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JP2022171777A - Ｄｎａｂｉｉワクチンおよび強化された活性を有する抗体 - Google Patents

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JP2022171777A
JP2022171777A JP2022143718A JP2022143718A JP2022171777A JP 2022171777 A JP2022171777 A JP 2022171777A JP 2022143718 A JP2022143718 A JP 2022143718A JP 2022143718 A JP2022143718 A JP 2022143718A JP 2022171777 A JP2022171777 A JP 2022171777A
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Lauren O Bakaletz
ディー． グッドマン スティーブン
d goodman Steven
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Nationwide Childrens Hospital Inc
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Abstract

【課題】ＤＮＡＢＩＩワクチンおよび強化された活性を有する抗体の提供。【解決手段】本開示は、１つまたは複数の新規のポリペプチドワクチン、抗体、抗体断片および組成物を使用して細菌バイオフィルムを減らしおよび／または治癒し、バイオフィルムに関連する疾患または障害を処置するのに有用である方法および組成物を提供する。機能的バイオフィルムを形成することができない細菌は、宿主の免疫系の残余によりおよび／または従来の抗生物質により、よりたやすく除去される。本開示は、バイオフィルムをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで破壊するまたは解体するのに効果的であることが示されている物質の新規の組成物を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１７年２月６日に出願された米国仮出願番号６２／４５５，４３７、２０１７年２月２日に出願された同６２／４５３，９２１、および２０１７年１月４日に出願された同６２／４４２，３０７に対する利益を主張し、上記の米国仮出願の各内容は、その全容が参考として本明細書に援用される。
政府権利についての陳述
本開示は、一部、米国国立衛生研究所により与えられる認可番号ＮＩＨ Ｒ０１ ＤＣ１１８１８のもとで政府支援を受けて行われた。政府は本開示に一定の権利を有する。
技術分野
本開示は一般的には、１つまたは複数の新規のポリペプチドワクチン、抗体、抗体断片および組成物を使用して細菌バイオフィルムを減らしおよび／または治癒し、バイオフィルムに関連する疾患または障害を処置するための方法および組成物に関する。
背景
公知の真正細菌全てにおいてタンパク質のＤＮＡＢＩＩファミリーからの少なくとも１つのタンパク質が見いだされ、細菌細胞の外側に天然に見いだされる。このファミリーにより、強力な自然免疫応答が引き出されるが、宿主対象は感染の結果として、ファミリーメンバーに対する特異的な保護的抗体を天然に生じることができない。ＤＮＡＢＩＩタンパク質および細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）は、「バイオフィルム」の格子構造に寄与する。細菌バイオフィルムに伴う主要な問題は、宿主免疫系および／または抗生物質および他の抗菌薬が、バイオフィルム内に保護された細菌に近づくことができないことである。
バイオフィルムは、工業の場にも存在する。例えば、バイオフィルムは、生産現場からガソリンスタンドの貯蔵タンクまでの広範囲の石油の加工問題に関係づけられる。現場では、硫酸還元性バイオフィルム細菌が硫化水素を産生する（サワー・オイル（ｓｏｕｒｅｄ ｏｉｌ））。加工パイプラインでは、バイオフィルム活性によりスライムが発生し、それがフィルターおよび開口部の邪魔になる。バイオフィルムおよびバイオフィルム生物は、パイプラインおよび石油加工装置の腐食も引き起こす。これらの問題は、油またはガスの生産設備全体を通して、汚損および腐食性のバイオフィルム生物が貯蔵タンクの最終製品の表面に見いだされるまで顕在化し得る。
家庭では、バイオフィルムは、微生物の成長を支持する任意の表面の中またはその上、例えば、排水管の中、調理台の上、トイレの中、およびスイミングプールおよびスパの中に見いだされる。バイオフィルムは、家庭用と工業用の両方の広範囲の水の加工に関係づけられる。バイオフィルムは、加工装置の表面上で成長し、熱伝達の効率低下、またはフィルターおよび膜を塞ぐなど、装置の性能を害する可能性がある。冷却塔充填材上で成長しているバイオフィルムにより、充填材の崩壊を引き起こすのに十分な重量が加わる可能性がある。バイオフィルムは、高度に特殊化されたステンレス鋼でさえも腐食させる。水の加工におけるバイオフィルムにより、例えば、紙加工におけるバイオフィルムの汚染、またはシリコンチップ上への単一の細胞の付着でさえ、最終製品の価値を下げる可能性がある。飲料水の配水系統において成長しているバイオフィルムは、水の美的品質を劣化させる潜在的な病原生物、腐食性の生物体または細菌を有し得る。
バイオフィルムは、動物およびヒトを苦しめるいくつかの処置困難疾患、例えば、静脈性潰瘍および糖尿病性足部潰瘍、耳感染症、副鼻腔感染症、尿路感染症、肺感染症、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、カテーテル関連感染症、植え込まれたプロテーゼに関連する感染症、ならびに歯周病を含む、慢性非治癒創傷にも関連している。バイオフィルムの浸透性ならびに宿主免疫系および／または抗生物質ならびに他の抗微生物薬がバイオフィルム内に保護されている細菌に近づくことができないせいで、バイオフィルムをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで分解するまたは破壊するのに効果的である組成物および方法の必要性が当技術分野には存在する。本開示は、この必要性にかなう新規の組成物および方法に向けられている。
本開示は、バイオフィルムをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで破壊するまたは解体するのに効果的であることが示されている物質の新規の組成物を提供する。一態様では、組成物は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドの２つもしくはそれよりも多い単離された立体構造先端ドメインまたは立体構造先端ドメインのうちの１つもしくは複数の生物学的等価物を含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる組換えポリペプチドである。一態様では、２つまたはそれよりも多い先端ドメインのアミノ酸配列は同じである、または代替的にアミノ酸配列は異なっている。立体構造先端ドメインの非限定的例は、Ａ５およびｍＢ４として本明細書で同定された断片、ならびにそのそれぞれの等価物ならびにそのそれぞれの断片を含有する
Figure 2022171777000001
 ならびに下に提供される配列表において同定される断片を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。先端ドメインの構造の方向性は「ヘッド」から「テイル」；「テイル」から「ヘッド」が可能であり、ポリペプチドが３つまたはそれよりも多い先端ドメインを含む場合、ヘッドからテイルの任意の組合せ、例えば、ヘッド－ヘッド－ヘッド；テイル－ヘッド－ヘッド（tail-head-heard）；テイル－ヘッド
－テイルが可能であり、野生型配列のアミン末端は「ヘッド」であり、野生型配列のカルボキシ末端はポリペプチドの「テイル」であり、それぞれのドメイン配列の方向性は保持される（例えば、
Figure 2022171777000002
 配列はアミンからカルボキシ方向性で変更はない）。
さらなる態様では、組換えポリペプチドは、１つもしくは複数のアミノ酸をさらに含む、または代替的にさらにそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるリンカーポリペプチドをさらに含む、または代替的にさらにそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。
同じもしくは異なる細菌種が産生することが可能な３～５つの立体構造先端ドメインを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる組換えポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が同じである（例えば、すべてＡ５アミノ酸配列）または少なくとも２つもしくは少なくとも３つもしくは少なくとも４つもしくは５つすべてが立体構造先端ドメインの異なるアミノ酸配列（例えば、Ａ５とｍＢ４の種々の組合せならびにそれの等価物および／またはそのそれぞれの断片を含有する
Figure 2022171777000003
 ）を有することが可能であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、またはＴから選択される、組換えポリペプチドも提供される。組換えポリペプチド中の立体構造先端ドメインは線形または分岐形立体構造でも可能である。立体構造先端ドメインは、それに連結された検出可能な標識および／または精製標識をさらに含むことが可能である。先端ドメインの構造の方向性は「ヘッド」からテイル；テイルからヘッドが可能であり、ポリペプチドは３つまたはそれよりも多い先端ドメイン、ヘッドからテイルの任意の組合せ、例えば、ヘッド－ヘッド－ヘッド；テイル－ヘッド－ヘッド；テイル－ヘッド－テイルを含み、野生型配列のアミン末端は「ヘッド」であり、野生型配列のカルボキシ末端はポリペプチドの「テイル」である。ポリペプチド（polyeptide）単位は６～約２５、または代替的に約１０～約２５、または代替的に約１５～約２３、または代替的に約１８～約２３、または代替的に約２０アミノ酸長が可能である。したがって、ポリペプチドは合計して約２１～約１２０アミノ酸長が可能である。
本明細書に記載される組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドも提供され、組換えポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている１つまたは複数の調節エレメントを必要に応じてさらに含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなることが可能である。ポリヌクレオチドは、発現または複製ベクター内に含有されることが可能である。なおさらなる態様では、組換えポリヌクレオチドは、検出可能な標識および／または精製標識をさらに含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなることが可能である。ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、宿主細胞、例えば、原核または真核細胞、例えば、哺乳動物細胞内に含有されることが可能である。これらのポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現に有利である条件下で、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を培養することにより、組換えポリペプチドを調製する方法において使用することが可能である。一態様では、組換えポリペプチドは、細胞または細胞培養培地から単離される。
出願人は、本明細書に記載される組換えポリペプチドに結合する抗体、または抗体の抗原結合性断片も提供する。抗体または抗原結合性断片は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドに結合するおよび／またはバイオフィルムの形成を防止するもしくはバイオフィルムを破壊する点で特徴付けることが可能である。抗体の非限定的例は、モノクローナル抗体、単離されたポリクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または霊長類化（primatized）抗体の群から選択される。単離されたポリクローナル抗体は、任意の適切な種、例えば、哺乳動物ポリクローナル抗体、例えば、ウサギポリクローナル抗体、マウスポリクローナル抗体、ヒツジポリクローナル抗体、イヌポリクローナル抗体、またはヒトポリクローナル抗体に由来し得る。
抗原結合性断片の非限定的例は、Ｆｖ抗体断片またはＦａｂ抗体断片である。
一態様では、本開示の抗体および／または抗体断片は、細菌種にまたがって保存されているＤＮＡＢＩＩタンパク質上のエピトープに結合する、例えば、本開示の抗体および／または抗体断片は、グラム陽性とグラム陰性種の両方を含む少なくとも２つの細菌種由来のバイオフィルムを破壊する。細菌ＤＮＡＢＩＩタンパク質の非限定的例は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡＢＩＩまたはその断片であり、必要に応じて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡＢＩＩの断片はベータヘアピン立体構造を含む。少なくとも２つの細菌種の非限定的例は、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａを含む。
本明細書に記載される抗体または抗原結合性断片は、必要に応じて、検出可能な標識および／または精製標識をさらに含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなることが可能である。
ＤＮＡＢＩＩポリペプチドと免疫反応性である本明細書に記載される抗体を得るためのまたはＤＮＡＢＩＩポリペプチドと免疫反応性である抗体を分泌するＢ細胞を生成するための方法も本明細書で提供される。この方法は、有効量の組換えポリペプチドまたは組換えポリペプチドを含有する組成物を対象に投与し、それに続いて対象から抗体を回収するまたはＢ細胞を回収することを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。対象は動物、例えば、ヒトなどの哺乳動物であってよい。方法は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドに対して高親和性を有する抗体の分泌について対象から回収したＢ細胞をスクリーニングし、こうしてＤＮＡＢＩＩポリペプチドに免疫反応性である抗体を分泌するＢ細胞を同定し、必要に応じて、Ｂ細胞から前記抗体をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離することをさらに含むことが可能である。
必要に応じて、検出可能な標識および／または精製標識をさらに含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなることが可能である、本明細書に記載される抗体または抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドも提供される。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、発現または複製ベクターと共に含有されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現および／または複製を駆動するためにポリヌクレオチドに作動的に連結されている１つまたは複数の調節エレメントをさらに含むことが可能である。ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、宿主細胞、例えば、原核または真核細胞、例えば、哺乳動物細胞内に含有されることが可能である。一態様では、これらの実施形態は、抗体または抗体の抗原結合性断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドを調製するための方法であって、ポリヌクレオチドの発現に有利である条件下で、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を培養することを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる、方法において使用することが可能である。さらなる態様では、ベクターおよび／または宿主細胞により産生されるポリペプチドは細胞および／または細胞を培養する培地から単離される。
キャリアならびに本明細書に記載される組換えポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、抗体、宿主細胞および／または抗原結合性断片のうちの１つまたは複数を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる組成物も提供される。組成物は、異なる構築物を有する複数の組成物を有するポリペプチドを含むことが可能であり、例えば、ポリペプチドは互いに異なるまたは同じ一次アミノ酸配列および／または立体構造（confirmation）を有することが可能である。組成物は、必要に応じて、さらに保存剤および／または安定化剤を、さらに必要に応じて少なくとも１つの抗生物質または追加の活性成分を含むことが可能である。
出願人らの開示は、有効量の組換えポリペプチドおよび薬学的に許容されるキャリアを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるワクチン組成物も提供する。組成物はさらにアジュバント、および必要に応じて、保存剤および／または安定化剤ならびにさらに必要に応じて、少なくとも１つの抗生物質または追加の活性成分を含むことが可能である。上記のように、一態様では、ワクチン組成物は、２つまたはそれよりも多い異なる組換えポリペプチドが同じワクチン組成物内に互いに対して様々な比で存在する、有効量の複数の組換えポリペプチドを含むことが可能である。ワクチン組成物は、ヒトまたは動物への使用のために製剤化することが可能である。さらなる態様では、組成物は小児への投与のために製剤化される。
互いに同じでも異なっていてもよい複数の抗体または抗原結合性断片、例えば、本明細書に記載される抗体の２つまたはそれよりも多いＦａｂ抗体断片を含む組成物も提供される。一態様では、上記の複数のもの内の２つまたはそれよりも多いＦａｂ断片は互いに異なっている。組成物は、キャリア、必要に応じて、薬学的に許容されるキャリアおよび必要に応じて、少なくとも１つの抗生物質または追加の活性成分をさらに含むことが可能である。組成物は、保存剤および／または安定化剤も含むことが可能である。これらの組成物は治療有効量を含み、ヒトまたは動物への使用のために製剤化することが可能である。さらなる態様では、組成物は小児への投与のための有効量を含み、必要に応じて小児投与用に製剤化される。
本明細書に記載される組成物は、診断上、治療的におよびｅｘ ｖｉｖｏで有用である。一態様では、組換えポリペプチド、抗体、その抗原結合性断片、組成物および／またはワクチンは、産業プロセスに関連するバイオフィルムの形成を防止する、またはこれを破壊する方法であって、バイオフィルムに感受性であるまたはバイオフィルムを含有する表面を、有効量の、本明細書に記載される組換えポリペプチド、抗体、ワクチン、組成物、および／または抗原結合性断片のうちの１つまたは複数を用いて処理するまたはこれと接触させることを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる、方法において使用される。
バイオフィルムの破壊またはその形成の防止を必要とする対象においてバイオフィルムを破壊するまたはその形成を防止するための方法であって、有効量の、本明細書に記載される組換えポリペプチド、抗体、抗体断片、ワクチン、および／または組成物のうちの１つまたは複数を対象に投与することを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる、方法がさらに提供される。一態様では、対象は方法の使用に先立って、バイオフィルムまたはバイオフィルムに関連する細菌感染を宿すと診断される。
バイオフィルムに関連する状態の処置を必要とする対象においてバイオフィルムに関連する状態を処置するための方法であって、有効量の、本明細書に記載される組換えポリペプチド、組成物、ワクチン、抗体、および／または抗原結合性断片のうちの１つまたは複数を対象に投与することを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる、方法も提供される。状態の非限定的な例は限定せずに、静脈性潰瘍および糖尿病性足部潰瘍、耳感染症、副鼻腔感染症、尿路感染症、肺感染症、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、カテーテル関連感染症、植え込まれたプロテーゼに関連する感染症、ならびに歯周病を含む、慢性非治癒創傷を含む。一態様では、方法の施行に先立って、対象はバイオフィルムを有すると診断される。
抗炎症性サイトカイン応答の誘導を必要とする対象において抗炎症性サイトカイン応答を誘導するための方法であって、有効量の、本明細書に開示される組換えポリペプチド、抗体、および／または抗原結合性断片のうちの１つまたは複数を対象に投与することを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる、方法も提供される。一態様では、抗炎症性サイトカイン応答は、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、またはＩＬ－１３の産生を誘導するまたは増強することのうちの１つまたは複数を含む。さらなる態様では、方法は、投与に先立ってまたはそれに引き続いて抗炎症性サイトカインのレベルについてアッセイすることをさらに含む。一態様では、対象は、静脈性潰瘍および糖尿病性足部潰瘍、耳感染症、副鼻腔感染症、尿路感染症、肺感染症、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、カテーテル関連感染症、植え込まれたプロテーゼに関連する感染症、ならびに歯周病を含む、慢性非治癒創傷の群の状態を患っている。
上記のように、一部の態様では、投与に先立って、対象においてバイオフィルムおよび／またはバイオフィルムを生じることが公知の生物の存在を検出するのが望ましい場合がある。一態様では、検出することは、バイオフィルムを含有するまたは感染と疑われている患者から単離した試料を、バイオフィルムの構成成分を認識し結合する抗体と接触させ、試料中のバイオフィルムと抗体の間に形成される任意の複合体を検出することを含む方法による。
本明細書に記載される組成物、組換えポリペプチド、単離された抗体、および／または抗原結合性断片のうちの１つまたは複数で被覆された非生理的表面であって、必要に応じて、表面が産業的環境にある非生理的表面がさらに提供される。上記の治療方法に類似して、投与または表面の接触に先立ってバイオフィルムおよび／またはバイオフィルムを生じることが公知の生物の存在を検出するのが望ましい場合がある。一態様では、検出することは、バイオフィルムを含有すると疑われている表面から単離した試料を、バイオフィルムの構成成分を認識し結合する抗体と接触させ、試料中のバイオフィルムと抗体の間に形成される任意の複合体を検出することを含む方法による。
バイオフィルムを破壊するのに効果的である抗血清を得るための方法であって、対象を本明細書に記載される組換えポリペプチドおよび／またはワクチン組成物で免疫し、対象から抗血清を回収し、必要に応じて、対象からポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を単離することを含む、方法も提供される。抗血清を使用すれば、バイオフィルムの処置もしくは破壊またはバイオフィルム関連状態の処置を必要とする対象に有効量の抗血清を投与することにより、対象においてバイオフィルムを処置するもしくは破壊するまたはバイオフィルム関連状態を処置することが可能である。
診断または治療的使用のためのキットがさらに提供される。キットの構成成分は意図する使用によって様々である。構成成分の非限定的な例は、本明細書に記載される１つまたは複数の組成物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、抗体断片、および／またはワクチンを含む。一態様では、キットは、キット構成成分の診断上の（theh diagnostic）、治療上のまたは産業上の使用のための指示も含有する。
部分配列表
配列番号１：全長野生型（ｗｔ）８６－０２８ＮＰ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＸ８８４２５．１（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
Figure 2022171777000004
 配列番号２：全長野生型（ｗｔ）８６－０２８ＮＰ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＸ８８６９９．１（２０１５年５月１３日が最近のアクセスである）：
Figure 2022171777000005
 配列番号３：全長ｗｔ８６－０２８ＮＰ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＹＰ＿２４８１４２．１（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
Figure 2022171777000006
 配列番号４：全長ｗｔ Ｒ２８４６ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
ＩｈｆＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＤＯ９６３７５（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
Figure 2022171777000007
 配列番号５：全長ｗｔ Ｒｄ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＣ２２９５９．１（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
Figure 2022171777000008
 配列番号６：全長ｗｔ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＩｈｆＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＣ７４７８２．１（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
Figure 2022171777000009
 配列番号７：全長ｗｔ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＩｈｆＢ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＢＡＡ３５６５６（２０１５年５月１９日が最近のアクセスである）：
Figure 2022171777000010
 配列番号８： Ｅ． ｃｏｌｉ ｈｕｐＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＰ＿００３８１８（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
Figure 2022171777000011
 配列番号９：Ｅ． ｃｏｌｉ ｈｕｐＢ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＰ＿００１０９０．１（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
Figure 2022171777000012
 配列番号１０：全長ｗｔ Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ ０１ ＩｈｆＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＧ０６１２６．１（２０１１年３月２１日が最近のアクセスである）：
Figure 2022171777000013
 配列番号１１：全長ｗｔ Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ ０１ ＩｈｆＢ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＦ７２９５０．１（２０１５年５月１９日が最近のアクセスである）：
Figure 2022171777000014
 配列番号１２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ－３断片：
Figure 2022171777000015
配列番号１３：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ５断片：
Figure 2022171777000016
 配列番号１４：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ， Ａ５断片：
Figure 2022171777000017
 配列番号１５：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ２断片：
Figure 2022171777000018
配列番号１６：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ４断片：
Figure 2022171777000019
配列番号１７：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂ４ （ｍＢ４）断片：
Figure 2022171777000020
 配列番号１８：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ－１断片：
Figure 2022171777000021
配列番号１９：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ２断片：
Figure 2022171777000022
配列番号２０：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ４断片
Figure 2022171777000023
配列番号２１：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ６断片：
Figure 2022171777000024
配列番号２２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ１断片：
Figure 2022171777000025
配列番号２３：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ３断片：
Figure 2022171777000026
配列番号２４：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ５断片：
Figure 2022171777000027
 配列番号２５：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ６断片：
Figure 2022171777000028
配列番号２６：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ， Ａ立体構造先端ドメイン：
Figure 2022171777000029
 配列番号２７：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ， Ｂ立体構造先端ドメイン：
Figure 2022171777000030
 配列番号２８：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ断片：
Figure 2022171777000031
配列番号２９：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ断片：
Figure 2022171777000032
配列番号３０：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ断片：
Figure 2022171777000033
配列番号３１：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ断片：
Figure 2022171777000034
 配列番号３２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ断片：
Figure 2022171777000035
配列番号３３：ヒトＩｇＤ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８８０：
Figure 2022171777000036
配列番号３４：ヒトＩｇＧ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７：
Figure 2022171777000037
配列番号３５：ヒトＩｇＧ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９：
Figure 2022171777000038
配列番号３６：ヒトＩｇＧ３定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６０：
Figure 2022171777000039
配列番号３７：ヒトＩｇＭ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７１：
Figure 2022171777000040
配列番号３８：ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６１：
Figure 2022171777000041
配列番号３９：ヒトＩｇＡ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６：
Figure 2022171777000042
配列番号４０：ヒトＩｇＡ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７７：
Figure 2022171777000043
配列番号４１：ヒトＩｇカッパ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４：
Figure 2022171777000044
配列番号４２：非限定的な例示的リンカー：ＧＰＳＬＫＬ．
配列番号４３：非限定的な例示的リンカー：ＧＧＧ．
配列番号４４：非限定的な例示的リンカー：ＧＰＳＬ．
配列番号４５：非限定的な例示的リンカー：ＧＰＳ．
配列番号４６：非限定的な例示的リンカー：ＰＳＬＫ．
配列番号４７：非限定的な例示的リンカー：ＧＰＳＬＫ．
配列番号４８：非限定的な例示的リンカー：ＳＬＫＬ．
配列番号４９：非限定的な例示的リンカー：GGSGGS．
配列番号５０：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000045
 配列番号５１：可変リンカーを有する非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000046
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号５２：非限定的な例示的ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５キメラ組換えポリペプチドポリペプチド配列：
Figure 2022171777000047
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号５３：非限定的な例示的ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000048
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号５４：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000049
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号５５：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000050
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号５６：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５キメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000051
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号５７：非限定的な例示的ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５－ＩｈｆＡ５キメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000052
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号５８：非限定的な例示的ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５－ＩｈｆＡ５キメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000053
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号５９：非限定的な例示的ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５キメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000054
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号６０：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000055
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号６１：非限定的な例示的ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５－ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000056
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号６２：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５キメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000057
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号６３：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000058
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列である。
配列番号６４：可変リンカーを有する非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000059
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号６５：非限定的な例示的ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５キメラ組換えポリペプチドポリペプチド配列：
Figure 2022171777000060
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号６６：非限定的な例示的ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000061
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号６７：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000062
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号６８：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000063
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号６９：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５キメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000064
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号７０：非限定的な例示的ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５－ＩｈｆＡ５キメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000065
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号７１：非限定的な例示的ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５－ＩｈｆＡ５キメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000066
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号７２：非限定的な例示的ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５キメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000067
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号７３：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000068
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号７４：非限定的な例示的ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５－ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000069
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号７５：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ＩｈｆＡ５キメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000070
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号７６：非限定的な例示的ＩｈｆＡ５－ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000071
 「Ｘ」は１～２０のアミノ酸を含むアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号７７：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000072
 、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号７８：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２－ＭＧ１６５５ ＨｉｍＡ断片：ＦＤＬＲＤＫＮＱＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＤＩ。
配列番号７９：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｅｎｔｅｒｉｃ ｓｅｒｏｖａｒ ｔｙｐｈｉ ＣＴ１８ ＨｉｍＡ断片：ＦＤＬＲＤＫＮＱＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＤＩ。
配列番号８０：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ Ｅｌ Ｔｏｚ Ｎ１６９６１ ＨｉｍＡ断片：ＦＤＬＲＤＫＮＥＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＤＩ。
配列番号８１：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＨｉｍＡ断片：ＦＤＬＲＤＫＲＱＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＥＩ。
配列番号８２：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＫＷ２０ Ｒｄ ＨｉｍＡ断片：ＦＥＬＲＤＫＳＳＲＰＧＲＮＰＫＴＧＤＶＶ。
配列番号８３：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ Ｄ１１Ｓ－１ ＩＨＦａｌｐｈａ断片：ＦＥＬＲＤＫＡＳＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＳＶ。
配列番号８４：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４ ＨｉｍＡ断片：ＦＥＬＫＤＫＫＰＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＳＶ。
配列番号８５：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＦＡ１０９０（Ｏｋｌａｈｏｍａ）ＩＨＦａｌｐｈａ断片：ＦＱＬＲＤＫＰＱＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＥＶ。
配列番号８６：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ ＭＣ５Ｂ ＨｉｍＡ断片：ＦＱＬＲＤＫＰＱＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＥＶ。
配列番号８７：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ ＨＩ２４２４ ＩＨＦＡ断片：ＦＱＬＲＤＫＰＱＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＡＩ。
配列番号８８：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ ６６８ ＩＨＦＡ断片：ＦＱＬＲＤＫＰＱＲＰＧＲＮＰＮＴＧＥＡＩ。
配列番号８９：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｉｓ Ｔｏｈａｍａ １ ＩｈｆＡ断片：ＦＱＶＲＤＫＰＰＲＰＧＲＮＰＫＴＧＥＴＩ。
配列番号９０：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ
ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ ＡＴＣＣ ２５８４５ ＨｉｍＡ断片：ＦＥＶＫＫＲＬＥＲＶＭＶＮＰＳＴＧＬＲＭ。
配列番号９１：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ １７ ＨｉｍＡ断片：ＦＥＶＫＫＲＬＥＲＩＭＴＮＰＡＴＧＬＲＭ。
配列番号９２：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｉｕｍ Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｄｂｐ ＩＩ断片：ＦＥＳＲＶＲＫＡＳＶＧＫＳＩＮＴＧＥＶＶ。
配列番号９３：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ ＡＴＣＣ ２５８４５ Ｈｕｐ断片：ＦＫＶＱＡＶＫＰＲＥＳＶＮＶＮＴＧＥＲＶ。
配列番号９４：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ １７例示的断片：ＦＫＶＱＡＶＫＰＲＥＳＶＮＶＮＴＧＥＲＶ。
配列番号９５：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＭＷ２ ＨＵ断片：ＦＥＶＲＥＲＡＡＲＫＧＲＮＰＱＴＧＫＥＩ。
配列番号９６：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２－ＭＧ．１６５５ ｈｕｐＡ断片：ＦＫＶＮＨＲＡＥＲＴＧＲＮＰＱＴＧＫＥＩ。
配列番号９７：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＲＰ６２Ａ Ｈｕｐ断片：ＦＥＶＲＥＲＡＡＲＫＧＲＮＰＱＴＧＫＥＩ。
配列番号９８：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ
６７１５ Ｈｕ断片：ＦＥＶＲＥＲＡＡＲＫＧＲＮＰＱＴＧＡＥＩ。
配列番号９９：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ
ＭＧＡＳ１０２７０ ＨＵ断片：ＦＥＶＲＥＲＡＡＲＫＧＲＮＰＱＴＧＡＥＩ。
配列番号１００：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ＵＣＮ３４（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）ＨｌｐＡ断片：ＦＥＶＲＥＲＡＡＲＫＧＲＮＰＱＴＧＥＥＩ。
配列番号１０１：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐ）２６０３Ｖ／Ｒ Ｈｕｐ断片：ＦＥＶＲＥＲＡＡＲＫＧＲＮＰＱＴＧＡＥＩ。
配列番号１０２：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ６ ＨＵ断片：ＦＥＶＲＥＲＡＥＲＫＧＲＮＰＱＴＧＫＥＭ。
配列番号１０３：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ Ｃｈａｌｌｉｓ ＮＣＴＣ７８６８ ＨｌｐＡ断片：ＦＥＶＲＥＲＡＡＲＫＧＲＮＰＱＴＧＫＥＩ。
配列番号１０４：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＵＡ１５９ ＨＵ断片：ＦＥＶＲＥＲＡＡＲＫＧＲＮＰＱＴＧＥＥＩ。
配列番号１０５：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＶＳ８３ Ｈｕｐ断片：ＦＥＶＲＥＲＡＡＲＫＧＲＮＰＱＴＧＱＥＩ。
配列番号１０６：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＫＷ２０ Ｒｄ ＨｕｐＡ断片：ＦＫＶＮＥＲＡＡＲＴＧＲＮＰＱＴＧＡＥＩ。
配列番号１０７：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ
Ｅｌ Ｔｏｚ Ｎ１６９６１ ＨｕｐＡ断片：ＦＫＶＮＨＲＳＡＲＴＧＲＮＰＱＴＧＥＥＩ。
配列番号１０８：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＨｕｐＢ断片：ＦＡＶＫＥＲＡＡＲＴＧＲＮＰＱＴＧＫＰＩ。
配列番号１０９：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ Ｄ１１Ｓ－１ ＨＵ断片：ＦＫＶＮＡＲＫＡＲＴＧＲＮＰＱＴＧＡＥＩ。
配列番号１１０：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ
Ｅｌ Ｔｏｚ Ｎ１６９６１ ＨｕｐＢ断片：ＦＳＶＲＴＲＡＡＲＴＧＲＮＰＫＴＧＥＥＩ。
配列番号１１１：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２－ＭＧ．１６５５ ｈｕｐＢ断片：ＦＡＶＫＥＲＡＡＲＴＧＲＮＰＱＴＧＫＥＩ。
配列番号１１２：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ
ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４ ＨｕｐＢ断片：ＦＳＶＫＥＲＡＡＲＭＧＲＮＰＫＴＧＥＡＩ。
配列番号１１３：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ Ｔｏｈａｍａ １ ＨｕｐＢ断片：ＦＡＶＳＡＲＡＡＲＴＧＲＮＰＲＴＧＥＴＩ。
配列番号１１４：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ
ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＲＨ４ ＨｉｍＤ断片：ＦＣＬＨＨＲＳＡＲＩＡＲＮＰＲＴＧＥＳＶ。
配列番号１１５：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ ＡＴＣＣ ２５８４５ ＨｕｐＢ断片：ＦＡＴＴＥＲＰＡＨＥＧＩＮＰＲＳＫＥＫＩ。
配列番号１１６：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ １７ Ｈｕｐ断片：ＹＳＶＴＥＲＰＡＨＥＧＩＮＰＡＴＫＱＫＩ。
配列番号１１７：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ
ｄｅｎｔｉｃｏｌａ ＡＴＣＣ ３５４０５ ＨＵ断片：ＤＦＡＶＬＨＧＲＫＮＡＲＮＰＫＴＧＥＡＶ。
配列番号１１８：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ８３ Ｈｕｐ－１断片：ＦＳＶＳＥＲＡＡＲＫＧＩＮＰＫＴＫＫＳＩ。
配列番号１１９：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ２６６９５ Ｈｕｐ断片：ＦＥＴＡＥＱＫＧＫＥＧＫＶＰＧＳＤＫＴＹ。
配列番号１２０：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ ＡＴＣＣ ２５８４５ ＨｕｐＡ断片：ＳＦＩＶＫＨＲＡＥＫＴＡＲＮＩＳＫＮＴＴＩ。
配列番号１２１：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ １７ Ｈｕｐ－２断片：ＳＦＩＶＫＨＲＡＥＫＴＡＲＮＩＳＫＮＴＴＩ。
配列番号１２２：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ８３ Ｈｕｐ－２断片：ＦＩＶＫＥＲＡＥＫＴＡＲＮＩＳＫＱＴＴＩ。
配列番号１２３：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＣＤＣ１５５１ ＨＵ断片：ＦＥＱＲＲＲＡＡＲＶＡＲＮＰＲＴＧＥＴＶ。
配列番号１２４：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ＭＣ２ Ｈｕｐ断片：ＦＥＱＲＲＲＡＡＲＶＡＲＮＰＲＴＧＥＴＶ。
配列番号１２５：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２－ＭＧ１６５５ ＨｉｍＤ断片：ＦＳＬＨＹＲＡＰＲＴＧＲＮＰＫＴＧＤＫＶ。
配列番号１２６：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃ ｓｅｒｏｖａｒ ｔｙｐｈｉ ＣＴ１８ ＨｉｍＤ断片：ＦＳＬＨＹＲＡＰＲＴＧＲＮＰＫＴＧＤＫＶ。
配列番号１２７：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ
Ｅｌ Ｔｏｚ Ｎ１６９６１ ＨｉｐＢ断片：ＦＳＬＨＹＲＥＰＲＶＧＲＮＰＫＴＧＤＫＶ。
配列番号１２８：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＨｉｍＤ断片：ＦＳＬＨＹＲＡＰＲＶＧＲＮＰＫＴＧＥＳＶ。
配列番号１２９：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ Ｄ１１Ｓ－１ ＩＨＦＢ断片：ＦＳＬＨＣＲＱＰＲＩＧＲＮＰＫＴＧＥＱＶ。
配列番号１３０：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＦＡ１０９０（Ｏｋｌａｈｏｍａ）ＩＨＦβ断片：ＦＤＬＮＨＲＰＡＲＩＧＲＮＰＫＴＧＥＲＶ。
配列番号１３１：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ ＭＣ５Ｂ ＨｉｍＤ断片：ＦＤＬＮＨＲＰＡＲＩＧＲＮＰＫＴＧＥＲＶ。
配列番号１３２：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ ＨＩ２４２４ ＩＨＦＢ断片：ＦＧＬＮＲＲＰＡＲＶＧＲＮＰＫＳＧＥＫＶ。
配列番号１３３：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ ６６８ ＩＨＦＢ断片：ＦＧＬＮＲＲＰＡＲＶＧＲＮＰＫＳＧＥＫＶ。
配列番号１３４：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ Ｔｏｈａｍａ １ ＩｈｆＢ断片：ＦＳＬＳＱＲＳＰＲＩＧＲＮＰＫＳＧＥＱＶ。
配列番号１３５：非限定的な例示的等価組換えポリペプチド配列、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ Ｂ３１ Ｈｂｂ断片：ＦＥＶＲＫＲＫＧＲＬＮＡＲＮＰＱＴＧＥＹＶ。
配列番号１３６：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＫＷ２０ Ｒｄ ＩｈｆＢ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂ４（ｍＢ４）断片：
Figure 2022171777000073
 。
図１は、チンチラおよびウサギにおいてポリクローナル血清を生成するために使用した、例示的ＩＨＦＮＴＨＩ先端部を対象とするキメラ組換えペプチド（tip-directed chimeric recombinant peptide）を示す。「ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ」はＡ５配列、すなわち、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＩｈｆＡ５配列、続いてリンカー配列（ＧＰＳＬ）、続いてｍＢ４ポリペプチド、すなわち、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ配列：（配列番号５０：ＲＰＧＲＮＰＫＴＧＤＶＶＰＶＳＡＲＲＶＶＧＰＳＬＦＳＬＨＨＲＱＰＲＬＧＲＮＰＫＴＧＤＳＶ）を有する。ＩＨＦ内を標的とした対応する構造領域は、ペプチド配列の下に矢印によって指し示したように示される。
図２Ａおよび２Ｂは、キメラ組換えポリペプチドの有効性を示す。図２Ａは、ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチドを使用して生成したチンチラ血清およびウサギ血清の逆数力価を示す。チンチラおよびウサギ血清抗ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ（ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ：配列番号１２、ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ：配列番号１３およびｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ：配列番号１７）ならびに抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ（ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ：配列番号５０）試料は、ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラペプチドとの反応性を評価するために分析した。図２Ｂは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰによって形成されたバイオフィルムの、媒体対照または以下のような種々のチンチラ血清：ナイーブ血清対照、抗ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよび抗ＩｈｆＡ５－ｍＢ４ＮＴＨＩキメラとのインキュベーションによる破壊を示す。チンチラ血清の１：５０希釈を使用した。示されたバイオマスの低減はナイーブ血清と比較される。
図３は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰにより形成されたバイオフィルムの破壊が、成体チンチラの中耳において、ポリクローナルウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラおよびナイーブウサギ血清から生成したＦａｂ断片を使用して分析された方法を示す。実験は、ナイーブウサギ血清ＩｇＧＦａｂ断片、ウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂ断片、ウサギ抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂ断片およびウサギ抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂ断片を使用するコホートを含んだ。ゼロ（０）日目に、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰをチンチラの中耳に接種した。その後、４および５日目（２用量実験）または４、５および６日目（３用量実験）のいずれかに、Ｆａｂ断片を中耳に直接送達によって投与した（３４２ｎＭ）。４および５日目に投与したものについては、６日目または１２日目のいずれかにコホート１つ当たり３（３）匹のチンチラを屠殺した。４、５および６日目に投与したものについては、１３日目に１つコホート当たり３（３）匹のチンチラを屠殺した。屠殺後、チンチラをイメージングし、中耳粘膜を収集し、接着したバイオフィルムを評価し、中耳液を収集し、細菌の定量を実施し、中耳液はサイトカイン多重アッセイを使用して評価した。１０％ビス－トリスＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）およびＳＹＰＲＯオレンジタンパク質ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって裏付けられたように、各Ｆａｂ調製物の純度も示す（４つの別々の調製物：ナイーブ、ＩｈｆＢ２、ｍＩｈｆＢ４およびＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラ）。
図４は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後に、ウサギＩｇＧ１Ｆａｂ、ウサギＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂ、ウサギｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂまたはウサギＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂのいずれかを投与されたチンチラにおける粘膜バイオフィルムの１ミリグラム（ｍｇ）当たりのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量を示す。定量は、以下の通りの３つの異なる実験で実施した：（１）それぞれのＦａｂの２用量を投与して１日後に屠殺した；（２）それぞれのＦａｂの２用量を投与して７日後に屠殺した；および（３）それぞれのＦａｂの３用量を投与して７日後に屠殺した。Ｆａｂの用量をＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の４および５日目（２用量）または４、５および６日目（３用量）に投与した。Ｐ値を示す：＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１および＊＊＊Ｐ≦０．００１。
図５は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後に、ウサギＩｇＧ１Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂ、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂまたはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂのいずれかを投与されたチンチラにおける中耳液の１ミリリットル（ｍｌ）当たりのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量を示す。定量は、以下の通りの３つの異なる実験で実施した：（１）それぞれのＦａｂの２用量を投与して１日後に屠殺した；（２）それぞれのＦａｂの２用量を投与して７日後に屠殺した；および（３）それぞれのＦａｂの３用量を投与して７日後に屠殺した。Ｆａｂの用量をＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の４および５日目（２用量）または４、５および６日目（３用量）に投与した。Ｐ値を示す：＊Ｐ≦０．０５および＊＊Ｐ≦０．０１。
図６は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後に、ウサギＩｇＧ１Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂ、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂまたはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂのいずれかを投与されたチンチラの平均粘膜バイオフィルムスコア（７人の盲検検査者）を示す。定量は、以下の通りの３つの異なる実験で実施した：（１）それぞれのＦａｂの２用量を投与して１日後に屠殺した；（２）それぞれのＦａｂの２用量を投与して７日後に屠殺した；および（３）それぞれのＦａｂの３用量を投与して７日後に屠殺した。Ｆａｂの用量をＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の４および５日目（２用量）または４、５および６日目（３用量）に投与した。粘膜バイオフィルムスコアスケールは、中耳腔内に残存するバイオフィルムをランク付けするために使用した。確立された規程を使用して、以下の通りに０から４までのスコアを各画像に割り当てた：ゼロ（０）：見ることができるバイオフィルムはない；１：バイオフィルムは中耳腔の＞０から≦２５％を満たす；２：バイオフィルムは中耳腔の＞２５％から≦５０％を満たす；３：バイオフィルムは中耳腔の＞５０％から≦７５％を満たす；および４：バイオフィルムは中耳腔の＞７５％から１００％を満たす。Ｐ値を示す：＊Ｐ≦０．０５および＊＊Ｐ≦０．０１。
図７は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後に、ナイーブウサギＩｇＧＦａｂ、ウサギ抗ｍＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＩｇＧＦａｂ、ウサギ抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＩｇＧＦａｂまたはウサギ抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＩｇＧＦａｂのいずれかを投与されたチンチラにおける清澄化した中耳液における炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのパネルの相対量を示す。測定された炎症誘発性サイトカインには、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７Ａ、ＴＮＦおよびＩＦＮγが含まれた。測定された抗炎症性サイトカインには、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３が含まれた。
図８Ａ～８Ｃは、ＩＨＦＮＴＨＩＦａｂ断片＋ＨＭＧＢ１－Ｃ４５Ｓの治療有効性を評価する研究の結果を示す。 図８Ａ～８Ｃは、ＩＨＦＮＴＨＩＦａｂ断片＋ＨＭＧＢ１－Ｃ４５Ｓの治療有効性を評価する研究の結果を示す。 図８Ａ～８Ｃは、ＩＨＦＮＴＨＩＦａｂ断片＋ＨＭＧＢ１－Ｃ４５Ｓの治療有効性を評価する研究の結果を示す。
表の説明
表１は、立体構造先端ドメインポリペプチドの例の概要である。
表２は、粘膜バイオマススコアを生成するために実施例３の中耳炎モデルにおいて使用されたスコア付け方法の概要である。
表３は、インタクトなウサギポリクローナルＩｇＧに対するウサギＩｇＧＦａｂポリクローナル断片の有効性の概要である。
詳細な説明
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で提供される全てのヌクレオチド配列は、５’から３’への方向で提示される。本開示の実施または試行では、本明細書で記載される方法および材料と類似または同等の、任意の方法および材料を使用しうるが、ここでは、特定の、非限定的で、例示的な方法、デバイス、および材料について記載する。本明細書で引用される全ての技術的刊行物および特許公開は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本開示が、先行発明として、このような開示に先行する権利がないことの容認とはみなされないものとする。
本開示の実施では、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の技術の範囲内にある、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡについての従来の技法を利用する。例えば、ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ編（２０１２年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」、４版；Ａｕｓｕｂｅｌら編（２０１５年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（２０１５年）、「ＰＣＲ １： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ内、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５年）、「ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（２００６年）、「ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃｓ」、（Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９９９年）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ編（２０１４年）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０１０年）、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、６版；Ｇａｉｔ編（１９８４年）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」；米国特許第４，６８３，１９５号；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９年）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編（２００５年）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」；ＢｕｚｄｉｎおよびＬｕｋｙａｎｏｖ編（２００７年）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６年））；Ｇｒａｎｄｉ編（２００７年）、「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、２版；Ｇｕｉｓａｎ編（２００６年）、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ」；Ｐｅｒｂａｌ（１９８８年）、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、２版；ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編（１９８７年）、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３年）、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７年）、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ＬｕｎｄｂｌａｄおよびＭａｃｄｏｎａｌｄ編（２０１０年）、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、４版；ならびにＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６年）、「Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、５版を参照されたい。
範囲を含めた全ての数字表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は近似であり、１．０または０．１単位で、必要に応じて、またはその代わりに、＋／－１５％、あるいは１０％あるいは５％あるいは２％の変動で（＋）または（－）に変動する。必ずしも明記されているとは限らないが、全ての数字表示に「約」という用語が先行することが理解されるべきである。本明細書に記載の試薬はただ単に例示的なものであり、その等価物が当技術分野で公知であることも、必ずしも明記されているとは限らないが、理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「ポリペプチド」という用語は、複数のポリペプチドを、それらの混合物を含めて包含する。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味するものとする。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、意図された使用のための組合せのための任意の本質的に重要な他の要素を排除することを意味するべきである。したがって、本明細書で定義されている要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法由来の微量汚染物質および薬学的に許容されるキャリア、例えば、リン酸生理食塩水、保存料（例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムおよびヒドロキシ安息香酸メチル）などを排除しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、他の成分の微量要素および本明細書に開示される組成物を投与するための実質的な方法のステップ以上のものを排除することを意味するべきである。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
「バイオフィルム」とは、微生物が分泌および／または放出するＤＮＡなどのポリマーと一緒になった、有機体または無機体であり得る構造物の表面に時折接着する微生物の組織化された群集を意図する。バイオフィルムは、微生物（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）および抗菌剤に対して非常に耐性である。バイオフィルムは、種々の有機体表面および無機体表面（例えば、歯肉組織、歯および修復物）に生息し、歯周プラーク疾患としても公知の齲歯および歯周病を引き起こす。バイオフィルムは、中耳感染症も引き起こす。バイオフィルムは、歯科インプラント、ステント、カテーテル線およびコンタクトレンズの表面上にも形成され得る。バイオフィルムは、ペースメーカー、心臓弁置換物、人工関節および他の外科用インプラントの上で成長する。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、院内の感染（ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（院内感染（ｈｏｓｐｉｔａｌ－ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ））の６５％超はバイオフィルムによって引き起こされると推定している。バイオフィルムは、膣感染症を引き起こし、免疫系が妨げられている人において生命にかかわる全身感染症を導く。バイオフィルムはまた、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（例えば、Ｂ３１）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（例えば、Ｔｏｈａｍａ Ｉ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（例えば、６６８）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ（例えば、ＨＩ２４２４）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（例えば、Ｋ１２ ＭＧ１６５５）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（例えば、Ｖ５８３）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、Ｒｄ ＫＷ２０）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（例えば、２６６９５）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（例えば、ＲＨ４）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（例えば、ＭＣ２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（例えば、ＣＤＣ１５５１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（例えば、ＦＡ１０９０）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（例えば、ＭＣ５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（例えば、Ｗ８３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（例えば、１７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）２５８４５）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（例えば、ＭＷ２）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（例えば、ＲＰ６２Ａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（例えば、２６０３Ｖ／Ｒ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（例えば、ＵＣＮ３４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ（例えば、ＮＣＴＣ ７８６８ （Ｃｈａｌｌｉｓ））、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（例えば、ＵＡ１５９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えば、Ｒ６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えば、ＭＧＡＳ１０２７０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ（例えば、６７１５）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｅｎｔｅｒｉｃａ（例えば、ｔｙｐｈｉ、ＣＴ１８）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）３５４０５）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｕｍ（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ（例えば、Ｅｌ
Ｔｏｒ、Ｎ１６９６１）により引き起こされる疾患を含むがこれらに限定されない、多数の疾患にも関与する。バイオフィルムと関連する、かつ／またはこれを形成することが公知の、さらなる生物は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むがこれらに限定されない。例えば、嚢胞性線維症患者は、抗生物質耐性バイオフィルムを結果としてもたらすことが多い、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染症を有する。バイオフィルムと関連する他の疾患は、嚢胞性線維症患者の肺感染症、中耳炎、鼓膜切開後耳漏（ｐｏｓｔ－ｔｙｍｐａｎｏｓｔｏｍｙ ｔｕｂｅ ｏｔｔｏｒｈｅａ）、慢性化膿性中耳炎、自然弁感染性心内膜炎（ｎａｔｉｖｅ ｖａｌｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、骨髄炎、鼻副鼻腔炎（ｒｈｉｎｏｓｉｎｏｓｉｔｉｓ）、前立腺炎、尿路感染症、創傷、齲歯、および歯周炎を含むがこれらに限定されない。上記で列挙した生物（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｅｎｔｅｒｉｃａ）のうちの一部などであるがこれらに限定されない食品媒介性病原体もまた、それらが汚染する食品上で、バイオフィルムを形成しうる。動物において疾患を引き起こすバイオフィルム（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、およびＳｈｉｇｅｌｌａ種）はまた、下流のヒト宿主における食品汚染および／または疾患も引き起こしうる。さらに、バイオフィルムは、１つの均質な微生物集団である必要はなく、他の病原体を組み込む場合があり、宿主細胞であってもなお組み込む場合がある。疾患（院内およびその他の両方における）および食品汚染と関連することに加えて、バイオフィルムはとりわけ、プロセス水およびそれとの接触表面と関連する工業汚染の原因であることが多い。工業汚染物質としての、バイオフィルムを形成する生物に関与する問題は、バイオフィルム形成の結果としての、生物腐食、生物付着（ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ）、および装置破損を含むがこれらに限定されない。工業の場における非限定的な例示的、バイオフィルムと関連する生物は、Ｆｅｒｒｅｒａら（２０１５年）、Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ、３１巻（２号）：１７３～１８０頁において開示されている生物と、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ種とを含む。バイオフィルムに関するさらなる詳細は、例えば、Ｄｏｎｌａｎ（２００２年）、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、８巻（９号）：８８１～８９０頁において見出すことができる。
用語「バイオフィルムの形成を防止する」は、微生物バイオフィルムの構成成分であるＤＮＡ／タンパク質マトリックスの形成またはその構造の防止を意図している。
用語バイオフィルムを「分解する」または「破壊する」は、微生物バイオフィルムの構成成分であるＤＮＡ／タンパク質マトリックスの形成またはその構造の低減または破壊を意図している。
本明細書で使用される「核封入体関連タンパク質」または「ＮＡＰ」という用語は、原核細胞の核封入体内の核酸の動的な空間組織化に影響を与えるタンパク質のクラスを指す。これらのタンパク質は、ＤＮＡの屈曲、結合、および凝集の実行を介して、ゲノムを組織化する。ある特定のＮＡＰは、ＤＮＡ結合性タンパク質であり、ＤＮＡＢＩＩタンパク質、ＤＰＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＡＡ４９１６９）、Ｈ－ＮＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＡＡ４７７４０）、Ｈｆｑ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＣＥ６３２５６）、ＣｂｐＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＢＡＡ０３９５０）、およびＣｂｐＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１８８１３）を含むバイオフィルムと関連しうる。ＮＡＰのうち、ＤＮＡＢＩＩタンパク質は別個であり、一般にアルファヘリックス二量体化ドメインとの強力な配列同一性を有し、ＮＰＸ１Ｔアミノ酸モチーフを含む先端部であって、ＤＮＡの副溝に結合し、その中に挿入され、ＤＮＡをねじれさせる先端部を有することが多い、アンチパラレルのベータリボンを含みうる。
「ＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはＤＮＡＢＩＩタンパク質」とは、ＤＮＡ結合性ドメインで構成され、したがって、微生物ＤＮＡに対して特異的または一般的な親和性を有するＤＮＡ結合性のタンパク質またはポリペプチドを意味する。一態様では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ＤＮＡに、副溝において結合する。ＤＮＡＢＩＩタンパク質の非限定的な例は、組込み宿主因子（ＩＨＦ）タンパク質およびヒストン様タンパク質（ＨＵ）である。
用語「Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ」とは、例えば、耳感染症、目感染症、および副鼻腔炎などの多くの異なる感染症を引き起こすことが可能な病原性細菌を指す。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの多くの異なる株が単離されており、それはＩｈｆＡ遺伝子またはタンパク質を有する。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの異なる株のいくつかの非限定的な例としては、Ｒｄ ＫＷ２０、８６－０２８ＮＰ、Ｒ２８６６、ＰｉｔｔＧＧ、ＰｉｔｔＥＥ、Ｒ２８４６、および２０１９が挙げられる。
「組込み宿主因子」または「ＩＨＦ」タンパク質は、バクテリオファージがそのＤＮＡを宿主細菌に組み入れるために使用する細菌のタンパク質である。これらは、細胞外の微生物ＤＮＡにも結合する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＩＨＦタンパク質サブユニットをコードする遺伝子は、ｈｉｍＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＰＯＡ６Ｘ７．１）およびｈｉｍＤ遺伝子（ＰＯＡ６Ｙ１．１）である。これらの遺伝子に対するホモログは他の生物体において見いだされ、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９９９，２９１号の表１０において記載されるとおりである。
「ＨＵ」または「ヒストン様タンパク質」とは、一般にはＥ．ｃｏｌｉに付随するヘテロ二量体タンパク質のクラスを指す。ＨＵタンパク質は、ＤＮＡホリデー接合部または他の屈曲した構造に結合することが公知である。他の微生物から関連するタンパク質が単離されている。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＵの完全なアミノ酸配列は、Ｌａｉｎｅら（１９８０年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０３巻（３号）：４４７～４８１頁によって報告された。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＵタンパク質サブユニットをコードする遺伝子は、それぞれ配列番号８および９に対応するｈｕｐＡおよびｈｕｐＢである。分類不能型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）に由来するＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのホモログは、配列番号３に対応する。これらの遺伝子のホモログは、他の生物においても見出され、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，９９９，２９１号の表１０において記載されるとおりである。
「微生物ＤＮＡ」は、バイオフィルムの細胞外マトリックスを生成するのに使用される微生物由来の一本または二本鎖ＤＮＡを意図している。
ポリペプチドの「立体構造先端ドメイン」とは、構造が、典型的にプロリン残基に媒介される急旋回をする逆平行ベータリボンを有する一次アミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。ＩＨＦポリペプチドの「先端部」を図１に示す。
「感染症を処置すること」とは、微生物、例えば、細菌の数の低減を意図し、本明細書中で用いられる他の局面では、この用語は、バイオフィルムの形成と関連することを意図する。当技術分野では、微生物の数が低減されたのかどうかを決定する方法が公知であり、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイおよびｅｘ ｖｉｖｏアッセイ、ならびに感染症の臨床症状の軽減を含む。細菌は、バイオフィルムにより保護されるため、細菌は、抗菌薬の使用に対して耐性となる。バイオフィルムを破壊することにより、抗菌薬および他の作用剤に対する細菌の耐性を低減または阻害することができ、ならびに細菌感染を処置することができる。
「屈曲したポリヌクレオチド」とは、他の鎖と対にならない１本の鎖上に小さなループを含有する二本鎖ポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、ループは、１塩基から約２０塩基までの長さ、あるいは２塩基から約１５塩基までの長さ、あるいは約３塩基から約１２塩基までの長さ、あるいは約４塩基から約１０塩基までの長さである、あるいは、約４塩基、５塩基、または６塩基、または７塩基、または８塩基、または９塩基、または１０塩基を有する。
「ＤＮＡへの結合においてＤＮＡＢＩＩタンパク質と競合するポリペプチド」とは、屈曲したＤＮＡ構造または歪んだＤＮＡ構造への結合においてＩＨＦまたはＨＵと競合するが、ＤＮＡとバイオフィルムを形成しないタンパク質またはペプチドを意味する。例としては、これらに限定することなく、ＩＨＦの１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインを含むＩＨＦの立体構造チップ断片、またはその生物学的等価物が挙げられる。
本明細書で使用された、「～を特異的に認識する、またはそれに特異的に結合する」という用語は、作用剤、例えば、抗体、抗原結合断片、またはFab（抗原結合性断片（fragment antigen binding））の、意図されるその標的または結合パートナーへの結合が、
非結合より可能性が高いことを意図する。
診断または処置の「対象」は、細胞または動物、例えば、哺乳動物またはヒトなどである。対象は特定の種に限定されておらず、診断または処置に供される非ヒト動物を含み、感染を受けやすい動物または動物モデル、例えば、サル、ラット、マウス、チンチラなどのネズミ（murine）、イヌなどのイヌ（canine）、ウサギなどのウサギ（leporid）、家
畜、スポーツ動物、およびペットである。その用語にはヒト患者も同様に含まれる。
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、それらの最も広範な意味では、２つ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸の類似体またはペプチド模倣薬の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されていてよい。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル結合、エーテル結合などによって連結されていてよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、アミノ酸の最大数に対する制限はなく、タンパク質の配列またはペプチドの配列を含んでよい。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸または合成アミノ酸のいずれかを指し、グリシンおよびＤ光学異性体とＬ光学異性体の両方、アミノ酸の類似体およびペプチド模倣薬を含める。
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、任意の長さのポリマーの形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはその類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してよく、公知または未知の任意の機能を果たし得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴタグまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などを含んでよい。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリヌクレオチドの組立ての前に、またはその後に付与することができる。ヌクレオチドの配列を非ヌクレオチド構成成分で遮ることができる。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識化構成成分とコンジュゲートすることによってさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に開示される任意の実施形態は、二本鎖の形態と、二本鎖の形態を成すことが公知であるまたは予測される２つの相補的な一本鎖の形態のそれぞれの両方を包含する。
ポリヌクレオチドは、特異的な配列の４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合はチミンの代わりにウラシル（Ｕ）で構成される。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は、中央処理装置を有するコンピュータ内のデータベースに入力し、バイオインフォマティクスの適用、例えば、機能ゲノム科学および相同性検索などのために使用することができる。
「単離された」または「組換え型の」という用語は、本明細書において核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどに関して使用される場合、それぞれ、巨大分子ならびにポリペプチドの天然の供給源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。「単離されたかまたは組換え型の核酸」という用語は、断片として天然に存在せず、自然の状態で見いだされない核酸断片を含むものとする。「単離された」という用語は、本明細書では、他の細胞タンパク質から単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびタンパク質を指すためにも使用され、精製されたポリペプチドと組換え型のポリペプチドの両方を包含するものとする。他の実施形態では、「単離されたかまたは組換え型の」という用語は、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（複数可）が天然で通常付随する構成成分、細胞および他の物から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離された細胞である。単離されたポリヌクレオチドは、そのネイティブな環境または天然の環境、例えば、染色体上では通常付随する３’および５’の連続したヌクレオチドから分離されている。当業者には明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（複数可）は、その天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。
明示的な列挙がなくとも、また別段の意図がなければ、本開示がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関する場合、本開示の範囲内でその等価物または生物学的等価物が意図されることが推定されるべきである。本明細書で使用される場合、「生物学的なその等価物」は、参照のタンパク質、抗体、断片、ポリペプチドまたは核酸について言及される場合、「その等価物」という用語と同義であるものとし、所望の構造または機能性を依然として維持しながら最小の相同性を有するものを意味する。本明細書において具体的に列挙されていなければ、本明細書で言及されているポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質はいずれも、その等価物も包含すると考えられる。一態様では、等価なポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で本明細書記載の、記載されている方法において使用するためのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの相補物とハイブリダイズするポリヌクレオチドである。別の態様では、等価な抗体または抗原結合性ポリペプチドとは、参照抗体または参照抗原結合性断片またはＦａｂ（抗原結合性断片）と、少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは少なくとも８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％の親和性またはそれを超える親和性で結合する抗体または抗原結合性ポリペプチドを意味する。別の態様では、その等価物は、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、抗体または抗原結合性断片の、その抗原への結合と競合する。別の態様では、等価物とは、少なくとも約８０％の相同性または同一性、あるいは、少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは９８％の相同性または同一性の百分率を意味し、参照タンパク質、参照ポリペプチドまたは参照核酸と実質的に等しい生物活性を示す。
下の表１は立体構造先端ドメインポリペプチドの例を示す。
Figure 2022171777000074
Figure 2022171777000075
Figure 2022171777000076
Figure 2022171777000077
Figure 2022171777000078
別の配列に対して特定の百分率（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（または、ポリペプチドまたはポリペプチド領域）は、アラインメントすると、その百分率の塩基（またはアミノ酸）が、比較している２つの配列において同じであることを意味する。アラインメントおよび相同性または配列同一性の百分率は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）付録３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載のものを使用して決定することができる。ある特定の実施形態では、アラインメントのために初期状態のパラメータが使用される。非限定的な例示的アラインメントプログラムは、初期状態のパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。具体的には、例示的プログラムは、以下の初期状態のパラメータを使用したＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを含む：遺伝暗号（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ）＝標準；フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）＝なし；鎖（ｓｔｒａｎｄ）＝両方；カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）＝６０；期待値（ｅｘｐｅｃｔ）＝１０；行列（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；ソート（ｓｏｒｔ ｂｙ）＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅｓ）＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見いだすことができる：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。配列同一性および同一性の百分率は、それらをｃｌｕｓｔａｌＷに取り込むことによって決定することができる（ウェブアドレス：ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／（２０１７年１月１３日に最終アクセス）において利用可能。
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較するためにアラインメントすることができる各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列内の位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合、それらの分子は、その位置において相同である。配列間の相同性の程度は、それらの配列が共有する、一致するまたは相同である位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同な」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を共有する。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸分子を指す場合もある。
「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的な様式で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成している２つの鎖、複数鎖複合体を形成している３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ性（ｓｅｌｆ－ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）鎖、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。ハイブリダイゼーション反応は、より大規模なプロセスのステップ、例えば、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などを構成し得る。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約２５℃～約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液の濃度；約０％～約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃～約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの緩衝液の濃度；約３０％～約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液の濃度；約５５％～約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液、または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、５分から２４時間の間であり、１つ、２つ、またはそれ以上の洗浄ステップを伴い、洗浄インキュベーション時間は約１分、２分、または１５分である。ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である。他の緩衝系を用いた同等のＳＳＣを使用することができることが理解される。
本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡがその後、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含んでよい。
「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、そのネイティブな状態にある場合、または当業者に周知の方法によって操作される場合、転写および／または翻訳してポリペプチドおよび／またはその断片に対するｍＲＮＡを作製することができるポリペプチドを「コードする」と考えられているポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補物であり、それからコード配列を推定することができる。
本明細書で使用される場合、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、本明細書では、所望の薬理的効果および／または生理的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、障害またはその徴候または症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であってよい、および／または、障害および／または障害に起因する有害作用に対する部分的または完全な治癒という点で治療的であってよい。当技術分野では、処置が行われたのかどうかを決定する方法が公知であり、本明細書でも略述される。
予防するとは、障害または影響の素因がある系または対象において障害または影響をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで予防することを意味する。その例は、バイオフィルムを生じることが公知の微生物に感染した系においてバイオフィルムの形成を予防することである。
「組成物」は、活性作用剤、および不活性な別の化合物または組成物（例えば、検出可能な作用剤または標識）または活性な別の化合物または組成物、例えば、アジュバントなどの組合せを意味するものとする。
「医薬組成物」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断または治療における使用に適した組成物を成す活性作用剤と不活性または活性なキャリアの組合せを含むものとする。
「薬学的に許容されるキャリア」とは、本明細書で開示される組成物中で使用しうる任意の希釈剤、賦形剤、またはキャリアを指す。薬学的に許容されるキャリアは、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩または電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、マイクロスフェア、マイクロ粒子、またはナノ粒子（例えば、Ｐｏｌｙ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）など生体分解性ポリマーを含む）、および羊毛脂を含む。適切な医薬キャリアは、この分野における標準の参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。適切な医薬キャリアは、意図された投与形態、すなわち、経口錠剤、カプセル、エリキシル剤、シロップ剤などに関して選択すること、および従来の医薬の実施と一致し得る。
本明細書に開示される「生物学的に活性な作用剤」または活性作用剤とは、単離されたかまたは組換え型のポリペプチド、単離されたかまたは組換え型のポリヌクレオチド、ベクター、単離された宿主細胞、または抗体、ならびにそれらのうちの１つまたは複数を含有する組成物のうちの１つまたは複数を意味する。
治療薬または他の作用剤の「投与」または「送達」は、処置の過程全体を通して、１回用量で、連続的に、または断続的に実施することができる。最も有効な手段および投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、療法に使用される組成物、療法の目的、処置されている標的細胞、および処置されている対象によって変動する。単回投与または多数回の投与は、処置にあたっている医師によって選択された用量のレベルおよびパターンを用いて行うことができる。適切な投薬の処方および作用剤を投与する方法は当技術分野で公知である。投与経路を決定することができ、最も有効な投与経路を決定する方法は当業者に公知であり、処置に使用される組成物、処置の目的、処置されている対象の健康状態または疾患の病期、および標的細胞または組織によって変動する。投与経路の非限定的な例は、経口投与、経鼻投与、吸入、注射、および局所塗布を含む。投与は、工業適用ならびに治療適用における使用のための投与でありうる。
本開示の作用剤（抗体もしくはその断片、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、組成物またはワクチン）は、いかなる適切な投与経路によってｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも（例えば、治療的に）その意図した使用のために投与することが可能である。最適経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置されている疾患により変動することも理解されたい。作用剤は産業環境においておよび動物の処置のために使用してもよい。産業環境において使用される場合、バイオフィルムは作用剤、例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合（fragment antigen binding））、抗体、ポリペプチドまたはワクチンと接触させる。
用語「有効量」とは、所望の効果を達成するのに十分な量を指す。治療または予防的使用という文脈では、有効量は問題の状態のタイプおよび重症度ならびに健康全般、年齢、性別、体重、種、および医薬組成物に対する耐性などの個々の対象の特徴に依存する。本開示の文脈では、一部の実施形態では、有効量は、バイオフィルム塊の低減またはバイオフィルムの分解をもたらすのに十分な量である。他の態様では、その量は、対象においてバイオフィルムに関連する細菌感染を処置するのに効果的である。他の実施形態では、Ｆａｂ（断片抗原結合）または抗体という文脈では、有効量はバイオフィルムを分解する、減らすまたは破壊するのに十分な量である。他の実施形態では、作用剤または免疫原性組成物の有効量は、抗原に対する抗体産生をもたらすのに十分な量である。一部の実施形態では、有効量は、受動免疫の付与を必要とする対象に受動免疫を与えるのに必要な量である。組成物に関しては、一部の実施形態では、上記の要因に加えて、有効量は、意図されている使用、対象の免疫系の健康／応答性に依存する。当業者であれば、これらのおよび他の要因に応じて、適切な量を決定することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用の場合では、いくつかの実施形態では、有効量は、問題の適用のサイズおよび性質に左右される。有効量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける標的および使用されている方法の性質および感受性にも左右される。当業者は、これらおよび他の考察に基づいて有効量を決定することができる。有効量は、実施形態に応じて、組成物を１回または複数回投与することを含んでよい。
抗生物質などの薬物の効力に関係する用語「効力」とは、所与の強度の効果を生じるのに必要な量という点から表される薬物活性の尺度を指す。高効力薬物は低濃度で所与の応答を誘起し、効力がもっと低い薬物はもっと高い濃度でのみ同じ応答を誘起する。効力は、親和性と有効性の両方に依存する。
「コンジュゲートした部分」という用語は、単離されたキメラポリペプチドに、キメラポリペプチドの残基と共有結合を形成することによって付加することができる部分を指す。部分は、キメラポリペプチドの残基と直接結合させることができる、または、リンカーとの共有結合を形成し、次にリンカーとキメラポリペプチドの残基の共有結合を形成することができる。
「ペプチドコンジュゲート」または「組換えポリペプチド」とは、１つまたは複数のポリペプチドの互いのおよび／または別の化学化合物もしくは生物化合物との共有結合または非共有結合による会合を指す。非限定的例では、ポリペプチドと化学化合物との「コンジュゲーション」により、その意図された目的のためのポリペプチドの安定性または有効性が改善される。一実施形態では、本開示の活性な作用剤はキャリアにコンジュゲートされ、キャリアはリポソーム、ミセル、または薬学的に許容されるポリマーである。
「リポソーム」は、同心脂質二重層からなる顕微鏡レベルの小胞である。リポソームは、キャリア、例えば、薬学的に許容されるキャリアの例である。構造的に、リポソームは、数百オングストロームから数分の１ミリメートルまでの寸法を有する長い管から球体まで、サイズおよび形状に幅がある。小胞形成性脂質は、外層の脂質組成物をもたらす最終的な複合体の特定の程度の流動性または剛性が達成されるように選択する。これらは、中性（コレステロール）または双極性であり、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）など、およびこれらに限定されないが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含めた他の種類の双極性の脂質を含み、炭化水素の鎖長は１４～２２の範囲内であり、飽和型であるまたは１つまたは複数のＣ＝Ｃ２重結合を有する。単独で、または他の脂質構成成分と組み合わせて安定なリポソームを作製することができる脂質の例は、リン脂質、例えば、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジステアロイルホスファチジルエタン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎ）－オラミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオテオイルホスファチジルコリン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｔｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＰＯＰＥ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミド－トリエチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）などである。さらなるリポソームに組み入れることができる、リンを含有しない脂質としては、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ミリスチン酸イソプロピル、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル－アリールスルフェート、アセチルパルミテート（ａｃｅｔｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、グリセロールリシノレエート（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ）、ヘキサデシルステアレート（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｓｔｅｒｅａｔｅ）、両性のアクリルポリマー、ポリエチルオキシレート化（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｏｘｙｌａｔｅｄ）脂肪酸アミド、および上記のカチオン性脂質（ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＭＲＩＥ、ＤＭＴＡＰ、ＤＯＧＳ、ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＭＡ）、ＤＯＳＰＡ、ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ）が挙げられる。負に荷電した脂質としては、小胞を形成することができるホスファチジン酸（ＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオテオイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｏｔｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＤＯＰＧ）、およびジセチルホスフェート（ｄｉｃｅｔｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が挙げられる。一般には、リポソームは、それらの全体的なサイズおよびラメラ構造の性質に基づいて３つのカテゴリーに分けることができる。Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、１９７７年１２月によって開発された３つの分類は、多層状の小胞（ＭＬＶ）、小さな単層の小胞（ＳＵＶ）および大きな単層の小胞（ＬＵＶ）である。生物活性のある作用剤を、本明細書に記載の方法に従って投与するためにそのようなものに封入することができる。
「ミセル」は、液体コロイド中に分散した界面活性物質分子の凝集体である。典型的な水溶液中ミセルは、周囲の溶媒と接触した親水性の「頭部」領域を有し、ミセルの中心に疎水性の尾部領域が隔離された凝集体を形成する。この種類のミセルは、順相ミセル（水中油ミセル）として公知である。逆ミセルは、頭部基を中心に有し、尾部が突き出している（油中水ミセル）。ミセルは、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、抗原結合断片、ワクチンまたは組成物を付着させて、標的の細胞または組織への効率的な送達を容易にするために使用することができる。
「薬学的に許容されるポリマー」という句は、本明細書に記載の１つまたは複数のポリペプチドまたは抗体とコンジュゲートすることができる化合物の群を指す。ポリマーをポリペプチドまたは抗体とコンジュゲートすることにより、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのポリペプチドの半減期を延長することができると考えられる。非限定的な例としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、糖、ポリオールならびにそれらの混合物が挙げられる。生物活性のある作用剤は、本明細書に記載の方法に従って投与するために、薬学的に許容されるポリマーとコンジュゲートすることができる。
「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞内に運ぶことができる任意の分子と定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、ミセル、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含めた生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖；リポ多糖；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；および細菌、またはウイルス、例えば、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスなど、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌のベクター、ならびに、種々の真核生物宿主および原核生物宿主における発現について記載されており、遺伝子療法のために、ならびに単純なタンパク質の発現のために使用することができる、当技術分野で一般に使用される他の組換え型ビヒクルである。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して細胞または組織に送達することができる。「遺伝子送達」、「遺伝子移入」、「形質導入」などは、本明細書で使用される場合、導入するために使用する方法に関係なく、外因性のポリヌクレオチド（時には「導入遺伝子」と称される）を宿主細胞に導入することに関する用語である。そのような方法としては、種々の周知の技法、例えば、ベクターに媒介される遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または種々の他のタンパク質ベースまたは脂質ベースの遺伝子送達複合体による）、ならびに、「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技法などが挙げられる（例えば、電気穿孔、「遺伝子銃」送達およびポリヌクレオチドを導入するために使用する種々の他の技法など）。導入したポリヌクレオチドは、宿主細胞内で安定にまたは一過性に維持することができる。安定に維持するためには、一般には、導入したポリヌクレオチドが宿主細胞と適合する複製開始点を含有すること、または、宿主細胞のレプリコン、例えば、染色体外のレプリコン（例えば、プラスミド）または核内染色体またはミトコンドリア染色体などに組み込まれることが必要である。当技術分野で公知であり、また本明細書に記載されている通り、いくつものベクターが、遺伝子の哺乳動物の細胞への移入を媒介することができることが公知である。
本明細書で使用される場合「ｅＤＮＡ」という用語は、病原性のバイオフィルムに対する構成成分として見いだされる細胞外のＤＮＡを指す。
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡと独立して複製することができる、染色体ＤＮＡから分離される染色体外のＤＮＡ分子である。多くの場合、プラスミドは環状の二本鎖である。プラスミドにより、微生物の集団内に水平に遺伝子移入するための機構がもたらされ、また、一般には、所与の環境状態下で選択的な利点がもたらされる。プラスミドは、競合的な環境的ニッチにおいて天然に存在する抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子を保有してよい、あるいは、産生されるタンパク質は同様の状況の下で毒素としての機能を果たし得る。
遺伝子工学において使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と称される。そのような使用のための多くのプラスミドが市販されている。複製しようとする遺伝子を、細胞を特定の抗生物質に対して耐性にする遺伝子およびＤＮＡ断片をこの場所に容易に挿入することを可能にするいくつかの一般に使用される制限部位を含有する短い領域である多重クローニング部位（ＭＣＳ、またはポリリンカー）を含有するプラスミドのコピーに挿入する。プラスミドの別の主要な使用は、大量のタンパク質を生産することである。この場合、研究者は、目的の遺伝子を有するプラスミドを含有する細菌を成長させる。細菌はタンパク質を産生してその抗生物質耐性を付与するのと同じように、挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように誘導することもできる。
「酵母人工染色体」または「ＹＡＣ」とは、大きなＤＮＡ断片（１００ｋｂよりも大きく、最大３０００ｋｂ）をクローニングするために使用されるベクターを指す。これは、人工的に構築された染色体であり、酵母細胞において複製および保存されるために必要なテロメア配列、セントロメア配列、および複製開始点配列を含有する。最初の環状のプラスミドを使用して築き、制限酵素を使用することによって直線化し、次いでＤＮＡリガーゼにより、突出末端を使用することによって目的の配列または遺伝子を線形の分子内に付加することができる。酵母発現ベクター、例えば、ＹＡＣ、ＹＩｐ（酵母組込みプラスミド）、およびＹＥｐ（酵母エピソームプラスミド）などは、酵母はそれ自体が真核細胞であるので、翻訳後修飾された真核生物のタンパク質産物を得ることができるので非常に有用であるが、ＹＡＣはＢＡＣよりも不安定であり、キメラ的な影響を生じることが見いだされている。
「ウイルスベクター」は、宿主細胞に送達しようとするポリヌクレオチドを含む、ｉｎ
ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで組換えによって作製されるウイルスまたはウイルス粒子と定義される。
ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが挙げられる。感染性のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベースのベクターは、タンパク質の製造に使用することができ、タバコの葉においてＧｒｉｆｆｉｔｈｓｉｎを発現することが報告されている（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（２００９年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０６巻（１５号）：６０９９～６１０４頁）。アルファウイルスベクター、例えば、セムルキ森林ウイルスベースのベクターおよびシンドビスウイルスベースのベクターなどが、遺伝子療法および免疫療法において使用するために開発されている。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ ＆ Ｄｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５巻：４３４～４３９頁およびＹｉｎｇら（１９９９年）Ｎａｔ． Ｍｅｄ．
５巻（７号）：８２３～８２７頁を参照されたい。遺伝子移入がレトロウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物とは、レトロウイルスのゲノムまたはその一部、および治療的な遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子移入における使用のための最新のベクター法についてのさらなる詳細は、例えばＫｏｔｔｅｒｍａｎら（２０１５年）、「Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｕｔｌｏｏｋ Ａｎｎｕａｌ
Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、１７頁において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス媒介性遺伝子移入」または「レトロウイルスの形質導入」は同じ意味を有し、ウイルスが細胞に侵入し、そのゲノムを宿主細胞ゲノム内に組み込むことによって遺伝子または核酸配列が宿主細胞に安定に移入されるプロセスを指す。ウイルスは、その通常の感染機構によって宿主細胞に侵入することができる、または、細胞に侵入するために異なる宿主細胞の表面受容体またはリガンドに結合するように修飾することができる。本明細書で使用される場合、レトロウイルスベクターとは、ウイルスまたはウイルス様の侵入機構によって外因性の核酸を細胞に導入することができるウイルス粒子を指す。
レトロウイルスは、それらの遺伝情報をＲＮＡの形態で保有する；しかし、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡはＤＮＡの形態に逆転写され、感染した細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＤＮＡ形態はプロウイルスと称されている。
遺伝子移入が、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのＤＮＡウイルスベクターにより媒介される態様では、ベクター構築物とは、ウイルスゲノムまたはその部分、およびトランス遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、５０を超えるセロタイプを含む、比較的よく特徴付けられている歴史的相同の（homogenous）ウイルス群である。Ａｄは宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。組換えＡｄ由来ベクター、特に野生型ウイルスの組換えおよび生成の潜在性を低減するベクターも構築されている。そのようなベクターは、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）、およびＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｇｅｎｅ（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）などの供給源から市販されている。野生型ＡＡＶは、宿主細胞ゲノムに組み込まれる高い感染力および特異性を有する。WoldおよびToth（２０１３年）Curr. Gene. Ther. １
３巻（６号）:４２１～４３３頁、Hermonat & Muzyczka（１９８４年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８１巻:６４６６～６４７０頁、およびLebkowskiら、（１９８８年）Mol. Cell. Biol. ８巻:３９８８～３９９６頁を参照されたい。
プロモーターと、ポリヌクレオチドを作動可能に連結することができるクローニング部位の両方を含有するベクターは当技術分野で周知である。そのようなベクターはＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで転写することができ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）などの供給源から市販されている。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を最適化するために、クローンの５’非翻訳部分および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変更して、転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかで発現に干渉するまたは発現を低下させる可能性がある余分の潜在的な不適切な代替翻訳開始コドンまたは他の配列を排除することが必要であり得る。あるいは、発現を増強するために、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンのすぐ５’側に挿入することができる。
遺伝子送達ビヒクルは、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセルおよびターゲティングされたウイルスタンパク質－ＤＮＡ複合体も包含する。本明細書に開示される方法では、ターゲティング抗体またはその断片も含むリポソームを用いることができる。タンパク質トランスフェクションの非限定的な技法により、ポリヌクレオチドを細胞または細胞集団に送達することに加えて、本明細書に記載のタンパク質を細胞または細胞集団に直接導入することができる、あるいは発現を増強し、かつ／または本明細書に開示されるタンパク質の活性を促進する培養条件が他の非限定的な技法である。
本明細書で使用される場合、「抗体」、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、全抗体および任意の抗原結合性断片またはその単鎖を含む。したがって、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを包含する。「抗体」、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの免疫グロブリン、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、およびＶ－ＮＡＲドメインを含めた、抗原への特異的な結合を保持する抗体の断片；ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）およびカッパ抗体（ｋａｐｐａ ｂｏｄｙ）；抗体断片から形成された多特異性の抗体断片および１つまたは複数の単離されたものも包含する。そのようなものの例としては、これらに限定されないが、重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合性部分、重鎖または軽鎖の可変領域、重鎖または軽鎖の定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、または任意のその部分、結合性タンパク質の少なくとも１つの部分、キメラ抗体、ヒト化抗体、種化抗体（ｓｐｅｃｉｅｓ－ｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単鎖抗体、および抗体の抗原結合性部分を含む融合タンパク質および非抗体タンパク質が挙げられる。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体（Ａｂ）の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織への結合を媒介することができる。「抗」という用語は、タンパク質の名称の前に使用される場合、例えば、抗ＩＨＦ、抗ＨＵ、抗ＯＭＰ Ｐ５は、特定のタンパク質に結合し、かつ／またはそれに対する親和性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を指す。例えば、「抗ＩＨＦ」とは、ＩＨＦタンパク質に結合する抗体を指す。特異的な抗体は、それが生じた対象のタンパク質以外のタンパク質に対する親和性を有し得る、またはそれに結合し得る。例えば、抗ＩＨＦは、ＩＨＦタンパク質に対して特異的に生じたが、配列相同性または構造相同性によって関連する他のタンパク質にも結合し得る。
抗体は、それらが所望の生物活性を示す限りは、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性（例えば、二重特異性抗体）、ダイアボディ、および抗体断片であってよい。抗体は、任意の適切な生物学的な供給源、例えば、ヒト、マウス、ラット、ヒツジおよびイヌから単離することができる。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は、そのそれぞれが抗原上の単一の決定因子に指向されるので、高度に特異的である。抗体は、例えば、放射性同位元素、検出可能な産物を生成する酵素、蛍光タンパク質などを用いて検出可能に標識化することができる。抗体は、さらに他の部分、例えば、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）などとコンジュゲートすることができる。抗体は、ポリスチレンプレートまたはビーズなどを含むがこれらに限定されない固体支持体に結合させてもよく、治療的に、診断的にまたはポリペプチドを単離するために使用することが可能である。
モノクローナル抗体は、当技術分野で公知のハイブリドーマ法または組換えＤＮＡ法を用いて生成することができる。ハイブリドーマは、研究室において、抗体産生リンパ球と非抗体産生癌細胞、通常、骨髄腫またはリンパ腫を融合させることで作製される細胞である。ハイブリドーマは、増殖し、特異的なモノクローナル抗体の連続的なサンプルを産生する。抗体を生成または選択するための代替の技法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球を目的の抗原に曝露させること、および細胞、ファージ、または同様の系において抗体ディスプレイライブラリーをスクリーニングすることが挙げられる。
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むものとする。本明細書に開示されるヒト抗体としては、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダム変異誘発または部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入された変異）を挙げることができる。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含まないものとする。したがって、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、タンパク質の実質的に全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬドメイン、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））が、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、軽微な配列の変化または変異のみを伴う抗体を指す。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、など）および他の哺乳動物に指定された抗体は、そのような種、亜属、属、サブファミリー、ファミリーに特異的な抗体を示す。さらに、キメラ抗体は、上記の任意の組合せを含む。そのような変化または変異は、場合によって、ヒトまたは他の種において、修飾されていない抗体と比較して、免疫原性を保持する、または免疫原性が低い。したがって、ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体とは異なる。ヒト抗体は、機能的に再編成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核細胞または真核細胞によって作製することができることが指摘されている。さらに、ヒト抗体が単鎖抗体である場合、ヒト抗体は、ネイティブなヒト抗体においては見いだされないリンカーペプチドを含んでよい。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域をつなぐリンカーペプチド、例えば、２個～約８個のグリシンまたは他のアミノ酸残基などを含んでよい。そのようなリンカーペプチドは、ヒト起源のものであるとみなされる。リンカーポリペプチドの追加の非限定的例は本明細書に提供されている。
本明細書で使用される場合、ヒト抗体は、抗体が、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫化することによって、またはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによってヒト免疫グロブリン配列を用いて系から得られる場合、特定の生殖系列配列「に由来する」。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列とヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較することによって、そのようなものとして同定することができる。選択されたヒト抗体は、一般には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種（例えば、マウス生殖系列配列）の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列と比較してヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。ある場合では、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列と、少なくとも９５％、または、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％までも、アミノ酸配列が同一である。一般には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列と１０アミノ酸以下の差異を示す。ある場合では、ヒト抗体は、５以下、または、さらには４以下、３以下、２以下、１以下までの、生殖系列免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とのアミノ酸の差異を示し得る。
「ヒトモノクローナル抗体」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。この用語は、組換えヒト抗体も意味する。
「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製した、発現させた、創出した、または単離したヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたは染色体導入体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えば、マウス）またはそれから調製されるハイブリドーマから単離された抗体、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離された抗体、組換え型の、コンビナトリアルなヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列をスプライシングして他のＤＮＡ配列にすることを伴う任意の他の手段によって調製した、発現させた、創出した、または単離した抗体などの全てを包含する。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物を使用する場合は、ｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞の変異誘発）に供することができ、したがって、組換え型の抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、それと関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト抗体生殖系列レパートリーに天然に存在しない可能性がある配列である。
本明細書で使用される場合、キメラ抗体は、その軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、一般には、遺伝子工学によって、異なる種に属する抗体可変性領域遺伝子および抗体定常領域遺伝子から構築された抗体である。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するヒト／非ヒトキメラ抗体を指す。ほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、レシピエントの可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギなど、または非ヒト霊長類の可変領域由来の残基と交換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体においては見いだされない残基を含んでよい。ヒト化抗体は、場合によって、一般にはヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含んでよい。非ヒト抗体は、フレームワーク領域、定常領域またはＣＤＲに、ヒト抗体由来の同様に位置づけされたアミノ酸と置換されている１つまたは複数のアミノ酸を含有する。一般に、ヒト化抗体は、同じ抗体の非ヒト化型と比較して、ヒト宿主において生じる免疫応答を低減することが予測される。ヒト化抗体は、抗原結合性または他の抗体機能に対する影響を実質的に有さない保存されたアミノ酸置換を有し得る。保存された置換のグループ分けとしては、グリシン－アラニン、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、セリン－トレオニンおよびアスパラギン－グルタミンが挙げられる。「種化された」という用語は、非ヒト種に向けても、同じまたは同様の形で修飾された抗体を指す。
「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、異なるＢ細胞系に由来する抗体の調製物を指す。これらは、それぞれが異なるエピトープを認識する、特異的な抗原に対して分泌される免疫グロブリン分子の混合物である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ポリクローナル抗体ではない。
本明細書で使用される場合、「抗体誘導体」という用語は、例えば、第２の分子に対する抗体を連結するために、アミノ酸の１つまたは複数がアルキル化、ペグ化、アシル化、エステル形成またはアミド形成などによって化学修飾されている全長の抗体または抗体の断片を含む。抗体誘導体としては、これらに限定されないが、ペグ化された抗体、システイン－ペグ化された抗体、およびその改変体が挙げられる。本開示は、抗体断片の抗体誘導体、例えば、別の分子、例えば、ＰＥＧにコンジュゲートされているまたはアシル化によりさらに改変されているポリペプチドも提供した。
本明細書で使用される場合、用語「免疫コンジュゲート」は、細胞傷害性薬剤、検出可能な薬剤、放射性薬剤、ターゲティング剤、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、半合成抗体、または多特異性抗体などの第２の薬剤に会合しているまたは連結されている抗体、抗体断片または抗体誘導体を含む。本開示は、１つの構成成分として、抗体またはＦａｂ断片および第２の薬剤を含む免疫コンジュゲートを提供する。
本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、「標識化された」組成物を生成するために、検出しようとする組成物に直接または間接的にコンジュゲートした、直接または間接的に検出可能な化合物または組成物、例えば、Ｎ末端ヒスチジンタグ（Ｎ－Ｈｉｓ）、磁気的に活性な同位元素、例えば、１１５Ｓｎ、１１７Ｓｎおよび１１９Ｓｎ、非放射性同位元素、例えば、１３Ｃおよび１５Ｎなど、ポリヌクレオチドまたはタンパク質、例えば抗体などを意味する。この用語は、ポリヌクレオチドとコンジュゲートした、挿入配列が発現されるとシグナルをもたらす配列、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）なども包含する。この用語は、混合集団からの生体材料の単離を助ける精製タグまたは標識も含む。「標識」という用語は一般に、検出される組成物に共有結合により付着させた組成物を意図するが、一態様では、「標識」という用語は具体的に、その天然環境において、ポリヌクレオチド内またはタンパク質内に配置された場合、特定の条件（例えば、温度、ｐＨなど）下で蛍光発光することが公知である、天然に存在するヌクレオシドおよびアミノ酸を除外し、一般に、検出される組成物内に存在しうる、任意の天然蛍光も除外する。標識は、それ自体で検出可能な場合（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）もあり、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変更を触媒する場合もある。標識は、小規模な検出に適していてよい、またはハイスループットなスクリーニングのためにより適していてよい。そのように、適切な標識としては、これらに限定されないが、磁気的に活性な同位元素、非放射性同位元素、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含めたタンパク質が挙げられる。標識は、単に検出することができる、または、数量化することができる。単に検出する反応は、一般には、ただ単にその存在が確認される反応を含み、一方、数量化する反応は、一般には、数量化できる（例えば、数値で報告することができる）値、例えば、強度、偏光、および／または他の性質などを有する反応を含む。発光アッセイまたは蛍光アッセイでは、検出可能な反応を、実際に結合に関与するアッセイの構成成分と結びつけた発光団またはフルオロフォアを使用して直接生成する、または別の構成成分（例えば、レポーターまたは指示薬）と結びつけた発光団またはフルオロフォアを使用して間接的に生成することができる。シグナルを生じる発光標識の例としては、これらに限定されないが、生物発光および化学発光が挙げられる。検出可能な発光反応は、一般には、発光シグナルの変化または出現を含む。発光標識化アッセイの構成成分のための適切な方法および発光団は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．（１９９６年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（第６版）に記載されている。発光プローブの例としては、これらに限定されないが、エクオリンおよびルシフェラーゼが挙げられる。
適切な蛍光標識の例としては、これらに限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Ｍａｌａｃｉｔｅ ｇｒｅｅｎ）、スチルベン、ルシファーイエロー、ＣＡＳＣＡＤＥ ＢＬＵＥ（商標）、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが挙げられる。
別の態様では、蛍光標識に官能性をもたせて、細胞または組織の内部または表面上に存在する細胞の構成成分、例えば、細胞表面マーカーなどへの共有結合性の付着を容易にする。これらに限定されないが、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステル、およびハロゲン化スルホニルを含めた適切な官能基は全て、蛍光標識を第２の分子に付着させるために使用することができる。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、作用剤、マーカー、または第２の標識化作用剤のいずれかに付着させる部位に左右される。
「真核細胞」は、モネラ界を除いた生物界の全てを含む。真核生物は、膜に結合した核によって容易に区別することができる。動物、植物、真菌、および原生生物は、その細胞が内部の膜および細胞骨格によって複雑な構造に組織化された真核生物または生物体である。最も特徴的な膜に結合した構造は核である。特に列挙がなければ、「宿主」という用語は、例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物の細胞を含めた真核生物の宿主を包含する。真核細胞または宿主の非限定的な例としては、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、鳥類、爬虫類およびヒトが挙げられる。
「原核細胞」は、通常、核または任意の他の膜に結合した細胞小器官を欠き、２つのドメイン、細菌および古細菌に分けられる。染色体ＤＮＡに加えて、これらの細胞は、エピソームと称される環状のループ内に遺伝情報も含有し得る。細菌細胞は、非常に小さく、およそ動物ミトコンドリアのサイズである（直径約１～２μｍ、長さ１０μｍ）。原核細胞は、３つの主要な形状：ロッド形状、球状、およびスパイラルを特徴とする。真核生物のような精巧な複製プロセスを行う代わりに、細菌細胞は二分裂によって分裂する。例としては、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細菌、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌が挙げられる。
「ネイティブな」または「天然の」抗原は、エピトープを含有する、天然の生物学的な供給源から単離された、かつ対象において抗原受容体、具体的には、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合することができるポリペプチド、タンパク質または断片である。
「抗原」および「抗原性」という用語は、抗体によって認識されるか、さもなければ抗体－リガンド対のメンバーとして働く能力を有する分子を指す。「特異的な結合」とは、抗原と免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の相互作用を指す。抗体－抗原結合は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで起こり得る。当業者は、タンパク質、核酸、脂肪酸、脂質、リポ多糖および多糖を含めた巨大分子は、抗原としての機能を果たす潜在性を有することを理解されよう。当業者は、さらに、抗体リガンドとしての機能を果たす潜在性を有するタンパク質をコードする核酸は、必ず抗原をコードすることを理解されよう。当業者は、さらに、抗原は、全長の分子に限定されず、部分的な分子も含んでよいことを理解されよう。「抗原性」という用語は、抗原の性質を有する分子に対する形容詞的参照である。この用語は、免疫原性である物質、すなわち免疫原、ならびに免疫学的不応答性、またはアネルギーを誘導する物質、すなわちアネルゲン（ａｎｅｒｇｅｎ）を包含する。
「変化した抗原」は、対応する野生型抗原の一次配列とは異なる一次配列を有する抗原である。ポリペプチドｍＢ４（配列番号１７）は変化したＢ４抗原（配列番号１６）の例である。変化した抗原は、合成方法または組換え方法によって作出することができ、それらとしては、これらに限定されないが、翻訳の間に、または翻訳後に、例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解性の切断、抗体分子、膜分子または他のリガンドへの連結によって示差的に修飾された抗原性ペプチドが挙げられる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（１９８８年）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７巻：２８５～３２０頁）。
本明細書ではネイティブな抗原または野生型抗原とも称される「自己抗原」は、対象において、抗原に対する自己寛容に起因して、免疫応答をわずかに誘導する、または全く誘導しない抗原性ペプチドである。自己抗原の例は、黒色腫特異的抗原ｇｐ１００である。
「免疫応答」とは、広範には、外来物質に対するリンパ球の抗原特異的な応答を指す。「免疫原」および「免疫原性」という用語は、免疫応答を引き出す能力を持つ分子を指す。免疫原は全て抗原であるが、全ての抗原が免疫原性なのではない。本明細書に開示される免疫応答は体液性（抗体活性による）または細胞媒介性（Ｔ細胞の活性化による）であってよい。応答は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで起こり得る。当業者は、タンパク質、核酸、脂肪酸、脂質、リポ多糖および多糖を含めた種々の巨大分子が免疫原性である潜在性を有することを理解されよう。当業者は、さらに、免疫応答を引き出すことができる分子をコードする核酸は必ず免疫原をコードすることを理解されよう。当業者は、さらに、免疫原は、全長の分子に限定されず、部分的な分子を含んでよいことを理解されよう。
「受動免疫」という用語は、ある対象から別の対象への、抗体の伝達を通じた免疫の伝達を指す。受動免疫は、母親の抗体が胎児に伝達される場合など、天然に起こり得る。受動免疫は、抗体組成物を非免疫の対象に投与する場合など、人工的にも起こり得る。抗体のドナーおよびレシピエントはヒト対象または非ヒト対象であってよい。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで生成することができ、また、実施形態に応じて、精製されていてよい、部分的に精製されていてよい、または精製されていなくてよい。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、受動免疫は、それを必要とする対象に、特定の抗原を特異的に認識する、またはそれに結合する抗体または抗原結合性断片を投与することによって付与される。いくつかの実施形態では、受動免疫は、特定の抗原を特異的に認識する、またはそれに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片をコードする、単離されたかまたは組換え型のポリヌクレオチドを投与することによって付与される。
本明細書で使用される場合、「対象において免疫応答を誘導すること」という用語は、当技術分野ではよく理解されている用語であり、対象に抗原（またはエピトープ）を導入した後、対象に抗原（またはエピトープ）を導入する前の免疫応答（もしあれば）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍またはそれを超える抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答の増加を検出または測定することができることを意味する。抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答としては、これらに限定されないが、抗原特異的な（またはエピトープ特異的な）抗体の産生、およびその表面上に抗原（またはエピトープ）に特異的に結合する分子を発現している免疫細胞の産生が挙げられる。所与の抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答が誘導されたかどうかを決定する方法は当技術分野で周知である。例えば、抗原特異的な抗体は、これに限定されないが、ＥＬＩＳＡを含めた、当技術分野で公知の種々の免疫測定法のうちの任意のものを用いて検出することができ、例えば、試料中の抗体の、固定した抗原（またはエピトープ）への結合を、検出可能に標識化した第２の抗体（例えば、酵素標識したマウス抗ヒトＩｇ抗体）を用いて検出する。
本明細書で使用される場合、用語「抗炎症性サイトカイン」は、炎症誘発性サイトカイン応答を制御する免疫調節分子を含む。サイトカインは特定のサイトカイン阻害剤および可溶性サイトカイン受容体と一緒に作用してヒト免疫応答を調節する。主要な抗炎症性サイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）－１受容体アンタゴニスト、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１およびＩＬ－１３を含む。ＩＬ－１、腫瘍壊死因子アルファおよびＩＬ－１８に対する特定のサイトカイン受容体も炎症誘発性サイトカイン阻害剤として機能する。抗炎症性サイトカインレベルを含むサイトカインレベルを測定する方法は、当技術分野では周知である。例えば、血清サイトカインレベルは、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して測定することが可能である。
本明細書で使用される場合、「固相支持体」または「固体支持体」は互換的に使用され、特定の種類の支持体に限定されない。それどころか、多数の支持体が利用可能であり、当業者に公知である。固相支持体としては、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲルが挙げられる。本明細書で使用される場合、「固体支持体」は、合成の抗原提示マトリックス、細胞、およびリポソームも包含する。適切な固相支持体は、所望の最終用途および種々のプロトコールに対する適合性に基づいて選択することができる。例えば、ペプチド合成では、固相支持体は、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、ＣｈｅｍＰｅｐ，Ｉｎｃ．等から得られるＰＡＭ樹脂）、ポリＨＩＰＥ樹脂、これはポリジメチルアクリルアミドがグラフトされているポリスチレンに基づくコポリマーであり；ＨＩＰＥ＝高内相エマルジョンポリアミド樹脂（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから得られる）、ポリエチレングリコールがグラフトされているポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから得られる）などの樹脂を指すことができる。
固相支持体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロース、修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、いくらかの程度まで可溶性であってよい、または不溶性であってよい。支持材料は、カップリングされた分子が、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体に結合することができる限りは、実質的にいかなる可能性のある構造上の構成を有してもよい。したがって、支持体の構成は、ビーズのように球状であってよい、または、試験管の内側表面、またはロッド外面のように円柱状であってよい。あるいは、表面は、例えばシート、試験紙など平らであってよい、あるいはポリスチレンビーズであってよい。当業者は、抗体または抗原に結合する多くの他の適切なキャリアを知っている、または常套的な実験を使用することによってそれらを確認することができるであろう。
発明を実施するための形態
キメラ組換えポリペプチド
本開示は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドの２つもしくはそれよりも多い単離された立体構造先端ドメイン、例えば、一態様では、
Figure 2022171777000079
 ペプチドモチーフ、または立体構造先端ドメインの１つもしくは複数の生物学的等価物またはその断片を含有するＤＮＡＢＩＩポリペプチドの断片を含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる組換えポリペプチドを提供し、モチーフを有する断片では、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。一態様では、２つまたはそれよりも多い先端ドメインのアミノ酸配列は同じである、または代替的にアミノ酸配列は異なっている。立体構造先端ドメインの非限定的例は、Ａ５およびｍＢ４として本明細書で同定された断片、ならびにそのそれぞれの等価物ならびにそのそれぞれの断片を含有する
Figure 2022171777000080
 を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなり、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。先端ドメインの構造の方向性は「ヘッド」からテイル；テイルからヘッドが可能であり、ポリペプチドが３つまたはそれよりも多い先端ドメイン、ヘッドからテイルの任意の組合せ、例えば、ヘッド－ヘッド－ヘッド；テイル－ヘッド－ヘッド；テイル－ヘッド－テイルを含み、野生型配列のアミン末端は「ヘッド」であり、野生型配列のカルボキシ末端はポリペプチドの「テイル」である。ポリペプチドの非限定的例は、限定せずに、本明細書に開示されるポリペプチド、例えば、配列表において同定されているポリペプチドを含む。
Ａ１からＡ４およびＡ６およびＢ１からＢ６として開示され、配列番号１８、１９、１２、２０、２１、２２、１５、２３、１６、２４および２５として上に開示されているポリペプチドは、ポリペプチドとしてさらに提供され、これらのポリペプチドは、立体構造先端ドメイン、および本明細書で同定されＤＮＡＢＩＩポリペプチドを産生する異なる生物由来のこれらのポリペプチドの等価物を含有しない。配列は、
ＭＡＴＩＴＫＬＤＩＩＥＹＬＳＤＫＹＨＬＳ（本明細書ではＡ１とも呼ばれる；配列番号１８）；
ＫＹＨＬＳＫＱＤＴＫＮＶＶＥＮＦＬＥＥＩ（本明細書ではＡ２とも呼ばれる；配列番号１９）；
ＦＬＥＥＩＲＬＳＬＥＳＧＱＤＶＫＬＳＧＦ（本明細書ではＡ３とも呼ばれる；配列番号１２）；
ＫＬＳＧＦＧＮＦＥＬＲＤＫＳＳＲＰＧＲＮ（本明細書ではＡ４とも呼ばれる；配列番号２０）；
ＡＲＲＶＶＴＦＫＰＧＱＫＬＲＡＲＶＥＫＴＫ（本明細書ではＡ６とも呼ばれる；配列番号２１）；
ＭＴＫＳＥＬＭＥＫＬＳＡＫＱＰＴＬＳＡＫ（本明細書ではＢ１とも呼ばれる；配列番号２２）；
ＴＬＳＡＫＥＩＥＮＭＶＫＤＩＬＥＦＩＳＱ（本明細書ではＢ２とも呼ばれる；配列番号１５）；
ＥＦＩＳＱＳＬＥＮＧＤＲＶＥＶＲＧＦＧＳ（本明細書ではＢ３とも呼ばれる；配列番号２３）；
ＲＧＦＧＳＦＳＬＨＨＲＱＰＲＬＧＲＮＰＫ（本明細書ではＢ４とも呼ばれる；配列番号１６）；
ＧＲＮＰＫＴＧＤＳＶＮＬＳＡＫＳＶＰＹＦ（本明細書ではＢ５とも呼ばれる；配列番号２４）；および
ＳＶＰＹＦＫＡＧＫＥＬＫＡＲＶＤＶＱＡ（本明細書ではＢ６とも呼ばれる；配列番号２５）
を含む。
ＤＮＡＢＩＩポリペプチドの非限定的な例は、ＩＨＦまたはＨＵアルファまたはベータポリペプチド；ＩＨＦアルファポリペプチド；Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＨＵ；Ｅ．ｃｏｌｉ ＨｕｐＡ、ＨｕｐＢ、ｈｉｍＡ、ｈｉｍＤ；Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＨＵ（Ｖ５８３など）を含む。
さらなる態様では、組換えポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸をさらに含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるリンカーポリペプチドをさらに含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。リンカーポリペプチドの非限定的な例は、限定せずに、本明細書で同定されたリンカーポリペプチドを含む。
同じまたは異なる細菌種が産生することが可能である３～５の立体構造先端ドメインを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる組換えポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が同じである（例えば、すべてＡ５アミノ酸配列）または少なくとも２つもしくは少なくとも３つもしくは少なくとも４つもしくは５つすべてが異なるアミノ酸配列を有する（例えば、Ａ５とｍＢ４の種々の組合せおよび等価物ならびにそのそれぞれの断片を含有する
Figure 2022171777000081
 ）ことが可能であり、Ｘ１は任意のアミノ酸であるまたは一態様ではアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、またはＴから選択されるアミノである、組換えポリペプチドも提供される。組換えポリペプチド中の立体構造先端ドメインは線形または分岐形の立体構造であり得る。組換えポリペプチドはそれに連結された検出可能な標識および／または精製標識をさらに含むことが可能である。先端ドメインの構造の方向性は「ヘッド」からテイル；テイルからヘッドが可能であり、ポリペプチドが３つまたはそれよりも多い先端ドメイン、ヘッドからテイルの任意の組合せ、例えば、ヘッド－ヘッド－ヘッド；テイル－ヘッド－ヘッド；テイル－ヘッド－テイルを含み、野生型配列のアミン末端は「ヘッド」であり、野生型配列のカルボキシ末端はポリペプチドの「テイル」である。一態様では、ポリペプチドは合計して４１～１２０アミノ酸長が可能である。
等価のポリペプチドの非限定的な例は、ポリペプチドと少なくとも６０％、もしくは代替的に少なくとも６５％、もしくは代替的に少なくとも７０％、もしくは代替的に少なくとも７５％、もしくは代替的に８０％、もしくは代替的に少なくとも８５％、もしくは代替的に少なくとも９０％、もしくは代替的に少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド、またはポリペプチド配列に関して、ポリヌクレオチドもしくはそのようなポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするその相補体によりコードされるポリペプチドを含む。高ストリンジェンシーの条件は本明細書に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。出願人らは、太字のおよび下線を施されたアミノ酸は大いに保存されており、したがって、一態様では、等価のポリペプチドを設計する場合には、修正も変更もされないことを決定している。等価のポリペプチドの追加の例は、例えば、
Figure 2022171777000082
 （配列番号７７）を含み、「Ｘ１」は任意のアミノ酸であるまたは代替的に「Ｘ１」はアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、またはＴから選択される。
等価のポリペプチドは、アミンまたはカルボキシ末端のいずれかに（または両方に）２５までの、または代替的に２０、または代替的に１５、または代替的に１０までの、または代替的に５までのランダムアミノ酸が付加された上記のポリペプチドからなる、またはそれを含むポリペプチドも含む。別の態様では、等価のポリペプチド（polypetide）は、対応する野生型配列の隣接するアミノ酸および野生型隣接アミノ酸の等価物から選択されるアミンまたはカルボキシ末端のいずれかに（または両方に）２５までの、または代替的に２０、または代替的に１５、または代替的に１０までの、または代替的に５までのアミノ酸が付加された上記のポリペプチドからなる、またはそれを含むポリペプチドを含む。
タンパク質およびポリペプチドは、当業者に公知の、多数のプロセスによって得られ、これらのプロセスは、精製、化学合成、および組換え法を含む。ポリペプチドは、宿主細胞株などの調製物から、抗体を伴う免疫沈降などの方法、ならびにゲル濾過、イオン交換、逆相、および親和性クロマトグラフィーなどの標準的な技法により単離することができる。このような方法については、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら（１９９９年）、「Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（１８２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。したがって、本開示はまた、これらのポリペプチドを得るためのプロセス、ならびにこれらのプロセスにより得ることができる生成物および得られる生成物も提供する。
ポリペプチドはまた、Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、モデル４３０Ａまたは４３１Ａ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡにより製造された自動ペプチド合成機など、市販の自動ペプチド合成機を使用する化学合成によっても得ることができる。合成されたポリペプチドは、沈殿させ、さらに、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製することができる。したがって、本開示はまた、アミノ酸および酵素など、タンパク質の配列および試薬を提供し、アミノ酸を、適切な方向および直鎖状配列に、併せて連結することにより、本明細書で開示されるタンパク質を化学的に合成するためのプロセスも提供する。
代替的に、タンパク質およびポリペプチドは、本明細書で記載される宿主細胞およびベクター系を使用して、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前出において記載されている周知の組換え法により、得ることができる。
本出願ではまた、本明細書で記載されるポリペプチドであって、診断法における使用のための、検出可能な作用剤とコンジュゲートしたポリペプチドも提供される。例えば、検出可能に標識化したポリペプチドは、カラムに結合させ、抗体を検出し、精製するために使用することができる。検出可能に標識化したポリペプチドはまた、下記で記載される通り、抗体を産生させるための免疫原としても有用である。本明細書で開示されるポリペプチドは、細胞プロセスを調節する作用剤または薬物をスクリーニングするための、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系において有用である。
当業者には、本明細書で開示されるペプチドを修飾して、それらの特性を変更しうることが周知である。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸または合成アミノ酸のいずれかを指し、グリシンおよびＤ光学異性体またはＬ光学異性体のいずれか、ならびにアミノ酸の類似体およびペプチド模倣薬を含む。３つまたはそれよりも多いアミノ酸のペプチドは一般に、ペプチド鎖が短ければオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長ければ、ペプチドは一般に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
本明細書で開示されるペプチドは、非天然アミノ酸を含むように修飾することができる。したがって、ペプチドは、ペプチドに特殊な特性をもたらすように、Ｄ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸との組合せ、および種々の「デザイナー」アミノ酸（例えば、ベータ－メチルアミノ酸、Ｃ－アルファ－メチルアミノ酸、およびＮ－アルファ－メチルアミノ酸など）を含みうる。加えて、特異的カップリングステップにおいて特異的アミノ酸を割り当てることにより、アルファへリックス、ベータターン、ベータシート、ガンマターンを伴うペプチド、および環式のペプチドも生成させることができる。一般的に、αヘリックス二次構造またはランダム二次構造が特に有用であり得ると考えられている。
本明細書で開示されるポリペプチドは、インプラント、ステント、ペースト、ゲル、歯科インプラント、もしくは医療用インプラントなど、種々の固相キャリアと組み合わせることもでき、ビーズ、滅菌溶液または水溶液、薬学的に許容されるキャリア、薬学的に許容されるポリマー、リポソーム、ミセル、懸濁物、およびエマルションなど、液相キャリアと組み合わせることもできる。非水性溶媒の例は、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、および植物油を含む。ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を調製する、または免疫応答を誘導するために使用する場合、キャリアはまた、特異的な免疫応答を非特異的に増進させるために有用なアジュバントも含みうる。当業者は、アジュバントが必要であるのかどうかを容易に決定し、それを選択することができる。しかし、例示だけを目的として、適切なアジュバントは、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント、無機塩類、およびポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されない。他の適切なアジュバントは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｅ．ｃｏｌｉの易熱性エンテロトキシンの変異体誘導体、コレラ毒素の変異体誘導体、ＣＰＧオリゴヌクレオチド、およびスクアレンに由来するアジュバントを含む。
本開示は、本明細書に開示されるポリペプチド、類似物、ムテインまたは断片のうちのいずれかを、単独でまたは互いにもしくは抗生物質などの他の作用剤および許容されるキャリアもしくは固体支持体と組み合わせて含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる医薬組成物も提供する。これらの組成物は、本明細書に記載される種々の診断および治療法に有用である。
ポリヌクレオチド
本開示は、上で同定された単離されたまたは組換えポリペプチドのうちの１つまたは複数をコードする単離されたまたは組換えポリヌクレオチドおよびそのそれぞれの相補鎖も提供する。単離されたまたは組換えポリヌクレオチドを含むベクターがさらに提供され、その例は当技術分野では公知であり本明細書では手短に記載されている。１つよりも多い単離されたまたは組換えポリヌクレオチドが単一ユニットとして発現されることになる一態様では、単離されたまたは組換えポリヌクレオチドはポリシストロン性ベクター内に含有され得る。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡなどの干渉ＲＮＡであり得る。
本開示はさらに、ＲＮＡ転写のプロモーター、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの複製および／または一過性発現もしくは安定的発現のための他の調節配列に作動可能に連結した、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチドも提供する。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、プロモーターが、ＤＮＡ分子からＲＮＡの転写を導くように位置づけられていることを意味する。このようなプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４、およびＴ７である。ある特定の実施形態では、挿入されたポリヌクレオチドを細胞特異的に発現させるために、細胞特異的なプロモーターを使用する。当技術分野では、プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーを、終結コドンおよび選択マーカー配列、ならびに、挿入されるＤＮＡの小片をそのプロモーターに作動可能に連結しうるクローニング部位と共に含有するベクターが公知であり、市販されている。一般的な方法およびクローニング戦略については、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｇｏｅｄｄｅｌ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９１年））およびそこで引用されている参照文献、ならびに種々の適切なベクターについてのマップ、機能的特性、販売元、およびＧｅｎＥＭＢＬ受託番号の参照を含有する、「Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄａｔａ Ｓｅｒｉｅｓ」（ＧａｃｅｓａおよびＲａｍｊｉ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４年））を参照されたい。
一実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド由来のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される診断上のおよび治療上の有用性を有するポリペプチドまたはタンパク質、ならびに存在することもあれば存在しないこともあるタンパク質の転写物を同定するためのプローブをコードする。これらの核酸断片は、例えば、もっと大きなポリヌクレオチドの制限酵素消化により調製し、次に検出可能なマーカーで標識することが可能である。代替的に、ランダム断片は分子のニックトランスレーションを使用して生成することが可能である。そのような断片の調製および標識化のための方法については、Sambrookら、（１９８９年）上記を参照されたい。
これらの核酸を含有する発現ベクターは、タンパク質およびポリペプチドを産生するための宿主ベクター系を得るために有用である。これらの発現ベクターは宿主生物体において、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの不可欠な一部として複製可能でなければならないことが示されている。適切な発現ベクターの非限定的な例は、プラスミド、酵母ベクター、ウイルスベクターおよびリポソームを含む。アデノウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても発現が高レベルであり、細胞を効率的に形質転換するため、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、遺伝子を組織に導入するために特に有用である。核酸を、適切な宿主細胞、例えば、原核細胞または真核細胞および宿主細胞複製物に挿入する場合、タンパク質は、組換えによって産生することができる。適切な宿主細胞はベクターに依存し、公知の方法を使用して構築した哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞を含みうる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前出を参照されたい。外因性の核酸を細胞に挿入するためのウイルスベクターの使用に加えて、核酸は、細菌細胞のための形質転換；哺乳動物細胞のための、リン酸カルシウム沈降を使用したトランスフェクション；またはＤＥＡＥ－デキストラン；電気穿孔；またはマイクロインジェクションなど、当技術分野で公知の方法により、宿主細胞に挿入することができる。方法についてはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前出を参照されたい。したがって、本開示は、タンパク質またはポリペプチドまたは抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、動物細胞（ラットまたはマウス）、ヒト細胞、または細菌細胞などの原核細胞も提供する。
ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体など、修飾されたヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリヌクレオチドの組立ての前に付与することもでき、組立ての後で付与することもできる。ヌクレオチドの配列を非ヌクレオチド構成成分で中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識化構成成分とコンジュゲートすることなどにより、さらに修飾することもできる。この用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。そうでないことが指定または要請されない限り、ポリヌクレオチドである本明細書で開示される任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を成すことが公知である、または予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれとの両方を包含する。
ベクターを、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける遺伝子療法のために使用する場合、複製能力のないレトロウイルスまたはアデノウイルスベクターなど、薬学的に許容されるベクターが例示的であり（しかし、非限定的であり）、特に有用である。本明細書で開示される核酸を含有する、薬学的に許容されるベクターは、挿入されたポリヌクレオチドを一過性に、または安定的に発現させるためにさらに修飾することができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容されるベクター」という用語は、核酸を、分裂細胞に選択的にターゲティングし、導入する能力を有するベクターまたは送達ビヒクルを含むがこれらに限定されない。そのようなベクターの例は、ウイルスタンパク質を産生することができず、感染した宿主細胞内のベクターの拡散を不可能とすることにより規定される、「複製能力のない」ベクターである。複製能力のないレトロウイルスベクターの例は、ＬＮＬ６（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９年）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７巻：９８０～９９０頁）である。遺伝子マーカーの、レトロウイルスを媒介する遺伝子移入のために、複製能力のないレトロウイルスを使用する方法が確立されている（Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ（１９８９年）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８６巻：８９１２～８９５２頁；Ｃｕｌｖｅｒ（１９９１年）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８８巻：３１５５頁；およびＲｉｌｌ（１９９１年）、Ｂｌｏｏｄ、７９巻（１０号）：２６９４～２７００頁）。
本開示はまた、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含有し、かつ／または発現させる、遺伝子改変された細胞も提供する。遺伝子改変された細胞は、プロモーターまたは遺伝子活性化因子など、上流の調節配列を挿入することにより産生することができる（米国特許第５，７３３，７６１号を参照されたい）。
ポリヌクレオチドは、細胞中での核酸および／または遺伝子の発現の検出のために、検出可能マーカー、例えば、酵素標識または放射性同位元素にコンジュゲートすることが可能である。当技術分野では、検出可能なシグナルを生じることができる蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンド、またはアビジン／ビオチンなど、他のリガンドを含む、多種多様な適切な検出可能なマーカーが公知である。一態様では、放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識、またはウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、もしくはペルオキシダーゼなどの酵素タグを使用することが所望される可能性が高い。酵素タグの場合、熱量測定的指示基質を利用して、相補的な核酸含有試料との特異的なハイブリダイゼーションを同定するための、目視可能な手段または分光光度的に検出可能な手段をもたらすことができる。したがって、本開示はさらに、標的の一本鎖ポリヌクレオチドを、本明細書で開示されるポリヌクレオチドの一部である、標識化された一本鎖のポリヌクレオチド（プローブ）と、相補的な一本鎖ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションが可能になる条件下で（任意選択で、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）、または任意選択で、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させることにより、一本鎖ポリヌクレオチドまたはその相補物を検出するための方法も提供する。ハイブリダイズしたポリヌクレオチド対は、ハイブリダイズしなかった一本鎖ポリヌクレオチドから分離する。ハイブリダイズしたポリヌクレオチド対は、当業者に公知の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前出に明示されている方法を使用して検出する。本開示において具体化されるポリヌクレオチドは、化学合成、組換えクローニング法、ＰＣＲ、またはこれらの任意の組合せを用いて得ることができる。当技術分野では、化学的なポリヌクレオチド合成法が公知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。当業者は、ＤＮＡ合成機を利用することにより、または市販のサービスを依頼することにより、所望のポリヌクレオチドを得るのに、本明細書で提供される配列データを使用することができる。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドはＰＣＲを使用して単離または複製することも可能である。ＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，８００，１５９号；同第４，７５４，０６５号；および同第４，６８３，２０２号の主題であり、「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９．４年））またはＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１年）および（１９９５年）、前出、ならびにそこに引用されている参考文献において記載されている。代替的に、当業者は、本明細書で提供される配列および市販のＤＮＡ合成機を使用して、ＤＮＡを複製することもできる。したがって、本開示はまた、ポリヌクレオチドの直鎖状配列、ヌクレオチド、適切なプライマー分子、酵素などの化学物質、およびそれらを複製するための指示をもたらし、ポリヌクレオチドを得るように、ヌクレオチドを、適切な方向に化学的に複製または連結することにより、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを得るためのプロセスも提供する。別の実施形態では、これらのポリヌクレオチドをさらに単離する。なおさらに、当業者は、複製し、増幅するために、ポリヌクレオチドを適切な複製ベクターに挿入し、そのベクターを適切な宿主細胞（原核細胞または真核細胞）に挿入することができる。こうして増幅されたＤＮＡは、当業者に公知の方法により、細胞から単離することができる。本明細書では、この方法によりポリヌクレオチドを得るためのプロセス、ならびにこうして得られたポリヌクレオチドもさらに提供される。
ＲＮＡは、まず、ＤＮＡポリヌクレオチドを、適切な宿主細胞に挿入することにより得ることができる。ＤＮＡは、任意の適切な方法により、例えば、適切な遺伝子送達ビヒクル（例えば、リポソーム、プラスミド、またはベクター）を使用することにより送達することもでき、電気穿孔により送達することもできる。細胞が複製され、ＤＮＡがＲＮＡに転写されたら、次いで、当業者に公知の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前出において明示されている方法を使用して、ＲＮＡを単離することができる。例えば、ｍＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、前出において明示されている手順に従い、種々の溶菌酵素または化学溶液を使用して単離することもでき、製造者によって提供される添付の説明書に従い、核酸結合性樹脂により抽出することもできる。
本明細書で開示されるポリヌクレオチドに対して配列相補性または相同性を示すポリヌクレオチドはハイブリダイゼーションプローブとしてまたは本明細書で同定された特定のポリヌクレオチドの等価物として有用である。転写物の完全なコード配列は公知であるので、この配列または相同配列のいかなる部分も本明細書で開示される方法において使用することが可能である。
当技術分野では、特異的なハイブリダイゼーションのために、「完全に一致する」プローブは必要とされないことが公知である。少数の塩基の置換、欠失、または挿入により達成される、プローブ配列の軽微な変化は、ハイブリダイゼーションの特異性に影響を及ぼさない。一般に、２０％程度の塩基対のミスマッチ（最適にアラインメントした場合）が容認されうる。一部の実施形態では、前述のｍＲＮＡを検出するために有用なプローブは、相同領域と少なくとも約８０％同一である。一部の実施形態では、プローブは、相同な領域とアラインメントした後で、対応する遺伝子配列と８５％同一であり、一部の実施形態では、プローブは９０％の同一性を示す。
これらのプローブをラジオアッセイ（例えば、サザンブロット分析およびノーザンブロット分析）において使用して、これらの細胞を含有する種々の細胞または組織を検出、予後診断、診断、またはモニタリングすることができる。プローブはまた、本明細書で開示されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出するためのハイスループットスクリーニングアッセイにおいて使用するために、チップなどの固体支持体またはアレイに付着させることもできる。したがって、本開示は、ハイスループットスクリーニングにおいて使用するために固体支持体に付着させた、本明細書で開示されるポリヌクレオチド、またはその等価物、またはその相補物、またはその断片を含む、またはそれに対応するプローブも提供する。
断片の全体のサイズ、ならびに相補的なストレッチのサイズは、特定の核酸セグメントの、意図される使用または適用に依存する。より小型の断片は、一般に、ハイブリダイゼーションの実施形態において使用され、相補領域の長さは、少なくとも５～１０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの間など、変動する場合もあり、なおまたは、検出することが望まれる相補配列に従い、全長の場合もある。
ハイブリッドの安定性および選択性を増大させ、これにより、得られる特定のハイブリッド分子の特異性を改善するために、５ヌクレオチド超から１０ヌクレオチドの長さのストレッチにわたる相補配列を有するヌクレオチドプローブが一般に好適である。ある特定の実施形態では、１０ヌクレオチドもしくはこれを超える長さ、または５０ヌクレオチドを超える長さの遺伝子相補的ストレッチ、あるいは、所望の場合、さらに長い遺伝子相補的ストレッチを有するポリヌクレオチドを設計することができる。このような断片は、例えば、化学的手段を介して、断片を直接合成することによりたやすく調製することもでき、米国特許第４，６０３，１０２号において記載されている、２つのプライミングオリゴヌクレオチドを伴うＰＣＲ技術などの核酸複製（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）技術を適用することによりたやすく調製することもでき、組換えによる産生のために、選択された配列を、組換えベクターに導入することによりたやすく調製することもできる。一態様では、プローブは、約５０～７５ヌクレオチドもしくはこれを超える長さ、または代替的に、５０～１００ヌクレオチドの長さである。
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される細胞において発現させる遺伝子または遺伝子転写物を検出するためのプライマーとして用いられうる。この文脈では、増幅とは、標的配列を妥当な忠実度で複製すること（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）ができるプライマー依存性のポリメラーゼを利用する、任意の方法を意味する。増幅は、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、および逆転写酵素などの、天然ＤＮＡポリメラーゼまたは組換えＤＮＡポリメラーゼにより行うことができる。例示だけを目的として、プライマーは、プローブについて同定された長さと同じ長さである。
ポリヌクレオチドを増幅するための１つの方法はＰＣＲであり、ＰＣＲ増幅のためのキットは市販されている。増幅後、結果として得られるＤＮＡ断片は、当技術分野で公知の任意の適切な方法、例えば、アガロースゲル電気泳動、その後の臭化エチジウム染色および紫外線照射を伴う視覚化により検出することができる。
細胞に有効量の遺伝子送達ベクターまたはビヒクルを投与するための方法は開発されており、当業者には公知であり、本明細書に記載されている。当技術分野では、細胞における遺伝子発現を検出するための方法が公知であり、ＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイおよびノーザンブロット分析などの技法を含む。このような方法は、細胞における遺伝子の発現を検出し、定量化するために有用である。代替的に、コードされるポリペプチドの発現は、種々の方法によって検出することもできる。特に、標的ポリペプチドと特異的に反応性である、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製することが有用である。このような抗体は、例えば、免疫組織学法、ＥＬＩＳＡ、およびウェスタンブロット法などの技法を使用して、ポリペプチドを発現させる細胞を視覚化するために有用である。これらの技法を使用して、発現させたポリヌクレオチドの発現レベルを決定することができる。
抗体およびそれらの誘導体
本開示はまた、本明細書で開示される方法における使用のための、単離されたポリペプチドに結合する、かつ／またはそれを特異的に認識する、かつそれに結合する抗体を提供する。抗体は、本明細書で説明される各種の抗体のうちのいずれかであることが可能であり、このような抗体の非限定的な例には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ベニア化抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、抗体誘導体、組換えヒト化抗体、またはそれらのそれぞれの誘導体もしくは断片が含まれる。一態様では、断片が、抗体のＣＤＲを含む、あるいはそれから本質的になる、またはさらにそれからなる。一態様では、抗体が、検出可能に標識化されている、またはそれにコンジュゲートした検出可能な標識をさらに含む。また、本明細書に開示されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も提供される。本明細書では、上記の実施形態のうちの１つもしくは複数を含む、あるいはそれから本質的になる、またはさらにそれからなる組成物もさらに提供される。抗体および断片のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのほか、抗体のポリペプチドおよびそれらの断片を組換えにより産生するまたは化学合成する方法もさらに提供される。抗体ポリペプチドは、真核細胞内または原核細胞内で産生することもでき、当技術分野で公知であり、本明細書でも記載される、他の方法により産生することもできる。
抗体は、当技術分野において公知であり、文献中で十分に記載されている従来の技法を使用して生成させることができる。ポリクローナル抗体を産生するための、いくつかの方法が存在する。例えば、ポリクローナル抗体は、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラット、およびウサギなどであるがこれらに限定されない適切な哺乳動物を免疫化することにより産生することが典型的である。抗原を哺乳動物に注射すると、これが、Ｂリンパ球を誘導して、この抗原に特異的な免疫グロブリンを産生させる。免疫グロブリンは、哺乳動物の血清から精製することができる。
この方法の変化形には、産生を最適化し、動物を人道的に取り扱うための、アジュバント、投与経路および投与部位、部位１カ所当たりの注射容量および動物１匹当たりの部位数の改変が含まれる。例えば、抗原に対する免疫応答を改善または増強するために、アジュバントを用いることが典型的である。大半のアジュバントは、注射部位における抗原貯留をもたらし、それにより、抗原の排出リンパ節内への緩徐な（ｓｔｏｗ）放出が可能となる。他のアジュバントには、タンパク質抗原分子の濃縮を広大な表面積にわたり促進する界面活性剤、および免疫賦活性分子が含まれる。ポリクローナル抗体を生成させるためのアジュバントの非限定的な例は、フロイントアジュバント、Ｒｉｂｉアジュバント系、およびＴｉｔｅｒｍａｘを含む。ポリクローナル抗体は、当技術分野において公知の方法を用いて産生することができ、それらのうちの一部は、米国特許第７，２７９，５５９号；同第７，１１９，１７９号；同第７，０６０，８００号；同第６，７０９，６５９号；同第６，６５６，７４６号；同第６，３２２，７８８号；同第５，６８６，０７３号；および同第５，６７０，１５３号において説明されている。
モノクローナル抗体は、当技術分野において公知であり、文献中で十分に説明されている従来のハイブリドーマ法を用いて産生することができる。例えば、ハイブリドーマは、適切な不死細胞株（例えば、Ｓｐ２／０細胞、Ｓｐ２／０－ＡＧ１４細胞、ＮＳＯ細胞、ＮＳ１細胞、ＮＳ２細胞、ＡＥ－１細胞、Ｌ．５細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８，６５３細胞、Ｓｐ２ ＳＡ３細胞、Ｓｐ２ ＭＡＩ細胞、Ｓｐ２ ＳＳ１細胞、Ｓｐ２ ＳＡ５細胞、Ｕ３９７細胞、ＭＩＡ １４４細胞、ＡＣＴ ＩＶ細胞、ＭＯＬＴ４細胞、ＤＡ－１細胞、ＪＵＲＫＡＴ細胞、ＷＥＨＩ細胞、Ｋ－５６２細胞、ＣＯＳ細胞、ＲＡＪＩ細胞、ＮＩＨ ３１３細胞、ＨＬ－６０細胞、ＭＬＡ １４４細胞、ＮＡＭＡＩＷＡ細胞、ＮＥＵＲＯ ２Ａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＰｅｒＣ．６細胞、ＹＢ２／Ｏ細胞などであるがそれらに限定されない骨髄腫細胞株）など、あるいはヘテロ骨髄腫、これらの融合産生物、またはそれらに由来する任意の細胞もしくは融合細胞、あるいは当技術分野において公知の他の任意の適切な細胞株（以下のウェブアドレス、例えば、２００７年１１月２６日に最終アクセスされたａｔｃｃ．ｏｒｇ、ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．における細胞株を参照されたい）を、単離されたかまたはクローニングされた脾臓、末梢血、リンパ、扁桃腺、または他の免疫細胞もしくはＢ細胞を含有する細胞、あるいは組換えまたは内因性のウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳動物、げっ歯類、ウマ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ヤギ、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、霊長類、真核生物のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡもしくはミトコンドリアＲＮＡ、クロロプラストＤＮＡもしくはクロロプラストＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖核酸、二本鎖核酸、または三本鎖核酸、ハイブリダイズした核酸など、あるいはそれらの任意の組合せの核酸としての内因性核酸または異種核酸としての、重鎖定常配列もしくは重鎖可変配列もしくは重鎖フレームワーク配列もしくは重鎖ＣＤＲ配列または軽鎖定常配列もしくは軽鎖可変配列もしくは軽鎖フレームワーク配列もしくは軽鎖ＣＤＲ配列を発現する他の任意の細胞などであるがそれらに限定されない抗体産生細胞と融合させることにより産生する。抗体産生細胞はまた、目的の抗原で免疫化したヒトまたは他の適切な動物の末梢血、または特定の実施形態では、脾臓もしくはリンパ節から得て、目的の活性についてスクリーニングすることもできる。また、他の任意の適切な宿主細胞も、本開示の抗体、指定された断片、またはそれらの改変体をコードする異種核酸または内因性核酸を発現させるのに用いることができる。融合細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞は、選択培養条件または他の適切な公知の方法を用いて単離することができ、限界希釈法、もしくは細胞分取法、または他の公知の方法を介してクローニングすることができる。
ペプチドライブラリーまたはタンパク質ライブラリー（例えば、バクテリオファージディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイライブラリー、オリゴヌクレオチドディスプレイライブラリー、ｃＤＮＡディスプレイライブラリーなどであるがそれらに限定されないライブラリー；例えば、当技術分野において公知の方法を用いる、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ、Ｄｅｌ．）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）、Ａｆｆｉｔｅｃｈ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）など、各販売元から市販されているライブラリー）から組換え抗体を選択する方法が含まれるがそれらに限定されない、必須の特異性を有する抗体を産生または単離する他の適切な方法を用いることができる。当技術分野で公知の方法は、特許文献において説明されており、それらのうちの一部には、米国特許第４，７０４，６９２号；同第５，７２３，３２３号；同第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８２４，５１４号；および同第５，９７６，８６２号が含まれる。代替的な方法は、トランスジェニック動物（例えば、ＳＣＩＤマウス； Ｎｇｕｙｅｎら（１９７７年）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４１巻：９０１～９０７頁（１９９７年）；Ｓａｎｄｈｕら（１９９６年）、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻：９５～１１８頁；Ｅｒｅｎら（１９９８年）、Ｍｕｍｍａ、９３巻：１５４～１６１頁の免疫化に依存し、それにより、当技術分野において公知であり、かつ／または本明細書でも説明されるヒト抗体のレパートリーを産生することが可能である。このような技法には、リボソームディスプレイ（Ｗａｎｅｓら（１９９７年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９４巻：４９３７～４９４２頁；Ｈａｎｅｓら（１９９８年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５巻：１４１３０～１４１３５頁）、単一細胞による抗体産生法（例えば、選択リンパ球抗体法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号、Ｗｅｎら（１９８７年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７巻：８８７～８９２頁；Ｂａｂｃｏｏｋら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３巻：７８４３～７８４８頁）、ゲルマイクロ液滴およびフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌら（１９９０年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８巻：３３３～３３７頁；Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ）；Ｇｒａｙら（１９９５年）、Ｊ． Ｉｍｍ． Ｍｅｔｈ．、１８２巻：１５５～１６３頁；ならびにＫｅｎｎｙら（１９９５年）、Ｂｉｏ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１３巻：７８７～７９０頁）、Ｂ細胞選択（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら（１９９４年）、Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｏｒｔｓ、１９巻：１２５～１３４頁）が含まれるがそれらに限定されない。
本開示の抗体誘導体はまた、本明細書に開示される抗体をコードするポリヌクレオチドを、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなど、それらのミルク中にこのような抗体を産生するトランスジェニック動物またはトランスジェニック哺乳動物を提供するように、適切な宿主に送達することにより調製することもできる。当技術分野ではこれらの方法が公知であり、例えば、米国特許第５，８２７，６９０号；同第５，８４９，９９２号；同第４，８７３，３１６号；同第５，８４９，９９２号；同第５，９９４，６１６号；同第５，５６５，３６２号；および同第５，３０４，４８９号において説明されている。
「抗体誘導体」という用語は、抗体または断片の直鎖状ポリペプチド配列に対する翻訳後修飾を包含する。例えば、米国特許第６，６０２，６８４Ｂ１号は、免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を包含し、Ｆｅを介する細胞傷害作用が増強されている全抗体分子、抗体断片、または融合タンパク質を含めた抗体の修飾グリコール形態を産生する方法、およびこのようにして産生された糖タンパク質について説明している。
本明細書に開示される抗体はまた、抗体が抗イディオタイプ応答を引き起こすことを共有結合が予防しないように、任意の種類の分子を抗体に共有結合させることにより修飾した誘導体も包含する。抗体誘導体には、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ／ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）を介する誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞内リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより修飾されている抗体が含まれるがそれらに限定されない。加えて、誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有し得る。
抗体誘導体はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを送達して、このような抗体、指定された部分、または改変体を、植物部分またはそれらに由来して培養された細胞において産生する、トランスジェニック植物および培養植物細胞（例えば、タバコ、トウモロコシ、およびウキクサであるがこれらに限定されない）を作製することにより調製することもできる。例えば、Ｃｒａｍｅｒら（１９９９年）、Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４０巻：９５～１１８頁、およびこの文献において引用された参考文献は、例えば、誘導性プロモーターを用いる、大量の組換えタンパク質を発現するトランスジェニックのタバコ葉の産生について説明している。トランスジェニックトウモロコシは、他の組換え系で産生されたまたは天然の供給源から精製された哺乳動物タンパク質と等価の生物学的活性を伴う哺乳動物タンパク質を、商業的生産レベルで発現させるのに用いられている。例えば、Ｈｏｏｄら（１９９９年）、Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．、４６４巻：１２７～１４７頁、およびこの文献において引用された参考文献を参照されたい。抗体誘導体はまた、タバコの種子および馬鈴薯の塊茎を含め、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を包含するトランスジェニック植物の種子からも大量に産生されている。例えば、Ｃｏｎｒａｄら（１９９８年）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３８巻：１０１～１０９頁、およびこの文献において引用された参考文献を参照されたい。したがって、抗体はまた、公知の方法に従いトランスジェニック植物を用いても産生することができる。
抗体誘導体はまた、例えば、外因性配列を付加して、免疫原性を修飾する、または結合、親和性、オン速度、オフ速度、アビディティ、特異性、半減期、もしくは他の任意の適切な特徴を低減、増強、もしくは修飾することにより産生することもできる。一般に、可変領域および定常領域の非ヒト配列をヒトアミノ酸または他のアミノ酸または他のアイソタイプ由来の可領域変もしくは定常領域で置換しながら、非ヒトＣＤＲ配列またはヒトＣＤＲ配列のうちの一部または全部を維持する。
一般に、ＣＤＲ残基は、抗原の結合への影響に直接的に、かつ、最も実質的に関与している。抗体のヒト化または操作は、米国特許第５，７２３，３２３号；同第５，９７６，８６２号；同第５，８２４，５１４号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７６３，１９２号；同第５，７２３，３２３号；同第５，７６６，８８６号；同第５，７１４，３５２号；同第６，２０４，０２３号；同第６，１８０，３７０号；同第５，６９３，７６２号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，２２５，５３９号；および同第４，８１６，５６７号において説明されている方法などであるがそれらに限定されない任意の公知の方法を用いて実施することができる。
本開示のキメラ抗体、ヒト化抗体、または霊長類化抗体は、標準的な分子生物学の技法を用いて調製される基準のモノクローナル抗体の配列に基づき調製することができる。重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のハイブリドーマから得、標準的な分子生物学の技法を用いて、基準以外の（例えば、ヒトの）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するには、当技術分野において公知の方法（米国特許第４，８１６，５６７号）を用いて、マウス可変領域を、ヒト定常領域に連結することができる。ヒト化抗体を創出するには、当技術分野において公知の方法（米国特許第５，２２５，５３９号、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号）を用いて、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワーク内に挿入することができる。同様に、霊長類化抗体を創出するには、当技術分野において公知の方法（ＷＯ９３／０２１０８およびＷＯ９９／５５３６９）を用いて、マウスＣＤＲ領域を、霊長類フレームワーク内に挿入することができる。
当技術分野では、部分ヒト抗体～完全ヒト抗体を作製する技法が公知であり、任意のこのような技法を用いることができる。一実施形態によれば、トランスジェニックマウスにおいて完全ヒト抗体配列を作製し、ヒト重鎖抗体遺伝子およびヒト軽鎖抗体遺伝子を発現させるように操作する。異なるクラスの抗体を産生させ得る、複数のこのようなトランスジェニックマウス系統が作製されている。所望の抗体を産生しているトランスジェニックマウスに由来するＢ細胞を融合させて、所望の抗体を持続的に産生するためのハイブリドーマ細胞株を作製することができる（例えば、Ｒｕｓｓｅｌら（２０００年）、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０００年４月：１８２０～１８２６頁；Ｇａｌｌｏら（２０００年）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎ．、３０巻：５３４～５４０頁；Ｇｒｅｅｎ（１９９９年）、Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１巻：１１～２３頁；Ｙａｎｇら（１９９９年Ａ）、Ｊ． ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻：４０１～４１０頁；Ｙａｎｇ（１９９９年Ｂ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９巻（６号）：１２３６～１２４３頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８年）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ、３１巻：３３～４２頁；ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８年）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１８８巻（３号）：４８３～４９５頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８年）、Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ、７巻（４号）：６０７～６１４頁；Ｔｓｕｄａら（１９９７年）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４２巻：４１３～４２１頁；Ｓｈｅｒｍａｎ－Ｇｏｌｄ（１９９７年）、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ、１７巻（１４号）；Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５巻：１４６～１５６頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９６年）、「Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ」、ＩＶ巻、１９４．１～１９４．７頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９５年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻：５６１～５６６頁；Ｍｅｎｄｅｚら（１９９５年）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２６巻：２９４～３０７頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９４年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４巻（８号）：７６１～７６３頁；Ａｒｂｏｎｅｓら（１９９４年）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１巻（４号）：２４７～２６０頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻（６４１７号）：２５５～２５８頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、９０巻（６号）：２５５１～２５５５頁；および米国特許第６，０７５，１８１号を参照されたい）。
本明細書に開示される抗体はまた、キメラ抗体を創出するように修飾することもできる。キメラ抗体とは、抗体の重鎖および軽鎖の多様なドメインが、複数の種に由来するＤＮＡによりコードされる抗体である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。
代替的に、本明細書に開示される抗体はまた、ベニア化抗体を創出するように修飾することもできる。ベニア抗体とは、第１の種の抗体が、第２の種において免疫原性とならず、それにより、この抗体の免疫原性を低減するように、１つの種の抗体の外部のアミノ酸残基を、第２の種の外部のアミノ酸残基で慎重に置換または「ベニア化」された抗体である。タンパク質の免疫原性は、主に、その表面の性質に依存するので、別の哺乳動物種の抗体中に通常見いだされる残基とは異なる露出残基を置換することによれば、抗体の免疫原性を低減し得るであろう。このように外部残基を慎重に置換すれば、内部ドメインまたはドメイン間の接触にはほとんどまたは全く影響が及ばないはずである。したがって、可変領域のフレームワーク残基に限定される変更の結果として、リガンドの結合特性に影響が及ぶことはないはずである。変更するのは抗体の外面またはスキン（ｓｋｉｎ）だけであり、支持残基は攪乱されずに維持されるので、この工程を、「ベニア化」と称する。
「ベニア化」の手順は、Ｋａｂａｔら（１９８７年）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、４版、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによりコンパイルされたヒト抗体可変ドメインについての利用可能な配列データ、このデータベースに対する更新、ならびに米国および海外の他のアクセス可能なデータベース（核酸およびタンパク質両方のデータベース）を活用する。ベニア化抗体を産生するのに用いられる方法の非限定的な例には、ＥＰ５１９５９６、米国特許第６，７９７，４９２号が含まれ、Ｐａｄｌａｎら（１９９１年）、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８巻（４～５号）：４８９～４９８頁においても説明されている。
「抗体誘導体」という用語はまた、２つの抗原結合部位を伴う小型の抗体断片であって、断片が、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む「ダイアボディ」も包含する（例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６４４４～６４４８頁を参照されたい）。同じ鎖の２つのドメイン間における対合を可能とするには短すぎるリンカーを用いることにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を創出することを余儀なくされる（また、１種または複数種のアミノ酸が親抗体の超可変領域内に挿入され、標的抗原に対する結合親和性が、この抗原に対する親抗体の結合親和性の少なくとも約２倍強い抗体改変体について開示する、Ｃｈｅｎらによる米国特許第６，６３２，９２６号も参照されたい）。
「抗体誘導体」という用語は、操作抗体分子、断片、および単一ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）、およびアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）もさらに包含する＆Ｈｕｄｓｏｎ（２００５年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２３巻（９号）：１１２６～３６頁；米国特許出願公開第２００６／０２１１０８８号；ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２００７／０５９７８２号；米国特許第５，８３１，０１２号）。
「抗体誘導体」という用語は、「直鎖状抗体」もさらに包含する。当技術分野では、直鎖状抗体を作製するための手順が公知であり、Ｚａｐａｔａら（１９９５年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８巻（１０号）：１０５７～１０６２頁においても説明されている。略述すると、これらの抗体は、抗原結合領域の対を形成する、タンデムのＥｄセグメント対（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性の場合もあり、単一特異性の場合もある。
本明細書に開示される抗体は、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれるがそれらに限定されない公知の方法により、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。精製にはまた、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も用いることができる。
本開示の抗体には、天然の精製産生物、化学合成手順の産生物、ならびに、例えば、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞を含めた真核生物宿主に由来する組換え法、または、代替的に、上記で説明した原核生物宿主に由来する組換え法を介して産生される産生物が含まれる。ＢｉｒｃｈおよびＲａｄｎｅｒ（２００６年）、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、５８巻：６７１～６８５頁では、多くの抗体産生系が説明されている。
被験抗体が、タンパク質またはポリペプチドと結合すれば、被験抗体と本開示により提供される抗体とは等価である。また、本開示の抗体が、本明細書に開示される抗体が通常反応性であるタンパク質またはポリペプチドに結合することを、被験抗体が予防するかどうかを決定することにより、ある抗体が、本明細書に開示される抗体と同じ特異性を有するかどうかを、過度の実験なしに決定することも可能である。本明細書に開示されるモノクローナル抗体による結合の低下により示される通り、被験抗体が、本明細書に開示される抗体と競合する場合は、２つの抗体が、同じエピトープまたは近縁のエピトープに結合する可能性が高い。代替的に、本明細書に開示される抗体を、それが通常反応性であるタンパク質と共にプレインキュベートして、被験抗体が、抗原に結合するその能力を阻害されるかどうかを決定することができる。被験抗体が阻害されれば、この抗体は、本明細書に開示される抗体と同じエピトープ特異性または近縁のエピトープ特異性を有する可能性が極めて高い。
「抗体」という用語はまた、全ての免疫グロブリンアイソタイプおよび免疫グロブリンサブクラスの抗体を包含することも意図する。モノクローナル抗体の特定のアイソタイプは、最初の融合体から選択することにより直接調製することもでき、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら（１９８５年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２巻：８６５３頁、またはＳｐｉｒａら（１９８４年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、７４巻：３０７頁において説明されている手順を用いてクラススイッチ改変体を単離するためのｓｉｂ選択法を用いることにより、異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製することもできる。代替的に、組換えＤＮＡ法も用いることができる。
また、本明細書で説明されるモノクローナル抗体の特異性を伴う他のモノクローナル抗体の単離も、抗イディオタイプ抗体を産生することを介して、当業者により達成され得る（Ｈｅｒｌｙｎら（１９８６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻：１００頁）。抗イディオタイプ抗体とは、目的のモノクローナル抗体において存在する固有の決定基を認識する抗体である。
本明細書に開示される一部の態様では、抗体を検出可能に、または治療的に標識化することが有用であろう。適切な標識については、前出で説明されている。当技術分野では、抗体を、これらの作用剤とコンジュゲートする方法が公知である。例示だけを目的として述べると、放射性原子、発色団、フルオロフォアなどの検出可能な部分で抗体を標識化することができる。このような標識化抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏまたは単離された被験試料における診断法に用いることができる。
抗体を、低分子量のハプテンにカップリングすることにより、アッセイにおける抗体の感度を増大させることができる。次いで、第２の反応により、ハプテンを特異的に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特定の抗ハプテン抗体と反応し得るジニトロフェノール、ピリドキサール、およびフルオレセインなどのハプテンを用いることが一般的である。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、前出を参照されたい。
ＶＨ ＣＤＲ １領域および／もしくはＶＬ ＣＤＲ １領域、ＶＨ ＣＤＲ ２領域および／もしくはＶＬ ＣＤＲ ２領域、ならびに／またはＶＨ ＣＤＲ ３領域および／もしくはＶＬ ＣＤＲ ３領域内のアミノ酸残基を変異させて、抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することにより、本開示の抗体の可変領域を修飾することができる。変異は、部位指向性変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発を介して導入することができ、抗体の結合または目的の他の機能的特性に対する効果は、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて評価することができる。ある特定の実施形態では、保存的修飾を導入し、典型的にＣＤＲ領域内の１、２、３、４、または５つ以下の残基を変化させる。変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失であり得る。
例えば、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列の配列へと「復帰変異」させることにより、抗体にフレームワーク修飾を施し、免疫原性を低下させることができる。
加えて、本明細書に開示される抗体を操作して、Ｆｃ領域内に、血清半減期（ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ－ｆｉｆｅ）、補体の結合、Ｆｃ受容体の結合、および／または抗原依存性細胞傷害作用など、抗体の１つまたは複数の機能的特性を変化させる修飾を包含させることもできる。このような修飾には、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易にする、または抗体の安定性を増大させる、もしくは減少させる、ヒンジ領域におけるシステイン残基数の変化（米国特許第５，６７７，４２５号）、ならびに抗体の生物学的半減期を短縮する、Ｆｃヒンジ領域におけるアミノ酸の変異（米国特許第６，１６５，７４５号）が含まれるがそれらに限定されない。
加えて、本明細書に開示される抗体は、化学修飾することもできる。例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を修飾して、抗原に対する抗体の親和性を増大させることにより、抗体のグリコシル化を変化させることができる（米国特許第５，７１４，３５０号；および同第６，３５０，８６１号）。代替的に、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用を増大させるには、グリコシル化機構を変化させた宿主細胞内で抗体を発現させることにより、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体、またはバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体を得ることもできる（Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．ら、（２００２年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７７巻：２６７３３～２６７４０頁；Ｕｍａｎａら、１９９９年、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻：１７６～１８０頁）。
本明細書に開示される抗体またはその断片を、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基がこの抗体または抗体断片に結合する条件下で、ＰＥＧまたはＰＥＧの反応性エステルもしくはＰＥＧのアルデヒド誘導体と反応させることにより、これらの抗体をペグ化して、生物学的半減期を延長することができる。抗体のペグ化は、反応性のＰＥＧ分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施することができる。本明細書で用いられる「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールもしくはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールマレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに用いられているＰＥＧの形態のいずれかを包含することを意図する。ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体であり得る。当技術分野では、タンパク質をペグ化する方法が公知であり、本明細書に開示される抗体に適用することができる（ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４）。
加えて、抗体の抗原結合領域を、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質とコンジュゲートする、または融合させることにより、抗体を化学修飾して、結果として得られる分子の半減期を延長することもできる。このような手法は、例えば、ＥＰ０３２２０９４およびＥＰ０４８６５２５において説明されている。
本開示の抗体またはそれらの断片を、診断薬とコンジュゲートして診断に用い、例えば、疾患の発症または増悪をモニタリングし、所与の処置レジメンの有効性を決定することができる。診断薬の例には、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、各種の陽電子放射トモグラフィーを用いる陽電子放出性金属、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。検出可能な物質は、抗体またはその断片に直接的にカップリングまたはコンジュゲートすることもでき、当技術分野で公知の技法を用いるリンカーを介して、抗体またはその断片に間接的に連結またはコンジュゲートすることもできる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれる。発光材料の例には、ルミノールが含まれる。生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれる。適切な放射性材料の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、インジウム１１１、ルテチウム１７１、ビスマス２１２、ビスマス２１３、アスタチン２１１、銅６２、銅６４、銅６７、イットリウム９０、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、リン３２、リン３３、スカンジウム４７、銀１１１、ガリウム６７、プラセオジム１４２、サマリウム１５３、テルビウム１６１、ジスプロシウム１６６、ホルミウム１６６、レニウム１８６、レニウム１８８、レニウム１８９、鉛２１２、ラジウム２２３、アクチニウム２２５、鉄５９、セレン７５、ヒ素７７、ストロンチウム８９、モリブデン９９、ロジウム１１０５、パラジウム１０９、プラセオジム１４３、プロメチウム１４９、エルビウム１６９、イリジウム１９４、金１９８、金１９９、および鉛２１１が含まれる。モノクローナル抗体は、これらの抗体に共有結合する二官能性のキレート化剤を用いることにより、放射性金属イオンと間接的にコンジュゲートすることができる。キレート化剤は、アミン（ａｍｉｔｉｅｓ）（Ｍｅａｒｅｓら、（１９８４年）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１４２巻：６８～７８頁）、アミノ酸残基のスルフヒドラール基（Ｋｏｙａｍａ（１９９４年）Ｃｈｅｍ． Ａｂｓｔｒ．、１２０巻：２１７～２６２頁）、および炭水化物基（Ｒｏｄｗｅｌｌら、（１９８６年）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８３巻：２６３２～２６３６頁；Ｑｕａｄｒｉら、（１９９３年）、Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．、２０巻：５５９～５７０頁）を介して結合させることができる。
さらに、本開示の抗体またはそれらの断片は、治療薬とコンジュゲートすることもできる。適切な治療薬には、タキソール、シトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、抗代謝剤（メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５－フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビンなど）、アルキル化剤（メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｈｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、および、カルボプラチンなど他の白金誘導体）、抗生物質（ダクチノマイシン（旧称：アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（旧称：ダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））、ジフテリア毒素および類縁分子（ジフテリア毒素Ａ鎖、およびその活性断片、ならびにハイブリッド分子など）、リシン毒素（リシン毒素Ａまたは脱グリコシル化リシン毒素Ａ鎖など）、コレラ毒素、志賀様毒素（ＳＬＴ－Ｉ、ＳＬＴ－ＩＩ、ＳＬＴ－ＩＩＶ）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、ダイズボーマン－バークプロテアーゼ阻害剤、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、アロリン、サポリン、モデクシン、ゲラニン、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｅｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン毒素および混合毒素が含まれる。
追加的な適切なコンジュゲートされた分子には、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ分子などの阻害性ＲＮＡ分子、免疫賦活性核酸、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、および外部ガイド配列が含まれる。アプタマーとは、ステムループまたはＧカルテットなど、規定の二次構造および三次構造へとフォールディングされる、１５～５０塩基の範囲の長さの小型核酸であり、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）およびテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）などの小分子のほか、逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）などの大型分子にも結合し得る。リボザイムとは、化学反応を分子内的にまたは分子間的に触媒することが可能な核酸分子である。リボザイムは、その後に切断される標的基質を認識し、それに結合することにより、核酸基質を切断することが典型的である。三重鎖形成機能を有する核酸分子は、三重鎖を形成することにより二本鎖核酸と相互作用する場合もあり、一本鎖核酸と相互作用する場合もあり、この場合、ＤＮＡの三本鎖は、ワトソン－クリックによる塩基対合およびフーグスティーンによる塩基対合の両方に依存して複合体を形成する。三重鎖分子は、高度な親和性および特異性により、標的領域と結合し得る。
機能性核酸分子は、標的分子により保有される特異的活性のエフェクター、阻害剤、調節剤、および刺激剤として作用する場合もあり、他の分子には依存しない新規の活性を保有する場合もある。
利用可能な多数の方法のうちのいずれかを用いて、治療薬を、直接的にまたは間接的に、抗体に連結することができる。例えば、作用剤を、還元した抗体成分のヒンジ領域に、Ｎ－スクシニル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などの架橋形成剤を用いるジスルフィド結合形成を介して結合させることもでき、抗体のＦｃ領域における炭水化物部分を介して結合させることもできる（Ｙｕら（１９９４年）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、５６巻：２４４頁；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」内の「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｂｉｒｃｈら（編）、１８７～２３０頁（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、１９９５年）；Ｐｒｉｃｅ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」内の「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｒｉｔｔｅｒら（編）、６０～８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５年））。
治療薬を抗体とコンジュゲートする技法は、周知である（Ａｍｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」内の「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３～５６頁（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、１９８５年）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（２版）内の「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３～５３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、１９８７年）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」内の「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５～５０６頁（１９８５年）；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ」内の「Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ， Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３～１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８５年）；およびＴｈｏｒｐｅら「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、（１９８２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．、６２巻：１１９～５８頁）。
本明細書に開示される抗体またはそれらの抗原結合領域は、別の抗体または受容体のリガンドなど、別の機能性分子に連結して、少なくとも２種以上の異なる結合部位または標的分子に結合する、二重特異性分子または多特異性分子を産生することができる。抗体を、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣体など、１種または複数種の他の結合分子に連結することは、例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、または非共有結合的会合を介して行うことができる。多特異性分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに包含し得る。
当技術分野で公知の方法を用いて、二重特異性分子および多特異性分子を調製することができる。例えば、二重特異性分子（ｈｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）の各結合単位を個別に産生し、次いで、これらを互いとコンジュゲートすることができる。結合分子がタンパク質またはペプチドである場合は、各種のカップリング剤または架橋形成剤を、共有結合的コンジュゲーションに用いることができる。架橋形成剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸（２－ｎｉｔｒｏｂｅｒｉｚｏｉｃ ａｃｉｄ））（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－Ｉ－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら（１９８４年）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１６０巻：１６８６頁；Ｌｉｕら（１９８５年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２巻：８６４８頁）が含まれる。結合分子が抗体である場合は、２つの重鎖のＣ末端のヒンジ領域をスルフヒドリル結合させることにより、それらをコンジュゲートすることができる。
本開示の抗体またはその断片は、抗体が結合している細胞に毒性である部分に連結されて「枯渇」抗体を形成し得る。これらの抗体はＮＫ細胞を枯渇させることが望まれる適用において特に有用である。
本明細書に開示される抗体はまた、固体支持体に結合させることもでき、これはイムノアッセイまたは標的抗原の精製に特に有用である。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが含まれるがそれらに限定されない。
抗体はまた、多くの異なるキャリアにも結合させることができる。したがって、本開示はまた、抗体および活性または不活性な別の物質を含有する組成物も提供する。周知のキャリアの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が含まれる。キャリアの性質は、本明細書に開示される目的に応じて、可溶性の場合もあり、不溶性の場合もある。当業者は、モノクローナル抗体を結合させるのに適する他のキャリアについても承知している、または日常的な実験を用いて、このようなキャリアを確認し得るであろう。
本明細書で提供される抗体の態様の一部では、抗体はＤＮＡＢＩＩタンパク質に１０－４Ｍ、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する。本明細書で提供される抗体の態様の一部では、抗原結合部位はＤＮＡＢＩＩタンパク質に特異的に結合する。
本明細書で提供される抗体の態様の一部では、抗体は可溶性Ｆａｂである。
本明細書で提供される抗体の態様の一部では、抗体は完全長抗体である。
本明細書で提供される抗体の態様の一部では、抗体はモノクローナル抗体である。
本明細書で提供される抗体の態様の一部では、抗体はキメラまたはヒト化である。
本明細書で提供される抗体の態様の一部では、抗体はＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、およびＦｖからなる群から選択される。
本明細書で提供される抗体の態様の一部では、抗体はＦｃドメインを含む。本明細書で提供される抗体の態様の一部では、抗体はラット、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコまたはウサギなどの非ヒト動物抗体である。本明細書で提供される抗体の態様の一部では、抗体はヒトもしくはヒト化抗体であるまたはヒトにおいて非免疫原性である。
本明細書で提供される抗体の態様の一部では、抗体はヒト抗体フレームワーク領域を含む。
他の態様では、本明細書で提供される抗体のＣＤＲ内の、１つまたは複数の残基を、別のアミノ酸と置換する。置換は、同じアミノ酸ファミリー内の置換であるという意味で、「保存的」でありうる。天然に存在するアミノ酸は、以下の４つのファミリーに分けることができ、保存的置換は、これらのファミリー内で生じるであろう。１）塩基性側鎖のあるアミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン。２）酸性側鎖のあるアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸。３）非電荷極性側鎖のあるアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン。４）非極性側鎖のあるアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。
別の態様では、１つまたは複数の残基を、抗体の１つまたは複数のＣＤＲに付加する、またはこれから欠失させる。このような付加または欠失は、ＣＤＲのＮ末端もしくはＣ末端またはＣＤＲ内の位置において生じる。
アミノ酸の付加、欠失または置換により抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を変えることによって、標的抗原に対する結合親和性の増加などの種々の効果を得ることができる。
ＣＤＲ配列のこのような変動を含む本開示の抗体もなお、ＤＮＡＢＩＩタンパク質に、開示される抗体と同様の特異性および感受性プロファイルで結合することを認識されたい。これは、結合アッセイにより調べることができる。
さらなる態様では、抗体は、適切なアッセイおよびスクリーニングを使用して決定した場合、免疫優性であり免疫防御性でもあることにより特徴付けられる。
抗体を用いた機能解析
本明細書に開示される抗体を使用すれば、本明細書に開示されるポリペプチドを精製し、生物学的に等価なポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを同定することが可能である。本明細書に開示される抗体を使用すれば、本明細書に開示されるポリペプチドの機能を改変する作用剤を同定することも可能である。これらの抗体は、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、および当業者によく知られており上に記載されているこれらの調製物に由来する種々の試薬を含む。
同定された遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を中和する抗体はまた、このような中和抗体を、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系に追加することにより、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける機能を裏付けるのにも使用することができる。このような中和抗体もまた、本明細書で開示されるポリペプチドの活性を調節する医薬剤としても有用である。
また、多様な抗体調製物も、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける、同定された遺伝子によりコードされるタンパク質の、被験細胞による発現を裏付ける、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウェスタンブロットなどの分析法において使用することができる。また、代謝時のプロテアーゼ分解により発生するこのようなタンパク質の断片も、適切なポリクローナル抗血清を、実験試料に由来する試料と共に使用することにより、同定することができる。
本明細書に開示される抗体は、単独であるいはペプチドもしくはタンパク質ベースのワクチンまたは樹状細胞ベースのワクチンと組み合わせて、ワクチン接種のためまたは追加免疫ワクチン接種するために使用し得る。
組成物
組成物がさらに提供される。組成物は、キャリアと、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される単離された宿主細胞、小分子、または本明細書に開示される抗体もしくはその断片のうちの１つまたは複数とを含む。キャリアは、固体支持体または薬学的に許容されるキャリアのうちの１つまたは複数であり得る。組成物は、ワクチンとしての投与に適するアジュバントまたは他の成分をさらに含み得る。一態様では、組成物を、１種または複数種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、キャリア、および／またはアジュバントと共に処方する。加えて、本開示の組成物についての実施形態は、１種または複数種の薬学的に許容される物質と共に処方された、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、小分子、本明細書に開示される単離された宿主細胞、または本開示の抗体のうちの１つまたは複数も包含する。
経口調製物の場合、本明細書で説明される単離されたもしくは組換え型のポリペプチド、本明細書で説明される単離されたもしくは組換え型のポリヌクレオチド、本明細書で説明されるベクター、本明細書で説明されるとおりの単離された宿主細胞、小分子、または本明細書で説明される抗体のうちの任意の１つまたは複数を、単独で用いることもでき、錠剤、粉末、顆粒、またはカプセルを作製するのに適切な添加剤と組み合わせた化合物、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、またはバレイショデンプンなど、従来の添加剤；微晶質セルロース（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、セルロース誘導体、アカシアガム、トウモロコシデンプン、またはゼラチンなどの結合剤；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤；滑石またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；ならびに、所望の場合は、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、防腐剤、および矯味矯臭剤と組み合わせた化合物を含む、またはこの化合物から本質的になる本明細書に開示される医薬処方物中で用いることもできる。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として組み入れることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分または類似の性質の化合物：微晶質セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤；コロイド性二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの矯味矯臭剤のうちのいずれかを含有し得る。
経口投与に適する医薬処方物および単位用量形態は、慢性状態、感染症の処置、および患者が薬物を自己投与する療法において特に有用である。一態様では、処方物が、小児科投与に特異的である。
本開示は、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される単離された宿主細胞、または本明細書に開示されるとおりの抗体もしくはその断片のうちの１つまたは複数を、水性溶媒、あるいは植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪族系酸グリセリド、高級脂肪族系酸のエステル、またはプロピレングリコールなどの非水性溶媒中で、かつ、所望の場合は、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤および防腐剤、または他の抗菌薬など、従来の添加剤と共に、溶解させる、懸濁させる、または乳化させることにより、本開示に従い注射するための調製物へと処方することができる。このような添加剤の非限定的な例は、表面抗原、例えば、ＯＭＰ Ｐ５、ＯＭＰ ２６、ＯＭＰ Ｐ２、またはＩＶ型ピリンタンパク質（ＪｕｒｃｉｓｅｋおよびＢａｋａｌｅｔｚ（２００７年）、Ｊ． ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８９巻（１０号）：３８６８～３８７５頁；ならびにＭｕｒｐｈｙ、Ｔ．Ｆ．Ｂａｋａｌｅｔｚ，Ｌ．Ｏ．およびＳｍｅｅｓｔｅｒｓ，Ｐ Ｒ（２００９年）、Ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ、２８巻：Ｓ１２１～Ｓ１２６頁を参照されたい）および抗菌薬などの抗微生物剤である。静脈内投与の場合、適切なキャリアには、生理学的、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いずれの場合にも、非経口投与のための組成物は、無菌でなければならず、シリンジ注射が容易に可能となる程度の流体であるべきである。
本開示により提供されるエアゾール処方物は、吸入を介して投与することができ、噴霧体に基づく場合もあり、非噴霧体に基づく場合もある。例えば、本明細書に開示される医薬処方物の実施形態は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など、加圧された許容可能な噴霧体へと処方される本明細書に開示される化合物を含む。吸入投与の場合、化合物は、適切な噴霧体、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器もしくは分注器、または噴霧器からのエアゾールスプレーの形態で送達することができる。非噴霧体の非限定的な例は、機械的な力により（すなわち、指でピストンを押し下げる、または容器の壁面に適用される圧縮力、または壁面自体により加えられる弾性力（例えば、弾性の袋（ｂｌａｄｄｅｒ）を介する）などを介する容器の圧縮により）閉鎖容器から駆出されるポンプスプレーである。
本明細書に開示される坐剤は、本明細書に開示される化合物を、乳化基剤または水溶性基剤など、各種の基剤のうちのいずれかと混合することにより調製することができる。本明細書に開示される化合物によるこの医薬処方物についての実施形態は、坐剤を介して直腸に投与することができる。坐剤は、体温では溶融するが、室温では固化するココアバター、カーボワックス、およびポリエチレングリコールなどのビヒクルを包含し得る。
シロップ、エリキシル、および懸濁物など、経口投与または直腸投与のための単位剤形を提供することが可能であり、各用量単位、例えば、茶さじ１杯分、料理用スプーン１杯分、錠剤、または坐剤は、本明細書に開示される１つまたは複数の化合物を含有する所定量の組成物を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水、または薬学的に許容される別のキャリア中の溶液としての組成物中に本明細書に開示される化合物を含み得る。
本明細書に開示される医薬処方物についての実施形態は、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本開示で用いられる小分子、本明細書に開示される単離された宿主細胞、または本明細書に開示される抗体のうちの１つまたは複数が、注射用組成物へと処方される医薬処方物を包含する。本明細書に開示される注射用医薬処方物は、溶液または懸濁物として調製される、または注射前に液体のビヒクル中で溶解または懸濁させるのに適する固体形態として調製される。調製物はまた、本明細書に開示される医薬処方物についての他の実施形態に従い、乳化させることもでき、有効成分をリポソームビヒクル中に封入することもできる。
ある実施形態では、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される単離された宿主細胞、または本明細書に開示される抗体もしくはその断片のうちの１つまたは複数を、持続送達系を介する送達のために処方する。本明細書では、「持続送達系」という用語を、「制御送達系」と互換的に用い、それらのうちの多種多様なデバイスが当技術分野において公知である、カテーテル、注射デバイスなどと組み合わせた持続（例えば、制御）送達デバイス（例えば、ポンプ）を包含する。
機械的注入ポンプまたは電気機械的注入ポンプもまた、本開示と共に用いるのに適する場合がある。このようなデバイスの例には、例えば、米国特許第４，６９２，１４７号；同第４，３６０，０１９号；同第４，４８７，６０３号；同第４，３６０，０１９号；同第４，７２５，８５２号；同第５，８２０，５８９号；同第５，６４３，２０７号；同第６，１９８，９６６号などで説明されているデバイスが含まれる。一般に、本明細書に開示される化合物の送達は、各種の再充填可能なポンプシステムのうちのいずれかを用いて達成することができる。ポンプは、ある時間にわたり、一定の制御放出をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に開示される化合物が、薬物不透過性レザバ内の液体処方物であり、個体に持続的に送達される。
一実施形態では、薬物送達系が、少なくとも部分的に植え込み式のデバイスである。植え込み式デバイスは、当技術分野で周知の方法およびデバイスを用いて、任意の適切な植え込み部位において植え込むことができる。植え込み部位は、薬物送達デバイスが導入および配置される、対象の体内の部位である。植え込み部位には、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ、ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）部位、筋肉内部位または対象の体内の他の適切な部位が含まれるが必ずしもそれらに限定されない。一部の実施形態では、薬物送達デバイスの植え込みおよび除去が簡便であるため、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）の植え込み部位を用いる。
本開示で用いるのに適する薬物放出デバイスは、各種の作動方式のうちのいずれかに基づき得る。例えば、薬物放出デバイスは、拡散システムに基づく場合もあり、対流システムに基づく場合もあり、浸食システム（例えば浸食ベースのシステム）に基づく場合もある。例えば、薬物放出デバイスは、電気化学式ポンプ、浸透圧ポンプ、電気浸透圧ポンプ、蒸気圧ポンプ、または浸透圧バーストマトリックス（ｏｓｍｏｔｉｃ ｂｕｒｓｔｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）であることが可能であり、例えば、薬物をポリマー中に組み込み、このポリマーが、薬物含浸性ポリマー材料（例えば、生体分解性の薬物含浸性ポリマー材料）の分解と共時的に薬物処方物を放出するポンプであり得る。他の実施形態では、薬物放出デバイスが、電気拡散システム、電気溶解式ポンプ、気泡ポンプ、圧電ポンプ、加水分解システムなどに基づく。
機械的注入ポンプまたは電気機械的注入ポンプに基づく薬物放出デバイスもまた、本開示と共に用いるのに適する場合がある。このようなデバイスの例には、例えば、米国特許第４，６９２，１４７号；同第４，３６０，０１９号；同第４，４８７，６０３号；同第４，３６０，０１９号；同第４，７２５，８５２号などで説明されているデバイスが含まれる。一般に、対象の処置法は、各種の再充填可能な非交換型ポンプシステムのうちのいずれかを用いて達成することができる。ポンプおよび他の対流システムは、それらの、ある時間にわたる一般に一定である程度の高い制御放出のために、利用され得る。一部の実施形態では、浸透圧ポンプが、一定である程度の高い制御放出と比較的小型のサイズとを組み合わせた利点のために用いられる（例えば、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ ９７／２７８４０号；ならびに米国特許第５，９８５，３０５号および同第５，７２８，３９６号を参照されたい）。本開示で用いるのに適する例示的な浸透圧駆動式デバイスには、米国特許第３，７６０，９８４号；同第３，８４５，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第３，９２３，４２６号；同第３，９８７，７９０号；同第３，９９５，６３１号；同第３，９１６，８９９号；同第４，０１６，８８０号；同第４，０３６，２２８号；同第４，１１１，２０２号；同第４，１１１，２０３号；同第４，２０３，４４０号；同第４，２０３，４４２号；同第４，２１０，１３９号；同第４，３２７，７２５号；同第４，６２７，８５０号；同第４，８６５，８４５号；同第５，０５７，３１８号；同第５，０５９，４２３号；同第５，１１２，６１４号；同第５，１３７，７２７号；同第５，２３４，６９２号；同第５，２３４，６９３号；同第５，７２８，３９６号などにおいて説明されているデバイスが含まれるが必ずしもそれらに限定されない。本開示に適合させ得るさらなる例示的なデバイスは、Ｓｙｎｃｈｒｏｍｅｄ注入ポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）である。
一部の実施形態では、薬物送達デバイスが、植え込み式デバイスである。薬物送達デバイスは、当技術分野で周知の方法およびデバイスを用いて、任意の適切な植え込み部位において植え込むことができる。本明細書で言及される通り、植え込み部位は、薬物送達デバイスが導入および配置される、対象の体内の部位である。植え込み部位には、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ、ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｏｓ）部位、筋肉内部位または対象の体内の他の適切な部位が含まれるが必ずしもそれらに限定されない。
本明細書に開示される化合物に適する賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合せである。加えて、所望の場合、ビヒクルは、湿潤剤、または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤など、微量の補助物質も含有し得る。本開示について考慮するとき、当業者には、このような剤形を調製する方法が公知である、または明らかであろう。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ、１７版、１９８５年を参照されたい。いずれにせよ、投与される組成物または処方物は、処置される対象において所望の状態を達成するのに十分な量の化合物を含有する。
本開示の組成物には、持続放出マトリックスまたは制御放出マトリックスを含む組成物が含まれる。加えて、本開示の実施形態は、持続放出処方物を用いる他の処置と共に用いることもできる。本明細書で用いられる持続放出マトリックスとは、通常はポリマーである、酵素的加水分解もしくは酸ベースの加水分解、または溶解を介して分解可能な材料から作製されるマトリックスである。体内に挿入されると、マトリックスは、酵素および体液により作用を受ける。持続放出マトリックスは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド－ｃｏ－グリコリド（乳酸とグリコール酸とのコポリマー）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、硫酸コンドロイチン、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｔａｎｉｎｅ）、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、およびシリコーンなどの生体適合性材料から選択することが望ましい。例示的な生体分解性マトリックスには、ポリラクチドマトリックス、ポリグリコリドマトリックス、およびポリラクチド－ｃｏ－グリコリド（乳酸とグリコール酸とのコポリマー）マトリックスが含まれる。
別の実施形態では、制御放出系により作用剤（ならびに組合せ組成物）を送達する。例えば、本明細書に開示される化合物は、静脈内注入、植え込み式浸透圧ポンプ、経皮的パッチ、リポソーム、または他の投与方式を用いて投与することができる。一実施形態では、ポンプを用いることができる（Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７年）、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ．、１４巻：２０１頁；Ｂｕｃｈｗａｌｄら（１９８０年）、Ｓｕｒｇｅｒｙ、８８巻：５０７頁；Ｓａｕｄｅｋら（１９８９年）、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．、３２１巻：５７４頁）。別の実施形態では、ポリマー材料を用いる。さらに別の実施形態では、制御放出系を、治療標的、すなわち、肝臓の近傍に配置し、それにより、全身用量の一部しか必要としない。さらに別の実施形態では、制御放出系を、治療標的の近傍に配置し、それにより、全身用量の一部しか必要としない。他の制御放出系については、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：１５２７～１５３３頁により総説されている。
別の実施形態では、本開示の組成物（ならびに個別または一体の組合せ組成物）に、本明細書で説明される阻害剤を縫合糸、包帯、およびガーゼなどの吸収性材料中に含浸させることにより形成される組成物、または組成物を送達するための手術用ステープル、ジッパー、およびカテーテルなどの固相材料の表面上にコーティングされる組成物が含まれる。本開示を念頭に置く当業者には、この種の他の送達系も容易に明らかであろう。
本開示は、微生物感染症を処置するために、宿主（例えば、ヒト）にポリペプチド（polyeptide）、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、抗体もしくはその断片のうちの１種または複数種を投与するための方法および組成物を提供する。多様な実施形態では、本明細書に開示されるこれらの方法が、ｉｎ ｖｉｖｏ法およびｅｘ ｖｉｖｏ法のほか、全身投与経路および局所投与経路を含め、薬物を送達するのに適する、利用可能なほとんど任意の方法および経路にわたる。
ワクチン組成物
本開示は、バイオフィルムを破壊するおよび／またはバイオフィルムに関連する感染症を予防するもしくは処置する免疫応答を個体において引き出す組成物および方法も提供する。ある特定の態様では、方法は本発明のキメラタンパク質に対する免疫応答を引き出すする。これらの方法は、本明細書に開示される治療応答（therapeutidc response）を提供する免疫応答を含むがこれに限定されない１つまたは複数の免疫応答を引き出す。一実施形態では、方法は、本明細書に記載されるポリペプチド組成物の免疫原性用量を投与するステップを含む。別の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の免疫原性用量を投与することを含む。方法は単一の個体において組み合わせて使用してもよい。方法は、バイオフィルムを生じる感染を宿す個体の感染に先立ってまたはそれに引き続いて使用してもよい。本開示の方法および組成物を使用すれば、バイオフィルムに関連するいかなる病態も処置するまたは予防することが可能であり、そのような病態の非限定的な例は、例えば、ＯＭ、副鼻腔炎、敗血症、および嚢胞性線維症を含む。
一態様では、本開示の１つまたは複数の組成物は、プライミング用量、続いて１つまたは複数のブースター用量として投与される。サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２，ＧＭ－ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、Ｌｅａｆ）または共刺激分子などの免疫応答を有利に増強するタンパク質またはポリペプチドの共投与も想定している。
本発明の組成物の「免疫原性用量」は、投与前に検出可能な免疫応答と比べてまたは投与前の標準免疫応答と比べて、投与後、検出可能な体液性（抗体）免疫応答および／または細胞性（Ｔ細胞）免疫応答を発生させる用量である。本発明は、方法から生じる免疫応答が保護的であるおよび／または治療的であり得ることを想定している。好ましい実施形態では、抗体および／またはＴ細胞免疫応答はバイオフィルム形成をもたらす感染から個体を保護するおよび／またはバイオフィルムを破壊する。正確な用量は、患者の健康状態および体重、投与様式、製剤の性質、等に依存するが、一般的には７０キログラム患者当たり約１．０マイクログラム～約５０００マイクログラム、さらに一般的には体重７０ｋｇあたり約１０～約５００マイクログラムの範囲に及ぶ。
体液性免疫応答は、一元放射免疫拡散アッセイ（ＳＲＩＤ）、酵素免疫アッセイ（ＥＴＡ）および赤血球凝集抑制アッセイ（ＨＡＩ）などの多くの周知の方法により測定し得る。特に、ＳＲＩＤは、アガロースなどの、検査されている免疫原を含有するゲルの層を利用する。ウェルはゲル中でカットされ検査されている血清はウェル中に置かれる。抗体が外に拡散してゲルに入ると沈澱リングを形成し、その面積が検査されている血清中の抗体の濃度に比例する。ＥＩＡは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫アッセイ）としても公知であり、試料中の全抗体を決定するのに使用される。免疫原はマイクロタイタープレートの表面に吸着される。検査血清はプレート、続いてＩｇＧなどの酵素結合免疫グロブリンに曝露される。プレートに接着している酵素活性は分光光度法などの任意の使いやすい手段により定量され、検査試料中に存在する免疫原に向けられる抗体の濃度に比例する。ＨＡＩは、ウイルスタンパク質などの免疫原がニワトリ赤血球（など）を凝集させる能力を利用する。アッセイは中和抗体、すなわち、赤血球凝集を阻害することができる抗体を検出する。検査血清の希釈物は標準濃度の免疫原と一緒にインキュベートし、続いて赤血球を添加する。中和抗体が存在すると、免疫原による赤血球の凝集が阻害される。細胞性免疫応答を測定する検査は、遅延型過敏症の判定または免疫原を標的にするリンパ球の増殖応答を測定することを含む。
したがって、一態様では、本開示は、ポリペプチドに対する免疫応答を引き出すのに適した組成物を提供する。上記のように、組成物は、１つもしくは複数のキメラタンパク質、１つもしくは複数のキメラタンパク質を発現する細胞、または１つもしくは複数のキメラタンパク質をコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む。組成物は、キャリアおよびアジュバントなどの他の成分も含み得る。
本開示の組成物では、キメラポリペプチドは、組換え法により産生する場合は、別のタンパク質に融合させることが可能である。一実施形態では、もう一方のタンパク質はそれ自身では抗体を誘発し得ないが、このタンパク質は最初のタンパク質を安定化して、免疫原性活性を保持する融合タンパク質を創り出す（faun）。別の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質を可溶化しその産生および精製を容易にする比較的大きな共タンパク質（co-protein）である、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベータガラクトシダーゼなどの免疫原性のある別のタンパク質を含む。もう一方のタンパク質は、免疫系の全身性刺激を提供するという意味でアジュバントとして作用し得る。もう一方のタンパク質は、本明細書に開示されるキメラタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端に融合し得る。
全体の態様では（In sum aspect）、ポリペプチドはキャリア物質に連結することが
可能である。当技術分野で公知のそのような連結を作り出すいかなる方法でも使用し得る。ジスルフィドアミド形成剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル（succidimidyl）－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などの一方の官能基末端にジスルフィドリンクおよびもう一方の官能基末端にペプチドリンクを生み出す異種二官能性剤（例えば、Jansenら、Immun. Rev. ６２巻：１８５頁、１９８２年参照）ならびに６－マレイミドカプロン酸、２－ブロモ酢酸、２－ヨード酢酸、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、などの反応性エステルなどのジスルフィド連結よりはむしろチオエーテルを形成する二官能性カップリング剤ならびにスクシンイミジル（succinimmidyl）４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（carobxylate）（ＳＭＣＣ）などのナトリウム塩では、カルボキシル基をスクシンイミドまたは１－ヒドロキシ－２－ニトロ－４－スルホン酸と組み合わせることによりカルボキシル基を活性化するカップリング剤を用いて連結を形成することが可能である。
ポリペプチドは中性または塩の形態として製剤化することが可能である。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）を含み、これは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される。遊離のカルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、およびプロカインなどの有機塩基に由来してもよい。
本開示の組成物は、さらにアジュバントを含むことが可能である。公知のアジュバントは、例えば、フロイントアジュバントなどの乳剤および他の油乳剤、ボルデテラパータシス（Bordetella pertussis）、ＭＦ５９、キラヤサポナリア（Quillaja saponaria）（ＱＳ２１）由来の精製サポニン、水酸化物、リン酸塩およびミョウバンなどのアルミニウム塩、リン酸カルシウム、（および他の金属塩）、水酸化アルミニウム塩などのゲル、ムラミルジペプチドを含むマイコバクテリア産物、固体材料、リポソームおよびビロソームなどの粒子を含む。アジュバントとして使用されることが公知の天然のおよび細菌性産物の例は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＲＣ－５２９（合成ＭＰＬ様アシル化単糖）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリピドＡ誘導体であるＯＭ－１７４、コレラ毒素（ＣＴ）などのホロ毒素またはその誘導体の１つ、百日咳毒素（ＰＴ）およびＥ．ｃｏｌｉの熱不安定性毒素（ＬＴ）またはその誘導体の１つ、ならびにＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。アジュバント活性は、キャリア効果、デポー形成、変化したリンパ球再循環、Ｔリンパ球の刺激、Ｂリンパ球の直接刺激およびマクロファージの刺激などのいくつかの要因により影響を受け得る。
本開示の組成物は、典型的には、注射剤として、液体液剤または懸濁剤として製剤化され、注射に先立って液体中での溶液または懸濁液に適した固体形態を調製し得る。調製物は乳状にもし得る。活性な免疫原性成分は賦形剤と混合させることも多く、賦形剤は薬学的に許容され活性成分と適合する。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、などおよびその組合せである。さらに、所望される場合、ワクチンは湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバントなどの補助物質を少量含有してもよく、これらの物質はワクチンの有効性を増強する。ワクチンは、非経口的に、注射により、例えば、皮下にまたは筋肉内に従来通りに投与される。
他の投与様式に適している追加の製剤は坐薬、および一部の場合には、経口製剤を含む。坐薬では、従来の結合剤およびキャリアは、例えば、ポリアルキレングリコール（polyalkalene glycols）またはトリグリセリドを含んでいてもよく；そのような坐薬は活性
成分を０．５％～１０％、好ましくは１～２％の範囲で含有する混合物から形成してもよい。経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどような通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または粉剤・散剤（powder）の形態をとり、１０％～９５％、好ましくは２５～７０％の活性成分を含有する。
組成物は、ジェットインジェクター、マイクロニードル、エレクトロポレーション、ソノポレーション、マイクロカプセル化、ポリマーまたはリポソームを利用する経皮経路、経粘膜経路ならびにネブライザー、エアゾールおよび鼻スプレーを使用する鼻腔内経路を通じて投与してもよい。デンプン、アルギネートおよびキトサン、Ｄ－ポリ Ｌ－ラクテート（ＰＬＡ）、Ｄ－ポリ ＤＬ－乳酸－コグリコール酸マイクロスフィア、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物およびポリホスファゼン ポリホスファタザンなどの天然または合成ポリマーを使用するマイクロカプセル化は経皮投与と経粘膜投与の両方に有用である。合成ポリオルニテート（poly-ornithate）、ポリリジンおよびポリアルギニンまたは両親媒性ペプチドを含むポリマー複合体は経皮送達システムに有用である。さらに、その両親媒性のせいで、リポソームは経皮、経粘膜および鼻腔内ワクチン送達システム用に想定される。ワクチン送達に使用される一般的な脂質は、Ｎ－（１）２，３－（ジオレイル－ジヒドロキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，－トリメチルアンモニウム－メチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）、ジオレイルオキシ－プロピル－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、ジミスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）および９Ｎ（Ｎ’，Ｎ－ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）を含む。ヘルパー脂質とリポソームの組合せは皮膚を通じたリポソームの取り込みを増強する。これらのヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）を含む。さらに、トリテルペノイドグリコシドまたはチリ産の石鹸樹皮（Chilean soap tree bark）（キラヤサポナリア）由来のサ
ポニンおよびキトサン（脱アセチル化キチン（chitan））は、鼻腔内および経粘膜ワクチン送達に有用なアジュバントとして想定されてきた。
製剤は、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提示することが可能であり、使用直前に無菌液体キャリアを添加するだけでよい凍結乾燥状態で保存し得る。
スクリーニングアッセイ
本開示は、本明細書に記載されるポリクローナル抗体に等価であるモノクローナル抗体などの等価な作用剤ならびに本明細書に開示される活性作用剤および医薬組成物の活性または本明細書に開示されるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドもしくはペプチド産物の機能を調節する種々の作用剤についてスクリーニングするための方法を提供する。本開示の目的では、「作用剤」に、単純なもしくは複雑な有機分子もしくは無機分子、ペプチド、タンパク質（例えば、抗体）、ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスポリヌクレオチド）、またはリボザイムを含むがこれらに限定されないことを意図する。例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどのポリマー、および多様なコア構造に基づく合成有機化合物など、多種多様な化合物を合成することができるが、これらもまた、「作用剤」という用語に含まれる。加えて、植物抽出物または動物抽出物など、各種の天然供給源も、スクリーニングのための化合物をもたらしうる。常に明示的に言及されるわけではないが、作用剤は、単独で、または本発明のスクリーニングにより同定される作用剤と同じもしくは異なる生物学的活性を有する、別の作用剤と組み合わせて使用されることを理解されたい。
ある種の実施形態は、本明細書に開示されるポリペプチド、抗体またはその断片と相互作用することができる小分子をスクリーニングするための方法に関する。本開示の目的では、「小分子」は、一実施形態では、目的のタンパク質に結合し、それによってタンパク質の機能を変更することができる低分子量（ＭＷ）を有する分子である。一部の実施形態では、小分子のＭＷは１，０００以下である。タンパク質機能を変更することができる小分子をスクリーニングするための方法は、当技術分野では公知である。例えば、細胞中で小分子－タンパク質相互作用を検出するための小型化したアレイ化アッセイはYouら、（
１９９７年）Chem. Biol. ４巻：９６１～９６８頁により論じられている。
スクリーニング法をｉｎ ｖｉｔｒｏで実行するためには、処置するべき微生物が感染している適切な細胞培養物または組織がまず提供される。細胞は、条件（温度、成長または培養培地および気体（ＣＯ２））下、密度依存性制約なしで指数関数的増殖を達成するのに適した時間培養される。対照として感染していない追加の別個の細胞培養物を維持するのも望ましい。
当業者には明らかであるように、適切な細胞はマイクロタイタープレートにおいて培養することが可能であり、いくつかの作用剤は、遺伝子型の変化、表現型の変化または微生物力価の低下に注目することにより同時にアッセイすることが可能である。
作用剤が、上記で説明した小分子など、ＤＮＡまたはＲＮＡ以外の組成物である場合は、この作用剤を、細胞培養物に直接添加することもでき、追加用の培養培地に添加することもできる。当業者に明らかである通り、経験的に決定され得る「有効」量を添加しなければならない。
作用剤が抗体または抗原結合性断片である場合、作用剤は、競合ＥＬＩＳＡを実施する条件下で本明細書に記載される標的抗原およびポリクローナル抗体と接触させるまたはこれと一緒にインキュベートすることが可能である。そのような方法は当業者には公知である。
アッセイはまた、対象において実施することもできる。対象が、ラット、チンチラ、マウス、またはサルなどの動物である場合、方法は、ヒト患者における作用剤の臨床試験の前に使用しうる、簡便な動物モデル系を提供する。この系では、疾患または微生物感染症の症状のそれぞれが、同じ感染症を有する処置されていない動物と比較して軽減される、または消失すれば、候補作用剤が潜在的な薬物である。また、比較のためのベースを提供する、健康で処置を受けていない細胞または動物の、別個の陰性対照群を有することも有用であり得る。
作用剤および組成物は、医薬の製造において用いることができ、医薬組成物の有効成分など、従来の手順に従う投与を介して、ヒトおよび他の動物を処置するのに用いることができる。
組合せ療法
本開示の組成物および関連する方法は、他の療法の投与と組み合わせて用いることができる。これらには、ＤＮアーゼ酵素、抗生物質、抗菌薬、または他の抗体の投与が含まれるがそれらに限定されない。
一部の実施形態では、方法および組成物が、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体と共に相乗的に作用するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）酵素を包含する。ＤＮアーゼとは、ＤＮＡ骨格におけるホスホジエステル結合の切断を触媒する任意の酵素である。十字構造だけでなく、ＤＮＡの多様な二次構造もまたターゲティングすることが公知であるＤＮアーゼ酵素についての、３つの非限定的な例は、ＤＮアーゼＩ、Ｔ４ Ｅｎｄｏ ＶＩＩ、およびＴ７ Ｅｎｄｏ Ｉを含む。ある特定の実施形態では、ＤＮアーゼと組み合わせると、バイオフィルムを不安定化させるのに必要とされる抗ＤＮＡＢＩＩ抗体の有効量が低減される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する場合、ＤＮアーゼは、アッセイに直接添加することもでき、この酵素を安定化させることが公知である適切な緩衝液中に添加することもできる。ＤＮアーゼの有効単位用量およびアッセイ条件は変動する場合があり、当技術分野で公知の手順に従い最適化することができる。
他の実施形態では、方法および組成物を、抗生物質および／または抗菌薬と組み合わせることもできる。抗菌薬とは、細菌、真菌、または原虫などの微生物を死滅させる、またはそれらの成長を阻害する物質である。バイオフィルムは一般に、抗生物質の作用に対して耐性であるが、本明細書で説明される組成物および方法を使用して、バイオフィルムを伴う感染症を、感染症を処置するための従来の療法に対して感作させることができる。他の実施形態では、抗生物質または抗菌薬を、本明細書で記載される方法および組成物と組み合わせて使用することにより、抗菌薬および／またはバイオフィルム低減剤の有効量を低減することが可能となる。本開示の方法との組合せに有用な抗菌薬および抗生物質についての一部の非限定的な例には、アモキシシリン、アモキシシリン－クラブラン酸、セフジニル、アジスロマイシン、およびスルファメトキサゾール－トリメトプリムが含まれる。バイオフィルム低減剤と組み合わされる抗菌薬および／または抗生物質の治療有効量は、従来の方法により容易に決定することができる。一部の実施形態では、バイオフィルム低減剤と組み合わされる抗菌薬の用量が、他の細菌感染症、例えば、感染症の病因がバイオフィルムを包含しない細菌感染症において有効であることが示されている平均有効用量である。他の実施形態では、用量が、平均有効用量の０．１、０．１５、０．２、０．２５、０，３０、０，３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、または５倍である。抗生物質または抗菌薬は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体を添加する前に付加することもでき、それと共時的に付加することもでき、その後で付加することもできる。
他の実施形態では、方法および組成物を、細菌感染症を処置する抗体と組み合わせることもできる。本明細書で説明される方法および組成物と組み合わせるのに有用な抗体の一例は、非類縁外膜タンパク質（すなわち、ＯＭＰ Ｐ５）を指向する抗体である。この抗体単独による処置は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてバイオフィルムを減量することがない。この抗体と、バイオフィルム低減剤とによる組合せ療法は、同じ濃度のいずれかの試薬を単独で用いることにより達成され得る効果より大きな効果を結果としてもたらす。バイオフィルム低減剤またはバイオフィルムを低減させる方法と組み合わせて用いると相乗効果をもたらし得る他の抗体には、抗ｒｓＰｉｌＡ調製物、抗ＯＭＰ２６調製物、抗ＯＭＰ Ｐ２調製物、および抗全ＯＭＰ調製物が含まれる。
本明細書で説明される組成物および方法を用いて、バイオフィルムを伴わない細菌感染症を処置するのには有効であるが、それ以外の、バイオフィルムを伴う細菌感染症を処置するには有効でない、一般的な治療モダリティーに対して、バイオフィルムを伴う細菌感染症を感作させることができる。他の実施形態では、本明細書で説明される組成物および方法を、バイオフィルムを伴う細菌感染症を処置するのに有効な治療モダリティーと組み合わせて用い得るが、このような追加的な療法とバイオフィルム低減剤またはバイオフィルム低減法との組合せは、バイオフィルム低減剤または追加的な治療薬の有効量を低減し得るような相乗効果をもたらす。他の場合には、このような追加的な療法とバイオフィルム低減剤またはバイオフィルム低減法との組合せが、処置を増強するような相乗効果をもたらす。処置の増強は、感染症を処置するのに必要とされる時間の長さの短縮により証拠立てることができる。
追加の治療的処置は、バイオフィルムを低減するのに使用される方法または組成物に先立って、これと同時にまたはこれに続いて加えることが可能であり、同じ製剤（same formation）内にまたは別個の製剤として含有することが可能である。
製剤および共製剤
本明細書で提供される開示は、本明細書の上で開示される賦形剤などの薬学的に許容される賦形剤と共に、本明細書に開示される作用剤の特定の製剤および共製剤を想定している。
特定の態様では、本開示は、単離されたまたは組換えポリペプチドを特異的に認識するまたはこれに結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む製剤または共製剤（co-formulation）を提供する。本明細書で開示される抗体は、それらが、バイオフィルムに対する、高レベルのエピトープ結合特異性および高結合親和性を有するように選択することができる。一般に、抗体の結合親和性が大きいほど、イムノアッセイにおいて、よりストリンジェントな洗浄条件を実施して、標的を除去せずに、非特異的に結合した材料を除去することができる。したがって、開示される方法において有用な、本技術の抗体は通例、少なくとも１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０、１０－１１、または１０－１２Ｍの結合親和性を有する。ある特定の態様では、抗体は、標準的な条件下、少なくとも１２時間、少なくとも５時間、少なくとも１時間、または少なくとも３０分間で、平衡に達するのに十分な動態オン速度を有する。別の態様では、抗体または抗原結合性断片の親和性は、１０００ピコモル（ｐＭ）、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、約１００ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、９ｐＭ、８ｐＭ、７ｐＭ、６ｐＭ、５ｐＭ、または４ｐＭ未満またはほぼこれらの親和性である。
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬまで、または代替的に、約１から約１５０ｍｇ／ｍＬまで、または代替的に、約２ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬまで、または代替的に、約３ｍｇ／ｍＬから約８０ｍｇ／ｍＬまで、または代替的に、約４ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬまで、または代替的に、約５ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬまでの濃度で、処方物中に存在する。一部の実施形態では、抗体は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約６ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約７ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約８ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約９ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約６０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約９０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１２０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態では、複数の抗体のうちの少なくとも１つは、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約３ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約６ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約７ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約８ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約９ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約６０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約９０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１２０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
複数の異なる抗体が、抗体併合処方物中に含まれる、一部の実施形態では、異なる抗体は、実質的に等濃度で存在しうる。このような実施形態についての別の態様では、異なる抗体のうちの１つまたは複数は、他の抗体より実質的に高濃度で、例えば、約１．５：１、または代替的に、約１．５：１：１、または代替的に、約１．５：１：１：１、または代替的に、約２：１、または代替的に、約２：１：１、または代替的に、約２：１：１：１、または代替的に、少なくとも約２．５：１、または代替的に、少なくとも約２．５：１：１、または代替的に、少なくとも約２．５：１：１：１の比で存在しうる。
一部の実施形態では、共製剤は、Ａ５、その断片もしくは等価物（例えば、２つ組で（in duplicate）またはｍＢ４などの別のものと組み合わせて）のうちの２つもしくはそ
れよりも多くまたはｍＢ４ポリペプチド、その断片もしくは等価物のうちの２つもしくはそれよりも多くまたはＡ５と組み合わせたｍＢ４、そのそれぞれの断片もしくは等価物から本質的になる単離されたまたは組換えポリペプチドを特異的に認識するまたはこれに結合する抗体を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれを含む。一部の実施形態では、製剤中の１つまたは複数の抗体はポリクローナル抗体ではない。一部の実施形態では、この製剤は治療薬として使用される。
一部の実施形態では、共製剤は、Ａ１からＡ４もしくはＡ６またはＢ１からＢ６、またはその断片もしくは等価物のうちの２つまたはそれよりも多くから本質的になる単離されたまたは組換えポリペプチドを特異的に認識するまたはこれに結合する抗体を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれを含む。一部の実施形態では、製剤中の１つまたは複数の抗体はポリクローナル抗体ではない。一部の実施形態では、この製剤は診断薬として使用される。
抗体製剤および共製剤を安定的に製剤化する方法は、当技術分野で開示されている技法にしたがってなすことが可能であり、例えば、米国特許出願公開第２０１１／００５９０７９号を参照されたい。
診断法および治療法
ＤＮＡＢＩＩポリペプチドもしくはタンパク質または微生物ＤＮＡを本明細書に記載される組成物と接触させることにより、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはタンパク質の微生物ＤＮＡへの結合を阻害する、これと競合するまたはこれを滴定するための方法も提供される。さらなる態様では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡは、例えば、互いに密に接触させるとシグナルを放出する発光性分子で検出可能に標識する。接触はｉｎ
ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施可能である。
別の態様では、微生物バイオフィルムを本明細書に記載される作用剤または組成物と接触させることにより、微生物バイオフィルムを阻害する、分解する、予防するまたは破壊するための方法が提供される。さらなる態様では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡを、例えば、互いに緊密に接触させるとシグナルを発生させる発光分子で検出可能に標識化する。接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施することもでき、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて実施することもできる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施する場合、方法は、本明細書で開示されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体またはその断片、宿主細胞、小分子、および組成物と同じ能力、同様の能力、または反対の能力を有する作用剤を、スクリーニングまたは確認するために有用である。代替的に、方法を使用して、微生物感染症を処置するためにはどの作用剤が最適であるかを同定することができる。例えば、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡおよび被験作用剤を含有する２つの試料を有することにより、例えば、新たな作用剤または組合せ療法をスクリーニングすることができる。第２の試料は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡおよび活性であることが公知の作用剤、例えば、抗ＩＨＦ抗体または陽性対照として用いられる小分子を含有する。さらなる態様では、いくつかの試料を提供し、希釈率を増大させながら、作用剤を、系に添加して、臨床の場で対象を処置するのに有効である可能性が高い、最適な用量を決定する。当業者に明らかである通り、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡを含有する陰性対照を提供することができる。さらなる態様では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡを、互いに緊密に接触させるとシグナルを発生させる発光分子で検出可能に標識化する。試料を、作用剤がＤＮＡＢＩＩポリペプチドと微生物ＤＮＡとの相互作用を阻害する、それと競合する、またはそれを漸減するために有効な時間にわたり、同様の条件下に保ち、次いで、試料を、発光分子からのシグナルの発生についてアッセイする。試料がシグナルを発生させれば、その作用剤は結合を阻害するのに有効ではない。
別の態様では、ヒト／動物から、感染症を引き起こす微生物の（例えば細菌などの）単離株を単離し、次いで、培養して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてバイオフィルムとして成長させることができる、小型化チャンバースライドシステムにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法を実施するが、例えば、下記の実験を参照されたい。作用剤（抗ＩＨＦ抗体など）または潜在的な作用剤を、抗ＩＨＦなど（または他の抗体、小分子、作用剤など）、潜在的な作用剤または作用剤の希釈率を増大させながら、または増大させずに、単独で、または別の作用剤と組み合わせて、培養物に添加して、感染症が存在する対象に送達した場合に、その患者を処置するのに有効である可能性が高い、最適用量を見出す。当業者に明らかである通り、陽性対照および陰性対照を同時に実施することができる。
さらなる態様では、作用剤（例えば、抗ＩＨＦ抗体など）および／または潜在的な作用剤（単独で、または別の作用剤と組み合わせて）をフローセル内に伴う、ハイスループットプラットフォームにおいて、方法を実施する。作用剤（抗ＩＨＦ抗体など）または潜在的な作用剤を、抗ＩＨＦなど（または他の抗体、小分子、作用剤など）、潜在的な作用剤または作用剤の希釈率を増大させながら、または増大させずに、単独で、または別の作用剤と組み合わせて、培養物に添加して、感染症が存在する対象に送達した場合に、その患者を処置するのに有効である可能性が高い、最適用量を見出す。バイオフィルム単離体を超音波処理して、微生物ＤＮＡに結合したＩＨＦなどのＤＮＡＢＩＩポリペプチドからバイオフィルム細菌を分離する。ＤＮＡＢＩＩポリペプチド－ＤＮＡ複合体を、プラットフォーム上の抗ＩＨＦ抗体によって単離する。次いで、微生物ＤＮＡを、例えば、塩洗浄により放出させ、添加したバイオフィルム細菌を同定するのに使用する。次いで、遊離したＤＮＡを、例えば、ＰＣＲシーケンシングにより同定する。ＤＮＡが遊離しなければ、作用剤は、首尾よく機能した、または微生物ＤＮＡに結合した。ＤＮＡが試料中に見出されれば、作用剤は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチド－微生物ＤＮＡ間の結合に干渉しなかった。当業者に明らかである通り、陽性対照および／または陰性対照を同時に実施することができる。
別の態様では、本明細書で開示される作用剤または抗体のうちの１つまたは複数を、ｉｎ ｖｉｖｏでバイオフィルムを検出する方法において使用する。さらなる実施形態では、作用剤または抗体を、例えば、発光分子または蛍光分子で、検出可能に標識化する。本明細書で開示される方法のさらなる適用は、このような作用剤または抗体の使用法であって、例えば、バイオフィルムに結合すると、検出可能なシグナルをもたらす、検出可能に標識化された一次作用剤もしくは抗体、または一次作用剤または一次抗体がバイオフィルムに結合するときに、それに結合している、検出可能に標識化された二次抗体を使用して、バイオフィルムをイメージングする使用法を含む。
上記の方法はまた、所与の細菌種が、ある作用剤によって、別の作用剤によりもそのバイオフィルムの逆転によく応答する可能性があるので、診断検査としても使用することができ、この迅速なハイスループットアッセイシステムであれば、当業者が可能性のある作用剤のパネルをアッセイして、最も効果的な群を同定することを可能とするであろう。
これらの方法の利点は、病院内の大半の臨床微生物学検査室には既に、液体培養物中で（または浮遊状態で）成長する細菌を使用してこれらの種類のアッセイ（すなわち、ＭＩＣ値、ＭＢＣ値の決定）を実施する設備が整っていることである。当業者には明らかである通り、細菌は一般に、疾患を引き起こすときには浮遊状態では成長しない。その代わりに、細菌は、安定なバイオフィルムとして成長し、これらのバイオフィルムは、抗生物質、抗体、または他の治療薬による処置に対する耐性が著明に大きい。この耐性が、大半のＭＩＣ／ＭＢＣ値により、ｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性を正確に予測することができない理由である。したがって、作用剤のどの「用量」がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細菌バイオフィルムを逆転しうるのかを決定することにより（上記で記載した通り）、出願人らの前臨床的なアッセイは、個別化医療の適用としてもなお、臨床的有効性についての、信頼性の大きな予測因子となるであろう。
臨床の場に加えて、この方法は、感染症を引き起こす微生物を同定し、かつ／または工業の場において有効な作用剤を確認するのにも使用することができる。
上記の方法のさらなる態様では、感染症を阻害しうるのかどうかを決定するために、根底的な感染症の進行を阻害することが公知である抗生物質または抗菌薬を、逐次的または同時に添加する。バイオフィルムの阻害をアッセイするためには、複合体を添加する前に、作用剤を、微生物ＤＮＡまたはＤＮＡＢＩＩポリペプチドに添加することも可能である。
チンチラなどの非ヒト動物において、ｉｎ ｖｉｖｏで実施する場合、方法は、バイオフィルムを分解するのに、単独で、または他の作用剤と組み合わせて使用しうる、作用剤を同定するための、前臨床なスクリーニングを提供する。
別の態様では、対象に有効量のポリペプチド、ポリヌクレオチド（polynucletide）、
ベクター、宿主細胞、抗体またはその抗原結合性断片を投与し、それによって微生物バイオフィルムを阻害する、予防する、分解するまたは破壊することにより対象においてバイオフィルムを阻害する、分解する、予防するまたは破壊するための方法が本明細書で提供される。
代替的にまたはさらに、バイオフィルムを阻害する、分解する、予防するまたは破壊する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで実施してもよく、対象から採取したまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成したバイオフィルムの試料を提供し、有効量のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、抗体またはその抗原結合性断片を投与し、それによって微生物バイオフィルムを阻害する、予防する、または破壊することを含む。同様に、本明細書で開示される組成物は、バイオフィルムがコロニーを作っている表面、限定されずに、病院器具、産業機器、および生きた組織で構成されていない他の材料などの表面の微生物バイオフィルムを阻害する、予防する、または破壊するための方法実施形態において使用し得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つまたは複数を単独でまたは組み合わせて投与することを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれを含む。開示されている方法のさらなる実施形態では、作用剤は同時に投与してもよい。代替の実施形態では、抗体は順次投与される。
免疫応答の誘導または受動免疫の付与を必要とする対象において免疫応答を誘導するまたは該対象に受動免疫を与えるための方法であって、有効量の、本明細書で開示されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つまたは複数を対象に投与することを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる、方法も本明細書で提供される。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ポリクローナル抗体ではない。
さらなる態様では、方法は、対象に、有効量の、抗菌薬、抗原性ペプチド、またはアジュバントのうちの１つまたは複数を投与するステップを含む、または代替的にそれから本質的になる、なおまたはさらにそれからなる。
抗菌剤の非限定的な例は、表面抗原、例えば、ＯＭＰ Ｐ５、ｒｓＰｉｌＡ、ＯＭＰ ２６、ＯＭＰ Ｐ２、またはＩＶ型Ｐｉｌｉｎタンパク質などのワクチン構成成分に対して方向づけられた抗体である（ＪｕｒｃｉｓｅｋおよびＢａｋａｌｅｔｚ（２００７年）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８９巻（１０号）：３８６８～３８７５頁；Ｍｕｒｐｈｙら（２００９年）、Ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ、２８巻：Ｓ１２１～Ｓ１２６頁；Ｎｏｖｏｔｎｙら（２０１５年）、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、９６巻（２号）：２７６～９２頁を参照されたい）。
本明細書で開示される作用剤および組成物は、他の抗菌剤および／または表面抗原と、同時にまたは逐次的に投与することができる。特定の一態様では、投与は、例えば、直接的な注射または吸入による、感染部位への局所投与である。投与の他の非限定的な例は、経皮的に、尿道に、舌下に、直腸に、膣に、眼に、皮下に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内に、吸入により、または経口的に投与することを含む、１つまたは複数の方法による投与を含む。
本明細書で開示される方法により処置されうる微生物感染症および疾患は、例において開示されている生物を含むがこれらに限定されない、バイオフィルムの形成と関連する多様な生物による感染症を含むがこれらに限定されない。関与性の生物（およびそれらの括弧中の例示的な株）の非限定的な例は、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（例えば、Ｂ３１）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（例えば、Ｔｏｈａｍａ Ｉ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（例えば、６６８）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ（例えば、ＨＩ２４２４）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（例えば、Ｋ１２ ＭＧ１６５５）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（例えば、Ｖ５８３）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、Ｒｄ ＫＷ２０）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（例えば、２６６９５）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（例えば、ＲＨ４）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（例えば、ＭＣ２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（例えば、ＣＤＣ１５５１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（例えば、ＦＡ１０９０）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（例えば、ＭＣ５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（例えば、Ｗ８３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（例えば、１７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）２５８４５）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（例えば、ＭＷ２）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（例えば、ＲＰ６２Ａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（例えば、２６０３Ｖ／Ｒ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（例えば、ＵＣＮ３４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ（例えば、ＮＣＴＣ ７８６８ （Ｃｈａｌｌｉｓ））、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（例えば、ＵＡ１５９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えば、Ｒ６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えば、ＭＧＡＳ１０２７０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ（例えば、６７１５）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（例えば、ｔｙｐｈｉ、ＣＴ１８）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）３５４０５）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｕｍ（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ（例えば、Ｅｌ Ｔｏｒ、Ｎ１６９６１）を含む。バイオフィルムと関連する、かつ／またはこれを形成することが公知の、さらなる生物は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むがこれらに限定されない。例えば、嚢胞性線維症患者は、抗生物質耐性バイオフィルムを結果としてもたらすことが多い、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染症を有する。バイオフィルムと関連する例示的な疾患は、嚢胞性線維症患者の肺感染症、中耳炎、自然弁感染性心内膜炎、骨髄炎、鼻副鼻腔炎、前立腺炎、再発性尿路感染症、創傷、齲歯、および歯周炎を含むがこれらに限定されない。感染した人工デバイス、関節、カテーテル、ステントまたは他の外科用インプラントなどの状態もまた、バイオフィルムの形成と関連する。
これらの微生物感染症は、上気道、中気道および下気道に存在しうる（耳炎、副鼻腔炎、気管支炎であるが、また、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の増悪、慢性咳、嚢胞性線維症（ＣＦ）の合併症および／または主因、ならびに市中感染性肺炎（ＣＡＰ）でもある）。したがって、本明細書で開示されるｉｎ ｖｉｖｏ法を実施することにより、これらの感染症由来の、これらの疾患および合併症も、予防または処置することができる。
感染症は、口腔においても生じる可能性があり（齲歯、歯周炎）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｖｃｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓにより引き起こされる。感染症はまた、皮膚に局在する可能性もあり（膿瘍、「ブドウ球菌」感染症、膿痂疹、熱傷の二次感染症、ライム病）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉにより引き起こされる。尿路（ＵＴＩ）の感染症は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにより引き起こされることが典型的であり、これもまた処置することができる。消化管（ＧＩ）の感染症（下痢、コレラ、胆石、胃潰瘍）は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉによって引き起こされることが典型的である。生殖管の感染症は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを含み、これによって引き起こされることが典型的である。感染症は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓによって引き起こされる、膀胱の感染症または留置デバイスの感染症でありうる。人工股関節または人工膝関節など、植え込まれた人工デバイス、または歯科インプラント、またはポンプ、カテーテル、ステント、もしくはモニタリングシステムなどの医療デバイスと関連する感染症は、種々の細菌により引き起こされることが典型的であり、本明細書で開示される方法により処置することができる。これらのデバイスは、本明細書で記載される作用剤でコーティングすることもでき、これとコンジュゲートすることもできる。したがって、本明細書で開示されるｉｎ
ｖｉｖｏ法を実施することによって、これらの感染症由来の、これらの疾患および合併症も予防または処置することができる。
また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅにより引き起こされる感染症も、本明細書で開示される方法により処置することができるが、これは、新生児における細菌性敗血症の主要な原因である。また髄膜炎を引き起こす恐れがある、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにより引き起こされる感染症も、処置することができる。
したがって、本明細書で開示される方法に適用可能な投与経路は、鼻腔内、筋肉内、尿道、気管内、皮下、皮内、局所塗布、静脈内、直腸、経鼻、経口的、吸入、および他の経腸および非経口的な投与経路を含む。投与経路は、所望であれば組み合わせることもでき、作用剤および／または所望の効果に応じて調整することもできる。活性作用剤は、単回用量または複数回用量で投与することができる。送達に適する、これらの方法および経路の実施形態は、全身経路または局所経路を含む。一般に、本明細書で開示される方法に適する投与経路は、これらに限定されないが、直接注射経路、経腸経路、非経口的経路、または吸入による経路を含むがこれらに限定されない。
吸入による投与以外の非経口的投与経路は、局所経路、経皮経路、皮下経路、筋肉内経路、眼窩内経路、嚢内経路、脊髄内経路、胸骨内経路、および静脈内経路、すなわち、消化管を通る経路以外の任意の投与経路を含むがこれらに限定されない。非経口投与は、阻害剤の全身送達または局所送達をもたらすように行うことができる。全身送達が望まれる場合、投与は、医薬調製物の侵襲的または全身的に吸収される局所投与または粘膜投与を伴うことが典型的である。
本明細書で開示される作用剤はまた、経腸投与により対象に送達することもできる。経腸投与経路は、経口的送達および直腸送達（例えば、坐薬を使用する）を含むがこれらに限定されない。
皮膚または粘膜を通じた活性物質の投与方法は、適切な医薬調製物の局所塗布、経皮的浸透（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）、経皮的浸透（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）、注射および表皮投与を含むがこれらに限定されない。経皮的浸透については、吸収促進剤またはイオン泳動が適切な方法である。イオン泳動的な浸透は、それらの生成物を、数日またはそれよりも長い期間にわたり、損なわれていない皮膚を通じて、電気的パルスにより連続的に送達する、市販の「パッチ」を使用して達成することができる。
本明細書で開示される方法の種々の実施形態では、作用剤を、吸入、注射により、または経口的に、連続的に、毎日、１日少なくとも１回（ＱＤ）投与し、種々の実施形態では、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、なおまたは１日４回投与する。毎日の治療有効用量は、少なくとも約１ｍｇ、または少なくとも約１０ｍｇ、または少なくとも約１００ｍｇ、または約２００ｍｇ～約５００ｍｇであり、場合によっては、化合物に応じて、約１ｇから約２．５ｇまでと同程度であることが典型的であろう。
本開示は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を放出する細菌による宿主または宿主細胞への感染を阻害する、予防するまたは処置するための方法および組成物であって、細菌に曝露されたまたは細菌に感染した組織に有効量のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、抗体またはその抗原結合性断片を投与し、それによって細菌による宿主または宿主細胞への感染を阻害する、予防するまたは処置することを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法および組成物を提供する。抗体は、細菌関連ＤＮＡＢＩＩタンパク質を認識して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または抗体の誘導体、ならびにその断片、例えば、Ｆａｂ断片であり得る。複数の抗体またはその断片は、本明細書で言及される支援療法と一緒に、同時にまたは順次投与することが可能である。
本開示は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を放出する細菌による細胞への感染を阻害するまたは予防する方法を提供する。方法は、細菌に感染した組織に、有効量のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、抗体またはその抗原結合性断片を投与し、それによって細菌の感染を阻害するまたは予防することを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。ＤＮＡＢＩＩタンパク質に対する抗体のソースは、本明細書に記載されるポリペプチドを用いた宿主の能動的ワクチン接種または本明細書で開示されるＤＮＡＢＩＩタンパク質のタンパク質に対する抗血清もしくは抗体の受動移入により引き出すことが可能である。抗体は、細菌関連ＤＮＡＢＩＩタンパク質を認識して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または抗体の誘導体であり得る。複数の抗体は、本明細書で言及される支援療法と一緒に、同時にまたは順次投与することが可能である。
一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体ではない。
投与は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、培養物中の投与の場合もあり、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、細菌に感染した患者への投与による場合もある。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて実施する場合、方法を使用して、感染した対象に、有効量の抗体を投与することにより、細菌に感染した対象を処置することができる。加えて、対象が非ヒト動物である場合、方法を使用して、ヒトへの投与の前に、可能な治療または組合せ療法について調べることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施する場合、方法は、組織内の細菌による感染症を阻害または予防する小分子薬など、他の治療薬および組合せ療法についてスクリーニングするのに有用である。
ＤＮＡＢＩＩタンパク質を含む細菌感染の処置を必要とする対象で、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を含む細菌に感染している対象において、細菌感染を処置する方法であって、対象に有効量のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、抗体またはその抗原結合性断片を投与し、それによって細菌による感染を阻害するまたは予防することを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる、方法も提供される。抗体は、細菌関連ＤＮＡＢＩＩタンパク質を認識して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または抗体の誘導体であり得る。ＤＮＡＢＩＩタンパク質に対する抗体のソースは、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを用いた宿主の能動的ワクチン接種または本明細書で開示されるポリペプチドに対する抗血清もしくは抗体の受動移入により引き出すことが可能である。複数の抗体は、本明細書で言及される支援療法と一緒に、同時にまたは順次投与することが可能である。
一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体ではない。
ＤＮＡＢＩＩタンパク質を発現している細菌の感染に関連する状態の処置を必要とする対象において、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を発現している細菌の感染に関連する状態を処置する方法であって、対象に有効量のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、抗体またはその抗原結合性断片を投与し、それによって細菌の感染を阻害するまたは予防することを含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる、方法がさらに提供される。ＤＮＡＢＩＩタンパク質に対する抗体のソースは、本明細書に開示されるポリペプチドを用いた宿主の能動的ワクチン接種あるいは本明細書で開示されるＤＮＡＢＩＩポリペプチドに対する抗血清または抗体もしくはその断片の受動移入により引き出すことが可能である。抗体は、細菌関連ＤＮＡＢＩＩタンパク質を認識して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または抗体の誘導体であり得る。複数の抗体は、本明細書で言及される支援療法と一緒に、同時にまたは順次投与することが可能である。
一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体ではない。
上記の方法のうちのいずれかは、対象、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組織培養物もしくは細胞培養物に、有効量の、抗菌薬、抗原性ペプチド、またはアジュバントのうちの１つまたは複数を投与するステップをさらに含む場合もあり、代替的にそれから本質的になる場合もあり、なおさらにそれからなる場合もある。一部の態様では、対象は、非ヒト動物またはヒト患者である。
抗体、その抗原結合断片、ポリペプチド、または組成物は、任意の適切な方法により、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）投与または全身投与される、例えば、感染症またはバイオフィルムの部位に、局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、直腸に、膣に、眼に、皮下に、筋肉内に、腹腔内に、尿道に、鼻腔内に、吸入により、または経口的に投与される。
一部の態様では、対象は、小児患者であり、抗体は、小児患者用の処方物により投与される。
また、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を移出する細菌による細胞の感染症を阻害もしくは予防し、かつ／またはバイオフィルムの形成を破壊もしくは防止する、潜在的な治療薬を同定するスクリーニングも開示される。スクリーニング法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細菌に感染した組織に、作用剤を接触させるステップ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、細菌に感染した組織に、作用剤を投与するステップと、作用剤が、ＤＮＡＢＩＩタンパク質に結合するのかどうかを決定するステップとを含む、または代替的にそれから本質的になる、なおまたはさらにそれからなる。当技術分野では、結合を決定する方法が公知であり、いくつかの非限定的な例については、本明細書でも記載する。一態様では、作用剤がタンパク質に結合すれば、作用剤は、潜在的な治療薬であり、作用剤がタンパク質に結合しなければ、作用剤は、潜在的な治療薬ではない。別の態様では、感染症またはバイオフィルムが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、阻害、破壊、または防止されれば、作用剤は、潜在的な治療薬であり、感染症が、阻害または防止されなければ、作用剤は、潜在的な治療薬ではない。当技術分野では、感染症が阻害または防止されるのかどうかを決定する方法が公知であり、いくつかの非限定的な例については、本明細書でも記載するが；当技術分野では、バイオフィルムが破壊または防止されるのかどうかを決定する方法も公知であり、本明細書でもさらに開示する。潜在的な治療薬の非限定的な例は、抗体、抗体誘導体もしくはそれらの断片、ポリペプチド、または小分子の群より選択される。複数の抗体は、本明細書で言及される支持療法と共に、共時的に投与することもでき、逐次的に投与することもできる。
一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体ではない。
さらなる態様では、作用剤はタンパク質に結合し、結合は、本明細書に記載されるポリペプチドへの抗ＤＮＡＢＩＩ抗血清、例えば、本明細書に記載されるポリペプチドに向けられた抗血清の結合と比較される。
ＤＮＡＢＩＩタンパク質の、微生物ＤＮＡへの結合を阻害する、それを漸減する、またはそれと競合するための作用剤に関して想定される一般的特性のうちのいずれも同様に、細菌の感染症に関する、上記で開示した方法に適用されることを認識されたい。
投薬は、本明細書で開示される方法に従って、カプセル、錠剤、経口懸濁物、筋肉内注射用懸濁物、静脈内注入用懸濁物、局所塗布用ゲルもしくはクリーム、または関節内注射用懸濁物を使用して達成することができる。
本明細書で記載される組成物の投与量、毒性、および治療有効性は、細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順であって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定する手順により決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。ある特定の実施形態では、組成物は、高い治療指標を示す。毒性の副作用を示す化合物を使用しうるが、感染していない細胞に対する潜在的な損傷を最小限にし、これにより、副作用を軽減するために、このような化合物を患部組織部位にターゲティングする送達系を設計するように注意を払うべきである。
ヒトにおける使用のための投与量の範囲を処方するために、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを使用することができる。このような化合物の投与量は、毒性をほとんどまたは全く伴わずに、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある（ある特定の実施形態では）。投与量は、利用される剤形および活用される投与経路に応じて、この範囲内で変動しうる。方法において使用される任意の化合物について、まず細胞培養アッセイから、治療有効用量を推定することができる。用量は、細胞培養物中で決定される、ＩＣ５０（すなわち、最大半量の症状の阻害が達成される被験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方することができる。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量を、より正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
一部の実施形態では、治療効果または予防効果を達成するために十分な有効量の組成物は、投与１回当たり体重１キログラム当たり約０．０００００１ｍｇから投与１回当たり体重１キログラム当たり約１０，０００ｍｇまでの範囲である。投与量は、投与１回当たり体重１キログラム当たり約０．０００１ｍｇから投与１回当たり体重１キログラム当たり約１００ｍｇまでの範囲であることが適切である。投与は、初回用量、その後の１回または複数回の「追加」用量として施すことができる。追加用量は、初回用量の１日後、２日後、３日後、１週間後、２週間後、３週間後、１カ月後、２カ月後、３カ月後、６カ月後または１２カ月後に施すことができる。一部の実施形態では、追加用量は、前の投与に対する対象の応答を評価した後に投与される。
当業者は、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全般的健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の因子が、対象を効果的に処置するのに必要とされる投与量およびタイミングに影響を及ぼしうることを認識するであろう。さらに、対象の、治療有効量の、本明細書で記載される治療的組成物による処置は、単回の処置を含む場合もあり、処置のシリーズを含む場合もある。
キット
本明細書で説明されるｉｎ ｖｉｔｒｏ法およびｉｎ ｖｉｖｏ法を実施するのに必要な作用剤および指示を含有するキットもまた、特許請求される。したがって、本開示は、本明細書に開示される作用剤を含有し得る方法を実施するためのキットのほか、組織を回収するステップ、および／またはスクリーニングを実施するステップ、および／または結果を解析するステップ、および／または本明細書で規定される有効量の作用剤を投与するステップなど、本明細書に開示される方法を実施するための指示も提供する。これらは、単独で用いることもでき、他の適切な抗菌薬と組み合わせて用いることもできる。
例えば、キットは、上で同定されたいずれか１つまたは複数の作用剤、例えば、単離されたもしくは組換えポリペプチドまたはそのそれぞれの断片もしくは等価物；上記のポリペプチドのいずれか１つをコードする単離されたまたは組換えポリヌクレオチド；抗体またはその断片；あるいは微生物ＤＮＡへのＤＮＡＢＩＩタンパク質またはポリペプチドの結合と競合する小分子の群の作用剤、および使用のための指示を含む、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなることが可能である。キットは、アジュバント、抗原ペプチドまたは抗微生物薬のうちの１つまたは複数をさらに含むことが可能である（can further comprising）。キャリアの例は、液体キャリア、薬学的に許容されるキャリア、固相キャリア、薬学的に許容されるキャリア、薬学的に許容されるポリマー、リポソーム、ミセル、インプラント、ステント、ペースト、ゲル、歯科インプラントまたは医療用インプラントを含む。
以下の例は、本明細書で開示される実施形態を例示することを意図するものであり、これらを限定することを意図するものではない。
（実施例１）
ウサギおよびチンチラのポリクローナル抗ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよび抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ抗体の生成ならびにウサギポリクローナルＦａｂ断片の生成
図１で示したように、チンチラおよびウサギにおいてポリクローナル血清を生成するために、ＩＨＦＮＴＨＩ先端部を対象とするキメラペプチドを使用した。抗体を生成するために使用した「ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ」は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＩｈｆＡ５配列、続いてリンカー配列（ＧＰＳＬ）、続いてＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ配列（配列番号５０：
Figure 2022171777000083
 ）を有する。ＩＨＦ内を標的とした対応する構造領域は、ペプチド配列の下に矢印によって指し示したように示される（図１）。
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよびＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラに対して向けられたポリクローナル血清は、ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよびＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラのそれぞれを個々に使用して標準的技術によってチンチラおよびまたウサギにおいて調製した。使用したペプチドは以下の通りである。ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩについては、対応する配列は配列番号１２（配列番号１２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ、Ａ－３断片：ＦＬＥＥＩＲＬＳＬＥＳＧＱＤＶＫＬＳＧＦ）である。ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩについては、使用した対応する配列は配列番号１３（配列番号１３：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ、Ａ５断片：
Figure 2022171777000084
 ）であった。ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩについては、使用した対応する配列は配列番号１５（配列番号１５：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ、Ｂ２断片：ＴＬＳＡＫＥＩＥＮＭＶＫＤＩＬＥＦＩＳＱ）であった。ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩについては、使用した対応する配列は配列番号１７（配列番号１７：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ、Ｂ４断片：ＲＧＦＧＳＦＳＬＨＨＲＱＰＲＬＧＲＮＰＫ）であった。ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩについては、使用した対応する配列は配列番号５０（配列番号５０：ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ組換えポリペプチド配列：
Figure 2022171777000085
 ）であった。
特に、ウサギポリクローナル抗ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよび抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩは以下の通りに調製した。ウサギに、フロイント完全アジュバントを伴う２５０μｇのＩｈｆＡ３ＮＴＨＩペプチド、ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩペプチド、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩペプチド、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩペプチドまたはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩペプチドを注射した。フロイント不完全アジュバントを伴う２５０μｇのＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩまたはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩの２回の追加免疫を２１日間隔で施した。ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩまたはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩのＥＬＩＳＡによって決定されるように、３回目の注射の２１日後に収集した血清はＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩまたはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ反応性物質の≧４０，０００の逆数力価を有した。抗体はさらには精製しなかった。粗血清は－７０℃で保存した。
チンチラポリクローナル抗ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよび抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩは以下の通りに調製した。チンチラに、アジュバントモノホスホリルリピドＡと混合した５０μｇのＩｈｆＡ３ＮＴＨＩペプチド、ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩペプチド、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩペプチド、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩペプチドまたはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩペプチドを注射した。同じ製剤の２回の追加免疫用量を３０日間隔で投与した。最終用量の１０日後に、血液を各動物から収集し、粗血清を－７０℃で保存した。抗ＩｈｆＢ２ＮＨＴＩ抗体の使用を図３に示す。
抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩの免疫原性および機能を決定した。図２（Ａ）は、ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラペプチドを使用して生成したチンチラ血清およびウサギ血清の逆数力価を示す。チンチラ血清およびウサギ血清は以下を評価するために分析した：抗ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよび抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ。
ウサギＦａｂ断片は、ＩｇＧ富化ポリクローナルウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラおよびナイーブウサギ血清ＩｇＧをアガロース固定パパインプロテアーゼ＋システイン－ＨＣｌ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４時間消化することによって生成した。次に、断片はプロテインＡスピンカラムによって精製し、１０ｍＭリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４に対して透析し、各調製物の純度は１０％ビス－トリスＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）およびＳＹＰＲＯオレンジタンパク質ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって裏付けられた。各Ｆａｂ断片調製物の濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって吸光係数１．４を使用して決定した。
（実施例２）
チンチラ血清を使用したＮＴＨＩバイオフィルムの低減の分析
ＮＴＨＩ８６－０２８ＮＰコロニーをチョコレート寒天での一晩培養物から収集し、培地（ｓＢＨＩ）１ｍｌ当たり２μｇのβ－ＮＡＤおよびヘムを補充した脳心臓注入ブロス中に懸濁した。次に４９０ｎｍでの光学密度を０．６５に調整し、培養物をｓＢＨＩで１：６に希釈してから静置して３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。次に、培養物を新鮮なｓＢＨＩで１：２５００に希釈し、２００μｌの懸濁液を８ウェルチャンバースライドの各ウェルに分注した。次にスライドを静置して３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。１６時間後、２００μｌの新鮮なｓＢＨＩを各ウェルに添加し、スライドをさらに８時間インキュベートした。この時点で、培地を各ウェルから吸引し、処置物（treatment）（１． １：５０希釈したチンチラ血清、または２． １７１ｎＭの
ポリクローナル抗体もしくはＦａｂ断片）を添加した。バイオフィルムをさらに１６時間インキュベートした。次にバイオフィルムを洗浄し、ＦＭ１－４３ＦＸ細菌細胞膜染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶かした１６％パラホルムアルデヒド、２．５％グルタルアルデヒド、４．０％酢酸中で、４℃で一晩固定した。固定剤を吸引し、２００μｌの０．９％食塩水を各ウェルに添加してからバイオフィルムをＺｅｉｓｓ５１０Ｍｅｔａ－ｌａｓｅｒ走査共焦点顕微鏡で観察した。画像は、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎソフトウェアに蓄積し、バイオフィルムバイオマスはＣＯＭＳＴＡＴ２ソフトウェアで計算した。
チンチラ血清（ナイーブ血清、抗ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよび抗ＩｈｆＡ５－ｍＢ４ＮＴＨＩキメラ）がバイオフィルムを破壊する能力を評価した。図２（Ｂ）は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰによって形成されたバイオフィルムの、培地対照または以下の通りの種々のチンチラ血清：ナイーブ血清対照、抗ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよび抗ＩｈｆＡ５－ｍＢ４ＮＴＨＩキメラとのインキュベーションによる破壊を示す。これらの実験では、チンチラ血清の１：５０希釈を使用した。以下の結果が認められた：バイオフィルムの１６％低減が抗ＩｈｆＡ３ＮＴＨＩ血清で認められ；バイオフィルムの７０％低減が抗ＩｈｆＡ５ＮＴＨＩ血清で認められ；バイオフィルムの７８％低減が抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ血清で認められ；バイオフィルムの８４％低減が抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラ血清で認められた（図２（Ｂ））。バイオマスの低減はナイーブ血清との比較である。
（実施例３）
ウサギＦａｂを使用した中耳炎の実験
中耳の感染症（または中耳炎、ＯＭ）は、世界的に高度に蔓延した疾患であり、最も重度の形態（慢性化膿性ＯＭまたはＣＳＯＭと呼ばれる）に、世界で毎年５０００万～３億３０００万人の小児が罹患している。ＯＭの社会経済的負荷もまた大きく、費用は、米国だけで、毎年５０～６０億ドルの間である。ＯＭの優勢な細菌性病原体の３つ全てが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても、バイオフィルムを形成することが公知であり、近年、臨床医らは、ＯＭの慢性性および再発が、少なくとも部分的には、中耳腔内の細菌バイオフィルムの形成に起因することを認識するようになっている。
実際、中耳腔換気用チューブおよび遷延性耳漏を伴う小児患者に由来する耳漏固体を、微生物培養物と組み合わせたｅＤＮＡおよびＩＨＦについて標識化した結果は、バイオフィルムが、慢性耳漏において役割を果たすことを指し示す。具体的に、分析された小児耳漏試料１５例のうち、９例（６０％）が、ｅＤＮＡ（ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ ５９４にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧにより検出されるウサギ抗ＩＨＦを使用して標識化された）の格子と関連するＩＨＦの標識化について陽性の固体を含有し、７５％が、陽性の細菌培養物をもたらした。細菌の培養結果は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、ＭＲＳＡ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を裏付けた。これらのデータは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質が、他の耳疾患の中でも、中耳腔換気用チューブ後の耳漏における治療標的として用いられうることを示唆する。
ＯＭについてのチンチラモデルの１つでは、若年のチンチラに、まずウイルス性の「風邪」を施した１週間後、これらに、生菌による接種物で鼻腔内的にチャレンジした。「私の子供は風邪をひき、１週間後に耳の感染症になりました」というヒトにおける状態と同様に、チンチラもまた、チャレンジの約１週間後に、ウイルス性の上気道感染症を患う一方で、細菌性ＯＭを発症した。細菌の増加が中耳に到達すると（耳管の上行を介して、または中耳腔への直接的なチャレンジ後において）、細菌は、頑健なバイオフィルムを形成する。したがって、本出願人らは、本明細書で報告する通り、チンチラモデルを意図し、これをすでに実際に用いて、既存のバイオフィルムを速やかに消失させる結果をもたらすＩＨＦによる免疫化の防御効果を裏付けた。このモデルはまた、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体の受動送達を介する、またはＩＨＦもしくは他のＤＮＡＢＩＩファミリーメンバーに結合することが公知である小分子または他の作用剤の送達を介する療法にも有用である。
チンチラモデルを、ヒトワクチンの開発および前臨床試験に用いるため、ヒト宿主、特に、小児との有意義な免疫学的相応物を確立することが重要である。本出願人らは、ＮＴＨＩに起因するＡＯＭを伴う小児から回収された滲出物と、実験によるＮＴＨＩ誘導性ＯＭを伴うチンチラに由来する中耳液とが、ＯＭＰ Ｐ５の免疫優性領域を類似した階層的な方式で認識することを示した（例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙら（２０００年）、Ｉｎｆｅｃｔ、６８巻（４号）：２１１９～２１２８頁；Ｎｏｖｏｔｎｙら（２００７年）、９ｔｈ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｔｉｔｉｓ Ｍｅｄｉａ、Ｓｔ． Ｐｅｔｅ Ｂｅａｃｈ、Ｆｌａ；Ｎｏｖｏｔｎｙら（２００２年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０巻（２９～３０号）：３５９０～３５９７頁を参照されたい）。本出願人らはまた、実験によるＯＭを伴うチンチラ、自然ＯＭを伴う小児、およびＣＯＰＤが増悪した成人のいずれもが、ＰｉｌＡを示すペプチドを非常に類似した方式で認識することも示した（例えば、Ａｄａｍｓら（２００７年）、１０７ｔｈ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７年、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ；Ａｄａｍｓら（２００７年）、９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｔｉｔｉｓ Ｍｅｄｉａ、Ｓｔ． Ｐｅｔｅ Ｂｅａｃｈ、Ｆｌａ．を参照されたい）。したがって、実験によるＯＭを伴うチンチラと、自然疾患を有する小児とは、少なくとも２つの非類縁ＮＴＨＩタンパク質であるアドヘシンに対して免疫学的に類似して応答する。近年、この類似が最終的な試験にかけられたが、そこでは、新規の１１価のプロテインＤ－肺炎菌多糖類コンジュゲートワクチンの前臨床有効性試験を実施するのに、チンチラのＡＶ－ＮＴＨＩ重感染モデルが用いられた。チンチラにおいて得られたデータが３４％の有効性を予測する一方、小児で調べたところでは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ誘導性ＯＭに対して得られた有効性が３５．６％であり（例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙら（２００６年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻（２２号）：４８０４～１１頁；およびＰｒｙｍｕｌａら（２００６年）、Ｌａｎｃｅｔ．、３６７巻（９５１２号）：７４０～８頁を参照されたい）、それにより、ＯＭワクチン候補物質の開発および試験に対するこのモデルの関与性が強く裏付けられた。
方法：
実施例１は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩおよびＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラに対して向けられたウサギポリクローナル抗体ならびにナイーブウサギ血清ＩｇＧ由来のＦａｂ（断片抗原結合）断片の生成について説明している。図３は、１０％ビス－トリスＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）およびＳＹＰＲＯオレンジタンパク質ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって裏付けられたように、各Ｆａｂ調製物（４つの別々の調製物：ナイーブ、ＩｈｆＢ２、ｍＩｈｆＢ４およびＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラ）の純度を示す。
図３は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰによって形成されたバイオフィルムの破壊が、成体チンチラの中耳においてポリクローナルウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ、抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラおよびナイーブウサギ血清から生成したＦａｂ断片を使用して分析された方法を示す。実験は、ナイーブウサギ血清ＩｇＧＦａｂ断片、ウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂ断片、ウサギ抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂ断片およびウサギ抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂ断片を使用するコホートを含んでいた。
ウサギポリクローナル抗体から生成したＦａｂ（断片抗原結合）断片の有効性を決定するために、ＮＴＨＩ細菌をチンチラの中耳腔に注射し、バイオフィルムを形成させた。特に、中耳疾患の証拠がない成体チンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ ｌａｎｉｇｅｒａ）を調達し（Ｒａｕｓｃｈｅｒ’ｓ Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ Ｒａｎｃｈ，ＬＬＣ）、７日間休息させた後、滅菌した発熱物質を含まない食塩水で希釈した中耳骨胞（bulla）１つ当
たり１０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）の分類不能（nontypeable）Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ＃８６－０２８ＮＰで経中耳骨胞チャレンジした（ゼロ日目（０））（図３）。次に、４および５日目または４、５および６日目に、３４２ｎＭのＦａｂ断片溶液を各中耳腔に注入した（中耳骨胞１つ当たり１００μｌ；３４２ｎＭ）（図３）。４日目および５日目にＦａｂ溶液を投与されたチンチラについては、６日目または１２日目にコホート１つ当たり３匹のチンチラを屠殺した（２用量の実験）（図３）。４、５および６日目に投与したものについては、１３日目にコホート１つ当たり３匹のチンチラを屠殺した（３用量の実験）。屠殺後、チンチラをイメージングし、中耳粘膜を収集し、接着したバイオフィルムを評価し、中耳液を収集し、細菌の定量を実施し、中耳液はサイトカイン多重アッセイを使用して評価した。
中耳液を収集し、一定量を系列希釈し、相対的な浮遊細菌負荷を定量するためにチョコレート寒天に塗布した。残存液を１０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を分離し、細胞ペレットおよび液体の両画分を瞬時冷凍してから－８０℃で保存した。中耳粘膜および接着した細菌バイオマスをデジタル的にイメージングし、予め秤量した微量遠心分離管に収集し、１．０ｍｌの滅菌した０．９％塩化ナトリウム中でホモゲナイズした。ホモジネートはまた、組織／バイオマスの１ｍｇ当たりの中耳腔内に接着した細菌の集団を定量するために、以前の通り系列希釈してプレーティングした。残存する試料を瞬時冷凍してから－８０℃で保存した。培養プレートを加湿した雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートしてからＰｒｏｔｏｃｏｌ２機器（Ｓｙｎｂｉｏｓｉｓ）を介して細菌コロニーを計数した。
ビデオ耳鏡検査およびティンパノメトリー。デジタルカメラシステムに連結された０度、３インチプローブを使用するビデオ耳鏡検査（ＭｅｄＲｘ、Ｌａｒｇｏ、ＦＬ）を利用してＯＭの徴候（例えば、鼓膜炎症および／または中耳腔における液体の存在）をモニターした。ティンパノメトリーはＭＡＤＳＥＮ Ｏｔｏｆｌｅｘティンパノメーターで実施し、データはＯＴＯｓｕｉｔｅソフトウェア（Ｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ、ＩＬ）で分析した。ＯＭの全体的な徴候は、確立された０から４＋のスケールに盲検的に等級付けし、≧２．０のスコアの中耳は、中耳液が鼓膜の後に見ることができる場合、ＯＭについて陽性と見なした。鼓膜が外耳道内の閉塞により（すなわち、耳垢蓄積により）見ることができないならば、その耳は毎日の計数から除外した。確立されたプロトコールに従って、各中耳は独立していると考えられ、各コホートについて、ＯＭの中耳の百分率を計算した。
中耳腔内の残存バイオフィルムをランク付けするために、中耳画像はスクランブルされ、７人の個人が盲検的によく調べた。確立された規程を使用して、０から４までのスコアを各画像に割り当てた：０：見ることができるバイオフィルムはない、１：バイオフィルムは中耳腔の≦２５％を満たす、２：バイオフィルムは中耳腔の＞２５％から≦５０％を満たす、３：バイオフィルムは中耳腔の＞５０％から≦７５％を満たす、４：バイオフィルムは中耳腔の＞７５％から≦１００％を満たす。
このランク付け／スコア付けスケールは、以下の表２に詳述されており、各動物の中耳内に残存するバイオマスの相対量を示す。
Figure 2022171777000086
清澄化した中耳液における炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７Ａ、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３）のパネルの相対量は、ＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ ａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して製造元の指示に従って決定し、試料はＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６サイトメーターで評価した。データは、ＦｌｏＪｏ Ｖ＿１０ソフトウェアで分析した。
結果：
ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂおよびＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂが粘膜バイオフィルムを低減させる能力を決定した。図４は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後に、ウサギＩｇＧ１Ｆａｂ、ウサギＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂ、ウサギｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂまたはウサギＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂのいずれかを投与されたチンチラにおける粘膜バイオフィルムの１ミリグラム（ｍｇ）当たりのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量を示す。定量は、以下の用量／屠殺の組合せについて実施した：（１）それぞれのＦａｂの２用量を投与して１日後に屠殺した；（２）それぞれのＦａｂの２用量を投与して７日後に屠殺した；および（３）それぞれのＦａｂの３用量を投与して７日後に屠殺した。Ｆａｂの用量をＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の４および５日目（２用量）または４、５および６日目（３用量）に投与した。３つの用量／屠殺の組合せすべてにおいて、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂまたはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂの投与後は、非特異的ＩｇＧ１ＦａｂおよびＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂ対照と比較して、有意に少ないＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰが中耳粘膜に接着し、バイオフィルム内に存在した（図４）。２用量のｍＩｈｆＢ４またはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラＦａｂ断片の投与は、確立した中耳バイオフィルムの根絶において３用量と同程度であった（図４）。２治療用量の投与後７日で、キメラ免疫原に対するＦａｂ断片を施された動物は、図４に示したように、中耳からのこの生体試料内に有意に少ない細菌を有した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１および＊＊＊Ｐ≦０．００１）。
図５は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後に、ＩｇＧ１Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂ、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂまたはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂのいずれかを投与されたチンチラにおける中耳液の１ミリリットル（ｍｌ）当たりのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量を示す。定量は、以下の用量／屠殺の組合せについて実施した：（１）それぞれのＦａｂの２用量を投与して１日後に屠殺した；（２）それぞれのＦａｂの２用量を投与して７日後に屠殺した；および（３）それぞれのＦａｂの３用量を投与して７日後に屠殺した。Ｆａｂの用量をＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の４および５日目（２用量）または４、５および６日目（３用量）に投与した。ＤＮＡＢＩＩタンパク質先端部に対して向けられた抗体はバイオフィルム崩壊および棲息する細菌の放出を誘導することができるので、最終用量の投与後１日の中耳液における回収可能なＮＴＨＩの相対濃度に差を予測せず、実測しなかった。しかし、ｍＩｈｆＢ４またはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラＦａｂ断片の２または３用量の受容後１週間では、中耳液内でのＮＴＨＩの有意な低減が認められた（図５）（＊Ｐ≦０．０５および＊＊Ｐ≦０．０１）。ｍＩｈｆＢ４またはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラのいずれかに対して向けられたＦａｂ断片の投与は、Ｆａｂの最終用量の投与後少なくとも１週間治療効果を媒介し続け、データはこの投薬レジメンは適応性があり最適化できることを示唆している。
平均粘膜バイオフィルムスコアを決定し、ウサギｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂおよびウサギＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂがバイオフィルムを破壊する能力を評価した。図６は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後に、ＩｇＧ１Ｆａｂ、ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂ、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂまたはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂのいずれかを投与されたチンチラの平均粘膜バイオフィルムスコアを示す。定量は、以下の用量／屠殺の組合せについて実施した：（１）それぞれのＦａｂの２用量を投与して１日後に屠殺した；（２）それぞれのＦａｂの２用量を投与して７日後に屠殺した；および（３）それぞれのＦａｂの３用量を投与して７日後に屠殺した。Ｆａｂの用量をＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジ後の４および５日目（２用量）または４、５および６日目（３用量）に投与した。粘膜バイオフィルムスコアスケールは、中耳腔内に残存するバイオフィルムをランク付けするために使用した。確立された規程を使用して、以下の通りに０から４までのスコアを各画像に割り当てた：ゼロ（０）：見ることができるバイオフィルムはない；１：バイオフィルムは中耳腔の＞０から≦２５％を満たす；２：バイオフィルムは中耳腔の＞２５％から≦５０％を満たす；３：バイオフィルムは中耳腔の＞５０％から≦７５％を満たす；および４：バイオフィルムは中耳腔の＞７５％から１００％を満たす（図６）。図６に示したように、有意に低い平均粘膜バイオマススコアは、ＩｇＧ１ＦａｂまたはＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂ対照を投与されたチンチラと比較して、ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂおよびＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂで処置されたチンチラにおいて認められた（＊Ｐ≦０．０５および＊＊Ｐ≦０．０１）。ＤＮＡＢＩＩタンパク質先端部に対して向けられた抗体はバイオフィルム崩壊を誘導するので、２用量の受容１日後にｍＩｈｆＢ４またはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラＦａｂ断片を投与された動物の中耳において、粘膜バイオフィルムの有意な減少が認められた（図６）。この減少は、ｍＩｈｆＢ４またはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラＦａｂ断片の２または３用量の受容後１週間維持された。ｍＩｈｆＢ４またはＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラのいずれかに対して向けられたＦａｂ断片の投与は、最終用量の受容後少なくとも１週間治療効果を媒介し続け、データはこの投薬レジメンは適応性があり最適化できることを示唆している。
炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインは、炎症に対するｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂおよびＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラＦａｂの効果を評価するために清澄化した中耳液において測定した。図７は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰチャレンジおよびバイオフィルム形成後に、ナイーブウサギＩｇＧＦａｂ、ウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＩｇＧＦａｂ、ウサギ抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂまたはウサギ抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＩｇＧＦａｂのいずれかを投与されたチンチラにおける清澄化した中耳液における炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのパネルの相対量を示す。液体は、２用量のＦａｂ断片を投与され、２回目の用量の受容後１日に屠殺されたチンチラから収集した。測定された炎症誘発性サイトカインには、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７Ａ、ＴＮＦおよびＩＦＮγが含まれた。測定された抗炎症性サイトカインには、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３が含まれた。より多い相対量の炎症誘発性サイトカインは、ウサギ抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＩｇＧＦａｂまたはウサギ抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＩｇＧＦａｂのいずれかで処置された中耳と比較して、ウサギ抗ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩＦａｂまたは非特異的ウサギＩｇＧＦａｂで処置された中耳において認められた（図７に示した）。最大量の抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３）が、ウサギ抗ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩＦａｂまたはウサギ抗ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩキメラＦａｂで処置された中耳において認められた（図７に示した）。
インタクトなウサギポリクローナルＩｇＧに対するウサギＩｇＧＦａｂポリクローナル断片の有効性の概要を以下の表３に示す。
Figure 2022171777000087
Figure 2022171777000088
表３は、種々のウサギポリクローナル血清のそれぞれを生成するために使用した標的（ＩｈｆＢ２、ｍＩｈｆＢ４およびＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラ）を示し、これらの標的のそれぞれについてのＩｇＧおよびＦａｂ断片のデータを提供する。示した実験はすべて、高度に制御された治療研究として実施された。表は、上記の実施例２および３で提示した実験に関する定量の概要を示しかつ提供し、「Monoclonal antibodies against DNA-binding tips of DNABII proteins disrupt biofilms in vitro and induce bacterial clearance in vivo.」（２０１６年）EBioMedicine.８月；１０巻：３
３～４４頁において発表されたデータ（「ＰｏＭｏ」研究コード）も提示する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ対ＮＴＨＩバイオフィルムについて、使用した方法は上記の実施例２において記載したとおりであった。示したような抗体またはＦａｂ断片の正確な濃度を、予め形成されたバイオフィルムに適用した。特に、使用した濃度は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析で使用した全抗体および断片について１７１ｎＭであった。ｉｎ ｖｉｖｏ研究について、使用した方法は上記の実施例３において記載したとおりであった。バイオフィルム形成を開始するために各動物の耳に送達された正確な接種物（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）８６－０２８ＮＰ）を制御し、耳の注入は示したような抗体または断片の特定量で実施した。特に、使用した濃度は、ｉｎ ｖｉｖｏ分析で使用した全抗体および断片について３４２．５ｎＭであった。
ウサギ抗体およびＦａｂ断片を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏバイオフィルム分析では、ウサギポリクローナルｍＩｈｆＢ４ＩｇＧおよびウサギポリクローナルＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラＩｇＧは、それぞれバイオマスの７５％および８２％の低減を示した。ウサギポリクローナルｍＩｈｆＢ４ＦａｂおよびウサギポリクローナルＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラＦａｂは、それぞれバイオマスの７８％および８７％の低減を示した。ＩｈｆＢ２ＩｇＧ（対照）およびＩｈｆＢ２Ｆａｂ（対照）は、それぞれバイオマスの０％および）％の低減を示した。ＮＴＨＩ誘発中耳炎のｉｎ ｖｉｖｏチンチラモデルについて、ウサギポリクローナルｍＩｈｆＢ４ＦａｂおよびウサギポリクローナルＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラＦａｂは、それぞれＣＦＵ ＮＴＨＩ／ｍｇ中耳粘膜バイオフィルムの５．５－ｌｏｇ１０および５．２－ｌｏｇ１０の低減を示し、一方、ウサギポリクローナルＩｈｆＢ２Ｆａｂ（対照）はＣＦＵ ＮＴＨＩ／ｍｇ中耳粘膜バイオフィルムの０．４－ｌｏｇ１０の低減を示した。これらの測定は、最終用量の受容１日後に実施し、それぞれのナイーブ血清との比較である。ウサギポリクローナルｍＩｈｆＢ４ＦａｂおよびウサギポリクローナルＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４キメラＦａｂは、それぞれ１．０および０．９の中耳バイオフィルムスコアを示し、一方、ウサギポリクローナルＩｈｆＢ２Ｆａｂ（対照）は３．７の中耳バイオフィルムスコアを示した。表３に提供した「ＰｏＭｏ」ｉｎ ｖｉｖｏ研究コードは、「Monoclonal antibodies against DNA-binding tips of DNABII proteins disrupt biofilms in vitro and induce bacterial clearance in vivo.」（２０１６年）EBioMedicine.８月；１０巻：３３～４４頁において発表
されたデータを指す。
（実施例４）
口腔疾患の処置
歯槽骨および歯肉を破壊する歯周炎およびインプラント周囲炎などの炎症性疾患の病因には、多数の口内細菌（例えば、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が関与している。これらの細菌の病因についての探索は、有効な動物モデルの欠如により妨げられている。特定の細菌の病原性を探索することの難題の１つは、外因性細菌が、動物の口腔内に導入された場合のバイオフィルムを確立することの困難である。歯周炎の動物モデルは開発されているが、接種された動物の口腔から培養可能な細菌が回収されることはまれである。特定の細菌の病原性を評価し得る有効な動物モデルを開発することは、それらの病原性機構を解明することに大きな一助となるであろう。
機械加工したチタン製の歯科インプラント（１．２×４．５ｍｍ）の表面を、Ａ１０３によるグリットブラスト（１００μｍ）、およびＨＣｌによるエッチング（ｐＨ７．８、８０℃で２０分間にわたる）を介して修飾することができる。機械加工およびナノテクスチャー処理したインプラントを、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（Ａａ）のＤ７Ｓ臨床株を接種したＴＳＢ培地中、３７℃で１～３日間にわたりインキュベートする。インプラント上の細菌バイオフィルムは、ＳＥＭにより解析するほか、共焦点レーザー走査顕微鏡により解析した後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）で染色する。Ａａバイオフィルムが確立されたインプラントおよびＡａバイオフィルムが確立されていないインプラントを、雌ラット歯槽骨の上顎の小臼歯領域と切歯領域との間に経粘膜的に設置する。ｉｎ ｖｉｖｏで設置されたインプラントにおけるＡａバイオフィルムの存在を検出するため、２日後に唾液およびインプラントの口腔表面から細菌試料を回収する。Ａａは培養、ならびにＰＣＲ解析によって検出することができる。インプラント周辺の骨および粘膜組織のＭｉｃｒｏ－ＣＴおよび組織学解析は、種々の時点、例えば、植え込みの６週間後に実施することができる。本明細書で開示した方法および組成物は、これらのバイオフィルムを低減および／または消失させるための治療的戦略および予防的戦略の両方を開発することを意図する。感染した対照と比較した発赤、炎症および出血の減少は、バイオフィルム低減および／または消失を示す。さらに、感染した対照と比較して炎症または炎症誘発性組織像の低減または欠如およびインプラントスクリューのトルク除去力の維持は、バイオフィルム低減および／または消失を示す。
（実施例５）
ライム病
この実験は、ライム病を処置する記載されるとおりの作用剤についての前臨床試験のためのマウスモデルを提供する。Ｄｒｅｓｓｅｒら、Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、５巻（１２号）、ｅ１０００６８０号、Ｅｐｕｂ、２００９年１２月４日を参照されたい。ライム病は、スピロヘータである微生物Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉにより引き起こされる。Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉは、Ｉｘｏｄｅｓ種のダニの咬刺を介して伝染し、その後、血流を介して他の組織および器官へと拡散する。
この動物モデルでは、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに、背側皮下注射および腹腔内注射を介して、または静脈内注射を介してスピロヘータを注射する。感染の約７日後に、組織および器官における微生物負荷を評価し、病態を評価するために、血液検体および生検検体を回収する。本明細書に開示される方法および組成物は、チャレンジの後に形成され、疾患の病因および慢性性の両方に寄与すると考えられる、結果として生じるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのバイオフィルムを低減させ、かつ／または消失させるための治療的戦略ならびに予防的戦略の両方を開発することを意図する。
（実施例６）
嚢胞性線維症
この実験は、嚢胞性線維症を処置する作用剤についての前臨床試験のためのブタモデルを提供する。Ｓｔｏｌｔｚら（２０１０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２巻（２９号）：２９～３１頁を参照されたい。嚢胞性線維症とは、ＣＦ膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲと呼ばれる）のアニオンチャネルをコードする遺伝子の変異に起因する常染色体劣性疾患である。このモデルでは、「ＣＦＴＲ」と呼ばれる遺伝子内に欠損を保有するように特異的に交配され、ＣＦブタと呼ばれているブタが、複数の細菌種による下気道感染症を包含する、ＣＦ肺疾患の顕著な特徴を自発的に発生させる。ブタを本明細書に記載のとおりの作用剤で免疫化して、疾患および関連する病態の徴候の改善を評価するために、１）これらのＣＦブタを、ポリペプチドまたは他の免疫原性作用剤で免疫化し、これにより、肺における細菌性バイオフィルムを根絶する抗体の形成を誘導し得（能動的な免疫化の後で、ＩＨＦに対する抗体により、チンチラの中耳内に存在するバイオフィルムを根絶した方式と同様に）、これらの動物の肺に、噴霧化を介して作用剤を送達し得る。
（実施例７）
結核
本出願人らはまた、結核（ＴＢ）の前臨床モデルも提供する。Ｏｒｄｗａｙら（２０１０年）、Ａｎｔｉ． Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、５４巻：１８２０頁を参照されたい。微生物であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、広がりつつある世界的な流行の原因である。最新の数字は、毎年約８００万例の新たなＴＢ症例が認められ、毎年約２７０万例がＴＢにより死亡していることを示唆する。ＨＩＶを伴う個体の共感染症としてのこの微生物の役割（ＨＩＶに感染する約４５００万例のうち、約１／３が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにも共感染していると推定されている）に加えて、単離菌が、複数の薬物に対して高度に耐性となっており、四半世紀超にわたり新規のＴＢ薬が導入されていないことも、特に、問題である。この動物モデルでは、ＳＰＦモルモットを、障壁コロニー内に維持し、約２０ｃｆｕのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株であるＥｒｄｍａｎ Ｋ０１桿菌を、それらの肺内に送達するエアゾール化スプレーを介して感染させる。チャレンジの２５、５０、７５、１００、１２５、および１５０日後において、細菌負荷を決定し、組織病理学的評価のために組織を回収すると共に動物を屠殺する。ＴＢの古典的な徴候を発症しないマウスと異なり、このようにしてチャレンジされたモルモットは、ヒト疾患の特徴である、中央部に壊死を伴う、十分に組織された肉芽腫を発症する。さらに、ヒトと同様に、モルモットは、原発病変複合体の一部として、排出リンパ節の化膿性肉芽腫性で壊死性の重度のリンパ節炎を発症する。このモデルの使用は、チャレンジの後にこれらの動物の肺内で形成され、疾患の病因および慢性性の両方に寄与すると考えられる、結果として生じるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのバイオフィルムを低減させ、かつ／または消失させるための治療的戦略ならびに予防的戦略を確認および同定するための前臨床スクリーニングを提供する。
（実施例８）
デバイスの適用
カテーテル／留置デバイスによるバイオフィルム感染症については、複数の動物モデルが公知である。Ｏｔｔｏ（２００９年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７巻：５５５頁を参照されたい。通常の皮膚微生物叢であると考えられることが典型的であるが、微生物であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、多くの研究者が重要な日和見病原体であるとみなす微生物となっており、院内感染の原因作用物質の第１にランクされている。第１に、この細菌は、デバイス挿入時にこの一般的な皮膚コロニー形成菌により汚染される、留置医療デバイス上で発生する感染症の大半の原因である。致死性ではないことが典型的であるが、これらのバイオフィルム感染症の処置と関連する困難により、これらのバイオフィルム感染症は、それらの頻度と組み合わさって、重篤な公衆衛生負荷となっている。米国において、血管カテーテルと関連する血流感染症の処置と関連する費用は、今日、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに起因するものだけで、毎年２０億ドルに上る。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに加えて、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓおよびＳ．ａｕｒｅｕｓもまた、留置医療デバイスにおいて見いだされる汚染である。カテーテルに関連するＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染症については、ウサギ、マウス、モルモット、およびラットを含めて複数の動物モデルが存在し、これらの全てが、病因の分子的機構を研究するのに用いられ、予防および／または治療薬の研究に役立っている。ラットの頸静脈カテーテルは、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、およびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓによるバイオフィルムの形成に干渉する療法を評価するのに用いられている。バイオフィルムの低減は、３つの方法：（ｉ）カテーテルを超音波処理し、ＣＦＵを計算する方法、（ｉｉ）カテーテルをスライスする、または単純にプレート上に置き、スコア付けする方法、（ｉｉｉ）バイオフィルムをクリスタルバイオレットまたは別の色素で染色し、溶出させ、ＣＦＵの代用物としてのＯＤを測定する方法で測定されることが多い。
（実施例９）
ワクチンの投与
本明細書で説明される方法を用いて、ヒトおよび動物において免疫応答を誘発することができる。アルミニウム塩およびリポソームなどであるがそれらに限定されないアジュバントの存在下で、免疫原性組成物を、ヒト対象および動物対象に投与することができる。当業者はまた、任意の数の薬学的に許容されるアジュバントも用い得ることを理解するであろう。免疫原性組成物は、筋肉内に、皮下的に、鼻腔内に、または他の任意の適切な経路を介して、ヒト対象または動物対象に投与することができる。免疫原性組成物は、選択された投与方式と符合する形で調製することができる。免疫原性組成物は、ポリペプチド、核酸、またはそれらの組合せの形態をとることが可能であり、全長抗原を含む場合もあり、部分的な抗原を含む場合もある。それに加えて、またはその代わりに、免疫原性組成物は、特定の抗原でパルスした抗原提示細胞（ＡＰＣ）の形態をとる場合もあり、特定の抗原をコードする１種または複数腫のポリヌクレオチドでトランスフェクトしたＡＰＣの形態をとる場合もある。投与は、免疫原性組成物の単回用量を含む場合もあり、初回投与の後、１回または複数回の追加抗原投与量が続く場合もある。追加抗原投与量は、初回用量の１日後、２日後、３日後、１週間後、２週間後、３週間後、１カ月後、２カ月後、３カ月後、６カ月後、もしくは１２カ月後、または他の任意の時点において施すことができる。追加抗原投与量は、対象の抗体力価を評価した後で投与することもできる。
（実施例１０）
受動免疫
本明細書で説明される方法を用いて、非免疫対象に受動免疫を付与することができる。所与の抗原に対する受動免疫は、特定の抗原を特異的に認識する、またはそれに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片の移入を介して付与される。抗体のドナーおよびレシピエントは、ヒト対象の場合もあり、非ヒト対象の場合もある。それに加えて、またはその代わりに、抗体組成物は、特定の抗原を特異的に認識する、またはそれに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片をコードする、単離されたかまたは組換え型のポリヌクレオチドを含み得る。
受動免疫は、免疫原性組成物の投与がレシピエント対象に対して危険性をもたらす場合、レシピエント対象が免疫無防備状態である場合、またはレシピエント対象が即時的な免疫を必要とする場合に付与することができる。免疫原性組成物は、選択された投与方式と符合する形で調製することができる。組成物は、全抗体、抗原結合性断片、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて産生される抗体、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて産生される抗体、精製された抗体もしくは部分的に精製された抗体、または全血清を含み得る。投与は、抗体組成物の単回用量を含む場合もあり、初回投与の後、１回または複数回の追加抗原投与量が続く場合もある。追加抗原投与量は、初回用量の１日後、２日後、３日後、１週間後、２週間後、３週間後、１カ月後、２カ月後、３カ月後、６カ月後、もしくは１２カ月後、または他の任意の時点において施すことができる。追加抗原投与量は、対象の抗体力価を評価した後で投与することもできる。
（実施例１１）
ＩＨＦＮＴＨＩＦａｂ断片＋ＨＭＧＢ１－Ｃ４５Ｓの相乗的治療有効性
チンチラは、０日目に１０００ＣＦＵのＮＴＨｉ株８６－０２８ＮＰで経中耳骨胞注射によってチャレンジした。４日目に、チンチラを図８Ａで示した製剤で処置した。５日目に、チンチラのサブセットを同じ製剤で再度処置した。チンチラは最終処置の１日後に安楽死させ、中耳のバイオフィルムをスコア付けし（左）、中耳粘膜中のＣＦＵを定量した（右）。ＨＭＧＢ１－Ｃ４５Ｓおよび尾部に向けられたＦａｂの組合せはＨＭＧＢ１－Ｃ４５Ｓ処置単独と等しい有効性を示し、一方、ＤＮＡ結合性先端部に向けられたＦａｂおよびＨＭＧＢ１－Ｃ４５Ｓの組合せは、どちらの単独療法と比較しても有効性の増加を示した。（図８Ｂおよび８Ｃを参照のこと）。
等価物
別段に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書において例示的に説明された発明は、本明細書で具体的に開示されていない、１つまたは複数の任意の要素、１つまたは複数の任意の限定が存在しない場合にも、適切に実施することができる。したがって、例えば、「～を含む」、「～を包含する」、「～を含有する」などの用語は、外延的に、かつ限定なしに読まれるものとする。加えて、本明細書で用いられる用語および表現は、説明を目的として用いられるものであり、限定を目的として用いられるものではなく、示され、かつ、説明される特徴またはその部分の任意の等価物を除外する、このような用語および表現の使用を意図するものではなく、本願発明の範囲内にある多様な改変が可能であると認識される。
したがって、本明細書で提供される材料、方法および例は、好ましい実施形態を表しており、例示的なものであり、本発明の範囲に対する限定として意図されるものではないことを理解されたい。
本明細書では、本発明を広範かつ一般的に説明してきた。一般的な開示の範囲内に収まる、より狭い範囲内にある種類、および亜属の群分けのそれぞれもまた、本発明の一部を形成する。これは、除外される材料が、本明細書で具体的に列挙されているかどうかにかかわらず、属から任意の対象物を除外する条件または否定的限定を伴う本発明の一般的な説明を包含する。
加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群との関係で説明される場合、当業者は、本発明がまた、それにより、マーカッシュ群の任意の個別のメンバーまたはマーカッシュ群のメンバーの亜群との関係でも説明され得ることを認識するであろう。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それぞれが参照により個別に組み込まれるのと同程度に、参照によりそれらの全体において明示的に組み込まれる。齟齬が生じた場合は、定義を含め、本明細書に従う。
その他の実施形態を以下の特許請求の範囲内に記載する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ＤＮＡＢＩＩポリペプチドの２つもしくはそれよりも多い単離された立体構造先端ドメインまたは該立体構造先端ドメインのうちの１つもしくは複数の断片もしくは生物学的等価物を含む組換えポリペプチド。
（項目２）
１つまたは複数のリンカーポリペプチドをさらに含む、項目１に記載の組換えポリペプチド。
（項目３）
前記ポリペプチドが２つの立体構造先端ドメインを含む、項目１または２に記載の組換えポリペプチド。
（項目４）
前記ポリペプチドが３つの立体構造先端ドメインを含む、項目１または２に記載の組換えポリペプチド。
（項目５）
前記リンカーポリペプチドが２つまたはそれよりも多いアミノ酸を含む、項目２から４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
（項目６）
前記立体構造先端ドメインが線形または分岐形ポリペプチドを含む、項目１から５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
（項目７）
検出可能な標識および／または精製標識をさらに含む、項目１から６のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
（項目８）
項目１から７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド。
（項目９）
１つまたは複数の調節エレメントをさらに含む、項目８に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１０）
検出可能な標識および／または精製標識をさらに含む、項目７または８に記載の組換えポリヌクレオチド。
（項目１１）
必要に応じて調節エレメントに作動可能に連結されている項目８から１０のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目１２）
ａ．項目１から７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド；
ｂ．項目８から１０のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド；および／または
ｃ．項目１１に記載のベクター
のうちの１つまたは複数を含む単離された宿主細胞。
（項目１３）
項目１から７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドに結合する抗体または該抗体の抗原結合性断片。
（項目１４）
ＤＮＡＢＩＩポリペプチドに結合する項目１３に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目１５）
バイオフィルムの形成を予防し、またはバイオフィルムを破壊する、項目１３または１４に記載の抗体。
（項目１６）
モノクローナル抗体、単離されたポリクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または霊長類化抗体の群から選択される、項目１３から１５のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１７）
単離されたポリクローナル抗体が単離された哺乳動物ポリクローナル抗体である、項目１３から１５のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１８）
前記単離された哺乳動物ポリクローナル抗体が、ウサギポリクローナル抗体、マウスポリクローナル抗体、ヒツジポリクローナル抗体、イヌポリクローナル抗体、またはヒトポリクローナル抗体の群から選択される、項目１７に記載の単離されたポリクローナル抗体。
（項目１９）
前記抗原結合性断片が、Ｆｖ抗体断片またはＦａｂ抗体断片から選択される、項目１３から１８のいずれか一項に記載の抗体断片。
（項目２０）
前記抗体または前記抗原結合性断片が、細菌種にまたがって保存されているＤＮＡＢＩＩタンパク質上のエピトープに結合する；および／または必要に応じて、該抗体または該抗原結合性断片が、グラム陽性種とグラム陰性種の両方を含む少なくとも２つの細菌種由来のバイオフィルムを予防するまたは破壊する、項目１３から１８のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
（項目２１）
ＤＮＡＢＩＩタンパク質が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡＢＩＩまたはその断片であり、必要に応じて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡＢＩＩの該断片が、ベータヘアピンまたはそのそれぞれの生物学的等価物を含む、項目１２から１９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目２２）
前記少なくとも２つの細菌種が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａから選択される、項目２０に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目２３）
検出可能な標識および／または精製標識をさらに含む、項目１３から２２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目２４）
項目１３から２３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
（項目２５）
検出可能な標識および／または精製標識をさらに含む、項目２４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６）
１つまたは複数の調節エレメントをさらに含む、項目２４および２５に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目２７）
ａ．項目１から７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド；
ｂ．項目８から１０、２４および２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；ならびに／または
ｃ．項目１１もしくは２６に記載のベクター；
のうちの１つまたは複数を含む単離された宿主細胞。
（項目２８）
キャリアならびに
ａ．項目１から７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド；
ｂ．項目８から１０、２４および２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；
ｃ．項目１１もしくは２６に記載のベクター；
ｄ．項目１３から２３のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性断片；
ならびに／または
ｅ．項目２７に記載の宿主細胞
のうちの１つまたは複数を含む組成物。
（項目２９）
項目１から７のいずれか一項に記載の２つまたはそれよりも多い異なる組換えポリペプチドを含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
保存剤および／または安定化剤をさらに含む、項目２８または２９に記載の組成物。
（項目３１）
有効量の項目１から７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドならびに薬学的に許容されるキャリアおよび、必要に応じて、保存剤および／または安定化剤、さらに必要に応じて、少なくとも１つの抗生物質または追加の活性成分を含む、ワクチン組成物。
（項目３２）
有効量の項目１から７のいずれか一項に記載の２つまたはそれよりも多い異なる組換えポリペプチドならびに薬学的に許容されるキャリアおよび、必要に応じて、保存剤および／または安定化剤、さらに必要に応じて、少なくとも１つの抗生物質または追加の活性成分を含む、ワクチン組成物。
（項目３３）
アジュバントをさらに含む、項目３１または３２に記載のワクチン組成物。
（項目３４）
前記組成物が小児投与のために製剤化される、項目３０から３３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
（項目３５）
項目１３から２３のいずれか一項に記載の２つまたはそれよりも多い抗原結合性断片を含む組成物であって、該２つまたはそれよりも多い抗原結合性断片が互いに異なっている、組成物。
（項目３６）
キャリア、必要に応じて、薬学的に許容されるキャリアおよび、必要に応じて、少なくとも１つの抗生物質または追加の活性成分をさらに含む、項目３５に記載の組成物。
（項目３７）
保存剤および／または安定化剤、ならびに必要に応じて、少なくとも１つの抗生物質または追加の活性成分をさらに含む、項目３５または３６に記載の組成物。
（項目３８）
産業プロセスに関連するバイオフィルムの形成を予防するまたはこれを破壊する方法であって、バイオフィルムに感受性であるまたはバイオフィルムを含有する表面を、該バイオフィルムを有効量の、項目１から７および１３から２３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド、抗体、および／または抗原結合性断片のうちの１つまたは複数と接触させることにより処置することを含む、方法。
（項目３９）
抗体、抗原結合性断片、抗体断片から選択される組換えポリヌクレオチドを調製する方法であって、項目１２または２７のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含み、該宿主細胞が必要に応じて哺乳動物細胞である、方法。
（項目４０）
ＩＨＦタンパク質に免疫反応性である抗体を入手するまたはＩＨＦタンパク質に免疫反応性である抗体を分泌するＢ細胞を生成する方法であって、対象に項目１から７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドを投与し、該対象から抗体を回収するまたはＢ細胞を回収することを含む、方法。
（項目４１）
ＩＨＦタンパク質に対して高親和性を有する抗体の分泌について前記対象から回収した前記Ｂ細胞をスクリーニングし、このようにしてＩＨＦに免疫反応性である抗体を分泌するＢ細胞を同定し；必要に応じて、該細胞から該抗体をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離することをさらに含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
バイオフィルムの破壊またはこれの形成の予防を必要とする対象においてバイオフィルムを破壊するまたはこれの形成を予防する方法であって、有効量の、項目１から７および１３から２３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド、抗体、および／または抗原結合性断片のうちの１つまたは複数を該対象に投与することを含む、方法。
（項目４３）
バイオフィルムの破壊またはこれの形成の予防を必要とする対象においてバイオフィルムを破壊するまたはこれの形成を予防する方法であって、有効量の、項目３１から３７のいずれか一項に記載の組成物のうちの１つまたは複数を該対象に投与することを含む、方法。
（項目４４）
バイオフィルムに関連する状態の処置を必要とする対象においてバイオフィルムに関連する状態を処置する方法であって、有効量の、項目１から７および１３から２３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド、抗体、および／または抗原結合性断片のうちの１つまたは複数を該対象に投与することを含む、方法。
（項目４５）
バイオフィルムに関連する状態の処置を必要とする対象においてバイオフィルムに関連する状態を処置する方法であって、有効量の、項目３１から３７のいずれか一項に記載の組成物のうちの１つまたは複数を該対象に投与することを含む、方法。
（項目４６）
前記組成物、前記組換えポリペプチド、前記抗体、および／または前記抗原結合性断片の投与に先立って、前記対象においてバイオフィルムの存在を検出することをさらに含む、項目４４または４５に記載の方法。
（項目４７）
前記検出することが、前記バイオフィルムを含有すると疑われる患者から単離した試料を、該バイオフィルムの構成成分を認識して結合する抗体と接触させ、該試料中の該バイオフィルムと該抗体の間で形成されるいかなる複合体でも検出することを含む方法による、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記状態が、静脈性潰瘍および糖尿病性足部潰瘍、耳感染症、副鼻腔感染症、尿路感染症、肺感染症、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、カテーテル関連感染症、植え込まれたプロテーゼに関連する感染症、ならびに歯周病を含む、慢性非治癒創傷からなる群から選択される、項目４４または４５に記載の方法。
（項目４９）
項目１から７および１３から２３のいずれかに記載の組成物、組換えポリペプチド、単離された抗体、および／または抗原結合性断片のうちの１つまたは複数で被覆された非生理的表面であって、必要に応じて、該表面が産業環境にある、非生理的表面。
（項目５０）
バイオフィルムを破壊するのに有効な抗血清を入手する方法であって、対象を項目１から７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドで免疫し、該対象から抗血清を回収し、必要に応じて、該対象からポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を単離することを含む、方法。
（項目５１）
対象においてバイオフィルムを処置するおよび／もしくは破壊するまたはバイオフィルム関連状態を処置する方法であって、該対象に有効量の項目５０に記載の前記抗血清を投与することを含む、方法。
（項目５２）
抗炎症性サイトカイン応答を誘導する方法であって、項目１から７および１３から２３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド、抗体、および／または抗原結合性断片のうちの１つまたは複数を対象に投与することを含む、方法。
（項目５３）
前記抗炎症性サイトカイン応答が、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、またはＩＬ－１３の産生を誘導するまたは増強することのうちの１つまたは複数を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
投与に先立ってまたはこれに続いて抗炎症性サイトカインのレベルについてアッセイすることをさらに含む、項目５１または５３に記載の方法。
（項目５５）
前記対象が、静脈性潰瘍および糖尿病性足部潰瘍、耳感染症、副鼻腔感染症、尿路感染症、肺感染症、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、カテーテル関連感染症、植え込まれたプロテーゼに伴う感染症、ならびに歯周病を含む、慢性非治癒創傷の群の状態を患っている、項目５２から５４のいずれか一項に記載の方法。

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  1. 明細書に記載の発明。
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