JP2022544573A

JP2022544573A - バチルス・リケニフォルミス（ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における増加したタンパク質産生のための組成物及び方法

Info

Publication number: JP2022544573A
Application number: JP2022509179A
Authority: JP
Inventors: エルフリッシュ、ライアン; フ、ホンシャン
Original assignee: ダニスコ・ユーエス・インク
Priority date: 2019-08-14
Filing date: 2020-08-10
Publication date: 2022-10-19
Anticipated expiration: 2040-08-10
Also published as: CN114630895A; CN114630895B; JP2025072450A; JP7676362B2; US20220282234A1; EP4031560A1; KR20220041928A; WO2021030267A1

Abstract

本開示は、概して、増加したタンパク質産生表現型を有するバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を構築し及び得るための組成物及び方法に関する。従って、所定の他の実施形態は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に関する。所定の実施形態は、改変ｒｇｈＲ遺伝子座を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。所定の実施形態は、改変ｒｇｈＲ遺伝子座を有し、増加したタンパク質産生性表現型を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。所定の他の実施形態では、改変ｒｇｈＲ遺伝子座を有する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、低減した量の赤色顔料を産生する。所定の他の実施形態では、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、増加したタンパク質産生性表現型を含み、低減した量の赤色顔料を産生する。【選択図】図１

Description

本開示は、一般に、細菌学、微生物学、遺伝学、分子生物学、酵素学、工業用タンパク質産生等の分野に関する。より特別には、本開示は、増加したタンパク質産生能力を有するバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株を得るための組成物及び方法に関する。

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０１９年８月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／８８６，５７１号に対する優先権を主張するものである。

配列表の参照
「ＮＢ４１５１４－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０２０年６月２３日に作成されたものであり、サイズは３１６ＫＢであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。

バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等のグラム陽性菌は、それらの優れた発酵特性と高い収率（例えば、培養物１Ｌ当たり最大２５グラム；ＶａｎＤｉｊｌａｎｄＨｅｃｋｅｒ，２０１３）から、工業用関連タンパク質を生産するための微生物工場として頻繁に使用されている。例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、食品、繊維、洗濯、医療機器の洗浄、薬品工業等のために必要なα－アミラーゼ（Ｊｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，２０００；Ｒａｕｌｅｔａｌ．，２０１４）及びプロテアーゼ（Ｂｒｏｄｅｅｔａｌ．，１９９６）を生産することでよく知られている（Ｗｅｓｔｅｒｓｅｔａｌ．，２００４）。これらの非病原性グラム陽性菌は、有害な副生成物を全く含まないタンパク質（例えば、リポ多糖類；内毒素としても公知であるＬＰＳ）を産生するので、欧州食品安全機関（ＥｕｒｏｐｅａｎＦｏｏｄＳａｆｅｔｙＡｕｔｈｏｒｉｔｙ）の「安全性適格推定（ＱｕａｌｉｆｉｅｄＰｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎｏｆＳａｆｅｔｙ）」（ＱＰＳ）の評価を得ており、それらの生成物の多くは、アメリカ食品医薬品局（ＵＳＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）から「安全食品認定（ＧｅｎｅｒａｌｌｙＲｅｃｏｇｎｉｚｅｄＡｓＳａｆｅ）」（ＧＲＡＳ）ステータスの評価を獲得している（Ｏｌｅｍｐｓｋａ－Ｂｅｅｒｅｔａｌ．，２００６；Ｅａｒｌｅｔａｌ．，２００８；Ｃａｓｐｅｒｓｅｔａｌ．，２０１０）。

従って、微生物宿主細胞内でのタンパク質（例えば、酵素、抗体、受容体等）の産生は、バイオテクノロジー分野において特に関心が高い。同様に、関心対象の１種以上のタンパク質を産生及び分泌させるためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の最適化は、特に工業バイオテクノロジーの状況においては高度に重要であり、タンパク質が工業的に大量生産される場合は、タンパク質収量の小さな改善が極めて重要な意味を有する。より特別には、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）は、工業的重要性の高いバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の宿主細胞であるので、従って、強化／増加したタンパク質発現／産生のためにＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞を改変及び操作する能力は、新規及び改善されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）産生株を構築するために高度に望ましい。本開示は、従って、増加したタンパク質産生能力を有するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞）を得て構築するための高度に望ましい、未だ満たされていない必要に関する。

本開示は、概して、増加したタンパク質産生表現型を有するバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（株）を構築且つ得るための組成物及び方法に関する。より特別には、所定の実施形態は、天然ｒｇｈＲ（染色体）遺伝子座を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞が、（ｉ）改変ｒｇｈＲ１遺伝子、（ｉｉ）改変ｒｇｈＲ２遺伝子、（ｉｉｉ）改変ｒｇｈＲ１遺伝子及び改変ｒｇｈＲ２遺伝子、並びに（ｉｖ）改変ｒｇｈＲ１遺伝子、改変ｒｇｈＲ２遺伝子、改変ｙｖｚＣ遺伝子及び改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子から成る群から選択されるｒｇｈＲ遺伝子座の少なくとも１つの改変を含み、改変細胞が、（同一条件下で培養した場合に親細胞と比較して）増加した量の関心タンパク質を産生する改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。

所定の実施形態では、改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、コード化ＲｇｈＲ１タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる、及び／又は改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、ｒｇｈＲ１遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、コード化ＲｇｈＲ１タンパク質を発現又は産生しない。

所定の実施形態では、改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、コード化ＲｇｈＲ２タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる、及び／又は改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、ｒｇｈＲ２遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、コード化ＲｇｈＲ２タンパク質を発現又は産生しない。

所定の実施形態では、改変ｙｖｚＣ遺伝子は、コード化ＹｖｚＣタンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる、及び／又は改変ｙｖｚＣ遺伝子は、ｙｖｚＣ遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、改変ｙｖｚＣ遺伝子は、コード化ＹｖｚＣタンパク質を発現又は産生しない。

所定の実施形態では、改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子は、コード化Ｂｌｉ３６４４タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる、及び／又は改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子は、Ｂｌｉ３６４４遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲを突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子は、コード化Ｂｌｉ３６４４タンパク質を発現又は産生しない。

従って、所定の実施形態では、ｒｇｈＲ遺伝子座の少なくとも１つの遺伝子改変を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、改変ｒｇｈＲ１遺伝子を含む。他の実施形態では、ｒｇｈＲ遺伝子座の少なくとも１つの遺伝子改変を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、改変ｒｇｈＲ２遺伝子を含む。他の実施形態では、ｒｇｈＲ遺伝子座の少なくとも１つの遺伝子改変を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、改変ｒｇｈＲ１遺伝子及び改変ｒｇｈＲ２遺伝子を含む。他の実施形態では、ｒｇｈＲ遺伝子座の少なくとも１つの遺伝子改変を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、改変ｒｇｈＲ１遺伝子、改変ｒｇｈＲ２遺伝子、改変ｙｖｚＣ遺伝子及び改変ｂｌｉ３６４４遺伝子を含む。所定の他の実施形態では、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、欠失ｒｇｈＲ遺伝子座を含む。所定の他の実施形態では、改変細胞は、（同一条件下で培養した場合の親細胞に比較して）低減した量の赤色顔料を産生する。さらに他の実施形態では、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、関心対象のタンパク質をコードする１つ以上の発現カセットを含む。所定の他の実施形態では、１つ以上の発現カセットは、アミラーゼタンパク質をコードする。

他の実施形態では、本開示は、天然ｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞は、ｒｇｈＲ２遺伝子を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる少なくとも１つの遺伝子改変を含み、改変細胞は、（同一条件下で培養した場合に親細胞に比較して）低減した量の赤色顔料を産生する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に関する。所定の実施形態では、細胞は、関心対象のタンパク質をコードする１つ以上の発現カセットを含む。特定の実施形態では、１つ以上の発現カセットは、アミラーゼタンパク質をコードする。所定の他の実施形態では、改変細胞は、（同一条件下で培養した場合に親細胞に比較して）増加した量の関心対象のタンパク質を産生する。

従って、本開示の所定の他の実施形態は、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で増加した量の関心対象のタンパク質を産生するための方法であって、（ａ）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を入手し、及び（ｉ）ｒｇｈＲ１遺伝子、（ｉｉ）ｒｇｈＲ２遺伝子、（ｉｉｉ）ｙｖｚＣ遺伝子及び（ｉｖ）Ｂｌｉ３６４４遺伝子又はそれらの組み合わせから成る群から選択されるｒｇｈＲ遺伝子座の少なくとも１つの遺伝子を遺伝子改変する工程、並びにｂ）関心対象のタンパク質の産生のために好適な条件下で工程（ａ）の改変細胞を発酵させる工程であって、改変細胞が（同一条件下で培養した場合に親細胞に比較して）増加した量の関心対象のタンパク質を産生する工程を含む方法に関する。

本方法の所定の実施形態では、改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、コード化ＲｇｈＲ１タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる、及び／又は改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、ｒｇｈＲ１遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、コード化ＲｇｈＲ１タンパク質を発現しない。

他の実施形態では、改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、コード化ＲｇｈＲ２タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる、及び／又は改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、ｒｇｈＲ２遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、コード化ＲｇｈＲ２タンパク質を発現しない。

別の実施形態では、改変ｙｖｚＣ遺伝子は、コード化ＹｖｚＣタンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる、及び／又は改変ｙｖｚＣ遺伝子は、ｙｖｚＣ遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、改変ｙｖｚＣ遺伝子は、コード化ＹｖｚＣタンパク質を発現しない。

本方法の所定の他の実施形態では、改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子は、コード化Ｂｌｉ３６４４タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる、及び／又は改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子は、Ｂｌｉ３６４４遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲを突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子は、コード化Ｂｌｉ３６４４タンパク質を発現しない。

本方法の別の実施形態では、細胞は、関心対象のタンパク質をコードする１つ以上の発現カセットを含む。所定の他の実施形態では、１つ以上の発現カセットは、アミラーゼタンパク質をコードする。本方法の別の実施形態では、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、低減した量の赤色顔料を産生する。

他の実施形態では、本開示は、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で関心対象のタンパク質を産生するための方法であって、改変細胞は、発酵中に低減した量の赤色顔料を産生し、（ａ）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を入手し、及びその中のｒｇｈＲ２遺伝子を遺伝子改変する工程、並びに（ｂ）関心対象のタンパク質を産生するために好適な条件下で改変細胞を発酵させる工程を含み、改変細胞は、（同一条件下で培養した場合に親細胞に比較して）低減した赤色顔料を産生する方法に関する。所定の他の実施形態では、改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、コード化ＲｇｈＲ２タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全的に欠失させる遺伝子改変を含む。他の実施形態では、細胞は、関心対象のタンパク質をコードする１つ以上の発現カセットを含む。所定の他の実施形態では、１つ以上の発現カセットは、アミラーゼタンパク質をコードする。他の実施形態では、改変細胞は、（同一条件下で培養した場合に親細胞に比較して）増加した量の関心対象のタンパク質を産生する。

Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体「ｒｇｈＲ遺伝子座」の略図であって、野生型ｒｇｈＲ遺伝子座（図１Ａ）は、ｒｇｈＲ１遺伝子（白矢印）、ｒｇｈＲ２遺伝子（黒矢印）、ｙｖｚＣ遺伝子（灰色矢印）及びＢｌｉ３６４４遺伝子（縞模様の矢印）を含む。下記の実施例の部でさらに記載するように、図１Ｂは、ｒｇｈＲ２_ｓｔｏｐ対立遺伝子（終止コドンを指示している３つの星印を示している白色矢印）、天然ｒｇｈＲ１遺伝子（黒色矢印）、天然ｙｖｚＣ遺伝子（灰色矢印）及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子（縞模様の矢印）を含む改変ｒｇｈＲ遺伝子座を示している；図１Ｃは、欠失ｒｇｈＲ１（ΔｒｇｈＲ１）対立遺伝子、天然ｒｇｈＲ２遺伝子（白色矢印）、天然ｙｖｚＣ遺伝子（灰色矢印）及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子（縞模様の矢印）を含む改変ｒｇｈＲ遺伝子座を示している；図１Ｄは、欠失ｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子、天然ｒｇｈＲ１遺伝子（黒色矢印）、天然ｙｖｚＣ遺伝子（灰色矢印）及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子（縞模様の矢印）を含むｒｇｈＲ遺伝子座を示している；図１Ｅは、欠失ｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子、欠失ｒｇｈＲ１（ΔｒｇｈＲ１）対立遺伝子、天然ｙｖｚＣ遺伝子（灰色矢印）及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子（縞模様の矢印）を含む改変ｒｇｈＲ遺伝子座を示している；並びに図１Ｆは、ｒｇｈＲ２、ｒｇｈＲ１、ｙｖｚＣ及びＢｌｉ３６４４対立遺伝子の欠失（ΔｒｇｈＲ２／ΔｒｇｈＲ１／ΔｙｖｚＣ／Δ３６４４）を含む改変（空の）ｒｇｈＲ遺伝子座を示している。

生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号２は、その核酸配列が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主株内での発現のためにコドン最適化されている配列番号１のＣａｓ９タンパク質をコードする核酸である。

配列番号３は、アミノ酸Ｎ末端核局在配列（ＮＬＳ）である。

配列番号４は、アミノ酸Ｃ末端核局在配列（ＮＬＳ）である。

配列番号５は、デカ－ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグアミノ酸配列である。

配列番号６は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター核酸配列である。

配列番号７は、合成ターミネーター核酸配列である。

配列番号８は、フォワードプライマー核酸配列である。

配列番号９は、リバースプライマー核酸配列である。

配列番号１０は、ｐＫＢ３２０骨格核酸配列である。

配列番号１１は、プラスミドｐＫＢ３２０の核酸配列である。

配列番号１２は、フォワードプライマー核酸配列である。

配列番号１３は、リバースプライマー核酸配列である。

配列番号１４は、リバースシーケンシングプライマーである。

配列番号１５は、リバースシーケンシングプライマーである。

配列番号１６は、フォワードシーケンシングプライマーである。

配列番号１７は、フォワードシーケンシングプライマーである。

配列番号１８は、フォワードシーケンシングプライマーである。

配列番号１９は、フォワードシーケンシングプライマーである。

配列番号２０は、フォワードシーケンシングプライマーである。

配列番号２１は、フォワードシーケンシングプライマーである。

配列番号２２は、フォワードシーケンシングプライマーである。

配列番号２３は、リバースシーケンシングプライマーである。

配列番号２４は、フォワードシーケンシングプライマーである。

配列番号２５は、プラスミドｐＲＦ６９４の核酸配列である。

配列番号２６は、プラスミドｐＲＦ８０１の核酸配列である。

配列番号２７は、プラスミドｐＲＦ８０６の核酸配列である。

配列番号２８は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）標的部位１（ＴＳ１）核酸配列である。

配列番号２９は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）標的部位２（ＴＳ２）核酸配列である。

配列番号３０は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｓｅｒＡオープンリーディングフレーム核酸配列である。

配列番号３１は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）標的部位１（ＴＳ１）ＰＡＭ核酸配列である。

配列番号３２は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）可変標的化（ＶＴ）部位１をコードする核酸配列である。

配列番号３３は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインをコードする核酸配列である。

配列番号３４は、部位１を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸配列である。

配列番号３５は、ｓｐａｃプロモーター核酸配列である。

配列番号３６は、ｔ０ターミネーター核酸配列である。

配列番号３７は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｓｅｒＡ１ホモロジーアーム１核酸配列である。

配列番号３８は、合成ｓｅｒＡ１ホモロジーアーム１フォワードプライマー配列である。

配列番号３９は、合成ｓｅｒＡ１ホモロジーアーム１リバースプライマー配列である。

配列番号４０は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｓｅｒＡ１ホモロジーアーム２核酸配列である。

配列番号４１は、合成ｓｅｒＡ１ホモロジーアーム２フォワードプライマー配列である。

配列番号４２は、合成ｓｅｒＡ１ホモロジーアーム２リバースプライマー配列である。

配列番号４３は、標的部位１（ＴＳ１）ｇＲＮＡをコードする発現カセットである。

配列番号４４は、合成ｓｅｒＡ１欠失編集鋳型である。

配列番号４５は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｇｈＲ１オープンリーディングフレーム核酸配列である。

配列番号４６は、標的化部位２（ＴＳ２）ＰＡＭ核酸配列である。

配列番号４７は、可変標的化（ＶＴ）部位２をコードする核酸配列である。

配列番号４８は、部位２を標的化するｇＲＮＡ核酸配列である。

配列番号４９は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ホモロジーアーム１核酸配列である。

配列番号５０は、合成ｒｇｈＲ１ホモロジーアーム１フォワード配列である。

配列番号５１は、合成ｒｇｈＲ１ホモロジーアーム１リバース配列である。

配列番号５２は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｇｈＲ１ホモロジーアーム２核酸配列である。

配列番号５３は、合成ｒｇｈＲ１ホモロジーアーム２フォワード配列である。

配列番号５４は、合成ｒｇｈＲ１ホモロジーアーム２リバース配列である。

配列番号５５は、標的部位２（ＴＳ２）ｇＲＮＡをコードする合成核酸発現カセットである。

配列番号５６は、合成ｒｇｈＲ１欠失変種鋳型配列である。

配列番号５７は、Ｃａｓ９（Ｙ１５５Ｈ）変異タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号５８は、Ｃａｓ９（Ｙ１５５Ｈ）フォワードプライマー配列である。

配列番号５９は、Ｃａｓ９（Ｙ１５５Ｈ）リバースプライマー配列である。

配列番号６０は、プラスミドｐＲＦ８２７の核酸配列である。

配列番号６１は、変異Ｃａｓ９（Ｙ１５５Ｈ）タンパク質をコードする発現カセットである。

配列番号６２は、プラスミドｐＲＦ８５６の核酸配列である。

配列番号６３は、合成Ｃａｓ９（Ｙ１５５Ｈ）断片核酸配列である。

配列番号６４は、Ｃａｓ９（Ｙ１５５Ｈ）断片フォワードプライマー配列である。

配列番号６５は、Ｃａｓ９（Ｙ１５５Ｈ）断片リバースプライマー配列である。

配列番号６６は、プラスミドｐＲＦ６９４の核酸配列である。

配列番号６７は、ｐＲＦ６９４断片核酸配列である。

配列番号６８は、ｐＲＦ６９４断片フォワードプライマー配列である。

配列番号６９は、ｐＲＦ６９４リバースプライマー配列である。

配列番号７０は、プラスミドｐＲＦ８６９の核酸配列である。

配列番号７１は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｇｈＲ２オープンリーディングフレーム核酸配列である。

配列番号７２は、合成ｒｇｈＲ２_ｓｔｏｐ断片核酸配列である。

配列番号７３は、合成ｒｇｈＲ２_ｓｔｏｐ編集鋳型配列である。

配列番号７４は、ｒｇｈＲ２ｇＲＮＡ発現カセットである。

配列番号７５は、合成断片フォワードプライマーである。

配列番号７６は、合成断片リバースプライマーである。

配列番号７７は、ｐＲＦ８６２骨格の核酸配列である。

配列番号７８は、ｐＲＦ８６２骨格フォワードプライマーである。

配列番号７９は、ｐＲＦ８６２骨格リバースプライマーである。

配列番号８０は、プラスミドｐＲＦ８７４の核酸配列である。

配列番号８１は、ｐＲＦ８７４標的部位及びＰＡＭ核酸配列である。

配列番号８２は、ｐＲＦ８７４編集鋳型である。

配列番号８３は、プラスミドｐＲＦ８７９の核酸配列である。

配列番号８４は、ｐＲＦ８７９標的部位及びＰＡＭ核酸配列である。

配列番号８５は、ｐＲＦ８７９編集鋳型である。

配列番号８６は、プラスミドｐＲＦ８９９の核酸配列である。

配列番号８７は、ｐＲＦ８９９及びｐＲＦ９０１標的部位並びにＰＡＭ核酸配列である。

配列番号８８は、ｐＲＦ８９９編集鋳型である。

配列番号８９は、プラスミドｐＲＦ９０１の核酸配列である。

配列番号９０は、ｐＲＦ９０１編集鋳型である。

配列番号９１は、野生型ｒｇｈＲ２遺伝子座核酸配列である。

配列番号９２は、ＬｙｓＡオープンリーディングフレーム核酸配列である。

配列番号９３は、ｓｅｒＡ＿α－アミラーゼ発現カセットである。

配列番号９４は、合成ｐ３プロモーター核酸配列である。

配列番号９５は、ａｐｒＥ５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）核酸配列である。

配列番号９６は、ａｍｙＬシグナル配列をコードする核酸配列である。

配列番号９７は、α－アミラーゼタンパク質をコードする核酸配列である。

配列番号９８は、ａｍｙＬターミネーター配列をコードする核酸配列である。

配列番号９９は、合成ａｍｙＬ＿α－アミラーゼ発現カセットである。

配列番号１００は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター配列である。

配列番号１０１は、ｐＢ１．ｃｏｍＫ核酸配列である。

配列番号１０２は、スペクチノマイシンマーカーをコードする核酸配列である。

配列番号１０３は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｘｙｌＲオープンリーディングフレームである。

配列番号１０４は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｘｙｌＡプロモーター配列である。

配列番号１０５は、ＣｏｍＫタンパク質をコードする核酸配列である。

配列番号１０６は、フォワードプライマー配列である。

配列番号１０７は、リバースプライマー配列である。

配列番号１０８は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｇｈＲ２標的化領域核酸配列である。

配列番号１０９は、合成ｒｇｈＲ２_ｓｔｏｐ核酸配列である。

配列番号１１０は、フォワードプライマー配列である。

配列番号１１１は、フォワードプライマー配列である。

配列番号１１２は、リバースプライマー配列である。

配列番号１１３は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）天然ｒｇｈＲ１配列である。

配列番号１１４は、ｒｇｈＲ１欠失ＰＣＲ産物である。

配列番号１１５は、フォワードプライマー配列である。

配列番号１１６は、リバースプライマー配列である。

配列番号１１７は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）天然ｒｇｈＲ２ＰＣＲ産物である。

配列番号１１８は、ｒｇｈＲ２欠失ＰＣＲ産物である。

配列番号１１９は、フォワードプライマー配列である。

配列番号１２０は、リバースプライマー配列である。

配列番号１２１は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）天然ｒｇｈＲ１ｒｇｈＲ２ＰＣＲ産物である。

配列番号１２２は、ｒｇｈＲ１ｒｇｈＲ２欠失ＰＣＲ産物である。

配列番号１２３は、フォワードプライマー配列である。

配列番号１２４は、リバースプライマー配列である。

配列番号１２５は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）天然遺伝子座ＰＣＲ産物である。

配列番号１２６は、合成遺伝子座欠失ＰＣＲ産物である。

配列番号１２７は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＬＤＮ１４３株ｒｇｈＲ２遺伝子座核酸配列である。

配列番号１２８は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＦ３１４株ｒｇｈＲ２遺伝子座核酸配列である。

配列番号１２９は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＦ３２４株ｒｇｈＲ２遺伝子座核酸配列である。

配列番号１３０は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＦ３７７株ｒｇｈＲ２遺伝子座核酸配列である。

配列番号１３１は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＦ３８９株ｒｇｈＲ２遺伝子座核酸配列である。

配列番号１３２は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＢＦ３９１株ｒｇｈＲ２遺伝子座核酸配列である。

本開示は、概して、増加したタンパク質産生表現型を有するバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（株）を構築且つ得るための組成物及び方法に関する。従って、所定の他の実施形態は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に関する。所定の他の実施形態では、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞、改変ｒｇｈＲ遺伝子座であって、それが由来した親細胞が、野生型ｒｇｈＲ遺伝子座を含む改変ｒｇｈＲ遺伝子座を含む。所定の実施形態では、改変ｒｇｈＲ遺伝子座を有する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、増加したタンパク質産生性表現型を含む。所定の他の実施形態では、改変ｒｇｈＲ遺伝子座を有する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、低減した量の赤色顔料を産生する。所定の他の実施形態では、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、増加したタンパク質産生性表現型を含み、低減した量の赤色顔料を産生する。

Ｉ．定義
本開示の改変バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞及び本明細書に記載したそれらの方法を考慮して、以下の用語及び語句を定義する。本明細書で定義されていない用語には、当該技術分野で通常使用されている意味が与えられるべきである。

他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明の組成物及び方法が属する分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものに類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の組成物及び方法を実施又は試験するためにも使用できるが、以下では例示的な方法及び材料について記載する。本明細書で引用した刊行物及び特許は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

特許請求の範囲が任意選択的な要素を排除するように記載され得ることにもさらに留意されたい。従って、この記述は、特許請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「ただ～のみ（ｏｎｌｙ）」、「～を除いて（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を含まない（ｎｏｔｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の排他的な用語の使用、又はその「否定的な」限定若しくは条件の使用のための先行文として機能することを意図している。

本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載する本組成物及び方法の範囲又は精神から逸脱することなく、他の幾つかの実施形態の何れかの特徴から容易に分離する、又は組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。記載した方法は何れも、記載した事象の順序で、又は論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。

本明細書で使用する「宿主細胞」は、新たに導入されるＤＮＡ配列のための宿主又は発現ビヒクルとして作用する能力を有する細胞を指す。従って、本開示の所定の実施形態では、宿主細胞は、例えば、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。

本明細書で使用する「改変細胞」は、改変細胞がそれに由来する「親」宿主細胞内に存在しない少なくとも１つの遺伝子改変を含む組み換え（宿主）細胞を指す。

例えば、所定の実施形態では、「親」細胞は、その「改変」（娘）細胞を生成するために（例えば、親細胞に導入された１つ以上の遺伝子改変によって）変化させられる。

所定の実施形態では、親細胞は、特に、「改変」バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）（娘）細胞と比較される場合、又はそれに対して、「対照細胞」と称し得る。本明細書で使用するように、「未改変」（親）細胞（例えば、対照細胞）における関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）の発現及び／又は産生が、「改変」（娘）細胞における同一ＰＯＩの発現及び／又は産生と比較される場合、「改変」及び「未改変」細胞は、同一条件（例えば、培地、温度、ｐＨ等の同一条件）下で増殖／培養／発酵されることは理解されるであろう。

本明細書で使用する「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」又は「バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）」細胞には、当業者に知られているように、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」内の全ての種、例えば、以下に限定されないが、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）及びＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が含まれる。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）が分類学的再編成を受け続けていることは認識されている。従って、この属は、再分類された種、例えば、「ゲオバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と現在称されている「Ｂ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」等の生物を含むがそれらに限定されないことが意図されている。

本明細書で使用する用語「野生型」及び「天然」は、互換的に使用され、天然において見出される遺伝子、タンパク質、タンパク質ミックス、細胞又は株を指す。

本明細書で使用する「天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｇｈＲ２遺伝子」は、「天然ＲｇｈＲ２タンパク質」をコードするヌクレオチド配列を含み、及び「変異－１８－ＢＰＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｇｈＲ２遺伝子」は、国際公開第２０１８／１５６７０５号パンフレット（その全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載された「変異ＲｇｈＲ２タンパク質」（ＲｇｈＲ２_ｄｕｐ）をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、変異－１８－ＢＰｒｇｈＲ２遺伝子（以下では、「ｒｇｈＲ２_ｄｕｐ」）は、変異ＲｇｈＲ２タンパク質（以下では、「ＲｇｈＲ２_ｄｕｐ」）をコードするヌクレオチド配列を含み、その変異ＲｇｈＲ２_ｄｕｐは、６つのアミノ酸残基重複／反復を含む（即ち、残基「ＡＡＡＳＩＲ」が重複している）。

本明細書で使用する「天然ｒｇｈＲ１遺伝子」は天然ＲｇｈＲ１タンパク質をコードし、「天然ｒｇｈＲ２遺伝子」は天然ＲｇｈＲ２タンパク質をコードし、「天然ｙｖｚＣ遺伝子」は天然ＹｖｚＣタンパク質をコードし、「天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子」は天然Ｂｌｉ３６４４タンパク質をコードする。

本明細書で使用する「天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（染色体）ｒｇｈＲ遺伝子座」（以下では、「天然ｒｇｈＲ遺伝子座」）は、図１Ａで略図により示したように、「天然ｒｇｈＲ１遺伝子」、「天然ｒｇｈＲ２遺伝子」、「天然ｙｖｚＣ遺伝子」及び「天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子」を含む。

本明細書で使用する「ＬＤＮ１４３」と指定された親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、天然ｒｇｈＲ遺伝子座を含む。

本明細書で使用する「改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（染色体）ｒｇｈＲ遺伝子座」（以下では、「改変ｒｇｈＲ遺伝子座」）は、天然ｒｇｈＲ遺伝子座と比較して、遺伝子（又はそのオープンリーディングフレーム）のｒｇｈＲ１、ｒｇｈＲ２、ｙｖｚＣ及び／又はＢｌｉ３６４４から選択される少なくとも１つの遺伝子改変を含む。所定の実施形態では、改変ｒｇｈＲ遺伝子座を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、天然ｒｇｈＲ遺伝子座を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する。

本明細書で使用する「ＢＦ３１４」と指定された改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞は、図１Ｂに略図により示したように、天然ｒｇｈＲ１遺伝子、改変ｒｇｈＲ２遺伝子（「ｒｇｈＲ_ＳＴＯＰ」と指定された；３個の未熟終止コドンを含む）、天然ｙｖｚＣ遺伝子及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子を含む改変ｒｇｈＲ遺伝子座を含む。

本明細書で使用する「ＢＦ３２４」と指定された改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞は、図１Ｃで略図により示したように、欠失ｒｇｈＲ１遺伝子（ΔｒｇｈＲ１）、天然ｒｇｈＲ２遺伝子、天然ｙｖｚＣ遺伝子及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子を含む改変ｒｇｈＲ遺伝子座を含む。

本明細書で使用する「ＢＦ３７７」と指定された改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞は、図１Ｄに略図により示したように、天然ｒｇｈＲ１遺伝子、欠失ｒｇｈＲ２遺伝子（ΔｒｇｈＲ２）、天然ｙｖｚＣ遺伝子及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子を含む改変ｒｇｈＲ遺伝子座を含む。

本明細書で使用する「ＢＦ３８９」と指定された改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞は、図１Ｅで略図により示したように、欠失ｒｇｈＲ１遺伝子（ΔｒｇｈＲ１）、欠失ｒｇｈＲ２遺伝子（ΔｒｇｈＲ２）、天然ｙｖｚＣ遺伝子及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子を含む改変ｒｇｈＲ遺伝子座を含む。

本明細書で使用する「ＢＦ３９１」と指定された改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞は、図１Ｆで略図により示したように、欠失ｒｇｈＲ１遺伝子（ΔｒｇｈＲ１）、欠失ｒｇｈＲ２遺伝子（ΔｒｇｈＲ２）、欠失ｙｖｚＣ遺伝子（ΔｙｖｚＣ）及び欠失Ｂｌｉ３６４４遺伝子（ΔＢｌｉ３６４４）を含む改変（空）ｒｇｈＲ遺伝子座を含む。

本明細書で使用する用語「等価位置」は、特定のポリペプチド配列と整列させた後のアミノ酸残基位置を意味する。

用語「改変」及び「遺伝子改変」は互換的に使用され、以下を含む：（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）における１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、又は遺伝子若しくはそのＯＲＦの転写若しくは翻訳に必要な調節要素における１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション、（ｆ）特異的変異誘発、及び／又は（ｇ）本明細書に開示される任意の１つ以上の遺伝子のランダム変異誘発。例えば、本明細書で使用する遺伝子改変には、ｒｇｈＲ１、ｒｇｈＲ２、ｙｖｚＣ、ＢＬｉ３６４４等から成る群から選択される１つ以上の遺伝子の改変が含まれるがそれらに限定されない。

本明細書で使用する「遺伝子の破壊」、「遺伝子破壊」、「遺伝子の不活性化」及び「遺伝子不活性化」は、互換的に使用され、宿主細胞は、機能的遺伝子産物（例えば、タンパク質）を産生することを実質的に妨げる任意の遺伝子改変を広く指す。例示的な遺伝子破壊方法には、ポリペプチドコード配列、プロモーター、エンハンサー又はまた別の調節エレメントを含む遺伝子の任意の部分の完全若しくは部分的な消失又は同一物の突然変異誘発が含まれるが、ここで突然変異誘発は、標的遺伝子を破壊／不活性化し、機能的遺伝子産物（即ち、タンパク質）の産生を実質的に低減若しくは防止する、置換、挿入、欠失、逆位並びにそれらの任意の組み合わせ及び変形形態を包含する。

本明細書で規定した、例えば語句「改変（宿主）細胞は親（宿主）細胞と比較して関心対象のタンパク質の増加した量を発現／産生する」において使用する複合用語「発現／産生する」は、本開示の宿主細胞内の関心対象のタンパク質の発現及び産生に関与する任意の工程を含むことが意図されている。

従って、本明細書で使用するタンパク質産生を「増加させる」又は「増加した」タンパク質産生は、産生したタンパク質（例えば、内因性及び／又は異種ＰＯＩ）の増加した量を指す。タンパク質は、宿主細胞の内部で産生されても、培養培地中へ分泌（又は、輸送）されてもよい。所定の実施形態では、関心対象のタンパク質は、培養培地中へ産生（分泌）される。タンパク質産生の増加は、例えば、親宿主細胞と比較して、より高い最大レベルのタンパク質若しくは酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性、セルラーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性等）として、又は産生される総細胞外タンパク質として検出され得る。

本明細書で使用する「核酸」は、ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド配列及びそれらの断片若しくは部分並びにセンス鎖又はアンチセンス鎖の何れを表していても、二本鎖であっても又は一本鎖であってもよい、ゲノム又は合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡを指す。遺伝子コードの縮重の結果として、多くのヌクレオチド配列が所与のタンパク質をコードし得ることは理解されよう。

本明細書に記載したポリヌクレオチド（若しくは核酸分子）には、「遺伝子」、「ベクター」及び「プラスミド」が含まれることは理解されている。

従って、用語「遺伝子」は、タンパク質のコード配列の全部又は一部を含む、アミノ酸の特定配列をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば、遺伝子が発現する条件を決定する、プロモーター配列等の調節（非転写）ＤＮＡ配列を含み得る。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’－ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）並びにコード配列を含み得る。

本明細書で使用する用語「コード配列」は、その（コードする）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレーム（以下では、「ＯＲＦ」）によって決定され、通常はＡＴＧ開始コドンで始まる。コード配列には、典型的には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び組み換えヌクレオチド配列が含まれる。

本明細書で使用する用語「プロモーター」は、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御できる核酸配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’（下流）に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子に由来してもよい、又は天然に存在する種々のプロモーターに由来する種々のエレメントから構成されていてもよい、又は合成核酸セグメントを含んでいてさえよい。種々のプロモーターが、種々の細胞型で、又は種々の生育段階で、又は種々の環境若しくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは、当業者には理解されている。殆どの細胞型で遺伝子の発現を最も多く引き起こすプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれている。さらに、殆どの場合に調節配列の正確な境界は完全には明らかになっていないため、種々の長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得ることは確認されている。

本明細書で使用する「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響されるような、単一の核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、それがそのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（即ち、そのコード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列（例えば、ＯＲＦ）に作動可能に連結している。コード配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。

核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結」している。例えば、分泌リーダー（即ち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現している場合は、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーター若しくはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコード配列に作動可能に連結している；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接している、及び分泌リーダーの場合には、隣接してリーディング期にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、便宜的な制限部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。

本明細書で使用する「関心対象のタンパク質コード配列の遺伝子に連結した関心対象の遺伝子の発現を制御する機能的プロモーター配列（又はそれらのオープンリーディングフレーム）」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）におけるコード配列の転写及び翻訳を制御するプロモーター配列を指す。例えば、所定の実施形態では、本開示は、５’プロモーター（又は、５’プロモーター領域若しくはタンデム５’プロモーター等）を含むポリヌクレオチドであって、そのプロモーター領域が関心対象のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結しているポリヌクレオチドに向けられる。従って、所定の実施形態では、機能的プロモーター配列は、本明細書に開示したタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する。他の実施形態では、機能的プロモーター配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内、より特別にはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞内の関心対象のタンパク質をコードする異種遺伝子（若しくは内在性遺伝子）の発現を制御する。

本明細書で規定した「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内又はコード配列の下流（３’非コード配列）に位置しており、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造が含まれ得る。

本明細書で定義した、例えば「細菌細胞内に導入すること」又は「Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内に少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又はその遺伝子、又はそのベクターを導入すること」等の語句に使用される用語「導入すること」は、プロトプラスト融合法、天然若しくは人工形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）法、形質導入法、トランスフェクション法、共役法等を含むがそれらに限定されない、ポリヌクレオチドを細胞内に導入するための当技術分野で公知の方法を含む（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ．，１９８９を参照されたい）。

本明細書で使用する「形質転換された」又は「形質転換」は、細胞が組み換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換されていることを指す。形質転換は、典型的には、１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、１つのポリヌクレオチド、ＯＲＦ若しくは遺伝子）を細胞内に挿入することによって発生する。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（即ち、形質転換対象の細胞には天然に存在しない配列）であってもよい。例えば、本開示の所定の実施形態では、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、親細胞に、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド構築物を導入することによって改変（例えば、形質転換）され、それによって結果として、親細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）宿主細胞が生じる。

本明細書で使用する「形質転換」は、ＤＮＡが、染色体組込体又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、外来ＤＮＡを宿主細胞内に導入することを指す。本明細書で使用する「形質転換ＤＮＡ」、「形質転換配列」及び「ＤＮＡ構築物」は、配列を宿主細胞又は生物に導入するために使用されるＤＮＡを指す。形質転換ＤＮＡは、配列を宿主細胞又は生物に導入するために使用されるＤＮＡである。このＤＮＡは、インビトロでＰＣＲ又は任意の他の好適な技術によって生成され得る。幾つかの実施形態では、形質転換ＤＮＡは、入来配列を含むが、他の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、ホモロジーボックスに隣接された入来配列をさらに含む。さらに別の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、末端に付加された、他の非相同配列（即ち、スタッファー配列又はフランキング配列）を含む。末端は、例えば、ベクターへの挿入等のように、形質転換ＤＮＡが閉環を形成するように閉じることができる。

核酸配列を細胞内に導入する状況において本明細書で使用する用語「導入（された）」は、核酸配列を細胞内に移すために好適な任意の方法を指す。導入のためのこのような方法には、プロトプラスト融合法、トランスフェクション法、形質転換法、エレクトロポレーション法、接合法及び形質導入法が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ．，１９８９を参照されたい）。

本明細書で使用する「入来配列」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内に導入されるＤＮＡ配列を指す。幾つかの実施形態では、入来配列は、ＤＮＡ構築物の一部である。他の実施形態では、入来配列は、１種以上の関心対象のタンパク質をコードする。幾つかの実施形態では、入来配列は、形質転換対象の細胞のゲノム内に既に存在していても存在していなくてもよい（即ち、相同配列であっても非相同配列であってもよい）配列を含む。幾つかの実施形態では、入来配列は、１種以上の関心対象のタンパク質、遺伝子及び／又は突然変異若しくは改変遺伝子をコードする。代替の実施形態では、入来配列は、機能的な野生型遺伝子若しくはオペロン、機能的な変異遺伝子若しくはオペロン又は非機能的な遺伝子若しくはオペロンをコードする。幾つかの実施形態では、非機能的配列は、遺伝子の機能を破壊するために遺伝子に挿入され得る。別の実施形態では、入来配列は、選択マーカーを含む。さらに別の実施形態では、入来配列は、２つのホモロジーボックスを含む。

本明細書で使用する「ホモロジーボックス」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内の配列と相同である核酸配列を指す。より詳細には、ホモロジーボックスは、本発明に従って、欠失する、破壊される、不活化される、ダウンレギュレートされる等の遺伝子又は遺伝子の幾つかの直接隣接するコード領域と約８０～１００％の配列同一性、約９０～１００％の配列同一性又は約９５～１００％の配列同一性を有する上流又は下流領域である。これらの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内にＤＮＡ構築物が組み込まれる場所を指示し、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどの部分を入来配列で置換するかを指示する。本開示を限定することを意図するものではないが、ホモロジーボックスには、約１塩基対（ｂｐ）～２００キロ塩基（ｋｂ）が含まれ得る。好ましくは、ホモロジーボックスは、約１ｂｐ～１０．０ｋｂ；１ｂｐ～５．０ｋｂ；１ｂｐ～２．５ｋｂ；１ｂｐ～１．０ｋｂ、及び０．２５ｋｂ～２．５ｋｂを含む。ホモロジーボックスは又、約１０．０ｋｂ、５．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂ、１．０ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２５ｋｂ及び０．１ｋｂを含み得る。幾つかの実施形態では、選択マーカーの５’及び３’末端は、ホモロジーボックスによって隣接されるが、ここでホモロジーボックスは、遺伝子のコード領域に直接隣接する核酸配列を含む。

本明細書で使用する用語「選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列」は、宿主細胞内で発現可能であり、選択可能マーカーの発現が発現された遺伝子を含む細胞に、対応する選択剤の存在下又は必須栄養素の欠如下で増殖する能力を付与するヌクレオチド配列を指す。

本明細書で使用する用語「選択可能マーカー」及び「選択マーカー」は、ベクターを含有するそれらの宿主の選択を容易にさせる、宿主細胞内で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指す。そのような選択可能マーカーの例としては、抗微生物剤が挙げられるが、それらに限定されない。従って、用語「選択可能マーカー」は、宿主細胞が目的入来ＤＮＡを取り込めたか、又は何らかの他の反応が発生したことの兆候を提供する遺伝子を指す。典型的には、選択可能マーカーは、形質転換中に外因性配列を受け入れていない細胞から外来ＤＮＡを含有する細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性又は代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。

「存在する選択可能マーカー」は、形質転換対象の微生物の染色体上に所在するマーカーである。存在する選択可能マーカーは、形質転換ＤＮＡ構築物上の選択可能マーカーとは異なる遺伝子をコードする。選択マーカーは、当業者にはよく知られている。上記で示したように、マーカーは、抗微生物耐性マーカー（例えば、ａｍｐ^Ｒ、ｐｈｌｅｏ^Ｒ、ｓｐｅｃ^Ｒ、ｋａｎ^Ｒ、ｅｒｙ^Ｒ、ｔｅｔ^Ｒ、ｃｍｐ^Ｒ及びｎｅｏ^Ｒ（例えば、Ｇｕｅｒｏｔ－Ｆｌｅｕｒｙ，１９９５；Ｐａｌｍｅｒｏｓｅｔａｌ．，２０００；及びＴｒｉｅｕ－Ｃｕｏｔｅｔａｌ．，１９８３を参照されたい）であり得る。幾つかの実施形態では、本発明は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（例えば、ｐＣ１９４上に存在する遺伝子、並びにバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に存在する耐性遺伝子）を提供する。この耐性遺伝子は、本発明において、並びに染色体に組み込まれたカセット及び統合的プラスミドの染色体増幅を包含する実施形態において、特に有用である（例えば、ＡｌｂｅｒｔｉｎｉａｎｄＧａｌｉｚｚｉ，１９８５；ＳｔａｈｌａｎｄＦｅｒｒａｒｉ，１９８４を参照されたい）。本発明により有用な他のマーカーとしては、セリン、リシン、トリプトファン等の栄養要求性マーカー及びβ－ガラクトシダーゼ若しくは蛍光タンパク質等の検出マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で規定した宿主細胞「ゲノム」、細菌（宿主）細胞「ゲノム」又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（宿主）細胞「ゲノム」は、染色体遺伝子及び染色体外遺伝子を含む。

本明細書で使用する用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、細胞の中央代謝には典型的には関与しない遺伝子を運ぶことが多い、通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある染色体外要素を指す。そのような要素は、多数のヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’－非翻訳配列と共に細胞内に導入できる固有の構成に接合又は再結合されている任意の起源に由来する、線状若しくは環状の、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であってよい。

本明細書で使用する「形質転換カセット」は、遺伝子（又は、そのＯＲＦ）を含み、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特異的ベクターを指す。

本明細書で使用する用語「ベクター」は、細胞内で複製（増殖）することができ、新たな遺伝子又はＤＮＡセグメントを細胞内に運ぶことができる任意の核酸を指す。従って、この用語は、様々な宿主細胞間を輸送するために設計された核酸構築物を指す。ベクターとしては、「エピソーム」（即ち、自律的に複製するか、又は宿主生物の染色体に組み込むことができる）である、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、並びにＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＰＬＡＣ（植物人工染色体）等の人工染色体が挙げられる。

「発現ベクター」は、細胞内で異種ＤＮＡを組み込んで発現させる能力を有するベクターを指す。多数の原核生物及び真核生物の発現ベクターが市販されており、当業者には知られている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。

本明細書で使用する用語「発現カセット」及び「発現ベクター」は、標的細胞内の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素を用いて、組み換え又は合成的に生成される核酸構築物（即ち、これらは、上述したベクター若しくはベクターエレメントである）を指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片内に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写対象の核酸配列及びプロモーターが含まれる。幾つかの実施形態では、ＤＮＡ構築物には、標的細胞内の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素も含まれる。所定の実施形態では、本開示のＤＮＡ構築物は、本明細書で定義する選択マーカー及び不活化染色体セグメント又は遺伝子セグメント又はＤＮＡセグメントを含む。

本明細書で使用する「ターゲティングベクター」は、その中にターゲティングベクターが形質転換される宿主細胞の染色体内の領域に相同なポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組み換えを駆動できるベクターである。例えば、ターゲティングベクターは、相同組み換えによって宿主細胞の染色体に変異を導入する際に使用される。幾つかの実施形態では、ターゲティングベクターは、例えば末端に付加された他の非相同配列（即ち、スタッファー配列又はフランキング配列）を含む。幾つかの実施形態では、ターゲティングベクターには、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ及びリコンビナーゼを含むがそれらに限定されない相同組み換えを増加させるための要素が含まれる。末端は、例えば、ベクターへの挿入等のように、ターゲティングベクターが閉環を形成するように閉じることができる。

本明細書で使用する用語「プラスミド」は、クローニングベクターとして使用され、且つ多くの細菌及び幾つかの真核生物において染色体外の自己複製遺伝要素を形成する、環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物を指す。幾つかの実施形態では、プラスミドは宿主細胞のゲノムに組み込まれる。

本明細書で使用する用語「関心対象のタンパク質」若しくは「ＰＯＩ」は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）宿主細胞内で発現するのが望ましい関心対象のポリペプチドを指すが、ＰＯＩは、好ましくは増加したレベルで発現する。従って、本明細書で使用するＰＯＩは、酵素、基質結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造タンパク質、受容体タンパク質等であり得る。所定の実施形態では、本開示の改変細胞は、親細胞に比較して、増加した量の異種ＰＯＩ若しくは増加した量の内因性ＰＯＩを産生する。特定の実施形態では、本開示の改変細胞によって産生したＰＯＩの増加した量は、親細胞と比較して、少なくとも０．５％の増加、少なくとも１．０％の増加、少なくとも５．０％の増加又は５．０％超の増加である。

同様に、本明細書で定義した「関心対象の遺伝子」若しくは「ＧＯＩ」は、ＰＯＩをコードする核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子又はＯＲＦ）を指す。「関心対象のタンパク質」をコードする「関心対象の遺伝子」は、天然型遺伝子、突然変異遺伝子又は合成遺伝子であってよい。

本明細書で使用する用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に対し、従来の１文字コード又は３文字コードを使用する。ポリペプチドは、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、及び非アミノ酸によって分断されていてもよい。ポリポチペプチドという用語は又、自然に、或いは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化又は標識化成分との結合等の任意の他の操作若しくは改変によって改変されているアミノ酸ポリマーを包含する。されに、この定義の範囲には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸等を含む）を含有するポリペプチド、及び当該技術分野において知られる他の改変も含まれる。

所定の実施形態では、本開示の遺伝子は、酵素（例えば、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリアーゼ（ｇｌｕｃａｎｌｙｓａｓｅ）、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ－ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組み合わせ）等の商業的に関連する工業用の関心対象のタンパク質をコードする。

本明細書で使用する「変異」ポリペプチドは、一般的には組み換えＤＮＡ技術による、１個以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失による親（若しくは参照）ポリペプチドに由来するポリペプチドを指す。変異ポリペプチドは、少数のアミノ酸残基によって親ポリペプチドとは異なる可能性があり、親（参照）ポリペプチドとの一次アミノ酸配列の相同性／同一性のレベルによって定義され得る。

好ましくは、変異ポリペプチドは、親（参照）ポリペプチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％さえのアミノ酸配列同一性を有する。本明細書で使用する「変異」ポリヌクレオチドは、変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指し、この「変異ポリヌクレオチド」は、親ポリヌクレオチドと特定の程度の配列相同性／同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で親ポリヌクレオチド（又は、その相補体）とハイブリダイズする。好ましくは、変異ヌクレオチドは、親（参照）ポリヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％さえのヌクレオチド配列同一性を有する。

本明細書で使用する「突然変異」は、核酸配列内の任意の変更又は変化を指す。点突然変異、欠失突然変異、サイレント突然変異、フレームシフト突然変異、スプライシング突然変異等を含む数種のタイプの突然変異が存在する。突然変異は、特異的に（例えば、部位特異的変異誘発によって）又はランダムに（例えば、化学薬品、修復マイナス細菌株を通しての継代によって）行われ得る。

本明細書で使用するポリペプチド若しくはその配列に関連して、用語「置換」は、１つのアミノ酸とまた別のアミノ酸との取り換え（即ち、置換）を意味する。

本明細書で規定した「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置に存在する遺伝子を指す。

本明細書で規定した「異種」遺伝子、「非内在性」遺伝子又は「外来」遺伝子は、通常は宿主生物中では見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子（若しくはＯＲＦ）を指す。本明細書で使用する用語「外来」遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子（若しくはＯＲＦ）及び／又は天然若しくは非天然生物中に挿入されたキメラ遺伝子を含む。

本明細書で定義する「異種」核酸構築物又は「異種」核酸配列は、その中でそれが発現する細胞に対して天然ではない配列の部分を有する。

本明細書で定義する「異種制御配列」は、天然では関心対象の遺伝子の発現を調節（制御）するために機能しない遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、その中にそれらが存在する細胞又はゲノムの一部に対して内因性（天然）ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等によって細胞に加えられている。「異種」核酸構築物は、天然宿主細胞内で見出される制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同一又は異なる制御配列／ＤＮＡコード（ＯＲＦ）配列の組み合わせを含有し得る。

本明細書で使用する用語「シグナル配列」及び「シグナルペプチド」は、成熟タンパク質又はタンパク質の前駆体形の分泌又は直接輸送に関与する可能性があるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、典型的には、前駆体又は成熟タンパク質配列のＮ末端に位置する。シグナル配列は、内因性であっても外来性であってもよい。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質には存在しない。シグナル配列は、典型的には、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。

用語「由来する」には、用語「～から生じた」、「～から得られた」、「～から入手可能な」及び「～から作成された」が含まれ、一般には、１つの特定の材料若しくは組成物が別の材料若しくは組成物にその起源が見出されるか、又は他の特定の材料若しくは組成物を参照して記載できる特徴を有することを示す。

本明細書で使用する用語「相同性」は、相同ポリヌクレオチド又は相同ポリペプチドに関する。２つ以上のポリヌクレオチド又は２つ以上のポリペプチドが相同である場合、これは、それらの相同のポリヌクレオチド又はポリペプチドが、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より一層好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９８％の「同一性度」を有することを意味している。２つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列が、本明細書で定義するように相同であるほどの十分に高い同一性度を有するか否かは、当該技術分野で知られるコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供される「ＧＡＰ」（ＰｒｏｇｒａｍＭａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８，Ａｕｇｕｓｔ１９９４、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ５３７１１）を使用して２つの配列を整列させることにより好適に調べることができる（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，（１９７０）。ＤＮＡ配列比較のために以下の設定でＧＡＰを使用：ＧＡＰ作成ペナルティ（ｃｒｅａｔｉｏｎｐｅｎａｌｔｙ）５．０及びＧＡＰ伸長ペナルティ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｐｅｎａｌｔｙ）０．３。

本明細書で使用する用語「同一性パーセント（％）」は、配列アラインメントプログラムを使用して整列させた場合の、ポリペプチドをコードする核酸配列間又はポリペプチドのアミノ酸配列間の核酸又はアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。

本明細書で使用する用語「比生産性」は、所定の期間に渡って、細胞１個当たり、単位時間当たりに産生するタンパク質の総量を指す。

本明細書で定義する用語「精製（された）」、「単離（された）」又は「濃縮（された）」は、生体分子（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）が、それが本来結合している、天然型の一部若しくは全部の構成要素から分離することによって、その天然状態から改変されることを指す。そのような単離若しくは精製は、最終組成物中の望ましくない全細胞、細胞残屑、不純物、外来タンパク質又は酵素を除くための、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈澱若しくは他のタンパク質塩析、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動又は勾配による分離等の当該技術分野で知られる分離技術によって実施することができる。精製又は単離した生体分子組成物には、その後さらに、追加の便益を付与する構成要素、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨ調節化合物又は他の酵素若しくは化学物質を添加することができる。

本明細書で使用する用語「ＣｏｍＫポリペプチド」は、ＤＮＡ結合及び取り込み並びに組み換えに関与する後期コンピテンス遺伝子の発現の活性化に関与する、コンピテンスの発達の前の最終自己調節制御スイッチとして作用する転写因子であるｃｏｍＫ遺伝子の産物であると定義されている（ＬｉｕａｎｄＺｕｂｅｒ，１９９８，Ｈａｍｏｅｎｅｔａｌ．，１９９８）。

本明細書で使用する「相同遺伝子」は、異なるが通常は関連する種に由来する、相互に対応し、且つ相互に同一又は極めて類似する１対の遺伝子を指す。この用語は、種分化（即ち、新規な種の発生）によって分離された遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、及び遺伝子重複によって分離されてきた遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。

本明細書で使用する「オルソログ」及び「オルソロガス遺伝子」は、種分化によって共通の先祖遺伝子（即ち、相同遺伝子）から生じた異なる種の遺伝子を指す。典型的には、オルソログは、進化の過程中に同じ機能を保持している。オルソログの同定は、新しく配列が決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性の高い予測に使用される。

本明細書で使用する「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」は、ゲノム内での重複に関係する遺伝子を指す。オルソログは進化の過程を通して同じ機能を保持し、一方、パラログは幾つかの機能は多くは元の機能に関連するものの新しい機能を生じる。パラロガス遺伝子の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビン（これらは何れも、セリンプロテイナーゼであり、同じ種において同時に発生する）をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する「相同性」は、配列類似性又は同一性を指すが、同一性が好ましい。この相同性は、当該技術分野で知られる標準技術を使用して決定される（例えば、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１；ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０；ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，１９８８；ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ．，１９８４を参照されたい）。

本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、当該技術分野で知られているように、核酸鎖がその相補鎖と塩基対を形成することによって結合するプロセスを指す。核酸配列は、２つの配列が中～高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下及び洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔ_ｍ）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、通常、Ｔ_ｍ ^－５℃（プローブのＴ_ｍを５℃下回る）程度で、「高ストリンジェンシー」はＴ_ｍを約５～１０℃下回って、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴ_ｍを約１０～２０℃下回って、そして「低ストリンジェンシー」はＴ_ｍを約２０～２５℃下回って、起こる。

機能上、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性、又はほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができ、一方、中間又は低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド配列ホモログを同定又は検出するために用いることができる。中～高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当該技術分野でよく知られている。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ及び１００ｐｇ／ｍＬの変性キャリアＤＮＡ中における約４２℃でのハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ中における室温（ＲＴ）での２回の洗浄、並びに０．１×ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ中における４２℃でのさらなる２回の洗浄が挙げられる。中程度のストリンジェント条件の例としては、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン及び２０ｍｇ／ｍＬの変性断片処理済みサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で一晩インキュベートし、続いて１×ＳＳＣ中、約３７～５０℃でフィルターを洗浄することが挙げられる。当業者は、プローブ長等の因子を適合させるために必要な温度、イオン強度等を調整する方法を知っている。

本明細書で使用する場合、「組み換え」は、異種核酸配列の導入によって改変されている、又は細胞がそのように改変された細胞に由来する細胞又はベクターへの言及が含まれる。従って、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）形態内の同一形態においては見出されない遺伝子を発現する、又はヒトが意図的に介入した結果として、さもなければ異常に発現する、過少発現する、若しくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。「組み換え」、「組み換える（こと）」又は「組み換え」核酸を生成することは、一般に、２つ以上の核酸断片の組み立てであり、この組み立ては、キメラ遺伝子を発生させる。

本明細書で使用する場合、「フランキング配列」は、考察対象の配列の上流又は下流にある任意の配列を指す（例えば、遺伝子Ａ－Ｂ－Ｃでは、遺伝子ＢがＡ及びＣの遺伝子配列にフランキングされている）。所定の実施形態では、入来配列は、両側でホモロジーボックスにフランキングされている。また別の実施形態においては、入来配列及びホモロジーボックスは、両側でスタッファー配列によってフランキングされている単位を含む。幾つかの実施形態では、フランキング配列は、一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、好ましい実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各ホモロジーボックスの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内の配列と相同である。これらの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどこに新規な構築物が組み込まれ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどの部分が入来配列により置換されるかを指示する。他の実施形態では、選択マーカーの５’及び３’末端は、不活化染色体セグメントの一部を含むポリヌクレオチド配列によってフランキングされている。幾つかの実施形態では、フランキング配列は、一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、他の実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。幾つかの実施形態では、ホモロジーボックスは、構築物がゲノム内で再結合すると、遺伝子Ｅは、ゲノムから取り除かれるであろうように、直接的に相互にフランキングする又は介入配列（例えば、遺伝子Ｄ－Ｅ－Ｆに対して構築物Ｄ～Ｆ）を欠如する。

ＩＩ．バチルス・リケニフォルミス（ＢＡＣＩＬＬＵＳＬＩＣＨＥＮＩＦＯＲＭＩＳ）ＲＧＨＲ遺伝子座
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｖａＮ遺伝子は、ｒａｐＧ、ｒａｐＨ及びｒａｐＤ遺伝子のリプレッサーであると同定されており、「ｒｇｈＲ」と指定されている（即ち、ｒａｐＧ及びｒａｐＨリプレッサー；Ｈａｙａｓｈｉｅｔａｌ．，２００６；Ｏｇｕｒａ＆Ｆｕｊｉｔａ，２００７）。例えば、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｇｈＲ遺伝子座は、「ＲｇｈＲ１」及び「ＲｇｈＲ２」と指定されているＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲｇｈＲ／ＹｖａＯ（転写制御因子）の２つのホモログをコードする。Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｇｈＲ１遺伝子の上流（５’）（例えば、図１Ａを参照されたい）は、それぞれ転写制御タンパク質ＹｖｚＣ及びＢｌｉ３６４４をコードする２つの追加の遺伝子であるｙｖｚＣ（Ｂｌｉ３６４５）及びＢｌｉ３６４４である。より特別には、上記で概して規定したように、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｇｈＲ（染色体）遺伝子座は、図１Ａで示したように、天然ｒｇｈＲ１遺伝子、天然ｒｇｈＲ２遺伝子、天然ｙｖｚＣ遺伝子及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子を含む。例えば、国際公開第２０１８／１５６７０５号パンフレットは、「ＲｇｈＲ２_ｄｕｐ」と指定された変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する（即ち、「ＡＡＡＳＩＲ」の６アミノ酸リピートを含む）突然変異ｒｇｈＲ２遺伝子を含む突然変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株について開示している。概して国際公開第２０１８／１５６７０５号パンフレットに記載されたように、ｒｇｈＲ２_ｄｕｐ配列からの１８ｂｐ重複の欠失（即ち、対立遺伝子ｒｇｈＲ２_ｒｅｓｔを生じる）は、異種タンパク質産生における同時の増加を伴ってバイオマスの低減を生じさせた。

本明細書及び下記の実施例の部に記載したように、本出願人は、ｒｇｈＲ遺伝子座を評価するため、及び強化されたタンパク質産生（若しくは他の有益な）表現型を有するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を同定するために改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）をさらに設計し、構築し、及び試験した。より特別には、本実施例では、ｓｅｒＡ及びｌｙｓＡ遺伝子の欠失を伴う天然ｒｇｈＲ遺伝子座（図１Ａ）を含む、及び２つの異種α－アミラーゼ発現カセットを含む、ＬＤＮ１４３と指定された親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を、改変ｒｇｈＲ遺伝子座を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞（即ち、ＬＤＮ１４３親に由来する）に対して評価した。従って、本明細書に記載した改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞は、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（ＬＤＮ１４３）に導入された一連の改変ｒｇｈＲ遺伝子座対立遺伝子を用いて構築した。

より詳細には、下記の改変ｒｇｈＲ遺伝子座：天然ｒｇｈＲ１遺伝子、改変ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２_ＳＴＯＰ）、天然ｙｖｚＣ遺伝子及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞ＢＦ３１４（図１Ｂ）、欠失ｒｇｈＲ１遺伝子（ΔｒｇｈＲ１）、天然ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２_ＳＴＯＰ）、天然ｙｖｚＣ遺伝子及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞ＢＦ３２４（図１Ｃ）、天然ｒｇｈＲ１遺伝子、欠失ｒｇｈＲ２遺伝子（ΔｒｇｈＲ２）、天然ｙｖｚＣ遺伝子及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞ＢＦ３７７（図１Ｄ）、欠失ｒｇｈＲ１遺伝子（ΔｒｇｈＲ１）、欠失ｒｇｈＲ２遺伝子（ΔｒｇｈＲ２）、天然ｙｖｚＣ遺伝子及び天然Ｂｌｉ３６４４遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞ＢＦ３８９（図１Ｅ）並びに欠失ｒｇｈＲ１遺伝子（ΔｒｇｈＲ１）、欠失ｒｇｈＲ２遺伝子（ΔｒｇｈＲ２）、欠失ｙｖｚＣ遺伝子（ΔｙｖｚＣ）及び欠失Ｂｌｉ３６４４遺伝子（ΔＢｌｉ３６４４）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞ＢＦ３９１（図１Ｆ、空ｒｇｈＲ遺伝子座）の１つを含む、ＬＤＮ１４３親に由来する下記のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞を構築した。

従って、下記の実施例４に記載したように（例えば、表２０を参照されたい）、ｒｇｈＲ遺伝子座における突然変異を伴う改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、ｒｇｈＲ遺伝子座に対する野生型である、匹敵する親細胞（ＬＤＮ１４３）よりも約２３～６２％多いアミラーゼタンパク質を産生した、増加した産生表現型を証明している。このため本開示の所定の実施形態は、改変ｒｇｈＲ遺伝子座を有する、及び増加したタンパク質産生性表現型を含むそのような改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に関する。所定の他の実施形態は、そのような組成物及び改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を構築且つ入手するための方法に関する。従って、所定の他の実施形態は、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である関心対象の内因性及び／又は異種タンパク質の発現／産生に関する。

ＩＩＩ．低減した量の赤色顔料を産生するバチルス・リケニフォルミス（ＢＡＣＩＬＬＵＳＬＩＣＨＥＮＩＦＯＲＭＩＳ）細胞
当業者には一般に理解されているように、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）は、天然及び組み換えタンパク質を産生するための宿主系として明確に理解されている。しかしながら、所定のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等）は、シクロ－Ｌ－ロイシル－Ｌ－ロイシルに由来するプルケリミン酸であって、このプルケリミン酸は、増殖培地中に分泌し、鉄イオンを（非酵素的反応によって）キレートしてプルケリミンとして公知の細胞外赤色顔料を産生する（ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９６５；ＵｆｆｅｎａｎｄＣａｎａｌｅ－Ｐａｒｏｌａ，１９７２）。従って、目に見える赤色顔料を（即ち、発酵／培養中に）生成するために十分な量でプルケリミンを産生するバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）（宿主）細胞は、一般に関心対象のタンパク質の回収及び／又は精製中の１つ以上のプルケリミン回収工程を必要とする、又はプルケリミン（赤色顔料）は、関心対象のタンパク質と共精製され得る。

例えば、所望の表現型（例えば、増加したタンパク質産生等）を備えるバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）は、必ずしも宿主細胞により産生した関心対象のタンパク質の上首尾の発酵、回収及び／又は精製のために最も所望の特性（例えば、赤色顔料表現型等）を有する必要はない。従って、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内でプルケリミンの産生を軽減するための所定の遺伝的アプローチは、プルケリミン産生を軽減するための手段としてバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）におけるｃｙｐＸ遺伝子及び／又はｙｖｍＣ遺伝子の欠失について記載している国際公開第２００４／０１１６０９号パンフレット等、当該技術分野において記載されてきた。

本明細書及び下記の実施例の部に記載したように、出願人は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞における赤色顔料（プルケリミン）の産生を軽減するための新規な手段を同定した。より詳細には、下記の実施例５に提示及び記載したように、ｒｇｈＲ遺伝子座の同定された特徴は、鉄捕捉顔料であるプルケリミン酸を産生することに責任を担うオペロンの転写制御である。この実施例で説明したように、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞ＢＦ３１４（即ち、改変（ｒｇｈＲ２_ＳＴＯＰ）遺伝子を含む）及びＢＦ３７７（即ち、欠失（ΔｒｇｈＲ２）遺伝子を含む）は、どちらも赤色顔料の産生における約３０～５０％への低減を証明するが、他方、いくつかの他の突然変異は、プルケリミンの産生を約１０～２０％へ増加させたので（例、表２１を参照されたい）、これはｒｇｈＲ遺伝子座における突然変異がプルケリミン酸の生合成を制御することを示している。

このため本開示の所定の実施形態は、低減した量の赤色顔料を産生する改変ｒｇｈＲ遺伝子座を有するような改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に関する。所定の他の実施形態は、そのような組成物及び低減した量の赤色顔料を産生する改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を構築且つ入手するための方法に関する。従って、所定の他の実施形態は、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である関心対象の内因性及び／又は異種タンパク質の発現／産生に関する。

ＩＶ．分子生物学
上記で説明したように、本開示の所定の実施形態は、天然ｒｇｈＲ遺伝子座を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。特定の他の実施形態では、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、改変ｒｇｈＲ遺伝子座を含む。そこで、所定の他の実施形態は、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞を生成するために親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を遺伝子改変するための組成物及び方法に関する。

本開示の所定の実施形態は、このため、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を遺伝子改変するための方法であって、その改変が、（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）内での１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去又は遺伝子若しくはそのＯＲＦの転写若しくは翻訳のために必要とされる調節要素内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、（ｂ）遺伝子の破壊、（ｃ）遺伝子の変換、（ｄ）遺伝子の欠失、（ｅ）遺伝子の下方制御、（ｆ）部位特異的変異誘発及び／又は（ｇ）ランダム突然変異誘発を含むがそれらに限定されない方法に向けられる。例えば、本明細書で使用する遺伝子改変には、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｇｈＲ１遺伝子、ｒｇｈＲ２遺伝子、ｙｖｚＣ遺伝子及びＢＬｉ３６４４遺伝子から成る群から選択される１つ以上の遺伝子の改変が含まれるがそれらに限定されない。

そこで、所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、当該技術分野において周知である方法、例えば、挿入、破壊、置換又は欠失を使用して、上記に規定した遺伝子の発現を低減させる、又は排除することによって構築される。改変又は不活化対象の遺伝子の部分は、例えば、コード領域、又はコード領域を発現させるために必要とされる調節エレメントであってよい。

そのような調節配列又は制御配列の例は、プロモーター配列又はその機能的部分（即ち、核酸配列の発現に十分に影響を及ぼす部分）であり得る。改変のための他の制御配列としては、リーダー配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター、転写活性化因子等が挙げられるがこれらに限定されない。

所定の他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、本開示の上記の遺伝子の少なくとも１つの発現を排除若しくは低減させるための遺伝子欠失によって構築される。遺伝子欠失技術は、遺伝子の部分的又は完全な除去を可能にし、それによりそれらの発現を排除する、又は非機能的（若しくは活性が低減した）タンパク質産物を発現させる。そのような方法では、遺伝子の欠失は、遺伝子にフランキングする５’及び３’領域を隣接して含有するように構築されているプラスミドを用い、相同組み換えによって遂行され得る。隣接する５’及び３’領域は、例えば、プラスミドが細胞内で樹立されることを可能にする許容温度で第２の選択可能マーカーと会合しているｐＥ１９４等の感温性プラスミドでバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内に導入され得る。細胞はその後、相同フランキング領域の１つで染色体内に組み込まれたプラスミドを有する細胞を選択するために非許容温度へシフトされる。プラスミドを組み込むための選択は、第２の選択可能マーカーの選択によって実施される。組み込み後、第２の相同フランキング領域での組み換え事象が、選択せずに細胞を数世代にわたり許容温度へシフトすることによって刺激される。細胞をプレーティングして単一コロニーを得、このコロニーを両方の選択可能マーカーの消失について試験する（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３を参照されたい）。従って、当業者であれば（例えば、ｒｇｈＲ１、ｒｇｈＲ２、ｙｖｚＣ、ｂｌｉ３６４４（核酸）配列及びそのコードされたタンパク質配列を参照することによって）、完全又は部分的欠失に好適な遺伝子のコード配列及び／又は遺伝子の非コード配列中のヌクレオチド領域を容易に同定することができる。

他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、それらの転写又は翻訳のために必要とされる遺伝子又は調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドを導入するか、置換するか、又は除去することによって構築される。例えば、終止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームのフレームシフトを生じさせるように、ヌクレオチドを挿入又は除去し得る。そのような改変は、当該技術分野で知られる方法に従って、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ生成変異誘発によって行われ得る（例えば、ＢｏｔｓｔｅｉｎａｎｄＳｈｏｒｔｌｅ，１９８５；Ｌｏｅｔａｌ．，１９８５；Ｈｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｍａｄａ，１９９６；Ｈｏｅｔａｌ．，１９８９；Ｈｏｒｔｏｎｅｔａｌ．，１９８９及びＳａｒｋａｒａｎｄＳｏｍｍｅｒ，１９９０を参照されたい）。従って、所定の実施形態では、本開示の遺伝子は、完全又は部分的欠失によって不活化される。

別の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、遺伝子変換のプロセスによって構築される（例えば、ＩｇｌｅｓｉａｓａｎｄＴｒａｕｔｎｅｒ，１９８３を参照されたい）。例えば、遺伝子変換法では、遺伝子に対応する核酸配列は、インビトロで変異させられて欠陥のある核酸配列を産生し、これは、その後親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に形質転換されて欠陥のある遺伝子を産生する。相同組み換えによって、欠陥のある核酸配列は、内在性遺伝子に取って代わる。欠陥のある遺伝子又は遺伝子断片は又、欠陥のある遺伝子を含む形質転換体の選択に使用することができるマーカーをコードすることが望ましい場合がある。例えば、欠陥のある遺伝子は、選択可能マーカーと会合して、非複製又は温度感受性プラスミドに導入され得る。プラスミドを組み込むための選択は、プラスミドを複製させない条件下でのマーカー選択によって達成される。遺伝子置換をもたらす第２の組み換え事象の選択は、選択可能マーカーの欠損及び変異遺伝子の獲得についてコロニーを調べることによって達成される（Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３）。或いは、欠陥のある核酸配列は、以下に記載する通り、遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの挿入、置換又は欠失を含有し得る。

他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、遺伝子の核酸配列と相補的であるヌクレオチド配列を使用する確立されたアンチセンス技術によって構築される（ＰａｒｉｓｈａｎｄＳｔｏｋｅｒ，１９９７）。より詳細には、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞による遺伝子の発現は、この遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することにより低減（下方制御）又は排除することができ、それは細胞内で転写され得、細胞内で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。相補的アンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイズすることをできる条件下では、従って、翻訳されるタンパク質の量は低減又は排除される。このようなアンチセンス法としては、以下に限定されないが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられ、これらの全てが当業者によく知られている。

他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集によって作製／構築される。例えば、ｒｇｈＲ１、ｒｇｈＲ２、ｙｖｚＣ及び／又はＢｌｉ３６４４をコードする遺伝子は、ＤＮＡ上の標的配列にエンドヌクレアーゼを動員するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９）及びＣｐｆｌ又はガイドＤＮＡ（例えば、ＮｇＡｇｏ）の何れかに結合することによってそれらの標的ＤＮＡを見出す核酸誘導型エンドヌクレアーゼによって破壊（又は欠失若しくは下方制御）されてもよく、ここで、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡにおいて一本鎖又は二本鎖切断を生成することができる。この標的化ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ修復のための基質となり、遺伝子を破壊又は欠失させるために提供された編集鋳型と再結合し得る。例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子（この目的のためには、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９）又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするコドン最適化遺伝子は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なプロモーター及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なターミネーターに作動可能に連結されており、これによりバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｃａｓ９発現カセットを生成する。同様に、関心対象の遺伝子に固有の１つ以上の標的部位は、当業者であれば容易に同定できる。例えば、関心対象の遺伝子内の標的部位に向けられたｇＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物をストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を用いて構築するためには、可変標的化ドメイン（ＶＴ）は、そのヌクレオチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９に対するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ）をコードするＤＮＡに融合している、（ＰＡＭ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＮＧＧ）の５’である標的部位のヌクレオチドを含むであろう。ＶＴドメインをコードするＤＮＡとＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとの組み合わせは、それによりｇＲＮＡをコードするＤＮＡを生成する。従って、ｇＲＮＡのためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現カセットは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なプロモーター及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なターミネーターにｇＲＮＡをコードするＤＮＡを作動可能に連結させることによって作製される。

所定の実施形態では、エンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ切断は、入来配列を用いて修復／置換される。例えば、上述したＣａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットによって生成されたＤＮＡ切断を精密に修復するためには、細胞のＤＮＡ修復機構が編集鋳型を利用できるように、ヌクレオチド編集鋳型が提供される。例えば、標的化遺伝子の約５００ｂｐの５’は、編集テンプレートを生成するために標的化遺伝子の約５００ｂｐの３’に融合させることができ、そのテンプレートは、ＲＧＥＮによって生成されたＤＮＡ切断を修復するためにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主の機構によって使用される。

Ｃａｓ９発現カセット、ｇＲＮＡ発現カセット及び編集鋳型は、多数の様々な方法を使用して細胞に同時に送達され得る。形質転換細胞は、遺伝子座をフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅させることにより、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅させることによってスクリーニングされる。これらのプライマーは、野生型遺伝子座又はＲＧＥＮによって編集されている改変遺伝子座を増幅させることができる。これらの断片は、次に編集されたコロニーを同定するためにシーケンシングプライマーを使用してシーケンシングされる（例えば、下記の実施例の部を参照されたい）。

さらに他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、化学的突然変異誘発（例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ，１９７０を参照されたい）及び転座（例えば、Ｙｏｕｎｇｍａｎｅｔａｌ．，１９８３を参照されたい）を含むがそれらに限定されない当該技術分野においてよく知られる方法を使用して、ランダム突然変異誘発又は特異的変異誘発によって構築される。遺伝子の改変は、親細胞に突然変異誘発を受けさせること、及びその中で遺伝子の発現が低減若しくは排除されている突然変異細胞についてスクリーニングすることによって実施され得る。特異的であってもランダムであってもよい突然変異誘発は、例えば、好適な物理的若しくは化学的突然変異誘発剤の使用によって、好適なオリゴヌクレオチドの使用によって、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成突然変異誘発（ＰＣＲ－ｇｅｎｅｒａｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）にかけることによって実施され得る。さらに、この突然変異誘発は、これらの突然変異誘発法の任意の組み合わせの使用により実施され得る。

本発明のために好適な物理的若しくは化学的突然変異誘発剤の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチドアナログが挙げられる。そのような薬剤を使用する場合、突然変異誘発は、典型的には、好適な条件下で最適な突然変異誘発剤の存在下で突然変異誘発対象の親細胞をインキュベートする工程、及び遺伝子の低減した発現を示す、又は発現を示さない突然変異細胞を選択する工程によって実施される。

国際公開第２００３／０８３１２５号パンフレットは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を迂回するためにＰＣＲ融合を使用する、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）欠失株及びＤＮＡ構築物の作成等の、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を改変するための方法を開示している。国際公開第２００２／１４４９０号パンフレットは、（１）統合的プラスミド（ｐＣｏｍＫ）の構築及び形質転換、（２）コード配列、シグナル配列及びプロペプチド配列のランダム突然変異誘発、（３）相同組み換え、（４）形質転換ＤＮＡに非相同フランクを付加することにより形質転換効率を増加させること、（５）二重交差組み込みを最適化すること、（６）部位特異的突然変異誘発、及び（７）マーカーレス欠失を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を改変するための方法を開示している。

当業者は、細菌細胞（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種）にポリヌクレオチド配列を導入するための好適な方法をよく知っている（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ．，１９８９；Ｓａｕｎｄｅｒｓｅｔａｌ．，１９８４；Ｈｏｃｈｅｔａｌ．，１９６７；Ｍａｎｎｅｔａｌ．，１９８６；Ｈｏｌｕｂｏｖａ，１９８５；Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．，１９７９；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａｅｔａｌ．，１９８０；Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，１９８６；Ｆｉｓｈｅｒｅｔ．ａｌ．，１９８１及びＭｃＤｏｎａｌｄ，１９８４を参照されたい）。実際に、プロトプラスト形質転換及び会合、形質導入、並びにプロトプラスト融合を含む形質転換等の方法が知られており、本開示における使用に適している。形質転換法は、本開示のＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するのに特に好ましい。

一般に使用される方法に加えて、幾つかの実施形態では、宿主細胞は、直接的に形質転換させられる（即ち、宿主細胞内に導入する前にＤＮＡ構築物を増幅させるために、又はさもなければプロセシングするために、中間細胞が使用されない）。ＤＮＡ構築物の宿主細胞内への導入には、プラスミド又はベクター内へ挿入することなく、ＤＮＡを宿主細胞内に導入するために当該技術分野において知られるそれらの物理的及び化学的方法が含まれる。このような方法としては、以下に限定されないが、塩化カルシウム沈降法、エレクトロポレーション法、裸のＤＮＡ法、リポソーム法等が挙げられる。追加の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、プラスミドに挿入することなく、プラスミドと共に同時形質転換される。さらなる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野において知られる方法によって改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株から欠失、又は実質的に切除される（例えば、Ｓｔａｈｌｅｔａｌ．，１９８４；Ｐａｌｍｅｒｏｓｅｔａｌ．，２０００）。幾つかの実施形態では、宿主染色体由来のベクターの分解は、染色体内のフランキング領域を残すが、一方、固有の染色体領域を除去する。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内での遺伝子の発現において使用するためのプロモーター及びプロモーター配列、それらのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び／又はそれらの変異配列は、一般に当業者に知られている。本開示のプロモーター配列は、一般に、それらがバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で機能的であるように選択される。所定の例示的なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロモーター配列としては、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）プロモーター、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα－アミラーゼプロモーター、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα－アミラーゼプロモーター、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＥ）プロモーター、突然変異ａｐｒＥプロモーター（例えば国際公開第２００１／５１６４３号パンフレット）又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）若しくは他の関連するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）由来の任意の他のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において広範囲の活性（プロモーター強度）を有するプロモーターライブラリーをスクリーニング及び作製する方法は、国際公開第２００３／０８９６０４号パンフレットに記載されている。

Ｖ．関心対象のタンパク質を産生するための改変細胞の培養
概して上記で記載したように、所定の他の実施形態は、増加したタンパク質産生表現型を有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞／株を構築且つ得るための組成物及び方法に関する。従って、所定の実施形態は、好適な培地中で細胞を発酵／培養することによってバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内での関心対象のタンパク質を産生する方法に関する。本開示の親及び改変（娘）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を発酵させるためには、当該技術分野でよく知られた発酵方法を適用することができる。

幾つかの実施形態では、細胞は、バッチ又は連続発酵条件下で培養する。古典的なバッチ発酵は、閉鎖系であり、培地の組成は発酵の開始時に設定し、発酵中には変更しない。発酵の開始時に、培地に所望の生物を接種する。この方法では、系にいかなる成分も添加することなく発酵を行わせる。典型的には、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度等の因子を制御することが頻繁に行われる。バッチ系の代謝産物及びバイオマス組成物は、発酵が停止される時点まで絶えず変化する。典型的なバッチ培養では、細胞は静的誘導期を経由して高増殖対数期へ進行し、最終的には増殖率が低減又は停止する静止期に進み得る。処理されなければ、静止期にある細胞は最終的には死滅する。一般に、対数期にある細胞は、産生物の大量産生に寄与する。

標準バッチ系に対する好適な変形形態は、「フェドバッチ発酵」系である。典型的なバッチ系のこの変形形態では、発酵の進行に伴い基質が徐々に加えられる。フェドバッチ系は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する可能性が高い場合、及び培地中の基質量が限られた量であることが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系では、実際の基質濃度の測定は困難であり、従って、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ_２等の廃ガスの分圧等の測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において一般的であり、知られている。

連続発酵は、規定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、処理のために等量の馴化培地が同時に除去される開放系である。連続発酵は、一般に、細胞が主として対数増殖期にある一定の高密度で培養を維持する。連続発酵は、細胞の増殖及び／又は産生物の濃度に影響する１つ以上の因子の調節を可能にする。例えば、一実施形態では、炭素源又は窒素源等の制限栄養素は一定比率で維持されるが、他の全てのパラメータは調節することができる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子は連続的に変化させることができる。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとする。従って、培地を取り出すことによる細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度に対して平衡が保たれなければならない。連続発酵プロセスで栄養素及び増殖因子を調節する方法、並びに産生物形成速度を最大化するための手法は、工業微生物学の技術分野においてはよく知られている。

所定の実施形態では、本開示のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞によって発現／産生した関心対象のタンパク質は、遠心若しくは濾過によって培地から宿主細胞を分離する、又は必要であれば、細胞を破壊し、上清を細胞分画及び細胞破片から取り除くことによって、培養培地から回収することができる。典型的には、清浄化後、上清若しくは濾液のタンパク質成分は、塩、例えば、硫酸アンモニウムによって沈澱させられる。その後、沈澱したタンパク質は可溶化され、様々なクロマトグラフ法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過によって精製され得る。

ＶＩ．関心対象のタンパク質
本開示の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）は、任意の内因性又は異種タンパク質であってよく、そのようなＰＯＩの変異体であってもよい。タンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有し得る、又はその機能的形態が単量体若しくは多量体であるタンパク質である、即ち、タンパク質は、四次構造を有し、複数の同一（相同）若しくは非同一（異種）サブユニットから構成されるが、ここで、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、好ましくは関心対象の特性を備えるタンパク質である。例えば、所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、その未改変（親）細胞と比較して、少なくとも約０．５％超、少なくとも約１％超、少なくとも約５％超、少なくとも約６％超、少なくとも約７％超、少なくとも約８％超、少なくとも約９％超又は少なくとも約１０％以上のＰＯＩを産生する。

所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、（非改変）親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較して、ＰＯＩの増加した比生産性（Ｑｐ）を示す。例えば、比生産性（Ｑｐ）の検出は、タンパク質の産生を評価するために好適な方法である。比生産性（Ｑｐ）は、下記の方程式：
「Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ」
（式中、「ｇＰ」は、タンク中に産生されるタンパク質のグラムであり、「ｇＤＣＷ」は、タンク中の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラムであり、「ｈｒ」は、接種時点からの発酵時間（時間）であり、これは、産生時間及び増殖時間を含む）
を使用して決定することができる。

従って、所定の他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、未改変（親）細胞と比較して、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上の比生産性（Ｑｐ）の増加を含む。

所定の実施形態では、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリアーゼ（ｇｌｕｃａｎｌｙｓａｓｅｓ）、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ－ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。

従って、所定の実施形態では、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、酵素番号（ＥＣ）のＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５若しくはＥＣ６から選択される酵素である。

所定の他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、アミラーゼをコードする発現構築物を含む。多種多様なアミラーゼ酵素及びその変異体が、当業者に知られている。例えば、国際公開第２００６／０３７４８４号パンフレット及び同第２００６／０３７４８３号パンフレットは、溶媒安定性が改善された変異α－アミラーゼを記載しており、国際公開第１９９４／１８３１４号パンフレットは、酸化的に安定なα－アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第１９９９／１９４６７号パンフレット、同第２０００／２９５６０号パンフレット及び同第２０００／６００５９号パンフレットは、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α－アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第２００８／１１２４５９号パンフレットは、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）７０７番に由来するα－アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第１９９９／４３７９４号パンフレットは、マルトジェニックα－アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第１９９０／１１３５２号パンフレットは、超耐熱性α－アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第２００６／０８９１０７号パンフレットは、粒状デンプン加水分解活性を有するα－アミラーゼ変異体を開示している。

細胞内及び細胞外で発現されたタンパク質の活性を検出及び測定するためには、当業者に知られる様々なアッセイがある。

国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットは、本明細書に記載したアミラーゼ活性の検出のために有用なＣｅｒａｌｐｈａ α－アミラーゼ活性アッセイを開示している。

本発明の特定の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解することができるが、それらの実施例は限定するものと解釈すべきでない。材料及び方法の変更は、当業者には明白であろう。

実施例１
ＲＧＨＲ遺伝子座を標的とするＣＡＳ９ベクターの構築
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号１）由来のＣａｓ９タンパク質は、Ｎ末端核局在化配列（ＮＬＳ、「ＡＰＫＫＫＲＫＶ」；配列番号３）、Ｃ末端ＮＬＳ（「ＫＫＫＫＬＫ」；配列番号４）及びデカ－ヒスチジンタグ（「ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ」；配列番号５）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥプロモーター配列（配列番号６）及びターミネーター配列（配列番号７）が加えてバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（配列番号２）に対してコドン最適化し、製造業者の使用説明書に従って、下記の表１に示したフォワード（配列番号８）プライマー及びリバース（配列番号９）プライマー対を用いてＱ５ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して増幅させた。

プラスミドｐＫＢ３２０（配列番号１１）の骨格（配列番号１０）は、製造業者の使用説明書に従って、以下の表２に示したフォワード（配列番号１２）プライマー及びリバース（配列番号１３）プライマー対を用いて、Ｑ５ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して増幅させた。

ＰＣＲ産物は、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ５カラムを製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。続いて、ＰＣＲ産物は、２個の断片を等モル比で混合し、Ｑ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いる長時間オーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＰＯＥ－ＰＣＲ）により組み立てた。以下のＰＯＥ－ＰＣＲ反応サイクルを実行した：９８℃で５秒間、６４℃で１０秒間、７２℃で４分１５秒間を３０サイクル。５μＬのＰＯＥ－ＰＣＲ（ＤＮＡ）は、製造業者の使用説明書に従って、Ｔｏｐ１０Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に形質転換させ、５０μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシンを含有する、溶原性（Ｌ）ブロス（Ｍｉｌｌｅｒの処方；１重量／容積％のトリプトン、０．５重量／容積％の酵母抽出物、１重量／容積％のＮａＣｌ）上で選択し、１．５％の寒天を用いて固化させた。コロニーを３７℃で１８時間増殖させた。コロニーを採取し、ＱｉａｐｒｅｐＤＮＡミニプレップキットを製造業者の使用説明書に従って使用してプラスミドＤＮＡを調製し、５５μＬのｄｄＨ_２Ｏ中に溶出させた。このプラスミドＤＮＡについてサンガーシーケンシングを行い、以下の表３に示すシーケンシングプライマーセットを使用して、正しい組み立てを確認した。

正確に組み立てられたプラスミドｐＲＦ６９４（配列番号２５）を使用して、下記に記載するように標的部位１（ＴＳ１；配列番号２８）及び標的部位２（ＴＳ２；配列番号２９）でＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ゲノムを編集するためのプラスミドｐＲＦ８０１（配列番号２６）及びｐＲＦ８０６（配列番号２７）を構築した。

Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｓｅｒＡ１オープンリーディングフレーム（配列番号３０）は、リバース方向に固有の標的部位（ＴＳ）である標的部位１（ＴＳ１；配列番号２８）を含有する。ＴＳ１は、リバース方向にプロト－スペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ；配列番号３１）に隣接する。標的部位は、可変標的化（ＶＴ）ドメイン（配列番号３２）をコードするＤＮＡに変換され得る。ＶＴドメイン（配列番号３２）をコードするＤＮＡ配列は、細菌細胞のＲＮＡポリメラーゼによって転写されると、標的部位１を標的化する機能的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（配列番号３４）を産生するように、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ、配列番号３３）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に融合される。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、プロモーターが、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号３３）の５’に位置し、ターミネーターが、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号３３）の３’に位置するように、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞において作動可能なプロモーター（例えば、ｓｐａｃプロモーター；配列番号３５）及びバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞において作動可能なターミネーター配列（例えば、ラムダファージのｔ０ターミネーター配列；配列番号３６）に作動可能に連結された。

Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ開裂に応答してｓｅｒＡ１遺伝子を欠失させるための編集鋳型は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に由来する２本のホモロジーアームの増幅によって作製した。第１断片（ホモロジーアーム１）は、ｓｅｒＡ１ＯＲＦ（配列番号３７）の直ぐ上流（５‘）の５００ヌクレオチドに一致する。この断片は、製造業者の使用説明書に従ってＱ５ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）並びに下記の表４に列挙したフォワード（配列番号３８）プライマー及びリバース（配列番号３９）プライマーを用いて増幅させた。これらのプライマーは、第１断片の３’末端上の第２断片の５’末端と相同である１８ヌクレオチド及び第１断片の５’末端のｐＲＦ６９４と相同である２０ヌクレオチドを組み込んでいる。

第２断片（ホモロジーアーム２）は、ｓｅｒＡ１ＯＲＦ（配列番号４０）の３’末端の直ぐ下流の５００ヌクレオチドに一致する。この断片は、製造業者の使用説明書に従って、Ｑ５ＤＮＡポリメラーゼ並びに下記の表５に列挙したフォワード（配列番号４１）プライマー及びリバース（配列番号４２）プライマーを用いて増幅させた。これらのプライマーは第２断片の５’末端上の第１断片の３’末端と相同である２８ヌクレオチド及び第２断片の３’末端上のｐＲＦ６９４と相同である２１ヌクレオチドを組み込んでいる。

標的部位１のｇＲＮＡ発現カセット（配列番号４３）、第１ホモロジーアーム（配列番号３７）及び第２ホモロジーアーム（配列番号４０）をコードするＤＮＡは、標準分子生物学技術を用いてｐＲＦ６９４（配列番号２５）内に組み立て、プラスミドｐＲＦ８０１（配列番号２６）、Ｃａｓ９発現カセット（配列番号２）を含有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）シャトルプラスミド、ｓｅｒＡ１ＯＲＦ内のｇＲＮＡ標的化ＴＳ１ａをコードするｇＲＮＡ発現カセット（配列番号４３）並びに第１ホモロジーアーム（配列番号３７）及び第２ホモロジーアーム（配列番号４０）から構成される編集鋳型（配列番号４４）を含有するプラスミドｐＲＦ６９４（配列番号２５）を組み立てた。プラスミドは、上記の表３に示したオリゴヌクレオチド（プライマー）を用いるサンガーシーケンシングによって検証した。

Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ１オープンリーディングフレーム（配列番号４５）は、リバース鎖上の固有の標的部位（ＴＳ）である標的部位２（ＴＳ２；配列番号２８）を含有する。この標的部位は、リバース鎖上のプロト－スペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ；配列番号４６）に隣接する。この標的部位は、可変標的化（ＶＴ）ドメイン（配列番号４７）をコードするＤＮＡに変換され得る。ＶＴドメイン（配列番号４７）をコードするＤＮＡ配列は、細菌細胞のＲＮＡポリメラーゼによって転写されると、標的部位２を標的化する機能的ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（配列番号４８）を産生するように、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ；配列番号３３）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に融合される。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、プロモーターが、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号４８）の５’に位置し、ターミネーターが、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号４８）の３’に位置するように、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞において作動可能なプロモーター（例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、配列番号３５由来のｓｐａｃプロモーター）及びバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）細胞において作動可能なターミネーター（例えば、ラムダファージのｔ０ターミネーター配列；配列番号３６）に作動可能に連結された。

Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ開裂に応答してｒｇｈＲ１遺伝子を改変するための編集鋳型は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に由来する２本のホモロジーアームの増幅によって作製した。第１断片は、ｒｇｈＲ１ＯＲＦ（ホモロジーアーム１；配列番号４９）の直ぐ上流（５‘）の５００ヌクレオチドに一致する。この断片は、製造業者の使用説明書に従って、Ｑ５ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）並びに下記の表６に列挙したフォワード（配列番号５０）プライマー及びリバース（配列番号５１）プライマーを用いて増幅させた。これらのプライマーは、第１断片の３‘末端上の第２断片の５’末端と相同である２３ヌクレオチド及び第１断片の５’末端のｐＲＦ６９４に相同である２０ヌクレオチドを組み込んでいる。

第２断片は、ｒｇｈＲ１ＯＲＦ（ホモロジーアーム２；配列番号５２）の３’末端の直ぐ下流の５００ヌクレオチドに一致する。この断片は、製造業者の使用説明書に従って、Ｑ５ＤＮＡポリメラーゼ並びに下記の表７に列挙したフォワード（配列番号５３）プライマー及びリバース（配列番号５４）プライマーを用いて増幅させた。これらのプライマーは第２断片の５’末端上の第１断片の３’末端と相同である２０ヌクレオチド及び第２断片の３’末端上のｐＲＦ６９４と相同である２１ヌクレオチドを組み込んでいる。

標的部位２のｇＲＮＡ発現カセット（配列番号５５）、第１ホモロジーアーム（配列番号４９）及び第２ホモロジーアーム（配列番号５２）をコードするＤＮＡは、標準分子生物学技術を用いてｐＲＦ６９４（配列番号２５）内に組み立て、ｐＲＦ８０６（配列番号２７）、Ｃａｓ９発現カセット（配列番号２）を含有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）シャトルプラスミド、ｒｇｈＲ１ＯＲＦ内のｇＲＮＡ標的部位２をコードするｇＲＮＡ発現カセット（配列番号５５）並びに第１ホモロジーアーム（配列番号４９）及び第２ホモロジーアーム（配列番号５２）から構成される編集鋳型（配列番号５６）を含有するプラスミドｐＲＦ６９４（配列番号２５）を組み立てた。プラスミドは、上記の表３に示したオリゴヌクレオチド（プライマー）を用いるサンガーシーケンシングによって検証した。

実施例２
ＣＡＳ９Ｙ１５５Ｈ変異体及び関連標的化プラスミドの構築
本実施例では、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９（配列番号５７）Ｙ１５５Ｈ変異体をｐＲＦ８０１（配列番号２６）及びｐＲＦ８０６プラスミド（配列番号２７）において構築した。ｐＲＦ８０１プラスミド（配列番号２６）若しくはｐＲＦ８０６プラスミド（配列番号２７）内に（Ｃａｓ９）Ｙ１５５Ｈ変異体を導入するために、部位特異的突然変異誘発は、製造業者の取り扱い説明書に従って、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キット並びに鋳型ＤＮＡとしてｐＲＦ８０１プラスミド（配列番号２６）若しくはｐＲＦ８０６プラスミド（配列番号２７）を用いて、下記の表８に示したフォワード（配列番号５８）プライマー及びリバース（配列番号５９）プライマーを使用して実施した。

結果として生じた反応産物であるｐＲＦ８２７（配列番号６０）は、（Ｃａｓ９）Ｙ１５５Ｈ変異発現カセット（配列番号６１）、ｓｅｒＡ１ＯＲＦ内のｇＲＮＡ標的化部位１（ＴＳ１）をコードするｇＲＮＡ発現カセット（配列番号４３）、並びに第１（配列番号３７）及び第２（配列番号４０）ホモロジーアームから構成される編集鋳型（配列番号４４）；又は（Ｃａｓ９）Ｙ１５５Ｈ変異発現カセット（配列番号６１）、ｒｇｈＲ１ＯＲＦ内のｇＲＮＡ発現カセット（配列番号５５）標的化部位２（ＴＳ２）並びに第１（配列番号４９）及び第２（配列番号５２）ホモロジーアームから構成される編集鋳型（配列番号５６）から構成されたｐＲＦ８５６（配列番号６２）を含んでいた。これらのプラスミドＤＮＡは、上記の表３に示すシーケンシングプライマー（プライマー）を使用して、正確な組み立てを検証するためにサンガーシーケンシングを行った。

プラスミドｐＲＦ８６２の構築
プラスミドｐＲＦ８６２（配列番号７７）は、ｐＲＦ８２７（配列番号６０）からのＹ１５５Ｈ（変異体）置換を含むＣａｓ９ＯＲＦの断片（配列番号６３）を移動させることによって構築され、下記の表９に示したフォワード（配列番号６４）プライマー及びリバース（配列番号６５）プライマーを用いて増幅させた。

第２断片（配列番号６７）は、それが上記のｐＲＦ８２７断片（配列番号６０）上に含有される断片を除く全プラスミドを含むように、ｐＲＦ６９４（配列番号６６）から増幅させた。この断片は、組み立てのためにｐＲＦ８２７断片（配列番号６０）の５’及び３’末端とホモロジーを共有しており、下記の表１０に記載したフォワード（配列番号６８）プライマー及びリバース（配列番号６９）プライマーを用いて増幅させた。

２つの断片は、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒを製造業者の取り扱い説明書に従って使用して組み立て、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞内に形質転換させた。プラスミド配列は、上記の表３に示したオリゴヌクレオチド（プライマー）を用いるサンガー法によって検証した。配列が検証された単離物は、プラスミドｐＲＦ８６２（配列番号７７）として保存した。

ｒｇｈＲ２ＯＲＦ（配列番号７１）を標的化し、３個のイン－フレーム終止コドンを挿入するプラスミドであるｐＲＦ８６９（配列番号７０）は、２つの部分を使用して構築した。ｒｇｈＲ２ＯＲＦ（配列番号７１）を改変するための編集鋳型（配列番号７３）及びｒｇｈＲ２ＯＲＦ（配列番号７１）を標的化するｇＲＮＡ発現カセット（配列番号７４）を含む第１部（配列番号７２）は、ＩＤＴによって合成し、下記の表１１に示したフォワード（配列番号７５）プライマー及びリバース（配列番号７６）プライマーを用いた組み立てのために増幅させた。

Ｃａｓ９発現カセットを含むｐＲＦ８６２（配列番号７７）由来の第２部（配列番号７７）及び全てのプラスミド成分は、下記の表１２に示したフォワード（配列番号７８）プライマー及びリバース（配列番号７９）プライマーを用いて増幅させた。

これら２つの部分は、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒを製造業者の取り扱い説明書に従って使用して組み立て、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換させた。プラスミド配列は、上記の表３に示したオリゴヌクレオチド（プライマー）を用いるサンガー法によって検証した。配列検証済み単離物は、ｐＲＦ８６９（配列番号７０）として保存した。

数個の追加のＣａｓ９プラスミドは、上記の実施例１及び２に記載したように組み立てた。それらのプラスミドは、標的部位（ＴＳ）配列及び編集鋳型作用と一緒に、下記の表１３に列挙した。下記の表１３で使用したように、用語「ＳＩＤ」は、「配列」番号の略語である。

実施例３
様々なＲＧＨＲ遺伝子座対立遺伝子を含むバチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）株を発現するアミラーゼの構築
本実施例では、一連のｒｇｈＲ遺伝子座対立遺伝子は、変異サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｓｐ．）α－アミラーゼ（例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／１００７２０号パンフレットに記載された変異サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｓｐ．）α－アミラーゼ）をコードする発現カセットを含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株内に導入した。より特別には、ＬＤＮ１４３と指定された親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株は、（ａ）天然ｒｇｈＲ遺伝子座、（ｂ）ｓｅｒＡ遺伝子（配列番号３０）の欠失、ｌｙｓＡ遺伝子（配列番号９２）の欠失及び２個のα－アミラーゼ発現カセットを含む。

例えば、ｓｅｒＡ遺伝子座内に統合された第１発現カセット（配列番号９３）は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号９８）に作動可能に連結したサイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｓｐ．）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結したサイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｓｐ．）変異αアミラーゼ（配列番号９７）に作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬシグナル配列（配列番号９６）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ５’－ＵＴＲ（配列番号９５）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したｓｅｒＡＯＲＦ（配列番号３０）及び合成ｐ３プロモーター（国際公開第２０１７／１５２１６９号パンフレットに記載された配列番号９４）を含む。ａｍｙＬ遺伝子座内に統合された第２発現カセット（配列番号９９）は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号９８）に作動可能に連結したサイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｓｐ．）変異αアミラーゼ（配列番号９７）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結したａｍｙＬシグナル配列（配列番号９６）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ５’－ＵＴＲ（配列番号９５）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したｌｙｓＡ栄養要求性マーカー（配列番号９２）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター（配列番号１００）を含む。

スペクチノマイシンマーカー（配列番号１０２）、ＸｙｌＲリプレッサー（配列番号１０３）をコードするＤＮＡ及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＣｏｍＫタンパク質（配列番号１０５）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したｘｙｌＡプロモーター（配列番号１０４）（例えば、ＬｉｕａｎｄＺｕｂｅｒ，１９９８；Ｈａｍｏｅｎｅｔａｌ．，１９９８；米国特許出願公開第２００６／０１９９２２２号明細書を参照されたい）を含有するｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号１０１）を含むＬＤＮ１４３細胞／株の１バージョンは、ローリングサークル増幅法（ＴｒｕｅＰｒｉｍｅＲＣＡ，Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して、ｐＲＦ８６９（配列番号７０）、ｐＲＦ８７４（配列番号８０）、ｐＲＦ８７９（配列番号８３）、ｐＲＦ８９９（配列番号８６）若しくはｐＲＦ９０１（配列番号８９）プラスミドを用いて形質変換させた。

手短には、ＬＤＮ１４３／ｐＢｌ．ｃｏｍＫコンピテント細胞を生成した。ＬＤＮ１４３／ｐＢｌ．ｃｏｍＫ株は、１００ｐｐｍのスペクチノマイシンを含有する３７℃のＬブロス内で２５０ＲＰＭでの振とうにより一晩増殖させた。培養物は、１００ｐｐｍのスペクチノマイシンを含有する新鮮Ｌブロス内で０．７のＯＤ_６００に希釈した。この新規培養物を１時間に渡り３７℃及び２５０ｒｐｍで増殖させた。Ｄ－キシロースを０．１重量／容積％に添加し、培養物をさらに４時間増殖させた。細胞を７分間に渡り１７００ｇで収穫した。細胞を１０重量／容積％のＤＭＳＯを含有する使用済み培地の４分の１の培養液量中に再懸濁させた。１００μＬの細胞を１０μＬのｐＲＦ８６９（配列番号７０）、ｐＲＦ８７４（配列番号８０）、ｐＲＦ８７９（配列番号８３）、ｐＲＦ８９９（配列番号８６）若しくはｐＲＦ９０１（配列番号８９）のプラスミドＲＣＡ増幅産物と混合した。細胞／ＤＮＡ混合物を１時間半に渡り３７℃、１４００ＲＰＭでインキュベートした。この混合物を次に、２０ｐｐｍのカナマイシンを含有するＬ寒天プレート上でプレーティングした。接種したプレートを４８～７２時間に渡り３７℃でインキュベートした。２０ｐｐｍのカナマイシンを含有するＬ寒天上で形成されたコロニーは、下記に記載するように遺伝子座の改変を確証するためにコロニーＰＣＲを用いてスクリーニングした。

ｐＲＦ８６９（配列番号７０）を用いて形質変換させた細胞については、ｒｇｈＲ２遺伝子は、標準ＰＣＲ技術を使用して、下記の表１４に列挙したフォワード（配列番号１０６）プライマー及びリバース（配列番号１０７）プライマーを用いて増幅させた。

このＰＣＲ産物、ｒｇｈＲ２（配列番号１０８）の標的化領域を含む１，１６４ヌクレオチド断片は、下記の表１５に示したフォワード（配列番号１１０）プライマーを用いる３つのインフレームナンセンス突然変異を含むｒｇｈＲ２_ｓｔｏｐ対立遺伝子（配列番号１０９）の導入を確証するためにサンガー法を用いてシーケンシングした。ｒｇｈＲ２_ｓｔｏｐ対立遺伝子（配列番号１０９）を備える単離物は、株ＢＦ３１４として保存した。

ｐＲＦ８７４（配列番号８０）を用いて形質変換させた細胞については、ｒｇｈＲ１遺伝子領域は、下記の表１６に示したフォワード（配列番号１１１）プライマー及びリバース（配列番号１１２）プライマーを用いて増幅させた。

表１６におけるプライマーによって産生した天然ｒｇｈＲ１断片（配列番号１１３）は、長さが１，４９９ヌクレオチドである。ｒｇｈＲ１遺伝子が欠失している場合（ΔｒｇｈＲ１）、表１６においてプライマーによって産生された断片（配列番号１１４）は、長さが１，０９７ヌクレオチドであり、電気泳動法上では明らかにより短い。欠失ｒｇｈＲ１対立遺伝子（ΔｒｇｈＲ１；配列番号１１４）を含むＬＤＮ１４３の単離物は、株ＢＦ３２４として保存した。

ｐＲＦ８７９（配列番号８３）を用いて形質変換させた細胞については、ｒｇｈＲ２遺伝子座は、下記の表１７に示したフォワード（配列番号１１５）プライマー及びリバース（配列番号１１６）プライマーを用いて増幅させた。

表１７におけるプライマーによって産生した天然ｒｇｈＲ２断片（配列番号１１７）は、長さが１，６２９ヌクレオチドである。ｒｇｈＲ２遺伝子が欠失している場合（ΔｒｇｈＲ２）、表１７においてプライマーによって産生した断片（配列番号１１８）は、長さが１，２４８ヌクレオチドであり、電気泳動法上では明らかにより短い。ｒｇｈＲ２遺伝子座対立遺伝子（配列番号１１８）を含むＬＤＮ１４３の単離物は、株ＢＦ３７７として保存した。

ｐＲＦ８９９（配列番号８６）を用いて形質変換させた細胞については、ｒｇｈＲ２ｒｇｈＲ１領域は、下記の表１８に示したフォワード（配列番号１１９）プライマー及びリバース（配列番号１２０）プライマーを用いて増幅させた。

親株ＬＤＮ１４３から表１８におけるプライマーによって産生した天然ｒｇｈＲ２ｒｇｈＲ１断片（配列番号１２１）は、長さが２，３５３ヌクレオチドである。ｒｇｈＲ２及びｒｇｈＲ１遺伝子が欠失している場合（ΔｒｇｈＲ２ ΔｒｇｈＲ１）、表１８においてプライマーによって産生された断片（配列番号１２２）は、長さが１，４０１ヌクレオチドであり、電気泳動法上では明らかにより短い。ΔｒｇｈＲ２遺伝子 ΔｒｇｈＲ１対立遺伝子（配列番号１２２）を含むＬＤＮ１４３の単離物は、株ＢＦ３８９として保存した。

ｐＲＦ９０１（配列番号８９）を用いて形質変換させた細胞については、ｒｇｈＲ２遺伝子座は、下記の表１９に示したフォワード（配列番号１２３）プライマー及びリバース（配列番号１２４）プライマーを用いて増幅させた。

親株ＬＤＮ１４３から表１９におけるプライマーによって産生した天然ｒｇｈＲ２断片（配列番号１２５）は、長さが３，２６５ヌクレオチドである。ｒｇｈＲ２、ｒｇｈＲ１、ｙｖｚＣ及び３６４４遺伝子が欠失している場合（ΔｒｇｈＲ２、ΔｒｇｈＲ１、ΔｙｖｚＣ及びΔ３６４４）、表１９におけるプライマーによって産生した断片（配列番号１２６）は、長さが１，５９６ヌクレオチドであり、電気泳動法上では明らかにより短い。ΔｒｇｈＲ２、ΔｒｇｈＲ１、ΔｙｖｚＣ及びΔ３６４４対立遺伝子エオ含むＬＤＮ１４３の単離物は、ＢＦ３９１として保存した。

実施例４
改変ＲＧＨＲ遺伝子座を備えるバチルス（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）株におけるアミラーゼの産生
様々なｒｇｈＲ遺伝子座対立遺伝子がα－アミラーゼの産生に及ぼす作用を決定するために、株を（その全体として参照により本明細書に組み込まれる）国際公開第２０１８／１５６７０５明細書に一般に記載されたように、３回ずつ標準的小規模アッセイ条件下で増殖させた。変異（サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｓｐ．））α－アミラーゼの収率は、製造業者の取り扱い説明書に従って、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Ｐｅｉｒｃｅ）を使用することによって決定した。従って、各株に対する平均α－アミラーゼ産生は、下記の表２０に示したように決定し、親株ＬＤＮ１４３に標準化した。

従って表２０に記載したように、ｒｇｈＲ遺伝子座における突然変異を伴うＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株は、ｒｇｈＲ遺伝子座に対する野生型である、匹敵する親細胞（ＬＤＮ１４３）よりもおよそ２３～６２％多い異種アミラーゼタンパク質の、増加した産生を証明している。

実施例５
改変ＲＧＨＲ遺伝子座を備えるバチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）株内でのプルケリミン産生
上記のセクションＩＩＩにおいて手短に記載したように、ｒｇｈＲ遺伝子座の特定の特徴は、鉄捕捉顔料であるプルケリミン酸を産生することに責任を担うオペロンの転写制御である。例えば、プルケリミン酸は、細胞外で鉄イオンと反応して不溶性の赤色顔料を産生することが知られている。この赤色顔料は、ナトリウム塩として再可溶化され得、４１０ｎｍでの吸光度を用いて定量することができる（ＵｆｆｅｎａｎｄＣａｎａｌｅ－Ｐａｒｏｌａ，１９７２）。手短には、１０ｍＬの培養上清を１０分間に渡り４０００ＲＰＭで採取した。ペレットは、水を用いて２回洗浄した。ペレットを１ｍＬの１ＮのＮａＯＨ中に再懸濁させ、室温で１０分間に渡りインキュベートし、不溶性のプルケリミンを可溶性のプルケリミン酸ナトリウムに変換させた。残留している破片は、１４０００ＲＰＭでの短時間の遠心分離によって取り除いた。４１０ｎｍでの吸光度を１ＮのＮａＯＨブランクに対して測定した。

従って、上記の表２１に示したように、ｒｇｈＲ遺伝子座における数個の突然変異は、親に比較してプルケリミンの産生を約３０～５０％有意に低減させたが（例えば、ＢＦ３１４及びＢＦ３７７）、他方数個の他の突然変異は、プルケリミンに産生を親に比較して約１０～２０％増加させたので（例えば、ＢＦ３２４、ＢＦ３８９及びＢＦ３９１）、これはｒｇｈＲ遺伝子座における突然変異がプルケリミン酸の生合成を制御することを示している。

異種アミラーゼタンパク質を産生する間の様々な株についての生合成の相対収率を測定するために、下記の表２２に提示したように、２００μＬの培養物の光学密度（ＯＤ）を６００ｎｍで測定した。

参考文献
ＰＣＴ国際公開第１９９４／１８３１４号明細書
ＰＣＴ国際公開第１９９９／１９４６７号明細書
ＰＣＴ国際公開第１９９９／４３７９４号明細書
ＰＣＴ国際公開第２０００／２９５６０号明細書
ＰＣＴ国際公開第２０００／６００５９号明細書
ＰＣＴ国際公開第２００４／０１１６０９号明細書
ＰＣＴ国際公開第２００６／０３７４８３号明細書
ＰＣＴ国際公開第２００６／０３７４８４号明細書
ＰＣＴ国際公開第２００６／０８９１０７号明細書
ＰＣＴ国際公開第２００８／１１２４５９号明細書
ＰＣＴ国際公開第２０１４／１６４７７７号明細書
ＰＣＴ国際公開第２０１８／１５６７０５号明細書
ＡｌｂｅｒｔｉｎｉａｎｄＧａｌｉｚｚｉ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２：１２０３－１２１１，１９８５．
Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒｅｔａｌ．，“ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ”ｖｏｌ．５，Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ，ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＶｅｒｌａｇＣｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９８４．
ＢｏｔｓｔｅｉｎａｎｄＳｈｏｒｔｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：４７１９，１９８５．
Ｂｒｏｄｅｅｔａｌ．，“ＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎＢＰＮ’ｖａｒｉａｎｔｓ：ｉｎｃｒｅａｓｅｄｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｎｓｕｒｆａｃｅ－ｂｏｕｎｄｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｖｉａｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｕｒｆａｃｅａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（１０）：３１６２－３１６９，１９９６．
Ｃａｓｐｅｒｓｅｔａｌ．，“ＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆＳｅｃ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆａｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｍｏｄｅｌｐｒｏｔｅｉｎｉｎＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｂｙｓａｔｕｒａｔｉｏｎｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅＮ－ｄｏｍａｉｎｏｆｔｈｅＡｍｙＥｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ”，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８６（６）：１８７７－１８８５，２０１０．
Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１－１１５，１９７９．
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１１９－１２９，１９９４．
Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａ／．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．，１２：３８７－３９５，１９８４．
Ｅａｒｌｅｔａｌ．，“ＥｃｏｌｏｇｙａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ”，ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，１６（６）：２６９－２７５，２００８．
Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，”ｉｎＨａｒｗｏｏｄｅｔａｌ．（ｅｄ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｒｐ．，１９８９．
Ｆｉｓｈｅｒｅｔ．ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：２１３－２１７，１９８１．
Ｇｕｅｒｏｔ－Ｆｌｅｕｒｙ，Ｇｅｎｅ，１６７：３３５－３３７，１９９５．
Ｈａｍｏｅｎｅｔａｌ．，“ＣｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅｉｎＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ：ｓｈａｒｅｄｕｓｅｄｏｆｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ”，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９：９－１７，２００３．
Ｈａｍｏｅｎｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１２：１５３９－１５５０，１９９８．
Ｈａｍｐｔｏｎｅｔａｌ．，ＳｅｒｏｌｏαｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＡＰＳＰｒｅｓｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，１９９０．
ＨａｒｄｗｏｏｄａｎｄＣｕｔｔｉｎｇ（ｅｄｓ．）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＢａｃｉｌｌｕｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０．
Ｈａｙａｓｈｉｅｔａｌ．，２００６
Ｈａｙａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９（６）：１７１４－１７２９，２００６
Ｈｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１６：７３５１，１９８８．
Ｈｏｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ７７：６１，１９８９．
Ｈｏｃｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３：１９２５－１９３７，１９６７．
Ｈｏｌｕｂｏｖａ，ＦｏｌｉａＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０：９７，１９８５．
Ｈｏｐｗｏｏｄ，ＴｈｅＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＭｕｔａｎｔｓｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｒ．ＮｏｒｒｉｓａｎｄＤ．Ｗ．Ｒｉｂｂｏｎｓ，ｅｄｓ．）ｐｐ３６３－４３３，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７０．
Ｈｏｒｔｏｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ７７：６１，１９８９．
Ｈｓｉａｅｔａｌ．，ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ．，２４２：２２１－２２７，１９９９．
ＩｇｌｅｓｉａｓａｎｄＴｒａｕｔｎｅｒ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ１８９：７３－７６，１９８３．
Ｊｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，“Ｃｅｌｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｆｆｅｃｔｓｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｓｅｃｒｅｔｅｄｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄａｎｄｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４６（Ｐｔ１０：２５８３－２５９４，２０００．
ＬｉｕａｎｄＺｕｂｅｒ，１９９８，
Ｌｏｅｔａｌ．，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵＳＡ８１：２２８５，１９８５．
Ｍａｄｄｏｘｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２１１，１９８３．
Ｍａｎｎｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：１３１－１３５，１９８６．
ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０：２０３，１９８４．
ＭａｃＤｏｎａｌｄ，“Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｉｎｉｃａｃｉｄ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，９６：５３３－５３８，１９６５．
ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０．
Ｏｇｕｒａ＆Ｆｕｊｉｔａ，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ．，２６８（１）：７３－８０．２００７．
Ｏｌｅｍｐｓｋａ－Ｂｅｅｒｅｔａｌ．，“Ｆｏｏｄ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｆｒｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ－－ａｒｅｖｉｅｗ”’Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４５（２）：１４４－１５８，２００６．
Ｐａｌｍｅｒｏｓｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ２４７：２５５－２６４，２０００．
ＰａｒｉｓｈａｎｄＳｔｏｋｅｒ，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ１５４：１５１－１５７，１９９７．
ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８．
Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３，ＩｎＡ．Ｌ．Ｓｏｎｎｅｓｈｅｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｈｏｃｈ，ａｎｄＲ．Ｌｏｓｉｃｋ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓａｎｄＯｔｈｅｒＧｒａｍ－ＰｏｓｉｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉａ，Ｃｈａｐｔｅｒ４２，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
Ｒａｕｌｅｔａｌ．，“ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐａｒｔｉａｌｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｌｐｈａａｍｙｌａｓｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＭＴＣＣ１２１）ｕｓｉｎｇｓｏｌｉｄｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ”，ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１４．
ＳａｒｋａｒａｎｄＳｏｍｍｅｒ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ８：４０４，１９９０．
Ｓａｕｎｄｅｒｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５７：７１８－７２６，１９８４．
Ｓｈｉｍａｄａ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：１５７；１９９６
ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２，１９８１．
Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４１９８６．
ＳｔａｈｌａｎｄＦｅｒｒａｒｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：４１１－４１８，１９８４．
Ｓｔａｈｌｅｔａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：４１１－４１８，１９８４．
Ｔａｒｋｉｎｅｎ，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１００７－１０１３，１９８３．
Ｔｒｉｅｕ－Ｃｕｏｔｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，２３：３３１－３４１，１９８３．
ＵｆｆｅｎａｎｄＣａｎａｌｅ－Ｐａｒｏｌａ，“ＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｉｎｉｃａｃｉｄｂｙＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ”，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１１１（１）：８６－９３，１９７２．
ＶａｎＤｉｊｌａｎｄＨｅｃｋｅｒ，“Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ：ｆｒｏｍｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｏｓｕｐｅｒ－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇｃｅｌｌｆａｃｔｏｒｙ”，ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｉｅｓ，１２（３）．２０１３．
Ｖｏｒｏｂｊｅｖａｅｔａｌ．，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７：２６１－２６３，１９８０．
Ｗａｒｄ，“Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，”ｉｎＦｏｇａｒｔｙ（ｅｄ．）．，ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｎｚｙｍｅｓａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ２５１－３１７，１９８３．
Ｗｅｌｌｓｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１：７９１１－７９２５，１９８３．
Ｗｅｓｔｅｒｓｅｔａｌ．，“Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓａｓｃｅｌｌｆａｃｔｏｒｙｆｏｒｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｈｏｓｔｏｒｇａｎｉｓｍ”，ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ．，１６９４：２９９－３１０，２００４．
Ｙａｎｇｅｔａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６０：１５－２１，１９８４．
Ｙａｎｇｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１：２３７－２４９，１９８３．
Ｙｏｕｎｇｍａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２３０５－２３０９，１９８３．

Claims

天然ｒｇｈＲ染色体遺伝子座を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、前記改変細胞は、（ａ）改変ｒｇｈＲ１遺伝子、（ｂ）改変ｒｇｈＲ２遺伝子、（ｃ）改変ｒｇｈＲ１遺伝子及び改変ｒｇｈＲ２遺伝子、並びに（ｄ）改変ｒｇｈＲ１遺伝子、改変ｒｇｈＲ２遺伝子、改変ｙｖｚＣ遺伝子及び改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子から成る群から選択される前記ｒｇｈＲ染色体遺伝子座の少なくとも１つの改変を含み、前記改変細胞は、同一条件下で培養した場合に前記親細胞と比較して、増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞。
前記改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、コード化ＲｇｈＲ１タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全的に欠失させる遺伝子改変を含む、請求項１に記載の改変細胞。
前記改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、前記ｒｇｈＲ１遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、前記改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、前記コード化ＲｇｈＲ１タンパク質を発現しない、請求項１に記載の改変細胞。
前記改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、コード化ＲｇｈＲ２タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全的に欠失させる遺伝子改変を含む、請求項１に記載の改変細胞。
前記改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、前記ｒｇｈＲ２遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、前記改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、前記コード化ＲｇｈＲ２タンパク質を発現しない、請求項１に記載の改変細胞。
前記改変ｒｇｈＲ１遺伝子及び改変ＲｇｈＲ２遺伝子は、前記コード化ＲｇｈＲ１タンパク質及びＲｇｈＲ２それぞれを突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全的に欠失させる遺伝子改変を含む、請求項１に記載の改変細胞。
前記改変ｒｇｈＲ１遺伝子及び改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、前記ｒｇｈＲ１遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列及び前記ｒｇｈＲ２遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、前記改変ｒｇｈＲ１遺伝子は前記コード化ＲｇｈＲ１タンパク質を発現せず、及び前記改変ｒｇｈＲ２遺伝子は前記コード化ＲｇｈＲ２タンパク質をそれぞれ発現しない、請求項１に記載の改変細胞。
前記改変ｒｇｈＲ１、ｒｇｈＲ２、ｙｖｚＣ遺伝子及び改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子は、前記コード化ＲｇｈＲ１タンパク質、前記コード化ＲｇｈＲ２タンパク質、前記コード化ＹｖｚＣタンパク質及び前記コード化Ｂｌｉ３６４４タンパク質をそれぞれ突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全的に欠失させる遺伝子改変を含む、請求項１に記載の改変細胞。
前記改変ｒｇｈＲ１、ｒｇｈＲ２、ｙｖｚＣ及びＢｌｉ３６４４遺伝子は、前記ｒｇｈＲ１遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列、前記ｒｇｈＲ２遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列、前記ｙｖｚＣ遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列、並びに前記Ｂｌｉ３６４４遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列をそれぞれ突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含むが、前記改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、前記コード化ＲｇｈＲ１タンパク質を発現せず、前記改変ｒｇｈＲ２遺伝子は前記コード化ＲｇｈＲ２タンパク質を発現せず、前記改変ｙｖｚＣ遺伝子は前記コード化ＹｖｚＣタンパク質を発現せず、及び前記改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子は、前記コード化Ｂｌｉ３６４４タンパク質を発現しない、請求項１に記載の改変細胞。
前記改変細胞は、前記親細胞に比較して、低減した量の赤色顔料を産生する、請求項４又は請求項５に記載の改変細胞。
関心対象のタンパク質をコードする１つ以上の発現カセットを含む、請求項１に記載の改変細胞。
前記１つ以上の発現カセットは、アミラーゼタンパク質をコードする、請求項１１に記載の改変細胞。
天然ｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）であって、前記改変細胞は、前記ｒｇｈＲ２遺伝子を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる少なくとも１つの遺伝子改変を含み、前記改変細胞は、同一条件下で培養した場合に、前記親細胞に比較して、低減した量の赤色顔料を産生する改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞。
前記赤色顔料は、プルケリミン酸であるとさらに規定されている、請求項１２又は請求項１３に記載の改変細胞。
関心対象のタンパク質をコードする１つ以上の発現カセットを含む、請求項１３に記載の改変細胞。
前記１つ以上の発現カセットは、アミラーゼタンパク質をコードする、請求項１５に記載の改変細胞。
前記改変細胞は、前記親細胞に比較して、増加した量の関心対象のタンパク質を産生する、請求項１３に記載の改変細胞。
改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で増加した量の関心対象のタンパク質を産生するための方法であって、
（ａ）親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を入手し、及び、（ｉ）ｒｇｈＲ１遺伝子、（ｉｉ）ｒｇｈＲ２遺伝子、（ｉｉｉ）ｙｖｚＣ遺伝子及び（ｉｖ）Ｂｌｉ３６４４遺伝子又はそれらの組み合わせから成る群から選択される前記ｒｇｈＲ遺伝子座の少なくとも１つの遺伝子を遺伝子改変する工程、並びに
（ｂ）関心対象のタンパク質を産生するための好適な条件下で前記改変細胞を発酵させる工程を含み、
前記改変細胞は、前記同一条件下で培養した場合に前記親細胞に比較して、増加した量の関心対象のタンパク質を産生する方法。
前記改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、前記コード化ＲｇｈＲ１タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、及び／又は前記改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、前記ｒｇｈＲ１遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含むが、前記改変ｒｇｈＲ１遺伝子は、前記コード化ＲｇｈＲ１タンパク質を発現しない、請求項１８に記載の方法。
前記改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、前記コード化ＲｇｈＲ２タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、及び／又は前記改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、ｒｇｈＲ２遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含むが、前記改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、前記コード化ＲｇｈＲ２タンパク質を発現しない、請求項１８に記載の方法。
前記改変ｙｖｚＣ遺伝子は、前記コード化ＹｖｚＣタンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、及び／又は前記改変ｙｖｚＣ遺伝子は、ｙｖｚＣ遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含むが、前記改変ｙｖｚＣ遺伝子は、前記コード化ＹｖｚＣタンパク質を発現しない、請求項１８に記載の方法。
前記改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子は、前記コード化Ｂｌｉ３６４４タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含み、及び／又は前記改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子は、前記Ｂｌｉ３６４４遺伝子の５’－ＵＴＲ配列及び／又は３’－ＵＴＲ配列を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全に欠失させる遺伝子改変を含むが、前記改変Ｂｌｉ３６４４遺伝子は、前記コード化Ｂｌｉ３６４４タンパク質を発現しない、請求項１８に記載の方法。
前記細胞は、関心対象のタンパク質をコードする１つ以上の発現カセットを含む、請求項１８に記載の方法。
前記１つ以上の発現カセットは、アミラーゼタンパク質をコードする、請求項２３に記載の方法。
前記改変細胞は、低減した量の赤色顔料を産生する、請求項１８に記載の方法。
改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で関心対象のタンパク質を産生するための方法であって、前記改変細胞は、発酵中に低減した量の赤色顔料を産生し、前記方法は、
（ａ）親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を入手し、及び前記ｒｇｈＲ遺伝子座の前記ｒｇｈＲ２遺伝子を遺伝子改変する工程、並びに
（ｂ）関心対象の前記タンパク質を産生するための好適な条件下で前記改変細胞を発酵させる工程を含み、
前記改変細胞は、前記同一条件下で培養した場合に前記親細胞に比較して、低減した量の赤色顔料を産生する方法。
前記改変ｒｇｈＲ２遺伝子は、前記コード化ＲｇｈＲ２タンパク質を突然変異させるか、破壊するか、部分的に欠失させるか、又は完全的に欠失させる遺伝子改変を含む、請求項２６に記載の方法。
前記細胞は、関心対象のタンパク質をコードする１つ以上の発現カセットを含む、請求項２６に記載の方法。
前記１つ以上の発現カセットは、アミラーゼタンパク質をコードする、請求項２８に記載の方法。
前記改変細胞は、前記同一条件下で培養した場合に、前記親細胞に比較して、増加した量の関心対象の前記タンパク質を産生する、請求項２８に記載の方法。