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１）
出発化合物のｐＫａ計算：
理論的なｐＫａ値は、ＡＣＤ／ｐＫａ ＤＢ Ｖｅｒｓを使用して計算した。１０．００、リリース１０．００ソフトウェア。得られた値を、図３．１に出発化合物（遊離塩基）の構造とともに示す。
出発化合物の １ Ｈ ＮＭＲ分光法：
ＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１のＮＭＲスペクトルは、ＤＭＳＯ−ｄ６において図３．２に示すように記録した。スペクトルには、約δ１２ｐｐｍの化学シフトで少なくとも１つの広範なシグナルが含まれているが、スペクトルは提供された化学構造と一致するようである。残留エタノールとジクロロメタンもＮＭＲスペクトルで観察される。
ラマン分光法：
ＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１のＦＴ−ラマンスペクトルは、図３．３に示すように５０〜３５００ｃｍ−１の領域で記録し、図３．４に示すように５０〜１８００ｃｍ−１のフィンガープリント領域を拡大表示している。
粉末Ｘ線回折：
ＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１のＰＸＲＤパターンは、図４に示すように透過モードで記録され、サンプル（遊離塩基の形）が本質的に非晶質であることを確認した。
出発化合物のおおよその溶解度：
ＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１のおおよその溶解度は、塩／共結晶実験の指針として、多くの異なる溶媒および溶媒混合物において決定した。結果は次のとおりである。
Figure 2020516620
４．結晶化実験
結晶化条件：
すべての実験で、１：１（ｍｏｌ：ｍｏｌ）の遊離塩基：酸比を使用した。ＰＯ４とＳＯ４の場合、１０：１の遊離塩基：酸比で２つの実験も行った。実験の多くは、ＰＸＲＤパターンで示されるような結晶製品をもたらした。これについては、以下で詳細に説明する。非晶質生成物のみをもたらしたこれらの実験は、更に詳細には示されていない（すなわち、ＬＬＡＣおよびＭＥＳ）。
選択された酸および結晶化溶媒：
Figure 2020516620
以下に、上記の条件による選択された塩の調製および特性決定を更に詳細に説明する：
５．例示化合物Ｎｏ．１２７の選択塩
５．１例示化合物Ｎｏ．１２７のクエン酸塩
エタノール中のクエン酸を使用した結晶化実験では、最初に、断続的な超音波処理で３０℃に加熱すると結晶化する非晶質材料が生じた（ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ１（２））。ＰＸＲＤパターンは、メタノールでの実験から得られた結晶材料と一致する（図５．１、ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ２）。この結晶形の調製は、実験ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ３で約６００ｍｇスケールで再現することもできた。サンプル−Ｐ２は約０．９％の水とメタノールを含み、約１５０℃を失う（図５．２）。２００℃に加熱すると、更に８．１％の水が失われる。サンプルＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ３のＤＳＣは、１５３℃の開始温度で塩が融解することを示している（図５．３）。ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ３のＦＴ−ラマンスペクトルを、図５．４と図５．５の遊離塩基のスペクトルと比較すると、２つのスペクトル間に明確な違いが見られる。ＤＭＳＯ−ｄ６において記録されたＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ２の１Ｈ ＮＭＲスペクトルには、約δ２．６ｐｐｍの追加のシグナルがあり、これは３．８に積分され、１：１の遊離塩基：酸塩を示唆する（図５．６）。この比が正しいと仮定すると、ＴＧ−ＦＴＩＲによって観察された８．１％の水は、１：１塩の三水和物を示唆している。興味深いことに、ＤＶＳは測定の開始から相対的なサンプル重量の減少を示し、サンプルは最終的に０％の相対湿度で無水になる（図５．７および図５．８）。相対湿度が増加するとすぐに水を吸着し始め、相対湿度０％と９５％での相対サンプル質量の差は約８％であり、ＴＧ−ＦＴＩＲの結果によく対応している。元素分析の結果も１：１の塩とよく一致するが、カールフィッシャー滴定による含水量の測定は無水サンプルを示唆している。
Figure 2020516620
５．２例示化合物Ｎｏ．１２７のマレイン酸塩
２−プロパノールおよびＴＨＦ中のマレイン酸を使用したスクリーニング結晶化実験により、ＰＸＲＤパターンが互いに非常によく一致する結晶性固体が得られた（図５．９）。２−プロパノールで約５００ｍｇスケールでこの合成をスケールアップすると、サンプルＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ３と同じ結晶形が得られた。ＴＧ−ＦＴＩＲは、サンプルが本質的に無水であることを示すが、約１７０℃から始まる大量の質量損失と分解を受ける（図５．１０）。密封された金製パン中のサンプルＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ３のＤＳＣは、約１６１℃の融点を示唆している（図５．１１）。ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ３のＦＴ−ラマンスペクトルが記録され、遊離塩基とのいくつかの違いを示している（図５．１２および図５．１３）。ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ１の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、３．５の積分でδ６．１のマレイン酸に起因するシグナルを有する。これは、遊離塩基：酸比が１：１．７５であることを示唆している（図５．１４）。ＤＶＳは、相対湿度が０％に低下すると質量損失が約１％になり、相対湿度が再び上昇するとすぐに水の吸着を示す（図５．１５および図５．１６）。約６．５％の質量の最大増加は、相対湿度９５％で達成される。これは、モルあたり約２．５水に相当する（遊離塩基：ＭＬＥの比が１：１．７５と想定）。ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ３の元素分析は１：１．７５塩によく適合し、カールフィッシャー滴定による含水量０．４％はＴＧ−ＦＴＩＲの結果と一致する。
Figure 2020516620
５．３例示化合物Ｎｏ．１２７のリン酸塩
リン酸とアセトニトリル（ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ１）および２−プロパノール（ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ２）を溶媒として使用したスクリーニング結晶化実験では、ＰＸＲＤによって２つの異なる結晶固体が得られた（図５．１７）。これら２つの実験では、遊離塩基：酸のモル比が１０：１であったことに注意することが重要である。サンプル−Ｐ２のＴＧ−ＦＴＩＲは、２００℃よりも高い温度で分解が始まる２−プロパノールの損失により、１３０℃で１．０％の質量損失を示している（図５．１８）。このサンプルを１Ｈおよび３１Ｐ ＮＭＲでも調査した。後者はリン酸イオンの証拠を示している（図５．１９および図５．２０）。同じ方法で２つの実験を行ったが、遊離塩基：酸のモル比は１：１であった。これらの実験では、非晶質の固体のみが得られ、それ以上の調査は行わなかった。このシステムを更に調査し、合成をよりよく理解するために、更にいくつかの実験を行った。ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ５では、再現性を確認するために、実験−Ｐ２を繰り返した。サンプル−Ｐ５のＰＸＲＤパターンは−Ｐ２（図５．２１）と一致し、リン分析では、サンプル−Ｐ５がヘミリン酸塩（つまり、２：１の遊離塩基：リン酸塩）であることが示唆される（表５．３）。実験ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ６では、遊離塩基：酸の２：１の比が達成されるまで、０．１モル当量の段階でリン酸水溶液を段階的に加えた。ＰＸＲＤパターンは、−Ｐ２および−Ｐ５（図５．２１）と同じ結晶形が得られたことを確認しており、２．８３質量パーセントのリンの結果もヘミリン酸塩を示唆している。実験ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ７を−Ｐ６と同様に実行したが、リン酸単塩を試して得るために、遊離塩基と酸の比が１：１になるまでリン酸を加えた。得られた固体のＰＸＲＤ分析は、ヘミリン酸塩が得られたことを示している（図５．２１）。実験ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８での約６００ｍｇスケールでのこの合成のスケールアップも、同じ結晶形の生成に成功した。このサンプルのＦＴ−ラマンスペクトルを、図５．２２および図５．２３の遊離塩基のスペクトルと比較した。このスペクトルは実質的な違いを示している。驚いたことに、ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８のＴＧ−ＦＴＩＲは、同じＰＸＲＤパターンを持っているにもかかわらず、サンプル内にかなり多くの水と２−プロパノールが存在することを示して
いる（図５．２４）。したがって、このリン酸塩は、同形の溶媒和／水和形態および非溶媒和／水和形態を有しているようである。密封された金製パンに入れたサンプルＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ６および−Ｐ８のＤＳＣは、７９℃および８０℃の開始点でかなり再現性のある融点を示している（図５．２５および図５．２６）。これらの値は、２−プロパノールの沸点によく対応しており、溶媒の放出と固体の融解を同時に示唆している。ＤＳＣの測定は、おそらく、開いたパンでも調査する必要がある。サンプルＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８のＤＶＳは、相対湿度が５０％から０％に減少するため、即時の質量損失を示すが、これは最初のサイクルでは完了しない。ＤＶＳの２回目のサイクルで大きな質量損失が観察され、最高相対サンプル質量と最低相対サンプル質量との間の１２．５％の差はＴＧ−ＦＴＩＲで観測される質量損失とよく一致する。１２．５％の含水量は、１つの２：１塩あたり約７個の水分子に相当する。サンプルＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ５および−Ｐ８の元素分析は、炭素含有量が非常に大きく異なるが、ある程度一貫している。
Figure 2020516620
また、カールフィッシャー滴定によって決定される８質量パーセントの含水量にも注意する必要がある。この値は、ＤＶＳに吸着されていると想定される１２質量パーセントの水よりもかなり低いが、２−プロパノールがまだいくらか残っていることを示唆する可能性がある。
５．４例示化合物Ｎｏ．１２７の硫酸塩
硫酸で行われた最初のスクリーニング実験は、遊離塩基：酸のモル比１０：１で行った。２−プロパノール（ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ１）での結晶化により、より大きなスケール（−Ｐ３）で再現された結晶固体が生じたが、アセトニトリル（−Ｐ２）での実験では固体が得られなかった（図５．２９）。結晶性固体の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、分子が分解したことをまったく示していない（図５．３０）。同様の方法で２つの追加の実験を実施したが、今回は遊離塩基：酸のモル比１：１を使用した。これらの結果は、最初に望ましい比の出発材料が使用されたため、より興味深いものである。両方の溶媒での結晶化実験では、ＰＸＲＤで非常によく似た結晶形が得られ、２−プロパノールでの実験は約６００ｍｇのスケールで再現できた（図５．３１）。ＴＧ−ＦＴＩＲは、サンプル−Ｐ４に約５．５質量パーセントの水が含まれており、４％と１．５％の２つの異なる工程損失で失われ、２００℃を超えると分解し始めることを示している（図５．３２）。４％の含水量は、塩あたり約１個の水に相当するが、１．５質量パーセントの水は、塩あたり０．５個の水を示唆する（遊離塩基：硫酸塩が１：１と想定）。ＤＶＳは、相対湿度が５０％から０％に減少すると一定の質量損失を示し、相対湿度が再び増加するとすぐに質量が増加する（図５．３３および図５．３４）。ＤＶＳの最小相対サンプル重量と最大相対サンプル重量の差は約５〜５．５％であり、これはＴＧ−ＦＴＩＲの結果とよく一致し、塩あたり合計１．５の水を示唆している（１：１の塩を想定）。１７３℃の融解開始温度は、密封された金製パンでＤＳＣを実行することにより、サンプルＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ６に関して決定した（図５．３５）。ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ４の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは分子の分解を示さず（図５．３６）、硫酸塩のＦＴ−ラマン分光法は、遊離塩基のスペクトルと比較した場合に有意差を示す（図５．３７および図５．３８）。表５．４に示されている元素分析の結果は、１．５の水とかなりよく一致しているが、カールフィッシャー滴定による酸素含有量と水分の決定は多少矛盾している。
Figure 2020516620
５．５選択した塩の水溶性とＨＰＬＣ純度の概要
選択した各塩の水溶性とＨＰＬＣ純度を決定し、結果を次の表に示す。
Figure 2020516620
測定した水への溶解度の範囲は、硫酸塩の約８ｍｇ／ｍＬから、リン酸塩の約３０ｍｇ／ｍＬまでである。ただし、ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８は２：１の遊離塩基：リン酸塩であるため、２分子の遊離塩基を送達することに注意する必要がある。このサンプルの飽和溶液のｐＨも、他の塩のｐＨよりも大幅に高くなっている（ｐＨ約７対ｐＨ３．２〜４．３）。また、各塩の純度も、検出された他のすべてのピークと比較したメインピークの相対面積パーセントを使用して決定され、ＳＰ２３８−ＳＯ４−Ｐ６の７８％からＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８の９３％までの範囲であった。試験サンプルの拡大ＨＰＬＣトレースを図５．３９（ＳＰ２３６−ＦＢ−Ｐ１）、図５．４０（ＳＰ２３６−ＣＩＴ−Ｐ３）、図５．４１（ＳＰ２３６−ＭＬＥ−Ｐ３）、図５．４２（ＳＰ２３６−ＰＯ４−Ｐ８）および図５．４３（ＳＰ２３６−ＳＯ４−Ｐ６）に示す。
６．他の塩形成剤によるスクリーニング実験
６．１安息香酸
安息香酸を使用して２つの結晶化実験を行った。溶媒として２−プロパノールを使用した（ＳＰ２３６−ＢＮＺ−Ｐ１）場合、固体は得られなかったが、酢酸エチルを使用した実験では結晶性固体が得られた（ＳＰ２３６−ＢＮＺ−Ｐ２、図６．１）。サンプルにはまだＴＧ−ＦＴＩＲで見られる酢酸エチルが約０．６％含まれており、約２００℃を超えると安息香酸が分解して失われ始める（図６．２）。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、更に５つの芳香族プロトンを示し、１：１の遊離塩基：ＢＮＺ塩を示唆している（図６．３）。
６．２フマル酸
溶媒系としてＴＨＦを使用したフマル酸による結晶化実験で白色沈殿物が形成された（ＳＰ２３６−ＦＵＭ−Ｐ１）が、この固体はＰＸＲＤによって部分的にのみ結晶性であることがわかった。２−プロパノールを使用した実験では、２５〜３０℃で反応を調整した後、はるかに多くの結晶サンプルが得られたようである（図６．４、ＳＰ２３６−ＦＵＭ−Ｐ２）。後者のサンプルのＴＧ−ＦＴＩＲは、約１４０℃で約２．６％の２−プロパノールの損失を示し（図６．５）、１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、δ６．６ｐｐｍのシグナルに基づいて１：１．３５の遊離塩基：酸比を示唆している。
６．３ Ｌ−リンゴ酸
２−プロパノール中のＬ−リンゴ酸を使用した結晶化実験では、２５〜３０℃の焼き戻しで結晶化した油性固体が元々生じていた（ＳＰ２３６−ＭＬＡ−Ｐ１、図６．７）。ＴＨＦでの同様の実験では、非晶質固体（ＳＰ２３６−ＭＬＡ−Ｐ２）のみが得られた。前者のサンプルの１Ｈ ＮＭＲスペクトルには、δ２．４および３．９のＬ−リンゴ酸に起因するシグナルがあり、１：１の遊離塩基：酸比を示している（図６．８）。
６．４コハク酸
溶媒としてＴＨＦを使用したコハク酸を用いた結晶化実験により、１Ｈ ＮＭＲにより遊離塩基と１：１の比のコハク酸塩の証拠を示す部分結晶性固体が得られた（ＳＰ２３６−ＳＵＣ−Ｐ２、図６．９および図６．１０）。ＴＧ−ＦＴＩＲは、１５０℃よりも高い温度で分解が始まるＴＨＦの損失による、１１０℃で３．１％の質量損失を示す（図６．１１）。エタノールを溶媒として使用した実験（ＳＰ２３６−ＳＵＣ−Ｐ１）では、粘稠な固体のみが得られたが、これ以上の調査は行わなかった。
６．５ Ｌ−酒石酸
Ｌ−酒石酸を用いた結晶化実験は、エタノール（−Ｐ１）とメタノール（−Ｐ２）を溶媒として使用して実施した。得られた固体のＰＸＲＤパターンは、両方のサンプルが結晶であり、構造的に類似している可能性があることを示している（図６．１２）。これらの２つの結晶化の生成物には、同様の質量パーセントの溶媒／水が含まれており（つまり、約５．３％、図６．１３および図６．１４を参照）、それらの１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、約δ４ｐｐｍのシグナルに基づいて１：１の遊離塩基：ＬＴＡＲ比を示している（図６．１５および図６．１６を参照）。
６．６トルエンスルホン酸
トルエンスルホン酸による結晶化実験は、２−プロパノール（−Ｐ１）およびＴＨＦ（−Ｐ２）で実施した。ＰＸＲＤは、得られた固体形態が類似している可能性があることを示しているが、ＴＨＦを使用した実験では、より多くの結晶サンプルが生成された（図６．１７）。残念なことに、これらの結晶化の収率は非常に低く、少量の微細で高度に静電的な固体しか回収されなかった。サンプル−Ｐ２の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを測定でき、遊離塩基：ＴＯＳ比が１：１．５であり、サンプルに約１０モル％のＴＨＦが残っていることを示唆している（図６．１８）。
７．例示化合物Ｎｏ．１２７のＨＣｌ単塩の調製
７．１遊離塩基から始まる塩形成
ＨＣｌ単塩は、３ＨＣｌ塩（これは本発明の範囲から除外されている）よりもはるかに高いエタノール溶解度を示す。
したがって、単塩の収量は低くなる。収率を上げるために、エタノール−水混合物を結晶化溶媒として使用できる。
遊離塩基から単塩酸塩を調製するために、遊離塩基の形態の例示化合物Ｎｏ．１２７の１．４ｇ（３．４ｍｍｏｌ）をエタノール８６ｍｌに溶解し、５０℃に加熱する。０．６１ｇ（１．０５当量）の３２％ＨＣｌを滴下し、溶液を２時間以内に０〜５℃に冷却する。得られた懸濁液をろ過し、１０ｍｌの２−プロパノールで洗浄する。湿った製品を、真空（１００ｍｂａｒ未満）で４５℃にて少なくとも１０時間乾燥する。
収量は白色固体の形態で０．５１ｇ（理論的に計算された収量の３４％）である。
７．２例示化合物Ｎｏ．１２７の３ＨＣｌ塩から始まる塩形成
ＨＣｌ単塩は水への溶解度が低いため、ｐＨ≧５で沈殿する。
３ＨＣｌ塩からＨＣｌ単塩を調製するために、５ｇ（９．７ミリモル）の３ＨＣｌ塩の形態の例示化合物Ｎｏ．１２７を２０〜２５℃で５０ｍｌの水に溶解する。次いでｐＨを３０％ＮａＯＨでｐＨ５〜６に調整し、懸濁液を１０分間撹拌する。懸濁液をろ過し、１０ｍｌの２−プロパノールで洗浄する。湿った製品を、真空（１００ｍｂａｒ未満）で４５℃にて少なくとも１０時間乾燥する。
収量は白色の固体の形態で３．７ｇ（理論的に計算された収量の８５％）である。
単塩製品は、出願人の内部方法ＩＮＳ００５３２４ＩＰＶ−ＤＥ０３ｖ．２によるＣｌ−含有量の従来の滴定測定によって特徴付けられている。
Figure 2020516620
Ｖ＝ＡｇＮＯ３容量 ０．０１Ｍ
ｆ＝ＡｇＮＯ３標準 ０．０１Ｍ １．００４
Ｅ＝初期重量［ｇ］。
Figure 2020516620
理論的に計算された値は７．９７％であり、これは単塩の形成を裏付けている。
元素分析：
Figure 2020516620
結晶化はｐＨ５〜５．５で発生した。
δは残留水に起因すると想定されている。
図７．１は、ＨＰＬＣ分析による単塩の確認を示している
図７．２は、ＤＳＣ測定による単塩の確認を示している。
ＩＩ．例示化合物Ｎｏ．１２７の選択された塩の多形体の評価
以下では、サンプルはＰＰ５６６−ＸＹＺ−Ｐｗの形式の識別コードで示される。ＸＹＺは、硫酸塩のＳＯ４またはリン酸塩のＰＯ４塩のいずれかである塩／共結晶形成剤（すなわち、酸の種類）を指定し、Ｐｗは特定のサンプル／実験（ｗ＝１、２、…ｎ）を示す。
多形体にはＰＭｘ、つまりＰＭ１、ＰＭ２、ＰＭ３…などの番号が付けられる。
１．例示化合物Ｎｏ．１２７の硫酸塩の多形体
以下の実験は、例示化合物Ｎｏ．１２７の硫酸塩の様々な多形体の評価について説明し、固体状態の例示化合物Ｎｏ．１２７の硫酸塩の安定な形態（または水和物）を決定する。ここで評価した硫酸の多形体はすべて、化合物Ｎｏ．１２７の１：１塩であった。
１．１出発材料（ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ１）の特性決定
粉末Ｘ線回折：
ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ１のＰＸＲＤパターンは反射モードで記録し（表示なし）、これはサンプルが本質的に非晶質であることを裏付けていた。
ＴＧ−ＦＴＩＲ分析：
ＴＧ−ＦＴＩＲは、非晶質硫酸塩ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ１がおよそ５％ｗｔを含み、１６０℃付近で分解を開始することを示す（図示せず）。
ＤＳＣ分析：
ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ１は最初５３℃でも小さな吸熱事象を示し、４．７Ｊ／ｇのΔＨに関連付けられている。７８℃では、急激な発熱事象を観察することができ、これは５２Ｊ／ｇのΔＨ（おそらくは結晶化）に関連付けられている。追加の小さな熱事象が５９℃で認められる。このシグナルは、非晶質画分のガラス転移に対応すると想定されているが、まだ最終的には確認されていない。１６４℃では、おそらくは化合物の分解に伴う新しい結晶相の融解に起因するであろう広範な吸熱事象が発生する。
１ Ｈ ＮＭＲ分光法：
化合物ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ１の化学的完全性を、１Ｈ−ＮＭＲによって検証した。スペクトルは、水素結合形成剤またはおそらくは完全に脱プロトン化されていない酸（おそらくＨＳＯ４）に割り当てられた１０ｐｐｍを中心とする広範な特徴を示す（スペクトルは表示せず）。
ＤＶＳ試験：
ＤＶＳ内の物質の挙動を分析した。この化合物は、５０％ｒ．ｈ．（約４．５％ｗｔ）で非常に迅速に水を取り込み、プラトーに達し、結晶性水和物の形成を示唆する。０％ｒ．ｈ．では、サンプルは元の重量の約５％ｗｔ（５０％ｒ．ｈ．で重量の９％）を失うが、プラトーに達しておらず、これは化合物に水がまだ存在し、物質が最終的には無水状態に到達する可能性があることを示唆している。ただし、この仮想状態は５％ｒ．ｈ．ですでに非常に不安定であり、それは水の取り込みを始め、５５％ｒ．ｈ．で１０％ｗｔ以上を得た。そこでは約３％ｗｔの急激な減少を受け、これは、湿度により再結晶化が誘導され、より少ない水和構造が生成されることを示唆している。このプロセスは、約６５％ｒ．ｈ．まで続き、化合物が最小値に達すると、物質は８０％ｒ．ｈ．までゆっくりと水を取り込む（２％ｗｔのオーダー）。ただし、臨界ｒ．ｈ．に達すると、相対湿度が５０％に低下した場合でも、数分でサンプルが１３％ｗｔ超過の水を取り込み、非常に安定しているように見えるプラトーに到達する。これは、５０％超過で安定なより高い水和物が形成されることを示唆している（表示せず）。
ＤＶＳサイクルの後にＰＸＲＤが撮影された。これは、結晶材料を示している（パターンはここには示していない）。
１．２多形体の評価
化合物ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ１の多形ランドスケープを、様々な溶媒および溶媒混合物に材料を懸濁して非常に様々な物理的条件と水分活性を調査することによって調査した。これまでに少なくとも６つの結晶形（ＰＭ１〜ＰＭ６）が特定されたが、更に多くの結晶形が推測される。４５℃で真空乾燥することにより、固体形態を試験した。結果の概要を次の表に示す。
Figure 2020516620
取得した形態ＰＭ１〜ＰＭ６のＰＸＲＤの概要を図８．１に示す。
１．３多形体ＰＭ１
ＰＭ１多形体は、ＭｅＣＮ、ｉ−ＰｒＯＨ、ＤＣＭ、アセトン、アセトン：水９５：５およびアセトン：水９：１から得られる。ＰＸＲＤは広範なピークを示し、結晶性が低いことを示唆している（図８．２）が、１Ｈ−ＮＭＲは化学的完全性が維持されていることを示している（図８．３）。サンプルＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ２のＴＧ−ＦＴＩＲは、約５０℃で始まる（１５０℃まで）２．５％ｗｔの水の損失を示しており、半水和物を示唆している（図８．４）。ＰＭ１形態がアセトン−水９：１のサンプルから得られたという事実は、ＰＭ１が０．７までの水分活性で安定していることを示唆している。驚くべきことに、水を含まない溶媒を使用した実験でＰＭ１が得られた。これらの場合、水はおそらく、それぞれのＴＧ−ＦＴＩＲ（本明細書には示さず）で見ることができるようなに約５％の水を含む出発材料から生じる。形態ＰＭ１は真空乾燥に耐性があり、４５℃およびｐ＜３０ｍｂａｒで一晩乾燥した後でも結晶性が維持される（実験ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ９−ＤＲＹ）。この形態は、独立した実験において再現性および独立性も伴って得られた。この形態を、ＤＶＳ、ＴＧ−ＦＴＩＲ、ＤＳＣ、およびＮＭＲによって更に調査した。
ＤＶＳを２サイクルの湿度ランプで実行した（図８．５）。また、ＰＭ１型の場合（非晶質出発材料と同様、本明細書には示さず）、材料はサーモグラムで非常に複雑な挙動を示す。湿度が０％ＲＨに低下し、サーモグラムが最小に達すると、％ｗｔはほとんど失われない。ＲＨが増加すると、サンプルは元の重量に近くなり、ゆっくりと水を取り込む（２〜３％ｗｔ）が、８０％ＲＨに達すると、材料はプラトーに達することなく、約１５％ｗｔの水を急速に吸収し、材料が９５％ＲＨでより長く保たれた場合、質量吸収が継続すると考えられる。湿度が５０％に戻ってから０％に近づくと、水和レベルは安定しているように見え、１８％ｗｔを急激に失う。２番目のサイクルでは、取り込みはより速く、非晶質相で観察されたもの（本明細書には示さず）と同様であり、急激な減少は再結晶を示唆している。材料はその後、ほぼ２０％ｗｔまでの迅速な質量吸収を行い、５０％ｗｔのサイクルの終わりまで安定である。この挙動は、水和物の形成メカニズムにいくつかの洞察を与え、塩が高い水和レベルに達し、その後乾燥条件にさらされると、格子が崩壊し、非晶質相になることを示唆している。これは、形態ＰＭ６で観察された挙動によってサポートされている（以下を参照）。ＰＭ１形態は、５℃および５０℃でＥｔＯＨ：水の４：１および３：１混合物に懸濁した場合にも安定しているように見える。
結論として、ＰＭ１形態は、厳密な湿度制御条件下（約５０％、いずれの場合も７０％ＲＨ未満）で安定したままであり、これは、１０ｍｇのＰＭ１を５３％ＲＨに１０日間さらしてからＰＸＲＤによって確認した（実験ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ２４）。多形体はＰＭ１のままであった。
Figure 2020516620
１．４多形体ＰＭ２
ＰＭ２多形体は結晶性が高く、ＥｔＯＨからのみ得られた。１Ｈ−ＮＭＲおよびＴＧ−ＦＴＩＲは、ＥｔＯＨ単溶媒和物を示唆している（本明細書には示さず）。興味深いことに、ＴＧ−ＦＴＩＲには微量の水のみが存在し、これは、ＥｔＯＨ（約８．３％ｗｔ）が結晶格子内の水を置換し、高度に秩序化されたシステムに有利であることを示唆している。これは、エタノールの沸点をはるかに上回る１２０〜１５０℃での溶媒の急激な損失と一致している。この形態は真空乾燥にも耐性があり、実験ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ５−ＤＲＹで確認されたように、ＰＸＲＤは４５℃、３０ｍｂａｒで一晩乾燥しても変化しない。
１．５多形体ＰＭ３
ＰＭ３多形体はＥｔＯＡｃ中のスラリーから得られ、結晶性が低いことが判明した。ＰＭ３形態は、ＰＭ１形態と線幅の点でほとんど類似していないが、ＰＸＲＤのピーク位置は本質的に異なる（本明細書には示さず）。１Ｈ−ＮＭＲは化合物の化学的完全性を確認し（本明細書には示さず）、ＴＧ−ＦＴＩＲは１５０℃までのＥｔＯＡｃの放出を示す形態の溶媒和性質を確認する（本明細書には示さず）。この形態は真空乾燥にも耐性があり、実験ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ６−ＤＲＹで確認されるように、ＰＸＲＤは４５℃、３０ｍｂａｒで一晩乾燥した後も変化しないままだった。
１．６多形体ＰＭ４
ＰＭ４多形体は、ＭｅＯＨ中でのスラリー実験およびいくつかのＭｅＯＨ：水混合物から得られた高度に結晶性の形態である。形態の溶媒和された性質は、１Ｈ−ＮＭＲおよびＴＧ−ＦＴＩＲの両方によって示唆されている（本明細書には示さず）。いくらかの水は存在するが、そのほとんどは約１００℃で失われるため、水和物／溶媒和物の混合物はほとんどない。一方、ＭｅＯＨの放出は３５℃を超えるこの溶媒の沸点よりも高い１１０℃付近で始まり、１７０℃付近で終了する。これは、ＭｅＯＨが結晶格子にしっかりと結合していることを示唆している。実験ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ１３〜Ｐ１６で実証されているように、ＰＭ４形態は少なくとも０．６の水分活性まで安定している。
１．７多形体ＰＭ５
ＰＭ５多形体は、ＴＨＦ中での懸濁平衡から得られ、シャープな反射を伴う良好な結晶化度を示す（本明細書には示さず）。化合物は、定量化できない少量の水を含むＴＨＦ溶媒和物である。１Ｈ−ＮＭＲは、塩化合物の化学的完全性が維持され、ＴＨＦも１．７６ｐｐｍで見えることを示しているが、３．６３ｐｐｍでの共鳴は他のシグナルと重なる（図９．１６）。シグナルが水と重複するため、ＴＨＦの量はＴＧ−ＦＴＩＲで近似的に推定し、３．９％ｗｔ未満である。相の溶媒和の性質は、ＴＨＦが最大１６０℃のサーモグラムで観察できるという事実によって確認され、ＴＨＦが結晶格子にしっかりと結合していることを示唆している（図９．１７）。これは、真空乾燥にも耐性があり、実験ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ１０−ＤＲＹで確認されたように、４５℃、３０ｍｂａｒで一晩乾燥した後もＰＸＲＤが変化しないという事実によって確認できる。
１．８多形体ＰＭ６
ＰＭ６多形体は、本実験で得られた最も水和された形態であり、水からの懸濁液平衡から得られる。当該形態は高い結晶化度を示し（本明細書には示さず）、ｒ．ｈ．が５０％に低下した場合でさえ合理的な時間の間安定であるように見える。本明細書中で評価される他の多形体と同様に、塩化合物の化学的完全性は改変されていない（１Ｈ−ＮＭＲ、本明細書には示さず）。格子に含まれる水は１９．６％ｗｔであり、六水和物に近く、約１５０℃まで放出され（本明細書には示さず）、ＤＶＳで観察される値（ｃａ．１９％ｗｔ）と一致する。この形態は、実験ＰＰ５６６−ＳＯ４−Ｐ１７−ＤＲＹで確認されるように、真空下で一晩乾燥されると、非晶質相への変換を受ける。
２．例示化合物Ｎｏ．１２７のリン酸塩の多形体
以下の実験は、例示化合物Ｎｏ．１２７のリン酸塩の様々な多形体の評価について説明し、固体状態の例示化合物Ｎｏ．１２７のリン酸塩の安定な形態（または水和物）を決定する。本明細書で評価したリン酸の多形体ＰＭ１およびＰＭ３〜ＰＭ１１は、化合物Ｎｏ．１２７の２：１塩である。本明細書中で評価されるリン酸の多形体ＰＭ２は、化合物Ｎｏ．１２７の１：１塩である。
２．１出発材料の特性決定（ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１）
粉末Ｘ線回折：
ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１のＰＸＲＤパターンを反射モードで記録し、これは、サンプルが部分的に結晶性または中間状態であることを裏付けていた（本明細書には示さず）。
ＴＧ−ＦＴＩＲ分析：
ＴＧ−ＦＴＩＲは、リン酸塩複合体が約１．３％ｗｔのｉ−ＰｒＯＨを含むことを示す。ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１は１２０℃付近で分解を開始する（本明細書には示さず）。
ＤＳＣ分析：
ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１は複雑な熱挙動を示す。約０．８Ｊ／ｇ℃の熱容量の変化に伴って、約４７℃でガラス転移が観察され、次いで、約５７℃で吸熱熱事象が発生する。サンプルは、部分的に結晶性であるか、中間（ガラス状液晶）材料で構成されている（本明細書には示さず）。
１ Ｈ ＮＭＲ分光法：
化合物ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１の化学的完全性は、１Ｈ−ＮＭＲによって検証された。ＴＧ−ＦＴＩＲと一致して、少量のイソプロパノールがリン酸塩スペクトルで観察される。スペクトルは、水素結合形成剤またはおそらくは完全に脱プロトン化されていない酸（Ｈ２ＰＯ４ −、ＨＰＯ４ ２−）に割り当てられた、５．７ｐｐｍを中心とする広範な特徴を示す。
ＤＶＳ試験：
ＤＶＳ内の物質の挙動を分析した。化合物ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１は、いくつかの水和物の形成を示唆している。サンプルは数分以内に水を取り込み、その後５０％ｒ．ｈ．でプラトーを示す。その後、水に非常に敏感である０％ｒ．ｈ．で可能な無水相が形成される（約５％ｒ．ｈ．で質量吸収を開始する）。最終的にプラトーに達するのは９５％ｒ．ｈ．であるが、この優れた水和状態は低ｒ．ｈ．では安定しておらず、水を失い、５０％ｒ．ｈ．で新しいプラトーに達する（ただし、実験の開始時に観察された最初のプラトーとは異なる）。５０％ｒ．ｈ．の最終含水量は約１０％である。
ＤＶＳサイクルの後にＰＸＲＤが撮影された。これは、水和物形態ＰＭ５の存在を示している（本明細書には示さず）。
元素分析：
出発材料はＣＨＮＦ分析に提出し、リン含有量はＩＣＰ−ＯＥＳによって決定した。化学量論は、例示化合物Ｎｏ．１２７：ＰＯ４の比２：１に近い。
Figure 2020516620
２．２多形体の評価
化合物ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１の多形ランドスケープを、様々な溶媒および溶媒混合物に材料を懸濁して非常に様々な物理的条件と水分活性を調査することによって調査した。これまでに少なくとも１１の結晶形（ＰＭ１〜ＰＭ１１）が特定されたが、更に多くの結晶形が推測される。結果の概要を次の表に示す。
Figure 2020516620
取得した形態ＰＭ１〜ＰＭ１１のＰＸＲＤの概要を図９．１に示す。
２．３多形体ＰＭ１
ＰＭ１多形体はＤＣＭから得られ、中程度の結晶性（本明細書には示さず）を示し、１Ｈ−ＮＭＲは化学的完全性が維持されていることを示している（本明細書に示さず）。５．５７ｐｐｍでの１Ｈ−ＮＭＲにおけるシグナルは、ＤＣＭの存在を示している。ＴＧ−ＦＴＩＲは１４．２％ｗｔのＤＣＭの損失を示す。これは、おそらく物理吸着ＤＣＭの場合、約３０℃で始まる。ただし、質量損失は１５０℃まで続き、溶媒和物が示唆される（本明細書には示さず）。この形態は、４５℃で１２時間真空乾燥にさらされると、結晶性の低い形態に進化する
２．４多形体ＰＭ２
ＰＭ２多形体は結晶性が高く、ＥｔＯＨからのみ得られたが、他のいくつかの溶媒からも得られ、無水相である可能性が示唆された（図９．２および図９．６）。実験ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ５の１Ｈ−ＮＭＲおよびＴＧ−ＦＴＩＲは、それがヘミＥｔＯＨ溶媒和物である可能性を示唆しているが（それぞれ図９．３および９．４）、エタノールは１７０℃まで放出されるため、ＴＧ−ＦＴＩＲは、ＰＭ２型が得られた別のサンプルについて記録し（実験ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１２、アセトンからのスラリー）、サーモグラムは、約１５０℃の分解温度まで溶媒放出も質量損失も示さない。これは、この化合物の構造が結晶格子内の異なる溶媒に対応でき、同じ固体構造を維持できることを示唆している。結晶形は、４５℃で一晩の真空乾燥に耐性がある。この形態でもＤＶＳを実行した。当該材料は９５％ｒ．ｈ．でおよそ０．７％ｗｔを取り込んで、プラトーに達し、サイクル後にわずかに低い重量に戻る（図９．７）。材料はわずかに吸湿性である。
材料は元素分析にも提出した。結果は１：１の塩と一致している：
Figure 2020516620
２．５多形体ＰＭ３
ＰＭ３多形体は、ＭｅＯＨ中およびＭｅＯＨ：水９５：５混合物中の形態ＰＭ７（下記参照）との混合物のスラリー実験から得られた高度に結晶性の形態である。形態の溶媒和された性質は、１Ｈ−ＮＭＲおよびＴＧ−ＦＴＩＲの両方によって示唆されている（本明細書には示さず）。ＭｅＯＨの放出は３５℃を超えるこの溶媒の沸点よりも高い９０℃付近で始まり、急激な工程にて１２０℃付近で終了する。これは、ＭｅＯＨが結晶格子にしっかりと結合していることを示唆している。この相の形成は非常に狭い水分活性範囲を持ち、ａｗ＝０．２をわずかに下回る混合溶媒和物：水和物形態（形態ＰＭ７）で進化し、ａｗ＝０．３ではこの形態の痕跡がないことに注意することは興味深い。
２．６多形体ＰＭ４
ＰＭ４多形体は、ＴＨＦ中の懸濁平衡から得られ、広範な反射を伴う低い結晶化度を示す（本明細書には示さず）。当該化合物はＴＨＦ溶媒和物である。１Ｈ−ＮＭＲは、ＡＰＩの化学的完全性が維持され、ＴＨＦも１．７６ｐｐｍおよび３．６３ｐｐｍで見えることを示している（本明細書には示さず）。ＴＨＦの量はＴＧ−ＦＴＩＲで推定でき、約２．８％ｗｔである。相の溶媒和の性質は、ＴＨＦが最大１８０℃のサーモグラムで分解とともに観察されるという事実によって確認され、ＴＨＦが結晶格子にしっかりと結合していることを示唆している（本明細書には示さず）。
２．７多形体ＰＭ５
ＰＭ５多形体は、本実験で得られた最も水和された形態である。これは、水からの懸濁液平衡化および９５％ｒ．ｈ．での材料の保存から得られる（出発材料のＤＶＳを参照）。この形態は、高い結晶化度を示す（本明細書には示さず）。他の得られた形態として、ＡＰＩの化学的完全性は改変されない（１Ｈ−ＮＭＲ、本明細書には示さず）。格子に含まれる水は、実験ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１１では十分な材料を回収できなかったため、ＴＧ−ＴＦＩＲで定量化できなかったが、約１１％ｗｔのＤＶＳ（本明細書には示さず）から推定できる。
２．８多形体ＰＭ６
ＰＭ６多形体は、ＭｅＯＨ：水が３：１および４：１の混合物から得られる、ＰＭ５よりも低い水和物である。この形態は、高い結晶化度を示す（本明細書には示さず）。他の得られた形態として、化合物の化学的完全性は変更されない（１Ｈ−ＮＭＲ、本明細書には示さず）。ＴＧ−ＦＴＩＲ実験中に、２工程で水が放出される（本明細書には示さず）。ＴＧ−ＦＴＩＲでもＮＭＲスペクトルでも、メタノールの痕跡は観察されなかった。この形態は、適度な水分活性（約０．４〜０．６）で得られる。
２．９多形体ＰＭ７
ＰＭ７多形体は、メタノール：水９：１の混合物（ａｗ＝０．３）から得られる混合水和物溶媒和物であり、メタノールと水の両方が格子に結合している純粋な結晶相（本明細書には示さず）である。形態は、比較的低い水分活性で得られる。ＴＧ−ＦＴＩＲは、２つの別々の工程で両方の溶媒の大量放出を示す（本明細書には示さず）。
２．１０多形体ＰＭ８
ＰＭ８多形体は、溶媒和物／水和物の混合物であると考えられており、水分活性が０．５〜０．７であるときに生成される（本明細書には示さず）。興味深いことに、化合物をＲＴで純粋なアセトン中で撹拌しても、アセトン溶媒和物は観察されない（実験ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１２）。
２．１１多形体ＰＭ９
材料ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ４を３０ｍｂａｒ、４５℃に約１２時間曝露した後、ＰＭ９多形体が得られた。この形態は、ＤＣＭ溶媒和物であるＰＭ１からの脱溶媒和形態であると推定される。この形態は結晶性が低く、回折図に広範なピークを示す（本明細書には示さず）。
２．１２多形体ＰＭ１０
材料ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１３を３０ｍｂａｒおよび４５℃に約１２時間さらした後にＰＭ１０多形体が得られた（本明細書には示さず）。興味深いことに、この形態はＰＭ６（本明細書には示さず）ではなく水和物形態ＰＭ５といくつかの類似点を共有しているが、結晶性が低く、２θの高い方へわずかにシフトしており、これは、わずかに小さい単位セルを示唆している（より低い水和物であり得るという想定につながる）。これはＴＧ−ＦＴＩＲで確認されている（本明細書には示さず）。
２．１３多形体ＰＭ１１
材料ＰＰ５６６−ＰＯ４−Ｐ１５を３０ｍｂａｒ、４５℃に約１２時間曝露した後、ＰＭ１１多形体が得られた（本明細書には示さず）。形態は結晶性が乏しく、ＴＧ−ＦＴＩＲは水の存在を示す（本明細書には示さず）。
ＩＩＩ．薬理学的アッセイ
以下の薬理学的アッセイは、対応する遊離塩基の形態および／またはＨＣｌ三重塩の形態の選択された例示化合物を用いて実施した。式（Ｉ）による化合物は主に有効成分を構成するので、本発明による対応する塩について同等の活性結果が期待される。以下の実験結果は、本特許出願による新規塩（それらの溶媒和物、水和物および多形体などを含む）が、フェロポーチン阻害活性を維持し、また、フェロポーチン阻害活性を改善でき、および／または化合物の薬物動態プロファイルを改善し、および／または化合物の物理化学的特性を改善してガレヌス製剤への製剤化をより容易にし、および／または化合物の物理化学的特性を改善してガレヌス製剤への製剤化をより容易にするか、取り扱い／加工をより容易にするか、またはその安定性を改善する結晶の形態で単離されるという利点を有することを裏付けている。
特に、以下の試験では、以下のように、例示化合物を三重塩（３ＨＣｌ）の形態および／または遊離塩基の形態で試験した。
Figure 2020516620
１．ヘプシジンインターナリゼーションアッセイ（Ｊ７７４）
この細胞アッセイは、蛍光標識ヘプシジンのＪ７７４細胞へのインターナリゼーションの顕微鏡検出により、ヘプシジンのフェロポーチン（Ｆｐｎ）への結合の定量化を可能にする。Ｊ７７４は、マウスマクロファージ細胞株であり、鉄とのインキュベーションによりＦｐｎを内因的に発現することが示された（Ｋｎｕｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ，２００５）。ヘプシジンのＦｐｎへの結合は、ヘプシジンとＦｐｎ両方のインターナリゼーションと分解を引き起こす。ただし、ヘプシジンに結合したＴＭＲ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）フルオロフォアは、ヘプシジンペプチド骨格の分解後も細胞と会合したままである。したがって、細胞に関連したＴＭＲ蛍光の顕微鏡的検出は、ヘプシジンのＦｐｎへの結合およびヘプシジンとＦｐｎのインターナリゼーションの尺度である。ＴＭＲ−ヘプシジンがＦｐｎへの結合を妨げられた場合、細胞のＴＭＲ蛍光は低いままである（Ｄｕｒｒｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１３）。このアッセイにおける低分子量Ｆｐｎ阻害剤化合物の効果は、以下で説明するようにインビトロで評価された。
約８０％コンフルエントな培養から回収したＪ７７４細胞を、２００μＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、１００μｌを含む完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）に８ｘ１０５細胞／ｍｌで播種する。９６ウェルＭｉｃｒｏＣｌｅａｒプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；カタログ番号６５５０９０）のウェルごとに、５％ＣＯ２、３７℃で成長させる。一晩インキュベートした後、細胞を事前に温めたフェノールレッドを含まないＤＭＥＭで３回洗浄し、最終洗浄後に３０μｌ／ウェルのフェノールレッドを含まないＤＭＥＭを加え、１０μｌ／ウェルの試験化合物の希釈系列を３回反復実験で加える。Ｊ７７４細胞は、５％ＣＯ２、３７℃で１５分間、試験化合物とプレインキュベートしてから、ＴＭＲ−ヘプシジンを最終濃度２５ｎＭで添加する。細胞を総容量５０μｌで３７％、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素を０．５μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えて核を染色し、更に３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド１００μｌで１５分間室温で固定する。パラホルムアルデヒド溶液を除去した後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ウェルあたり１００μｌを残し、プレートをホイルプレートシールで密封する。ＴＭＲ（５３０〜５５０ｎｍ励起／５７５〜６２５ｎｍ発光／４００ｍｓ露光時間）およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（３６０〜３７０ｎｍ励起／４２０〜４６０ｎｍ発光／１０ｍｓ露光時間）蛍光画像は、２０倍の高ＮＡ対物レンズを伴うＳｃａｎＲプレートイメージャーを使用して取得する（オリンパス）。ウェルごとに４つの写真を取得し、蛍光チャネルはウェルあたり約１５００個の細胞をカバーしている。取得した画像データは、ＳｃａｎＲ画像解析ソフトウェアで解析される。画像分析には、核の検出（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２蛍光）、細胞関連領域の識別、仮想チャネルの適用、およびローリングボール型バックグラウンド低減のしきい値処理、それに続く内面化されたＴＭＲ−ヘプシジンの定量的尺度としての細胞に関連するＴＭＲ蛍光を測定するためのＳｕｍ（Ｍｅａｎ）アルゴリズムの適用が含まれる。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、バージョン５．０
２）の「ログ（阻害剤）対応答」曲線適合を使用して、Ｓｕｍ（平均）生データで計算される。各データセットについて、「ログ（阻害剤）対応答（３つのパラメータ）」モデルの適合度を「ログ（阻害剤）対応答−可変勾配（４つのパラメータ）」モデルの適合度および好ましいモデルのＩＣ５０データと比較する。ヘプシジンインターナリゼーションアッセイにおいて試験したＦｐｎ阻害剤のＩＣ５０データを表１に示す。このアッセイでの非標識ヘプシジンのＩＣ５０は０．０１５±０．０１１μＭである。
表１：ヘプシジンインターナリゼーションアッセイで試験したＦｐｎ阻害剤の平均（ＡＶＥ）ＩＣ５０データを複数の測定について示す。
Figure 2020516620
２．生物物理学的フェロポーチン−ヘプシジン結合アッセイ
この生物物理学的アッセイは、フェロポーチン（Ｆｐｎ）へのヘプシジン結合の阻害をより直接確認するために開発された。Ｃ末端ＦＬＡＧ親和性タグを有するヒトＦｐｎを発現するピキアパストリス酵母細胞から単離された精製ヒトＦｐｎとＴＭＲ−ヘプシジンのインキュベーション（Ｂｏｎａｃｃｏｒｓｉ ｄｉ Ｐａｔｔｉ，２０１４）は、ＴＭＲ−ヘプシジンリガンドの蛍光偏光（ＦＰ）の増加につながる。以下で詳細に説明するように、ＴＭＲ ＦＰシグナルの用量依存性の減少によって検出されるように、低分子量Ｆｐｎ阻害剤をＦｐｎへのＴＭＲヘプシジンの結合の阻害について試験する。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．３、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ＤＤＭ、０．１％ＢＳＡを含むＦＰアッセイバッファー中の１．３μＭヒトＦｐｎと３０ｎＭ ＴＭＲ−ヘプシジンの混合物を、３８４ウェルの黒色低容量丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３６７７）にウェルあたり１６μｌで載置する。試験化合物の連続希釈液８μｌを２回反復実験で添加して、それぞれ１μＭおよび２０ｎＭの最終ＦｐｎおよびＴＭＲ−ヘプシジン濃度を達成する。プレートを室温で９０分間インキュベートし、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１蛍光リーダー（ＢｉｏＴｅｋ）で平行（Ｓ）および垂直（Ｐ）蛍光を測定する。ＦＰ値は、次の式に従ってｍＰで計算される。
Figure 2020516620
ＩＣ５０値は、ヘプシジンインターナリゼーションアッセイについて説明したように計算されたｍＰ値で決定され、表２に記載されている。このアッセイでの非標識ヘプシジンのＩＣ５０は０．３７±０．０６７μＭである。
表２：生物物理学的ヘプシジン−フェロポーチン結合アッセイで試験したＦｐｎ阻害剤の平均（ＡＶＥ）ＩＣ５０データを複数の測定について示す。
Figure 2020516620
３．鉄応答アッセイにおけるフェロポーチン媒介鉄輸出活性の阻害
このアッセイにおいて、細胞内鉄濃度は、ヒトフェリチンプロモーターおよびフェリチンｍＲＮＡの５’非翻訳領域内に含まれる関連鉄調節エレメント（ＩＲＥ）に融合したβラクタマーゼ（ＢＬＡ）レポーター遺伝子の活性をモニターすることにより間接的に測定される。そのような細胞株におけるフェロポーチン（Ｆｐｎ）の発現は、レポーター遺伝子のより低い活性によって反映されるように、鉄流出およびより低い鉄濃度をもたらす。一方、Ｆｐｎ媒介鉄流出の阻害は、レポーター遺伝子活性の増大として検出される細胞内鉄濃度の上昇をもたらす。低分子量Ｆｐｎ阻害剤化合物は、以下で説明するように、このインビトロ鉄応答アッセイで用量依存効果について試験される。
ＨＥＫ−２９３細胞株＃３５４は、（ｉ）ドキシサイクリン誘導性ｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ−ＢＩプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３１０６８）の誘導体に挿入されたヒトＦｐｎ−ＧＦＰ融合構築物および（ｉｉ）ヒトフェリチンプロモーター−ＢＬＡレポーター遺伝子のＨＥＫ−２９３ Ｔｅｔ−ＯＮ Ａｄｖａｎｃｅｄ細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）への安定した組み込みによって生成される。フェリチン−ＢＬＡレポーター遺伝子構築物を生成するために、
ヒトフェリチンＨプロモーターの１．４ｋｂ断片をヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅し（フォワードプライマー５’−ＣＡＧＧＴＴＴＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＴＧＡＡ−３’；リバースプライマー５’−ＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＡＡＧＧＡＧＡＧＧ−３’）、ｐｃＤＮＡ（商標）６．２／ｃＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ（商標）−ＤＥＳＴプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２５７８−０４３）に存在するＢＬＡ遺伝子の前に挿入して、元のＣＭＶプロモーターを置き換え、約１７０ｂｐのフェリチン遺伝子の翻訳を調節するＩＲＥをレポーター遺伝子の開始コドンの上流に配置する。＃３５４細胞を約８０％コンフルエントな培養から回収し、１０％ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３１１０６）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０６８７−０１０）、ブラスチシジン５μｇ／ｍｌ、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ２１０−０１）、４μｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３１３１１）、３８４ウェルＰＤＬコーティングプレートのウェルあたり５０μｌを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１３３１−０２８）に１．８ｘ１０５細胞／ｍｌで播種し、５％ＣＯ２、３７℃で成長させる。一晩のインキュベーション後、１０μｌ／ウェルの希釈系列の試験化合物を４回反復実験で加え、プレートを５％ＣＯ２、３７℃で一晩更にインキュベートする。細胞をＨＢＳＳで３回洗浄し、ウェルあたり２５μｌ残す。５μｌ／ウェルのＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ試薬ＣＣＦ４−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ１０８５）を細胞に添加することにより、ＢＬＡ活性が検出された。プレートを暗所において１８℃で６０分間インキュベートした後、青色および緑色の蛍光シグナルをＳａｆｉｒｅ２蛍光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）で測定したところ、４１０ｎｍで励起し、４５８ｎｍ（青）および５２２ｎｍ（緑）で発光した。ＢＬＡ活性の尺度としての青色／緑色蛍光の比が計算され、ヘプシジンインターナリゼーションアッセイについて記載されているように、計算された青色／緑色蛍光比を用いてＥＣ５０値が決定される。試験したＦｐｎ阻害剤のＥＣ５０データを表３に示す。このアッセイ
でのヘプシジンのＥＣ５０は０．０９６±０．０６３μＭ（ｎ＝３７）である。
表３：鉄応答アッセイで試験したＦｐｎ阻害剤の平均（ＡＶＥ）ＥＣ５０データを複数の測定について示す。
Figure 2020516620
４．フェロポーチンのインターナリゼーションおよび分解アッセイ
ＨＥＫ−２９３細胞株＃３５４（実施例３に記載）を使用して、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によりフェロポーチン（Ｆｐｎ）のインターナリゼーションおよび分解を誘導する化合物の能力を測定する。ドキシサイクリン含有培地でＨＥＫ−２９３＃３５４細胞を増殖させると、細胞表面でヒトＦｐｎ−ＧＦＰ融合タンパク質の発現が誘導される。１０回の独立した実験からのデータは、４μｇ／ｍｌドキシサイクリンの存在下で４８時間ＨＥＫ＃３５４細胞を培養すると、平均４２．６％±６．４％Ｆｐｎ−ＧＦＰ陽性細胞が誘導されることを示している。以下に説明するように、低分子量Ｆｐｎ阻害剤化合物は、ＨＥＫ−２９３細胞株＃３５４のＦｐｎ−ＧＦＰ平均蛍光強度（ＭＦＩ）に対する用量依存効果について試験される。
ＨＥＫ＃３５４細胞を約８０％コンフルエントな培養物から回収し、１０％ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３１１０６）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５１４０−１２２）、２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０６８７−０１０）、ブラスチシジン５μｇ／ｍｌ、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ２１０−０１）、４μｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３１３１１）、３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ； カタログ番号７８１０９１）のウェルあたり５０μｌを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１３３１−０２８）に、０．６ｘ１０６細胞／ｍｌで播種し、５％ＣＯ２、３７℃で成長させる。一晩のインキュベーション後、１０μｌ／ウェルの希釈系列の試験化合物を４回反復実験で加え、プレートを５％ＣＯ２、３７℃で一晩更にインキュベートする。細胞をＦＡＣＳバッファー（１％ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）で１回洗浄し、０．５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ４８６４）を含むＦＡＣＳバッファーで回収し、ハイスループットサンプラーを装備したフローサイトメーター（ＣＡＮＴＯｔｍＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。生存ＨＥＫ＃３５４細胞は、ヨウ化プロピジウム陰性集団としてゲートし、Ｆｐｎ−ＧＦＰの発現について分析する。ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ’ｓ、Ｏｒｅｇｏｎ）を使用して、各化合物希釈の２０００以上の生細胞のＦｐｎ−ＧＦＰのＭＦＩを計算し、Ｆｐｎ−ＧＦＰのインターナリゼーションおよび分解を誘導するＦｐｎ阻害剤の効力をヘプシジンインターナリゼーションアッセイの説明に従って計算する。ＦＡＣＳによるフェロポーチンのインターナリゼーションおよび分解アッセイで試験されたＦｐｎ阻害剤のＥＣ５０データを表４に示す。このアッセイでのヘプシジンの平均ＥＣ５０値は０．００４±０．００２μＭである。
表４：複数の測定で示されたフェロポーチンのインターナリゼーションおよび分解アッセイで試験されたＦｐｎ阻害剤の平均（ＡＶＥ）ＥＣ５０データ。
Figure 2020516620
５．フェロポーチンのユビキチン化および分解
フェロポーチン（Ｆｐｎ）を発現している細胞のヘプシジンへの曝露は、ユビキチン化とそれに続くＦｐｎのインターナリゼーションおよび分解を引き起こすことが知られている（Ｑｉａｏ，２０１２）。Ｆｐｎユビキチン化および分解を誘導するＦｐｎ阻害剤の可能性は、鉄で処理するとＦｐｎを発現するＪ７７４マウスマクロファージ細胞株を使用した免疫沈降アッセイで調べられる。
Ｊ７７４細胞（ＤＳＭＺ、カタログ番号ＡＣＣ１７０）を１５ｍｌの培地（ＤＭＥＭ Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１９７１−０２５、１０％熱不活性化ＦＢＳ Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１０５００−０６４、１％ペニシリン−ストレプトマイシンＧｉｂｃｏ カタログ番号１５１４０−１２２）２００μＭ Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＮＴＡを１０ｃｍの組織培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ カタログ番号６６４１６０）に０．８ｘ１０６細胞／ｍｌで播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩成長させる。細胞を合成ヒトヘプシジン（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｈ−５９２６）またはＦｐｎ阻害剤化合物と１０分間または１２０分間インキュベートする。細胞を洗浄し、ユビキチン化タンパク質を安定化するために、１Ｘ ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８４２９）および１０ｍＭヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ６１２５）を含む氷冷溶解バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ、カタログ番号８７７８７）で溶解する。免疫沈降は、製造元のプロトコルに従って、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｌａｓｓｉｃ ＩＰ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２６１４６）を使用して行われる。簡単に言うと、１．２５ｍｌ ＩＰ溶解バッファー中の２ｍｇのタンパク質を、対照アガロースビーズと４℃で１時間混合することによりインキュベートし、溶解物を前もって除去し、非特異的シグナルを低減する。次に、未結合の溶解物を、マウスＦｐｎアミノ酸２２４−３０８のＧＳＴ融合タンパク質に対して生成したアフィニティ精製抗Ｆｐｎ抗体Ｆ３０８の反応あたり１２μｇで一晩インキュベートする。免疫複合体は、反応ごとに１４μｌの沈降Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ＰｌｕｓＡｇａｒｏｓｅビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２０４２３）をピペッティングすることにより捕捉し、スラリーを４℃で１．５時間、穏やかに転倒混和しながらインキュベートする。ビーズを洗浄し、ＤＴＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＮＰ０００９）を含む７５μｌ ＳＤＳ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＮＰ０００７）で免疫複合体を直接溶出する。
免疫沈降後、ウサギ抗マウスＭＴＰ１抗血清（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号ＭＴＰ１１−Ａ）およびマウス抗モノおよびポリユビキチン化コンジュゲートモノクローナル抗体（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＢＭＬ−ＰＷ８８１０）を使用したウエスタンブロット法によりサンプルを分析して、フェロポーチンおよびユビキチンそれぞれを検出する。マウスモノクローナル抗ウサギＩｇＧ軽鎖（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９９６９７）および抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ６７８９）ＨＲＰコンジュゲートを二次抗体として使用する。
１１種類のＦｐｎ阻害剤をこのアッセイで試験し、ヘプシジンと比較した。図１０および表５に示すように、Ｆｐｎ阻害剤による細胞の処理は、１０分以内の急速なユビキチン化（図１０上パネル）と２時間後のＦｐｎの分解（図１０の下パネル）につながる。Ｆｐｎ阻害剤によるＦｐｎ分解の程度は、ヘプシジンの効果に匹敵した。ただし、ヘプシジン治療はＦｐｎ阻害剤治療と比較して高分子量のユビキチン化Ｆｐｎをもたらし、これは、ヘプシジンおよびＦｐｎ阻害剤それぞれによるポリユビキチン化およびモノユビキチン化を示唆している。
表５：Ｆｐｎユビキチン化および分解アッセイで試験したＦｐｎ阻害剤の概要。Ｆｐｎ分解およびＦｐｎユビキチン化に対するＦｐｎ阻害剤による治療の効果は、ウエスタンブロットの目視検査によって記録された（＋ヘプシジンに匹敵；−効果なし；＋／−中間効果）。
Figure 2020516620
図１０：Ｆｐｎ阻害剤は、マウスマクロファージ細胞株で発現したＦｐｎのユビキチン化および分解を引き起こすＪ７７４細胞をＦｅ（ＩＩＩ）−ＮＴＡとともに一晩インキュベートして、Ｆｐｎの発現を誘導した。次いで、細胞を、ヘプシジンインターナリゼーションアッセイ（表１を参照）で決定されるように、ヘプシジン（ヘプシジン、１５０ｎＭ）またはＦｐｎ阻害剤である例示化合物Ｎｏ．２０８（２１０ｎＭ）、例示化合物Ｎｏ．１６７（１．５μＭ）、例示化合物Ｎｏ．１２７（１２０ｎＭ）、例示化合物Ｎｏ．１５２（４０ｎＭ）の約１０倍のＩＣ５０濃度で１０または１２０分間処理し、回収または抗Ｆｐｎ抗体Ｆ３０８で免疫沈降した。模擬処理された細胞は、１２０分後に収集された（対照）。
抗Ｆｐｎ抗体ＭＴＰ１を用いた免疫沈降物の免疫ブロットにより、ヘプシジンで処理したサンプルと同程度に、Ｆｐｎ阻害剤で処理してから１２０分後にフェロポーチンが消失することが明らかになった（上パネル）。Ｆｐｎの急速なユビキチン化が、細胞をＦｐｎ阻害剤とヘプシジンで処理した１０分後に観察された。タンパク質の分子量標準は、ｋＤで左に示される。
６．フェロポーチン阻害剤による鉄流出の阻害
フェロポーチンを介した鉄の輸出を遮断する能力に関するヘプシジンおよびフェロポーチン阻害剤化合物の活性は、以下に説明するようにＴ４７Ｄ細胞（ＥＣＡＣＣ、カタログ番号８５１０２２０１）で試験される。
細胞を３５００００細胞／ウェルを含む２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６６２１６０）に播種し、増殖培地を含むＬ−アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号７９５４３７）５００μＭ中の１００μＭ ５８Ｆｅ（５８Ｆｅ（ＩＩ）−硫酸塩、Ｖｉｆｏｒ Ｐｈａｒｍａ Ｂａｔｃｈ Ｎｏ．ＲＯＲ３０８５）とともに、一晩インキュベートする。５００μｌの鉄取り込みバッファー（ＩＵＢ、ＰＩＰＥＳ ４０ｍＭ、カタログ番号Ｐ１８５１、グルコース一水和物１０ｍＭ、カタログ番号４９１５８、塩化ナトリウム２６０ｍＭ、カタログ番号７１３７９、塩化カリウム２０ｍＭ、カタログ番号Ｐ９５４１、硫酸マグネシウム２ｍＭ、カタログ番号６３１３８、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で細胞を１回洗浄し、その後、除去バッファーで１回（２分間のインキュベーション、ＩＵＢ中ＢＰＤＳ １００μＭ、カタログ番号１１８９０およびＮａ２Ｓ２Ｏ４ ５００μＭ、カタログ番号１５７９５３、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、再度ＩＵＢで２回洗浄する。ヘプディシン（Ｂａｃｈｅｍ）またはフェロポーチン阻害剤の連続希釈液（４μＭ〜０．００６４μＭ、５倍希釈）をウェルあたり０．６ｍｌの総容量で加える。細胞を５％ＣＯ２、３７℃で２０時間インキュベートする。上清を収集し、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｌｅｍｅｎｔ２）を使用して５８Ｆｅを測定した。タンパク質濃度測定のためにペレットを回収する。結果は、細胞溶解物中のタンパク質ｍｇあたりの上清中のｎｇ ５８Ｆｅとしてプロットされている。例示化合物Ｎｏ．１２７は、内因性Ｆｐｎリガンドヘプシジンと同様の効力で鉄流出を阻害した（図１１）。
図１１：ヘプシジンの代表的な鉄流出阻害（ＩＣ５０：０．０８６μＭ）および例示化合物Ｎｏ．１２７（ＩＣ５０：０．０８０μＭ）。
７．ナイーブマウスの低鉄血症
野生型（ＷＴ）ナイーブマウスに合成ヘプシジンを注射すると、血清鉄濃度が低下し（ビヒクル対照から４０−５０％）、治療後３〜４時間で最大の効果が得られる（Ｒｉｖｅｒａ，２００５；図１２Ａ）。このデータは、注入されたヘプシジンが結合し、十二指腸の腸細胞および脾細胞のフェロポーチン（Ｆｐｎ）のインターナリゼーションを引き起こし、血清鉄の急速な低下を引き起こすことを示唆している。同様に、経口投与された低分子量Ｆｐｎ阻害剤は、用量依存的にＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清鉄濃度を低下させ、ヘプシジンに匹敵する効果を発揮する。このデータは、インビボでＦｐｎ阻害剤の急性効果を試験するためのシンプルで信頼できるモデルとしてのＷＴマウスの使用を検証した。
９週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）に標準飼料（Ｈａｒｌａｎ Ｐｒｏｖｉｍｉ Ｋｌｉｂａ ３４３６）を与え、１０ｍｌ／ｋｇ体重の容量で化合物または対応する量のビヒクルを経口（ｐ．ｏ．）投与する。Ｆｐｎ阻害剤は、０．５％メチルセルロース／水または２０％クレモホールＥＬ／水で製剤化し、１０、３０または１００ｍｇ／ｋｇ体重のマウスに経口投与する。３時間後、マウスをイソフルランチャンバーで死亡直前まで麻酔し、眼窩後部の出血により血液を採取する。マウスを頸椎脱臼により屠殺し、脾臓、肝臓、十二指腸を採取し、バイオマーカー分析に使用した。すべての実験は、担当獣医当局によって承認されたライセンスに従って実施される。血清は、血液をゲル含有マイクロテイナーに遠心分離することによって分離され、血清鉄は、ＭＵＬＴＩＧＥＮＴ Ｉｒｏｎアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、６Ｋ９５）によって決定する。群ごとに８匹のマウスを使用し、ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析を実行して、実験群間の統計的差異を分析する。ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける選択されたＦｐｎ阻害剤の有効性を表６に示す。
図１２：例示化合物９４（例示化合物Ｎｏ．９４）によるヘプシジンおよびフェロポーチン阻害剤により誘導される血清鉄減少。
Ａ．指示された時間、合成ヘプシジン（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射したナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの血清鉄の動態。＊−＊＊＊−は、ＰＢＳ処理マウスと比較して、統計的に有意な血清鉄の減少を示す。
Ｂ．指示量のヘプシジン（ｉ．ｐ．）または例示化合物９４（例示化合物Ｎｏ．９４）のいずれか（ｐ．ｏ．）で３時間処理したナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスの血清鉄濃度。
表６：ナイーブマウス低鉄血症モデルで試験したＦｐｎ阻害剤の有効性。
１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇのナイーブＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに経口投与した、選択されたフェロポーチン阻害剤によって誘導される血清鉄の減少。Ｆｐｎ阻害剤を投与した動物の血清鉄値の平均値をビヒクル処理動物の血清鉄値から差し引くことにより、投与後３時間での相対的な血清鉄減少を計算した。次いで、ビヒクル処理群と化合物処理群との間の平均血清鉄値の差を、ビヒクル対照群の血清鉄の平均で除算し、パーセントとして列挙した。
Figure 2020516620
８．貧血ラットにおける鉄吸収の予防
鉄吸収を遮断するフェロポーチン（Ｆｐｎ）阻害剤のインビボでの効果を評価するために、貧血ラットモデルで一連のＦｐｎ阻害剤を鉄吸収について試験する。Ｗｉｓｔａｒラット（３〜４週齢、ｎ＝５、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ）には、Ｆｐｎ阻害剤化合物を投与する前に、ヘモグロビン（Ｈｂ）値が投与の１日前に７〜８ｇ／ｄｌに達するまで、低鉄飼料（Ｐｒｏｖｉｍｉ−Ｋｌｉｂａ、カタログ番号２０３９）を与える。０．５ｍｇ／ｋｇの硫酸第一鉄を経口投与する１時間前に、メチルセルロースまたはクレモホールで製剤化した試験化合物を経口投与する。鉄の投与の１時間前（−１ｈ）、Ｆｐｎ阻害剤の投与直後（０ｈ）および試験化合物の投与の１時間後（１ｈ）、３時間後（３ｈ）、時には最大６時間後（６ｈ）に、尾静脈穿刺により血液サンプルを採取する。血清鉄濃度を測定し（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号６Ｋ９５）、鉄吸収の遮断におけるＦｐｎ阻害剤の有効性の尺度として、試験化合物投与後３時間の血清鉄上昇の抑制を計算する（表７）。図４に示すように、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇでのＦｐｎ阻害剤例示化合物Ｎｏ．５５の経口投与は、鉄投与前のビヒクル対照動物の血清鉄濃度と比較した場合、鉄投与後３時間で血清鉄濃度をそれぞれ５４％、７２％および８９％減少させ、鉄の投与を受けなかったビヒクル処置動物のベースライン血清鉄濃度について補正した。
表７：鉄吸収の阻害についてラット貧血モデルで試験したＦｐｎ阻害剤。鉄投与前にビヒクルで処理した対照群と比較して、経口鉄の投与を受けなかった対照群の平均ベースライン血清鉄濃度について補正した、血清鉄濃度の相対阻害値（％）を示す。示された用量のＦｐｎ阻害剤で治療された群（ｎ＝５）の平均値を示す。化合物処理群とビヒクル処理群の間に観察された統計的に有意な（ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析）差が示される（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。
Figure 2020516620
９．β２−ミクログロブリン欠損マウスにおける高鉄血症の是正
ヘプシジン（Ｈａｍｐ１）、ヘモクロマトーシスタンパク質（ＨＦＥ）、ヘモジュベリン（ＨＪＶ）およびトランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）などの全身性鉄貯蔵の感知に関与する遺伝子の突然変異は、マウスおよび男性に鉄過剰を引き起こす。肝細胞上のＨＦＥ、ＨＪＶおよびＴＦＲ２分子は、適切なヘプシジン産生のシグナル伝達に必要であり、その欠乏は病態生理学的に低いヘプシジンレベルおよび過剰な鉄吸収をもたらす。ＨＦＥ突然変異は、白人成人における遺伝性ヘモクロマトーシス（ＨＨ）の最も頻繁な原因である。ＨＦＥは、β２−ミクログロブリンと結合し、骨形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）経路を介してヘプシジン転写調節に関与するＭＨＣクラスＩ様膜分子である。ＨＦＥ−／−マウスはヘプシジンレベルを低下させ、高鉄血症および高肝臓鉄濃度を発症しているため、ヒトの鉄過剰を研究するのに適した動物モデルとなっている（Ｚｈｏｕ，１９９８）。β２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ−／−）が欠損したマウスは、ＨＦＥの細胞表面発現と機能にβ２ミクログロブリンが必要であるため、ＨＦＥ−／−動物と同様に高鉄血症とヘモクロマトーシスを発症する（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｖｏｌａｎｄ，１９９６）。ＨＦＥ−／−マウスは利用できないため、ｂ２ｍ−／−マウスは鉄過剰のモデルとして使用される。パイロット研究では、ＨＦＥ−／−およびｂ２ｍ−／−マウスに同様の鉄代謝関連パラメータがあることが確認された。
雌性および雄性のホモ接合ｂ２ｍ−／−マウスは、６〜７週齢でＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｂ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ、ストック番号：００２０８７）から供給され、標準飼料（Ｈａｒｌａｎ Ｐｒｏｖｉｍｉ Ｋｌｉｂａ ３４３６）を自由に摂取できる。年齢と性別が一致したＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから提供されている。鉄過剰におけるフェロポーチン（Ｆｐｎ）阻害剤の急性効果を研究するため、ｂ２ｍ−／−マウスを化合物または対応する量の１０ｍｌ／ｋｇ体重の体積のビヒクルで処理する。Ｆｐｎ阻害剤化合物は、０．５％メチルセルロース／水または２０％クレモホールＥＬ／水で製剤化され、５０ｍｇ／ｋｇ体重のマウスに経口投与される。ＷＴ対照はビヒクルのみを摂取した。３時間後、マウスをイソフルランチャンバーで死亡直前まで麻酔し、眼窩後部の出血により血液を採取する。マウスを頸椎脱臼により屠殺し、脾臓、肝臓、十二指腸を採取し、バイオマーカー分析に使用する。すべての実験は、担当獣医当局によって承認されたライセンスに従って実施される。血液をゲル含有マイクロテイナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に遠心分離することによって血清を分離し、ＭＵＬＴＩＧＥＮＴ Ｉｒｏｎアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号６Ｋ９５）により血清鉄を測定する。群ごとに４〜９匹のマウスを使用し、ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析を適用して、実験群間の統計的差異を分析する。
Ｆｐｎ阻害剤の効果を調べるため、鉄過剰ｂ２ｍ−／−マウスまたはＷＴ対照の条件での例示化合物Ｎｏ．４０および例示化合物Ｎｏ．９４にＦｐｎ阻害剤またはビヒクルを３時間投与した。遺伝的欠損のため、ビヒクルで処理したｂ２ｍ−／−マウスは、ＷＴマウスと比較して有意に高い血清鉄濃度を示した（図１３、Ａで６０μＭ、Ｂで５６μＭの群平均）。例示化合物Ｎｏ．４０または例示化合物Ｎｏ．９４を５０ｍｇ／ｋｇで３時間ｂ２ｍ−／−マウスを処理すると、血清鉄の上昇がＷＴ対照で観察されるレベルに是正された。これらのデータは、疾患関連モデルにおける低分子量フェロポーチン阻害剤の急性効果を実証した。表８に要約されているように、更なる試験で血清鉄の是正が観察された。
図１３ フェロポーチン阻害剤である例示化合物Ｎｏ．４０／メチルセルロース（Ａ．）および例示化合物Ｎｏ．９４／クレモホールＥＬ（Ｂ．）での３時間の処理によるｂ２ｍ−／−マウスの血清鉄濃度上昇の完全な是正。
表８：血清鉄濃度の上昇を低下させるためにβ２ミクログロブリン欠損マウスモデルで試験されたＦｐｎ阻害剤。
示された用量のＦｐｎ阻害剤をβ２−ミクログロブリン欠損マウスに経口投与してから１（＃）または３（＃＃）時間後に血液を採取し、血清鉄濃度を測定する。血清鉄濃度の相対的な減少（％）が示されており、これはＦｐｎ阻害剤を投与した動物の血清鉄値の平均値を、溶媒で処理した動物の血清鉄値から差し引くことで計算された。次いで、ビヒクル処理群と化合物処理群との間の平均血清鉄値の差を、ビヒクル対照群の血清鉄の平均で除算し、パーセントとして列挙した。雌性（♀）と雄性（♂）の動物については、性別による顕著な効力の違いが認められたため、値は別々に記載されている。化合物処理群とビヒクル処理群の間に観察された統計的に有意な（ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析）差が示される（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。
Figure 2020516620
１０．β２−ミクログロブリン欠損マウスにおける鉄過剰の予防
ヘプシジンレベルが低下し、標準飼料を摂取した腸内β２ミクログロブリン欠損（ｂ２ｍ−／−）マウスの鉄吸収が増加した結果、肝臓、心臓、膵臓に過剰量の鉄が蓄積する。パイロット研究では、ｂ２ｍ−／−の肝臓鉄負荷が３〜４週齢で始まり、肝臓鉄濃度が６週齢で野生型（ＷＴ）マウスの肝臓鉄含有量の最大４倍に達することが示された。更に、離乳直後に３週齢のｂ２ｍ−／−マウスに低鉄分（ＬＩＤ）の飼料を与えると、６〜７週齢までに肝臓の鉄の負荷が防止される。ｂ２ｍ−／−マウスの肝臓鉄蓄積を防ぐためのＦｐｎ阻害剤の有効性が調査されている。ＬＩＤを与えられた３週齢のｂ２−／−マウスにＦｐｎ阻害剤またはビヒクル（メチルセルロース；１０ｍｌ／ｋｇ）を投与する。マウスは、１ｍＭ ５８Ｆｅ（ＩＩ）−硫酸塩と１０ｍＭアスコルビン酸を補充した飲料水を利用できる。Ｆｐｎ阻害剤またはビヒクルの投与とそれに続く鉄含有水への曝露を１４日間繰り返す。マウスを安楽死させ、肝臓と脾臓の鉄含有量をＩＣＰ−ＯＥＳ（すべての鉄同位体）で分析し、肝臓組織の５８Ｆｅ濃度（ＩＣＰ−ＭＳ）も分析する。表９に要約したデータは、２週間のＦｐｎ阻害剤の経口投与により、ｂ２ｍ−／−マウスの肝臓鉄負荷が防止され、脾臓鉄濃度が増加したことを例証する。これは、腸と脾臓の両方でフェロポーチンが阻害されることを示している。
これらのデータは、低分子量フェロポーチン阻害剤がｂ２−／−マウスの肝臓鉄負荷を予防する効果を実証し、疾患関連モデルの概念実証を提供する。
表９ 肝臓の鉄過剰の阻害について、β２ミクログロブリン欠損マウスモデルで試験されたＦｐｎ阻害剤。
肝臓および脾臓を、示された用量のＦｐｎ阻害剤によるβ２ミクログロブリン欠損マウスの１４日間の治療（ｐ．ｏ．；ｂ．ｉ．ｄ）後に収集する。肝臓および脾臓組織の総鉄濃度はＩＣＰ−ＯＥＳを使用して測定され、５８Ｆｅ肝臓濃度はＩＣＰ−ＭＳで測定される。組織鉄濃度の相対変化（％）は、Ｆｐｎ阻害剤を投与した動物の組織鉄値の平均と、ビヒクル対照の平均を用いたビヒクル処理動物の組織鉄値との差を正規化することによって計算される。雌性（♀）と雄性（♂）の動物については、性別による顕著な効力の違いが認められたため、値は別々に記載されている。化合物処理群とビヒクル処理群の間に観察された統計的に有意な（ボンフェローニ事後検定を用いる二元配置分散分析）差が示される（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。ｎｄ：未決定；ｎａ：利用不可。
Figure 2020516620
１１．中間型β−サラセミアのマウスモデルにおける貧血、無効赤血球生成および鉄過剰の改善
β−サラセミアは、ヘモグロビンのβ−グロビン遺伝子の突然変異によって引き起こされる遺伝性貧血であり、寿命が短くなる異常な赤血球が生じる。最も重篤な形態である重症型サラセミアは、輸血を必要とし、その結果、二次的な鉄過剰が生じる。中間型サラセミアの患者は、中程度の輸血非依存性貧血を持っているが、無効赤血球生成とヘプシジン産生の慢性的抑制のために鉄過剰が進行する。
前の例で示したように、ヘプシジンと同様に、経口フェロポーチン（Ｆｐｎ）阻害剤は、フェロポーチンにより媒介されるインビトロでの細胞からの鉄の輸出を遮断し、野生型マウスへの投与時に血清鉄を一時的に減少させた。これらの発見と公表された研究に基づいて（Ｓｃｈｍｉｄｔ ＰＪ，ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ２０１３，Ｇｕｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ，ＪＣＩ，２０１３およびＣａｓｕ Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１６）、Ｆｐｎ阻害剤は、鉄負荷を防ぐ能力に関して検討されており、老化赤血球からの鉄の吸収と再利用を制限することにより、中間型サラセミアの赤血球生成を改善する。Ｆｐｎ阻害剤の有効性は、輸血非依存性βサラセミアのマウスモデルを使用して調査される。β１およびβ２グロビン遺伝子のヘテロ接合体欠失マウス（Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスと呼ばれる）は、輸血非依存性貧血、無効赤血球生成、脾腫、ならびに脾臓、肝臓および腎臓の二次鉄過剰を発症する。ヘテロ接合Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂ６；１２９Ｐ−Ｈｂｂ−ｂ１ｔｍ１Ｕｎｃ Ｈｂｂ−ｂ２ｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ、ストック番号：００２６８３）から８〜１８週齢で供給され、実験中、低鉄飼料（Ｈａｒｌａｎ Ｐｒｏｖｉｍｉ Ｋｌｉｂａ ２０３９，１３．４ｐｐｍ Ｆｅ）を自由に与えられる。Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスに、２０または６０ｍｇ／ｋｇの化合物またはビヒクルとしてメチルセルロース（１０ｍｌ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２７４４２９）のいずれかを１日２回投与する。両方の投与間で、マウスは、１ｍＭ ５８Ｆｅ（ＩＩ）−硫酸塩（Ｖｉｆｏｒ Ｐｈａｒｍａ、バッチ番号ＲＯＲ ３０９６）および１０ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７９５４３７）を６時間補充した飲料水を利用できる。飲料水に供給される５８Ｆｅ（ＩＩ）−Ｓｕｌｆａｔｅの濃度は、鉄含有量が２５０ｐｐｍの標準的なげっ歯類用飼料の摂取を置き換えるために調整される。５８Ｆｅ（ＩＩ）−硫酸塩およびアスコルビン酸を含まない水は、残りの１８時間提供される。個々の実験では、Ｆｐｎ阻害剤またはビヒクルの投与とそれに続く鉄含有水への曝露を２０〜４６日間繰り返す。
野生型およびｂ２ｍ−／−マウスで以前に示されたように、Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスに３時間投与されたＦｐｎ阻害剤は、このマウス系統でも血清鉄濃度を効率的に低下させ（表１０）、これらの小分子が鉄制限を引き起こす能力を実証する。
Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスは、７０〜８０ｇ／Ｌの範囲のヘモグロビン濃度で貧血である。Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスでの２週間のＦｐｎ阻害剤の経口投与は、ビヒクルで処理したマウスと比較してヘモグロビン濃度を大幅に増加させる（表１０）。ビヒクル処理群と比較した化合物投与群のヘモグロビン濃度の変化は、研究終了までに１９〜２２ｇ／Ｌに達する。追加の血液学的パラメータは、自動血液細胞分析装置を使用して最終血液で測定する。Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスをＦｐｎ阻害剤で処理すると、赤血球数、ヘマトクリットが増加し、網状赤血球濃度と赤血球分布幅（ＲＤＷ）が減少し、赤血球生成が改善されたことが示される。更に、Ｆｐｎ阻害剤を投与されたＨｂｂ ｔｈ３／＋マウスは、ビヒクル群と比較して血液中の白血球数が大幅に少なく、疾患モデルの病理学的に変更されたパラメータの是正におけるＦｐｎ阻害剤の有益な効果を更に示している。したがって、Ｆｐｎ阻害剤は、中間型サラセミアのマウスモデルで有意に貧血を改善し、血液組成を是正する。
Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスの無効赤血球生成は、脾臓の赤血球前駆体の過剰な増殖を引き起こし、脾腫を引き起こす。Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスをＦｐｎ阻害剤で処理すると、脾臓重量が大幅に減少するため、脾腫を回復させるＦｐｎ阻害剤の可能性が強調される（表１０）。
赤血球生成に対するＦｐｎ阻害剤の効果は、フローサイトメトリーならびにＴｅｒ１１９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１７−５９２１）およびＣＤ４４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０３０２８）マーカーを使用して、骨髄および脾臓の赤血球前駆体の分化の割合を分析することによって検討する。Ｆｐｎ阻害剤で処理されたＨｂｂ ｔｈ３／＋マウスから単離された骨髄または脾臓細胞には、ビヒクルで処理されたＨｂｂ ｔｈ３／＋マウスと比較して、初期赤血球前駆体の前赤芽球、好塩基球および多色性赤芽球の割合が大幅に減少し、成熟赤血球の割合が増加している（表１０）。これらのデータは、Ｆｐｎ阻害剤がＨｂｂ ｔｈ３／＋マウスの無効赤血球生成を改善し、血液の血液学的パラメータの改善と一致していることを示している。
Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスおよびサラセミア患者の血清エリスロポエチン濃度は、貧血、低酸素症、および無効赤血球生成に対するフィードバック反応により上方制御される（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．ＪＣＩ，２０１３）。Ｆｐｎ阻害剤で処理したＨｂｂ ｔｈ３／＋マウスは、おそらくは部分的に是正された貧血と改善された赤血球生成の結果として、ビヒクル群と比較して血清エリスロポエチン（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ９５９）を大幅に減少させる（表１０）。
Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスのエリスロポエチン濃度の上昇は、ヘプシジンを抑制することが知られている赤血球調節ホルモンであるエリスロフェロンの過剰発現を誘発する（Ｋａｕｔｚ Ｌ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１４）。血清エリスロポエチンの減少と一致して、Ｆｐｎ阻害剤で処理したＨｂｂ ｔｈ３／＋マウスの脾臓では、ビヒクルのみで投与したものと比較して、エリスロフェロンｍＲＮＡ発現が有意に減少した（表１０）。エリスロフェロンは、髄外赤血球生成の結果として、Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスの脾臓で大量に増殖する赤血球前駆体によって産生される。したがって、脾臓におけるエリスロフェロン発現に対するＦｐｎ阻害剤の効果は、赤血球生成の改善によって媒介される。
サラセミア患者の赤血球生成が不十分で慢性的にヘプシジン濃度が低いために鉄の需要が増加すると、肝細胞癌や心不全などの臓器鉄負荷および関連する病的状態が引き起こされる（Ｒｉｖｅｌｌａ Ｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２０１５）。Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスは、肝臓、脾臓および腎臓の高鉄含有量と比較してヘプシジンレベルが不十分なため、過剰な量の鉄を吸収し、十二指腸でのフェロポーチンの発現を増加させる（Ｇａｒｄｅｎｇｈｉ Ｓ．，Ｂｌｏｏｄ，２００７）。ビヒクルまたはＦｐｎ阻害剤のいずれかで処理したＨｂｂ ｔｈ３／＋マウスの臓器の総肝臓鉄および５８Ｆｅ含有量は、それぞれ誘導結合プラズマ発光分析（ＩＣＰ−ＯＥＳ）および誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）によって分析される。Ｆｐｎ阻害剤を投与したＨｂｂ ｔｈ３／＋マウスの肝臓および脾臓の５８Ｆｅ濃度は、ビヒクルで処理したマウスの濃度と比較して有意に低く、Ｆｐｎ阻害剤が臓器鉄の蓄積を防ぐことを示している（表１０）。
Ｆｐｎ阻害剤は全身的に利用可能であるため、十二指腸、脾臓、肝臓を含むすべてのフェロポーチン発現組織で鉄の輸出を遮断することができる。したがって、Ｆｐｎ阻害剤は十二指腸からの鉄の吸収を防ぐことが期待されているが、肝臓と脾臓の既存の鉄を除去することはできなかった。実際、Ｆｐｎ阻害剤またはビヒクルで処理したマウスの総肝臓鉄は変化しないままである（示さず）。重要なことに、Ｆｐｎ阻害剤は、Ｈｂｂ ｔｈ３／＋マウスの脾臓および肝臓の５８Ｆｅ濃度を大幅に低下させ、これらの小分子が鉄負荷を防ぐ能力を示している。
更に、蛍光指示薬ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ６８２７）を使用して、骨髄細胞で活性酸素種（ＲＯＳ）が検出される。フローサイトメトリー分析により、Ｆｐｎ阻害剤は、ビヒクルで処理したＨｂｂ ｔｈ３／＋マウスと比較して、成熟赤血球細胞のＲＯＳを大幅に減少させることが示されている（表１０）。
これらのデータは、経口投与された低分子量フェロポーチン阻害剤の貧血および無効赤血球生成の改善、ならびに脾腫の減少およびβ−中間型サラセミアの疾患モデルにおける更なる肝臓および脾臓鉄負荷の予防における疾患修飾能力を示している。
Figure 2020516620
１２．マウスモデルにおける鎌状赤血球貧血の治療における の決定
Ｙｕｌｉｎ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．ｉｎ “ＭＥＫ１／２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ａｃｕｔｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ｄｉｓｅａｓｅ”；Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．３，ｐｐ１１７１−１１８６，２０１６に記載されるマウスモデルを使用して、鎌状赤血球貧血の治療における本発明の塩の活性を、以下のように決定した。
フェロポーチン阻害剤は、鎌状赤血球症のマウスモデルにおける急性血管閉塞および臓器損傷を予防する。
血管閉塞の危機（ＶＯＣ）は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）患者の罹患率と死亡率の主な原因である。低酸素症、脱水症、炎症または溶血はすべて、複数の臓器の凝固、血管閉塞、痛みを伴う危機および不可逆的な損傷を促進する小血管の活性化内皮への鎌状赤血球（ＳＳＲＢＣ）、好中球および血小板の付着の増加に寄与する。白血球数の増加、特に活性化された好中球は、ＳＣＤ患者の早期死亡、無症候性脳梗塞、出血性脳卒中、急性胸部症候群と相関している（Ｐｌａｔｔ ＯＳ，ＮＥＪＭ，１９９４）。ＳＣＤの溶血は、損傷した鎌状赤血球膜から生じ、慢性貧血と血中へのＨｂの放出を引き起こし、ＮＯの枯渇、酸化ストレスの生成、ヘムの放出により炎症を促進する。ＳＳＲＢＣは、内皮細胞による活性酸素種（ＲＯＳ）産生を誘発し、白血球接着を促進し、ホスファチジルセリン依存的に内皮アポトーシスを誘導する微小胞を放出し、ＳＣＤの急性ＶＯＣに寄与する（Ｃａｍｕｓ Ｍ，Ｂｌｏｏｄ，２０１２）。
上記の未公開の国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５３０５号および第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５３０６号に記載されている化合物などについて示されているように、フェロポーチン阻害剤の投与による慢性鉄制限は、β−サラセミアマウスのＲＢＣへのＲＯＳの形成を減少させた（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｙａｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ．１９９５）。このデータに基づいて、フェロポーチン阻害剤は、ＳＳＲＢＣの溶血とＲＯＳの形成を減らし、白血球の内皮細胞への接着を連続的に防ぐことにより、ＳＣＤのＶＯＣを緩和できると仮定できる。
この仮説を検証するために、ＳＣＤのＴｏｗｎｅｓマウスモデルで４週間、１日２回、ビヒクルまたは３０もしくは１００ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ）のフェロポーチン阻害剤を経口投与する（Ｒｙａｎ Ｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０）。これらのマウスは、ヒトヘモグロビンのみを発現するように遺伝子操作されている（ｈα／ｈα：：βＳ／βＳ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。Ｔｏｗｎｅｓマウスは、貧血、網状赤血球数の増加、脾腫、血管炎症を起こし、低酸素症、炎症、溶血に反応してＶＯＣを起こしやすくなる。炎症内皮への白血球およびＳＳＲＢＣ接着に対するフェロポーチン阻害剤の影響を調査するため、ビヒクルまたはフェロポーチン阻害剤を用いて２５日間処理されたＴｏｗｎｅｓマウスを麻酔し、前述のように滅菌状態で窓付きチャンバーを背側皮膚のひだに外科的に埋め込む（Ｋａｌａｍｂｕｒ ＶＳ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４；Ｚｅｎｎａｄｉ，Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２００７）。手術の３日後、マウスに０．５μｇＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を注射して、ＶＯＣを引き起こす炎症を誘発する。ＴＮＦα投与の９０分後、ローダミン結合Ｌｙ６Ｇ（Ｓｉｇｍａ）とフィコエリトリン結合抗ＴＥＲ１１９ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の静脈内注射により、それぞれ白血球とＲＢＣがインビボで標識される。白血球とＲＢＳの微小血管内皮への付着を、前述のように蛍光生体顕微鏡検査により次の９０分でモニターする（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，ＦＡＳＥＢ Ｊ，２０１６）。簡単に説明すると、窓付きチャンバーを埋め込んだ麻酔動物を３７℃で維持し、蛍光顕微鏡（Ａｘｏｐｌａｎ顕微鏡、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）に接続したデジタルビデオカメラＣ２４００（浜松ホトニクス株式会社、日本、浜松市）を使用して血流と細胞接着事象を記録する。マウスごとに２０〜３０個の微小毛細血管セグメントを調べ、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して付着蛍光標識細胞の蛍光強度を測定することにより、静止画像上で細胞付着を定量化する。結果を、細胞１００万個あたりの蛍光単位として表す。
１３．オスのＳｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットにおけるＨ ２ ＳＯ ４ またはＨＣｌ単塩としての例示化合物Ｎｏ．１２７の単回静脈内および経口薬物動態試験
Ｈ２ＳＯ４（ＭＷ ６０４．６ｇ／ｍｏｌ）またはＨＣｌ（ＭＷ ４４４．９ｇ／ｍｏｌ）単塩としての例示化合物Ｎｏ．１２７の薬物動態（ＰＫ）を決定するために、これらの塩化合物の単回投与を雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（経路ごとにｎ＝３）に静脈内に（１ｍｇ／ｋｇ）または経口で（３０ｍｇ／ｋｇ）行った。使用した用量は、塩基としての化合物の重量（ＭＷ ４０８．４３ｇ／ｍｏｌ）に対して補正された。
ラットは、２２〜２５℃の温度、湿度４０〜７０％ＲＨ、１２時間の明／１２時間の暗サイクルで換気ケージに入れ、標準的なげっ歯類の飼料と水を自由に摂取させた。ＰＫ試験の前に、ラットを一晩絶食させ、投与の４時間後に給餌した。プロトコルは、ＣＲＯ（ＧＶＫ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．、インド、ハイデラバード）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって検討および承認された。
５％ＤＭＳＯおよび１０％ソルトールを含むＰＢＳで製剤化された例示化合物Ｎｏ．１２７ Ｈ２ＳＯ４単塩または例示化合物Ｎｏ．１２７のＨＣｌ単塩を、５ｍｌ／ｋｇおよび０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で２７ガーゼ針を使用してラットの尾静脈に静脈内投与した。
３０ｍｇ／ｋｇの経口投与のために、塩化合物を、５％ＤＭＳＯを含む０．５％メチルセルロースの溶液中に６ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化し、５ｍｌ／ｋｇで経口投与した。
投与後５、１５、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、および２４時間の時点で、ラットのカニューレ挿入された頸静脈から０．２０〜０．３０ｍＬの血液サンプルをリチウムヘパリン充填済みチューブに採取した。血漿は、２５００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離して調製した。液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって化合物の血漿濃度を測定し、Ｐｈｏｅｎｉｘソフトウェアバージョン６．４の非コンパートメントモデルによってＣ０、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｃｌ、Ｖｄ、ＡＵＣｌａｓｔ、Ｔ１／２、ＭＲＴ、％Ｆなどの標準ＰＫパラメータを決定した。
結果は、良好な／改善された薬物動態プロファイルを示している。
ＩＩＩ．併用療法の評価
フェロポーチン阻害剤としての活性を有する、本明細書に記載の塩と、他の有効成分との前述の可能な併用療法に関して、このような併用療法は、中間型βサラセミアのマウスモデルで検討することができる。
本発明の塩と他の治療薬（第２の薬剤）との潜在的な相乗効果または相加効果は、中間型サラセミア（Ｈｂｂｔｈ３／＋またはＨｂｂｔｈ１／ｔｈ１、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または重症型サラセミア（例えばＣａｓｕ Ｃ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＪＡＫ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ａｎｄ ｍａｊｏｒ．”；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２０１７に記載されるＣ５７−ＦＬＣｔｈ３／ｔｈ３のマウスモデルにおいて併用試験によって評価されており、貧血、造血、鉄過剰、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生、脾腫、およびサラセミアモデルの他のバイオマーカーに対する効果について、本発明の塩自体（すなわち、塩のみ）を、または１つ以上の追加の化合物と組み合わせた本発明の塩を試験する。１２週齢の両方の性別のマウスを、本発明の塩それ自体で、または以下の第２の薬剤の１つと組み合わせて治療する：
・改変アクチビン受容体タイプＩＩＡまたはＩＩＢ融合タンパク質（Ｓｕｒａｇａｎｉ ＲＮ，ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩＢ ｌｉｇａｎｄ ｔｒａｐ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．”Ｂｌｏｏｄ．２０１４ Ｊｕｎ １９；１２３（２５）：３８６４−７２およびＤｕｓｓｉｏｔ Ｍ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎ ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩＡ ｌｉｇａｎｄ ｔｒａｐ ｃｏｒｒｅｃｔｓ ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．”Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１４ Ａｐｒ；２０（４）：３９８−４０７などに記載されているものなど）であって、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーメンバーに対するリガンドトラップとして作用するもの、例えばＲＡＰ−０１１もしくはＲＡＰ−５３６（ＡＣＥ−０１１ ＳｏｔａｔｅｒｃｅｐｔまたはＡＣＥ−５３６ Ｌｕｓｐａｔｅｒｃｅｐｔのマウス類似体（国際公開第２０１００１９２６１号に記載、または米国特許第８３６１９５７号にて特許請求）それぞれ、Ａｃｃｅｌｅｒｏｎ／Ｃｅｌｇｅｎｅ）、またはＴＧＦβスーパーファミリーメンバーの他の拮抗薬（抗体、抗体の断片、非抗体足場薬またはアクチビン受容体リガンドトラップを産生する細胞）。
・ルクスチリニブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ−米国特許第７，５９８，２５７号および同第８，４１５，３６２号にて特許請求）またはフェドラチニブ（Ｓａｎｏｆｉ）を含むが、これらに限定されないＪＡＫ１／２またはＪＡＫ２阻害剤（Ｃａｓｕ Ｃ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＪＡＫ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ａｎｄ ｍａｊｏｒ．”；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２０１７に記載）。
・Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ（ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国；米国特許第６，５５２，０６５号および同第６，８３３，３８４号にて特許請求）などのｐａｎ−ＨＤＡＣ阻害剤またはＨＤＡＣ３阻害剤ＲＧＦＰ９６６（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｐａｓｒｉｃｈａ ＳＲ ｅｔ ａｌ．“Ｈｅｐｃｉｄｉｎ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＨＤＡＣ３．”Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７ Ｓｅｐ １；８（１）：４０３に記載されているものなど）。
・マウスＴｍｐｒｓｓ６をターゲットとする、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）−製剤化Ｔｍｐｒｓｓ６ ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などのマトリプターゼ−２（Ｔｍｐｒｓｓ６とも呼ばれる）の拮抗薬（Ｇｕｏ Ｓ ｅｔ ａｌ“Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ＴＭＰＲＳＳ６ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ ａｎｄ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎ ｍｉｃｅ．” Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３ Ａｐｒ；１２３（４）：１５３１−４１またはＳｃｈｍｉｄｔ ＰＪ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎ ＲＮＡｉ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｍｐｒｓｓ６ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｉｎ Ｈｆｅ（−／−） ｍｉｃｅ ａｎｄ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ａｎｅｍｉａ ａｎｄ ｉｒｏｎ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ．”Ｂｌｏｏｄ．２０１３ Ｆｅｂ １４；１２１（７）：１２００−８に記載）。
・外因性アポトランスフェリン（Ｌｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃ ｍｉｃｅ．“Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１０ Ｆｅｂ；１６（２）：１７７−８２に記載）。
・エピチオスタノール、プロゲステロンおよびミフェプリストンとしてのヘプシジン誘導ステロイド（ＨＩＳ）、またはプロゲステロン受容体膜成分−１（ＰＧＲＭＣ１）の拮抗薬（Ｒｅｆ．７）。
・抗体やリガンドトラップなどのエリスロフェロン拮抗薬
・組換えエリスロポエチン（ｅｐｏ）。本発明による治療薬として使用可能なエリスロポエチンは、細胞培養における組換えＤＮＡ技術により産生され、エポゲン／プロクリット（エポエチンα）およびアラネスプ（ダルベポエチンα）またはミルセラ（エポエチンβおよびメトキシポリエチレングリコール）が含まれる。
・ビトペルチン（Ｒｏｃｈｅ ＡＧ）などのグリシントランスポーター１（ＧｌｙＴ１）阻害剤。
本発明の塩は、単剤として１０、３０および６０ｍｇ／ｋｇで１日２回、または上記化合物の１つ（第２の薬剤）と組み合わせて、サラセミアマウスに経口投与される。サラセミアマウスの対照群には、２番目の薬剤のみを投与している。年齢および性別を一致させたビヒクルで処理したサラセミアおよび野生型（ＷＴ）マウスを対照として使用する。いくつかの実験では、本発明の塩を飲料水に投与して、他の経口投与薬物の共投与を促進することもできた。
より具体的には、第２の薬剤は、以下のように、単一の治療として投与されるか、または本発明の塩と同時投与される：
・ＲＡＰ−０１１またはＲＡＰ−５３６は、週に２回、１、１０、または３０ｍｇ／ｋｇで最大８週間皮下注射できる。
・ＪＡＫ１／２阻害剤は、飲料水に配合された本発明の塩の非存在下または存在下で、１日２回経口投与することができる。
・ルキソチリニブ（６０または１８０ｍｇ／ｋｇ）またはフェドラチニブ（４０または１２０ｍｇ／ｋｇ）は、飲料水に配合された本発明の塩の非存在下または存在下で、２週間１日１回経口投与できる。
・パノビノスタットまたはＲＧＦＰ９６６は、飲料水に配合された本発明の塩の非存在下または存在下で１日１回１０または２０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
・アポトランスフェリンは、１００または３００ｍｇ／ｋｇで８週間毎日腹腔内注射される。
・ミフェプリストン（３０または１００ｍｇ／ｋｇ）は、２週間毎日腹腔内注射できる
・エリスロフェロンに特異的な抗体またはリガンドトラップは、皮下注射により週２回投与できる。
・エリスロポエチンは、２週間、毎日２００ＩＵで腹腔内に注入できる。
・ビトペルチン（Ｒｏｃｈｅ ＡＧ）などのグリシントランスポーター１（ＧｌｙＴ１）阻害剤も、適切な投与経路で投与できる。
マウスのヘモグロビンの変化を毎週モニターし、試験の最後に血液と臓器を採取する。脾臓重量は体重に対して正規化し、髄外赤血球生成に対する治療の効果として評価する。肝臓、脾臓、腎臓および心臓の鉄濃度は、発光分光計（ＯＥＳ）を備えた誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）によって測定される。完全な血球数は、自動カウンターを使用して測定する。骨髄および脾臓の赤血球生成は、細胞をＣＤ７１、ＣＤ４４、およびＴｅｒ１１９抗体で標識し、フローサイトメトリーにより赤血球細胞を検出することにより分析する。赤血球（ＲＢＣ）上の膜結合αグロビン分画は、ＨＰＬＣによって定量化される。ＲＢＣの活性酸素種（ＲＯＳ）の存在は、蛍光指示薬クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテートを使用して染色することにより測定される。血清鉄を、Ｆｅｒｅｎｅ−Ｓベースの試薬（Ａｂｂｏｔｔ）を使用した比色アッセイによって測定する。血清エリスロポエチンを、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ、デュオセット）によって定量化する。血清ヘプシジンを、ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定する。肝臓ヘプシジン、骨髄、および脾臓のエリスロフェロン遺伝子発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって定量化する。

Claims (20)

  1. 式（Ｉ）：
    Figure 2020516620
     ［ここで、
    Ｘ１はＮもしくはＯであり、
    Ｘ２はＮ、ＳもしくはＯであり、
    ただし、Ｘ１とＸ２は異なる；
    Ｒ１は、
    −水素、および
    −置換されていてもよいアルキル
    からなる群から選択され、
    ｎは１〜３の整数であり、
    Ａ１およびＡ２はアルカンジイルの群から独立して選択され、
    Ｒ２は
    −水素、もしくは
    −置換されていてもよいアルキルであるか、
    または
    Ａ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４〜６員環を形成し、
    Ｒ３は、
    −ハロゲン、
    −シアノ、
    −置換されていてもよいアルキル、
    −置換されていてもよいアルコキシ、および
    −カルボキシル基
    からなる群から独立して選択され得る１、２または３個の任意の置換基を示し、
    Ｒ４は、
    −水素、
    −ハロゲン、
    −Ｃ１−Ｃ３−アルキル、および
    −ハロゲン置換アルキル
    からなる群から選択される］
    の化合物の塩であって、
    式（Ｉ）の化合物と、安息香酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、乳酸、リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸およびトルエンスルホン酸からなる群からの酸との塩から選択され、化合物（Ｉ）：酸の比が１〜２：１〜３であることを特徴とし、但し
    以下の３ＨＣｌ塩
    Figure 2020516620
    Figure 2020516620
    が除外される
    塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  2. 請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の塩であって、式中
    ｎ＝１であり、；
    Ｒ２＝水素であり、；
    Ｒ３＝水素であり、；
    Ｒ４＝水素であり、；
    Ａ１＝メチレンもしくはエタン−１，２−ジイルであり、；
    Ａ２＝メチレン、エタン−１，２−ジイルもしくはプロパン−１，３−ジイルであり；または
    Ａ１およびＲ２はそれらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４員環を形成し、
    式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
    Figure 2020516620
    Figure 2020516620
     ［式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）中、
    ｍは１、２もしくは３の整数であり、
    Ｘ１、Ｘ２、およびＲ１は、請求項１に定義される意味を有する］
    を形成する塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  3. 単塩から選択される、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物の塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  4. 前記酸が、クエン酸、塩酸、マレイン酸および硫酸からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  5. 前記酸がリン酸および硫酸からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  6. 前記酸が、式（Ｉ）の化合物：ＰＯ４の比が２：１のリン酸形成塩から選択される、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物の塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  7. ３ＨＣｌ塩が除外される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  8. 以下からなる群から選択される請求項１〜７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の塩、
    Figure 2020516620
    Figure 2020516620
    ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  9. 以下からなる群から選択される請求項８に記載の式（Ｉ）の化合物の塩、
    Figure 2020516620
     ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  10. 以下からなる群から選択される請求項８または９に記載の式（Ｉ）の化合物の塩、
    Figure 2020516620
     および
    Figure 2020516620
     ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  11. 式：
    Figure 2020516620
     を有する１：１硫酸塩である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の塩、およびそれらの多形体。
  12. 式：
    Figure 2020516620
     を有する１：１リン酸塩である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の塩、およびそれらの多形体。
  13. 医薬として使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  14. フェロポーチン阻害剤としての使用のための、および／または、フェロポーチン媒介鉄輸送の阻害における使用のための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  15. 鉄濃度の増大もしくは鉄吸収の増大をもたらす鉄代謝障害の予防および／もしくは治療に使用するための、例えば、鉄過剰の予防および／もしくは治療における使用のための、ならびに／または、鉄濃度の増大、鉄吸収の増大もしくは鉄過剰に関連または起因する疾患の予防および／または治療における使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  16. 鉄濃度の増大、鉄吸収の増大もしくは鉄過剰に関連するまたは起因する前記疾患が、サラセミア、ヘモグロビン症、ヘモグロビンＥ症、ヘモグロビンＨ症、ヘモクロマトーシス、溶血性貧血、αサラセミア、βサラセミアおよびδサラセミアを含むサラセミア、鎌状赤血球貧血（鎌状赤血球症）および先天性赤血球形成異常性貧血から選択される、請求項１５に記載の使用のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  17. 骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、骨髄異形成）、真性赤血球増加症および先天性赤血球形成異常性貧血などの無効赤血球生成に関連する疾患の予防および／もしくは治療に使用するための、または細菌ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）などの病原性微生物が利用できる鉄の量を制限することにより前記病原性微生物によって引き起こされる感染症を治療する補助療法での使用のための、または組織もしくは細胞内の鉄の沈着もしくは増加を制限することによるアルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患の予防および／もしくは治療における使用のための、またはラジカル、活性酸素種（ＲＯＳ）および酸化ストレスの形成の予防および／もしくは治療における使用のための、または鉄過剰によって引き起こされる心臓、肝臓および内分泌損傷の予防および／もしくは治療における使用のための、または過剰な鉄によって誘発される炎症の予防および／もしくは治療における使用のための、請求項１〜１６のいずれか一項に定義される塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
  18. 請求項１４〜１７のいずれか一項に定義される使用のための医薬などの、溶媒和物、水和物および多形体を含む請求項１〜１７のいずれか一項に定義される塩の１つ以上を含む医薬であって、更に、１つ以上の医薬担体および／もしくは助剤および／もしくは溶媒、ならびに／または、鉄過剰、サラセミア、ヘモクロマトーシスもしくは鎌状赤血球症、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患、ならびに関連する症状の予防および治療のための活性化合物、または鉄キレート化合物などの少なくとも１つの追加の医薬活性化合物を含んでいてもよい、医薬。
  19. 経口または非経口投与用製剤の形態である、請求項１８に記載の医薬。
  20. 溶媒和物、水和物および多形体を含む請求項１〜１９のいずれかに定義される塩と少なくとも１つの追加の医薬活性化合物との共投与を含む併用療法において使用するための、請求項１〜１９のいずれか一項に定義される塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体であって、
    前記併用療法の共投与が、溶媒和物、水和物および多形体を含む請求項１〜１９のいずれかに定義される塩と、固定用量製剤中の少なくとも１つの追加の医薬活性化合物との共投与による、固定用量併用療法で実施することができるか、または
    前記併用療法の共投与が、個々の成分の同時投与またはある期間にわたって分布した個々の成分の連続使用のいずれかによる、それぞれの成分の自由用量における、溶媒和物、水和物および多形体を含む請求項１〜１９のいずれかに定義される塩と、前記少なくとも１つの追加の医薬活性化合物との自由用量併用療法で実施することができ、かつ
    前記併用療法が、好ましくは、溶媒和物、水和物および多形体を含む請求項１〜１９のいずれかに定義される塩と、Ｔｍｐｒｓｓ６−ＡＳＯ、鉄キレート剤、クルクミン、ＳＳＰ−００４１８４、デフェリトリン、デフェラシロクス、デフェロキサミンおよび／もしくはデフェリプロンから選択される鉄過剰を減少させるための１つ以上の他の医薬活性化合物と、ならびに／または、ｎ−アセチルシステインなどの抗酸化剤；ＧＬＰ−１受容体作動薬などの抗糖尿病薬；バンコマイシン（Ｖａｎ）もしくはトブラマイシンなどの抗生物質；マラリア治療薬；抗がん剤；抗真菌薬；レボドパなどのドーパミン作動薬を含む、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患の治療薬；インターフェロン−αまたはリバビリンなどの抗ウイルス薬；シクロスポリンＡまたはシクロスポリンＡ誘導体などの免疫抑制剤；鉄サプリメント；ビタミンサプリメント；赤血球産生刺激剤（例：エリスロポエチン、Ｅｐｏ）；抗炎症性生物薬；抗血栓薬；スタチン；昇圧剤；ならびに変力性化合物から選択される１つ以上の他の医薬活性化合物との共投与を含む、
    塩、ならびにそれらの溶媒和物、水和物および多形体。
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