JP2021501578A - 改変されたナチュラルキラー細胞を生成する方法および使用方法 - Google Patents

Abstract

本明細書で開示されるのは、１種またはこれより多くの異種核酸を含むＮＫ細胞を生成するための方法である。上記方法は、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で単離されたＮＫ細胞の集団を培養して、活性化ＮＫ細胞の集団を生成する工程を包含する。活性化ＮＫ細胞の集団は、上記１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで、例えば、上記活性化ＮＫ細胞と、ウイルスベクターを含むウイルス粒子とを接触させることによって形質導入される。次いで、その得られた形質導入されたＮＫ細胞は、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で、および必要に応じて照射したフィーダー細胞の存在下で培養されて、拡大増殖された形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年１１月１日出願に出願された米国特許出願第１５／８０１，０８５号（これは、２０１７年７月２５日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４３７７４の一部継続出願であり、この出願は、２０１６年７月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／３６６，４９３号の利益を主張し、これらは全て、それらの全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。

分野
本開示は、改変されたナチュラルキラー細胞を生成するための方法、上記改変されたナチュラルキラー細胞を含む組成物、およびそれらの使用法に関する。

背景
抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の他に、先天性免疫系の細胞構成要素が、悪性の細胞増殖の免疫監視に寄与し得る。特に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、初回刺激も感作もなしに異常な細胞を排除し得る。それらの活性は、阻害性および活性化ＮＫ細胞レセプターからのシグナルのバランスによって決定される。阻害性レセプター（例えば、キラー免疫グロブリンレセプター（ＫＩＲ））は、自己の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原と相互作用し、ＮＫ細胞の攻撃から正常の細胞を保護する。

ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を利用することにおける試みは、ヒトのがんの免疫療法に関して２０年超にわたって調査されてきた。しかし、多くの悪性細胞は、ＭＨＣクラスＩ抗原を発現し、従って、自家ＮＫ細胞による溶解に天然に抵抗性である。よって、自家ＮＫ細胞の養子移入を使用する最初の臨床試験は、有意な治療効果を生じなかった。ＮＫ細胞サイトカイン、ケモカイン、および活性化／阻害レセプター発現の調節は、ＮＫ細胞抗腫瘍活性を支持する魅力的なストラテジーである。しかし初代ＮＫ細胞の、効率的遺伝子改変は、達成するのが困難であった。

要旨
初代ＮＫ細胞において目的の遺伝子を有効に送達し、発現するために、単純かつ効率的な遺伝子移入法が必要である。導入遺伝子の安定しかつ堅固で、長期間の発現を示すＮＫ細胞への遺伝子移入のための効率的なウイルスベクターベースの方法が本明細書で開示される。

本明細書で開示されるのは、１種またはこれより多くの異種核酸を含むかまたは発現するＮＫ細胞（いくつかの例では、「改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」ＮＫ細胞と本明細書でいわれる）を生成する方法である。上記方法は、単離されたＮＫ細胞（例えば、被験体から単離または精製されたＮＫ細胞）の集団を、１種またはこれより多くのサイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２１）の存在下で、および必要に応じてフィーダー細胞の存在下で培養されて、活性化ＮＫ細胞の集団を生成する工程を包含する。いくつかの例では、上記単離されたＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下で培養されて、上記活性化ＮＫ細胞の集団を生成する。特定の例では、上記単離されたＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下で、かつ他のサイトカインは添加されずに培養されて、上記活性化ＮＫ細胞の集団を生成する。上記活性化ＮＫ細胞の集団は、１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで、例えば、上記活性化ＮＫ細胞と、上記ウイルスベクターを含むウイルス粒子とを接触させることによって形質導入される。上記得られる形質導入されたＮＫ細胞は、次いで、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で（例えば、ＩＬ−２の存在下で、およびいくつかの例では、ＩＬ−２の存在下かつかつ他のサイトカインは添加されずに）、および必要に応じて、フィーダー細胞の存在下で培養されて、拡大増殖（ｅｘｐａｎｄ）された形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成する。

障害（例えば、腫瘍または過剰増殖性障害またはウイルス感染）を有する被験体を、上記改変されたＮＫ細胞で処置するための方法がまた、本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記被験体またはドナーから単離されたＮＫ細胞の集団を得る工程、および上記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２１）の存在下で、および必要に応じて、フィーダー細胞の存在下で培養して、活性化ＮＫ細胞の集団を生成する工程を包含する。いくつかの例では、上記単離されたＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下で培養されて、上記活性化ＮＫ細胞の集団を生成する。特定の例では、上記単離されたＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下でかつ他のサイトカインは添加されずに培養されて、上記活性化ＮＫ細胞の集団を生成する。上記活性化ＮＫ細胞の集団は、上記被験体の障害を処置するために適した１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで、例えば、上記活性化ＮＫ細胞と上記ウイルスベクターを含むウイルス粒子とを接触させることによって、形質導入される。上記得られた形質導入されたＮＫ細胞は、次いで、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で（例えば、ＩＬ−２の存在下で、ならびにいくつかの例では、ＩＬ−２の存在下でかつ他のサイトカインは添加されずに）、および必要に応じてフィーダー細胞の存在下で培養されて、拡大増殖された形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成し、これは、上記被験体に（例えば、薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物において）投与される。

１種またはこれより多くの目的の核酸を含むウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）で形質導入されたＮＫ細胞のような、１種またはこれより多くの異種核酸を含む改変されたＮＫ細胞（例えば、改変されたＮＫ細胞の集団）がまた、本明細書で開示される。いくつかの例では、上記異種核酸は、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、またはＣＤ１６（例えば、高親和性ＣＤ１６またはＣＤ１６−Ｖ１５８）をコードする。目的のさらなる核酸は、以下の表１に示される。改変されたＮＫ細胞（例えば、改変されたＮＫ細胞の集団）および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物がまた、開示される。いくつかの実施形態において、上記改変されたＮＫ細胞は、本明細書で開示される方法によって生成される。

本開示の前述のおよび他の特徴は、添付の図面を参照しながら進む以下の詳細な説明からより明らかになる。

図１Ａおよび図１Ｂは、開示される方法において利用され得る例示的な３種のプラスミドレンチウイルスベクター系（図１Ａ）および標的細胞を形質導入するために使用され得る非複製性レンチウイルスを生成するための例示的方法（図１Ｂ）を図示する模式図である。 図１Ａおよび図１Ｂは、開示される方法において利用され得る例示的な３種のプラスミドレンチウイルスベクター系（図１Ａ）および標的細胞を形質導入するために使用され得る非複製性レンチウイルスを生成するための例示的方法（図１Ｂ）を図示する模式図である。 図２は、拡大増殖された形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成するための例示的方法を図示する模式図である。 図３は、形質導入前に、培地中で培養し、ＩＬ−２（５００ ＩＵ／ｍｌ）で初回刺激したＣＤ５６＋ ＮＫ細胞（条件１）または形質導入前に、照射したリンパ芽球系（ＬＣＬ）細胞上で培養し、インターロイキン−２（ＩＬ−２； ５００ ＩＵ／ｍｌ）で初回刺激したＣＤ５６＋ ＮＫ細胞（条件２）における増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）発現を示す一連のパネルである。分析を、形質導入の７日後の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって行った。 図４は、ＩＬ−２（５００ ＩＵ／ｍｌ）を含む培地中で、形質導入前に示された日数にわたって培養したＣＤ５６＋ ＮＫ細胞における形質導入効率を示すグラフである。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、照射したＬＣＬを、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２とともに添加した（ＬＣＬ：ＮＫ比 １０：１）。ｅＧＦＰ発現を、形質導入の７日後にＦＡＣＳによって分析した。 図５Ａおよび図５Ｂは、形質導入前の３日間にわたって５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で初回刺激したＮＫ細胞において、形質導入後の導入遺伝子発現の持続（図５Ａ）および細胞生存度（図５Ｂ）を示すグラフである。 図５Ａおよび図５Ｂは、形質導入前の３日間にわたって５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で初回刺激したＮＫ細胞において、形質導入後の導入遺伝子発現の持続（図５Ａ）および細胞生存度（図５Ｂ）を示すグラフである。 図６は、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で、形質導入前の示された日数にわたって、照射したＬＣＬ上で培養されたＣＤ５６＋ ＮＫ細胞における形質導入効率を示すグラフである。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、その細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。ｅＧＦＰ発現を、形質導入の７日後に、ＦＡＣｓによって分析した。 図７は、形質導入後の示された日数で、形質導入されたＮＫ細胞におけるｅＧＦＰ発現の持続（上）および細胞生存度（下）を示す一連のグラフである。細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２および照射されたフィーダー細胞を含む培地中で、形質導入前の０日間、３日間、または７日間にわたって培養した。ｅＧＦＰ発現を、ＦＡＣＳによって分析し、細胞生存度を、トリパンブルーによって決定した。 図８Ａおよび図８Ｂは、照射したＬＣＬおよび５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で形質導入前の１４日間にわたって拡大増殖させた、３名の被験体に由来する初代末梢血ＮＫ細胞（ＮＫ−１、ＮＫ−２、ＮＫ−３）の形質導入効率を示す一連のパネルである。図８Ａは、形質導入の７日後の各細胞株のＦＡＣＳ分析を示す。図８Ｂは、形質導入後の示された日数でのＣＤ５６＋ ｅＧＦＰ＋ ＮＫ細胞の％を定量するグラフである。 図８Ａおよび図８Ｂは、照射したＬＣＬおよび５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で形質導入前の１４日間にわたって拡大増殖させた、３名の被験体に由来する初代末梢血ＮＫ細胞（ＮＫ−１、ＮＫ−２、ＮＫ−３）の形質導入効率を示す一連のパネルである。図８Ａは、形質導入の７日後の各細胞株のＦＡＣＳ分析を示す。図８Ｂは、形質導入後の示された日数でのＣＤ５６＋ ｅＧＦＰ＋ ＮＫ細胞の％を定量するグラフである。 図９は、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２（一番上の列）、１０００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２（第２列）、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５（第３列）または５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５（一番下の列）で、形質導入前の３日間にわたって初回刺激したＮＫ細胞におけるｅＧＦＰ発現を示す一連のパネルである。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、細胞を、照射したＬＣＬ（１０：１ ＬＣＬ：ＮＫ）上で、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２と共に維持した。ｅＧＦＰ発現を、形質導入の２週間後にＦＡＣＳによって分析した。 図１０は、形質導入前の３日間にわたる示された処置を伴う形質導入後の示された日数での導入遺伝子発現の持続を示すグラフである。 図１１は、形質導入前の３日間にわたって、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ（上）または５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５（下）で初回刺激したＮＫ細胞上の示されたレセプターの発現を示す一連のパネルである。形質導入の２日後、ウイルス粒子を除去し、照射したＬＣＬ（１０：１ ＬＣＬ：ＮＫ細胞）を添加し、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を有する培地中で維持した。形質導入の２週間後に、ＦＡＣＳによって分析を行った。白抜きのトレースは、ＩｓｏＡｂ、濃いトレースは、Ａｇ特異的Ａｂ。 図１２は、形質導入前の３日間にわたって５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ（上）または５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５（下）で初回刺激したＮＫ細胞上の示されたレセプターの発現を示す一連のパネルである。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、照射したＬＣＬ（１０：１ ＬＣＬ：ＮＫ細胞）を添加し、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を有する培地中で維持した。形質導入の２週間後に、ＦＡＣＳによって分析を行った。 図１３は、形質導入前の３日間にわたって示された条件で初回刺激したＮＫ細胞における、Ｋ５６２細胞（上）またはＭＯＬＭ１４細胞（下）の腫瘍細胞溶解を示す一連のグラフである。細胞を、^５１Ｃｒ放出アッセイによってそれらの腫瘍死滅能力を試験する前の１４日間にわたって、照射したＬＣＬとともに拡大増殖させた。 図１４は、形質導入前のサイトカイン刺激（５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２）の日数に対してＧＦＰを発現するＮＫ細胞の割合（丸）および細胞生存度（四角）を示すグラフである。導入遺伝子発現および生存度のバランスを、形質導入前に２〜３日間のサイトカイン刺激で達成した（四角で囲んだ領域）。 図１５は、形質導入前に示されたサイトカインで処置したＮＫ細胞において、ＧＦＰを発現するＮＫ細胞の割合を示すグラフである。ＩＬ−２単独と、ＩＬ−２とＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１との組み合わせとの間には、有意差はなかった。 図１６Ａおよび図１６Ｂは、形質導入効率（図１６Ａ）およびＮＫ細胞拡大増殖（図１６Ｂ）に対する形質導入試薬の効果を示すグラフである。 図１７は、５、２０、または１００のＭＯＩにおいて、示されたプロモーターの制御下で、ＧＦＰで形質導入されたＮＫ細胞の形質導入効率を示すグラフである。 図１８は、０日目での発現（１００％）と比較して、形質導入後７日目および１４日目に、示されたプロモーターの制御下で、ＧＦＰで形質導入されたＮＫ細胞におけるＧＦＰの発現の倍数変化を示すグラフである。 図１９は、Ｋ５６２細胞と接触した場合に、拡大増殖の１４日後に、示されたプロモーターの制御下にあるＧＦＰで形質導入されたＮＫ細胞または模擬形質導入した細胞の活性（％脱顆粒）を示すグラフである。Ｐ／Ｉは、最大脱顆粒能を示すために、ＰＭＡ／イオノマイシンでの処置を示す。 図２０は、Ｋ５６２細胞と接触した場合に、拡大増殖の１４日後に非形質導入細胞と比較して、示されたプロモーターの制御下で、ＧＦＰで形質導入されたＮＫ細胞の活性を示すグラフである。Ｐ／Ｉは、最大脱顆粒能を示すために、ＰＭＡ／イオノマイシンでの処置を示す。 図２１Ａおよび２１Ｂは、ＣＸＣＲ４の発現のためのレンチウイルスベクター（図２１Ａ）またはＣＤ３４ｔおよびＣＸＣＲ４の発現のためのレンチウイルスベクター（図２１Ｂ）の模式図である。 図２２Ａおよび図２２Ｂは、ＣＸＣＲ４をコードするレンチウイルスベクター（図２２Ａ）またはＣＤ３４ｔおよびＣＸＣＲ４の両方をコードするレンチウイルスベクター（図２２Ｂ）で形質転換されたＮＫ細胞におけるＣＸＣＲ４およびＣＤ３４の発現を示すプロットである。 図２３は、ＬＣＬフィーダー細胞の存在下または非存在下で活性化され、続いて、 ＬＣＬフィーダー細胞の存在下または非存在下でのウイルス形質導入および拡大増殖を行ったＮＫ細胞の拡大増殖倍数を示すグラフである。 図２４Ａおよび２４Ｂは、ｐＬＶ［Ｅｘｐ］−ＰＧＫ＞ＥＧＦＰで形質導入する前に、５００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２とともに、示されるように０〜５日間にわたって培養したＰＢＭＣに由来するＮＫ細胞の結果を示す。形質導入の３日後に、細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現および生存度に関してアッセイした。図２４Ａは、ＧＦＰ＋ ＮＫ細胞の代表的ゲーティングを示す。図２４Ｂは、３名のドナーからの実験の平均およびＳＥＭ（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ） ＧＦＰのｌｏｇ_１０変換した値についての）を示す。＊は、一元配置ＡＮＯＶＡ後のＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によって、ＩＬ−２刺激なしの細胞（０日目）と比較してｐ＜０．０５を示す（図２４Ｂで示される％Ａｎｎｅｘｉｎ^-ＰＩ^-細胞は、ゲーティングしたＣＤ５６^＋ＣＤ３^-細胞に対して表にした）。 図２５Ａ〜２５Ｄは、示されたプロモーターおよびＧＦＰを有するレンチウイルスベクターでの形質導入前に、ＩＬ−２で３日間刺激したヒトＮＫ細胞におけるＧＦＰ発現を示すグラフである。照射したＳＭＩ−ＬＣＬフィーダー細胞を、その形質導入されたＮＫ細胞に添加し、さらに１４日間共培養した（合計で２０日間）。形質導入の３日後、ＮＫ細胞を、フローサイトメトリーによって試験し（図２５Ａ）、形質導入効率（図２５Ｂ）および導入遺伝子発現のレベル（図２５Ｃ）を計算した。ＮＫ細胞における導入遺伝子発現の経時的な安定性を、６日目のＥＧＦＰ％を、２０日目のＥＧＦＰ％で除算することによって定量し、パーセントとして表した（図２５Ｄ）。平均およびＳＥＭ（ＧＭＦＩのｌｏｇ_１０変換した値についての）を、４名のドナーからの実験の各場合において示す。＊は、一元配置ＡＮＯＶＡ後のＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によって、以前に使用したＰＧＫプロモーターを含むベクターと比較して、ｐ＜０．０５を示す。 図２６Ａおよび２６Ｂは、形質導入効率に対する挿入物配列の配置の効果を示す。ＰＢＭＣに由来するＮＫ細胞を、ＰＧＫプロモーター、ＧＦＰ、Ｐ２Ａ−リンカー、ＩＲＥＳ、短縮型ＣＤ３４タンパク質、およびコドン最適化短縮型ＣＤ３４タンパク質（ＣＤ３４ｏｐｔ）の組み合わせをコードするその示された挿入物配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入する前に、ＩＬ−２で３日間刺激した。さらに３日後に、ＮＫ細胞を、ＧＦＰおよびＣＤ３４の表面発現についてフローサイトメトリーによって測定した（図２６Ａ）。３名のドナーからの実験の平均およびＳＥＭを示す。＊は、一元配置ＡＮＯＶＡ後のＴｕｋｅｙの多重比較検定による選択された比較のｐ＜０．０５を示す。代表的染色は、元の短縮型ＣＤ３４を含む構築物を、コドン最適化短縮型ＣＤ３４に対して比較する（図２６Ｂ）。 図２７Ａ〜２７Ｄは、レンチウイルス形質導入前の、フィーダー細胞の存在下でのＮＫ細胞の予備刺激の効果を示す。ＰＢＭＣに由来するＮＫ細胞を、ＩＬ−２またはＩＬ−２ ＋ ＳＭＩ−ＬＣＬフィーダー細胞で３日間刺激した。ＮＫ細胞を、２０：１ ＭＯＩにおいてｐＬＶ−ＥＦＳ−ＧＦＰ−２Ａ−ＣＤ３４ｏｐｔウイルス粒子で形質導入する前に、抗ＣＤ５６ビーズとの共培養物から除去した。さらに３日後に、ＳＭＩ−ＬＣＬを、両方の条件に添加し、ＮＫ細胞を、実験開始から２１日目まで培養した。ＮＫ細胞を、フローサイトメトリーによって、ＧＦＰおよびＣＤ３４導入遺伝子発現に関して試験した（図２７Ａ）。平均およびＳＥＭを、４名のドナーからの実験に関して示す。ＮＫ細胞数を、培養の間中頻繁に計数し、その拡大増殖倍数を計算した（図２７Ｂ）。平均およびＳＥＭ（ｌｏｇ_１０変換した値についての）を、同じドナーに由来する、０日目にＳＭＩ−ＬＣＬを受けたのみの非形質導入ＮＫ細胞のコントロール拡大増殖と比較して示す。入力に対する形質導入された細胞の全体収量を、全細胞の拡大増殖倍数×各条件のＧＦＰ^＋ＣＤ３４^＋割合のかけ算をすることによって計算した（図２７Ｃ）。平均およびＳＥＭ（ｌｏｇ_１０変換した値についての）を示す。類似の実験を行って、形質導入（２０：１ ＭＯＩでのｐＬＶ−ＥＦＳ−ＧＦＰ−２Ａ−ＣＤ３４ｏｐｔ）の前に、ＳＭＩ−ＬＣＬでの刺激の最適期間（２〜７日間）を決定した（図２７Ｄ）。形質導入された細胞のパーセンテージ、細胞の拡大増殖倍数、および入力に対する形質導入された細胞の全体収量を、３名のドナーからの実験に関して決定した。 図２８Ａおよび２８Ｂは、ＬＣＬ細胞で予備刺激したＮＫ細胞を形質導入する間にＢＸ７９５を含めることの効果を示す。ＰＢＭＣに由来するＮＫ細胞を、ＳＭＩ−ＬＣＬフィーダー細胞 ＋ ＩＬ−２で５日間刺激した。ＮＫ細胞を、示されるとおりの種々の用量のＢＸ７９５の存在下でｐＬＶ−ＥＦＳ−ＧＦＰ−２Ａ−ＣＤ３４ｏｐｔウイルス粒子で形質導入する前に、抗ＣＤ５６ビーズとの共培養物から除去した。１日後、ＮＫ細胞を、ＢＸ７９５なしの培地へと交換した。さらに２日後、ＳＭＩ−ＬＣＬを再び添加し、ＮＫ細胞を、実験開始から２１日目まで培養し、細胞数を終始モニターした。ＮＫ細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰおよびＣＤ３４発現に関してアッセイした（図２８Ａ）。その入力細胞に対する形質導入された細胞の全体収量を、細胞の拡大増殖倍数×ＧＦＰ^＋ＣＤ３４^＋細胞の割合のかけ算をすることによって計算した。３名のドナーからの実験の平均およびＳＥＭを示す（拡大増殖倍数のｌｏｇ_１０変換した値についての）。＊は、一元配置ＡＮＯＶＡ後のＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定による、薬物を欠く条件と比較したｐ＜０．０５を示す。類似の実験を行って、１．５μＭ ＢＸ７９５の添加ありまたはなしでの形質導入の前に、ＩＬ−２またはＩＬ−２ ＋ ＳＭＩ−ＬＣＬフィーダー細胞で５日間刺激した細胞を比較した（図２８Ｂ）。その入力細胞に対する形質導入された細胞の全体収量を、上記のように表にした。 図２９Ａおよび２９Ｂは、最適化したＳＭＩ−ＬＣＬプロトコールからのＣＤ３４ｏｐｔ、ＣＤ１９、およびＣＤ４のレンチウイルス発現を示す。ＮＫ細胞を、抗ＣＤ３ ＭＡＣＳビーズ除去、続いて、抗ＣＤ５６ ＭＡＣＳビーズ陽性選択を介して、ＰＢＭＣから単離した。細胞を、ＳＭＩ−ＬＣＬ ＋ ＩＬ−２で４〜５日間刺激した。得られた細胞を、１．５μＭ ＢＸ７９５の存在下で、示されるように、コドン最適化短縮型ＣＤ３４、短縮型ＣＤ１９、または短縮型ＣＤ４をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。１日後、細胞を、ＢＸ７９５なしの培地へと交換した。さらに２日後、形質導入されたＮＫ細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ１９、またはＣＤ４を認識するＭＡＣＳビーズを使用して選択した。陽性選択したＮＫ細胞を、ＳＭＩ−ＬＣＬとともに培養し、細胞の増殖を、実験開始から２１日目まで追跡した。ＭＡＣＳビーズ選択前後のＧＦＰおよび導入遺伝子発現のフローサイトメトリー評価（図２９Ａ）。細胞数を終始モニターし、その入力細胞に対する形質導入された細胞の全体収量を、細胞の拡大増殖倍数×ＧＦＰおよび導入遺伝子発現の両方に関して陽性の割合のかけ算をすることによって計算した（図２９Ｂ）。３名のドナーからの実験の平均およびＳＥＭ（ｌｏｇ_１０変換した値についての）を示す。 図２９Ａおよび２９Ｂは、最適化したＳＭＩ−ＬＣＬプロトコールからのＣＤ３４ｏｐｔ、ＣＤ１９、およびＣＤ４のレンチウイルス発現を示す。ＮＫ細胞を、抗ＣＤ３ ＭＡＣＳビーズ除去、続いて、抗ＣＤ５６ ＭＡＣＳビーズ陽性選択を介して、ＰＢＭＣから単離した。細胞を、ＳＭＩ−ＬＣＬ ＋ ＩＬ−２で４〜５日間刺激した。得られた細胞を、１．５μＭ ＢＸ７９５の存在下で、示されるように、コドン最適化短縮型ＣＤ３４、短縮型ＣＤ１９、または短縮型ＣＤ４をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。１日後、細胞を、ＢＸ７９５なしの培地へと交換した。さらに２日後、形質導入されたＮＫ細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ１９、またはＣＤ４を認識するＭＡＣＳビーズを使用して選択した。陽性選択したＮＫ細胞を、ＳＭＩ−ＬＣＬとともに培養し、細胞の増殖を、実験開始から２１日目まで追跡した。ＭＡＣＳビーズ選択前後のＧＦＰおよび導入遺伝子発現のフローサイトメトリー評価（図２９Ａ）。細胞数を終始モニターし、その入力細胞に対する形質導入された細胞の全体収量を、細胞の拡大増殖倍数×ＧＦＰおよび導入遺伝子発現の両方に関して陽性の割合のかけ算をすることによって計算した（図２９Ｂ）。３名のドナーからの実験の平均およびＳＥＭ（ｌｏｇ_１０変換した値についての）を示す。 図３０は、図２９Ａおよび２９Ｂにあるように形質導入および拡大増殖されたＮＫ細胞の、脱顆粒（左上および左下）およびＩＦＮ−γ（中央上および中央下）およびＴＮＦ−α（右上および右下）の生成を示す。パーセンテージを、ＳＭＩ−ＬＣＬで拡大増殖した同じドナーに由来するコントロール非形質導入ＮＫ細胞で測定した値に対して正規化した。

配列表
本明細書でまたは添付の配列表に列挙される任意の核酸配列およびアミノ酸配列は、施行規則§１．８２２において規定されるように、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸の標準的な文字略語を使用して示される。少なくともいくつかの場合では、各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、その相補鎖は、その示された鎖に対する何らかの言及によって含まれると理解される。

配列番号１および配列番号２は、それぞれ、例示的なＣＸＣＲ４の核酸およびアミノ酸配列である。

配列番号３および配列番号４は、それぞれ、例示的な短縮型ＣＤ３４の核酸およびアミノ酸配列である。

配列番号５および配列番号６は、それぞれ、例示的な高親和性ＣＤ１６の核酸およびアミノ酸配列である。

配列番号７は、例示的なコドン最適化高親和性ＣＤ１６核酸である。

配列番号８は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーターおよびＥＧＦＰを含む例示的なレンチウイルス発現ベクターである。

配列番号９は、ヒト真核生物翻訳伸長因子１α（ＥＦ１Ａ）プロモーターおよびＥＧＦＰを含む例示的レンチウイルス発現ベクターである。

配列番号１０は、ヒトＥＦ１Ａプロモーター（ＥＦＳ）のショートバージョンおよびＥＧＦＰを含む例示的レンチウイルス発現ベクターである。

配列番号１１は、ニワトリβ鎖（ＣＡＧ）プロモーターおよびＥＧＦＰと融合されたヒトＣＭＶ初期エンハンサーを含む例示的レンチウイルス発現ベクターである。

配列番号１２は、ＣＡＧプロモーターのショートバージョンおよびＥＧＦＰを含む例示的レンチウイルス発現ベクターである。

配列番号１３は、シミアンＳＶ４０初期プロモーターおよびＥＧＦＰを含む例示的レンチウイルス発現ベクターである。

配列番号１４は、マウスホスホグリセレートキナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＧＦＰを含む例示的レンチウイルス発現ベクターである。

配列番号１５は、ヒトユビキチンＣプロモーターおよびＥＧＦＰを含む例示的レンチウイルス発現ベクターである。

配列番号１６は、マウスＰＧＫプロモーターおよびヒトＣＸＣＲ４を含む例示的レンチウイルス発現ベクターである。

配列番号１７は、マウスＰＧＫプロモーターおよび短縮型ヒトＣＤ３４、Ｔ２Ａペプチド、およびヒトＣＸＣＲ４を含む例示的レンチウイルス発現ベクターである。

配列番号１８は、ヒトＥＦ１Ａプロモーターのショートバージョン、ＥＧＦＰ、および短縮型ヒトＣＤ４を含む例示的レンチウイルス発現ベクターである。

配列番号１９は、ヒトＥＦ１Ａプロモーターのショートバージョン、ＥＧＦＰ、および短縮型ヒトＣＤ１９を含む例示的レンチウイルス発現ベクターである。

詳細な説明
本明細書で開示されるのは、ＮＫ細胞において導入遺伝子を効率的にかつ安定して発現するための方法である。その方法は、ＮＫ細胞への遺伝子移入に効率的なウイルスベクターベースの方法を含み、導入遺伝子の安定してかつ長期間の堅固な発現を示す。形質転換されている初代細胞への高遺伝子移入率および患者細胞の大規模形質導入のための高力価のウイルス粒子を生成する能力は、臨床試験の重要な基準である。レンチウイルスベクター（例えば、本明細書中の実施例で利用されるもの）は、それらの形質導入効率を損なうことなく、高力価で生成され、濃縮され得る。さらに、現在記載される方法は、臨床適用するためにより安価かつ単純である。なぜならそれは、中程度の形質導入効率を得るために現在のレトロウイルスベクター媒介性遺伝子移入プロトコルにおいて適合されたいくつかの扱いづらい高価な工程（例えば、レトロネクチン、スピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）、および形質導入されている初代ＮＫ細胞の生存度に対して顕著な有害な影響を有し得る反復／複数回の形質導入の使用）の必要性を要求しないからである。さらに、養子ＮＫ細胞ベースの免疫療法適用のための医薬品等の製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）条件の下でＮＫ細胞の効率的エキソビボ拡大増殖のためのプロトコルが、適用可能である。本高効率レンチウイルスベクターベースの遺伝子移入プロトコルは、多くの現在のエキソビボＮＫ細胞拡大増殖プロトコルを補完して、多数の遺伝的に再プログラムされたＮＫ細胞を生成するために使用され得、潜在的には、がんまたはウイルス感染を有する患者においてそれらの抗腫瘍有効性を増強することによって、ＮＫ細胞ベースの免疫療法アプローチに変革を起こし得る。

開示される方法は、ヒト初代ＮＫ細胞のレンチウイルスベクター媒介性遺伝子操作のための他の方法論を超えるいくつかの利点を有する。本発明のレンチウイルスベクターベースのアプローチは、初代ヒト末梢血由来ＮＫ細胞への安定な遺伝子移入の効率的で、堅固で、かつ高度に再現可能な方法を生じる。これは、細胞分裂／長期間培養で失われるエピソームベクター、核機能を阻害し宿主細胞溶解を最終的に引き起こすポックスウイルスベクター、および他の非ウイルス媒介性遺伝子送達法（例えば、導入された遺伝子の一過性の発現のみを可能にするエレクトロポレーション）とは対照的である。さらに、ガンマレトロウイルスベクター（これは転写開始部位の近くに、優先的に組み込み、長末端反復（ＬＴＲ）からのプロモーター活性化によってがん遺伝子を潜在的に活性化する）とは異なり、レンチウイルスベクターは、高度に発現される遺伝子内で優先的に組み込まれる。さらに、開示される方法において使用されるレンチウイルスベクターは、スプリットゲノムレンチウイルスパッケージングデザイン（ｓｐｌｉｔ ｇｅｎｏｍｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎ）のような改善された安全性の特徴を有し、３’ＬＴＲにおける欠失を通じて、移入ベクターの自己不活型デザインを有し、それによって、プロモーター活性化の可能性を低減する。

本明細書で開示される方法によって得られる、形質導入された初代ＮＫ細胞は、表現型的におよび機能的に正常であるので、多数の遺伝子治療および免疫療法適用を可能にする。重要なことには、この現在の形質導入法は単純であり、ＮＫ細胞を、１種またはこれより多くのサイトカインとともにインビトロで培養し、続いて、濃縮ウイルス粒子へと曝露することを含む。形質導入後に、細胞は、これらと照射されたフィーダー細胞とを、１種またはこれより多くのサイトカインを含む培地中で共培養することによって、大量に拡大増殖される。

Ｉ．略語
ＣＡＲ キメラ抗原レセプター
ＥＢＶ−ＬＣＬ エプスタイン・バーウイルスで形質転換したリンパ芽球系細胞株
ｅＧＦＰ 増強型緑色蛍光タンパク質
ＦＡＣＳ 蛍光活性化セルソーティング
ＧＭＰ 医薬品等の製造管理および品質管理に関する基準
ＩＬ インターロイキン
ＬＴＲ 長末端反復
ＭＯＩ 感染多重度
ＮＫ ナチュラルキラー細胞
ＰＢＭＣ 末梢血単球
ｓｈＲＮＡ 低分子ヘアピン型ＲＮＡ

ＩＩ．用語
別段注記されなければ、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、以下で見出され得る：Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ Ｘ， 編． Ｋｒｅｂｓら， Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ２００９（ＩＳＢＮ ０７６３７６６３２１）； Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓによって発行， １９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）； Ｒｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， Ｗｉｌｅｙ， Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．によって発行， １９９５（ＩＳＢＮ ０４７１１８６３４１）；およびＧｅｏｒｇｅ Ｐ． Ｒeｄｅｉ， Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， 第３版， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ２００８（ＩＳＢＮ： １４０２０６７５３４）、ならびに他の同様の参考文献。

別段説明されなければ、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形の用語「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「上記、この、その（ｔｈｅ）」とは、状況がそうでないことを明らかに示すのでなければ、複数形への言及を含む。同様に、文言「または（ｏｒ）」は、状況がそうでないことを明らかに示すのでなければ、「および（ａｎｄ）」を含むことが意図される。よって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ａ ｏｒ Ｂ）」とは、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに関して与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値が、近似値であり、説明のために提供されることは、さらに理解されるべきである。

本明細書で記載される方法および材料に類似または等価なものは、本開示の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が、以下で記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。矛盾する場合には、本明細書が用語の説明を含めて優先する。さらに、材料、方法、および実施例は、例証に過ぎず、限定するとは意図されない。

本開示の種々の実施形態の検討を促進するために、具体的用語の以下の説明が提供される：

がん（ｃａｎｃｅｒ）： 「悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）」または「悪性新生物（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｎｅｏｐｌａｓｍ）」としても、本明細書でいわれる。細胞の制御されない、異常な増殖、がん細胞が局所的に、または血流およびリンパ系を通じて身体の他の部分へと拡がる（例えば、転移する）能力、ならびに多くの特徴的構造および／または分子的特徴のいずれかによって特徴づけられる多くの疾患のいずれか。「がん細胞（ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ）」とは、特異的構造特性を有し、分化を欠き、そして浸潤および転移の能力がある細胞である。

ＣＤ３４： 細胞−細胞接着分子として機能する細胞表面糖タンパク質。ＣＤ３４は、高度にグリコシル化された細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを有する１回膜貫通タンパク質である。ＣＤ３４は、造血細胞上で発現され、細胞移動において役割を果たす。例示的なヒトＣＤ３４配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０２５１０９およびＮＭ＿００１７７３（核酸配列）ならびにＮＰ＿００１０２０２８０およびＮＰ＿００１７６４（アミノ酸配列）を含み、これらは全て、２０１７年７月２５日にＧｅｎＢａｎｋに存在するので、本明細書に参考として援用される。

接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）： 固体および液体の形態の両方を含め、直接物理的に会合する状態に置くこと。一例では、接触は、液体培地中の物質（例えば、サイトカイン）と１またはこれより多くの細胞（例えば、培養物中のＮＫ細胞）との間の会合を含む。接触は、単離された細胞もしくは組織とともにインビトロで、または被験体への投与によってインビボで起こり得る。

培養（Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）または細胞培養（Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）： 規定された条件のセット（例えば、培養培地、細胞外マトリクス、温度、および／または培養時間）における細胞の集団のインビトロでの増殖。いくつかの例では、細胞培養は、実質的に純粋な培養物（例えば、単離されたＮＫ細胞）を含む。さらなる例では、細胞培養は、混合培養（例えば、２種またはこれより多くの細胞タイプの共培養（例えば、フィーダー細胞を含むＮＫ細胞の培養物））を含む。さらなる例では、細胞培養は、細胞外マトリクスと接触した状態で増殖される細胞を含む。

培養培地： 細胞（例えば、ＮＫ細胞）の特定の集団の生存度、機能、および／または増殖を支援するために必要な栄養素を有する培養条件の合成セット。培養培地は、一般に、炭素源、窒素源およびｐＨを維持するための緩衝液のような構成要素を含む。培養培地中のさらなる構成要素はまた、血清（例えば、熱非働化血清）、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、プロテアーゼインヒビター、タンパク質加水分解物、剪断力保護物質（ｓｈｅａｒ ｆｏｒｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ）、タンパク質、ビタミン、グルタミン、微量元素、無機塩、ミネラル、脂質および／または付着因子の１種またはこれより多くを含み得る。

サイトカイン： 他の細胞（例えば、リンパ球）の挙動に影響を及ぼす、細胞により作製されるタンパク質。一実施形態において、サイトカインは、ケモカイン、細胞の往き来に影響を及ぼす分子である。用語「サイトカイン」は、ナノモル濃度からピコモル濃度で液性調節因子として作用し、正常または病的な条件下のいずれにしても、個々の細胞および組織の機能的活性を調節する可溶性タンパク質およびペプチドの多様な群の一般名称として使用される。これらのタンパク質はまた、細胞間の相互作用を直接的に媒介し、細胞外環境において起こるプロセスを調節する。サイトカインの例としては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が挙げられるが、これらに限定されない。

有効量： 例えば、特定の薬剤で処置されている被験体において、所望の効果を達成するために十分なその薬剤の量。いくつかの例では、本明細書で開示される改変されたＮＫ細胞の有効量は、被験体において疾患または障害（例えば、腫瘍、過剰増殖性障害、またはウイルス感染）を処置または阻害するために十分な量である。他の例では、有効量は、被験体において疾患または障害の１またはこれより多くの症状を低減または改善するために十分な改変されたＮＫ細胞の量である。その有効量（例えば、被験体において障害を改善、阻害、および／または処置する量）は、例えば、処置されている特定の障害、処置されている被験体、組成物の投与様式、および他の因子に依存する。

発現： 遺伝子のコードされた情報が、細胞の機能を果たす部分、機能を果たさない部分、または構造部分へと変換されるプロセス（例えば、タンパク質の合成）。遺伝子発現は、外部シグナルによって影響を受け得る。例えば、ホルモンへの細胞の曝露は、ホルモン誘導性遺伝子の発現を刺激し得る。異なる細胞タイプは、同一のシグナルに異なって応答し得る。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡから、ＲＮＡへ、タンパク質への経路のどこかで調節され得る。調節としては、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、中間分子（例えば、ｍＲＮＡ）の分解に際して、またはそれらが生成された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、区画化（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）もしくは分解を通じての制御を含み得る。

フィーダー細胞： エキソビボまたはインビトロでの培養において別の細胞タイプの支持を提供する細胞。フィーダー細胞は、フィーダー細胞とともに培養される細胞の生存、増殖、および／または分化に必要とされる（または分化を阻害する）１またはこれより多くの因子を提供し得る。代表的には、フィーダー細胞は、培養物中でのそれらの増殖を防止するために照射または別の方法で処置される。本明細書で開示されるいくつかの例では、ＮＫ細胞は、フィーダー細胞（例えば、照射されたＥＢＶで形質転換したリンパ芽球（例えば、ＥＢＶ−ＬＣＬ細胞）とともに培養される。

過剰増殖性疾患（Ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）： 細胞が正常な組織成長より迅速に増殖する疾患または障害。従って、過剰増殖している細胞は、正常な細胞より迅速に増殖している細胞である。いくつかの例では、過剰増殖性障害は、悪性腫瘍またはがんを含むが、良性腫瘍も含み得る。

状態を阻害または処置する： 状態の「阻害」は、状態または疾患（例えば、腫瘍）の完全な発生の阻害に言及する。状態の阻害は、疾患の部分的な阻害から実質的に完全な阻害までの幅にまたがり得る（例えば、防止が挙げられるが、これに限定されない）。いくつかの例では、用語「阻害」は、状態の発生または進行を低減または遅らせることに言及する。「処置（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、発生しはじめた後の疾患または状態の徴候または症状を改善する治療介入に言及する。開示されるＮＫ細胞の有効量を投与されるべき被験体は、このような障害（例えば、疾患もしくは障害の存在または疾患もしくは障害を発生させるリスク因子）のための標準的診断技術によって同定され得る。

単離された： 「単離された」または「精製された」生物学的構成要素（例えば、細胞、核酸、ペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、またはウイルス様粒子）は、他の構成要素（例えば、その構成要素が天然に存在する細胞または生物中の他の生物学的構成要素）から実質的に分離されているか、離れて生成されているか、または離れて精製されている。そのようにして「単離され」または「精製され」た細胞、核酸、ペプチドおよびタンパク質は、標準的な精製法によって精製された細胞、核酸、およびタンパク質を含む。

用語「単離された」または「精製された」とは、絶対的純度を要しない；むしろ、それは、相対的な用語と意図される。従って、例えば、単離された生物学的構成要素は、その生物学的要素が、細胞、生物、サンプル、または生成容器（例えば、細胞培養システム）内のその自然な環境にあるその生物学的構成要素より富化されているものである。好ましくは、調製物は、その生物学的構成要素が、その調製物の全生物学的構成要素含有量の少なくとも５０％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはこれより高い）を表すように、精製される。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞： 特異的抗原性刺激の非存在下で、およびＭＨＣクラスに従う拘束なしに標的細胞を死滅させる免疫系の細胞。標的細胞は、腫瘍細胞またはウイルスを有する細胞であり得る。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６表面マーカーの存在およびＣＤ３表面マーカーの非存在によって特徴づけられる。ＮＫ細胞は、代表的には、正常末梢血中で、およそ１０〜１５％の単核細胞の割合を含む。歴史的には、ＮＫ細胞は、これら細胞が以前の免疫化も活性化もなく、ある種の腫瘍細胞を溶解する能力によって最初に同定された。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ提示をダウンレギュレートすることによって、ＣＴＬ応答から逃れ得るウイルスおよび腫瘍に対する「バックアップ」の防御機構を提供すると考えられる。直接的な細胞傷害性死滅に関与することに加えて、ＮＫ細胞はまた、サイトカイン生成において役割を果たし、このことは、がんおよび感染を制御するために重要であり得る。

いくつかの例では、「改変されたＮＫ細胞（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌ）」は、異種核酸（例えば、本明細書で開示される核酸またはベクターの１種もしくはこれより多く）で形質導入されるか、または１種もしくはこれより多くの異種タンパク質を発現するＮＫ細胞である。用語「改変されたＮＫ細胞」および「形質導入されたＮＫ細胞（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌ）」は、本明細書中のいくつかの例では交換可能に使用される。

薬学的に受容可能なキャリア： 本開示において有用な薬学的に受容可能なキャリア（ビヒクル）は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， 編者， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， 第２１版（２００５）は、１種またはこれより多くの治療用組成物（例えば、１種もしくはこれより多くの改変されたＮＫ細胞および／またはさらなる薬剤）の薬学的送達に適した組成物および製剤を記載する。

一般に、そのキャリアの性質は、使用されている特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして薬学的におよび生理学的に受容可能な流体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）を含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形態）に関しては、従来の非毒性固体キャリアとしては、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与されるべき薬学的組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝化剤などのような、少量の非毒性補助物質（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）を含み得る。

被験体： 生きている多細胞脊椎生物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、および非ヒト霊長類）の両方を含むカテゴリー）。

形質導入する： 細胞への核酸の移入（例えば、宿主細胞への異種核酸の移入）。本明細書で使用される場合、用語形質導入する（またはトランスフェクトするもしくは形質転換する）は、核酸が細胞に導入される全ての技術（プラスミドベクターでの形質転換、ウイルスベクターもしくはウイルス粒子での感染、およびエレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポフェクション、もしくは粒子銃加速による裸のＤＮＡの導入が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。

導入遺伝子： 例えば、形質導入によって、細胞に導入される異種核酸。いくつかの例では、導入遺伝子は、目的のタンパク質をコードする核酸である。他の例では、導入遺伝子は、目的の核酸（例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、またはアンチセンス核酸）の発現を調節し得る核酸である。導入遺伝子は、１種またはこれより多くの発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結され得る。

「異種」核酸またはタンパク質は、異なる遺伝子供給源に由来する核酸またはタンパク質に言及する。例えば、細胞に対して異種である核酸またはタンパク質は、これが発現される細胞以外の生物または個体に由来する。他の例では、異種核酸またはタンパク質は、これが発現される細胞以外の細胞タイプに由来する（例えば、ＮＫ細胞に通常は存在しない核酸またはタンパク質は、ＮＫ細胞に対して異種である）。さらなる例では、異種核酸は、組換え核酸（例えば、別の遺伝子に由来するプロモーターに作動可能に連結されたタンパク質コード核酸、および／または異なる供給源に由来する、２種もしくはこれより多くの作動可能に連結された核酸）を含む。

ベクター： そのベクターが宿主細胞において複製するおよび／または組み込まれる能力を破壊することなく、細胞への外来もしくは異種核酸の挿入を可能にする核酸分子。ベクターは、そのベクターが宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。ベクターはまた、１種またはこれより多くの選択マーカー遺伝子および他の遺伝的エレメントを含み得る。発現ベクターは、挿入される遺伝子の転写および／または翻訳を可能にするために必要な調節配列を含むベクターである。いくつかの非限定的例では、そのベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）である。

ＩＩ．改変されたＮＫ細胞を生成するための方法
本明細書で開示されるのは、改変されたＮＫ細胞（例えば、１種もしくはこれより多くの異種核酸を含むかもしくは発現するか、または１種もしくはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターの全てもしくは一部を含むＮＫ細胞）を生成するための方法である。特定の例では、本明細書で開示される方法は、高効率においてウイルスベクターで形質導入するために以前は困難があった、（ＮＫ細胞株または拡大増殖されたＮＫ細胞ではなく）休止中のまたは短期間の活性化ＮＫ細胞を形質導入するために利用される。

いくつかの実施形態において、開示される方法は、レンチウイルスシステムを利用して、１種またはこれより多くの異種核酸（「導入遺伝子」）をＮＫ細胞に導入する。形質導入用のウイルス生成のためのレンチウイルスシステムは、一般に、それらの安全性を増大するために、複数のプラスミドにわたって分割される。例示的なレンチウイルスシステムは、３種のプラスミドを伴う「第２世代」システムまたは４種のプラスミドを伴う「第３世代」システムを含む。例示的な３種のプラスミドシステムは、図１Ａに図示される。その導入遺伝子核酸は、移入プラスミド中に含まれ、プロモーター（非限定的な例では、ｈＰＧＫプロモーター）に作動可能に連結される。その移入プラスミドはまた、５’および３’ ＬＴＲを含み、さらなるエレメント（例えば、プサイパッケージングシステム）を含み得る。ウイルス粒子を生成するためのレンチウイルスタンパク質（例えば、ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、および／またはｔａｔ）は、２種または３種の別個のプラスミドによってコードされる。例示的な移入ベクターはまた、図２１Ａおよび図２１Ｂに示される。レンチウイルスプラスミド（３種または４種のプラスミド）は、哺乳動物細胞株（これは、複製することができないレンチウイルス粒子を生成する）にトランスフェクトされる。次いで、そのレンチウイルス粒子は、他の細胞（例えば、ＮＫ細胞）を形質導入するために使用される。本明細書で開示される方法において使用するためのレンチウイルス（例えば、非複製性レンチウイルス）を生成するための例示的な方法は、図１Ｂに示される。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるのは、ウイルスベクターでの形質導入を利用して、改変されたＮＫ細胞を生成するための方法である。例示的なプロセスの概要は、図２に示される。いくつかの例では、その方法は、精製ＮＫ細胞を得るかまたは調製し、その精製したＮＫ細胞を、１種またはこれより多くのサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２１）を含む培地中で１〜１４日間培養することによって、そのＮＫ細胞を、活性化（または「初回刺激」する）工程を包含する。その活性化ＮＫ細胞は、１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）で、例えば、活性化ＮＫ細胞をそのウイルスベクター（例えば、そのウイルスベクターを含むウイルス粒子）とともに１〜３日間インキュベートすることによって形質導入される。次いで、その形質導入されたＮＫ細胞は、１〜５０日間（またはより長く）、例えば、１種またはこれより多くのサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）とのおよび／またはフィーダー細胞の存在下での培養によって、拡大増殖されて、拡大増殖された改変されたＮＫ細胞を生成する。いくつかの例では、その活性化ＮＫ細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインを欠く短縮型ＣＤ３４タンパク質（ＣＤ３４ｔ）をコードする核酸（例えば、目的の別の核酸に作動可能に連結されたＣＤ３４ｔ核酸）を含むウイルスベクターで形質導入される。そのＣＤ３４ｔタンパク質は、ＣＤ３４の細胞外および膜貫通領域を含み、そして結果として、それは細胞表面上で発現されるが、短縮型タンパク質を発現する細胞の活性に影響を及ぼさない（Ｎｏｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５９：８５１−８６２， ２０１０）。形質導入された細胞を富化するために、ＣＤ３４ｔを発現する細胞（例えば、形質導入された細胞）は、抗ＣＤ３４抗体で同定され得、フローサイトメトリーまたは免疫磁性方法を使用して単離され得る。他の例では、その活性化ＮＫ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ１９タンパク質（または例えば、細胞内ドメインを欠く、短縮型ＣＤ４もしくはＣＤ１９タンパク質）をコードする核酸を含むウイルスベクターで形質導入される。形質導入された細胞を富化するために、ＣＤ４またはＣＤ１９を発現する細胞は、抗ＣＤ４または抗ＣＤ１９抗体で同定され得、フローサイトメトリーまたは免疫磁性方法を使用して単離され得る。改変されたＮＫ細胞を生成するための方法は、以下でより詳細に考察される。

開示される方法の特定の実施形態において、精製または単離されたＮＫ細胞は、拡大増殖させる前におよび／またはフィーダー細胞の非存在下で形質導入される。拡大増殖させる前にＮＫ細胞を形質導入することによって、拡大増殖されたＮＫ細胞を形質導入する場合より、必要とされるウイルス粒子の量を低減することが可能である（例えば、ウイルス粒子の量を、多くとも約１／１０、１／５０、１／１００、１／２００、１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／２０００、１／５０００、または１／１０，０００に減らす）。さらに、いくつかの例では、拡大増殖させる前に、ＮＫ細胞を形質導入するために、より単純であり、そして／またはより少ない労働力、費用、および／もしくは時間を要する。いくつかの例では、本発明者らは、ＮＫ細胞がウイルス粒子とフィーダー細胞層の存在下で接触された場合に、そのウイルスが、ＮＫ細胞よりむしろ、フィーダー細胞を優先的に形質導入したことを観察した。さらに、いくつかの例では、導入遺伝子は、フィーダー細胞に対して毒性であり得、ＮＫ細胞拡大増殖に負の影響を及ぼし得る。従って、いくつかの非限定的例では、ＮＫ細胞は、フィーダー細胞が存在しない場合により効率的に形質導入される。

他の実施形態において、そのＮＫ細胞は、フィーダー細胞（例えば、照射されたフィーダー細胞）の存在下で活性化、形質導入、および／または拡大増殖される。いくつかの例では、ＮＫ細胞は、形質導入（例えば、１〜５日間（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、または５日間）にわたる）の前に、フィーダー細胞（例えば、少なくとも１：１比（フィーダー細胞：ＮＫ細胞）、例えば、少なくとも２：１、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、またはこれより高い）の存在下で、本明細書で記載されるように活性化される。次いで、そのＮＫ細胞は形質導入され、１〜５日間にわたって（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、または５日間、例えば、３日間にわたって）、やはりフィーダー細胞の存在下で培養される。次いで、そのＮＫ細胞は、拡大増殖のために、フィーダー細胞（例えば、少なくとも２：１、５：１、１０：１、１５：１、２０：１の比のフィーダー細胞：ＮＫ細胞）とともに再度平板培養される。他の非限定的例では、ＮＫ細胞は単離され、フィーダー細胞とともに１０：１ フィーダー細胞：ＮＫ細胞で平板培養される。そのＮＫ細胞は、形質導入の前に、ＩＬ−２で２〜３日間活性化される。形質導入の３日後、そのＮＫ細胞は、１０：１ フィーダー細胞：ＮＫ細胞とともに再度平板培養され、拡大増殖のために、ＩＬ−２の存在下で継続して培養される。

他の実施形態において、そのＮＫ細胞は、フィーダー細胞の存在下で活性化される。そのフィーダー細胞は、その活性化ＮＫ細胞の形質導入の前に（例えば、ＣＤ１９またはＣＤ５６に関する免疫磁性選択を使用して）実質的に除去される。形質導入後に、そのＮＫ細胞は、フィーダー細胞の存在下で拡大増殖される。いくつかの例では、ＮＫ細胞は、形質導入前に（例えば、１〜５日間（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、または５日間にわたる）、フィーダー細胞（例えば、少なくとも１：１比（フィーダー細胞：ＮＫ細胞）、例えば、少なくとも２：１、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、またはこれより高い）の存在下で、本明細書で記載されるように活性化される。次いで、そのフィーダー細胞は、形質導入の前に、その活性化ＮＫ細胞から分離される。いくつかの例では、そのフィーダー細胞は、そのフィーダー細胞に特異的な細胞表面タンパク質（例えば、ＬＣＬフィーダー細胞に関してはＣＤ１９）に関する免疫磁性除去を使用して除去される。あるいは、そのフィーダー細胞は、ＮＫ細胞表面特異的タンパク質（例えば、ＣＤ５６）を使用して、そのＮＫ細胞から分離され得る。次いで、その分離されたＮＫ細胞は形質導入され、１〜５日間にわたって（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、または５日間、例えば、３日間にわたって）、フィーダー細胞の非存在下で培養される。その形質導入されたＮＫ細胞は、拡大増殖のために、フィーダー細胞（例えば、少なくとも２：１、５：１、１０：１、１５：１、２０：１比のフィーダー細胞：ＮＫ細胞）とともに再度平板培養される。他の非限定的例では、ＮＫ細胞は単離され、フィーダー細胞とともに１０：１ フィーダー細胞：ＮＫ細胞で平板培養される。そのＮＫ細胞は、形質導入の前に、２〜３日間にわたって、ＩＬ−２で活性化される。そのフィーダー細胞は、形質導入の前に、ＣＤ１９除去および／またはＣＤ５６選択を使用して除去される。形質導入の３日後、そのＮＫ細胞は、１０：１ フィーダー細胞：ＮＫ細胞とともに再度平板培養され、拡大増殖のために、ＩＬ−２の存在下で継続して培養される。

開示される方法は、改変されたＮＫ細胞において高効率導入遺伝子発現を提供する。いくつかの実施形態において、開示される方法で得られたＮＫ細胞における導入遺伝子発現は、２５％より高い（例えば、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、例えば、３０〜６０％、４５〜７５％、５０〜８０％、４０〜６０％、または４０〜５０％）。導入遺伝子発現はまた、形質導入後長期間持続し、例えば、１〜１０週間またはこれより長く（例えば、２〜４週間、３〜６週間、４〜８週間、７〜１０週間、またはこれより長く）持続する。いくつかの例では、その導入遺伝子は、形質導入後、少なくとも３日間、少なくとも５日間、少なくとも７日間、少なくとも１０日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、少なくとも４２日間、少なくとも４９日間、少なくとも５６日間、またはより長く発現される。他の例では、その導入遺伝子発現は、インビトロまたは被験体への投与後のいずれかで、ＮＫ細胞の寿命にわたって継続する。

Ａ．ＮＫ細胞の単離および富化
ＮＫ細胞のインビトロでの単離および富化に関する技術は、本明細書で記載される。例示的な手順は、米国特許出願公開番号２０１４／００８６８９０（その全体において本明細書に参考として援用される）に記載される。当業者は、ＮＫ細胞を拡大増殖させるためのさらなる方法（例えば、Ｃｈｉｌｄｓら， Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｔｈｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ２０１３：２３４−２４６， ２０１３（その全体において本明細書に参考として援用される）に記載されるとおり）を同定し得る。

単核細胞は、被験体（例えば、ドナー被験体または腫瘍もしくは過剰増殖性疾患もしくはウイルス感染を有する被験体）から、または処置されるべき被験体とＨＬＡが一致したドナーから、集められる。いくつかの例では、単核細胞は、アフェレーシス手順によって集められる。その単核細胞は、ＮＫ細胞に関して、例えば、免疫磁性ビーズストラテジーを使用した負の枯渇によって、富化される。いくつかの例では、ＮＫ細胞は、ビオチン化モノクローナル抗体の混合物を利用して、Ｔ細胞の単核細胞サンプル、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、血小板、マクロファージ、および赤血球を枯渇させることによって富化される。そのサンプル中の非ＮＫ細胞は、ストレプトアビジンに連結した磁性ビーズで除去され、ＮＫ細胞の富化された調製物を生じる。この方法に関する例示的な市販のキットは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ^ＴＭ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌｓキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）である。別の例では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^＋ ＮＫ細胞の正の選択によって、例えば、抗ＣＤ５６抗体に結合体化された磁性ビーズ（例えば、ＣＤ５６ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｉｎｃ．， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）を利用して、富化される。他の例では、負の枯渇（例えば、Ｔ細胞枯渇）、続いて、ＣＤ５６^＋ ＮＫ細胞の正の選択を含む２工程方法が、ＮＫ細胞を富化するために使用される。これらの方法は、現行の医薬品等の製造管理および品質管理に関する基準（ｃＧＭＰ）の下でまたはこれに適合させて、行われ得る。当業者は、ＮＫ細胞の富化された集団を調製するために使用され得る他の方法を同定し得る。

さらなる富化手順によって（例えば、免疫磁性ビーズもしくはフローソーティングの使用を通じて）単離されたバルクＮＫ細胞またはＮＫ細胞部分セットは、細胞培養培地中で増殖され得る。一例では、その培地は、１０％ ヒトＡＢ血清、５０Ｕ ／ｍＬ ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、および５００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２を含むＣｅｌｌｇｒｏ ＳＣＧＭ無血清培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）、または１０％ 熱非働化ヒトＡＢ血清もしくは１０％ 自家血清を含むＸ−ＶＩＶＯ^ＴＭ ２０培地である。

その単離されたＮＫ細胞は、マーカー（例えば、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、ＮＫＧ２Ｄ、ＬＦＡ−１、パーフォリン、ならびにグランザイムＡおよびＢ）の発現に関してフローサイトメトリーによって分析され得る。クロム放出アッセイは、細胞標的に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を評価するために使用され得る。当業者は、単離されたＮＫ細胞集団（例えば、純度、生存度、および／または活性）を評価するための他の方法を同定し得る。

いくつかの実施形態において、富化されたＮＫ細胞（代表的には、＞９９％ ＣＤ３陰性および＞８５％ ＣＤ５６＋）は、必要に応じてインビトロでも拡大増殖される。１つの非限定的例において、その富化されたＮＫ細胞は、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で２１日間まで、照射されたＥＢＶ−ＬＣＬフィーダー細胞株（例えば、ＳＭＩ−ＬＣＬ）とともに培養される。この技術を利用すると、２００倍〜１０００倍の範囲におけるＮＫ細胞の拡大増殖が達成され得る（拡大増殖されたＮＫ細胞は、代表的には＞９９％ ＣＤ３陰性および＞９０％ ＣＤ５６＋である）。いくつかの例では、富化されるＮＫ細胞の出発集団は、約０．８〜１．６×１０^８ 全ＮＫ細胞であり、これは、２〜４週間の期間にわたって、最大１０００倍またはこれを超えてインビトロで拡大増殖される。ＮＫ細胞の類似の数が、ＧＭＰ条件を使用するスケールアップされた実験で拡大増殖されている。いくつかの例では、ＮＫ細胞は、Ｇ−Ｒｅｘ（登録商標）容器（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ， Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ， ＭＮ）の中で拡大増殖される。Ｇ−Ｒｅｘ（登録商標）１００容器は、２．５×１０^８ ＮＫ細胞／ｋｇまたはこれより高い用量へのＮＫ拡大増殖を支援する。Ｇ−Ｒｅｘ（登録商標）１００容器中で培養されたＮＫ細胞は、４×１０^６ ＮＫ細胞／ｍｌまでの濃度において培養され得る。

Ｂ．ＮＫ細胞活性化
開示される方法は、形質導入前のＮＫ細胞の活性化（本明細書では「初回刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）ともいわれる）を含む。単離されたＮＫ細胞（例えば、＞９５％ ＣＤ３⁻および＞８５％ ＣＤ５６^＋または＞９９％ ＣＤ３⁻および＞９０％ ＣＤ５６^＋）は、第ＩＩＡ節に記載されるように調製されるか、または別の方法で得られる（例えば、低温保存された単離されたＮＫ細胞調製物のような以前の調製物から）。サイトカイン刺激は、代謝的活性化を誘導し、他のリンパ球部分セットに類似のＮＫ細胞における活性な遺伝子発現を可能にする。これは、効率的レンチウイルスベクター媒介性遺伝子形質導入で補助し得る。

開示される方法のいくつかの実施形態において、単離されたＮＫ細胞（例えば、被験体もしくはドナーから得られたＮＫ細胞、または被験体もしくはドナーから単離され拡大増殖されたＮＫ細胞）は、形質導入の前に、その単離されたＮＫ細胞を１種またはこれより多くのサイトカインとともに一定期間培養することによって活性化される。そのＮＫ細胞は、１種またはこれより多くのサイトカインを含む培養培地中で、形質導入前に１〜１４日間（例えば、１〜１０日間、１〜７日間、１〜５日間、２〜６日間、３〜８日間、１〜４日間、または１〜３日間）培養される。いくつかの例では、そのＮＫ細胞は、１種またはこれより多くのサイトカインとともに、形質導入前に１２時間、１８時間、または１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、または１４日間、培養される。いくつかの例では、そのＮＫ細胞は、１種またはこれより多くのサイトカインとともに、フィーダー細胞の非存在下での培養によって初回刺激される。必要に応じて、そのＮＫ細胞は、１種またはこれより多くのサイトカインおよび照射されたフィーダー細胞（例えば第ＩＩＣ節において考察されるもの）とともに、形質導入前に１〜１４日間培養することによって初回刺激される。

そのＮＫ細胞は、形質導入の前に、１種またはこれより多くのサイトカインとともに１〜１４日間培養される。その１種またはこれより多くのサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２１が挙げられる。いくつかの例では、そのＮＫ細胞は、ＩＬ−２を含む培養培地中、形質導入の前に１〜１４日間（例えば、１〜７日間、２〜６日間、５〜１０日間、または７〜１４日間）培養される。特定の例では、その単離されたＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下でかつ他のサイトカインは添加されずに培養されて、その活性化ＮＫ細胞の集団を生成する。ＩＬ−２は、約１０〜２０００ ＩＵ／ｍｌ（例えば、約５０〜１００ ＩＵ／ｍｌ、１００〜５００ ＩＵ／ｍｌ、２００〜６００ ＩＵ／ｍｌ、５００〜１０００ ＩＵ／ｍｌ、または１０００〜２０００ ＩＵ／ｍｌ、例えば、約１０ ＩＵ／ｍｌ、２０ ＩＵ／ｍｌ、５０ ＩＵ／ｍｌ、１００ ＩＵ／ｍｌ、２００ ＩＵ／ｍｌ、５００ ＩＵ／ｍｌ、１０００ ＩＵ／ｍｌ、１５００ ＩＵ／ｍｌ、２０００ ＩＵ／ｍｌ、またはこれより高い）において培養培地中でインキュベートされる。いくつかの非限定的例では、そのＮＫ細胞は、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２または１０００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培養培地中で、１〜６日間、２〜３日間、３〜５日間、または２日間活性化される。

他の例では、そのＮＫ細胞は、ＩＬ−１５を含む培養培地中で、形質導入前に１〜１４日間（例えば、１〜７日間、２〜６日間、５〜１０日間、または７〜１４日間）培養される。ＩＬ−１５は、約１〜１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、約１〜１０ｎｇ／ｍｌ、５〜２０ｎｇ／ｍｌ、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、２５〜７５ｎｇ／ｍｌ、または５０〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ ４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌ）において、その培養培地中に含まれる。１つの非限定的例では、そのＮＫ細胞は、１０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を含む培養培地中で、１〜６日間、２〜３日間、または３〜５日間活性化される。

なおさらなる例では、そのＮＫ細胞は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む培養培地中で、形質導入前に１〜１４日間（例えば、１〜７日間、２〜６日間、５〜１０日間、または７〜１４日間）、例えば、１〜１０００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２および１〜１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を含む培養培地中で、培養される。１つの非限定的例では、そのＮＫ細胞は、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５を含む培養培地中で、１〜６日間、２〜３日間、または３〜５日間活性化される。他の例では、そのＮＫ細胞は、ＩＬ−２およびＩＬ−２１を含む培養培地中で、形質導入前に１〜１４日間（例えば、１〜７日間、２〜６日間、５〜１０日間、または７〜１４日間）、例えば、１〜１０００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２および１〜１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２１を含む培養培地中で培養される。１つの非限定的例では、そのＮＫ細胞は、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２および２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２１を含む培養培地中で、１〜６日間、２〜３日間、または３〜５日間活性化される。別の例では、そのＮＫ細胞は、１〜１０００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２、１〜１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５、および１〜１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２１を含む培養培地中で、形質導入前に１〜１４日間（例えば、１〜７日間、２〜６日間、５〜１０日間、または７〜１４日間）培養される。１つの非限定的例では、そのＮＫ細胞は、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５、および２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−２１を含む培養培地中で、１〜６日間、２〜３日間、または３〜５日間活性化される。

いくつかの実施形態において、形質導入の前に、そのＮＫ細胞はまた、先天的免疫シグナル伝達またはウイルス感知の１種またはこれより多くのインヒビター（例えば、ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）および／もしくはＲＩＧ−Ｉ様レセプター（ＲＬＲ）のインヒビター、ＴＢＫ１／ＩＫＫεのインヒビター、ＡＩＭ２様レセプター（ＡＬＲ）のインヒビター、サイクリック−ＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＳ）のインヒビター、ならびに／またはインターフェロン遺伝子の刺激因子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅｓ）（ＳＴＩＮＧ）のインヒビター）の存在下で培養される。ＴＬＲ、ＲＬＲ、ＡＬＲ、ｃＧＡＳ、および／またはＳＴＩＮＧの例示的なインヒビターとしては、ＳＴ２８２５、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ＣｐＧ−５２３６４、ＳＭ９３４、ＩＲＳ−９５４、ＤＶ−１１７９、ＩＭＯ−３１００、ＩＭＯ−８４００、ＩＭＯ−９２００、ＩＨＮ−ＯＤＮ ２０８８、ＩＨＮ−ＯＤＮ−２４８８８、ＲＵ．５２１、ＰＦ−０６９２８２１５、Ｐｅｐｉｎｈ−ＭＹＤ、Ｐｅｐｉｎｈ−ＴＲＩＦ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、２−アミノプリン、ＢＡＹ１１−７０８２、セラストロール、ＣＬＩ−０９５、Ｈ−８９、ノルハルマン、およびＩＲＡＫ１／４インヒビターが挙げられる（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８：５０８， ２０１７； Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８：７５０， ２０１７； Ｓｕｔｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２３：１０９０−１１００， ２０１２； Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２：ｅ０１８４８４３， ２０１７を参照のこと）。ＴＢＫ１／ＩＫＫεの例示的なインヒビターとしては、ＢＸ７９５、ＭＲＴ６７３０７、ＡＺ１３１０２９０９、ＭＰＩ−０４８５５２０、アレキサノクス、化合物ＩＩ、ＳＲ８１８５およびＣＹＴ３８７が挙げられる（例えば、Ｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ． １１１：３３６−３４２， ２０１６を参照のこと）。他の非限定的例では、そのインヒビターはＢＸ７９５である。いくつかの例では、そのＮＫ細胞は、そのインヒビター（例えば、ＢＸ７９５）を含む培地中、形質導入の前に１〜１４日間（例えば、１〜７日間、２〜６日間、５〜１０日間、または７〜１４日間）にわたって、フィーダー細胞の存在下または非存在下で培養される。一例では、そのＮＫ細胞は、そのインヒビターを含む培地中、形質導入の前に約１〜２４時間（例えば、１〜８時間、６〜１８時間、または１２〜２４時間）にわたって培養される。一例では、そのインヒビターは、ＢＸ７９５（例えば、約０．２５μＭ〜１５μＭ（例えば、約０．２５μＭ〜約３μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約１．５μＭ〜約１２μＭ、約０．７５μＭ〜約３μＭ、または約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１．５μＭ、約３μＭ、約６μＭ、または約１２μＭ）である。他の非限定的例では、そのインヒビターは、１．５μＭ ＢＸ７９５である。

Ｃ．形質導入および形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖
その活性化（初回刺激）されたＮＫ細胞（例えば、第ＩＩＢ節に記載されるもの）は、１種またはこれより多くの異種核酸（例えば、目的のタンパク質をコードする１もしくはこれより多くの核酸、または目的の別の核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ））を含むウイルスベクターで形質導入される。特定の非限定的例では、そのベクターは、レンチウイルスベクターである。

ＮＫ細胞への遺伝子送達に適したウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、鶏痘、およびレンチウイルスベクターが挙げられる。本明細書で開示される特定の非限定的例では、ＮＫ細胞はまた、目的の１種またはこれより多くの異種核酸を含むレンチウイルスベクターで形質導入される。レンチウイルスシステムを使用するいくつかの利点としては、導入遺伝子の長期間の発現、分裂中の細胞および分裂していない細胞の両方を形質導入する能力、複雑な遺伝的エレメントを送達する能力、形質導入後のウイルスタンパク質の発現を欠くこと、ヒト細胞における挿入変異誘発を欠くこと、高力価生成、ならびにベクター操作および生成の容易さが挙げられる。

本明細書で開示されるのは、１種またはこれより多くの目的の異種核酸を含むレンチウイルスベクターまたは構築物である。特定の例では、その目的の核酸（例えば、ＩＩＩ節で記載されるもの）は、レンチウイルス遺伝子移入ベクターに含まれる（例えば、図１Ａを参照のこと）。その移入ベクター中の目的の核酸は、１種またはこれより多くの発現制御エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。例示的なプロモーターとしては、構成的プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＳＶ４０、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、伸長因子−１（ＥＦＳ）、ニワトリβ−アクチンショートプロモーター（ｃｈｉｃｋｅｎ β−ａｃｔｉｎ ｓｈｏｒｔ ｐｒｍｏｔｅｒ）（ＣＢＨ）、ＥＦ−１α（ＥＦ１ａ）プロモーター、またはＥＦ１ａショートプロモーター）、ハイブリッドプロモーター（例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合されたＣＭＶエンハンサー）、または誘導性もしくは組織特異的プロモーターが挙げられる。他の例では、例えば、その目的の核酸がｓｈＲＮＡである場合、その核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６またはＨ１プロモーター）に作動可能に連結され得る。

その移入ベクターに含まれ得るさらなる発現制御エレメントとしては、核酸の転写および／または翻訳を制御または調節する配列（例えば、エンハンサー、リーダー配列、転写ターミネーター、開始および／もしくは終止コドン、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライシングシグナル、ならびにポリアデニル化シグナル）が挙げられる。そのベクターまたは構築物が目的の２種（またはこれより多くの）異種核酸を含む例では、その核酸は、作動可能に連結され、例えば、ＩＲＥＳまたは他のマルチシストロン性エレメント（例えば、Ｐ２Ａおよび／またはＴ２Ａエレメント）によって分離される。そのベクターはまた、さらなるエレメント（例えば、パッケージングシグナル（例えば、レンチウイルスψパッケージングシグナル）、中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、またはＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ））を含み得る。いくつかの例では、そのレンチウイルスベクターは、自己不活型（ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）である。

目的の１種またはこれより多くの核酸を含むレンチウイルスベクターは、従来の分子生物学技術を利用して、当業者によって調製され得る。例えば、その目的の核酸は、レンチウイルス移入ベクターへとクローニングされ得る。レンチウイルスプラスミドシステム（例えば、３種または４種のプラスミドシステム）は、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）、またはＡｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）から市販されている。いくつかの例では、レンチウイルスベクターは、特定の用途に合うように（例えば、造血細胞において発現が持続して得られるように）改変される。いくつかの例では、その改変は、以下の実施例１に記載される改変の１またはこれより多くを含む。

いくつかの実施形態において、そのレンチウイルスベクターは、配列番号８〜１９のいずれか１つと少なくとも９０％ 配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有する核酸配列を含むかまたはからなる。いくつかの非限定的例では、そのレンチウイルスベクターは、配列番号８〜１９のいずれか１つの核酸配列を含むかまたはからなる。配列番号１６のベクターマップは、図２１Ａに示され、配列番号１７のベクターマップは、図２１Ｂに示される。

いくつかの実施形態において、その開示されるレンチウイルスベクターは、目的の核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。配列番号８〜１９におけるそのプロモーターおよび／またはその目的の核酸は、任意のプロモーターおよび／または目的の核酸で置換され得る。例えば、配列番号１６および１７のベクターは、ＰＧＫプロモーター（例えば、ヌクレオチド１９５９〜２４６９位）を含む；しかし、このプロモーターは、異なるプロモーター（例えば、ＥＦＳプロモーター（例えば、配列番号１０のヌクレオチド１９５９〜２１９０位））で置換され得る。あるいは、そのプロモーターに連結された核酸は、発現のための代替の核酸で置換され得る。一例では、配列番号１０のベクターは、ＥＧＦＰをコードする核酸（ヌクレオチド２２２１〜２９４０位）に連結されたＥＦＳプロモーター（例えば、ヌクレオチド１９５９〜２１９０位）を含む。本明細書で開示されるベクター中のＥＧＦＰをコードする核酸は、目的の異なる核酸をコードする核酸（ＣＸＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ３４ｔ（配列番号１６および１７における核酸位置は表３に示される）、ＣＤ４（または短縮型ＣＤ４）、ＣＤ１９（または短縮型ＣＤ１９）をコードする核酸、または目的の他の核酸（例えば、表１に示される導入遺伝子）をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない）で置換され得る。特定の例では、その目的の核酸は、ＰＧＫ、ＥＦＳ、またはＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結される。その開示されるベクターの他のエレメント（表４に示される）はまた、変更され得る（例えば、置換され得る）か、または望ましい場合には改変され得る。

レンチウイルス粒子は、哺乳動物細胞株（例えば、２９３Ｔ細胞またはその派生物）を、レンチウイルスシステムのプラスミド（例えば、図１Ａに図示される３種プラスミドシステム）でトランスフェクトすることによって生成される。トランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウムもしくはポリエチレンイミン媒介性トランスフェクションまたは市販のトランスフェクション試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）、ＦｕＧｅｎｅ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、またはＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）トランスフェクション試薬）を利用して、標準的方法によって行われる。トランスフェクション後に、レンチウイルス粒子は、培養培地へと放出され、採取される。いくつかの例では、そのトランスフェクトされた細胞は、約１８〜７２時間（例えば、約１８〜３６時間、２４〜４８時間、または３６〜７２時間、例えば、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、または７２時間）にわたって培養される。そのウイルス含有培地（これは、パッケージングされたレンチウイルス粒子を含む）が採取される。いくつかの例では、そのウイルスは、例えば、その培養上清の超遠心分離によって濃縮される（例えば、約２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはこれより高く）。そのウイルス調製物は、特定の容積中のウイルス粒子数（例えば、ｐ２４ ＥＬＩＳＡによって例えば、ｐｆｕ／ｍｌ）を決定するか、または目的のＲＮＡを含む粒子数（例えば、ＦＡＣＳ分析によって例えば、形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌ）を決定するために分析され得る。いくつかの例では、濃縮されたウイルス調製物は、約１０^７〜１０^１０ ＴＵ／ｍｌ（例えば、約１０^７〜１０^９、１０^８〜１０^１０、または１０^８〜１０^９ ＴＵ／ｍｌ）を含む。

形質導入されたＮＫ細胞は、第ＩＩＢ節で記載される活性化ＮＫ細胞と、レンチウイルス粒子とを、例えば、約０．５〜２００（例えば、約０．５〜５、１〜１０、５〜１５、１０〜２５、２０〜５０、４０〜８０、６０〜１００、７５〜１５０、または１００〜２００、例えば、約０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００）の感染多重度（ＭＯＩ）において接触させることによって生成される。いくつかの例では、そのＮＫ細胞は、約１０〜２０のＭＯＩまたは約２０のＭＯＩにおいてウイルスと接触される。いくつかの例では、その形質導入は、１種もしくはこれより多くのさらなる化合物（例えば、硫酸プロタミン（例えば、５〜５０μｇ／ｍｌ、例えば、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌ）または臭化ヘキサジメトリン（例えば、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）、例えば、約４〜４０μｇ／ｍｌ、例えば、４μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２４μｇ／ｍｌ、２８μｇ／ｍｌ、３２μｇ／ｍｌ、３６μｇ／ｍｌ、または４０μｇ／ｍｌ）、またはフィブロネクチンフラグメント（例えば、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標））の存在下にある。その細胞は、ウイルス粒子とともに、約６時間〜５日間（例えば、約６〜２４時間、１２〜４８時間、２４〜７２時間、４８〜６０時間、または７２〜９６時間）（例えば、約１日間、２日間、３日間、４日間、または５日間）にわたって培養される。

いくつかの実施形態において、そのＮＫ細胞は、先天的免疫シグナル伝達またはウイルス感知の１種またはこれより多くのインヒビター（例えば、ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）および／もしくはＲＩＧ−Ｉ様レセプター（ＲＬＲ）のインヒビター、ＴＢＫ１／ＩＫＫεのインヒビター、ＡＩＭ２様レセプター（ＡＬＲ）のインヒビター、サイクリック−ＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＳ）のインヒビター、ならびに／またはインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）のインヒビター）の存在下で形質導入される。ＴＬＲ、ＲＬＲ、ＡＬＲ、ｃＧＡＳ、および／またはＳＴＩＮＧの例示的なインヒビターとしては、ＳＴ２８２５、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ＣｐＧ−５２３６４、ＳＭ９３４、ＩＲＳ−９５４、ＤＶ−１１７９、ＩＭＯ−３１００、ＩＭＯ−８４００、ＩＭＯ−９２００、ＩＨＮ−ＯＤＮ ２０８８、ＩＨＮ−ＯＤＮ−２４８８８、ＲＵ．５２１、ＰＦ−０６９２８２１５、Ｐｅｐｉｎｈ−ＭＹＤ、Ｐｅｐｉｎｈ−ＴＲＩＦ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、２−アミノプリン、ＢＡＹ１１−７０８２、セラストロール、ＣＬＩ−０９５、Ｈ−８９、ノルハルマン、およびＩＲＡＫ１／４インヒビターが挙げられる（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８：５０８， ２０１７； Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８：７５０， ２０１７； Ｓｕｔｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２３：１０９０−１１００， ２０１２； Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２：ｅ０１８４８４３， ２０１７を参照のこと）。ＴＢＫ１／ＩＫＫεの例示的なインヒビターとしては、ＢＸ７９５、ＭＲＴ６７３０７、ＡＺ１３１０２９０９、ＭＰＩ−０４８５５２０、アレキサノクス、化合物ＩＩ、ＳＲ８１８５およびＣＹＴ３８７が挙げられる（例えば、Ｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ． １１１：３３６−３４２， ２０１６を参照のこと）。いくつかの例では、そのＮＫ細胞は、フィーダー細胞の存在下または非存在下で、そのインヒビターを含む培地中で形質導入される。他の非限定的例では、そのインヒビターは、ＢＸ７９５（例えば、約０．２５μＭ〜１５μＭ（例えば、約０．２５μＭ〜約３μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約１．５μＭ〜約１２μＭ、約０．７５μＭ〜約３μＭ、または約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１．５μＭ、約３μＭ、約６μＭ、または約１２μＭ））である。他の非限定的例では、そのインヒビターは、１．５μＭ ＢＸ７９５である。

そのＮＫ細胞をそのレンチウイルスで形質導入した後に、そのウイルス粒子（および存在する場合、先天的免疫シグナル伝達またはウイルス感知の１種またはこれより多くのインヒビター）は、（例えば、培養培地を交換し、必要に応じて、その細胞を洗浄することによって）除去される。いくつかの例では、その導入遺伝子を発現するＮＫ細胞は、必要に応じて、拡大増殖する前に選択される（以下）。例えば、その導入遺伝子が、その細胞表面上で発現される場合、その導入遺伝子を発現するＮＫ細胞は、免疫磁性技術またはフローサイトメトリーによって富化され得る。例えば、そのＮＫ細胞が、短縮型ＣＤ３４分子（ＣＤ３４ｔ）、短縮型ＣＤ１９分子、または短縮型ＣＤ４分子をコードする核酸を含むベクターで形質導入される場合、形質導入されたＮＫ細胞は、その形質導入されたＮＫ細胞の集団と適切な抗体（例えば、抗ＣＤ３４抗体）とを接触させ、その分子（例えば、ＣＤ３４）を発現するＮＫ細胞を、例えば、フローサイトメトリーまたは免疫磁性ビーズ（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標） ＣＤ３４試薬システム， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡまたはＩｓｏｌｅｘ（登録商標） ３００磁性細胞選択システム， Ｎｅｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．， Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ）を使用して、例えば、形質導入の約２〜４日後に精製することによって、選択または富化され得る。他の導入遺伝子（例えば、ＣＤ１９またはＣＤ４）を発現するＮＫ細胞は、フローサイトメトリーまたはその導入遺伝子に特異的な免疫磁性ビーズを使用して、同様に選択または富化され得る（例えば、図２９Ａを参照のこと）。

次いで、その形質導入されたＮＫ細胞は、その細胞を、１〜４０日間またはそれより長く（例えば、３〜１４日間、５〜２１日間、７〜２８日間、１４〜３０日間、２１〜４０日間、またはこれより長く、例えば、１日間、３日間、５日間、７日間、１０日間、１４日間、２１日間、２８日間、３５日間、４２日間、またはこれより長く）培養することによって拡大増殖される。いくつかの例では、その形質導入されたＮＫ細胞は、少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地中で拡大増殖される。いくつかの例では、その形質導入されたＮＫ細胞は、ＩＬ−２（例えば、１−１０００ ＩＵ／ｍｌ、例えば、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２）を含む培地（例えば、Ｘ−ＶＩＶＯ^ＴＭ ２０またはＸ−ＶＩＶＯ^ＴＭ １５培地（Ｌｏｎｚａ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））中で培養することによって拡大増殖される。いくつかの実施形態において、１種またはこれより多くのさらなるサイトカインは、その形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖において利用され得る（ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−１２が挙げられるが、これらに限定されない）。他の例では、その形質導入されたＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下でかつ他のサイトカインは添加されずに培養される。

いくつかの例では、フィーダー細胞（例えば、照射されたフィーダー細胞）は、拡大増殖工程の間に形質導入されたＮＫ細胞培養物に添加される。そのフィーダー細胞は、ＮＫ細胞の拡大増殖を支援し得る量（例えば、少なくとも２：１比（フィーダー細胞：ＮＫ細胞）、例えば、５：１。１０：１、１５：１、２０：１、またはこれより高い）で添加される。例示的なフィーダー細胞としては、ＥＢＶ−ＬＣＬ（ＴＭ−ＬＣＬ、ＳＭＩ−ＬＣＬ）、同種異系または自家ＰＢＭＣ、ウィルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ、およびＫ５６２細胞（例えば、遺伝的に改変したＫ５６２細胞、例えば、Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬまたはＫ５６２−ｍｂＩＬ−２１細胞）が挙げられる。いくつかの例では、その形質導入されたＮＫ細胞は、選択された比でフィーダー細胞と混合され、その細胞混合物は、平板培養される。

これらの技術を利用して、１００倍〜１０００倍（例えば、２００倍〜５００倍、３００倍〜７００倍、または６００倍〜１０００倍）の範囲の形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖が、達成され得る。

拡大増殖後に、その改変されたＮＫ細胞は、フィーダー細胞から分離される（使用される場合）。その改変されたＮＫ細胞は、１回またはこれより多く洗浄され、適切な緩衝液または他の薬学的に受容可能なキャリア中に、例えば、被験体への投与のために再懸濁される。いくつかの例では、その細胞は採取され、洗浄される（例えば、緩衝液（例えば、リン酸緩衝化食塩水）中で）。そのＮＫ細胞は、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ^ＴＭマルチ電解質注射物（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、自家血漿、または薬学的に受容可能なキャリア（例えば、平衡塩類溶液）を含む培地中で再懸濁され得る。いくつかの例では、改変されたＮＫ細胞のいくらかまたは全てが、後の使用のために低温保存される。

いくつかの例では、改変されたＮＫ細胞は、被験体への投与の前に、例えば、細胞生存度、腫瘍細胞細胞傷害性、および導入遺伝子発現の１またはこれより多くに関して試験される。さらなる例では、改変されたＮＫ細胞の表現型は、投与前に、例えば、フローサイトメトリーによって、例えば、１種またはこれより多くの細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、ＮＫＧ２Ｄ、ＬＦＡ−１、パーフォリン、またはグランザイムＡおよびＢ）の存在および／または量を測定することによって評価される。

ＩＩＩ．改変されたＮＫ細胞
本明細書で開示されるのは、異種核酸を含むか、または目的の１種もしくはこれより多くの異種タンパク質もしくは核酸を発現するＮＫ細胞（本明細書では「改変されたＮＫ細胞」といわれる）である。１種またはこれより多くの異種核酸を含む改変されたまたは組換えＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を、１種またはこれより多くの異種核酸を有するベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を含むウイルス粒子で、例えば、本明細書で開示される方法を使用して形質導入することによって生成され得る。その改変されたＮＫ細胞は、被験体への投与のための治療用組成物へと、例えば、１種またはこれより多くの薬学的に受容可能なキャリアとともに製剤化され得る。治療用組成物およびそれらの使用法は、以下の第ＩＶ節で考察される。

改変されたＮＫ細胞は、１種またはこれより多くの導入遺伝子（例えば、目的のタンパク質をコードするか、または別の核酸もしくはタンパク質（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはアンチセンス核酸）の発現を調節し得る１種またはこれより多くの異種核酸）を含むウイルスベクターまたはウイルス粒子（例えば、レンチウイルスベクターまたはレンチウイルス粒子）で形質導入されたＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、その核酸は、タンパク質を発現する改変されたＮＫ細胞を、標的組織または細胞タイプに標的化することを促進するそのタンパク質をコードする。例えば、その核酸は、タンパク質を発現するＮＫ細胞を、腫瘍細胞または腫瘍細胞の部位に標的化することを増大させるそのタンパク質をコードし得る。１つの非限定的例では、その導入遺伝子は、骨髄もしくはリンパ節へと（例えば、Ｃ−Ｃケモカインレセプタータイプ７（ＣＣＲ７）、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインレセプタータイプ４（ＣＸＣＲ４；例えば、野生型ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ４ Ｒ３３４Ｘ）、またはＣＤ３４）または炎症部位へと（例えば、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインレセプタータイプ３（ＣＸＣＲ３））、ＮＫ細胞の標的化を増大する。他の例では、その導入遺伝子は、腫瘍細胞上で発現されるエピトープに結合するタンパク質（例えば、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ））をコードする。他の実施形態において、その核酸は、ＮＫ細胞の抗体依存精細胞媒介性細胞傷害性を増大させるタンパク質（例えば、高親和性ＣＤ１６（ＣＤ１６−Ｖ１５８））をコードする。

従って、特定の例では、本明細書で開示される改変されたＮＫ細胞は、ケモカインレセプター（例えば、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７、またはＣＸＣＲ３）をコードする異種核酸を含むＮＫ細胞（例えば、ＮＫ細胞の集団）である。他の例では、その改変されたＮＫ細胞は、細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６−Ｖ１５８）、ＣＤ３４、ダブルネガティブＴＧＦβタイプＩＩレセプター、ＶＬＡ−４（α４β−１）、ＬＦＡ−１、ＣＤ４、またはＣＤ１９）をコードする異種核酸を含むＮＫ細胞（例えば、ＮＫ細胞の集団）である。さらなる例では、その改変されたＮＫ細胞は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）、例えば、ＣＤ１９−ＣＡＲ、ＣＤ２０−ＣＡＲ、ＣＤ３３−ＣＡＲ、ＣＤ１３８−ＣＡＲ、ＣＳ１−ＣＡＲ、ＧＤ２−ＣＡＲ、ＨＥＲ２−ＣＡＲ、ｅｒｂＢ２−ＣＡＲ、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）−ＣＡＲ、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）−ＣＡＲ、ナチュラルキラーグループ２、メンバーＤ、ロングフォーム（ＮＫＧ２Ｄ−Ｌ）−ＣＡＲ、またはＴＲＡＩＬレセプター１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）−ＣＡＲをコードする異種核酸を含むＮＫ細胞（例えば、ＮＫ細胞の集団）である。なおさらなる例では、その改変されたＮＫ細胞は、組換えＴＲＡＩＬ（例えば、ＮＫ細胞ＴＲＡＩＬ媒介性腫瘍死滅を増強するために）、ＤＲ５特異的ＴＲＡＩＬ、組換えＦＡＳ−リガンド（例えば、ＦＡＳ−リガンド媒介性腫瘍死滅を増強するために）、ＤＮＡＭ−１（例えば、ＮＫ細胞活性化および腫瘍死滅を増強するために）、ＮＫ細胞活性化レセプター（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、もしくはＮＫｐ４６）（例えば、腫瘍死滅を増強するために）、またはＮＫＧ２Ｃ（例えば、ＮＫ細胞のウイルス感染細胞殺傷を増強するために）で形質導入される。

１つの非限定的例では、その改変されたＮＫ細胞は、プロモーター（例えば、ＰＧＫプロモーター）に作動可能に連結されたＣＸＣＲ４をコードする異種核酸、またはプロモーター（例えば、ＰＧＫプロモーター）に作動可能に連結されたＣＤ３４ｔおよびＣＸＣＲ４をコードする核酸を含む。他の非限定的例では、その改変されたＮＫ細胞は、プロモーター（例えば、ＰＧＫプロモーター）に作動可能に連結された高親和性ＣＤ１６をコードする異種核酸、またはプロモーター（例えば、ＰＧＫプロモーター）に作動可能に連結されたＣＤ３４ｔおよび高親和性ＣＤ１６をコードする核酸を含む。別の非限定的例では、その改変されたＮＫ細胞は、プロモーター（例えば、ＰＧＫプロモーター）に作動可能に連結されたＣＸＣＲ４および高親和性ＣＤ１６をコードする異種核酸、またはプロモーター（例えば、ＰＧＫプロモーター）に作動可能に連結されたＣＤ３４ｔ、ＣＸＣＲ４、および高親和性ＣＤ１６をコードする核酸を含む。いくつかの例では、ＣＸＣＲ４をコードする核酸は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性）を有する核酸を含むかまたはこれからなる、および／あるいは配列番号２と少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるタンパク質をコードする。いくつかの例では、ＣＤ３４ｔをコードする核酸は、配列番号３と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性）を有する核酸を含むかまたはこれからなる、および／あるいは配列番号４と少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるタンパク質をコードする。いくつかの例では、高親和性ＣＤ１６をコードする核酸は、配列番号５もしくは配列番号６と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性）を有する核酸を含むかまたはこれからなる、および／あるいは配列番号７と少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるタンパク質をコードする。

他の例では、その改変されたＮＫ細胞は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（例えば、小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））をコードする核酸を含むウイルスベクターで形質導入され得る。一例では、その改変されたＮＫ細胞は、異種ＮＫＧ２Ａ ｓｈＲＮＡ核酸を含むＮＫ細胞（例えば、ＮＫ細胞の集団）である。

ＩＶ．ある状態を処置または阻害する方法
本明細書で開示されるのは、本明細書で記載される改変されたＮＫ細胞を被験体に投与することによって、疾患または障害を有する被験体を処置する方法である。本明細書で記載される改変されたＮＫ細胞は、動物またはヒト被験体のいずれかに投与され得る。いくつかの実施形態において、その疾患または障害は、腫瘍または過剰増殖性疾患である。他の実施形態において、その疾患または障害は、ウイルス感染（サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、エプスタイン・バーウイルス、またはヒト免疫不全ウイルスの感染が挙げられるが、これらに限定されない）である。

本明細書で記載される改変されたＮＫ細胞は、薬学的組成物へと組みこまれ得る。このような組成物は、代表的には、改変されたＮＫ細胞の集団および薬学的に受容可能なキャリアを含む。「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与と適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）および吸収遅延剤などを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， 編者，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， 第２１版，２００５を参照のこと）。このようなキャリアまたは希釈剤の例としては、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、平衡塩類溶液、および５％ ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。補助的活性化合物はまた、その組成物へと組みこまれ得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、以下のような刊行物中でより詳細に記載される：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， 編者，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， 第２１版（２００５）。１つの非限定的例では、その形質導入されたＮＫ細胞は、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ^ＴＭ マルチ電解質溶液中で懸濁される。

いくつかの例では、その組成物は、約１０^４〜１０^１２個の改変されたＮＫ細胞（例えば、約１０^４〜１０^７個の細胞、約１０^６〜１０^９個の細胞、または約１０^８〜１０^１２個の細胞）を含む。例えば、その組成物は、約１０^６〜１０^１０個の改変されたＮＫ細胞／ｋｇ（例えば、約１０^６個、１０^７個、１０^８個、１０^９個、または１０^１０個の細胞／ｋｇ）が被験体に投与されるように調製され得る。改変されたＮＫ細胞の集団は、代表的には非経口的に、例えば、静脈内に投与される；しかし、腫瘍もしくは腫瘍の近くへの注射または注入（局所投与）または腹腔への投与がまた、使用され得る。当業者は、適切な投与経路を決定し得る。

改変されたＮＫ細胞の集団の複数の用量は、被験体に投与され得る。例えば、改変されたＮＫ細胞の集団は、毎日、１日おきに、１週間に２回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月、またはより少ない頻度で投与され得る。熟練の臨床医は、被験体、処置されている状態、以前の処置履歴、および他の要因に基づいて投与スケジュールを選択し得る。

さらなる例では、その被験体はまた、ＮＫ細胞の生存および／または増殖を支援するために１種またはこれより多くのサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、および／またはＩＬ−１２）が投与される。そのサイトカインは、ＮＫ細胞の前に、後に、または実質的に同時に投与される。いくつかの例では、そのサイトカインは、ＮＫ細胞の後に投与される。１つの具体例では、そのサイトカインは、ＮＫ細胞の投与後の約１〜８時間以内（例えば、約１〜４時間、約２〜６時間、約４〜６時間、または約５〜８時間以内）でその被験体に投与される。

いくつかの例では、その方法は、過剰増殖性障害（例えば、血液悪性疾患または固形腫瘍）を処置または阻害する工程を包含する。血液悪性疾患の例としては、白血病（急性白血病（例えば、１１ｑ２３陽性急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病）、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、真性多血症、リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（無痛性および高悪性度形態）、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、Ｈ鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病および脊髄形成異常が挙げられる）が挙げられる。

固形腫瘍（例えば、肉腫および癌腫）の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜肉腫（ｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵臓がん、乳がん（基底様乳癌（ｂａｓａｌ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳管癌（ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および小葉性乳癌（ｌｏｂｕｌａｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含む）、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭状癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫）が挙げられる。

特定の例では、本明細書で開示される方法によって阻害または処置され得る血液悪性疾患としては、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、前リンパ球性／骨髄球性白血病、形質細胞性白血病、ＮＫ細胞白血病、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、および濾胞性リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる特定の例では、本明細書で開示される方法によって処置または阻害され得る固形腫瘍としては、肺癌、前立腺がん、膵臓がん（例えば、インスリノーマ）、乳がん、結腸直腸腺癌または扁平上皮癌、神経芽腫、精巣がん（例えば、精上皮腫）、および卵巣がんが挙げられる。具体的な非限定的例では、被験体は、慢性骨髄性白血病または急性単球性白血病を有する。例示的な障害を有する被験体を処置するために使用されうる改変されたＮＫ細胞による発現のための例示的な導入遺伝子は、表１に示される。しかし、当業者は、他の障害を有する被験体を処置するための適切な導入遺伝子を発現するＮＫ細胞を選択しうる。

いくつかの例では、被験体（例えば、腫瘍または過剰増殖性障害を有する被験体）はまた、１種もしくはこれより多くの化学療法剤および／または放射線療法が投与される。当業者は、例えば、処置されている腫瘍または障害のタイプに基づいて、本明細書で記載される改変されたＮＫ細胞と組み合わせて被験体に投与するために、さらなる化学療法剤を選択しうる。このような薬剤としては、以下が挙げられる：アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタードまたはクロラムブシル）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジン））；代謝拮抗物質（例えば、葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート）、ピリミジンアナログ（例えば、５−ＦＵまたはシタラビン）、およびプリンアナログ（例えば、メルカプトプリンまたはチオグアニン））；または天然生成物（例えば、ビンカ・アルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドまたはテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣ）、および酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ））。さらなる薬剤としては、白金配位錯体（例えば、シス−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩ（シスプラチンとしても公知））、置換されたウレア（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、および副腎皮質抑制剤（ａｄｒｅｎｏｃｒｏｔｉｃａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）（例えば、ミトタンおよびアミノグルテチミド）；ホルモンおよびアンタゴニスト、例えば、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール（ｍａｇｅｓｔｒｏｌ ａｃｅｔａｔｅ））、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、ならびにアンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）が挙げられる。最も一般的に使用される化学療法薬の例としては、アドリアマイシン、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、Ａｒａ−Ｃ（シタラビン）、カルムスチン、ブスルファン、ロムスチン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、ダウノルビシン、ダカルバジン、５−フルオロウラシル、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル（または他のタキサン（例えば、ドセタキセル））、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６が挙げられる一方で、より新しい薬物としては、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、イマチニブ（ＳＴＩ−５７１）、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ（登録商標））、カペシタビン、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、およびカルシトリオールが挙げられる。

いくつかの特定の例では、改変されたＮＫ細胞は、ＣＤ１６ Ｖ１５８を発現し、さらなる薬剤は、抗がんモノクローナル抗体である。具体的な非限定的例では、ＣＤ１６−Ｖ１５８を発現する改変されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８に結合する抗体（例えば、ダラツムマブ）と組み合わせて多発性骨髄腫を有する被験体に投与される。別の特定の例では、ＣＤ１６−Ｖ１５８を発現する改変されたＮＫ細胞は、ＣＤ２０に結合する抗体（例えば、リツキシマブ）と組み合わせてリンパ腫を有する被験体に投与される。ＣＤ１６−Ｖ１５８を発現する改変されたＮＫ細胞と組み合わせて被験体に投与されうるさらなる例示的なモノクローナル抗体は、表２に提供される。

以下の実施例は、ある種の特定の特徴および／または実施形態を例証するために提供される。これらの実施例は、本開示を、その記載される特定の特徴または実施形態に限定すると解釈されるべきではない。

実施例１
材料および方法
細胞株および試薬： ヒト骨髄性白血病株（赤白血病タイプ）Ｋ５６２（ＡＴＣＣ）および急性単球性白血病細胞株ＭＯＬＭ−１４（ＡＴＣＣ）、およびＥＢＶ−ＳＭＩ−ＬＣＬを、ＲＰＭＩ １６４０（１０％ 熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ， Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭ グルタミン、および１００ Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充）中で培養した。２９３Ｔ細胞株（ＳＶ４０ラージＴ抗原を安定して発現するヒト胚性腎臓細胞株２９３）（ＡＴＣＣから）を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびに１０％ ＦＢＳを補充）中で培養した。それら細胞を、３７℃および５％ ＣＯ_２において９５％ 湿度下で培養した。

ヒト末梢血由来ＮＫ細胞の培養および拡大増殖： 健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、米国国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， ＵＳＡ）の輸血医学部門における治験審査委員会が承認したプロトコルで、アフェレーシス（Ａｍｉｃｕｓ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ； Ｆｅｎｗａｌ， Ｌａｋｅ Ｚｕｒｉｃｈ， ＩＬ， ＵＳＡ）によって集めた。細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配媒体上での遠心分離によって富化した。ＮＫ細胞を、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＮＫ細胞単離キットを使用して、製造業者の指示に従ってドナーＰＢＭＣから単離した。示されたＮＫ細胞を、ＮＫ細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ^ＴＭ ２０培地（Ｌｏｎｚａ）（１０％ 熱非働化ヒトＡＢ血漿（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および５００ ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ）を補充）中、照射したＥＢＶ−ＳＭＩ−ＬＣＬ細胞の存在下で１：１０の比において１１〜２１日間拡大増殖させた。その細胞を、３７℃および６．５％ ＣＯ_２において培養した。その培地の半分を、新鮮なＮＫ細胞培地と交換し、５日間、拡大増殖させた。その後、ＮＫ細胞を計数し、７日目から実験において利用するまで、４８時間ごとに０．５〜１×１０^６ 細胞／ｍｌへと調節した。

レンチウイルスベクターシステム： 本研究において使用されるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１ベースのレンチウイルス遺伝子移入ベクターは、中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）を含むさらなる１１８−ｂｐの配列がそのベクターの中に導入されたことを除いて、Ｄｕｌｌら（Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７２： ８４６３−８４７１， １９９８）によって記載される自己不活型構築物ｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＳＩＮ−１８に類似であった。さらに、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）骨格を、導入遺伝子発現および／またはウイルスベクター力価を増強するために含めた。導入遺伝子の転写を駆動するために使用される内部サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターＣＭＶプロモーターを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの増幅によって、ヒトホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターで置き換えた。パッケージングプラスミドｐＣＭＶΔＲ８．９１（全てのＨＩＶ−１アクセサリ遺伝子を欠く）を使用して、ＨＩＶ−１ ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、およびｒｅｖ遺伝子を発現し、それによって、レンチウイルス構造タンパク質および調節タンパク質を生成した。ＣＭＶプロモーターによって駆動される水疱性口内炎ウイルスエンベロープＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）コード配列、続いて、β−グロビンポリアデニル化部位を有するプラスミドｐＭＤ．Ｇを、ベクター粒子を偽型化するために使用した。プラスミドｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＳＩＮ−１８、ｐＣＭＶΔＲ８．９１、およびｐＭＤ．Ｇは、親切なことに、Ｄ．Ｔｒｏｎｏ教授（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ＣＭＵ， Ｇｅｎｅｖａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって提供された。

レンチウイルスベクター生成： ＶＳＶ−Ｇエンベロープで偽型化した複製欠損レンチウイルス粒子を、１２μｇの遺伝子移入構築物ｐＲＲＬｓｉｎ．ＰＰＴ．ｈＰＧＫ．ｅＧＦＰ．Ｗｐｒｅ、１０μｇのｐＣＭＶΔＲ８．９１、および５μｇのｐＭＤ．Ｇで、２９３Ｔ細胞の３種プラスミド一過性トランスフェクションによって、リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を以前に記載された（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙら， Ｂｌｏｏｄ ９６：１３０９−１３１６． ２０００）ように使用して、生成した。そのトランスフェクション培地を、８時間後に、新鮮な培養培地と交換した。ウイルス上清を、トランスフェクション後６５時間で採取し、０．４５μｍフィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）を通して濾過した。そのウイルス上清を、４℃で５０，０００ｇにおいて１．５時間の超遠心分離によって５０×に濃縮した。ウイルスペレットを、Ｘ−ＶＩＶＯ^ＴＭ ２０培地（Ｌｏｎｚａ）中で再懸濁し、−８０℃において使用するまで貯蔵した。ウイルス上清の力価を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｈｉａｌｅａｈ， ＦＬ）によってｐ２４ ｇａｇの定量によって、およびウイルス上清の系列希釈物での２９３Ｔ細胞の形質導入によっても決定し、続いて、形質導入の４８時間後に、ＥＧＦＰ陽性細胞のフローサイトメトリー分析を行った。１ｎｇのｐ２４は、１０００〜５０００形質導入単位にほぼ等しいと想定された。全てのレンチウイルスベクター調製物を、２９３Ｔ細胞を形質導入し、少なくとも５回の細胞継代後にｐ２４ ｇａｇの存在に関して培養培地をアッセイすることによって、複製能のあるレンチウイルス（ＲＣＬ）の存在に関して試験した。ＲＣＬは、試験したベクター調製物のいずれにおいても検出不能であった。

サイトカインで初回刺激したかまたはＬＣＬで刺激した初代ヒトＮＫ細胞のレンチウイルス形質導入： 培養したヒトＮＫ細胞を、１ｍｌ／ウェルのＮＫ培養培地（ＩＬ−２（５００ ＩＵ／ｍｌまたは１０００ ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、またはＩＬ−２（５００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充）を含む２４ウェルプレートにおいて、感染多重度（ＭＯＩ）において、硫酸プロタミン（１０μｇ／ｍｌ， Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で濃縮したレンチウイルスベクター粒子で形質導入した。形質導入の４８時間後に、細胞を洗浄し、ＩＬ−２（５００ ＩＵ／ｍｌ）を含む新鮮なＮＫ細胞培養培地中で、照射したＥＢＶ−ＳＭＩ−ＬＣＬの存在下または非存在下で（ＬＣＬ 対 ＮＫ比は１０：１）、培養した。いくつかの条件では、初代ＮＫ細胞を、４８時間にわたるレンチウイルスベクターでの形質導入の前に、種々の時間の長さでＥＢＶ−ＳＭＩ−ＬＣＬ（ＬＣＬ 対 ＮＫ比は１０：１）と共培養し、次いで、細胞を、洗浄し、ＩＬ−２（５００ ＩＵ／ｍｌ）を含む新鮮なＮＫ細胞培養培地中で培養した。ＮＫ培養物の生存度を、トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）染色を使用して、形質導入の前後に定期的にモニターした。その表現型およびｅＧＦＰ発現を、フローサイトメトリーによって規則的な間隔でモニターした。

フローサイトメトリー： その培養したＮＫ細胞を、標準的な手順に従って、培養および拡大増殖後の異なる時点でのフローサイトメトリーによって表現型決定した。以下の試薬を表現型特徴づけにおいて使用した：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）の抗ＣＤ５６（ＮＣＡＭ−１）、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ１６（３Ｇ８）、抗ＴＲＡＩＬ（ＲＩＫ−２）、抗ＮＫｐ４６（２９Ａ１．４）、およびＩｇＧ１（ＭＯＰＣ２１）；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒの抗ＫＩＲ２ＤＬ１／ＤＳ１（ＥＢ６）、抗ＫＩＲ２ＤＬ２／３／ＤＳ２（ＧＬ１８３）、および抗ＮＫＧ２Ａ（Ｚ１９９）；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄの抗ＫＩＲ３ＤＬ１（Ｄｘ９）、抗ＣＤ５７（ＨＣＤ５７）、ＮＫｐ４４（クローンｐ４４−８、ＦＡＳ（クローンＤＸ２）、ＣＸＣＲ３（クローン１２Ｇ５）、ＣＸＣＲ４（クローンＧ０２５Ｈ７）、およびＢＶ６５０−ストレプトアビジン；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅの抗Ｌｉｒ−１（ＨＰ−Ｆ１）；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓの抗ＮＫＧ２Ｃ（１３４５９１）；Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存度マーカーまたはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）；ＵＣＳＦのビオチン化抗ＫＩＲ３ＤＬ２（Ｄｘ３１）一次抗体。ＢＶ６５０−ストレプトアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ビオチン化抗ＫＩＲ３ＤＬ２を検出した。簡潔には、細胞を、適切な濃度の異なる染料結合体化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と混合した。一次Ａｂの添加および室温での２０分間のインキュベーションの後に、細胞を、１％ ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）またはＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を、死細胞排除のために使用した。全てのデータを、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＣａｎｔｏ ＩＩまたはＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して獲得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して分析した。各サンプルにおいて、最低でも１０，０００個の細胞を、対数増幅蛍光および線形増幅の側方散乱シグナルおよび前方散乱シグナルを使用して、生細胞の分析領域において獲得した。全てのサンプルを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ陰性細胞またはＰＩ陰性細胞を使用して、リンパ球集団の周りに適切なゲートを設定することによって分析した。分析パラメーターの一貫性を、フローサイトメーターを較正用ビーズ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で較正することによって確認した。形質導入した細胞におけるＥＧＦＰ発現を、ＦＬ１チャネルにおいて５３０／３０ｎｍバンドパスフィルタを使用して、％緑色蛍光陽性細胞を検出することによって決定した。

細胞傷害性アッセイ： ナチュラルキラー細胞を、１：１の比で^５１Ｃｒ標識Ｋ５６２細胞またはＭｏｌｍ−１４細胞のいずれかとともに、最終容積２００μｌにおいて９６ウェルプレート中、３７℃および５％ ＣＯ_２で共培養した。４時間後、上清を、Ｌｕｍａプレート上に採取した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して数を測定し、比標的溶解を、以下の式を使用して計算した：［（ＮＫ細胞で誘導された^５１Ｃｒ放出−自発的^５１Ｃｒ放出）／（最大^５１Ｃｒ放出−自発的^５１Ｃｒ放出）×１００］。

実施例２
ＮＫ細胞のレンチウイルス形質導入に対するＩＬ−２初回刺激の効果
この実施例は、レンチウイルスベクターを使用するＮＫ細胞の形質導入に対するＩＬ−２での初回刺激の効果および形質導入されたＮＫ細胞の特徴づけを記載する。

形質導入前にＮＫ細胞を初回刺激するための条件および形質導入後の培養条件を、評価した。最初の実験では、ＩＬ−２でのＮＫ細胞の初回刺激を評価した。１つの実験では、ＬＣＬフィーダー細胞上でのＮＫ細胞を、種々の感染多重度（ＭＯＩ）の、ｅＧＦＰ導入遺伝子を含むレンチウイルス粒子での形質導入前に３日間、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で初回刺激した。細胞を、ウイルス粒子とともに２日間インキュベートし、次いで、ウイルス粒子を洗い流し、その細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地で培養した。第２の実験では、ＮＫ細胞を、ｅＧＦＰ導入遺伝子を含むレンチウイルス粒子での形質導入前に３日間、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で初回刺激した。細胞を２日間インキュベートし、次いで、ウイルス粒子を洗い流し、その細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地で照射したＬＣＬフィーダー細胞上で培養した。ｅＧＦＰ発現を、形質導入後７日目に、ＦＡＣＳによって評価した。ＣＤ５６＋細胞上でのｅＧＦＰ発現は、２つの条件間で類似であった（図３）が、ＬＣＬおよびＩＬ−２で初回刺激し、形質導入後にＩＬ−２のみで増殖した細胞（条件１）において僅かに高かった。

ＮＫ細胞形質導入に対するＩＬ−２初回刺激の影響を、ＮＫ細胞を５００ ＩＵ／ｍｌ
ＩＬ−２で形質導入前に１〜５日間初回刺激することによって評価した。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、照射したＬＣＬを１０：１比（ＬＣＬ：ＮＫ細胞）で添加し、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。２日間またはこれより長い日数にわたるＩＬ−２での初回刺激は、約２５％またはこれより高い形質導入効率を生じた（図４）。ＮＫ細胞はまた、ＩＬ−２（５００ ＩＵ／ｍｌ）を含む培地で、ＭＯＩ ２０での形質導入前に３日間、初回刺激した。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、照射したＬＣＬ（１０：１比のＬＣＬ：ＮＫ細胞）を添加し、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。導入遺伝子発現は、形質導入後少なくとも４０日間にわたって安定なままであり（図５Ａ）、細胞生存度は、形質導入後少なくとも２８日間にわたって非形質導入細胞に匹敵したままであった（図５Ｂ）。

ＮＫ細胞形質導入に対するＬＣＬ刺激の影響もまた、評価した。ＮＫ細胞を、ＩＬ−２（５００ ＩＵ／ｍｌ）を含む培地中で、形質導入前の１〜１４日間にわたって照射したＬＣＬで刺激した。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。形質導入効率は、形質導入前のＬＣＬ刺激の日数とともに増大した（図６）。

ＬＣＬ刺激後の形質導入後の導入遺伝子発現の持続および細胞生存度を、試験した。ＮＫ細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で、照射したＬＣＬ（ＮＫ細胞と１０：１比）とともに培養し、０日目、３日目、７日目、または１４日目に形質導入した。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。ｅＧＦＰ発現は、各条件下で形質導入後４０日間まで、安定なままであった（図７、上）。形質導入後２１日間までの細胞生存度は、３日間の初回刺激で改善し、形質導入前の７日間にわたる初回刺激で最高であった（図７、下）。

３名の被験体の初代ヒト末梢ＮＫ細胞を、照射したＬＣＬ上で、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２とともにＭＯＩ １０での形質導入前の１４日間にわたって培養した。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。ｅＧＦＰ発現を、形質導入の７日後（図８Ａ）および形質導入後のさらなる時点で（図８Ｂ）、ＦＡＣＳによって分析した。

実施例３
ＮＫ細胞のレンチウイルス形質導入に対するＩＬ−２およびＩＬ−１５初回刺激の効果
この実施例は、レンチウイルスベクターを使用するＮＫ細胞の形質導入に対するＩＬ−２およびＩＬ−１５での初回刺激の効果、ならびに形質導入されたＮＫ細胞の特徴づけを記載する。

ＮＫ細胞形質導入に対するＩＬ−１５初回刺激（単独で、またはＩＬ−２との組み合わせで）の効果を、評価した。ＮＫ細胞を、ＩＬ−２（５００ ＩＵ／ｍｌまたは１０００ ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、またはＩＬ−２（５００ ＩＵ／ｍｌ）＋ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む培地中で、ＭＯＩ ２０での形質導入前に３日間培養した。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、照射したＬＣＬを添加し（ＮＫ細胞と１０：１比）、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。ＩＬ−２＋ＩＬ−１５で初回刺激したＮＫ細胞は、ＩＬ−２またはＩＬ−１５単独で初回刺激したものより、形質導入に対してより許容性であった（図９）。ＩＬ−２＋ＩＬ−１５で初回刺激した細胞はまた、少なくとも２８日間、高頻度で導入遺伝子の長期間の発現を維持した（図１０）。

実施例４
ＮＫ細胞表現型に対するレンチウイルス形質導入の効果
この実施例は、レンチウイルスで形質導入されたＮＫ細胞の表現型を記載する。

ＮＫ細胞表現型に対するレンチウイルス形質導入の効果を、ＮＫ細胞上でクローン性に発現されたレセプターの発現を分析することによって決定した。ＮＫ細胞を、ＩＬ−２（５００ ＩＵ／ｍｌ）またはＩＬ−２（５００ ＩＵ／ｍｌ）＋ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む培地中で、ＭＯＩ ２０での形質導入前に３日間培養した。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、照射したＬＣＬを添加し（ＮＫ細胞と１０：１比）、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。両方の条件下で、ＮＫ細胞表現型に対する影響はなかった（図１１および図１２）。

ＮＫ細胞活性を評価するために、３名の異なる健康なドナーのＮＫ細胞を、照射したＬＣＬ＋５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２、ＩＬ−２単独（５００ ＩＵ／ｍｌ）またはＩＬ−２（５００ ＩＵ／ｍｌ）＋ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）で、形質導入前の３日間、初回刺激した。細胞を、照射したフィーダーＬＣＬ＋５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で１４日間拡大増殖させ、次いで、それらの腫瘍死滅能力を、Ｋ５６２細胞（慢性骨髄性白血病細胞）またはＭＯＬＭ１４細胞（急性骨髄性白血病細胞）に対して試験した。形質導入されたＮＫ細胞の細胞死滅活性は、全ての初回刺激条件に関して非形質導入細胞のものに類似であった（図１３）。

実施例５
培養および形質導入の条件のさらなる評価
この実施例は、ＮＫ細胞の活性化、形質導入、および拡大増殖のための条件を評価するさらなる実験を記載する。

ＮＫ細胞形質導入に対するＩＬ−２初回刺激の影響を、ＧＦＰ導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターでの形質導入前に１〜６日間、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２でＮＫ細胞を初回刺激することによって評価した。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、照射したＬＣＬを１０：１比（ＬＣＬ：ＮＫ細胞）で添加し、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。形質導入効率は、１〜４日間の初回刺激とともに増大し、次いで、５日目および６日目に僅かに低下した（図１４）。細胞生存度は、１〜３日間の初回刺激で１００％に近いままであり、次いで、低下した（図１４）。従って、ＩＬ−２での２〜３日間の初回刺激は、形質導入効率および細胞生存度の最良のバランスを提供するようである。

初回刺激に関するサイトカインの組み合わせの影響を、再評価した。ＮＫ細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌもしくは５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２＋２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１２、または５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５＋２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１２で、３日間初回刺激した。ＧＦＰ導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターでの形質転換の２日後に、ウイルス粒子を除去し、照射したＬＣＬを、１０：１比（ＬＣＬ：ＮＫ細胞）で添加し、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。ＩＬ−２単独とサイトカイン組み合わせとの間で、形質導入効率における有意差は観察されなかった（図１５）。

形質導入試薬をまた、形質導入効率およびその後のＮＫ細胞拡大増殖に対する効果の両方に関して試験した。ＮＫ細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で３日間初回刺激し、次いで、硫酸プロタミン、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）、またはＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬を使用して、ＧＦＰ導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、照射したＬＣＬを１０：１比（ＬＣＬ：ＮＫ細胞）で添加し、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）またはＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬を含めると、形質導入効率が硫酸プロタミンと比較して有意に増大した（図１６Ａ）。その後のＮＫ細胞生存度は、硫酸プロタミンと比較して、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）試薬を使用して形質導入したＮＫ細胞において有意に低下した一方で、生存度は、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）またはＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬を使用して形質導入したＮＫ細胞間で有意に異ならなかった（図１６Ｂ）。

種々のプロモーターを、ＮＫ細胞形質導入効率に関して評価した。ＰＧＫ、ＵＢＣ、ＥＦ１Ａ、ＥＦＳ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＣＡＧ、またはＣＢＨプロモーターに作動可能に連結されたＧＦＰ導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターを、構築した。ＮＫ細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で３日間、初回刺激した。５、２０、または１００でのＭＯＩにおけるレンチウイルスベクターでの形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、照射したＬＣＬを１０：１比（ＬＣＬ：ＮＫ細胞）で添加し、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。試験した全ての構築物は、形質導入されたＮＫ細胞においてＧＦＰ発現を生じた（図１７）。ＰＧＫ、ＥＦＳ、およびＳＶ４０プライマーは、最高の形質導入効率を生じた。さらに、ＧＦＰ発現は、０日目での発現と比較して、形質導入後の１４日間の拡大増殖にわたって安定であった（図１８）。

最後に、形質導入されたＮＫ細胞の機能を評価した。ＮＫ細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で３日間、初回刺激した。ＰＧＫ、ＥＦＳ、またはＳＶ４０プロモーターに連結されたＧＦＰ導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターでの形質導入の２日後に、ウイルス粒子を除去し、照射したＬＣＬを１０：１比（ＬＣＬ：ＮＫ細胞）で添加し、細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で維持した。その形質導入された細胞は、Ｋ５６２細胞に対する応答において模擬形質導入細胞と比較して、等しい脱顆粒を、ならびにＰＭＡ／イオノマイシンに対する応答において自発的および最大の脱顆粒を示した（図１９）。その細胞はまた、非形質導入細胞と比較して、Ｋ５６２細胞またはＰ／Ｉに対する応答において等しいＣＤ１０７ａ発現（脱顆粒のマーカー）、ならびにＩＦＮγおよびＴＮＦα分泌を示した（図２０）。

実施例６
さらなる導入遺伝子でのＮＫ細胞の形質導入
この実施例は、目的のさらなる導入遺伝子でのＮＫ細胞の形質導入を記載する。

ＣＸＣＲ４をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを、構築した（図２１Ａ）。ＮＫ細胞を、ＭＯＩ ２０での形質導入前に３日間、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で活性化した。形質転換されたＮＫ細胞を、ウイルス形質導入の２日後に、照射したＥＢＶ−ＬＣＬとともに１４日間拡大増殖させた。このベクターで形質導入したＮＫ細胞は、非形質導入細胞と比較して、ＣＸＣＲ４の増大した発現を示した（図２２Ａ）。ＣＤ３４の細胞外および膜貫通ドメインを含むが、細胞内シグナル伝達ドメインを欠く短縮型ＣＤ３４分子をコードする核酸に連結されたＣＸＣＲ４をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを、構築した（図２１Ｂ）。このベクター（上記で記載されるとおり）で形質導入したＮＫ細胞は、非形質導入細胞と比較して、ＣＤ３４の発現およびＣＸＣＲ４の増大した発現を示した（図２２Ｂ）。

実施例７
マウスモデルにおける形質導入されたＮＫ細胞の評価
この実施例は、過剰増殖性障害のマウスモデルにおいて異種核酸を発現する改変されたＮＫ細胞の機能および有効性を評価するための方法を記載する。しかし、当業者は、これらの特定の方法から外れる方法がまた、動物モデルにおいて形質導入されたＮＫ細胞を評価するために使用されうることを認識する。

骨髄腫のマウスモデルは、免疫不全マウス（例えば、ＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ−ｈｕ、またはＳＣＩＤ−ｒａｂマウス）に悪性形質細胞を注射することによって、またはＣ５７ＢＬ／ＫａｌｗＲｉｊマウスに同種異系悪性形質細胞（例えば、５Ｔ２ＭＭ、５Ｔ３３、または５ＴＧＭ１細胞）を注射することによって、生成される。一例では、多発性骨髄腫細胞株を、ＮＳＧマウスの尾静脈に注射し、ＮＫ細胞のｉ．ｖ．注入でマウスを処置する前に、７〜１４日間にわたって確立させる。ヒトＮＫ細胞を活性化し（２〜３日間にわたって５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２）、次いで、ルシフェラーゼまたはＣＸＣＲ４をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターで形質導入する。拡大増殖後に（５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２とともにＥＢＶ−ＬＣＬ細胞上で１４日間）、その改変されたＮＫ細胞（１００万〜２０００万個の細胞）を、マウスに投与する。

マウスを、ＮＫ細胞注入の７日後、１４日後、および２１日後に屠殺し、骨（大腿骨から流し出した骨髄）の中の骨髄腫細胞の％を決定して、腫瘍負荷に対する異なるＮＫ細胞（形質導入 対 非形質導入）の影響を評価する。改変されたＮＫ細胞の生存および局在化を、ルシフェラーゼコードベクターで形質導入した改変されたＮＫ細胞を注射したマウスの生体発光画像化によって評価し得る。

実施例８
過剰増殖性障害を有する被験体を処置するための方法
この実施例は、過剰増殖性障害を有する被験体を、異種核酸を発現する改変されたＮＫ細胞で処置するための方法を記載する。しかし、当業者は、これらの特定の方法を外れる方法がまた、被験体において過剰増殖性障害を成功裡に処置または阻害するために使用されうることを理解する。

過剰増殖性障害（例えば、多発性骨髄腫）を有する被験体は、アフェレーシスを受けて、末梢血単核細胞を集める。ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ５６陽性／ＣＤ３陰性細胞）を、免疫磁性法を使用して、正および／または負の選択によってＰＢＭＣから単離する。その単離されたＮＫ細胞を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地中で２日間培養する。そのＮＫ細胞を、次いで、目的の異種核酸を有するウイルスベクターを含むレンチウイルス粒子と２日間接触させる。その異種核酸は、ＣＸＣＲ４、高親和性ＣＤ１６、または両方であり得る。いくつかの例では、そのベクターはまた、短縮型ＣＤ３４核酸を含む。そのウイルス粒子を除去し、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む培地および照射されたフィーダー細胞（１０：１比のフィーダー細胞：ＮＫ細胞）を添加し、そのＮＫ細胞を１４〜２８日間拡大増殖させる。そのベクターがＣＤ３４ｔを含む場合、ＩＬ−２およびフィーダー細胞の添加の前に、ＣＤ３４発現ＮＫ細胞を、ＣＤ３４＋免疫磁性ビーズ選択を使用して富化する。その拡大増殖させたＮＫ細胞は、後の使用のために低温保存され得るか、またはその被験体への投与のために（例えば、薬学的に受容可能なキャリア中で）製剤化されうる。１０^６〜１０^１２個の拡大増殖させたＮＫ細胞を含む組成物を、被験体に静脈内投与する。ＣＤ３８を発現する多発性骨髄腫を有する患者をまた、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）で処置し得る。その被験体の腫瘍の応答を、５年間までモニターする。

実施例９
レンチウイルス発現ベクター
レンチウイルス発現ベクターを、Ｖｅｃｔｏｒｂｕｉｌｄｅｒ ｄｅｓｉｇｎ ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｃｙａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）を使用して構築した。そのベクターは、種々のプロモーターおよびＥＧＦＰまたはＰＧＫプロモーターおよび種々のヒトタンパク質を含んだ。そのベクターは、配列番号８〜１７の配列（表３に示されるとおり）を有する。さらなるベクター構成要素および各配列におけるそれらの位置は、表４に示される。

実施例１０
フィーダー細胞共培養でのＮＫ細胞の活性化
ヒト末梢血から単離したＮＫ細胞を、１００Ｇｙ照射ＳＭＩ−ＬＣＬありまたはなしで培養した。３日後に、細胞培養物を、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）培地上で遠心分離して、死細胞を除去し、計数し、ｐＬＶ［Ｅｘｐ］−ＰＧＫ＞ＥＧＦＰ：Ｔ２Ａ：Ｌｕｃ（Ｔ２Ａペプチドをコードし、コドン最適化ルシフェラーゼがさらに挿入された配列を有する配列番号１４）で、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｔａｋａｒａ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）被覆プレートを使用して、レンチウイルスで形質導入した。さらに３日後、細胞を再度計数し、１０倍過剰のＬＣＬとともに再度平板培養した。細胞を、１０％ 熱非働化ヒトＡＢ血清、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２、および２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ^ＴＭ補充物を補充したＸ−ＶＩＶＯ^ＴＭ ２０培地（Ｌｏｎｚａ）中で終始維持し、計数して、拡大増殖倍数を決定した。最初に、ＬＣＬ（１０：１比）とともにその後のＬＣＬ添加なしで培養した非形質導入ＮＫ細胞を、比較のために試験した。形質導入の前に１０倍過剰のＬＣＬとともに培養した細胞は、形質導入の前にＬＣＬとともに培養しなかった細胞と比較して、改善された拡大増殖を有し、非形質導入細胞に類似の拡大増殖倍数を有した（図２３）。

実施例１１
形質導入前のＩＬ−２培養物での初代ＮＫ細胞のレンチウイルス形質導入
ＰＢＭＣに由来するＮＫ細胞を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ被覆プレートにおいて、２０：１ ＭＯＩでｐＬＶ［Ｅｘｐ］−ＰＧＫ＞ＥＧＦＰベクターでの形質導入前に、５００ Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２とともに０〜５日間培養した。形質導入の３日後、細胞を、フローサイトメトリーによって、ＧＦＰ発現および生存度に関してアッセイした。図２４Ａは、ＧＦＰ＋ ＮＫ細胞の代表的ゲーティングを示す。平均およびＳＥＭ（３名のドナーからの実験の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）ＧＦＰのｌｏｇ_１０変換した値についての）を示す（図２４Ｂ）。これは、形質導入前のＩＬ−２の存在下でのＮＫ細胞の活性化が、効率的な形質導入を提供しかつＮＫ細胞生存度を維持することを確認する。

ＰＢＭＣに由来するＮＫ細胞を、その示されたプロモーター配列およびＧＦＰを含むレンチウイルスベクターでの形質導入の前に、ＩＬ−２で３日間刺激した。形質導入の３日後、ＮＫ細胞を、フローサイトメトリーによって、ＧＦＰ発現（パーセントおよびＧＭＦＩ）に関して試験した（図２５Ａ〜Ｃ）。照射ＳＭＩ−ＬＣＬフィーダー細胞を、その形質導入されたＮＫ細胞に添加し、さらに１４日間（合計２０日間）共培養した。ＮＫ細胞における導入遺伝子発現の経時的な安定性を、その６日目のＥＧＦＰ％をその２０日目のＥＧＦＰ％で除算することによって定量し、パーセントとして表した（図２５Ｄ）。ＰＧＫ、ＥＦＳ、およびＳＶ４０プライマーは、最高の形質導入効率を生じた（図２５Ｂ）。しかし、いくつかのプロモーターは、ＥＦＳ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＣＢＨ、およびＥＦ１Ａプロモーターを含め、ＰＧＫプロモーターと比較して、形質導入遺伝子発現の改善されたレベルを提供した（図２５Ｃ）。

そのレンチウイルスベクター内の挿入物配列の種々の組み合わせを、ヒトＮＫ細胞における形質導入効率に関して試験した。ＰＢＭＣに由来するＮＫ細胞を、図２６Ａに示されるように、ＰＧＫプロモーター、ＧＦＰ、Ｐ２Ａ−リンカー、ＩＲＥＳ、短縮型ＣＤ３４タンパク質、およびコドン最適化短縮型ＣＤ３４タンパク質（ＣＤ３４ｏｐｔ）の組み合わせをコードする挿入物配列を含むレンチウイルスベクターでの形質導入の前に、ＩＬ−２で３日間刺激した。さらに３日後、ＮＫ細胞を、フローサイトメトリーによって、ＧＦＰおよびＣＤ３４の表面発現に関して測定した（図２６Ａ）。ＣＤ３４ｏｐｔおよびＥＦＳプロモーターをコードするベクターでのＮＫ細胞の形質導入をまた、試験した（図２６Ｂ）。そのベクター中にＧＦＰに対して遠位に挿入物配列を配置すると、ヒトＮＫ細胞におけるそれらの形質導入効率が増強されるようであった。

形質導入の前にフィーダー細胞の存在下で、ＩＬ−２でのＮＫ細胞の予備刺激の効果をまた、試験した。ＰＢＭＣに由来するＮＫ細胞を、ＩＬ−２またはＩＬ−２ ＋ ＳＭＩ−ＬＣＬフィーダー細胞（ＬＣＬ＋ＩＬ−２）で３日間刺激した。ＮＫ細胞を、２０：１ ＭＯＩにおいてｐＬＶ−ＥＦＳ−ＧＦＰ−２Ａ−ＣＤ３４ｏｐｔウイルス粒子での形質導入の前に、抗ＣＤ５６ビーズとの共培養物から除去した。さらに３日後、ＳＭＩ−ＬＣＬを両方の条件に添加し、ＮＫ細胞を、実験開始から２１日目まで培養した。ＮＫ細胞を、フローサイトメトリーによって、ＧＦＰおよびＣＤ３４導入遺伝子発現に関して試験した（図２７Ａ）。ＮＫ細胞数を、培養の間中頻繁に計数し、その拡大増殖倍数を計算した（図２７Ｂ）。入力に対する形質導入された細胞の全体収量を、全細胞の拡大増殖倍数×各条件に関するＧＦＰ^＋ＣＤ３４^＋割合のかけ算をすることによって計算した（図２７Ｃ）。類似の実験を行って、形質導入（２０：１ ＭＯＩでのｐＬＶ−ＥＦＳ−ＧＦＰ−２Ａ−ＣＤ３４ｏｐｔ）の前に、ＳＭＩ−ＬＣＬでの刺激の最適な期間（２〜７日間）を決定した。形質導入されたＮＫ細胞は、各場合において２回目に、形質導入の３日後にＳＭＩ−ＬＣＬの添加を受け、培養物を、実験開始から２１日目まで追跡した。形質導入された細胞のパーセンテージ、細胞の拡大増殖倍数、および入力に対する形質導入された細胞の全体収量を、３名のドナーからの実験に関して決定した（図２７Ｄ）。レンチウイルス形質導入の前のＳＭＩ−ＬＣＬフィーダー細胞でのヒトＮＫ細胞の予備刺激は、培養物におけるＮＫ細胞拡大増殖後の形質導入された細胞の全体収量を増強するようであった。

ＰＢＭＣに由来するＮＫ細胞を、ＳＭＩ−ＬＣＬフィーダー細胞 ＋ ＩＬ−２で５日間刺激した。ＮＫ細胞を、種々の用量のＢＸ７９５の存在下でのｐＬＶ−ＥＦＳ−ＧＦＰ−２Ａ−ＣＤ３４ｏｐｔウイルス粒子での形質導入の前に、抗ＣＤ５６ビーズとの共培養物から除去した。１日後に、ＮＫ細胞を、ＢＸ７９５なしの培地へと交換した。さらに２日後、ＳＭＩ−ＬＣＬを再び添加し、ＮＫ細胞を実験開始から２１日目まで培養し、細胞数を終始モニターした。ＮＫ細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰおよびＣＤ３４発現に関してアッセイした。その入力細胞に対する形質導入された細胞の全体収量を、細胞の拡大増殖倍数×ＧＦＰ^＋ＣＤ３４^＋細胞の割合のかけ算をすることによって計算した（図２８Ａ）。類似の実験を行って、１．５μＭ ＢＸ７９５の添加ありまたはなしでの形質導入の前に、（ｉ）ＩＬ−２または（ｉｉ）ＩＬ−２ ＋ ＳＭＩ−ＬＣＬフィーダー細胞で５日間刺激した細胞を比較した（図２８Ｂ）。ＢＸ７９５とＳＭＩ−ＬＣＬフィーダー細胞での予備刺激とを合わせると、レンチウイルスで形質導入したエキソビボで拡大増殖したヒトＮＫ細胞のその後の増殖が増大した。

ＮＫ細胞を、抗ＣＤ３免疫磁性ビーズ除去、続いて、抗ＣＤ５６免疫磁性ビーズ陽性選択を介して、ＰＢＭＣから単離した。細胞を、ＳＭＩ−ＬＣＬ ＋ ＩＬ−２で４〜５日間刺激した。得られた細胞を、１．５μＭ ＢＸ７９５の存在下で、コドン最適化短縮型ＣＤ３４、短縮型ＣＤ１９、または短縮型ＣＤ４をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。１日後に、細胞を、ＢＸ７９５なしの培地へと交換した。さらに２日後、形質導入されたＮＫ細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ１９、またはＣＤ４を認識する免疫磁性ビーズを使用して選択した。陽性選択したＮＫ細胞をＳＭＩ−ＬＣＬとともに培養し、細胞の増殖を、実験開始から２１日目まで追跡した（図２９Ａおよび２９Ｂ）。細胞数を終始モニターし、入力細胞に対する形質導入された細胞の全体収量を、細胞の拡大増殖倍数×ＧＦＰおよび導入遺伝子発現の両方に関して陽性の割合のかけ算をすることによって計算した。

図２９Ａおよび２９Ｂに関して上記で記載されるように形質導入し、拡大増殖させたヒトＮＫ細胞を、Ｋ５６２標的細胞（１：１比）とともに平板培養したか、または示されるように、ＰＭＡ ＋ イオノマイシンで処理した。脱顆粒を、抗ＣＤ１０７ａ抗体を用いて２時間後にアッセイし、サイトカイン生成を、６時間後に、細胞内フローサイトメトリー染色によって、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αに関して測定した。レンチウイルスで形質導入し、ＳＭＩ−ＬＣＬフィーダーとともに拡大増殖させたヒトＮＫ細胞は、完全な脱顆粒 ＋ ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α生成を示した（図３０）。

上記に加えて、または上記の代わりに、以下の実施形態が記載される：

実施形態１は、１種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法に関し、上記方法は、活性化ＮＫ細胞の集団を生成するために、単離されたＮＫ細胞の集団を、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で少なくとも２日間培養する工程；形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成するために、上記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで形質導入する工程；ならびに形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を生成するために、上記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、ＩＬ−２および照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程、を包含する。

実施形態２は、実施形態１に記載の方法に関し、ここでａ）上記ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下かつ照射されたフィーダー細胞の非存在下で培養される、および／もしくは上記活性化ＮＫ細胞は、照射されたフィーダー細胞の非存在下で、上記ウイルスベクターで形質導入される；またはｂ）上記ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下かつ照射されたフィーダー細胞の存在下で培養される、および／もしくは上記活性化ＮＫ細胞は、照射されたフィーダー細胞の存在下で、上記ウイルスベクターで形質導入される。

実施形態３は、実施形態１または実施形態２に記載の方法に関し、ここで上記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養する工程は、上記単離されたＮＫ細胞の集団を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で培養することを包含する。

実施形態４は、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法に関し、ここで上記１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

実施形態５は、実施形態４に記載の方法に関し、ここで上記レンチウイルスベクターは、配列番号８〜１７のいずれか１つと少なくとも９０％ 配列同一性を有する核酸配列を含むかまたはからなる。

実施形態６は、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法に関し、ここで上記照射されたフィーダー細胞 対 上記形質導入されたＮＫ細胞の比は、１０：１である。

実施形態７は、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法に関し、ここで上記照射されたフィーダー細胞は、、エプスタイン・バーウイルスで形質転換されたリンパ芽球系細胞株またはＫ５６２細胞を含む。

実施形態８は、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法に関し、ここで上記異種核酸は、以下をコードする： 高親和性ＣＤ１６（ＣＤ１６−Ｖ１５８）、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、ＣＤ３４、ダブルネガティブＴＧＦβタイプＩＩレセプター、もしくはＶＬＡ−４、ＬＦＡ−１；腫瘍細胞上で発現される抗原に特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であって、ここで上記異種核酸は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＳ１、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ｅｒｂＢ２−、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄ−Ｌ、もしくはＴＲＡＩＬ−Ｒ１に特異的に結合するＣＡＲをコードする、ＣＡＲ；細胞内ドメインを欠く短縮型ＣＤ３４タンパク質をコードする核酸分子；および／または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、もしくはアンチセンス核酸。

実施形態９は、実施形態２ｂに記載の方法に関し、ここで上記ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下かつ照射されたフィーダー細胞の存在下で培養されて、活性化ＮＫ細胞の集団を生成し、上記フィーダー細胞は、ＣＤ１９免疫除去を使用して、上記活性化ＮＫ細胞から実質的に分離される。

実施形態１０は、腫瘍、過剰増殖性疾患、またはウイルス感染を有する被験体を処置する１方法に関し、上記方法は、単離されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を、上記被験体またはドナーから得る工程；活性化ＮＫ細胞の集団を生成するために、単離されたＮＫ細胞の集団を、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で少なくとも２日間培養する工程；形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成するために、上記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで形質導入する工程；形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を生成するために、上記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、ＩＬ−２および照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程；ならびに上記形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を含む組成物を、上記被験体に投与する工程、を包含する。

実施形態１１は、実施形態１０に記載の方法に関し、ここで： ａ）上記ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下かつ照射されたフィーダー細胞の非存在下で培養される；および／もしくは上記活性化ＮＫ細胞は、照射されたフィーダー細胞の非存在下で、上記ウイルスベクターで形質導入される；またはｂ）上記ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下かつ照射されたフィーダー細胞の存在下で培養される；および／もしくは上記活性化ＮＫ細胞は、照射されたフィーダー細胞の存在下で、上記ウイルスベクターで形質導入される。

実施形態１２は、実施形態１０または１１の記載の方法に関し、ここで上記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養する工程は、上記単離されたＮＫ細胞の集団を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で培養することを包含する。

実施形態１３は、実施形態１０〜１２のいずれか１つに記載の方法に関し、ここで上記１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

実施形態１４は、実施形態１３に記載の方法に関し、ここで上記レンチウイルスベクターは、配列番号８〜１７のいずれか１つと少なくとも９０％ 配列同一性を有する核酸配列を含むかまたはからなる。

実施形態１５は、実施形態１３に記載の方法に関し、ここで上記レンチウイルスベクターは、ＰＧＫ、ＥＦＳ、またはＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結された目的の核酸を含む。

実施形態１６は、実施形態１０〜１５のいずれか１つに記載の方法に関し、ここで上記照射されたフィーダー細胞 対 上記形質導入されたＮＫ細胞の比は、１０：１である。

実施形態１７は、実施形態１０〜１６のいずれか１つに記載の方法に関し、ここで上記照射されたフィーダー細胞は、エプスタイン・バーウイルスで形質転換されたリンパ芽球系細胞株またはＫ５６２細胞を含む。

実施形態１８は、実施形態１０〜１７に記載の方法に関し、ここで上記異種核酸は、以下をコードする： 高親和性ＣＤ１６（ＣＤ１６−Ｖ１５８）、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、ＣＤ３４、ダブルネガティブＴＧＦβタイプＩＩレセプター、もしくはＶＬＡ−４、ＬＦＡ−１；腫瘍細胞上で発現される抗原に特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であって、ここで上記異種核酸は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＳ１、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ｅｒｂＢ２−、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄ−Ｌ、もしくはＴＲＡＩＬ−Ｒ１に特異的に結合するＣＡＲをコードするＣＡＲ；細胞内ドメインを欠く短縮型ＣＤ３４タンパク質をコードする核酸分子；および／または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、もしくはアンチセンス核酸。

実施形態１９は、実施形態１１ｂに記載の方法に関し、ここで上記ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下かつ照射されたフィーダー細胞の存在下で培養されて、活性化ＮＫ細胞の集団を生成し、上記フィーダー細胞は、ＣＤ１９免疫除去を使用して、上記活性化ＮＫ細胞から実質的に分離される。

実施形態２０は、実施形態１０〜１９のいずれか１つに記載の方法に関し、ここで上記形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を含む組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む。

実施形態２１は、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法によって生成される、１種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー細胞に関する。

実施形態２２は、１種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物に関し、ここで上記ナチュラルキラー細胞は、実施形態１０〜２０のいずれか１つに記載の方法によって生成される。

本開示の原理が適用され得る多くの考えられる実施形態に鑑みて、例証される実施形態が例示に過ぎず、本発明の範囲を限定すると理解されるべきではないことは、認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。本発明者らは、従って、これらの請求項の範囲および趣旨の範囲内に入る全てを、本発明者らの発明として特許請求する。

Claims (32)

1. １種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、前記方法は、
   活性化ＮＫ細胞の集団を生成するために、単離されたＮＫ細胞の集団を、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で少なくとも２日間培養する工程；
   形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成するために、前記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで形質導入する工程；ならびに
   形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を生成するために、前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、ＩＬ−２および照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程、
   を包含する、方法。
2. ａ）前記ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下でかつ照射されたフィーダー細胞の非存在下で培養される、および／もしくは前記活性化ＮＫ細胞は、照射されたフィーダー細胞の非存在下で、前記ウイルスベクターで形質導入される；または
   ｂ）前記ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下でかつ照射されたフィーダー細胞の存在下で培養される、および／もしくは前記活性化ＮＫ細胞は、照射されたフィーダー細胞の存在下で、前記ウイルスベクターで形質導入される、
   請求項１に記載の方法。
3. 前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養する工程は、前記単離されたＮＫ細胞の集団を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で培養することを包含する、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記単離されたＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下でかつ他のサイトカインは添加されずに培養される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記活性化ＮＫ細胞の集団を形質導入する工程は、ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）もしくはＲＩＧ−Ｉ様レセプター（ＲＬＲ）の１種もしくはこれより多くのインヒビター、および／またはＴＢＫ１／ＩＫＫεの１種もしくはこれより多くのインヒビターの存在下で行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. ＴＬＲおよび／もしくはＲＬＲの１種もしくはこれより多くのインヒビター、ならびに／またはＴＢＫ１／ＩＫＫεの１種もしくはこれより多くのインヒビターは、ＢＸ７９５、２−アミノプリン、ＢＡＹ１１−７０８２、セラストロール、ＣＬＩ−０９５、Ｈ−８９、ノルハルマン、ＩＲＡＫ１／４インヒビター、ＭＲＴ６７３０７、ＡＺ１３１０２９０９、ＭＰＩ−０４８５５２０、アレキサノクス、化合物ＩＩ、およびＳＲ８１８５の１種もしくはこれより多くである、請求項５に記載の方法。
7. ＴＬＲおよび／もしくはＲＬＲの１種もしくはこれより多くのインヒビターならびに／またはＴＢＫ１／ＩＫＫεの１種もしくはこれより多くのインヒビターは、ＢＸ７９５である、請求項６に記載の方法。
8. 前記１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記レンチウイルスベクターは、配列番号８〜１９のいずれか１つと少なくとも９０％ 配列同一性を有する核酸配列を含むかまたはからなる、請求項８に記載の方法。
10. 前記照射されたフィーダー細胞 対 前記形質導入されたＮＫ細胞の比は、約１０：１である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記照射されたフィーダー細胞は、エプスタイン・バーウイルスで形質転換されたリンパ芽球系細胞株またはＫ５６２細胞を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記異種核酸は、
    高親和性ＣＤ１６（ＣＤ１６−Ｖ１５８）、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、ＣＤ３４、ダブルネガティブＴＧＦβタイプＩＩレセプター、ＶＬＡ−４、ＬＦＡ−１、ＣＤ１９、もしくはＣＤ４；
    腫瘍細胞上で発現される抗原に特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であって、ここで前記異種核酸は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＳ１、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ｅｒｂＢ２−、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄ−Ｌ、もしくはＴＲＡＩＬ−Ｒ１に特異的に結合するＣＡＲをコードするＣＡＲ；
    細胞内ドメインを欠く短縮型ＣＤ３４タンパク質をコードする核酸分子；および／または
    低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、もしくはアンチセンス核酸、
    をコードする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下かつ照射されたフィーダー細胞の存在下で培養されて、活性化ＮＫ細胞の集団を生成し、前記フィーダー細胞は、ＣＤ１９免疫除去および／またはＣＤ５６免疫選択を使用して、前記活性化ＮＫ細胞から実質的に分離される、請求項２ｂに記載の方法。
14. 腫瘍、過剰増殖性疾患、またはウイルス感染を有する被験体を処置する方法であって、前記方法は、
    単離されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を、前記被験体またはドナーから得る工程；
    活性化ＮＫ細胞の集団を生成するために、単離されたＮＫ細胞の集団を、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で少なくとも２日間培養する工程；
    形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成するために、前記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで形質導入する工程；
    形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を生成するために、前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、ＩＬ−２および照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程；ならびに
    前記形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を含む組成物を、前記被験体に投与する工程、
    を包含する、方法。
15. ａ）前記ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下かつ照射されたフィーダー細胞の非存在下で培養される；および／もしくは前記活性化ＮＫ細胞は、照射されたフィーダー細胞の非存在下で、前記ウイルスベクターで形質導入される；または
    ｂ）前記ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下かつ照射されたフィーダー細胞の存在下で培養される；および／もしくは前記活性化ＮＫ細胞は、照射されたフィーダー細胞の存在下で、前記ウイルスベクターで形質導入される、
    請求項１４に記載の方法。
16. 前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養する工程は、前記単離されたＮＫ細胞の集団を、５００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で培養することを包含する、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
17. 前記単離されたＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下でかつ他のサイトカインは添加されずに培養される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記活性化ＮＫ細胞の集団を形質導入する工程は、ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）もしくはＲＩＧ−Ｉ様レセプター（ＲＬＲ）の１種もしくはこれより多くのインヒビターおよび／またはＴＢＫ１／ＩＫＫεの１種もしくはこれより多くのインヒビターの存在下で行われる、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. ＴＬＲおよび／もしくはＲＬＲの１種もしくはこれより多くのインヒビターならびに／またはＴＢＫ１／ＩＫＫεの１種もしくはこれより多くのインヒビターは、ＢＸ７９５、２−アミノプリン、ＢＡＹ１１−７０８２、セラストロール、ＣＬＩ−０９５、Ｈ−８９、ノルハルマン、ＩＲＡＫ１／４インヒビター、ＭＲＴ６７３０７、ＡＺ１３１０２９０９、ＭＰＩ−０４８５５２０、アレキサノクス、化合物ＩＩ、およびＳＲ８１８５の１種またはこれより多くである、請求項１８に記載の方法。
20. ＴＬＲおよび／もしくはＲＬＲの１種もしくはこれより多くのインヒビターならびに／またはＴＢＫ１／ＩＫＫεの１種もしくはこれより多くのインヒビターは、ＢＸ７９５である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記レンチウイルスベクターは、配列番号８〜１９のいずれか１つと少なくとも９０％ 配列同一性を有する核酸配列を含むかまたはからなる、請求項２１に記載の方法。
23. 前記レンチウイルスベクターは、ＰＧＫ、ＥＦＳ、またはＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結された目的の核酸を含む、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
24. 前記照射されたフィーダー細胞 対 前記形質導入されたＮＫ細胞の比は、１０：１である、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記照射されたフィーダー細胞は、エプスタイン・バーウイルスで形質転換されたリンパ芽球系細胞株またはＫ５６２細胞を含む、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記異種核酸は、
    高親和性ＣＤ１６（ＣＤ１６−Ｖ１５８）、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、ＣＤ３４、ダブルネガティブＴＧＦβタイプＩＩレセプター、ＶＬＡ−４、ＬＦＡ−１、ＣＤ１９、もしくはＣＤ４；
    腫瘍細胞上で発現される抗原に特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であって、ここで前記異種核酸は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＳ１、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ｅｒｂＢ２−、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄ−Ｌ、もしくはＴＲＡＩＬ−Ｒ１に特異的に結合するＣＡＲをコードするＣＡＲ；
    細胞内ドメインを欠く短縮型ＣＤ３４タンパク質をコードする核酸分子；および／または
    低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、もしくはアンチセンス核酸、
    をコードする、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記ＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下かつ照射されたフィーダー細胞の存在下で培養されて、活性化ＮＫ細胞の集団を生成し、前記フィーダー細胞は、ＣＤ１９免疫除去および／またはＣＤ５６免疫選択を使用して、前記活性化ＮＫ細胞から実質的に分離される、請求項１５ｂに記載の方法。
28. 前記形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を含む組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって生成される、１種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー細胞。
30. １種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、ここで前記ナチュラルキラー細胞は、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって生成される、組成物。
31. １種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、前記方法は、
    活性化ＮＫ細胞の集団を生成するために、単離されたＮＫ細胞の集団を、インターロイキン−２（ＩＬ−２）および照射されたフィーダー細胞の存在下で少なくとも２日間培養する工程；
    形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成するために、ＢＸ７９５の存在下で前記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで形質導入する工程；ならびに
    前記１種またはこれより多くの異種核酸を含む形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を生成するために、前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、ＩＬ−２および照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程、
    を包含する、方法。
32. 前記単離されたＮＫ細胞の集団は、ＩＬ−２の存在下でかつ他のサイトカインは添加されずに培養される、請求項３１に記載の方法。