JP2020529832A

JP2020529832A - ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαおよび抗原結合ドメインを含む標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質

Info

Publication number: JP2020529832A
Application number: JP2019571006A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．バーネット，マシュー; デスジャルレイス，ジョン; ヴァルマ，ラジャット; シュバート，スザンヌ; ディアス，フアン
Original assignee: ゼンコアインコーポレイテッド
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-07-02
Publication date: 2020-10-15
Also published as: EP3645122A1; US20190016778A1; CA3067603A1; WO2019006472A1; US11084863B2; IL271704A; CN111132733A; MA49517A; US20220073588A1; AU2018291497A1; US12139525B2

Abstract

本発明は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα Ｆｃ融合タンパク質および抗原結合ドメインＦｃ融合タンパク質を含む新規の標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に関する。いくつかの例では、抗原結合ドメインはＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
この出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１７年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／５２７，８９８号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれ、特に図、凡例、および特許請求の範囲を参照する。

ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の増殖および分化を補助する機能を持つ。両サイトカインは、２つの共通の受容体、共通γ鎖（γｃ、ＣＤ１３２）、およびＩＬ−２受容体Ｂ鎖（ＩＬ−２Ｒβ、ＣＤ１２２）、ならびに各サイトカインに固有のα鎖である、ＩＬ−２受容体α（ＩＬ−２Ｒα、ＣＤ２５）またはＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα、ＣＤ２１５）からなるトリマー複合体への結合によってその細胞シグナル伝達機能を発揮する。両サイトカインは腫瘍学において潜在的に価値のある治療薬と考えられており、ＩＬ−２は転移性腎細胞癌および悪性黒色腫の患者に使用することが承認されている。現在、いくつかの臨床試験が進行中であるが、組み換えＩＬ−１５の承認された用途はない。

ＩＬ−２は、高親和性受容体複合体（すなわち、ＩＬ−２Ｒα／β／γ複合体）を提示するＴ細胞を優先的に増殖させる。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋ＣＤ２５^ｈｉｇｈＦｏｘｐ３＋）はＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）を恒常的に発現するので、ＩＬ−２によるＴ細胞の増殖は、免疫応答を抑制するＴｒｅｇに有利にスキュー（ｓｋｅｗ）され、したがって腫瘍治療には好ましくない。この不均衡が高用量ＩＬ−２の概念をもたらした。しかし、この手法は、血管漏出症候群などＩＬ−２媒介毒性によるさらなる問題を生じさせる。

対照的に、ＩＬ−１５は主に単球および樹状細胞上のＩＬ−１５Ｒαを含む膜結合ヘテロダイマー複合体として提示され、その効果はＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体の中間親和性受容体複合体へのトランス提示によって実現され（すなわち、ＩＬ−２Ｒβ／γ複合体）、例えば、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に見られる。しかし、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体はＴｒｅｇに有利にスキューされることはないが、この複合体は依然としてＴｒｅｇの増殖に寄与し、上述のとおり腫瘍治療には好ましくない。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および活性化を有利にスキューする治療方針に対して、腫瘍治療における満たされないニーズが残る。さらにまた、ＴＩＬにおける高いＣＤ８／ＣＤ４Ｔ細胞比は、一般的に腫瘍治療の良好な予後マーカーと考えられている。ＣＤ４エフェクターＴ細胞の刺激および増殖は、ＣＤ８エフェクターと比較してサイトカイン放出量の増加に寄与するとも考えられており、この効果を小さくすると、ＩＬ−１５治療は副作用の少ないより安全なものになる可能性がある。本発明は、ＩＬ−１５をＣＤ８＋Ｔ細胞に優先的に誘導する、新規なＩＬ−１５標的化タンパク質（例えば、二機能性）を提供することにより、この必要性に対処する。

本発明は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体、ならびにヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄなどの１つ以上の抗原に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含む二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「二機能性」および「標的化」という用語は、互換的に使用することができる。

一態様では、本明細書で提供されるのは、
ａ）ＩＬ−１５Ｒαタンパク質、ＩＬ−１５タンパク質、および第１のＦｃドメインを含むＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であって、
ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、第１のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５タンパク質が、第２のドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合しているか、または
ＩＬ−１５タンパク質が、第１のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、第２のドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質と、
ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む重鎖（ＶＨは可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）、ならびに可変軽鎖（ＶＬ）および軽定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖を含む抗原結合ドメインモノマーと、を含み、
第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、抗原結合ドメインモノマーが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質である。

いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する。様々な場合に、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。場合によっては、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。二機能性ヘテロダイマータンパク質は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、またはＸＥＮＰ２７１４６であってもよい。

いくつかの実施形態では、上述のヘテロダイマータンパク質は、ドメインリンカーを使用して上記ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインをさらに含むことができ、上記抗原結合ドメインは、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない。二機能性ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５４８であってもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、上記のＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質をコードする第１の核酸、上記の抗原結合ドメインモノマーをコードする第２の核酸、および任意選択的に、ドメインリンカーを使用してＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合している抗原結合ドメインをコードする第３の核酸を含む核酸組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、第１の核酸を含む第１の発現ベクター、第２の核酸を含む第２の発現ベクター、および任意選択的に、第３の核酸を含む第３の発現ベクターを含む発現ベクター組成物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は発現ベクター組成物を含む。本明細書では、二機能性ヘテロダイマータンパク質のうちのいずれか１つを作製する方法も提供する。この方法は、二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で上述の宿主細胞を培養すること、および上記ヘテロダイマータンパク質を回収することを含む。

さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、
ａ）第１のタンパク質ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む融合タンパク質であって、前記第１のタンパク質ドメインが、ドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している、融合タンパク質と、
ｂ）第１のタンパク質ドメインに非共有結合した第２のタンパク質ドメインと、
ｃ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む重鎖（ＶＨは可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）、ならびに可変軽鎖および軽定常ドメインを含む軽鎖を含む抗原結合ドメインモノマーと、を含み、
第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含むか、または第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含み、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、抗原結合ドメインモノマーが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群より選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質である。

いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はシステイン残基を含み、ＩＬ−１５タンパク質はシステイン残基を含み、それによりジスルフィド結合を形成する。

いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する。様々な場合に、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。場合によっては、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。二機能性ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２５１３７であってもよい。

いくつかの実施形態では、上述のヘテロダイマータンパク質は、１つ以上のドメインリンカーを使用して上記ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインをさらに含むことができ、上記抗原結合ドメインは、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、上記の融合タンパク質をコードする第１の核酸、上記の第２のタンパク質ドメインをコードする第２の核酸、上記の抗原結合ドメインをコードする第３の核酸、ならびに任意選択的に、１つ以上のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５タンパク質および／またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインをコードする第４の核酸を含む核酸組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、第１の核酸を含む第１の発現ベクター、第２の核酸を含む第２の発現ベクター、第３の核酸を含む第３の発現ベクター、および任意選択的に、４番目の核酸を含む第４の発現ベクターを含む発現ベクター組成物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は発現ベクター組成物を含む。本明細書では、二機能性ヘテロダイマータンパク質のうちのいずれか１つを作製する方法も提供する。この方法は、二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で上述の宿主細胞を培養すること、および上記ヘテロダイマータンパク質を回収することを含む。

さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、
ａ）第１のＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む第１の重鎖（ＶＨは第１の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第１のＦｃドメインである）、ならびに第１の可変軽鎖および第１の軽定常ドメインを含む第１の軽鎖を含む、第１の抗原結合ドメインモノマーと、
ｂ）第２のＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む第２の重鎖（ＶＨは第２の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインであり）、第２の可変軽鎖および第２の軽定常ドメインを含む第２の軽鎖、ならびに第１のドメインリンカーを使用して第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合している第１のタンパク質ドメインを含む、第２の抗原結合ドメインモノマーと、
ｃ）第２の抗原結合ドメインモノマーの第１のタンパク質ドメインに結合または非共有結合している第２のタンパク質ドメインと、を含み、
第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質であり、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質であるか、または第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質であり、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質であり、
第１のＦｃドメインのおよび第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
第１の抗原結合ドメインモノマーおよび第２の抗原結合ドメインモノマーが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質である。

いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する。様々な場合に、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。場合によっては、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。二機能性ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５４６であってもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、上記の第１の抗原結合ドメインモノマーをコードする第１の核酸、上記の第２の抗原結合ドメインモノマーをコードする第２の核酸、および上記の第２のタンパク質ドメインをコードする第３の核酸を含む核酸組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、第１の核酸を含む第１の発現ベクター、第２の核酸を含む第２の発現ベクター、および第３の核酸を含む第３の発現ベクターを含む発現ベクター組成物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は発現ベクター組成物を含む。本明細書では、二機能性ヘテロダイマータンパク質のうちのいずれか１つを作製する方法も提供する。この方法は、二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で上述の宿主細胞を培養すること、および上記ヘテロダイマータンパク質を回収することを含む。

一態様では、本明細書で提供されるのは、
ａ）ＩＬ−１５タンパク質、第１の抗原結合ドメイン、および第１のＦｃドメインを含む、ＩＬ−１５融合タンパク質であって、
第１の抗原結合ドメインは、第１のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５タンパク質は、第２のドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、抗原結合ドメインは、第１の可変重鎖ドメインおよび第１の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、ＩＬ−１５融合タンパク質と、
ｂ）ＩＬ−１５Ｒαタンパク質、第２の抗原結合ドメイン、および第２のＦｃドメインを含む、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であって、
第２の抗原結合ドメインは、第３のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、第４のドメインリンカーを使用して第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、第２の抗原結合ドメインは、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質と、を含み、
第１のおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質である。

いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する。様々な場合に、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。場合によっては、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。二機能性ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５４７であってもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、上述のＩＬ−１５融合タンパク質をコードする第１の核酸、および上記のＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質をコードする第２の核酸を含む核酸組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、第１の核酸を含む第１の発現ベクターおよび第２の核酸を含む第２の発現ベクターを含む発現ベクター組成物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は発現ベクター組成物を含む。本明細書では、二機能性ヘテロダイマータンパク質のうちのいずれか１つを作製する方法も提供する。この方法は、二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で上述の宿主細胞を培養すること、および上記ヘテロダイマータンパク質を回収することを含む。

別の態様では、本発明は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される二機能性ヘテロダイマータンパク質を提供する。

一態様では、本発明は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５，およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される二機能性ヘテロダイマータンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む核酸組成物を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、１つ以上の発現ベクターがＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される二機能性ヘテロダイマータンパク質をコードするように、それぞれが核酸を含む１つ以上の発現ベクターを含む発現ベクター組成物を提供する。

本明細書に記載の核酸組成物のいずれか１つを含む宿主細胞または本明細書に記載の発現ベクター組成物のいずれか１つを含む宿主細胞も提供される。

一態様では、本発明は、本明細書に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質のいずれかを製造する方法を提供する。この方法は、（ａ）上記二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される好適な条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養すること、および（ｂ）上記タンパク質を回収することを含む。

一態様では、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質のうちのいずれか１つを患者に投与することを含む、それを必要とする患者の癌を治療する方法を提供する。

さらなるＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲαヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、例えば、２０１８年６月１２日に出願された米国特許第６２／６８４，１４３号、２０１８年４月１８日に出願された米国特許第６２／６５９，５６３号、２０１６年１０月１４日に出願された米国特許第６２／４０８，６５５号、２０１６年１１月１日に出願された米国特許第６２／４１６，０８７号、２０１７年１月６日に出願された米国特許第６２／４４３，４６５号、２０１７年３月２８日に出願された米国特許第６２／４７７，９２６号、２０１７年１０月１６日に出願された米国特許出願第１５／７８５，４０１号、および２０１７年１０月１６日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５６８２９号に詳細に記載され、特にその図、凡例、および特許請求の範囲を参照して、その全体が参照により明示的に組み込まれる。

本発明の他の態様が本明細書で提供される。

（スキューバリアントおよびＰＩバリアントを含む）Ｆｃヘテロダイマー化バリアントのセットの有用な対を示す。対応する「モノマー２」バリアントが存在しないバリアントがあり、これらはいずれのモノマーでも単独で使用できるｐＩバリアントである。等配電子バリアント抗体の定常領域およびそれぞれ置換のリストを示す。ｐＩ＿（−）は低ｐＩバリアントを示し、ｐＩ＿（＋）は高ｐＩバリアントを示す。これらは、任意選択的に独立して、本発明の他のヘテロダイマー化バリアント（および本明細書に概説される他のバリアント型）と組み合わせることができる。ＦｃγＲ結合を除去した有用な切除バリアントを示す（しばしば「ノックアウト」または「ＫＯ」バリアントと呼ばれる）。一般に、切除バリアントは両方のモノマーに見られるが、場合によっては、それらは一方のモノマーのみにあってもよい。本発明のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の「非サイトカイン」構成要素の有用な実施形態を示す。本発明のＣＤ８標的化、ＮＫＧ２Ａ標的化、およびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の「非サイトカイン」／「非Ｆｖ」構成要素の特に有用な実施形態を示す。ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質において使用するためのいくつかの例示的な可変長リンカーの数を示す。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＣ末端をＦｃ領域のＮ末端に連結するのに使用される。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、ＩＬ−１５をＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合するのに使用される。構成要素として、１つ以上のｓｃＦｖを利用するヘテロダイマー抗体のｐＩを増加または減少するのに使用されるいくつかの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。（＋Ｈ）正のリンカーは、本明細書において特に使用される。単一電荷を有する単一の先行技術ｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ６（８）：９８９−９９５（１９９３）からの「Ｗｈｉｔｌｏｗ」と称される。このリンカーは、ｓｃＦｖにおける凝集を減少させ、タンパク質分解安定性を高めるために使用されたことに留意すべきである。サイトカイン配列（例えば、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ））を含まない、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット骨格の配列を示す。これらの骨格はまた、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の特定の実施形態において使用され得ることに留意することが重要である。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳのスキューバリアントおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳのスキューバリアントおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｅ／Ｋ３７０ＳのスキューバリアントおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＤ４０１Ｋ：Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＫ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１ＥのスキューバリアントおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳのスキューバリアントおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有し、さらに両方の鎖にＮ２９７Ａバリアントを有する。骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。骨格６および７の代替フォーマットは、両方の鎖において切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外することができる。骨格８はヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、鎖にＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳのスキューバリアントおよびＳ２２８Ｐ（ＥＵ付番によるもので、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）バリアントを有し、これは当技術分野で既知のとおり、Ｆａｂアーム交換を切除する。骨格９はヒトＩｇＧ２に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアントを有する。骨格１０はヒトＩｇＧ２に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキューバリアント、およびＳ２６７Ｋバリアントを含む。骨格１１は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ変異を含むことを除いて、骨格１と同一である。骨格１２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、そして両方の同一の鎖にＣ２２０Ｓ、両方の同一の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを含む。骨格１３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、両方の鎖にＣ２２０Ｓ、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｐ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６ＫのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアント、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。当業者には理解され以下に概説されるように、これらの配列は、図１６Ａ〜１６Ｇおよび３０Ａ〜３０Ｄに概略的に示すＩＬ−１５／ＲαヘテロＦｃ、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα、およびｓｃＩＬ−１５／Ｒαを含むがこれらに限定されない、本明細書に概説される任意のＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）対とともに使用することができる。さらに、任意のＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントを、任意の組み合わせで、これら図８Ａ〜８Ｄの骨格に組み込むことができる。これらの骨格のそれぞれに含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一である配列であり、かつ／または（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比べていくつかのアミノ酸修飾をすでに含む、図の「親」と比べて）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキューバリアント、ｐＩバリアントおよび切除バリアントに加えて、さらなるアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。サイトカイン配列（例えば、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ））またはＶＨを含まず、さらに図１０に示す軽鎖骨格を除く、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体フォーマット骨格の配列を示す。骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｃ２２０Ｓ、およびＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳのスキューバリアントおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｃ２２０Ｓ、両方の鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのバリアント、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、Ｑ１９６Ｋ／Ｉ１９９Ｔ／Ｐ２１７Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６ＫのｐＩバリアントを有し、両方の鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのバリアント、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの切除バリアントを有する。特定の実施形態では、これらの配列は、３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプのものであり得る。他の実施形態では、これらの配列は、Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｓ置換のいずれかを含み得る。いくつかの他の実施形態において、これらの配列はＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ変異を含み得る。さらに他の実施形態では、これらの配列は代わりにヒトＩｇＧ４に基づくことができ、当技術分野で既知のように両方の鎖にＦａｂアーム交換を切除するＳ２２８Ｐ（ＥＵ付番、ＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）バリアントを含む。なおさらなる実施形態において、これらの配列は代わりにヒトＩｇＧ２に基づき得る。さらに、これらの配列は、代わりに、図１Ａ〜１Ｅ、２、および３に示す他のスキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントを利用し得る。当業者には理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、図７０に概略的に示すｓｃＩＬ−１５／Ｒα、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα、およびｄｓＩＬ−１５Ｒαを含むがこれらに限定されない、本明細書に概説される任意のＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）対とともに使用することができる。さらに当業者には理解されそして以下に概説されるように、任意のＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントがこれらの骨格に組み込まれ得る。さらに、当業者には理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、ｓｃＦｖまたはＦａｂのいずれかを含む、本明細書に概説された任意のＶＨおよびＶＬ対とともに使用することができる。これらの骨格のそれぞれに含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一である配列であり、かつ／または（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じたＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比べていくつかのアミノ酸修飾をすでに含む、図の「親」と比べて）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキューバリアント、ｐＩバリアントおよび切除バリアントに加えて、さらなるアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。また、本明細書に示される骨格は、本発明のＮＫＧ２Ａ標的化およびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質に使用するのに適していることに留意すべきである。本発明のＣＤ８標的化、ＮＫＧ２Ａ標的化、およびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質に使用される軽鎖の「非Ｆｖ」骨格（すなわち、定常軽鎖）を示す。本明細書に記載のいくつかの実施例で使用される対照である、モタビズマブ（Ｎｕｍａｘ（登録商標））の可変領域に基づく抗ＲＳＶｍＡｂであるＸＥＮＰ１５０７４の配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））の可変領域に基づいた抗ＰＤ−１ｍＡｂであるＸＥＮＰ１６４３２の配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。本明細書に記載の多くの実施例で対照として使用される「ＲＳＶ標的化」ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体である、ＸＥＮＰ２６００７の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。ＩＬ−１５の受容体であるＩＬ−１５Ｒα（ＣＤ２１５）、ＩＬ−１５Ｒβ（ＣＤ１２２）、および共通γ鎖（ＣＤ１３２）を含む複合体におけるＩＬ−１５の構造を示す。図は、ＩＬ−１５およびその受容体の配列を示す。本発明のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のいくつかのフォーマットを示す。ＩＬ−１５ＲαヘテロダイマーＦｃ融合体または「ＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」（図１６Ａ）は、ヘテロダイマーＦｃの一方側に組み換えで融合されたＩＬ−１５、およびヘテロダイマーＦｃの他方側に組み換えで融合されたＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含む。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）は、Ｆｃ領域のＣ末端とＮ末端との間に可変長Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを有し得る。一本鎖ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図１６Ｂ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「一本鎖」ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合され、分子の他方側は「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である。非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃまたは「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図１６Ｃ）はヘテロダイマーＦｃに融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含むが、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされ、分子の他方側は「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である。二価非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体または「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図１６Ｄ）はホモダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含むが、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。二価一本鎖ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体または「二価ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図１６Ｅ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合したＩＬ−１５を含み（「一本鎖」ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、次いでこれをホモダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合させる。Ｆｃ非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα融合体または「Ｆｃ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」（図１６Ｆ）はヘテロダイマーＦｃ領域のＣ末端に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含むが、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされ、分子の他方側は「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である。Ｆｃ−一本鎖ＩＬ−１５／Ｒα融合体または「Ｆｃ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」（図１６Ｇ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合したＩＬ−１５を含み（「一本鎖」ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＣ末端に融合され、分子の他方側は「Ｆｃのみ」または「空のＦｃ」である。「ＩＬ−１５／ＲαヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２０８１８およびＸＥＮＰ２１４７５の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２１４７８およびＸＥＮＰ２１９９３の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２１４７９、ＸＥＮＰ２２３６６およびＸＥＮＰ２４３４８の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２１９７８の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。「二価ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。「Ｆｃ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２６３７およびＸＥＮＰ２２６３８の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。「Ｆｃ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。ＦＡＣＳにより測定したＫｉ６７発現に基づく異なるリンカー長を有するフォーマットＡの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による、（図２４Ａ）ＮＫ（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）細胞、（図２４Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、および（図２４Ｃ）ＣＤ８＋細胞の増殖の誘導を示す。ＦＡＣＳにより測定したＫｉ６７発現に基づくｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２１４７８）およびｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２１４７９）の例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による、（図２５Ａ）ＮＫ（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）細胞、（図２５Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、および（図２５Ｃ）ＣＤ８＋細胞の増殖の誘導を示す。操作されたジスルフィド結合対の位置を示すＩＬ−１５／Ｒαヘテロダイマーの構造モデルを示す。システイン残基を操作するための足場として機能するＣ末端のさらなる残基によって操作された例示的なＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントの配列を示す。システインによって操作されたＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントと共有ジスルフィド結合を形成するために、システインによって操作された例示的なＩＬ−１５バリアントの配列を示す。システインによって操作されたＩＬ−１５バリアントと共有ジスルフィド結合を形成するために、システインによって操作された例示的なＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントの配列を示す。操作されたジスルフィド結合を有する本発明のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のさらなるフォーマットを示す。ジスルフィド結合したＩＬ−１５ヘテロダイマーＦｃ融合体または「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」）（図３０Ａ）は「ＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」と同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果としてさらに共有結合している。ジスルフィド結合したＩＬ−１５／ＲαＦｃ融合体または「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図３０Ｂ）は「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」と同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果としてさらに共有結合している。二価ジスルフィド結合したＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃまたは「二価ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」（図３０Ｃ）は、「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」と同一であるが、操作されたシステインの結果としてＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５はさらに共有結合している。Ｆｃ−ジスルフィド結合したＩＬ−１５／Ｒα融合体または「Ｆｃ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」（図３０Ｄ）は「Ｆｃ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と同一であるが、操作されたシステインの結果としてＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５がさらに共有結合している。「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２０１３、ＸＥＮＰ２２０１４、ＸＥＮＰ２２０１５、およびＸＥＮＰ２２０１７の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２３５７、ＸＥＮＰ２２３５８、ＸＥＮＰ２２３５９、ＸＥＮＰ２２６８４、およびＸＥＮＰ２２３６１の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。「二価ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２６３４、ＸＥＮＰ２２６３５、ＸＥＮＰ２２６３６、およびＸＥＮＰ２２６８７の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。「Ｆｃ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２６３９およびＸＥＮＰ２２６４０の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。ＣＥＦによって決定される操作されたジスルフィド結合がある場合とない場合の例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の純度および均質性を示す。ＦＡＣＳにより測定したＫｉ６７発現に基づく、操作されたジスルフィド結合を含む場合と含まない場合の例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による、（図３６Ａ）ＮＫ（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）細胞、（図３６Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、および（図３６Ｃ）ＣＤ４＋細胞の増殖の誘導を示す。ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、および共通のγ鎖と複合体を形成したＩＬ−１５の構造を示す。効力を低減するために設計された置換の位置が示されている。効力低下のために操作された例示的なＩＬ−１５バリアントの配列を示す。列挙された配列と（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８および９９％同一であり、かつ／または１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のさらなるアミノ酸置換を含む配列がこれらのバリアントＩＬ−１５配列のそれぞれに含まれる。非限定的な例において、列挙された配列は、実施例３Ｂに記載されるように共有ジスルフィド結合の形成に寄与するものなどのさらなるアミノ酸修飾を含み得る。効力低下のために操作された「ＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２２８２１、ＸＥＮＰ２２８２２、ＸＥＮＰ２３３４３、ＸＥＮＰ２３５５４、ＸＥＮＰ２３５５７、ＸＥＮＰ２３５６１、ＸＥＮＰ２４０１８、ＸＥＮＰ２４０１９、ＸＥＮＰ２４０４５、ＸＥＮＰ２４０５１、ＸＥＮＰ２４０５２、およびＸＥＮＰ２４３０６の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。効力低下のために操作された「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２４０１３、ＸＥＮＰ２４０１４、ＸＥＮＰ２４０１５、ＸＥＮＰ２４０５０、ＸＥＮＰ２４２９４、ＸＥＮＰ２４４７５、ＸＥＮＰ２４４７６、ＸＥＮＰ２４４７８、ＸＥＮＰ２４４７９、およびＸＥＮＰ２４４８１の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。効力低下のために操作された「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２４３４９、ＸＥＮＰ２４８９０、およびＸＥＮＰ２５１３８の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。効力低下のために操作された例示的なｎｃＩＬ−１５／Ｒαヘテロダイマーである、ＸＥＮＰ２２８０１およびＸＥＮＰ２２８０２の配列を示す。これらの配列は、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＣ末端におけるポリヒスチジン（Ｈｉｓ×６またはＨＨＨＨＨＨ）Ｃ末端タグを使用して生成されたことに注目することが重要である。効力低下のために操作された「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２４３４２の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。効力低下のために操作された「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの、例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質である、ＸＥＮＰ２３４７２およびＸＥＮＰ２３４７３の配列を示す。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図８３に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、およびＦｃ領域の間の境界（複数可）を示す。ＦＡＣＳにより測定したＫｉ６７発現に基づく、バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による、Ａ）ＮＫ細胞、Ｂ）ＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、およびＣ）ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞の増殖の誘導を示す。バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質によるＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導するＥＣ５０、およびＸＥＮＰ２０８１８に対するＥＣ５０の倍率低下を示す。指定のバリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質とともに４日間インキュベートしたヒトＰＢＭＣにおける細胞増殖を示す。図４７Ａ〜４７Ｃは、増殖しているＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１６＋）（図４７Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−）（図４７Ｂ）、およびＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−）の割合を示す（図４７Ｃ）。図４７Ｄは、対照（ＸＥＮＰ２０８１８）に対する様々なＩＬ１５／ＩＬ１５ＲαＦｃヘテロダイマーのＥＣ５０の倍率変化を示す。ヒトＰＢＭＣとＸＥＮＰ２２８２１とのインキュベーション前（図５５Ａ）および後（図５５Ｂ）のＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を示す。指定のバリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質とともに３日間インキュベートしたヒトＰＢＭＣにおける細胞増殖を示す。図５４Ａ〜Ｃは、増殖中のＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞（図４９Ａ）、ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞（図４９Ｂ）、γδＴ細胞（図４９Ｃ）、およびＮＫ細胞（図４９Ｄ）の割合を示す。追加のＩＬ−１５／Ｒαバリアントでの処理後の（図５０Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（図５０Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、および（図５０Ｃ）ＮＫ細胞でのＫｉ６７発現の割合を示す。ＩＬ−１５／Ｒαバリアントでの処理後の（図５１Ａ）ＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、（図５１Ｂ）ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、（図５１Ｃ）γδＴ細胞、（図５１Ｄ）ＮＫ（ＣＤ１６＋ＣＤ８α−）細胞、および（図５１Ｅ）ＮＫ（ＣＤ５６＋ＣＤ８α−）細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。ＩＬ−１５／Ｒαバリアントでの処理後の（図５２Ａ）ＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、（図５２Ｂ）ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、（図５２Ｃ）γδＴ細胞、（図５２Ｄ）ＮＫ（ＣＤ１６＋ＣＤ８α−）細胞、および（図５２Ｅ）ＮＫ（ＣＤ５６＋ＣＤ８α−）細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。追加のＩＬ−１５／Ｒαバリアントでの処理後の（図５３Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（図５３Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、（図５３Ｃ）γδＴ細胞、および（図５３Ｄ）ＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。追加のＩＬ−１５／Ｒαバリアントでの処理後の（図５４Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（図５４Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、（図５４Ｃ）γδＴ細胞、および（図５４Ｄ）ＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの０．１ｍｇ／ｋｇの単回投与での様々なＩＬ−１５／ＲαＦｃ融合タンパク質または対照のＩＶ−ＴＶ投与時のＰＫを示す。効力低下のために操作されたＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による処理後の半減期とＮＫ細胞の効力の相関を示す。本発明のＸ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のいくつかのフォーマットを示す。Ｘは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄであってもよいが、これらに限定されない。「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」フォーマット（図５７Ａ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合し、ｓｃＦｖはヘテロダイマーＦｃの他方側に融合している。「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｂ）は、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したｓｃＦｖを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。「ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｃ）は、「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットと同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果として共有結合している。「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマット（図５７Ｄ）は、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合し、可変重鎖（ＶＨ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマット（図５７Ｅ）は、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、一方、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマット（図５７Ｆ）は、「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」フォーマットと同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果として共有結合している。「ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｇ）は、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合し、これは次いでさらにヘテロダイマーＦｃ領域の一方のＣ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。「ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｈ）は、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃ領域の一方のＣ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。「ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｉ）は、「ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットと同一であるが、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）およびＩＬ−１５は操作されたシステインの結果として共有結合している。「ｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｊ）は、ＩＬ−１５（ヘテロダイマーＦｃの一方側にさらに融合する）のＮ末端に組み換えで融合したＶＨと、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）（ヘテロダイマーＦｃの他方側にさらに融合する）のＮ末端に組み換えで融合したＶＨとを含むが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。「ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマット（図５７Ｋ）は、ＩＬ−１５（ヘテロダイマーＦｃの一方側にさらに融合される）に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に融合したＶＨと、ヘテロダイマーＦｃの他方側に融合したＶＨとを含むが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。モナリズマブ（２０１４年１２月２日発行の米国特許第８，９０１，２８３号に開示）に基づく例示的な抗ＮＫＧ２ＡｍＡｂの配列をキメラｍＡｂ（ＸＥＮＰ２４５４２）およびヒト化ｍＡｂ（ＸＥＮＰ２４５４２）として示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。ＭＳ（２０１１年２月１日発行の米国特許第７，８７９，９８５号に開示）に基づく例示的な抗ＮＫＧ２ＤｍＡｂの配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットの例示的なＮＫＧ２Ａ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の配列、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、およびＸＥＮＰ２７１４６を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットの例示的なＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の配列、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、およびＸＥＮＰ２７１４５を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。ＮＫＧ２Ａ標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（および対照ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ）での処理後の（図６２Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、（図６２Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、および（図６２Ｃ）ＮＫ細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。指定の試験物質で処理されたヒトＰＢＭＣ中の、細胞増殖と厳密に関連するタンパク質のＫｉ−６７を発現する、（図６３Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、（図６３Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、および（図６３Ｃ）ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の割合を示す。指定の試験物質で処理されたヒトＰＢＭＣ中の、（図６４Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５−Ｔ細胞、（図６４Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５−Ｔ細胞、（図６４Ｃ）Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）、および（図６４Ｄ）ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上のＳＴＡＴ５リン酸化を示す。キメラｍＡｂ（ＸＥＮＰ１５０７６）、ヒト化ｍＡｂ（１５２５１）、ヒト化Ｆａｂ（ＸＥＮＰ２３６４７）、およびヒト化ワンアームｍＡｂ（ＸＥＮＰ２４３１７）としてフォーマットされたヒト化ｍＡｂ（２０１０年２月２日発行の米国特許第７，６５７，３８０号に前述したとおり）に基づく例示的なＣＤ８結合分子の配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。ｓｃＩＬ−１５／ＲαｘＦａｂフォーマットの例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表Ｘに示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。ＣＤ９標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（ならびに対照の抗ＣＤ８ｍＡｂおよびｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ）での処理後の（図６７Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（図６７Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、および（図６７Ｃ）ＮＫ細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体での処理後の（図６８Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（図６８Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、および（図６８Ｃ）ＮＫ細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。ＣＤ８標的化ＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ融合体ならびに対照での処理後の（図６９Ａ）ドナー２１および（図６９Ｂ）ドナー２３からのラパマイシン濃縮ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。ＣＤ８標的化ＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ融合体ならびに対照での処理後の（図７０Ａ）ドナー２１および（図７０Ａ）ドナー２３からの濃縮されたＴｒｅｇのＣＤ４＋細胞数を示す。ＣＤ８標的化ＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ融合体ならびに対照での処理後の（図７１Ａ）ドナー２１および（図７１Ｂ）ドナー２３からのラパマイシン濃縮ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５ＭＦＩを示す。Ｔｒｅｇの存在下でＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体でＰＢＭＣを処理した後の（図７２Ａ）ＣＤ８レスポンダーＴ細胞、（図７２Ｂ）ＣＤ４レスポンダーＴ細胞、および（図７２Ｃ）ＮＫ細胞の増殖割合を示す。様々な量のＴｒｅｇの存在下でＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体でＰＢＭＣを処理した後のＴｒｅｇ数を示す。Ｔｒｅｇ（１：２Ｔｒｅｇ：ＰＢＭＣ比）の存在下でＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体および対照でＰＢＭＣを処理した後の（図７４Ａ）ＣＤ８メモリーＴ細胞、および（図７４Ｂ）ＣＤ４レスポンダーＴ細胞、および（図７４Ｃ）Ｔｒｅｇ細胞数の増殖割合を示す。ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体およびＰＢＭＣの非存在下での対照による処置後のＴｒｅｇ数を示す。ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体およびＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合バリアントでの処理後４日目のｈｕＰＢＭＣ移植マウスの全血中の、（図７６Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞現象、（図７６Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞現象、（図７６Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞現象とＣＤ４＋Ｔ細胞現象の相関関係、および（図７６Ｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体およびＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合バリアントでの処理後７日目のｈｕＰＢＭＣ移植マウスの全血中の、（図７７Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞現象、（図７７Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞現象、（図７７Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞現象とＣＤ４＋Ｔ細胞現象の相関関係、および（図７７Ｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体およびＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合バリアントでの処理後８日目のｈｕＰＢＭＣ移植マウスの脾臓中の、（図７８Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞現象、（図７８Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞現象、（図７８Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞現象とＣＤ４＋Ｔ細胞現象の相関関係、および（図７８Ｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。代替フォーマットでのＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の例示的配列を示す（図５７に示すように）。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。代替フォーマットのＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体で処理後のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞上のＫｉ６７発現の割合を示す。ファージ由来の抗ＣＤ８抗体配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するワンアームＦａｂ−Ｆｃ抗体として再フォーマットされた例示的なファージヒットの結合を示す。標的細胞上のｐＭＨＣＩへのＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ８およびＴＣＲの結合の図。（抗ＣＤ８抗体とプレインキュベーションしない）対照と比較して、抗ＣＤ８抗体とともにプレインキュベーション後のＨＬＡ２：０１制限ｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチド特異的Ｔ細胞に対するＨＬＡ２：０１制限ＭＨＣテトラマー特異的ｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドによる結合割合を示す。ＨＬＡ−Ａ２＊０２０１制限ＣＭＶｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドまたはＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドをロードしたＴ２細胞とのインキュベーション後、（様々な抗ＣＤ８抗体とプレインキュベートした）ＨＬＡ２：０１制限ｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドに特異的なＴ細胞によるＩＦＮγ放出を示す。ＩＦＮγ放出とＴ細胞によるテトラマー結合との相関関係を示す。ファージ由来１Ｃ１１Ｂ３に基づく抗ＣＤ８Ｆａｂアームを含む例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体である、ＸＥＮＰ２４７３６の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。指定の試験物質で処理されたヒトＰＢＭＣでＫｉ６７を発現する（図８８Ａ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞および（図８８Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示す。示すようにマウスまたはヒト化のＯＫＴ８可変領域を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。ヒト化抗ＯＫＴ８ｍＡｂであるＸＥＮＰ１５０７５の配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。図８９に示すヒト化ＯＫＴ８可変領域に基づくＦａｂアームを含む例示的なワンアーム抗ＣＤ８ｍＡｂを示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。図８９に示すように、マウスまたはヒト化ＯＫＴ８可変領域に基づく抗ＣＤ８Ｆａｂアームを含む例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。ヒト化ＯＫＴ８を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体で処理したヒトＰＢＭＣ中でＫｉ６７を発現する、（図９３Ａ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻Ｔ細胞および（図９３Ｂ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻Ｔ細胞の割合を示す。７日目のヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血液中の（図９４Ａ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻Ｔ細胞数、（図９４Ｂ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻Ｔ細胞数、および（図９４Ｃ）ＣＤ８^＋／ＣＤ４^＋Ｔ細胞比を示す。図８９に示すＯＫＴ８＿Ｈ２（ヒト化可変重鎖Ｖ２）に基づくバリアント可変重領域と、図８９に示すＯＫＴ８＿Ｈ１（ヒト化可変軽鎖Ｖ１）に基づくバリアント可変軽領域を示す。本明細書に示す可変重領域のそれぞれは、この図に示される可変軽領域および図８９に示される可変軽領域のいずれかと組み合わせることができる。本明細書に示される可変軽領域のそれぞれは、この図に示される可変重領域および図８９に示される可変重領域のいずれかと組み合わせることができる。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれかで使用することができる。ヒトおよびカニクイザルＣＤ８に対して例示的なカニクイザルＣＤ８の親和性操作したＯＫＴ８＿Ｈ２Ｌ１の解離定数（Ｋ_Ｄ）、解離速度（ｋ_ｄ）、および会合速度（ｋ_ａ）を示す。ここに描かれている分子は、空のＦｃおよびＦａｂを有するワンアームｍＡｂであり、図８９および９５に示すＦａｂアームは可変領域を含む。例えば、ＸＥＮＰ２６００９のＦａｂアームには、ＯＫＴ８＿Ｈ２．１５２可変重鎖とＯＫＴ８＿Ｌ１．１０３可変軽鎖がある。図９５に示すように、カニクイザル親和性操作（ＨｕＣｙ）ＯＫＴ８可変領域に基づいた、抗ＣＤ８Ｆａｂアームを含む例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記され、かつ本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示すように使用する付番によってわずかに異なっていてもよく、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。カニクイザル親和性操作ヒト化ＯＫＴ８結合ドメインを含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体で処理したヒトＰＢＭＣ中のＫｉ６７を発現する、（図９８Ａ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻Ｔ細胞および（図９８Ｂ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻Ｔ細胞の割合を示す。カニクイザル親和性操作ヒト化ＯＫＴ８結合ドメインを含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体で処理したヒトＰＢＭＣ中の、（図９９Ａ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻Ｔ細胞および（図９９Ｂ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻Ｔ細胞のＳＴＡＴ５リン酸化を示す。カニクイザル親和性操作ヒト化ＯＫＴ８結合ドメインを含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体を投与後７日目のヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスの血中の、（図１００Ａ）ＣＤ４５^＋細胞数、（図１００Ｂ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞数、（図１００Ｃ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞数、および（図１００Ｄ）ＣＤ８^＋／ＣＤ４^＋Ｔ細胞比を示す。カニクイザル親和性操作ヒト化ＯＫＴ８結合ドメインを含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体で処理したカニクイザルＰＢＭＣ中のＫｉ６７を発現する、（図１０１Ａ）ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻Ｔ細胞および（図１０１Ｂ）ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻Ｔ細胞の割合を示す。ＸｔｅｎｄＦｃを含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の例を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表２に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）には下線が付され、リンカーには二重下線が付され（しかし、当業者には理解されるように、リンカーは、その一部が図６および７に示す他のリンカーで置き換えられ得る）、スラッシュ（／）は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、リンカー、様々な領域、および定常／Ｆｃ領域の間の境界（複数可）を示す。様々な濃度の組み換えＩＬ−１５、ＷＴＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２０８１８）、および例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（ＸＥＮＰ２６５８５）による、（図１０３Ａ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、（図１０３Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、（図１０３Ｃ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、（図１０３Ｄ）ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、（図１０３Ｅ）Ｔｒｅｇ、および（図１０３Ｆ）ＣＤ５６−ＮＫ細胞のＳＴＡＴ５リン酸化を経時的に示す。ＸＥＮＰ２４０５０またはＸＥＮＰ２６２２３の投与後のカニクイザル末梢血中の（図１０４Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数および（図１０４Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞数の経時的な倍率変化を示す。ＸＥＮＰ２４０５０またはＸＥＮＰ２６２２３の投与後のカニクイザル末梢血中のＫｉ６７を発現する（図１０５Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞および（図１０５Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。ＸＥＮＰ２４０５０またはＸＥＮＰ２６２２３の投与後のカニクイザルのリンパ節でＫｉ６７を発現するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示す。ＸｔｅｎｄＦｃ（ＸＥＮＰ２４２９４）を含むワンアーム効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体およびＸｔｅｎｄＦｃ（ＸＥＮＰ２６５８５）を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の投与後の、（図１０７Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞数、（図１０７Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞数、およびＣ）ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。（図１０８Ａ）グループ１（親ＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）および（図１０８Ｂ）グループ２（ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）におけるＫｉ６７陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。（図１０９Ａ）グループ１（親ＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）および（図１０９Ｂ）グループ２（ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）におけるＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。（図１１０Ａ）グループ１（親ＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）および（図１１０Ｂ）グループ２（ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）におけるＫｉ６７およびＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。（図１１１Ａ）グループ１（親ＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）および（図１１１Ｂ）グループ２（ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）におけるＫｉ６７陽性ＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合を示す。（図１１２Ａ）グループ１（親ＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）および（図１１２Ｂ）グループ２（ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）におけるＩＦＮγ陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。（図１１３Ａ）グループ１（親ＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）および（図１１３Ｂ）グループ２（ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞および指定の試験物質とともにインキュベートした精製Ｔ細胞）におけるＫｉ６７およびＩＦＮγ陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示す。精製Ｔ細胞および指定の試験物質とともにインキュベーション後の残りの標的細胞を示す。［図１１４Ａ：親ＭＣＦ−７腫瘍細胞、図１１４Ｂ：ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞］ｐｐ６５反応性ｈｕＰＢＭＣで移植し指定の試験物質で処理後の、ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７細胞を移植したＮＳＧマウスの（図１１５Ａ）平均腫瘍体積および（図１１５Ｂ）腫瘍体積の変化を示す。ｐｐ６５反応性ｈｕＰＢＭＣで移植し指定の試験物質で処理後の、ｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７細胞を移植したＮＳＧマウスの全血中の（図１１６Ａ）ＣＤ４５^＋細胞、（図１１６Ｂ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞、（図１１６Ｃ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞、（図１１６Ｄ）ＮＫ細胞数、ならびに（図１１６Ｅ）ＣＤ８^＋／ＣＤ４^＋Ｔ細胞比を示す。

発明を実行するための形態

Ｉ．概要
本発明の二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、様々な種類の癌を治療するのに有用である。当業者には理解されるように、組み換えで産生されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαヘテロダイマーは、Ｔ細胞を強力に活性化することができる。しかし、その半減期が短いため、好ましい投薬が妨げられる。本発明の標的化ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、Ｔ細胞活性化をもたらすことができ、癌細胞に対する免疫応答がより大きくなり、したがってより効果的な治療をもたらし得る。そのような標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、多種多様な腫瘍タイプの治療に有用性を見出すことが期待できる。

後述するように、Ｔ細胞活性化を測定できる様々な方法がある。ＮＫ細胞およびＴ細胞に対する二重特異性チェックポイント抗体の機能的作用は、増殖、サイトカイン放出、および細胞表面メーカーのパラメーターの変化を測定することにより、インビトロ（以下により詳細に説明するように場合によっては、インビボ）で評価できる。ＮＫ細胞の場合、細胞増殖の増加、細胞傷害性（ＣＤ１０７ａ、グランザイム、およびパーフォリン発現の増加により測定される標的細胞を殺滅能力、または標的細胞殺滅を直接測定することによる）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ）、および細胞表面受容体の発現（例えば、ＣＤ２５）は、免疫調節、例えば、癌細胞の死滅の増強を示す。Ｔ細胞の場合、増殖の増加、活性化の細胞表面マーカー発現の増加（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＰＤ１など）、細胞傷害性（標的細胞を死滅させる能力）、およびサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）は、免疫調節、例えば、癌細胞の死滅増強などを示す。したがって、治療の評価は、以下のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して実施することができる。（ｉ）免疫応答を増加させること、（ｉｉ）αβＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化を増加させること、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させること、（ｉｖ）ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性を増加させること、（ｖ）αβＴ細胞抑制および／またはγδＴ細胞抑制を軽減させること、（ｖｉ）炎症誘発性サイトカイン分泌を増加させること、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌を増加させること、（ｖｉｉｉ）インターフェロン−γ産生を増加させること、（ｉｘ）Ｔｈ１応答を増加させること、（ｘ）Ｔｈ２応答を減少させること、（ｘｉ）少なくとも１つの制御性Ｔ細胞の細胞数および／または活性を減少させること、ならびに（ｘｉｉ）腫瘍免疫浸潤物を増加させること。

いくつかの実施形態では、本発明は、二機能性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の使用を提供し、それを必要とする対象において以下のうちの１つ以上を実施する。（ａ）炎症促進性サイトカインを上方制御すること（ｂ）Ｔ細胞の増殖、拡大、または腫瘍浸潤を増加させること（ｃ）Ｔ細胞によるインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、および他のサイトカイン産生を増加させること、（ｄ）ＩＬ−２分泌増加させること、（ｅ）抗体応答を刺激すること、（ｆ）癌細胞の成長を阻害すること、（ｇ）抗原特異的Ｔ細胞免疫を促進すること、（ｈ）ＣＤ４＋および／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を促進すること、（ｉ）Ｔ細胞抑制を緩和させること、（ｊ）ＮＫ細胞活性を促進すること、（ｋ）癌細胞のアポトーシスまたは溶解を促進すること、ならびに／または（ｌ）癌細胞に対する細胞傷害性または細胞増殖抑制作用。

二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、集合して「ダイマー」を構築する２つの「モノマー」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、以下でさらに詳しく説明するとおり、各モノマーのアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は概して、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の生成に関し、ヘテロダイマー形成を促進するために、かつ／またはホモダイマーよりもヘテロダイマーの精製を容易にするために、各鎖で異なる定常領域中のアミノ酸バリアントに応じて、抗原をいくつかの方法で共結合することができる。

二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の形成における主要な障害は、ホモダイマー融合タンパク質から離れてヘテロダイマー融合タンパク質を精製することの難しさ、かつ／またはホモダイマーの形成よりもヘテロダイマーの形成に偏らせることの難しさである。この問題を解決するために、本発明のヘテロダイマーを生成するために使用することができるいくつかのメカニズムが存在する。さらに、当業者には理解されるように、これらのメカニズムを組み合わせて高いヘテロダイマー化を確実にすることができる。したがって、ヘテロダイマー抗体の生成を引き起こすアミノ酸バリアントは、「ヘテロダイマー化バリアント」と呼ばれる。後述するように、ヘテロダイマー化バリアントは、立体バリアント（例えば、下記の「ノブアンドホール」または「スキュー」バリアントおよび下記の「電荷対」バリアント）ならびに「ｐＩバリアント」含むことができ、それによってヘテロダイマーから離れてホモダイマー精製を可能にする。

１つのメカニズムは、当技術分野において一般的に「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」）、または本明細書ではしばしば「スキューバリアント」を指し、これはヘテロダイマー形成を有利にし、ホモダイマー形成を不利にする立体効果および／または静電効果をもたらすアミノ酸操作を指すものであり、任意選択的に使用することができる。Ｒｉｄｇｗａｙｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号、米国特許公開第２０１２／０１４９８７６号に記載のとおりであり、それらのすべては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの図は、「ノブアンドホール」アミノ酸置換を含むいくつかの「モノマーＡ−モノマーＢ」対を同定する。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール（ｋｎｏｂｓａｎｄｈｏｌｅ）」変異は、ヘテロダイマー化に対するスキュー形成へのジスルフィド結合と組み合わせることができる。本発明において有用なのは、Ｔ３６６Ｗと対をなすＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、ならびに架橋ジスルフィドを有するこのバリアント、Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃと対をなすＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃであり、特に以下に概説するｐＩバリアントを含む他のヘテロダイマー化バリアントとの組み合わせである。

ヘテロダイマー抗体の生成に使用される追加のメカニズムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているように、しばしば「静電ステアリング」または「電荷対」と呼ばれる。これは、本明細書において、しばしば「電荷対」と呼ばれる。この実施形態では、静電学を使用して、ヘテロダイマー化に向けて形成をスキューさせる。当業者には理解されるように、これらは、ｐＩ、すなわち精製にも影響を及ぼす可能性があり、したがって場合によってはｐＩバリアントと見なすこともできる。しかしながら、これらはヘテロダイマー化を強制するために生成され、精製手段として使用されなかったので、それらは「立体バリアント」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは「モノマーの対応セット」である）、およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれるがこれらに限定されない。

本発明において、いくつかの実施形態では、ｐＩバリアントを使用して、モノマーの一方または両方のｐＩを変更し、Ａ−Ａ、Ａ−Ｂ、およびＢ−Ｂダイマータンパク質の等電分離を可能にする。

本発明において、ヘテロダイマータンパク質の精製を容易に引き起こすことができるいくつかの基本的メカニズムが存在し、その１つは、各モノマーが異なるｐＩを有することによって、Ａ−Ａ、Ａ−Ｂ、およびＢ−Ｂダイマータンパク質の等電精製が可能になるように、ｐＩバリアントの使用に依存する。あるいは、「トリプルＦ」フォーマットなどの一部の足場フォーマットでは、サイズに基づいて分離することもできる。以下にさらに概説するように、ホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成を「スキューさせる」ことも可能である。したがって、立体的ヘテロダイマー化バリアントおよびｐＩバリアントまたは電荷対バリアントの組み合わせは、本発明において特に使用される。

ヘテロダイマータンパク質の精製を可能にする分離メカニズムとしてｐＩを利用する本発明では、アミノ酸バリアントを一方または両方のモノマーポリペプチドに導入することができる。すなわち、一方のモノマー（本明細書では簡潔さために「モノマーＡ」と呼ぶ）のｐＩは、モノマーＢから離れて操作されることができ、あるいはＡとＢの両モノマーは、モノマーＡのｐＩを増加させ、モノマーＢのｐＩを減少させるように変えることができる。以下で完全に概説されるように、いずれかまたは両方のモノマーのｐＩ変化は、荷電残基を除去または付加することによって（例えば、中性アミノ酸を正荷電または負荷電のアミノ酸残基で置換する、例えばグリシンからグルタミン酸）、正または負から反対の電荷へ荷電残基を変更することによって（例えばアスパラギン酸からリジンへ）、あるいは荷電残基を中性残基へ変更することによって（例えば電荷の消失、リジンからセリン）、実施することができる。いくつかのこれらのバリアントを図に示す。さらに、本明細書のヘテロダイマー抗体の生成に使用するのに好適なｐＩバリアントはアイソタイプのもの、例えば、有意な免疫原性を導入することなくｐＩが変化するように、異なるＩｇＧアイソタイプからｐＩバリアントを移入することである。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１４０２８８２７５号の図２９を参照されたい。

したがって、本発明のこの実施形態では、ヘテロダイマーをホモダイマーから分離することができるように、少なくとも１つのモノマーに十分なｐＩの変化を生じさせることをもたらす。当業者には理解され、かつ以下にさらに論じるように、これは「野生型」重鎖定常領域、およびそのｐＩを増加または減少させる（ｗｔＡ：Ｂ＋またはｗｔＡ：Ｂ−）ように操作されたバリアント領域を使用することによって、または一方の領域を増加して他方の領域を減少させることによって（Ａ＋：Ｂ−またはＡ−：Ｂ＋）、実施できる。

したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、ダイマータンパク質のモノマーの両方ではないにしても少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を、アミノ酸置換（「ｐＩバリアント」または「ｐＩ置換」）をモノマーの一方または両方に組み込むことによって変化させることを目的とする抗体の定常領域におけるアミノ酸バリアントである。本明細書中に示されるように、２つのホモダイマーからのヘテロダイマーの分離は、２つのモノマーのｐＩが０．１ｐＨ単位とわずかに異なる場合に達成でき、０．２、０．３、０．４、および０．５以上異なるものがすべて本発明において使用される。

当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各モノマーまたは両モノマー（複数可）に含まれるべきｐＩバリアントの数は、対象のｓｃＦｖおよびＦａｂの出発ｐＩに部分的に依存するであろう。すなわち、どのモノマーを操作するか、またはどの「方向」か（例えば、より陽性または陰性）を決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列を計算し、そこから決定される。当技術分野において既知のように、異なるＦｖは、本発明において利用される異なる出発ｐＩを有するであろう。概して、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ｌｏｇの各モノマーの総ｐＩ差をもたらすように操作され、本明細書に概説されるように０．２〜０．５が好ましい。

さらに、当業者には理解され、本明細書に概説されるように、場合によっては（フォーマットに応じて）、ヘテロダイマーはサイズ（例えば、分子量）に基づいてホモダイマーから分離することができる。図５７Ａ〜５７Ｋに示すように、一部のフォーマットでは、サイズの異なるヘテロダイマーをもたらす。

さらに、図５７Ａ〜５７Ｋに示すように、いくつかの抗原が二価に結合している可能性があることが認識される（例えば、単一の抗原に対する２つの抗原結合部位）。理解されているように、ＦａｂおよびｓｃＦｖの任意の組み合わせを利用して、所望の結果および組み合わせを達成することができる。

ｐＩバリアントを使用してホモダイマーよりもヘテロダイマーの精製を達成する場合、重鎖（複数可）の定常領域（複数可）を使用することによって、抗体を含む多重特異性タンパク質を設計および精製するよりモジュール方式のアプローチが提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ヘテロダイマー化バリアント（スキューバリアントおよび精製ヘテロダイマー化バリアントを含む）は可変領域に含まれないため、各個々の抗体を操作しなければならない。さらに、いくつかの実施形態では、ｐＩバリアントから生じる免疫原性の可能性は、顕著な免疫原性を導入することなくｐＩが変化するように、異なるＩｇＧアイソタイプからのｐＩバリアントを移入することによって顕著に低下する。したがって、解決されるべきさらなる問題は、高いヒト配列含有量を有する低いｐＩ定常ドメインの解明、例えば、任意の特定位置における非ヒト残基の最小化または回避である。

このｐＩ操作で起こり得る副次的な利益はまた、血清半減期の延長およびＦｃＲｎ結合の増加である。すなわち、米国特許第８，６３７，６４１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、抗体定常ドメイン（抗体およびＦｃ融合体に見られるものを含む）のｐＩを低下させるとインビボでより長い血清保持をもたらし得る。血清半減期を延長するためのこれらのｐＩバリアントはまた、精製のためのｐＩ変化を促進する。

さらに、ヘテロダイマー化バリアントのｐＩバリアントは、ホモダイマーが存在するときを排除、最小化、および区別する能力が顕著であるので、二重特異性抗体の分析および品質管理プロセスにさらなる利益を与えることに注意すべきである。同様に、ヘテロダイマータンパク質の製造の再現性を確実に試験する能力は重要である。

当業者には理解され、以下でより詳細に説明するように、概して図５７Ａ〜５７Ｋに示すように、本発明のヘテロダイマー融合タンパク質は、多種多様な立体配置をとることができる。いくつかの図は、「シングルエンド型」立体配置を示し、分子の一方の「アーム」には１つのタイプの特異性があり、他方の「アーム」には異なる特異性がある。他の図は、「デュアルエンド型」立体配置を示し、分子の「上部」に少なくとも１つのタイプの特異性があり、分子の「底部」に１つ以上の異なる特異性がある。本発明は、抗原に関与し、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体を含む新規免疫グロブリン組成物に関する。

さらに、本明細書で概説するように、追加の機能を追加するために、追加のアミノ酸バリアントを本発明の二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に導入してもよい。例えば、Ｆｃ領域内のアミノ酸変化を（一方のモノマーまたは両方のモノマーいずれか）追加して、ＡＤＣＣまたはＣＤＣの増加（例えば、Ｆｃγ受容体への結合の変化）を促進し、ＦｃＲｎへの結合を増加および／または結果として生じる分子の血清半減期を増加させることができる。本明細書でさらに説明するように、また当業者には理解されるように、本明細書で概説する変形のいずれかおよびすべては、他の変形と任意選択的に独立して組み合わせることができる。

同様に、機能性バリアントの別のカテゴリーは「Ｆｃγ切除バリアント」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）バリアント」である。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、１つ以上またはすべてのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な結合を低減または除去して、追加の作用機序を回避することが望ましい。すなわち、例えば、ＡＤＣＣ活性を排除または有意に低下させるために、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を除去することが一般に望ましい。好適な切除バリアントを図２９に示す。

ＩＩ．命名法
本発明の二重特異性抗体を、いくつかの異なるフォーマットに列挙する。各ポリペプチドには固有の「ＸＥＮＰ」番号が付与されるが、当技術分野で理解されるように、より長い配列はより短い配列を含み得る。いくつかの分子には３つのポリペプチドがあるため、ＸＥＮＰ番号が構成要素とともに名称として使用される。したがって、ボトルオープナー形式の分子ＸＥＮＰ２４１１６は概して、３つの配列「ＸＥＮＰ２４１１６＿ヒトＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉドメイン）＿（ＧＧＧＧＳ）５＿ヒトＩＬ１５（Ｎ６５Ｄ、一本鎖）−Ｆｃ」、「ＸＥＮＰ２４１１６＿５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖」、および「ＸＥＮＰ２４１１６＿５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ軽鎖」または同等物を含むが、当業者はこれらを配列アラインメントにより容易に特定することができるだろう。これらのＸＥＮＰ番号は、配列表ならびに識別子にあり、図で使用される。さらに、３つの構成要素を含む１つの分子は、複数の配列識別子を生成する。例えば、Ｆａｂモノマーのリストには、完全長配列、可変重配列、可変重配列の３つのＣＤＲがあり、軽鎖には、完全長配列、可変軽配列、および可変軽配列の３つのＣＤＲがあり、ｓｃＦｖ−Ｆｃドメインには、完全長配列、ｓｃＦｖ配列、可変軽配列、３つの軽鎖ＣＤＲ、ｓｃＦｖリンカー、可変重配列、および３つの重鎖ＣＤＲがあり、ｓｃＦｖドメインを含む本明細書のすべての分子は、単一の荷電ｓｃＦｖリンカー（＋Ｈ）を使用するが、他の分子も使用できることに留意されたい。さらに、特定の可変ドメインの命名法では、「Ｈｘ．ｘｘ＿Ｌｙ．ｙｙ」タイプの形式が使用され、番号は特定の可変鎖配列の一意の識別子である。したがって、ＸＥＮＰ２６２２９のＦａｂ側の可変ドメインは「ＯＫＴ８＿Ｈ２．１６６＿Ｌ１．１０３」であり、これは可変重ドメインＨ２．１６６が軽ドメインＬ１．１０３と組み合わされたことを示す。これらの配列がｓｃＦｖとして使用される場合、「ＯＫＴ８＿Ｈ２．１６６＿Ｌ１．１０３」という名称は、可変重ドメインＨ２．１６６が軽ドメインＬ１．１０３と結合し、Ｎ末端からＣ末端に向かってｖｈ−リンカー−ｖｌ方向にあることを示す。重可変ドメインと軽可変ドメインの同一の配列を持つが逆順のこの分子は、「ＯＫＴ８＿Ｌ１．１０３＿Ｈ２．１６６」と名付けらる。同様に、配列表および図から明らかなように、異なる構築物は重鎖および軽鎖を「混合および適合」し得る。

ＩＩＩ．定義
本出願をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的同等物を包含することを意図する。

本明細書において「アブレーション」とは、結合および／または活性の低下または除去を意味する。したがって、例えば、「ＦｃγＲ結合を切除する」とは、Ｆｃ領域アミノ酸バリアントが、その特定のバリアントを含まないＦｃ領域と比較して５０％未満の開始結合を有することを意味し、７０〜８０〜９０〜９５〜９８％未満の結合喪失が好ましく、一般に、結合はＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて検出可能な結合のレベル未満である。ＦｃγＲ結合の除去において特に有用なものは、図２９に示すものである。しかしながら、他の記載がない限り、本発明のＦｃモノマーはＦｃＲｎへの結合を保持する。

本明細書で使用される「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の連結抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加はＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。本明細書で論じるように、本発明の多くの実施形態はＡＤＣＣ活性を完全に除去する。

本明細書で用いられる「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞媒介食作用とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の連結抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介反応を意味する。

本明細書における「修飾」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、および／もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分への改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に結合した改変された炭水化物またはＰＥＧ構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。明確にするために、別段の記載がない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ中にコドンを有する２０個のアミノ酸に対するものである。

本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない（生物内で天然に存在しないか、またはいずれの生物中にも存在しないかのいずれか）アミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｅ２７２Ｙまたは２７２Ｙは、２７２位のグルタミン酸がチロシンで置換されているバリアントポリペプチド、この場合はＦｃバリアントを指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させない（例えば、宿主生物発現レベルを上昇させるために（アルギニンをコードする）ＣＧＧを（アルギニンをなおコードする）ＣＧＡに交換する）ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子の生成にもかかわらず、タンパク質は、それが開始する特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。置換には、天然に存在するアミノ酸および場合によっては合成アミノ酸が含まれ得る。例としては、米国特許第６，５８６，２０７号、ＷＯ９８／４８０３２、ＷＯ０３／０７３２３８、ＵＳ２００４／０２１４９８８Ａ１、ＷＯ０５／３５７２７Ａ２、ＷＯ０５／７４５２４Ａ２、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎｅｔａｌ．，（２００２），ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ１２４：９０２６−９０２７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ１１：１１３５−１１３７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔａｌ．，（２００２），ＰＩＣＡＳＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ９９：１１０２０−１１０２４、およびＬ．Ｗａｎｇ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．１−１０が含まれ、参照により全体が組み込まれる。

本明細書で使用される「アミノ酸挿入」または「挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置にアミノ酸残基またはアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、−２３３Ｅは、２３３位の後、かつ２３４位の前のグルタミン酸の挿入を示す。さらに、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後、かつ２３４位の前のＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を示す。

本明細書で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でアミノ酸残基またはアミノ酸配列を除去することを意味する。例えば、Ｅ２３３−、またはＥ２３３＃、Ｅ２３３（）、またはＥ２３３ｄｅｌは、２３３位のグルタミン酸の欠失を示す。さらに、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。

本明細書で使用される「バリアントタンパク質」「タンパク質バリアント」または「バリアント」とは、少なくとも１つの修飾によって親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質バリアントは、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、それをコードするアミノ配列、またはそれをコードするＤＮＡ配列を指し得る。好ましくは、タンパク質バリアントは、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約１〜約７０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸修飾を有する。修飾は、付加、欠失、または置換であり得る。

以下に記載するように、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えばＦｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来の重定常ドメインまたはＦｃ領域などのヒト野生型配列であるが、バリアントを有するヒト配列もまた、「親ポリペプチド」として機能することができ、例えば、米国特許公開第２００６／０１３４１０５号のＩｇＧ１／２ハイブリッドを含めることができる。本明細書のタンパク質バリアントの配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５−９８−９９％の同一性を有する。

したがって、本明細書で使用される「抗体バリアント」または「バリアント抗体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「ＩｇＧバリアント」または「バリアントＩｇＧ」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親ＩｇＧ（ここでも、多くの場合はヒトＩｇＧ配列に由来）とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「免疫グロブリンバリアント」または「バリアント免疫グロブリン」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親免疫グロブリン配列のそれとは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃバリアント」または「バリアントＦｃ」は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のＦｃドメインと比較してアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。

本発明のＦｃバリアントは、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して４３４位に置換セリンを有するＦｃバリアントであり、付番はＥＵインデックスによるものである。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを有するＦｃバリアントを定義する。ＷＴアミノ酸の同一性は特定されていなくてもよく、その場合、前述のバリアントは４２８Ｌ／４３４Ｓと呼ばれる。置換が提供される順序は任意であり、すなわちそれは、例えばＮ４３４Ｓ／Ｍ４２８ＬはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同一のＦｃバリアントである、などということである。抗体に関連する本発明において論じられるすべての位置について、特に明記しない限り、アミノ酸位置の付番はＥＵインデックスによるものである。ＥＵインデックス、またはＫａｂａｔもしくはＥＵ付番スキームにあるようなＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の付番を指す。Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づき、Ｋａｂａｔらは、個々の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類し、そのリストを作成した（参照により全体が組み込まれるＳＥＱＵＥＮＣＥＳＯＦＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔｅｔａｌ．を参照されたい）。Ｅｄｅｌｍａｎｅｔａｌ．，１９６９，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ６３：７８−８５（これにより参照によりその全体が組み込まれる）も参照されたい。修飾は、付加、欠失、または置換であり得る。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。さらに、ポリペプチドには、１つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加が含まれ得る。生物学的に機能する分子が２つ以上のタンパク質を含む場合、各タンパク質は「モノマー」または「サブユニット」または「ドメイン」と呼ばれてもよく、生物学的に機能する分子は「複合体」と呼ばれてもよい。

「残基」とは、本明細書で使用されるとき、タンパク質における位置およびその関連するアミノ酸素性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも称される）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の２９７位の残基である。

本明細書で使用される「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、概して２つの異なるポリペプチド鎖の（例えば、一方の鎖のＶＨ−ＣＨ１、他方の鎖のＶＬ−ＣＬ）、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、この領域単独、または本発明の二重特異性抗体との関係においてこの領域を指し得る。Ｆａｂの関連で、Ｆａｂは、ＣＨ１およびＣＬドメインに加えてＦｖ領域を含む。

本明細書で使用される「Ｆｖ」または「Ｆｖフラグメント」または「Ｆｖ領域」は、ＡＢＤのＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆｖ領域は、Ｆａｂ（上述のとおり、概して上記に概説されている定常領域も含む２つの異なるポリペプチド）とｓｃＦｖの両方としてフォーマットすることができ、ｖｌおよびｖｈドメインを（一般に、本明細書で考察されるリンカーで）組み合わせてｓｃＦｖを形成する。

本明細書における「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は概して、本明細書で論じられるｓｃＦｖリンカーを使用してｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成する、可変軽ドメインに共有結合した可変重ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって（ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈ）のいずれの向きにもあり得る。配列表および図に示す配列では、ｖｈおよびｖｌドメインの順序が名前に示される。例えば、ＨＸ＿Ｌ．Ｙは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ｖｈ−リンカー−ｖｌ、およびＬ．Ｙ＿Ｈ．Ｘがｖｌ−リンカー−ｖｈであることを意味する。

本明細書で使用される「ＩｇＧサブクラス修飾」または「アイソタイプ修飾」とは、１つのＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を、異なる、整合したＩｇＧアイソタイプの対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＥＵ位置２９６においてＩｇＧ１はチロシンを含み、ＩｇＧ２はフェニルアラニンを含むので、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス修飾であると考えられる。

本明細書で使用される「天然に存在しない修飾」とは、アイソタイプ性ではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧのうちのいずれも４３４位にセリンを含まないので、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４（またはそれらのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、天然に生じない修飾であると見なされる。

本明細書で使用される「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」は、ＤＮＡおよびＲＮＡによってコードされている２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。

本明細書で使用される「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「ＩｇＧＦｃリガンド」または「Ｆｃリガンド」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテインＡ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲが含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドにはまた、ＦｃγＲと相同なＦｃ受容体のファミリーである、Ｆｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）が含まれる（Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，２００２，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ１９０：１２３−１３６（参照により全体が組み込まれる））。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未発見の分子を含み得る。特定のＩｇＧＦｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。

本明細書で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、かつＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１とＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１とＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８とＦ１５８を含む）、およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１とＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（参照により全体が組み込まれるＪｅｆｆｅｒｉｓｅｔａｌ．，２００２，ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ８２：５７−６５）、同様に、任意の未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに任意の未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。当技術分野で既知のとおり、機能性ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖および軽鎖と呼ばれる２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ−２−ミクログロブリン（β２−ミクログロブリン）であり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。本明細書において別段の記載がない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とβ２−ミクログロブリンとの複合体を指す。様々なＦｃバリアントを使用して、ＦｃＲｎへの結合を増加させ、場合によっては、血清半減期を増加させることができる。「ＦｃＲｎバリアント」とは、ＦｃＲｎへの結合を増加させるものであり、好適なＦｃＲｎバリアントを以下に示す。概して、別段の記載がない限り、本発明のＦｃモノマーは、ＦｃＲｎへの結合を保持する（下記のように、ＦｃＲｎへの結合を増大させるためのアミノ酸バリアントを含み得る）。

本明細書で使用される「親ポリペプチド」とは、バリアントを生成するようにその後修飾される出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドのバリアントもしくは操作されたバージョンであってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。したがって、本明細書で使用される「親抗原結合ドメイン」は、バリアントを生成するように修飾される未修飾抗原結合ドメインポリペプチドを意味し、本明細書で使用される「親免疫グロブリン」は、バリアントを生成するように修飾される未修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用される「親抗体」は、バリアント抗体を生成するように修飾される未修飾抗体を意味する。「親抗体」には、以下に概説するように、既知の市販の組み換えで産生した抗体が含まれることに注意すべきである。

本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、ＩｇＧ分子のＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを意味し、場合によってはヒンジを含む。ヒトＩｇＧ１のＥＵ付番では、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはアミノ酸２３１〜４４７を含み、ヒンジは２１６〜２３０である。したがって、「Ｆｃドメイン」の定義には、アミノ酸２３１〜４４７（ＣＨ２−ＣＨ３）または２１６〜４４７（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）の両方、またはそのフラグメントが含まれる。この文脈における「Ｆｃフラグメント」は、Ｎ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方のより少ないアミノ酸を含んでもよいが、一般的にサイズに基づく標準的な方法（例えば、非変性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）を使用して検出できるように、別のＦｃドメインまたはＦｃフラグメントとダイマーを形成する能力を依然として保持する。ヒトＩｇＧＦｃドメインは本発明において特に有用なものであり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４由来のＦｃドメインであり得る。本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味し、場合によっては、最初に定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１）またはその一部のすべてまたは一部を除外し、場合によっては、ヒンジのすべてまたは一部をさらに除外する。このため、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ２とＣＨ３）、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、および任意選択的にこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端のすべてまたは一部を指し得る。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、ＦｃはＪ鎖を含んでもよい。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびに任意選択的に、ＣＨ１（Ｃγ１）とＣＨ２（Ｃγ２）との間のヒンジ領域のすべてまたは一部を含む。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシ末端に残基Ｅ２１６、Ｃ２２６、またはＡ２３１を含むものと定義され、ここでの付番はＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスによるものである。いくつかの実施形態では、以下でより詳細に説明されるように、例えば、１つ以上のＦｃγＲまたはＦｃＲｎへの結合を変化させるために、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾が行われる。

当業者には理解されるように、重定常領域ドメインの正確な付番および配置は、異なる付番システムで異なり得る。ＥＵおよびＫａｂａｔによる重定常領域の付番の有用な比較は以下のとおり、Ｅｄｅｌｍａｎｅｔａｌ．，１９６９，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ６３：７８−８５、およびＫａｂａｔｅｔａｌ．，１９９１，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ（参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。

「バリアントＦｃ領域」は、親のＦｃドメインと比較したアミノ酸修飾を含む。したがって、「バリアントヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン」は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、アミノ酸修飾（切除バリアントの場合はアミノ酸欠失が含まれるが、一般的にアミノ酸置換）を含むものである。一般に、バリアントＦｃドメインは、対応する親ヒトＩｇＧＦｃドメインに対して少なくとも約８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９パーセントの同一性を有する（以下に議論する同一性アルゴリズム（一実施形態では当技術分野で既知のＢＬＡＳＴアルゴリズム）をデフォルトパラメーターを用いて使用する）。あるいは、バリアントＦｃドメインは、親Ｆｃドメインに対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸修飾を有し得る。さらに、本明細書で議論されるように、本明細書のバリアントＦｃドメインは、非変性ゲル電気泳動などの本明細書に記載の既知の技術を使用して測定される別のＦｃドメインとともにダイマーを形成する能力を依然として保持する。

本明細書において「重定常領域」とは、アミノ酸１１８〜４４７などのヒトＩｇＧ１のＥＵ付番において、抗体のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分（またはそのフラグメント）を意味し、可変重ドメインを除く。本明細書における「重鎖定常領域フラグメント」とは、Ｎ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方からのアミノ酸がより少ない重鎖定常領域を意味するが、別の重鎖定常領域とダイマーを形成する能力を依然として保持する重鎖定常領域を意味する。

本明細書で使用される「融合タンパク質」とは、少なくとも２つのタンパク質の共有結合を意味する。本明細書に記載されるように、融合タンパク質は人工配列、例えば、ドメインリンカーを含み得る。本明細書における「Ｆｃ融合タンパク質」または「イムノアドヘシン」とは概して、（任意選択的に、本明細書に記載のドメインリンカーを介して）１つ以上の異なるタンパク質、例えば本明細書に記載のＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒに連結したＦｃ領域を含むタンパク質を意味する。いくつかの例では、２つのＦｃ融合タンパク質がホモダイマーＦｃ融合タンパク質またはヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を形成することができ、後者が好ましい。場合によっては、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の一方のモノマーは、Ｆｃドメインのみ（例えば、空のＦｃドメイン）を含み、他方のモノマーは、バリアントＦｃドメインおよび受容体、リガンド、または他の結合パートナーなどのタンパク質ドメインを含むＦｃ融合体である。

本明細書で使用される「位置」は、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順番に付番されるか、または確立されたフォーマット、例えば、抗体付番のためのＥＵインデックスによって付番されてもよい。

本明細書中の本発明のヘテロダイマータンパク質のモノマーの文脈で「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は、「マッチ」する２本鎖ＤＮＡと同様に、「マッチ」してヘテロダイマーを形成する能力を保持、生成、および／または促進するようにヘテロダイマー化バリアントを各モノマーに組み込むことを意味する。例えば、いくつかのｐＩバリアントがモノマーＡへと操作される（例えば、ｐＩをより高くする）場合、同様に利用され得る「電荷対」である立体バリアントはｐＩバリアントを妨害せず、例えば、ｐＩを高くした電荷バリアントが同一の「鎖」または「モノマー」に置かれ、両方の機能を保持する。同様に、以下により詳細に概説されるように、対のセットになる「スキュー」バリアントついて、当業者は、対の１つのセットを組み入れる鎖またはモノマーがどちらに入るかを決定する際に、同様にスキューのｐＩを使用してｐＩ分離を最大化するようにｐＩを考慮する。

本明細書で使用される「標的抗原」とは、所与の抗原結合ドメインまたは抗体の可変領域が特異的に結合する分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であってもよい。多数の適切な標的抗原が以下に記載されている。

「標的細胞」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原を発現する細胞を意味する。

本明細書の本発明による二重特異性抗体を製造する文脈における「宿主細胞」とは、二重特異性抗体の構成要素をコードする外因性核酸を含み、好適な条件下で二重特異性抗体を発現できる細胞を意味する。好適な宿主細胞について以下で説明する。

本明細書で使用される「可変領域」とは、κ、λ、および重鎖免疫グロブリン遺伝子座をそれぞれ構成するＶκ、Ｖλ、および／またはＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。

本明細書における「野生型またはＷＴ」とは、対立遺伝子変異を含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。

タンパク質配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために配列を整合し、必要ならギャップを導入した後の、特定の（親）配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、そして配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野の範囲内である様々な方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の整合を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整合を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。１つの特定のプログラムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１６／０２４４５２５号の段落番号［０２７９］〜［０２８０］に概説されているＡＬＩＧＮ−２プログラムである。

本発明は、ヒト抗体ドメインと配列同一性を有するいくつかの抗原結合ドメインを提供する。２つの類似した配列（抗体可変ドメインなど）間の配列同一性は、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎＯｆＢｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［ｌｏｃａｌｈｏｍｏｌｏｇｙａｌｇｏｒｉｔｈｍ］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，ＣＤ．（１９７０）“ＡＧｅｎｅｒａｌＭｅｔｈｏｄＡｐｐｌｉｃａｂｌｅＴｏＴｈｅＳｅａｒｃｈＦｏｒＳｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓＩｎＴｈｅＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅＯｆＴｗｏＰｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［ｈｏｍｏｌｏｇｙａｌｉｇｎｍｅｎｔａｌｇｏｒｉｔｈｍ］、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）“ＩｍｐｒｏｖｅｄＴｏｏｌｓＦｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４［ｓｅａｒｃｈｆｏｒｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｍｅｔｈｏｄ］、またはＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ，（１９９０）”ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ，“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，ｔｈｅ”ＢＬＡＳＴ”ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ参照のこと）などのアルゴリズムによって測定できる。前述のアルゴリズムのいずれかを使用する場合、デフォルトパラメーター（ウィンドウの長さ、ギャップペナルティなど）が使用される。一実施形態では、デフォルトパラメーターを使用して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して配列同一性を測定する。

本発明のアミノ酸配列（「本発明の配列」）と親アミノ酸配列との間の同一性の程度は、「本発明の配列」の長さまたは親配列の長さのうちの短い方で割った、２つの配列の整合における正確な一致の数として計算される。結果は同一性パーセントで表される。

いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である。いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％まで同一である。

本発明のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は概して、単離されているか、または組み換え体である。本明細書に開示される様々なポリペプチドを説明するために使用される場合、「単離された」とは、それが発現された細胞または細胞培養物から特定および分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。「単離されたヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質」とは、宿主細胞タンパク質などの細胞培養由来の他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質を指す。「組み換え体」は、外来性宿主細胞において組み換え核酸技術を用いて抗体が生成されることを意味し、それらも単離され得る。

本明細書における「抗原結合ドメイン」または「ＡＢＤ」とは、抗原決定基にその結合特異性を付与する抗原結合分子の一部を意味する。

本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」という用語は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する任意の分子を指す。抗原結合分子は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化学化合物であってもよい。抗原結合分子の例としては、免疫グロブリンおよびその誘導体またはフラグメント、例えばＦａｂおよびｓｃＦｖがある。抗原結合分子の追加の例は、受容体とリガンドである。

特異的結合の強度または親和性は、相互作用の解離定数（ＫＤ）として表すことができ、ＫＤが小さいほど親和性が大きくなり、ＫＤが大きいほど親和性が低くなる。結合特性は、生体層干渉法および表面プラズモン共鳴に基づく方法などの当技術分野で周知の方法によって決定することができる。そのような方法の１つは、抗原結合部位／抗原または受容体／リガンド複合体の会合速度と解離速度を測定することを伴い、速度は、複合パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的パラメーターに依存する。したがって、会合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）の両方を決定でき、ｋｄ／ｋａの比は解離定数ＫＤに等しくなる（Ｎａｔｕｒｅ３６１：１８６−１８７（１９９３）およびＤａｖｉｅｓｅｔａｌ．（１９９０）ＡｎｎｕａｌＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ５９：４３９−４７３を参照のこと）。

特定の分子またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対して少なくとも約１０^−４Ｍ、少なくとも約１０^−５Ｍ、少なくとも約１０^−６Ｍ、少なくとも約１０^−７Ｍ、少なくとも約１０^−８Ｍ、少なくとも約１０^−９Ｍ、代替的に少なくとも約１０^−１０Ｍ、少なくとも約１０^−１１Ｍ、少なくとも約１０^−１２Ｍ、またはそれ以上のＫＤを有する抗体によって示すことができる。典型的には、抗原に特異的に結合する抗原結合分子は、抗原またはエピトープに対する対照分子について、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上のＫＤを有することになる。

また、特定の分子またはエピトープへの特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対するＫａまたは会合速度が、対照と比べたそのエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きい抗原結合分子によって示され得る。

「エピトープ」とは、本明細書では、特異的抗原結合ドメイン、例えばパラトープとして既知の抗体分子の可変領域と相互作用する決定基を意味する。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の群分けであり、通常、特異的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。単一分子は、２つ以上のエピトープを有してもよい。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性構成要素とも称される）および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基、換言すると、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にあるアミノ酸残基を含み得る。エピトープは、立体配座または直線状のいずれであってもよい。立体配座エピトープは、直線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントからのアミノ酸の空間的な並置によって作り出される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって作り出されるものである。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別され得る。エピトープは、典型的には、固有の空間立体構造内に、少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個、または８〜１０個のアミノ酸を含む。同一のエピトープを認識する抗原結合分子は、ある抗原結合分子の別の抗原結合分子の標的抗原への結合を遮断する能力、例えば、「ビニング」を示す単純な免疫アッセイにおいて検証され得る。以下に概説するように、本発明は、列挙された本明細書の抗原結合分子および抗原結合ドメインを含むだけでなく、列挙された抗原結合分子または抗原結合ドメインによって結合されるエピトープとの結合について競合するものも含む。

「融合」または「共有結合」とは、本明細書で概説される構成要素（例えば、ＩＬ−１５タンパク質およびＦｃドメイン）が、直接またはドメインリンカーを介してペプチド結合により連結されることを意味する。

本明細書で使用される場合、「一本鎖」という用語は、ペプチド結合によって直線的に連結されたアミノ酸モノマーを含む分子を指す。特定の実施形態では、一本鎖ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体または「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」、すなわちＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインが融合して、単一ペプチド鎖を形成する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５のＣ末端はＩＬ−１５ＲαｓｕｓｈｉドメインのＮ末端に結合している。いくつかの実施形態では、モノマーは直接連結されている。他の実施形態では、モノマーは、本明細書に概説されるドメインリンカーを介して連結される。

特定の抗原またはエピトープへの「特異的結合」もしくはそれら「に特異的に結合する」またはそれら「に対して特異的である」とは、非特異的相互作用と測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない類似の構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と同様である対照分子との競合によって決定することができる。

特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対して少なくとも約１０^−４Ｍ、少なくとも約１０^−５Ｍ、少なくとも約１０^−６Ｍ、少なくとも約１０^−７Ｍ、少なくとも約１０^−８Ｍ、少なくとも約１０^−９Ｍ、代替的に少なくとも約１０^−１０Ｍ、少なくとも約１０^−１１Ｍ、少なくとも約１０^−１２Ｍ、またはそれ以上のＫＤを有する抗体によって示され得、ＫＤとは特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープと比べて、対照分子に対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きいＫＤを有することになる。

また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａが、対照と比べて、そのエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きい抗体によって示され得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は一般的に、ＢｉａｃｏｒｅＳＰＲまたはＢＬＩアッセイを用いて測定される。

本発明をさらに説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、よって当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを目的とするものではないことも理解されるべきである。

ＩＶ．標的化ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質
本明細書において提供されるのは、抗原に結合することができ、共通γ鎖（γｃ、ＣＤ１３２）および／またはＩｌ−２受容体β鎖（ＩＬ−２Ｒβ、ＣＤ１２２）と複合体形成することができるヘテロダイマー融合タンパク質である。ヘテロダイマー融合タンパク質は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質および抗原結合ドメインを含み得る。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ−１５Ｒαに共有結合したＩＬ−１５タンパク質、およびＦｃドメインを含み得る。任意選択で、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質は非共有結合している。抗原結合ドメインは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄなど、だがこれらに限定されない標的抗原に特異的に結合する。

Ｆｃドメインは、ＩｇＧＦｃドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃドメインから誘導することができ、ＩｇＧ１Ｆｃドメインが本発明において特に使用される。以下に、本発明の二機能性ヘテロダイマータンパク質のＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲαＦｃ融合モノマーおよび抗原結合ドメインに有用なＦｃドメインを記載する。

各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定し、Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づき、Ｋａｂａｔらは、個々の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類し、そのリストを作成した（参照により全体が組み込まれるＳＥＱＵＥＮＣＥＳＯＦＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔｅｔａｌ．を参照されたい）。本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔ付番系は概して、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）を参照するときに使用され、ＥＵ付番系は、Ｆｃ領域に対するものである（例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，上述（１９９１）を参照）。

免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖においていくつかの免疫グロブリンドメインがある。本明細書の「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、明確に異なる三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。定常重（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインが本発明における関心対象である。ＩｇＧ抗体の関連において、ＩｇＧアイソタイプは、それぞれ３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧとの関連における「ＣＨ」ドメインは以下のとおりである。「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスによる１１８〜２１５位を指す。「ヒンジ」とは、Ｋａｂａｔにあるような、ＥＵインデックスによる２１６〜２３０位を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスによる２３１〜３４０位を指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従う３４１〜４４７位を指す。表１に示すように、重鎖ドメインの正確な付番および配置は、異なる付番システムで異なり得る。本明細書に示され、以下に記載されるように、ｐＩバリアントは、以下に考察されるヒンジ領域と同様に１つまたは複数のＣＨ領域にあり得る。

重鎖のＩｇドメインの別の種類は、ヒンジ領域である。本明細書において「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１のおよび第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧＣＨ１ドメインはＥＵ位置２１５で終わり、ＩｇＧＣＨ２ドメインは残基ＥＵ位置２３１で始まる。したがって、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは、位置２１６（ＩｇＧ１中のＥ２１６）から２３０（ＩｇＧ１中のＰ２３０）を含むように本明細書で定義され、付番は、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスによるものである。いくつかの実施形態では、例えばＦｃ領域に関連して、ヒンジが含まれ、一般に位置２１６〜２３０を指す。本明細書に記載のとおり、ｐＩバリアントはヒンジ領域にも同様に作製することができる。

したがって、本発明は、異なる抗体ドメイン、例えば異なるＦｃドメインを提供する。本明細書中に記載され、当技術分野において既知のとおり、本発明のヘテロダイマータンパク質は異なるドメインを含み、これもまた重複し得る。これらのドメインは、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含むが、これらに限定されない。

したがって、「Ｆｃドメイン」は、−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、および場合によりヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインはまた、ＣＨ１ドメインの一部も含む。本明細書のいくつかの実施形態では、タンパク質フラグメント、例えばＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＲαがＦｃドメインに結合している場合、Ｆｃドメインのヒンジの全部または一部に結合しているのはＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒα構築物のＣ末端であり、例えば、それは一般にヒンジの始まりである配列ＥＰＫＳに結合している。他の実施形態では、タンパク質フラグメント、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＲαがＦｃドメインに結合している場合、それは、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒα構築物のＮ末端であり、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインに結合している。

本明細書に概説したＦｃドメインタンパク質の構築物および配列のいくつかにおいて、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質フラグメントのＣ末端はドメインリンカーのＮ末端に結合し、そのＣ末端は定常ＦｃドメインのＮ末端に結合している（Ｎ−ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質フラグメント−リンカー−Ｆｃドメイン−Ｃ）が、これはスイッチできる（Ｎ−Ｆｃドメイン−リンカー−ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質フラグメント−Ｃ）。本明細書に概説される他の構築物および配列において、第１のタンパク質断片のＣ末端は、場合によりドメインリンカーを介して、第２のタンパク質断片のＮ末端に結合し、第２のタンパク質断片のＣ末端は、場合によりドメインリンカーを介して定常ＦｃドメインのＮ末端に結合する。本明細書に概説されるさらに他の構築物および配列において、第１のタンパク質断片または第２のタンパク質断片に結合していない定常Ｆｃドメインが提供される。ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、本明細書に記載の２つ以上の例示的なモノマーＦｃドメインタンパク質を含み得る。

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインをともに連結するために使用される「ドメインリンカー」であり、そのいくつかを図６に示す。任意の好適なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（一般に１〜２〜３〜４〜５）の整数である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン−セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組み換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。場合によっては、以下に概説する「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」に注意を払って、リンカーは荷電ドメインリンカーである。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、自己組織化してヘテロダイマーＦｃドメイン融合ポリペプチドを形成する、２つの異なる重鎖バリアントＦｃ配列の使用に依存するヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供する。

一実施形態では、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、それがｐＩ操作などのヘテロダイマーを生成するように操作することができる少なくとも２つの定常ドメインを含む。使用され得る他のＦｃドメインは、ｐＩ操作された本発明のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびヒンジドメインのうちの１つ以上を含む断片を含む。特に、図５７Ａ〜５７Ｋに示すフォーマットは、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質であり、つまり、タンパク質が、ヘテロダイマーＦｃドメインに自己組織化した２つの関連Ｆｃ配列および少なくとも１つのタンパク質フラグメント（例えば、１、２またはそれ以上のタンパク質フラグメント）を有することを意味する。場合によっては、第１のタンパク質フラグメントは第１のＦｃ配列に連結し、第２のタンパク質フラグメントは第２のＦｃ配列に連結する。場合によっては、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、第１のＦｃ配列に連結している第２のタンパク質フラグメントに連結した第１のタンパク質フラグメント、および第１のまたは第２のタンパク質フラグメントのいずれにも連結していない第２のＦｃ配列を含む。

本発明は、１つ以上の結合パートナー、リガンド、または受容体への結合を可能にするヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供するための新規構築物に関する。ヘテロダイマーＦｃ構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、「ダイマー」に組み立てられる２つの「モノマー」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロダイマーＦｃ融合体は、以下でさらに詳しく説明するとおり、各モノマーのアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は概して、結合パートナー（複数可）またはリガンド（複数可）または受容体（複数可）をいくつかの方法で共結合することができるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の生成に関し、ヘテロダイマー形成を促進するために、かつ／またはホモダイマーよりもヘテロダイマーの精製を容易にするために、各鎖で異なる定常領域中のアミノ酸バリアントに依存している。

本発明のヘテロダイマーを生成するために使用することができるいくつかのメカニズムが存在する。さらに、当業者には理解されるように、これらのメカニズムを組み合わせて高いヘテロダイマー化を確実にすることができる。したがって、ヘテロダイマーの産生をもたらすアミノ酸バリアントは、「ヘテロダイマー化バリアント」と呼ばれる。後述するように、ヘテロダイマー化バリアントは、ヘテロダイマーから離れてホモダイマーの精製を可能にする立体バリアント（例えば、後述の「ノブアンドホール」または「スキュー」バリアントおよび「電荷対」バリアント）ならびに「ｐＩバリアント」を含み得る。ＷＯ２０１４／１４５８０６（その全体が参照により、具体的には以下で「ヘテロダイマー化バリアント」の議論について本明細書に組み込まれ）に一般的に記載されているとおり、ヘテロダイマー化の有用なメカニズムには「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」、本明細書でしばしば「スキュー」バリアントとして記載（ＷＯ２０１４／１４５８０６中の議論を参照）、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載される「静電ステアリング」または「電荷対」、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されるｐＩバリアント、およびＷＯ２０１４／１４５８０６および以下に概説される一般的なさらなるＦｃバリアントが含まれる。

本発明において、ヘテロダイマータンパク質の精製を容易に引き起こすことができるいくつかの基本的メカニズムが存在し、その１つは、各モノマー、続いて各ダイマー種が異なるｐＩを有することによって、Ａ−Ａ、Ａ−Ｂ、およびＢ−Ｂダイマータンパク質の等電精製が可能になるように、ｐＩバリアントの使用に依存する。代替的に、いくつかのフォーマットはまた、サイズに基づいて分離することも可能にする。以下にさらに概説するように、ホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成を「スキューさせる」ことも可能である。したがって、立体的ヘテロダイマー化バリアントおよびｐＩバリアントまたは電荷対バリアントの組み合わせは、本発明において特に使用される。

一般に、本発明において特に使用される実施形態は、２つのモノマー間および各ダイマー種間のｐＩ差を増加させる、ｐＩバリアントと組み合わせた、ホモダイマー形成に対するヘテロダイマー形成を促進するスキューバリアントを含むバリアントのセットに依存する。

さらに、以下により完全に概説されるように、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質のフォーマットに応じて、ｐＩバリアントはモノマーの定常ドメインおよび／またはＦｃドメイン内に含まれるか、またはドメインリンカーが使用されるかのいずれかであり得る。すなわち、本発明は、一方または両方のモノマー上にあるｐＩバリアント、および／または荷電ドメインリンカーも提供する。さらに、代替の機能性のためのさらなるアミノ酸操作もまた、Ｆｃ、ＦｃＲｎ、およびＫＯバリアントなどのｐＩ変化を付与し得る。

ヘテロダイマータンパク質の精製を可能にする分離メカニズムとしてｐＩを利用する本発明では、アミノ酸バリアントを一方または両方のモノマーポリペプチドに導入することができる。すなわち、一方のモノマー（本明細書では簡潔さために「モノマーＡ」と呼ぶ）のｐＩは、モノマーＢから離れて操作されることができ、あるいはＡとＢの両モノマーは、モノマーＡのｐＩを増加させ、モノマーＢのｐＩを減少させるように変えることができる。論じられるように、いずれかまたは両方のモノマーのｐＩ変化は、荷電残基を除去または付加することによって（例えば中性アミノ酸を正または負に荷電したアミノ酸残基で置換する、例えばグルタミンからグルタミン酸）、正または負から反対の電荷への荷電残基の変更によって（例えばアスパラギン酸からリジンへ）、または荷電残基の中性残基への変更によって（例えば電荷の消失、リジンからセリン）、実施することができる。いくつかのこれらのバリアントを図に示す。

したがって、本発明のこの実施形態は、ヘテロダイマーをホモダイマーから分離することができるように、少なくとも１つのモノマーに十分なｐＩの変化を生じさせることを提供する。当業者には理解され、かつ以下にさらに論じるように、これは「野生型」重鎖定常領域、およびそのｐＩを増加または減少させる（ｗｔＡ：Ｂ＋またはｗｔＡ：Ｂ−）ように操作されたバリアント領域を使用することによって、または一方の領域を増加して他方の領域を減少させることによって（Ａ＋：Ｂ−またはＡ−：Ｂ＋）、実施できる。

したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、ダイマータンパク質のモノマーの両方ではないにしても少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を、アミノ酸置換（「ｐＩバリアント」または「ｐＩ置換」）をモノマーの一方または両方に組み込むことによって変化させることを目的とする定常領域におけるアミノ酸バリアントである。本明細書中の２つのホモダイマーからのヘテロダイマーの分離は、２つのモノマーのｐＩが０．１ｐＨ単位とわずかに異なる場合に達成でき、０．２、０．３、０．４、および０．５以上異なるものがすべて本発明において使用される。

当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各モノマーまたは両方のモノマー（複数可）に含まれるべきｐＩバリアントの数は、構成要素の出発ｐＩに部分的に依存するであろう。すなわち、どのモノマーを操作するか、またはどの「方向」（例えば、より陽性またはより陰性）かを決定するために、Ｆｃドメインの配列、場合によっては、Ｆｃドメインに連結するタンパク質ドメイン（複数可）が計算され、そこから決定がなされる。当技術分野において既知のとおり、異なるＦｃドメインおよび／またはタンパク質ドメインは、本発明において利用される異なる出発ｐＩを有するであろう。概して、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ｌｏｇの各モノマーの総ｐＩ差をもたらすように操作され、本明細書に概説されるように０．２〜０．５が好ましい。

さらに、当業者には理解され、本明細書に概説されるように、いくつかの実施形態では、ヘテロダイマーはサイズに基づいてホモダイマーから分離することができる。図に示すように、例えば、フォーマットのいくつかは、サイズに基づいてヘテロダイマーおよびホモダイマーの分離を可能にする。

ｐＩバリアントを使用してヘテロダイマー化を達成する場合、Ｆｃドメイン（複数可）の定常領域（複数可）を使用することによって、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を設計および精製するためのよりモジュール方式のアプローチが提供される。したがって、いくつかの実施形態において、ヘテロダイマー化バリアント（スキューバリアントおよび精製ヘテロダイマー化バリアントを含む）を操作しなければならない。さらに、いくつかの実施形態では、ｐＩバリアントから生じる免疫原性の可能性は、顕著な免疫原性を導入することなくｐＩが変化するように、異なるＩｇＧアイソタイプからのｐＩバリアントを移入することによって顕著に低下する。したがって、解決されるべきさらなる問題は、高いヒト配列含有量を有する低ｐＩの定常ドメインの解明、例えば、任意の特定の位置における非ヒト残基の最小化または回避である。

このｐＩ操作で起こり得る副次的な利益はまた、血清半減期の延長およびＦｃＲｎ結合の増加である。すなわち、ＵＳＳＮ１３／１９４，９０４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、抗体定常ドメイン（抗体およびＦｃ融合体に見られるものを含む）のｐＩを低下させるとインビボでより長い血清保持をもたらし得る。血清半減期を延長するためのこれらのｐＩバリアントはまた、精製のためのｐＩ変化を促進する。

さらに、ヘテロダイマー化バリアントのｐＩバリアントは、ホモダイマーが存在するとき、排除、最小化、および区別する能力が顕著であるので、Ｆｃ融合タンパク質の分析および品質管理プロセスにさらなる利益を与える。同様に、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の製造の再現性を確実に試験する能力は重要である。

Ａ．ヘテロダイマー化バリアント
本発明は、ヘテロダイマー形成および／またはホモダイマーからの精製を可能にするためにヘテロダイマーバリアントを利用する、様々なフォーマットのヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含む、ヘテロダイマータンパク質を提供する。ヘテロダイマー融合構築物は、２つのＦｃドメイン、例えば、「ダイマー」に組み立てられる２つの「モノマー」の自己組織化の性質に基づく。

ヘテロダイマー化スキューバリアントのセットのいくつかの好適な対がある。これらのバリアントは、「セット」の「対」になる。すなわち、一方のセットの対が第１のモノマーに組み込まれ、他のセットの対が第２のモノマーに組み込まれる。注目すべきは、これらのセットは、一方のモノマー上の残基と他方のモノマー上の残基との間で一対一の対応関係を有する「ノブインホール」バリアントとして必ずしも振舞わないことであり、すなわち、これらのセットの対は、ヘテロダイマー形成を促進し、ホモダイマー形成を妨げる２つのモノマー間の境界面を形成し、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロダイマーの割合を予想の５０％（２５％ホモダイマーＡ／Ａ：５０％ヘテロダイマーＡ／Ｂ：２５％ホモダイマーＢ／Ｂ）ではなく９０％以上にする。

Ｂ．立体バリアント
いくつかの実施形態において、ヘテロダイマーの形成は、立体バリアントの付加によって促進され得る。すなわち、各重鎖中のアミノ酸を変えることによって、異なる重鎖が会合して同一のＦｃアミノ酸配列を有するホモダイマーを形成するよりもヘテロダイマー構造を形成する可能性が高い。好適な立体バリアントは、ＵＳＳＮ１５／１４１，３５０の図２９に含まれており、そのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、同様に図１Ａ〜１Ｅにも含まれる。

１つのメカニズムは、当技術分野で一般的に「ノブアンドホール」と呼ばれ、ヘテロダイマー形成を有利にし、ホモダイマー形成を不利にする立体効果をもたらすアミノ酸操作を指し、ＵＳＳＮ６１／５９６，８４６、Ｒｉｄｇｗａｙｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号に記載のとおりであり、それらのすべては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの図は、「ノブアンドホール」に依存するいくつかの「モノマーＡ−モノマーＢ」対を特定する。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール（ｋｎｏｂｓａｎｄｈｏｌｅ）」変異は、ヘテロダイマー化に対するスキュー形成へのジスルフィド結合と組み合わせることができる。

ヘテロダイマーの生成に使用される追加のメカニズムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているように、しばしば「静電ステアリング」と呼ばれる。これは、本明細書において、しばしば「電荷対」と呼ばれる。この実施形態では、静電学を使用して、ヘテロダイマー化に向けて形成をスキューさせる。当業者には理解されるように、これらは、ｐＩ、すなわち精製にも影響を及ぼす可能性があり、したがって場合によってはｐＩバリアントと見なすこともできる。しかしながら、これらはヘテロダイマー化を強制するために生成され、精製手段として使用されなかったので、それらは「立体バリアント」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは「モノマーの対応セット」である）、およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれるがこれらに限定されない。

さらなるモノマーＡおよびモノマーＢのバリアントは、本明細書に概説されるｐＩバリアントまたはＵＳ２０１２／０１４９８７６（参照によりそのすべてが本明細書に明示的に組み込まれる）の図３７に示される他の立体バリアントなどの他のバリアントと、任意選択的に独立して任意の量で組み合わせることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される立体バリアントは、任意のｐＩバリアント（またはＦｃバリアント、ＦｃＲｎバリアント等の他のバリアント）を一方または両方のモノマーに任意選択的に独立して組み込むことができ、本発明のタンパク質に独立して任意選択的に含むかまたは除外することができる。

好適なスキューバリアントの一覧を図１Ａ〜１Ｅに示す。多くの実施形態において特に有用であるのは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意選択的に架橋ジスルフィドＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）を含むが、これらに限定されないセットの対である。命名法に関して、対「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、一方のモノマーが二重バリアントセットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、他方が二重バリアントセットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味し、上述のように、これらの対の「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は出発ｐＩに依存する。

Ｃ．ヘテロダイマーのｐＩ（等電点）バリアント
一般に、当業者には理解されるように、ｐＩバリアントには２つの一般的なカテゴリー：タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性変化）とタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性変化）がある。本明細書に記載されるように、これらのバリアントのすべての組み合わせを使用することができる。一方のモノマーは野生型、または野生型と顕著に異なるｐＩを示さないバリアントであってもよく、他方がより塩基性またはより酸性のいずれかであり得る。あるいは、各モノマーは、１つはより塩基性に、１つはより酸性へと変化し得る。

ｐＩバリアントの好ましい組み合わせはＵＳＳＮ１５／１４１，３５０の図３０に示されており、そのすべてはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に概説し、図に示すように、これらの変化はＩｇＧ１と比較して示されているが、すべてのアイソタイプをこのように変更することができ、アイソタイプハイブリッドも同様である。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２〜４に由来する場合、Ｒ１３３ＥおよびＲ１３３Ｑもまた使用され得る。

一実施形態では、Ｆｃモノマーの１つがＣＨ１ドメインを含む場合、ｐＩバリアントの好ましい組み合わせは、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１と比較するときＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む１つのモノマーを有する。いくつかの例では、第２のモノマーは、（ＧＫＰＧＳ）_４を含む、正荷電ドメインリンカーを含む。場合によっては、第１のモノマーは２０８位を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まない構築物（例えば、ドメインの１つにＣＨ１ドメインを利用しないヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の場合）において、好ましい負のｐＩバリアントＦｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１と比較するときＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。

いくつかの実施形態では、変異は、位置２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、および２３０を含む、Ｆｃドマン（ｄｏｍａｎ）のヒンジドメインで生じる。したがって、ｐＩ変異、特に置換は、本発明で使用されている１、２、３、４または５個の変異によって位置２１６〜２３０のうちの１つ以上で行うことができる。同様に、すべての可能な組み合わせが、単独で、または他のドメイン中の他のｐＩバリアントとともに企図されている。

ヒンジドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換としては、２２１位の欠失、２２２位の非天然バリンまたはトレオニン、２２３位の欠失、２２４位の非天然グルタミン酸、２２５位の欠失、２３５位の欠失、および２３６位の欠失または非天然アラニンが含まれるがこれらに限定されない。場合によっては、ヒンジドメインにおいてはｐＩ置換のみが行われ、他の例では、これらの置換（複数可）は他のドメイン内の他のｐＩバリアントに任意の組み合わせで加えられる。

いくつかの実施形態では、位置２３３、２３４、２３５、２３６、２７４、２９６、３００、３０９、３２０、３２２、３２６、３２７、３３４、および３３９を含むＣＨ２領域内に変異を生じさせることができる。２３３〜２３６における変化は、ＩｇＧ２骨格における（３２７Ａとともに）エフェクター機能を増加させるためになされ得ることに留意されたい。同様に、これら１４個の位置のすべての可能な組み合わせを作ることができ、例えば、ｐＩ抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＣＨ２のｐＩ置換を有していてもよい。

ＣＨ２ドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換としては、２７４位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、２９６位の非天然フェニルアラニン、３００位の非天然フェニルアラニン、３０９位の非天然バリン、３２０位の非天然グルタミン酸、３２２位の非天然グルタミン酸、３２６位の非天然グルタミン酸、３２７位の非天然グリシン、３３４位の天然グルタミン酸、３３９位の非天然トレオニン、およびＣＨ２内および他のドメインとのすべての可能な組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。

この実施形態では、変異は位置３５５、３５９、３６２、３８４、３８９、３９２、３９７、４１８、４１９、４４４および４４７から独立して任意選択的に選択され得る。ＣＨ３ドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換としては、３５５位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、３８４位の非天然セリン、３９２位の非天然アスパラギンまたはグルタミン酸、３９７位の非天然メチオニン、４１９位の非天然グルタミン酸、３５９位の非天然グルタミン酸、３６２位の非天然グルタミン酸、３８９位の非天然グルタミン酸、４１８位の非天然グルタミン酸、４４４位の非天然グルタミン酸、および４４７位の欠失または非天然アスパラギン酸が含まれるがこれらに限定されない。ｐＩバリアントの例示的な実施形態は図２に提示されている。

Ｄ．アイソタイプバリアント
さらに、本発明の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの特定の位置でのｐＩアミノ酸の「移入」に依存し、したがって、バリアントに望ましくない免疫原性が導入される可能性を低減または排除する。これらのいくつかは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示されている。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由から治療用抗体の一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２のそれよりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。特定の位置でＩｇＧ２残基をＩｇＧ１骨格に導入することによって、得られるモノマーのｐＩは低下（または上昇）し、さらにより長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有し、グルタミン酸を移入すると、得られるタンパク質のｐＩに影響を与える。以下に記載されるように、バリアントＦｃ融合タンパク質のｐＩに顕著な影響を与えるためには、一般にいくつかのアミノ酸置換が必要とされる。しかしながら、ＩｇＧ２分子中の変化でさえも血清半減期の増加を可能にすることが以下に論じられるように留意されるべきである。

他の実施形態では、非アイソタイプのアミノ酸変化を行って、（例えば、高ｐＩのアミノ酸から低ｐＩのアミノ酸へと変化させることによって）得られるタンパク質の全体的な荷電状態を低下させるか、または以下でさらに詳細に説明する安定性等のための構造の調整を可能にする。

さらに、重定常ドメインと軽定常ドメインの両方をｐＩ操作することによって、ヘテロダイマーの各モノマーにおける顕著な変化を見ることができる。本明細書で考察されるように、２つのモノマーのｐＩが少なくとも０．５だけ異なることが、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に高感度な他の方法による分離を可能する。

Ｅ．ｐＩの計算
各モノマーのｐＩは、バリアント重鎖定常ドメインのｐＩおよび全モノマーのｐＩに依存し、バリアント重鎖定常ドメインおよび融合パートナーを含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図１９のチャートを用いて、バリアント重鎖定常ドメインに基づいて計算される。本明細書で論じるように、どのモノマーを操作するかは概して、各モノマーの固有のｐＩによって決定される。

Ｆ．インビボ結合により良好なＦｃＲｎも付与するｐＩバリアント
ｐＩバリアントがモノマーのｐＩを減少させる場合、それらはインビボでの血清保持を改善するというさらなる利点を有することができる。

まだ検討中ではあるが、エンドソーム内のｐＨ６でＦｃＲｎに結合するとＦｃが隔離されるため、Ｆｃ領域はインビボでより長い半減期を有すると考えられている（ＧｈｅｔｉｅａｎｄＷａｒｄ，１９９７ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ．１８（１２）：５９２−５９８、全体が参照により組み込まれる）。次いでエンドソーム区画はＦｃを細胞表面にリサイクルする。区画が細胞外空間に開くと、約７．４のより高いｐＨが、血中へのＦｃの放出を誘導する。マウスにおいて、Ｄａｌｌ´Ａｃｑｕａらは、ｐＨ６およびｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合が増加したＦｃ変異体は、実際に血清濃度の低下および野生型Ｆｃと同一の半減期を有することを示した（Ｄａｌｌ´Ａｃｑｕａｅｔａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１−５１８０、参照によりその全体が組み込まれる）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＦｃの親和性の増加は、血中へのＦｃの放出を妨げると考えられる。したがって、インビボでのＦｃの半減期を増加させるＦｃ変異は、理想的には、より高いｐＨでのＦｃの放出をなお可能にしながら、より低いｐＨでのＦｃＲｎ結合を増加させる。アミノ酸ヒスチジンは、６．０〜７．４のｐＨ範囲でその荷電状態を変化させる。それ故、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体中の重要な位置にＨｉｓ残基を見出すことは驚くべきことではない。

Ｇ．追加機能のための追加のＦｃバリアント
ｐＩアミノ酸バリアントに加えて、１つ以上のＦｃγＲ受容体への結合を改変すること、ＦｃＲｎ受容体への結合の改変等を含むがこれらに限定されない、様々な理由で実施することができるいくつかの有用なＦｃアミノ酸修飾が存在する。

したがって、本発明のタンパク質は、ｐＩバリアントおよび立体バリアントを含む、本明細書に概説したヘテロダイマー化バリアントを含むアミノ酸修飾を含むことができる。バリアントの各セットは独立して任意選択的に特定のヘテロダイマータンパク質に含み得るかまたはそれから除外し得る。

Ｈ．ＦｃγＲバリアント
したがって、ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への結合を変更するために実施され得るいくつかの有用なＦｃ置換が存在する。結合の増加ならびに結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、すなわち、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応）の増加をもたらすことが知られている。同様に、いくつかの状況下では、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）への結合の減少も有益であり得る。本発明で使用されるアミノ酸置換には、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０（特に図４１）、ＵＳＳＮ１１／１７４，２８７、ＵＳＳＮ１１／３９６，４９５、ＵＳＳＮ１１／５３８，４０６に列挙されるものが含まれ、それらのすべてはその全体が、具体的にはそこで開示されるバリアントが参照により、明示的に本明細書に組み込まれる。使用される特定のバリアントには、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ、および２９９Ｔが含まれるがこれらに限定されない。

さらに、ＦｃγＲＩＩｃに対する親和性を増加させるアミノ酸置換もまた、本明細書に概説されるＦｃドメインバリアントに含まれ得る。例えば、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０およびＵＳＳＮ１４／５７８，３０５に記載される置換は有用である。

さらに、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９に具体的に開示される、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩまたはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、および２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含むがこれらに限定されない、ＦｃＲｎへの結合の増加および血清半減期の増加に使用される追加のＦｃ置換が存在する。

Ｉ．切除バリアント
同様に、機能性バリアントの別のカテゴリーは「ＦｃγＲ切除バリアント」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）」バリアントである。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、さらなる作用機序を回避するために、１つ以上またはすべてのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な結合を低減または除去することが望ましい。つまり、例えば、多くの実施形態において、特に二機能性免疫調節性タンパク質の使用において、Ｆｃドメインのうちの１つが、１つ以上のＦｃγ受容体切除バリアントを含むように、ＦＣγＲＩＩＩａ結合を切除してＡＤＣＣ活性を除去または顕著に減少させることが望ましい。これらの切除バリアントは、それらのすべてが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１５／１４１，３５０の図３１に示されており、ＥＵインデックスに従って、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される切除バリアントを用いる好ましい態様で、それぞれが独立して任意選択的に含まれるか除外することができる。本明細書で言及される切除バリアントは、ＦｃγＲ結合を切除するが、ＦｃＲｎ結合を切除しないことに留意されたい。

Ｊ．ヘテロダイマーとＦｃバリアントの組み合わせ
当業者には理解されるように、列挙されたヘテロダイマー化バリアント（スキューバリアントおよび／またはｐＩバリアントを含む）はすべて、それらの「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」または「モノマー分割」を保持する限り、任意の方法で任意選択的に独立して組み合わせることができる。さらに、これらのバリアントはすべて、ヘテロダイマー化フォーマットのいずれにも組み合わせることができる。

ｐＩバリアントの場合、特に使用される実施形態が図面に示されているが、精製を促進するために２つのモノマー間のｐＩの差異を変えるという基本的な規則に従って、他の組み合わせを生成できる。

さらに、ヘテロダイマー化バリアント、スキュー、およびｐＩのいずれも、本明細書で概説されるように、独立して任意選択的にＦｃ切除バリアント、Ｆｃバリアント、ＦｃＲｎバリアントと組み合わせることができる。

さらに、モノマーＦｃドメインは、Ｃ２２０Ｓ／Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳまたはＣ２２０Ｓ／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含むアミノ酸置換のセットを含み得る。

さらに、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、スキューバリアント（例えば、ＵＳＳＮ１５／１４１，３５０号の図１Ａ〜１Ｃ（それらのすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に示されるアミノ酸置換のセット）を含むことができ、特に有用なスキューバリアントは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗからなる群から選択され（任意選択的に、架橋ジスフィルドＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）、任意選択的に切除バリアント、任意選択的に荷電ドメインリンカー、および任意選択的にｐＩバリアントを含むことができる。

いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＥＵ付番による２３６Ｒ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｆ２４３Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｖ２５９Ｉ、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｓ６７Ｋ、Ｓ２９８Ａ、Ｖ３０８Ｆ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｒ、３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｓ、２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｆ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３Ｓ、Ｙ４３６Ｉ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３６Ｖ／Ｍ４２８Ｌ、Ｖ４３６Ｉ／Ｎ４３４Ｓ、Ｙ４３６Ｖ／Ｎ４３４Ｓ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ／Ｍ４２８Ｌ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。

一実施形態では、本発明で使用されるスキューおよびｐＩバリアントの特定の組み合わせは、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意選択的に、架橋ジスルフィドＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）であり、一方のモノマーがＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含み他方が正荷電ドメインリンカーである。当技術分野において理解されるように、「ノブインホール」バリアントはｐＩを変化させず、したがってどちらのモノマーにも使用することができる。

Ｖ．ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合モノマー
本発明の二機能性ヘテロダイマー融合タンパク質は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）−Ｆｃ融合モノマーを含む。場合によっては、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）タンパク質ドメインは異なる向きにある。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ融合モノマーの例示的な実施形態は、図４Ａ〜４Ｅ、５Ａ〜５Ｄ、および８Ａ〜８Ｄを含むがこれらに限定されない図で提供される。

いくつかの実施形態では、ヒトＩＬ−１５タンパク質は、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＰ＿０００５７６．１または配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。場合によっては、ヒトＩＬ−１５のコード配列を、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＭ＿０００５８５に示す。本明細書に概説されるＦｃ融合ヘテロダイマータンパク質の例示的なＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸４９〜１６２を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２に対して少なくとも９０％、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列およびアミノ酸置換Ｎ７２Ｄを有する。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列ならびにＣ４２Ｓ、Ｌ４５Ｃ、Ｑ４８Ｃ、Ｖ４９Ｃ、Ｌ５２Ｃ、Ｅ５３Ｃ、Ｅ８７Ｃ、およびＥ８９Ｃからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。場合により、ＩＬ−１５タンパク質はまたＮ７２Ｄ置換を有する。Ｆｃ融合タンパク質のＩＬ−１５タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸置換を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換Ｎ４Ｄを有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩＬ−１５タンパク質は、アミノ酸置換Ｎ６５Ｄを有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩＬ−１５タンパク質は、アミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを有する。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質のヒトＩＬ−１５タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。場合によっては、ヒトＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換を有さない。

アミノ酸置換（複数可）は、ＩＬ−１５：ＩＬ−２βおよびＩＬ−１５：共通γ鎖の境界面での等配電子置換であり得る。いくつかの実施形態では、ヒトＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、Ｑ１０８Ｅ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換Ｑ１０８Ｅを有する。場合によっては、ＩＬ−１５タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のアミノ酸置換を有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、またはＱ１０８Ｅ置換を有することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、またはＮ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換Ｎ４Ｄを有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換Ｎ６５Ｄを有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄを有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はアミノ酸置換Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄを有する。

いくつかの実施形態において、ヒトＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）タンパク質は、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＰ＿００２１８０．１または配列番号３に示したアミノ酸配列を有する。場合によっては、ヒトＩＬ−１５Ｒαのコード配列を、ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＭ＿００２１８９．３に示す。本明細書に概説されるＦｃ融合ヘテロダイマータンパク質の例示的なＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号３のｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号３のアミノ酸３１〜９５）、換言すると、配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列ならびにＤ９６、Ｐ９７、Ａ９８、Ｄ９６／Ｐ９７、Ｄ９６／Ｃ９７、Ｄ９６／Ｐ９７／Ａ９８、Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、およびＤ９６／Ｃ９７／Ａ９８からなる群から選択されるアミノ酸挿入を有し、アミノ酸位置は完全長ヒトＩＬ−１５Ｒαタンパク質または配列番号３に対してである。例えば、Ｄ（例えばＡｓｐ）、Ｐ（例えばＰｒｏ）、Ａ（例えばＡｌａ）、ＤＰ（例えばＡｓｐ−Ｐｒｏ）、ＤＣ（例えばＡｓｐ−Ｃｙｓ）、ＤＰＡ（例えば、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ）、ＤＰＣ（例えば、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ）、またはＤＣＡ（例えば、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｌａ）のようなアミノ酸は、配列番号４のＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＣ末端に付加され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列ならびにＫ３４Ｃ、Ａ３７Ｃ、Ｇ３８Ｃ、Ｓ４０Ｃ、およびＬ４２Ｃからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、ここでアミノ酸位置は配列番号４に対してである。ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のアミノ酸変異（例えば、置換、挿入および／または欠失）を有することができる。

配列番号１は、ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡＧＩＨＶＦＩＬＧＣＦＳＡＧＬＰＫＴＥＡＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳである。

配列番号２は、ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳである。

配列番号３は、ＭＡＰＲＲＡＲＧＣＲＴＬＧＬＰＡＬＬＬＬＬＬＬＲＰＰＡＴＲＧＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＴＶＴＴＡＧＶＴＰＱＰＥＳＬＳＰＳＧＫＥＰＡＡＳＳＰＳＳＮＮＴＡＡＴＴＡＡＩＶＰＧＳＱＬＭＰＳＫＳＰＳＴＧＴＴＥＩＳＳＨＥＳＳＨＧＴＰＳＱＴＴＡＫＮＷＥＬＴＡＳＡＳＨＱＰＰＧＶＹＰＱＧＨＳＤＴＴＶＡＩＳＴＳＴＶＬＬＣＧＬＳＡＶＳＬＬＡＣＹＬＫＳＲＱＴＰＰＬＡＳＶＥＭＥＡＭＥＡＬＰＶＴＷＧＴＳＳＲＤＥＤＬＥＮＣＳＨＨＬである。

配列番号４は、ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲである。

いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はＦｃドメインのＮ末端に結合しており、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に結合している。他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＦｃドメインのＮ末端に結合しており、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＩＬ−１５タンパク質に非共有結合している。さらに他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＦｃドメインのＣ末端に結合しており、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はＩＬ−１５タンパク質に非共有結合している。

いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質はリンカーを介してともに結合している。任意選択的に、タンパク質はリンカーを介して結合していない。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質は非共有結合している。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はリンカーを介してＦｃドメインに結合している。他の実施形態では、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質はリンカーを介してＦｃドメインに結合している。任意選択的に、リンカーは、ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質をＦｃドメインに結合するためには使用されない。

いくつかの例では、免疫チェックポイントＡＢＤはドメインリンカーなどのリンカーを介してＦｃドメインのＮ末端に共有結合している。

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインをともに連結するために使用される「ドメインリンカー」である。任意の好適なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（一般に１〜２〜３〜４〜５）の整数である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン−セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組み換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。場合によっては、以下に概説する「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」に注意を払って、荷電ドメインリンカーは、本明細書において考察し図６および７に示すように使用することができる。

ＶＩ．抗原結合ドメインモノマー
ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および活性化に焦点を当てた治療方針は、癌の治療の臨床に大いに有望であり得る。癌は、患者が癌性細胞を認識し排除する能力がないものと考えることができる。多くの場合、これらの形質転換した（例えば、癌性）細胞は、免疫監視に反作用する。体内でのＴ細胞活性化を制限して無制限なＴ細胞活性を予防する天然の制御機構が存在し、これを、癌性細胞が免疫応答を回避または抑制するために利用し得る。免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞が癌を認識し排除する能力を回復させることが、免疫療法の目的である。「免疫療法」と称されることもある免疫腫瘍学の分野は、急速に進化しており、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、およびＯｐｄｉｖｏ（登録商標）などいくつかのＴ細胞チェックポイント阻害抗体が近年承認されている。共刺激性と共抑制性の両方の種々の免疫調節シグナルを使用して、最適な抗原特異的免疫応答を統合することができると一般に理解されている。

本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞および／またはＩＬ−２Ｒβおよび共通γ鎖（γｃ；ＣＤ１３２）を発現する細胞に結合する二機能性ヘテロダイマータンパク質の生成に関する。二機能性ヘテロダイマータンパク質は、免疫抗原または免疫細胞に結合できる任意の有用な抗体フォーマットの抗原結合性モノマーを含むことができる。いくつかの実施形態では、抗原結合モノマーは、Ｆｃドメインに連結したＦａｂまたはｓｃＦｖを含む。

そのような抗原結合モノマーの例示的な実施形態は、図６６Ａ（ＸＥＮＰ２４１１４の鎖２および３）、図６６Ａ（ＸＥＮＰ２４１１５の鎖２および３）、図６６Ｂ（ＸＥＮＰ２４１１６の鎖２および３）、図６０Ａ（ＸＥＮＰ２４５３２の鎖２および３）、図６１Ａ（ＸＥＮＰ２４５３３の鎖２および３）、図６１Ａ（ＸＥＮＰ２４５３４の鎖２および３）、図７９Ａ（ＸＥＮＰ２４５４３の鎖２および３）、図７９Ａ（ＸＥＮＰ２４５４６の鎖２および３）、図７９Ｂ（ＸＥＮＰ２４５４７の鎖２および３）、および図７９Ｂ（ＸＥＮＰ２４５４８の鎖２および３）に提供されている。

Ａ．標的抗原
本発明の標的化ヘテロダイマータンパク質は、Ｆｃドメインに融合した標的抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、および異なるＦｃドメインに融合したＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαタンパク質ドメインを有する。好適な標的抗原には、ヒト（しばしばカニクイザル）ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｂが含まれる。いくつかの実施形態では、２つの異なる標的抗原（「標的対」）に結合する２つの異なるＡＢＤは、二価の二機能性フォーマットまたは三価の二機能性フォーマットのいずれかで存在する。したがって、好適な二機能性ＡＢＤは、ＣＤ８とＮＫＧ２Ａ、ＣＤ８とＮＫＧ２Ｄ、またはＮＫＧ２ＡとＮＫＧ２Ｄを結合する。さらに他の実施形態では、二機能性ヘテロダイマータンパク質は、二価の二機能性フォーマットまたは三価の二機能性フォーマットのいずれかで同じ標的抗原（「標的対」）に結合する２つの異なる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を有し、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαタンパク質ドメインはタンパク質のＦｃドメインのうちの１つに融合した。

ＡＢＤは、ＦａｂフォーマットまたはｓｃＦｖフォーマットなどの様々なフォーマットであり得る。本発明で使用するための例示的なＡＢＤはＵＳ６２／３５３，５１１に開示されており、その内容はすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはＣＤ８に結合する。ＣＤ８に結合する好適なＡＢＤは、二価抗体（ＸＥＮＰ１５０７６およびＸＥＮＰ１５２５１）、Ｆａｂ（ＸＥＮＰ２３６４７）、ワンアームＦａｂ−Ｆｃ抗体（ＸＥＮＰ２４３１７）として図６５Ａ〜６５Ｆに、二価抗体（ＸＥＮＰ２４０２５）、ワンアームＦａｂ−Ｆｃ抗体（ＸＥＮＰ２４３２１）として図８１に、図８９（マウスおよびヒト化可変重ドメインおよび可変軽ドメインとして）に、二価抗体（ＸＥＮＰ１５０７５）として図９０に、ワンアームＦａｂ−Ｆｃ抗体（ＸＥＮＰ２４９２０）として図９１に、図９５（バリアントヒト化可変重ドメインおよび可変軽ドメインとして）に示す。当業者には理解されるように、適切なＡＢＤは、下線が引かれているように、これらの図に示されるように６つのＣＤＲのセットを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８に結合するＡＢＤを含むモノマーは、非ブロッキング抗ＣＤ８アームとして作用することができる。

いくつかの実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはＮＫＧ２Ａに結合する。ＮＫＧ２Ａに結合する好適なＡＢＤは、二価抗体（ＸＥＮＰ２４５４１およびＸＥＮＰ２４５４２）およびＦａｂ（ＸＥＮＰ２４５４２）として図５８に示される。当業者には理解されるように、適切なＡＢＤは、下線が引かれているように、これらの図に示されるように６つのＣＤＲのセットを含むことができる。

いくつかの実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはＮＫＧ２Ｄに結合する。ＮＫＧ２Ｄに結合する好適なＡＢＤを図５９（ＸＥＮＰ２４３６５）に示す。当業者には理解されるように、適切なＡＢＤは、下線が引かれているように、この図に示されるように６つのＣＤＲのセットを含むことができる。

さらに、本発明の抗体は、本明細書に概説した抗原結合ドメインと同一のエピトープに結合するか、または本明細書に概説した抗原結合ドメインとの結合について競合するかのいずれかのものを含む。いくつかの実施形態では、二機能性チェックポイント抗体は、本明細書で概説したＡＢＤのうちの１つ、および本明細書で概説したＡＢＤのうちの１つとの結合で競合する第２のＡＢＤを含み得る。いくつかの実施形態では、両方のＡＢＤが、本明細書で概説した対応するＡＢＤとの結合について競合する。結合の競合は一般に、本明細書に概説されるようにＢｉａｃｏｒｅアッセイを用いて決定される。

当業者には理解され、以下でより詳細に説明するように、一般的にＵＳ６２／３５３，５１１の図１に示すように、本発明のヘテロダイマー融合タンパク質は、多種多様な立体配置をとることができる。いくつかの図は、「シングルエンド型」立体配置を示し、分子の一方の「アーム」には１つのタイプの特異性があり、他方の「アーム」には異なる特異性がある。他の図は、「デュアルエンド型」立体配置を示し、分子の「上部」に少なくとも１つのタイプの特異性があり、分子の「底部」に１つ以上の異なる特異性がある。図５７Ａ〜５７Ｋを参照されたい。したがって、本発明は、免疫抗原とＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα結合パートナーを共結合する新規な免疫グロブリン組成物に関する。

当業者には理解されるように、本発明のヘテロダイマーフォーマットは、異なる価数を有し得るとともに、二機能性であり得る。すなわち、本発明のヘテロダイマー抗体は二価および二機能性であることができ、一方の標的抗原は１つの結合ドメインにより結合され、他方の標的抗原は第２の結合ドメインにより結合される。ヘテロダイマー抗体はまた、三価および二機能性であり得、第１の抗原は２つの結合ドメインによって結合され、第２の抗原は第２の結合ドメインによって結合される。

Ｂ．抗体
以下で考察するように、「抗体」という用語は全般的に使用される。本発明で使用される抗体は、本明細書に記載されているようにいくつかのフォーマットをとることができ、本明細書に記載され図に示される従来の抗体、および抗体誘導体、断片および模倣物を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、抗原結合ドメインおよびＦｃドメインを含む抗体融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、抗体融合タンパク質は、本明細書に記載のＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα Ｆｃ融合タンパク質とともに二機能性ヘテロダイマータンパク質を形成する。そのような二機能性ヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態には、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、およびＸＥＮＰ２４５４８が含まれるが、これらに限定されない。そのような二機能性ヘテロダイマータンパク質の例示的なフォーマットには、図５７Ａ〜５７Ｋに示すものが含まれるが、これらに限定されない。

従来の抗体構造単位は、典型的にはテトラマーを含む。各テトラマーは、典型的には、２本の同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、１本の「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量）と、１本の「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量）とを有する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。本発明は概して、ＩｇＧクラスに基づく抗体または抗体断片（抗体モノマー）に関し、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。一般に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４が、ＩｇＧ３よりも頻繁に使用される。ＩｇＧ１は、３５６（ＤまたはＥ）および３５８（ＬまたはＭ）で多型を有する異なるアロタイプを有することに留意すべきである。本明細書に図示される配列は３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプを使用するが、他のアロタイプが本明細書に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む任意の配列は、３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプの代わりに３５６Ｅ／３５８Ｌを有することができる。

さらに、本明細書中の配列の多くは、位置２２０の少なくとも１つのシステインをセリンで置換したものであり、これは一般に、本明細書に記載の配列の大部分について「ｓｃＦｖモノマー」側にあるが、ジスルフィド形成を減少させるために「Ｆａｂモノマー」側、またはその両方にすることもできる。本明細書中の配列内に具体的に含まれるのは、これらのシステインの一方または両方が置換されたもの（Ｃ２２０Ｓ）である。

したがって、本明細書で使用されるとき、「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンの任意のサブクラスを意味する。治療用抗体は、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されたい。たとえば、米国特許出願公開第２００９／０１６３６９９号に示されるように、本発明は、ＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドのｐＩ工学を包含し、これは参照により本明細書に組み込まれる。

超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域においておよそ、アミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域においてはおよそ約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を表す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）からのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳＯＦＰＲＯＴＥＩＮＳＯＦＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））ならびに／または超可変ループを形成する残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域における２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、および９６−１０１（ＨＣＤＲ３）を包含する（ＣｈｏｔｈｉａａｎｄＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）。本発明の特定のＣＤＲを以下に記載する。

当業者には理解されるように、ＣＤＲの正確な付番および配置は、異なる付番システムで異なり得る。しかしながら、可変重鎖および／または可変軽鎖の開示は、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。ＣＤＲ付番の有用な比較は以下のとおりであり、Ｌａｆｒａｎｃｅｔａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５−７７（２００３）を参照されたい。

本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔ付番系は一般に、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）を参照するときに使用され、ＥＵ付番系は、Ｆｃ領域に対するものである（例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．、上述（１９９１））。

重鎖のＩｇドメインの別の種類は、ヒンジ領域である。本明細書において「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」とは、抗体の第１のおよび第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧＣＨ１ドメインはＥＵ位置２１５で終わり、ＩｇＧＣＨ２ドメインは残基ＥＵ位置２３１で始まる。したがって、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは、本明細書では、２１６位（ＩｇＧ１中のＥ２１６）〜２３０位（ＩｇＧ１中のＰ２３０）を含むように定義され、付番はＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスによる。場合によっては、「ヒンジフラグメント」が使われ、それは、ヒンジドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方でより少ないアミノ酸を含む。本明細書に記載のとおり、ｐＩバリアントはヒンジ領域にも同様に作製することができる。

軽鎖は、一般に、可変軽ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含み、可変重ドメインとともにＦｖ領域を形成する）、および定常軽領域（しばしばＣＬまたはＣκと称される）の２つのドメインを含む。

上に概説される追加の置換のための別の目的とする領域は、Ｆｃ領域である。

本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全ＣＤＲセット」は、３つの可変軽鎖ＣＤＲおよび３つの可変重鎖ＣＤＲ、例えばｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれより大きな可変軽または可変重ドメインの一部であり得る。さらに、本明細書により完全に概説されているように、可変重および可変軽ドメインは、重鎖および軽鎖が使用されるとき（例えば、Ｆａｂが使用されるとき）には別個のポリペプチド鎖上に、またはｓｃＦｖ配列の場合には単一ポリペプチド鎖上にあり得る。

ＣＤＲは、抗原結合の形成、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の群分けであり、通常、特異的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。単一抗原が、２つ以上のエピトープを有してもよい。

エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性構成要素とも称される）および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基、換言すると、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にあるアミノ酸残基を含み得る。

エピトープは、立体配座または直線状のいずれかであってもよい。立体配座エピトープは、直線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントからのアミノ酸の空間的な並置によって作り出される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって作り出されるものである。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別され得る。

エピトープは、典型的には、固有の空間立体構造内に、少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個、または８〜１０個のアミノ酸を含む。同一のエピトープを認識する抗体は、ある抗体の別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力、例えば、「ビニング」を示す単純な免疫アッセイにおいて検証され得る。以下に概説するように、本発明は、列挙された抗原結合ドメインおよび本明細書の抗体を含むだけでなく、列挙された抗原結合ドメインによって結合されるエピトープとの結合について競合するものも含む。

したがって、本発明は異なる抗体ドメインを提供する。本明細書中に記載され、当技術分野において既知のとおり、本発明のヘテロダイマー抗体は、重鎖および軽鎖内に異なるドメインを含み、これもまた重複し得る。これらのドメインは、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、軽定常ドメイン、Ｆａｂドメイン、およびｓｃＦｖドメインを含むが、これらに限定されない。

したがって、「Ｆｃドメイン」は、−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、任意選択的にヒンジドメイン（−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。本明細書の実施形態では、ｓｃＦｖがＦｃドメインに結合しているとき、Ｆｃドメインのヒンジの全部または一部に結合しているのはｓｃＦｖ構築物のＣ末端であり、例えば、それは一般にヒンジの始まりである配列ＥＰＫＳに結合している。重鎖は、可変重ドメインおよび定常ドメインを含み、これは、ＣＨ１−任意選択のＣＨ２−ＣＨ３を含むヒンジ−Ｆｃドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖および軽定常ドメインを含む。ｓｃＦｖは、可変重鎖、ｓｃＦｖリンカー、および可変軽ドメインを含む。本明細書に概説した構築物および配列のほとんどにおいて、可変重鎖のＣ末端はｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合し、そのＣ末端は可変軽鎖のＮ末端に結合している（Ｎ−ｖｈ−リンカー−ｖｌ−Ｃ）が、これはスイッチできる（Ｎ−ｖｌ−リンカー−ｖｈ−Ｃ）。

本発明のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含み、それは天然に生じないが、ｓｃＦｖリンカーによってともに連結した可変重ドメインと可変軽ドメインとを一般に含む。本明細書に概説するように、ｓｃＦｖドメインは、一般に、Ｎ末端からＣ末端方向にｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌであるが、これは、ｓｃＦｖドメイン（または、Ｆａｂ由来のｖｈおよびｖｌ配列を使用して構築されたドメイン）のいずれに関しても、フォーマットに応じて片端または両端の任意のリンカーを用いて、ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈへと逆転させることができる（一般的に図５７Ａ−５７Ｋを参照されたい。）。

本明細書に示されるように、好適なリンカー（ドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれかとして使用）にはいくつかあり、列挙されたドメインに共有結合（組み換え技術により生成される従来型ペプチド結合を含む）するために使用することができる。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、主に、以下のアミノ酸残基Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを含み得る。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座をとるような方法で２つの分子を結合させるのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１〜５０アミノ酸長、好ましくは約１〜３０アミノ酸長である。一実施形態では、１〜２０アミノ酸長のリンカーが使用されてもよく、いくつかの実施形態では、約５〜約１０アミノ酸が使用されている。有用なリンカーには、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号ＸＸ）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号ＸＸ）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号ＸＸ）、（ｎは少なくとも１（および一般に３〜４）の整数である）を含むグリシン−セリンポリマー、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、ならびに他の可動性リンカーが含まれる。例示的なドメインリンカーを図６に示す。あるいは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとして有用であり得る。

他のリンカー配列は、任意の長さのＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の配列を含むが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインのすべての残基ではなく、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２個のアミノ酸残基は含まない場合がある。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、ＣκまたはＣλに由来し得る。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、および他のタンパク質由来の他の天然配列などの他のタンパク質に由来してもよい。

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインをともに連結するために使用される「ドメインリンカー」である。例えば、ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端をｓｃＦｖのＮ末端に結合するドメインリンカーがあり、別の任意のドメインリンカーはｓｃＦｖのＣ末端をＣＨ２ドメインに結合している（ただし、多くの実施形態では、このドメインリンカーとしてヒンジが使用される）。任意の好適なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（一般に３〜４〜５）の整数である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むドメインリンカーとしてグリシン−セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組み換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。場合によっては、以下に概説する「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」に注意を払って、ｓｃＦｖリンカーのいくつかの実施形態において使用されるように、荷電ドメインリンカーを使用することができる。

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書で考察されるｖｈおよびｖｌドメインを共有結合するために使用されるｓｃＦｖリンカーである。したがって、本発明はさらに、第１のモノマーと第２のモノマーとの間のｐＩの分離を促進するための荷電ｓｃＦｖリンカーを提供する。すなわち、正または負のいずれかの荷電ｓｃＦｖリンカー（または異なるモノマーに対してｓｃＦｖを使用する足場の場合は両方）を組み込むことによって、Ｆｃドメインをさらに変化させずに、荷電リンカーを含むモノマーはｐＩを変えることを可能にする。これらの荷電リンカーは、標準的なリンカーを含む任意のｓｃＦｖ中に置換することができる。また、当業者には理解されるように、ｐＩの所望の変化に従って、荷電ｓｃＦｖリンカーが正しい「鎖」またはモノマー上に使用される。例えば、本明細書で論じられるように、トリプルＦフォーマットヘテロダイマー抗体を作製するために、所望の抗原結合ドメインのそれぞれについてのＦｖ領域の元のｐＩが計算され、そしてｓｃＦｖを作製するために１つが選択され、ｐＩに応じて、正または負のリンカーのいずれかが選択される。

荷電ドメインリンカーを使用して発明のモノマーのｐＩ分離を増加させることもでき、リンカーが利用される、本明細書の任意の実施形態で使用することもできる。特に、図５７Ａ〜５７Ｋに示すフォーマットは抗原結合タンパク質を含み、通常「ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質」と呼ばれ、タンパク質が、ヘテロダイマーＦｃドメインに自己組織化した少なくとも２つの関連Ｆｃ配列、およびＦａｂとしてであるかｓｃＦｖとしてであるかを問わず、少なくとも１つ以上のＦｖ領域を有することを意味する。

Ｃ．キメラおよびヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書の抗体は、異なる種由来の混合物、例えばキメラ抗体および／またはヒト化抗体に由来し得る。一般に、「キメラ抗体」と「ヒト化抗体」の両方は、２つ以上の種由来の領域を組み合わせる抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は伝統的に、マウス（または場合によってはラット）由来の可変領域（複数可）およびヒト由来の定常領域（複数可）を含む。「ヒト化抗体」は一般に、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に見出される配列でスワップされた、非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト由来のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いてそのような抗体と同一である。非ヒト生物を起源とする核酸によって一部またはすべてがコードされるＣＤＲを、ヒト抗体可変領域のベータシートフレームワークにグラフティングして、その特異性がグラフティングされたＣＤＲによって決定される抗体を作製する。そのような抗体の生成は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６に記載され、参照により全体が組み込まれる。選択されたアクセプターフレームワーク残基の、対応するドナー残基への「逆変異」が、最初の移植された構築物において失われた親和性を回復するためにしばしば必要とされる（ＵＳ５５３０１０１、ＵＳ５５８５０８９、ＵＳ５６９３７６１、ＵＳ５６９３７６２、ＵＳ６１８０３７０、ＵＳ５８５９２０５、ＵＳ５８２１３３７、ＵＳ６０５４２９７、ＵＳ６４０７２１３、参照により全体が組み込まれる）。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、通常は全部を含み、したがって典型的にはヒトＦｃ領域を含むであろう。ヒト化抗体はまた、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを用いて生成され得る。Ｒｏｑｕｅｅｔａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４、参照により全体が本明細書に組み込まれる。非ヒト抗体をヒト化および再形成するための様々な技法および方法は、当技術分野で周知である（参照により全体が組み込まれる、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ＆Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，ＨｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＢＣｅｌｌｓ，５３３−５４５，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、およびそこで引用される参考文献を参照されたい）。ヒト化方法には、Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，１９８８、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６、Ｑｕｅｅｎｅｔａｌ．，１９８９，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，ＵＳＡ８６：１００２９−３３、Ｈｅｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５、Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，１９９２，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａｅｔａｌ．，１９９７，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５７（２０）：４５９３−９、Ｇｏｒｍａｎｅｔａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４１８１−４１８５、Ｏ´Ｃｏｎｎｏｒｅｔａｌ．，１９９８，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ１１：３２１−８に記載される方法が含まれ、参照により全体が組み込まれる。ヒト化、または非ヒト抗体の可変領域の免疫原性を低下させる他の方法には、例えば、参照により全体が組み込まれるＲｏｇｕｓｋａｅｔａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９６９−９７３に記載されているような表面再構成法が含まれ得る。特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含み得るかまたはそれからなり得る。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することと、ヒト抗体の配列に最も近い配列である（すなわち、最も高い同一性％）ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンを選択することとによって、そのようなものとして特定され得る。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に生じる体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較してアミノ酸の相違を含み得る。しかしながら、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較したときに、抗体をヒト配列に由来するものとして特定するアミノ酸残基を含む。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％までも同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０〜２０個以下のアミノ酸差しか示さない（本明細書中の任意のスキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントの導入前、すなわち、本発明のバリアントの導入前は、バリアントの数は一般に少ない）。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは５個以下、またはさらには４、３、２、もしくは１個以下のアミノ酸差しか示さない場合がある（同様に、本明細書における任意のスキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントの導入前、すなわち、本発明のバリアントの導入前は、バリアントの数は一般に少ない）。一実施形態では、親抗体は、当技術分野で既知のとおり、親和性成熟されたものである。構造に基づく方法が、例えば、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載されているように、ヒト化および親和性成熟のために用いられ得る。Ｗｕｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２；Ｂａｃａｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４；Ｒｏｓｏｋｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８；Ｒａｄｅｒｅｔａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：８９１０−８９１５；Ｋｒａｕｓｓｅｔａｌ．，２００３，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１６（１０）：７５３−７５９に記載される方法を含むがこれらに限定されない選択に基づく方法が抗体可変領域のヒト化および／または親和性成熟のために使用でき、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。他のヒト化方法は、ＣＤＲの部分のみを移植することを含んでもよく、これには、参照によりすべての内容が組み込まれる、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０、Ｔａｎｅｔａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５、ＤｅＰａｓｃａｌｉｓｅｔａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４に記載される方法が含まれるがこれらに限定されない。

ＶＩＩ．本発明の有用な実施形態
図５７Ａ〜５７Ｋに示すように、本発明の二重特異性ヘテロダイマー融合タンパク質のいくつかの有用なフォーマットが存在する。一般に、本発明のヘテロダイマー融合タンパク質は、３つの機能性成分：ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）成分、抗原結合ドメイン成分（例えば、抗ＣＤ８成分、抗ＮＫＧ２Ａ成分、抗ＮＫＧ２Ｄ成分）、およびＦｃ成分を有し、本明細書で概説されるようにそれぞれが異なる形態をとることができ、それぞれが任意の立体配置で他の構成要素と組み合わせることができる。

第１のおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番による、ａ）Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、ｂ）Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｃ）Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、ｄ）Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、ｅ）Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、ｆ）Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびｇ）Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有することができる。

いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。

任意選択的に、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。

任意選択的に、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、半減期延長のために４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを有する。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ
一実施形態は図５７Ａに示されており、２つのモノマーを含む。第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２のモノマーは、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３またはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むが、いずれの方向にもドメインリンカーをヒンジの代わりに置換することができる。これは一般に「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」と呼ばれ、「ｓｃ」は「一本鎖」を表し、共有結合リンカーを用いたＩＬ−１５およびｓｕｓｈｉドメインの結合を指す。

図５７Ａについて、「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」フォーマットは、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合され、ｓｃＦｖはヘテロダイマーＦｃの他方側に融合している。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２５１３７であり得る。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントのＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃモノマー上の）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合体モノマー上の）、ｐＩバリアントのＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側の）、両モノマー上の切除バリアントのＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択的に両側の４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを利用する。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、抗ＣＤ８ＡＢＤを利用し、図９２Ｃに示すように、ヒト＿ＩＬ１５Ｒα（Ｓｕｓｈｉ）＿Ｆｃ（２１６）＿ＩｇＧ１＿ｐＩ（−）＿等配電子＿Ａ＿Ｃ２２０Ｓ／ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）−Ｆｃ鎖（鎖１）、ＩＬ１５＿Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ（鎖２）、ＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｈ２＿ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ重鎖（鎖３）、およびＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｌ１軽鎖（鎖４）の配列を有する。

１つの好ましい実施形態は、図９２Ｃに示すように、ヒト＿ＩＬ１５Ｒα（Ｓｕｓｈｉ）＿Ｆｃ（２１６）＿ＩｇＧ１＿ｐＩ（−）＿等配電子＿Ａ＿Ｃ２２０Ｓ／ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）−Ｆｃ鎖（一本鎖）の配列を有するｓｃＩＬ−１５／Ｒα複合体を利用する。

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン、ｉｉ）第１のドメインリンカー、ｉｉｉ）バリアントＩＬ−１５ドメイン、ｉｖ）第２のドメインリンカー、ｖ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のバリアントＦｃドメインを含む第１のモノマーと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ｓｃＦｖドメイン、ｉｉ）第３のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む第２のモノマーとを含み、ｓｃＦｖドメインは、第１の可変重ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、および第１の可変軽ドメインを含み、ｓｃＦｖドメインは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する。

ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｂに示され、３つのモノマーを含む。第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２のモノマーは、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３またはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むが、いずれの方向にも、ドメインリンカーをヒンジの代わりに置換することができる。第３のモノマーはＩＬ−１５ドメインである。これは一般に「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」または「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」はＩＬ−１５とｓｕｓｈｉドメインの自己組織化非共有結合を指す「非共有」を表す。

図５７Ｂについて、「ｓｃＦｖ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットは、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したｓｃＦｖを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、ＩＬ−１５は、非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。

ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントのＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃモノマー上の）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合体モノマー上の）、ｐＩバリアントのＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側の）、両モノマー上の切除バリアントのＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択的に両側の４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを利用する。

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン、ｉｉ）第１のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のバリアントＦｃドメインを含む第１のモノマーと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ｓｃＦｖドメイン、ｉｉ）第２のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む第２のモノマー（上記ｓｃＦｖドメインは、第１の可変重ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、および第１の可変軽ドメインを含む）と、ｃ）バリアントＩＬ−１５ドメインを含む第３のモノマー（上記ｓｃＦｖドメインは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する）とを含む。

ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｃに示され、３つのモノマーを含む。第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、ｓｕｓｈｉドメインが操作されたシステイン残基を有し、第２のモノマーは、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３またはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むが、いずれの方向にも、ドメインリンカーをヒンジの代わりに置換することができる。第３のモノマーは、システインバリアントアミノ酸を有するようにも操作されたＩＬ−１５ドメインであり、それにより、ｓｕｓｈｉドメインとＩＬ−１５ドメインとの間にジスルフィド架橋を形成することが可能になる。これは一般に「ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」または「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」と呼ばれ、「ｄｓ」は「ジスルフィド」を表す。

図５７Ｃについて、「ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」フォーマットは、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したｓｃＦｖを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、操作されたシステインの結果として、ＩＬ−１５は、非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。

ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

ｓｃＦｖ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントのＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃモノマー上の）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合体モノマー上の）、ｐＩバリアントのＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側の）、両モノマー上の切除バリアントのＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択的に両側の４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを利用する。

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かってｉ）システイン残基を含むバリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン、ｉｉ）第１のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のバリアントＦｃドメインを含む第１のモノマーと、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ｓｃＦｖドメイン、ｉｉ）第２のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む第２のモノマー（ｓｃＦｖドメインは、第１の可変重ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、および第１の可変軽ドメインを含む）と、ｃ）システイン残基を含むバリアントＩＬ−１５ドメインを含む第３のモノマー（バリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメインおよびバリアントＩＬ−１５ドメインはジスルフィド結合を形成し、ｓｃＦｖドメインは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する）とを含む。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ
この実施形態は、図５７Ｄに示され、３つのモノマーを含む。第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２のモノマーは、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３のモノマーは軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」と呼ばれ、「ｓｃ」は「一本鎖」を表す。本実施形態のバリアントの好ましい組み合わせは、図６０Ａ、６０Ｂ、６１Ａ、６１Ｂ、６６Ａ、６６Ｂ、８７、９２Ａ、９２Ｂ、９２Ｃ、９７Ａ、９７Ｂ、および１０２に見られる。

図５７Ｄについて、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ（またはＦａｂ×ｓｃＩＬ−１５／Ｒα）フォーマットは、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合し、可変重鎖（ＶＨ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２７１４５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６であり得る。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図１０２に示す配列を有する抗ＣＤ８ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図１０２に示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２６５８５である。

いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９７Ａに示す配列を有する抗ＣＤ８ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９７Ａに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２６２２３である。

他の実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９７Ａに示す配列を有する抗ＣＤ８ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９７Ａに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２６２２４である。

様々な実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９７Ｂに示す配列を有する抗ＣＤ８ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９７Ｂに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２６２２７である。

特定の実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９７Ｂに示す配列を有する抗ＣＤ８ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９７Ｂに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２６２２９である。

いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９２Ａに示す配列を有する抗ＣＤ８ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９２Ａに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４９１７である。

他の実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９２Ｂに示す配列を有する抗ＣＤ８ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９２Ｂに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４９１８である。

いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図９２Ｂに示す配列を有する抗ＣＤ８ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図９２Ｂに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４９１９である。

一実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図８７に示す配列を有する抗ＣＤ８ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図８７に示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４７３６である。

別の実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図６６Ａに示す配列を有する抗ＣＤ８ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図６６Ａに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４１１４である。

さらに別の実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図６６Ａに示す配列を有する抗ＣＤ８ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図６６Ａに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４１１５である。

別の実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマータンパク質は、図６６Ａに示す配列を有する抗ＣＤ８ＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、タンパク質のＩＬ−１５複合体は、図６６Ａに示した配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４１１６である。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図６１Ａに示す配列を有する抗ＮＫＧ２ＤＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図６１Ａに示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５３３である。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図６１Ａに示す配列を有する抗ＮＫＧ２ＤＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図６１Ａに示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５３４である。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図６１Ｂに示す配列を有する抗ＮＫＧ２ＤＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図６１Ｂに示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５３５である。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図６０Ａに示す配列を有する抗ＮＫＧ２ＡＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図６０Ａに示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５３１である。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、図６０Ａに示す配列を有する抗ＮＫＧ２ＡＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図６０Ａに示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２４５３２である。

別の実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、図６０Ｂに示す配列を有する抗ＮＫＧ２ＡＡＢＤを利用する。いくつかの実施形態では、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×ＦａｂのＩＬ−１５複合体は、図６０Ｂに示す配列を利用する。場合によっては、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２７１４６である。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントのＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（抗ＣＤ８モノマー、抗ＮＫＧ２Ａモノマー、または抗ＮＫＧ２Ｄモノマー上の）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合体モノマー上の）、ｐＩバリアントのＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側の）、両モノマー上の切除バリアントのＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択的に両側の４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを利用する。

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン、ｉｉ）第１のドメインリンカー、ｉｉｉ）バリアントＩＬ−１５ドメイン、ｉｖ）第２のドメインリンカー、ｖ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のバリアントＦｃドメインを含む第１のモノマーと、ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）と、ｃ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖（ＶＨおよびＶＬは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメインを形成する）とを含む。

Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図５７Ｅに示されており、４つのモノマーを含む。第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２のモノマーは、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３のモノマーはＩＬ−１５ドメインである。第４のモノマーは、軽鎖ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」はＩＬ−１５とｓｕｓｈｉドメインの自己組織化非共有結合を指す「非共有」を表す。この実施形態のためのバリアントの好ましい組み合わせは、図９２Ｃに見られる。

図５７Ｅについて、Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒα（またはｎｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ）フォーマットは、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、ＩＬ−１５は非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２５１３７であり得る。

Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントのＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃモノマー上の）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合体モノマー上の）、ｐＩバリアントのＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側の）、両モノマー上の切除バリアントのＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択的に両側の４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを利用する。

好ましい実施形態は、抗ＣＤ８ＡＢＤを利用し、図９２Ｃに示すように、ヒト＿ＩＬ１５Ｒα（Ｓｕｓｈｉ）＿Ｆｃ（２１６）＿ＩｇＧ１＿ｐＩ（−）＿等配電子＿Ａ＿Ｃ２２０Ｓ／ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）−Ｆｃ鎖（鎖１）、ＩＬ１５＿Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ（鎖２）、ＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｈ２＿ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ重鎖（鎖３）、およびＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｌ１軽鎖（鎖４）の配列を有する。

Ｆａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットでは、図９２Ｃに示すように、１つの好ましい実施形態は、ヒト＿ＩＬ１５Ｒα（Ｓｕｓｈｉ）＿Ｆｃ（２１６）＿ＩｇＧ１＿ｐＩ（−）＿等配電子＿Ａ＿Ｃ２２０Ｓ／ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０ＳＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ鎖（鎖１）、およびＩＬ１５＿Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ（鎖２）の配列を有するｎｃＩＬ−１５／Ｒα複合体を利用する。

いくつかの実施形態では、ヘテロ二ダイマータンパク質は、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第１のモノマー（上記ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）と、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン、ｉｉ）第１のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む第２のモノマーと、ｃ）バリアントＩＬ−１５ドメインを含む第３のモノマーと、ｄ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第４のモノマー（ＶＨおよびＶＬは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメインを形成する）とを含む。

Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は図５７Ｆに示されており、４つのモノマーを含む。第１のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、ｓｕｓｈｉドメインがシステイン残基を含むよう操作されており、第２のモノマーは、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３のモノマーは、天然の細胞条件下でジスルフィド架橋が形成されるようにシステイン残基を有するように操作されたＩＬ−１５ドメインである。第４のモノマーは、軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｄｓ」はＩＬ−１５とｓｕｓｈｉドメインの自己組織化非共有結合を指す「ジスルフィド」を表す。

図５７Ｆについて、Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒα（またはｄｓＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ）フォーマットは、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、一方、操作されたシステインの結果として、ＩＬ−１５は、共有結合ＩＬ−１５／Ｒα複合体が形成されるように別々にトランスフェクトされる。

Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

Ｆａｂ×ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアントのＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ｓｃＦｖ−Ｆｃモノマー上の）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（ＩＬ−１５複合体モノマー上の）、ｐＩバリアントのＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ（ＩＬ−１５複合体側の）、両モノマー上の切除バリアントのＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋ、および任意選択的に両側の４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを利用する。

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第１のモノマー（上記ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）と、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ｉ）システイン残基を含むバリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン、ｉｉ）第１のドメインリンカー、ｉｉｉ）ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２のバリアントＦｃドメインを含む第２のモノマーと、ｃ）システイン残基を含むバリアントＩＬ−１５ドメインを含む第３のモノマーと、ｄ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第４のモノマーとを含み、バリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメインおよびバリアントＩＬ−１５ドメインはジスルフィド結合を形成し、ＶＨおよびＶＬはヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメインを形成する。

ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｇに示され、３つのモノマーを含む（融合タンパク質はテトラマーであるが）。第１のモノマーは、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第２のモノマーは、ｓｃＩＬ−１５複合体を有する重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ドメインリンカー−ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５を含む。第３の（および第４の）モノマーは軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｓｃ」は「一本鎖」を表す。この実施形態のためのバリアントの好ましい組み合わせは、図７９Ａに見られる。

図５７Ｇについて、ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットは、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）に融合し、次いでこれはさらにヘテロダイマーＦｃ領域のうちの１つのＣ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４５４６であり得る。

ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

好ましい実施形態は、抗ＣＤ８ＡＢＤを利用し、図７９Ａに示すように、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−Ｆｃ−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）＿（ＧＧＧＧＳ）５−ＩＬ１５（一本鎖）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖（鎖２）、および５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖（鎖３）の配列を有する。

ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットでは、１つの好ましい実施形態は、図７９Ａに示す５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−Ｆｃ−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）＿（ＧＧＧＧＳ）５−ＩＬ１５（一本鎖）のｓｃＩＬ−１５／Ｒα複合配列を利用する。

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第１のモノマー（上記ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）、ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインリンカー−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５バリアントを含む第２のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）、およびｃ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー（ＶＨおよびＶＬドメインはヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する）を含む。

ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｈに示され、４つのモノマーを含む（ヘテロダイマー融合タンパク質はペンタマーであるが）。第１のモノマーは、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第２のモノマーは、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）ドメインを有する重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ドメインリンカー−ｓｕｓｈｉドメインを含む。第３のモノマーはＩＬ−１５ドメインである。第４の（および第５の）モノマーは軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｎｃ」は「非共有結合」を表す。この実施形態のためのバリアントの好ましい組み合わせは、図７９Ａに見られる。

図５７Ｈについて、ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットは、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃ領域のうちの１つのＣ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、ＩＬ−１５は、非共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体を形成するように別々にトランスフェクトされる。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４５４３であり得る。

ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

好ましい実施形態は、抗ＣＤ８ＡＢＤを利用し、図７９Ａに示すように、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ−重鎖−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）（鎖１）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖（鎖２）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ軽鎖（鎖３）、およびＩＬ１５（Ｎ６５Ｄ）（鎖４）の配列を有する。

ｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒα形式では、１つの好ましい実施形態は、図７９Ａに示す５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１＿Ｆａｂ−Ｆｃ−重鎖−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）（鎖１）およびＩＬ１５（Ｎ６５Ｄ）（鎖４）のｎｃＩＬ−１５／Ｒα複合体配列を利用する。

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第１のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）、ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインリンカーＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメインを含む第２のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）、ｃ）バリアントＩＬ−１５ドメインを含む第３のモノマー、およびｄ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第４のモノマー（ＶＨおよびＶＬドメインはヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する）を含む。

ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｉに示され、４つのモノマーを含む（ヘテロダイマー融合タンパク質はペンタマーであるが）。第１のモノマーは、重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第２のモノマーは、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）ドメインを有する重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ドメインリンカー−ｓｕｓｈｉドメインを含み、ｓｕｓｈｉドメインがシステイン残基を含むように操作されている。第３のモノマーは、ＩＬ−１５複合体が生理学的条件下で形成されるようにシステイン残基を含むように操作されたＩＬ−１５ドメインである。第４の（および第５の）モノマーは軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｄｓ」は「ジスルフィド」を表す。

図５７Ｉについて、ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットは、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃ領域のうちの１つのＣ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされ、ＩＬ−１５は、操作されたシステインの結果として、共有結合のＩＬ−１５／Ｒα複合体を形成するように別々にトランスフェクトされる。

ｍＡｂ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第１のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）、ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインリンカーＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメインを含む第２のモノマー（上記バリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメインはシステイン残基を含み、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）、ｃ）システイン残基を含むバリアントＩＬ−１５ドメインを含む第３のモノマー、およびｄ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第４のモノマー（バリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメインおよびバリアントＩＬ−１５ドメインはジスルフィド結合を形成し、ＶＨおよびＶＬドメインはヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する）を含む。

Ｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｊに示され、テトラマーを形成する４つのモノマーを含む。第１のモノマーは、ＶＨ−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ＩＬ−１５−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の任意選択のドメインリンカーはしばしばヒンジドメインである。第２のモノマーは、ＶＨ−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ｓｕｓｈｉドメイン−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の任意選択のドメインリンカーはしばしばヒンジドメインである。第３の（および第４の）モノマーは軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる。この実施形態のためのバリアントの好ましい組み合わせは、図７９Ｂに見られる。

図５７Ｊについて、ｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットは、次いでヘテロダイマーＦｃの一方にさらに融合したＩＬ−１５のＮ末端に組み換え融合したＶＨと、次いでヘテロダイマーＦｃの他方にさらに融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に組み換え融合したＶＨとを含み、一方、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４５４７であり得る。

ｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

好ましい実施形態は、抗ＣＤ８ＡＢＤを利用し、図７９Ｂに示すように、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−ＩＬ１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）−Ｆｃ（鎖１）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）−Ｆｃ（鎖２）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖（鎖３）の配列を有する。

ｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマットでは、１つの好ましい実施形態は、図７９Ｂに示す５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−ＩＬ１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）−Ｆｃ（鎖１）および５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）−ＦｃのＩＬ−１５／Ｒα複合配列を利用する。

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ−ＣＨ１−ドメインリンカーバリアントＩＬ−１５ドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のモノマー（上記ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）と、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ−ＣＨ１−ドメインリンカーバリアントＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第２のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）と、ｃ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー（ＶＨおよびＶＬは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメインを形成する）とを含む。

Ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα
この実施形態は、図５７Ｋに示され、テトラマーを形成する４つのモノマーを含む。第１のモノマーは、ＶＨ−ＣＨ１−［任意選択のドメインリンカー］−ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−ＩＬ−１５−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２の任意選択のドメインリンカーはしばしばヒンジドメインである。第２のモノマーは、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。第３の（および第４の）モノマーは軽鎖、ＶＬ−ＣＬである。これは一般に「ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ、「ｓｃ」は「一本鎖」を表す。この実施形態のためのバリアントの好ましい組み合わせは、図７９Ｂに見られる。

図５７Ｋについて、ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットは、ＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に融合し、それは次いでヘテロダイマーＦｃの一方側にさらに融合したＶＨと、ヘテロダイマーＦｃの他方側に融合したＶＨとを含むが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。そのようなヘテロダイマータンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４５４８であり得る。

ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットにおいて、１つの好ましい実施形態は、スキューバリアント対Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを利用する。

好ましい実施形態は、抗ＣＤ８ＡＢＤを利用し、図７９Ｂに示すように、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）＿（ＧＧＧＧＳ）５−ＩＬ１５−Ｆｃ（鎖１）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖（鎖２）、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖（鎖３）の配列を有する。

ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットでは、１つの好ましい実施形態は、図７９Ｂに示す５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１−ＩＬ１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）＿（ＧＧＧＧＳ）５−ＩＬ１５−Ｆｃ（鎖１）のｓｃＩＬ−１５複合配列を利用する。

いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ−ＣＨ１−ドメインリンカー−ＩＬ−１５ｓｕｓｈｉドメイン−ドメインリンカー−バリアントＩＬ−１５ドメイン−ドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３含む第１モノマー（上記ＣＨ２−ＣＨ３は第１のバリアントＦｃドメインである）と、ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖を含む第２のモノマー（ＣＨ２−ＣＨ３は第２のバリアントＦｃドメインである）と、ｃ）ＶＬ−ＣＬを含む軽鎖を含む第３のモノマー（ＶＨおよびＶＬは、ヒトＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、またはＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合ドメインを形成する）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ８（ＣＤ８α鎖など）に特異的に結合する。ヒトＣＤ８α鎖ポリペプチド配列は、例えばＵｎｉｐｒｏｔＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｐ０１７３２に記載されている。当業者は、ＣＤ８がすべてのアイソフォームバリアントを含むことを理解するであろう。いくつかの例では、本発明のヘテロダイマータンパク質の抗ＣＤ８ＡＢＤは、図６６Ａおよび６６Ｂに示すように、５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖および５１．１［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖の配列を有する。いくつかの例では、本発明のヘテロダイマータンパク質の抗ＣＤ８ＡＢＤは、図８１に示すように、ＸＥＮＰ２４０２５の配列：１Ｃ１１Ｂ３［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１重鎖（鎖１）および１Ｃ１１Ｂ３［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖（鎖２）、またはＸＥＮＰ２４３２１の配列：１Ｃ１１Ｂ３［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖（鎖１）、１Ｃ１１Ｂ３［ＣＤ８］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖（鎖２）、および空のＦｃ（鎖３）を有する。他の場合には、図９０に示すように、ヘテロダイマータンパク質の抗ＣＤ８ＡＢＤはＸＥＮＰ１５０７５（ＯＫＴ８＿Ｈ１Ｌ１＿ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ）の配列を有する。特定の場合には、図９１に示すように、ヘテロダイマータンパク質の抗ＣＤ８ＡＢＤは、ＸＥＮＰ２４９２０の配列、すなわちＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｈ２＿ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ重鎖（鎖２）およびＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｌ１軽鎖（鎖３）を有する。ヘテロダイマータンパク質の抗ＣＤ８ＡＢＤは、図９７Ａに示すように、ＸＥＮＰ２６２２３の配列：ＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｈ２．１５７＿ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ重鎖（鎖２）およびＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｌ１．１０３軽鎖（鎖３）を有する。いくつかの例では、ヘテロダイマータンパク質の抗ＣＤ８ＡＢＤは、図１０２に示すように、ＸＥＮＰ２６５８５の配列：ＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｈ２．１５７＿ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ重鎖（鎖２）およびＯＫＴ８［ＣＤ８］＿Ｌ１．１０３軽鎖（鎖３）を有する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＤ８に結合する１つ以上のＡＢＤおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を含むヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供し、図５７Ａ〜５７Ｆに示す任意のフォーマットであり得る。一実施形態では、ＣＤ８およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質に結合する２つの抗原結合ドメインを含むヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、図５７Ｇ〜５７Ｋに示す形式のいずれかであり得る。

いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマー融合タンパク質は、スキューバリアント、特に、ＥＵ付番によるＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｗ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｌ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｗ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される有用なスキューバリアントを有するＦｃドメインを含む。

他の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマー融合タンパク質は、ｐＩバリアントを有するＦｃドメインを含み、特に有用なｐＩバリアントはＥＵ付番によるＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄである。

別の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマー融合タンパク質は、切除バリアントを有するＦｃドメインを含み、特に有用な切除バリアントはＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋである。さらに別の実施形態では、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマー融合タンパク質は、ＦｃＲｎバリアントを有するＦｃドメインを含み、特に有用なＦｃＲｎバリアントはＥＵ付番による４２８Ｌ／４３４Ｓである。

ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＣＤ８ヘテロダイマー融合タンパク質の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、およびＸＥＮＰ２６５８５のうちのいずれかを含むことができる。有用なフォーマットは、図６６Ａ、６６Ｂ、７９Ａ、７９Ｂ、８７、９２Ａ、９２Ｂ、９２Ｃ、９７Ａ、および９７Ｂに示す。

他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒトＮＫＧ２Ａに特異的に結合する。ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチド配列は、例えばＵｎｉｐｒｏｔＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｐ２６７１５に記載されている。当業者は、ＮＫＧ２Ａがすべてのアイソフォームバリアントを含むことを理解するであろう。いくつかの例では、本発明のヘテロダイマータンパク質の抗ＮＫＧ２ＡＡＢＤは、図６０Ａおよび６０Ｂに示すように、モナリズマブ［ＮＫＧ２Ａ］＿Ｈ１Ｌ１Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖およびモナリズマブ［ＮＫＧ２Ａ］＿Ｈ１Ｌ１軽鎖の配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＮＫＧ２Ａに結合するＡＢＤおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を含む二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供し、図５７Ａ〜５７Ｆに示す任意のフォーマットであり得る。一実施形態では、ＮＫＧ２ＡおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質に結合する２つの抗原結合ドメインを含む二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、図５７Ｇ〜５７Ｋに示す形式のいずれかであり得る。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＮＫＧ２Ａヘテロダイマー融合タンパク質（例えば、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα× 抗ＮＫＧ２ＡＦａｂ形式）の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、およびＸＥＮＰ２７１４６のうちのいずれかを含むことができる。

別の実施形態では、抗原結合ドメインはヒトＮＫＧ２Ｄに特異的に結合する。ヒトＮＫＧ２Ｄポリペプチド配列は、例えばＵｎｉｐｒｏｔＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｐ２６７１８に記載されている。当業者は、ＮＫＧ２Ｄがすべてのアイソフォームバリアントを含むことを理解するであろう。いくつかの例では、本発明のヘテロダイマータンパク質の抗ＮＫＧ２ＤＡＢＤは、図６１Ａおよび６１Ｂに示すように、ＭＳ［ＮＫＧ２Ｄ］＿Ｈ０Ｌ０Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖およびＭＳ［ＮＫＧ２Ｄ］＿Ｈ０Ｌ０軽鎖の配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合するＡＢＤおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を含む二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供し、図５７Ａ〜５７Ｆに示す任意のフォーマットであり得る。一実施形態では、ＮＫＧ２ＤおよびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質に結合する２つの抗原結合ドメインを含む二機能性ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、図５７Ｇ〜５７Ｋに示す形式のいずれかであり得る。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗ＮＫＧ２Ｄヘテロダイマー融合タンパク質（例えば、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα×抗ＮＫＧ２ＤＦａｂ形式）の例示的な実施形態は、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、およびＸＥＮＰ２７１４５のうちのいずれかを含むことができる。

いくつかの実施形態では、第１のおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番による［Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ］、［Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｗ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｌ３６８Ｅ／Ｌ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ］、［Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ］、［Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ］、［Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３９４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ］、および［Ｔ３６６Ｗ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ］からなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有することができる。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。他の場合には、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。いくつかの例では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番による４２８Ｌ／４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）からなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。

他の態様では、本発明で提供されるのは、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される二機能性ヘテロダイマータンパク質である。

これらのタンパク質を作製する方法および本タンパク質を用いて患者を治療する方法に加えて、核酸、発現ベクター、および宿主細胞もすべて同様に提供される。

一態様では、本明細書に記載のヘテロダイマータンパク質は、（ａ）ＩＬ−１５Ｒαタンパク質、ＩＬ−１５タンパク質、および第１のＦｃドメインを含むＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であって、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、第１のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５タンパク質は、第２のドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合しているか、またはＩＬ−１５タンパク質は、第１のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、第２のドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質と、（ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマー（ＶＨは可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）を含む重鎖、ならびに可変軽鎖および軽定常ドメインを含む軽鎖（例えばＶＬ−ＣＬ）を含む抗原結合ドメインモノマーとを、を含み、第１のおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（短縮型ヒトＩＬ−１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができ、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）および配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はＤ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、またはＱ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ６１Ｎ／Ｑ１０８Ｅ、またはＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインモノマーは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する。換言すれば、抗原結合ドメインモノマーはＣＤ８に結合してもよい。抗原結合ドメインモノマーはＮＫＧ２Ａに結合してもよい。場合によっては、抗原結合ドメインモノマーはＮＫＧ２Ｄに結合してもよい。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインモノマーはＦａｂである。ヘテロダイマータンパク質は、本明細書において「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα（ｓｕｓｈｉ）×Ｆａｂ」と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、または図６６Ａ、図６６Ｂ、図６０Ａ、もしくは図６１Ａに示したものである。他の実施形態では、ヘテロダイマータンパク質はまた、ドメインリンカーを使用して上記ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインも含み、上記抗原結合ドメインは、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない。そのようなヘテロダイマータンパク質は、ＸＥＮＰ２４５４８または図７９Ｂに示すものであり得る。

別の態様では、本明細書に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質は、（ａ）第１のタンパク質ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む融合タンパク質であって、第１のタンパク質ドメインがドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している融合タンパク質と、（ｂ）第１のタンパク質ドメインに非共有結合した第２のタンパク質ドメインと、（ｃ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマー（ＶＨは可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）を含む重鎖、および可変軽鎖および軽定常ドメイン（例えば、ＶＬ−ＣＬ）を含む軽鎖を含む抗原結合ドメインモノマーと、を含む。第１のおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有することができ、第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含むか、または第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含み、第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。特定の実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（短縮型ヒトＩＬ−１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができ、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）および配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はＤ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、またはＱ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ６１Ｎ／Ｑ１０８Ｅ、またはＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインモノマーは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する。換言すれば、抗原結合ドメインモノマーはＣＤ８に結合してもよい。抗原結合ドメインモノマーはＮＫＧ２Ａに結合してもよい。場合によっては、抗原結合ドメインモノマーはＮＫＧ２Ｄに結合してもよい。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインモノマーはＦａｂである。そのようなヘテロダイマータンパク質は、本明細書において「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂ」と呼ばれ得る。いくつかの例では、ヘテロダイマータンパク質は、ＸＥＮＰ２５１３７または図５７Ｅおよび図９２Ｃに示すものであり得る。特定の実施形態では、抗原結合ドメインモノマーはｓｃＦｖであり、Ｆａｂではない。そのようなヘテロダイマータンパク質は、本明細書では「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα×ｓｃＦｖ」と呼ばれ、図５７Ｂに示される。

他の実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、１つ以上のドメインリンカーを使用してＩＬ−１５タンパク質および／またはＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない。例えば、２０１７年６月３０日出願のＵＳ６２／５２７，８９８の図１Ｉ、１Ｌ、または１Ｋに示されるヘテロダイマータンパク質などである。

別の態様では、本明細書に記載のヘテロダイマータンパク質は、（ａ）第１のＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマー（ＶＨは第１の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第１のＦｃドメインである）を含む第１の重鎖、ならびに第１の可変軽鎖および第１の軽定常ドメインを含む第１の軽鎖を含む第１の抗原結合ドメインモノマーと、ｂ）第２のＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマー（ＶＨは第２の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）を含む第２の重鎖、第２の可変軽鎖および第２の軽定常ドメインを含む第２の軽鎖、ならびに第１のドメインリンカーを使用して第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合している第１のタンパク質ドメインを含む第２の抗原結合ドメインモノマーと、ｃ）第２の抗原結合ドメインモノマーの第１のタンパク質ドメインに結合または非共有結合している第２のタンパク質ドメインと、を含み、第１のおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番による、Ｓ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（短縮型ヒトＩＬ−１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができ、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）および配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はＤ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、またはＱ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ６１Ｎ／Ｑ１０８Ｅ、またはＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。好ましい実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインモノマーおよび第２の抗原結合ドメインモノマーは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する。他の実施形態では、第１の抗原結合ドメインモノマーまたは第２の抗原結合ドメインモノマーは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する。換言すれば、抗原結合ドメインモノマー（複数可）はＣＤ８に結合してもよい。抗原結合ドメインモノマー（複数可）はＮＫＧ２Ａに結合してもよい。場合によっては、抗原結合ドメインモノマー（複数可）はＮＫＧ２Ｄに結合してもよい。いくつかの実施形態では、第１のおよび第２の抗原結合ドメインモノマーはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を形成する。そのようなヘテロダイマータンパク質は、本明細書において「ｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれ得る。いくつかの例では、ヘテロダイマータンパク質はＸＥＮＰ２５１３７または図５７Ｇおよび図７９Ａに示すものであり得る。

別の態様では、本明細書に記載のヘテロダイマータンパク質は、（ａ）ＩＬ−１５タンパク質、第１の抗原結合ドメイン、および第１のＦｃドメインを含む、ＩＬ−１５融合タンパク質であって、第１の抗原結合ドメインは、第１のドメインリンカーを使用して、ＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５タンパク質は、第２のドメインリンカーを使用して、第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、抗原結合ドメインは、第１の可変重鎖ドメインおよび第１の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、ＩＬ−１５融合タンパク質と、（ｂ）ＩＬ−１５Ｒαタンパク質、第２の抗原結合ドメイン、および第２のＦｃドメインを含むＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であって、第２の抗原結合ドメインは、第３のドメインリンカーを使用して、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合し、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、第４のドメインリンカーを使用して、第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、第２抗原結合ドメインは、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質と、を含み、第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ；Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する。第１のおよび／または第２のＦｃドメインは、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（短縮型ヒトＩＬ−１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができ、ＩＬ−１５Ｒαタンパク質は、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）および配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。様々な実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質およびＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質はＤ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、またはＱ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ６１Ｎ／Ｑ１０８Ｅ、またはＮ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｄ６１Ｎ／Ｎ６５Ｄ／Ｑ１０８Ｅのアミノ酸置換を有する。好ましい実施形態では、ＩＬ−１５タンパク質は、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインモノマーおよび第２の抗原結合ドメインモノマーは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する。他の実施形態では、第１の抗原結合ドメインモノマーまたは第２の抗原結合ドメインモノマーは、ＣＤ８、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する。換言すれば、抗原結合ドメインモノマー（複数可）はＣＤ８に結合してもよい。抗原結合ドメインモノマー（複数可）はＮＫＧ２Ａに結合してもよい。場合によっては、抗原結合ドメインモノマー（複数可）はＮＫＧ２Ｄに結合してもよい。いくつかの実施形態では、ヘテロダイマータンパク質は、ＸＥＮＰ２４５４７であるか、図５７Ｊおよび図７９Ｂに表したとおりである。

本明細書では、本明細書に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質のいずれか１つをコードする１つ以上の核酸を含む核酸組成物も提供する。別の態様では、本発明は、１つ以上の発現ベクターが本明細書に記載のヘテロダイマータンパク質のいずれか１つをコードするように各ベクターが核酸を含む、１つ以上の発現ベクターを含む発現ベクター組成物を提供する。他の態様では、核酸組成物または発現ベクター組成物のいずれか１つを含む宿主細胞が提供される。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のヘテロダイマータンパク質のいずれか１つを製造する方法を提供する。この方法は、（ａ）そのような宿主細胞を、ヘテロダイマータンパク質が発現される好適な条件下で培養することと、（ｂ）ヘテロダイマータンパク質を回収することと、を含む。さらに別の態様では、本発明は、本明細書に開示される治療有効量のヘテロダイマータンパク質を患者に投与することを含む、患者（例えばヒト患者）の癌を治療する方法を提供する。いくつかの例では、本明細書で提供されるのは、必要とする患者の癌を治療する方法である。

ＶＩＩＩ．本発明の核酸
本発明はさらに、本発明の二機能性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマー融合タンパク質をコードする核酸組成物を提供する。

当業者には理解されるように、核酸組成物は二機能性ヘテロダイマー融合タンパク質のフォーマットに依存するだろう。したがって、例えば、フォーマットが３つのアミノ酸配列を必要とするとき、３つの核酸配列を発現のために１つ以上の発現ベクターに組み込むことができる。同様に、いくつかのフォーマットは２つの核酸のみを必要とし、同様に、それらを１つまたは２つの発現ベクターに入れることができる。

当技術分野で既知のとおり、本発明の構成要素をコードする核酸は、当技術分野において既知のとおり、そして本発明の二機能性ヘテロダイマー融合タンパク質を産生するために使用される宿主細胞に応じて、発現ベクターに組み込まれ得る。一般に、核酸は任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択可能マーカー、リボソーム結合部位、インデューサーなど）に作動可能に連結されている。発現ベクターは、染色体外ベクターまたは組み込みベクターであり得る。

次いで、本発明の核酸および／または発現ベクターを、多くの実施形態において使用される、哺乳動物、細菌、酵母、昆虫および／または真菌細胞を含む当技術分野において周知の任意の数の異なる種類の宿主細胞に哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）で形質転換する。

いくつかの実施形態では、各モノマーをコードする核酸は、フォーマットに応じて適用可能なように、それぞれ一般に異なるまたは同じプロモーター制御下で単一の発現ベクター内に含まれる。本発明において特に使用される実施形態では、これら２つまたは３つの核酸のそれぞれは異なる発現ベクターに含まれる。本明細書および米国仮出願第６２／０２５，９３１号、米国特許出願公開第２０１５／０３０７６２９号、および国際特許公開第ＷＯ２０１５／１４９０７７号（すべて参照により本明細書に組み入れられる）に示されるように、異なるベクター配給量を使用してヘテロダイマー形成を駆動することができる。つまり、驚くべきことに、タンパク質は、１：１：２の比率で第１のモノマー：第２のモノマー：軽鎖（ヘテロダイマー抗体を含む３つのポリペプチドを有する実施形態など）を含むが、これらは最良の結果をもたらす比率ではない。

本発明の二機能性ヘテロダイマー融合タンパク質は、当技術分野において周知のように、発現ベクター（複数可）を含む宿主細胞を培養することによって作製される。一旦製造されると、イオン交換クロマトグラフィー工程を含む従来の融合タンパク質または抗体精製工程が実施される。本明細書で考察されるように、２つのモノマーのｐＩが少なくとも０．５だけ異なることが、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に高感度な他の方法による分離を可能する。すなわち、各モノマーが異なる等電点（ｐＩ）を有し、ヘテロダイマーも異なるｐＩを有するように、各モノマーのｐＩを変化させるｐＩ置換を含むことによって、ヘテロダイマーの等電点精製（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー）を促進する。これらの置換はまた、精製後の任意の混入したホモダイマーの特定およびモニタリングにも役立つ（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、および分析用ＩＥＸカラム）。

ＩＸ．二機能性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマー融合タンパク質の生物学的および生化学的機能
一般に、本発明の二機能性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマー融合タンパク質は、本明細書に記載されるようないくつかの方法で、癌患者に投与され、有効性を評価する。このため、癌量、腫瘍のサイズ、転移の存在または程度の評価等の、有効性の標準的なアッセイを実行し得るが、免疫腫瘍学的治療もまた免疫状態評価に基づいて評価され得る。これは、インビトロアッセイおよびインビボアッセイの両方を含むいくつかの方法で行うことができる。例えば、腫瘍量、サイズ、侵襲性、リンパ節（ＬＮ）関与、転移等といった他の測定と併せて、免疫状態（例えば、イピリムマブ治療後のＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在）の変化の評価を実施することができる。このため、以下のいずれかまたはすべてを評価することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ（ＣＴＬ）細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞傷害性活性および／もしくはＣＴＬ媒介性細胞枯渇、ＮＫ細胞活性およびＮＫ媒介性細胞枯渇に対するＰＶＲＩＧの抑制効果、Ｔｒｅｇ細胞分化および増殖ならびにＴｒｅｇもしくは骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）媒介性免疫抑制もしくは免疫耐性に対するチェックポイントの増強効果、ならびに／または免疫細胞による炎症性サイトカイン産生、例えば、Ｔ細胞もしくは他の免疫細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、もしくはＴＮＦ−α産生に対するチェックポイントの効果。

いくつかの実施形態では、処理の評価は、例えば、ＣＦＳＥ希釈法、免疫エフェクター細胞のＫｉ６７細胞内染色、および^３Ｈ−チミジン取り込み法を使用して、免疫細胞の増殖を評価することによって実施される。

いくつかの実施形態では、治療の評価は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、およびＣＤ１０７Ａの表面発現によって測定される細胞脱顆粒のうちの１つ以上を含む、遺伝子発現の増加または活性化関連マーカーの増加したタンパク質レベルを評価することによって行われる。

一般に、遺伝子発現アッセイは、当技術分野で既知のとおり行われる。

一般に、タンパク質発現測定も同様に、当技術分野で既知のとおり実施される。

いくつかの実施形態では、治療の評価は、酵素活性（プロテアーゼ活性を含む）、細胞膜透過性、細胞接着、ＡＴＰ産生、補酵素産生、およびヌクレオチド取り込み活性等の多数の細胞パラメーターを推測することによる標的細胞生存検出によって測定される細胞傷害性活性を評価することによって行われる。これらのアッセイの具体的な例としては、トリパンブルーまたはＰＩ染色、^５１Ｃｒまたは^３５Ｓ放出法、ＬＤＨ活性、ＭＴＴおよび／またはＷＳＴアッセイ、カルセイン−ＡＭアッセイ、発光系アッセイ、ならびに他のものが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、治療の評価は、サイトカイン産生によって測定されるＴ細胞活性を評価することによって行われ、周知の技法を使用して、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３を含むがこれらに限定されないサイトカインを使用して、培養上清液中で細胞内のいずれかで測定する。

したがって、治療の評価は、以下のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して実施することができる。（ｉ）免疫応答を増加させること、（ｉｉ）αβおよび／またはγδのＴ細胞の活性化を増加させること、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させること、（ｉｖ）ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性を増加させること、（ｖ）αβおよび／またはγδのＴ細胞抑制を軽減させること、（ｖｉ）炎症誘発性サイトカイン分泌を増加させること、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌を増加させること、（ｖｉｉｉ）インターフェロン−γ産生を増加させること、（ｉｘ）Ｔｈ１応答を増加させること、（ｘ）Ｔｈ２応答を減少させること、（ｘｉ）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の少なくとも１つの細胞数および／または活性を減少させるかまたは排除すること。

Ａ．有効性および効力を測定するアッセイ
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化は、当技術分野において既知の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して評価される。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、異なる因子のリン酸化または脱リン酸化によって、または他の翻訳後修飾を測定することによって測定される、免疫応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδ Ｔ細胞の活性化の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、癌細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、細胞傷害性Ｔ細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、癌細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、またはＣＤ１０７ａ等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδ Ｔ細胞抑制の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはマルチプレックスビーズ系方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ分析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔ等によって測定される、炎症促進性サイトカイン分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはマルチプレックスビーズ系方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ分析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔ等によって測定される、ＩＬ−２分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはマルチプレックスビーズ系方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ分析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔ等によって測定される、インターフェロン−γ産生の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔｈ１応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔｈ２応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定される調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のうちの少なくとも１つの細胞数および／または活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定される、Ｍ２マクロファージ細胞数の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｍ２マクロファージ腫瘍形成促進活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定される、Ｎ２好中球増加の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＮ２好中球腫瘍形成促進活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔ細胞活性化の阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、癌細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、ＣＴＬ活性化の阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδ Ｔ細胞枯渇の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδ Ｔ細胞応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７等の例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、抗原特異的メモリー応答の刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＭＴＴ、^１５Ｃｒ放出、カルセインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等の例のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、癌細胞のアポトーシスまたは細胞溶解の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＭＴＴ、^１５Ｃｒ放出、カルセインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、またはＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等の例のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、癌細胞に作用する細胞傷害性または細胞増殖抑制性の刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＭＴＴ、^１５Ｃｒ放出、カルセインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等の例のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、癌細胞の直接殺傷の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイ測定は、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔｈ１７活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＭＴＴ、^１５Ｃｒ放出、カルセインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、またはＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、補体依存性細胞障害作用および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用の誘導の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。

一実施形態では、Ｔ細胞活性化は、例えば、癌細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、またはＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される。Ｔ細胞については、増殖、活性化の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＰＤ１）、細胞傷害性（標的細胞を殺傷する能力）、およびサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）の増加が、癌細胞殺傷の増強と一致する免疫調節を示し得る。

一実施形態では、ＮＫ細胞活性化は、例えば、癌細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、またはＣＤ１０７ａなどの例のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される。ＮＫ細胞については、増殖、細胞傷害性（標的細胞を殺傷し、ＣＤ１０７ａ、グランザイム、およびパーフォリン発現を増加させる能力）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦ）、および細胞表面受容体発現（例えば、ＣＤ２５）の増加が、癌細胞殺傷の増強と一致する免疫調節を示し得る。

一実施形態では、γδ Ｔ細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。

一実施形態では、Ｔｈ１細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。

活性または応答の適切な増加（または必要に応じて上で概説した減少）とは、基準試料または対照試料のいずれか、例えば、本発明のＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα×抗原結合ドメインヘテロダイマー融合タンパク質を含まない試験試料におけるシグナルと比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８〜９９％パーセントの増加である。同様に、参照対象または対照試料と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍または５倍の増加が有効性を示す。

Ｘ．治療
一旦生成されると、本発明の組成物は、一般に、本発明のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の結合Ｔ細胞活を用いて性化を促進すること（例えば、Ｔ細胞はもはや抑制されない）による、癌治療によって、いくつかの腫瘍学適用に使用される。

したがって、本発明の二機能性ヘテロダイマー組成物はこれらの癌の治療に使用される。

Ａ．インビボ投与のための二機能性ヘテロダイマータンパク質組成物
いくつかの実施形態では、本発明の二機能性ヘテロダイマータンパク質は、別個の抗体と同時投与される。当業者に理解されるように、同時投与は、同時にまたは連続して実施することができる。

本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度を有する抗体を任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］に一般に概説されるとおり）と混合することによって、保存のために、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。許容される担体、緩衝剤、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度において、レシピエントに対して非毒性でありリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

Ｂ．投与様式
本発明の二機能性ヘテロダイマータンパク質は、ボーラスとしての静脈内投与またはある期間にわたる持続注入などの既知の方法に従って、化学療法剤とともに対象に投与することができる。二機能性ヘテロダイマータンパク質および化学療法剤の投与は、当業者によって理解されるように、同時にまたは連続して実施することができる。

Ｃ．治療法
本発明の方法において、治療は、疾患または病状に関して肯定的な治療応答を提供するために使用される。「肯定的な治療応答」は、疾患もしくは病状の改善、および／または疾患または病状に関連する症状の改善を意図する。例えば、肯定的な治療応答は、疾患における以下の改善のうちの１つ以上を指し得る：（１）腫瘍細胞の数の減少、（２）腫瘍細胞死の増加、（３）腫瘍細胞の生存の阻害、（５）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、および（７）疾患または病状に関連する１つ以上の症状からのいくらかの解放。

任意の所与の疾患または病状における肯定的な治療応答は、その疾患または病状に特有の標準化された応答基準によって決定され得る。腫瘍応答は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン撮影、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺（ＢＭＡ）および循環中の腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検サンプリングなどのスクリーニング技法を使用して、腫瘍形態（すなわち、全身腫瘍組織量、腫瘍サイズなど）の変化について評価され得る。

これらの肯定的な治療応答に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。

本発明に従う治療には、使用される医薬品の「治療有効量」が含まれる。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な投薬量および期間で有効な量をいう。

治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子によって異なり得る。治療有効量はまた、二機能性ヘテロダイマータンパク質、抗原結合ドメイン、またはそれらの部分のいかなる毒性または有害な影響よりも治療上有益な効果が勝る量である。

腫瘍療法のための「治療有効量」は、疾患の進行を安定化する能力によっても測定することができる。癌を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してもよい。

あるいは、組成物のこの特性は、当業者に既知のインビトロアッセイによって、化合物または組成物が細胞増殖を阻害するか、またはアポトーシスを誘導する能力を調べることによって評価してもよい。治療有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少させるか、さもなければ対象の症状を軽減し得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。

投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単回のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例して減少または増加させてもよい。非経口組成物は、投与の容易性および投薬量の均一性のために、単位剤形で処方され得る。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象のための単一投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。

本発明の単位剤形形態の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療に対してそのような活性化合物を調合する分野に付いて回る制限に影響され、またそれらに直接的に依存する。

本発明で使用される二機能性ヘテロダイマータンパク質の効率的な投薬量及び投薬レジメンは、治療される疾患または病態に依存し、当業者によって決定され得る。

すべての引用文献は、本明細書にそれらの全体が参照により明示的に組み込まれる。

本発明の特定の実施形態を例示の目的で上述のように説明してきたが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく詳細の多数の変形をなし得ることが当業者には理解されよう。

本発明を説明するために実施例を以下に提供する。これらの実施例は、本発明を任意の特定の用途または動作理論に限定することを意味するものではない。本発明で論じられるすべての定常領域位置について、付番は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，１９９１，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、参照により全体が組み込まれる）と同様のＥＵインデックスに従う。抗体の技術分野の当業者は、この規則が免疫グロブリン配列の特定の領域における非連続的な付番からなり、免疫グロブリンファミリーにおける保存された位置への標準的な基準を可能にすることを理解するであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義されるような任意の所与の免疫グロブリンの位置は必ずしもその連続配列に対応しない。

一般的および具体的な科学技術は、米国特許出願公開第２０１５／０３０７６２９号、同第２０１４／０２８８２７５号、および国際特許出願第ＷＯ２０１４／１４５８０６号に概説されており、それらはすべて、特にその中で概説される技術に関して、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。

実施例１：ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲαＦｃ融合タンパク質
１Ａ：ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の操作
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαヘテロダイマーの短い半減期に対処するために、産生の促進および複合体のＦｃＲｎ媒介リサイクルの促進および半減期の延長を目的として、Ｆｃ融合体としてＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）複合体（以下、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質と呼ばれる）を生成した。

ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメインをコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてＦｃ融合パートナー（例えば、図８に示す定常領域）を含むｐＴＴ５発現ベクターへのサブクローニングによって構築した。例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質フォーマットの略図を図１６Ａ〜１６Ｇに示す。

ＩＬ−１５／ＲαヘテロＦｃフォーマット（図１６Ａ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２０８１８およびＸＥＮＰ２１４７５が含まれ、その配列を図１７に示す。ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図１６Ｂ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２１４７８およびＸＥＮＰ２１９９３が含まれ、その配列を図１８に示す。ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図１６Ｃ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２１４７９、ＸＥＮＰ２２３６６、およびＸＥＮＰ２４３４８が含まれ、それらの配列を図１９に示す。二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマットの（図１６Ｄ）の例示的タンパク質はＸＥＮＰ２１９７８であり、その配列は図２０に示す。二価ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図１６Ｅ）の例示的タンパク質の配列を図２１に示す。Ｆｃ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマット（図１６Ｆ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２６３７およびＸＥＮＰ２２６３８が含まれ、その配列を図２２に示す。Ｆｃ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマット（図１６Ｇ）の例示的タンパク質の配列を図２３に示す。

タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションによって産生され、プロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．５と１ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．５との５〜４０％勾配によるＨｉＴｒａｐＱ５ｍＬカラム）を含む二段階精製プロセスによって精製された。

上述のような様々なフォーマットのＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質を細胞増殖アッセイで試験した。ヒトＰＢＭＣを指定濃度で試験物質を用いて処理した。処理の４日後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＯＫＴ４）、抗ＣＤ２７−ＰＥ（Ｍ−Ｔ２７１）、抗ＣＤ５６−ＢＶ４２１（５．１Ｈ１１）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、および抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ６０５（Ｈｉ１００）で染色し、以下の細胞型についてゲートした：ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ１６＋）。Ｋｉ６７は細胞増殖と厳密に関連するタンパク質であり、そして細胞内Ｋｉ６７についての染色は抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）およびＦｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）を使用して実施された。上述の細胞型に対するＫｉ６７の割合は、ＦＡＣＳを使用して測定された（図２４Ａ〜２４Ｃおよび２５Ａ〜２５Ｃに示す）。様々なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質はＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の強い増殖を誘導した。特に、増殖活性の差異は、ＩＬ−１５−Ｆｃ側のリンカーの長さに依存していた。特に、ＸＥＮＰ２１４７１、ＸＥＮＰ２１４７４、およびＸＥＮＰ２１４７５を含む、リンカーを有さない（ヒンジのみ）構築物は、より弱い増殖活性を示した。

１Ｂ：操作されたジスルフィド結合を有するＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質
ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の安定性をさらに向上させ、半減期を延ばすために、ＩＬ−１５／Ｒα境界面においてジスルフィド結合を操作した。ＩＬ−１５／Ｒα複合体の結晶構造を調べることによって、ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒＯｐｅｒａｔｉｎｇＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ、ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）ソフトウェアを用いてモデリングすることによって、図２６に示されるように、共有ジスルフィド結合を形成するためにシステインで置換し得るＩＬ−１５／Ｒα境界面の残基を予測した。さらに、ＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインに続く３個までのアミノ酸を、操作するシステインの足場としてＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＣ末端に付加した（その例示的な配列を図２７に示す）。システインで操作された例示的なＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）バリアントの配列をそれぞれ図２８および２９に示す。

ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてＦｃ融合パートナー（例えば、図８に示す定常領域）を含むｐＴＴ５発現ベクターへのサブクローニングによって構築した。上述のように同定された残基を、標準的な変異導入技術によってシステインで置換した。操作されたジスルフィド結合を有するＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の略図を図３０Ａ〜３０Ｄに示す。

ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−ヘテロＦｃフォーマット（図３０Ａ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２０１３、ＸＥＮＰ２２０１４、ＸＥＮＰ２２０１５、およびＸＥＮＰ２２０１７が含まれ、それらの配列を図３１に示す。ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図３０Ｂ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２３５７、ＸＥＮＰ２２３５８、ＸＥＮＰ２２３５９、ＸＥＮＰ２２６８４、およびＸＥＮＰ２２３６１が含まれ、それらの配列を図３２に示す。二価ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（図３０Ｃ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２６３４、ＸＥＮＰ２２６３５、ＸＥＮＰ２２６３６、およびＸＥＮＰ２２６８７が含まれ、それらの配列を図３３に示す。Ｆｃ−ｄｓＩＬ−１５／Ｒαフォーマット（図３０Ｄ）の例示的タンパク質には、ＸＥＮＰ２２６３９およびＸＥＮＰ２２６４０が含まれ、それらの配列を図３４に示す。

タンパク質が精製された後、それらは純度および均質性についてキャピラリー等電点電気泳動（ＣＥＦ）によって分析された。製造者の使用説明書を使用して実施したＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓＡｓｓａｙＬａｂＣｈｉｐおよびＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔＫｉｔを使用するＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩＴｏｕｃｈＨＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）を使用してＣＥＦを実施した。試料は、一方を還元下（ジチオトレイトールを用いて）、他方を非還元条件下で二重に試験した。変性非還元ＣＥＦによって示されるように、多くのジスルフィド結合が正しく形成され、操作されたジスルフィド結合を含まない対照と比較した場合、共有結合複合体のより大きい分子量が観察され得る（図３５）。

次いでタンパク質を細胞増殖アッセイで試験した。ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質（操作されたジスルフィド結合を有する場合または有さない場合）または対照をＰＢＭＣとともに４日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ５１０（ＨＩ１００）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ５６−ＢＶ４２１（ＨＣＤ５６）、抗ＣＤ２７−ＰＥ（Ｏ３２３）、および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）で染色して種々の細胞集団を標識し、ＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７発現によって示されるＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を図３６Ａ〜３６Ｃに示す。ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質およびＩＬ−１５対照のそれぞれが、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞の強い増殖を誘導した。

１Ｃ：より低い効力およびＰＫおよび半減期を増加させるために操作されたＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質
ＰＫをさらに改善し半減期を延長するために、ＩＬ−１５の効力を低下させることが抗原シンクを減少させるので、半減期を増加させるだろうと推論した。ＩＬ−１５：ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−１５：共通γ鎖の界面の結晶構造を調べることによって、ならびにＭＯＥソフトウェアを使用してモデリングすることによって、効力を低減させるために置換され得るこれらの境界面における残基を予測した。図３７は、（免疫原性のリスクを低減するために）等配電子置換を操作した推定残基の位置を示すＩＬ−１５：受容体複合体の構造モデルを示す。効力低下のために設計された例示的なＩＬ−１５バリアントの配列を図３に示す。

ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）をコードするプラスミドを、標準的な遺伝子合成、続いてＦｃ融合パートナー（例えば、図８Ａ〜８Ｄに示す定常領域）を含むｐＴＴ５発現ベクターへのサブクローニングによって構築した。上述のように同定された置換を、標準的な変異導入技術によって組み込んだ。効力低下のために操作された「ＩＬ−１５／ＲαヘテロＦｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図３９Ａ〜３９Ｅに示す。効力低下のために操作された「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４０Ａ〜４０Ｄに示す。効力低下のために操作された「ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４１Ａ〜４１Ｂに示す。効力低下のために操作された例示的なｎｃＩＬ−１５／Ｒαヘテロダイマーの配列を図４２に示す。効力低下のために操作された「二価ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４３に示す。効力低下のために操作された「ｄｓＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ」フォーマットの例示的なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図４４に示す。

１Ｃ（ａ）：効力の低下のために操作されたバリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ活性
バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質をいくつかの細胞増殖アッセイで試験した。

最初の細胞増殖アッセイでは、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質（操作された置換を有する場合または有さない場合）または対照をＰＢＭＣとともに４日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ４−Ｅｖｏｌｖｅ６０５（ＳＫ−３）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、抗ＣＤ１６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＣＢ１６）、抗ＣＤ５６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＴＵＬＹ５６）、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ３）、および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）で染色して種々の細胞集団を標識し、ＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７発現によって示されるＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を図４５〜４６に示す。ほとんどのＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質は各細胞集団の増殖を誘導したが、活性は特定の操作された置換に依存して変化した。

第２の細胞増殖アッセイでは、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質（操作された置換を有する場合または有さない場合）をＰＢＭＣとともに３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−Ｅｖｏｌｖｅ６０４（ＳＫ−３）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＣＢ１６）、抗ＣＤ５６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＴＵＬＹ５６）、抗ＣＤ２７−ＰＥ（Ｏ３２３）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（２０Ｒａｊ１）抗体で染色して様々な細胞集団をマークした。最初にリンパ球を側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）に基づいてゲートした。次にリンパ球をＣＤ３発現に基づいてゲートした。ＣＤ３発現について陰性の細胞をさらにＣＤ１６発現に基づいてゲートしてＮＫ細胞（ＣＤ１６＋）を同定した。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびγδＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）を同定するために、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣＤ４およびＣＤ８発現に基づいてさらにゲートした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４５ＲＡ発現についてゲートした。最後に、様々な細胞集団の増殖を、Ｋｉ６７発現の割合に基づいて決定し、データを図４７Ａ〜Ｄに示す。ＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質に対してＣＤ４＋Ｔ細胞よりも感受性であり、そして上述のように、増殖活性は特定の操作された置換に応じて変化した。図４７Ｄは、対照ＸＥＮＰ２０８１８に対する様々なＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のＥＣ５０の倍率変化を示す。図４８Ａおよび４８Ｂは、ＰＢＭＣとＸＥＮＰ２２８２１とのインキュベーション前後のＣＤ６９およびＣＤ２５（Ｔ細胞活性化マーカー）の発現についてゲートすることによって、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質による処理後のリンパ球の活性化をさらに示す。

第３の実験において、追加のバリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質をヒトＰＢＭＣとともに３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＳＢ６００（ＳＫ−３）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、抗ＣＤ１６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＣＢ１６）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（Ｍ−Ａ２５１）、および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）で染色して種々の細胞集団を標識し、ＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７発現によって示されるＣＤ８＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、ＣＤ４＋（ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ細胞の増殖を図４９Ａ〜４９Ｄに示す。

第４の実験において、ヒトＰＢＭＣを示された濃度の追加のＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃバリアントとともに３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４（ＳＢ６００）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＣＢ１６）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ６７）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。処理後のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図５０に示す。

第５の実験において、バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質をヒトＰＢＭＣとともに３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ＡＰＣ（２ＳＴ８．５Ｈ７）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＮＣＡＭ１６．２）、および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図５１Ａ〜５１Ｅに示す。

第６の実験において、バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質をヒトＰＢＭＣとともに３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ＡＰＣ（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＮＣＡＭ１６．２）、および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図５２Ａ〜５２Ｅに示す。

第７の実験において、バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質を指定濃度でヒトＰＢＭＣとともに３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＨＩ１００）、および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞に対するＫｉ６７の割合を図５３Ａ〜Ｄに示す。データは、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質ＸＥＮＰ２１４７９がＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞、およびγδＴ細胞の増殖の最も強力な誘導因子であることを示している。各ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質は、増殖を誘導することにおいてＸＥＮＰ２１４７９よりも効力が弱かったが、差異はリンカーの長さと特定の操作された置換の両方に依存していた。

第８の実験において、バリアントＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質を指定濃度でヒトＰＢＭＣとともに３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＨＩ１００）、および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞に対するＫｉ６７の割合を、それぞれ図５４Ａ〜Ｄに示す。上述のように、データは、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質ＸＥＮＰ２１４７９がＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ（ＣＤ１６＋）細胞、およびγδＴ細胞の増殖の最も強力な誘導因子であることを示している。特に、ｎｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃフォーマット（ＸＥＮＰ２４３４９）へのＱ１０８Ｅ置換の導入は、野生型（ＸＥＮＰ２１４７９）と比較してその増殖活性を劇的に減少させる。

１Ｃ（ｂ）：効力低下のために操作されたＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のＰＫ
効力低下のために操作されたＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質が半減期およびＰＫを改善したかどうかを調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＫ試験においてこれらのバリアントを調べた。０日目に、２コホートのマウス（１コホートあたり試験試料あたり５匹のマウス）にＩＶ−ＴＶによって０．１ｍｇ／ｋｇの指定の試験物質を投与した。投与６０分後に、次いでコホート１では２、４、および７日目、そしてコホート２では１、３、および８日目に血清を採取した。ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の血清レベルは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて抗ＩＬ−１５および抗ＩＬ−１５Ｒα抗体を用いて決定した。結果を図５５に示す。図５６は、試験物質の効力と半減期の間の相関関係を示す。予想通り、効力が低下したバリアントは実質的により長い半減期を示した。特に、半減期は、野生型対照ＸＥＮＰ２０８１８の０．５日と比較して、約９日まで改善された（ＸＥＮＰ２２８２１およびＸＥＮＰ２２８２２を参照）。

例２：ＮＫＧ２Ａ標的化およびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合の操作
腫瘍が免疫除去から逃れるための１つの戦略は、Ｔ細胞による認識を避けるためのＭＨＣクラスＩのダウンレギュレーションによるものである（Ｇａｒｒｉｄｏ，Ｆｅｔａｌ．，２０１６）。バックアップとして、ＮＫ細胞はＭＨＣＩの非存在下で癌細胞を認識することができ、実際、腫瘍細胞によるＭＨＣクラスＩのダウンレギュレーションを感作し得るする可能性があります（Ｚａｍａｉ，Ｌｅｔａｌ．，２００７）。しかし、癌患者ではＮＫ細胞数が減少していることが判明している（Ｌｅｖｙ，ＥＭｅｔａｌ．，２０１１）。したがって、ＮＫＧ２Ａ標的化およびＮＫＧ２Ｄ標的化構築物は、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体をＴｒｅｇから遠ざけるだけでなく、ＮＫ細胞を選択的に標的化し拡大させることを目的として生成された。

２Ａ：ＮＫＧ２Ａ標的化およびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の操作
モナリズマブのＶＨおよびＶＬ配列（２０１４年１２月２日発行の米国特許第８，９０１，２８３号に開示）は、概念実証としてのＮＫＧ２Ａ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の構成要素として使用するために、Ｆａｂフォーマットでヒト化され操作された。二価フォーマットのモナリズマブ（キメラおよびヒト化）の配列は、図５８にＸＥＮＰ２４５４１およびＸＥＮＰ２４５４２として示す。

抗ＮＫＧ２ＤのＶＨおよびＶＬ配列（２０１１年２月１日発行の米国特許第７，８７９，９８５号に開示）は、プロトタイプＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の構成要素として使用するためにＦａｂフォーマットで操作された。二価ｍＡｂ形式の配列を図５９にＸＥＮＰ２４３６５として示す。

ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、図５７Ｄに示すｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットで生成され、ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）を含む他方側がヘテロダイマーＦｃ領域の他方側のＮ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。例示的なＮＫＧ２Ａ標的ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２およびＸＥＮＰ２７１４６の配列を図６０に示し、例示的なＮＫＧ２Ｄ標的ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合物ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、およびＸＥＮＰ２７１４５の配列を図６１Ａ〜６１Ｂに示す。

上述のＶＨおよびＶＬ配列、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）ドメイン、軽鎖定常領域、ならびにヘテロダイマー定常領域（図９に示す）をコードするプラスミドは、ギブソンアセンブリによって構築された。タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞での一過性トランスフェクションによって生成され、プロテインＡクロマトグラフィーとそれに続くイオン交換クロマトグラフィーを含む２段階精製プロセスによって精製された。

２Ｂ：ＩＬ−１５効力バリアントを含むＮＫＧ２Ａ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の活性
ワンアームｓｃＩＬ−１５／ＲαＦｃ融合（ＸＥＮＰ２１９９３）、ＮＫＧ２Ａ標的化効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／Ｒα（ＸＥＮＰ２４５３１）、およびモナリズマブに基づく抗ＮＫＧ２ＡＦａｂアームを有するＮＫＧ２Ａ標的化効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｑ１０８Ｅ）／Ｒα（ＸＥＮＰ２４５３２）が細胞増殖アッセイでテストされた。

ヒトＰＢＭＣを指定濃度で試験物質を用いて処理した。処理の３日後、ＰＢＭＣをＦＡＣＳで分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を各試験物質について図６２Ａ〜Ｃに示す。データは、ＸＥＮＰ２１９９３と比較して、ＸＥＮＰ２４５３１およびＸＥＮＰ２４５３２は、増殖中のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の効力の低下を示したことを示す。特に、ＸＥＮＰ２４５３２は、ＸＥＮＰ２４５３１と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖における効力を維持しながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖における効力の低下を示した。これは、同じＮＫＧ２Ａ標的化Ｆａｂアームを使用しても、ｓｃＩＬ−１５／Ｒα側の効力が様々な細胞型を拡大する効力に影響することを示唆する。

２Ｃ：ＮＫＧ２Ａ標的化およびＮＫＧ２Ｄ標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体はＮＫ細胞の選択的増殖を示す
ヒトＰＢＭＣを指定濃度で試験物質を用いて処理した。処理の３日後、最初にＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＢＶ７８６（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＰＥ／Ｃｙ７（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５、および抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）で染色した。細胞を再度洗浄し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｏｘｐ３／ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＳｔａｉｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒＳｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を使用して、抗ＦｏｘＰ３−ＡＦ４８８（２５９Ｄ）および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣで染色した。最初に、リンパ球はＳＳＣおよびＦＳＣに基づいてゲートすることによって同定された。次いで、リンパ球をＣＤ３発現に基づいてゲートし、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１６＋）およびＣＤ３＋Ｔ細胞を同定した。次いで、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣＤ４およびＣＤ８に基づいてゲートして、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を同定した。次に、ＣＤ４５ＲＡに基づいてさらにゲーティングすることにより、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞亜集団を特定した。最後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−）、およびＮＫ細胞の細胞増殖に厳密に関連するタンパク質である、Ｋｉ６７の割合を決定した（それぞれ図６３Ａ〜Ｃに示す）。データは、対照の「ＲＳＶ標的化」効力低下型ワンアームｓｃＩＬ−１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−ＦｃＸＥＮＰ２６００７が、ＸＥＮＰ２０８１８（ＷＴＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ）と比較して、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞ならびにＮＫ細胞の増殖における効力を有意に低下させたことを示す。抗ＮＫＧ２Ａまたは抗ＮＫＧ２ＤＦａｂアーム（ＸＥＮＰ２７１４５およびＸＥＮＰ２７１４６のように）を用いたターゲティングは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対して効力を増加させることなくＮＫ細胞の増殖を選択的に誘導する。

サイトカインがその受容体に結合した後、受容体に関連するヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）がＳＴＡＴタンパク質をリン酸化し、ＳＴＡＴタンパク質が核に移行してさらに下流のプロセスを調節する。したがって、ＳＴＡＴタンパク質（特に、ＳＴＡＴ５ａおよびＳＴＡＴ５ｂを含むＳＴＡＴ５）のリン酸化は、ＩＬ−１５がその受容体に結合することによって引き起こされる最も初期のシグナル伝達現象の１つである。

したがって、別の実験では、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄ標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体による様々なリンパ球集団でのＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を調査した。ヒトＰＢＭＣを、指定濃度の次の試験物質：ＸＥＮＰ２０８１８（ＷＴＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４０５０、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６とともに３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後の様々な細胞集団をゲートするために、ＰＢＭＣを室温で３０〜４５分間、抗ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＲＰＡ−Ｔ４）、および抗ＣＤ８−Ａｌｅｘａ７００（ＳＫ１）で染色した。細胞を洗浄し、予め冷却した（−２０℃）９０％メタノールとともに２０〜６０分間インキュベートした。メタノールインキュベーション後、細胞を再度洗浄し、抗ＣＤ２５−ＢＶ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ５１０（ＨＩ１００）、抗ＦｏｘＰ３−ＡＦ４８８（２４９Ｄ）、抗ＣＤ５６−ＰＥ、および抗ｐＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ６４７（ｐＹ６８７）で染色し、様々な細胞集団およびＳＴＡＴ５リン酸化を標識した。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、およびＮＫ細胞集団でのＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示すデータを図６４に示す。Ｋｉ６７発現を示す上のデータと一致して、ここでのデータは、ＸＥＮＰ２０８１８と比較して、ＸＥＮＰ２６００７が、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにＴｒｅｇおよびＮＫ細胞でＳＴＡＴ５リン酸化の誘導において顕著に効力低下させ、抗ＮＫＧ２ＡＦａｂまたは抗ＮＫＧ２ＤＦａｂ（ＸＥＮＰ２７１４５およびＸＥＮＰ２７１４６など）を用いてＮＫ細胞を選択的にターゲティングするが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＴｒｅｇの好ましいターゲティングは示さない。

実施例３：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体
３Ａ：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の操作
マウス抗ＣＤ８抗体の親可変領域（図６５にＸＥＮＰ１５０７６として示す）をヒト化（２０１０年２月２日に発行された米国特許第７，６５７，３８０号に以前に記載されているように）し、プロトタイプＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の構成要素として使用するためにＦａｂフォーマットで操作した。ヒト化抗ＣＤ８の配列は、二価抗体（ＸＥＮＰ１５２５１）およびＦａｂ（ＸＥＮＰ２３６４７）、ならびにワンアームｍＡｂ（ＸＥＮＰ２４３１７）としてのヒト化バリアントとして図６５に示す。

ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、図５７Ｄに示すｓｃＩＬ−１５／Ｒα×Ｆａｂフォーマットで生成され、可変長リンカーによってＩＬ−１５に融合したＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）を含み（「ｓｃＩＬ−１５／Ｒα」と呼ばれる）、これは次いでヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合し、可変重鎖（ＶＨ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクトされる。このフォーマットの例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合物は、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、およびＸＥＮＰ２４１１６を含み、それらの配列を図６６に示す。

ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体はまた、以下のフォーマット：ヘテロダイマーＦｃ領域のＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃの他方側に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクションされ、ＩＬ−１５は非共有結合ＩＬ−１５／Ｒα複合体を形成するように別々にトランスフェクションされる、図５７Ｅに示すＦａｂ×ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマット、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）（ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）は次いでヘテロダイマーＦｃ領域の一方側のＣ末端にさらに融合する）に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクションされる、図５７Ｇに示すｍＡｂ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマット、第１のおよび第２のヘテロダイマーＦｃのＮ末端に融合したＶＨを含み、ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はヘテロダイマーＦｃ領域の一方側のＣ末端に融合するが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクションされ、ＩＬ−１５は非共有結合ＩＬ−１５／Ｒα複合体を形成するように別々にトランスフェクションされる、図５７Ｈに示すｍＡｂ−ｎｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマット、ＩＬ−１５（ヘテロダイマーＦｃの一方側にさらに融合する）のＮ末端に組み替えで融合したＶＨ、およびＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）（ヘテロダイマーＦｃの他方側にさらに融合する）のＮ末端に組み替えで融合したＶＨを含むが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクションされる、図５７Ｊに示すｃｅｎｔｒａｌ−ＩＬ−１５／Ｒαフォーマット、ならびにＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）のＮ末端に融合したＶＨ（ＩＬ−１５Ｒα（ｓｕｓｈｉ）はＩＬ−１５に融合し、次いでヘテロダイマーＦｃの一方側にさらに融合する）、およびヘテロダイマーＦｃの他方側に融合したＶＨを含むが、対応する軽鎖はＶＨを含むＦａｂを形成するように別々にトランスフェクションされる、図５７Ｋに示すｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＩＬ−１５／Ｒαフォーマットで生成された。これらの代替フォーマットのＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合物の例示的な配列を図７９に示す。

３Ｂ：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５Ｆｃ融合体プロトタイプによる細胞増殖の誘導
二価抗ＣＤ８抗体（ＸＥＮＰ１５２５１）、ワンアームｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合（ＸＥＮＰ２１９９３）、ＸＥＮＰ１５２５１に基づく抗ＣＤ８Ｆａｂアームを有するＣＤ８標的化ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２４１１４）を、細胞増殖アッセイでテストした。

ヒトＰＢＭＣを指定濃度で試験物質を用いて処理した。処理の３日後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１６−ＢＶ６０５（３Ｇ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＨＩ１００）、および抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、ＦＡＣＳで分析した。最初に、リンパ球はＳＳＣおよびＦＳＣに基づいてゲートすることによって同定された。次いで、リンパ球をＣＤ３発現に基づいてゲートし、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１６＋）およびＣＤ３＋Ｔ細胞を同定した。次いで、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣＤ４およびＣＤ８に基づいてゲートして、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびγδＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）を同定した。次に、ＣＤ４５ＲＡに基づいてさらにゲーティングすることにより、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞亜集団を特定した。最後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−）、およびＮＫ細胞の細胞増殖に厳密に関連するタンパク質である、Ｋｉ６７の割合を決定した（それぞれ図６７Ａ〜Ｃに示す）。データは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、ワンアームＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導に強力であることを示す。特に、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、Ｆａｂアームの包含に起因するＩＬ−１５活性の低下により、ワンアームＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体よりもＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導する能力が低かった。

３Ｃ：ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５Ｆｃ融合体プロトタイプによる細胞増殖の誘導
ワンアームｓｃＩＬ−１５／ＲαＦｃ融合体（ＸＥＮＰ２１９９３）、ワンアーム効力低下型ｓｃＩＬ−１５／ＲαＦｃ融合体（ＸＥＮＰ２４０１４）、およびＸＥＮＰ１５２５１に基づく抗ＣＤ８Ｆａｂアームを有するＣＤ８標的化効力低下型ｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２４１１６）を、細胞増殖アッセイで試験した。ヒトＰＢＭＣを指定濃度で試験物質を用いて処理した。処理の３日後、ＰＢＭＣをＦＡＣＳで分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図６８Ａ〜６８Ｃに示す。

データは、ＸＥＮＰ２１９９３と比較して、ＸＥＮＰ２４０１４が、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に効力の低下を示したことを示す。ＸＥＮＰ２４０１４と比較して、ＸＥＮＰ２４１１６は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の効力を増加させ（ＸＥＮＰ２１９９３に相当）、ＣＤ４＋Ｔ細胞の効力の低下、およびＮＫ細胞に対して同様の効力を示した。

３Ｄ：ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５Ｆｃ融合体プロトタイプのＴｒｅｇに対する作用
Ｔｒｅｇ増殖（ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＫｉ６７発現率で示される）について、ＣＤ８標的化効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２４１１６）の作用、ならびにワンアーム効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／ＲαＦｃ融合体（ＸＥＮＰ２４０１４）、効力低下型ＩＬ−１５（Ｑ１０８Ｅ）／Ｒα−Ｆｃヘテロダイマー（ＸＥＮＰ２２８２２）、および組み換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５）を調査した。

インビトロでラパマイシン増殖したＴｒｅｇを使用して、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の作用を調べた。ラパマイシンはインビトロでＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇの増殖を促進し、その結果生じる拡大したＴｒｅｇはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制することが以前に報告されている（例えば、Ｂａｔｔａｇｌｉａｅｔａｌ．（２００６）ＲａｐａｍｙｃｉｎｐｒｏｍｏｔｅｓｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓｏｆｂｏｔｈｈｅａｌｔｈｙｓｕｂｊｅｃｔｓａｎｄｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｉｃｐａｔｉｅｎｔｓ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１７７（１２）８３３８−８３４７、およびＳｔｒａｕｓｓｅｔａｌ．（２００７）ＳｅｌｅｃｔｉｖｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｎａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇｈｕｍａｎＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｒａｐａｍｙｃｉｎ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１７８（１）３２０−３２９）。したがって、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＨｕｍａｎＴＣｅｌｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＫｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用したネガティブ選択により、２人のドナー（ドナー２１および２３）のヒトＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した。Ｔｒｅｇを、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎仔血清＋０．１μｇ／ｍｌラパマイシン＋５００Ｕ／ｍｌＩＬ−２で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ＨｕｍａｎＴｒｅｇＥｘｐａｎｄｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を使用して１〜４日間拡大させた。Ｔｒｅｇを０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）でコーティングしたＴ７５フラスコに移し、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清＋０．１μｇ／ｍｌラパマイシン＋１００Ｕ／ｍｌＩＬ−２＋０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８ｍＡｂで培養した。実験は、ＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の初回の濃縮から少なくとも８日後に行われた。１．５×１０^５個のラパマイシンで培養したＴｒｅｇを、抗ＣＤ３コーティングプレート（０．５μｇ／ｍＬＯＫＴ３）上で３７℃で４日間、指示濃度の指定試験物質とともにインキュベートした。４日目に、細胞をＦＡＣＳにより分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＫｉ６７の割合を、それぞれドナー２１および２３について図６９Ａ〜６９Ｂに示す。ドナー２１および２３についてＣＤ４＋細胞数をそれぞれ図７０Ａ〜Ｂに示す。ＣＤ２５ＭＦＩは、ドナー２１および２３についてそれぞれ図７１Ａ〜Ｂに示されている。

データは、組み換えヒトＩＬ−１５が最も強固なＴｒｅｇの増殖を誘導することを示す。ＸＥＮＰ２２８２２およびＸＥＮＰ２４０１４はｒｈＩＬ−１５と比較してＴｒｅｇの増殖をそれほど誘発しないが、ＣＤ８標的化効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ融合体のＸＥＮＰ２４１１６は、Ｔｒｅｇの増殖の最も弱い誘発剤である。

３Ｅ：抑制アッセイでのＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５Ｆｃ融合体によるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導
Ｔｒｅｇの存在下でＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞、ＣＤ４＋レスポンダーＴ細胞、およびＮＫ細胞の増殖に対する、ＣＤ８標的化効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｎ６１Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ融合体（ＸＥＮＰ２４１１５）、ならびにワンアーム効力低下型ｓｃＩＬ−１５（Ｎ６１Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ融合体（ＸＥＮＰ２４０１３）の作用を調べた。

ＣＦＳＥ標識化ＰＢＭＣを、抗抗ＣＤ３コーティングプレート（ＯＫＴ３、１００ｎｇ／ｍＬ）上で、５００ｎｇ／ｍＬの指定の試験物質および指定濃度のＴａｇ−ｉｔＶｉｏｌｅｔ標識化Ｔｒｅｇ（実施例２Ｃに記載のとおり拡大）とともにインキュベートした。３７℃で４日間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳで分析し、増殖をＣＦＳＥで測定した。図７２Ａ〜７２Ｃに示すデータはそれぞれ、増殖中のＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞およびＮＫ細胞の割合について示す。図７３は、異なるＴｒｅｇ：ＰＢＭＣ比を使用した同様の実験でのＴｒｅｇ数を示す。

データは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、ＣＤ８＋レスポンダーＴ細胞の増殖を増加させ、増殖を抑制するためにより多くのＴｒｅｇが必要であることを示す。データはまた、ＸＥＮＰ２４１１５もＸＥＮＰ２４０１３もＣＤ４＋レスポンダーＴ細胞の増殖に影響を与えなかったことを示す。ただし、どちらもＮＫ細胞の増殖を誘発した。特に、図７３は、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体がＴｒｅｇの増殖を依然として誘導する一方で（処理なしの対照と比較して）、その誘導はワンアームｓｃＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃによる処理から生じる誘導よりも実質的に少ないことを示す。

さらなる実験では、Ｔｒｅｇの存在下でＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体で処理した後のＣＤ８＋メモリーＴ細胞、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞、およびＴｒｅｇの増殖に対する用量反応を調べた。１×１０^５個のＣＦＳＥ標識化ＰＢＭＣおよび５×１０^４個のＴａｇ−ｉｔＶｉｏｌｅｔ標識化Ｔｒｅｇ（実施例３Ｄに記載の拡大、Ｔｒｅｇ：ＰＢＭＣ比１：２）を、抗ＣＤ３コーティングプレート（ＯＫＴ３、１００ｎｇ／ｍＬ）で、４日間、対照の抗ＲＳＶ二価ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１５０７４）を含む指定濃度の指定試験物質とともにインキュベートした。増殖は、ＣＦＳＥまたはＴａｇ−ｉｔＶｉｏｌｅｔ希釈により測定した。図７４Ａ〜７４Ｃに示すデータはそれぞれ、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞、およびＴｒｅｇについて示す。最後に、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体による処理後、ＰＢＭＣの非存在下でのＴｒｅｇの増殖に対する投与反応を調査した。１×１０^５個のＴａｇ−ｉｔＶｉｏｌｅｔ標識化Ｔｒｅｇを、抗ＣＤ３コーティングされたプラーク（ＯＫＴ３、１００ｎｇ／ｍＬ）上で、指示濃度の指定試験物質とともに４日間インキュベートした。図７５に示す細胞数は、Ｔａｇ−ｉｔＶｉｏｌｅｔ希釈によって測定された。

データは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、試験したすべての濃度でワンアームｓｃＩＬ−１５／Ｒα−ＦｃよりもＣＤ８＋メモリーＴ細胞の増殖を誘導したことを示す。特に、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ワンアームｓｃＩＬ−１５／Ｒα−ＦｃよりもＣＤ４＋メモリーＴ細胞およびＴｒｅｇの増殖が少ない。

３Ｆ：ＧＶＨＤモデルにおけるプロトタイプＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５Ｆｃ融合体の活性
ＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（ＸＥＮＰ２４１１６）および追加の効力低下型ＩＬ−１５バリアントを、雌性ＮＳＧ（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ）免疫不全マウスで実施した移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルで評価した。ＮＳＧマウスにヒトＰＢＭＣを注射したとき、ヒトＰＢＭＣはマウス細胞に対して自己免疫応答を引き起こす。ＮＳＧマウスにヒトＰＢＭＣを注射した後にＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体、ＩＬ−１５バリアントによる処理は、移植されたＴ細胞の増殖を増強する。

７日目に１０００万個のヒトＰＢＭＣをＩＶ−ＯＳＰによってＮＳＧマウスに移植し、続いて０日目に指定の試験物質（０．３ｍｇ／ｋｇ）を投与した。全血を４日目および７日目に採取し、マウスを１１日目に脾臓のために屠殺して、ＦＡＣＳを使用してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数を測定した。図７６Ａ〜７６Ｄはそれぞれ、４日目の全血中のＣＤ４＋Ｔ細胞現象、ＣＤ８＋Ｔ細胞現象、ＣＤ８＋Ｔ細胞現象とＣＤ４＋Ｔ細胞現象との間の相関、およびＣＤ８＋Ｔ細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。図７７Ａ〜７７Ｄはそれぞれ、７日目の全血中のＣＤ４＋Ｔ細胞現象、ＣＤ８Ｔ細胞現象、ＣＤ８＋Ｔ細胞現象とＣＤ４＋Ｔ細胞現象との間の相関、およびＣＤ８＋Ｔ細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞細胞比を示す。図７８Ａ〜７８Ｄはそれぞれ、８日目の脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞現象、ＣＤ８Ｔ細胞現象、ＣＤ８＋Ｔ細胞現象とＣＤ４＋Ｔ細胞現象との相関、およびＣＤ８＋Ｔ細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示す。各点は１匹のメスのＮＳＧマウスを表す。データは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を拡大するＩＬ−１５バリアントと比較して、ＸＥＮＰ２４１１６がＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大することを示す。

３Ｇ：代替フォーマットのＣＤ８標的化ＩＬ−１５Ｆｃ融合体
図５７（略画）および図７９（配列）に示すように、いくつかの代替フォーマットのＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体を細胞増殖アッセイで試験した。ヒトＰＢＭＣは、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４７、およびＸＥＮＰ２４５４８で処理された。処理の３日後、ＰＢＭＣをＦＡＣＳで分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞に対するＫｉ６７の割合を図８０に示す。

実施例４：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（非ブロッキングＣＤ８結合ドメイン）
４Ａ：ファージディスプレイライブラリーおよびＣＤ８バインダーのスクリーニング
組み換えヒトＣＤ８αおよびカニクイザルＣＤ８αは、ファージパニングのために自家生成された。抗原をコードするプラスミドは、ｐＴＴ５ベクターのＧｉｂｓｏｎアセンブリにより構築した。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞の一過性トランスフェクション後、分泌された抗原はプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。

自家製の新規ファージライブラリーを構築してファージコートタンパク質ｐＩＩＩ上にＦａｂバリアントを表示し、４回パニングした。初回の前および各回の後に、ファージを対数期のＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）に加え、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。ＦａｂクローンをそのＶＨおよびＶＬ同一性について配列決定し、そこからギブソンアセンブリによりプラスミドを構築し、ＩｇＧ１定常領域のコード配列を含むｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅにトランスフェクトし、得られた二価ｍＡｂをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して上清から精製した。例示的なクローン１Ｃ１１Ｂ３のアミノ酸配列は、図８１の二価ｍＡｂ（ＸＥＮＰ２４０２５）およびワンアームｍＡｂ（ＸＥＮＰ２４３２１）に示す。

４Ｂ：ファージディスプレイライブラリーとＣＤ８バインダーのスクリーニング
ワンアームＦａｂ−Ｆｃ抗体（それぞれＸＥＮＰ２４３２１）として再フォーマットされたファージクローン１Ｃ１１Ｂ３を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞への結合について試験した。ＸＥＮＰ１５２５１のバリアントに基づくワンアームＦａｂ−Ｆｃ抗体（ＸＥＮＰ２４３１７、図６５に示す配列）を対照として使用した。

ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＨｕｍａｎＴＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、ヒトＰＢＭＣから精製したＴ細胞を、氷上で１時間、指定濃度の試験物質とインキュベートした。細胞を遠心分離して過剰量の試験物質を除去し、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＨＩＴ３ａ）、抗ＣＤ４−ＰＥ（ＯＫＴ４）、およびＡＰＣと結合した二次抗体で再懸濁し、氷上で４５分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、染色緩衝液で再懸濁し、ＦＡＣＳで分析した。図８２は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＭＦＩを示す。データは、ＣＤ８＋Ｔ細胞へのＸＥＮＰ２４３２１の結合がＸＥＮＰ２４３１７よりも優れていることを示した。

４Ｂ：ＣＤ８とｐＭＨＣＩとの相互作用をブロックしない抗ＣＤ８ｍＡｂの同定
腫瘍細胞は、ＴＣＲ（ペプチドに特異的）およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ８によって認識されるペプチドフラグメントを提示する主要組織適合性複合体クラスＩ分子（ＭＨＣＩ）を提示する（図８３Ａに示すとおり）。ＣＤ８のｐＭＨＣＩへの結合は、Ｔ細胞の増殖と活性化を引き起こす。抗ＣＤ８抗体は、ＣＤ８によるｐＭＨＣＩの結合をブロックし、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を妨げるように配置するＣＤ８上のエピトープに結合し得る（図８３Ｂ）。活性化を維持するために、ＣＤ８−ＭＨＣＩ相互作用を遮断しない、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体に抗ＣＤ８アームを使用する必要がある。

４Ｃ（ａ）：ＭＨＣテトラマーアッセイ
ＭＨＣテトラマーアッセイを使用して、上述の抗ＣＤ８ｍＡｂクローンがＣＤ８とｐＭＨＣＩの相互作用をブロックしたかどうかを調べた。ＨＬＡ−Ａ２＊０２０１制限ＣＭＶｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチド（ＡｓｔａｒｔｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．からのドナー１５３）に特異的な約２００ｋのＴ細胞を、指定濃度の指定の試験物質とともに氷上で３０分間プレインキュベートした。抗ＣＤ８抗体なしでインキュベートした対照試料も使用した。インキュベーション後、試料をｉＴＡｇＴｅｔｒａｍｅｒ／ＰＥ−ＨＬＡ２：０１ＣＭＶｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）（ＭＢＬ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ．）、抗ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＴＨ−１）、および抗ＣＤ４−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＯＫＴ４）で１．５時間染色し、ＦＡＣＳによって分析した。細胞はまずＣＤ３およびＣＤ４発現に基づいてゲートされ、ＣＤ８＋細胞を同定した。ＣＤ３＋細胞上のＭＨＣテトラマーの結合をＰＥＭＦＩとして測定した。データは、対照試料に対する結合の割合として図８４に示す。

データは、市販のＯＫＴ８ｍＡｂ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．およびＸＥＮＰ１５０７５として自家製された）とのプレインキュベーションにより、対照試料と同等のＭＨＣテトラマー結合が可能になり、他の市販のｍＡｂであるＳＫ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、３２−Ｍ４（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘ．）、およびＤＫ２５（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ．）では結合が１５〜８０％減少したことを示し、これはＣｌｅｍｅｎｔらにより報告された結果と一致している。ＸＥＮＰ１５２５１とのプレインキュベーションにより、ＭＨＣテトラマー結合が５０％以上減少した。特に、ＸＥＮＰ２４０２５（１Ｃ１１Ｂ３）とのプレインキュベーションはＭＨＣテトラマー結合を約４％減少させ、クローン１Ｃ１１Ｂ３が非ブロッキングであることを示唆する。

４Ｃ（ｂ）：サイトカイン放出アッセイ
上述のとおり、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴＣＲおよびＣＤ８のｐＭＨＣＩへの結合がＴ細胞を活性化し、サイトカイン放出をもたらす。したがって、サイトカイン放出アッセイにおいて、抗ＣＤ８ｍＡｂクローンがＣＤ８とｐＭＨＣＩとの相互作用をブロックするかどうかも調査した。

Ｔ２細胞に５０ｎｇ／ｍｌＨＬＡ−Ａ２＊０２０１制限ＣＭＶｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドを室温で一晩ロードした。陰性対照として、Ｔ２細胞にＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを負荷した。一晩ロードした後、Ｔ２細胞をマイトマイシン−Ｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）で３７℃で３０分間処理した。ＨＬＡ−Ａ２^＊０２０１制限ＣＭＶｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドに特異的な５０ｋのＴ細胞を、１００μｇ／ｍｌの指定の試験物質で（二重に）プレインキュベートした。次いで、１０ｋペプチドをロードしたＴ２細胞を試料に加え、３７℃で１８時間インキュベートした。抗ＣＤ８プレインキュベーションなしの対照は次のとおりだった。Ａ）ＣＭＶ特異的Ｔ細胞とインキュベートしたｐｐ６５ペプチドをロードしたＴ２細胞、Ｂ）ＣＭＶ特異的Ｔ細胞とインキュベートしたＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドをロードしたＴ２細胞、Ｃ）ＣＭＶ特異的Ｔ細胞とインキュベートしたアンロードＴ２細胞、およびＤ）ＣＭＶ特異的Ｔ細胞のみ。上清をを回収し、ＩＦＮγ ＭＳＤアッセイ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）で分析した。

図８５に示すデータは、ＯＫＴ８およびＸＥＮＰ２４０２５とともにプレインキュベートしたＣＭＶ特異的Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出が、抗ＣＤ８抗体プレインキュベーションの非存在下でＣＭＶ特異的Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出と同等であったことを示すが、ＸＥＮＰ１５２５１と同様に市販の抗体ＳＫ−１、３２−Ｍ４、およびＤＫ２５とともにプレインキュベートしたＣＭＶ特異的Ｔ細胞ではＩＦＮγ放出の減少が観察された。さらに、ＸＥＮＰ２４０２５とプレインキュベートしたＣＭＶ特異的Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出は、抗ＣＤ８抗体プレインキュベーションの非存在下でのＣＭＶ特異的Ｔ細胞による放出と同等であった。図８６は、ＩＦＮγ放出とテトラマー結合ＭＦＩとの間の相関関係を示す。

４Ｄ：１Ｃ１１Ｂ３を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりもＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を選択的に誘導する
ヒトＰＢＭＣを、ＸＥＮＰ２４７３６（１Ｃ１１Ｂ３を含むＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ、図８７に示す配列）、ＸＥＮＰ２４０５０（ワンアーム効力低下型ＩＬ−１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４３２１（１Ｃ１１Ｂ３に基づくワンアーム抗ＣＤ８ｍＡｂ）、およびＸＥＮＰ２０８１８（ＷＴＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ）を用いて、指定濃度で３７℃で３日間処理した。次に、ＰＢＭＣを氷上で４５分間、抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＲＰＡＴ８またはＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ｅＦ６６０（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０（ＨＩ１００）、および抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（５．１Ｈ１）で染色した。前述のパネルで染色した後、細胞を室温で３０分間抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、種々の細胞集団およびＫｉ６７の発現についてＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７を発現するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示すデータを図８８に示す。データは、ワンアーム効力低下型ＩＬ１５／Ｒα−ＦｃＸＥＮＰ２４０５０と比較して、１Ｃ１１Ｂ３によるＣＤ８ターゲティングがＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進することを示す。

実施例５：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５Ｆｃ融合体（ＯＫＴ８系）
５Ａ：ＯＫＴ８のヒト化
先行技術の抗ＣＤ８抗体ＯＫＴ８（ＯＫＴ８＿Ｈ０．１およびＯＫＴ８＿Ｌ０．１として図８９に示される可変領域配列）は、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５分子で使用するためのＦａｂの関連で操作された。ＯＫＴ８は、ストリング含有量最適化を用いてヒト化した（例えば、２０１０年２月２日に発行された米国特許第７，６５７，３８０号を参照）。例示的なヒト化ＯＫＴ８クローンの可変重鎖および軽鎖配列を図８９に示す。上述のとおり、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ヘテロダイマー定常領域のコード配列とともに、前述のＶＨおよびＶＬ配列をコードするギブソン構築プラスミドを使用して作成された（図９に示すとおり）。タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞での一過性トランスフェクションによって生成され、プロテインＡクロマトグラフィーとそれに続くイオン交換クロマトグラフィーを含む２段階精製プロセスによって精製された。マウスまたはヒト化ＯＫＴ８可変領域に基づく抗ＣＤ８Ｆａｂアームを含む例示的なＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の配列を図９２に示す。

５Ａ（ａ）：ＯＫＴ−８系のＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりもＣＤ８^＋Ｔ細胞の選択的に増殖させる
ヒトＰＢＭＣを、マウスＯＫＴ８またはヒト化ＯＫＴ８の２つのバージョン（Ｈ１Ｌ１およびＨ２Ｌ１）に基づいて、ＣＤ８結合ドメインを含むＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ二重変異体およびＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ三重変異体）で、指定濃度で３７℃で３日間で処理した。処置後、ＰＢＭＣを氷上で４５分間、抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＲＰＡＴ８またはＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ｅＦ６６０（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、および抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＮＣＡＭ１６．２）で染色した。パネルで染色した後、細胞を室温で３０分間、抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、種々の細胞集団およびＫｉ６７の発現についてＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７を発現するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示すデータを図９３に示す。データは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体のそれぞれが、対照ＸＥＮＰ２０８１８と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞に対して選択的であることを示す。予想外に、ＸＥＮＰ２４９１７（ＯＫＴ８＿Ｈ１Ｌ１）は、ＸＥＮＰ２４９１９（マウスＯＫＴ８）と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導する効力が低かった。特に、ＸＥＮＰ２４９１８（代替のヒト化ＯＫＴ８＿Ｈ２Ｌ１を有する）は、ＸＥＮＰ２４９１７と同様の効力を回復した。さらに、三重変異体およびＯＫＴ＿Ｈ２Ｌ１抗ＣＤ８ＦａｂアームでＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ効力を低下させたＸＥＮＰ２５１３７は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導においてＸＥＮＰ２４９１８よりも強力だが、ＸＥＮＰ２５１３７はＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の誘導においてＸＥＮＰ２４９１８よりも強力だった。

５Ａ（ｂ）：ＯＫＴ８系ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおいてインビボでＴ細胞を増殖させ、サイトカイン分泌を促進する
８日目に１０００万個のヒトＰＢＭＣをＩＶ−ＯＳＰによってＮＳＧマウスに移植し、続いて０日目に指定濃度で指定の試験物質を投与した。図９４Ａ〜Ｂはそれぞれ、７日目のＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞数を示す。データは、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比で示されるように、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に増殖することを示す。特に、データは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択性が、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体と抗ＣＤ８の作用の組み合わせではなく、ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体の標的化によることを示す（ＸＥＮＰ２４０５０とＸＥＮＰ２４９２０の組み合わせで示すとおり）。

５Ｂ：カニクイザルＣＤ８親和性のためのＯＫＴ８操作
臨床開発を容易にするために、カニクイザルの薬力学、薬物動態、および毒性など、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質の様々なパラメーターを評価することは有用である。しかしながら、１つの例示的なヒト化ＯＫＴ８バリアント（Ｈ２Ｌ１）は、ヒトＣＤ８に対する１２ｎＭＫＤ親和性と比較して、カニクイザルＣＤ８に対する２００ｎＭＫＤ親和性のみを有していた。したがって、ＯＫＴ８＿Ｈ２Ｌ１（以下ＨｕＣｙＯＫＴ８と呼ぶ）に基づいたバリアントのライブラリーは、ヒトおよびカニクイザルの両方のＣＤ８と同様の親和性を持つように操作された。ライブラリーは、部位特異的突然変異誘発法（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣｅｄａｒＣｒｅｅｋ，Ｔｘ．）または標準的な遺伝子合成によって構築された。バリアント重可変領域およびバリアント軽可変領域の配列を図９５に示す。バリアント可変領域に基づくワンアームｍＡｂは、ヘテロダイマーＦｃに結合した重可変領域と、分子の他方側が「Ｆｃのみ」であり、軽定常領域に結合した軽可変領域とともに生成された。そのようなワンアームｍＡｂの例示的な配列を図９１に示す。

ヒトおよびカニクイザルＣＤ８のＨｕＣｙＯＫＴ８バリアントに基づくワンアームｍＡｂの親和性を、ＢｉｏＬａｙｅｒＩｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）ベースの方法であるＯｃｔｅｔで評価した。Ｏｃｔｅｔの実験工程は、一般的に以下を含んでいた。試験物質の親和性を決定するための、固定化（バイオセンサー上へのリガンドの捕捉）、会合（分析物の連続希釈物を含むウェルにリガンドコーティングしたバイオセンサーの浸漬）、解離（緩衝液を含むウェルにバイオセンサーを戻すこと）。緩衝液のみを含む参照ウェルもまた、データ処理中のバックグラウンド補正のための方法に含まれた。特に、ヒトまたはカニクイザルのＣＤ８を捕捉し、複数の濃度のＯＫＴ８バリアントに浸漬した。得られた解離定数（Ｋ_Ｄ）、会合速度（ｋ_ａ）、および解離速度（ｋ_ｄ）を図９６に示す。データは、多数のバリアントがＯＫＴ＿Ｈ２Ｌ１と比較してカニクイザルＣＤ８に対する親和性を改善した一方で、いくつかのバリアントのみがヒトおよびカニクイザルＣＤ８の両方に対して同様の親和性を示したことを示す。

５Ｃ：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（ＨｕＣｙＯＫＴ８）は、ヒトＴ細胞の増殖において活性である
ＨｕＣｙＯＫＴ８可変領域に基づく抗ＣＤ８Ｆａｂアームを含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、実施例５Ａに一般的に記載されているように産生され、例示的な分子の配列は図９７および図１０２に示されている。

５Ｃ（ａ）：ＨｕＣｙＯＫＴ８を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体はインビトロで活性である
ヒトＰＢＭＣを、例示的なＨｕＣｙＯＫＴ８結合ドメインを含むＣＤ８標的化効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃおよびワンアーム効力低下型ＩＬ−１５／Ｒα−ＦｃＸＥＮＰ２４０５０（対照として）で、指定濃度で３７℃で３日間、処理した。処置後、ＰＢＭＣを氷上で４５分間、抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ＰＥ／Ｃｙ７（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、および抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＮＣＡＭ１６．２）で染色した。パネルで染色した後、細胞を室温で３０分間、抗Ｋｉ６７−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｋｉ−６７）で染色し、種々の細胞集団およびＫｉ６７の発現についてＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７を発現するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示すデータを図９８に示す。データは、ＣＤ８標的化分子（ＨｕＣｙＯＫＴ８結合ドメインを持つ分子を含む）のそれぞれが、ＸＥＮＰ２４０５０よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導に強力であったことを示す。

別の実験では、新鮮なＰＢＭＣを、指定の試験物質とともに指定濃度で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＲＰＡ−Ｔ４）、および抗ＣＤ８−Ａｌｅｘａ７００（ＳＫ１）で室温で３０〜４５分間染色した。細胞を洗浄し、予め冷却した（−２０℃）９０％メタノールとともに２０〜６０分間インキュベートした。メタノールインキュベーション後、細胞を再度洗浄し、抗ＣＤ２５−ＢＶ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ５１０（ＨＩ１００）、抗ＦｏｘＰ３−Ａｌｅｘａ４８８（２５９Ｄ）、抗ＣＤ５６−ＰＥ、および抗ｐＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ６４７（ｐＹ６９４）で室温で１時間染色し、様々な細胞集団およびＳＴＡＴ５リン酸化を標識した。最初にリンパ球を側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）に基づいてゲートした。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ３およびＣＤ４発現に基づいてゲートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団を、ＴｒｅｇのＦｏｘＰ３およびＣＤ２５発現と同様に、ＣＤ４５ＲＡ発現に基づいてさらにゲートした。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ８発現に基づいてゲートし、亜集団を、ＣＤ４５ＲＡ発現に基づいてさらにゲートした。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞でのＳＴＡＴ５リン酸化を示すデータを図９９に示す。Ｋｉ６７を発現する細胞の割合を示す上記のデータと一致して、ＨｕＣｙＯＫＴ８系ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞に対して選択的である。

５Ｃ（ｂ）：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体（ＨｕＣｙＯＫＴ８）は、ＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスでインビボでＣＤ８^＋Ｔ細胞を選択的に拡大する
８日目に１０００万個のヒトＰＢＭＣをＩＶ−ＯＳＰによってＮＳＧマウスに移植し、続いて０日目に指定濃度で指定の試験物質を投与した。図１００は、７日目のマウス血液中のＣＤ４５＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞数（ならびにＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比）を示す。データは、ＨｕＣｙＯＫＴ８を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、ＣＤ４５＋細胞およびＴ細胞の拡大において、ＯＫＴ８＿Ｈ２Ｌ１を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃと同様の活性を示した。重要なことに、ＨｕＣｙＯＫＴ８を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的拡大を保持した。

５Ｄ：ＯＫＴ８系ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体はカニクイザルＴ細胞の増殖において活性である
次に、ＨｕＣｙＯＫＴ８結合ドメインを含む上記のＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、カニクイザルリンパ球を増殖できるかどうかを調べた。ＣｙｎｏＰＢＭＣを指定の試験物質とともに４日間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＰＥ（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８α−ＢＶ５１０（ＳＫ１）、抗ＣＤ８β−ＰＥ／Ｃｙ７（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ１６−ＢＶ４２１（３Ｇ８）、抗ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＨＩ１００）、および抗ＣＤ５６−ＢＶ６０５（ＮＣＡＭ１６．２）で氷上で４５分間染色した。パネルで染色した後、細胞を室温で３０分間、抗Ｋｉ６７−ＡＰＣ（Ｋｉ−６７）で染色し、種々の細胞集団およびＫｉ６７の発現についてＦＡＣＳによって分析した。Ｋｉ６７を発現するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示すデータを図１０１に示す。データは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体のそれぞれがカニクイザルＴ細胞を増殖させることができたことを示す。実施例５Ａ（ａ）に示すデータと一致して、ＣＤ８標的化分子はＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞に対して選択的であった。

実施例６：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇよりもＣＤ８^＋Ｔ細胞に対して選択的である
６Ａ：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、インビトロでＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇよりもＣＤ８^＋Ｔ細胞を選択的に拡大する
ヒトＰＢＭＣを、指定の試験物質とともに３７℃で、２、５、１０、１５、３０、６０、１８０、および３６０分間インキュベートした。タイミングは、すべての反応が同時に停止されるように、異なる時間に試験物質を追加することで達成した。インキュベーション後、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＢＵＶ３９５（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＲＰＡ−Ｔ４）、および抗ＣＤ８−Ａｌｅｘａ７００（ＳＫ１）で室温で３０〜４５分間染色した。細胞を洗浄し、予め冷却した（−２０℃）９０％メタノールとともに２０〜６０分間インキュベートした。メタノールインキュベーション後、細胞を再度洗浄し、抗ＣＤ２５−ＢＶ５１０（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ５１０（ＨＩ１００）、抗ＦｏｘＰ３−Ａｌｅｘａ４８８（２５９Ｄ）、および抗ｐＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ６４７で染色し、様々な細胞集団およびＳＴＡＴ５リン酸化を標識した。最初にリンパ球を側方散乱（ＳＳＣ）および前方散乱（ＦＳＣ）に基づいてゲートした。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ３およびＣＤ４発現に基づいてゲートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団を、ＴｒｅｇのＦｏｘＰ３およびＣＤ２５発現と同様に、ＣＤ４５ＲＡ発現に基づいてさらにゲートした。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ８発現に基づいてゲートし、亜集団を、ＣＤ４５ＲＡ発現に基づいてさらにゲートした。様々な集団でのＳＴＡＴ５リン酸化を示すデータを図１０３に示す。データは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が、Ｔｒｅｇを含むＣＤ４＋Ｔ細胞を回避しながらＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させることを示し、ＣＤ８標的化分子は、ＷＴＩＬ−１５ならびにＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して選択的であることを示す。特に、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ（ＸＥＮＰ２６５８５）の濃度がはるかに高いと、組み換えＩＬ−１５およびＷＴＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体ＸＥＮＰ２０８１８と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇのＳＴＡＴ５リン酸化のベースラインレベルが刺激された。

６Ｂ：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、カニクイザルのＣＤ４^＋Ｔ細胞よりもＣＤ８^＋Ｔ細胞を選択的に拡大する
次に、カニクイザルのＴ細胞を拡大する際に、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体のインビボ作用を調べた。カニクイザル（１グループあたり３匹）に指定の試験物質を０日目に投与し、３週間モニターした。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の倍率変化を示すデータを図１０４に示す。Ｋｉ６７発現陽性の末梢血中のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の割合を示すデータを図１０５に示す。リンパ節のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞に対するＫｉ６７の割合を示すデータを図１０６に示す。実施例５Ｄに示すカニクイザルＰＢＭＣの拡大に関するインビトロデータ、ならびにＰＢＭＣ移植マウスにおけるヒトＰＢＭＣの拡大に関するインビトロデータと一致して、ここでのデータは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が選択的にＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大させていることを示す。

実施例７：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は薬力学の増強を示す
カニクイザルの後続試験では、Ｘｔｅｎｄ（ＸＥＮＰ２４２９４、図４０に示す配列）を含むワンアームｓｃＩＬ−１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−ＦｃおよびＸｔｅｎｄ（ＸＥＮＰ２６５８５、図１０２に示す配列）を含むＣＤ８標的化ＩＬ−１５（Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ）／Ｒα−Ｆｃを調査した。１日目と１６日目にカニクイザル（１グループあたり３匹）に試験物質を投与し、Ｔ細胞の拡大を調べるために経時的に採血した。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞数、ならびにＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を示すデータを図１０７に示す。実施例６Ｂに示す試験と一致して、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大し、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を高めた。特に、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、より長間のＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大によって示されるワンアーム分子よりも薬力学が改善された。

実施例８：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５Ｆｃ融合体は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の同種異系抗腫瘍活性を増強する（インビトロ）
製造元の指示に従って、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＨｕｍａｎＴＣｅｌｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＫｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣ（ＣＭＶ＋ＨＬＡ−Ａ０２０１）から精製した。精製Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ標識化親ＭＣＦ−７腫瘍細胞（この実施例ではグループ１と指定）またはＣＦＳＥ標識化ｐｐ６５発現ＭＣＦ−７腫瘍細胞（この実施例ではグループ１と指定）を１９：１のＥ：Ｔ比で、指定の試験物質とともにを４日間インキュベートした。３日目に、ブレフェルジンＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）および抗ＣＤ１０７ａ−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＬＡＭＰ−１）を細胞に加えた。インキュベーション後、細胞をＺｏｍｂｉｅＡｑｕａ（商標）ＦｉｘａｂｌｅＶｉａｂｉｌｉｔｙＫｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて室温で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、抗ＣＤ４−ＡＰＣ／ｅＦｌｕｏｒ７８０（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８ｂ−ＰＥ／Ｃｙ７（ＳＩＤＩ８ＢＥＥ）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（Ｍ−Ａ２５１）、および抗ＣＤ６９−ＢＶ６０５（ＦＮ５０）を使用して、氷上で１時間染色した。細胞を再度洗浄し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｏｘｐ３／ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＳｔａｉｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒＳｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を使用して、抗ＩＦＮγ−ＢＶ４２１（４Ｓ．Ｂ３）および抗Ｋｉ６７−ＡＰＣで染色した。様々な細胞集団について、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。標的細胞はＣＦＳＥ染色に基づいて同定され、死亡標的細胞はＺｏｍｂｉｅ染色に基づいて同定された。エフェクター細胞（ＣＦＳＥ−）は、ＣＤ４およびＣＤ８の発現に基づいてゲートした。

Ｋｉ６７はタンパク質の増殖と厳密に関連するタンパク質であるが、Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生は細胞溶解活性を示す。図１０８Ａ〜１０８Ｂはそれぞれ、２つのグループにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＦＮγ＋の割合を示す。図１０９Ａ〜１０９Ｂはそれぞれ、２つのグループにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のＫｉ−６７＋の割合を示す。図１１０Ａ〜１１０Ｂはそれぞれ、２つのグループにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のＫｉ−６７＋／ＩＦＮγ＋の割合を示す。図１１１Ａ〜１１１Ｂはそれぞれ、２つのグループにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮγ＋の割合を示す。図１１２Ａ〜１１２Ｂはそれぞれ、２つのグループにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＫｉ−６７＋の割合を示す。図１１３Ａ〜１１３Ｂはそれぞれ、２つのグループにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＫｉ−６７＋／ＩＦＮγ＋の割合を示す。図１１４Ａ〜１１４Ｂはそれぞれ、２つのグループの残りの標的細胞（ｐｐ６５を形質導入したＭＣＦ−７または親ＭＣＦ−７のいずれか）を示す。全体として、データは、本発明のＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体が腫瘍細胞の同種異系殺滅を増強するだけでなく、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体がＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に拡大することを示す。

実施例９：ＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合体は、インビボでＴ細胞の同種異系抗腫瘍作用を増強し、チェックポイント遮断と相乗的に結びつく
次に、本発明のＣＤ８標的化ＩＬ−１５／Ｒα−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ抗腫瘍作用、ならびにそれらがチェックポイント遮断とのスタッキングに適しているかどうかを調べた。使用したチェックポイント遮断抗体は、ＸＥＮＰ１６４３２（エフェクター機能が除去されたニボルマブに基づく二価抗ＰＤ−１ｍＡｂであり、図１２に示された配列）である。ＮＯＤＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス（１グループあたり１０匹）に、１４日目に、背腹部に３×１０^６個のｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７細胞を皮内移植した。０日目に、マウスに、Ｔ細胞ｐｐ６５反応性（または対照マウスのＰＢＳ）に対して陽性とスクリーニングされたＨＬＡ適合ＣＭＶ＋ドナーからの５×１０^６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内に移植した。マウスを指定の試験物質またはＰＢＳ（対照マウス用）で４週間（合計４回）投与した。腫瘍体積はキャリパー測定によりモニターされ、そのデータを図１１５Ａ〜１１５Ｂに示す（初回投与後の日数）。図１１６Ａ〜１１６Ｅに示すように、７、１２、１９、および２６日目に採血し、フローサイトメトリーで分析して、様々なリンパ球集団を数えた。

上記は、単に本発明の原理を説明するに過ぎない。当業者は、本明細書で明示的に説明または図示されていないが、本発明の原理を具体化し、その主旨および範囲内に含まれる様々な構成を考案できることを理解されたい。さらに、本明細書に列挙されるすべての例および条件付き言語は、主に、そのような具体的に列挙される例および条件に限定されない本発明の原理を読者が理解するのを助けることを意図している。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態ならびにその特定の例を列挙する本明細書のすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図している。さらに、そのような等価物には、現在知られている等価物および将来開発される等価物、つまり構造に関係なく同じ機能を実行する開発された任意の要素が含まれることが意図されている。したがって、本発明の範囲は、本明細書に記載され、示される例示的な実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲および主旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。上記の実施例は、当業者に本発明の組成物、システム、および方法の実施形態をどのように作製および使用するかについての完全な開示および説明を与えるために提供されており、そして本発明者らが自分たちの発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。当業者に明らかである本発明を実施するための上記の様式の修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書中で言及されているすべての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者の技術水準を示している。本開示において引用されたすべての参考文献は、あたかも各参考文献が参照によりその全体が個別に組み込まれているのと同程度に参照により組み込まれる。

すべての見出しおよびセクションの指定は、明確さおよび参照目的のためだけに使用されているにすぎず、決して限定的であるとみなされるべきではない。例えば、当業者は、本明細書に記載の本発明の趣旨および範囲に従って、必要に応じて異なる見出しおよびセクションからの様々な態様を組み合わせることの有用性を認識するであろう。

本明細書に引用されたすべての参考文献は、あたかも各個々の刊行物または特許または特許出願がすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されるのと同程度にそれらの全体がすべての目的のために本明細書に参照により組み込まれる。

当業者には明らかなように、本出願の趣旨および範囲から逸脱することなく、本出願の多くの修正および変形をなすことができる。本明細書に記載された特定の実施形態および実施例は例としてのみ提供され、特許請求の範囲が権利を与えられる同等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。

Claims

二機能性ヘテロダイマータンパク質であって、
ａ）ＩＬ−１５Ｒαタンパク質、ＩＬ−１５タンパク質、および第１のＦｃドメインを含むＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であって、
前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、第１のドメインリンカーを使用して前記ＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に共有結合し、前記ＩＬ−１５タンパク質が、第２のドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合しているか、または
前記ＩＬ−１５タンパク質が、第１のドメインリンカーを使用して前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、第２のドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質と、
ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む重鎖（ＶＨは可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）、ならびに可変軽鎖（ＶＬ）および軽定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖を含む抗原結合ドメインモノマーと、を含み、
前記第１のＦｃドメインおよび前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
前記抗原結合ドメインモノマーが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項１に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項１または２に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質が、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質および前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記二機能性ヘテロダイマータンパク質が、ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
ドメインリンカーを使用して前記ＩＬ−１５タンパク質または前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインをさらに含み、前記抗原結合ドメインが、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
二機能性ヘテロダイマータンパク質がＸＥＮＰ２４５４８である、請求項９に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
核酸組成物であって、
ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の前記ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項１〜１０のうちの一項に記載の前記抗原結合ドメインモノマーをコードする第２の核酸と、
ｃ）任意選択的に、請求項９に記載の前記抗原結合ドメインをコードする第３の核酸と、を含む、核酸組成物。
発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項１１に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項１１に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、
ｃ）任意選択的に、請求項１１に記載の前記第３の核酸を含む第３の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
請求項１２に記載の前記発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質を作製する方法であって、前記二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で請求項１３に記載の宿主細胞を培養することと、前記ヘテロダイマータンパク質を回収することと、を含む、方法。
二機能性ヘテロダイマータンパク質であって、
ａ）第１のタンパク質ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む融合タンパク質であって、前記第１のタンパク質ドメインが、ドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合している、融合タンパク質と、
ｂ）前記第１のタンパク質ドメインに非共有結合した第２のタンパク質ドメインと、
ｃ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む重鎖（ＶＨは可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）、ならびに可変軽鎖および軽定常ドメインを含む軽鎖を含む抗原結合ドメインモノマーと、を含み、
前記第１のＦｃドメインおよび前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
前記第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、前記第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含むか、または前記第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質を含み、前記第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質を含み、
前記抗原結合ドメインモノマーが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質がシステイン残基を含み、前記ＩＬ−１５タンパク質がシステイン残基を含み、それによりジスルフィド結合を形成する、請求項１５に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項１５または１６に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項１５〜１７のうちの１つに記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質が、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質および前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記二機能性ヘテロダイマータンパク質がＸＥＮＰ２５１３７である、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
１つ以上のドメインリンカーを使用して、前記ＩＬ−１５タンパク質および／または前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合した抗原結合ドメインをさらに含み、前記抗原結合ドメインが、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
核酸組成物であって、
ａ）請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の前記第２のタンパク質ドメインをコードする第２の核酸と、
ｃ）請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の前記抗原結合ドメインをコードする第３の核酸と、
ｄ）任意選択的に、請求項２４に記載の前記抗原結合ドメインをコードする第４の核酸と、を含む、核酸組成物。
発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項２５に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項２５に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、
ｃ）請求項２５に記載の前記第３の核酸を含む第３の発現ベクターと、
ｄ）任意選択的に、請求項２５に記載の前記第４の核酸を含む第４の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
請求項２６に記載の前記発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質を作製する方法であって、前記二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で請求項２７に記載の宿主細胞を培養することと、前記ヘテロダイマータンパク質を回収することと、を含む、方法。
二機能性ヘテロダイマータンパク質であって、
ａ）第１のＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む第１の重鎖（ＶＨは第１の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第１のＦｃドメインである）、ならびに第１の可変軽鎖および第１の軽定常ドメインを含む第１の軽鎖を含む、第１の抗原結合ドメインモノマーと、
ｂ）第２のＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３モノマーを含む第２の重鎖（ＶＨは第２の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３は第２のＦｃドメインである）、第２の可変軽鎖および第２の軽定常ドメインを含む第２の軽鎖、ならびに第１のドメインリンカーを使用して前記第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合している第１のタンパク質ドメインを含む、第２の抗原結合ドメインモノマーと、
ｃ）前記第２の抗原結合ドメインモノマーの前記第１のタンパク質ドメインに結合または非共有結合している第２のタンパク質ドメインと、を含み、
前記第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質であり、前記第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒタンパク質であるか、または前記第１のタンパク質ドメインがＩＬ−１５タンパク質であり、前記第２のタンパク質ドメインがＩＬ−１５Ｒαタンパク質であり、
前記第１のＦｃドメインおよび前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
前記第１の抗原結合ドメインモノマーおよび前記第２の抗原結合ドメインモノマーが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項２９に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項２９または３０に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質が、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）または配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質および前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記二機能性ヘテロダイマータンパク質がＸＥＮＰ２４５４６である、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
核酸組成物であって、
ａ）請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の前記第１の抗原結合ドメインモノマーをコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の前記第２の抗原結合ドメインモノマーをコードする第２の核酸と、
ｃ）請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の前記第２のタンパク質ドメインをコードする第３の核酸と、を含む、核酸組成物。
発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項３７に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項３７に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、
ｃ）請求項３７に記載の前記第３の核酸を含む第３の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
請求項３８に記載の前記発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質を作製する方法であって、前記二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で請求項３９に記載の宿主細胞を培養することと、前記ヘテロダイマータンパク質を回収することと、を含む、方法。
二機能性ヘテロダイマータンパク質であって、
ａ）ＩＬ−１５タンパク質、第１の抗原結合ドメイン、および第１のＦｃドメインを含む、ＩＬ−１５融合タンパク質であって、
前記第１の抗原結合ドメインが、第１のドメインリンカーを使用して前記ＩＬ−１５タンパク質のＮ末端に共有結合し、前記ＩＬ−１５タンパク質が、第２のドメインリンカーを使用して前記第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、前記抗原結合ドメインが、第１の可変重鎖ドメインおよび第１の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、ＩＬ−１５融合タンパク質と、
ｂ）ＩＬ−１５Ｒαタンパク質、第２の抗原結合ドメイン、および第２のＦｃドメインを含む、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質であって、
前記第２の抗原結合ドメインが、第３のドメインリンカーを使用して前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質のＮ末端に共有結合し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、第４のドメインリンカーを使用して前記第２のＦｃドメインのＮ末端に共有結合し、前記第２の抗原結合ドメインが、第２の可変重鎖ドメインおよび第２の可変軽鎖ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質と、を含み、
前記第１のＦｃドメインおよび前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＳ２６７Ｋ／Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ２６７Ｋ／Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、
前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される抗原に結合する、二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含むアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項４１に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記第１のＦｃドメインおよび／または前記第２のＦｃドメインが、ＥＵ付番によるＧ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなるアミノ酸置換の追加のセットを有する、請求項４１または４２に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質が、配列番号１（完全長ヒトＩＬ−１５）および配列番号２（成熟ヒトＩＬ−１５）のアミノ酸配列を有し、前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、配列番号３（完全長ヒトＩＬ−１５Ｒα）または配列番号４（ヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン）のアミノ酸配列を有する、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質および前記ＩＬ−１５Ｒαタンパク質が、それぞれ、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｐ９７／Ｃ９８、Ｅ８７Ｃ：Ｄ９６／Ｃ９７／Ａ９８、Ｖ４９Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｌ５２Ｃ：Ｓ４０Ｃ、Ｅ８９Ｃ：Ｋ３４Ｃ、Ｑ４８Ｃ：Ｇ３８Ｃ、Ｅ５３Ｃ：Ｌ４２Ｃ、Ｃ４２Ｓ：Ａ３７Ｃ、およびＬ４５Ｃ：Ａ３７Ｃからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ、Ｄ６１Ｎ、Ｎ６５Ｄ、およびＱ１０８Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記ＩＬ−１５タンパク質が、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５ＤまたはＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄのアミノ酸置換を含む、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
前記二機能性ヘテロダイマータンパク質がＸＥＮＰ２４５４７である、請求項４１〜４７のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質。
核酸組成物であって、
ａ）請求項４１〜４８のいずれか一項に記載の前記ＩＬ−１５融合タンパク質をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項４１〜４８のいずれか一項に記載の前記ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質をコードする第２の核酸と、を含む、核酸組成物。
発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項４９に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項４９に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
請求項５０に記載の前記発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
請求項４１〜４８のいずれか一項に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質を作製する方法であって、前記二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される条件下で請求項５１に記載の宿主細胞を培養することと、前記ヘテロダイマータンパク質を回収することと、を含む、方法。
ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される、二機能性ヘテロダイマータンパク質。
ＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される二機能性ヘテロダイマータンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む、核酸組成物。
１つ以上の発現ベクターを含み、前記１つ以上の発現ベクターがＸＥＮＰ２４１１４、ＸＥＮＰ２４１１５、ＸＥＮＰ２４１１６、ＸＥＮＰ２４５３１、ＸＥＮＰ２４５３２、ＸＥＮＰ２４５３３、ＸＥＮＰ２４５３４、ＸＥＮＰ２４５４３、ＸＥＮＰ２４５４６、ＸＥＮＰ２４５４７、ＸＥＮＰ２４５４８、ＸＥＮＰ２４７３６、ＸＥＮＰ２４９１７、ＸＥＮＰ２４９１８、ＸＥＮＰ２４９１９、ＸＥＮＰ２５１３７、ＸＥＮＰ２６２２３、ＸＥＮＰ２６２２４、ＸＥＮＰ２６２２７、ＸＥＮＰ２６２２９、ＸＥＮＰ２６５８５、ＸＥＮＰ２７１４５、およびＸＥＮＰ２７１４６からなる群から選択される二機能性ヘテロダイマータンパク質をコードするようにそれぞれ核酸を含む、発現ベクター組成物。
請求項５４に記載の核酸組成物を含む宿主細胞。
請求項５７に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
請求項５３に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質を製造する方法であって、（ａ）前記二機能性ヘテロダイマータンパク質が発現される好適な条件下で、請求項５６または５７に記載の宿主細胞を培養することと、（ｂ）前記タンパク質を回収することと、を含む、方法。
癌を治療することを必要とする患者において癌を治療する方法であって、治療有効量の請求項５３に記載の二機能性ヘテロダイマータンパク質を前記患者に投与することを含む、方法。