JP2022540530A

JP2022540530A - 安定化されたｃｒｉｓｐｒ複合体

Info

Publication number: JP2022540530A
Application number: JP2021543279A
Authority: JP
Inventors: トラヴィスモーレス，; ジャレドカールソン－スティーヴァーマー，; サヒルジョシ，; リードケルソ，; アナスタシアカディナ，; ジョンアンドリューザセカンドウォーカー，
Original assignee: シンテゴコーポレイション
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2020-07-17
Publication date: 2022-09-16
Also published as: GB2603223A; EP3999639A1; KR20220034717A; US12139707B2; AU2020318916A1; US20220056436A1; CA3127684A1; GB202110535D0; US20250011768A1; EP3999639A4; WO2021016135A1; CN113677793A

Abstract

共有結合してＣＲＩＳＰＲ複合体になるように構成されたポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が本発明で提供される。ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性をモジュレートするようにさらに修飾することができる。ポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の修飾を使用して、標的結合および／または切断の有効性を改善することができる。本発明は例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）内のヌクレオチドでＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に架橋した前記ｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、前記ｇＲＮＡが、標的結合性領域およびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域を含み、前記ヌクレオチドが、前記ｇＲＮＡの標的結合性領域の外側に存在する、ＣＲＩＳＰＲ複合体、を提供する。

Description

相互参照
本出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年７月１９日出願の米国仮特許出願第６２／８７６，２０４号、２０１９年７月１９日出願の米国仮特許出願第６２／８７６，１７７号、２０１９年１１月２２日出願の米国仮特許出願第６２／９３９，５５４号、２０１９年１１月２２日出願の米国仮特許出願第６２／９３９，５５３号、２０２０年１月２５日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／１５１２７号および２０２０年４月１５日出願の米国仮特許出願第６３／０１０，４６５号の優先権を主張するものである。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを種々の医療の場、研究の場、および他の診査の場において使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、多数の異なる生物体において標的部位における切断（ｂｒｅａｋ）を生じさせ、その後、その遺伝子座に突然変異を導入するための遺伝子編集ツールとして使用することができる。遺伝子編集プロセスには２つの主要な構成成分：エンドヌクレアーゼ様Ｃａｓ酵素、および特定のＤＮＡ標的核酸配列を認識するための低分子ＲＮＡ分子が必要であり得る。あらゆるＤＮＡ標的に対するヌクレアーゼ酵素を工学的に作製する代わりに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ酵素を異なる核酸、例えばＤＮＡの標的部位に動員するためにカスタマイズされた低分子ＲＮＡ分子に依拠し得る。Ｃａｓ酵素の例としては、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために使用される合成ガイドＲＮＡ、例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ酵素と複合体を形成していない場合には、分解を受けさせることができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために使用される合成ガイドＲＮＡ、例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、現在利用可能なｓｇＲＮＡ／Ｃａｓヌクレアーゼ複合体の適用を限定する可能性がある免疫応答を誘導する可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ複合体はｉｎｖｉｖｏにおいて部分的にまたは完全に解離し得、それにより、効率が低下し、場合によってオフターゲット切断事象が引き起こされる。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、不安定性であるので、多くの場合、プラスミドにコードされた状態で送達され、これは、コードされるタンパク質およびガイド配列が産生される標的細胞の転写に依拠する。ＣＲＩＳＰＲＣａｓ酵素とガイドＲＮＡ分子を厳密な比で送達することが必要とされており、これは、純粋な試薬を制御された投薬レジメンで送達することなど、あらゆる研究の状況で一貫している。さらに、例えば、調整可能な活性を有する１つまたは複数の外因性ＣＲＩＳＰＲ複合体の厳密な投薬が必要な種々の設定における使用のための、安定性が増強されたＣＲＩＳＰＲ複合体が必要とされている。

単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内の非天然ヌクレオチドでＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に架橋したｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、ｓｇＲＮＡが、ｃｒＲＮＡ領域とｔｒａｃｒＲＮＡ領域とを含み、非天然ヌクレオチドが、ｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の外側に存在する、ＣＲＩＳＰＲ複合体が本明細書に開示される。非天然ヌクレオチドは、ウラシルを含み得る。非天然ヌクレオチドはｓｇＲＮＡのヌクレオチド４９位に存在し得、ここで、ヌクレオチド１位はｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’に連続的に番号が付されている。非天然ヌクレオチドは、糖の修飾を含み得る。非天然ヌクレオチドは、塩基の修飾を含み得る。非天然ヌクレオチドは、マレイミドを含み得る。マレイミドは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインと共有結合により連結していてよい。非天然ヌクレオチドは、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰ、または８－Ｎ（３）ＡＭＰを含み得る。

一部の実施形態では、非天然ヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のステムループ内に存在し得る。ステムループの構造は、非天然ヌクレオチドを欠くｓｇＲＮＡのステムループの構造と比べて維持され得る。非天然ヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のバルジ内に存在し得る。バルジの構造は、非天然ヌクレオチドを欠くｓｇＲＮＡのバルジの構造と比べて維持され得る。非天然ヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のステムループ間に存在し得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ヌクレアーゼ活性を含み得る。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲットヌクレアーゼ活性は、架橋していないＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とｓｇＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲットヌクレアーゼ活性と等しいまたはそれよりも低い。非天然ヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインに対して２０オングストローム以内に存在し得る。一部の実施形態では、非天然ヌクレオチドは、４－チオウリジンまたは修飾アデノシンではない場合がある。

単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のヌクレオチド４９位のヌクレオチドでＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に架橋したｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、ヌクレオチド１位が、ｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’に連続的に番号が付されている、ＣＲＩＳＰＲ複合体が本明細書にさらに開示される。ヌクレオチド４９位のヌクレオチドは、ウラシルを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ヌクレアーゼ活性を含み得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内の非天然ヌクレオチドでＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に架橋したｓｇＲＮＡを含み得、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ヌクレアーゼ活性を含む。

ＣＲＩＳＰＲ複合体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤が本明細書に開示される。医薬製剤を対象に投与するステップを含む方法がさらに開示される。

ＣＲＩＳＰＲ複合体を細胞に導入するステップを含む方法が本明細書に開示される。ＣＲＩＳＰＲ複合体および説明書を含むキットも開示される。

ＣＲＩＳＰＲ複合体を核酸分子に接触させるステップを含む、核酸分子を編集する方法が本明細書に開示される。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、切断事象の２％未満のオフターゲット切断活性を含み得る。

複数の細胞において標的遺伝子を編集する方法であって、標的遺伝子を含む複数の細胞にＣＲＩＳＰＲ複合体を投与し、それにより、編集された標的遺伝子を含む細胞を生成するステップを含み、編集された標的遺伝子を含む細胞の９９％が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の投与後に生存可能なままである、方法が本明細書に開示される。細胞生存率は、レサズリンアッセイによって測定することができる。

ＣＲＩＳＰＲ複合体を作製する方法であって、ｃｒＲＮＡ領域とｔｒａｃｒＲＮＡ領域とを含むｓｇＲＮＡをＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋させるステップを含み、架橋がｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ領域の外側の非天然ヌクレオチドにおいて生じ、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ活性が架橋後にも維持される、方法が本明細書に開示される。非天然ヌクレオチドは、ウラシルを含み得る。非天然ヌクレオチドは、マレイミドを含み得る。架橋は、ウラシルとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインの間におけるものであり得る。ウラシルは、４－チオウリジンを含み得る。架橋は、ウラシルとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のアミン基の間におけるものであり得る。ウラシルは、５－ブロモウリジンを含み得る。架橋は溶液中で生じ得、溶液中のｓｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の比は、少なくとも９：１であり得る。架橋は、溶液をＵＶ光に曝露させることを含み得る。架橋は、ｓｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を混合すると生じ得る。

架橋剤（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇａｇｅｎｔ）を含む非天然ヌクレオチドを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋させるステップを含み、架橋が、ｓｇＲＮＡの標的結合性領域の外側の非天然ヌクレオチドにおいて生じ、それにより、架橋した複合体が生成され、架橋した複合体が、ヌクレアーゼ活性を含む、方法が本明細書に開示される。

ｃｒＲＮＡ領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域およびヌクレオチド４９位の非天然ヌクレオチドを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が本明細書に開示され、ここで、ヌクレオチド１位はｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の５’末端に存在し、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’に連続的に番号が付されている。

ｃｒＲＮＡ領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域およびヌクレオチド４９位のウラシルを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が本明細書に開示され、ここで、ヌクレオチド１位はｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の５’末端に存在し、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’に連続的に番号が付されている。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋した単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、ｓｇＲＮＡが、ｃｒＲＮＡ領域、ｔｒａｃｒＲＮＡ領域、およびＣＲＩＳＰＲ複合体の活性をモジュレートするように構成された配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体が本明細書に開示される。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲオン（ＣＲＩＳＰＲ－ＯＮ）ポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフ（ＣＲＩＳＰＲ－ＯＦＦ）ポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド、またはオフターゲット編集が低減するように修飾されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドであり得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ内に非天然ヌクレオチドを含み得、ｓｇＲＮＡは、非天然ヌクレオチドにおいてＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋している。非天然ヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の外側に存在し得る。非天然ヌクレオチドは、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド４９位に存在し得、ここで、ヌクレオチド１位はｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’に連続的に番号が付されている。非天然ヌクレオチドは、糖の修飾を含み得る。非天然ヌクレオチドは、塩基の修飾を含み得る。非天然ヌクレオチドは、マレイミドを含み得る。マレイミドは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインと共有結合により連結していてよい。非天然ヌクレオチドは、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰ、または８－Ｎ（３）ＡＭＰを含み得る。非天然ヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のステムループ内に存在し得る。ステムループの構造は、非天然ヌクレオチドを欠くｓｇＲＮＡのステムループの構造と比べて維持され得る。非天然ヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のバルジ内に存在し得る。バルジの構造は、非天然ヌクレオチドを欠くｓｇＲＮＡのバルジの構造と比べて維持され得る。非天然ヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のステムループ間に存在し得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ヌクレアーゼ活性を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲットヌクレアーゼ活性は、架橋していないＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とｓｇＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲットヌクレアーゼ活性と等しいまたはそれよりも低い場合がある。非天然ヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインに対して２０オングストローム以内に存在し得る。一部の実施形態では、非天然ヌクレオチドは、４－チオウリジンまたは修飾アデノシンではない場合がある。

修飾を含むポリヌクレオチドであって、（ｉ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成されており、修飾を含む配列と、（ｉｉｉ）非天然ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するように構成されたヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した修飾を有さないポリヌクレオチドを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体よりもオフターゲット核酸分子に対する編集活性が低い第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が形成される、ポリヌクレオチドが本明細書に開示される。非天然ヌクレオチドは、４９位に存在し得る。修飾は、標準的なヌクレオチド塩基を含まないリンカーを含み得る。修飾は、標準的なヌクレオチド塩基を含まない少なくとも２つのリンカーを含み得る。ｉｉ）の配列は、５’から３’に、テトラループ、第１のステムループ、第２のステムループ、および第３のステムループを形成し得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドは、第４のステムループを含まない。一部の場合では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端にはステムループを含まない。リンカーは、切断可能なリンカーを含み得る。リンカーは、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含み得る。リンカーは、感光性リンカーを含み得る。感光性リンカーは、紫外線放射によって切断可能なものであり得る。感光性リンカーは、可視光線によって切断可能なものであり得る。切断可能なリンカーは、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含み得る。切断可能なリンカーは、１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピルを含み得る。切断可能なリンカーは、

（式中、＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）を含み得る。感光性リンカーは、ホスホロアミダイトを含み得る。感光性リンカーは、クマリンを含み得る。修飾は、ポリヌクレオチドの５７位または７４位に存在し得、ここで、１位はポリヌクレオチドの５’末端に存在し、位置は、５’から３’にカウントされる。修飾は、ポリヌクレオチドの５７位および７４位に存在し得る。修飾はループ内に存在し得る。修飾は、第１のステムループ内または第２のステムループ内に存在し得る。修飾は第１のステムループのループ内または第２のステムループのループ内に存在し得る。修飾は、５７位および７４位の一方または両方に存在し得、ここで、１位はポリヌクレオチドの５’末端に存在し、位置は、５’から３’までカウントされる。修飾は、光切断可能な結合を含み得る。一部の場合では、修飾は、ステムループ内には存在しない。ポリヌクレオチドは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み得る。編集活性は、編集されるオフターゲット核酸分子のパーセンテージとして測定することができる。第１のＣＲＩＳＰＲ複合体によるオフターゲット核酸分子に対する編集活性は、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の編集活性よりも低いものであり得、ｐ値≦０．０００１である。第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性と第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性は、５％以内であり得る。第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性は、編集される標的核酸分子のパーセンテージとして測定することができる。上述のポリヌクレオチドのいずれかとＣＲＩＳＰＲ酵素とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体が本明細書に開示される。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ヌクレアーゼ活性を含み得る。

別の態様では、式（Ｉ）：

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールおよび置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し；
ｍは、１から１０までから選択される整数であり得、Ｘは、Ｏ、Ｓ、＝Ｃ（ＣＮ）２から選択され得、＊は、Ｈまたはペントース部分の付着点を示し得、＊＊は、ＯＨまたはヌクレオチドのリン酸基の付着点を示し得る）のリンカーを含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが本明細書に記載される。式（Ｉ）のリンカーは、式（Ｉ’）：

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールおよび置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；あるいは、Ｒ^２、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くは、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、Ｘは、酸素、Ｓ、または＝Ｃ（ＣＮ）２であり得る。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり得、Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂは、Ｃ_１～６アルキルであり得る。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ、Ｈであり得る；ならびにＲ^３ａ、およびＲ^３ｂは、それぞれ、エチルであり得る）によって表され得る。

別の態様では、

を含む化合物が本発明で提供される。上述の化合物を含むポリヌクレオチドが本明細書に開示される。ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ酵素に結合するように構成された配列をさらに含み得る。ポリヌクレオチドは、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列をさらに含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素と上述のポリヌクレオチドで構成されるＣＲＩＳＰＲ複合体が本明細書に開示される。

別の態様では、式（Ｉ）：

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールおよび置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり得、Ｘは、Ｏ、Ｓ、＝Ｃ（ＣＮ）２から選択され得、＊は、Ｈまたはペントース部分の付着点を示し得、＊＊は、ＯＨまたはヌクレオチドのリン酸基の付着点を示し得る）を含む化合物が本明細書に記載される。式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ’）：

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリールおよび置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；あるいは、Ｒ^２、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くは、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、Ｘは、酸素、Ｓ、または＝Ｃ（ＣＮ）２であり得る。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり得、Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂは、Ｃ_１～６アルキルであり得る。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ、Ｈであり得、Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂは、それぞれ、エチルであり得る）によって表され得る。
参照による組込み

本明細書において言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本発明の原理が利用されている例示的な実施形態が記載されている以下の詳細な説明および付属図を参照することにより、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られよう。

図１は、ポリヌクレオチドが単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であるＣＲＩＳＰＲ複合体の簡易図を示す図である。星印は、ポリヌクレオチドとＣａｓヌクレアーゼの架橋のための非天然ヌクレオチドの例示的な位置を示す。棒は、ポリヌクレオチドの標的結合性領域を示す。

図２は、標的配列と結合したｓｇＲＮＡの３－Ｄモデルを示す図である。この図を図３～５（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，＆Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．（２０１４）．ＣｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９ｉｎｃｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈｇｕｉｄｅＲＮＡａｎｄｔａｒｇｅｔＤＮＡ．Ｃｅｌｌ．ｄｏｉ：１０．２２１０／ｐｄｂ４ｏｏ８／ｐｄｂからの改変画像）と関連付けるためにテトラループおよびステムループ１～３が強調表示されている。

図３は、結合したネクサス内のｓｇＲＮＡヌクレオチドとＣａｓ９ヌクレアーゼの隣接アミノ酸の相互作用の図である。

図４は、結合したステムループ１内のｓｇＲＮＡヌクレオチドとＣａｓ９ヌクレアーゼの隣接アミノ酸の相互作用の図である。

図５は、結合したステムループ２内のｓｇＲＮＡヌクレオチドとＣａｓ９ヌクレアーゼの隣接アミノ酸の相互作用の図である。

図６は、修飾される例示的なＲＮＡヌクレオチドおよびタンパク質上の架橋部位を示す結晶構造を示す図である。

図７Ａ～７Ｄは、ｓｇＲＮＡの型立体配置およびｓｇＲＮＡに対する３つの例示的な修飾の図である。同上。同上。同上。

図８は、マレイミドをどのようにウラシルヌクレオチドに付加することができるかの例の概略を示す図である。

図９は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の結晶構造を示す図である。ｓｇＲＮＡの全てのウラシル塩基が強調表示されている。

図１０は、ｓｇＲＮＡの４４位のウラシルとチロシン残基を含むアルファヘリックス空間的関係に焦点を当てたＣＲＩＳＰＲ複合体の結晶構造を示す図である。

図１１は、５９位のウラシルとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の二次構造の空間的関係に焦点を当てたＣＲＩＳＰＲ複合体の結晶構造を示す図である。

図１２は、６６位のウラシルとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の二次構造の空間的関係に焦点を当てたＣＲＩＳＰＲ複合体の結晶構造を示す図である。

図１３は、６３位のウラシルとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の二次構造の空間的関係に焦点を当てたＣＲＩＳＰＲ複合体の結晶構造を示す図である。

図１４は、３つの例示的な架橋反応を示す図である。

図１５は、ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して遺伝子配列を切断する実験の結果を示すグラフである。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子を示し、Ｙ軸は、切断された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列パーセントを示す。

図１６は、ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体の精製の例示的な図を示す。

図１７は、ＣＲＩＳＰＲオン標的切断活性の活性化の例示的なモデルを示す。不活性ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質であるＣａｓ９と複合体を形成した標準的なｓｇＲＮＡの５’末端に位置する付加されたステムループ構造を含むＣＲＩＳＰＲオン単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。ステムループ構造により、複合体の活性を抑止し、その結果、不活性複合体をもたらすことができる。切断因子の添加により、ステムループ構造を遊離させ、それにより、ゲノム編集を生じさせることを可能にし得る活性な（オン）ＣＲＩＳＰＲ複合体を生成することができる。

図１８は、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡ内の切断可能なリンカーの例示的な位置を示す図である。

図１９は、活性化可能なＣＲＩＳＰＲオンｓｇＲＮＡバリアントの切断の有効性を示す図である。ＵＶの影響を受けやすい切断可能なリンカーによってガイド配列と分離された５’ステムループエレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンｓｇＲＮＡを、ＵＶ光に０分間、５分間、１０分間、または１５分間曝露させた。１５分間の曝露後、ｓｇＲＮＡは、ガイド配列の５’側の配列の切断と一致する横縞模様を示した。「対照」レーンは、ガイド配列の５’側にいかなる追加的な配列も有さないｓｇＲＮＡであり、「第２なし（Ｎｏ２ｎｄ）」条件は、ガイド配列に対するステムを形成しない５’付加を伴うｓｇＲＮＡを使用したものである。「３ｂｐステム」および「６ｂｐステム」条件は、ガイド配列の５’末端にそれぞれ３ｂｐおよび６ｂｐの長さのステム領域を有するように設計されたｓｇＲＮＡを使用するものである。

図２０は、標的ＤＮＡ切断に関するｉｎｖｉｔｒｏＣＲＩＳＰＲオンｓｇＲＮＡ活性化の有効性を示す。切断可能な５’ステムループを有するＣＲＩＳＰＲオンｓｇＲＮＡを、標的ＤＮＡ（ヒトＦＡＮＣＦ）と一緒に１時間インキュベートし、切断因子であるＵＶＡ光（３２０～３９０ｎｍ）に規則的な間隔で曝露させた。「Ｍｏｄｓ」は、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、ガイド配列の５’へのいかなる塩基付加も有さないように修飾されたｓｇＲＮＡである。ｓｇＲＮＡに対する標準の修飾は含む。「二次構造なし（ＮｏＳｅｃｏｎｄａｒｙ）」条件は、ガイド配列に対するステムを形成しない５’付加を伴うｓｇＲＮＡを使用したものである。「３ｂｐステム」および「６ｂｐステム」条件は、ｓｇＲＮＡの５’末端に、それぞれ３ｂｐおよび６ｂｐのステム領域を形成するように設計された配列を有するｓｇＲＮＡを使用するものである。

図２１は、非活性化可能なＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡバリアントの切断の有効性を示す。５つの異なる切断点を有するｓｇＲＮＡを切断因子（ＵＶ光）に０分間（左側）または５分間（右側）晒した。

図２２は、細胞におけるゲノム編集効率の時間依存的なＣＲＩＳＰＲオフ非活性化の概略図を示す。非活性化可能なｓｇＲＮＡバリアントをトランスフェクトした細胞をＲＮＰ送達後の時点でＵＶ光を用いて処理し、ＲＮＰ送達後に合計４８時間、編集、修復、および回復を生じさせた。４８時間後、ゲノムＤＮＡを全ての試料から収集し、インデルの存在について分析した。２種のＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡ（５７および７４）では、ゲノム編集活性の時間依存的な増大が示された。

図２３は、ＣＲＩＳＰＲオフ複合体を使用して遺伝子配列を切断する実験の結果を示す。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子ならびにガイド配列のバージョンを示し、Ｙ軸は、編集された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列のパーセントを示す。

図２４は、標準ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して遺伝子配列を切断する、図２３に対応する実験に対する対照としての実験実行の結果を示す。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子ならびにガイド配列のバージョンを示し、Ｙ軸は、編集された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列のパーセントを示す。

図２５は、ＣＲＩＳＰＲオフ複合体を使用して遺伝子配列を切断する実験の結果を示す。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子ならびにガイド配列のバージョンを示し、Ｙ軸は、編集された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列のパーセントを示す。

図２６は、標準ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して遺伝子配列を切断する、図２５に対応する実験に対する対照としての実験実行の結果を示す。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子ならびにガイド配列のバージョンを示し、Ｙ軸は、編集された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列のパーセントを示す。

図２７は、ＣＲＩＳＰＲオフ複合体を使用して遺伝子配列を切断する実験の結果を示すグラフである。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子ならびにガイド配列のバージョンを示し、Ｙ軸は、編集された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列のパーセントを示す。

図２８は、標準ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して遺伝子配列を切断する、図２７に対応する実験に対する対照としての実験実行の結果を示す。Ｘ軸は、ガイド配列によって標的化される遺伝子ならびにガイド配列のバージョンを示し、Ｙ軸は、編集された標的化遺伝子を含有するＤＮＡ配列のパーセントを示す。

図２９は、３種の遺伝子標的にわたって、上位の予測されるオフターゲット部位において、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡまたは修飾ｓｇＲＮＡのいずれかを使用したオフターゲット編集活性を比較する一連の散布図である。ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡでは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含むようにだけ編集されたｓｇＲＮＡよりも有意に少ないオフターゲットインデルが引き起こされた（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、スチューデントの対応のないｔ検定、ｎ＝２４の技術的反復実験）。

図３０は、ＤＮＭＴ１を標的とするＣＲＩＳＰＲオフ複合体の時間依存的な編集活性を、ＤＮＭＴ１を標的とする標準ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体と比較して示すグラフである。

図３１は、ＧＲＫ１を標的とするＣＲＩＳＰＲオフ複合体の時間依存的な編集活性を、ＧＲＫ１を標的とする標準ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体と比較して示すグラフである。

図３２は、ＶＥＧＦＡを標的とするＣＲＩＳＰＲオフ複合体の時間依存的な編集活性を、ＶＥＧＦＡを標的とする標準ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体と比較して示すグラフである。

図３３は、ポリヌクレオチドが単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であるＣＲＩＳＰＲ複合体の簡易図である。４つの頂点を有する星印は、ポリヌクレオチドとＣａｓヌクレアーゼの架橋のための非天然ヌクレオチドの例示的な位置を示す。５つ頂点を有する星印は、切断可能なリンカーの例示的な位置を示す。棒は、ポリヌクレオチドの標的結合性領域を示す。

図３４は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに対してクマリンリンカーを含む修飾を行うことができる例示的な位置を例示する図である。

図３５は、切断可能なリンカーを有さない修飾ｓｇＲＮＡと比較した、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに対して切断可能なリンカーを含む修飾を行うことができる例示的な位置を例示する図である。

図３６Ａは、断片化が光の非存在下では観察されないことを実証する、図３４のインタクトなＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析トレースである。

図３６Ｂは、ポリヌクレオチドが、４２０ｎｍよりも長い波長の光に曝露すると、両方の光切断可能な部位で切断されることを実証する、光切断後の図３４のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析トレースである。

図３７は、ＵＶ光への曝露後に５７位および７４位における光切断可能なリンカーの切断後に創出された断片、ＵＶ光への曝露後に創出された断片、およびインタクトなｓｇＲＮＡに対応するポリヌクレオチド断片の比較を示すゲルの画像である。

図３８は、図３４の光切断可能な部位を含む２３カ所の異なる標的部位を標的とする２３種のガイドＲＮＡのＨＥＫ２９３細胞におけるパーセント編集として数量化された性能を比較し、３つの条件：光なし、環境光あり、または３４５ｎｍよりも長い波長の光ありを比較したグラフである。

図３９は、５７位および７４位の光切断可能なリンカーを含む、２３カ所の異なる標的部位を標的とする２３種のガイドＲＮＡのＨＥＫ２９３細胞におけるパーセント編集として数量化された性能を比較し、３つの条件：光なし、環境光あり、または３４５ｎｍよりも長い波長の光ありを比較し、光切断可能な部位を有さないｓｇＲＮＡと比較したグラフである。

図４０は、５７位および７４位の光切断可能なリンカーを含む、１８カ所の異なる標的部位を標的とする１８種のガイドＲＮＡのＨｅｐ３Ｂ細胞におけるパーセント編集として数量化された性能を比較し、３つの条件：光なし、環境光あり、または３４５ｎｍよりも長い波長の光ありを比較し、光切断可能な部位を有さないｓｇＲＮＡと比較したグラフである。

図４１は、５７位および７４位の光切断可能なリンカーを含む、１３カ所の異なる標的部位を標的とする１３種のガイドＲＮＡのＵ２ＯＳ細胞におけるパーセント編集として数量化された性能を比較し、３つの条件：光なし、環境光あり、または３４５ｎｍよりも長い波長の光ありを比較し、光切断可能な部位を有さないｓｇＲＮＡと比較したグラフである。

図４２は、修飾されていないｓｇＲＮＡを対照として用いて、ｓｇＲＮＡをより長く活性にさせておくとオフターゲット編集が増加することによって実証される、ｓｇＲＮＡが活性である時間の量とオンターゲット編集とオフターゲット編集の比の関係を例示する図である。

図４３は、細胞において観察されるパーセント編集が、３８５ｎｍの光への曝露が増加するに伴って低減することを示すグラフである。

図４４は、一部の細胞に対して光への曝露を防ぎ、したがって、暗闇で維持された細胞ではＧＦＰ遺伝子がノックアウトされ、一方、光に曝露した細胞はＧＦＰを発現するように選択的に遮蔽された細胞のプレートの画像である。

図４５は、光切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡと比較して、図３４のポリヌクレオチドの存在量が光に曝露すると有意に減少することを示すグラフである。

図４６は、光切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡと比較して、図３４のポリヌクレオチドによるパーセント編集が、光に曝露すると有意に低減することを示すグラフである。

図４７は、ＨＥＫ２９３細胞において観察された、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した図３４のポリヌクレオチドによるパーセント編集活性の経時的な変化を示すグラフである。各時点は、試験したＨＥＫ２９３細胞の集団を光に曝露させた時間を表す。

図４８は、図２７と同じプロトコールを使用した、図３４のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが４３０±２３ｎｍの波長の光への曝露によって不活性化される時間枠を示すグラフである。

図４９は、切断可能なリンカーをｓｇＲＮＡに沿って異なる場所で活性化した場合に得られた切断生成物を示すゲルである。

図５０Ａ～Ｃは、異なる遺伝子を標的とした場合の種々のＣＲＩＳＰＲオフ切断可能なリンカーの場所の編集活性のグラフである。

図５１は、光への曝露の持続時間に対する編集の消失の影響のグラフを示す。完全な消失が４５秒から６０秒の間に実現される。

図５２は、細胞を広スペクトルの光に曝露させる時間の増大の細胞生存率に対する影響を示すグラフである。

図５３は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した、ＣＡＭＫ１を標的とするＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドのインデルプロファイルをＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した標準ｓｇＲＮＡと比較して示す図である。

図５４は、必須遺伝子を標的とするためにＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した図３４のポリヌクレオチドを使用する細胞培養物の画像である。光に曝露させた細胞培養物（＋ｈｖ）では、光に曝露させていない細胞培養物よりも高い集密度が実証され、これにより、不活性化の欠如により高度の細胞死が引き起こされたことが示される。

図５５は、トランスフェクション後様々な時点でのオンターゲット編集：オフターゲット編集比を示すグラフである。

図５６は、透明な領域では光の通過が可能になり、それにより、ＣＲＩＳＰＲオフと複合体を形成したＣａｓ９ヌクレアーゼの編集活性が不活性化され、暗闇領域は不透明になって編集が妨害されずに進行することが可能になるように、図４４の細胞培養に適用した薄膜遮蔽の画像である。

図５７Ａは、５７位および７４位に光切断可能なリンカーを有するインタクトなＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析トレースを示すグラフである。断片化が光の非存在下では観察されないことが実証される。

図５７Ｂは、５７位および７４位に光切断可能なリンカーを有するＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの光切断後のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析トレースを示すグラフである。ポリヌクレオチドが、３４５ｎｍよりも長い波長の光に曝露すると、両方の光切断可能な部位において切断されることが実証される。

図５８は、ＣＲＩＳＰＲオンＶ１ｓｇＲＮＡの構造を示す図である。ｓｇＲＮＡ構造はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ｓｇＲＮＡと同一であるが、プロトスペーサー（バックトラック）配列と相補的な２０ヌクレオチド（ｎｔ）配列、続いてプロトスペーサーのすぐ５’側の４ｎｔループ構造を含有する。

図５９は、４種の独特の遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲオンＶ１ｓｇＲＮＡの３種のバリアントを使用した編集を示すグラフである。３種のバリアントには、以下が含まれた：光刺激に応答することが予測されなかったもの（切断不可能な対照）、ｓｇＲＮＡの５’末端から２４位のところに単一の光切断可能なリンカーを含有するもの（１光切断可能）、および１１位と２４位に２つの光切断可能なリンカーを含有するもの（２光切断可能）。

図６０は、ＣＲＩＳＰＲオンＶ２ｓｇＲＮＡの構造を示す図である。ＣＲＩＳＰＲオンＶ２にはＣＲＩＳＰＲオンＶ１と同じ構造が使用されるが、バックトラック配列（ＲＮＡの最初の２０ｎｔ、プロトスペーサーと相補的）が２’－Ｏ－メチル（２’Ｏ－Ｍｅ）ＲＮＡに置き換えられている。２’Ｏ－ＭｅＲＮＡはＲＮＡにより密接に結合し、Ｒ－ループ形成の間に取り換えられる可能性が低い。

図６１は、標準ｓｇＲＮＡ（Ｍｏｄ）、ＣＲＩＳＰＲオンＶ１（ＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲオンＶ２（Ｏ－Ｍｅ）の間の編集活性の比較を示すグラフである。

図６２は、ＣＲＩＳＰＲオンＶ３ｓｇＲＮＡの構造を示す図である。ＣＲＩＳＰＲオンＶ３は、ＣＲＩＳＰＲオンＶ２を踏まえたものであるが、光切断可能なリンカーがプロトスペーサーバックトラックの中央（１１位）およびプロトスペーサーのすぐ５’側の配列（２４位）に組み入れられている。

図６３は、５種の独特の遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲオンＶ３ｓｇＲＮＡ（Ｋ１１、２４）を使用した編集を単一の光切断可能なリンカーを２４位に含有するＣＲＩＳＰＲオンＶ２バリアント（Ｋ２４）、ＣＲＩＳＰＲオンＶ２（Ｏ－Ｍｅ）および標準ｓｇＲＮＡ（Ｍｏｄ）と比較して示すグラフである。

図６４は、ＣＲＩＳＰＲオンＶ４ｓｇＲＮＡの構造を示す図である。ＣＲＩＳＰＲオンＶ４はＣＲＩＳＰＲオンＶ３を踏まえたものであるが、バックトラック領域のＤＮＡ標的による効率的な取換えを確実にするために追加的な光切断可能なリンカーが導入されている。ｓｇＲＮＡからのバックトラック遊離の確率を上昇させるために光切断可能な残基が２３位および２４位に位置付けられている。解離を補助するために追加的な光切断可能な残基が６位および１４位に位置付けられている。

図６５は、２つの遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲオンＶ４ｓｇＲＮＡバリアントを使用した編集を５ＲＰ（ｓｇＲＮＡの５’に追加的な配列５’－ＵＣＵＣＣＣＵＧＡＧＣＵＵＣＡＧＧＧＡＧ－３’を含む）、ＣＲＩＳＰＲオンＶ２（Ｍｅ）および標準ｓｇＲＮＡ（Ｍｏｄ）と比較して示すグラフである。ＣＲＩＳＰＲオンＶ４ｓｇＲＮＡバリアントは光切断可能なリンカーを以下のヌクレオチドにおいて含むものであった：３、２３および２４（Ｋ３、２３、２４）；６、１１、１６、２３および２４（Ｋ６、１１、１６、２３、２４）；６、１４、２３および２４（Ｋ６、１４、２３、２４）。

Ｉ．概要
標的核酸配列とアニーリングするように設計された配列とＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように設計された配列とを含むポリヌクレオチド（ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド）であって、架橋剤（Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ）を含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが本明細書に開示される。架橋剤は、ポリヌクレオチドのヘアピン領域内に存在し得る。別の態様では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体が本発明で提供される。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、例えばＣａｓ酵素と結合して、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するように設計することができる。Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂなどであり得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を架橋させて架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するための方法も本発明で提供される。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣａｓ酵素を、例えば、紫外線領域内の特定の光の波長への曝露によって架橋反応を活性化させることによって、または標的アミノ酸側鎖の極めて近傍になると共有結合を形成する非天然ヌクレオチドをｓｇＲＮＡ内に位置付けることによって共有結合させることができる。

別の態様では、ａ）標的核酸配列とアニーリングするように設計された配列、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように設計された配列を含み、活性に影響を及ぼすようにモジュレートすることができる１つまたは複数のエレメントを有するまたは有さないＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと、ｂ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の結合の平衡解離定数（Ｋ_ｄ）が８ｐＭ未満である、ＣＲＩＳＰＲ複合体が本発明で提供される。

別の態様では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と共有結合するように構成された配列と、（ｉｉ）必要に応じて、標的分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性に影響を及ぼすようにモジュレートすることができる１つまたは複数のエレメントとを含み得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、「調整可能」であるとみなすことができる。一部の場合では、１つまたは複数のエレメントを、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性が増大するようにモジュレートすることができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ「オン」複合体）。一部の場合では、１つまたは複数のエレメントを、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性が低下するようにモジュレートすることができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ「オフ」複合体）。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの第１のエレメントを、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性が増大するようにモジュレートすることができ、第２のエレメントを、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性が低下するようにモジュレートすることができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ「オン／オフ」複合体）。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと架橋したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲオン複合体；ＣＲＩＳＰＲオフ複合体；またはＣＲＩＳＰＲオン／オフ複合体）も本発明で提供される。一部の場合では、架橋は、非天然ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内のヌクレオチドにおけるものであり得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをモジュレートする方法が本発明で提供される。ポリヌクレオチド、および、例えば説明書、および必要に応じてＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含むキットが提供される。さらに、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤、ならびに医薬製剤を投与する方法が提供される。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを細胞に導入する方法も本発明で提供される。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する方法およびキットが本発明で提供される。例えば、標的核酸配列をＣＲＩＳＰＲ複合体と接触させるステップを含む方法が本発明で提供される。さらに、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／またはＣＲＩＳＰＲ複合体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤が本発明で提供される。別の態様では、医薬製剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。さらに、ＣＲＩＳＰＲ複合体を細胞に導入するステップを含む方法が本発明で提供される。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／またはＣＲＩＳＰＲ複合体を含むキットも本発明で提供される。
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲの概要

増強された安定性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が本発明で提供される。増強された安定性および調整可能な活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が本発明で提供される。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ））は、原核生物が以前に遭遇したウイルス由来のＤＮＡ断片に由来する、原核生物のゲノム内に見出されるＤＮＡ配列のファミリーであり得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）は、ＤＮＡ配列に由来するＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）に結合し得、標的領域：ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド配列と相補的な（ウイルス）ＤＮＡ配列にも結合し得る。結合すると、Ｃａｓヌクレアーゼは、標的（ウイルス）ＤＮＡの標的領域を不活性化するために、当該領域に二本鎖カットを生じさせることができる。標的領域は、「プロトスペーサー」および「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）を含み得、両方のドメインがＣａｓ酵素により媒介される活性（例えば、切断）に必要であり得る。標的部位は、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、またはＣｐｆ１に対するＰＡＭ部位に隣接して存在し得る。ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９であり得る。ＰＡＭ部位は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によって認識され、一部の場合ではＣａｓ酵素活性に必要な短い配列であり得、例えば、ＰＡＭ部位はＮＧＧであり得る。ＰＡＭ部位のヌクレオチドの配列および数は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、例えばＣａｓ酵素の型に応じて異なり得る。プロトスペーサーは、標的部位（またはゲノム標的部位）と称することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、プロトスペーサー（結合性部位）の逆の鎖と対合（またはハイブリダイズ）してＣａｓ酵素を標的領域に方向付けることができる。
Ａ．ＣＲＩＳＰＲ複合体の概要

ＣＲＩＳＰＲ複合体は、１つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとを含む、天然に存在しないまたは工学的に作製されたＤＮＡまたはＲＮＡ標的化系である。１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、本明細書に提示される任意のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドであり得る。標的配列は、それと相補性を有するようにＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列を設計することができる配列であり得、「相補性」は、核酸の、別の核酸配列と従来のワトソン・クリック塩基対合または他の従来型ではない塩基対合のいずれかによって水素結合を形成する能力を指し得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、二重鎖構造を形成する２つの核酸鎖、多重鎖複合体を形成する３つまたはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組合せと相互作用し得る。

ＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列に結合すると、標的配列に付随する配列がＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によって修飾され得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、１つまたは複数の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に加えて約１個もしくは約１個よりも多く、約２個もしくは約２個よりも多く、約３個もしくは約３個よりも多く、約４個もしくは約４個よりも多く、約５個もしくは約５個よりも多く、約６個もしくは約６個よりも多く、約７個もしくは約７個よりも多く、約８個もしくは約８個よりも多く、約９個もしくは約９個よりも多く、約１０個もしくは約１０個よりも多く、またはそれよりも多くのドメイン）を含み得る融合タンパク質の一部であり得る。一部の実施例では、ＣＲＩＳＰＲ複合体の機能性は異種タンパク質ドメインによって付与される。

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来するものであり得る。ＣＲＩＳＰＲＩＩ型系では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと相互作用し、Ｃａｓ酵素のヌクレアーゼ活性を標的領域に方向付けることができる。標的領域は、「プロトスペーサー」および「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）を含み得、両方のドメインがＣａｓ酵素により媒介される活性（例えば、切断）に使用され得る。ガイド配列は、プロトスペーサーの逆の鎖（結合性部位）と対合（またはハイブリダイズ）して、Ｃａｓ酵素を標的領域に方向付けることができる。ＰＡＭ部位は、Ｃａｓ酵素によって認識され、一部の場合では、Ｃａｓ酵素活性に必要な短い配列を指し得る。ＰＡＭ部位のヌクレオチドの配列および数はＣａｓ酵素の型に応じて異なり得る。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体（ＣＲＩＳＰＲ系）は２つのクラスの任意の１つであり得る。クラス１は外来核酸を分解するために多数のＣａｓタンパク質の系を使用し得る。クラス２系は同じ目的のために単一のＣａｓタンパク質を使用し得る。クラス１は、Ｉ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型に分けることができる；クラス２は、ＩＩ型、Ｖ型およびＶＩ型に分けることができる。ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数のエレメントはＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し得る。ＣＲＩＳＰＲＩＩ型エフェクタータンパク質では、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）がＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ）と相互作用し、Ｃａｓ酵素のヌクレアーゼ活性を標的領域に方向付けることができる。ＩＩ型Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９を含み、Ｖ型はＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）を含み、ＶＩ型はＣａｓ１３およびＣａｓ１４を含む。ＩＩ型およびＶ型の標準的な標的はＲＮＡであり得、一方、Ｖ型の標準的な標的はＤＮＡであり得る。
Ｂ．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、ＲＮＡによりガイドされるポリヌクレオチド結合活性またはヌクレアーゼ活性を有し得る、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型系のＣａｓタンパク質またはそれらに由来するタンパク質を含み得る。適切なＣａｓタンパク質の例としては、ＣａｓＸ、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘｌ２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｕ１９６６、そのホモログ、およびその修飾バージョンが挙げられる。一部の場合では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、そのホモログ、およびその修飾バージョンなどの、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＶ型またはＶＩ型系のタンパク質またはそれらに由来するタンパク質を含み得る。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、触媒として不活性型（ｄｅａｄ）または不活性型（ｉｎａｃｔｉｖｅ）のＣａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質であり得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮｍＣａｓ９）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｊｏｓｔｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ、Ｋｒｉｂｂｅｌｌａｆｌａｖｉｄａ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｕｒｖａｔａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｅｎｔｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ、Ｓｌａｃｋｉａｈｅｌｉｏｔｒｉｎｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａｍａｒｉｎａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｏｃｈｒａｃｅａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｍｉｎｕｔｕｍ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａｍａｇｎａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｃｔａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｍｏｂｉｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒｓｈｉｂａｅ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘｅｂｒｅｕｓ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒｅｉｓｅｎｉａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｌａｒｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｈｅｐａｔｉｃｕｓ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｔｏｌｕｍｏｎａｓａｕｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓａｔｌａｎｔｉｃａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｐｅａｌｅａｎａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａに由来するＩＩ型Ｃａｓ９であり得る。

Ｃａｓタンパク質は、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍｐｅｒｎｉｘ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓｋａｍｃｈａｔｋｅｎｓｉｓ、Ｉｇｎｉｃｏｃｃｕｓｈｏｓｐｉｔａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓｍａｒｉｎｕｓ、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓｂｕｔｙｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａｓｅｄｕｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍｐｅｎｄｅｎｓ、Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａｍａｑｕｉｌｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍａｒｓｅｎａｔｉｃｕｍ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｆｅｒｒｏｇｌｏｂｕｓｐｌａｃｉｄｕｓ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍｍｕｋｏｈａｔａｅｉ、Ｈａｌｏｒｈａｂｄｕｓｕｔａｈｅｎｓｉｓ、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓｐｈａｒａｏｎｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｓｍｉｔｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａｓｔａｄｔｍａｎａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓｖｕｌｃａｎｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍｌａｂｒｅａｎｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒｕｌａｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓｂｕｒｔｏｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｉｂｉｒｉｃｕｓ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓｔｏｒｒｉｄｕｓ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＫｏｒａｒｃｈａｅｕｍｃｒｙｐｔｏｆｉｌｕｍ、Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｕｍｅｑｕｉｔａｎｓ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａａｃｉｄｉｐｈｉｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｕｒｉｍｕｃｏｓｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｊｅｉｋｅｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｆｒａｎｋｉａａｌｎｉ、Ｆｒａｎｋｉａ、Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｔａ、Ｒｏｔｈｉａｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａｔｒｏｐｉｃａ、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｖｉｒｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａｆｕｓｃａ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｕｒｖａｔａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｅｎｔｉｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａｌｅｎｔａ、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓａｌｂｕｓ、Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａｍａｒｉｎａ、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍａｚｏｒｅｎｓｅ、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｓｐｉｒｏｓｏｍａｌｉｎｇｕａｌｅ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓｍａｒｉｎｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍｔｅｐｉｄｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｉ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍｌｉｍｉｃｏｌａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍｐｈａｅｏｖｉｂｒｉｏｉｄｅｓ、Ｐｅｌｏｄｉｃｔｙｏｎｌｕｔｅｏｌｕｍ、Ｐｅｌｏｄｉｃｔｙｏｎｐｈａｅｏｃｌａｔｈｒａｔｉｆｏｒｍｅ、Ｃｈｌｏｒｏｈｅｒｐｅｔｏｎｔｈａｌａｓｓｉｕｍ、Ｐｒｏｓｔｈｅｃｏｃｈｌｏｒｉｓａｅｓｔｕａｒｉｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍｒｏｓｅｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｓｔｏｃｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓｔｕｒｇｉｄｕｍ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｙｔｏｔｏｘｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｉｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｎｏｖｙｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａｍａｇｎａ、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｃｔａｌｅ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｏｄｅｓｔｉｃａｌｄｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＤｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓａｕｄａｘｖｉａｔｏｒ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈａｆｎｉｅｎｓｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｗｏｌｆｅｉ、Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｈａｌｏｔｈｅｒｍｏｔｈｒｉｘｏｒｅｎｉｉ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｍｏｏｒｅｌｌａｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｂｕｃｃａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｏｄｕｌａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒｓｈｉｂａｅ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍｃｒｙｐｔｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｇｒａｎｕｌｉｂａｃｔｅｒｂｅｔｈｅｓｄｅｎｓｉｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｃｅｎｔｅｎｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘｃｉｔｒｕｌｌｉ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、Ｄｅｌｆｔｉａａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘｆｅｒｒｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒｅｉｓｅｎｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘｃｈｏｌｏｄｎｉｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｌａｒｉｂａｃｔｅｒｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓｅｕｒｏｐａｅａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａｒｏｍａｔｏｌｅｕｍａｒｏｍａｔｉｃｕｍ、Ｔｈａｕｅｒａ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＡｃｃｕｍｕｌｉｂａｃｔｅｒｐｈｏｓｐｈａｔｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｈａｌｏｂｉｕｍｒｅｔｂａｅｎｓｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｍａｇｎｅｔｉｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒｌｏｖｌｅｙｉ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒｕｒａｎｉｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｓ、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｘｏｃｏ
ｃｃｕｓｘａｎｔｈｕｓ、Ｈａｌｉａｎｇｉｕｍｏｃｈｒａｃｅｕｍ、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒｆｕｍａｒｏｘｉｄａｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｕｒｖｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｄｅｌｅｙｉａｎｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ、Ｔｏｌｕｍｏｎａｓａｕｅｎｓｉｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｍａｃｌｅｏｄｉｉ、Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒｔｕｒｎｅｒａｅ、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓｉｎｇｒａｈａｍｉｉ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｂａｌｔｉｃａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｐｉｅｚｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒｎｏｄｏｓｕｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓｏｃｅａｎｉ、Ａｌｋａｌｉｌｉｍｎｉｃｏｌａｅｈｒｌｉｃｈｉｉ、Ｔｈｉｏａｌｋａｌｉｖｉｂｒｉｏ、Ｈａｌｏｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｎｅａｐｏｌｉｔａｎｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｒｏｄｅｎｔｉｕｍ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｄｉｃｋｅｙａｄａｄａｎｔｉｉ、Ｄｉｃｋｅｙａｚｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａｐｙｒｉｆｏｌｉａｅ、Ｅｒｗｉｎｉａｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｖａｒｉｉｃｏｌａ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｗａｓａｂｉａｅ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｂｏｙｄｉｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｏｎｎｅｉ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｂｏｖｉｅｎｉｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｏｘｉｅｌｌａｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｈａｈｅｌｌａｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｅｎｄｏｃｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｖｉｂｒｉｏｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｒｏｆｕｎｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏｈａｒｖｅｙｉ、Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅ、Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｏｄｏｓｕｍ、Ｋｏｓｍｏｔｏｇａｏｌｅａｒｉａ、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏｍｅｌａｎｅｓｉｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｌｅｔｔｉｎｇａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、またはＴｈｅｒｍｏｂａｃｕｌｕｍｔｅｒｒｅｎｕｍに由来するＩ型Ｃａｓ７またはＣａｓ１であり得る。

Ｃａｓタンパク質は、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓｋａｍｃｈａｔｋｅｎｓｉｓ、Ｉｇｎｉｃｏｃｃｕｓｈｏｓｐｉｔａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓｍａｒｉｎｕｓ、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓｂｕｔｙｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａｓｅｄｕｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍｐｅｎｄｅｎｓ、Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａｍａｑｕｉｌｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍａｒｓｅｎａｔｉｃｕｍ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓｐｈａｒａｏｎｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａｓｔａｄｔｍａｎａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓｆｅｒｖｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓｖｕｌｃａｎｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｏｎｎｕｒｉｎｅｕｓ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓｔｏｒｒｉｄｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｖｏｌｃａｎｉｕｍ、Ａｃｉｄｕｌｉｐｒｏｆｕｎｄｕｍｂｏｏｎｅｉ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＫｏｒａｒｃｈａｅｕｍｃｒｙｐｔｏｆｉｌｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｆｒａｎｋｉａ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａｔｒｏｐｉｃａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｖｉｒｉｄｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａｆｕｓｃａ、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓａｌｂｕｓ、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍａｚｏｒｅｎｓｅ、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓｍａｒｉｎｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍｐａｒｖｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｅｌｏｄｉｃｔｙｏｎｐｈａｅｏｃｌａｔｈｒａｔｉｆｏｒｍｅ、Ｃｈｌｏｒｏｈｅｒｐｅｔｏｎｔｈａｌａｓｓｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍｒｏｓｅｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｓｔｏｃｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓｔｕｒｇｉｄｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＳｏｌｉｂａｃｔｅｒｕｓｉｔａｔｕｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＤｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓａｕｄａｘｖｉａｔｏｒ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｗｏｌｆｅｉ、Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｐａｒｖｕｌａ、Ｈａｌｏｔｈｅｒｍｏｔｈｒｉｘｏｒｅｎｉｉ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｐａｒｖｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｂｕｃｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｐｉｒｅｌｌｕｌａｓｔａｌｅｙｉ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｃｅｎｔｅｎｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓｅｕｒｏｐａｅａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓｅｕｔｒｏｐｈａ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＡｃｃｕｍｕｌｉｂａｃｔｅｒｐｈｏｓｐｈａｔｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓｘａｎｔｈｕｓ、Ｈａｌｉａｎｇｉｕｍｏｃｈｒａｃｅｕｍ、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒｆｕｍａｒｏｘｉｄａｎｓ、Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒｂｕｔｚｌｅｒｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｆｅｔｕｓ、Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒｔｕｒｎｅｒａｅ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ、Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｔｈｉｏａｌｋａｌｉｖｉｂｒｉｏ、Ｄｉｃｋｅｙａｄａｄａｎｔｉｉ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｏｄｏｓｕｍ、Ｋｏｓｍｏｔｏｇａｏｌｅａｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏｍｅｌａｎｅｓｉｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎａｐｈｔｈｏｐｈｉｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、またはＴｈｅｒｍｏｂａｃｕｌｕｍｔｅｒｒｅｎｕｍに由来するＩＩＩ型Ｃａｓ１０であり得る。

Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９であり得る。Ｃａｓ９は、アルファヘリックスローブおよびヌクレアーゼローブを含み得る。アルファヘリックスローブは、架橋へリックスと称される長いαへリックス、ＲＥＣ１ドメイン、およびＲＥＣ２ドメインという３つの領域を含み得る。ヌクレアーゼローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメインおよびＰＡＭ相互作用ドメインを含み得る。図３はＲＥＣ１ドメイン（Ｓｅｒ４６０、Ｌｅｕ４５５、Ａｒｇ４６７、Ｔｈｒ４７２、Ｉｌｅ４７３）、架橋へリックス（Ａｒｇ６９、Ａｓｎ７７、Ａｒｇ７４、Ａｒｇ７０）、およびＰＡＭ相互作用ドメイン（Ｇｌｙ１１０３、Ｐｈｅ１１０５、Ｌｙｓ１１２３、Ｌｙｓ１１２４、Ｐｈｅ１１０５）などの、架橋部位であり得るネクサスの極めて近傍にある異なるドメインのアミノ酸を強調する。図４は、ＲｕｖＣドメイン（Ｌｙｓ３３、Ｌｙｓ７４２、Ｌｙｓ１０９７、Ｈｉｓ７２１、Ｇｌｕ５７）、ＰＡＭ相互作用ドメイン（Ｓｅｒ１３５１、Ｔｙｒ１３５６、Ｈｉｓ１３４９、Ｖａｌ１１００、Ｔｈｒ１１０２）、および架橋へリックスドメイン（Ｔｈｒ６２）などの、架橋部位であり得るステムループ１の極めて近傍にある異なるドメインのアミノ酸を強調する。図５は、ＲｕｖＣドメイン（Ｌｙｓ３０、Ａｓｎ４６、Ａｒｇ４０、Ｌｙｓ４４）およびＰＡＭ相互作用ドメイン（Ｇｌｕ１２２５、Ａｌａ１２２７、Ｇｌｎ１２７２）などの、架橋部位であり得るステムループ２の極めて近傍にある異なるドメインのアミノ酸を強調する。

核酸がＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）および標的ＤＮＡ分子と結合すると、ヌクレアーゼローブがアルファヘリックスローブに対して約１００°回転し得る。１つまたは複数の架橋基をＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の完全な活性が保持されるように位置させることができ、また、架橋方法により、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）の完全な活性を保持することが可能になり得る。
Ｃ．ＣＲＩＳＰＲ複合体に使用するためのポリヌクレオチド

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはその誘導体を含み得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、糖部分、例えば、リボースまたはデオキシリボースに共有結合により付着した塩基を含み得るヌクレオシドを含み得る。ヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドであり得る。ヌクレオシドは、遊離のカルボキシル基、遊離のアミノ基、または保護基を含み得るアミノ酸またはアミノ酸類似体と連結した連結を含み得る。保護基は、例えば、Ｐ．Ｇ．Ｍ．ＷｕｔｓａｎｄＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ， ”ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”，２ｎｄＥｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９９に記載されている保護基であり得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、標準的な環状ヌクレオチド、例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ｃＣＭＰ、ｃＵＭＰ、ｃＩＭＰ、ｃＸＭＰ、またはｃＴＭＰを含み得る。標準的なヌクレオチド塩基は、アデニン、シトシン、ウラシル、グアニン、またはチミンであり得る。ヌクレオチドは、リン酸基またはリン酸類似体に付着したヌクレオシドを含み得る。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、またはＤＮＡの１つまたは複数の分子として存在し得る（例えば、前記ＲＮＡの１つまたは複数の分子またはタンパク質をコードする１つまたは複数のベクター内）。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、一本鎖形態、二本鎖形態または多重鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーであり得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖または多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよび／もしくはピリミジン塩基または他の天然の、化学修飾された、生化学的に修飾された、天然でない、合成のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含み得る。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に使用されるポリヌクレオチド（ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド）配列は、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み得る。天然では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子として存在し得る。「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント」という用語は、タンパク質結合性セグメント（例えば、タンパク質結合性セグメントはＣａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ－エフェクタータンパク質と相互作用することができる）を含むポリヌクレオチド分子またはその一部を指し得る。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、ｃｒＲＮＡセグメントとｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが同じＲＮＡ分子内に位置する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を包含し得る。

一部の場合では、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）セグメントとトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）セグメントの複合体（例えば、水素結合を介したもの）であり得る。ｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズ性ポリヌクレオチド配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ結合性ポリヌクレオチド配列を含み得る。ハイブリダイズ性ポリヌクレオチド配列は、標的核酸の一部（例えば、選択されたエクソン）とハイブリダイズし得る。ｃｒＲＮＡのハイブリダイズ性ポリヌクレオチド配列は、１７ヌクレオチドから２３ヌクレオチドまでにわたり得る。ｃｒＲＮＡのハイブリダイズ性ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、またはそれよりも多くのヌクレオチドであり得る。ｃｒＲＮＡのハイブリダイズ性ポリヌクレオチド配列は、最大で２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。一実施例では、ｃｒＲＮＡのハイブリダイズ性ポリヌクレオチド配列は、２０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ性ポリヌクレオチドはガイド配列であり得る。ガイド配列は、標的核酸配列に対して、標的核酸配列とハイブリダイズするために十分な相補性を含み得る。相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントした場合、約５０％もしくは約５０％よりも大きい、約６０％もしくは約６０％よりも大きい、約７５％もしくは約７５％よりも大きい、約８０％もしくは約８０％よりも大きい、約８５％もしくは約８５％よりも大きい、約９０％もしくは約９０％よりも大きい、約９５％もしくは約９５％よりも大きい、約９７．５％もしくは約９７．５％よりも大きい、または約９９％もしくは約９９％よりも大きいものであり得る。相補性の程度は１００％であり得る。一部の場合では、ガイド配列は、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも多くのヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列は、約５～約４０ヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列を、ガイド配列がそれ自体と塩基対合するまたはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの別の部分と塩基対合する可能性が低下するように設計することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが最適にフォールディングされた場合、ガイド配列の別の部分またはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの別の部分と塩基対合するのは、ガイド配列のヌクレオチドの約７５％もしくは約７５％未満、約５０％もしくは約５０％未満、約４０％もしくは約４０％未満、約３０％もしくは約３０％未満、約２５％もしくは約２５％未満、約２０％もしくは約２０％未満、約１５％もしくは約１５％未満、約１０％もしくは約１０％未満、約５％もしくは約５％未満、約１％もしくは約１％未満、またはそれ未満であり得る。

一部の場合では、単一のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが単一のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋する。単一のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ガイド配列と、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋する配列とを含み得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋し得る配列は、トランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であり得る。単一のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドがガイド配列およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む場合、単一のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、単一ガイドＲＮＡ（またはｓｇＲＮＡ）と称することができる。

一部の場合では、２つのＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが単一のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋し得る。第１のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはガイド配列を含むものであり得、第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ガイド配列を欠くものであり得る。

一部の場合では、第１のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ガイド配列、およびｃｒＲＮＡを形成する配列の第１の部分（ｔｒａｃｒメイト配列と称することができる）を含み、第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒ配列と称することができる）を形成する配列の第２の部分を含む。一部の場合では、ｔｒａｃｒ配列（またはｔｒａｃｒＲＮＡ）はｃｒＲＮＡ内の「ｔｒａｃｒメイト」配列とハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によって認識される二本鎖ＲＮＡ二重鎖タンパク質結合性セグメントが形成される。ガイド配列（スペーサー配列としても公知）を含むが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合し得る配列は欠くＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（またはｇＲＮＡ）と称することができる。ガイド配列およびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合し得る配列の一部分（例えば、ｔｒａｃｒメイト配列）のみを含む（ｔｒａｃｒ配列を欠く）ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドもガイドＲＮＡ（またはｇＲＮＡ）またはｃｒＲＮＡと称することができる。

ｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡ内の「ｔｒａｃｒメイト」配列とハイブリダイズし得、それにより、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によって認識される二本鎖ＲＮＡ二重鎖タンパク質結合性セグメントが形成される。一部の実施例では、これら２つのハイブリダイゼーションにより、ヘアピンなどの二次構造が生じる。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド配列は、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多くのヘアピンを含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、１つまたは複数のヘアピンを含み得るまたはそれからなり得、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。

一部の場合では、第１のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはｃｒＲＮＡであり得、第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはｔｒａｃｒＲＮＡであり得、第１のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは２つの別々のＲＮＡ分子であり得る。一部の場合では、単一のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、（１）標的配列（例えば、真核細胞のゲノム標的遺伝子座）とハイブリダイズすることができるガイド配列（またはガイド配列を含むｃｒＲＮＡ）と（２）ｔｒａｃｒＲＮＡとを含み得る。一部の場合では、第１のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、（１）ガイド配列（またはガイド配列を含むｃｒＲＮＡ）（例えば、真核細胞の標的配列とハイブリダイズすることができる）と（２）ｔｒａｃｒメイト配列（ダイレクトリピート配列としても公知）とを含むが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は欠くものであり得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質には、標的配列とハイブリダイズすることができるガイド配列およびｔｒａｃｒメイト配列（ダイレクトリピート配列）が付随し得るが、ｔｒａｃｒＲＮＡの必要性は伴わない。

ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列が単一のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとして存在する場合、ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列は、共有結合により連結していてよい。ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列は、リン酸ジエステル結合によって連結していてよい。ｔｒａｃｒとｔｒａｃｒメイトは、スペーサー、付着、バイオコンジュゲート、発色団、レポーター基、色素標識されたＲＮＡ、または天然に存在しないヌクレオチド類似体などの部分を含む非ヌクレオチドループを介して共有結合により連結していてよい。スペーサーは、ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール、多価アルコール、ポリプロピレングリコールまたはエチレンとプロピレングリコールの混合物）、ポリアミン基（例えば、スペルミン（ｓｐｅｎｎｉｎｅ）、スペルミジン、またはそのポリマー誘導体）、ポリエステル（例えば、ポリ（アクリル酸エチル））、ポリホスホジエステル、アルキレン、およびこれらの組合せであり得る。付着は蛍光標識であり得る。バイオコンジュゲートは、例えば、ペプチド、配糖体、脂質、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、脂肪酸、炭化水素、酵素基質、ステロイド、ビオチン、ジゴキシゲニン、炭水化物、または多糖であり得る。発色団、レポーター基、または色素標識されたＲＮＡは、蛍光色素、例えば、フルオレセインまたはローダミン、化学発光、電気化学発光、または生物発光マーカー化合物であり得る。

全体として、ｃｒＲＮＡは、３５ヌクレオチドから４５ヌクレオチドまでにわたり得る。ｃｒＲＮＡは、少なくとも３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、またはそれよりも多くのヌクレオチドであり得る。ｃｒＲＮＡは、最大で４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、６０ヌクレオチドから８０ヌクレオチドまでにわたり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも６０、６１、６２、６３、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、またはそれよりも多くのヌクレオチドであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、最大で８０、７９、７８、７７、７６、７４、７２、７０、６８、６６、６４、６２、６０、またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。一実施例では、ｔｒａｃｒＲＮＡは７２ヌクレオチドであり得る。別の例では、ｃｒＲＮＡのハイブリダイズ性ポリヌクレオチド配列は２０ヌクレオチドであり、ｃｒＲＮＡは４２ヌクレオチドであり、それぞれのｔｒａｃｒＲＮＡは７２ヌクレオチドである。別の例では、ｃｒＲＮＡのハイブリダイズ性ポリヌクレオチドは２０ヌクレオチドであり、ｃｒＲＮＡは合計３４ヌクレオチドであり、それぞれのｔｒａｃｒＲＮＡは６６ヌクレオチドである。

一部の場合では、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを接合してｓｇＲＮＡまたは「単一ガイドＲＮＡ」と称される単一ガイドＲＮＡ分子にする。各ｓｇＲＮＡは、約２０ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドまで、約３０～約４０ヌクレオチド、約４０～約５０ヌクレオチド、約５０～約６０ヌクレオチド、約６０～約７０ヌクレオチド、約７０～約８０ヌクレオチド、または約８０～約１００ヌクレオチドヌクレオチドの長さの定常領域を含み得る。各ｓｇＲＮＡは、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１１０ヌクレオチドを含み得る。

あるいは、ｇＲＮＡは、３つまたはそれよりも多くのＲＮＡ鎖の複合体であり得る。３つまたはそれよりも多くのＲＮＡ鎖の複合体の少なくとも１つのＲＮＡ鎖は、ハイブリダイズ性ポリヌクレオチド配列を含み得る。３つまたはそれよりも多くのＲＮＡ鎖の複合体の少なくとも１つのＲＮＡ鎖は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ酵素）結合性配列を含み得る。

ｇＲＮＡが標的核酸分子とハイブリダイズする場合、遺伝子のハイブリダイズする部分は、プロトスペーサー（標的部位）、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ酵素）によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、およびプロトスペーサーの逆の鎖（結合性部位）を含む標的領域（または標的遺伝子座）であり得る。プロトスペーサーの逆の鎖は、ｇＲＮＡハイブリダイズ性ゲノム領域（配列）であり得る。標的核酸配列内のｇＲＮＡハイブリダイズ性配列は、１７ヌクレオチドから２３ヌクレオチドまでにわたり得る。遺伝子内のｇＲＮＡハイブリダイズ性配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、またはそれよりも多くのヌクレオチドであり得る。遺伝子内のｇＲＮＡハイブリダイズ性配列は、最大で２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、またはそれよりも少ないヌクレオチドであり得る。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質）はＣａｓ９であり得、その場合、ｔｒａｃｒＲＮＡがＣａｓ９のアルファヘリックスローブおよびヌクレアーゼローブと、４つのヘアピンループを通じて相互作用し得る；２つのヘアピンループは各ローブとそれぞれ相互作用し得る。ｃｒＲＮＡは、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列と相補的に結合するように設計することができる。全長ｓｇＲＮＡ標的ＤＮＡ結合性領域は、Ｃａｓ９については２０ヌクレオチドであり得る。Ｃａｓ９に関しては、ＰＡＭ配列は３’－ＮＧＧ、３’－ＮＧＧＮＧ、３’ＮＮＡＧＡＡＷ、および３’－ＡＣＡＹを含み得、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＷはＡまたはＴであり、ＹはＣまたはＴである。

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの効果を増大させるために、他の二次構造をＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えばｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに付加して、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの安定性を増強する。一部の場合では、安定性の増大により、核酸編集が改善し得る。
ＩＩＩ．安定化されたＣＲＩＳＰＲ複合体

本開示は、「ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体」と称することができる、ｓｇＲＮＡと共有結合したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を包含する。本開示は、別々のｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡと共有結合したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を包含する。ｓｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が増強された結合親和性を有するＣＲＩＳＰＲ複合体も本発明で提供される。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、本明細書に記載の任意のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド、またはオフターゲット編集が低減するように修飾されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと共有結合（例えば、架橋）し得る。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を、特定の遺伝子のノックアウトならびに特定の遺伝子のノックインの両方がなされるように改変することができる。ＣＲＩＳＰＲ媒介性ノックアウトは細胞の非相同末端結合修復経路を通じて生じさせることができる。この事象では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、結合したＲＮＡの相補的な標的核酸（例えば、ＤＮＡ）領域に結合し、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）領域における二本鎖カットを実行し得る。ｓｇＲＮＡを設計する場合、ＰＡＭ認識部位を必要とするＣａｓヌクレアーゼに対して、ｓｇＲＮＡ内に、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の近くの独特の３～９ヌクレオチドＰＡＭ認識領域を設計することができる。あらゆるＣａｓヌクレアーゼがＰＡＭ領域を必要とするわけではない；例えば、Ｃａｓ１４ａは同定のためにＰＡＭ領域を必要としない。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成したｓｇＲＮＡの安定性増強を少なくとも１つの共有結合によって増強することにより、共有結合していないＣＲＩＳＰＲ複合体と比較してオフターゲット切断事象の数を減少させ、それにより、細胞毒性を低減することができる。ｓｇＲＮＡと架橋したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（「ロックされた」）を使用して、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９と比較してオフターゲット編集を減少させることができる。オフターゲット編集は、Ｈｓｉａｕｅｔａｌ． ”ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓｆｒｏｍＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅＤａｔａ”，Ｊａｎｕａｒｙ１４，２０１９ｂｉｏＲｘｉｖｏｒｄｅｅｐ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｓｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎＴｓａｉｅｔａｌ． ”ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑｅｎａｂｌｅｓｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｃｌｅａｖａｇｅｂｙＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｎｕｃｌｅａｓｅｓ”，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３３，１８７－１９７（２０１５）に記載されている通り、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定したＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｉｎｇ））を使用して決定することができる。

ｓｇＲＮＡをＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に共有結合によりロックすることにより、ｓｇＲＮＡにより細胞内の毒性が引き起こされる確率を低下させることができる。ｓｇＲＮＡをＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質にロックすることにより、特定の標的に対して設計されたガイドＲＮＡを有する単一の種のＣＲＩＳＰＲ複合体を投与することを可能にすることによって投薬の正確度を高めることができる。多数の部位を標的とする複合療法のために、互いに独特の標的を有する２種またはそれよりも多くのロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体を投与することができる。さらに、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成したｓｇＲＮＡ配列を、複合体を形成した状態から解離することができないように製剤化することにより、製剤化および投与後の両方において、分解からの大きな保護をもたらすことができる。
Ａ．修飾されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド

架橋のための少なくとも１つの非天然ヌクレオチドおよび活性をモジュレートするための配列で修飾されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが本明細書に開示される。活性を改変するための配列は、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド配列、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド配列、またはオフターゲット編集が低減するように修飾されたＣＲＩＳＰＲヌクレオチドであり得る。非天然ヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ内、ｃｒＲＮＡ内、またはｃｒＲＮＡのガイド配列内に位置し得る。

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのヌクレアーゼに対する抵抗性、血清安定性、標的特異性、血液系循環、組織分布、組織透過、細胞内取り込み、効力、および／または細胞透過性が改善されるように修飾することができる。例えば、ある特定のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド修飾により、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の活性に有意に影響を及ぼすことなく、ヌクレアーゼ安定性を増大させ、かつ／またはインターフェロン誘導を低減することができる。修飾されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、同じ配列を有する修飾されていないＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと比較して改善された血清および／または脳脊髄液中での安定性を有し得る。本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、糖部分、リン酸ジエステル連結、および／または塩基を含めた種々の場所に１つまたは複数の修飾を含み得る。本明細書に記載の修飾されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ｓｇＲＮＡおよび別々のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含み得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と水素結合相互作用によって結合させることができる。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と１つまたは複数の共有結合によって架橋し、それにより、ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することができるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが本発明で提供される。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の間に１～３、３～６、６～９、９～１２、１２～１５、１５～１８、１８～２１、２１～２４、２４～２７、２７～３０、３０～３３、３３～３６、３６～３９、３９～４２、４２～４５、４５～４８、４８～５１、５１～５４、５４～５７、５７～６０、６０～６２、６２～６５、６５～６８、６８～７１、７１～７４、７４～７７、７７～８０、８０～８３、８３～８６、８６～８９、８９～９１、９１～９４、９４～９７、９７～１００の共有結合が存在し得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００の共有結合が存在し得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の間に最大で１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１の共有結合が存在し得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の間に約１～約１０、約１０～約３０、約３０～約６０、または約６０～約８０の共有結合が存在し得る。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を制御するために、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート連結、Ｏ－メチルホスホロアミダイト連結、および／またはペプチド核酸を含む骨格を含み得る。個々のヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質内の隣接アミノ酸との共有結合を形成することができる架橋剤がＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに付加されるように修飾することができる。１つまたは複数の架橋剤の場所は、例えば、図１に図示されている通り、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ領域内であり得る。１つまたは複数の架橋剤はｓｇＲＮＡのヘアピンループ内に存在し得る。架橋反応は、共有結合を形成するために、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質内の受容体分子と極めて近傍のものであり得る。ある実施形態は、官能化されたヌクレオチドが、架橋の開始前に、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の受容体分子、例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質内の隣接アミノ酸に対して２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１オングストローム以内になるように設計することを含む。

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡ）は、少なくとも１の架橋剤、少なくとも２の架橋剤、少なくとも５の架橋剤、少なくとも１２の架橋剤、少なくとも１５の架橋剤、少なくとも２０の架橋剤、少なくとも２５の架橋剤、少なくとも３０の架橋剤、少なくとも３５の架橋剤、少なくとも４０の架橋剤、少なくとも５０の架橋剤、少なくとも５５の架橋剤、少なくとも６０の架橋剤、少なくとも６５の架橋剤、少なくとも７０の架橋剤、少なくとも７５の架橋剤、または少なくとも８０の架橋剤を含み得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、最大で１００、５０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１の架橋剤を含み得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、約１～約１０、約１０～約３０、約３０～約６０、または約６０～約８０の架橋剤を含み得る。

その代わりにまたは組み合わせて、１つまたは複数の架橋剤の位置は、標的結合性ｃｒＲＮＡ領域の外側の、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の任意のヌクレオチド、またはｔｒａｃｒＲＮＡ配列の任意の２つのヌクレオチドの間にあり得る。１つまたは複数の架橋剤は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの任意のステム領域：ネクサス内、ステムループ１内、ステムループ２内、またはテトラループ内に存在し得る（例えば、図２を参照されたい）。１つまたは複数の架橋剤は、ネクサスのヘアピンループもしくはステム内、ステムループ１内、ステムループ２内、またはポリヌクレオチドのテトラループ内、またはこれらの任意の組合せに存在し得る。１つまたは複数の架橋剤は、１つのヘアピン内、２つのヘアピン内、３つのヘアピン内または４つのヘアピン内に存在し得る。ヘアピンのループは、１つの架橋剤、２つの架橋剤、３つの架橋剤、４つの架橋剤、５つの架橋剤、６つの架橋剤などを含み得る。１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれよりも多くの架橋剤がテトラループのバルジ内に存在し得る。

上記の代わりにまたはそれと組み合わせて、１つまたは複数の架橋剤は、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド４９位に存在し得、ここで、ヌクレオチド１位はｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている。

１つまたは複数の架橋剤は、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド１位、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９位、または１１０位に存在し得、ここで、ヌクレオチド１位はｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている。

１つまたは複数の架橋剤は、ｓｇＲＮＡの任意のウラシル残基に存在し得る。ｓｇＲＮＡを、架橋剤を欠くｓｇＲＮＡのステムループの構造と比べてｓｇＲＮＡのヘアピン構造が維持されるように修飾することができる。ｓｇＲＮＡを、ヘアピン構造内のヌクレオチドの相補対間のヌクレオチドスワップによって修飾することができる。例示的なスワップは、図７Ａにおいて見られる立体配置から改変された図７Ｂにおいて見ることができる通り、２２位にアデニンが残される、ｓｇＲＮＡの４９位におけるウラシル－アデニンスワップであり得る。あるいは、図７Ｃにおいて見ることができる通り、４９位のウリジンをデオキシウリジンに置き換えることができる。あるいは、図７Ｄにおいて見ることができる通り、２２位のアデノシンをデオキシ－アデノシンに置き換えることができる。最終的な選択肢として、５０位のウリジンをデオキシウリジンで置換することができる。

上記の代わりにまたはそれと組み合わせて、１つまたは複数の架橋剤は、１つのヘアピンステム内、２つのヘアピンステム内、３つのヘアピンステム内、または４つのヘアピンステム内に存在し得る。ヘアピンステムは、１つの架橋剤、２つの架橋剤、３つの架橋剤、４つの架橋剤、５つの架橋剤、６つの架橋剤、７つの架橋剤、８つの架橋剤などを含み得る。１つまたは複数の架橋剤は、ステム間の塩基対合していないヌクレオチドに存在し得る。その代わりにまたは組み合わせて、１つまたは複数の架橋剤は、ステム領域間の１つまたは複数のヌクレオチドに存在し得る。

１つまたは複数の架橋剤は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡ）の骨格上に位置し得る、または架橋剤で修飾されたヌクレオチドとして含まれ得る。ヌクレオチド修飾は、（ａ）５’末端修飾または３’末端修飾を含めた末端修飾；（ｂ）塩基の置換えまたは除去を含めた核酸塩基（または「塩基」）修飾；（ｃ）２’位、３’位および／または４’位における修飾を含めた糖修飾；ならびに（ｄ）リン酸ジエステル連結の修飾または置換えを含めた骨格修飾を含み得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、２’フルオロ－アラビノ核酸、三環－ＤＮＡ（ｔｃ－ＤＮＡ）、ペプチド核酸、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、エチレン－架橋核酸（ＥＮＡ）、ホスホジアミデートモルホリノ、（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）、またはこれらの組合せを含み得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオエート連結を有するヌクレオチド、ボラノホスフェート連結を有するヌクレオチド、または架橋核酸（ＢＮＡ）を含み得る。天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、２’－０－メチル類似体、２’－デオキシ類似体、２－チオウリジン類似体、Ｎ６－メチルアデノシン類似体、または２’－フルオロ類似体であり得る。

一部の場合では、ポリヌクレオチドは、５’末端の最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチドに修飾されたヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド間連結を含み得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドは、３’末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチドに修飾されたヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド間連結を含み得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドは、５’末端の最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチドまたは３’末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチドに修飾されたヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド間連結を含み得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドは、５’末端の最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド、および３’末端の最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチドに修飾されたヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド間連結を含み得る。修飾は、２’－Ｏ－メチル類似体および／または３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結であり得る。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾された塩基を含み得る。１つまたは複数の修飾された塩基は、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ＾メチルプソイドウリジン（ｍｅｌＰ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、または７－メチルグアノシンであり得る。

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの３’末端および５’末端を、例えば、３’または５’連結を修飾することにより、ヌクレアーゼから実質的に保護することができる（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号およびＷＯ９８／１３５２６）。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを、１つまたは複数の「ブロッキング基」を含めることによって抵抗性にすることができる。１つまたは複数の「ブロッキング基」は、ポリヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに保護基としてまたは合成用のカップリング基としてのいずれかで付着させることができる置換基（例えば、ＯＨ基以外）であり得る（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３）、グリコール（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）リン酸（ＰＯ３２－）、水素ホスホネート、またはホスホロアミダイト）。１つまたは複数のブロッキング基は、修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ抵抗性構造を含めた、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの５’末端および３’末端を保護することができる１つまたは複数の「末端ブロッキング基」または１つまたは複数の「エキソヌクレアーゼブロッキング基」であり得る。

１つまたは複数の末端ブロッキング基は、キャップ構造（例えば、７－メチルグアノシンキャップ）、例えば３’－３’または５’－５’末端逆位を有する逆向きヌクレオモノマーであり得る（例えば、Ｏｒｔｉａｇａｏｅｔａｌ．１９９２．ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．２：１２９を参照されたい）、メチルホスホネート、ホスホロアミダイト、非ヌクレオチド基（例えば、非ヌクレオチドリンカー、アミノリンカー、コンジュゲート）など。３’末端ヌクレオモノマーは、修飾された糖部分を含み得る。例えば、３’－ヒドロキシルをヌクレオチドに対して３’→３’ヌクレオチド間連結を通じてエステル化することができる。例えば、アルキルオキシラジカルは、メトキシ、エトキシ、またはイソプロポキシであり得る。必要に応じて、３’末端において３’→３’連結したヌクレオチドを置換連結によって連結することができる。ヌクレアーゼ分解を低減するために、最も５’側の３’→５’連結を、修飾された連結、例えば、ホスホロチオエートまたはＰ－アルキルオキシホスホトリエステル連結にすることができる。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、１つまたは複数の標識またはタグを含み得る。１つまたは複数の「標識」または「タグ」は、別の分子、例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドまたはそのセグメントに付着させて、他の分子を容易に検出することができる手段をもたらすことができる分子であり得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、蛍光性、発光性、放射性、酵素的に活性なものなどの標識を含み得る。１つまたは複数の標識として、蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、２，７－ジメトキシ－４，５－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシ－２，４，７，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射性標識、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ；などを挙げることができる。１つまたは複数の標識は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを親和性が高い結合パートナー、例えば、アビジン、特異的抗体などを有するビオチン、ハプテンなどとコンジュゲートし、結合パートナーを検出可能な標識とコンジュゲートする、二段階系であり得る。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数のステムループＲＮＡ結合性タンパク質（ＲＢＰ）と相互作用することができる１つまたは複数のステムループを含み得る。これらのステムループは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）とＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）の相互作用またはＣＲＩＳＰＲ複合体と標的ＤＮＡの結合に悪影響が及ばないように位置付けることができる。１つまたは複数のステムループをＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）の外側に置くことができる。１つまたは複数のステムループＲＮＡ結合性タンパク質は、例えば、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑｐ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、Ｆｌ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、Ｓ１、Ｓ１ｍ、７ｓ、またはＰＲＲ１であり得る。

一部の場合では、ステムループＲＮＡ結合性タンパク質（ＲＢＰ）は、ステムループＲＮＡと１種もしくは複数種の他のタンパク質もしくはポリペプチド、または１つもしくは複数の機能的ドメインのどちらにも結合することができるアダプタータンパク質（すなわち、媒介体）として作用し得る。アダプタータンパク質は、１つまたは複数の機能的ドメインを含み得るエフェクタータンパク質または融合体を動員することができる。一部の場合では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、１つまたは複数の機能的ドメインを有する融合タンパク質であり得る。
１．修飾の型

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡ）を、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質へのロックが容易になるように修飾することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）分子をＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質にロックするための修飾は、ｓｇＲＮＡ上のヌクレオチドを機能的な架橋基で修飾することを含み得る。

修飾されたヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）に導入することができる。適切な方法は、例えば、（自動または半自動）オリゴヌクレオチド合成デバイスを、例えば、３’から５’への方向で使用する合成方法である。そのようなデバイスは、マイクロアレイ、ポリメラーゼ循環アセンブリ（ＰＣＡ）、マイクロチップなどを含み得る。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、糖部分を含み得る。糖部分は、天然の、修飾されていない糖、例えば、単糖（例えば、ペントース、例えば、リボース、デオキシリボース）、修飾された糖、または糖類似体であり得る。一部の場合では、糖部分は、１つもしくは複数のヒドロキシル基がハロゲン、ヘテロ原子、脂肪族基で置き換えられたものであり得る、または、１つもしくは複数のヒドロキシル基がエーテル、アミン、チオールなどに官能化されたものであり得る。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、リボースの２’位に１つまたは複数の修飾を含み得る。リボースの２’位の１つまたは複数の修飾は、例えば、細胞の状況下で免疫刺激を低減するために導入することができる。２’部分は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、Ｈ２、ＨＲ、Ｒ２またはＯＮであり得、ＲはＣ１～Ｃ６のアルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、ＣＩ、ＢｒまたはＩである。糖修飾の例としては、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミンオリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、２’－０－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン－５’－三リン酸、２’－メチルウリジン－５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびそれらの異性体（２’－アラシチジン－５’－三リン酸、２’－アラウリジン－５’－三リン酸）、アジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、およびこれらの組合せが挙げられる。糖修飾されたリボヌクレオチドは、２’ＯＨ基がＨ、アルコキシ（もしくはＯＲ）、Ｒもしくはアルキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、アミノ（例えば、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２など）、またはＣＮ基で置き換えられたものであり得、Ｒは低級アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。２’位における修飾は、メチル基であり得る。

ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の核酸塩基修飾されたリボヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数の修飾されたリボヌクレオチドは、５’位において修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば、５’（２－アミノ）プロピルウリジンまたは５’－ブロモウリジン；８位において修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば、８－ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン；ならびにＮ－アルキル化されたヌクレオチド、例えば、Ｎ６－メチルアデノシンなどの、天然に存在しない塩基を含有し得る（天然に存在する塩基の代わりに）。

核酸塩基修飾されたリボヌクレオチドは、ｍ５Ｃ（５－メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５－メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６－メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２－チオウリジン）、Ｕｍ（２’－０－メチルウリジン）、ｍｌＡ（１－メチルアデノシン）、ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）、Ａｍ（２－１－Ｏ－メチルアデノシン）、ｍｓ２ｍ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン）、ｉ６Ａ（Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）、ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン）、ｉｏ６Ａ（Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン）、ｔ６Ａ（Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｈｎ６Ａ（Ｎ６．－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、Ａｒ（ｐ）（２’－０－リボシルアデノシン（リン酸）、Ｉ（イノシン）、ｍｉｌ（１－メチルイノシン）、ｍ’ｌｍ（ｌ，２’－０－ジメチルイノシン）、ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）、Ｃｍ（２Ｔ－０－メチルシチジン）、ｓ２Ｃ（２－チオシチジン）、ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）、ｆ５Ｃ（５－フォンニルシチジン）、ｍ５Ｃｍ（５，２－Ｏ－ジメチルシチジン）、ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）、ｋ２Ｃ（リシジン）、ｍｌＧ（１－メチルグアノシン）、ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）、ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）、Ｇｍ（２’－０－メチルグアノシン）、ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）、ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’－０－ジメチルグアノシン）、ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－０－トリメチルグアノシン）、Ｇｒ（ｐ）（２’－０－リボシルグアノシン（リン酸）、ｙＷ（ワイブトシン）、ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ＊（未修飾ヒドロキシワイブトシン）、ｉｍＧ（ワイオシン）、ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）、Ｑ（キューオシン）、ｏＱ（エポキシキューオシン）、ｇａｌＱ（ガルタクトシル－キューオシン）、ｍａｎＱ（マンノシル－キューオシン）、ｐｒｅＱｏ（７－シアノ－７－デアザグアノシン）、ｐｒｅＱｉ（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）、Ｇ（アルカエオシン）、Ｄ（ジヒドロウリジン）、ｍ５Ｕｍ（５，２’－０－ジメチルウリジン）、ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）、ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）、ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－０－メチルウリジン）、ａｃｐ３Ｕ（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）、ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）、ｍｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）、ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）、ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）、ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））、ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）、ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）、ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ－メトキシカルボニルメチル－２－Ｏ－メチルウリジン）、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）、ｎｍ５ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン）、ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）、ｎｃｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－０－メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）、ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－Ｌ－Ｏメチルウリジン）、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン）、Ｔｍ（２’－０－メチルイノシン）、ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）、ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２－０－ジメチルシチジン）、ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）、ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）、ｃｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）、ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ－０－ジメチルアデノシン）、ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，０－２－トリメチルアデノシン）、ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７－ジメチルグアノシン）、ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン）、ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ－０－ジメチルウリジン）、ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）、ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－０－メチルシチジン）、ｍｌＧｍ（１，２’－０－ジメチルグアノシン）、ｍ’Ａｍ（１，２－０－ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）、ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ－タウリノメチル－２－チオウリジン））、ｉｍＧ－１４（４－デメチルグアノシン）、ｉｍＧ２（イソグアノシン）、またはａｃ６Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８－オキソ－アデニン、その７置換誘導体、ジヒドロウラシル、プソイドウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－アミノウラシル、５－（Ｃ１～Ｃ６）－アルキルウラシル、５－メチルウラシル、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニルウラシル、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルキニルウラシル、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－（Ｃ１～Ｃ６）－アルキルシトシン、５－メチルシトシン、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルケニルシトシン、５－（Ｃ２～Ｃ６）－アルキニルシトシン、５－クロロシトシン、５－フルオロシトシン、５－ブロモシトシン、Ｎ２－ジメチルグアニン、７－デアザグアニン、８－アザグアニン、７－デアザ－７置換グアニン、７－デアザ－７－（Ｃ２～Ｃ６）アルキニルグアニン、７－デアザ－８置換グアニン、８－ヒドロキシグアニン、６－チオグアニン、８－オキソグアニン、２－アミノプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２，４－ジアミノプリン、２，６－ジアミノプリン、８－アザプリン、置換７－デアザプリン、７－デアザ－７置換プリン、７－デアザ－８置換プリン、およびこれらの組合せであり得る。

核酸塩基修飾されたリボヌクレオチドは、アミノプリン、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ））、５－ブロモｄＵ、デオキシウリジン、逆向きｄＴ（ＩｎｖｅｒｔｅｄｄＴ）、逆向きジデオキシ－Ｔ、ジデオキシ－Ｃ、５－メチルｄＣ、Ｓｕｐｅｒ（Ｔ）、Ｓｕｐｅｒ（Ｇ）、５－ニトロインドール、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、ヒドロキシメチルｄＣ、イソｄＧ、イソｄＣ、フルオロＣ、フルオロＵ、フルオロＡ、フルオロＧ、２－メトキシエトキシＭｅＣ、２－メトキシエトキシＧ、または２－メトキシエトキシＴであり得る。
ａ．ロックのための化学架橋剤

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）へのロックが容易になるように修飾することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の架橋剤を含み得る。１つまたは複数の架橋剤は、例えばポリマー間に共有結合を形成する官能基、例えば、イソシアネートなどであり得る。１つまたは複数の架橋剤は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドであり得る。架橋は、バイオコンジュゲーションを伴い得る。バイオコンジュゲーション架橋試薬は、アミンおよびスルフヒドリルなどの官能基と反応する反応性基を含有し得る。バイオコンジュゲーション架橋剤は、例えば、マレイミド、ハロアセチル、アジリジン、アクリロイル、アルコキシアミン、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢ－チオール、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡなどのスルフヒドリル反応性基を含み得る。バイオコンジュゲーション架橋剤は、例えば、スクシンイミジルエステル（ＮＨＳエステル）、スルホニルクロリド、アルデヒド、カルボジイミド、アシルアジ化物、アリールアジド、無水物、フルオロベンゼン、炭酸塩、イミドエステル、エポキシド、フルオロフェニルエステル、ホスホロアミダイトなどのアミン反応性架橋剤反応性基も含み得る。

架橋剤のさらなる非限定的な例は、以下の化合物に由来するものであり得る：チオール＋チオール、チオール＋マレイミド、ＮＨＳエステル＋アミン、カルボン酸＋ＮＨＳ＋アミン、アジド＋ホスフィン（シュタウディンガーライゲーション）、カルボニル化合物＋アミン、カルボニル化合物＋Ｏ置換ヒドロキシルアミン、ジアジリン＋Ｃ－Ｈ／Ｏ－Ｈ、Ｎ－Ｈ、ハロ酢酸塩＋チオール、アジド＋アルキン、ニトロン＋アルキン、ニトリル酸化物＋アルキン、テトラジン＋アルケン、４－チオウリジン、５’－アジドウリジン、５－ブロモウリジン、８－アジドアデノシン、５－（（４－アジドフェナシル）チオ）ウリジン。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドを含むように修飾することができる。非天然ヌクレオチドは、塩基、糖、および／またはリン酸部分に対する１つまたは複数の修飾を含有するヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数の修飾は、１つまたは複数の化学修飾を含み得る。１つまたは複数の修飾は、例えば、３’ＯＨ基もしくは５’ＯＨ基の修飾、骨格の修飾、糖構成成分の修飾、および／またはヌクレオチド塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）の修飾であり得る。１つまたは複数の修飾は、架橋のための１つまたは複数のリンカー分子の付加を含み得る。１つまたは複数のリンカー分子は、アミノ酸と共有結合を形成するように構成されたものであり得る。１つまたは複数のリンカー分子は、アミノ酸と非共有結合を形成するように構成されたものであり得る。一態様では、修飾された塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、もしくはチミン以外の塩基（修飾されたＤＮＡに関して）、またはアデニン、グアニン、シトシンもしくはウラシル以外の塩基（修飾されたＲＮＡに関して）を含む。一部の実施形態では、修飾は、修飾された形態のアデニン、グアニン、シトシンもしくはチミン（修飾されたＤＮＡに関して）または修飾された形態のアデニン、グアニン、シトシンもしくはウラシル（修飾されたＲＮＡに関して）に対するものである。非天然ヌクレオチドは、糖、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合、プリンまたはピリミジン残基において、共有結合性リンカーの官能基を含むように共有結合により修飾されたヌクレオチドであり得る。例えば、Ｓｌｅｔｔｅｎｅｔａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００９）４８：６９７４－６９９８；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００４）８：５７０－９；Ｂｅｈｌｋｅｅｔａｌ．，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（２００８）１８：３０５－１９；Ｗａｔｔｓ，ｅｔａｌ．，Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ（２００８）１３：８４２－５５；Ｓｈｕｋｌａ，ｅｔａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ（２０１０）５：３２８－４９を参照されたい。非天然ヌクレオチドは、糖、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合、プリンまたはピリミジン残基において、官能基を含むように修飾された、例えば、共有結合により修飾されたヌクレオチドを含み得る。共有結合性リンカーは、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、フルホン、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、感光性連結、ディールス・アルダー環化付加対または閉環メタセシス対、およびマイケル反応対などのＣ－Ｃ結合形成基からなる群から選択される化学的部分であり得る。化学結合は、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、スルホン、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、感光性連結、ディールス・アルダー環化付加対または閉環メタセシス対、およびマイケル反応対などのＣ－Ｃ結合形成基に基づくものであり得る。

例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の非天然ヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質内の近くのシステインアミノ酸と架橋し、それにより、チオエーテル結合を形成するためにマレイミドを含み得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を架橋させることができる非天然ヌクレオチドを組み込むための１つの技法は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）のヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質において見出されるシステインと反応する化学基、例えばマレイミドなどで修飾することを伴い得る。マレイミドを含む非天然ヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインのチオール側鎖と反応することにより、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を架橋させることができる。図６は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の隣接するシステインとの架橋のための非天然ヌクレオチドの例示的な場所の結晶構造を示す。具体的には、構造は、非天然ヌクレオチドであるヌクレオチド２２位（左側の白色の丸）と、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質上の隣接アミノ酸である、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の８０位のシステイン（右側の白色の丸）を示す。上記の通り、ｓｇＲＮＡの２２位と４９位を図７Ｂに見られるようにウリジンとアデニンの切り換えされるように修飾し、ＲＮＡヌクレオチド４９位にウラシル（Ｕ４９）を残すことができる。Ｕ４９の非天然ヌクレオチドは、Ｕ４９の糖分子を、ＳｐＣａｓ９上のＣｙｓ８０と相互作用する架橋性部分を含むように修飾することによって組み込むことができる。ウリジンとアデニンの切り換えで修飾することができる、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有するｓｇＲＮＡの他の位置は、Ｕ７２／Ａ７７、Ｕ７１／Ａ７８、およびＵ９４／Ａ８４である。ｓｇＲＮＡの７７位、７８位および８４位のウラシルヌクレオチドを、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの隣接アミノ酸と共有結合を形成するように、本明細書に記載の架橋基で修飾することができる。

図８は、リンカー基を用いてヌクレオチドを修飾する典型的な方法の概略を示す。ホスホロアミダイトヌクレオチドを、スペーサーおよびマレイミド基と付着した求核試薬と反応させる。入ってくる求核試薬でホスホロアミダイトヌクレオチドのリンカー基が置き換えられ、マレイミドに付着したスペーサーが残される。チオール基を有するシステインの近傍になった場合、例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合、マレイミドは、生理的条件下でシステインと共有結合性のチオエーテル結合を形成し得る。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を架橋させるための１つの技法は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）のヌクレオチドを修飾して、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質内のリシンの側鎖上に見出される第一級アミンと反応する化学基、例えば、ＮＨＳエステル、エポキシド、アルデヒド、アシルアジ化物などを有する非天然ヌクレオチドを創出することを伴い得る。

図９は、ｓｇＲＮＡのネイティブなウラシルヌクレオチドが強調表示されたＣＲＩＳＰＲ複合体の結晶構造を示す。ウラシルヌクレオチドは、２２位、２３位、２４位、２５位、３１位、３７位、４４位、４５位、５０位、５６位、５９位、６３位、６４位、６６位、７１位、７２位、８０位、９０位、および９４位に存在する。これらの残基を、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋を形成するように官能化することができる。

図１０は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ複合体の結晶構造の非限定的な例を示す。ｓｇＲＮＡの４４位のウラシルが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のチロシン３２５の近傍にあることに起因して修飾に適するものとして強調表示されている。

図１１は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ複合体の結晶構造の非限定的な例を示す。ｓｇＲＮＡの５９位のウラシルが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のチロシン８１の近傍にあることに起因して修飾に適するものとして強調表示されている。

図１２は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ複合体の結晶構造の非限定的な例を示す。ｓｇＲＮＡの６６位のウラシルが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のアルギニン１１７１の近傍にあることに起因して、修飾に適するものとして強調表示されている。

図１３は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ複合体の結晶構造の非限定的な例を示す。ｓｇＲＮＡの６３位のウラシルが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のアルギニン６４およびリシン６５の近傍にあることに起因してジアジリン修飾に適するものとして強調表示されている。
ｂ．ロックするための光反応性架橋剤

本発明で提供されるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、１つまたは複数の感光性リンカー、例えば、アリールアジド（フェニルアジド）およびジアジリンを含み得る。１つまたは複数の感光性基（リンカー）を、光由来のエネルギーを開始に使用することができる光化学架橋反応に使用することができる。１つまたは複数の感光性基は、紫外線または可視光線に曝露すると反応性になる、化学的に不活性な化合物であり得る。バイオコンジュゲーション技法に使用するための架橋性化合物に組み入れられる１つまたは複数の感光性基は、アリールアジド、アジド－メチル－クマリン、ベンゾフェノン、アントラキノン、ジアゾ化合物、ジアジリン、およびソラレン誘導体であり得る。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）をＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との架橋反応のためにソラレンで修飾することができる。ソラレンは、ＲＮＡまたはＤＮＡと排他的に反応させることができ、また、核酸を標識するためまたはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを架橋させるために使用することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに組み入れることができる感光性基で修飾されたヌクレオチドは、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＰＴ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、－ＡＰＡＳ－ＵＴＰ、８－Ｎ（３）ＡＭＰ、５－［Ｎ－（４－ベンゾイル－ベンゾイル）－３－アミノアリル］－デオキシウリジン三リン酸（ＢＰ－ｄＵＴＰ、ベンゾフェノンで修飾されたもの）、５－［Ｎ－（４－アジド－２，３，５，６－テトラフルオロベンゾイル）－３－アミノアリル］－デオキシ－ウリジン三リン酸（ＦＡＢ－ｄＵＴＰ、全フッ素置換アリールアジドで修飾されたもの）、５－｛Ｎ－［４－［３－（トリフルオロメチル）－ジアジリン－３－イル］ベンゾイル］－３－アミノアリル｝－デオキシウリジン三リン酸（ＤＢ－ｄＵＴＰ、ジアジリンで修飾されたもの）、および５－［Ｎ－（ｐ－アジドベンゾイル）－３－アミノアリル］－デオキシウリジン三リン酸（ＡＢ－ｄＵＴＰ、アリールアジドで修飾されたもの）を含み得る。

架橋は、光開始によるものであり得る。紫外線領域内およびその付近の波長を生じさせる発光デバイスを、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と例えば水素結合によって結合したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を有する溶液を、発光デバイスのそばを通過するとその波長に曝露させることができるように設置する。この曝露により、感光性基の光開始およびＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）とＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を上記の通り連結する共有結合の形成が導かれる。

光開始のための光の波長は、２２０～４６５ｎｍにわたり得る。曝露プロトコールにおける光の強度は、約１５、２０、２５、３５、４０、５０、７０、９０、１１０、１２０、１４０、１６０、１７５、１９０、２００、２２０、２４０、２６０２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６５０、６７５、７００、７２０、７４５、７６５、７９０、８１０、８３０、８５０、８７０、９００、９２０、９４５、９６５、９８５、１０００、１０２５、１０５０、１０８０、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２４０、１２７５、１２９０、１３２０、１３５０、１３８０、１４００、１４２０、１４５０、１４７０、１４９０、１５２０、１５４０、１５６０、１６００、１６３０、１６５０、１６７０、１７００、１７２０または１７５０ｍＷ／ｃｍ^２であり得る。曝露プロトコールにおいて使用される光の出力ワット数は、ＯＡＩ３０６ＵＶパワーメーターによって測定して、約５０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１７５、１９０、２１０、２３０、２５０、２７０、２９０、３１０、３３０、２５０、３７０、３９０、４２０、４５０、４８０、５００、５３０、５５０、５７０、６００、６２０、６５０、６７０、７００、７２０、７５０、７７０、８００、８２０、８５０、８７０、９００、９２０、９５０、９７０、１０００、１０２０、１０５０、１０７０、１１００、１１２０、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、または６０００Ｗであり得る。

曝露の持続時間は、１秒間から３０分間までであり得る。曝露プロトコールは、連続した曝露またはパルス状曝露またはその両方を含み得る。パルス曝露の持続時間は均一であっても変動してもよい。架橋を開始させるための曝露時間は、選択される架橋剤に依存し得る。例えば、ＵＶ光に曝露すると、ジアジリンは、半減期がナノ秒規模の反応性カルベンを生じ得る。アリールアジドは、ＵＶ光に曝露すると、半減期がミリ秒規模の反応性カルベンを形成し得る。曝露時間はまた、反応に利用可能なＣ－Ｈ基からカルベンまでの距離にも依存し得る。

架橋に使用される１つまたは複数の感光性基は、光の波長によって活性化することができる。波長により、特定の頻度の光子を通じた感光性基の電子殻の励起がもたらされ得る。反応は励起すると起こり得、これにより、架橋反応に共有結合形成のタイミングに関して柔軟性が付与され得る。１つまたは複数の感光性基を、紫外線波長によって活性化されるように選択することができる。

架橋をｉｎｖｉｔｒｏにおいて生じさせることができる。適当なフォールディングおよびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドへの付着を確実にするために、生理的条件を使用することができる。生理的条件は、試薬、例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴおよび５％（ｖ／ｖ）グリセロールを有する溶液を含み得る。温度は約２５℃または３７℃であり得る。

個々のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質からのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を容易にするために、準備される比（例えば、モル比）（ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド：ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質）は、約０．００１：１、０．０１：１、０．１：１、０．２：１、０．３：１、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２５：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、およびその間の任意の変動であり得る。比（例えば、モル比）（ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド：ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質）は、約０．００１：１～約０．０１：１、約０．０１～約０．１：１、約０．１：１～約１：１、約１：１～約１０：１、または約１０：１～約１００：１、または約１００：１～約１０００：１であり得る。

架橋は、ｉｎｖｉｖｏにおいて、例えば、細胞を、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと結合していないまたは結合したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の溶液と接触させた後に生じさせることもできる。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）および／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を細胞において核酸から発現させることができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）をＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）にロックする（例えば、共有結合により架橋させる）ために、細胞をＵＶ光に曝露させることができる。細胞は、外胚葉系（例えば、ニューロンおよび線維芽細胞）、中胚葉系（例えば、心筋細胞）、内胚葉系（例えば、膵臓細胞）、上皮（例えば、肺および鼻道）、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、破骨細胞、内皮細胞、造血、赤血球などであり得る。細胞は、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯＫ１）；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２－ＯＳ細胞；ＮＩＨ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ－５６２細胞、Ｕ－９３７細胞；ＭＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；ジャーカット細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ－１０８０細胞；ＨＣＴ－１１６細胞；Ｈｕ－ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；ならびにＭｏｌｔ４細胞などの特定の細胞系に由来するものであり得る。本開示の範囲に適用可能な他の細胞の例としては、幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ＭＳＣ－１、Ｋ５６２などを挙げることができる。

架橋のタイミングは、選択される架橋性官能基に依存し得る。光反応性架橋剤の場合では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド複合体の、例えば光への曝露を、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを溶液中に混合した後に生じさせることができる。

光、例えばＵＶ光への曝露の持続時間は、１秒間から３０分間までであり得る。光、例えばＵＶ光への曝露の持続時間は、２秒間未満、５秒間未満、１０秒間未満、２０秒間未満、３０秒間未満、４５秒間未満、５０秒間未満、１分間未満、２分間未満、５分間未満、１０分間未満、１５分間未満、２０分間未満、３０分間未満、４５分間未満であり得る。
２．ＣＲＩＳＰＲ活性をモジュレートするための修飾

一部の場合では、例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの効果を増大させるために、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのオフターゲット編集活性を低下させる１つまたは複数の修飾をＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えばｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに付加することができる。１つまたは複数の修飾は、糖部分、リン酸ジエステル連結、および／または塩基を含めた種々の場所に存在し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート連結、Ｏ－メチルホスホロアミダイト連結、および／またはペプチド核酸を含む骨格を含み得る。１つまたは複数の修飾は、２’フルオロ－アラビノ核酸、三環－ＤＮＡ（ｔｃ－ＤＮＡ）、ペプチド核酸、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、リボース環の２’炭素と４’炭素の間にメチレン架橋を含むロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）、エチレン－架橋核酸（ＥＮＡ）、ホスホジアミデートモルホリノ、またはこれらの組合せを含み得る。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するように少なくとも１つの非天然ヌクレオチドで修飾されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、切断特性を助長するように構成された配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するように少なくとも１つの非天然ヌクレオチドで修飾されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断特性は、妥当な条件下で、組み入れられた点におけるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断の傾向を変更することができる切断可能なエレメントによって変更することができる。「切断可能なエレメント」は、天然のヌクレオチドまたは１つもしくは複数の修飾されたヌクレオチドを含み得る。切断可能なエレメントは、核酸合成の間にＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）に組み入れることができる。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の２つまたはそれよりも多くの切断可能なエレメントは、異なる切断特徴を有し得、例えば、２つまたはそれよりも多くの切断可能なエレメントは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）に組み入れられた場合、異なる作用因子および／または反応条件を使用することによって互いの存在下で選択的に切断することができる。

本明細書で使用される場合、「切断すること（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」、「切断された（ｃｌｅａｖｅｄ）」および「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」という用語は全て、実質的に、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）内の切断可能なエレメントが存在する各ポイントでＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を切ることに関し得る。

切断は、作用因子によって開始することができる。作用因子は、例えば、切断可能なエレメントの切断を引き起こす化学的実体または物理的な力であり得る。作用因子は、化学物質もしくは化学物質の組合せ、生体分子もしくは生体分子の組合せ、正常なもしくは可干渉性の（レーザー）可視光もしくは紫外線（ＵＶ）光、熱または他の形態の電磁気エネルギーであり得る。一部の場合では、作用因子、例えば、２つまたはそれよりも多くの作用因子の組合せを同時にまたは逐次的に使用してＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を切断することができる。同時にとは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を２つまたはそれよりも多くの作用因子に同じ時間に曝露させることができるが、２つまたはそれよりも多くの作用因子はＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と１つずつ反応することができることを意味する。逐次的にとは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を１つの作用因子と接触させ、次いで、その後に第２の作用因子と接触させることができることを意味する。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋させるための１つまたは複数の非天然ヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、１つよりも多くの型の切断可能なエレメントを含み得る。一部の実施例では、第１の切断可能なエレメントと第２の切断可能なエレメントは同じ切断特徴を有する。一部の実施例では、第２の切断可能なエレメントは第１の切断可能なエレメントとは異なる切断特徴を有する。例えば、第１の切断可能なエレメントは光切断可能なリンカーであり得、第２の切断可能なエレメントは化学的ヌクレアーゼによる切断を受けやすい場合がある。別の例では、第１の切断可能なエレメントは化学的ヌクレアーゼによる切断を受けやすく、第２の切断可能なエレメントは光切断可能になるように工学的に作製されていてよく、それにより、オルソゴナルな（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）処理レジメンを適用することが可能になる。一部の場合では、同じ切断可能なエレメントは、１つよりも多くの型の切断特徴を有し得る。第１の切断可能なエレメントおよび第２の切断可能なエレメントは、本明細書に記載の任意の切断可能なエレメントであり得る。

切断可能なエレメント（例えば、切断可能なリンカー）は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を妥当な条件下での切断を受けやすいものにする、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）の２つまたはそれよりも多くの構成物を接続することができる実体を指し得る。例えば、妥当な条件は、ＵＶ光への曝露であり得る。切断可能なリンカーは、妥当な条件下で切れやすい１つまたは複数の修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドを含み得る。

切断可能なリンカーは、修飾されたヌクレオシド間連結を含み得る。修飾されたヌクレオシド間連結は、リン原子を有するヌクレオチド間連結またはリン原子を有さないヌクレオチド間連結であり得る。リン原子を含有するヌクレオシド間連結としては、例えば、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステラーゼ、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、および３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めた他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含めたホスホラミデート、Ｐ－エチオキシホスホジエステル、Ｐ－エトキシホスホジエステル、Ｐ－アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェート、ならびにリンを含有しない連結、例えば、アセタールおよびアミド、例えば、これらの通常の３’－５’連結を有することが当技術分野で公知であるもの、２’－５’連結類似体、および１つまたは複数のヌクレオチド間連結が３’－３’、５’－５’または２’－２’連結である逆極性を有するものなどが挙げられる。逆極性を有するポリヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間連結において単一の３’－３’連結、すなわち、塩基を欠くもの（核酸塩基が欠損しているまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）であり得る単一の逆方向ヌクレオシド残基を含み得る。

リンを含有しないヌクレオシド間連結としては、短鎖アルキル、シクロアルキル、混合ヘテロ原子アルキル、混合ヘテロ原子シクロアルキル、１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子および１つまたは複数の短鎖複素環が挙げられる。これらのヌクレオシド間連結としては、これだけに限定されないが、シロキサン、硫化物、スルホキシド、スルホン、アセチル、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、アルケニル、スルファミン酸；メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、アミドおよび混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するその他が挙げられる。他のリン原子を含有しない修飾されたヌクレオシド間連結としては、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－（メチレン（メチルイミノ）骨格として公知）、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－および－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－が挙げられる。

切断可能なリンカーは、非ヌクレオチドの性質であり得る。「非ヌクレオチド」は、糖および／またはリン酸置換のいずれも含めた、１つまたは複数のヌクレオチド単位の代わりにポリヌクレオチド鎖に組み入れることができる任意の基または化合物を指し得る。基または化合物は、例えば糖のＣ１位に、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなどの一般に理解されるヌクレオチド塩基を含有しないという点で、塩基を欠くものであり得る。

非ヌクレオチドリンカーは、例えば、塩基を欠く残基（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール（スペーサー９）もしくはヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）などのオリゴエチレングリコール、またはブタンジオールなどのアルカン－ジオールであり得る。スペーサー単位は、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合によって連結していることが好ましい場合がある。リンカー単位は、例えば、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、またはアミド連結を介して、分子内にただ１回出現し得る、または数回組み入れることができる。別の好ましいリンカーは、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ１２アミノリンカーなどのアルキルアミノリンカー、および同様にＣ３またはＣ６チオールリンカーなどのアルキルチオールリンカーである。一部の実施例では、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性連結部分を使用してペプチドおよびタンパク質をヌクレオチドとコンジュゲートすることができる。例としては、５’－アミノ－修飾因子Ｃ６および３’－アミノ－修飾因子Ｃ６試薬が挙げられる。
ａ．ＣＲＩＳＰＲオン

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と共有結合により架橋してＣＲＩＳＰＲオン複合体を形成し得るＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが本発明で提供される。ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドは、（ｉ）標的分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成された配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と、（ｉｉｉ）第１のガイド配列の５’側の配列エレメントとを含み得る。第１のガイド配列の５’側の配列エレメントは、ポリヌクレオチドリーダー配列と称することができる。第１の配列エレメントは、二次構造、例えばステムループを含み得る。ステムループは、約３塩基対（ｂｐ）から約３０ｂｐまでを含み得る。第１の配列エレメントの５’末端は、ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングし得る。一部の場合では、第１の配列エレメントの５’末端はガイド配列とアニーリングする。ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドは、第１の切断可能なエレメント、例えば、第１の天然に存在しない切断可能なエレメント、例えば、感光性リンカーをさらに含み得る。切断可能なエレメントは、ガイド配列のすぐ５’側に位置付けることができる。切断可能なエレメントは、光、小分子、または１つまたは複数の細胞プロセスによる切断を受けやすい場合がある。ポリヌクレオチドリーダー配列は、ガイド配列の標的配列とアニーリングする能力に干渉し得る。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と、架橋したＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドとを含む複合体（例えば、図１７Ａを参照されたい）をアセンブルすることができる。第１のガイド配列の５’側の配列エレメントを有する架橋したＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、第１の配列エレメントを有さない架橋したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い標的特異的活性を有し得る；例えば、活性は、約２分の１～約１００分の１であり得る。標的核酸、例えば、ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ複合体の調整可能なターゲティングのための方法が本発明で提供される。方法は、切断可能なエレメントを切断因子で切断し（例えば、図１７Ａを参照されたい）、それにより、第１のガイド配列の５’側の配列エレメントを遊離させる（例えば、図１７Ｃを参照されたい）ステップを含み得る。例えば、切断可能なエレメントは、感光性リンカーであり得、感光性リンカーは、光に曝露すると切断され得る。切断可能なリンカーの切断により、切断前のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも標的特異的切断活性が高いＣＲＩＳＰＲ複合体をもたらすことができる。

ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、第１のガイド配列の５’側の配列エレメントを含み得る。第１のガイド配列の５’側の配列エレメントは、ポリヌクレオチドリーダー配列と称することができる。ポリヌクレオチドリーダー配列を有するＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと架橋したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、ポリヌクレオチドリーダー配列を有さないＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い活性を有し得る。ポリヌクレオチドリーダー配列の除去により、活性が増大したＣＲＩＳＰＲ複合体（ＣＲＩＳＰＲオン）をもたらすことができる。
ｉ．ポリヌクレオチドリーダー配列の長さ

ポリヌクレオチドリーダー配列は、約１ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドまで、例えば、約５ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、または少なくとも４ヌクレオチド、３ヌクレオチド～約１５ヌクレオチド、例えば、約５ヌクレオチド～約１５ヌクレオチド、約３ヌクレオチド～約１０ヌクレオチド、約３～約１５ヌクレオチド、または約３ヌクレオチド～約１２ヌクレオチド、約４ヌクレオチド～約１３ヌクレオチド、約３ヌクレオチド～約１８ヌクレオチド、約４ヌクレオチド～約１９ヌクレオチド、４ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドまで、４ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで、５ヌクレオチドから約１２ヌクレオチドまで、５ヌクレオチドから約少なくとも４ヌクレオチド、または３０またはそれ未満のヌクレオチドの長さにわたり得る。
ｉｉ．ポリヌクレオチドリーダー配列の組成

ポリヌクレオチドリーダー配列は、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドリーダー配列は、非標準ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含み得る。ポリヌクレオチドリーダー配列は、本明細書に記載の任意のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間連結を含み得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列は、本明細書に記載の任意のリンカーを含み得る。
ｉｉｉ．ポリヌクレオチドリーダー配列の二次構造

ポリヌクレオチドリーダー配列は、二次構造を形成し得るまたはそれを形成するように設計することができる。二次構造は、例えば、ステムループ構造であり得る。ステムループのステムは、相補的なＸ配列とＹ配列で構成される少なくとも約３ｂｐを含み得る（Ｘはステムの一方の鎖の配列を表し、Ｙはステムの他方の鎖の配列を表す）。ステムは、少なくとも（または最大で）２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０塩基対を含み得る。ステムは、１～２０ｂｐ、または２～５ｂｐ、２～９ｂｐ、３～１０ｂｐ、４～９ｂｐ、５～１０ｂｐ、５～２０ｂｐ、６～２０ｂｐ、７～２０ｂｐ、８～２０ｂｐなどにわたる二重鎖ドメインを含み得る。一部の場合では、ステムの２つの鎖は共有結合により架橋結合していてよい。

ステムループは、一本鎖ループを含み得る。一本鎖ループは、１～５０塩基、例えば、３～５塩基、３～７塩基、４～１０塩基、５～２０塩基、６～２５塩基、３～２５塩基、３～３０塩基、４～３０塩基、または４～５０塩基にわたり得る。

ステムループまたはポリヌクレオチドリーダー配列の最も５’側の塩基は、ガイド配列のすぐ５’側のポリヌクレオチドリーダー配列内の塩基とアニーリングし得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列の最も５’側の塩基は、ガイド配列の最も５’側の塩基から１～２０塩基３’側、例えば、ガイド配列の最も５’側の塩基から２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１５塩基、または２０塩基３’側の塩基とアニーリングし得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列は、ガイド配列内の塩基と塩基対合する塩基を含まない。

ポリヌクレオチドリーダー配列は、１つまたは複数のバルジ（一本鎖配列の領域；これらの領域は、二次構造における配列塩基対合の１００％未満を含む位置に対応し得る）を含むヘアピンループまたはステムループ構造を形成し得る。１つまたは複数のバルジの数、長さ、および／または位置は、変動し得、ステムループ構造の全体的な安定性に影響を及ぼし得る。ポリヌクレオチドリーダー配列は、最適にフォールディングされた場合、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれよりも多くのバルジを含み得る。

一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列は、非ポリヌクレオチド部分を含み得る。ポリヌクレオチドリーダー配列内の非ヌクレオチド部分は、ビオチン、抗体、ペプチド、親和性、レポーターまたはタンパク質部分（例えば、ＮＨＳエステルまたはイソチオシアネートなど）、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼなどの酵素などであり得る。

一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列は二次構造を欠く。ポリヌクレオチドリーダー配列は、ヌクレオチドの一本鎖の連続したひと続きを含み得る、またはそれからなり得る。

ポリヌクレオチドリーダー配列によって形成されるステムループの融解温度は、約２５℃～約６０℃、または約３０℃～約５０℃、または約４０℃～約５０℃であり得る。
ｉｖ．ポリヌクレオチドリーダー配列による活性の低下

ポリヌクレオチドリーダー配列を有するＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと架橋したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、ポリヌクレオチドリーダー配列を有さないＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い活性を有し得る。一部の場合では、活性は、少なくとも（または最大で）０．１倍、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、２分の１、５分の１、１０分の１、５０分の１、１００分の１、または１０００分の１である。一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列を有するＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体は活性を有さない。活性は、例えば、酵素活性または転写活性化活性であり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が触媒として活性型のＣａｓタンパク質である場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的核酸を切断することができないものであり得る。別の例では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、転写活性化ドメインと融合した、触媒として不活性型のＣａｓタンパク質である場合、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的遺伝子の転写を活性化することができないものであり得る。
ｖ．ポリヌクレオチドリーダー配列の除去

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドリーダー配列の遊離を可能にするための１つまたは複数の切断可能なエレメントを含み得る。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ポリヌクレオチドリーダー配列とガイド配列の間に存在し得る。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ポリヌクレオチドリーダー配列内に存在する。一部の場合では、少なくとも１つの切断可能なエレメントがポリヌクレオチドリーダー配列内に存在し、少なくとも１つの切断可能なエレメントがポリヌクレオチドリーダー配列とガイド配列の間に存在する。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントはガイド配列の５’側に位置付けられた。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、少なくとも、または最大で、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の切断可能なエレメントであり得る。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントを、切断後にポリヌクレオチドリーダー配列の一部（例えば、１塩基、２塩基、５塩基、または１０塩基）がガイド配列と共有結合により連結したままになるように位置付ける。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントを、切断後に、ポリヌクレオチドリーダー配列のいずれもガイド配列と共有結合により付着したままにならないように位置付ける。

１つまたは複数の切断可能なエレメントは、本明細書に記載の任意の切断可能なエレメントであり得る。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、同じ型の切断可能なエレメントまたは異なる型の切断可能なエレメントであり得る。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる一方でＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合していない。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる一方でＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋している。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる一方でＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋し、標的配列に結合している。一部の場合では、ポリヌクレオチドリーダー配列により、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋することが妨げられる、またはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋する能力が、ポリヌクレオチドリーダー配列を欠くＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと比べて低下する；ポリヌクレオチドリーダー配列をＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドから切断することにより、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合する能力が増大し得る。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをｉｎｖｉｔｒｏで１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを細胞または生物体、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、霊長類、例えば、チンパンジー、ゴリラ、またはヒトにおいて１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる。

１つまたは複数の切断可能なエレメントにおけるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断のタイミングは、変動し得る。例えば、１つまたは複数の切断可能なエレメントをＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが細胞もしくは生物体に導入された直後に、または細胞もしくは生物体への導入の少なくとも（もしくは最大で）０．２５時間後、０．５時間後、０．７５時間後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１５時間後、１６時間後、１７時間後、１８時間後、１９時間後、２０時間後、２１時間後、２２時間後、２３時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、または９６時間後に切断することができる。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に１回曝露させることができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に１回よりも多く、例えば、２回、３回、５回、または１０回晒すことができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを、１つよりも多くの型の切断因子、例えば、少なくとも（または最大で）２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種の切断因子に曝露させることができる。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に種々の持続時間にわたって曝露させることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に０．１分間、０．５分間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、３０分間、６０分間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間にわたって曝露させることができる。

一部の場合では、試料は複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含み、切断因子を使用してある特定のパーセンテージのＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断することができる。例えば、切断因子（ｃｌｅａｖｉｎｇａｇｅｎｔ）を使用して、試料中のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの少なくとも（または最大で）５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を切断することができる。ある用量の切断因子（ｃｌｅａｖｉｎｇａｇｅｎｔ）を使用して、試料中のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの１００％を切断することができる。その量の切断が少なくとも（または最大で）１分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間にわたって起こり得る。

ポリヌクレオチドリーダー配列の遊離の結果、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと結合したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９）の活性の増大がもたらされ得る。一部の場合では、試料において、ポリヌクレオチドリーダー配列の遊離の結果、活性の少なくとも０．１倍、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、または１０００倍の増大がもたらされる。
ｖｉ．他の特色

ポリヌクレオチドリーダー配列を含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、標的特異的切断活性がより低い第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する修飾されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを生成するために特定の修飾を受けさせることができる１つまたは複数のエレメントの第２のセットを含み得る。１つまたは複数のエレメントの第２のセットは、１つまたは複数の切断可能なエレメントの第２のセットであり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドリーダー配列、および、ポリヌクレオチドリーダー配列の遊離が可能になるように構成された１つまたは複数の切断可能なエレメントの第１のセット、および残りのＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断が可能になるように構成された１つまたは複数の切断可能なエレメントの第２のセットを含み得る；このポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドと称することができる。
ｂ．ＣＲＩＳＰＲオフ

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋してＣＲＩＳＰＲオフ複合体を形成することができるＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドが本発明で提供される。ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成された配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と、（ｉｉ）切断可能なリンカーとを含み得る。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドは、標的分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列をさらに含む。切断可能なリンカーは、天然に存在しない切断可能なリンカーであり得る。ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドがガイド配列を含む場合、切断可能なリンカーは、ガイド配列の最も５’側の塩基の３’側に位置付けることができる（例えば、図１８を参照されたい）。切断可能なリンカーは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と架橋するように構成された配列内に位置付けることができる。一部の場合では、切断可能なリンカーのすぐ３’側および／またはすぐ５’側の塩基は、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド内の別の塩基とはアニーリングしない。切断可能なリンカーは、感光性リンカーであり得る。切断可能なリンカーは、光、小分子、または１つまたは複数の細胞プロセスによる切断を受けやすい場合がある。

ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のオフターゲット編集活性は、非ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、例えば、１つまたは複数の切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のオフターゲット編集活性よりも低いものであり得る。オフターゲット編集活性（例えば、本明細書に記載の通り測定される）は、約１．１分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、２１分の１、２２分の１、２３分の１、２４分の１、２５分の１、２６分の１、２７分の１、２８分の１、２９分の１、３０分の１、３１分の１、３２分の１、３３分の１、３４分の１、３５分の１、３６分の１、３７分の１、３８分の１、３９分の１、４０分の１、４１分の１、４２分の１、４３分の１、４４分の１、４５分の１、４６分の１、４７分の１、４８分の１、４９分の１、５０分の１、５１分の１、５２分の１、５３分の１、５４分の１、５５分の１、５６分の１、５７分の１、５８分の１、５９分の１、もしくは６０分の１；少なくとも１．１分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、２１分の１、２２分の１、２３分の１、２４分の１、２５分の１、２６分の１、２７分の１、２８分の１、２９分の１、３０分の１、３１分の１、３２分の１、３３分の１、３４分の１、３５分の１、３６分の１、３７分の１、３８分の１、３９分の１、４０分の１、４１分の１、４２分の１、４３分の１、４４分の１、４５分の１、４６分の１、４７分の１、４８分の１、４９分の１、５０分の１、５１分の１、５２分の１、５３分の１、５４分の１、５５分の１、５６分の１、５７分の１、５８分の１、５９分の１、もしくは６０分の１；または最大で１．１分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、２１分の１、２２分の１、２３分の１、２４分の１、２５分の１、２６分の１、２７分の１、２８分の１、２９分の１、３０分の１、３１分の１、３２分の１、３３分の１、３４分の１、３５分の１、３６分の１、３７分の１、３８分の１、３９分の１、４０分の１、４１分の１、４２分の１、４３分の１、４４分の１、４５分の１、４６分の１、４７分の１、４８分の１、４９分の１、５０分の１、５１分の１、５２分の１、５３分の１、５４分の１、５５分の１、５６分の１、５７分の１、５８分の１、５９分の１、または６０分の１に低下し得る。一部の場合では、低下は、切断因子、例えばＵＶ光への曝露の非存在下で生じる；一部の場合では、低下は、切断因子への曝露後に生じる。５７位および／または７４位に切断可能なリンカーを有するＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体は、切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質よりも低いオフターゲット編集効率を有し得る。ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体は、非ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、例えば、切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のオンターゲット編集効率と同じであるまたは１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、もしくは５％以内のオンターゲット編集効率を有し得る。

ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと架橋したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体をアセンブルすることができる。標的ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ複合体の調整可能なターゲティングのための方法が本発明で提供される。方法は、切断可能なリンカーの切断を含み得る。切断可能なリンカーの切断により、切断前よりも標的特異的切断活性が低いＣＲＩＳＰＲ複合体をもたらすことができる。一部の場合では、切断可能なリンカーの切断は、切断によって生成されたがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋していないＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの断片を、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質から解離させることができる。一部の場合では、切断可能なリンカーの切断により、ＣＲＩＳＰＲ複合体が不活性になる。
ｉ．１つまたは複数の切断可能なエレメントの位置

１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ガイド配列内の最も５’側の塩基（またはヌクレオチド）の３’側またはガイド配列内の最も３’側の塩基（またはヌクレオチド）の５’側に位置付けることができる。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ｃｒＲＮＡまたはガイド配列の５’末端の約１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基３’側に位置付けることができる。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ｃｒＲＮＡ配列またはガイド配列の３’末端から約１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基３’側に位置付けることができる。

１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に結合するように構成されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの配列、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内に位置付けることができる。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ｔｒａｃｒ配列の５’末端の１～３０塩基、例えば２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基３’側に存在し得る。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ｔｒａｃｒ配列の３’末端の１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基５’側に存在し得る。

一部の実施例では、１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）内の塩基（またはヌクレオチド）５６および／またはヌクレオチド７３のすぐ５’側または３’側に位置付けることができ、ここで、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）の最も５’側のヌクレオチドはヌクレオチド１である、またはヌクレオチド５７および／もしくはヌクレオチド７４に置き換わる。一部の実施例では、１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の塩基（またはヌクレオチド）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００のすぐ５’側または３’側に位置付けることができ、ここで、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）の最も５’側の塩基（またはヌクレオチド）は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の塩基（またはヌクレオチド）１である、または塩基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００に置き換わる。
ｉｉ．切断因子への曝露前の１つまたは複数の切断エレメントの影響

一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントを含み、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の切断可能なエレメントを有さない、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と比べて活性の低下を有さない（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に曝露させる前）。一部の場合では、１つまたは複数の切断可能なエレメントを含み、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の切断可能なエレメントを有さない、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と比べて活性の低下を有する（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に曝露させる前）。
ｉｉｉ．１つまたは複数の切断可能なエレメントの切断

１つまたは複数の切断可能なエレメントは、本明細書に記載の任意の切断可能なエレメントであり得る。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、同じ型の切断可能なエレメントまたは異なる型の切断可能なエレメントであり得る。１つまたは複数の切断可能なエレメントは、少なくとも、または最大で、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の切断可能なエレメントであり得る。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる一方でＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に結合していない。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる一方でＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成している。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる一方でＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成しており、標的配列に結合している。一部の場合では、切断後に、得られたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の断片のうちの１つまたは複数はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に結合したままである。一部の場合では、切断後に、得られたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の断片のうちの１つまたは複数（または全て）はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）ともはや結合しない、またはもはや結合することができない。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをｉｎｖｉｔｒｏで１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをｉｎｖｉｖｏで１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを細胞または生物体、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、霊長類、例えば、チンパンジー、ゴリラ、またはヒトにおいて１つまたは複数の切断可能なエレメントにおいて切断することができる。

１つまたは複数の切断可能なエレメントにおけるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の切断のタイミングは、変動し得る。例えば、１つまたは複数の切断可能なエレメントをＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）が細胞もしくは生物体に導入された直後に、または細胞もしくは生物体への導入の少なくとも（もしくは最大で）０．２５時間後、０．５時間後、０．７５時間後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１５時間後、１６時間後、１７時間後、１８時間後、１９時間後、２０時間後、２１時間後、２２時間後、２３時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、または９６時間後に切断することができる。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を切断因子に１回曝露させることができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を切断因子に１回よりも多く、例えば、２回、３回、５回、または１０回晒すことができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を１つよりも多くの型の切断因子、例えば、少なくとも（または最大で）２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種の切断因子に曝露させることができる。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を切断因子に種々の持続時間にわたって曝露させることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を切断因子に０．１分間、０．５分間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、３０分間、６０分間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間にわたって曝露させることができる。

一部の場合では、試料は複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含み、切断因子を使用してある特定のパーセンテージのＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断することができる（例えば、ｓｇＲＮＡ）。例えば、切断因子（ｃｌｅａｖｉｎｇａｇｅｎｔ）を使用して、試料中のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の少なくとも（または最大で）５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を切断することができる。ある用量の切断因子（ｃｌｅａｖｉｎｇａｇｅｎｔ）を使用して、試料中のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の１００％を切断することができる。その量の切断が少なくとも（または最大で）１分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間にわたって起こり得る。

切断の結果、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと結合したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９）の活性（例えば、ｓｇＲＮＡ）の低下がもたらされ得る。一部の場合では、試料において、１つまたは複数の切断因子への曝露の結果、活性が少なくとも０．１倍、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、２分の１、５分の１、１０分の１、５０分の１、１００分の１、または１０００分の１に低下する。一部の場合では、試料において、もう１つの切断因子への曝露の結果、活性の完全な喪失がもたらされる。
ｃ．ＣＲＩＳＰＲオン／オフ

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋して、ＣＲＩＳＰＲ「オン／オフ」複合体を形成することができるＣＲＩＳＰＲ「オン／オフ」ポリヌクレオチドが本発明で提供される。ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、標的分子内の標的配列とアニーリングするように構成されたガイド配列と、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するように構成された配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と、（ａ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋した場合に、第１の特定の修飾を受けていないポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体よりも高い標的特異的切断活性を有する第１のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する第１の特定の修飾を受けて第１の修飾されたポリヌクレオチドを生成するように構成された第１のエレメント、および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋した場合に、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い標的特異的切断活性を有する第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する第２の特定の修飾を受けて第２の修飾されたポリヌクレオチドを生成するように構成された第２のエレメントとを含み得る。ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの特色を含み得る。

ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドと架橋したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体をアセンブルすることができる。標的ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ複合体の調整可能なターゲティングのための方法が本発明で提供される。方法は、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドの第１のエレメントに第１の特定の修飾を受けさせ、それにより、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋した場合に、第１の特定の修飾を受けていないポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体よりも高い標的特異的切断活性を有する第１のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する第１の修飾されたポリヌクレオチドを生成するステップを含み得る。方法は、第１のエレメントに第１の修飾を受けさせた後に、第２のエレメントに第２の特定の修飾を受けさせ、それにより、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋した場合に、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い標的特異的切断活性を有する第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する第２の修飾されたポリヌクレオチドを形成するステップをさらに含み得る。一部の場合では、第２の修飾により、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋していないＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの一部の断片化および／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質からの解離が引き起こされ得る。
ｄ．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドおよびオフターゲット編集の低減

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成した場合に、ＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、光に曝露していない場合に、１つまたは複数の修飾を有さないポリヌクレオチドを有するＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低いオフターゲット切断活性を有するように、１つまたは複数の修飾を含み得る。１つまたは複数の修飾は、本明細書に記載の１つまたは複数のリンカーであり得る。１つまたは複数の修飾は、本明細書に記載の１つまたは複数の切断可能なリンカーであり得る。１つまたは複数の修飾は、本明細書に記載のリボースの２’位における１つまたは複数の修飾であり得る。１つまたは複数の修飾は、１つまたは複数の切断可能なエレメントであり得る。１つまたは複数の修飾は、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含み得る。ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに含み得る。
Ａ．１つまたは複数の修飾の位置

１つまたは複数の修飾は、ガイド配列内の最も５’側の塩基（またはヌクレオチド）の３’側またはガイド配列内の最も３’側の塩基（またはヌクレオチド）の５’側に位置付けることができる。１つまたは複数の修飾は、ｃｒＲＮＡまたはガイド配列の５’末端の約１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基３’側に位置付けることができる。１つまたは複数の修飾は、ｃｒＲＮＡ配列またはガイド配列の５’末端の約１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基３’側に位置付けることができる。

１つまたは複数の修飾は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に結合するように構成されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの配列、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内に位置付けることができる。一部の場合では、１つまたは複数の修飾は、図１に示されているＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのテトラループ、ネクサス、ステムループ１、またはステムループ２内に存在し得る。一部の場合では、１つまたは複数の修飾は、テトラループのループ、テトラループのバルジ、テトラループの第１のステム、テトラループの第２のステム、ネクサスのループ構造内、ネクサスのステム内、ステムループ１のループ構造内、ステムループ１のステム内、ステムループ２のループ構造内、またはステムループ２のステム内に存在し得る；テトラループ、ネクサス、ステムループ１、およびステムループ２の例は図１に例示されている。一部の場合では、１つまたは複数の修飾は、例えば、ガイド配列とステムループを形成するように構成されたガイド配列の５’側の配列を含まない。一部の場合では、１つまたは複数の修飾は、ｔｒａｃｒ配列の５’末端の１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基３’側に存在し得る。一部の場合では、１つまたは複数の修飾は、ｔｒａｃｒ配列の３’末端の１～３０塩基、例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または３０塩基５’側に存在し得る。

一部の実施例では、１つまたは複数の修飾は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）内の塩基（またはヌクレオチド）５６および／またはヌクレオチド７３のすぐ５’側または３’側に位置付けることができ、ここで、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）の最も５’側のヌクレオチドはヌクレオチド１である、またはヌクレオチド５７および／もしくはヌクレオチド７４に置き換わる。一部の実施例では、１つまたは複数の複合体を変更させるエレメントは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の塩基（またはヌクレオチド）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００のすぐ５’側または３’側に位置付けることができ、ここで、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）の最も５’側の塩基（またはヌクレオチド）は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の塩基（またはヌクレオチド）１である、または塩基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００に置き換わる。
Ｂ．１つまたは複数の修飾の影響

一部の場合では、１つまたは複数の修飾を含む、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の修飾を有さない、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と比べて標的配列における編集活性の低下を有さない（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に曝露させる前）。一部の場合では、１つまたは複数の修飾を含む、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の複合体を変更させるエレメントを有さない、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と比べて標的配列における編集活性の低下を有する（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に曝露させる前）。一部の場合では、標的配列における編集活性は、標準のＣＲＩＳＰＲ複合体と比べて約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％または最大で１％、２％、または３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％低下する。

一部の場合では、１つまたは複数の修飾を含む、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つまたは複数の修飾を有さない、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と比べてオフターゲット配列における編集活性の低下を有する（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断因子に曝露させる前）。オフターゲット配列における編集活性は、オフターゲット編集と記載される。オフターゲット編集は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドのガイド配列と正確には相補的でない配列における編集であり得る。一部の場合では、オフターゲット配列における編集活性は、約、少なくとも、または最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低下する。一部の場合では、オフターゲット編集活性は、０％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である。一部の場合では、オフターゲット編集活性は、１％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または９５％未満である。一部の場合では、オフターゲット編集活性は、０％～５％、５％～１０％、１０％～２５％、２５％～５０％、５０％～７５％、または７５％～９５％である。

光への曝露なしの場合のＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のオフターゲット編集活性は、非ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、例えば、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結でのみ修飾されたｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のオフターゲット編集活性よりも低いものであり得る。切断されていない場合（例えば、光に曝露していない場合）のＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のオフターゲット編集活性は、非ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質よりも統計学的に低いものであり得、ｐ値≦０．０５、≦０．０１、≦０．００５、≦０．００１、≦０．０００５、または≦０．０００１である。オフターゲット編集活性（例えば、本明細書に記載の通り測定される）は、約１．１分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、２１分の１、２２分の１、２３分の１、２４分の１、２５分の１、２６分の１、２７分の１、２８分の１、２９分の１、３０分の１、３１分の１、３２分の１、３３分の１、３４分の１、３５分の１、３６分の１、３７分の１、３８分の１、３９分の１、４０分の１、４１分の１、４２分の１、４３分の１、４４分の１、４５分の１、４６分の１、４７分の１、４８分の１、４９分の１、５０分の１、５１分の１、５２分の１、５３分の１、５４分の１、５５分の１、５６分の１、５７分の１、５８分の１、５９分の１、もしくは６０分の１；少なくとも１．１分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、２１分の１、２２分の１、２３分の１、２４分の１、２５分の１、２６分の１、２７分の１、２８分の１、２９分の１、３０分の１、３１分の１、３２分の１、３３分の１、３４分の１、３５分の１、３６分の１、３７分の１、３８分の１、３９分の１、４０分の１、４１分の１、４２分の１、４３分の１、４４分の１、４５分の１、４６分の１、４７分の１、４８分の１、４９分の１、５０分の１、５１分の１、５２分の１、５３分の１、５４分の１、５５分の１、５６分の１、５７分の１、５８分の１、５９分の１、もしくは６０分の１；または最大で１．１分の１、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、２１分の１、２２分の１、２３分の１、２４分の１、２５分の１、２６分の１、２７分の１、２８分の１、２９分の１、３０分の１、３１分の１、３２分の１、３３分の１、３４分の１、３５分の１、３６分の１、３７分の１、３８，３９分の１、４０分の１、４１分の１、４２分の１、４３分の１、４４分の１、４５分の１、４６分の１、４７分の１、４８分の１、４９分の１、５０分の１、５１分の１、５２分の１、５３分の１、５４分の１、５５分の１、５６分の１、５７分の１、５８分の１、５９分の１、もしくは６０分の１に低下し得る。一部の場合では、５７位および／または７４位に修飾を有するＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体は、切断されていない場合（例えば、光または別の切断誘導処理に曝露していない場合に）、切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質よりも低いオフターゲット編集効率を有し得る。ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体は、切断されていない場合（例えば、光または別の切断誘導処理に曝露していない場合に）非ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、例えば切断可能なリンカーを有さないｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のオンターゲット編集効率と同じ、またはその１％以内、２％以内、３％以内、４％以内、または５％以内のオンターゲット編集効率を有し得る。

一部の場合では、オフターゲット編集活性を１つの核酸領域において測定する。オフターゲット編集活性を１つよりも多くのゲノム領域（例えば、遺伝子）において測定することができる。オフターゲット編集活性を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、７５、または１００のゲノム領域（例えば、遺伝子）において測定することができる。オフターゲット編集活性を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、７５、１００、１０００、または１０，０００のゲノム領域（例えば、遺伝子）において測定することができる。オフターゲット編集活性を最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、７５、１００、１０００、または１０，０００のゲノム領域（例えば、遺伝子）において測定することができる。

オフターゲット編集活性は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を接触させた細胞由来の核酸分子を分析することによって測定することができる。測定は、トランスフェクションの約または最大で３０分後、１時間後、２時間後、５時間後、１０時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後、４日後、５日後、または６日後に、細胞から抽出された核酸分子を使用して行うことができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体を細胞に形質転換によって導入することができる。核酸分子を、例えば、配列決定、ＰＣＲ、質量分析、サザンブロットなどによって解析することができる。オフターゲット編集を、例えば、データを、例えば、グラフ、例えば、散布図として提示することによって可視化することができる。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して、本明細書に記載の修飾を有さないｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９と比較してオフターゲット編集を低減することができる。オフターゲット編集は、Ｈｓｉａｕｅｔａｌ． ”ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓｆｒｏｍＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅＤａｔａ”，Ｊａｎｕａｒｙ１４，２０１９ｂｉｏＲｘｉｖｏｒｄｅｅｐ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｓｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎＴｓａｉｅｔａｌ． ”ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑｅｎａｂｌｅｓｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｃｌｅａｖａｇｅｂｙＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｎｕｃｌｅａｓｅｓ”，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３３，１８７－１９７（２０１５）に記載されている通り、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定するためのＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｉｎｇ））を使用して決定することができる。オフターゲット編集部位は、標的配列に対するパーセント配列同一性が高い配列を有し得る。配列同一性は、９９％未満であるもしくは９９％と等しい、９８％未満であるもしくは９８％と等しい、９７％未満であるもしくは９７％と等しい、９６％未満であるもしくは９６％と等しい、９５％未満であるもしくは９５％と等しい、９４％未満であるもしくは９４％と等しい、９３％未満であるもしくは９３％と等しい、９２％未満であるもしくは９２％と等しい、９１％未満であるもしくは９１％と等しい、９０％未満であるもしくは９０％と等しい、８９％未満であるもしくは８９％と等しい、８８％未満であるもしくは８８％と等しい、８７％未満であるもしくは８７％と等しい、８６％未満であるもしくは８６％と等しい、８５％未満であるもしくは８５％と等しい、８４％未満であるもしくは８４％と等しい、８３％未満であるもしくは８３％と等しい、８２％未満であるもしくは８２％と等しい、８１％未満であるもしくは８１％と等しい、８０％未満であるもしくは８０％と等しい、７９％未満であるもしくは７９％と等しい、７８％未満であるもしくは７８％と等しい、７７％未満であるもしくは７７％と等しい、７６％未満であるもしくは７６％と等しい、７５％未満であるもしくは７５％と等しい、７４％未満であるもしくは７４％と等しい、７３％未満であるもしくは７３％と等しい、７２％未満であるもしくは７２％と等しい、７１％未満であるもしくは７１％と等しい、７０％未満であるもしくは７０％と等しい、６９％未満であるもしくは６９％と等しい、６８％未満であるもしくは６８％と等しい、６７％未満であるもしくは６７％と等しい、６６％未満であるもしくは６６％と等しい、６５％未満であるもしくは６５％と等しい、６４％未満であるもしくは６４％と等しい、６３％未満であるもしくは６３％と等しい、６２％未満であるもしくは６２％と等しい、６１％未満であるもしくは６１％と等しい、６０％未満であるもしくは６０％と等しい、５９％未満であるもしくは５９％と等しい、５８％未満であるもしくは５８％と等しい、５７％未満であるもしくは５７％と等しい、５６％未満であるもしくは５６％と等しい、５５％未満であるもしくは５５％と等しい、５４％未満であるもしくは５４％と等しい、５３％未満であるもしくは５３％と等しい、５２％未満であるもしくは５２％と等しい、５１％未満であるもしくは５１％と等しい、５０％未満であるもしくは５０％と等しい、４９％未満であるもしくは４９％と等しい、４８％未満であるもしくは４８％と等しい、４７％未満であるもしくは４７％と等しい、４６％未満であるもしくは４６％と等しい、４５％未満であるもしくは４５％と等しい、４４％未満であるもしくは４４％と等しい、４３％未満であるもしくは４３％と等しい、４２％未満であるもしくは４２％と等しい、４１％未満であるもしくは４１％と等しい、４０％未満であるもしくは４０％と等しい、３９％未満であるもしくは３９％と等しい、３８％未満であるもしくは３８％と等しい、３７％未満であるもしくは３７％と等しい、３６％未満であるもしくは３６％と等しい、３５％未満であるもしくは３５％と等しい、３４％未満であるもしくは３４％と等しい、３３％未満であるもしくは３３％と等しい、３２％未満であるもしくは３２％と等しい、３１％未満であるもしくは３１％と等しい、または３０％未満であるもしくは３０％と等しい。オフターゲット編集部位は、ＰＡＭ領域の極めて近くの配列を有し得、例えば、オフターゲット編集が生じるにはプロトスペーサーの５’末端（ＰＡＭより遠位）におけるガイドＲＮＡとＤＮＡの間のミスマッチが許容され得る。２つの核酸間の配列同一性の決定の仕方は当業者には容易に理解される。例えば、２つの配列をアラインメントした後に配列同一性を算出することができ、したがって、配列同一性はその最高レベルになる。配列同一性を算出する別のやり方は、公開されているアルゴリズムによって実施することができる。比較のための配列の光学的アラインメントを、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎＡｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬＢｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性の方法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行によって（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂ１２ｓｅｑ／ｂ１２．ｈｔｍｌから入手可能なＴａｔｕｓｏｖａａｎｄＭａｄｄｅｎＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７－２５０（１９９９）のＢＬＡＳＴアルゴリズム）、または検査によって行うことができる。
ｅ．切断可能なエレメント

１つまたは複数の切断可能なエレメントは、本明細書に記載の任意の切断可能なエレメントであり得る。
ｉ．切断可能なエレメントの型

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断特性は、妥当な条件下で、組み入れられた点におけるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断の傾向を変更することができる切断可能なエレメントによって変更することができる。「切断可能なエレメント」は、天然のヌクレオチドまたは１つもしくは複数の修飾されたヌクレオチドを含み得る。切断可能なエレメントは、核酸合成の間にＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）に組み入れることができる。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、１つよりも多くの型の切断可能なエレメントを含み得る。一部の実施例では、第１の切断可能なエレメントと第２の切断可能なエレメントは同じ切断特徴を有する。一部の実施例では、第２の切断可能なエレメントは第１の切断可能なエレメントとは異なる切断特徴を有する。例えば、第１の切断可能なエレメントは光切断可能なリンカーであり得、第２の切断可能なエレメントは化学的ヌクレアーゼによる切断を受けやすい場合がある。別の例では、第１の切断可能なエレメントは化学的ヌクレアーゼによる切断を受けやすく、第２の切断可能なエレメントは光切断可能になるように工学的に作製されていてよく、それにより、オルソゴナルな（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）処理レジメンを適用することが可能になる。一部の場合では、同じ切断可能なエレメントは、１つよりも多くの型の切断特徴を有し得る。第１の切断可能なエレメントおよび第２の切断可能なエレメントは、本明細書に記載の任意の切断可能なエレメントであり得る。

切断可能なエレメント（例えば、切断可能なリンカー）は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）を妥当な条件下での切断を受けやすいものにするＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の２つまたはそれよりも多くの構成物を接続することができる実体を指し得る。例えば、妥当な条件は、ＵＶ光への曝露であり得る。切断可能なリンカーは、妥当な条件下で切れやすい１つまたは複数の修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドを含み得る。

切断可能なリンカーは、修飾されたヌクレオシド間連結を含み得る。修飾されたヌクレオシド間連結は、リン原子を有するヌクレオチド間連結またはリン原子を有さないヌクレオチド間連結であり得る。リン原子を含有するヌクレオシド間連結としては、例えば、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステラーゼ、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、および３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めた他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含めたホスホラミデート、Ｐ－エチオキシホスホジエステル、Ｐ－エトキシホスホジエステル、Ｐ－アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェート、ならびにリンを含有しない連結、例えば、アセタールおよびアミド、例えば、これらの通常の３’－５’連結を有することが当技術分野で公知であるもの、２’－５’連結類似体、および１つまたは複数のヌクレオチド間連結が３’－３’、５’－５’または２’－２’連結である逆極性を有するものなどが挙げられる。逆極性を有するポリヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間連結において単一の３’－３’連結、すなわち、塩基を欠く（核酸塩基が欠損しているまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）であり得る単一の逆方向ヌクレオシド残基を含み得る。

リンを含有しないヌクレオシド間連結としては、短鎖アルキル、シクロアルキル、混合ヘテロ原子アルキル、混合ヘテロ原子シクロアルキル、１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子および１つまたは複数の短鎖複素環が挙げられる。これらのヌクレオシド間連結としては、これだけに限定されないが、シロキサン、硫化物、スルホキシド、スルホン、アセチル、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、アルケニル、スルファミン酸；メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、アミドおよび混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するその他が挙げられる。他のリン原子を含有しない修飾されたヌクレオシド間連結としては、－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－（メチレン（メチルイミノ）骨格として公知）、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－および－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－が挙げられる。

非ヌクレオチドリンカーは、例えば、塩基を欠く残基（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール（スペーサー９）もしくはヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）などのオリゴエチレングリコール、またはブタンジオールなどのアルカン－ジオールであり得る。スペーサー単位は、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合によって連結していることが好ましい場合がある。リンカー単位は、例えば、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、またはアミド連結を介して、分子内にただ１回出現し得る、または数回組み入れることができる。別の好ましいリンカーは、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ１２アミノリンカーなどのアルキルアミノリンカー、および同様にＣ３またはＣ６チオールリンカーなどのアルキルチオールリンカーである。一部の実施例では、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性連結部分を使用してペプチドおよびタンパク質をヌクレオチドとコンジュゲートすることができる。例としては、５’－アミノ－修飾因子Ｃ６および３’－アミノ－修飾因子Ｃ６試薬が挙げられる。
ｉｉ．切断可能なエレメントを切断する方法

切断可能なエレメントを、酸、塩基、求核試薬、求電子試薬、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素、小分子、核酸、タンパク質などへの曝露を含めた任意の適切な方法によって切断することができる。一部の実施例では、切断可能なエレメント（例えば、切断可能なリンカー）は、細胞プロセスまたはその副産物による切断を受けやすい。細胞プロセスは、酵素、二次メッセンジャー分子、代謝産物、タンパク質、およびフリーラジカルを伴い得る。
ｉｉｉ．感光性基

切断可能なエレメントは、感光性基であり得る。感光性基は、ホスホロアミダイト化学によってＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに導入することができる。架橋に感光性基を使用する場合、感光性基は感光性の切断可能なエレメントと同じであっても異なってもよい。架橋に使用される感光性基が切断に使用される感光性基と異なる場合、架橋の活性化に使用する波長とは異なる波長を切断の活性化に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の２つまたはそれよりも多くの感光性エレメントは、異なる活性化特徴を有し得、例えば、２つまたはそれよりも多くのエレメントは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに組み入れられた場合、異なる作用因子および／または反応条件を使用することによって互いの存在下で選択的に活性化することができる。

ＰＣ－アミノタグホスホロアミダイトと成長しているオリゴヌクレオチド鎖の遊離の５’－ＯＨ基の選択的反応、その後の支持体からの切断および脱保護の結果、第一脂肪族アミノ基に光切断可能なリンカーを通じて連結したリン酸ジエステル基の導入をもたらすことができる。次いで、このアミノ基を使用して、アミン反応性試薬との合成後修飾反応を通じて種々の光切断可能なマーカーを導入することができる（ＯｌｅｊｎｉｋＪｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ．１９９８；２６：３５７２－６）。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の２つのヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド５３とヌクレオチド５４）を連結する光切断可能な脂肪族基を含み得、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをＵＶ光に曝露させ、その結果、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド５３と５４の間）の切断（ｂｒｅａｋ）をもたらすことができる。他の例では、光切断可能なアミノタグホスホロアミダイトをＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内のポリヌクレオチドリーダー配列とガイド配列の間に位置付けることができ、ＵＶ光を使用して光切断可能なアミノタグホスホロアミダイトにおける切断を開始させ、それにより、ポリヌクレオチドリーダー配列を分離することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を開始させるために使用することができる光切断可能なリンカーの例は、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトであり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の２つのヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド５３とヌクレオチド５４）を連結する光切断可能な脂肪族基を含み得、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを可視光線に曝露させ、その結果、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド５３と５４の間）切断（ｂｒｅａｋ）をもたらすことができる。他の例では、光切断可能なクマリンフォトリンカーをＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内のポリヌクレオチドリーダー配列とガイド配列の間に位置付けることができ、可視光線を使用して光切断可能なクマリンフォトリンカーの切断を開始させ、それにより、ポリヌクレオチドリーダー配列を分離することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を開始させるために使用することができる光切断可能なリンカーの例は、クマリンリンカーであり得る。光切断可能なリンカーをポリヌクレオチド配列に導入する他の方法は、例えば、その内容全体が本明細書において参照される米国特許出願第ＵＳ２００８０２２７７４２Ａ１号、同第ＵＳ２０１０００２２７６１Ａ１号、同第ＵＳ７８９７７３７Ｂ２号に記載されている。
ｉｖ．リボヌクレアーゼに基づく切断

一部の実施例では、１つまたは複数の切断可能なエレメントは、エンドリボヌクレアーゼ、例えば、ＲＮＡを定義されたリボヌクレオチド配列モチーフにおいてまたはその内部で切断するエンドリボヌクレアーゼに対する切断部位を含む。例えば、切断可能なエレメントは、配列特異的エンドリボヌクレアーゼによって認識される切断部位を含み得る。エンドリボヌクレアーゼは、天然に存在するものまたは工学的に作製されたものであり得る。一部の実施例では、エンドリボヌクレアーゼは、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドによって形成されるヌクレオチド配列に特異的なものであり得る。一部の実施例では、エンドリボヌクレアーゼの配列特異性を、オリゴヌクレオチドとの融合によって、または他のタンパク質ドメインとの融合によって工学的に操作することができる。例えば、配列特異的エンドリボヌクレアーゼ酵素を、２つの機能的に独立したドメイン、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド内のＲＮＡを前進的かつ配列に無関係の様式で加水分解するＲＮａｓｅＨＩと、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド内の配列を認識するジンクフィンガーとを融合することによって工学的に操作することができる。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドとリボヌクレアーゼＨの別のコンジュゲーションにより、配列特異的切断をもたらすことができる。例えば、Ｓｕｌｅｊｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１２；４０（２２）：１１５６３－７０およびＦｕｋｕｍａｅｔ．ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００３；１４（２）：２９５－３０１を参照されたい。一部の場合では、切断可能なエレメントは、ＲＮａｓｅＨ１を動員してＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの二本鎖領域を切断することができる（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい）。

切断可能なエレメントは、例えば、Ｚａｕｇｅｔ．ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８８；２７，２５，８９２４－８９３１に記載されている通り、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａの切除されたＩＶＳｒＲＮＡ部分などの配列特異的ｓｓＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される切断部位を含み得る。他の例では、切断可能なエレメントは、例えば、Ｂｅｌｏｇｌａｚｏｖａｅｔ．ａｌ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００８；２８３（２９）：２０３６１－２０３７１に記載されている通り、配列特異的ｓｓＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＣａｓ２によって認識される１つまたは複数の切断部位を含み得る。他の例では、切断可能なエレメントは、例えば、Ｇｌｏｗｅｔ．ａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０１５；４３（５）２８６４－７３において考察されている通り、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＲＮａｓｅＭｉｎｉ－ＩＩＩによって認識されるｄｓＲＮＡ１つまたは複数の好ましい部位を含み得る。他の例では、短いオリゴヌクレオチドを外部ガイド配列（ＥＧＳ）として使用してヒトＲＮａｓｅＰによる部位特異的ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を方向付けることができる。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の２．１ｋｂの表面抗原ｍＲＮＡを標的とする１３ｍｅｒのＥＧＳにより、ＲＮａｓｅＰによるＨＢＶＲＮＡの切断を誘導することができた。（ＷｅｒｎｅｒＭｅｔ．ａｌ，ＲＮＡ．１９９８；４（７）：８４７－５５．を参照されたい）。エンドリボヌクレアーゼは、配列または構造特異的エンドリボヌクレアーゼＣａｓ６スーパーファミリー、例えばＣａｓ６Ａのメンバーであり得る（ＨｏｎｇＬｉ（２０１５），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｊａｎｕａｒｙ６；２３（１）：１３－２０を参照されたい）。エンドリボヌクレアーゼは、Ｃａｓ６ｆとしても公知のＣｓｙ４であり得る。ｓｓＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲエンドリボヌクレアーゼのＣａｓ１３ファミリーに属するものまたはその誘導体であり得る。エンドリボヌクレアーゼは、プレｃｒｅＲＮＡ転写物を処理することができるＣｐｆ１またはＣａｓ５ｄ酵素であり得る（Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．ｅｔａｌ．（２０１６）， ”ＭｕｌｔｉｐｌｅｘｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｂｙＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ｕｓｉｎｇａｓｉｎｇｌｅｃｒＲＮＡａｒｒａｙ”，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１６）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３７３７）。

切断可能なエレメントは、リボザイム、例えば、ハンマーヘッド型リボザイム、デルタ肝炎ウイルスリボザイムなどによって切断可能なエレメントであり得る。リボザイムは、天然に存在するものであってもよく、例えばＬｅｖｙｅｔ．ａｌ，ＲＮＡ２００５．１１：１５５５－１５６２において考察されている通り、「触媒」鎖と「基質」鎖に分離することによってトランス作用リボザイムになるように工学的に作製されたものであってもよい。一部の場合では、２つのリボザイムを協働させて使用して、所望の標的配列の後での切断を可能にすることができる。一部の場合では、異なる細胞の区画において機能する代替の人工リボザイム－タンパク質複合体を、Ｓａｍａｒｓｋｙｅｔ．ａｌ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９９９；９６（１２）：６６０９－６６１４において示されている通り、リボザイムを特定の細胞内部位に送達するため、または特定の型のＲＮＡを標的とするために局在化決定因子を使用することによって設計することができる。一部の場合では、リボザイムの使用には、活性のための外因性小分子の結合、例えば、ｇｌｍＳリボザイムが伴い得る。

一部の実施例では、アプタマーとカップリングすることにより、リボザイムの活性をリガンドにより制御されるようにさらに調整することができる。アプタマーは、リガンドに結合する、または他の点では、環境（例えば、ｐＨ、温度、容量オスモル濃度、塩濃度など）の変化を、情報伝達ドメインを通じてループＩおよび／またはループＩＩと直接カップリングした様式で「検知する」能力に基づいて選択することができる。リガンドは、例えば、タンパク質、ヌクレオチドまたは小分子リガンドであり得る。例えば、ＵＳ８６０３９９６Ｂ２に記載されている通り、リガンドのアプタマーへの結合により、情報伝達ドメインとループ、ステムまたは触媒コアのうちの１つまたは複数の相互作用の変化を引き起こすことができ、したがって、リボザイム活性をリガンドの存在または非存在に依存的にモジュレートすることができる。

切断可能なエレメントのＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断（例えば、ｓｇＲＮＡ）を所望の時点で独立に誘導することができる；例えば、遺伝子にコードされたエンドリボヌクレアーゼを宿主細胞内で活性化することができる。エンドリボヌクレアーゼをコードするベクターまたはプラスミドを所望の時点で細胞にトランスフェクトすることができる。１つまたは複数のエンドリボヌクレアーゼを１つまたは複数の独立したプロモーターの制御下に置くことができる。プロモーターのうちの１つまたは複数を所望の時点で活性化することができる。
ｖ．アンチセンスオリゴヌクレオチド

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの１つまたは複数の切断可能なエレメントを、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合が可能になるように設計することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドであり得る。ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の一本鎖ＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、ＲＮＡｓｅＨを使用して、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡを切断することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合することができる切断可能なエレメント（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内のステムループのＲＮＡループ）に関しては、切断可能なエレメント（例えば、ステムループのループ）は、約６～約４０ヌクレオチドの長さであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１２～約１６ヌクレオチドの長さ、または約１２～約２５ヌクレオチド、または約１０～約３０ヌクレオチドの長さであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断可能なエレメント（例えば、ステムループのループ）の相補性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％であり得る。配列が切断可能なエレメントと完全にまたは部分的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを宿主細胞内で産生させることまたは宿主細胞に導入することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）または他の公知のトランスフェクション方法を使用して細胞にトランスフェクトすることができる。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの１つまたは複数の切断可能なエレメントは、ｍｉＲＮＡ応答エレメントを含み得る。ｍｉＲＮＡ応答エレメントの長さは、約１５～約３０ヌクレオチド、例えば、約２０～約２５ヌクレオチドの長さであり得る。ｍｉＲＮＡの長さは、約２０～約２４ヌクレオチド、例えば、約２１～約２３ヌクレオチド、例えば、約２２ヌクレオチドの長さであり得る。ｍｉＲＮＡとＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内のｍｉＲＮＡ応答エレメントの配列相補性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％であり得る。

切断可能なエレメントはｍｉＲＮＡ応答エレメント（ＭＲＥ）を含み得、ＭＲＥに結合することができるｍｉＲＮＡを宿主細胞内で産生させることまたは宿主細胞に導入することができる。ｍｉＲＮＡは、ＭＲＥを標的とし、第１の切断可能なエレメントを切断することができるｍｉＲＩＳＣ複合体の形態で存在し得る。
ｖｉ．部位特異的化学的ヌクレアーゼ

特異的ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断は、部位特異的ヌクレアーゼ活性を有するように設計された化学化合物によって実現することができる。

化学的ヌクレアーゼを、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドに対する配列特異的親和性を有するように設計することができる。例えば、トリス（２－アミノベンズイミダゾール）を切断するＲＮＡをＤＮＡオリゴヌクレオチドまたは２’－Ｏ－メチルオリゴリボヌクレオチドにジスルフィド結合またはアミド結合を介して付着させて、ＲＮＡ基質および部位選択性を示す有機触媒ヌクレアーゼを形成することができる（例えば、Ｇｎａｃｃａｒｉｎｉｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００６，１２８（２４），ｐｐ８０６３－８０６７を参照されたい）。他の例では、化学的ＲＮＡｓｅ（例えば、１，１０－フェナントロリン部分、ネオクプロインＺｎ（ＩＩ）、ネアミン）のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに対する部位特異性は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、例えば、ポリアミド核酸を使用することによって実現することができる。

化学的ＲＮＡｓｅ（例えば、ジエチレントリアミン部分）のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに対する部位特異性は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチドタンパク質またはＰＮＡを組み合わせて使用することによって実現することができる。一部の実施例では、ＲＮＡ結合性タンパク質を、１，１０－フェナントロリン－銅複合体などの配位化合物を共有結合により付着させることにより、配列特異的ヌクレアーゼに化学的に変換することができる。例えば、Ｃｈｅｎｅｔ．ａｌ，ＳｉｇｍａｎＤＳ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８７；２３７（４８１９）：１１９７－２０１を参照されたい。別の例では、部位特異的ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を、ブレオマイシン－Ｆｅ（ＩＩ）とＥＤＴＡまたはオリゴヌクレオチドをコンジュゲートして、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに対する特異性を有する人工ヌクレアーゼを形成することによって実現することができる。

化学的ヌクレアーゼの例としては、１，１０－フェナントロリン銅（Ｓｉｇｍａｎｅｔａｌ．，１９９３）、二価鉄エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、大環状ランタニド複合体、メタロポルフィリン、サレンの金属錯体、酢酸ウラニル、ロジウム（ＩＩＩ）の八面体金属錯体、ベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボレート、脂肪族モノアミン－、ジアミン－およびポリアミン、ネオマイシンＢならびに銅（ＩＩ）アミノグリコシド複合体などのアミノグリコシドなどが挙げられる。一部の場合では、化学的ヌクレアーゼは、ヌクレオシドの糖部分を標的とし、切断部位において糖から水素原子を引く抜くことによる酸化的切断を触媒することができる。
ｖｉｉ．光化学的切断

一部の実施例では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断に使用される作用因子の活性をさらに制御するために、光ケージング基を使用することができる。例えば、本開示に記載されている部位特異的化学的ヌクレアーゼの遊離を制御するために、光活性化可能なまたは「ケージド」プローブの光分解を使用することができる。別の例では、例えば、Ｂｏｈａｃｏｖａｅｔ．ａｌ，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８．１６，１５２７に示されている通り、光ケージング基を使用して、リボヌクレアーゼまたは制限酵素によるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を、光分解による遊離まで遮断することができる。別の例では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内のヌクレオチドの１つまたは複数上の光ケージング基を使用して、アンチセンスヌクレオチドに対する認識配列を、光分解による遊離まで遮蔽し、それにより、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を開始させることができる。別の例では、光ケージング基をアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの切断因子に付着させることができ、これは、光分解されると、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドへの結合およびＲＩＳＣ複合体の形成の開始に利用可能になる。別の例では、光ケージング基を使用して、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断のための「ｍｉＲＮＡ応答エレメント」を光分解による遊離まで遮蔽することができる。他の態様では、これだけに限定することなく、光ケージング基を、異なる切断特徴を有する多数の切断エレメントの切断のためにオルソゴナルな処理レジメンで使用することができる。

光ケージング基を、タグが１つまたは複数の方法による検出および／または数量化に適し得る「タグ付け」切断反応に使用することができる。例えば、２－ニトロ－ベンジルに基づく光切断可能な基を、光分解時に遊離する色素をさらに用いて標識することができ、例えば、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの活性化の「効率」またはＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの非活性化に関する検出可能なマーカーとして使用することができる。別の例では、「切断事象」が開始されたら、切断可能なエレメントに組み入れられた光ケージドヌクレオチドからの「蛍光タグ」の遊離によりＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断可能なエレメントに結合するリボヌクレアーゼタンパク質がタグ付けされ得、ここで、蛍光タグの測定値がＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断に関する代理マーカーになり得る。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドに合成により組み入れることができる光ケージング基の例としては、当技術分野で公知の方法によってヘテロ原子（通常Ｏ、ＳまたはＮ）にエーテル、チオエーテル、エステル（リン酸またはチオホスフェートエステルを含む）、アミンまたは同様の官能基として連結することができるオルト－ニトロベンジルに基づくケージング基が挙げられる。２－ニトロベンジルに基づくケージング基の例としては、α－カルボキシ－２－ニトロベンジル、１－（２－ニトロフェニル）エチル、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル、１－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチル、５－カルボキシメトキシ－２－ニトロベンジル、ニトロフェニルなどが挙げられる。光除去可能な保護基の他の例としては、ベンジルオキシカルボニル、３－ニトロフェニル、フェナシル、３，５－ジメトキシベンゾイニル、２，４－ジニトロベンゼンスルフェニル、エチジウムモノアジド、ビマンアジドおよびそれらのそれぞれの誘導体が挙げられる。

本明細書に記載の感光性リンカーは、いくつかのメソメリズム形態として表すことができる。単一の構造が描かれている場合、関連性のあるメソメリズム形態のいずれも意図されている。構造式によって表される本明細書に記載のクマリンリンカーは関連するメソメリズム形態のいずれかで示すことができる。例示的なメソメリズム構造を以下に式（Ｉ）に関して示す：

感光性保護基をヌクレオシドおよびヌクレオチド内のヒドロキシおよびリン酸または核酸塩基に付着させることができる。例えば、Ｂｏｈａｃｏｖａｅｔ．ａｌ，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，１６，１５２に記載されている通り、例えば、２－ニトロベンジル－、６－ニトロピペロニル－およびアントリル－９－メチル基によって保護された２’－デオキシ－５－（ヒドロキシメチル）ウリジンヌクレオシド、一リン酸および三リン酸の光ケージド誘導体をポリヌクレオチドに酵素的に組み入れることができる。光切断は、糖環からの水素結合の引き抜き、塩基から光により励起される切断因子までの直接電子伝達または光切断からのエネルギーの伝達および付加生成物の形成による一重項酸素生成などの種々の機構を通じて起こり得る。
ｖｉｉｉ．切断可能なエレメントの切断

２種またはそれよりも多く（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種）のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断可能なエレメントを同じ切断性部分によって切断することができる。２種またはそれよりも多く（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種）の異なるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断を異なる外部因子によって誘導することができる。

切断誘導性作用因子は、電磁放射線であり得る。切断誘導性作用因子は、可視スペクトル内の特定の波長の光であり得る。切断エレメントを、ＵＶ光によって切断することができる。

光の波長は、２２０～４６５ｎｍにわたり得る。曝露プロトコールにおける光の強度は、約５、１０、１５、２０、２５、３５、４０、５０、７０、９０、１１０、１２０、１４０、１６０、１７５、１９０、２００、２２０、２４０、２６０２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６５０、６７５、７００、７２０、７４５、７６５、７９０、８１０、８３０、８５０、８７０、９００、９２０、９４５、９６５、９８５、１０００、１０２５、１０５０、１０８０、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２４０、１２７５、１２９０、１３２０、１３５０、１３８０、１４００、１４２０、１４５０、１４７０、１４９０、１５２０、１５４０、１５６０、１６００、１６３０、１６５０、１６７０、１７００、１７２０または１７５０ｍＷ／ｃｍ^２であり得る。曝露プロトコールにおける光の強度は、約７０ｍＷ／ｃｍ^２から１００ｍＷ／ｃｍ^２まで、８０ｍＷ／ｃｍ^２～１１０ｍＷ／ｃｍ^２、９０ｍＷ／ｃｍ^２～１２０ｍＷ／ｃｍ^２、１００ｍＷ／ｃｍ^２～１３０ｍＷ／ｃｍ^２、１１０ｍＷ／ｃｍ^２～１４０ｍＷ／ｃｍ^２、１２０ｍＷ／ｃｍ^２～１５０ｍＷ／ｃｍ^２、１３０ｍＷ／ｃｍ^２～１６０ｍＷ／ｃｍ^２、１４０ｍＷ／ｃｍ^２～１７０ｍＷ／ｃｍ^２、１５０ｍＷ／ｃｍ^２～１８０ｍＷ／ｃｍ^２、１６０ｍＷ／ｃｍ^２～１９０ｍＷ／ｃｍ^２、１７０ｍＷ／ｃｍ^２～２００ｍＷ／ｃｍ^２、１８０ｍＷ／ｃｍ^２～２１０ｍＷ／ｃｍ^２、１９０ｍＷ／ｃｍ^２～２２０ｍＷ／ｃｍ^２、２００ｍＷ／ｃｍ^２～２３０ｍＷ／ｃｍ^２、２１０ｍＷ／ｃｍ^２～２４０ｍＷ／ｃｍ^２、２２０ｍＷ／ｃｍ^２～２５０ｍＷ／ｃｍ^２、２３０ｍＷ／ｃｍ^２～２６０ｍＷ／ｃｍ^２、２４０ｍＷ／ｃｍ^２～２７０ｍＷ／ｃｍ^２、２５０ｍＷ／ｃｍ^２～２８０ｍＷ／ｃｍ^２、２６０ｍＷ／ｃｍ^２～２９０ｍＷ／ｃｍ^２、または２７０ｍＷ／ｃｍ^２～３００ｍＷ／ｃｍ^２にわたり得る。光の波長は、約３２０ｎｍから約３９０ｎｍまでにわたり得る。光の波長は、約３２０ｎｍから４２５ｎｍまで、３２０ｎｍ～４２０ｎｍ、４２０ｎｍ～５２０ｎｍ、５２０ｎｍ～６２０ｎｍ、４２０ｎｍ～７００ｎｍにわたり得る。光の波長は、約３２０ｎｍよりも長い、３３０ｎｍよりも長い、３４０ｎｍよりも長い、３５０ｎｍよりも長い、３６０ｎｍよりも長い、３７０ｎｍよりも長い、３８０ｎｍよりも長い、３９０ｎｍよりも長い、４００ｎｍよりも長い、４１０ｎｍよりも長い、４２０ｎｍよりも長い、４３０ｎｍよりも長い、４４０ｎｍよりも長い、４５０ｎｍよりも長い、４６０ｎｍよりも長い、４７０ｎｍよりも長い、４８０ｎｍよりも長い、４９０ｎｍよりも長い、５００ｎｍよりも長い、５１０ｎｍよりも長い、５２０ｎｍよりも長い、５３０ｎｍよりも長い、５４０ｎｍよりも長い、５５０ｎｍよりも長い、５６０ｎｍよりも長い、５７０ｎｍよりも長い、５８０ｎｍよりも長い、５９０ｎｍよりも長い、６００ｎｍよりも長い、６１０ｎｍよりも長い、６２０ｎｍよりも長い、６３０ｎｍよりも長い、６４０ｎｍよりも長い、６５０ｎｍよりも長い、６６０ｎｍよりも長い、６７０ｎｍよりも長い、６８０ｎｍよりも長い、６９０ｎｍよりも長い、または７００ｎｍよりも長いものであり得る。光の波長は、約７００ｎｍ未満、６９０ｎｍ未満、６８０ｎｍ未満、６７０ｎｍ未満、６６０ｎｍ未満、６５０ｎｍ未満、６４０ｎｍ未満、６３０ｎｍ未満、６２０ｎｍ未満、６１０ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５９０ｎｍ未満、５８０ｎｍ未満、５７０ｎｍ未満、５６０ｎｍ未満、５５０ｎｍ未満、５４０ｎｍ未満、５３０ｎｍ未満、５２０ｎｍ未満、５１０ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４９０ｎｍ未満、４８０ｎｍ未満、４７０ｎｍ未満、４６０ｎｍ未満、４５０ｎｍ未満、４４０ｎｍ未満、４３０ｎｍ未満、または４２５ｎｍ未満であり得る。光の波長は、約４２０ｎｍから４３０ｎｍまで、４３０ｎｍ～４４０ｎｍ、４４０ｎｍ～４５０ｎｍ、４５０ｎｍ～４６０ｎｍ、４６０ｎｍ～４７０ｎｍ、４７０ｎｍ～４８０ｎｍ、４８０ｎｍ～４９０ｎｍ、４９０ｎｍ～５００ｎｍ、５００ｎｍ～５１０ｎｍ、５１０ｎｍ～５２０ｎｍ、５２０ｎｍ～５３０ｎｍ、５３０ｎｍ～５４０ｎｍ、５４０ｎｍ～５５０ｎｍ、５５０ｎｍ～５６０ｎｍ、５６０ｎｍ～５７０ｎｍ、５７０ｎｍ～５８０ｎｍ、５８０ｎｍ～５９０ｎｍ、５９０ｎｍ～６００ｎｍ、６００ｎｍ～６１０ｎｍ、６１０ｎｍ～６２０ｎｍ、６２０ｎｍ～６３０ｎｍ、６３０ｎｍ～６４０ｎｍ、６４０ｎｍ～６５０ｎｍ、６５０ｎｍ～６６０ｎｍ、６６０ｎｍ～６７０ｎｍ、６７０ｎｍ～６８０ｎｍ、６８０ｎｍ～６９０ｎｍ、または６９０ｎｍ～７００ｎｍにわたり得る。曝露プロトコールにおいて使用される光の出力ワット数は、ＯＡＩ３０６ＵＶパワーメーターによって測定して、約５０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１７５、１９０、２１０、２３０、２５０、２７０、２９０、３１０、３３０、２５０、３７０、３９０、４２０、４４５０、４８０、５００、５３０、５５０、５７０、６００、６２０、６５０、６７０、７００、７２０、７５０、７７０、８００、８２０、８５０、８７０、９００、９２０、９５０、９７０、１０００、１０２０、１０５０、１０７０、１１００、１１２０、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、または６０００Ｗであり得る。

曝露の持続時間は、１秒間から３０分間までであり得る。曝露の持続時間は、１秒間から３０秒間まで、３０秒間～６０秒間、１分間～５分間、５分間～１０分間、１０分間～２０分間、２０分間～３０分間、３０分間～４０分間、４０分間～５０分間、または５０分間～１時間であり得る。曝露の持続時間は、約１時間よりも長く、約５０分間よりも長く、約４０分間よりも長く、約３０分間よりも長く、約２０分間よりも長く、約１０分間よりも長く、約５分間よりも長く、約１分間よりも長く、約３０秒間よりも長く、または約１秒間よりも長くであり得る。曝露の持続時間は、約２秒間未満、約３０秒間未満、約１分間未満、約５分間未満、約１０分間未満、約２０分間未満、約３０分間未満、約４０分間未満、約５０分間未満、または約１時間未満であり得る。曝露プロトコールは、連続した曝露またはパルス状曝露またはその両方を含み得る。パルス曝露の持続時間は均一であっても変動してもよい。

光源は、帯域フィルターにかけた広範なスペクトルの光であり得る。帯域フィルターは、３４５ｎｍの帯域フィルターであり得る。帯域フィルターは、４２０ｎｍロングパスフィルターであり得る。光源は紫外線（ＵＶ）であり得る。光源はＬＥＤであり得る。ＬＥＤは紫外線を放出し得る。ＬＥＤは可視光線を放出し得る。ＬＥＤは赤外線を放出し得る。
Ｂ．ロックのために修飾されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドへのロックが容易になるように修飾することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質へのロックが容易になるように修飾することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した場合にオフターゲット編集活性の低下を有する１つまたは複数の修飾を含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド配列、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド配列、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド配列、またはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含み得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質およびＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの両方を、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質へのロックが容易になるように修飾することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとの架橋が容易になるように非天然アミノ酸で修飾することができる。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の両方を、ロックが容易になるように修飾する。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のみが架橋剤を含み、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは架橋剤を含まない。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは架橋剤を含み、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は架橋剤を含まない。

下記の通り、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を、１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含めることによって、または、別の分子との結合が容易になるように設計された、例えばＳＮＡＰ融合タンパク質など、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とアミノ酸配列の融合（例えば、融合体の発現）によってのいずれかで修飾することができる。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、１つまたは複数の突然変異を含み得る（したがって、それをコードする核酸分子も突然変異を有し得る）。１つまたは複数の突然変異は、人工的に導入された突然変異であり得、触媒ドメイン内の１つまたは複数の突然変異であり得る。Ｃａｓ９酵素を参照した触媒ドメインの例は、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩおよびＨＮＨドメインであり得る。１つまたは複数の突然変異により、Ｃａｓ９の１つまたは複数の触媒ドメインを不活性にすることができる。１つまたは複数の突然変異により、Ｃａｓ９の触媒活性を０．１倍、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、２分の１、５分の１、１０分の１、５０分の１、１００分の１、または１０００分の１に低下させることができる。一部の場合では、１つまたは複数の突然変異により、Ｃａｓ９の触媒活性を０．１倍、０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、または１０００倍増大させることができる。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを、細胞透過性ＲＮＡアプタマーを用いて修飾することができる。細胞透過性ＲＮＡアプタマーにより、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの細胞への有効な送達を改善することができる。ＲＮＡアプタマーは、細胞表面受容体に結合し、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの細胞への進入を促進することができる。細胞特異的送達を媒介するために、細胞透過性アプタマーを、特定の細胞受容体を標的とするように設計することができる。
１．ロックのための修飾の型

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を、非天然アミノ酸を含めることによって修飾することができる。非天然アミノ酸は、感光性非天然アミノ酸を含み、例えば、感光性非天然アミノ酸架橋剤、例えば、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（ＡｚＦ）またはｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン（ＢｚＦ）を使用してバイオコンジュゲーションに架橋を形成することができる。３５０～３６０ｎｍで励起されると、ベンゾフェノン、例えばＢｚＦは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド上に位置する露出した官能基上の、そうでなければ不活性化されている炭素－水素結合と優先的に反応し得る。一部の場合では、ベンゾフェノンは光解離せず、反応する適切な炭素－水素結合の非存在下では、それらの光により励起されるトリプレットの状態は容易に弱まり、それにより、ベンゾフェノンが他の架橋試薬よりも許容される試薬になり得る。ＡｚＦは、紫外線に曝露すると反応性ニトレンを生じ得、これを使用してＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを連結することができる。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を別のタンパク質、例えば、ＳＮＡＰタンパク質と融合することができる。立体配置は、ＤＮＡ修復鋳型をＣＲＩＳＰＲ複合体に近くに保つ方法としてＤＮＡ修復鋳型のＳＮＡＰタンパク質へのＢＧ（Ｏ６－ベンジルグアニン）リンカーを通じた共有結合による付着、ならびに／または、付着のためのリンカーヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えばｓｇＲＮＡのＳＮＡＰタンパク質への下記のＢＧリンカーおよびＲＮＡアプタマーの使用を通じた付着を伴い得る。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）とＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の連結が容易になるようにＳＮＡＰタンパク質融合体で修飾することができる。例えば、ベクターを使用してＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質およびＳＮＡＰタンパク質、その後にアーム領域を含む融合タンパク質を発現させることができる。アーム領域は、柔軟性のために構成された一連のアミノ酸をさらに含む。アーム領域を、ベンジルグアニン修飾されたポリヌクレオチドを連結するようにさらに構成することができる。ＳＮＡＰタンパク質領域は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のＮ末端に位置し得る。ＳＮＡＰタンパク質のＮ末端はアーム領域であり得る。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをベンジル－グアニン結合性ＲＮＡアプタマーで修飾することができる（例えば、ＣａｒｒｏｃｃｉａｎｄＨｏｓｋｉｎｓ，ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａＢｅｎｚｙｌｇｕａｎｉｎｅ－ＢｉｎｄｉｎｇＲＮＡＡｐｔａｍｅｒ，ＣｈｅｍＣｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）．２０１６Ｊａｎｕａｒｙ１１；５２（３）：５４９－５５２．ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ５ｃｃ０７６０５ｆに記載の通り）。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドがベンジル－グアニン結合性ＲＮＡアプタマーと結合したら、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、融合タンパク質のアーム領域と共有結合し得る。アーム領域の柔軟性により、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドが融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質領域と複合体を形成することを可能にすることができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、融合タンパク質のアーム領域への付着前に複合体を形成し得る。
Ｃ．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とポリヌクレオチドが高い親和性で結合したＣＲＩＳＰＲ複合体

（ａ）標的核酸配列とアニーリングするように設計された配列およびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように設計された配列、および活性をモジュレートするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオン、ＣＲＩＳＰＲオフ、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフ）；と、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、ポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の結合の平衡解離定数（Ｋ_ｄ）が８ｐＭ未満である（ｐＭ＝ピコモル）、ＣＲＩＳＰＲ複合体が本発明で提供される。平衡解離定数（Ｋ_ｄ）は、７ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、２ｐＭ未満、１ｐＭ未満、９ｆＭ未満（ｆＭ＝フェムトモル）、８ｆＭ未満、７ｆＭ未満、６ｆＭ未満、５ｆＭ未満、４ｆＭ未満、３ｆＭ未満、２ｆＭ未満、１ｆＭ未満、９ａＭ未満（ａＭ＝アトモル）、８ａＭ未満、７ａＭ未満、６ａＭ未満、５ａＭ未満、４ａＭ未満、３ａＭ未満、２ａＭ未満、または１ａＭ未満である。平衡解離定数（Ｋ_ｄ）は、約１ｐＭから８ｐＭまで、約１ｆＭから約１０ｆＭまで、または約１ａＭから約１０ａＭまでであり得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと共有結合により付着していてよい。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと共有結合により付着していない。
ＩＶ．安定化されたＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する方法

本明細書に記載の安定化（例えば、ロック）されたＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する方法が本発明で提供される。
Ａ．細胞への投与

本開示の態様は、安定化（例えば、ロック）されたＣＲＩＳＰＲ複合体を細胞に投与するための方法を包含する。安定化されたＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するための非天然ヌクレオチドおよび活性をモジュレートする配列を含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオン、ＣＲＩＳＰＲオフ、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフ）を含み得る。方法は、細胞を安定化（例えば、ロック）されたＣＲＩＳＰＲ複合体の溶液と接触させるステップを含み得る。その代わりにまたは組み合わせて、方法は、細胞を、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質コード領域および／またはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドコード領域を含むベクターと接触させるステップを含み得る。その代わりにまたは組み合わせて、非ウイルス媒介性技法を使用してＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。非ウイルス媒介性技法は、電気穿孔、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、微量注射、微粒子銃媒介性移入、ナノ粒子、カチオン性ポリマー媒介性移入（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン、ＰＥＧ、ＤＭＳＯなど）または細胞融合を含み得る。

ウイルス媒介性技法および非ウイルス媒介性技法を使用してＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。非ウイルス媒介性技法は、電気穿孔、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、微量注射、微粒子銃媒介性移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介性移入（ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）または細胞融合であり得る。

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド配列、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド配列、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド配列を含む、架橋のための少なくとも１つの非天然ヌクレオチドで修飾されたポリヌクレオチド、および、関連するベクターを、細胞にネイキッドで（すなわち、トランスフェクションを促進する作用因子を伴わずに）送達することができる。ネイキッドＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを細胞に、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている投与経路を使用して送達することができる。

一部の場合では、宿主細胞内の標的ＤＮＡの標的遺伝子の編集の調整可能なモジュレーションは、（ｉ）本明細書に記載の当技術分野で公知のウイルスによるまたはウイルスによらない送達方法またはこれらの組合せを使用して、（ａ）ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を架橋させるための非天然ヌクレオチド、ならびに第１の切断エレメントおよび第２の切断エレメントを含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドであって、切断エレメントが、切断を受けやすく、ガイド配列のヌクレオチド配列が、標的核酸配列と完全にまたは部分的に相補的であり、第１の切断エレメントが、ポリヌクレオチドリーダー配列とガイド配列の５’末端の間に位置付けられている、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと、（ｂ）触媒活性を有するＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９）とを宿主細胞に導入し、その結果、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲ酵素がＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する、ステップと、（ｉｉ）ＵＶ光への曝露により、ポリヌクレオチド内の第１の配列エレメントの切断を誘導し、それにより、ポリヌクレオチドリーダー配列を遊離させ、ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子のより高い標的特異的切断を活性化するステップとを含む。その後、方法は、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの足場配列内に位置し得る第２の配列エレメントの切断を所望の時点でＵＶ光へのパルス状曝露によって誘導し、それにより、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを切断し、ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子の標的特異的切断を非活性化または低減するステップを含み得る。

細胞は、外胚葉系（例えば、ニューロンおよび線維芽細胞）、中胚葉系（例えば、心筋細胞）、内胚葉系（例えば、膵臓細胞）、上皮（例えば、肺および鼻道）、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、破骨細胞、内皮細胞、造血の、赤血球などであり得る。細胞は、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯＫ１）；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２－ＯＳ細胞；ＮＩＨ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ－５６２細胞、Ｕ－９３７細胞；ＭＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；ジャーカット細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ－１０８０細胞；ＨＣＴ－１１６細胞；Ｈｕ－ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；ならびにＭｏｌｔ４細胞などの特定の細胞系に由来するものであり得る。本開示の範囲に適用可能な他の細胞の例としては、幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ＭＳＣ－１、Ｋ５６２などを挙げることができる。

一部の場合では、遮蔽を、細胞培養物全体を覆うように創出することができる。遮蔽は、様々な技法（レーザー切断、３Ｄ印刷、写真平板など）を使用して創出することができる。遮蔽は、光を定義済みの領域内に透過するように設計することができる。光切断可能なリンカーを含むＣＲＩＳＰＲオフ複合体と併せて使用する場合、光（例えば、ＵＶ光または可視光線）が透過する領域における編集を低減することができ、光に曝露されない領域における編集は維持することができる。ＣＲＩＳＰＲオン複合体と併せて使用する場合、光（例えば、ＵＶ光）が透過する領域における編集を開始させることができる。

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲオフ複合体活性は時間依存的であり得る（例えば、実施例６、図３０～３２において見ることができる通り）。細胞を、完全な編集前の時点でＵＶ光などの切断活性化因子または可視光線に曝露させることができ、その結果、ヘテロ接合性クローンが生じる。あるいは、そのような方法を使用して、患者由来の細胞系の病的な対立遺伝子を標的化することができる。

ゼロに近い解離定数を有する安定化（例えば、ロック）されたＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞への投与前または投与の間にＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質から解離し得る現行の複合体よりも増大した有効性を有し得る。
１．多数のＣＲＩＳＰＲ複合体

一部の場合では、系は、本発明で提供される１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ複合体を含む。第１のおよび第２の（またはそれよりも多くの）ＣＲＩＳＰＲ複合体をｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏにおける方法に使用することができる。第１のＣＲＩＳＰＲ複合体内のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と第２のＣＲＩＳＰＲ複合体内のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は同じであっても異なってもよい。一実施例では、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏ系は、異なるガイド配列および同じＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を有する複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含み得る。別の例では、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏ系は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび複数の異なるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、触媒として活性型のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と触媒として不活性型（ｉｎａｃｔｉｖｅ）のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の混合物）を含み得る。

その代わりにまたは組み合わせて、宿主細胞は、２種またはそれよりも多く（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種）の異なるロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体を含み得、ここで、異なるＣＲＩＳＰＲ複合体のガイド配列のヌクレオチド配列は、独立に、２種またはそれよりも多くの異なる標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の領域と完全にまたは部分的に相補的である。異なるＣＲＩＳＰＲ複合体は、異なる１つもしくは複数の切断エレメントの相対的位置、または同じ１つもしくは複数の切断エレメントの相対的位置を有し得る。
Ｂ．標的核酸の切断

本開示の態様は、標的核酸を切断するための方法を包含する。方法は、核酸配列を安定化（例えば、ロック）されたＣＲＩＳＰＲ複合体と接触させるステップを含み得る。安定化されたＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するための非天然ヌクレオチドおよび活性をモジュレートする配列を含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオン、ＣＲＩＳＰＲオフ、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフ）を含み得る。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性またはｃｒＲＮＡ領域の結合効率には干渉しないように選択された架橋性部位を有するロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的核酸の切断に関して増強された有効性を有し得る。ポリヌクレオチドは、「プロトスペーサー」および「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）」を含み得、両方のドメインがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質により媒介される活性（例えば、切断）に必要であり得る。

その代わりに、またはそれと組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の各触媒ドメインが活性であり得る。各触媒ドメインの効率は、５０％から６０％まで、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～９９．９％であり得る。

切断後、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介性末端結合（ＭＭＥＪ、代替非相同末端結合）または相同組換え修復（ＨＤＲ）によるＤＮＡ修復が起こり得る。ＨＤＲのためのＤＮＡ鋳型を提供することができる。

一部の実施例では、切断により、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）プロセスにより挿入および／または欠失（「インデル」）突然変異またはフレームシフトが導かれ、それにより、標的遺伝子特異的ノックアウト（ＫＯ）が導かれ得る。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を、特異的なｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）により、同時投与されたドナーポリヌクレオチド（一本鎖または二本鎖）と一緒に標的ゲノム領域に方向付けることができる。標的領域の切断後、相同組換え修復（ＨＤＲ）プロセスではドナーポリヌクレオチドの１つまたは複数が（ａ）切断された標的ヌクレオチド配列の修復および（ｂ）ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝情報の伝達ための１つまたは複数の鋳型として使用され得る。遺伝情報の性質に応じて、ＨＤＲプロセスにより、標的遺伝子特異的ＫＯまたはノックイン（ＫＩ）が生じる。ＨＤＲ媒介性遺伝子ＫＩの適用の例としては、タンパク質をコードする核酸材料、ｍＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、タグ（例えば、６ｘＨｉｓ）、レポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、および遺伝子に対する調節配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル）の付加（挿入または置換え）が挙げられる。

ＨＤＲプロセスに関しては、ドナーポリヌクレオチドは、所望の編集、例えば、コピーされる遺伝子編集（配列）、ならびに切断された標的部位のすぐ上流および下流の、相同である両末端の追加的なヌクレオチド配列（相同アーム）を含有し得る。一部の場合では、ＨＤＲプロセスの効率は、遺伝子編集のサイズおよび／または相同アームのサイズに依存し得る。

１つまたは複数の切断部位を標的とするために１または複数のＣＲＩＳＰＲ複合体を供給することができる。例えば、２つの切断部位を標的とするために２つのＣＲＩＳＰＲ複合体を供給することができ、１０の切断部位を標的とするために１０のＣＲＩＳＰＲ複合体を供給することができ、２０の切断部位を標的とするために２０のＣＲＩＳＰＲ複合体を供給することができるなどである。細胞に供給することができる異なるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）の数は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２５、５０、１００、もしくは１０００、または１～３、１～５、１～１０、１０～５０、もしくは５０～１００であり得る。

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体により、細胞における１つまたは複数の編集または突然変異を誘導することができる。１つまたは複数の編集または突然変異は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）による細胞の各標的配列における１つまたは複数のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含み得る。１つまたは複数の編集または突然変異は、前記細胞の各標的配列における約１～約７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換であり得る。１つまたは複数の編集または突然変異は、前記細胞の各標的配列における１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換であり得る。標的配列は遺伝子であり得、それらは、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＡＭＫ１、ＰＲＫＡＧ３、ＳＴＫ３、ＣＡＭＫ１、Ｃｈｒ８ｑ２３、ＣＥＬ、ＩＲＡＫ４、ＤＮＭＴ１、ＥＭＸ１、ＦＡＮＣＦ、ＧＲＫ１、ＰＲＧＮ、ＡＡＶＳ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＸＣＲ４、ＦＡＭ１６３Ａ、ＧＡＡ、ＣＲＫ１、ＩＲＡＫ４、ＭＡＰＲＥ１、ＭＩＰ、ＯＭＰ、ＯＰＮ１ＳＷ、ＰＲＫＡＧ３、ＳＴＫ３、およびＶＥＧＦＡを含み得る（実施例７、８、１１、１２において見ることができる通り）。

異なるｓｇＲＮＡに付着したＣＲＩＳＰＲ複合体のセットによって多数の標的部位を標的とすることができる。セット内の各ｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡのセットの少なくとも１種の他のガイドＲＮＡのハイブリダイズ可能な領域から最大で１７０塩基離れた領域とハイブリダイズ可能であり得る。目的のゲノム領域を標的とするｇＲＮＡのセット内の各ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡのセットの少なくとも１種の他のｇＲＮＡのハイブリダイズ可能な領域から約１０～２００塩基（ヌクレオチド）離れた領域とハイブリダイズ可能であり得る。ｇＲＮＡのセット内の各ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡのセットの少なくとも１種の他のｇＲＮＡのハイブリダイズ可能な領域から少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００塩基またはそれよりも大きく離れた領域とハイブリダイズ可能であり得る。ｇＲＮＡのセット内の各ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡのセットの少なくとも１種の他のｇＲＮＡのハイブリダイズ可能な領域から最大で２００、１８０、１６０、１４０、１２０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０塩基またはそれ未満離れた領域とハイブリダイズ可能であり得る。一実施例では、ｇＲＮＡのセット内のｇＲＮＡのハイブリダイズ可能な領域間の最小距離は、ｇＲＮＡのセットの少なくとも１種の他のｇＲＮＡのハイブリダイズ可能な領域から少なくとも３０塩基離れたものである。別の例では、ｇＲＮＡのセット内のｇＲＮＡのハイブリダイズ可能な領域の最大距離は、ｇＲＮＡのセットの少なくとも１種の他のｇＲＮＡのハイブリダイズ可能な領域から最大で１５０塩基離れたものである。

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性は、例えば、遺伝子治療において使用される、例えば、遺伝子ノックアウト（ＫＯ）、遺伝子ノックイン（ＫＩ）、遺伝子編集、遺伝子タグ付けなど、ＤＮＡを部位特異的に（標的化）改変することが望ましい任意のｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏにおける適用において有用であり得る。遺伝子治療の例としては、疾患の処置、または抗ウイルス薬、抗病原体薬、もしくは抗がん治療薬として；農業における遺伝子改変生物体の作製；治療、診断、または研究目的での細胞によるタンパク質の大規模生産；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）の誘導；および病原体の遺伝子を欠失または置換えのために標的化することが挙げられる。
Ｃ．遺伝子の調節

本開示の態様は、リプレッサードメインおよび活性化因子などの機能的ドメインを遺伝子にターゲティングすることによるドメインノックダウン法として公知の、遺伝子発現、または遺伝子のｍＲＮＡへの転写を調節するための方法を包含する。転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢ、ＤＭＴ３Ａ、および／またはＬＳＤ１）ならびに結合したＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と連結した触媒として不活性型のＣａｓヌクレアーゼは、遺伝子内の相補ＤＮＡ領域に結合し、転写を遮断し得る。方法のある実施形態は、ｓｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼの架橋が光開始されたらＣａｓヌクレアーゼを触媒として不活性型にする一方で、ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体内のｓｇＲＮＡの標的ＤＮＡ配列への相補的な結合活性を維持することを包含する。一部の場合では、触媒として不活性型のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ）を１種または複数種の転写活性化因子（例えば、ＶＰ６４、ｐ６５、および／またはＲＴａ１９）と融合することができ、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と安定化（例えば、ロック）された複合体を形成することができる。安定化（例えば、ロック）された複合体を細胞内の遺伝子に送達して、遺伝子の転写を上方制御することができる。

一部の場合では、機能的なドメインを不活性型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することができる、細胞内の不活性型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質）に連結することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するための非天然ヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドは、光切断可能なエレメントによってガイド配列から分離されたポリヌクレオチドリーダー配列をさらに含み得る。細胞をＵＶ照射に曝露させ、その結果、切断エレメントの切断およびポリヌクレオチドリーダー配列の遊離をもたらすことができる。次いで、ＣＲＩＳＰＲ複合体により標的配列を切断することができる。一部の場合では、ドナー核酸も細胞に導入し、それを、切断部位における相同組換えに使用して、核酸に編集を導入することができる。

核酸編集は、内因性調節性制御エレメント（例えば、エンハンサーまたはサイレンサー）を標的とし得る。核酸編集は、プロモーターまたはプロモーターの近位のエレメントを標的とし得る。これらの制御エレメントは、転写開始部位（ＴＳＳ）の上流または下流に、ＴＳＳから２００ｂｐのところから開始して１００ｋｂ離れたところまで位置し得る。公知の制御エレメントを標的とすることを使用して、目的の遺伝子を活性化または抑止することができる。単一の制御エレメントが多数の標的遺伝子の転写に影響を及ぼし得る。したがって、単一の制御エレメントを標的とすることを使用して、多数の遺伝子の転写を同時に制御することができる。

１つまたは複数の機能的ドメインは、核局在化配列（ＮＬＳ）または核外移行シグナル（ＮＥＳ）であり得る。

１つまたは複数の機能的ドメインは、転写活性化ドメインであり得る。転写活性化ドメインは、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９、またはヒストンアセチルトランスフェラーゼであり得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、転写活性化因子またはリプレッサー活性を有するドメインと融合した不活性型Ｃａｓタンパク質であり得る。転写活性化因子またはリプレッサー活性を有するドメインと融合した不活性型Ｃａｓタンパク質を、特定の組織における所与の遺伝子の対間の上位相互作用を試験するために使用することができる。

１つまたは複数の機能的ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑止活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ組込み活性または核酸結合活性を含む１つまたは複数の活性を有し得る。

１つまたは複数の機能的ドメインは、トランスポザーゼドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、リゾルバーゼドメイン、インベルターゼドメイン、プロテアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ＤＮＡヒドロキシルメチラーゼドメイン、ＤＮＡデメチラーゼドメイン、ヒストンアセチラーゼドメイン、ヒストン脱アセチル化酵素ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、リプレッサードメイン、活性化因子ドメイン、核局在シグナルドメイン、転写調節タンパク質（または転写複合体動員）ドメイン、細胞内取り込み活性関連ドメイン、核酸結合性ドメイン、抗体提示ドメイン、ヒストン修飾酵素、ヒストン修飾酵素の動員因子；ヒストン修飾酵素の阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ヒストンキナーゼ、ヒストンホスファターゼ、ヒストンリボシラーゼ、ヒストンデリボシラーゼ、ヒストンユビキチナーゼ、ヒストンデユビキチナーゼ、ヒストンビオチナーゼ、またはヒストン尾部プロテアーゼであり得る。

一部の場合では、機能的なドメインを不活性型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、不活性型Ｃａｓタンパク質）に連結することができる。不活性型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、不活性型Ｃａｓタンパク質）と連結した機能的なドメインを、プロモーターまたはエンハンサーとの結合および／またはその活性化のために使用することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、不活性型Ｃａｓ）を含むＣＲＩＳＰＲ複合体をプロモーターまたはエンハンサーとの結合に方向付けるために、プロモーターまたはエンハンサーとアニーリングし得るガイド配列を含む１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを提供することもできる。ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを、触媒として不活性型のＣａｓ９であり得るＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と共有結合により架橋させることができる。触媒として不活性型のＣａｓ９を転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）と融合することができる。融合体、例えば、Ｃａｓ９－ＶＰ６４融合体を使用して、標的遺伝子またはクロマチン領域の発現を調整可能にモジュレートすることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのポリヌクレオチドリーダー配列は、ガイド配列を介したＣＲＩＳＰＲ複合体の標的遺伝子への効率的な局在を妨げ得る。ポリヌクレオチドリーダー配列の切断により、ガイド配列を介したＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への効率的なターゲティングをもたらすことができ、これにより、転写活性化をもたらすことができる。その後、第２の切断因子を、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを曝露させることにより、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断をもたらし、ＣＲＩＳＰＲ複合体（または切断されたＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質から解離されている場合にはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質）の、遺伝子の転写を活性化する能力を低下させるかまたは阻害することができる。

本明細書に記載の活性化系または抑止系のいずれかを有する領域を標的とした後、例えば、ＲＮＡｓｅｑまたはマイクロアレイによる、ａ）推定上の標的のセット（例えば、制御エレメントの極めて近くに位置する遺伝子のセット）の転写の読み取りまたはｂ）全トランスクリプトーム読み取りのいずれかを行うことができる。

別の例では、本発明で提供されるＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して、宿主細胞における２種またはそれよりも多くの標的遺伝子の上位相互作用を試験することができる。方法は、（ｉ）ウイルスによるまたはウイルスによらない送達方法またはこれらの組合せを使用して、（ａ）第１の切断エレメントおよび第２の切断エレメントを含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドであって、切断エレメントが、切断を受けやすく、ガイド配列のヌクレオチド配列が、第１の標的核酸配列と完全にまたは部分的に相補的である、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと、（ｂ）触媒活性を有するＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）酵素とを宿主細胞に導入し、その結果、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）とＣＲＩＳＰＲ酵素がＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するステップと、（ｉｉ）所望の時点で、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の第１の切断エレメントの切断を誘導し、ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子のより高い標的特異的切断を活性化するステップと、次いで、（ｉｉｉ）所望の時点で第２の切断エレメントの切断を誘導し、それにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子の標的特異的切断を非活性化または低減するステップとを含み得る。

方法は、（ｉ）ウイルスによるまたはウイルスによらない送達方法またはこれらの組合せを使用して、（ａ）第１の切断エレメントおよび第２の切断エレメントを含む第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドであって、切断エレメントが、切断を受けやすく、ガイド配列のヌクレオチド配列が、第２の標的配列の領域（例えば、標的遺伝子内）と完全にまたは部分的に相補的である、第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと、（ｂ）触媒活性を有するＣＲＩＳＰＲ酵素を宿主細胞に導入し、その結果、第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）とＣＲＩＳＰＲ酵素が第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するステップと、（ｉｉ）所望の時点で、第２のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の第１の切断エレメントの切断を誘導し、ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子のより高い標的特異的切断を活性化するステップと、次いで、（ｉｉｉ）所望の時点で第２の切断エレメントの切断を誘導し、それにより、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子の標的特異的切断を非活性化または低減するステップとをさらに含み得る。

さらに、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体内の第１の切断エレメントの切断は、組織特異的プロモーター、例えば、筋肉特異的プロモーターの制御下に置くことができる。例えば、細胞における遺伝子操作されたエンドリボヌクレアーゼＣａｓ６ａ／Ｃｓｙ４の発現を、所与の時点で第１の切断エレメントの切断を誘導するために活性化することができる組織特異的プロモーター（例えば、筋肉）プロモーターの制御下に置くことができる。第１のＣＲＩＳＰＲ複合体および第２のＣＲＩＳＰＲ複合体内の第２の切断エレメントを所望の時点で所与の配列特異的小分子に曝露させることによって誘導的に切断することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、転写活性化因子またはリプレッサー活性を有するドメインと融合したｄＣａｓ９であり得、特定の組織における所与の遺伝子の対間の上位相互作用を試験するために使用することができる。

別の例では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して、１つまたは複数の宿主細胞内の標的ＤＮＡ内の２種またはそれよりも多くの標的遺伝子のオルソゴナルな転写を誘導することができる。「オルソゴナル」という用語は、独立していることを意味し得る、すなわち、２種またはそれよりも多くの標的遺伝子は、独立に調節され得るまたは独立に転写され得る。方法は、（ａ）第１の切断エレメントおよび第２の切断エレメントを含む２種またはそれよりも多くの異なる誘導性ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドであって、第１の配列エレメントおよび第２の配列エレメントが、切断を受けやすく、ガイド配列のヌクレオチド配列が、２種またはそれよりも多くの異なる標的遺伝子の付近の１種または複数種の標的ＤＮＡと完全にまたは部分的に相補的である、誘導性ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと、（ｂ）転写活性化因子ドメインと連結した触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ酵素とを宿主細胞に導入し、その結果、異なる誘導性ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲ酵素が異なるＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するように、ウイルスによるまたはウイルスによらない送達方法またはこれらの組合せを使用するステップであって、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、１つまたは複数のエフェクタードメインを含む、ステップと、（ｉｉ）所望の時点で、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチド内の第１の切断エレメントの切断を誘導し、したがって、標的遺伝子の発現を調和させるステップとを含み得る。標的ＤＮＡは、単一の遺伝子または制御エレメント内の隣接領域であり得る。
Ｄ．医薬製剤

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲ複合体をｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで使用して、細胞または生物体における変化を引き起こすことができる。ＣＲＩＳＲＰポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を複合体として導入することもでき、細胞内でそれらの複合体を形成させることもできる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を細胞に受動的に導入することもでき、ビヒクルを通じて導入することもできる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は導入時に緩衝剤中に存在し得る。

本開示の態様は、医薬製剤に使用するための安定化（例えば、ロック）されたＣＲＩＳＰＲ複合体を製造するための方法を包含する。ＣＲＩＳＰＲ複合体を、例えば、リポソームおよびナノ粒子送達による送達用に調製することができる。その代わりにまたは組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質および／またはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチをコードするベクタードを患者に、例えば、微量注射または他の機械的、物理的、またはウイルスによる方法によって送達することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体および関連するベクター構築物を１種または複数種の治療剤、予防剤、診断剤、または造影剤と組み合わせて使用することができる。

医薬製剤は、安定性を増大させるため、細胞へのトランスフェクションを増強するため、放出を制御するため（例えば、担体、例えば、ナノ粒子から）、体内分布を変更するため、またはＣＲＩＳＰＲ複合体をコードするベクターの翻訳を変更するために１つまたは複数の賦形剤を含み得る。医薬製剤は、架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体、水、共溶媒、緩衝剤、およびｐＨ調整剤の混合物を含み得る。共溶媒賦形剤は、油、界面活性物質、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、安定剤、キレート剤、および保存剤を含み得る。安定剤は、糖およびアミノ酸を含み得る。糖は、スクロースおよびラクトースを含み得る。アミノ酸は、グリシンおよびグルタミン酸ナトリウムを含み得る。保存剤は、フェノール、フェノキシエタノールおよびチメロサールを含み得る。

ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）安定性を増大させる；（２）細胞トランスフェクションを増大させる；（３）持続放出または遅延放出を可能にする（例えば、ポリヌクレオチドのデポ製剤から）；（４）体内分布（例えば、標的ポリヌクレオチド、一次構築物、または特定の組織もしくは細胞型に対するｍＲＮＡ）を変更する；（５）ｉｎｖｉｖｏにおけるコードされるタンパク質の翻訳を増加させる；かつ／または（６）ｉｎｖｉｖｏにおけるコードされるタンパク質の放出プロファイルを変更するための１つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化することができる。

賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁の補助剤、表面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇａｇｅｎｔ）、保存剤、および／または乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、保存剤、緩衝剤、平滑剤、および／または油であり得る。賦形剤は、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドがトランスフェクトされた細胞、一次構築物、またはＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、対象への移植のため）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体およびこれらの組合せであり得る。

医薬組成物中のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、またはいずれかをコードする核酸、および薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加的な成分の相対量は、処置を受ける対象の同一性、サイズ、および／または状態に応じて変動し得、組成物を投与する経路にもさらに依存する。組成物は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、またはいずれかをコードする核酸を、０．１％から１００％の間、例えば、５％から５０％の間、１～３０％の間、５～８０％の間、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）含み得る。

架橋のための少なくとも１つの非天然ヌクレオチドおよび活性をモジュレートするエレメント、例えば本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドなどを含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド配列を、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、１種または複数種の追加的な活性な物質、例えば、治療的におよび／または予防的に活性な物質を含み得る。医薬組成物の製剤化および／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ２ｅｄ．，ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５に見出すことができる（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

リピドイドの合成は広範囲にわたって記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、本明細書に記載の修飾されたＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドおよび一次構築物の送達に特に適する（Ｍａｈｏｎｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ．２０１０２１：１４４８－１４５４；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒｅｔａｌ．，ＪＩｎｔｅｒｎＭｅｄ．２０１０２６７：９－２１；Ａｋｉｎｃｅｔａｌ，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８２６：５６１－５６９；Ｌｏｖｅｅｔａｌ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１０１０７：１８６４－１８６９；Ｓｉｅｇｗａｒｔｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１１１０８：１２９９６－３００１を参照されたい；全てその全体が本明細書に組み込まれる）。リピドイドと、これだけに限定されないが、ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ－ＤＭＧを含めた他の構成成分の異なる比を使用して、ポリヌクレオチドの製剤、一次構築物、またはＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを、これだけに限定されないが、肝細胞、骨髄細胞、筋肉細胞などを含めた異なる細胞型を送達するために最適化することができる。

ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体は、１つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用して製剤化することができる。医薬組成物はリポソームを含み得る。本明細書に記載の医薬組成物は、以前に記載されており、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおけるポリヌクレオチド送達に適することが示されている、安定化されたプラスミド－脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化された核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるものなどのリポソームを含み得る（Ｗｈｅｅｌｅｒｅｔａｌ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．１９９９６：２７１－２８１；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．１９９９６：１４３８－１４４７；Ｊｅｆｆｓｅｔａｌ．ＰｈａｒｍＲｅｓ．２００５２２：３６２－３７２；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙｅｔａｌ，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５２：１００２－１００７を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、官能化された脂質二重層間に架橋を有し得る脂質小胞として製剤化することができる。

ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体は、脂質－ポリカチオン複合体として製剤化することができる。脂質－ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で公知であり、かつ／またはその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２０１７８７０２号に記載されている方法によって実現することができる。医薬組成物は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１２０９９７５５号に記載されているＰＥＧ化された脂質のうちの少なくとも１つを含み得る。

ＬＮＰ製剤は、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１１１２７２５５号または同第ＷＯ２００８１０３２７６号に記載されている方法によって製剤化することができる。そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１１２７２５５および／またはＷＯ２００８１０３２７６号；に記載されている通り、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをＬＮＰ製剤に封入することができる。

ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体を固体脂質ナノ粒子として製剤化することができる。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均直径が１０～１０００ｎｍの球状であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性物質および／または乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）を用いて安定化することができる固体脂質コアマトリックスを有し得る。脂質ナノ粒子は、自己組織化脂質－ポリマーナノ粒子であり得る（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ，ＡＣＳＮａｎｏ，２００８，２（８），ｐｐ１６９６－１７０２を参照されたい；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体、一次構築物、またはＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを脂質ナノ粒子または迅速に排出される脂質ナノ粒子に封入することができ、次いで、脂質ナノ粒子または迅速に排出される脂質ナノ粒子を本明細書に記載のおよび／または当技術分野で公知のポリマー、ハイドロゲルおよび／または外科用密封材に封入することができる。

制御放出および／または標的化送達のためのロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体製剤は、少なくとも１種の制御放出コーティングも含み得る。制御放出コーティングとしては、これだけに限定されないが、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースが挙げられる。

制御放出および／または標的化送達製剤は、ポリカチオン側鎖を含有し得る分解性ポリエステルを少なくとも１つ含み得る。分解性ポリエステルは、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リシン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、およびこれらの組合せであり得る。分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧコンジュゲーションを含み得る。

ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体は、治療用ナノ粒子に封入することができる。治療用ナノ粒子は、持続放出用に製剤化することができる。期間は、数時間、数日、数週、数カ月および数年を含み得る。非限定的な例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマーおよび治療剤、例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含み得る（そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１００７５０７２号ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号および同第ＵＳ２０１１０２１７３７７号を参照されたい）。治療用ナノ粒子は、標的特異的になるように製剤化することができる。治療用ナノ粒子は、コルチコステロイドを含み得る（国際特許公開第ＷＯ２０１１０８４５１８号を参照されたい）。

ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体は、合成ナノ担体に封入する、それと連結するおよび／またはそれと結び付けることができる。合成ナノ担体は国際特許公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号に記載されている方法によって製剤化することができる。合成ナノ担体は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを放出するための反応性基を含有し得る（そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１２０９５２５５２号および米国特許公開第ＵＳ２０１２０１７１２２９号を参照されたい）。

合成ナノ担体は、標的化放出用に製剤化することができる。合成ナノ担体は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を指定のｐＨにおいて、かつ／または所望の時間間隔後に放出するように製剤化することができる。合成ナノ粒子は、ポリヌクレオチド、一次構築物および／またはＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを２４時間後に、かつ／またはｐＨ４．５で放出するように製剤化することができる（そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１０１３８１９３号および同第ＷＯ２０１０１３８１９４号ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１１００２０３８８号および同第ＵＳ２０１１００２７２１７号を参照されたい）。

合成ナノ担体は、本明細書に記載のロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体の制御放出および／または持続放出のために製剤化することができる。持続放出用の合成ナノ担体は、例えば、本明細書に記載の通りおよび／またはそのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１０１３８１９２号および米国特許公開第２０１００３０３８５０号に記載されている通り製剤化することができる。

ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体は、高分子化合物と共にまたはその中に製剤化することができる。ポリマーとしては、少なくとも１つのポリマーポリエチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬに移植されたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋した分枝ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、生分解性ポリマー、生分解性ブロック共重合体、生分解性ランダム共重合体、生分解性ポリエステル共重合体、生分解性ポリエステルブロック共重合体、生分解性ポリエステルブロックランダム共重合体、直鎖状生分解性共重合体、ポリ［ａ－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性マルチブロック共重合体、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リシン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、アクリルポリマー、アミン含有ポリマーまたはこれらの組合せを挙げることができる。

本明細書に記載のロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体は、別の化合物とコンジュゲートすることができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ポリマー、脂質、および／または他の生分解性作用因子、例えば、リン酸カルシウムの組合せを使用してナノ粒子として製剤化することもできる。構成成分を、ナノ粒子の微調整が可能になるように組み合わせてコアシェル、ハイブリッド、および／または層ごとのアーキテクチャにすることができ、したがって、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの送達を増強することができる（Ｗａｎｇｅｔａｌ，ＮａｔＭａｔｅｒ．２００６５：７９１－７９６；Ｆｕｌｌｅｒｅｔａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００８２９：１５２６－１５３２；ＤｅＫｏｋｅｒｅｔａｌ，ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ．２０１１６３：７４８－７６１；Ｅｎｄｒｅｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１３２：７７２１－７７３１；Ｓｕｅｔａｌ．，ＭｏｌＰｈａｒｍ．２０１１Ｊｕｎ６；８（３）：７７４－８７；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体は、ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体による細胞のトランスフェクションを増大させるために、ペプチドおよび／またはタンパク質と共に製剤化することができる。ペプチドは細胞透過性ペプチドおよびタンパク質であり得、細胞内送達を可能にするペプチドを使用して医薬製剤を送達することができる。

ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体をｅｘｖｉｖｏで細胞にトランスフェクトし、その後、対象に移植することができる。そのようなベクターの例としては、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質または関連するポリペプチドをコードする一次核酸構築物または合成配列が挙げられる。医薬組成物は、修飾されたＲＮＡを肝臓および骨髄細胞に送達するための赤血球、修飾されたＲＮＡをウイルス様粒子（ＶＬＰ）中に入れて送達するためのビロソーム、ならびに、修飾されたＲＮＡを送達するための電気穿孔された細胞、例えば、ＭＡＸＣＹＴＥ（登録商標）（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）およびＥＲＹＴＥＣＨ（登録商標）（Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）からのものを含み得る。

本明細書に開示されるロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体または関連するベクター構築物の細胞に基づく製剤を、細胞トランスフェクション（例えば、細胞担体において）を確実にするため、ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体の体内分布を変更するため（例えば、細胞担体を特定の組織または細胞型にターゲティングすることによって）、および／またはコードされるタンパク質の翻訳を増大させるために使用することができる。

組成物は、例えば、直接浸漬するまたは浸すことによって、カテーテルを介して、ゲル、粉末、軟膏剤、クリーム剤、ゲル、ローション剤、および／または点滴薬によって、組成物をコーティングしたまたは含浸させたファブリックまたは生分解性材料などの基質を使用することによって、臓器または組織への直接送達のために製剤化することもできる。

本開示の態様は、医薬製剤を患者に投与するための方法を包含する。結合していないＲＮＡにより、インターフェロンガンマによる免疫応答が引き出される可能性がある。ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体では、医薬組成物中の結合していないｓｇＲＮＡの可能性を著しく低減することができる。連結したＣＲＩＳＰＲ複合体および関連する配列／ポリペプチドは、治療的に有効な転帰をもたらす任意の経路によって投与することができる。これらとしては、経腸、胃腸内、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ）（硬膜外（ｐｅｒｉｄｕｒａｌ））、脳内（大脳の中に）、脳室内（脳室の中に）、皮膚上（皮膚への塗布）、皮内（皮膚自体の中に）、皮下（皮膚の下に）、経鼻投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈の中に）、動脈内（動脈の中に）、筋肉内（筋肉の中に）、心臓内（心臓の中に）、骨内注入（骨髄の中に）、くも膜下腔内（脊柱管の中に）、腹腔内（腹膜への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通じて）、空洞内注射、（陰茎の基部の中に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身に分布させるための無傷の皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、吹送（鼻で吸い込むこと）、舌下、唇下、浣腸、点眼剤（結膜上に）、または点耳剤中が挙げられる。組成物は、組成物が血液脳関門、血管関門、または他の上皮性関門を横断することを可能にするやり方で投与することができる。

医薬製剤は、それを必要とする対象に、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、週３回、週２回、週１回、月４回、月３回、月２回、月１回、年４回、年３回、年２回、または年１回投与することができる。投与は、ある期間にわたるものであり得、期間は、少なくともまたは最大１週間、少なくともまたは最大１カ月間、少なくともまたは最大１年間、少なくともまたは最大１０年間、または対象の生涯にわたり得る。
Ｅ．状態

本開示の態様は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いた疾患状態の処置を包含する。疾患状態は、がん、神経性の状態、自己免疫障害などを含み得る。疾患状態の処置は、患部組織の処置を含み得る。処置は、細胞をＣＲＩＳＰＲ複合体で処理し、その後、細胞をヒト患者に注射する、移植する、または埋め込むことを含み得る。

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを、物質（「ペイロード」）の生物学的標的への送達が望まれる多数の異なるシナリオ、例えば、標的を検出するための検出可能な物質の送達、または治療剤の送達に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび関連するベクター構築物を１種または複数種の他の治療剤、予防剤、診断剤、または造影剤と組み合わせて使用することができる。

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド、および他の一次構築物は、リンカーおよびペイロードの両方を任意の有用な方向で含むように設計することができる。例えば、末端を２つ有するリンカーを使用して、一方の末端をペイロードに付着させ、他方の末端を核酸塩基に、例えばデアザ－アデノシンもしくはデアザ－グアノシンのＣ－７位もしくはＣ－８位またはシトシンもしくはウラシルのＮ－３位もしくはＣ－５位に付着させることができる。ペイロードは、細胞毒、放射性イオン、化学療法薬、または他の治療剤などの治療剤であり得る。

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを、細胞の表現型を変更するために使用することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする配列を治療薬ならびに／または臨床および研究の場において使用することができる。本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドおよび関連するベクター構築物ならびに本明細書に記載のそれらから翻訳されたタンパク質を治療剤または予防剤として使用することができる。例えば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドまたはＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチドまたはエフェクタータンパク質をコードする修飾されたｍＲＮＡ）を対象に投与し、ｉｎｖｉｖｏで翻訳させて、対象における治療的に関連性のあるまたは予防的ポリペプチドの発現を方向付けることができる。

ガイド配列（核酸標的化ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ内の）の、核酸標的化複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を方向付ける能力を任意の適切なアッセイによって評価することができる。例えば、試験されるガイド配列を含めた、核酸標的化複合体を形成するために十分な核酸標的化ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に、例えば核酸標的化複合体の構成成分をコードするベクターを用いたトランスフェクションによって供給することができ、その後、標的核酸配列内の優先的な標的化（例えば、切断）の評価を行うことができる。標的核酸配列の切断を、試験管中、標的核酸配列、試験されるガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含めた核酸標的化複合体の構成成分を準備し、試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応の間で標的配列における結合または切断率を比較することによって評価することができる。

本発明で提供される組成物は、種々の疾患、障害、および／または状態のいずれか、例えば、以下のうちの１つまたは複数の処置に使用することができる：自己免疫障害（例えば、糖尿病、ループス、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）；炎症性障害（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）；感染性疾患（例えば、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染症、真菌感染症、敗血症）；神経性障害（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、黄斑変性症などの血管新生障害）；増殖性障害（例えばがん、良性新生物）；呼吸器疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患）；消化性障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍）；筋骨格障害（例えば、線維筋痛症、関節炎）；内分泌障害、代謝障害、および栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗鬆症）；泌尿器障害（例えば、腎疾患）；心理学的障害（例えば、うつ病、統合失調症）；皮膚障害（例えば、創傷、湿疹）；血液およびリンパ性障害（例えば、貧血、血友病）など。

一態様では、疾患状態は、心血管疾患、糖尿病、肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、特発性肺線維症、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、冠動脈心疾患、脳血管疾患などであり得る。一態様では、疾患状態は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、動静脈奇形、多発性硬化症（ＭＳ）、またはパーキンソン病であり得る。別の態様では、疾患状態は、乾癬、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、血管炎、重症筋無力症、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性のループス、関節リウマチなどであり得る。

一態様では、疾患状態は、胆道がん（例えば、腺癌）、肺がん（例えば、大細胞癌、非小細胞癌、扁平上皮癌、新形成など）、結腸直腸がん、前立腺がん、子宮体がん、卵巣がん、造血系のがん、白血病、リンパのがん、腎がん（ｒｅｎａｌｃａｎｃｅｒ）、乳がん（例えば、癌腫）、食道がん（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｎｃｅｒ）、膵がん、皮膚がん（例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌、悪性黒色腫など）、軟部組織がん（例えば、血管肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、粘液腫、悪性線維性組織球腫－多形性肉腫など）、精巣がん（例えば、胚細胞腫、セミノーマなど）、甲状腺がん（例えば、未分化癌、濾胞癌、乳頭癌、ヒュルトレ細胞癌など）、膀胱がん（例えば、移行上皮癌）、子宮頸がん（例えば、腺癌）、子宮がん、腹膜がん、脳がん、神経芽細胞腫、中皮腫、胆管細胞癌、軟骨肉腫、白血病（例えば、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＣＭＭＬ、ＪＭＭＬなど）、リンパ腫（例えば、ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質細胞骨髄腫など）、副腎皮質性がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、骨がん、骨転移、脳がん、中枢神経系（ＣＮＳ）がん、末梢神経系（ＰＮＳ）がん、子宮頸がん、小児非ホジキンリンパ腫、膵がん（例えば、管状腺癌、内分泌腫瘍など）、結腸がん（例えば、腺癌、腺腫など）、結腸がん・直腸がん、子宮体がん、食道がん（ｅｓｏｐｈａｇｕｓｃａｎｃｅｒ）、ユーイングファミリーの腫瘍（例えば、ユーイング肉腫）、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛疾患、ヘアリー細胞白血病、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎がん（ｋｉｄｎｅｙｃａｎｃｅｒ）、喉頭・咽頭がん、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、小児白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、肝がん（例えば、肝細胞癌）、肺カルチノイド腫瘍、男性乳がん、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔・中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん（例えば、腺癌）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん）、肉腫、黒色腫皮膚がん、非黒色腫皮膚がん、胃がん（例えば、腺癌など）、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん（例えば、子宮肉腫）、移行上皮癌、膣がん、外陰がん、中皮腫、扁平上皮細胞または類表皮癌、気管支腺腫、絨毛癌、頭頸部がん、奇形癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、神経節がん（例えば、神経芽細胞腫）、または神経鞘がんであり得る。
Ｆ．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質およびＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの発現

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）を発現させるための１つまたは複数の発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターをまず宿主細胞にトランスフェクトし、次いで、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターおよび誘導性ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを宿主細胞に同時にトランスフェクトすることができる。単一の（型の）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターおよび誘導性ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞にトランスフェクトすることができる。宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）を内因性に発現する宿主細胞であり得る。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）をコードするメッセンジャーＲＮＡを遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えば、ｓｇＲＮＡと一緒に使用することもできる。ベクターを使用する場合、ベクターは、誘導性プロモーターを含有し得る。条件付きプロモーターおよび／または誘導性プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ、ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、ｐｏｌＩＩＩ、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターであり得る。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）をコードする導入遺伝子を細胞のゲノム内に組み込むことができる。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）を発現する導入遺伝子を細胞に導入することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９）導入遺伝子を単離された細胞に導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体トランスジェニック細胞を、トランスジェニック生物体から細胞を単離することによって得ることができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９）導入遺伝子を、同じく本明細書に記載の通り、ベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）および／または粒子および／またはナノ粒子送達によって真核細胞に送達することができる。

一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを誘導的に発現させることができる。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）を誘導的に発現させることができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）の発現を誘導することにより、所望の時点で、標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）を標的とし、その標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）を切断するように「オン」にすることができるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド／ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）複合体の形成をもたらすことができる。誘導性複合体を使用して、複合体の活性半減期を限定することによってまたはモデル生物体またはヒト細胞における組織特異的編集を実現することによってオフターゲット効果を低減することができる。

誘導性ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）を宿主細胞内で発現させることができる。発現は任意の順序であってよい。
Ｖ．ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの合成

本明細書に記載されている、ＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成した場合にオフターゲット編集活性の低下を有する１つまたは複数の修飾を含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド配列、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド配列、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド配列、またはＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドをさらに含む架橋のための非天然ヌクレオチドで修飾されたポリヌクレオチドは、当業者に公知の任意の方法によって合成することができる。本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドをさらに含む架橋のための非天然ヌクレオチドで修飾されたポリヌクレオチドは、化学的に合成することができる。本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドをさらに含む架橋のための非天然ヌクレオチドで修飾されたポリヌクレオチドは、２’－０－チオノカルバメートで保護されたヌクレオシドホスホロアミダイトを使用して合成することができる。ポリヌクレオチドの合成方法は、例えば、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ１３３，１１５４０－１１５５６（２０１１）；Ｔｈｒｅｌｆａｌｌｅｔａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ＆ＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１０，７４６－７５４（２０１２）；およびＤｅｌｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ，Ｊ．ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ１２５，９４０－９５０（２００３）に記載されている。本明細書に記載の修飾のいずれかを組み合わせ、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを、例えば、ガイド配列および／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合する配列（例えば、足場配列）に組み入れることができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、そのそれぞれが具体的に参照により本明細書に組み込まれるＢｅａｕｃａｇｅａｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，（１９８１）２２：１８５９－１８６２）に記載されているホスホロアミダイト法によって、またはＭａｔｔｅｕｃｃｉ，ｅｔａｌ．，（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，（１９８１）１０３：３１８５）によるトリエステル法によって、または市販の自動ポリヌクレオチドの合成機を使用する他の化学的方法によって調製することができる。

ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、例えば、ＢｅａｕｃａｇｅａｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２２：１８５９－１８６２（１９８１）に最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って、ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒｅｔ．ａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：６１５９－６１６８（１９８４）に記載されている通り、自動合成機を使用して化学的に合成することができる。ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの合成は、固相合成の間に特別なホスホロアミダイト試薬を使用する化学修飾を導入することを含み得る。
Ａ．ｓｇＲＮＡ連結

ｓｇＲＮＡであるＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、非リン酸ジエステル結合を介して化学的に連結またはコンジュゲートした、修飾されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み得る。修飾されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、非ヌクレオチドループを介して化学的に連結またはコンジュゲートしていてよい。修飾されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、非リン酸ジエステル共有結合性リンカーを介して接合していてよい。共有結合性リンカーは、クマリン、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、フルホン、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、感光性連結、ディールス・アルダー環化付加対または閉環メタセシス対、およびマイケル反応対などのＣ－Ｃ結合形成基からなる群から選択される化学的部分であり得る。
Ｂ．切断可能なエレメント

本発明のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド内の切断可能なエレメントは、適切に保護または活性化することができる官能基を各末端に伴って提供することができる。官能基は、エーテル、エステル、カルバメート、リン酸エステルまたはアミン連結を介して共有結合により付着させることができる。例えば、ヘキサエチレングリコールを、一方の末端において感光性保護基（すなわち、ＮＶＯＣまたはＭｅＮＰＯＣ）を用いて保護することができ、他の末端において２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ－クロロホスファイトを用いて活性化して、ホスホロアミダイトを形成することができる。エーテル、カルバメートまたはアミン連結を形成する他の方法は、当業者に公知であり、特定の試薬および参考文献は、Ｍａｒｃｈ，ＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈＥｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９２などのテキストに見出すことができる。

本明細書に記載のリンカーの合成方法は、当技術分野で周知である。本出願のリンカーを合成する方法の非限定的な例を以下に提示する：

前記リンカーの合成方法のさらなる非限定的な例を以下に記載する：

前記リンカーの合成方法の非限定的な例を以下に記載する：

Ｃ．ｓｇＲＮＡの合成

まず、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡを、ホスホロアミダイト合成プロトコールを使用して合成することができる（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，ｅｄ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＣｏｌ２８８，ＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ（２０１２））。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡ配列を、ライゲーションのための妥当な官能基を含有するように官能化することができる（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（２０１３）を参照されたい）。官能基は、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、アルデヒド、カルボニル、クロロカルボニル、クマリン、ソラレン、ジアジリン、またはアジドであり得る。修飾されたｔｒａｃｒおよびｔｒａｃｒメイト配列が官能化されたら、この２つのポリヌクレオチド間に共有結合性の化学結合または連結を形成することができる。化学結合は、クマリン、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、フルホン、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、感光性連結、ディールス・アルダー環化付加対または閉環メタセシス対、およびマイケル反応対などのＣ－Ｃ結合形成基に基づくものであり得る。

ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡ配列を化学的に合成することができる。ｓｇＲＮＡは、融合体の形態で一緒に合成してもよいし、別々に合成してもよいし、化学的に連結してもよい。化学合成は、固相ポリヌクレオチド合成機械を使用した自動化を使用し、２’－アセトキシエチルオルトエステル（２’－ＡＣＥ）（Ｓｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１１８２０－１１８２１；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３１７：３－１８）または２’－チオノカルバメート（２’－ＴＣ）化学（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０１１）１３３：１１５４０－１１５４６；Ｈｅｎｄｅｌｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３：９８５－９８９）を用いることができる。

ｓｇＲＮＡは、糖の修飾、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合、プリンおよびピリミジン残基を介した種々のバイオコンジュゲーション反応、ループ、架橋、および非ヌクレオチド連結を用いて共有結合により連結することができる。Ｓｌｅｔｔｅｎｅｔａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００９）４８：６９７４－６９９８；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００４）８：５７０－９；Ｂｅｈｌｋｅｅｔａｌ．，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（２００８）１８：３０５－１９；Ｗａｔｔｓ，ｅｔａｌ．，Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ（２００８）１３：８４２－５５；Ｓｈｕｋｌａ，ｅｔａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ（２０１０）５：３２８－４９。

ｓｇＲＮＡは、クリックケミストリーを使用してアセンブルすることができる。ｃｒＲＮＡｔｒａｃｒＲＮＡおよび／またはその中の配列エレメントをトリアゾールリンカーを使用して共有結合性の連結によってアセンブルすることができる。５’－ヘキシンｔｒａｃｒＲＮＡと３’－アジドｃｒＲＮＡをライゲーションすることによって共有結合により連結したｓｇＲＮＡにすることができる。５’－ヘキシンｔｒａｃｒＲＮＡおよび３’－アジドｃｒＲＮＡのいずれかまたは両方を２’－アセトキシエチルオルトエステル（２’－ＡＣＥ）基で保護することができ、これはその後、Ｄｈａｒｍａｃｏｎプロトコールを使用して除去することができる（Ｓｃａｒｉｎｇｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１１８２０－１１８２１；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３１７：３－１８）。
ＶＩ．キット

キットは、本明細書に記載の構成成分のうちの１つまたは複数を含み得る。キットは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドを含み得る。キットは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。キットは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドと本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含む本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体を含み得る。キットは、リンカー、例えば、切断可能なリンカーを含み得る。キットは、光切断可能なリンカーを含み得る。キットは、説明書を含み得る。キットは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、またはＣＲＩＳＰＲ複合体を含む細胞または生物体を含み得る。

キットは、遺伝子構築物、例えば、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／または１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を発現させるためのベクター系ならびにキットの使用に関する説明書を含み得る。キットは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよび／またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を発現させるための１つまたは複数の遺伝子構築物（例えば、１つまたは複数のベクター系）を含む細胞を含み得る。

キットは、核酸標的を、例えば本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体と接触させるために適した組成物を生成するための賦形剤を含み得る。組成物は、ゲノム内の核酸標的配列を接触させるために適したものであり得る。組成物は、組成物（例えば、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えばｓｇＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、例えばＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９と複合体を形成したもの）を細胞に送達するために適したものであり得る。組成物は、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、例えばｇＲＮＡ、またはそれとＣＲＩＳＰＲ酵素の複合体）を対象に送達するために適したものであり得る。賦形剤は、薬学的に許容される賦形剤であり得る。

キットは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの切断可能なエレメントの１つまたは複数の切断に使用するための１つまたは複数の試薬を含み得る。１つまたは複数の試薬は、任意の適切な容器に入れて提供することができる。キットは、１種または複数の反応または保管緩衝剤を含み得る。キットは、試薬を含み得る。試薬は、特定のアッセイに使用可能な形態で、または使用前に１種または複数の他の構成成分の添加を必要とする形態で（例えば、濃縮物または凍結乾燥した形態で）提供することができる。反応または保管緩衝剤は、任意の緩衝剤、例えば、炭酸ナトリウム緩衝剤、炭酸水素ナトリウム緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、またはこれらの組合せであり得る。緩衝剤のｐＨは約７から約１０までであり得る。

キットは、ガイド配列および調節エレメントに作動可能に連結するようにベクターに挿入するための、ガイド配列に対応する１種または複数のポリヌクレオチドを含み得る。キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含み得る。
本開示の例示的な非限定的態様

上記の本主題の実施形態を含めた態様は、単独でまたは１種もしくは複数種の他の態様もしくは実施形態との組合せで有益であり得る。前述の説明を限定することなく、１～２４４の番号を付した本開示のある特定の非限定的態様を以下に提示する。本開示を読めば当業者には明らかになるように、個別に番号を付した態様のそれぞれを前のまたは後ろの個別に番号が付された態様と共に使用するまたはそれと組み合わせることができる。これは、そのような態様の組合せの全てに対する支持を提供し、また、以下に明確に提示される態様の組合せに限定されないことが意図されている。
１．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）内のヌクレオチドでＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に架橋したｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、ｇＲＮＡが、標的結合性領域およびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域を含み、ヌクレオチドが、ｇＲＮＡの標的結合性領域の外側に存在する、ＣＲＩＳＰＲ複合体。
２．ヌクレオチドが、ウラシルを含む、実施形態１に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
３．ｇＲＮＡが、標的結合性領域を含むｃｒＲＮＡ領域とｔｒａｃｒＲＮＡ領域とを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり、ヌクレオチドがｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の外側に存在する、実施形態１または２に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
４．ヌクレオチドがｓｇＲＮＡのヌクレオチド４９位に存在し、ヌクレオチド１位がｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、実施形態３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
５．ヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチド位：２２、２３、２４、２５、３１、３７、４４、４９、４５、５０、５６、５９、６３、６４、６６、７１、７２、７７、７８、８０、８４、９０または９４に存在し、ヌクレオチド１位が、ｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、実施形態３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
６．ヌクレオチドが、非天然ヌクレオチドである、実施形態１から５までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
７．非天然ヌクレオチドが、糖の修飾を含む、実施形態６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
８．非天然ヌクレオチドが、塩基の修飾を含む、実施形態６または７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
９．非天然ヌクレオチドが、マレイミドを含む、実施形態６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１０．マレイミドが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインに共有結合により連結している、実施形態９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１１．ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋剤を介して架橋しており、架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰ、または８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、実施形態６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１２．ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋剤を介して架橋しており、架橋剤が、ジスルフィド、アミド、イミン、ヒドラジド、Ｏ－アルキルオキシム、アルキル、アミン、アルコール、トリアゾール、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾールまたはピリダジンを含む、実施形態６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１３．ヌクレオチドが、ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のステムループ内に存在する、実施形態３から１２までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１４．ステムループの構造が、ヌクレオチドを欠くｓｇＲＮＡのステムループの構造と比べて維持されている、実施形態１３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１５．ヌクレオチドが、ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のバルジ内に存在する、実施形態３から１４までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１６．バルジの構造が、ヌクレオチドを欠くｓｇＲＮＡのバルジの構造と比べて維持されている、実施形態１５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１７．ヌクレオチドが、ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のステムループ間に存在する、実施形態３から１６までのいずれかに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１８．ＣＲＩＳＰＲ複合体が、ヌクレアーゼ活性を含む、実施形態１から１７までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１９．ＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲットヌクレアーゼ活性が、架橋していないＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とｇＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲットヌクレアーゼ活性と等しいまたはそれよりも低い、実施形態１８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
２０．ヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインに対して２０オングストローム以内に存在する、実施形態１から１９までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
２１．ヌクレオチドが、４－チオウリジンまたは修飾アデノシンではない、実施形態１から２０までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
２２．単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のヌクレオチド４９位のヌクレオチドでＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に架橋したｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、ｓｇＲＮＡが、標的結合性領域を含むｃｒＲＮＡ領域とｔｒａｃｒＲＮＡ領域とを含み、ヌクレオチド１位がｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、ＣＲＩＳＰＲ複合体。
２３．ヌクレオチド４９位のヌクレオチドが、ウラシルを含む、実施形態２２に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
２４．ヌクレアーゼ活性を含む、実施形態２２または２３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
２５．ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性をモジュレートするように構成された配列をさらに含む、実施形態１から２４までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
２６．ｇＲＮＡが、切断可能なリンカーを含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを含む、実施形態２５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
２７．ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドを含む、実施形態２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
２８．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した配列エレメントを含み、ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、実施形態２６または２７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
２９．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、ガイド配列の５’末端と共有結合により連結した配列エレメントを含み、ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、実施形態２６または２７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
３０．配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結している、実施形態２９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
３１．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、１つまたは複数の切断可能なリンカーを含む配列エレメントを含み、配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結しておらず、ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、実施形態２６または２７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
３２．配列エレメントが、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、実施形態２８から２９までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
３３．配列エレメントが、少なくとも２０ヌクレオチドを含む、実施形態２８から２９までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
３４．配列エレメントが、２４ヌクレオチドを含む、実施形態２８から３０までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
３５．配列エレメントが、ＲＮＡ配列を含む、実施形態２９から３１までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
３６．ＲＮＡ配列が、修飾されたＲＮＡ塩基を含む、実施形態３２に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
３７．修飾されたＲＮＡ塩基が、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基である、実施形態３３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
３８．配列エレメントが、ループを含むステムループを形成する、実施形態２８から３４までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
３９．ループが、少なくとも２ヌクレオチドを含む、実施形態３５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
４０．ループが、少なくとも３ヌクレオチドを含む、実施形態３５または３６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
４１．ループが、４ヌクレオチドを含む、実施形態３５から３７までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
４２．配列エレメントが、ガイド配列に対する塩基対を含む、実施形態３５から３８までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
４３．配列エレメントが、ガイド配列の標的結合性領域に対する塩基対を含む、実施形態３９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
４４．配列エレメントが、ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１０ヌクレオチドと塩基対合する、実施形態４０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
４５．配列エレメントが、ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１５ヌクレオチドと塩基対合する、実施形態４０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
４６．配列エレメントが、ガイド配列の標的結合性領域内の２０ヌクレオチドと塩基対合する、実施形態４０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
４７．配列エレメントが、ガイド配列に対する塩基対を含まない、実施形態３５から３８までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
４８．配列エレメントの最も５’側の塩基が、ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングする、実施形態４４に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
４９．配列エレメント内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２８から４５までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
５０．配列エレメント内に少なくとも２つの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２８から４５までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
５１．配列エレメント内に少なくとも３つの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２８から４５までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
５２．配列エレメント内に少なくとも４つの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２８から４５までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
５３．配列エレメント内に少なくとも５個またはそれよりも多く、７個またはそれよりも多く、１０個またはそれよりも多く、１５個またはそれよりも多く、または２０個またはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２８から４５までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
５４．配列エレメントのループ内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態３５から４５までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
５５．配列エレメントのループ内に２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態３５から４５までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
５６．配列エレメントのループ内に３つの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態３５から４５までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
５７．配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態３５から４５または５１から５３までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
５８．配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態３５から４５または５１から５３までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
５９．配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに３つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態３５から４５または５１から５３までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
６０．配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに４つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態３５から４５または５１から５３までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
６１．配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの１１位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
６２．配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位、１６位、２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
６３．配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
６４．配列エレメントの２４位に切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに第１の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに第２の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
６５．配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
６６．配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
６７．配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの１６位に第４の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの１１位に第５の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
６８．配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの１４位に第４の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
６９．配列エレメントが、２４ヌクレオチド長であり、配列エレメントのループが、ガイド配列の標的結合性領域と塩基対合する配列エレメントの２１位から２４位までのヌクレオチドおよび１位から２０位までのヌクレオチドを含む、実施形態５８から６５までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
７０．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドが、ガイド配列の最も５’側のヌクレオチドの３’側に切断可能なリンカーを含み、ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、実施形態２６または２７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
７１．切断可能なリンカーが、ポリヌクレオチドの３’末端には存在せず、ポリヌクレオチドが、ガイド配列と、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域を含む配列とをポリヌクレオチドの５’末端から３’末端までの順序で含む、実施形態６７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
７２．切断可能なリンカーが、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態２６から６８までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
７３．ポリヌクレオチドが、第１の切断可能なリンカーおよび第２の切断可能なリンカーを含み、第１の切断可能なリンカーが、ヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けられており、第２の切断可能なリンカーが、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けられており、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態２６から６８までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
７４．ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、切断可能なリンカーが、ネクサスのループ内またはステムループ１のループ内に存在する、実施形態２６から７０までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合。
７５．ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、切断可能なリンカーが、ネクサスのループ内およびステムループ１のループ内に存在する、実施形態２６から７０までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
７６．切断可能なリンカーが、感光性である、実施形態２６から７２までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
７７．切断可能なリンカーが、紫外線（ＵＶ）によって切断される、実施形態７３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
７８．切断可能なリンカーが、１００ｎｍ～４００ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態７４に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
７９．切断可能なリンカーが、可視光線によって切断される、実施形態７３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
８０．切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～７００ｎｍの波長の光によって切断される、実施形態７３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
８１．切断可能なリンカーが、緑色光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
８２．切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
８３．切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
８４．切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
８５．切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
８６．切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
８７．切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
８８．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、緑色光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
８９．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
９０．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
９１．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
９２．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
９３．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
９４．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
９５．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
９６．ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド内の切断可能なリンカーが、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド内の切断可能なリンカーよりも長い波長の光によって切断される、実施形態７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
９７．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが緑色光によって切断され、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが紫色光によって切断される、実施形態９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
９８．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが緑色光によって切断され、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが青色光によって切断される、実施形態９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
９９．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１００．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１０１．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１０２．切断可能なリンカーが、ホスホロアミダイト誘導体である、実施形態２６から９８までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１０３．切断可能なリンカーが、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト誘導体である、実施形態２６から９８までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１０４．切断可能なリンカーが、１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）－３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト誘導体である、実施形態２６から９８までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１０５．切断可能なリンカーが、リン酸ジエステルを含む、実施形態２６から９８までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１０６．切断可能なリンカーが、ホスホモノエステルを含む、実施形態２６から９８までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１０７．切断可能なリンカーが、クマリン誘導体である、実施形態２６から９８までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１０８．切断可能なリンカーが、次式：

（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む、実施形態２６から９８までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１０９．Ｘが酸素である、実施形態１０５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１１０．Ｘが硫黄である、実施形態１０５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１１１．Ｘが＝Ｃ（ＣＮ）２である、実施形態１０５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１１２．切断可能なリンカーが、式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
ただし、ＸがＯであり、Ｒ^３がジアルキルアミノである場合には、ｍは２から１０までの整数であり；
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む、実施形態２６から９８までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１１３．Ｘが酸素である、実施形態１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１１４．Ｘが硫黄である、実施形態１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１１５．Ｘが＝Ｃ（ＣＮ）２である、実施形態１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１１６．式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、酸素である）
によって表される、実施形態１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１１７．式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、硫黄である）
によって表される、実施形態１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１１８．式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、＝Ｃ（ＣＮ）２である）
によって表される、実施形態１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１１９．Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、Ｃ_１～６アルキルである、
実施形態１１３から１１５までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１２０．Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれＨであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、それぞれエチルである、
実施形態１１３から１１５までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１２１．ｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、第１の架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され、第１の架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲット核酸分子に対する編集活性が、架橋していないｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い、実施形態１から１１７までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１２２．編集活性が、編集されるオフターゲット核酸分子のパーセンテージとして測定される、実施形態１１８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１２３．編集活性が、編集される標的核酸分子のパーセンテージとして測定される、実施形態１１８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１２４．第１のＣＲＩＳＰＲ複合体によるオフターゲット核酸分子に対する編集活性が、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の編集活性よりも低く、ｐ値≦０．０００１である、実施形態１１８から１２０までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１２５．第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性と第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性が５％以内である、実施形態１１８から１２１までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１２６．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である、実施形態１から１２２までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１２７．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ９ポリペプチドである、実施形態１２３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１２８．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である、実施形態１から１２２までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１２９．Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈまたはＣａｓ１２ｉポリペプチドである、実施形態１２５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１３０．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である、実施形態１から１２２までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１３１．ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄポリペプチドである、実施形態１２７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１３２．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、またはＣａｓ１４ｃポリペプチドである、実施形態１から１２２までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
１３３．ｃｒＲＮＡ領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域およびヌクレオチド４９位のヌクレオチドを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、ヌクレオチド１位が、ｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の５’末端に存在し、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、ｓｇＲＮＡ。
１３４．ｃｒＲＮＡ領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域およびヌクレオチド４９位のウラシルを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、ヌクレオチド１位が、ｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の５’末端に存在し、ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、ｓｇＲＮＡ。
１３５．（ｉ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含むガイド配列と、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域を含む配列と、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するように構成されたヌクレオチドであって、ガイド配列の標的結合性領域の外側に存在する、ヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド。
１３６．ヌクレオチドが、ウラシルを含む、実施形態１３２に記載のポリヌクレオチド。
１３７．ヌクレオチドが、ポリヌクレオチドのヌクレオチド４９位に存在し、ヌクレオチド１位が、ガイド配列の標的結合性領域の５’末端に存在し、ポリヌクレオチドのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、実施形態１３２または１３３に記載のポリヌクレオチド。
１３８．ヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチド位：２２、２３、２４、２５、３１、３７、４４、４９、４５、５０、５６、５９、６３、６４、６６、７１、７２、７７、７８、８０、８４、９０、および９４に存在し、ヌクレオチド１位が、ガイド配列の標的結合性領域の５’末端に存在し、ポリヌクレオチドのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、実施形態１３２から１３４までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１３９．ヌクレオチドが、非天然ヌクレオチドである、実施形態１３２から１３５までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１４０．非天然ヌクレオチドが、糖の修飾を含む、実施形態１３６に記載のポリヌクレオチド。
１４１．非天然ヌクレオチドが、塩基の修飾を含む、実施形態１３６または１３７に記載のポリヌクレオチド。
１４２．非天然ヌクレオチドが、マレイミドを含む、実施形態１３６に記載のポリヌクレオチド。
１４３．マレイミドが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインと共有結合により連結している、実施形態１３９に記載のポリヌクレオチド。
１４４．ポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋剤を介して架橋しており、架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰ、または８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、実施形態１３２から１４０までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１４５．ポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋剤を介して架橋しており、架橋剤が、ジスルフィド、アミド、イミン、ヒドラジド、Ｏ－アルキルオキシム、アルキル、アミン、アルコール、トリアゾール、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾールまたはピリダジンを含む、実施形態１３２から１４０までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１４６．（ｉｉ）の配列が、５’から３まで、テトラループ、ネクサス、第１のステムループおよび第２のステムループを形成する、実施形態１３２から１４２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１４７．第３のステムループを含まない、実施形態１３２または１４２に記載のポリヌクレオチド。
１４８．ポリヌクレオチドの５’末端にはステムループを含まない、実施形態１３２から１４４までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１４９．ヌクレオチドが、ステムループ内に存在する、実施形態１４２から１４５までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１５０．ステムループの構造が、ヌクレオチドを欠くポリヌクレオチドのステムループの構造と比べて維持されている、実施形態１４６に記載のポリヌクレオチド。
１５１．ヌクレオチドが、テトラループ内に存在する、実施形態１４２から１４７までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１５２．テトラループの構造が、ヌクレオチドを欠くポリヌクレオチドのテトラループの構造と比べて維持されている、実施形態１４８に記載のポリヌクレオチド。
１５３．テトラループが、バルジを含む、実施形態１４８または１４９に記載のポリヌクレオチド。
１５４．ヌクレオチドが、バルジ内に存在する、実施形態１５０に記載のポリヌクレオチド。
１５５．バルジの構造が、ヌクレオチドを欠くポリヌクレオチドのバルジの構造と比べて維持されている、実施形態１５１に記載のポリヌクレオチド。
１５６．ヌクレオチドが、ステムループ間に存在する、実施形態１４２から１５２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１５７．ヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインに対して２０オングストローム以内に存在する、実施形態１３２から１５３までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１５８．ヌクレオチドが、４－チオウリジンまたは修飾アデノシンではない、実施形態１３２から１５４までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１５９．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するように構成されたヌクレオチドを少なくとも２つ含む、実施形態１３２から１５５までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６０．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性をモジュレートするように構成された配列をさらに含む、実施形態１３２から１５６までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６１．切断可能なリンカーを含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを含む、実施形態１５７に記載のポリヌクレオチド。
１６２．ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドを含む、実施形態１５８に記載のポリヌクレオチド。
１６３．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した配列エレメントを含む、実施形態１５８または１５９に記載のポリヌクレオチド。
１６４．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、ガイド配列の５’末端と共有結合により連結した配列エレメントを含み、ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、実施形態１５８または１５９に記載のポリヌクレオチド。
１６５．配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結している、実施形態１５８または１５９に記載のポリヌクレオチド。
１６６．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、１つまたは複数の切断可能なリンカーを含む配列エレメントを含み、配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結しておらず、ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、実施形態１５８または１５９に記載のポリヌクレオチド。
１６７．配列エレメントが、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、実施形態１６０から１６６までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６８．配列エレメントが、少なくとも２０ヌクレオチドを含む、実施形態１６０から１６６までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１６９．配列エレメントが、２４ヌクレオチドを含む、実施形態１６０から１６５までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７０．配列エレメントが、ＲＮＡ配列を含む、実施形態１６０から１６６までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７１．ＲＮＡ配列が、修飾されたＲＮＡ塩基を含む、実施形態１６７に記載のポリヌクレオチド。
１７２．修飾されたＲＮＡ塩基が、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基である、実施形態１６８に記載のポリヌクレオチド。
１７３．配列エレメントが、ループを含むステムループを形成する、実施形態１６０から１６９までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７４．ループが、少なくとも２ヌクレオチドを含む、実施形態１７０に記載のポリヌクレオチド。
１７５．ループが、少なくとも３ヌクレオチドを含む、実施形態１７０または１７１に記載のポリヌクレオチド。
１７６．ループが、４ヌクレオチドを含む、実施形態１７０から１７２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７７．配列エレメントが、ガイド配列に対する塩基対を含む、実施形態１７０から１７３までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１７８．配列エレメントが、ガイド配列の標的結合性領域に対する塩基対を含む、実施形態１７４に記載のポリヌクレオチド。
１７９．配列エレメントが、ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１０ヌクレオチドと塩基対合する、実施形態１７５に記載のポリヌクレオチド。
１８０．配列エレメントが、ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１５ヌクレオチドと塩基対合する、実施形態１７５に記載のポリヌクレオチド。
１８１．配列エレメントが、ガイド配列の標的結合性領域内の２０ヌクレオチドと塩基対合する、実施形態１７５に記載のポリヌクレオチド。
１８２．配列エレメントが、ガイド配列に対する塩基対を含まない、実施形態１７０から１７３までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８３．配列エレメントの最も５’側の塩基が、ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングする、実施形態１７９に記載のポリヌクレオチド。
１８４．配列エレメント内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態１６０から１８０までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８５．配列エレメント内に少なくとも２つの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態１６０から１８０までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８６．配列エレメント内に少なくとも３つの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態１６０から１８０までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８７．配列エレメント内に少なくとも４つの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態１６０から１８０までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８８．配列エレメント内に少なくとも５個またはそれよりも多く、７個またはそれよりも多く、１０個またはそれよりも多く、１５個またはそれよりも多く、または２０個またはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態１６０から１８０までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１８９．配列エレメントのループ内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態１７０から１８０までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１９０．配列エレメントのループ内に２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態１７０から１８０までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１９１．配列エレメントのループ内に３つの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態１７０から１８０までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１９２．配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態１７０から１８０までまたは１８６から１８８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１９３．配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態１７０から１８０までまたは１８６から１８８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１９４．配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに３つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態１７０から１８０までまたは１８６から１８８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１９５．配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに４つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態１７０から１８０までまたは１８６から１８８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
１９６．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの１１位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態１８１に記載のポリヌクレオチド。
１９７．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位、１６位、２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態１８１に記載のポリヌクレオチド。
１９８．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態１８１に記載のポリヌクレオチド。
１９９．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに第１の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに第２の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態１８１に記載のポリヌクレオチド。
２００．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態１８１に記載のポリヌクレオチド。
２０１．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態１８１に記載のポリヌクレオチド。
２０２．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの１６位に第４の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの１１位に第５の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態１８１に記載のポリヌクレオチド。
２０３．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの１４位に第４の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態１８１に記載のポリヌクレオチド。
２０４．配列エレメントが、２４ヌクレオチド長であり、配列エレメントのループが、ガイド配列の標的結合性領域と塩基対合する配列エレメントの２１位から２４位までのヌクレオチドおよび１位から２０位までのヌクレオチドを含む、実施形態１９３から２００までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２０５．ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した配列エレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド。
２０６．ガイド配列の５’末端と共有結合により連結した配列エレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドであって、ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド。
２０７．配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結している、実施形態２０６に記載のポリヌクレオチド。
２０８．１つまたは複数の切断可能なリンカーを含む配列エレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドであって、配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結しておらず、ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド。
２０９．配列エレメントが、ＲＮＡ配列を含む、実施形態２０２から２０８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２１０．ＲＮＡ配列が、修飾されたＲＮＡ塩基を含む、実施形態２０９に記載のポリヌクレオチド。
２１１．ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した配列エレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドであって、ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含み、配列エレメントが、修飾されたＲＮＡ塩基を含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド。
２１２．修飾されたＲＮＡ塩基が、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基である、実施形態２１０または２１１に記載のポリヌクレオチド。
２１３．配列エレメントが、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、実施形態２０２から２０９までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２１４．配列エレメントが、少なくとも２０ヌクレオチドを含む、実施形態２０２から２１０までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２１５．配列エレメントが、２４ヌクレオチドを含む、実施形態２０２から２１１までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２１６．配列エレメントが、ループを含むステムループを形成する、実施形態２０２から２１２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２１７．ループが、少なくとも２ヌクレオチドを含む、実施形態２１３に記載のポリヌクレオチド。
２１８．ループが、少なくとも３ヌクレオチドを含む、実施形態２１３または２１４に記載のポリヌクレオチド。
２１９．ループが、４ヌクレオチドを含む、実施形態２１３から２１５までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２２０．配列エレメントが、ガイド配列に対する塩基対を含む、実施形態２１３から２１６までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２２１．配列エレメントが、ガイド配列の標的結合性領域に対する塩基対を含む、実施形態２１７に記載のポリヌクレオチド。
２２２．配列エレメントが、ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１０ヌクレオチドと塩基対合する、実施形態２１８に記載のポリヌクレオチド。
２２３．配列エレメントが、ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１５ヌクレオチドと塩基対合する、実施形態２１８に記載のポリヌクレオチド。
２２４．配列エレメントが、ガイド配列の標的結合性領域内の２０ヌクレオチドと塩基対合する、実施形態２１８に記載のポリヌクレオチド。
２２５．配列エレメントが、ガイド配列に対する塩基対を含まない、実施形態２１３から２１６までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２２６．配列エレメントの最も５’側の塩基が、ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングする、実施形態２２２に記載のポリヌクレオチド。
２２７．配列エレメント内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２０２から２２３までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２２８．配列エレメント内に少なくとも２つの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２０２から２２３までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２２９．配列エレメント内に少なくとも３つの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２０２から２２３までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２３０．配列エレメント内に少なくとも４つの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２０２から２２３までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２３１．配列エレメント内に少なくとも５個またはそれよりも多く、７個またはそれよりも多く、１０個またはそれよりも多く、１５個またはそれよりも多く、または２０個またはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２０２から２２３までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２３２．配列エレメントのループ内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２０２から２２３までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２３３．配列エレメントのループ内に２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２０２から２２３までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２３４．配列エレメントのループ内に３つの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２０２から２２３までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２３５．配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２０２から２２３までまたは２２９から２３２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２３６．配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２０２から２２３までまたは２２９から２３２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２３７．配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに３つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２０２から２２３までまたは２２９から２３２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２３８．配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに４つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、実施形態２０２から２２３までまたは２２９から２３２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２３９．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの１１位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態２２４に記載のポリヌクレオチド。
２４０．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位、１６位、２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態２２４に記載のポリヌクレオチド。
２４１．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態２２４に記載のポリヌクレオチド。
２４２．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに第１の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに第２の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態２２４に記載のポリヌクレオチド。
２４３．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態２２４に記載のポリヌクレオチド。
２４４．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態２２４に記載のポリヌクレオチド。
２４５．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの１６位に第４の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの１１位に第５の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態２２４に記載のポリヌクレオチド。
２４６．ポリヌクレオチドが、配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの１４位に第４の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、配列エレメントの５’末端から配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態２２４に記載のポリヌクレオチド。
２４７．配列エレメントが、２４ヌクレオチド長であり、配列エレメントのループが、ガイド配列の標的結合性領域と塩基対合する配列エレメントの２１位から２４位までのヌクレオチドおよび１位から２０位までのヌクレオチドを含む、実施形態２３６から２４３までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２４８．ガイド配列の最も５’側のヌクレオチドの３’側に切断可能なリンカーを含むＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド。
２４９．切断可能なリンカーが、ポリヌクレオチドの３’末端には存在しない、実施形態２４５に記載のポリヌクレオチド。
２５０．切断可能なリンカーが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域内に位置付けられた、実施形態１５８から２４６までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２５１．切断可能なリンカーが、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態１５８から２４７までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２５２．ポリヌクレオチドが、第１の切断可能なリンカーおよび第２の切断可能なリンカーを含み、第１の切断可能なリンカーが、ヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けられており、第２の切断可能なリンカーが、ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けられており、ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、ガイド配列の５’末端からポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、実施形態１５８から２４８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２５３．ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、切断可能なリンカーが、ネクサスのループ内またはステムループ１のループ内に存在する、実施形態１５８から２４９までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２５４．ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、切断可能なリンカーが、ネクサスのループ内およびステムループ１のループ内に存在する、実施形態１５８から２４９までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２５５．実施形態２０２から２４４までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドおよび実施形態２４５から２５１までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド。
２５６．切断可能なリンカーが、感光性である、実施形態１５８から２５２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２５７．切断可能なリンカーが、紫外線（ＵＶ）によって切断される、実施形態２５３に記載のポリヌクレオチド。
２５８．切断可能なリンカーが、１００ｎｍ～４００ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２５４に記載のポリヌクレオチド。
２５９．切断可能なリンカーが、可視光線によって切断される、実施形態２５３に記載のポリヌクレオチド。
２６０．切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～７００ｎｍの波長の光によって切断される、実施形態２５３に記載のポリヌクレオチド。
２６１．切断可能なリンカーが、緑色光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２６２．切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２６３．切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２６４．切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２６５．切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２６６．切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２６７．切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２６８．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、緑色光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２６９．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２７０．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２７１．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２７２．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２７３．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２７４．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２７５．ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２７６．ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド内の切断可能なリンカーが、ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド内の切断可能なリンカーよりも長い波長の光によって切断される、実施形態２５６に記載のポリヌクレオチド。
２７７．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２６８に記載のポリヌクレオチド。
２７８．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２６８に記載のポリヌクレオチド。
２７９．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、実施形態２６８に記載のポリヌクレオチド。
２８０．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、緑色光によって切断され、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、実施形態２６８に記載のポリヌクレオチド。
２８１．ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、緑色光によって切断され、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、実施形態２６８に記載のポリヌクレオチド。
２８２．切断可能なリンカーが、ホスホロアミダイト誘導体である、実施形態１５８から２７８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２８３．切断可能なリンカーが、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト誘導体である、実施形態１５８から２７８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２８４．切断可能なリンカーが、１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）－３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト誘導体である、実施形態１５８から２７８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２８５．切断可能なリンカーが、リン酸ジエステルを含む、実施形態１５８から２７８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２８６．切断可能なリンカーが、ホスホモノエステルを含む、実施形態１５８から２７８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２８７．切断可能なリンカーが、クマリン誘導体である、実施形態１５８から２７８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２８８．切断可能なリンカーが、次式：

（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む、実施形態１５８から２７８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２８９．Ｘが、酸素である、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９０．Ｘが、硫黄である、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９１．Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、実施形態２８５に記載のポリヌクレオチド。
２９２．切断可能なリンカーが、式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
ただし、ＸがＯであり、Ｒ^３がジアルキルアミノである場合には、ｍは２から１０までの整数であり；
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む、実施形態１５８から２７８までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
２９３．Ｘが、酸素である、実施形態２８９に記載のポリヌクレオチド。
２９４．Ｘが、硫黄である、実施形態２８９に記載のポリヌクレオチド。
２９５．Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、実施形態２８９に記載のポリヌクレオチド。
２９６．式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、酸素である）
によって表される、実施形態２８９に記載のポリヌクレオチド。
２９７．式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、硫黄である）
によって表される、実施形態２８９に記載のポリヌクレオチド。
２９８．式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、＝Ｃ（ＣＮ）２である）
によって表される、実施形態２８９に記載のポリヌクレオチド。
２９９．Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、Ｃ_１～６アルキルである、
実施形態２９３から２９６までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３００．Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれＨであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、それぞれエチルである、
実施形態２９３から２９６までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３０１．ポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、第１の架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され、第１の架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲット核酸分子に対する編集活性が、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋していないポリヌクレオチドを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い、実施形態１３２から２９７までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３０２．編集活性が、編集されるオフターゲット核酸分子のパーセンテージとして測定される、実施形態２９８に記載のポリヌクレオチド。
３０３．編集活性が、編集される標的核酸分子のパーセンテージとして測定される、実施形態２９８に記載のポリヌクレオチド。
３０４．第１のＣＲＩＳＰＲ複合体によるオフターゲット核酸分子に対する編集活性が、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の編集活性よりも低く、ｐ値≦０．０００１である、実施形態２９８から３００までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３０５．第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性と第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的核酸分子に対する編集活性が５％以内である、実施形態２９８から３０１までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
３０６．実施形態１３２から３０２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体。
３０７．ヌクレアーゼ活性を含む、実施形態３０３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
３０８．式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
ただし、ＸがＯであり、Ｒ^３がジアルキルアミノである場合には、ｍは２から１０までの整数であり；
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
の構造を含む切断可能なリンカーを含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３０９．Ｘが、酸素である、実施形態３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３１０．Ｘが、硫黄である、実施形態３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３１１．Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、実施形態３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３１２．式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、酸素である）
によって表される、実施形態３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３１３．式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、硫黄である）
によって表される、実施形態３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３１４．（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、＝Ｃ（ＣＮ）２である）
によって表される、実施形態３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３１５．Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、Ｃ_１～６アルキルである、
実施形態３０９から３１１までのいずれか１つに記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３１６．Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれＨであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、それぞれエチルである、
実施形態３０９から３１１までのいずれか１つに記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３１７．次式：

（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む切断可能なリンカーを含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３１８．Ｘが、酸素である、実施形態３１４に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３１９．Ｘが、硫黄である、実施形態３１４に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３２０．Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、実施形態３１４に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３２１．ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、架橋剤をさらに含む、実施形態３０５から３１７までのいずれか１つに記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３２２．架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰまたは８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、実施形態３１８に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３２３．架橋剤が、ジスルフィド、アミド、イミン、ヒドラジド、Ｏ－アルキルオキシム、アルキル、アミン、アルコール、トリアゾール、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾールまたはピリダジンを含む、実施形態３１８に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３２４．架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰまたは８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、実施形態３１８に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３２５．架橋剤を含むヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、架橋剤が、ジスルフィド、アミド、イミン、ヒドラジド、Ｏ－アルキルオキシム、アルキル、アミン、アルコール、トリアゾール、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾールまたはピリダジンを含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３２６．架橋剤を含むヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰまたは８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
３２７．実施形態１から１２２まで、３０３もしくは３０４のいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、実施形態１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡまたは実施形態１３２から３０２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を含む細胞。
３２８．幹細胞である、実施形態３２０に記載の細胞。
３２９．免疫細胞である、実施形態３２０に記載の細胞。
３３０．幹細胞が、人工多能性幹細胞である、実施形態３２５に記載の細胞。
３３１．免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態３２６に記載の細胞。
３３２．免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である、実施形態３２６に記載の細胞。
３３３．次式：

（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む化合物。
３３４．Ｘが、酸素である、実施形態３３０に記載の化合物。
３３５．Ｘが、硫黄である、実施形態３３０に記載の化合物。
３３６．Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、実施形態３３０に記載の化合物。
３３７．式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
ただし、ＸがＯであり、Ｒ^３がジアルキルアミノである場合には、ｍは２から１０までの整数であり；
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む化合物。
３３８．Ｘが、酸素である、実施形態３３４に記載の化合物。
３３９．Ｘが、硫黄である、実施形態３３４に記載の化合物。
３４０．Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、実施形態３３４に記載の化合物
３４１．式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、酸素である）
によって表される、実施形態３３４に記載の化合物。
３４２．式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、硫黄である）
によって表される、実施形態３３４に記載の化合物。
３４３．式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、＝Ｃ（ＣＮ）２である）
によって表される、実施形態３３４に記載の化合物。
３４４．実施形態１から１２９まで、３０３もしくは３０４までのいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、実施形態１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡ、実施形態１３２から３０２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、実施形態３２４から３２９までのいずれか１つに記載の細胞、または実施形態３３０から３４０までのいずれか１つに記載の化合物のうちの１つまたは複数を含む医薬製剤。
３４５．薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態３４１に記載の医薬製剤。
３４６．実施形態３４１または３４２に記載の医薬製剤を対象に投与するステップを含む方法。
３４７．対象が、哺乳動物である、実施形態３４３に記載の方法。
３４８．哺乳動物が、ヒトである、実施形態３４４に記載の方法。
３４９．実施形態１から１２９まで、３０３または３０４のいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、実施形態１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡまたは実施形態１３２から３０２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を細胞に導入するステップを含む方法。
３５０．細胞が、幹細胞である、実施形態３４６に記載の方法。
３５１．細胞が、免疫細胞である、実施形態３４６に記載の方法。
３５２．幹細胞が、人工多能性幹細胞である、実施形態３４７に記載の方法。
３５３．免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態３４８に記載の方法。
３５４．免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である、実施形態３４８に記載の方法。
３５５．核酸分子を編集する方法であって、実施形態１から１２９まで、３０３または３０４のいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体を核酸分子と接触させるステップを含む方法。
３５６．ＣＲＩＳＰＲ複合体が、切断事象の２％未満のオフターゲット切断活性を含む、実施形態３５２に記載の方法。
３５７．核酸分子を編集する方法であって、核酸分子をＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質および実施形態１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡまたは実施形態１３２から３０２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数と接触させるステップを含む方法。
３５８．１つまたは複数の細胞内の標的遺伝子を編集する方法であって、実施形態１から１２９まで、３０３または３０４のいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体を、標的遺伝子を含む１つまたは複数の細胞に投与し、それにより、編集された標的遺伝子を含む１つまたは複数の細胞を生成するステップを含む方法。
３５９．１つまたは複数の細胞内の標的遺伝子を編集する方法であって、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび実施形態１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡまたは実施形態１３２から３０２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を、標的遺伝子を含む１つまたは複数の細胞に投与し、それにより、編集された標的遺伝子を含む１つまたは複数の細胞を生成するステップを含み、編集された標的遺伝子を含む細胞の９９％が、投与後に生存可能なままである、方法。
３６０．編集された標的遺伝子を含む細胞の９９％が、投与後に生存可能なままである、実施形態３５５または３５６に記載の方法。
３６１．レサズリンアッセイによって細胞生存率を測定するステップをさらに含む、実施形態３５７に記載の方法。
３６２．ＣＲＩＳＰＲ複合体を作製する方法であって、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を架橋するステップを含み、架橋が、ｇＲＮＡの標的結合性領域の外側のヌクレオチドにおいて生じ、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ活性が架橋後も維持される、方法。
３６３．架橋が溶液中で生じ、溶液中のｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の比が少なくとも９：１である、実施形態３５９に記載の方法。
３６４．架橋するステップが、溶液を紫外線（ＵＶ）に曝露することを含む、実施形態３６０に記載の方法。
３６５．架橋するステップが、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を混合すると生じる、実施形態３５９から３６１までのいずれか１つに記載の方法。
３６６．実施形態２０２から３０２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを切断する方法であって、ポリヌクレオチドを切断因子に曝露させ、それにより、切断可能なリンカーを切断するステップを含む方法。
３６７．ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質および実施形態２０２から３０２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを導入するステップと、
ポリヌクレオチドを切断因子に曝露させ、それにより、切断可能なリンカーを切断するステップと
を含む方法。
３６８．ポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成している、実施形態３６３または３６４に記載の方法。
３６９．切断因子が、紫外線（ＵＶ）である、実施形態３６３から３６５までのいずれか１つに記載の方法。
３７０．切断因子が、１００ｎｍ～４００ｎｍの範囲内の波長の光である、実施形態３６６に記載の方法。
３７１．切断因子が、可視光線である、実施形態３６３から３６５までのいずれか１つに記載の方法。
３７２．切断因子が、４００ｎｍ～７００ｎｍの波長の光である、実施形態３６３から３６５までのいずれか１つに記載の方法。
３７３．切断因子が、緑色光である、実施形態３６３から３６５までのいずれか１つに記載の方法。
３７４．切断因子が、紫色光である、実施形態３６３から３６５までのいずれか１つに記載の方法。
３７５．切断因子が、青色光である、実施形態３６３から３６５までのいずれか１つに記載の方法。
３７６．切断因子が、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光である、実施形態３６３から３６５までのいずれか１つに記載の方法。
３７７．切断因子が、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光である、実施形態３６３から３６５までのいずれか１つに記載の方法。
３７８．切断因子が、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光である、実施形態３６３から３６５までのいずれか１つに記載の方法。
３７９．切断因子が、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光である、実施形態３６３から３６５までのいずれか１つに記載の方法。
３８０．曝露により、ポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の標的特異的切断活性が増大する、実施形態３６３から３７１までのいずれか１つに記載の方法。
３８１．ポリヌクレオチドが、細胞内に存在しない、実施形態３６３から３７３までのいずれか１つに記載の方法。
３８２．ポリヌクレオチドが、細胞内に存在する、実施形態３６３から３７３までのいずれか１つに記載の方法。
３８３．細胞が、幹細胞である、実施形態３７９に記載の方法。
３８４．細胞が、免疫細胞である、実施形態３７９に記載の方法。
３８５．幹細胞が、人工多能性幹細胞である、実施形態３８０に記載の方法。
３８６．免疫細胞が、Ｔ細胞である、実施形態３８１に記載の方法。
３８７．免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である、実施形態３８１に記載の方法。
３８８．実施形態１から１２９まで、３０３もしくは３０４のいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、実施形態１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡ、実施形態１３２から３０２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、実施形態３２４から３２９までのいずれか１つに記載の細胞、実施形態３３０から３４０までのいずれか１つに記載の化合物、または実施形態３４１もしくは３４２に記載の医薬製剤のうちの１つまたは複数を含む系。
３８９．実施形態１から１２９、３０３もしくは３０４のいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、実施形態１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡ、実施形態１３２から３０２までのいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、実施形態３２４から３２９までのいずれか１つに記載の細胞、実施形態３３０から３４０までのいずれか１つに記載の化合物、実施形態３４１もしくは３４２に記載の医薬製剤、または実施形態３８５に記載の系のうちの１つまたは複数を含むキット。
３９０．実施形態３４３から３８４までのいずれか１つに記載の方法を実行するための説明書をさらに含む、実施形態３８６に記載のキット。

（実施例１）
テトラループ内に位置付けられた架橋剤を有する修飾されたポリヌクレオチド。
最初の試験では、２２位および４９位にある特定のヌクレオチドがスイッチされた修飾されたポリヌクレオチドを創出する。図１において見ることができる通り、ヌクレオチドはテトラループの基部に位置する。さらに、この位置にあるヌクレオチドをデオキシリボ核酸に変換する。この変換のポリヌクレオチドまたはリボ核タンパク質活性に対する影響は最小のものである。図２。あるいは、５０位のウラシル分子をデオキシチミジンに変換することができる。

次に、ポリヌクレオチドを、４９位または５０位のいずれかのデオキシヌクレオチドを、反応性リンカー化合物を含有する類似体で置換することによってさらに修飾する。この反応性リンカーに対して、公知の化学を通じてマレイミドを共有結合により付着させる。さらに、このマレイミド化合物は、様々な長さのスペーサーを含有し得る。次いで、修飾されたポリヌクレオチドをＣａｓ９と混合してリボ核タンパク質を形成する。リボ核タンパク質は生理的条件下で架橋反応を受ける。

次に、個々の遊離の構成成分および非特異的な架橋した種から架橋したリボ核タンパク質（ロックされたＲＮＰ）を精製する。混合溶液を最初にサイズ除去クロマトグラフィーを使用して精製して、遊離のポリヌクレオチドを分離する。次に、採取された画分を、ｓｇＲＮＡを固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムを通過させて、形成されたＲＮＰから遊離のポリペプチドを分離する。最後に、精製されたＲＮＰを、高塩濃度条件（例えば、３００ｍＭのＮａＣｌ）で陽イオン交換カラムを通過させて、ロックされたＲＮＰを単離する（図１６において見ることができる通り）。高塩濃度条件により、ＲＮＰの、構成成分種であるＣａｓ９とｓｇＲＮＡへの解離が引き起こされる。ロックされたＲＮＰの共有結合により結合した性質に起因して、これらの種は一緒になったままであり、したがって、精製することができる。

精製されたロックされたＲＮＰを不死化細胞系にトランスフェクトして、ヒト細胞内で二本鎖切断を形成するそれらの能力をアッセイする。ゲノムの標的特異的領域に対するポリヌクレオチドを合成し、ロックされたＲＮＰとして形成する。トランスフェクション後、トランスフェクトされたプールにサンガー配列決定を実施し、得られたゲノムデータをＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔ；ＩＣＥ）するソフトウェアによって解析して、インデル突然変異の存在を検出する。

ロックされたＲＮＰ複合体の特異性を試験するために、特定のポリヌクレオチド配列を含有するロックされたＲＮＰを形成し、精製する。この精製のために、別々のゲノム領域を標的とするポリヌクレオチドを１０倍過剰で添加し、混合させる。次いで、この混合物を細胞にトランスフェクトする。両方の遺伝子座における編集を解析し、ＣＲＩＳＰＲにより、ロックされたＲＮＰが標的とする遺伝子座においてのみ生じる編集が誘導されることが示される。
（実施例２）
架橋が可能になるように修飾されたｓｇＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ＤＮＡカット効率の特徴付け

Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＡｌｄｅｖｒｏｎからのＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳ；ＰＤＢ：４ｏｏ８）を、ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体に使用されるように設計された異なる修飾を含む３種の別個のｓｇＲＮＡと共にＨＥＫ２９３細胞に導入した。各修飾について、ｓｇＲＮＡを、５つのＤＮＡ標的のうちの１つを標的とするように作製した。１５種の異なるｓｇＲＮＡをＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて試験し、それぞれをＨＥＫ２９３細胞のそれぞれの培養物に導入した。図１５は、ＥＭＸ１、ＦＡＮＣＦ、ＧＲＫ１、ＰＲＧＮ、およびＶＥＧＦＡを標的とする１５種の異なるｓｇＲＮＡを用いたゲノム編集効率の概略図を示す。ｓｇＲＮＡの第１の修飾（「ｕ５０ｔ」）は、５０位のウラシルヌクレオチドがチミジンＤＮＡヌクレオチドに置き換えられたものである。ｓｇＲＮＡの第２の修飾（「ｕ４９ａ」）は、ヌクレオチド位Ｕ２２よとＡ４９がひっくり返ったものであり、ステムループ構造が保存される一方でさらなる機能的修飾が可能になる。ｓｇＲＮＡの第３の修飾（「ｕ４９ｔ」）は、ｕ４９ａにさらに基づくが、新しいＵ４９がデオキシチミジンに置き換えられたものである。各修飾を５つの標的結合性領域と組み合わせて、５つの標的を標的とした。５つのＤＮＡ標的領域は：ＥＭＸ１（ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）；ＦＡＮＣＦ（ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧ）；ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＴＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧ）；ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧ）；およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧ）であった。

ゲノムＤＮＡを全ての試料から収集し、挿入および欠失の存在について、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｉｎｇ））を使用して解析した。Ｈｓｉａｕｅｔａｌ．， ”ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓｆｒｏｍＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅＤａｔａ”，２０１９ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥにより、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをインデル形成頻度にマッピングすることによって遺伝子編集の量を測定した。図１５のグラフは編集効率を表す。試料を、ＰＣＲを使用して増幅し、配列決定にかけた。配列決定後、増幅後に野生型であるまたは編集された配列の数をＩＣＥによって解析した。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。大多数の修飾されたガイドｓｇＲＮＡにより、５つの標的にわたって遺伝子編集を誘導することができ、例外として、ｕ５０ｔガイドをＰＧＲＮ遺伝子座に対して使用した場合に編集の欠如が見られた。
（実施例３）
光切断可能なリンカーを有する修飾されたポリヌクレオチドの生成および機能的特徴付け。

４種のｓｇＲＮＡを合成した。ｓｇＲＮＡの一部を表す配列を以下に提示する。ｓｇＲＮＡに対する修飾は、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
「対照」：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
「第２なし」：
ＧＡＡＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
「３ｂｐステム」：
ＵＧＡＧＡＡＡＵＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
「６ｂｐステム」：
ＣＡＣＵＧＡＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ

第１のｓｇＲＮＡ（「対照」または「Ｍｏｄｓ」）は、ガイド配列の５’側のポリヌクレオチドリーダー配列を欠くｓｇＲＮＡである。第２のｓｇＲＮＡ（「第２なし」または「二次構造なし」）は、ステムループを形成しないように設計されたガイド配列の５’側のポリヌクレオチドリーダー配列を有し、その後、光切断可能なリンカー、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｄａｔａ／ＰｒｏｄｕｃｔＩｎｆｏ．ｐｈｐ？ｉｔｅｍ＝１０－４９２０）がポリヌクレオチドリーダー配列の３’末端とガイド配列の５’側の間に挿入されたものであった。ガイド配列の５’側の塩基の前でステムループを形成するように設計されたポリヌクレオチドリーダー配列が追加され、その後、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｄａｔａ／ＰｒｏｄｕｃｔＩｎｆｏ．ｐｈｐ？ｉｔｅｍ＝１０－４９２０）光切断可能なリンカーが追加されたポリヌクレオチドリーダー配列の３’末端とガイド配列の５’側の塩基の間に挿入された、２種の追加的なｓｇＲＮＡを合成した。第３のｓｇＲＮＡ（「３ｂｐステム」）は、３ｂｐのステムループを形成するように設計されたポリヌクレオチドリーダー配列を有するものであり、第４のｓｇＲＮＡ（「６ｂｐステム」）は、６ｂｐのステムループを形成するように設計されたポリヌクレオチドリーダー配列を有するものであった。次いで、これらの４つの型のｓｇＲＮＡを、ｓｇＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏで光切断するために十分であることが分かっている条件を使用してＵＶＡ光（３２０～３９０ｎｍ）に曝露させた。

図１９は、ＡｄｖａｎｃｅｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌからの低分子ＲＮＡ解析キットを使用して断片解析機器で流したゲル画像であり、ＵＶ光に０分間、５分間、１０分間、または１５分間曝露させた後の４種のｓｇＲＮＡが示されている。設定時点からの全ての画像は、同じゲルにおいて隣接するレーンに流したものである、すなわち、１０分間の試料は全て互いの隣で流したものである。異なる時点からの試料は、多数のｓｇＲＮＡ標的部位の試験を可能にするために異なるゲルで流したものである。条件間の比較は、主に定性的観察に基づくものであった。ＵＶ光に５分間曝露させた後、第２のｓｇＲＮＡ、第３のｓｇＲＮＡ、および第４のｓｇＲＮＡではポリヌクレオチドリーダー配列の切断と一致する横縞模様が示された。１０分曝露後および１５分曝露後の横縞模様も、第２のｓｇＲＮＡ、第３のｓｇＲＮＡ、および第４のｓｇＲＮＡからのポリヌクレオチドリーダー配列の切断と一致するものであった。
（実施例４）
ｓｇＲＮＡ活性化の際の標的ＤＮＡカット効率の特徴付け

上記の通り、４種のｓｇＲＮＡを、ｓｐＣａｓ９と複合体を形成させ、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて標的ＤＮＡと一緒に妥当な持続時間にわたってインキュベートした。次いで、図２０に示されているように、４種のｓｇＲＮＡをそれぞれＵＶ光（３２０～３９０ｎｍ）に１７５ｍＷ／ｃｍ^２、示されている周期的間隔で曝露させた。設計されたステム（「３ｂｐステム」および「６ｂｐステム」）を有するｓｇＲＮＡのＵＶ媒介性切断は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を活性化する働きをし、その結果、標的特異的ＤＮＡのカットがもたらされた。次いで、標的ＤＮＡを断片解析機器に流して、ＣＲＩＳＰＲ媒介性カットを実証した。図２０は、標的ＤＮＡ（ＦＡＮＣＦ）と一緒にインキュベートし、切断因子に規則的な間隔で曝露させたｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９ＣＲＩＳＰＲ複合体の例を示す。曝露後０分の時点で、第３のｓｇＲＮＡおよび第４のｓｇＲＮＡ（「３ｂｐステム」および「６ｂｐステム」）では、第１のｓｇＲＮＡおよび第２のｓｇＲＮＡと比較してカット効率の低下が示された。切断因子に１５分間曝露させた後、活性化されたｓｇＲＮＡでは標的ＤＮＡのカット効率の上昇が記録された。カットされなかったＤＮＡとカットされたＤＮＡの比の測定により、「６ｂｐステム」について１５分間の曝露での約４５％から３０分間の曝露での約２０％までの低下が示された。比較して、５’ポリヌクレオチドリーダー配列を欠く第１のｓｇＲＮＡ（「Ｍｏｄｓ」）または５’二次構造を欠くｓｇＲＮＡ（「二次構造なし」）では、カットされなかったＤＮＡとカットされたＤＮＡの比によって測定して、切断因子による活性化は示されなかった。「Ｍｏｄｓ」は、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有し、ガイド配列の５’へのいかなる塩基付加も有さない修飾された合成ｓｇＲＮＡであり、「二次構造なし」条件では、ガイド配列に対するステムを形成しない５’付加を伴うｓｇＲＮＡを使用する。「３ｂｐステム」および「６ｂｐステム」条件では、ｓｇＲＮＡの５’末端にそれぞれ長さ３ｂｐおよび６ｂｐのステムを形成するように設計された領域を有するｓｇＲＮＡを使用する。
（実施例５）
非活性化可能なｓｇＲＮＡの生成および特徴付け

６種のｓｇＲＮＡを合成した。ｓｇＲＮＡの一部を表す配列を以下に提示する。ｓｇＲＮＡに対する修飾は、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
対照：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
２１
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ＊ＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
２４
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵ＊ＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
５０
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡ＊ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
５７
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵ＊ＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
７４
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ＊ＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ

第１のｓｇＲＮＡ（「対照」）は光切断可能なエレメントを含まないものであった。第２のｓｇＲＮＡ、第３のｓｇＲＮＡ、第４のｓｇＲＮＡおよび第５のｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの５’末端から２１位、２４位、５０位、５７位および７４位に光切断可能な結合を有するものであった。次いで、５種のｓｇＲＮＡをＵＶ光に５分間曝露させた。図２１は、ＡｄｖａｎｃｅｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌからの断片解析機器を使用して流した、ＵＶ光に曝露させた後の５種のｓｇＲＮＡのゲルの画像である。全ての試料を、低分子ＲＮＡキットを用い、製造者のプロトコールに従って流した。ＵＶ光に５分間曝露させた後、５種のｓｇＲＮＡ全てで、それぞれの光切断可能な結合の位置における切断と一致する横縞模様が示された。
（実施例６）
ゲノム編集された細胞系の迅速な生成

Ｃａｓ９を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、光切断可能なリンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、切断因子に晒した。図２２は、ＤＮＭＴ１を標的とする６種の異なるｓｇＲＮＡを用いたプログラム可能なゲノム編集効率の概略図を示す。第１のｓｇＲＮＡ（「Ｍｏｄ」）は、光切断可能な部位を欠くものであった。第２のｓｇＲＮＡ、第３のｓｇＲＮＡ、第４のｓｇＲＮＡおよび第５のｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの５’末端から２１位、２４位、５０位、５７位および７４位に光切断可能な結合を有するものであった（それぞれｂ２１、ｂ２４、ｂ５０、ｂ５７、およびｂ７４）。ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９混合物［９：１の比］を細胞に導入した。細胞を４８時間にわたって２時間ごとに切断因子に曝露させた。各試料を指定された時点まで暗闇で維持し、次いで、ＵＶ光に１回曝露させて切断を誘導した。次いで、細胞を、トランスフェクションの４８時間後まで暗闇に置いた。トランスフェクションの４８時間後に全ての試料を収集した。トランスフェクションの４８時間後、ゲノムＤＮＡを全ての試料から収集し、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｉｎｇ））を使用して挿入および欠失の存在について解析した。Ｈｓｉａｕｅｔａｌ．， ”ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓｆｒｏｍＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅＤａｔａ”，２０１９ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥにより、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをインデル形成頻度にマッピングすることによって遺伝子編集の量を測定した。図２２のグラフは編集効率を表す。試料を、ＰＣＲを使用して増幅し、配列決定にかけた。配列決定後、増幅後に野生型であるまたは編集された配列の数をＩＣＥによって解析した。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。５７位に光切断可能な結合を有するｓｇＲＮＡおよび７４位に光切断可能な結合を有するｓｇＲＮＡではゲノム編集効率の時間依存的な非活性化が示された。
（実施例７）
編集されたＨＥＫ２９３細胞系の生成

ＨＥＫ２９３細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能な（ＰＣ）リンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、ＵＶ光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられたホスホロアミダイト（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）を含み、ＢＵＢ１Ｂ（ＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡ）、ＣＡＭＫ１（ｓｇ１：ＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡ）、ＰＲＫＡＧ３（ｓｇ１－ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡ；ｓｇ２－ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＵＣＡ）、ＳＴＫ３（ｓｇ１－ＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＴＣＡＡＣ；ｓｇ２－ＡＡＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＴＣ；ｓｇ３－ＣＣＡＴＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＴＧＡＣ；ｓｇ４－ＵＵＵＡＡＵＵＧＣＧＡＣＡＡＣＵＵＧＡＣ）、ＩＲＡＫ４（ＧＴＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＡＡ）、およびＣｈｒ８ｑ２３（ｓｇ１－ＡＧＴＣＴＡＣＴＡＴＧＡＧＴＴＴＴＣＴＧ；ｓｇ２－ＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＧＡＴ；ｓｇ３－ＡＡＧＣＣＴＣＡＡＡＴＴＡＧＧＡＧＡＡＡ）を標的とする標的結合性領域を有する、１２種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、１２種の実験集団を作製した。Ｃａｓ９をまた、光切断可能なリンカーを有さない、上記の標的結合性領域を有する１２種の異なるｓｇＲＮＡ（標準）とも複合体を形成させた。２４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、室温で１５分間にわたって混合させた。ＨＥＫ２９３細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して室温で５分間にわたって収集して細胞を個別化した。集団を計数して妥当な細胞数を決定し、その後、１００×ｇで３分間遠心分離した。次いで、得られたペレットをヌクレオフェクション緩衝剤に５μＬ当たり細胞２００，０００個の濃度で再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液を予め複合体を形成させたＣａｓ９ｓｇＲＮＡ溶液に添加し、トランスフェクトを行った。各実験集団を２つのウェルに分割して対照と処理細胞の対の反復実験を形成した。トランスフェクションの４時間後、処理細胞をＵＶ光に１分間、および１５秒間曝露させた（帯域フィルターを用いて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した）。その後、細胞をインキュベーターに戻した。トランスフェクションの４８時間後、対照および処理試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡをＡｍｐｌｉｔａｑならびにオンターゲット遺伝子座およびオフターゲット遺伝子座に特異的なプライマーを使用したＰＣＲに供した。配列決定データを編集の存在についてＩＣＥを使用して解析した。Ｈｓｉａｕｅｔａｌ．， ”ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓｆｒｏｍＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅＤａｔａ”，Ｊａｎｕａｒｙ１４，２０１９ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。

図２３は、１２種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９の編集効率のグラフを示す。灰色の棒は、ＵＶ光への曝露なしの場合の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。黒棒は、ＵＶ光への曝露後の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。

図２４は、光切断可能なリンカーを有さない、図２３のｓｇＲＮＡと同じ標的結合性領域を有する１２種の異なる標準ｓｇＲＮＡを伴うＣａｓ９の編集効率を示す。灰色の棒は、ＵＶ光への曝露なしの場合の、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。黒棒は、ＵＶ光への曝露後の、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。
（実施例８）
編集されたＵ２ＯＳ細胞系の生成

Ｕ２ＯＳ細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能なリンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、ＵＶ光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられたホスホロアミダイト（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）を含む、ＤＮＭＴ１（ＧＧＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣ）、ＥＭＸ１（ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）、ＦＡＮＣＦ（ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧ）、ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＴＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧ）、ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧ）、およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧ）を標的とする標的結合性領域を有する６種の異なるｓｇＲＮＡと複合体を形成させて（ＣＲＩＳＰＲオフ）、６種の実験集団を作製した。Ｃａｓ９をまた、光切断可能なリンカーを有さない、上記の標的結合性領域を有する６種の異なるｓｇＲＮＡ（標準）とも複合体を形成させた。１２種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、室温で１５分間にわたって混合させた。Ｕ２０Ｓ細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して室温で５分間にわたって収集して細胞を個別化した。集団を計数して妥当な細胞数を決定し、その後、１００×ｇで３分間遠心分離した。次いで、得られたペレットをヌクレオフェクション緩衝剤に５μＬ当たり細胞２００，０００個の濃度で再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液を予め複合体形成させたＣａｓ９ｓｇＲＮＡ溶液に添加し、トランスフェクトを行った。各実験集団を２つのウェルに分割して対照と処理細胞の対の反復実験を形成した。トランスフェクションの４時間後、処理細胞をＵＶ光に１分間、および１５秒間曝露させた（帯域フィルターを用いて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した）。その後、細胞をインキュベーターに戻した。トランスフェクションの４８時間後、対照および処理試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡをＡｍｐｌｉｔａｑならびにオンターゲット遺伝子座およびオフターゲット遺伝子座に特異的なプライマーを使用したＰＣＲに供した。配列決定データを編集の存在についてＩＣＥを使用して解析した。Ｈｓｉａｕｅｔａｌ． ”ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓｆｒｏｍＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅＤａｔａ”，Ｊａｎｕａｒｙ１４，２０１９ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。

図２５は、６種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９の編集効率のグラフを示す。灰色の棒は、ＵＶ光への曝露なしの場合の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。黒棒は、ＵＶ光への曝露後の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。

図２６は、光切断可能なリンカーを有さない、図２５のｓｇＲＮＡと同じ標的結合性領域を有する６種の異なる標準ｓｇＲＮＡを伴うＣａｓ９の編集効率を示す。灰色の棒は、ＵＶ光への曝露なしの場合の、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。黒棒は、ＵＶ光への曝露後の、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。
（実施例９）
ＵＶ光への曝露なしの場合の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲオフＣａｓ９複合体によるオフターゲット編集の解析

図２９は、上記のＤＮＭＴ１、ＦＡＮＣＦ、およびＶＥＧＦＡを標的とするｓｇＲＮＡに関して高度のオフターゲット編集を有することが分かっているオフターゲット部位における編集のパーセンテージを示すグラフを含む。

使用した配列は、以下の通りであり、＊は、リンカー（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）の場所を示す：
ＤＮＭＴ１
オンターゲットｓｇＲＮＡ：
ＧＧＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ
オンターゲットＣＲＩＳＰＲオフ：
ＧＧＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴ＊ＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧ＊ＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ
オフターゲット１：ＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＣＣＣ
ＦＡＮＣＦ
オンターゲットｓｇＲＮＡ：
ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ
オンターゲットＣＲＩＳＰＲオフ：
ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴ＊ＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧ＊ＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ
オフターゲット２：ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧ
ＶＥＧＦＡ
オンターゲットｓｇＲＮＡ：
ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ
オンターゲットＣＲＩＳＰＲオフ：
ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴ＊ＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧ＊ＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ
オフターゲット３：ＧＣＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＴＧ

Ｈｓｉａｕｅｔａｌ． ”ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓｆｒｏｍＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅＤａｔａ”，Ｊａｎｕａｒｙ１４，２０１９ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９の比３０ｐｍｏｌ：１０ｐｍｏｌを使用してＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成した。次いで、ＲＮＰをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ｎ＝２４の生物学的反復実験で細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを細胞から収集した。細胞をＵＶ光に曝露させなかった。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。Ｘ軸は、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを含むｓｇＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲオフ」）と複合体を形成したＣａｓ９によって、または３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを有さないｓｇＲＮＡ（「標準ｓｇＲＮＡ」）と複合体を形成したＣａｓ９によってオフターゲット編集が生じたかどうかを示す。Ｙ軸は、編集されたオフターゲット部位のパーセントを示す。図２９において見ることができる通り、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを有さない、ＤＮＭＴ１を標的とするｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素に関して観察されるオフターゲット編集は、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素よりも多く、ｐ値≦０．０００１である；３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを有さない、ＦＡＮＣＦを標的とするｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素に関して観察されるオフターゲット編集は、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素よりも大きく、ｐ値≦０．０００１である；３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを有さない、ＶＥＧＦＡを標的とするｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素に関して観察されるオフターゲット編集は、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素よりも多く、ｐ値≦０．０００１である。上述のＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのそれぞれの標的部位における編集効率は、上記の通りＩＣＥによって測定して、上述の標準ｓｇＲＮＡのそれぞれの標的部位における編集効率と同じかまたは１～３％低かった。結果から、ネクサスおよびステムループ１内に３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを有するｓｇＲＮＡの編集アッセイにおいて使用することにより、ネクサスおよびステムループ１内に３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイトを欠くｓｇＲＮＡの使用と比べて低いオフターゲット編集活性がもたらされることが例示される。
（実施例１０）
Ｕ２ＯＳ細胞におけるＣＲＩＳＰＲオフと複合体を形成したＣａｓ９の時間依存的活性の解析

図２９～３２は、ＤＮＭＴ１、ＧＲＫ１、およびＶＥＧＦＡを標的とする「ＣＲＩＳＰＲオフ」と複合体を形成したＣａｓ９の時間依存的活性を、「標準ｓｇＲＮＡ」と複合体を形成したＣａｓ９の時間依存的活性の欠如と対照して示すグラフである。細胞を、４８時間にわたって２時間ごとにＵＶ光に曝露させた。Ｈｓｉａｕｅｔａｌ． ”ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓｆｒｏｍＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅＤａｔａ”，Ｊａｎｕａｒｙ１４，２０１９ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。
（実施例１１）
編集されたＫ５６２細胞系の生成

Ｋ５６２細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能なリンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、ＵＶ光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられたホスホロアミダイト（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）を含む、ＥＭＸ１（ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）およびＧＲＫ１（ＧＣＣＧＴＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧ）を標的とする標的結合性領域を有する２種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、２種の実験集団を作製した。Ｃａｓ９をまた、光切断可能なリンカーを有さない、上記の標的結合性領域を有する異なる２種のｓｇＲＮＡ（標準）とも複合体を形成させた。４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、室温で１５分間にわたって混合させた。Ｋ５６２細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して室温で５分間にわたって収集して細胞を個別化した。集団を計数して妥当な細胞数を決定し、その後、１００×ｇで３分間遠心分離した。次いで、得られたペレットをヌクレオフェクション緩衝剤に５μＬ当たり細胞２００，０００個の濃度で再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液を予め複合体を形成させたＣａｓ９ｓｇＲＮＡ溶液に添加し、トランスフェクトを行った。各実験集団を２つのウェルに分割して対照と処理細胞の対の反復実験を形成した。トランスフェクションの４時間後、処理細胞をＵＶ光に約１分間および１５秒間晒した（帯域フィルターを用いて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した）。その後、細胞をインキュベーターに戻した。トランスフェクションの４８時間後、対照および処理試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡをＡｍｐｌｉｔａｑならびにオンターゲット遺伝子座およびオフターゲット遺伝子座に特異的なプライマーを使用したＰＣＲに供した。配列決定データを編集の存在についてＩＣＥを使用して解析した。Ｈｓｉａｕｅｔａｌ． ”ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓｆｒｏｍＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅＤａｔａ”，Ｊａｎｕａｒｙ１４，２０１９ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。

図２７は、２種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを伴うＣａｓ９の編集効率のグラフを示す。灰色の棒は、ＵＶ光への曝露なしの場合の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。黒棒は、ＵＶ光への曝露後の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。

図２８は、光切断可能なリンカーを有さない、図２７のｓｇＲＮＡと同じ標的結合性領域を有する２種の異なる標準ｓｇＲＮＡを伴うＣａｓ９の編集効率を示す。灰色の棒は、ＵＶ光への曝露なしの場合の、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。黒棒は、ＵＶ光への曝露後の、標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。
（実施例１２）
転写調節

１０ｂｐのステムループを形成する５’ポリヌクレオチドリーダー配列およびポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を架橋するための非天然ヌクレオチドを含む修飾された活性化可能なｓｇＲＮＡポリヌクレオチド（ＣＲＩＳＰＲオン）を、ＶＰ６４の転写活性化因子ドメインと融合した不活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９）と架橋させた。光切断可能なエレメントを、ポリヌクレオチドリーダー配列の３’側およびガイド配列のすぐ５’側に挿入する。ｄＣａｓ９融合酵素と架橋したｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトする。５’ポリヌクレオチドリーダー配列により、ＣＲＩＳＰＲ複合体がガイド配列と相補的な標的配列のプロモーターと効率的にアニーリングすることができなくなる。標的遺伝子は比較的低い転写活性を有する。所望の時点で、トランスフェクトされた細胞をＵＶ光に曝露させ、その結果、光切断可能な結合およびポリヌクレオチドリーダー配列の遊離の切断をもたらす。その時からＣＲＩＳＰＲ複合体は標的配列のプロモーターにより効率的に結合し、標的配列のより効率的な転写がもたらされる。
（実施例１３）
ＵＶ光への曝露ありの場合およびＵＶ光への曝露なしの場合の、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＲＩＳＰＲオフＣａｓ９複合体によるオンターゲット編集の解析

ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）を先進の改変イーグル培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０％ｖ／ｖのＦＢＳ中、５回～２０回の間の継代で維持した。細胞を２週間に１回、ＴｒｙｐＬＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１：８の比で継代した。

ＨＥＫ２９３細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能な（ＰＣ）リンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、３４５ｎｍの帯域フィルターにかけた光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられた光切断可能なリンカー（１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル）を含む、ＡＡＶＳ１（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ）、ＢＵＢ１Ｂ（ＡＧＵＧＡＡＧＣＣＡＵＧＵＣＣＣＵＧＧＡ）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ１（ＵＧＣＣＡＧＧＡＵＣＡＣＣＵＣＣＧＡＧＡ）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ２（ＧＣＧＵＣＣＵＣＵＵＡＵＣＵＵＣＵＧＣＣ）、ＣＥＬ（ＡＡＣＣＡＧＵＵＧＣＡＧＧＣＧＣＣＣＣＡ）、Ｃｈｒ８ｑ２３＿ｓｇ１（ＵＵＡＵＡＧＵＵＡＣＧＡＵＧＵＵＵＧＡＵ）、ＣＸＣＲ４（ＧＡＵＡＡＣＵＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＡＵ）、ＤＮＭＴ１（ＧＧＡＧＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣ）、ＥＭＸ１（ＧＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）、ＦＡＭ１６３Ａ（ＣＵＧＣＡＧＧＧＣＵＣＧＣＵＧＧＵＧＡＧ）、ＦＡＮＣＦ（ＧＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＵＵＣＣＡＵＧ）、ＧＡＡ（ＡＧＧＡＧＣＣＧＧＵＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧ）、ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＧＣＣＵＣＧＧＧ）、ＩＴＧＡ７（ＧＧＵＧＣＵＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＵＧ）、ＩＲＡＫ４（ＧＵＣＣＵＧＵＣＵＵＵＧＵＣＡＣＡＧＡＡ）、ＭＡＰＲＥ１（ＵＵＣＵＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＵＣＣＵＧ）、ＭＩＰ（ＧＣＵＧＧＧＧＵＣＣＵＣＡＣＵＧＣＧＣＵ）、ＯＭＰ（ＧＡＡＣＵＧＵＡＧＣＣＧＣＵＧＣＵＧＣＵ）、ＯＰＮ１ＳＷ（ＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＡＣＵＧ）、ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＵＧＣＣＵＧＣＵＣＡＧＵＧＵＵＧ）、ＰＲＫＡＧ３（ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＵＣＡ）、ＳＴＫ３＿ｓｇ１（ＡＡＡＧＣＡＡＵＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＵＣ）、ＳＴＫ３＿ｓｇ２（ＣＣＡＵＡＡＵＧＣＡＧＣＡＡＵＧＵＧＡＣ）、およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）を標的とする標的結合性領域を有する２３種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、２３種の実験集団を作製した。次いで、各実験集団を３つの群に分割し、１つは暗闇で維持するものとし、１つは環境光に曝露させるものとし、１つは３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に曝露するものとした。４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、トランスフェクション前に１０分間にわたって混合させた。トランスフェクションの４時間後、処理細胞を、環境光に２０分間曝露させたか、または３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に６０秒間曝露させた。トランスフェクションの４８時間後、試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。

ゲノム解析

ＤＮＡＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用し、製造者のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを単離した。収集後、抽出物溶液を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、その後、９８℃で１０分間インキュベートした。ゲノムＰＣＲを、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ３６０マスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を使用し、表１に見出されるプライマー配列を使用して実施した。サンガー配列決定後、インデルの存在をＩＣＥ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）によって解析した。

図３８は、２３種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９の編集効率のグラフを示す。左から右に、各ｓｇＲＮＡについて：黒棒（丸）は、光への曝露なしの場合の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す；灰色の棒（四角）は、環境光への曝露後の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す；薄い灰色の棒（三角形）は、３４５ｎｍよりも長い波長の光への曝露後の、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の編集効率を示す。矢印で示されている通り、ＦＡＮＣＦおよびＦＡＭ１６３部位では、曝露後に編集の低減は示されない。使用したランプは６００Ｗ、強度は９０～１２０ｍＷ／ｃｍ^２であった。核局在化シグナルを有するＡｌｄｅｖｒｏｎからのＣａｓ９（ＮＬＳ－Ｓｐ．Ｃａｓ９－ＮＬＳ）を全ての実験に使用した。

図３９は、２６種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９の編集効率を同じ標的結合性配列を有する修飾されていないｓｇＲＮＡと比較したグラフを示す。

図４６は、光への曝露後の、Ｃａｓ９と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲオフを発現する細胞において観察される、光への曝露なしの場合のＣａｓ９と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲオフを発現する細胞、および光への曝露ありの場合となしの場合の標準ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９を発現する細胞と比較したパーセント編集の低減を実証するグラフを示す。

図４７は、試験した細胞によって発現されるＣａｓ９－ＣＲＩＳＰＲオフ複合体を光で不活性化する前の期間を漸増させて観察されたパーセント編集の増大を実証するグラフを示す。

図５３は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成したＣＡＭＫ１を標的とする上述のポリヌクレオチドのＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した標準ｓｇＲＮＡと比較したインデルプロファイルである。

図５１は、光への曝露の持続時間に対する編集の消失の影響のグラフを示し、完全な消失が４５秒から６０秒の間に実現される。

図５２は、細胞を広スペクトルの光に曝露させる時間の増大の細胞生存率に対する影響を示すグラフである。
表１：標的配列プライマー

（実施例１４）
ＵＶ光への曝露ありの場合およびＵＶ光への曝露なしの場合の、Ｕ２ＯＳ細胞におけるＣＲＩＳＰＲオフＣａｓ９複合体によるオンターゲット編集の解析

Ｕ２ＯＳ細胞を、１０％ｖ／ｖのＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中、５回～１５回の間の継代で維持した。細胞を、週に１回、ＴｒｙｐＬＥを用いて１：４の比で継代した。全ての細胞を３７℃および５％ＣＯ２で維持した。

Ｕ２ＯＳ細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能な（ＰＣ）リンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、３４５ｎｍの帯域フィルターにかけた光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられた光切断可能なリンカー（１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル）を含む、ＡＡＶＳ１（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ）、ＢＵＢ１Ｂ（ＡＧＵＧＡＡＧＣＣＡＵＧＵＣＣＣＵＧＧＡ）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ１（ＵＧＣＣＡＧＧＡＵＣＡＣＣＵＣＣＧＡＧＡ）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ２（ＧＣＧＵＣＣＵＣＵＵＡＵＣＵＵＣＵＧＣＣ）、Ｃｈｒ８ｑ２３＿ｓｇ１（ＵＵＡＵＡＧＵＵＡＣＧＡＵＧＵＵＵＧＡＵ）、Ｃｈｒ８ｑ２３＿ｓｇ２（ＡＧＵＣＵＡＣＵＡＵＧＡＧＵＵＵＵＣＵＧ）、ＤＮＭＴ１（ＧＧＡＧＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣ）、ＥＭＸ１（ＧＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）、ＦＡＭ１６３Ａ（ＣＵＧＣＡＧＧＧＣＵＣＧＣＵＧＧＵＧＡＧ）、ＦＡＮＣＦ（ＧＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＵＵＣＣＡＵＧ）、ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＧＣＣＵＣＧＧＧ）、ＩＴＧＡ７（ＧＧＵＧＣＵＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＵＧ）、ＩＲＡＫ４（ＧＵＣＣＵＧＵＣＵＵＵＧＵＣＡＣＡＧＡＡ）、ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＵＧＣＣＵＧＣＵＣＡＧＵＧＵＵＧ）、ＰＲＫＡＧ３（ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＵＣＡ）、ＳＴＫ３＿ｓｇ１（ＡＡＡＧＣＡＡＵＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＵＣ）、ＳＴＫ３＿ｓｇ２（ＣＣＡＵＡＡＵＧＣＡＧＣＡＡＵＧＵＧＡＣ）、およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）を標的とする標的結合性領域を有する１８種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、１８種の実験集団を作製した。次いで、各実験集団を３つの群に分割し、１つは暗闇で維持するものとし、１つは環境光に曝露させるものとし、１つは３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に曝露するものとした。４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、トランスフェクション前に１０分間にわたって混合させた。トランスフェクションの４時間後、処理細胞を、環境光に２０分間曝露させたか、または３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に６０秒間曝露させた。トランスフェクションの４８時間後、試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。

ゲノム解析

図４０は、１８種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９の編集効率を同じ標的結合性配列を有する修飾されていないｓｇＲＮＡと比較したグラフを示す。
（実施例１５）
ＵＶ光への曝露ありの場合およびＵＶ光への曝露なしの場合の、Ｈｅｐ３ｂ細胞におけるＣＲＩＳＰＲオフＣａｓ９複合体によるオンターゲット編集の解析

Ｈｅｐ３Ｂ細胞を先進の改変イーグル培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０％ｖ／ｖのＦＢＳ中、５回～２０回の間の継代で維持した。細胞を２週間に１回、ＴｒｙｐＬＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１：８の比で継代した。

Ｈｅｐ３ｂ細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能な（ＰＣ）リンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、３４５ｎｍの帯域フィルターにかけた光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられた光切断可能なリンカー（１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル）を含む、ＡＡＶＳ１（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ）、ＢＵＢ１Ｂ（ＡＧＵＧＡＡＧＣＣＡＵＧＵＣＣＣＵＧＧＡ）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ１（ＵＧＣＣＡＧＧＡＵＣＡＣＣＵＣＣＧＡＧＡ）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ２（ＧＣＧＵＣＣＵＣＵＵＡＵＣＵＵＣＵＧＣＣ）、ＣＥＬ（ＡＡＣＣＡＧＵＵＧＣＡＧＧＣＧＣＣＣＣＡ）、Ｃｈｒ８ｑ２３＿ｓｇ１（ＵＵＡＵＡＧＵＵＡＣＧＡＵＧＵＵＵＧＡＵ）、ＣＸＣＲ４（ＧＡＵＡＡＣＵＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＡＵ）、ＥＭＸ１（ＧＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）、ＦＡＭ１６３Ａ（ＣＵＧＣＡＧＧＧＣＵＣＧＣＵＧＧＵＧＡＧ）、ＦＡＮＣＦ（ＧＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＵＵＣＣＡＵＧ）、ＧＡＡ（ＡＧＧＡＧＣＣＧＧＵＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧ）、ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＧＣＣＵＣＧＧＧ）、ＩＴＧＡ７（ＧＧＵＧＣＵＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＵＧ）、ＩＲＡＫ４（ＧＵＣＣＵＧＵＣＵＵＵＧＵＣＡＣＡＧＡＡ）、ＭＡＰＲＥ１（ＵＵＣＵＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＵＣＣＵＧ）、ＭＩＰ（ＧＣＵＧＧＧＧＵＣＣＵＣＡＣＵＧＣＧＣＵ）、ＯＭＰ（ＧＡＡＣＵＧＵＡＧＣＣＧＣＵＧＣＵＧＣＵ）、ＯＰＮ１ＳＷ（ＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＡＣＵＧ）、ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＵＧＣＣＵＧＣＵＣＡＧＵＧＵＵＧ）、ＰＲＫＡＧ３（ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＵＣＡ）、ＳＴＫ３＿ｓｇ１（ＡＡＡＧＣＡＡＵＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＵＣ）、ＳＴＫ３＿ｓｇ２（ＣＣＡＵＡＡＵＧＣＡＧＣＡＡＵＧＵＧＡＣ）、およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）を標的とする標的結合性領域を有する２３種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、２３種の実験集団を作製した。次いで、各実験集団を３つの群に分割し、１つは暗闇で維持するものとし、１つは環境光に曝露させるものとし、１つは３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に曝露するものとした。４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、トランスフェクション前に１０分間にわたって混合させた。トランスフェクションの４時間後、処理細胞を環境光に２０分間曝露させたか、または３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を４２０ｎｍよりも長いものに限定した光に６０秒間曝露させた。トランスフェクションの４８時間後、試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。

ゲノム解析

図４１は、２３種の異なるＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９の編集効率を同じ標的結合性配列を有する修飾されていないｓｇＲＮＡと比較したグラフを示す。
（実施例１６）
クマリンリンカーを有するＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡの可視光線への曝露

図３４は、ｓｇＲＮＡの５７位および７４位にクマリンリンカー、ジエチルアミノクマリン（１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル）を含むＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドの図である。クマリンリンカーは有意に赤色移動し、可視光線を使用してオリゴヌクレオチドを切断するために使用することができる。クマリンリンカーの遊離は、密接なイオン対形成、その後のクマリニルメチルカチオンと水および他の入手可能な求核試薬との反応を通じて起こる。

エレクトロスプレーイオン化

ＴＥ緩衝剤（３μＭ）中ＲＮＡ試料を質量分析（Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０ＩｎｆｉｎｉｔｙＩＩ液体クロマトグラフィーシステム（ＬＣ）とＡｇｉｌｅｎｔ６５３０ＢＱ－ＴＯＦ質量分析計（ＭＳ）の結合）により、陰イオン極性モードで分析した。ＬＣを、ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＢＥＨＣ１８ＶａｎＧｕａｒｄＰｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ（１．７μｍ、２．１×５ｍｍ）でグラジエント溶離（緩衝剤Ａ：５０ｍＭのＨＦＩＰ；１５ｍＭのヘキシルアミン２％ＭｅＯＨ；緩衝剤Ｂ：ＭｅＯＨ、毎分０．７５ｍＬ、１．０５分で２～９５％Ｂ）を用いて実施した。エレクトロスプレーイオン化をデュアルＥＳＩソース（ガス温度３２５℃、乾燥ガス毎分１２Ｌ、ネブライザー４０ｐｓｉ、Ｖｃａｐ４ｋＶ、フラグメンター２５０、スキマー６５）を用いて実施した。データを１００～３２００ｍ／ｚ範囲で取得し、４０００～３５０００ｍ／ｚ範囲にデコンボリューションした。

図３６Ａは、光への曝露前の、ＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）を標的とする上記のＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのＥＳＩトレースである。

図３６Ｂは、４２０ｎｍロングパスフィルターにかけた光への曝露後の、上記のＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのＥＳＩトレースである。光に晒さなかったＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡは修飾されていないｓｇＲＮＡと同じ分子量に保持された。光に晒さなかったＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡについて断片化は観察されなかった。図２０Ｂは、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡが４２０ｎｍの光に曝露したら両方の光切断可能な部位において切断されたことを実証する。
（実施例１７）
ＵＶにより切断可能なリンカーを有するＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのＵＶ光への曝露

エレクトロスプレーイオン化

図５７Ａは、ＵＶ光への曝露前の、５７位および７４位に光切断可能なリンカーを有する、ＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）を標的とするＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのＥＳＩトレースである。

図５７Ｂは、３４５ｎｍの帯域フィルターにかけた光への曝露後の、図４１ＡのＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのＥＳＩトレースである。光に晒さなかったＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡは修飾されていないｓｇＲＮＡと同じ分子量に保持された。図５７Ｂは、ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡが、３４５ｎｍの光に曝露したら両方の光切断可能な部位で切断されたことを実証する。
（実施例１８）
ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９のＵＶ光を用いた不活性化

１０ｐｍｏｌのＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳタンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）を３０ｐｍｏｌの合成ｓｇＲＮＡと合わせて総体積２０μＬにし、１０分間にわたって複合体を形成させた。このインキュベーション中、細胞を収集し、計数した。ＲＮＰ溶液に細胞溶液５μＬを１μＬ当たり細胞４×１０^４個の濃度で添加し、穏やかに混合した。

４Ｄ－ヌクレオフェクター（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）システム（Ｌｏｎｚａ）を２０μＬフォーマットで使用して細胞＋ＲＮＰ溶液をトランスフェクトした。トランスフェクションは製造者のプロトコールに従って行った。トランスフェクション後、細胞を培養培地中に回収し、９６ウェルプレートにプレーティングした。

ＣＲＩＳＰＲオフ不活性化を、Ｓｕｎｒａｙ６００ＵＶＦｌｏｏｄＬａｍｐ（ＵｖｉｔｒｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して実施した。３４５ｎｍおよび３５５ｎｍの６．５インチ×６．５インチの色ガラス代替ロングパスフィルターをＮｅｗｐｏｒｔ．ｃｏｍから入手し、特注の３Ｄプリントした容器に乗せた。

正立顕微鏡を使用した不活性化を、ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｓＯｂｓｅｒｖｅｒを使用し、Ｃｏｌｉｂｒｉの７つのフレキシブルな光源および３８５ｎｍのＬＥＤを用いて実施した。

図５４は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲオフを使用して必須遺伝子を標的とした細胞培養物の画像である。光に曝露させた細胞培養物（＋ｈｖ）では、光に曝露させていない細胞培養物よりも高い集密度が実証され、これにより、不活性化の欠如により高度の細胞死が引き起こされたことが示される。

図４２は、標準ｓｇＲＮＡを用いた場合に見られる比と比較した、オフターゲット編集が起こる前にＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを不活性化することによるオンターゲット編集とオフターゲット編集の比のモジュレーションを示す。ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡの不活性化を、トランスフェクション後の別個の時点で細胞に光を当てることによって実現した。表２において見ることができる通りゲノム内の１つまたは２つの部位で有意なレベルのオフターゲット編集を有した標的部位を選択した。

図５５は、ＨＥＫ２９３細胞におけるトランスフェクション後の種々の時点でのオンターゲット編集：オフターゲット編集比を示すグラフである。

表２：オフターゲット部位

表３：オフターゲット配列決定プライマー

ゲノム解析

ＤＮＡＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用し、製造者のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを単離した。収集後、抽出物溶液を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、その後、９８℃で１０分間インキュベートした。ゲノムＰＣＲを、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ３６０マスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を使用し、表１に見出されるプライマー配列を使用して実施した。サンガー配列決定後、インデルの存在をＩＣＥ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）によって解析した。
（実施例１９）
Ｃａｓ９－ＣＲＩＳＰＲオフを使用したＧＦＰノックアウト

４Ｄ－ヌクレオフェクターシステム（Ｌｏｎｚａ）を２０μＬフォーマットで使用して細胞＋ＲＮＰ溶液をトランスフェクトした。トランスフェクションは製造者のプロトコールに従って行った。トランスフェクション後、細胞を培養培地中に回収し、９６ウェルプレートにプレーティングした。

図４４は、光に曝露した細胞内のＧＦＰをコードする遺伝子は不活性化される一方で光に曝露していない細胞はＧＦＰを発現し続けるように、遮蔽を使用してＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡを発現する細胞を光に選択的に曝露させた細胞培養物を示す。

図２４は、透明な領域では光の通過が可能になり、それにより、ＣＲＩＳＰＲオフと複合体を形成したＣａｓ９ヌクレアーゼの編集活性が不活性化され、暗闇領域は不透明になって編集が妨害されずに進行することが可能になるように図４４の細胞培養物に適用した薄膜遮蔽の画像である。
（実施例２０）
ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の可視光線を用いた不活性化

図４８は、５７位および７４位にクマリンリンカーを有する、ＭＩＰを標的とするＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡがＬＥＤ光源によってどのくらい迅速に不活性化されるかを示す。クマリンリンカーを有するＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を５つの独立したウェルに分割した。４時間後、対の反復実験に覆いをして環境光を取り除いたか、または４３０±２３ｎｍのＬＥＤに１分間、２分間、３分間、または４分間曝露させた。遺伝子編集を不活性化するには１分で十分であった。１００％強度の４３０±２３ｎｍのＬＥＤを有するＣｏｌｉｂｒｉ７光源を、１回に１つのウェルに光を当てることができる標準の倒立蛍光顕微鏡と一緒に使用した。
（実施例２１）
ｓｇＲＮＡ上の多数のリンカーの場所に関する試験

ＲＮＰの形成および送達

ＣＲＩＳＰＲオフ不活性化

ゲノム解析

図５０Ａ～５０Ｃは、上記の通りＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した１８種の異なるｓｇＲＮＡによって観察されたパーセント編集を示す。図５０Ａは、それぞれＤＮＭＴ１を標的とする、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した６種の異なるｓｇＲＮＡにおいて観察されたパーセント編集を示す。ｓｇＲＮＡは、標準（Ｍｏｄ）または２１位、２４位、５０位、５７位、または７４位に単一の切断可能なリンカーを有するものである。図５０Ｂは、それぞれＦＡＮＣＦを標的とする、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した６種の異なるｓｇＲＮＡにおいて観察されたパーセント編集を示す。ｓｇＲＮＡは、標準（Ｍｏｄ）または２１位、２４位、５０位、５７位、または７４位に単一の切断可能なリンカーを有するものである。図５０Ｃは、それぞれＶＥＧＦＡを標的とする、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成した６種の異なるｓｇＲＮＡにおいて観察されたパーセント編集を示す。ｓｇＲＮＡは、標準（Ｍｏｄ）または２１位、２４位、５０位、５７位、または７４位に単一の切断可能なリンカーを有するものである。
（実施例２２）
光への曝露後のＣＲＩＳＰＲオフの断片化を検出するための液滴ＰＣＲ

デジタル液滴ＰＣＲ

細胞ＲＮＡを、ＤＮａｓｅを伴わないＲＮＡＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して抽出した。ＲＮＡを、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して数量化し、正規化した。

全ＲＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔＡｄｖａｎｃｅｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、０．４μＭの転写用リバースプライマーを用いて逆転写した。逆転写産物を、２×ＥｖａＧｒｅｅｎｄｄＰＣＲＭａｓｔｅｒｍｉｘおよび９５℃で３分間の熱サイクル、その後、９５℃で３０秒間および５２．４℃で１分の４０サイクルを使用して増幅した。次いで、シグナルを４℃で５分間にわたって安定化し、その後、９０℃で５分間にわたって不活性化した。次いで、液滴をＱＸ２００ＤｒｏｐｌｅｔＤｉｇｉｔａｌＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）によって読み取った。

表４：ｄｄＰＣＲ試薬：

図４５は、標準ｓｇＲＮＡと比較した、光への曝露後のＣＲＩＳＰＲオフの存在量の減少を実証するグラフを示す。
（実施例２３）
１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピルの調製

ホスホロアミダイト化合物３（３－（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）－１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト）をＷｅｎｚｅｌｅｔａｌ．（２００３）（ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ、ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ＆ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏｓ．５－８，ｐｐ．１５７９－１５８１）に開示されている方法に従い、アルデヒド化合物１（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－カルバルデヒド）とアリルトリメチルシランをＴｉＣｌ_４の存在下で反応させることによって合成する。次に、前の化合物のオゾン分解およびＮａＢＨ_４を用いた還元ワークアップによってジオール化合物２（７－（ジエチルアミノ）－４－（１，３－ジヒドロキシプロピル）－２Ｈ－クロメン－２－オン）を生成する。２のジメトキシトリチル化、その後のホスフィチル化により、ホスホロアミダイト化合物３を優れた収量で得る。

（実施例２４）
１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピルとヌクレオチドの連結

化合物３の添加後に形成されたリンカーを有するＲＮＡのＤＭＴ（ＤＭＴ＝４，４’－ジメトキシトリチル）保護基を酸により触媒される脱トリチル化反応で除去した。脱トリチル化ＲＮＡは、ヌクレオシドホスホロアミダイト単量体の形態で添加されるヌクレオチドと反応する準備ができている。妥当なヌクレオシドホスホロアミダイトを性化因子（テトラゾールまたは誘導体）と混合する。これらの両方をアセトニトリルに溶解させる。ヌクレオシドホスホロアミダイトのジイソプロピルアミノ基が活性化因子によりプロトン化され、それにより、良好な脱離基に変換される。これは脱トリチル化ＲＮＡの脱保護されたヒドロキシル基によるその近くのリン原子に対する攻撃によって急速に除かれ、新しいリン－酸素結合が形成され、それにより、ホスファイトトリエステル結合が創出される（すぐ下の図に示されている通り）。ヌクレオシドホスホロアミダイトは不活性雰囲気中で合理的に安定であり、多量に調製することができる。

Ｘは、Ｈ、ＯＴＢＤＭＳ（Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルエーテル）、またはＯＭｅであり得る。

一部の実施形態では、ホスホロアミダイトリンカー化合物３のジイソプロピルアミノ基が活性化因子によってプロトン化され、それにより、良好な脱離基に変換される。これは、ヌクレオシド塩基の３’または５’ヒドロキシル基の攻撃によって急速に除かれ、新しいリン－酸素結合が形成される（すぐ下の図に示されている通り）。

前述の例に記載されているホスホロアミダイト法は、一般に、４つのステップ：ステップ１（脱トリチル化）、ステップ２（カップリング）、ステップ３（キャップ形成）、およびステップ４（酸化）を含むことが当業者には理解されよう。
（実施例２５）
ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと連結したＣａｓ９のＵＶ光を用いた不活性化

ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳタンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）を、Ｃａｓ９と共有結合を形成するように構成されたリンカーならびに５４位および７４位の光切断可能なリンカーを含む合成ＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡと合わせた。ｓｇＲＮＡをＣａｓ９ヌクレアーゼとリンカーを通じて共有結合により連結して連結したＲＮＰ複合体を形成する。

細胞に、連結したＲＮＰ複合体をトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞を培養培地から回収し、９６ウェルプレートにプレーティングする。細胞を４８時間インキュベートしてＲＮＰ複合体による標的配列を編集可能にする。

ＣＲＩＳＰＲ複合体を、Ｓｕｎｒａｙ６００ＵＶＦｌｏｏｄＬａｍｐ（ＵｖｉｔｒｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用し、３４５ｎｍおよび３５５ｎｍの６．５インチ×６．５インチの色ガラス代替ロングパスフィルターを用いて不活性化する。フラッドランプの使用前後の時間間隔で細胞を収集する。

あるいは、正立顕微鏡を使用した不活性化を、ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｓＯｂｓｅｒｖｅｒを使用し、Ｃｏｌｉｂｒｉの７つのフレキシブルな光源および３８５ｎｍＬＥＤを用いて実施する。収集された細胞から核酸を抽出し、時間間隔で編集効率を測定するために使用する。
（実施例２６）
ＣＲＩＳＰＲオンＶ１ｓｇＲＮＡバリアントを使用した標的編集

図５８は、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）ｓｇＲＮＡと同一であるが、プロトスペーサー（バックトラック）配列と相補的な２０ヌクレオチド（ｎｔ）配列、続いてプロトスペーサーのすぐ５’側の４ｎｔループ構造を含有するＣＲＩＳＰＲオンＶ１ｓｇＲＮＡの構造を示す。図５９は、４種の独特の遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲオンＶ１ｓｇＲＮＡの３種のバリアントを使用した標的編集を示す。３種のバリアントには、以下が含まれた：光刺激に応答することが予測されなかったもの（切断不可能な対照）、ｓｇＲＮＡの５’末端から２４位のところに単一の光切断可能なリンカーを含有するもの（１光切断可能）、および１１位と２４位に２つの光切断可能なリンカーを含有するもの（２光切断可能）。ＣＲＩＳＰＲオンｓｇＲＮＡをＳｐＣａｓ９と混合してＲＮＰを形成し、ＨＥＫ２９３にトランスフェクトした。４時間後、細胞を２つの実験群に分割し、一方は光照射するものとし、一方の群は暗闇で放置するものとした。トランスフェクションの４８時間後、両群からゲノムＤＮＡを単離し、インデルの存在について分析した。プロトスペーサー配列への相補物の組み入れにより、解析した全ての標的における編集効率が低下した。ヘアピンへの光切断可能なリンカーの組み入れ、および必要に応じてプロトスペーサーに対する相補物の組み入れにより、編集の完全な破壊はもたらされなかったが、光への曝露後の編集の完全な回復も可能にならなかった。
（実施例２７）
ＣＲＩＳＰＲオンＶ２ｓｇＲＮＡを使用した標的編集

図６０は、ＣＲＩＳＰＲオンＶ１と同じ構造が使用されるが、バックトラック配列（ＲＮＡの最初の２０ｎｔ、プロトスペーサーと相補的）が２’－Ｏ－メチル（２’Ｏ－Ｍｅ）ＲＮＡに置き換えられている、ＣＲＩＳＰＲオンＶ２ｓｇＲＮＡの構造を示す。２’Ｏ－ＭｅＲＮＡはＲＮＡにより密接に結合し、Ｒ－ループ形成の間に取り換えられる可能性が低い。図６１は、標準ｓｇＲＮＡ（Ｍｏｄ）、ＣＲＩＳＰＲオンＶ１（ＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲオンＶ２（Ｏ－Ｍｅ）の間の編集活性の比較を示す。ＣＲＩＳＰＲオンＲＮＰをＨＥＫ２９３にトランスフェクトし、回復させた。トランスフェクションの４８時間後、ゲノムＤＮＡを収集し、インデルの存在について分析した。ＣＲＩＳＰＲオンＶ２により、試験した５つの遺伝子座全てにおいてインデルの誘導が有意に低減した。ＣＲＩＳＰＲオンＲＮＰをＨＥＫ２９３にトランスフェクトし、回復させた。トランスフェクションの４８時間後、ゲノムＤＮＡを収集し、インデルの存在について分析した。ＣＲＩＳＰＲオンＶ２により、試験した５つの遺伝子座全てにおいてインデルの誘導が有意に低減した。
（実施例２８）
ＣＲＩＳＰＲオンＶ３ｓｇＲＮＡを使用した標的編集

図６２は、ＣＲＩＳＰＲオンＶ２を踏まえたものであるが、光切断可能なリンカーがプロトスペーサーバックトラックの中央（１１位）およびプロトスペーサーのすぐ５’側の配列（２４位）に組み入れられている、ＣＲＩＳＰＲオンＶ３ｓｇＲＮＡの構造を示す。図６３は、５種の独特の遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲオンＶ３ｓｇＲＮＡ（Ｋ１１、２４）を使用した編集を単一の光切断可能なリンカーを２４位に含有するＣＲＩＳＰＲオンＶ２バリアント（Ｋ２４）、ＣＲＩＳＰＲオンＶ２（Ｏ－Ｍｅ）および標準ｓｇＲＮＡ（Ｍｏｄ）と比較して示す。ＣＲＩＳＰＲオンＶ３に光切断可能なリンカーの組み入れたことにより、編集活性の部分的な回復が可能になった。ＣＲＩＳＰＲオンＶ３ｓｇＲＮＡを含有するＲＮＰをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、プールを２つの群に分割し、一方は光に曝露させ、他方は暗闇のままにした。トランスフェクションの４８時間後、ＤＮＡを全群から抽出し、インデルの存在について分析した。暗闇に放置したＣＲＩＳＰＲオンＶ３ｓｇＲＮＡでは一貫して低い～検出不可能なレベルの編集が示された。同じ試料を光に曝露した場合、ゲノムＤＮＡにおいて検出されるインデルのレベルが上昇した。インデルの存在の増加は、光切断可能なリンカーを欠くガイドでは見られなかった。
（実施例２９）
ＣＲＩＳＰＲオンＶ４ｓｇＲＮＡバリアントを使用した標的編集

図６４は、ＣＲＩＳＰＲオンＶ３を踏まえたものであるが、バックトラック領域のＤＮＡ標的による効率的な取換えを確実にするために追加的な光切断可能なリンカーが導入されている、ＣＲＩＳＰＲオンＶ４ｓｇＲＮＡの構造を示す。ｓｇＲＮＡからのバックトラック遊離の確率を上昇させるために光切断可能な残基が２３位および２４位に位置付けられている。解離を補助するために追加的な光切断可能な残基が６位および１４位に位置付けられている。図６５は、２つの遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲオンＶ４ｓｇＲＮＡバリアントを使用した編集を５ＲＰ（ｓｇＲＮＡの５’に追加的な配列５’－ＵＣＵＣＣＣＵＧＡＧＣＵＵＣＡＧＧＧＡＧ－３’を含む）、ＣＲＩＳＰＲオンＶ２（Ｍｅ）および標準ｓｇＲＮＡ（Ｍｏｄ）と比較して示す。ＣＲＩＳＰＲオンＶ４ｓｇＲＮＡバリアントは光切断可能なリンカーを以下のヌクレオチドにおいて含むものであった：３、２３および２４（Ｋ３、２３、２４）；６、１１、１６、２３および２４（Ｋ６、１１、１６、２３、２４）；６、１４、２３および２４（Ｋ６、１４、２３、２４）。ＣＲＩＳＰＲオンＶ４ｓｇＲＮＡを用いて形成されたＲＮＰをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１時間後、細胞を２つの群に分割した。一方の群は標的化光に曝露させ、一方、他方は暗闇のままにした。トランスフェクションの４８時間後、両群からＤＮＡを単離し、インデルの存在について分析した。２３位および２４位の光切断可能なリンカーの付加により、全ての標的における編集効率の回復が増大すると思われた。６位および１４位に光切断可能なリンカーを含めることによるさらなる最適化により、標準の（Ｍｏｄ）ｓｇＲＮＡの編集活性と同様の編集活性の効率的な回復が可能になった。

材料および方法：

ＣＲＩＳＰＲオンｓｇＲＮＡの合成

全てのＲＮＡを、ＳｙｎｔｈｅｇｏのＣＲＩＳＰＲｅｖｏｌｕｔｉｏｎプラットフォームを使用し、固相ホスホロアミダイト化学によって合成し、それらの同一性をエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって確認した。

細胞培養

ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）を先進の改変イーグル培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０％ｖ／ｖのＦＢＳ中、５回～２０回の間の継代で維持した。細胞を２週間に１回、ＴｒｙｐＬＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１：８の比で継代した。全ての細胞を３７℃および５％ＣＯ_２で維持した。

ＲＮＰの形成および送達

１０ｐｍｏｌのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＰｙｏｇｅｎｅｓＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９－ＮＬＳタンパク質（ＡｌｄｅｖｒｏｎＣａｔ＃９２１２）を３０ｐｍｏｌの合成ｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）と合わせて総体積２０μＬにし、１０分間にわたって複合体を形成させた。このインキュベーション中、細胞を収集し、計数した。ＲＮＰ溶液に細胞溶液５μＬを１μＬ当たり細胞４×１０^４個の濃度で添加し、穏やかに混合した。

４Ｄ－ヌクレオフェクターシステム（Ｌｏｎｚａ）を２０μＬフォーマットで使用して細胞＋ＲＮＰ溶液をトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３トランスフェクションをＳＦ緩衝剤中、プロトコールＣＭ－１３０を使用して行った。トランスフェクション後、細胞を培養培地中に回収し、９６ウェルプレートにプレーティングした。対の反復実験を創出するために、トランスフェクションを第２の９６ウェルプレートにスタンプし、独立に回復させた。

ｓｇＲＮＡ活性化

ＣＲＩＳＰＲオン活性化を特注のＡｒｄｕｉｎｏ制御ライトボードで実施した。ライトボードは２４個の独特の個別に制御される４２０～４３０ｎｍのＬＥＤを含有するものであった。９６ウェルプレートに４～７分にわたって光を当ててｓｇＲＮＡを活性化した。

ゲノム解析

ＤＮＡＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用し、製造者のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを単離した。収集後、抽出物溶液を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、その後、９８℃で１０分間インキュベートした。ゲノムＰＣＲを、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ３６０マスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を使用し、補足の表２に見出されるプライマー配列を使用して実施した。サンガー配列決定後、インデルの存在をＩＣＥ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）によって解析した。

本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施形態が単に例として提供されていることは当業者には明白であろう。当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形、変化および置換をすぐに思いつくであろう。本明細書に記載の発明の実施形態に対する種々の代替を任意の組合せで本発明の実施に使用することができることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義されること、ならびに、それによりこれらの特許請求の範囲の範囲内に入る方法および構造およびそれらの等価物が包含されることが意図されている。

別の態様では、式（Ｉ）：

別の態様では、

別の態様では、式（Ｉ）：

図１４は、３つの例示的な架橋反応を示す図である。

ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質）はＣａｓ９であり得、その場合、ｔｒａｃｒＲＮＡがＣａｓ９のアルファヘリックスローブおよびヌクレアーゼローブと、４つのヘアピンループを通じて相互作用し得る；２つのヘアピンループは各ローブとそれぞれ相互作用し得る。ｃｒＲＮＡは、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列と相補的に結合するように設計することができる。全長ｓｇＲＮＡ標的ＤＮＡ結合性領域は、Ｃａｓ９については２０ヌクレオチドであり得る。Ｃａｓ９に関しては、ＰＡＭ配列は３’－ＮＧＧ、３’－ＮＧＧＮＧ（配列番号１）、３’ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号２）、および３’－ＡＣＡＹ（配列番号３）を含み得、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＷはＡまたはＴであり、ＹはＣまたはＴである。

Ｃ．ｓｇＲＮＡの合成

Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＡｌｄｅｖｒｏｎからのＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳ；ＰＤＢ：４ｏｏ８）を、ロックされたＣＲＩＳＰＲ複合体に使用されるように設計された異なる修飾を含む３種の別個のｓｇＲＮＡと共にＨＥＫ２９３細胞に導入した。各修飾について、ｓｇＲＮＡを、５つのＤＮＡ標的のうちの１つを標的とするように作製した。１５種の異なるｓｇＲＮＡをＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて試験し、それぞれをＨＥＫ２９３細胞のそれぞれの培養物に導入した。図１５は、ＥＭＸ１、ＦＡＮＣＦ、ＧＲＫ１、ＰＲＧＮ、およびＶＥＧＦＡを標的とする１５種の異なるｓｇＲＮＡを用いたゲノム編集効率の概略図を示す。ｓｇＲＮＡの第１の修飾（「ｕ５０ｔ」）は、５０位のウラシルヌクレオチドがチミジンＤＮＡヌクレオチドに置き換えられたものである。ｓｇＲＮＡの第２の修飾（「ｕ４９ａ」）は、ヌクレオチド位Ｕ２２よとＡ４９がひっくり返ったものであり、ステムループ構造が保存される一方でさらなる機能的修飾が可能になる。ｓｇＲＮＡの第３の修飾（「ｕ４９ｔ」）は、ｕ４９ａにさらに基づくが、新しいＵ４９がデオキシチミジンに置き換えられたものである。各修飾を５つの標的結合性領域と組み合わせて、５つの標的を標的とした。５つのＤＮＡ標的領域は：ＥＭＸ１（ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）（配列番号４）；ＦＡＮＣＦ（ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧ）（配列番号５）；ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＴＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧ）；ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧ）（配列番号６）；およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧ）（配列番号７）であった。

４種のｓｇＲＮＡを合成した。ｓｇＲＮＡの一部を表す配列を以下に提示する。ｓｇＲＮＡに対する修飾は、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
「対照」：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号８）
「第２なし」：
ＧＡＡＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号９）
「３ｂｐステム」：
ＵＧＡＧＡＡＡＵＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１０）
「６ｂｐステム」：
ＣＡＣＵＧＡＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１１）

６種のｓｇＲＮＡを合成した。ｓｇＲＮＡの一部を表す配列を以下に提示する。ｓｇＲＮＡに対する修飾は、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
対照：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１２）
２１
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ＊ＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１３）
２４
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵ＊ＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１４）
５０
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡ＊ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１５）
５７
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵ＊ＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１６）
７４
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ＊ＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１７）

ＨＥＫ２９３細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能な（ＰＣ）リンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、ＵＶ光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられたホスホロアミダイト（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）を含み、ＢＵＢ１Ｂ（ＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡ）（配列番号１８）、ＣＡＭＫ１（ｓｇ１：ＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡ）（配列番号１９）、ＰＲＫＡＧ３（ｓｇ１－ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡ（配列番号２０）；ｓｇ２－ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＵＣＡ（配列番号２１））、ＳＴＫ３（ｓｇ１－ＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＴＣＡＡＣ（配列番号２２）；ｓｇ２－ＡＡＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＴＣ（配列番号２３）；ｓｇ３－ＣＣＡＴＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＴＧＡＣ（配列番号２４）；ｓｇ４－ＵＵＵＡＡＵＵＧＣＧＡＣＡＡＣＵＵＧＡＣ（配列番号２５））、ＩＲＡＫ４（ＧＴＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＡＡ（配列番号２６））、およびＣｈｒ８ｑ２３（ｓｇ１－ＡＧＴＣＴＡＣＴＡＴＧＡＧＴＴＴＴＣＴＧ（配列番号２７）；ｓｇ２－ＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＧＡＴ（配列番号２８）；ｓｇ３－ＡＡＧＣＣＴＣＡＡＡＴＴＡＧＧＡＧＡＡＡ（配列番号２９））を標的とする標的結合性領域を有する、１２種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、１２種の実験集団を作製した。Ｃａｓ９をまた、光切断可能なリンカーを有さない、上記の標的結合性領域を有する１２種の異なるｓｇＲＮＡ（標準）とも複合体を形成させた。２４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、室温で１５分間にわたって混合させた。ＨＥＫ２９３細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して室温で５分間にわたって収集して細胞を個別化した。集団を計数して妥当な細胞数を決定し、その後、１００×ｇで３分間遠心分離した。次いで、得られたペレットをヌクレオフェクション緩衝剤に５μＬ当たり細胞２００，０００個の濃度で再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液を予め複合体を形成させたＣａｓ９ｓｇＲＮＡ溶液に添加し、トランスフェクトを行った。各実験集団を２つのウェルに分割して対照と処理細胞の対の反復実験を形成した。トランスフェクションの４時間後、処理細胞をＵＶ光に１分間、および１５秒間曝露させた（帯域フィルターを用いて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した）。その後、細胞をインキュベーターに戻した。トランスフェクションの４８時間後、対照および処理試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡをＡｍｐｌｉｔａｑならびにオンターゲット遺伝子座およびオフターゲット遺伝子座に特異的なプライマーを使用したＰＣＲに供した。配列決定データを編集の存在についてＩＣＥを使用して解析した。Ｈｓｉａｕｅｔａｌ．， ”ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓｆｒｏｍＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅＤａｔａ”，Ｊａｎｕａｒｙ１４，２０１９ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。

Ｕ２ＯＳ細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能なリンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、ＵＶ光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられたホスホロアミダイト（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）を含む、ＤＮＭＴ１（ＧＧＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣ）（配列番号３０）、ＥＭＸ１（ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）（配列番号３１）、ＦＡＮＣＦ（ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧ）（配列番号３２）、ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＴＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＧＧＧ）（配列番号３３）、ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧ）（配列番号３４）、およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧ）（配列番号３５）を標的とする標的結合性領域を有する６種の異なるｓｇＲＮＡと複合体を形成させて（ＣＲＩＳＰＲオフ）、６種の実験集団を作製した。Ｃａｓ９をまた、光切断可能なリンカーを有さない、上記の標的結合性領域を有する６種の異なるｓｇＲＮＡ（標準）とも複合体を形成させた。１２種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、室温で１５分間にわたって混合させた。Ｕ２０Ｓ細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して室温で５分間にわたって収集して細胞を個別化した。集団を計数して妥当な細胞数を決定し、その後、１００×ｇで３分間遠心分離した。次いで、得られたペレットをヌクレオフェクション緩衝剤に５μＬ当たり細胞２００，０００個の濃度で再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液を予め複合体形成させたＣａｓ９ｓｇＲＮＡ溶液に添加し、トランスフェクトを行った。各実験集団を２つのウェルに分割して対照と処理細胞の対の反復実験を形成した。トランスフェクションの４時間後、処理細胞をＵＶ光に１分間、および１５秒間曝露させた（帯域フィルターを用いて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した）。その後、細胞をインキュベーターに戻した。トランスフェクションの４８時間後、対照および処理試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡをＡｍｐｌｉｔａｑならびにオンターゲット遺伝子座およびオフターゲット遺伝子座に特異的なプライマーを使用したＰＣＲに供した。配列決定データを編集の存在についてＩＣＥを使用して解析した。Ｈｓｉａｕｅｔａｌ． ”ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｓｆｒｏｍＳａｎｇｅｒＴｒａｃｅＤａｔａ”，Ｊａｎｕａｒｙ１４，２０１９ｂｉｏＲｘｉｖに記載されている通り、ＩＣＥ（ＣＲＩＳＰＲ編集の推論（ＩｎｆｅｒｅｎｃｅｏｆＣＲＩＳＰＲＥｄｉｔｉｎｇ））により、サンガー配列決定トレースを解析し、配列分解のレベルをマッピングして、インデル形成頻度を決定することによって遺伝子編集の量を測定した。編集を野生型ではない配列のパーセンテージによって表した。

使用した配列は、以下の通りであり、＊は、リンカー（３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト）の場所を示す：
ＤＮＭＴ１
オンターゲットｓｇＲＮＡ：
ＧＧＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ（配列番号３６）
オンターゲットＣＲＩＳＰＲオフ：
ＧＧＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴ＊ＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧ＊ＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ（配列番号３７）
オフターゲット１：ＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＣＣＣ（配列番号３８）
ＦＡＮＣＦ
オンターゲットｓｇＲＮＡ：
ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ（配列番号３９）
オンターゲットＣＲＩＳＰＲオフ：
ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴ＊ＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧ＊ＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ（配列番号４０）
オフターゲット２：ＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧ（配列番号４１）
ＶＥＧＦＡ
オンターゲットｓｇＲＮＡ：
ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ（配列番号４２）
オンターゲットＣＲＩＳＰＲオフ：
ＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴ＊ＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧ＊ＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ（配列番号４３）
オフターゲット３：ＧＣＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＴＧ（配列番号４４）

ＨＥＫ２９３細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能な（ＰＣ）リンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、３４５ｎｍの帯域フィルターにかけた光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられた光切断可能なリンカー（１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル）を含む、ＡＡＶＳ１（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ）（配列番号４５）、ＢＵＢ１Ｂ（ＡＧＵＧＡＡＧＣＣＡＵＧＵＣＣＣＵＧＧＡ）（配列番号４６）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ１（ＵＧＣＣＡＧＧＡＵＣＡＣＣＵＣＣＧＡＧＡ）（配列番号４７）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ２（ＧＣＧＵＣＣＵＣＵＵＡＵＣＵＵＣＵＧＣＣ）（配列番号４８）、ＣＥＬ（ＡＡＣＣＡＧＵＵＧＣＡＧＧＣＧＣＣＣＣＡ）（配列番号４９）、Ｃｈｒ８ｑ２３＿ｓｇ１（ＵＵＡＵＡＧＵＵＡＣＧＡＵＧＵＵＵＧＡＵ）（配列番号５０）、ＣＸＣＲ４（ＧＡＵＡＡＣＵＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＡＵ）（配列番号５１）、ＤＮＭＴ１（ＧＧＡＧＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣ）（配列番号５２）、ＥＭＸ１（ＧＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）（配列番号５３）、ＦＡＭ１６３Ａ（ＣＵＧＣＡＧＧＧＣＵＣＧＣＵＧＧＵＧＡＧ）（配列番号５４）、ＦＡＮＣＦ（ＧＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＵＵＣＣＡＵＧ）（配列番号５５）、ＧＡＡ（ＡＧＧＡＧＣＣＧＧＵＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧ）（配列番号５６）、ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＧＣＣＵＣＧＧＧ）（配列番号５７）、ＩＴＧＡ７（ＧＧＵＧＣＵＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＵＧ）（配列番号５８）、ＩＲＡＫ４（ＧＵＣＣＵＧＵＣＵＵＵＧＵＣＡＣＡＧＡＡ）（配列番号５９）、ＭＡＰＲＥ１（ＵＵＣＵＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＵＣＣＵＧ）（配列番号６０）、ＭＩＰ（ＧＣＵＧＧＧＧＵＣＣＵＣＡＣＵＧＣＧＣＵ）（配列番号６１）、ＯＭＰ（ＧＡＡＣＵＧＵＡＧＣＣＧＣＵＧＣＵＧＣＵ）（配列番号６２）、ＯＰＮ１ＳＷ（ＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＡＣＵＧ）（配列番号６３）、ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＵＧＣＣＵＧＣＵＣＡＧＵＧＵＵＧ）（配列番号６４）、ＰＲＫＡＧ３（ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＵＣＡ）（配列番号６５）、ＳＴＫ３＿ｓｇ１（ＡＡＡＧＣＡＡＵＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＵＣ）（配列番号６６）、ＳＴＫ３＿ｓｇ２（ＣＣＡＵＡＡＵＧＣＡＧＣＡＡＵＧＵＧＡＣ）（配列番号６７）、およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）（配列番号６８）を標的とする標的結合性領域を有する２３種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、２３種の実験集団を作製した。次いで、各実験集団を３つの群に分割し、１つは暗闇で維持するものとし、１つは環境光に曝露させるものとし、１つは３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に曝露するものとした。４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、トランスフェクション前に１０分間にわたって混合させた。トランスフェクションの４時間後、処理細胞を、環境光に２０分間曝露させたか、または３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に６０秒間曝露させた。トランスフェクションの４８時間後、試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。

ゲノム解析

Ｕ２ＯＳ細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能な（ＰＣ）リンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、３４５ｎｍの帯域フィルターにかけた光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられた光切断可能なリンカー（１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル）を含む、ＡＡＶＳ１（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ）（配列番号４５）、ＢＵＢ１Ｂ（ＡＧＵＧＡＡＧＣＣＡＵＧＵＣＣＣＵＧＧＡ）（配列番号４６）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ１（ＵＧＣＣＡＧＧＡＵＣＡＣＣＵＣＣＧＡＧＡ）（配列番号４７）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ２（ＧＣＧＵＣＣＵＣＵＵＡＵＣＵＵＣＵＧＣＣ）（配列番号４８）、Ｃｈｒ８ｑ２３＿ｓｇ１（ＵＵＡＵＡＧＵＵＡＣＧＡＵＧＵＵＵＧＡＵ）（配列番号５０）、Ｃｈｒ８ｑ２３＿ｓｇ２（ＡＧＵＣＵＡＣＵＡＵＧＡＧＵＵＵＵＣＵＧ）（配列番号１４４）、ＤＮＭＴ１（ＧＧＡＧＵＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣ）（配列番号５２）、ＥＭＸ１（ＧＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）（配列番号５３）、ＦＡＭ１６３Ａ（ＣＵＧＣＡＧＧＧＣＵＣＧＣＵＧＧＵＧＡＧ）（配列番号５４）、ＦＡＮＣＦ（ＧＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＵＵＣＣＡＵＧ）（配列番号５５）、ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＧＣＣＵＣＧＧＧ）（配列番号５７）、ＩＴＧＡ７（ＧＧＵＧＣＵＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＵＧ）（配列番号５８）、ＩＲＡＫ４（ＧＵＣＣＵＧＵＣＵＵＵＧＵＣＡＣＡＧＡＡ）（配列番号５９）、ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＵＧＣＣＵＧＣＵＣＡＧＵＧＵＵＧ）（配列番号６４）、ＰＲＫＡＧ３（ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＵＣＡ）（配列番号６５）、ＳＴＫ３＿ｓｇ１（ＡＡＡＧＣＡＡＵＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＵＣ）（配列番号６６）、ＳＴＫ３＿ｓｇ２（ＣＣＡＵＡＡＵＧＣＡＧＣＡＡＵＧＵＧＡＣ）（配列番号６７）、およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）（配列番号６８）を標的とする標的結合性領域を有する１８種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、１８種の実験集団を作製した。次いで、各実験集団を３つの群に分割し、１つは暗闇で維持するものとし、１つは環境光に曝露させるものとし、１つは３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に曝露するものとした。４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、トランスフェクション前に１０分間にわたって混合させた。トランスフェクションの４時間後、処理細胞を、環境光に２０分間曝露させたか、または３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に６０秒間曝露させた。トランスフェクションの４８時間後、試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。

ゲノム解析

Ｈｅｐ３ｂ細胞に、Ｃａｓ９および光切断可能な（ＰＣ）リンカーを含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、３４５ｎｍの帯域フィルターにかけた光に晒してリンカーを切断した。Ｃａｓ９を、５７位および７４位に組み入れられた光切断可能なリンカー（１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）プロピル）を含む、ＡＡＶＳ１（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ）（配列番号４５）、ＢＵＢ１Ｂ（ＡＧＵＧＡＡＧＣＣＡＵＧＵＣＣＣＵＧＧＡ）（配列番号４６）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ１（ＵＧＣＣＡＧＧＡＵＣＡＣＣＵＣＣＧＡＧＡ）（配列番号４７）、ＣＡＭＫ１＿ｓｇ２（ＧＣＧＵＣＣＵＣＵＵＡＵＣＵＵＣＵＧＣＣ）（配列番号４８）、ＣＥＬ（ＡＡＣＣＡＧＵＵＧＣＡＧＧＣＧＣＣＣＣＡ）（配列番号４９）、Ｃｈｒ８ｑ２３＿ｓｇ１（ＵＵＡＵＡＧＵＵＡＣＧＡＵＧＵＵＵＧＡＵ）（配列番号５０）、ＣＸＣＲ４（ＧＡＵＡＡＣＵＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＡＵ）（配列番号５１）、ＥＭＸ１（ＧＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ）（配列番号５３）、ＦＡＭ１６３Ａ（ＣＵＧＣＡＧＧＧＣＵＣＧＣＵＧＧＵＧＡＧ）（配列番号５４）、ＦＡＮＣＦ（ＧＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＵＵＣＣＡＵＧ）（配列番号５５）、ＧＡＡ（ＡＧＧＡＧＣＣＧＧＵＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧ）（配列番号５６）、ＧＲＫ１（ＧＣＣＧＵＣＡＡＡＧＣＵＧＣＣＵＣＧＧＧ）（配列番号５７）、ＩＴＧＡ７（ＧＧＵＧＣＵＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＵＧ）（配列番号５８）、ＩＲＡＫ４（ＧＵＣＣＵＧＵＣＵＵＵＧＵＣＡＣＡＧＡＡ）（配列番号５９）、ＭＡＰＲＥ１（ＵＵＣＵＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＵＣＣＵＧ）（配列番号６０）、ＭＩＰ（ＧＣＵＧＧＧＧＵＣＣＵＣＡＣＵＧＣＧＣＵ）（配列番号６１）、ＯＭＰ（ＧＡＡＣＵＧＵＡＧＣＣＧＣＵＧＣＵＧＣＵ）（配列番号６２）、ＯＰＮ１ＳＷ（ＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＡＣＵＧ）（配列番号６３）、ＰＲＧＮ（ＣＡＧＡＵＧＣＣＵＧＣＵＣＡＧＵＧＵＵＧ）（配列番号６４）、ＰＲＫＡＧ３（ＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＵＣＡ）（配列番号６５）、ＳＴＫ３＿ｓｇ１（ＡＡＡＧＣＡＡＵＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＵＣ）（配列番号６６）、ＳＴＫ３＿ｓｇ２（ＣＣＡＵＡＡＵＧＣＡＧＣＡＡＵＧＵＧＡＣ）（配列番号６７）、およびＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）（配列番号６８）を標的とする標的結合性領域を有する２３種の異なるｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲオフ）と複合体を形成させて、２３種の実験集団を作製した。次いで、各実験集団を３つの群に分割し、１つは暗闇で維持するものとし、１つは環境光に曝露させるものとし、１つは３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を３４５ｎｍよりも長いものに限定した光に曝露するものとした。４種の複合体溶液のそれぞれを形成するために、Ｃａｓ９タンパク質１０ｐｍｏｌをｓｇＲＮＡ、３０ｐｍｏｌと混合した。各溶液を、トランスフェクション緩衝剤を使用して２０μＬまで希釈し、トランスフェクション前に１０分間にわたって混合させた。トランスフェクションの４時間後、処理細胞を環境光に２０分間曝露させたか、または３４５ｎｍの帯域フィルターにかけて波長を４２０ｎｍよりも長いものに限定した光に６０秒間曝露させた。トランスフェクションの４８時間後、試料を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した。

ゲノム解析

エレクトロスプレーイオン化

図３６Ａは、光への曝露前の、ＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）（配列番号６８）を標的とする上記のＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのＥＳＩトレースである。

エレクトロスプレーイオン化

図５７Ａは、ＵＶ光への曝露前の、５７位および７４位に光切断可能なリンカーを有する、ＶＥＧＦＡ（ＧＧＵＧＡＧＵＧＡＧＵＧＵＧＵＧＣＧＵＧ）（配列番号６８）を標的とするＣＲＩＳＰＲオフｓｇＲＮＡのＥＳＩトレースである。

表２：オフターゲット部位

表３：オフターゲット配列決定プライマー

ゲノム解析

ＲＮＰの形成および送達

ＣＲＩＳＰＲオフ不活性化

ゲノム解析

デジタル液滴ＰＣＲ

表４：ｄｄＰＣＲ試薬：

図６４は、ＣＲＩＳＰＲオンＶ３を踏まえたものであるが、バックトラック領域のＤＮＡ標的による効率的な取換えを確実にするために追加的な光切断可能なリンカーが導入されている、ＣＲＩＳＰＲオンＶ４ｓｇＲＮＡの構造を示す。ｓｇＲＮＡからのバックトラック遊離の確率を上昇させるために光切断可能な残基が２３位および２４位に位置付けられている。解離を補助するために追加的な光切断可能な残基が６位および１４位に位置付けられている。図６５は、２つの遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲオンＶ４ｓｇＲＮＡバリアントを使用した編集を５ＲＰ（ｓｇＲＮＡの５’に追加的な配列５’－ＵＣＵＣＣＣＵＧＡＧＣＵＵＣＡＧＧＧＡＧ－３’（配列番号１８７）を含む）、ＣＲＩＳＰＲオンＶ２（Ｍｅ）および標準ｓｇＲＮＡ（Ｍｏｄ）と比較して示す。ＣＲＩＳＰＲオンＶ４ｓｇＲＮＡバリアントは光切断可能なリンカーを以下のヌクレオチドにおいて含むものであった：３、２３および２４（Ｋ３、２３、２４）；６、１１、１６、２３および２４（Ｋ６、１１、１６、２３、２４）；６、１４、２３および２４（Ｋ６、１４、２３、２４）。ＣＲＩＳＰＲオンＶ４ｓｇＲＮＡを用いて形成されたＲＮＰをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１時間後、細胞を２つの群に分割した。一方の群は標的化光に曝露させ、一方、他方は暗闇のままにした。トランスフェクションの４８時間後、両群からＤＮＡを単離し、インデルの存在について分析した。２３位および２４位の光切断可能なリンカーの付加により、全ての標的における編集効率の回復が増大すると思われた。６位および１４位に光切断可能なリンカーを含めることによるさらなる最適化により、標準の（Ｍｏｄ）ｓｇＲＮＡの編集活性と同様の編集活性の効率的な回復が可能になった。

材料および方法：

ＣＲＩＳＰＲオンｓｇＲＮＡの合成

細胞培養

ＲＮＰの形成および送達

ｓｇＲＮＡ活性化

ゲノム解析

本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施形態が単に例として提供されていることは当業者には明白であろう。当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形、変化および置換をすぐに思いつくであろう。本明細書に記載の発明の実施形態に対する種々の代替を任意の組合せで本発明の実施に使用することができることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義されること、ならびに、それによりこれらの特許請求の範囲の範囲内に入る方法および構造およびそれらの等価物が包含されることが意図されている。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）内のヌクレオチドでＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に架橋した前記ｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、前記ｇＲＮＡが、標的結合性領域およびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域を含み、前記ヌクレオチドが、前記ｇＲＮＡの標的結合性領域の外側に存在する、ＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目２）
前記ヌクレオチドが、ウラシルを含む、項目１に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３）
前記ｇＲＮＡが、標的結合性領域を含むｃｒＲＮＡ領域とｔｒａｃｒＲＮＡ領域とを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり、前記ヌクレオチドが前記ｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の外側に存在する、項目１に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目４）
前記ヌクレオチドが前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド４９位に存在し、ヌクレオチド１位が前記ｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、項目３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目５）
前記ヌクレオチドが、前記ｓｇＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチド位：２２、２３、２４、２５、３１、３７、４４、４９、４５、５０、５６、５９、６３、６４、６６、７１、７２、７７、７８、８０、８４、９０または９４に存在し、ヌクレオチド１位が、前記ｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、項目３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目６）
前記ヌクレオチドが、非天然ヌクレオチドである、項目５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目７）
前記非天然ヌクレオチドが、糖の修飾を含む、項目６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目８）
前記非天然ヌクレオチドが、塩基の修飾を含む、項目６または７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目９）
前記非天然ヌクレオチドが、マレイミドを含む、項目６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１０）
前記マレイミドが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインに共有結合により連結している、項目９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１１）
前記ｇＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋剤を介して架橋しており、前記架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰ、または８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、項目６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１２）
前記ｇＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋剤を介して架橋しており、前記架橋剤が、ジスルフィド、アミド、イミン、ヒドラジド、Ｏ－アルキルオキシム、アルキル、アミン、アルコール、トリアゾール、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾールまたはピリダジンを含む、項目６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１３）
前記ヌクレオチドが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のステムループ内に存在する、項目１２に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１４）
前記ステムループの構造が、前記ヌクレオチドを欠くｓｇＲＮＡのステムループの構造と比べて維持されている、項目１３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１５）
前記ヌクレオチドが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のバルジ内に存在する、項目１４に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１６）
前記バルジの構造が、前記ヌクレオチドを欠くｓｇＲＮＡのバルジの構造と比べて維持されている、項目１５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１７）
前記ヌクレオチドが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のステムループ間に存在する、項目１６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１８）
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、ヌクレアーゼ活性を含む、項目１７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１９）
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲットヌクレアーゼ活性が、架橋していない前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と前記ｇＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲットヌクレアーゼ活性と等しいまたはそれよりも低い、項目１８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目２０）
前記ヌクレオチドが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインに対して２０オングストローム以内に存在する、項目１９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目２１）
前記ヌクレオチドが、４－チオウリジンまたは修飾アデノシンではない、項目２０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目２２）
単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のヌクレオチド４９位のヌクレオチドでＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に架橋した前記ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、前記ｓｇＲＮＡが、標的結合性領域を含むｃｒＲＮＡ領域とｔｒａｃｒＲＮＡ領域とを含み、前記ヌクレオチド１位がｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、ＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目２３）
ヌクレオチド４９位のヌクレオチドが、ウラシルを含む、項目２２に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目２４）
ヌクレアーゼ活性を含む、項目２３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目２５）
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性をモジュレートするように構成された配列をさらに含む、項目１から２４までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目２６）
前記ｇＲＮＡが、切断可能なリンカーを含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを含む、項目２５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目２７）
前記ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドを含む、項目２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目２８）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した配列エレメントを含み、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、項目２６または２７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目２９）
前記配列エレメントが、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、項目２８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３０）
前記配列エレメントが、少なくとも２０ヌクレオチドを含む、項目２９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３１）
前記配列エレメントが、２４ヌクレオチドを含む、項目３０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３２）
前記配列エレメントが、ＲＮＡ配列を含む、項目３１に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３３）
前記ＲＮＡ配列が、修飾されたＲＮＡ塩基を含む、項目３２に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３４）
前記修飾されたＲＮＡ塩基が、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基である、項目３３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３５）
前記配列エレメントが、ループを含むステムループを形成する、項目３４に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３６）
前記ループが、少なくとも２ヌクレオチドを含む、項目３５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３７）
前記ループが、少なくとも３ヌクレオチドを含む、項目３６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３８）
前記ループが、４ヌクレオチドを含む、項目３７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３９）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列に対する塩基対を含む、項目３８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目４０）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域に対する塩基対を含む、項目３９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目４１）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１０ヌクレオチドと塩基対合する、項目４０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目４２）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１５ヌクレオチドと塩基対合する、項目４０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目４３）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の２０ヌクレオチドと塩基対合する、項目４０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目４４）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列に対する塩基対を含まない、項目３５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目４５）
前記配列エレメントの最も５’側の塩基が、前記ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングする、項目４４に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目４６）
前記配列エレメント内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、項目２９から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目４７）
前記配列エレメント内に少なくとも２つの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２９から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目４８）
前記配列エレメント内に少なくとも３つの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２９から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目４９）
前記配列エレメント内に少なくとも４つの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２９から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目５０）
前記配列エレメント内に少なくとも５個またはそれよりも多く、７個またはそれよりも多く、１０個またはそれよりも多く、１５個またはそれよりも多く、または２０個またはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２９から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目５１）
前記配列エレメントのループ内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、項目３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目５２）
前記配列エレメントのループ内に２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目５３）
前記配列エレメントのループ内に３つの切断可能なリンカーをさらに含む、項目３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目５４）
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、項目３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目５５）
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目５６）
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに３つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目５７）
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに４つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目５８）
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１１位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目５９）
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位、１６位、２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目６０）
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目６１）
前記配列エレメントの２４位に切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに第１の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに第２の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目６２）
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目６３）
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目６４）
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１６位に第４の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１１位に第５の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目６５）
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１４位に第４の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目６６）
前記配列エレメントが、２４ヌクレオチド長であり、前記配列エレメントのループが、前記ガイド配列の標的結合性領域と塩基対合する前記配列エレメントの２１位から２４位までのヌクレオチドおよび１位から２０位までのヌクレオチドを含む、項目５８から６５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目６７）
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドが、ガイド配列の最も５’側のヌクレオチドの３’側に切断可能なリンカーを含み、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、項目２６または２７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目６８）
前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチドの３’末端には存在せず、前記ポリヌクレオチドが、前記ガイド配列と、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域を含む配列とを前記ポリヌクレオチドの５’末端から３’末端までの順序で含む、項目６７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目６９）
前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、項目６８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目７０）
前記ポリヌクレオチドが、第１の切断可能なリンカーおよび第２の切断可能なリンカーを含み、前記第１の切断可能なリンカーが、ヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けられており、前記第２の切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、項目６８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目７１）
前記ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、前記切断可能なリンカーが、前記ネクサスのループ内または前記ステムループ１のループ内に存在する、項目６８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合。
（項目７２）
前記ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、前記切断可能なリンカーが、前記ネクサスのループ内および前記ステムループ１のループ内に存在する、項目６８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目７３）
前記切断可能なリンカーが、感光性である、項目６８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目７４）
前記切断可能なリンカーが、紫外線（ＵＶ）によって切断される、項目７３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目７５）
前記切断可能なリンカーが、１００ｎｍ～４００ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目７４に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目７６）
前記切断可能なリンカーが、可視光線によって切断される、項目７３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目７７）
前記切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～７００ｎｍの波長の光によって切断される、項目７３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目７８）
前記切断可能なリンカーが、緑色光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目７９）
前記切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目８０）
前記切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目８１）
前記切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目８２）
前記切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目８３）
前記切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目８４）
前記切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目８５）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、緑色光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目８６）
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目８７）
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目８８）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目８９）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目９０）
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目９１）
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目９２）
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目９３）
前記ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド内の切断可能なリンカーが、前記ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド内の切断可能なリンカーよりも長い波長の光によって切断される、項目７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目９４）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが緑色光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが紫色光によって切断される、項目９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目９５）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが緑色光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが青色光によって切断される、項目９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目９６）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目９７）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目９８）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目９９）
前記切断可能なリンカーが、ホスホロアミダイト誘導体である、項目２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１００）
前記切断可能なリンカーが、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト誘導体である、項目２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１０１）
前記切断可能なリンカーが、１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）－３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト誘導体である、項目２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１０２）
前記切断可能なリンカーが、リン酸ジエステルを含む、項目２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１０３）
前記切断可能なリンカーが、ホスホモノエステルを含む、項目２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１０４）
前記切断可能なリンカーが、クマリン誘導体である、項目２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１０５）
前記切断可能なリンカーが、次式：

（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ ^ｘＲ ^ｙであり、ここで、Ｒ ^ｘおよびＲ ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む、項目２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１０６）
Ｘが酸素である、項目１０５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１０７）
Ｘが硫黄である、項目１０５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１０８）
Ｘが＝Ｃ（ＣＮ）２である、項目１０５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１０９）
前記切断可能なリンカーが、式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３、Ｒ ^４およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ ^ｘＲ ^ｙであり、ここで、Ｒ ^ｘおよびＲ ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
ただし、ＸがＯであり、Ｒ ^３がジアルキルアミノである場合には、ｍは２から１０までの整数であり；
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む、項目２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１１０）
Ｘが酸素である、項目１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１１１）
Ｘが硫黄である、項目１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１１２）
Ｘが＝Ｃ（ＣＮ）２である、項目１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１１３）
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ ^３ａおよびＲ ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、Ｘは、酸素である）
によって表される、項目１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１１４）
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ ^３ａおよびＲ ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、硫黄である）
によって表される、項目１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１１５）
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ ^３ａおよびＲ ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、＝Ｃ（ＣＮ）２である）
によって表される、項目１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１１６）
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５が、それぞれ独立に、ＨまたはＣ _１～６アルキルであり、
Ｒ ^３ａ、およびＲ ^３ｂが、Ｃ _１～６アルキルである、
項目１１３から１１５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１１７）
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５が、それぞれＨであり、
Ｒ ^３ａ、およびＲ ^３ｂが、それぞれエチルである、
項目１１３から１１５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１１８）
前記ｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、第１の架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され、第１の架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲット核酸分子に対する編集活性が、架橋していない前記ｇＲＮＡと前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い、項目１から１１７までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１１９）
前記編集活性が、編集されるオフターゲット核酸分子のパーセンテージとして測定される、項目１１８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１２０）
前記編集活性が、編集される標的核酸分子のパーセンテージとして測定される、項目１１８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１２１）
前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体による前記オフターゲット核酸分子に対する編集活性が、前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の編集活性よりも低く、ｐ値≦０．０００１である、項目１１８から１２０までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１２２）
前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の前記標的核酸分子に対する編集活性と前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の前記標的核酸分子に対する編集活性が５％以内である、項目１１８から１２１までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１２３）
前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である、項目１から１２２までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１２４）
前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ９ポリペプチドである、項目１２３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１２５）
前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である、項目１から１２２までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１２６）
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈまたはＣａｓ１２ｉポリペプチドである、項目１２５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１２７）
前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である、項目１から１２２までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１２８）
前記ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄポリペプチドである、項目１２７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１２９）
前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、またはＣａｓ１４ｃポリペプチドである、項目１から１２２までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目１３０）
ｃｒＲＮＡ領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域およびヌクレオチド４９位のヌクレオチドを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、ヌクレオチド１位が、前記ｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、ｓｇＲＮＡ。
（項目１３１）
ｃｒＲＮＡ領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域およびヌクレオチド４９位のウラシルを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、ヌクレオチド１位が、前記ｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、ｓｇＲＮＡ。
（項目１３２）
（ｉ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含むガイド配列と、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域を含む配列と、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するように構成されたヌクレオチドであって、前記ガイド配列の標的結合性領域の外側に存在する、ヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド。
（項目１３３）
前記ヌクレオチドが、ウラシルを含む、項目１３２に記載のポリヌクレオチド。
（項目１３４）
前記ヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド４９位に存在し、ヌクレオチド１位が、前記ガイド配列の標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、項目１３２または１３３に記載のポリヌクレオチド。
（項目１３５）
前記ヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチド位：２２、２３、２４、２５、３１、３７、４４、４９、４５、５０、５６、５９、６３、６４、６６、７１、７２、７７、７８、８０、８４、９０、および９４に存在し、ヌクレオチド１位が、前記ガイド配列の前記標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、項目１３２から１３４までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１３６）
前記ヌクレオチドが、非天然ヌクレオチドである、項目１３２から１３５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１３７）
前記非天然ヌクレオチドが、糖の修飾を含む、項目１３６に記載のポリヌクレオチド。
（項目１３８）
前記非天然ヌクレオチドが、塩基の修飾を含む、項目１３６または１３７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１３９）
前記非天然ヌクレオチドが、マレイミドを含む、項目１３６に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４０）
前記マレイミドが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインと共有結合により連結している、項目１３９に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４１）
前記ポリヌクレオチドが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋剤を介して架橋しており、前記架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰ、または８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、項目１３２から１４０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４２）
前記ポリヌクレオチドが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋剤を介して架橋しており、前記架橋剤が、ジスルフィド、アミド、イミン、ヒドラジド、Ｏ－アルキルオキシム、アルキル、アミン、アルコール、トリアゾール、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾールまたはピリダジンを含む、項目１３２から１４０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４３）
前記（ｉｉ）の配列が、５’から３まで、テトラループ、ネクサス、第１のステムループおよび第２のステムループを形成する、項目１３２から１４２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４４）
第３のステムループを含まない、項目１３２または１４２に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４５）
ポリヌクレオチドの５’末端にはステムループを含まない、項目１３２から１４４までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４６）
前記ヌクレオチドが、ステムループ内に存在する、項目１４２から１４５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４７）
前記ステムループの構造が、前記ヌクレオチドを欠くポリヌクレオチドのステムループの構造と比べて維持されている、項目１４６に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４８）
前記ヌクレオチドが、前記テトラループ内に存在する、項目１４２から１４７までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４９）
前記テトラループの構造が、前記ヌクレオチドを欠くポリヌクレオチドのテトラループの構造と比べて維持されている、項目１４８に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５０）
前記テトラループが、バルジを含む、項目１４８または１４９に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５１）
前記ヌクレオチドが、前記バルジ内に存在する、項目１５０に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５２）
前記バルジの構造が、前記ヌクレオチドを欠くポリヌクレオチドのバルジの構造と比べて維持されている、項目１５１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５３）
前記ヌクレオチドが、ステムループ間に存在する、項目１４２から１５２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５４）
前記ヌクレオチドが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインに対して２０オングストローム以内に存在する、項目１３２から１５３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５５）
前記ヌクレオチドが、４－チオウリジンまたは修飾アデノシンではない、項目１３２から１５４までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５６）
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するように構成されたヌクレオチドを少なくとも２つ含む、項目１３２から１５５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５７）
前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性をモジュレートするように構成された配列をさらに含む、項目１３２から１５６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５８）
切断可能なリンカーを含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを含む、項目１５７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５９）
前記ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドを含む、項目１５８に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６０）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、前記ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した配列エレメントを含む、項目１５８または１５９に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６１）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、ガイド配列の５’末端と共有結合により連結した配列エレメントを含み、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、項目１５８または１５９に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６２）
前記配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結している、項目１５８または１５９に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６３）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、１つまたは複数の切断可能なリンカーを含む配列エレメントを含み、前記配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結しておらず、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、項目１５８または１５９に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６４）
前記配列エレメントが、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、項目１６０から１６６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６５）
前記配列エレメントが、少なくとも２０ヌクレオチドを含む、項目１６０から１６６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６６）
前記配列エレメントが、２４ヌクレオチドを含む、項目１６０から１６５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６７）
前記配列エレメントが、ＲＮＡ配列を含む、項目１６０から１６６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６８）
前記ＲＮＡ配列が、修飾されたＲＮＡ塩基を含む、項目１６７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６９）
前記修飾されたＲＮＡ塩基が、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基である、項目１６８に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７０）
前記配列エレメントが、ループを含むステムループを形成する、項目１６０から１６９までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７１）
前記ループが、少なくとも２ヌクレオチドを含む、項目１７０に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７２）
前記ループが、少なくとも３ヌクレオチドを含む、項目１７０または１７１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７３）
前記ループが、４ヌクレオチドを含む、項目１７０から１７２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７４）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列に対する塩基対を含む、項目１７０から１７３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７５）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域に対する塩基対を含む、項目１７４に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７６）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１０ヌクレオチドと塩基対合する、項目１７５に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７７）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１５ヌクレオチドと塩基対合する、項目１７５に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７８）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の２０ヌクレオチドと塩基対合する、項目１７５に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７９）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列に対する塩基対を含まない、項目１７０から１７３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８０）
前記配列エレメントの最も５’側の塩基が、前記ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングする、項目１７９に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８１）
前記配列エレメント内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、項目１６０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８２）
前記配列エレメント内に少なくとも２つの切断可能なリンカーをさらに含む、項目１６０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８３）
前記配列エレメント内に少なくとも３つの切断可能なリンカーをさらに含む、項目１６０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８４）
前記配列エレメント内に少なくとも４つの切断可能なリンカーをさらに含む、項目１６０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８５）
前記配列エレメント内に少なくとも５個またはそれよりも多く、７個またはそれよりも多く、１０個またはそれよりも多く、１５個またはそれよりも多く、または２０個またはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目１６０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８６）
前記配列エレメントのループ内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、項目１７０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８７）
前記配列エレメントのループ内に２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目１７０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８８）
前記配列エレメントのループ内に３つの切断可能なリンカーをさらに含む、項目１７０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８９）
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、項目１７０から１８０までまたは１８６から１８８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９０）
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目１７０から１８０までまたは１８６から１８８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９１）
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに３つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目１７０から１８０までまたは１８６から１８８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９２）
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに４つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目１７０から１８０までまたは１８６から１８８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９３）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１１位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目１８１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９４）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位、１６位、２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目１８１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９５）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目１８１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９６）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに第１の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに第２の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目１８１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９７）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目１８１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９８）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目１８１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９９）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１６位に第４の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１１位に第５の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目１８１に記載のポリヌクレオチド。
（項目２００）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１４位に第４の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目１８１に記載のポリヌクレオチド。
（項目２０１）
前記配列エレメントが、２４ヌクレオチド長であり、前記配列エレメントのループが前記ガイド配列の標的結合性領域と塩基対合する前記配列エレメントの２１位から２４位までのヌクレオチドおよび１位から２０位までのヌクレオチドを含む、項目１９３から２００までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２０２）
前記ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した配列エレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド。
（項目２０３）
ガイド配列の５’末端と共有結合により連結した配列エレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドであって、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド。
（項目２０４）
前記配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結している、項目２０３に記載のポリヌクレオチド。
（項目２０５）
１つまたは複数の切断可能なリンカーを含む配列エレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドであって、前記配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結しておらず、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド。
（項目２０６）
前記配列エレメントが、ＲＮＡ配列を含む、項目１９９から２０５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２０７）
前記ＲＮＡ配列が、修飾されたＲＮＡ塩基を含む、項目２０６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２０８）
ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した配列エレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドであって、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含み、前記配列エレメントが、修飾されたＲＮＡ塩基を含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド。
（項目２０９）
前記修飾されたＲＮＡ塩基が、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基である、項目２０７または２０８に記載のポリヌクレオチド。
（項目２１０）
前記配列エレメントが、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、項目２０２から２０９までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２１１）
前記配列エレメントが、少なくとも２０ヌクレオチドを含む、項目２０２から２１０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２１２）
前記配列エレメントが、２４ヌクレオチドを含む、項目２０２から２１１までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２１３）
前記配列エレメントが、ループを含むステムループを形成する、項目２０２から２１２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２１４）
前記ループが、少なくとも２ヌクレオチドを含む、項目２１３に記載のポリヌクレオチド。
（項目２１５）
前記ループが、少なくとも３ヌクレオチドを含む、項目２１３または２１４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２１６）
前記ループが、４ヌクレオチドを含む、項目２１３から２１５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２１７）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列に対する塩基対を含む、項目２１３から２１６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２１８）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域に対する塩基対を含む、項目２１７に記載のポリヌクレオチド。
（項目２１９）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１０ヌクレオチドと塩基対合する、項目２１８に記載のポリヌクレオチド。
（項目２２０）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１５ヌクレオチドと塩基対合する、項目２１８に記載のポリヌクレオチド。
（項目２２１）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の２０ヌクレオチドと塩基対合する、項目２１８に記載のポリヌクレオチド。
（項目２２２）
前記配列エレメントが、前記ガイド配列に対する塩基対を含まない、項目２１３から２１６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２２３）
前記配列エレメントの最も５’側の塩基が、前記ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングする、項目２２２に記載のポリヌクレオチド。
（項目２２４）
前記配列エレメント内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、項目２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２２５）
前記配列エレメント内に少なくとも２つの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２２６）
前記配列エレメント内に少なくとも３つの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２２７）
前記配列エレメント内に少なくとも４つの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２２８）
前記配列エレメント内に少なくとも５個またはそれよりも多く、７個またはそれよりも多く、１０個またはそれよりも多く、１５個またはそれよりも多く、または２０個またはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２２９）
前記配列エレメントのループ内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、項目２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２３０）
前記配列エレメントのループ内に２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２３１）
前記配列エレメントのループ内に３つの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２３２）
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、項目２０２から２２３までまたは２２９から２３１までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２３３）
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２０２から２２３までまたは２２９から２３２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２３４）
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに３つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２０２から２２３までまたは２２９から２３２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２３５）
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに４つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、項目２０２から２２３までまたは２２９から２３２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２３６）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１１位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目２２４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２３７）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位、１６位、２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目２２４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２３８）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目２２４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２３９）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに第１の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに第２の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目２２４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２４０）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目２２４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２４１）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目２２４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２４２）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１６位に第４の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１１位に第５の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目２２４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２４３）
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１４位に第４の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、項目２２４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２４４）
前記配列エレメントが、２４ヌクレオチド長であり、前記配列エレメントのループが、前記ガイド配列の標的結合性領域と塩基対合する前記配列エレメントの２１位から２４位までのヌクレオチドおよび１位から２０位までのヌクレオチドを含む、項目２３６から２４３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２４５）
前記ガイド配列の最も５’側のヌクレオチドの３’側に切断可能なリンカーを含むＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド。
（項目２４６）
前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチドの３’末端には存在しない、項目２４５に記載のポリヌクレオチド。
（項目２４７）
前記切断可能なリンカーが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域内に位置付けられた、項目１５８から２４６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２４８）
前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、項目１５８から２４７までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２４９）
前記ポリヌクレオチドが、第１の切断可能なリンカーおよび第２の切断可能なリンカーを含み、前記第１の切断可能なリンカーが、ヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けられており、前記第２の切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、項目１５８から２４８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２５０）
前記ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、前記切断可能なリンカーが、前記ネクサスのループ内または前記ステムループ１のループ内に存在する、項目１５８から２４９までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２５１）
前記ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、前記切断可能なリンカーが、前記ネクサスのループ内および前記ステムループ１のループ内に存在する、項目１５８から２４９までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２５２）
項目２０２から２４４までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドおよび項目２４５から２５１までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド。
（項目２５３）
前記切断可能なリンカーが、感光性である、項目１５８から２５２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２５４）
前記切断可能なリンカーが、紫外線（ＵＶ）によって切断される、項目２５３に記載のポリヌクレオチド。
（項目２５５）
前記切断可能なリンカーが、１００ｎｍ～４００ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２５４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２５６）
前記切断可能なリンカーが、可視光線によって切断される、項目２５３に記載のポリヌクレオチド。
（項目２５７）
前記切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～７００ｎｍの波長の光によって切断される、項目２５３に記載のポリヌクレオチド。
（項目２５８）
前記切断可能なリンカーが、緑色光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２５９）
前記切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６０）
前記切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６１）
前記切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６２）
前記切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６３）
前記切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６４）
前記切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６５）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、緑色光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６６）
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６７）
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６８）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６９）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２７０）
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２７１）
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２７２）
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２７３）
前記ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド内の切断可能なリンカーが、前記ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド内の切断可能なリンカーよりも長い波長の光によって切断される、項目２５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目２７４）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２６８に記載のポリヌクレオチド。
（項目２７５）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２６８に記載のポリヌクレオチド。
（項目２７６）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、項目２６８に記載のポリヌクレオチド。
（項目２７７）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、緑色光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、項目２６８に記載のポリヌクレオチド。
（項目２７８）
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、緑色光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、項目２６８に記載のポリヌクレオチド。
（項目２７９）
前記切断可能なリンカーが、ホスホロアミダイト誘導体である、項目１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２８０）
前記切断可能なリンカーが、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト誘導体である、項目１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２８１）
前記切断可能なリンカーが、１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）－３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト誘導体である、項目１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２８２）
前記切断可能なリンカーが、リン酸ジエステルを含む、項目１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２８３）
前記切断可能なリンカーが、ホスホモノエステルを含む、項目１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２８４）
前記切断可能なリンカーが、クマリン誘導体である、項目１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２８５）
前記切断可能なリンカーが、次式：

（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ ^ｘＲ ^ｙであり、ここで、Ｒ ^ｘおよびＲ ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む、項目１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２８６）
Ｘが、酸素である、項目２８５に記載のポリヌクレオチド。
（項目２８７）
Ｘが、硫黄である、項目２８５に記載のポリヌクレオチド。
（項目２８８）
Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、項目２８５に記載のポリヌクレオチド。
（項目２８９）
前記切断可能なリンカーが、式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ ^ｘＲ ^ｙであり、ここで、Ｒ ^ｘおよびＲ ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
ただし、ＸがＯであり、Ｒ ^３がジアルキルアミノである場合には、ｍは２から１０までの整数であり；
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む、項目１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２９０）
Ｘが、酸素である、項目２８９に記載のポリヌクレオチド。
（項目２９１）
Ｘが、硫黄である、項目２８９に記載のポリヌクレオチド。
（項目２９２）
Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、項目２８９に記載のポリヌクレオチド。
（項目２９３）
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
Ｒ ^３ａおよびＲ ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、酸素である）
によって表される、項目２８９に記載のポリヌクレオチド。
（項目２９４）
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ ^３ａおよびＲ ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、硫黄である）
によって表される、項目２８９に記載のポリヌクレオチド。
（項目２９５）
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ ^３ａおよびＲ ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、＝Ｃ（ＣＮ）２である）
によって表される、項目２８９に記載のポリヌクレオチド。
（項目２９６）
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５が、それぞれ独立に、ＨまたはＣ _１～６アルキルであり、
Ｒ ^３ａ、およびＲ ^３ｂが、Ｃ _１～６アルキルである、
項目２９３から２９５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２９７）
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５が、それぞれＨであり、
Ｒ ^３ａ、およびＲ ^３ｂが、それぞれエチルである、
項目２９３から２９５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２９８）
前記ポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、第１の架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され、第１の架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲット核酸分子に対する編集活性が、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋していない前記ポリヌクレオチドを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い、項目１３２から２９７までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２９９）
前記編集活性が、編集されるオフターゲット核酸分子のパーセンテージとして測定される、項目２９８に記載のポリヌクレオチド。
（項目３００）
前記編集活性が、編集される標的核酸分子のパーセンテージとして測定される、項目２９８に記載のポリヌクレオチド。
（項目３０１）
前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体による前記オフターゲット核酸分子に対する編集活性が、前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の編集活性よりも低く、ｐ値≦０．０００１である、項目２９８から３００までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目３０２）
前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の前記標的核酸分子に対する編集活性と前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の前記標的核酸分子に対する編集活性が５％以内である、項目２９８から３０１までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目３０３）
項目１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３０４）
ヌクレアーゼ活性を含む、項目３０３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
（項目３０５）
式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ ^ｘＲ ^ｙであり、ここで、Ｒ ^ｘおよびＲ ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
ただし、ＸがＯであり、Ｒ ^３がジアルキルアミノである場合には、ｍは２から１０までの整数であり；
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
の構造を含む切断可能なリンカーを含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３０６）
Ｘが、酸素である、項目３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３０７）
Ｘが、硫黄である、項目３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３０８）
Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、項目３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３０９）
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ ^３ａおよびＲ ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、酸素である）
によって表される、項目３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３１０）
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ ^３ａおよびＲ ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、硫黄である）
によって表される、項目３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３１１）
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ ^３ａおよびＲ ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、＝Ｃ（ＣＮ）２である）
によって表される、項目３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３１２）
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５が、それぞれ独立に、ＨまたはＣ _１～６アルキルであり、
Ｒ ^３ａ、およびＲ ^３ｂが、Ｃ _１～６アルキルである、
項目３０９から３１１までのいずれか一項に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３１３）
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５が、それぞれＨであり、
Ｒ ^３ａ、およびＲ ^３ｂが、それぞれエチルである、
項目３０９から３１１までのいずれか一項に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３１４）
次式：

（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ ^ｘＲ ^ｙであり、ここで、Ｒ ^ｘおよびＲ ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む切断可能なリンカーを含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３１５）
Ｘが、酸素である、項目３１４に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３１６）
Ｘが、硫黄である、項目３１４に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３１７）
Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、項目３１４に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３１８）
架橋剤をさらに含む、項目３０５から３１７までのいずれか一項に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３１９）
前記架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰまたは８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、項目３１８に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３２０）
前記架橋剤が、ジスルフィド、アミド、イミン、ヒドラジド、Ｏ－アルキルオキシム、アルキル、アミン、アルコール、トリアゾール、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾールまたはピリダジンを含む、項目３１８に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３２１）
前記架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰまたは８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、項目３１８に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３２２）
架橋剤を含むヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、前記架橋剤が、ジスルフィド、アミド、イミン、ヒドラジド、Ｏ－アルキルオキシム、アルキル、アミン、アルコール、トリアゾール、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾールまたはピリダジンを含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３２３）
架橋剤を含むヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、前記架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰまたは８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（項目３２４）
項目１から１２２まで、３０３もしくは３０４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、項目１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡまたは項目１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を含む細胞。
（項目３２５）
幹細胞である、項目３２０に記載の細胞。
（項目３２６）
免疫細胞である、項目３２０に記載の細胞。
（項目３２７）
前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、項目３２５に記載の細胞。
（項目３２８）
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、項目３２６に記載の細胞。
（項目３２９）
前記免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である、項目３２６に記載の細胞。
（項目３３０）
次式：

（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ ^ｘＲ ^ｙであり、ここで、Ｒ ^ｘおよびＲ ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む化合物。
（項目３３１）
Ｘが、酸素である、項目３３０に記載の化合物。
（項目３３２）
Ｘが、硫黄である、項目３３０に記載の化合物。
（項目３３３）
Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、項目３３０に記載の化合物。
（項目３３４）
式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ ^ｘＲ ^ｙであり、ここで、Ｒ ^ｘおよびＲ ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
ただし、ＸがＯであり、Ｒ ^３がジアルキルアミノである場合には、ｍは２から１０までの整数であり；
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む化合物。
（項目３３５）
Ｘが、酸素である、項目３３４に記載の化合物。
（項目３３６）
Ｘが、硫黄である、項目３３４に記載の化合物。
（項目３３７）
Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、項目３３４に記載の化合物
（項目３３８）
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ ^３ａおよびＲ ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、酸素である）
によって表される、項目３３４に記載の化合物。
（項目３３９）
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ ^３ａおよびＲ ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、硫黄である）
によって表される、項目３３４に記載の化合物。
（項目３４０）
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^４、およびＲ ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ ^３ａおよびＲ ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、およびＲ ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ ^１、Ｒ ^２、Ｒ ^３ａ、Ｒ ^３ｂ、Ｒ ^４、およびＲ ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ _５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、＝Ｃ（ＣＮ）２である）
によって表される、項目３３４に記載の化合物。
（項目３４１）
項目１から１２９まで、３０３もしくは３０４までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、項目１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡ、項目１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、項目３２４から３２９までのいずれか一項に記載の細胞、または項目３３０から３４０までのいずれか一項に記載の化合物のうちの１つまたは複数を含む医薬製剤。
（項目３４２）
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目３４１に記載の医薬製剤。
（項目３４３）
項目３４１または３４２に記載の医薬製剤を対象に投与するステップを含む方法。
（項目３４４）
前記対象が、哺乳動物である、項目３４３に記載の方法。
（項目３４５）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目３４４に記載の方法。
（項目３４６）
項目１から１２９まで、３０３または３０４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、項目１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡまたは項目１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を細胞に導入するステップを含む方法。
（項目３４７）
前記細胞が、幹細胞である、項目３４６に記載の方法。
（項目３４８）
前記細胞が、免疫細胞である、項目３４６に記載の方法。
（項目３４９）
前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、項目３４７に記載の方法。
（項目３５０）
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、項目３４８に記載の方法。
（項目３５１）
前記免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である、項目３４８に記載の方法。
（項目３５２）
核酸分子を編集する方法であって、項目１から１２９まで、３０３または３０４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体を核酸分子と接触させるステップを含む方法。
（項目３５３）
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、切断事象の２％未満のオフターゲット切断活性を含む、項目３５２に記載の方法。
（項目３５４）
核酸分子を編集する方法であって、前記核酸分子をＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質および項目１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡまたは項目１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数と接触させるステップを含む方法。
（項目３５５）
１つまたは複数の細胞内の標的遺伝子を編集する方法であって、項目１から１２９まで、３０３または３０４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体を、標的遺伝子を含む前記１つまたは複数の細胞に投与し、それにより、編集された標的遺伝子を含む１つまたは複数の細胞を生成するステップを含む方法。
（項目３５６）
１つまたは複数の細胞内の標的遺伝子を編集する方法であって、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび項目１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡまたは項目１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を、標的遺伝子を含む前記１つまたは複数の細胞に投与し、それにより、編集された標的遺伝子を含む１つまたは複数の細胞を生成するステップを含み、編集された標的遺伝子を含む前記細胞の９９％が、投与後に生存可能なままである、方法。
（項目３５７）
編集された標的遺伝子を含む前記細胞の９９％が、投与後に生存可能なままである、項目３５５または３５６に記載の方法。
（項目３５８）
レサズリンアッセイによって細胞生存率を測定するステップをさらに含む、項目３５７に記載の方法。
（項目３５９）
ＣＲＩＳＰＲ複合体を作製する方法であって、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を架橋するステップを含み、前記架橋が、前記ｇＲＮＡの標的結合性領域の外側のヌクレオチドにおいて生じ、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ活性が架橋後も維持される、方法。
（項目３６０）
前記架橋が溶液中で生じ、前記溶液中の前記ｇＲＮＡと前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の比が少なくとも９：１である、項目３５９に記載の方法。
（項目３６１）
前記架橋するステップが、前記溶液を紫外線（ＵＶ）に曝露することを含む、項目３６０に記載の方法。
（項目３６２）
前記架橋するステップが、前記ｇＲＮＡと前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を混合すると生じる、項目３５９から３６１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３６３）
項目２０２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを切断する方法であって、前記ポリヌクレオチドを切断因子に曝露させ、それにより、前記切断可能なリンカーを切断するステップを含む方法。
（項目３６４）
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質および項目２０２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを導入するステップと、
前記ポリヌクレオチドを切断因子に曝露させ、それにより、前記切断可能なリンカーを切断するステップと
を含む方法。
（項目３６５）
前記ポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成している、項目３６３または３６４に記載の方法。
（項目３６６）
前記切断因子が、紫外線（ＵＶ）である、項目３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３６７）
前記切断因子が、１００ｎｍ～４００ｎｍの範囲内の波長の光である、項目３６６に記載の方法。
（項目３６８）
前記切断因子が、可視光線である、項目３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３６９）
前記切断因子が、４００ｎｍ～７００ｎｍの波長の光である、項目３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３７０）
前記切断因子が、緑色光である、項目３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３７１）
前記切断因子が、紫色光である、項目３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３７２）
前記切断因子が、青色光である、項目３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３７３）
前記切断因子が、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光である、項目３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３７４）
前記切断因子が、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光である、項目３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３７５）
前記切断因子が、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光である、項目３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３７６）
前記切断因子が、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光である、項目３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３７７）
前記曝露により、ポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の標的特異的切断活性が増大する、項目３６３から３７１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３７８）
前記ポリヌクレオチドが、細胞内に存在しない、項目３６３から３７３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３７９）
前記ポリヌクレオチドが、細胞内に存在する、項目３６３から３７３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３８０）
前記細胞が、幹細胞である、項目３７９に記載の方法。
（項目３８１）
前記細胞が、免疫細胞である、項目３７９に記載の方法。
（項目３８２）
前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、項目３８０に記載の方法。
（項目３８３）
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、項目３８１に記載の方法。
（項目３８４）
前記免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である、項目３８１に記載の方法。
（項目３８５）
項目１から１２９まで、３０３もしくは３０４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、項目１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡ、項目１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、項目３２４から３２９までのいずれか一項に記載の細胞、項目３３０から３４０までのいずれか一項に記載の化合物、または項目３４１もしくは３４２に記載の医薬製剤のうちの１つまたは複数を含む系。
（項目３８６）
項目１から１２９、３０３もしくは３０４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、項目１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡ、項目１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、項目３２４から３２９までのいずれか一項に記載の細胞、項目３３０から３４０までのいずれか一項に記載の化合物、項目３４１もしくは３４２に記載の医薬製剤、または項目３８５に記載の系のうちの１つまたは複数を含むキット。
（項目３８７）
項目３４３から３８４までのいずれか一項に記載の方法を実行するための説明書をさらに含む、項目３８６に記載のキット。

Claims

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）内のヌクレオチドでＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に架橋した前記ｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、前記ｇＲＮＡが、標的結合性領域およびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域を含み、前記ヌクレオチドが、前記ｇＲＮＡの標的結合性領域の外側に存在する、ＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ヌクレオチドが、ウラシルを含む、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ｇＲＮＡが、標的結合性領域を含むｃｒＲＮＡ領域とｔｒａｃｒＲＮＡ領域とを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり、前記ヌクレオチドが前記ｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の外側に存在する、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ヌクレオチドが前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド４９位に存在し、ヌクレオチド１位が前記ｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、請求項３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ヌクレオチドが、前記ｓｇＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチド位：２２、２３、２４、２５、３１、３７、４４、４９、４５、５０、５６、５９、６３、６４、６６、７１、７２、７７、７８、８０、８４、９０または９４に存在し、ヌクレオチド１位が、前記ｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、請求項３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ヌクレオチドが、非天然ヌクレオチドである、請求項５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記非天然ヌクレオチドが、糖の修飾を含む、請求項６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記非天然ヌクレオチドが、塩基の修飾を含む、請求項６または７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記非天然ヌクレオチドが、マレイミドを含む、請求項６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記マレイミドが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインに共有結合により連結している、請求項９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ｇＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋剤を介して架橋しており、前記架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰ、または８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、請求項６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ｇＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋剤を介して架橋しており、前記架橋剤が、ジスルフィド、アミド、イミン、ヒドラジド、Ｏ－アルキルオキシム、アルキル、アミン、アルコール、トリアゾール、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾールまたはピリダジンを含む、請求項６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ヌクレオチドが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のステムループ内に存在する、請求項１２に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ステムループの構造が、前記ヌクレオチドを欠くｓｇＲＮＡのステムループの構造と比べて維持されている、請求項１３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ヌクレオチドが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のバルジ内に存在する、請求項１４に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記バルジの構造が、前記ヌクレオチドを欠くｓｇＲＮＡのバルジの構造と比べて維持されている、請求項１５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ヌクレオチドが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ領域のステムループ間に存在する、請求項１６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、ヌクレアーゼ活性を含む、請求項１７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲットヌクレアーゼ活性が、架橋していない前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と前記ｇＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲットヌクレアーゼ活性と等しいまたはそれよりも低い、請求項１８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ヌクレオチドが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインに対して２０オングストローム以内に存在する、請求項１９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ヌクレオチドが、４－チオウリジンまたは修飾アデノシンではない、請求項２０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のヌクレオチド４９位のヌクレオチドでＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に架橋した前記ｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体であって、前記ｓｇＲＮＡが、標的結合性領域を含むｃｒＲＮＡ領域とｔｒａｃｒＲＮＡ領域とを含み、前記ヌクレオチド１位がｃｒＲＮＡの標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、ＣＲＩＳＰＲ複合体。
ヌクレオチド４９位のヌクレオチドが、ウラシルを含む、請求項２２に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
ヌクレアーゼ活性を含む、請求項２３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性をモジュレートするように構成された配列をさらに含む、請求項１から２４までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ｇＲＮＡが、切断可能なリンカーを含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを含む、請求項２５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドを含む、請求項２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した配列エレメントを含み、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、請求項２６または２７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントが、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、請求項２８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントが、少なくとも２０ヌクレオチドを含む、請求項２９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントが、２４ヌクレオチドを含む、請求項３０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントが、ＲＮＡ配列を含む、請求項３１に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＲＮＡ配列が、修飾されたＲＮＡ塩基を含む、請求項３２に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記修飾されたＲＮＡ塩基が、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基である、請求項３３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントが、ループを含むステムループを形成する、請求項３４に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ループが、少なくとも２ヌクレオチドを含む、請求項３５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ループが、少なくとも３ヌクレオチドを含む、請求項３６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ループが、４ヌクレオチドを含む、請求項３７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列に対する塩基対を含む、請求項３８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域に対する塩基対を含む、請求項３９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１０ヌクレオチドと塩基対合する、請求項４０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１５ヌクレオチドと塩基対合する、請求項４０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の２０ヌクレオチドと塩基対合する、請求項４０に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列に対する塩基対を含まない、請求項３５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの最も５’側の塩基が、前記ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングする、請求項４４に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメント内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２９から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメント内に少なくとも２つの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２９から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメント内に少なくとも３つの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２９から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメント内に少なくとも４つの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２９から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメント内に少なくとも５個またはそれよりも多く、７個またはそれよりも多く、１０個またはそれよりも多く、１５個またはそれよりも多く、または２０個またはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２９から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントのループ内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、請求項３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントのループ内に２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントのループ内に３つの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、請求項３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに３つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに４つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項３５から４５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１１位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位、１６位、２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの２４位に切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに第１の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに第２の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１６位に第４の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１１位に第５の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１４位に第４の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項４６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記配列エレメントが、２４ヌクレオチド長であり、前記配列エレメントのループが、前記ガイド配列の標的結合性領域と塩基対合する前記配列エレメントの２１位から２４位までのヌクレオチドおよび１位から２０位までのヌクレオチドを含む、請求項５８から６５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドが、ガイド配列の最も５’側のヌクレオチドの３’側に切断可能なリンカーを含み、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、請求項２６または２７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチドの３’末端には存在せず、前記ポリヌクレオチドが、前記ガイド配列と、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域を含む配列とを前記ポリヌクレオチドの５’末端から３’末端までの順序で含む、請求項６７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項６８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ポリヌクレオチドが、第１の切断可能なリンカーおよび第２の切断可能なリンカーを含み、前記第１の切断可能なリンカーが、ヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けられており、前記第２の切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項６８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、前記切断可能なリンカーが、前記ネクサスのループ内または前記ステムループ１のループ内に存在する、請求項６８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合。
前記ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、前記切断可能なリンカーが、前記ネクサスのループ内および前記ステムループ１のループ内に存在する、請求項６８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、感光性である、請求項６８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、紫外線（ＵＶ）によって切断される、請求項７３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、１００ｎｍ～４００ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項７４に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、可視光線によって切断される、請求項７３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～７００ｎｍの波長の光によって切断される、請求項７３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、緑色光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、緑色光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド内の切断可能なリンカーが、前記ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド内の切断可能なリンカーよりも長い波長の光によって切断される、請求項７６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが緑色光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが紫色光によって切断される、請求項９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが緑色光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが青色光によって切断される、請求項９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項９３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、ホスホロアミダイト誘導体である、請求項２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト誘導体である、請求項２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）－３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト誘導体である、請求項２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、リン酸ジエステルを含む、請求項２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、ホスホモノエステルを含む、請求項２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、クマリン誘導体である、請求項２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、次式：

（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む、請求項２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
Ｘが酸素である、請求項１０５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
Ｘが硫黄である、請求項１０５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
Ｘが＝Ｃ（ＣＮ）２である、請求項１０５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記切断可能なリンカーが、式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
ただし、ＸがＯであり、Ｒ^３がジアルキルアミノである場合には、ｍは２から１０までの整数であり；
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む、請求項２６に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
Ｘが酸素である、請求項１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
Ｘが硫黄である、請求項１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
Ｘが＝Ｃ（ＣＮ）２である、請求項１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、Ｘは、酸素である）
によって表される、請求項１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、硫黄である）
によって表される、請求項１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、＝Ｃ（ＣＮ）２である）
によって表される、請求項１０９に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、Ｃ_１～６アルキルである、
請求項１１３から１１５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれＨであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、それぞれエチルである、
請求項１１３から１１５までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、第１の架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され、第１の架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲット核酸分子に対する編集活性が、架橋していない前記ｇＲＮＡと前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い、請求項１から１１７までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記編集活性が、編集されるオフターゲット核酸分子のパーセンテージとして測定される、請求項１１８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記編集活性が、編集される標的核酸分子のパーセンテージとして測定される、請求項１１８に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体による前記オフターゲット核酸分子に対する編集活性が、前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の編集活性よりも低く、ｐ値≦０．０００１である、請求項１１８から１２０までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の前記標的核酸分子に対する編集活性と前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の前記標的核酸分子に対する編集活性が５％以内である、請求項１１８から１２１までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である、請求項１から１２２までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項１２３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である、請求項１から１２２までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈまたはＣａｓ１２ｉポリペプチドである、請求項１２５に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である、請求項１から１２２までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄポリペプチドである、請求項１２７に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、またはＣａｓ１４ｃポリペプチドである、請求項１から１２２までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
ｃｒＲＮＡ領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域およびヌクレオチド４９位のヌクレオチドを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、ヌクレオチド１位が、前記ｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、ｓｇＲＮＡ。
ｃｒＲＮＡ領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域およびヌクレオチド４９位のウラシルを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、ヌクレオチド１位が、前記ｃｒＲＮＡ領域の標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ｓｇＲＮＡのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、ｓｇＲＮＡ。
（ｉ）標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含むガイド配列と、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合するように構成されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域を含む配列と、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するように構成されたヌクレオチドであって、前記ガイド配列の標的結合性領域の外側に存在する、ヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド。
前記ヌクレオチドが、ウラシルを含む、請求項１３２に記載のポリヌクレオチド。
前記ヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド４９位に存在し、ヌクレオチド１位が、前記ガイド配列の標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、請求項１３２または１３３に記載のポリヌクレオチド。
前記ヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチド位：２２、２３、２４、２５、３１、３７、４４、４９、４５、５０、５６、５９、６３、６４、６６、７１、７２、７７、７８、８０、８４、９０、および９４に存在し、ヌクレオチド１位が、前記ガイド配列の前記標的結合性領域の５’末端に存在し、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド位に、ヌクレオチド１位から、５’から３’まで連続的に番号が付されている、請求項１３２から１３４までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ヌクレオチドが、非天然ヌクレオチドである、請求項１３２から１３５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記非天然ヌクレオチドが、糖の修飾を含む、請求項１３６に記載のポリヌクレオチド。
前記非天然ヌクレオチドが、塩基の修飾を含む、請求項１３６または１３７に記載のポリヌクレオチド。
前記非天然ヌクレオチドが、マレイミドを含む、請求項１３６に記載のポリヌクレオチド。
前記マレイミドが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインと共有結合により連結している、請求項１３９に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋剤を介して架橋しており、前記架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰ、または８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、請求項１３２から１４０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋剤を介して架橋しており、前記架橋剤が、ジスルフィド、アミド、イミン、ヒドラジド、Ｏ－アルキルオキシム、アルキル、アミン、アルコール、トリアゾール、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾールまたはピリダジンを含む、請求項１３２から１４０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記（ｉｉ）の配列が、５’から３まで、テトラループ、ネクサス、第１のステムループおよび第２のステムループを形成する、請求項１３２から１４２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
第３のステムループを含まない、請求項１３２または１４２に記載のポリヌクレオチド。
ポリヌクレオチドの５’末端にはステムループを含まない、請求項１３２から１４４までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ヌクレオチドが、ステムループ内に存在する、請求項１４２から１４５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ステムループの構造が、前記ヌクレオチドを欠くポリヌクレオチドのステムループの構造と比べて維持されている、請求項１４６に記載のポリヌクレオチド。
前記ヌクレオチドが、前記テトラループ内に存在する、請求項１４２から１４７までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記テトラループの構造が、前記ヌクレオチドを欠くポリヌクレオチドのテトラループの構造と比べて維持されている、請求項１４８に記載のポリヌクレオチド。
前記テトラループが、バルジを含む、請求項１４８または１４９に記載のポリヌクレオチド。
前記ヌクレオチドが、前記バルジ内に存在する、請求項１５０に記載のポリヌクレオチド。
前記バルジの構造が、前記ヌクレオチドを欠くポリヌクレオチドのバルジの構造と比べて維持されている、請求項１５１に記載のポリヌクレオチド。
前記ヌクレオチドが、ステムループ間に存在する、請求項１４２から１５２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ヌクレオチドが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のシステインに対して２０オングストローム以内に存在する、請求項１３２から１５３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ヌクレオチドが、４－チオウリジンまたは修飾アデノシンではない、請求項１３２から１５４までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋するように構成されたヌクレオチドを少なくとも２つ含む、請求項１３２から１５５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性をモジュレートするように構成された配列をさらに含む、請求項１３２から１５６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
切断可能なリンカーを含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドまたはＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドを含む、請求項１５７に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドおよびＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドを含む、請求項１５８に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、前記ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した配列エレメントを含む、請求項１５８または１５９に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、ガイド配列の５’末端と共有結合により連結した配列エレメントを含み、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、請求項１５８または１５９に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結している、請求項１５８または１５９に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドが、１つまたは複数の切断可能なリンカーを含む配列エレメントを含み、前記配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結しておらず、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、請求項１５８または１５９に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、請求項１６０から１６６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、少なくとも２０ヌクレオチドを含む、請求項１６０から１６６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、２４ヌクレオチドを含む、請求項１６０から１６５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、ＲＮＡ配列を含む、請求項１６０から１６６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ＲＮＡ配列が、修飾されたＲＮＡ塩基を含む、請求項１６７に記載のポリヌクレオチド。
前記修飾されたＲＮＡ塩基が、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基である、請求項１６８に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、ループを含むステムループを形成する、請求項１６０から１６９までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ループが、少なくとも２ヌクレオチドを含む、請求項１７０に記載のポリヌクレオチド。
前記ループが、少なくとも３ヌクレオチドを含む、請求項１７０または１７１に記載のポリヌクレオチド。
前記ループが、４ヌクレオチドを含む、請求項１７０から１７２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列に対する塩基対を含む、請求項１７０から１７３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域に対する塩基対を含む、請求項１７４に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１０ヌクレオチドと塩基対合する、請求項１７５に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１５ヌクレオチドと塩基対合する、請求項１７５に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の２０ヌクレオチドと塩基対合する、請求項１７５に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列に対する塩基対を含まない、請求項１７０から１７３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントの最も５’側の塩基が、前記ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングする、請求項１７９に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメント内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、請求項１６０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメント内に少なくとも２つの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項１６０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメント内に少なくとも３つの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項１６０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメント内に少なくとも４つの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項１６０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメント内に少なくとも５個またはそれよりも多く、７個またはそれよりも多く、１０個またはそれよりも多く、１５個またはそれよりも多く、または２０個またはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項１６０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントのループ内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、請求項１７０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントのループ内に２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項１７０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントのループ内に３つの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項１７０から１８０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、請求項１７０から１８０までまたは１８６から１８８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項１７０から１８０までまたは１８６から１８８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに３つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項１７０から１８０までまたは１８６から１８８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに４つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項１７０から１８０までまたは１８６から１８８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１１位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１８１に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位、１６位、２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１８１に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１８１に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに第１の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに第２の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１８１に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１８１に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１８１に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１６位に第４の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１１位に第５の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１８１に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１４位に第４の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１８１に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、２４ヌクレオチド長であり、前記配列エレメントのループが前記ガイド配列の標的結合性領域と塩基対合する前記配列エレメントの２１位から２４位までのヌクレオチドおよび１位から２０位までのヌクレオチドを含む、請求項１９３から２００までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した配列エレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド。
ガイド配列の５’末端と共有結合により連結した配列エレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドであって、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結している、請求項２０３に記載のポリヌクレオチド。
１つまたは複数の切断可能なリンカーを含む配列エレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドであって、前記配列エレメントが、ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結しておらず、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、ＲＮＡ配列を含む、請求項１９９から２０５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ＲＮＡ配列が、修飾されたＲＮＡ塩基を含む、請求項２０６に記載のポリヌクレオチド。
ガイド配列の５’末端と切断可能なリンカーを介して共有結合により連結した配列エレメントを含むＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドであって、前記ガイド配列が、標的核酸分子内の標的配列とアニーリングするように構成された標的結合性領域を含み、前記配列エレメントが、修飾されたＲＮＡ塩基を含む、ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド。
前記修飾されたＲＮＡ塩基が、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基である、請求項２０７または２０８に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、請求項２０２から２０９までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、少なくとも２０ヌクレオチドを含む、請求項２０２から２１０までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、２４ヌクレオチドを含む、請求項２０２から２１１までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、ループを含むステムループを形成する、請求項２０２から２１２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ループが、少なくとも２ヌクレオチドを含む、請求項２１３に記載のポリヌクレオチド。
前記ループが、少なくとも３ヌクレオチドを含む、請求項２１３または２１４に記載のポリヌクレオチド。
前記ループが、４ヌクレオチドを含む、請求項２１３から２１５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列に対する塩基対を含む、請求項２１３から２１６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域に対する塩基対を含む、請求項２１７に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１０ヌクレオチドと塩基対合する、請求項２１８に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の少なくとも１５ヌクレオチドと塩基対合する、請求項２１８に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列の標的結合性領域内の２０ヌクレオチドと塩基対合する、請求項２１８に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、前記ガイド配列に対する塩基対を含まない、請求項２１３から２１６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントの最も５’側の塩基が、前記ガイド配列のすぐ５’側の配列エレメント内の塩基とアニーリングする、請求項２２２に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメント内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメント内に少なくとも２つの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメント内に少なくとも３つの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメント内に少なくとも４つの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメント内に少なくとも５個またはそれよりも多く、７個またはそれよりも多く、１０個またはそれよりも多く、１５個またはそれよりも多く、または２０個またはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントのループ内に１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントのループ内に２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントのループ内に３つの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２０２から２２３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに１つまたは複数の切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２０２から２２３までまたは２２９から２３１までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに２つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２０２から２２３までまたは２２９から２３２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに３つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２０２から２２３までまたは２２９から２３２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントの中央の位置に位置するヌクレオチドに４つまたはそれよりも多くの切断可能なリンカーをさらに含む、請求項２０２から２２３までまたは２２９から２３２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１１位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項２２４に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位、１６位、２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項２２４に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項２２４に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２１位、２２位または２３位のうちのいずれか１つに第１の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５位、６位、１０位、１１位、１４位、１５位または１６位のうちのいずれか１つに第２の１つまたは複数の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項２２４に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項２２４に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの３位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項２２４に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１６位に第４の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１１位に第５の切断可能なリンカーを含み、配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項２２４に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記配列エレメントの２４位に第１の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの２３位に第２の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの６位に第３の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの１４位に第４の切断可能なリンカーを含み、前記配列エレメントの５’末端のヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記配列エレメントの５’末端から前記配列エレメントの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項２２４に記載のポリヌクレオチド。
前記配列エレメントが、２４ヌクレオチド長であり、前記配列エレメントのループが、前記ガイド配列の標的結合性領域と塩基対合する前記配列エレメントの２１位から２４位までのヌクレオチドおよび１位から２０位までのヌクレオチドを含む、請求項２３６から２４３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ガイド配列の最も５’側のヌクレオチドの３’側に切断可能なリンカーを含むＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチドの３’末端には存在しない、請求項２４５に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質結合性領域内に位置付けられた、請求項１５８から２４６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド５６または７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１５８から２４７までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、第１の切断可能なリンカーおよび第２の切断可能なリンカーを含み、前記第１の切断可能なリンカーが、ヌクレオチド５６のすぐ３’側に位置付けられており、前記第２の切断可能なリンカーが、前記ポリヌクレオチド内のヌクレオチド７３のすぐ３’側に位置付けられており、前記ガイド配列の５’末端に存在するヌクレオチドがヌクレオチド１であり、ヌクレオチドに、前記ガイド配列の５’末端から前記ポリヌクレオチドの３’末端までの順序で番号が付されている、請求項１５８から２４８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、前記切断可能なリンカーが、前記ネクサスのループ内または前記ステムループ１のループ内に存在する、請求項１５８から２４９までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、５’から３’までに、テトラループ、ネクサス、ステムループ１およびステムループ２を含み、前記切断可能なリンカーが、前記ネクサスのループ内および前記ステムループ１のループ内に存在する、請求項１５８から２４９までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
請求項２０２から２４４までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドおよび請求項２４５から２５１までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、感光性である、請求項１５８から２５２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、紫外線（ＵＶ）によって切断される、請求項２５３に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、１００ｎｍ～４００ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２５４に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、可視光線によって切断される、請求項２５３に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～７００ｎｍの波長の光によって切断される、請求項２５３に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、緑色光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、緑色光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチド内の切断可能なリンカーが、前記ＣＲＩＳＰＲオン／オフポリヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチド内の切断可能なリンカーよりも長い波長の光によって切断される、請求項２５６に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２６８に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２６８に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光によって切断される、請求項２６８に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、緑色光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、紫色光によって切断される、請求項２６８に記載のポリヌクレオチド。
前記ＣＲＩＳＰＲオンポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、緑色光によって切断され、前記ＣＲＩＳＰＲオフポリヌクレオチドの切断可能なリンカーが、青色光によって切断される、請求項２６８に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、ホスホロアミダイト誘導体である、請求項１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト誘導体である、請求項１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、１－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）－３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－プロパン－１－イル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト誘導体である、請求項１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、リン酸ジエステルを含む、請求項１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、ホスホモノエステルを含む、請求項１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、クマリン誘導体である、請求項１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、次式：

（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む、請求項１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
Ｘが、酸素である、請求項２８５に記載のポリヌクレオチド。
Ｘが、硫黄である、請求項２８５に記載のポリヌクレオチド。
Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、請求項２８５に記載のポリヌクレオチド。
前記切断可能なリンカーが、式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
ただし、ＸがＯであり、Ｒ^３がジアルキルアミノである場合には、ｍは２から１０までの整数であり；
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む、請求項１５８から２７８までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
Ｘが、酸素である、請求項２８９に記載のポリヌクレオチド。
Ｘが、硫黄である、請求項２８９に記載のポリヌクレオチド。
Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、請求項２８９に記載のポリヌクレオチド。
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、酸素である）
によって表される、請求項２８９に記載のポリヌクレオチド。
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、硫黄である）
によって表される、請求項２８９に記載のポリヌクレオチド。
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、＝Ｃ（ＣＮ）２である）
によって表される、請求項２８９に記載のポリヌクレオチド。
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、Ｃ_１～６アルキルである、
請求項２９３から２９５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれＨであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、それぞれエチルである、
請求項２９３から２９５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成した場合に、第１の架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され、第１の架橋したＣＲＩＳＰＲ複合体のオフターゲット核酸分子に対する編集活性が、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と架橋していない前記ポリヌクレオチドを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体よりも低い、請求項１３２から２９７までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記編集活性が、編集されるオフターゲット核酸分子のパーセンテージとして測定される、請求項２９８に記載のポリヌクレオチド。
前記編集活性が、編集される標的核酸分子のパーセンテージとして測定される、請求項２９８に記載のポリヌクレオチド。
前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体による前記オフターゲット核酸分子に対する編集活性が、前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の編集活性よりも低く、ｐ値≦０．０００１である、請求項２９８から３００までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の前記標的核酸分子に対する編集活性と前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の前記標的核酸分子に対する編集活性が５％以内である、請求項２９８から３０１までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
請求項１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ複合体。
ヌクレアーゼ活性を含む、請求項３０３に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体。
式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
ただし、ＸがＯであり、Ｒ^３がジアルキルアミノである場合には、ｍは２から１０までの整数であり；
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
の構造を含む切断可能なリンカーを含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
Ｘが、酸素である、請求項３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
Ｘが、硫黄である、請求項３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、請求項３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、酸素である）
によって表される、請求項３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、硫黄である）
によって表される、請求項３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され；
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、＝Ｃ（ＣＮ）２である）
によって表される、請求項３０５に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、Ｃ_１～６アルキルである、
請求項３０９から３１１までのいずれか一項に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれＨであり、
Ｒ^３ａ、およびＲ^３ｂが、それぞれエチルである、
請求項３０９から３１１までのいずれか一項に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
次式：

（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む切断可能なリンカーを含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
Ｘが、酸素である、請求項３１４に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
Ｘが、硫黄である、請求項３１４に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、請求項３１４に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
架橋剤をさらに含む、請求項３０５から３１７までのいずれか一項に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
前記架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰまたは８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、請求項３１８に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
前記架橋剤が、ジスルフィド、アミド、イミン、ヒドラジド、Ｏ－アルキルオキシム、アルキル、アミン、アルコール、トリアゾール、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾールまたはピリダジンを含む、請求項３１８に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
前記架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰまたは８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、請求項３１８に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
架橋剤を含むヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、前記架橋剤が、ジスルフィド、アミド、イミン、ヒドラジド、Ｏ－アルキルオキシム、アルキル、アミン、アルコール、トリアゾール、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、イソオキサゾールまたはピリダジンを含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
架橋剤を含むヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、前記架橋剤が、ピリジルジスルフィド、アルコキシアミン、ＮＨＳエステル、ジアザリン、イミドエステル、ハロアセチル基、ヒドラジド、アリールアジド、イソシアネート、ジチオールホスホロアミダイトＤＴＰＡ、４－チオ－ＵＴＰ、５－アジド－ＵＴＰ、５－ブロモ－ＵＴＰ、８－アジド－ＡＴＰ、５－ＡＰＡＳ－ＵＴＰまたは８－Ｎ（３）ＡＭＰを含むか、またはそれらに由来する、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
請求項１から１２２まで、３０３もしくは３０４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、請求項１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡまたは請求項１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を含む細胞。
幹細胞である、請求項３２０に記載の細胞。
免疫細胞である、請求項３２０に記載の細胞。
前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項３２５に記載の細胞。
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項３２６に記載の細胞。
前記免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である、請求項３２６に記載の細胞。
次式：

（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む化合物。
Ｘが、酸素である、請求項３３０に記載の化合物。
Ｘが、硫黄である、請求項３３０に記載の化合物。
Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、請求項３３０に記載の化合物。
式（Ｉ）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
ｍは、１から１０までから選択される整数であり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＣＲ^ｘＲ^ｙであり、ここで、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立に、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいヘテロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノ、アルキルアミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、チオール、アルキルチオ、チオールアルキル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ウレイド、ニトロ、シアノ、スルホニル、スルホ、スルホネート、スルフィノ、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
ただし、ＸがＯであり、Ｒ^３がジアルキルアミノである場合には、ｍは２から１０までの整数であり；
＊は、Ｈまたは第１のヌクレオチドの付着点を示し、
＊＊は、ＯＨまたは第２のヌクレオチドの付着点を示す）
によって表される構造を含む化合物。
Ｘが、酸素である、請求項３３４に記載の化合物。
Ｘが、硫黄である、請求項３３４に記載の化合物。
Ｘが、＝Ｃ（ＣＮ）２である、請求項３３４に記載の化合物
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、酸素である）
によって表される、請求項３３４に記載の化合物。
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、硫黄である）
によって表される、請求項３３４に記載の化合物。
式（Ｉ）の構造が、式（Ｉ’）：

（式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ^３ａおよびＲ^３ｂは、独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されるか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、およびＲ^４のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成するか；
あるいは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３ａ、Ｒ^３ｂ、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの２つまたはそれよりも多くが、それらが付着している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～１０員ヘテロアリール、置換されていてもよい５～１０員ヘテロシクリル、および置換されていてもよいＣ_５～１０の炭素環式化合物から選択される環または環系を形成し、
Ｘは、＝Ｃ（ＣＮ）２である）
によって表される、請求項３３４に記載の化合物。
請求項１から１２９まで、３０３もしくは３０４までのいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、請求項１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡ、請求項１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２４から３２９までのいずれか一項に記載の細胞、または請求項３３０から３４０までのいずれか一項に記載の化合物のうちの１つまたは複数を含む医薬製剤。
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項３４１に記載の医薬製剤。
請求項３４１または３４２に記載の医薬製剤を対象に投与するステップを含む方法。
前記対象が、哺乳動物である、請求項３４３に記載の方法。
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３４４に記載の方法。
請求項１から１２９まで、３０３または３０４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、請求項１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡまたは請求項１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を細胞に導入するステップを含む方法。
前記細胞が、幹細胞である、請求項３４６に記載の方法。
前記細胞が、免疫細胞である、請求項３４６に記載の方法。
前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項３４７に記載の方法。
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項３４８に記載の方法。
前記免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である、請求項３４８に記載の方法。
核酸分子を編集する方法であって、請求項１から１２９まで、３０３または３０４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体を核酸分子と接触させるステップを含む方法。
前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、切断事象の２％未満のオフターゲット切断活性を含む、請求項３５２に記載の方法。
核酸分子を編集する方法であって、前記核酸分子をＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質および請求項１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡまたは請求項１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数と接触させるステップを含む方法。
１つまたは複数の細胞内の標的遺伝子を編集する方法であって、請求項１から１２９まで、３０３または３０４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体を、標的遺伝子を含む前記１つまたは複数の細胞に投与し、それにより、編集された標的遺伝子を含む１つまたは複数の細胞を生成するステップを含む方法。
１つまたは複数の細胞内の標的遺伝子を編集する方法であって、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび請求項１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡまたは請求項１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を、標的遺伝子を含む前記１つまたは複数の細胞に投与し、それにより、編集された標的遺伝子を含む１つまたは複数の細胞を生成するステップを含み、編集された標的遺伝子を含む前記細胞の９９％が、投与後に生存可能なままである、方法。
編集された標的遺伝子を含む前記細胞の９９％が、投与後に生存可能なままである、請求項３５５または３５６に記載の方法。
レサズリンアッセイによって細胞生存率を測定するステップをさらに含む、請求項３５７に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲ複合体を作製する方法であって、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を架橋するステップを含み、前記架橋が、前記ｇＲＮＡの標的結合性領域の外側のヌクレオチドにおいて生じ、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ活性が架橋後も維持される、方法。
前記架橋が溶液中で生じ、前記溶液中の前記ｇＲＮＡと前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の比が少なくとも９：１である、請求項３５９に記載の方法。
前記架橋するステップが、前記溶液を紫外線（ＵＶ）に曝露することを含む、請求項３６０に記載の方法。
前記架橋するステップが、前記ｇＲＮＡと前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を混合すると生じる、請求項３５９から３６１までのいずれか一項に記載の方法。
請求項２０２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを切断する方法であって、前記ポリヌクレオチドを切断因子に曝露させ、それにより、前記切断可能なリンカーを切断するステップを含む方法。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質および請求項２０２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを導入するステップと、
前記ポリヌクレオチドを切断因子に曝露させ、それにより、前記切断可能なリンカーを切断するステップと
を含む方法。
前記ポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成している、請求項３６３または３６４に記載の方法。
前記切断因子が、紫外線（ＵＶ）である、請求項３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
前記切断因子が、１００ｎｍ～４００ｎｍの範囲内の波長の光である、請求項３６６に記載の方法。
前記切断因子が、可視光線である、請求項３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
前記切断因子が、４００ｎｍ～７００ｎｍの波長の光である、請求項３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
前記切断因子が、緑色光である、請求項３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
前記切断因子が、紫色光である、請求項３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
前記切断因子が、青色光である、請求項３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
前記切断因子が、４９０ｎｍ～５７０ｎｍの範囲内の波長の光である、請求項３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
前記切断因子が、４００ｎｍ～４２０ｎｍの範囲内の波長の光である、請求項３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
前記切断因子が、４２０ｎｍ～４３０ｎｍの範囲内の波長の光である、請求項３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
前記切断因子が、４２０ｎｍ～４４０ｎｍの範囲内の波長の光である、請求項３６３から３６５までのいずれか一項に記載の方法。
前記曝露により、ポリヌクレオチドと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の標的特異的切断活性が増大する、請求項３６３から３７１までのいずれか一項に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、細胞内に存在しない、請求項３６３から３７３までのいずれか一項に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、細胞内に存在する、請求項３６３から３７３までのいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、幹細胞である、請求項３７９に記載の方法。
前記細胞が、免疫細胞である、請求項３７９に記載の方法。
前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項３８０に記載の方法。
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項３８１に記載の方法。
前記免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である、請求項３８１に記載の方法。
請求項１から１２９まで、３０３もしくは３０４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、請求項１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡ、請求項１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２４から３２９までのいずれか一項に記載の細胞、請求項３３０から３４０までのいずれか一項に記載の化合物、または請求項３４１もしくは３４２に記載の医薬製剤のうちの１つまたは複数を含む系。
請求項１から１２９、３０３もしくは３０４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ複合体、請求項１３０もしくは１３１に記載のｓｇＲＮＡ、請求項１３２から３０２までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２４から３２９までのいずれか一項に記載の細胞、請求項３３０から３４０までのいずれか一項に記載の化合物、請求項３４１もしくは３４２に記載の医薬製剤、または請求項３８５に記載の系のうちの１つまたは複数を含むキット。
請求項３４３から３８４までのいずれか一項に記載の方法を実行するための説明書をさらに含む、請求項３８６に記載のキット。