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JP2020520977A - ＧａｌＮＡｃオリゴヌクレオチド結合体のための方法 - Google Patents

ＧａｌＮＡｃオリゴヌクレオチド結合体のための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、治療上有用なGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体を調製するための方法を含む。本方法は、オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはテトラアルキルアンモニウム塩とGalNAcクラスター化合物またはその塩とのカップリング、およびその後の精製を含む。

Description

本発明は、GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の調製のための新しい方法に関する。
近年、オリゴヌクレオチドにさらなる官能性を追加する、例えば、インビボで治療用オリゴヌクレオチドが特定の臓器および組織を標的とすることを可能にする、非ヌクレオチド部分を有するオリゴヌクレオチドの結合がかなり注目されている。肝細胞を標的とするために、アシアロ糖タンパク質受容体に結合し得る3価のGalNAc結合部分が、有効な治療作用を送達する一方で、用量を大幅に削減できることが見出されている。そのようなGalNAcクラスターアンチセンス結合体は、例えば、国際公開公報第2012/083046号（特許文献1）または米国特許出願公開第2011/0207799号（特許文献2）に記載されている。
これらの出版物はGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の調製方法を開示しているが、これらの方法は技術的規模の合成のための標準を満たしていないことが判明した。
したがって、本発明の目的は、工業規模方法の要件を満たすGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の調製のための改善された方法を提供することである。
国際公開公報第2012/083046号 米国特許出願公開第2011/0207799号
GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体を調製するための方法は、
a）固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドまたはその脂肪族アミン塩を生成する段階；
b）オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、アンモニア存在下で保護基を除去し、それにより無保護オリゴヌクレオチドのアンモニウム塩を提供する段階；
c）オリゴヌクレオチドのアンモニウム塩からオリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはテトラアルキルアンモニウム塩への塩交換を行い、それにより任意の遊離アンモニアまたは残留脂肪族アミンを除去する段階；
d）オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはテトラアルキルアンモニウム塩をGalNAcクラスター化合物またはその塩とカップリングする段階；および最後に、
e）GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体を精製する段階
を含む。
以下の定義は、本明細書において本発明を記載するために用いられる様々な用語の意味および範囲を例示し、かつ定義するために示す。
キラル炭素が化学構造中に存在する場合は常に、そのキラル炭素に関連するすべての立体異性体が、純粋な立体異性体ならびにその混合物として構造に含まれることが意図される。
「アルキル」なる用語は、1〜12の炭素原子の一価直鎖または分枝飽和炭化水素基を意味する。特定の態様において、アルキルは1〜7つの炭素原子、より具体的態様において、1〜4つの炭素原子を有する。アルキルの例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、またはtert-ブチルが含まれる。
「C1〜12アルキル」なる用語は、1〜12の炭素原子、より具体的態様において、1〜7つの炭素原子の一価直鎖または分枝飽和炭化水素基を意味する。アルキルの例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、またはtert-ブチルおよびペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルおよびドデシルならびにその異性体が含まれる。
「脂肪族アミン」なる用語は、C1〜4-アルキルが前述の定義のとおりであるモノ-、ジ-もしくはトリ-C1〜4-アルキルアミンまたは環式脂肪族アミンを意味する。モノ-、ジ-またはトリ-C1〜4-アルキルアミンの特定の例は、エチルアミン、ジエチルアミンまたはトリエチルアミンである。環式脂肪族アミンの特定の例は、ピロリジンなどの5員環式脂肪族アミンまたはピペリジンもしくはモルホリンなどの6員環式脂肪族アミンである。
「アミノ保護基」なる用語は、アミノ基を保護することを意図した基を意味し、ベンゾイル、ベンジルオキシカルボニル、カルボベンジルオキシ（CBZまたはZ）、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（FMOC）、p-メトキシベンジルオキシカルボニル、p-ニトロベンジルオキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル（BOC）、およびトリフルオロアセチルを含む。これらの基のさらなる例は、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, ''Protective Groups in Organic Synthesis'', 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapter 7；E. Haslam, ''Protective Groups in Organic Chemistry'', J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5、およびT.W. Greene, ''Protective Groups in Organic Synthesis'', John Wiley and Sons, New York, NY, 1981において見出される。
「ヒドロキシ保護基」なる用語および「エステル保護基」なる用語は、ヒドロキシ基を保護することを意図した基を意味し、エステルおよびエーテル生成基、特にテトラヒドロピラニル、アシル基、カルバモイル、ベンジルおよびシリルエーテル（例えば、TBS、TBDPS）基を含む。これらの基のさらなる例は、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, ''Protective Groups in Organic Synthesis'', 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapters 2-3；E. Haslam, ''Protective Groups in Organic Chemistry'', J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5、およびT.W. Greene, ''Protective Groups in Organic Synthesis'', John Wiley and Sons, New York, NY, 1981において見出される。好ましいのは、アシル基、特にC1〜12-アルキルカルボニル基、より具体的にはC1〜6-アルキルまたはフェニルによって置換されていてもよいC1〜6-アルキルカルボニル基である。より好ましいヒドロキシ保護基は、アセチル、ピバロイルまたはベンゾイルから選択することができ、ここでアセチルが最も好ましいヒドロキシ保護基である。
「アルカリ」なる用語は、アルカリ金属リチウム、ナトリウムおよびカリウム、特にナトリウムおよびカリウムを含み、ナトリウムが好まれる。
「アルカリ土類」なる用語は、アルカリ土類金属カルシウムおよびマグネシウムを含むが、特にカルシウムを含む。
5'アミノ修飾なる用語は、5'アミノ修飾オリゴヌクレオチドに関連して使用され、アミノリンカーとしてオリゴヌクレオチドの5'末端基に結合しているリンカーに共有結合する反応性アミノ基を決定する。リンカーは、好ましくは、2〜12の炭素原子の脂肪族アルキル基または1〜10のエチレングリコール単位を含むエチレングリコールリンカーである。
好ましい5'アミノ修飾基は、したがって、アミノ基保護されていてもよいアミノC2〜12-アルキルリンカーまたは1〜10のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコールリンカーから選択される。
5'アミノ修飾オリゴヌクレオチドに対する適切なアミノ保護基は、トリフルオロアセチル（TFA）またはモノメトキシトリチル（MMT）である。
一般に、アミノリンカーは、例えばSigma AldrichからのTFA-もしくはMMT-C6-リンカーホスホロアミダイトを介して、またはGlen Researchからの5'アミノ修飾基TEG（トリエチレングリコール）CEホスホロアミダイトを介してなどの、市販のアミノリンカーホスホロアミダイトを介して導入される。
本明細書において用いられるオリゴヌクレオチドなる用語は、当業者には複数の共有結合ヌクレオチドを含む分子として一般に理解されるものとして定義される。治療上有用なオリゴヌクレオチドとして使用するために、オリゴヌクレオチドは典型的には長さ7〜30ヌクレオチドとして合成される。
オリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよいDNA、RNAもしくはLNAヌクレオシドモノマーまたはその組み合わせからなってもよい。
LNAヌクレオシドモノマーは、ヌクレオチドのリボース糖環のC2'とC4'との間のリンカー基（ビラジクルまたは架橋と呼ばれる）を含む修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドはまた、文献において架橋核酸または二環式核酸（BNA）とも呼ばれる。
本明細書において用いられる、修飾されていてもよいとは、糖部分または核酸塩基部分の1つまたは複数の修飾の導入により、等価DNA、RNAまたはLNAヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを意味する。好ましい態様において、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含み、例えば1つもしくは複数の2'置換ヌクレオシドおよび/または1つもしくは複数のLNAヌクレオシドを含んでもよい。修飾ヌクレオシドなる用語は、本明細書において「ヌクレオシド類縁体」または修飾された「単位」または修飾された「モノマー」なる用語と交換可能に使用してもよい。
DNA、RNAまたはLNAヌクレオシドは一般に、2つのヌクレオシドを共有結合する、ホスホジエステル（P=O）および/またはホスホロチオエート（P=S）ヌクレオシド間連結によって連結される。
したがって、いくつかのオリゴヌクレオチドでは、すべてのヌクレオシド間結合はホスホジエステル（P=O）からなり得、他のオリゴヌクレオチドでは、すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（P=S）からなり得、またはさらに他のオリゴヌクレオチドでは、ヌクレオシド間結合の配列は多様で、ホスホジエステル（P=O）とホスホロチオエート（P=S）ヌクレオシド間の両方を含む。
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基の文字コード、例えばA、T、G、CまたはUによって示してもよく、ここで各文字は、任意に等価の機能の修飾核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示するオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、LNAヌクレオシドに対して大文字A、T、GおよびMeC（5-メチルシトシン）、ならびにDNAヌクレオシドに対して小文字a、t、g、cおよびMecで記載する。修飾核酸塩基には、tert.ブチルフェノキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイル、アセチル、イソブチリルまたはジメチルホルムアミジノなどの保護基を有する核酸塩基が含まれるが、それらに限定されない（Wikipedia, Phosphoramidit-Synthese, https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese of March 24, 2016参照）。
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよいDNAもしくはLNAヌクレオシドモノマーまたはその組み合わせからなり、かつ10〜25ヌクレオチドの長さである。
段階a）：
段階a）は、固相支持体上のオリゴヌクレオチドまたはその脂肪族アミン塩の生成を必要とする。
オリゴヌクレオチド合成の原理は、当技術分野において周知で、文献に詳しく記載され、ウィキペディアなどで有名である（例えば、Oligonucleotide synthesis; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide_synthesis, of March 15, 2016参照）。
今日では、より大規模のオリゴヌクレオチド合成が、コンピュータ制御された合成機を用いて自動的に行われる。
一般に、オリゴヌクレオチド合成は固相合成であり、ここで組み立てられるオリゴヌクレオチドは、その3'末端ヒドロキシ基を介して、固体支持体材料に共有結合され、鎖の組み立ての全体にわたってそれに結合したままである。適切な支持体は、GE HealthcareからのPrimer support 5GまたはKinovateからのNittoPhase(登録商標)HL supportのような市販のマクロポーラスポリスチレン支持体である。
オリゴヌクレオチド合成は、原理的には、所望の配列が組み立てられるまでの、伸長鎖の5'末端へのヌクレオチド残基の段階的付加である。
一般に、各付加は合成サイクルと呼ばれ、原理的には以下の化学反応からなる
a1)固体支持体上の保護ヒドロキシル基を脱保護する段階、
a2）第1のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして固体支持体上の遊離ヒドロキシル基とカップリングする段階、
a3）それぞれのP連結ヌクレオシドを酸化または硫化して、それぞれのホスホトリエステル（P=O）またはそれぞれのホスホロチオエート（P=S）を生成する段階；
a4）任意に、固体支持体上の任意の未反応ヒドロキシル基をキャッピングする段階；
a5）固体支持体に結合した第1のヌクレオシドの5'ヒドロキシル基を脱保護する段階；
a6）第2のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとしてカップリングして、それぞれのP連結二量体を生成する段階；
a7）それぞれのP連結ジヌクレオシドを酸化または硫化して、それぞれのホスホトリエステル（P=O）またはそれぞれのホスホロチオエート（P=S）を生成する段階；
a8）任意に、任意の未反応5'ヒドロキシル基をキャッピングする段階；
a9）所望の配列が組み立てられるまで、前の段階a5〜a8を繰り返す段階。
適用されるホスホロアミダイトモノマーを以下に示し、本発明の好ましい態様を表す。
Figure 2020520977
本発明の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドを脂肪族アミン塩の形態で生成する。
脂肪族アミン塩を、それぞれの脂肪族アミンによる脱保護段階（2-シノエチルP保護基の除去）の後に得る。
適切な脂肪族アミンは、前述の定義のモノ-、ジ-もしくはトリ-C1〜4-アルキルアミンまたは環式脂肪族アミンである。
好ましくは、モノ-、ジ-またはトリ-C1〜4-アルキルアミン、より好ましくはジ-C1〜4-アルキルアミン、特にジエチルアミンを用いる。
したがって、本発明のより好ましい態様において、オリゴヌクレオチドをジエチルアミン塩の形態で生成する。
段階b）：
段階b）は、オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、保護基を除去することを必要とする。
オリゴヌクレオチドの支持体からの切断および保護基（核酸塩基保護基およびアミノ修飾基保護基）の除去は、アンモニア水で都合よく行い、それによりオリゴヌクレオチドのアンモニウム塩を提供する。一般に、濃アンモニア水溶液および40℃〜80℃の間の高い反応温度を適用する。
次いで、オリゴヌクレオチドの粗製アンモニウム塩を、ろ過による反応混合物からの分離、水および/または脂肪族アルコールによる洗浄段階ならびにその後の蒸発による溶媒の除去によって得ることができる。
段階c）：
段階c）は、オリゴヌクレオチドのアンモニウム塩からオリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはテトラアルキルアンモニウム塩への塩交換を行い、それにより任意の遊離アンモニアまたは残留脂肪族アミンを除去することを必要とする。
本発明の1つの態様に従い、アルカリ金属塩を生成する。次いで、塩交換をアルカリ金属水酸化物により都合よく行う。
適切な水酸化アルカリは、水酸化リチウム、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムであるが、好ましくは水酸化ナトリウムである。
一般に、塩交換は、水性環境下、室温またはわずかに高温で起こり、したがってそれぞれの水酸化物の水溶液を好ましくは適用する。
本発明のもう1つの態様に従い、アルカリ土類金属塩を生成する。次いで、塩交換を水性アルカリ土類金属水酸化物により都合よく行う。
適切なアルカリ土類金属水酸化物は、水酸化カルシウムまたは水酸化マグネシウムであるが、好ましくは水酸化カルシウムである。
一般に、塩交換は、水性環境下、室温またはわずかに高温で起こり、したがってそれぞれの水酸化物の水溶液を好ましくは適用する。
好ましい態様において、オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩、より好ましくはナトリウム塩を生成する。
得られたオリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の水溶液の後処理は、任意の遊離アンモニアまたは残留脂肪族アミンを効果的に除去するという点で、非常に重要である。
したがって、1つの方法に従い、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の水溶液を、水を蒸発させることにより単離することができる。2-メチル-2-ブタノールなどの適切な有機溶媒を用いて残存する水を共沸（Aceotropic）除去し、続いて蒸発させることで、オリゴヌクレオチドの粗製アルカリ金属塩を提供することができる。メタノールまたはエタノールなどの脂肪族アルコールによるさらなる消化、それぞれの脂肪族アルコールによるろ過および洗浄により、アンモニアおよび残留脂肪族アミンを実質的に含まず、したがってカップリング段階に容易に適用することができる、オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を得ることができる。
もう1つの方法に従い、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の水溶液を、蒸気相のpHがpH7に達し、それにより残存するアンモニアおよびまたは脂肪族アミンが除去されたことを示すまで、連続部分蒸発（一定量および水の添加による）させることにより単離することができる。得られた溶液は、アンモニアおよび残留脂肪族アミンを実質的に含まず、したがって溶液中のカップリング段階に容易に適用することができる、オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を提供する。
もう1つの方法に従い、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の水溶液を、例えば、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム（pH6〜8）およびその混合物などの、アルカリ金属塩水溶液またはアルカリ土類金属塩水溶液に対する接線流ろ過または直交流ろ過によって単離することができる。得られた溶液は、アンモニアおよび残留脂肪族アミンを実質的に含まず、したがって溶液中のカップリング段階に容易に適用することができる、オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を提供する。または、メタノールまたはエタノールなどの脂肪族アルコールによるさらなる消化、それぞれの脂肪族アルコールによるろ過および洗浄により、アンモニアおよび残留脂肪族アミンを実質的に含まず、したがってカップリング段階に容易に適用することができる、オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を得ることができる。
前述の「連続部分蒸発」法および「接線流ろ過または直交流ろ過」法が好ましい。
さらにもう1つの方法に従い、オリゴヌクレオチドの粗製アンモニウム塩を、アニオン交換クロマトグラフィーと、続く接線流ろ過または直交流ろ過による脱塩および濃縮によって精製することができる。得られた溶液は、アンモニアおよび残留脂肪族アミンを実質的に含まず、したがって溶液中のカップリング段階に容易に適用することができる、オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を提供する。または、この溶液の凍結乾燥により、アンモニアおよび残留脂肪族アミンを実質的に含まず、したがってカップリング段階に容易に適用することができる、オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を得ることができる。
精製技術「接線流ろ過または直交流ろ過」および「アニオン交換クロマトグラフィー」は、以下の段階e）に詳細に記載する。
本発明のさらなる態様に従い、テトラアルキルアンモンミウム（tetraalkylammonmium）塩を生成する。塩交換は、この場合、メタノール、ジメチルスルホキシド、N,N'-ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、N-メチル-2-ピロリジン、N-エチルピロリドン、1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノンまたはその混合物から選択される適切な有機溶媒中、水酸化またはハロゲン化テトラアルキルアンモニウム、好ましくは水酸化またはハロゲン化テトラC1〜12-アルキルアンモニウム、例えば、水酸化テトラブチルアンモニウムまたは臭化テトラブチルアンモニウムにより都合よく行う。好ましくはメタノールもしくはジメチルスルホキシドまたはその混合物を用いる。メタノールとジメチルスルホキシドの混合物の場合、メタノールを蒸発によって除去して、非プロトン性溶液中のテトラアルキルアンモニウム塩を得ることができる。本態様は、その後のカップリングを無水条件下で行う場合に適している。
段階d）：
段階d）は、オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはテトラアルキルアンモニウム塩をGalNAcクラスター化合物またはその塩とカップリングさせることを必要とする。
GalNAcクラスター化合物は以下の式、その対応する塩、鏡像異性体および/または立体異性体を有する：
Figure 2020520977
式中、R2は水素またはヒドロキシ保護基であり、かつnは0〜10の整数である。
適切なヒドロキシ保護基は、C1〜6-アルキルまたはフェニルで置換されていてもよい、アシル、特にC1〜12-アルキルカルボニル基、より具体的にはC1〜6-アルキルカルボニル基である。より好ましいのは、アセチル、ピバロイルまたはベンゾイルであり、ここでアセチルが最も好ましいヒドロキシ保護基である。
nは好ましくは0〜5、より好ましくは1〜3の整数であるが、最も好ましいのは2である。
好ましい態様において、式IのGalNAcクラスター化合物は、式Iaのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩である：
Figure 2020520977
式中、M+/++はアルカリ金属またはアルカリ土類金属のカチオンであるが、好ましくはナトリウムである。
GalNAcクラスター化合物は以下のとおりに調製することができる：
最初にGalNAcクラスター化合物のベンジルエステル前駆体を、以下のスキーム1に従って調製することができる。続いて、ベンジルエステルを、例えば、パラジウム炭素などの水素化触媒存在下、水素による接触水素化により水素化分解して、式Iのアセチル保護GalNAcクラスター酸誘導体を提供する。
スキーム1：
Figure 2020520977
式IのGalNAcクラスター塩を、以下のスキーム2に従って調製することができる。
スキーム2：
Figure 2020520977
オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはテトラアルキルアンモニウム塩と式IのGalNAcクラスター化合物とのカップリング反応は、第1段階において、カップリング剤によるGalNAcクラスター化合物の活性化と、第2段階において、アミン塩基および有機溶媒存在下、活性化GalNAcクラスター化合物のオリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはテトラアルキルアンモニウム塩とのカップリングとを含む。
カップリング剤は、DCC（N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド）またはEDC（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド-塩酸塩）またはTBTU（N,N,N',N'-テトラメチル-O-(ベンゾトリアゾル-1-イル)ウロニウムテトラフルオロボレート、HBTU（2-(1H-ベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、およびHOBt（1-ヒドロキシベンズトリアゾール）、HOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）またはHOAt（1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール）から選択される添加剤、ならびにTBTU/HOBtまたはHBTU/HOAtなどのその一般的な組み合わせから選択される。
好ましい態様において、カップリング剤は、EDC（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド-塩酸塩）および添加剤としてのHOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）から選択される。
GalNAcクラスターをアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の形で適用する場合、活性化は酸性環境で実施しなければならない。適切な酸は、オルトリン酸などの鉱酸またはメタンスルホン酸などの有機酸およびN,N'-ジメチルホルムアミドなどの適切な極性非プロトン性溶媒である。反応温度は10℃〜40℃の間で選択することができる。
カップリングのために、アミン塩基は通常は、トリエチルアミンまたはN-エチルジイソプロピルアミンなどの3級アミン、2,4,6-コリジンなどのピリジン誘導体、またはDABCO（1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン）であるが、好ましくはN-エチルジソプロピルアミンである。反応は、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドもしくはテトラヒドロフランまたはその混合物などの極性非プロトン性溶媒中、20℃〜70℃の範囲の反応温度で行う。
または、n-プロピルホスホン酸無水物トリマー（T3P）または3-(ジエトキシ-ホスホリルオキシ)-1,2,3-ベンゾ[d]トリアジン-4(3H)-オン（DEPBT）を、トリエチルアミンまたはN-エチルジイソプロピルアミンなどの3級アミン塩基、好ましくはN-エチルジイソプロピルアミンと共にカップリング剤として選択する。
反応混合物のろ過により、その後の精製段階で使用し得るろ液を含むGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体を提供する。
段階e）：
段階 e）は、GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体を精製することを必要とする。
前の段階から得たGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の精製は、基本的には、クロマトグラフィー、濃縮および単離の段階を含む。クロマトグラフィーおよび濃縮段階は繰り返し適用することができる。
適切な精製手順は以下の順序の段階を含む：
I. クロマトグラフィー、
II. 濃縮、
III. 単離、
または
I. クロマトグラフィー、
II. 濃縮、
III. クロマトグラフィー、
IV. 濃縮、
V. 単離、
または
I. クロマトグラフィー、
II. 濃縮、
III. 単離、
IV. クロマトグラフィー、
V. 濃縮、
VI. 単離。
I.〜V.の順序を含む精製手順が好ましい。
さらに好ましいのは、以下の順序の段階を含む精製手順である：
I. アニオン交換クロマトグラフィーもしくは逆相クロマトグラフィー、
II. 接線流ろ過、
III. 凍結乾燥もしくは噴霧乾燥、
または
I. アニオン交換クロマトグラフィーもしくは逆相クロマトグラフィー、
II. 接線流濾過、
III. アニオン交換クロマトグラフィーもしくは逆相クロマトグラフィー、
IV. 接線流ろ過、
V. 凍結乾燥もしくは噴霧乾燥。
前述の精製法は、本発明の当業者には一般的かつ周知である。
クロマトグラフィーなる用語は、アニオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーおよびその組み合わせの方法を含む。
アニオン交換クロマトグラフィーは、試料溶液の荷電イオンと、用いる緩衝媒体との競合相互作用に基づく。通常の市販のアニオン交換樹脂、好ましくはトリメチルアンモニウム官能基を有するもので実施することができる。これらの相材料は、例えばGE Healthcare、Tosoh Bioscience、Bio-RadまたはMerckから入手することができる。特に良好な結果は、Tosoh Bioscienceから市販のアニオン交換樹脂TSKgel Super Q-5PW (QAE)で達成された。
逆相クロマトグラフィーは、固定相としての修飾シリカゲル吸着剤などの従来の市販の相材料、ならびにアセトニトリルなどの適切な有機溶媒および、該当する場合は緩衝液により実施することができる。適切な修飾シリカゲルタイプ相材料は、Kromasil(商標)C18、Kromasil(商標)C8、YMC Triart C18およびYMC Triart C8から選択することができる。特に良好な結果は、YMCのTriart Prep C8-Sで達成された。
濃縮なる用語は、接線流ろ過または蒸発およびその組み合わせの方法を含む。
接線流ろ過または直交流ろ過において、供給物は透過側に対して陽圧でろ過膜を通過（接線的に）する。膜の孔径よりも小さい材料の一部は、透過物またはろ液として膜を通過し；他のすべては、残余物として膜の供給物側に保持される。接線流ろ過の原理は、ナノろ過、限外ろ過、透析ろ過およびマイクロろ過方法でも用いられる。適切な膜は、例えば、Merck MilliporeからPellicon(商標)の商品名で市販されている。適切な膜は、≦3kDAの分子量カットオフ（MWCO）を有する。それぞれ1kDaおよび3kDaのMWCOを有するMerck Millipore Pellicon 2および3膜が好ましい。
単離なる用語は、凍結乾燥、沈殿、噴霧乾燥および蒸発の方法を含む。これらの用語はすべて当業者には周知である。
非限定的態様において、オリゴヌクレオチドは下記からなる群より選択される：
Figure 2020520977
ここで、AM-C6はC6アミノリンカーを意味し；*はホスホルチオエート架橋を表し；A、G、TおよびMeC（5-メチルシトシン）はLNAヌクレオシドモノマーであり、かつa、t、c、gはDNAヌクレオシドモノマーである。
非限定的態様において、GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体は下記からなる群より選択され得る：
Figure 2020520977
ここで、AM-C6はC6アミノリンカーを意味し；*はホスホルチオエート架橋を表し；A、G、TおよびMeC（5-メチルシトシン）はLNAヌクレオシドモノマーであり、a、t、c、gはDNAヌクレオシドモノマーであり、かつGN2はGalNAcクラスター部分であり、これは以下の式の立体異性体GN2aもしくはGN2b、またはその混合物の形態で出現し得、ここでRはAM-C6-オリゴヌクレオチドテールを示す。
Figure 2020520977
本明細書において開示する化合物は、SEQ ID NO 1、2、3および4からなる群より選択される核酸塩基配列を有する。
Figure 2020520977
。
略語：
AcOH 酢酸
DMAP 4-(ジメチルアミノ)-ピリジン
DMF N,N'-ジメチルホルムアミド
EtOH エタノール
MeOH メタノール
rt 室温
THF テトラヒドロフラン
TBME tert-ブチルメチルエーテル
ACN アセトニトリル
GalNAcクラスター化合物前駆体の調製
構築ブロックA：
実施例A1
ベンジル(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエート
Figure 2020520977
234.0g（500.0mmol）の(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸を500mlジクロロメタンに懸濁し、62.0ml（600mmol、1.2当量）のベンジルアルコールおよび3.05gのDMAP（25.0mmol、0.05当量）を加えた。溶液を40分間で0〜5℃に冷却し、500mlジクロロメタン中108.0g（525.0mmol、1.05当量）のN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドの溶液を滴加した。白色懸濁液を0〜5℃で1時間と、次いで室温で15時間撹拌した。懸濁液をG3ガラスフィルターでろ過し、白色ろ過ケークを合計250mlジクロロメタンで少しずつ洗浄した。ろ液を650〜10mbar/1hで蒸発させて黄色油状物を得、これを2.0L酢酸エチルに溶解し、2.0Lの0.5M塩酸、2.0Lの1M NaHCO3および1.0Lの食塩水で抽出し、有機層を40℃/150〜10mbar/5hで蒸発乾固させて、291.1gの粗製ベンジル(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエートを白色固体として収率104％および純度96.4％（HPLC面積％；約5％ベンジルアルコールを含む）で得た。材料をそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS: m/z = 459.22735 (M-boc+H)+。
実施例A2
ベンジル(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエートメタンスルホン酸塩
Figure 2020520977
291.1gベンジル（500.0mmol）の(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエート（HPLC純度；95.8％；約5％ベンジルアルコールを含む）を室温で1.4L THFに溶解した。10分以内に、1.04Lジエチルアミン（10.0mol、20当量）を加え、淡黄色溶液を室温で2時間撹拌し、次いで40℃/200〜10mbarで蒸発させ、200mlアセトニトリルを加え、40℃/100〜10mbar/1hで再び蒸発させてジエチルアミンを効率的に除去した。最後に、268.1gの黄色油状物を得、これを2.5Lアセトニトリルに溶解し、室温で10分間撹拌した。不溶性粒子をガラス繊維フィルターでろ過し、500mlアセトニトリルで洗浄した。ろ液を、20℃〜25℃で34.0mlのメタンスルホン酸を10分の間に滴下して処理した。生成した白色懸濁液を室温で17時間撹拌し、G3ガラスフィルターでろ過した。ろ過ケークを500mlアセトニトリルで少しずつ洗浄した。白色結晶を40℃/15mbar/4hで乾燥して、195.8gのベンジル(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエートメタンスルホン酸塩を白色結晶として収率91％（2段階）および純度99.3％（HPLC面積％）で得た。MS: m/z = 337.2149 (M+H)+。
実施例A3
ベンジル(2S)-2-[[(2S)-2,6-ビス(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエート
Figure 2020520977
190.0g（439.0mmol）のベンジル(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエートメタンスルホン酸塩を室温で1.9L THFに懸濁した。335ml（1.98mol、4.5当量）のN-エチルジイソプロピルアミンを加え、それによって温度が15℃までわずかに低下した。次に、213g（615mmol,1.4当量）の(S)-2,6-ビス((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキサン酸を加え、白色懸濁液を室温で20分間撹拌した。390mlのn-プロピルホスホン酸無水物（環式トリマーとしてのT3P、酢酸エチル中50％、659mmol、1.5当量）を20〜25℃（冷水浴中で冷却）で20分の間に滴加した。得られた淡黄色の濁った溶液を室温で1.5時間撹拌し、分液漏斗に移し、1.9L TBMEで希釈し、1.9L水、1.9L 0.5M塩酸、1.9L 0.5M NaOH、1.9L水および1.9L食塩水で抽出した。分離し、まだ濁った有機層をガラス繊維フィルターでろ過し、フィルターを100ml TBMEで洗浄し、合わせたろ液を40℃/100mbar/1hで蒸発させ、1.0L TBME（水を共沸除去するため）を再度加え、40℃/250〜10mbar/1hで蒸発させて、粗製296.4gを白色固体残渣として得た。
粗製固体を500mlアセトニトリルで処理し、濁った溶液を60〜65℃まで10分間加熱した。混合物を20〜25℃に冷却し、10分間撹拌し、ガラス繊維フィルターでろ過し、50mlアセトニトリルで洗浄した。淡黄色溶液を40℃/100〜10mbar/4hで蒸発させて、295gのベンジル(2S)-2-[[(2S)-2,6-ビス(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエートをオフホワイト固体として収率101％（HPLC純度：100％、ジアステレオマー純度（SS）98.6％）で得、これをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS: m/z = 565.3741 (M-boc+H)+。
実施例A4
ベンジル(2S)-6-アミノ-2-[[(2S)-2,6-ジアミノヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート三メタンスルホン酸塩
Figure 2020520977
124.0g（187mmol）のベンジル(2S)-2-[[(2S)-2,6-ビス(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエートを1.25Lアセトニトリルに懸濁した。61.0ml（935.0mmol、5.0当量）のメタンスルホン酸を20〜25℃で10分の間（ガス発生）に加えた。得られた橙色懸濁液を40分で55〜60℃に加熱し、55〜60℃でさらに1時間撹拌した。橙赤色乳濁液を室温まで冷却し（脱boc（debocation）を1H-NMRで制御した）、それ以上精製せずにA+B組み立て段階、実施例8で用いた。MS: m/z = 365.2558 (M+H)+。
構築ブロックB：
実施例B1a
ベンジル2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]アセテート
Figure 2020520977
30.0g（200.0mmol）の2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エタノールを50ml DMFに20〜25℃で溶解し、次いで、46.0mlのメタノール中25％ナトリウムメトキシド（200.0mmol、1.0当量）を加えた。生成した溶液を40℃/50mbar/0.5hで蒸発させ（40mlの溶媒を除去）、50mlのDMFを再度加え、40℃/20mbar/0.5hで蒸発させた（15mlの溶媒を除去）。わずかにゼリー状の懸濁液に、50mlのDMF中13.9gのブロモ酢酸（100mmol、0.5当量）を20〜25℃で加え、混合物を6時間撹拌した。11.9mlの臭化ベンジル（100mmol、0.5当量）を加え、混合物を20〜25℃でさらに16時間撹拌した。次いで、反応混合物を200mlの食塩水で処理し、200ml TBMEで抽出した。分離したTBME層を200mlの食塩水で抽出し、分離したTBME層を次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥し、40℃/300〜10mbar/1hで蒸発させ、23.9gの粗製ベンジル2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]アセテートを得た。
クロマトグラフィー（600gシリカ60（0.063〜0.2mm）、移動相：酢酸エチル）後、合計7.85gのベンジル2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]アセテートを無色油状物として収率13％および純度99.0％（HPLC面積％）で単離した。MS: m/z = 299.1517 (M+H)+。
実施例B1b
ベンジル2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]アセテート
Figure 2020520977
11.2gのカリウムtert-ブチレート（100.0mmol、0.5当量）を70mlの2-メチル-2-ブタノール（軽度に発熱、35℃）に懸濁し、次いで30.0g（200.0mmol）の2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エタノールを5分間で滴加し、滴下漏斗を10mlの2-メチル-2-ブタノールで洗浄し（温度は45℃に上昇）、溶液を60〜65℃に加熱し、 11.6g（100mmol、0.5当量）のクロロ酢酸ナトリウムを加え、60〜65℃で16時間撹拌し、次いで11.9mlの臭化ベンジル（100mmol、0.5当量）を加え、混合物を60〜65℃でさらに16時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、次いで50mlの水で処理し、80ml TBMEおよび40ml TBMEで抽出した。合わせたTBME層を50ml半飽和食塩水で洗浄し、有機層を40℃/300〜10mbar/1hで蒸発させて、27.0gの粗製ベンジル2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]アセテートを得た。
クロマトグラフィー (270gシリカ60（0.063〜0.2mm）、移動相：酢酸エチル/n-ヘプタン1/1で開始し、純粋な生成物が見られれば、移動相を100％酢酸エチルに変更）後、合計11.4gのベンジル2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]アセテートをほぼ無色油状物として収率19％（クロロ酢酸ナトリウムから38％）および純度99.0％（HPLC面積％）で単離した。
実施例B2
ベンジル2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセテート
Figure 2020520977
268.0gのベンジル2-(2-(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)アセテート（900mol）を2.4Lジクロロメタンに溶解した。385.0gの(2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2,4,5-トリイルトリアセテート（990mmol, 1.1当量）および12.0mlのトリフルオロメタンスルホン酸（135mmol、0.15当量）を加えた。懸濁液をディーンスタークセパレータ（50ml、AcOHを除去するため）で加熱還流した。1時間後、4.50mlのトリフルオロメタンスルホン酸（50.7mmol、0.05当量）および50mlのジクロロメタンを橙色懸濁液に加え、ディーンスタークセパレータから溶媒（50ml）を排出した。30分ごとにこの手順を合計6回（3時間）繰り返した。合計4.5時間後、赤色溶液を10〜15℃に冷却し、20〜25℃で1.8Lの1M炭酸水素ナトリウム（1.8mol、2.0当量）の溶液に30分以内で加えた（CO2発生、pH7〜8）。黄色の有機層を分離し、40℃/600〜10mbar/3hで蒸発させて、585.4gの粗製ベンジル2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセテートを黄色油状物として得た（HPLC純度：87％）。粗生成物を700mlアセトンに溶解し、プリロードシリカカラム（3.0kgシリカ60；0.063〜0.2mm）にチャージした。クロマトグラフィーを、移動相としてn-ヘプタン/アセトン（5：1から1：2の勾配）を用いて行った。集めた分画を40℃/600〜10mbarで蒸発させ、20〜25℃/0.3mbar/3hで乾燥して、465.0gのベンジル2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセテートを黄色油状物として収率83％および純度100％（HPLC面積％）で得た。MS: m/z = 628.2627 (M+H)+。
実施例B3
2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸
Figure 2020520977
アルゴン雰囲気下、456.0gのベンジル2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセテート（727mmol）を1.4LのTHFに溶解した。4.56gのPd/C 10％を加え、アルゴン雰囲気を水素（1bar）に置き換えた。黒色懸濁液を20〜25℃で2時間水素化した。水素雰囲気をアルゴンに置き換え、黒色懸濁液をろ過し、ろ過ケークを合計400mlのTHFで少しずつ洗浄した。無色ろ液（HPLC純度：71％および27％トルエン）をいかなる精製もせずにA＋B組み立て段階、実施例C1で用いた。MS: m/z = 538.2191 (M+H)+。
構築ブロックAおよびBの組み立て
実施例C1
ベンジル(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート
Figure 2020520977
実施例4からのベンジル(2S)-6-アミノ-2-[[(2S)-2,6-ジアミノヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート三メタンスルホン酸塩（180.0mmol）の赤橙色溶液（約1.4L）を3.60Lアセトニトリルで希釈した。20〜25℃で、365.0mlのN-エチルジイソプロピルアミン（2.16mol、12.0当量）を5分以内に加えた。生成した粘着性スラリーに、実施例B3からの2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸（720mmol、4.0当量）の溶液（約2.25L）を20〜25℃で10分以内に加え、それにより温度が40℃までわずかに上昇した。45〜50℃で、425mlのn-プロピルホスホン酸無水物（T3P、トリマー、酢酸エチル中50％、720mmol、4.0当量）の溶液を10分以内に加えた。反応液を45〜50℃で1時間撹拌した。淡黄色溶液を20〜25℃に冷却し、40℃/10mbar/6hで蒸発させて1.06kgの粗製ベンジル(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート（HPLC純度：24.1％）を得た。粗生成物を3つの部分に分けて沈殿させ、メタンスルホン酸N-エチルジイソプロピルアミンおよび残留T3Pを除去した。353gの粗生成物を7.0Lの2-プロパノールに溶解し、1時間で-25℃まで冷却し、-25℃で1時間撹拌し、予冷した（-25℃）G3ガラスフィルターでろ過し（すすぎなし）、沈澱生成物の一部は反応器からガラス壁に沈積した。すべての沈殿物を、合計1.0LのTHFでフィルターおよびガラス壁から少しずつ溶解した。合わせた溶液を40℃/20mbar/6hで蒸発させて、390.0gのベンジル(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート（HPLC純度：71.9％）を得、これをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS: m/z = 1923.8438 (M+H)+。
実施例C2
ナトリウム;(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート
Figure 2020520977
ベンジル(2S)-6-アミノ-2-[[(2S)-2,6-ジアミノヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート三メタンスルホン酸塩（12.2mmol）の赤橙色溶液（約95ml）を240mlアセトニトリルで希釈した。20〜25℃で、30.0mlのN-エチルジイソプロピルアミン（2.16mol、14.5当量）を5分以内に加えた。生成した粘着性スラリーに、2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸（48.8mmol、4.0 当量）の溶液（約150ml）を20〜25℃で10分以内に加え、それにより温度が40℃までわずかに上昇した。45〜50℃で、28.8mlのn-プロピルホスホン酸無水物（T3P、トリマー、酢酸エチル中50％、48.8mmol、4.0当量）の溶液を10分以内に加えた。反応溶液を45〜50℃で1時間撹拌した。淡黄色溶液を20〜25℃に冷却し、40℃/10mbar/6hで蒸発させて、73.6gの粗製ベンジル(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート（HPLC純度：32面積％）を得た。
68.0g（11.0mmol）の粗生成物を340mlメタノールに溶解し、20.0ml（220mmol、20当量）のNaOH 10.8Mを淡黄色溶液に加え、温度が32℃に上昇し、反応混合物を室温で2.5時間撹拌し、それにより懸濁液が生成した（pH12.0）。懸濁液をろ過し、ろ過ケークを100.0mlメタノールで洗浄し、ろ液を40℃/250〜10mbar/2hで蒸発させて、41.5gのナトリウム(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエートを得、これを次いで分取逆相クロマトグラフィーにより精製し、条件については実験C3を参照されたい。
実施例C3
ナトリウム;(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート
Figure 2020520977
378.0g（197.0mmol、粗製）のベンジル(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエートを1.9Lメタノールに溶解した。10分以内に、200.0mLの10.8M水酸化ナトリウム溶液（2.16mol、11.0当量）を20〜25℃で加えた。それにより温度は31℃に上昇した。淡黄色溶液を20〜25℃で2時間撹拌し（pH13.4）、次いで80.0mLの5M塩化アンモニウム溶液を加えた（pH10.7）。次いで、淡黄色溶液を20〜25℃/100〜20mbar/5hで蒸発させ、20〜0.5mbar/1hで乾燥して、543gの粗製ナトリウム(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエート（HPLC純度：40.1％）を得、これを次いで分取逆相クロマトグラフィーにより精製した。
カラム：Triart C18-120 26×15cm；10um；
移動相：A：2mM NaHCO3/B：アセトニトリル；
勾配：
Figure 2020520977
温度調節：室温
検出：220nm
溶液：543gを4500mlの2mM NaHCO3に溶解し、ろ過（GF5）（＝5000ml（109mg/ml）
試料溶液/注入：1回あたり200ml試料＝21.8g（25回）
濃縮：合わせた分画（46L）を110Lの水で希釈し、この溶液をRP C18カラムに3分割してポンプで送り、水/MeOH 98/2で洗浄し、次いでMeOHで溶出し、ロータリーエバポレーターで濃縮して、1.18kgのメタノール溶液を得た。分取HPLC精製段階の1.18kgメタノール溶液の4分の1、すなわち、295gを40℃/20mbar/1hと、次いで20〜25℃/0.35mbar/14hで蒸発乾固して、43.5gのナトリウム;(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノエートを非晶質白色粉末、HPLC純度99.88％として得た。前記溶液の残りの4分の3（885g）は、次の段階で用いた。MS: m/z = 1452.684 (M-H)-。
GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の調製
実施例1A
Figure 2020520977
のそのジエチルアミン塩としての調製
用語：A、G、T、MeC（5-メチルシトシン）＝LNA；a、t、c、g＝DNA；*＝ジアステレオマー混合物としてのホスホルチオエート；AM-C6＝アミノリンカーC6；GN2＝GalNAcクラスター；CF3CO＝TFA＝トリフルオロアセチル；bz＝ベンゾイル；ibu＝イソブチリル
表題化合物を、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, GermanyおよびPrimer Support 5G Unylinker 350（GE Healthcare, Freiburg, Germany）を用い、1.60mmolの規模で固相上の標準的なホスホラミダイト化学によって生成した。LNA、すなわち2'-OCH2-4'架橋ヌクレオチドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）およびDNAヌクレオシドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）を含むオリゴヌクレオチドを、対応するホスホラミダイトおよびTFA保護アミノリンカー-ホスホラミダイト（Link Technologies, Scotland, UK）を用いて生成した。一般に、カップリング1回につき2.0当量のDNA/LNA-ホスホラミダイトおよび3.0当量のTFA-アミノリンカー-ホスホラミダイトを用いた。ホスホロチオール化試薬（キサンタンヒドリド）、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン（ABCR、AB251827）を無水アセトニトリル/ピリジン1/1中の0.1M溶液として用いた。他のすべての標準試薬溶液（DCA-debloc、BTT、Cap A、B1、B2、Oxidizer、DEA washは市販品であった（Sigma-Aldrich、Merck Millipore、EMP Biotech；以下の詳細参照）。2-シアノエチル基の脱保護は、DEA-washとして公知の方法によって達成され、粗製保護ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドをジエチルアミン塩として得た。このようにして得た表題化合物は、実験実施例2Aでさらなる操作を行わずに用いた。
標準試薬溶液
DCA-deblock トルエン中3体積％ジクロロ酢酸
BTT活性化剤 アセトニトリル中0.3M 5-ベンジルチオテトラゾール
Cap A アセトニトリル中20体積％1-メチルイミダゾール
Cap B1 アセトニトリル中40体積％無水酢酸
Cap B2 アセトニトリル中60体積％ピリジンまたは2,6-ルチジン
Oxidizer 0.05M 水/ピリジン/ヨウ素 10/90/1.27（v/v/w）
DEA wash アセトニトリル中20体積％ジエチルアミン
実施例1B
Figure 2020520977
のそのジエチルアミン塩としての調製
用語：A、G、T、MeC（5-メチルシトシン）＝LNA；a、t、c、g＝DNA；*＝ジアステレオマー混合物としてのホスホルチオエート；AM-C6＝アミノリンカーC6；GN2＝GalNAcクラスター；CF3CO＝TFA＝トリフルオロアセチル；bz＝ベンゾイル；ibu＝イソブチリル；dmf＝ジメチルホルムアミジン
表題化合物を、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, GermanyおよびPrimer Support Unylinker（Kinovate Nittophase(登録商標)HL UnyLinker(商標)400, USA）を用い、1.90mmolの規模で固相上の標準的なホスホラミダイト化学によって生成した。LNA、すなわち2'-OCH2-4'架橋ヌクレオチドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）およびDNAヌクレオシドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）を含むオリゴヌクレオチドを、対応するホスホラミダイトおよびTFA保護アミノリンカー-ホスホラミダイト（Link Technologies, Scotland, UK）を用いて生成した。一般に、カップリング1回につき1.5当量のDNA/LNA-ホスホラミダイトおよび2.0当量のTFA-アミノリンカー-ホスホラミダイトを用いた。ホスホロチオール化試薬（キサンタンヒドリド）、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン（ABCR、AB251827）を無水アセトニトリル/ピリジン1/1中の0.1M溶液として用いた。他のすべての標準試薬溶液（DCA-debloc、BTT、Cap A、B1、B2、Oxidizer、DEA washは市販品であった（Sigma-Aldrich、Merck Millipore、EMP Biotech；以下の詳細参照）。2-シアノエチル基の脱保護は、DEA-washとして公知の方法によって達成され、粗製保護ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドをジエチルアミン塩として得た。このようにして得た表題化合物は、実験実施例2Bでさらなる操作を行わずに用いた。
標準試薬溶液
DCA-deblock トルエン中3体積％ジクロロ酢酸
BTT活性化剤 アセトニトリル中0.3M 5-ベンジルチオテトラゾール
Cap A アセトニトリル中20体積％1-メチルイミダゾール
Cap B1 アセトニトリル中40体積％無水酢酸
Cap B2 アセトニトリル中60体積％ピリジンまたは2,6-ルチジン
Oxidizer 0.05M 水/ピリジン/ヨウ素 10/90/1.27（v/v/w）
DEA wash アセトニトリル中20体積％ジエチルアミン
実施例1C
Figure 2020520977
のそのジエチルアミン塩としての調製
用語：A、G、T、MeC（5-メチルシトシン）＝LNA；a、t、c、g＝DNA；*＝ジアステレオマー混合物としてのホスホルチオエート；AM-C6＝アミノリンカーC6；GN2＝GalNAcクラスター；CF3CO＝TFA＝トリフルオロアセチル；bz＝ベンゾイル；ibu＝イソブチリル；dmf＝ジメチルホルムアミジン
表題化合物を、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, GermanyおよびPrimer Support Unylinker（Kinovate Nittophase(登録商標)HL UnyLinker(商標)400, USA）を用い、1.90mmolの規模で固相上の標準的なホスホラミダイト化学によって生成した。LNA、すなわち2'-OCH2-4'架橋ヌクレオチドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）およびDNAヌクレオシドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）を含むオリゴヌクレオチドを、対応するホスホラミダイトおよびTFA保護アミノリンカー-ホスホラミダイト（Link Technologies, Scotland, UK）を用いて生成した。一般に、カップリング1回につき1.5当量のDNA/LNA-ホスホラミダイトおよび2.0当量のTFA-アミノリンカー-ホスホラミダイトを用いた。ホスホロチオール化試薬（キサンタンヒドリド）、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン（ABCR、AB251827）を無水アセトニトリル/ピリジン1/1中の0.1M溶液として用いた。他のすべての標準試薬溶液（DCA-debloc、BTT、Cap A、B1、B2、Oxidizer、DEA washは市販品であった（Sigma-Aldrich、Merck Millipore、EMP Biotech；以下の詳細参照）。2-シアノエチル基の脱保護は、DEA-washとして公知の方法によって達成され、粗製保護ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドをジエチルアミン塩として得た。このようにして得た表題化合物は、実験実施例2Cでさらなる操作を行わずに用いた。
標準試薬溶液
DCA-deblock トルエン中3体積％ジクロロ酢酸
BTT活性化剤 アセトニトリル中0.3M 5-ベンジルチオテトラゾール
Cap A アセトニトリル中20体積％1-メチルイミダゾール
Cap B1 アセトニトリル中40体積％無水酢酸
Cap B2 アセトニトリル中60体積％ピリジンまたは2,6-ルチジン
Oxidizer 0.05M 水/ピリジン/ヨウ素 10/90/1.27（v/v/w）
DEA wash アセトニトリル中20体積％ジエチルアミン
実施例1D
Figure 2020520977
のそのジエチルアミン塩としての調製
用語：A、G、T、MeC（5-メチルシトシン）＝LNA；a、t、c、g＝DNA；*＝ジアステレオマー混合物としてのホスホルチオエート；AM-C6＝アミノリンカーC6；GN2＝GalNAcクラスター；CF3CO＝TFA＝トリフルオロアセチル；bz＝ベンゾイル；ibu＝イソブチリル；dmf＝ジメチルホルムアミジン
表題化合物を、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, GermanyおよびPrimer Support 5G Unylinker 350（GE Healthcare, Freiburg, Germany）を用い、1.60mmolの規模で固相上の標準的なホスホラミダイト化学によって生成した。LNA、すなわち2'-OCH2-4'架橋ヌクレオチドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）およびDNAヌクレオシドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）を含むオリゴヌクレオチドを、対応するホスホラミダイトおよびTFA保護アミノリンカー-ホスホラミダイト（Link Technologies, Scotland, UK）を用いて生成した。一般に、カップリング1回につき2.0当量のホスホラミダイトおよび3.0当量のTFA-アミノリンカー-ホスホラミダイトを用いた。ホスホロチオール化試薬（キサンタンヒドリド）、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン（ABCR、AB251827）を無水アセトニトリル/ピリジン1/1中の0.1M溶液として用いた。他のすべての標準試薬溶液（DCA-debloc、BTT、Cap A、B1、B2、Oxidizer、DEA washは市販品であった（Sigma-Aldrich、Merck Millipore、EMP Biotech；以下の詳細参照）。2-シアノエチル基の脱保護は、DEA-washとして公知の方法によって達成され、粗製保護ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドをジエチルアミン塩として得た。このようにして得た表題化合物は、実験実施例2Dでさらなる操作を行わずに用いた。
標準試薬溶液
DCA-deblock トルエン中3体積％ジクロロ酢酸
BTT活性化剤 アセトニトリル中0.3M 5-ベンジルチオテトラゾール
Cap A アセトニトリル中20体積％1-メチルイミダゾール
Cap B1 アセトニトリル中40体積％無水酢酸
Cap B2 アセトニトリル中60体積％ピリジンまたは2,6-ルチジン
Oxidizer 0.05M 水/ピリジン/ヨウ素 10/90/1.27（v/v/w）
DEA wash アセトニトリル中20体積％ジエチルアミン
実施例1E
Figure 2020520977
のそのジエチルアミン塩としての調製
用語：A、G、T、MeC（5-メチルシトシン）＝LNA；a、t、c、g＝DNA；*＝ジアステレオマー混合物としてのホスホルチオエート；AM-C6＝アミノリンカーC6；GN2＝GalNAcクラスター；CF3CO＝TFA＝トリフルオロアセチル；bz＝ベンゾイル；ibu＝イソブチリル；dmf＝ジメチルホルムアミジン
表題化合物を、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, GermanyおよびPrimer Support Unylinker（Kinovate Nittophase(登録商標)HL UnyLinker(商標)400, USAを用い、0.20mmolの規模で固相上の標準的なホスホラミダイト化学によって生成した。LNA、すなわち2'-OCH2-4'架橋ヌクレオチドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）およびDNAヌクレオシドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）を含むオリゴヌクレオチドを、対応するホスホラミダイトおよびTFA保護アミノリンカー-ホスホラミダイト（Link Technologies, Scotland, UK）を用いて生成した。一般に、カップリング1回につき1.5当量のホスホラミダイトおよび2.0当量のTFA-アミノリンカー-ホスホラミダイトを用いた。ホスホロチオール化試薬（PADS）、ビス-(フェニルアセチル)-ジスルフィド（ABCR、AB180887）を無水アセトニトリル/3-ピコリン1/1中の0.2M溶液として用いた。他のすべての標準試薬溶液（DCA-debloc、BTT、Cap A、B1、B2、Oxidizer、DEA washは市販品であった（Sigma-Aldrich、Merck Millipore、EMP Biotech；以下の詳細参照）。2-シアノエチル基の脱保護は、DEA-washとして公知の方法によって達成され、粗製保護ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドをジエチルアミン塩として得た。このようにして得た表題化合物は、実験実施例2Eでさらなる操作を行わずに用いた。
標準試薬溶液
DCA-deblock トルエン中3体積％ジクロロ酢酸
BTT活性化剤 アセトニトリル中0.3M 5-ベンジルチオテトラゾール
Cap A アセトニトリル中20体積％1-メチルイミダゾール
Cap B1 アセトニトリル中40体積％無水酢酸
Cap B2 アセトニトリル中60体積％ピリジンまたは2,6-ルチジン
Oxidizer 0.05M 水/ピリジン/ヨウ素 10/90/1.27（v/v/w）
DEA wash アセトニトリル中20体積％ジエチルアミン
実施例1F
Figure 2020520977
のそのジエチルアミン塩としての調製
用語：A、G、T、MeC（5-メチルシトシン）＝LNA；a、t、c、g＝DNA；*＝ジアステレオマー混合物としてのホスホルチオエート；AM-C6＝アミノリンカーC6；GN2＝GalNAcクラスター；CF3CO＝TFA＝トリフルオロアセチル；bz＝ベンゾイル；ibu＝イソブチリル；dmf＝ジメチルホルムアミジン
表題化合物を、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, GermanyおよびPrimer Support Unylinker（Kinovate Nittophase(登録商標)HL UnyLinker(商標)400, USA）を用い、0.20mmolの規模で固相上の標準的なホスホラミダイト化学によって生成した。LNA、すなわち2'-OCH2-4'架橋ヌクレオチドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）およびDNAヌクレオシドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）を含むオリゴヌクレオチドを、対応するホスホラミダイトおよびTFA保護アミノリンカー-ホスホラミダイト（Link Technologies, Scotland, UK）を用いて生成した。一般に、カップリング1回につき1.5当量のDNA/LNA-ホスホラミダイトおよび2.0当量のTFA-アミノリンカー-ホスホラミダイトを用いた。ホスホロチオール化試薬（キサンタンヒドリド）、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン（ABCR、AB251827）を無水アセトニトリル/ピリジン1/1中の0.1M溶液として用いた。他のすべての標準試薬溶液（DCA-debloc、DCI、Cap A、B1、B2、Oxidizer、DEA washは市販品であった（Sigma-Aldrich、Merck Millipore、EMP Biotech；以下の詳細参照）。2-シアノエチル基の脱保護は、DEA-washとして公知の方法によって達成され、粗製保護ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドをジエチルアミン塩として得た。このようにして得た表題化合物は、実験実施例2Fでさらなる操作を行わずに用いた。
標準試薬溶液
DCA-deblock トルエン中3体積％ジクロロ酢酸
DCI活性化剤 アセトニトリル中0.25M 4,5-ジシアノイミダゾール
Cap A アセトニトリル中20体積％1-メチルイミダゾール
Cap B1 アセトニトリル中40体積％無水酢酸
Cap B2 アセトニトリル中60体積％ピリジンまたは2,6-ルチジン
Oxidizer 0.05M 水/ピリジン/ヨウ素 10/90/1.27（v/v/w）
DEA wash アセトニトリル中20体積％ジエチルアミン
実施例1G
Figure 2020520977
のそのジエチルアミン塩としての調製
用語：A、G、T、MeC（5-メチルシトシン）＝LNA；a、t、c、g＝DNA；*＝ジアステレオマー混合物としてのホスホルチオエート；AM-C6＝アミノリンカーC6；GN2＝GalNAcクラスター；CF3CO＝TFA＝トリフルオロアセチル；bz＝ベンゾイル；ibu＝イソブチリル；dmf＝ジメチルホルムアミジン
表題化合物を、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, GermanyおよびPrimer Support Unylinker（Kinovate Nittophase(登録商標)HL UnyLinker(商標)400, USA）を用い、1.90mmolの規模で固相上の標準的なホスホラミダイト化学によって生成した。LNA、すなわち2'-OCH2-4'架橋ヌクレオチドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）およびDNAヌクレオシドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）を含むオリゴヌクレオチドを、対応するホスホラミダイトおよびTFA保護アミノリンカー-ホスホラミダイト（Link Technologies, Scotland, UK）を用いて生成した。一般に、カップリング1回につき1.5当量のDNA/LNA-ホスホラミダイトおよび2.0当量のTFA-アミノリンカー-ホスホラミダイトを用いた。ホスホロチオール化試薬（キサンタンヒドリド）、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン（ABCR、AB251827）を無水アセトニトリル/ピリジン1/1中の0.1M溶液として用いた。他のすべての標準試薬溶液（DCA-debloc、BTT、Cap A、B1、B2、Oxidizer、DEA washは市販品であった（Sigma-Aldrich、Merck Millipore、EMP Biotech；以下の詳細参照）。2-シアノエチル基の脱保護は、DEA-washとして公知の方法によって達成され、粗製保護ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドをジエチルアミン塩として得た。このようにして得た表題化合物は、実験実施例2Gでさらなる操作を行わずに用いた。
標準試薬溶液
DCA-deblock トルエン中3体積％ジクロロ酢酸
BTT活性化剤 アセトニトリル中0.3M 5-ベンジルチオテトラゾール
Cap A アセトニトリル中20体積％1-メチルイミダゾール
Cap B1 アセトニトリル中40体積％無水酢酸
Cap B2 アセトニトリル中60体積％ピリジンまたは2,6-ルチジン
Oxidizer 0.05M 水/ピリジン/ヨウ素 10/90/1.27（v/v/w）
DEA wash アセトニトリル中20体積％ジエチルアミン
実施例1H
Figure 2020520977
のそのジエチルアミン塩としての調製
用語：A、G、T、MeC（5-メチルシトシン）＝LNA；a、t、c、g＝DNA；*＝ジアステレオマー混合物としてのホスホルチオエート；AM-C6＝アミノリンカーC6；GN2＝GalNAcクラスター；CF3CO＝TFA＝トリフルオロアセチル；bz＝ベンゾイル；ibu＝イソブチリル；dmf＝ジメチルホルムアミジン
表題化合物を、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, GermanyおよびPrimer Support Unylinker（Kinovate Nittophase(登録商標)HL UnyLinker(商標)400, USA）を用い、1.90mmolの規模で固相上の標準的なホスホラミダイト化学によって生成した。LNA、すなわち2'-OCH2-4'架橋ヌクレオチドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）およびDNAヌクレオシドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）を含むオリゴヌクレオチドを、対応するホスホラミダイトおよびTFA保護アミノリンカー-ホスホラミダイト（Link Technologies, Scotland, UK）を用いて生成した。一般に、カップリング1回につき1.5当量のDNA/LNA-ホスホラミダイトおよび2.0当量のTFA-アミノリンカー-ホスホラミダイトを用いた。ホスホロチオール化試薬（キサンタンヒドリド）、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン（ABCR、AB251827）を無水アセトニトリル/ピリジン1/1中の0.1M溶液として用いた。他のすべての標準試薬溶液（DCA-debloc、BTT、Cap A、B1、B2、Oxidizer、DEA washは市販品であった（Sigma-Aldrich、Merck Millipore、EMP Biotech；以下の詳細参照）。2-シアノエチル基の脱保護は、DEA-washとして公知の方法によって達成され、粗製保護ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドをジエチルアミン塩として得た。このようにして得た表題化合物は、実験実施例2Hでさらなる操作を行わずに用いた。
標準試薬溶液
DCA-deblock トルエン中3体積％ジクロロ酢酸
BTT活性化剤 アセトニトリル中0.3M 5-ベンジルチオテトラゾール
Cap A アセトニトリル中20体積％1-メチルイミダゾール
Cap B1 アセトニトリル中40体積％無水酢酸
Cap B2 アセトニトリル中60体積％ピリジンまたは2,6-ルチジン
Oxidizer 0.05M 水/ピリジン/ヨウ素 10/90/1.27（v/v/w）
DEA wash アセトニトリル中20体積％ジエチルアミン
実施例1I
Figure 2020520977
のそのジエチルアミン塩としての調製
用語：A、G、T、MeC（5-メチルシトシン）＝LNA；a、t、c、g＝DNA；*＝ジアステレオマー混合物としてのホスホルチオエート；AM-C6＝アミノリンカーC6；GN2＝GalNAcクラスター；CF3CO＝TFA＝トリフルオロアセチル；bz＝ベンゾイル；ibu＝イソブチリル；dmf＝ジメチルホルムアミジン
表題化合物を、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, GermanyおよびPrimer Support Unylinker（Kinovate Nittophase(登録商標)HL UnyLinker(商標)400, USA）を用い、0.2mmolの規模で固相上の標準的なホスホラミダイト化学によって生成した。LNA、すなわち2'-OCH2-4'架橋ヌクレオチドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）およびDNAヌクレオシドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）を含むオリゴヌクレオチドを、対応するホスホラミダイトおよびTFA保護アミノリンカー-ホスホラミダイト（Link Technologies, Scotland, UK）を用いて生成した。一般に、カップリング1回につき1.5当量のDNA/LNA-ホスホラミダイトおよび2.0当量のTFA-アミノリンカー-ホスホラミダイトを用いた。ホスホロチオール化試薬（キサンタンヒドリド）、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン（ABCR、AB251827）を無水アセトニトリル/ピリジン1/1中の0.1M溶液として用いた。他のすべての標準試薬溶液（DCA-debloc、Activator 42、Cap A、B1、B2、Oxidizer、DEA washは市販品であった（Sigma-Aldrich、Merck Millipore、EMP Biotech；以下の詳細参照）。2-シアノエチル基の脱保護は、DEA-washとして公知の方法によって達成され、粗製保護ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドをジエチルアミン塩として得た。このようにして得た表題化合物は、実験実施例2Iでさらなる操作を行わずに用いた。
標準試薬溶液
DCA-deblock トルエン中3体積％ジクロロ酢酸
Activator 42 アセトニトリル中0.3M 5-(3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル)-1H-テトラゾール
Cap A アセトニトリル中20体積％1-メチルイミダゾール
Cap B1 アセトニトリル中40体積％無水酢酸
Cap B2 アセトニトリル中60体積％ピリジンまたは2,6-ルチジン
Oxidizer 0.05M 水/ピリジン/ヨウ素 10/90/1.27（v/v/w）
DEA wash アセトニトリル中20体積％ジエチルアミン
実施例1J
Figure 2020520977
のそのジエチルアミン塩としての調製
用語：A、G、T、MeC（5-メチルシトシン）＝LNA；a、t、c、g＝DNA；*＝ジアステレオマー混合物としてのホスホルチオエート；AM-C6＝アミノリンカーC6；GN2＝GalNAcクラスター；CF3CO＝TFA＝トリフルオロアセチル；bz＝ベンゾイル；ibu＝イソブチリル；dmf＝ジメチルホルムアミジン
表題化合物を、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, GermanyおよびPrimer Support Unylinker（Kinovate Nittophase(登録商標)HL UnyLinker(商標)400, USA）を用い、1.90mmolの規模で固相上の標準的なホスホラミダイト化学によって生成した。LNA、すなわち2'-OCH2-4'架橋ヌクレオチドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）およびDNAヌクレオシドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）を含むオリゴヌクレオチドを、対応するホスホラミダイトおよびTFA保護アミノリンカー-ホスホラミダイト（Link Technologies, Scotland, UK）を用いて生成した。一般に、カップリング1回につき1.5当量のDNA/LNA-ホスホラミダイトおよび2.0当量のTFA-アミノリンカー-ホスホラミダイトを用いた。ホスホロチオール化試薬（キサンタンヒドリド）、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン（ABCR、AB251827）を無水アセトニトリル/ピリジン1/1中の0.1M溶液として用いた。他のすべての標準試薬溶液（DCA-debloc、DCI、Cap A、B1、B2、Oxidizer、DEA washは市販品であった（Sigma-Aldrich、Merck Millipore、EMP Biotech；以下の詳細参照）。2-シアノエチル基の脱保護は、DEA-washとして公知の方法によって達成され、粗製保護ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドをジエチルアミン塩として得た。このようにして得た表題化合物は、実験実施例2Jでさらなる操作を行わずに用いた。
標準試薬溶液
DCA-deblock トルエン中3体積％ジクロロ酢酸
DCI活性化剤 アセトニトリル中0.7M ジシアノイミダゾール
Cap A アセトニトリル中20体積％1-メチルイミダゾール
Cap B1 アセトニトリル中40体積％無水酢酸
Cap B2 アセトニトリル中60体積％ピリジンまたは2,6-ルチジン
Oxidizer 0.05M 水/ピリジン/ヨウ素 10/90/1.27（v/v/w）
DEA wash アセトニトリル中20体積％ジエチルアミン
実施例2A
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製。
実施例1Aからのそのジエチルアミン塩としての粗製ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドを180mlの濃水酸化アンモニウム水溶液30〜32％で処理した。懸濁液を、圧安定密閉フラスコ中、60℃で10時間攪拌した。懸濁液をガラス繊維フィルターでろ過し、60mlの水で洗浄した。黄色ろ液を40℃/300〜10mbar/2hで蒸発させて、約10.5gの粗製オリゴをアンモニウム塩として得た。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 5455.6。合計13の同様に調製した1.6mmolバッチを上記のものと混合し（新しい合計バッチサイズ：22.4mmol）、1つの丸底フラスコ中、750mlの水に溶解した。黄色溶液を52.0mlの10.8M NaOH（561.6mmol）を加えて処理し（pH10）、溶液を40℃/100〜10mbar/2hで蒸発させ、残渣を100mlの水で処理し、40℃/100〜10mbarで減圧濃縮し、この手順を合計4回繰り返した（4回目の蒸留物は7.0のpHを有する）。油性残渣を100mlの2-メチル-2-ブタノールで処理し、40℃/50〜10mbar/2hで蒸発させ（水の共沸除去）、160gを黄色固体として得た。粗生成物を800mlエタノールに懸濁し、40〜45℃に15分間加温し、黄色懸濁液を20〜25℃で1時間撹拌した。懸濁液をろ過し（ベンズアミド、イソブチリルアミド、トリフルオロアセトアミドおよび他の副産物を除去）、ろ過ケークを160mlエタノールで少しずつ洗浄した。生成物を40〜45℃/10mbar/3hで乾燥させ、130.5gの
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として、LC-純度75.6面積％（LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、260nm、勾配A：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン、B：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン）の高密度黄色粉末で得た。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 5455.6。生成物をそれ以上精製せずに実験実施例3Aで用いた）。
実施例2B
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製。
実施例1Bからのそのジエチルアミン塩としての粗製ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドを180mlの濃水酸化アンモニウム水溶液30〜32％で処理した。懸濁液を、圧安定密閉フラスコ中、60℃で10時間攪拌した。懸濁液をガラス繊維フィルターでろ過し、60mlの水で洗浄した。黄色ろ液を40℃/300〜10mbar/2hで蒸発させて、約10.5gの粗製オリゴをアンモニウム塩として得た。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 5197.6。合計25の同様に調製した1.9mmolバッチを上記のものと混合し（新しい合計バッチサイズ：47.5mmol）、1つの丸底フラスコ中、1200mlの水に溶解した。橙色溶液を68.0mlの10.8M NaOH（734.4mmol、15.5当量、pH10）で処理し、溶液を40℃/200〜50mbarで濃縮して約600gの粗製溶液を得、これを200mlの水で処理し、同量を40℃/50mbarで減圧留去し、この手順を合計10回繰り返した（合計2000mlの水を留去し、10回目の蒸留物は7.0のpHを有し、すべてのアンモニアが除去された）。得られた855gの橙色水溶液は最大47.5mmolの生成物
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として含み、これをそれ以上精製せずに実験実施例3Bで用いた。2×20の同様に調製した1.9mmolバッチ（2×38.0mmol）を同じ手順で後処理した、合計123.5mmol。
実施例2C
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製。
表題化合物を実施例2Bと同様に、ex実施例1Cの材料から出発して生成した。得られた148gの黄色水溶液は最大1.9mmolの生成物、
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として含み、これをそれ以上精製せずに実験実施例3Cで用いた。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 5197.6。
実施例2D
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製。
実施例1Cからのそのジエチルアミン塩としての粗製ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドを180mlの濃水酸化アンモニウム水溶液30〜32％で処理した。懸濁液を、圧安定密閉フラスコ中、60℃で10時間攪拌した。懸濁液をガラス繊維フィルターでろ過し、60mlの水/エタノール3/1で洗浄した。黄色ろ液を40℃/300〜10mbar/2hで蒸発させて、約10.5gの粗製オリゴをアンモニウム塩として得た。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 5197.6。残渣10.2g（1.6mmol）を、1つの丸底フラスコ中、250mlの水に溶解した。黄色溶液を2.22mlの10.8M NaOH（24mmol、15当量、pH10）で処理し、溶液を40℃/200〜50mbarで蒸発させて黄色油状物を得、これを10mlの水で2回処理し、同量を40℃/50〜10mbarで減圧留去した（2.蒸留物pH7.0、すべてのアンモニアが除去された）。油性残渣を30mlの2-メチル-2-ブタノールで処理し、40℃/10mbarで蒸発させて、粗生成物9.82gを黄色固体で得た（すべての切断された保護基を含む）そのナトリウム塩としての
Figure 2020520977
を、それ以上精製せずに実験実施例3Dで用いた。
実施例2E
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製。
実施例1Eからのそのジエチルアミン塩としての粗製ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドを25.0mlの濃水酸化アンモニウム水溶液30〜32％で処理した。懸濁液を、圧安定密閉フラスコ中、60℃で10時間攪拌した。懸濁液をガラス繊維フィルターでろ過し、20mlの水で洗浄した。黄色ろ液を40℃/300〜10mbar/2hで蒸発させて、約1.3gの粗製オリゴをアンモニウム塩として得た。残渣を10mlに溶解し、0.28ml（3.0mmol、15当量）の水酸化ナトリウム32％水溶液で処理した。黄色溶液を40℃/100〜15mbar/1hで蒸発させて、黄色固体として0.96g（すべての切断された保護基を含む）の
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として得た。黄色固体を4.8mlのエタノールに懸濁し、40℃で1時間撹拌し、20〜25℃に冷却し、この温度で1時間撹拌した。懸濁液をろ過し、ろ過ケークを1.0mlのエタノールで洗浄し、40℃/15mbar/1hで乾燥して、0.75gのオフホワイト固体（すべての切断された保護基を含む）
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として得た。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 5197.6。
実施例2F
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製。
実施例1Fからのそのジエチルアミン塩としての粗製ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドを25.0mlの濃水酸化アンモニウム水溶液30〜32％で処理した。懸濁液を、圧安定密閉フラスコ中、60℃で10時間攪拌した。懸濁液をガラス繊維フィルターでろ過し、20mlの水で洗浄した。黄色ろ液を0.28ml（3.0mmol、15当量）の水酸化ナトリウム32％水溶液で処理した。黄色溶液を40℃/100〜15mbar/1hで蒸発させて、黄色固体として0.65g（すべての切断された保護基を含む）の
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として得た。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 5197.6。
実施例2G
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製。
表題化合物を実施例2Bと同様に、ex実施例1Gの材料から出発して生成した。得られた1720gの橙色水溶液は最大15.2mmolの生成物、
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として含み、これをそれ以上精製せずに実験実施例3Eで用いた。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 6357.7。
実施例2H
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製。
表題化合物を実施例2Bと同様に、ex実施例1Hの材料から出発して生成した。得られた1920gの橙色水溶液は最大15.2mmolの生成物、
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として含み、これをそれ以上精製せずに実験実施例3Fで用いた。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 6748.8。
実施例2I
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製。
表題化合物を実施例1Iからのそのジエチルアミン塩としての粗製CF3CO-
Figure 2020520977
1.00gの限外ろ過/透析ろ過により生成した。実施例1Iの材料を水（150mL）に溶解し、得られた溶液を、2つのSartocon Slice Hydrosart 2KD 0.1 m2膜を備えたAkta-Cross-Flowで、0.1M NaOH（1.0L）と、続いて0.1M NaHCO3（1.0L）および1M NaCl（1.0L）を用いて透析ろ過した。最終脱塩段階をH2O（2.0L）で実施した。得られた溶液を減圧下で濃縮し、EtOH（5mL）により室温で1時間粉砕し、ろ過し、減圧下で乾燥（24℃/10mbar/12h）して、表題化合物をそのナトリウム塩で得た（白色固体、410mg、収率40％）。この材料をそれ以上精製せずに実施例3Gで用いた。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 6357.7。
実施例2J
Figure 2020520977
のそのアンモニウム塩としての調製。
表題化合物をex実施例1Jの材料から出発して生成した。実施例1Jからのそのジエチルアミン塩としての粗製ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドを20mlの濃水酸化アンモニウム水溶液30〜32％で処理した。懸濁液を、圧安定密閉フラスコ中、45℃で10時間攪拌した。懸濁液をガラス繊維フィルターでろ過し、10mlの水で洗浄した。黄色ろ液を40℃/300〜10mbar/2hで蒸発させて、0.45gの粗製オリゴをアンモニウム塩として得た。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 6357.7。
実施例3A
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製
Figure 2020520977
GalNAc活性化：
30.5g（20.6mmol）のGalNAcクラスターナトリウム塩を300mlのDMFに20〜25℃で溶解し、300ml DMF中の1.22ml（18.1mmol）のオルトリン酸85％水溶液の溶液を2分間で加えた。20〜25℃で5分後、2.61g（22.7mmol）のN-ヒドロキシスクシンイミドをわずかに濁った無色溶液に加え、続いて4.75g（24.8mmol）のEDC・HCl（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩）を加えた。無色のわずかに濁った溶液を20〜25℃で3時間撹拌し、カップリング段階で用いた。
GalNAcカップリング：
900mlのメタノール、30mlの水、および20.7ml（119mmol）のN-エチルジイソプロピルアミン中、60.0g（10.3mmol）のそのナトリウム塩としての
Figure 2020520977
（実施例2Aから）のあらかじめ生成した溶液を40〜45℃に加温し、前に調製した活性化溶液に1分間で加えた。生成した黄色懸濁液を40〜45℃で0.5時間撹拌した。黄色懸濁液に、100mlの水を加え、懸濁液をガラス繊維フィルターでろ過して、
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての澄明黄色溶液を、LC純度68.2面積％（LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、260nm、勾配A：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン、B：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン）で得た。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 6891.3、これを次いで実験実施例4Aで精製し、単離した。
実施例3B
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製
Figure 2020520977
GalNAc活性化：
112.1g（75.9mmol）のGalNAcクラスターナトリウム塩を640mlのDMFに20〜25℃で溶解し、640ml DMF中の4.48ml（66.4mmol、1.4当量）のオルトリン酸85％水溶液の溶液を2分間で加えた。20〜25℃で5分後、13.1g（114mmol、2.4当量）のN-ヒドロキシスクシンイミドをわずかに濁った無色溶液に加え、続いて21.8g（24.8mmol、2.4当量）のEDC・HCl（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩）を加えた。無色のわずかに濁った溶液を20〜25℃で4時間撹拌し、カップリング段階で用いた。
GalNAcカップリング：
実験実施例2Bからのそのナトリウム塩としての
Figure 2020520977
の溶液、855g（47.5mmol）を3400mlの水で希釈し、95.3ml（546mmol）のN-エチルジイソプロピルアミンおよび2100mlのDMSOを加え、溶液を40〜45℃に加温し、前に調製した活性化溶液に1分間で加えた。黄色溶液を40〜45℃で0.5時間撹拌して、
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として得た。HPLC、粗製溶液中46.9面積％（LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、260nm、勾配A：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン、B：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン）。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Detector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 6633.3、これを次いで実験実施例4B1で、実験2Bから2×20の同様に調製した1.9mmolバッチ（2×38.0mmol）と共に精製し、単離した。
実施例3C
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製。
表題化合物を実施例3Bと同様に、ex実施例2Cの材料から出発して生成した。
得られた約275gの黄色水溶液は最大1.5mmolの生成物、
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として含んだ。230gの黄色溶液をロータリーエバポレーターにより40℃/50mbarで溶液重量が約115gになるまで濃縮した。濃縮黄色溶液を20〜25℃まで冷却し、230mlの1-プロパノールに20〜25℃で30分間かけて滴加した。生成した白色懸濁液を20〜25℃で16時間撹拌し、G3フィルターでろ過した。オフホワイトのろ過ケークを合計50mlの1-プロパノールで洗浄し、40℃/10mbarで1時間乾燥して、9.66gの粗製
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として、HPLC純度50.3面積％で得た。（LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、260nm、勾配A：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン、B：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン）。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Detector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 6633.3。
実施例3D
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製。
表題化合物を実施例3Bと同様に、ex実施例2Dの材料から出発して生成した。
GalNAc活性化：
2.54g（1.72mmol）のGalNAcクラスターナトリウム塩を24.0mlのDMFに20〜25℃で溶解し、24.0ml DMF中の0.100ml（1.50mmol、1.175当量）のオルトリン酸85％水溶液の溶液を2分間で加えた。20〜25℃で5分後、0.22g（1.90mmol、2.2当量）のN-ヒドロキシスクシンイミドをわずかに濁った無色溶液に加え、続いて0.40g（2.06mmol、2.4当量）のEDC・HCl（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩）を加えた。無色のわずかに濁った溶液を20〜25℃で3時間撹拌し、カップリング段階で用いた。
GalNAcカップリング：
実験実施例2Dからのそのナトリウム塩としての
Figure 2020520977
の固体、4.75g（0.859mmol）を70mlの水に溶解し、1.70ml（9.9mmol）のN-エチルジイソプロピルアミンおよび38mlのDMSOで処理し、溶液を40〜45℃に加温し、前に調製した活性化溶液に1分間で加えた。黄色溶液を40〜45℃で0.5時間撹拌して、そのナトリウム塩としての
Figure 2020520977
の溶液170gを得た。黄色溶液をロータリーエバポレーターにより40℃/50mbarで溶液重量が80gになるまで濃縮した。濃縮黄色溶液を20〜25℃まで冷却し、160mlの1-プロパノールに20〜25℃で30分間かけて滴加した。生成した白色懸濁液を20〜25℃で2時間撹拌し、G3フィルターでろ過した。ろ過ケークを合計30mlの1-プロパノールで洗浄し、40℃/20mbarで1時間乾燥して、6.05gの粗製
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として、HPLC純度57.2面積％で得た。（LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、260nm、勾配A：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン、B：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン）。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Detector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 6633.3、これを次いで実験実施例4Cおよび実施例4Dで精製し、単離した。
実施例3E
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製
Figure 2020520977
表題化合物を実施例3Bと同様に、ex実施例2Gの材料から出発して生成した。得られた約3500gの黄色溶液は15.2mmolの生成物、
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として含み、これをそれ以上精製せずに実験実施例4E1で用いた。
実施例3F
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製
Figure 2020520977
表題化合物を実施例3Bと同様に、ex実施例2Hの材料から出発して生成した。得られた約3500gの黄色溶液は最大15.2mmolの生成物、
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として含み、これをそれ以上精製せずに実験実施例4F1で用いた。
実施例3G
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製
表題化合物を実施例3Bと同様に、ex実施例2Iの材料から出発して生成した。黄色溶液をロータリーエバポレーターにより40℃/50mbarで溶液重量が4.9gになるまで濃縮した。濃縮黄色溶液を20〜25℃まで冷却し、10mlの1-プロパノールに20〜25℃で5分間かけて滴加した。生成した白色懸濁液を20〜25℃で12時間撹拌し、G3フィルターでろ過した。ろ過ケークを合計5mlの1-プロパノールで洗浄し、40℃/20mbarで1時間乾燥して、530mgの粗製
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として、HPLC純度57.2面積％で得た。（LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、260nm、勾配A：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン、B：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン）。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Detector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 7793.4。
実施例4A
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての精製および単離
実施例3Aからの溶液を、Tosoh TSK Gel Super Q-5PW、30μmを充填した9Lカラムでのイオン交換クロマトグラフィー（IEX）により、クロマトグラフィーを2回行って精製した。各回1.5Lの粗製溶液を吸着させ、50mM NaHCO3 pH9.0 EtOH 80/20（移動相A）から50mM NaHCO3 pH9.0/EtOH 80/20 + 1.2M NaCl（移動相B）の直線勾配で溶出した。
勾配：
Figure 2020520977
流速：0.8L/min
検出：290nm
温度：20〜25℃
分画を溶出特性により分取した。分画を集め（9L）、限外ろ過（UF）により濃縮した。
UFを2×0.57（Milliporeの1.14m2 Pellicon2 3kD膜で実施した。9Lの溶液を約3Lまで濃縮し、Amicon SP 20 UFユニットで20Lの水により、透過物の最終導電率35μS/cmまで透析ろ過した。
溶液をLyostar II凍結乾燥器で、lyoguardトレイ中、1回の凍結乾燥サイクルで凍結乾燥し、43gの乾燥白色粉末を得た。21〜22℃および38〜42％相対湿度で4日間調整した後、合計46.4gの
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として白色非晶質粉末で単離し、水含有量12.7％および純度90.2％（LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、260nm、勾配A：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン、B：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン）であった。
リンカードメインの2D-1H/13C-NMR分光法を用いて、GN2bに対するGN2aのエピマー比（17ページ参照）約64％〜約36％が検出された。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Detector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 6891.3。
実施例4B1
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての精製
実施例3Bからの溶液を、Tosoh TSK Gel Super Q-5PW、30μmを充填した9LカラムでのIEXにより、クロマトグラフィーを47回行って精製した。各回0.4Lの粗製溶液を吸着させ、50mM NaHCO3 pH9.0 EtOH 80/20（移動相A）から50mM NaHCO3 pH9.0/EtOH 80/20 + 1.2M NaCl（移動相B）の直線勾配で溶出した。
勾配：
Figure 2020520977
流速：0.8L/min
検出：290nm
温度：20〜25℃
分画を溶出特性により分取した。分画を集め（220L）、限外ろ過（UF）により濃縮した。
UFを2×0.57（Milliporeの1.14m2 Pellicon2 3kD膜で実施した。220Lの溶液を約3Lまで濃縮し、Amicon SP 20 UFユニットで20Lの水により、透過物の最終導電率＜50μS/cmまで透析ろ過した。
得られた濃縮物は、直接凍結乾燥（3段階行程）することもでき、または実施例4B2に記載のとおり逆相クロマトグラフィー（RP）によりさらに精製することもできる。
前記溶液をLyostar II凍結乾燥器で、2つのlyoguardトレイ中、1回の凍結乾燥サイクルで凍結乾燥し、174gの乾燥白色粉末を得た。
21℃および50％相対湿度で2日間調整した後、合計203.9gの
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として白色非晶質粉末で単離し、水含有量16.2％および純度89.0％（LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、260nm、勾配A：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン、B：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン）であった。リンカードメインの2D-1H/13C-NMR分光法を用いて、GN2bに対するGN2aのエピマー比（17ページ参照）約43.9％〜約56.1％が検出された。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Detector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 6633.3。
実施例4B2
実施例4B1からの凍結乾燥粉末1.6gを逆相クロマトグラフィー（RP）を用いてさらに精製した。
材料を16mlの0.2M酢酸ナトリウムに溶解し、YMC Triart prep C8-S、10μm 250×30mmカラムで、クロマトグラフィーを2回行って分離した。各回8mlの溶液を吸着させ、0.2M酢酸ナトリウム（移動相A）からアセトニトリル（移動相B）の直線勾配で溶出した。
勾配：
Figure 2020520977
流速：30mL/min
検出：290nm
温度：20〜25℃
分画を溶出特性により分取した。分画を集め、濃縮し、Amicon Ultra-15遠心フィルター、3kDでの限外ろ過（UF）により透析ろ過した。得られた濃縮物を凍結乾燥して、0.9gの白色非晶質粉末を得、実施例4B1に記載の分析法により決定した純度面積93.9％であった。
実施例4C
クロマトグラフィー精製の順序は交換可能である。逆相クロマトグラフィー（RP）で開始し、続いてイオン交換クロマトグラフィー（IEX）を行う精製は、IEXを最初に行い、その後RPクロマトグラフィーを行う場合と収率および純度が同じとなる。
第1のクロマトグラフィー−RP：実験実施例3Dからの1gを10mlの0.2M酢酸ナトリウムに溶解し、逆相（RP）クロマトグラフィーを用い、YMC Triart prep C18-S、10μm 250×4.6mmカラムでクロマトグラフィーを50回行って精製した。各回0.2mlの溶液を吸着させ、0.2M酢酸ナトリウム（移動相A）からアセトニトリル（移動相B）の直線勾配で溶出した。
勾配：
Figure 2020520977
流速：0.7mL/min
検出：310nm
温度：45℃
分画を溶出特性により分取した。分画を集め（250ml）、濃縮し（150ml）、0.1m2 Millipore Pellicon II膜（3kDa）を備えたGEクロスフローユニットでの限外ろ過（UF）により、1.5Lの水で透析ろ過した。得られた濃縮物を凍結乾燥して、0.375gの白色非晶質粉末を得、実施例4B1に記載の分析法により決定した純度91.3面積％であった。
第2のクロマトグラフィー−IEX：この材料0.355gをアニオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した。材料を10mlの50mM炭酸水素ナトリウムpH9.0/EtOH 80/20に溶解し、Tosoh TSK Gel Super Q-5PW、30μmを充填したカラム（10×220mm）で、50mM NaHCO3 pH9.0 EtOH 80/20（移動相A）から50mM NaHCO3 pH9.0/EtOH 80/20 + 1.2M NaCl（移動相B）の直線勾配により、クロマトグラフィーを11回行って精製した。
勾配：
Figure 2020520977
流速：1.3mL/min
検出：300nm
温度：30℃
分画を溶出特性により分取した。分画を集め（150ml）、0.1m2 Millipore Pellicon II膜（3kDa）を備えたGEクロスフローユニットでの限外ろ過（UF）により、1.5Lの水で透析ろ過した。得られた濃縮物を凍結乾燥して、0.246gの白色非晶質粉末を得、実施例4B1に記載の分析法により決定した純度92.8面積％であった。
実施例4D
第1のクロマトグラフィー−IEX：実験実施例3Dからの1gを10mlの0.2M酢酸ナトリウムに溶解し、Tosoh TSK Gel Super Q-5PW、30μmを充填したカラム（10×220mm）で、50mM NaHCO3 pH9.0 EtOH 80/20（移動相A）から50mM NaHCO3 pH9.0/EtOH 80/20 + 1.2M NaCl（移動相B）の直線勾配により、クロマトグラフィーを34回行って精製した。
勾配：
Figure 2020520977
流速：1.3mL/min
検出：300nm
温度：30℃
分画を溶出特性により分取した。分画を集め（250ml）、濃縮し（150ml）、0.1m2 Millipore Pellicon II膜（3kDa）を備えたGEクロスフローユニットでの限外ろ過（UF）により、1.5Lの水で透析ろ過した。得られた濃縮物を凍結乾燥して、0.292gの白色非晶質粉末を得、実施例4B1に記載の分析法により決定した純度87.7面積％であった。
第2のクロマトグラフィー−RP：この材料0.272gを3mlの0.2M酢酸ナトリウムに溶解し、逆相（RP）クロマトグラフィーを用い、YMC Triart prep C18-S、10μm 250×4.6mmカラムでクロマトグラフィーを18回行って精製した。各回0.18mlの溶液を吸着させ、0.2M酢酸ナトリウム（移動相A）からアセトニトリル（移動相B）の直線勾配で溶出した。
勾配：
Figure 2020520977
流速：0.7mL/min
検出：310nm
温度：45℃
分画を溶出特性により分取した。分画を集め（150ml）、0.1m2 Millipore Pellicon II膜（3kDa）を備えたGEクロスフローユニットでの限外ろ過（UF）により、1.5Lの水で透析ろ過した。得られた濃縮物を凍結乾燥して、0.19gの白色非晶質粉末を得、実施例4B1に記載の分析法により決定した純度93.7面積％であった。
実施例4E1
実施例3Eからの溶液を、Tosoh TSK Gel Super Q-5PW、30μmを充填した9LカラムでのIEXクロマトグラフィーにより、クロマトグラフィーを8回行って精製した。各回0.3〜0.38Lの粗製溶液を吸着させ、50mM NaHCO3 pH9.0 EtOH 80/20（移動相A）から50mM NaHCO3 pH9.0/EtOH 80/20 + 1.2M NaCl（移動相B）の直線勾配で溶出した。
勾配：
Figure 2020520977
流速：0.8L/min
検出：294nm
温度：20〜25℃
分画を溶出特性により分取した。分画を集め（48L）、限外ろ過（UF）により濃縮した。
UFをSartoriusの2×0.1m2 Sartocon Slice Hydrosart膜で実施した。48Lの溶液を1.4Lまで濃縮し、GEクロスフローUFユニットで水により、透過物の最終導電率＜50μS/cmまで透析ろ過した。
溶液をLyostar II凍結乾燥器で、1つのlyoguardトレイ中、1回の凍結乾燥サイクルで凍結乾燥し、51gの乾燥白色粉末を得た。21℃および50％相対湿度で2日間調整した後、合計60.5gの
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として白色非晶質粉末で単離し、水含有量15.7％および純度85.4面積％（LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、260nm、勾配A：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン、B：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン）であった。リンカードメインの2D-1H/13C-NMR分光法を用いて、GN2bに対するGN2aのエピマー比（17ページ参照）約50.8％〜約49.2％が検出された。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Detector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 7793.4。
実施例4E2
実施例4E1からの凍結乾燥粉末0.5gをRPクロマトグラフィーを用いてさらに精製した。
材料を3.3mlの0.2M酢酸ナトリウムに溶解し、YMC Triart prep C8-S、10μm 250×4.6mmカラムで、クロマトグラフィーを33回行って分離した。各回0.1mlの溶液を吸着させ、0.2M酢酸ナトリウム（移動相A）からアセトニトリル（移動相B）の直線勾配で溶出した。
勾配：
Figure 2020520977
流速：0.7mL/min
検出：290nm
温度：45℃
分画を溶出特性により分取した。分画を集め（100ml）、水で希釈し（400ml）、Sartoriusの2×0.1m2 Sartocon Slice Hydrosart膜を備えたGEクロスフローユニットでの限外ろ過（UF）により濃縮し（150ml）、1.5Lの水で透析ろ過した。得られた濃縮物を凍結乾燥して、0.29gの白色非晶質粉末を得、実施例4E1に記載の分析法により決定した純度91.9面積％であった。
実施例4E3
純度85.4面積％の
Figure 2020520977
、5.0gを実施例4E1と同様に調製し、精製した。次いで、実施例4E2と同様に、材料をRPクロマトグラフィー、UFでさらに精製し、凍結乾燥により単離して、純度89.8面積％の
Figure 2020520977
、2.5gを得た。材料を50mlの水に溶解した後、無色溶液を次いでProcept噴霧乾燥機（120℃）で噴霧乾燥して、実施例4E1に記載の分析法により決定した純度89.5面積％の
Figure 2020520977
、1.8gを得た。LC/MS、NMRおよびEA（元素分析）技術による、噴霧乾燥中に材料が（部分的）分解を起こすという分析所見（hind）は見られなかった。その結果、IEXおよび/またはRPクロマトグラフィーならびに続くUF後の材料単離を、噴霧乾燥または凍結乾燥のいずれかにより行うことができる。
実施例4E4
実施例3Eと同様に調製した、純度55.4面積％の粗製
Figure 2020520977
の溶液（7.2ml）を、14.4mlの0.2M酢酸ナトリウムで希釈し、YMC Triart C8 prep 120、10μm 250×4.6mmカラムでクロマトグラフィーを36回行って精製した。ここで、各回0.6ml分画の溶液を吸着させ、0.2M酢酸ナトリウム（移動相A）からアセトニトリル（移動相B）の直線勾配で溶出した。
勾配：
Figure 2020520977
流速：0.7mL/min
検出：300nm
温度：45℃
標的分画を集め（50ml）、GEクロスフローUFユニット上、Sartoriusの0.1m2 Sartocon Slice Hydrosart膜での限外ろ過により濃縮し、水により、透過物の最終導電率＜50μS/cmまで透析ろ過した。溶液を凍結乾燥して、実施例4E1に記載の分析法により決定した純度87.6面積％の
Figure 2020520977
、120mgを得た。
実施例4F1
実施例3Fからの溶液を、Tosoh TSK Gel Super Q-5PW、30μmを充填した9LカラムでのIEXクロマトグラフィーにより、クロマトグラフィーを8回行って精製した。各回0.35Lの粗製溶液を吸着させ、50mM NaHCO3 pH9.0 EtOH 80/20（移動相A）から50mM NaHCO3 pH9.0/EtOH 80/20 + 1.2M NaCl（移動相B）の直線勾配で溶出した。
勾配：
Figure 2020520977
流速：0.8L/min
検出：294nm
温度：20〜25℃
分画を溶出特性により分取した。分画を集め（29L）、限外ろ過（UF）により濃縮した。
UFをSartoriusの2×0.1m2 Sartocon Slice Hydrosart膜で実施した。29Lの溶液を3.2Lまで濃縮し、GEクロスフローUFユニットで水により、透過物の最終導電率＜50μS/cmまで透析ろ過した。
溶液をLyostar II凍結乾燥器で、2つのlyoguardトレイ中、1回の凍結乾燥サイクルで凍結乾燥し、43gの乾燥白色粉末を得た。
21℃および50％相対湿度で2日間調整した後、合計50.2gの
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として白色非晶質粉末で単離し、水含有量16.4％および純度85.0面積％（LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、260nm、勾配A：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン、B：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン）であった。リンカードメインの2D-1H/13C-NMR分光法を用いて、GN2bに対するGN2aのエピマー比（17ページ参照）約49.3％〜約50.7％GN2bが検出された。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Detector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 8184.4。
実施例4F2
実施例4F1からの凍結乾燥粉末0.5gをRPクロマトグラフィーを用いてさらに精製した。
材料を3.3mlの0.2M酢酸ナトリウムに溶解し、YMC Triart prep C8-S、10μm 250×4.6mmカラムで、クロマトグラフィーを33回行って分離した。各回0.1mlの溶液を吸着させ、0.2M酢酸ナトリウム（移動相A）からアセトニトリル（移動相B）の直線勾配で溶出した。
勾配：
Figure 2020520977
流速：0.7mL/min
検出：290nm
温度：45℃
分画を溶出特性により分取した。分画を集め（100ml）、水で希釈し（400ml）、Sartoriusの2×0.1m2 Sartocon Slice Hydrosart膜を備えたGEクロスフローユニットでの限外ろ過（UF）により濃縮し（150ml）、透析ろ過（1.5Lの水）した。得られた濃縮物を凍結乾燥して、0.29gの白色非晶質粉末を得、実施例4F1に記載の分析法により決定した純度91.9面積％であった。
実施例5
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての合成
段階1：
Figure 2020520977
のそのジエチルアンモニウム塩としての調製
用語：A、G、T、MeC（5-メチルシトシン）＝LNA；a、t、c、g＝DNA；*＝ジアステレオマー混合物としてのホスホルチオエート；AM-C6＝アミノリンカーC6；GN2＝GalNAcクラスター；CF3CO＝TFA＝トリフルオロアセチル；bz＝ベンゾイル；ibu＝イソブチリル；dmf＝ジメチルホルムアミジン
表題化合物を、AEKTA Oligopilot 100（GE Healthcare, Freiburg, Germany）およびPrimer Support Unylinker（Kinovate Nittophase(登録商標)HL UnyLinker(商標)400，USA）を用い、1.90mmolの規模で固相上の標準的なホスホラミダイト化学によって生成した。LNA、すなわち2'-OCH2-4'架橋ヌクレオチドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）およびDNAヌクレオシドモノマー（Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany）を含むオリゴヌクレオチドを、対応するホスホラミダイトおよびTFA保護アミノリンカー-ホスホラミダイト（Link Technologies, Scotland, UK）を用いて生成した。一般に、カップリング1回につき1.5当量のDNA/LNA-ホスホラミダイトおよび2.0当量のTFA-アミノリンカー-ホスホラミダイトを用いた。ホスホロチオール化試薬（キサンタンヒドリド）、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン（ABCR、AB251827）を無水アセトニトリル/ピリジン1/1中の0.1M溶液として用いた。他のすべての標準試薬溶液（DCA-debloc、BTT、Cap A、B1、B2、Oxidizer、DEA washは市販品であった（Sigma-Aldrich、Merck Millipore、EMP Biotech；以下の詳細参照）。2-シアノエチル基の脱保護は、無水アセトニトリル中ジエチルアミンでの洗浄（DEA-wash）によって達成され、粗製保護ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドをジエチルアンモニウム塩として得た。このようにして得た表題化合物は、実験2でさらなる操作を行わずに用いた。
標準試薬溶液
DCA-deblock トルエン中3体積％ジクロロ酢酸
BTT活性化剤 アセトニトリル中0.3M 5-ベンジルチオテトラゾール
Cap A アセトニトリル中20体積％1-メチルイミダゾール
Cap B1 アセトニトリル中40体積％無水酢酸
Cap B2 アセトニトリル中60体積％ピリジンまたは2,6-ルチジン
Oxidizer 0.05M 水/ピリジン/ヨウ素 10/90/1.27（v/v/w）
チオール化 ピリジン/MeCN 1：1（v/v）中0.1M 3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン
DEA wash アセトニトリル中20体積％ジエチルアミン
段階2：
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製
実験1からのそのジエチルアンモニウム塩としての粗製ポリマー支持体結合Unylinker-LNA-オリゴヌクレオチドを180mlの濃水酸化アンモニウム水溶液30〜32％で処理した。懸濁液を、圧安定密閉フラスコ中、60℃で10時間攪拌した。懸濁液をガラス繊維フィルターでろ過し、60mlの水で洗浄した。黄色ろ液を40℃/300〜10mbar/2hで蒸発させて、約14.5gの粗製オリゴをアンモニウム塩として得た。生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Dedector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 6362.1。合計51の同様に調製した1.9mmolバッチおよび2つの3.8mmolバッチを上記のものと混合し（新しい合計バッチサイズ：106.7mmol）、1つの丸底フラスコ中、4.0Lの水に溶解した。橙色溶液を189mlの10.8M NaOH（2.04mol、19.1当量）で処理した。沈澱した固体をろ過し、200mlの水で洗浄し、ろ液を40℃/200〜60mbarで濃縮して約1.5kgの粗製溶液を得、これを2Lの水で処理し、同量を40℃/50mbarで減圧留去し、この手順を2回、蒸留物がアンモニアがないことを示すpH7〜7.5に達するまで繰り返した。懸濁液を水で希釈して10kgの懸濁液を得、これを再度ろ過し、固体を200mlの水で洗浄して、9.67kgの褐色溶液（理論上7.4重量％の粗生成物を含む）得、これをそれ以上精製せずに数バッチで用いた。
段階3：1、RO7191863-001、
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての調製
GalNAc活性化：
82.6g（55.9mmol）のGalNAcクラスターナトリウム塩を600mlのDMFに20〜25℃で溶解し、600ml DMF中の3.3ml（48.9mmol、1.13当量）のリン酸85％水溶液の溶液を2分間で加えた。20〜25℃で5分後、9.66g（83.9mmol、1.94当量）のN-ヒドロキシスクシンイミドを無色溶液に加え、続いて16.1g（84mmol、1.94当量）のEDC・HCl（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩）を加えた1。無色のわずかに濁った溶液を20〜25℃で4時間撹拌し、カップリング段階で用いた。
GalNAcカップリング：
理論的に292g（43.3mmol）の
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として含む、実験実施例2からの溶液、3.95kgに、70.3ml（402mmol）のN-エチルジイソプロピルアミンおよび1.98LのDMSOを加え、溶液を40〜45℃に加温し、上記活性化GalNAc溶液に1分間で加えた。黄色溶液を40〜45℃で0.5時間撹拌して、そのナトリウム塩としての
Figure 2020520977
の粗製溶液を得た。HPLCは粗製溶液中56.5面積％を示した（LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、260nm、勾配A：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン、B：水/CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/トリエチルアミン）。
この溶液を精製まで4℃で貯蔵した。貯蔵後、残存ベンズアミドの沈澱が生じ、これを精製前にろ去した。この手順を同じ規模で1回と、半分の規模で1回繰り返し、3つの個々の反応混合物を精製のために混合した。
段階4：
Figure 2020520977
のそのナトリウム塩としての精製＆単離
GalNAcカップリング反応から得た溶液を、逆相クロマトグラフィーを用いて精製した。15cmのID DACカラムに2.5kgのYMC Triart prep C8-Sをカラム圧80barまで充填した。粗製カップリング反応物を0.2M酢酸ナトリウム溶液で体積比50/50に希釈して供給溶液を調製し、勾配溶出（注入：400ml供給溶液。勾配：A：0.2M酢酸ナトリウム、B：アセトニトリル）によるクロマトグラフィー77回で完全に分離した。
勾配：
Figure 2020520977
勾配は標的ピークの溶出後に停止した。
流速：700mL/min検出：300nm
温度：45℃
クロマトグラムは勾配ならびに分画カットを示す。主要標的分画をc4とc5との間で分取し、一方、副次分画は他のカットの間で分取した。
すべての分画をプールごとにまとめた。
c2とc3との間で分取したプール1は廃棄し、一方、他のプールは2×Pellicon 3 Kassetten 0.57m2での限外ろ過により濃縮し、脱塩した。
濃縮：入口圧力：3.0bar；出口圧力：0.5bar；透過流速：200ml/min
脱塩：入口圧力：3.0bar；出口圧力：0.5bar；透過流速：50ml/min
主要標的プール70Lを3Lまで濃縮し、導電率＜100uS/cmまで透析ろ過し、2つのlyoguardで凍結乾燥して、188gの凍結乾燥粉末（88.70面積％）を得た。しかし、最終濃度で材料が膜を通過し始めた。
副次分画プールを合わせて濃縮し、前述のとおりに透析ろ過し、別々に凍結乾燥して、120gの凍結乾燥粉末（88.62面積％）を得た。
均質な材料を得るために、両方のバッチを混合し、3Lの水に溶解し、再度凍結乾燥して、305gの凍結乾燥粉末（88.80面積％）を得た。
材料は非常に吸湿性であるため、凍結乾燥後にlyoguardを21℃および50％相対湿度の人工気候室内で重量が一定になるまで調整し、これは48時間後に達成された。
調整後、合計355gの
Figure 2020520977
をそのナトリウム塩として純度90.35％および水含有量16％、全収率30.7％で単離した。生成物の純度をHPLCで決定した（LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity Series LC129；カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm；カラム温度：80℃；試料温度：15℃；流速0.4mL/min；検出210nm/260nm；移動相A：200mMヘキサフルオロ-2-プロパノール + 5mMヘキシルアミン + 4mMトリエチルアミン + 40μL H3PO4；移動相B：90％MeOH/10％アセトニトリル。
勾配：
Figure 2020520977
生成物の同一性をUPLC-MSで決定した（Waters UPLC ACQUITY H-class、Waters MS SQ Detector H-class SQD、カラム：Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7μm 2.1×50mm、勾配A：95％水/2.5％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリメチルアミン、B：17.5％水/80％CH3OH/0.2Mヘキサフルオロ-2-プロパノール/16.3mmolトリエチルアミン）。UPLC-MS: m/z 7793.4。

Claims (22)

  1. GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体を調製するための方法であって、以下の段階を含む方法：
    （a）固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドまたはその脂肪族アミン塩を生成する段階；
    （b）オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、アンモニア存在下で保護基を除去し、それにより無保護オリゴヌクレオチドのアンモニウム塩を提供する段階；
    （c）オリゴヌクレオチドのアンモニウム塩からオリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはテトラアルキルアンモニウム塩への塩交換を行い、それにより任意の遊離アンモニアまたは残留脂肪族アミンを除去する段階；
    （d）オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはテトラアルキルアンモニウム塩をGalNAcクラスター化合物またはその塩とカップリングする段階；および最後に、
    （e）GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体を精製する段階。
  2. オリゴヌクレオチドが5'-アミノ修飾オリゴヌクレオチドである、請求項1記載の方法。
  3. 5'アミノ修飾基が、アミノ基保護されていてもよいアミノC2〜12-アルキルリンカーまたは1〜10のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコールリンカーから選択される、請求項2記載の方法。
  4. オリゴヌクレオチドが、修飾されていてもよいDNA、RNAもしくはLNAヌクレオシドモノマーまたはその組み合わせからなり、かつ7〜30ヌクレオチドの長さである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
  5. オリゴヌクレオチドが、DNAもしくはLNAヌクレオシドモノマーまたはその組み合わせからなり、かつ10〜25ヌクレオチドの長さである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
  6. 段階（a）において、脂肪族アミン塩がモノ-、ジ-もしくはトリ-C1〜4-アルキルアミンまたは環式脂肪族アミン塩である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
  7. ジエチルアミン塩を生成する、請求項6記載の方法。
  8. 段階（b）において、アンモニア水を用いる、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
  9. 段階（c）において、オリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の水溶液を生成する、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
  10. 水溶液からのオリゴヌクレオチドのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の単離が、
    （a）水を蒸発させ、続いて適切な有機溶媒を用いて残存する水を共沸除去することにより行われるか、または
    （b）蒸気相のpHがpH7に達するまで、連続部分蒸発（一定量および水の添加による）させることにより行われるか、または
    （c）アルカリ金属塩水溶液またはアルカリ土類金属塩水溶液に対する接線流ろ過により行われるか、または
    （d）アニオン交換クロマトグラフィーと、続く接線流ろ過による脱塩および濃縮により行われる、
    請求項9記載の方法。
  11. 段階（d）におけるカップリングが、以下の式のGalNAcクラスター化合物、その対応する塩、鏡像異性体および立体異性体と実施される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法：
    Figure 2020520977
    式中、R2は水素またはヒドロキシ保護基であり、かつnは0〜10の整数である。
  12. 式IのGalNAcクラスター化合物が、式Iaのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩である、請求項11記載の方法：
    Figure 2020520977
    式中、M+/++はアルカリ金属またはアルカリ土類金属のカチオンである。
  13. 段階（d）におけるオリゴヌクレオチドのGalNAcクラスター化合物またはその塩とのカップリングが、第1段階において、カップリング剤によるGalNAcクラスター化合物の活性化と、第2段階において、アミン塩基および有機溶媒存在下、活性化GalNAcクラスター化合物とオリゴヌクレオチドのカップリングとを含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
  14. カップリング剤が、DCC（N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド）またはEDC（N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド-塩酸塩）またはTBTU（N,N,N',N'-テトラメチル-O-(ベンゾトリアゾル-1-イル)ウロニウムテトラフルオロボレート、HBTU（2-(1H-ベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、およびHOBt（1-ヒドロキシベンズトリアゾール）、HOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）またはHOAt（1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール）から選択される添加剤、ならびにその組み合わせから選択される、請求項13記載の方法。
  15. アミン塩基が3級アミンであり、有機溶媒が極性非プロトン性溶液であり、かつ反応温度が20℃〜70℃の範囲である、請求項13または14記載の方法。
  16. カップリング剤が、3級アミン塩基と共に、n-プロピルホスホン酸無水物（T3P）または3-(ジエトキシ-ホスホリルオキシ)-1,2,3-ベンゾ[d]トリアジン-4(3H)-オン（DEPBT）である、請求項13記載の方法。
  17. 段階（e）におけるGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の精製が、クロマトグラフィー、濃縮および単離の段階を含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
  18. 精製が以下の順序の段階を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法：
    I. クロマトグラフィー、
    II. 濃縮、
    III. 単離、
    または
    I. クロマトグラフィー、
    II. 濃縮、
    III. クロマトグラフィー、
    IV. 濃縮、
    V. 単離、
    または
    I. クロマトグラフィー、
    II. 濃縮、
    III. 単離、
    IV. クロマトグラフィー、
    V. 濃縮、
    VI. 単離。
  19. 精製が以下の順序の段階を含む、請求項18記載の方法：
    I. クロマトグラフィー、
    II. 濃縮、
    III. 単離、
    または
    I. クロマトグラフィー、
    II. 濃縮、
    III. クロマトグラフィー、
    IV. 濃縮、
    V. 単離。
  20. 精製が以下の順序の段階を含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法：
    I. アニオン交換クロマトグラフィーもしくは逆相クロマトグラフィー、
    II. 接線流ろ過、
    III. 凍結乾燥もしくは噴霧乾燥、
    または
    I. アニオン交換クロマトグラフィーもしくは逆相クロマトグラフィー、
    II. 接線流濾過、
    III. アニオン交換クロマトグラフィーもしくは逆相クロマトグラフィー、
    IV. 接線流ろ過、
    V. 凍結乾燥もしくは噴霧乾燥。
  21. オリゴヌクレオチドが下記から選択される、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法：
    Figure 2020520977
    ここで、AM-C6はC6アミノリンカーを意味し；*はホスホルチオエート架橋を表し；A、G、TおよびMeC（5-メチルシトシン）はLNAヌクレオシドモノマーであり、かつa、t、c、gはDNAヌクレオシドモノマーである。
  22. GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体が下記から選択される、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法：
    Figure 2020520977
    ここで、AM-C6はC6アミノリンカーを意味し；*はホスホルチオエート架橋を表し；A、G、TおよびMeC（5-メチルシトシン）はLNAヌクレオシドモノマーであり、a、t、c、gはDNAヌクレオシドモノマーであり、かつGN2はGalNAcクラスターである。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111867638A (zh) * 2018-01-26 2020-10-30 豪夫迈·罗氏有限公司 放射性标记的寡核苷酸及其制备方法
SG11202007218YA (en) 2018-01-29 2020-08-28 Hoffmann La Roche Process for the preparation of galnac oligonucleotide conjugates
JP7419354B2 (ja) 2018-10-24 2024-01-22 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー オリゴヌクレオチドの精製プロセス
US11510939B1 (en) 2019-04-19 2022-11-29 Apellis Pharmaceuticals, Inc. RNAs for complement inhibition
AR118949A1 (es) * 2019-05-20 2021-11-10 Hoffmann La Roche Proceso para preparar epímeros de fosforamidita de galnac
WO2021001329A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for the preparation of high water affinity type products with controlled humidity
CN110642704B (zh) * 2019-09-30 2024-09-24 兰州交通大学 一种合成烯丙基脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸（apea-4）的方法
CN115487308B (zh) * 2022-09-29 2024-09-27 北京大学 反义核酸糖基缀合物及其制备方法和在肝癌治疗中的应用
CN116655715B (zh) * 2023-07-27 2023-10-20 北京炫景瑞医药科技有限公司 一种GalNAc衍生物、缀合物、组合物以及它们的用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011104169A1 (en) * 2010-02-24 2011-09-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions for targeted delivery of sirna
WO2014118267A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
WO2015173208A2 (en) * 2014-05-15 2015-11-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligomers and oligomer conjugates
WO2017021385A1 (en) * 2015-08-06 2017-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Processes for the preparation of galnac acid derivatives
WO2017055423A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugation process

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5525465A (en) * 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
GB9021625D0 (en) 1990-10-04 1990-11-21 Ici Plc Synthesis of oligonucleotides
US20040033973A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Muthiah Manoharan Compounds and oligomeric compounds comprising novel nucleobases
GB9717158D0 (en) * 1997-08-13 1997-10-22 King S College London Solution synthesis of oligonucleotides and their phosphorothioate analogues
GB0229443D0 (en) * 2002-12-18 2003-01-22 Avecia Ltd Process
WO2006029023A2 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polymeric beads for oligonucleotide synthesis
CN101133073B (zh) * 2005-03-04 2012-08-29 集润德斯股份公司 寡核苷酸的合成
US8541569B2 (en) 2008-09-06 2013-09-24 Chemgenes Corporation Phosphoramidites for synthetic RNA in the reverse direction, efficient RNA synthesis and convenient introduction of 3'-end ligands, chromophores and modifications of synthetic RNA
US9056841B2 (en) 2009-03-19 2015-06-16 The Johns Hopkins University PSMA-targeting compounds and uses thereof
US8501930B2 (en) 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
CN103492568B (zh) 2010-12-17 2017-04-12 箭头研究公司 用于siRNA的半乳糖簇‑药代动力学调节剂靶向部分
EP3453762B1 (en) * 2012-05-02 2021-04-21 Sirna Therapeutics, Inc. Short interfering nucleic acid (sina) compositions
BR112015010116A2 (pt) * 2012-11-15 2017-08-22 Roche Innovation Ct Copenhagen As COMPOSTOS CONJUGADOS ANTI-SENTIDO ANTI-ApoB
IL284593B2 (en) 2013-05-01 2023-02-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for modulation of hbv and ttr expression
LT3013959T (lt) 2013-06-27 2020-03-10 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Priešprasmiai oligomerai ir konjugatai, nukreirti į pcsk9
WO2015071388A1 (en) 2013-11-14 2015-05-21 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Apob antisense conjugate compounds
JP2017512774A (ja) * 2014-03-16 2017-05-25 ミラゲン セラピューティクス， インコーポレイテッド 二環式ヌクレオシドの合成
PL3137605T3 (pl) 2014-05-01 2021-04-19 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Kompozycje i sposoby modulowania ekspresji białka angiopoetynopodobnego 3
SG11202007218YA (en) 2018-01-29 2020-08-28 Hoffmann La Roche Process for the preparation of galnac oligonucleotide conjugates
JP2021516673A (ja) 2018-03-14 2021-07-08 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｌｎａ−ジカルボン酸誘導体およびその調製のための方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011104169A1 (en) * 2010-02-24 2011-09-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions for targeted delivery of sirna
WO2014118267A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
WO2015173208A2 (en) * 2014-05-15 2015-11-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligomers and oligomer conjugates
WO2017021385A1 (en) * 2015-08-06 2017-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Processes for the preparation of galnac acid derivatives
WO2017055423A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugation process

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PRAKASH, T. P. ET AL.: "Comprehensive structure-activity relationship of triantennary N-acetylgalactosamine conjugated antis", JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 59, JPN6021002937, 2016, pages 2718 - 2733, XP055394434, ISSN: 0004506463, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.5b01948 *
RAJEEV, K. G. ET AL.: "Hepatocyte-specific delivery of siRNAs conjugated to novel non-nucleosidic trivalent N-acetylgalacto", CHEMBIOCHEM, vol. 16, JPN6021002936, 2015, pages 903 - 908, XP055488494, ISSN: 0004506462, DOI: 10.1002/cbic.201500023 *

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