JP2022548837A - がんの診断、予後、および治療のための方法 - Google Patents

Abstract

ＮＫ細胞の細胞表面上のＣＤ９タンパク質の獲得は、ＮＫ細胞に免疫抑制性表現型を付与し、免疫療法におけるそれらの効果を低下させる。ＣＤ９は、トロゴサイトーシスのプロセスを通じて、腫瘍細胞から腫瘍環境に存在するＮＫ細胞に移入することができる。ＮＫ細胞抗腫瘍活性を強化する方法は、ＮＫ細胞免疫療法を受ける資格がある患者について、腫瘍微小環境内でのＮＫ受容体リガンド発現を評価することを含み得る。

Description

卵管卵巣の高悪性度漿液性がん（ＨＧＳＣ）は、主にその進行期診断の結果として最も致死的な婦人科悪性腫瘍であり、診断の時点で複数の視野に転移しており、治癒的治療が困難である。標準治療は、外科的デバルキングおよび白金ベースの化学療法で、５年以内に７０～８０％の再発の可能性がある。

最近、クリニックに２つの新しい治療様式が導入されたことで、ＨＧＳＣの女性に新たな希望がもたらされた。１つは、小分子ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ阻害剤（ＰＡＲＰｉ）の投与による合成致死性のパラダイムを利用する。これらは、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２遺伝子の機能喪失を保有するＨＧＳＣに対して臨床的に承認されている。

最近開発された第２の治療様式である免疫療法は、患者の免疫系が腫瘍を根絶する能力を回復することを目的とし、主にＴリンパ球の再活性化に焦点を当てたアプローチである。ＨＧＳＣ腫瘍は、機能的に疲弊したＴ細胞の高頻度、ならびにＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、およびＰＤ－Ｌ１などの高レベルの免疫チェックポイントタンパク質を示すが、ＨＧＳＣの免疫療法に対する応答は、失望的である。したがって、ＨＧＳＣ免疫微小環境内の細胞型のより深い理解は、免疫療法から最も利益を得る可能性が高い患者を選択するための予測的で機械的なバイオマーカーを特定するために役立ち得る。

１９７５年に発見されて以来、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍およびウイルス感染細胞に対して強力な細胞傷害活性を有する先天性リンパ球として認識されている。加えて、ＮＫ細胞は、免疫応答を調節するサイトカインのアレイも産生する。ＮＫ細胞は、その細胞傷害活性が抗原非依存的な様式で、かつ事前の感作の必要なしに生じるという点で、Ｔリンパ球とは機械論的に異なる。

代わりに、ＮＫ細胞機能は、活性化能および阻害能の両方を有する複数の生殖細胞系表面受容体によって媒介される細胞内シグナル伝達の厳密に調節された統合から生じる。腫瘍では、これらの二重エフェクター機能は、ＮＫ細胞に、腫瘍細胞を根絶するための両方の免疫監視における役割、および逆に腫瘍の進行を促進する免疫寛容微小環境の作成を与える。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞免疫療法を伴うがん療法を強化するための組成物、方法、およびキットが提供される。本明細書では、ＮＫ細胞の細胞表面上のＣＤ９タンパク質の獲得は、ＮＫ細胞に免疫抑制性表現型を付与し、免疫療法におけるそれらの効果を低下させることが示されている。データは、ＣＤ９が、トロゴサイトーシスのプロセスを通じて、卵巣がん細胞を含むがこれらに限定されない腫瘍細胞から、腫瘍環境に存在するＮＫ細胞に移入することができることを示す。本発明のいくつかの実施形態では、がんは、卵巣がんである。いくつかの実施形態では、がんは、卵巣漿液性がんである。いくつかの実施形態では、がんは、高悪性度漿液性がん（ＨＧＳＣ）である。他の実施形態では、ＣＤ９をＮＫ細胞に移入させるがんとしては、大腸がん、乳がん、肺腺がん、非小細胞肺がんなどが挙げられる。

一実施形態では、ＮＫ細胞免疫療法による治療のために選択された患者は、治療の前に、がん細胞上のＣＤ９の発現について評価される。いくつかの実施形態では、ＣＤ９を発現する高レベルのがん細胞の存在は、ＮＫ細胞療法と組み合わせてＣＤ９遮断剤を投与する必要性を示し、例えば、がん細胞集団の少なくとも約０．０１％の陽性、少なくとも約０．１％の陽性、少なくとも１％の陽性、少なくとも１０％の陽性、少なくとも２０％の陽性、少なくとも３０％の陽性、少なくとも５０％の陽性、またはそれ以上がＣＤ９^＋である。

いくつかの実施形態では、がんが、低レベルのＣＤ９^＋細胞、例えば、約５０％未満のＣＤ９^＋細胞、約４０％未満のＣＤ９^＋細胞、約３０％未満のＣＤ９^＋細胞、約２０％未満のＣＤ９^＋細胞、約１０％未満のＣＤ９^＋細胞を有すると決定される場合、患者は、ＮＫ細胞免疫療法のために選択され、例えば、個々のがんが、治療前、または臨床試験における層別化の前に、ＣＤ９の発現について評価される場合、患者は、それに応じて治療のために選択される。

ＮＫ細胞免疫療法による治療としては、有効用量の同種異系または自己集団のＮＫ細胞の投与を挙げることができるが、これらに限定されない。ＮＫ細胞は、投与前にインビトロで拡大することができる。ＮＫ細胞は、インビトロで前駆細胞集団から、例えば、脊髄血液、造血幹細胞などから分化させることができる。ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ９２細胞を含む、既製の細胞産物であり得る。ＮＫ細胞は、投与前に、例えば、ＣＡＲベクターの導入によって遺伝子改変され得る。ＮＫ細胞免疫療法による治療には、内因性ＮＫ細胞を活性化する薬剤、例えば、抗体、チェックポイント阻害剤、ＢＩＫＥ、ＴＲＩＫＥなどの投与も含まれ得る。

ＮＫ細胞免疫療法によるがんの治療において、免疫療法は、有効用量のＣＤ９を遮断する薬剤と組み合わせて提供されてもよく、その用量は、ＣＤ９遮断剤を含まない投与と比較して、ＮＫ細胞殺傷の阻害を低減するために効果的である。この目的のための薬剤としては、抗体、ペプチド、可溶性受容体、低分子などが挙げられる。抗体は、ＣＤ９に特異的に結合し得る。患者は、有効用量のＣＤ９に結合する薬剤で前処置され得る。有効用量の薬剤は、ＮＫ細胞とともに投与され得るか、またはＮＫ細胞投与後に投与され得る。

代替的な実施形態では、ＮＫ細胞は、患者に投与する前に、トロゴサイトーシスを阻害する薬剤で処置される。この目的のための薬剤としては、例えば、コンカナバリンＡ、ワートマニン、ＥＤＴＡ、ノコダゾール、およびサイトカラシンＤが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ９^＋がんの治療のための投与前にサイトカラシンＤで処置される。

ＮＫ細胞抗腫瘍活性を強化する方法は、ＮＫ細胞免疫療法を受けた患者について、腫瘍微小環境内でのＮＫ受容体リガンド発現を評価することを含み得る。かかる一実施形態では、末梢血検査を使用して、養子移入されたＮＫ細胞によるＣＤ９発現の増加を監視し、ＣＤ９の増加は、ＮＫ細胞が細胞傷害性について下方制御されていることを示す。かかる実施形態では、処置は、ＣＤ９の獲得を低減させるか、または代替療法を提供するように変更される。遮断ＣＤ９抗体は、ＮＫ免疫療法の前に投与することができるか、またはＮＫ細胞は、トロゴサイトーシスによるマーカー獲得を低減するために処置することができる。かかるバイオマーカーは、ＮＫ免疫療法に応答する可能性が最も高い患者の選択を導くだけでなく、患者応答性の耐久性を監視するために使用することができる。

他の実施形態では、ＮＫ細胞免疫療法から利益を受ける可能性が高い、ＮＫ細胞を活性化するＮＫ受容体リガンドを担持する卵巣がん腫瘍細胞を有する患者と、ＮＫ細胞免疫療法から利益を受ける可能性が低い、ＮＫ細胞を阻害するＮＫ受容体リガンドを担持する卵巣がん腫瘍細胞を有する患者とを区別するために、卵巣がん腫瘍におけるＮＫ受容体リガンド分布を決定するための方法が提供される。加えて、卵巣がん患者の予後不良を示す脱落膜様ＮＫ細胞のマーカー、ならびにより積極的な抗がん治療を必要とする、卵巣がんの治療を必要とする個体を特定するために、腫瘍浸潤ＮＫ細胞の集団における脱落膜様ＮＫ細胞の頻度を決定する方法が開示される。いくつかのかかる実施形態では、マーカーは、ＣＤ９である。

一態様では、卵巣がんを有する患者の予後不良を予測し、患者を卵巣がんについて治療する方法が提供され、本方法は、ａ）患者から卵巣腫瘍組織の試料を取得することであって、卵巣腫瘍組織が、浸潤ＮＫ細胞の集団を含む、取得することと、ｂ）浸潤ＮＫ細胞の集団における脱落膜様ＮＫ細胞の頻度を測定することであって、ＮＫ細胞の対照集団の基準値範囲と比較した脱落膜様ＮＫ細胞の頻度の増加が、患者が予後不良であることを示す、測定することと、ｃ）患者が予後不良であると特定される場合に、患者を手術、放射線療法、化学療法、標的療法、抗血管新生療法、もしくは免疫療法、またはこれらの任意の組み合わせで治療することとを含む。

ある特定の実施形態では、脱落膜様ＮＫ細胞の頻度を測定することは、ＣＤ９マーカーを発現する少なくとも１つのＮＫ細胞を検出することを含み、ＣＤ９マーカーの発現は、ＮＫ細胞が脱落膜様ＮＫ細胞であることを示す。

ある特定の実施形態では、本方法は、ＣＤ５６およびケモカイン受容体ＣＸＣＲ３からなる群から選択される１つ以上の追加のマーカーと組み合わせて、ＣＤ９マーカーを発現する少なくとも１つの脱落膜様ＮＫ細胞を検出することをさらに含む。

ある特定の実施形態では、浸潤ＮＫ細胞の集団における脱落膜様ＮＫ細胞の頻度は、少なくとも２９％である。ある特定の実施形態では、浸潤ＮＫ細胞の集団における脱落膜様ＮＫ細胞の頻度は、少なくとも６０％である。いくつかの実施形態では、浸潤ＮＫ細胞の集団における脱落膜様ＮＫ細胞の頻度は、約２９％～約７０％の範囲であり、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％などのこの範囲内の任意のパーセンテージを含む。

ある特定の実施形態では、本方法は、卵巣腫瘍組織の試料中のがん細胞上の１つ以上の活性化ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルを測定することをさらに含み、対照卵巣細胞上の該ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルと比較した１つ以上の活性化ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルの低下と組み合わせて、脱落膜様ＮＫ細胞の頻度の増加は、患者が予後不良であることを示す。

ある特定の実施形態では、本方法は、卵巣腫瘍組織の試料中のがん細胞上の１つ以上の阻害性ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルを測定することをさらに含み、対照卵巣細胞上の該ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルと比較した１つ以上の阻害性ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルの増加と組み合わせた、脱落膜様ＮＫ細胞の頻度の増加は、患者が予後不良であることを示す。

ある特定の実施形態では、ＮＫ受容体リガンドのレベルは、Ｅ－カドヘリンを発現する卵巣がん細胞（Ｅ腫瘍区画）、Ｅ－カドヘリンおよびビメンチンを共発現する卵巣がん細胞（ＥＶ腫瘍区画）、ならびにビメンチンを発現する卵巣がん細胞（Ｖ腫瘍区画）において測定される。

ある特定の実施形態では、本方法は、活性化ＮＫ受容体リガンドが卵巣がん細胞上で検出され、１つ以上の阻害性ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルの増加が卵巣がん細胞上で検出されない場合に、ＮＫ細胞免疫療法を患者に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞免疫療法は、ＮＫ細胞を活性化する１つ以上のサイトカインの患者への投与、ＮＫ細胞の患者への養子移入、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞免疫療法を投与することは、ＮＫ活性化受容体を含む操作されたＮＫ細胞を投与することを含む。

ある特定の実施形態では、本方法は、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも３つのサイトカインを産生する浸潤ＮＫ細胞の集団におけるＮＫ細胞の頻度を測定することをさらに含み、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも３つのサイトカインを産生するＮＫ細胞の頻度の低下と組み合わせた、脱落膜様ＮＫ細胞の頻度の増加は、患者が予後不良であることを示す。

ある特定の実施形態では、本方法は、浸潤ＮＫ細胞の集団によって産生されるパーフォリンおよびグランザイムＢのレベルを測定することをさらに含み、ＮＫ細胞の対照集団についてのパーフォリンのレベルおよびグランザイムＢのレベルと比較したパーフォリンおよびグランザイムＢのレベルの低下とを組み合わせた、脱落膜様ＮＫ細胞の頻度の増加は、患者が予後不良であることを示す。

ある特定の実施形態では、卵巣腫瘍組織の試料中の浸潤ＮＫ細胞の集団における脱落膜様ＮＫ細胞の頻度は、質量サイトメトリー（飛行時間によるサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ））、蛍光ベースのフローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光、インデックス化によるＣＯ検出（ＣＯＤＥＸ）、多重イオンビーム撮像（ＭＩＢＩ）、環状免疫蛍光、または他の多パラメータ単一細胞分析技術を実施することによって測定される。

別の態様では、卵巣がんを有する患者がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞免疫療法から利益を受けるか否かを予測し、患者を卵巣がんについて治療する方法が提供され、本方法は、ａ）患者から卵巣腫瘍組織の試料を取得することと、ｂ）ＣＤ９発現を含む卵巣腫瘍組織におけるがん細胞上のＮＫ受容体リガンド分布を測定することであって、１つ以上の活性化ＮＫ受容体リガンドの検出は、患者がＮＫ細胞免疫療法から利益を受けることを示し、１つ以上の阻害性ＮＫ受容体リガンドの検出は、患者がＮＫ細胞免疫療法から利益を受けないことを示す、測定することと、ｃ）ＮＫ受容体リガンド分布が、患者がＮＫ細胞免疫療法から利益を受けることを示す場合に、ＮＫ細胞免疫療法を患者に投与することとを含む。

ある特定の実施形態では、本方法は、ＮＫ細胞免疫療法による患者の治療の前、または患者が免疫療法を受けている間に実施される。

いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞免疫療法は、ＮＫ細胞を活性化する１つ以上のサイトカインの患者への投与、ＮＫ細胞の患者への養子移入、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞免疫療法を投与することは、ＮＫ活性化受容体を含む操作されたＮＫ細胞を投与することを含む。

ある特定の実施形態では、活性化ＮＫ受容体リガンドは、ＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化する。例示的な活性化ＮＫ受容体リガンドとしては、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＰＢＰ３、ＵＬＰＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、およびＭＩＣＡ／Ｂが挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態では、本方法は、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも３つのサイトカインを産生する浸潤ＮＫ細胞の集団におけるＮＫ細胞の頻度を測定することをさらに含み、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、およびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも３つのサイトカインを産生するＮＫ細胞の頻度の低下は、患者がＮＫ細胞免疫療法から利益を受けないことを示す。

ある特定の実施形態では、本方法は、浸潤ＮＫ細胞の集団によって産生されるパーフォリンおよびグランザイムＢのレベルを測定することをさらに含み、ＮＫ細胞の対照集団についてのパーフォリンのレベルおよびグランザイムＢのレベルと比較したパーフォリンおよびグランザイムＢのレベルの低下は、患者がＮＫ細胞免疫療法から利益を受けないことを示す。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、高悪性度漿液性卵巣がんを有する卵巣がん患者に対して実施される。ある特定の実施形態では、卵巣腫瘍組織の試料は、生検標本または外科標本である。

ＨＧＳＣ腫瘍およびＥＶ細胞頻度は、ｄｌ－ＮＫ細胞表現型と相関する。（Ａ）特異的免疫細胞クラスターとの、総腫瘍頻度と総ＥＶ細胞頻度との間のペアワイズスピアマン相関を示す、階層的に整理されたヒートマップである。ヒートマップの拡大部分（右側）は、ｄｌ－ＮＫ細胞クラスターとの正（赤）および負（青）のｒ_ｓ相関をそれぞれ示す。ｄｌ－ＮＫ細胞クラスター（正方形）および２つのＴ細胞クラスター（円形）との、腫瘍細胞の総頻度とＥＶ細胞の総頻度との間に正の相関が観察された。脱落膜様の特徴（三角形）を有するクラスターは、腫瘍およびＥＶ細胞とは相関しないが、すべての腫瘍に存在する。（Ｂ）タンパク質発現パターンによって示されるｄｌ－ＮＫ細胞クラスターの表現型（Ｃ）ＣＤ４５＋ＣＤ６６－免疫細胞浸潤物からか、または総ＮＫ細胞集団から手動でゲート化されたｄｌ－ＮＫ細胞は、総ＥＶ細胞頻度と正の相関がある。（Ｄ）ＣＤ４５＋ＣＤ６６－免疫細胞浸潤物から手動でゲート化されたｄｌ－ＮＫ細胞は、ビメンチンクラスターの亜群と負の相関がある。 新たに診断されたＨＧＳＣ腫瘍におけるＮＫ受容体リガンドの発現パターンを示す。単一細胞力指向性レイアウト（ＦＤＬ）は、１２個のＨＧＳＣ腫瘍の複合体である。５６個のＸシフト腫瘍細胞クラスターの各々からサンプリングした１０，０００個の細胞を以下の発現によって色分けする。（Ａ）Ｅ－カドヘリンおよびビメンチン、（Ｅ－カドヘリンおよびビメンチンを共発現するＥＶクラスターを囲み、１～７（１５）で標識する）、ＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドおよびＡＤＡＭプロテアーゼ（Ｂ）ネクチンファミリーリガンド（Ｃ）ＨＬＡ－ＡＢＣおよびＨＬＡ－Ｅ阻害性リガンド、ならびに腫瘍関連抗原ＣＡ１２５、メソセリン、およびＨＥ４である。（Ｄ）箱ひげ図は、１２個のＨＧＳＣ腫瘍にわたる、各ＮＫ受容体リガンドならびにＡＤＡＭプロテアーゼ１０および１７についての発現レベルの分布を示す。Ｅ、ＥＶ、およびＶ区画にわたるＮＫ受容体リガンド発現を比較する全体的なＡＮＯＶＡに関してのｐ値：＊＊≦０．０１、＊＊＊≦０．００１、＊＊＊＊≦０．０００１である。中央値および四分位範囲を示す。 Ｅ、ＥＶ、およびＶ ＨＧＳＣ腫瘍区画内のＮＫ受容体リガンドについての組み合わせ多様性を示す。（Ａ）ブール論理を使用して、１２個のＮＫ受容体リガンド、ならびに腫瘍細胞によって発現されるＡＤＡＭ１０および１７プロテアーゼの組み合わせ多様性を決定した。各ＮＫ受容体リガンドの組み合わせは、行（左側）である。ヒートマップ（右側）は、各リガンドの組み合わせを発現する１２個の腫瘍試料（列）について、Ｅ、ＥＶ、およびＶ区画内の腫瘍細胞の頻度を示す。行は、最高（上）から最低（下）総細胞頻度に基づいてランク付けした。（Ｂ）ベン図は、Ｅ、ＥＶ、およびＶ区画にわたる、異なる、かつ重複するＮＫ受容体リガンドの組み合わせの数を示す。（Ｃ）ジニ－シンプソンの多様度の逆指数は、すべてのＨＧＳＣ腫瘍にわたって、Ｅ（ｐ＝０．０５）およびＥＶ（ｐ＝０．００７）がＶ腫瘍区画に対して有意に大きかった。中央値および四分位範囲を示す。 Ｅ、ＥＶ、およびＶ ＨＧＳＣ細胞株にわたるカルボプラチンに対する応答を示す。ビヒクルまたはカルボプラチンに０．５または１μｇ／ｍＬで１週間曝露したＯＶＣＡＲ４（Ｅ）、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ（ＥＶ）、およびＴＹＫ－ｎｕ（Ｖ）細胞株を、腫瘍ＮＫ受容体リガンド／ＡＤＡＭ抗体パネルを用いてＣｙＴＯＦのために処理した。親集団は、シスプラチンおよびｃＰＡＲＰに対して陰性である生存可能な単一細胞として定義される。プロットは、親集団（Ｙ軸）からゲートアウトされた活性化および阻害性ＮＫ受容体リガンド（Ｘ軸）を発現するＨＧＳＣ細胞の頻度を示す。プロットは、標準偏差を伴う３つの複製の平均値を示す。全体的なＡＮＯＶＡについての、ｐ値：＊≦０．０５、＊＊≦０．００５である。 ＨＧＳＣからＮＫ－９２細胞株へのトロゴサイトーシス別途示されない限り、ＨＧＳＣおよびＮＫ－９２細胞株を、１：１のエフェクター（ＮＫ－９２）：標的（ＯＶＣＡＲ４）比で６時間共培養した（材料および方法）。（Ａ）それぞれ、トランスウェルの有無によるＯＶＣＡＲ４、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、およびＴＹＫ－ｎｕとの共培養後のＮＫ－９２細胞におけるＣＤ９発現の頻度を示す。標準偏差を伴う平均値を示す（ｎ＝４）。共培養後のＣＤ９発現ＮＫ－９２細胞の誘導を示す例示的な２Ｄフロープロットを示す。（Ｂ）ヒストグラムにより、ＮＫ－９２細胞株における細胞外および細胞内ＣＤ９タンパク質発現の欠如が確認されたが、両細胞のＯＶＣＡＲ４細胞株における高レベル（Ｃ）ＯＶＣＡＲ４細胞との共培養後の、選別されたＣＤ９＋およびＣＤ９－のＮＫ－９２細胞のＲＴ－ＰＣＲを示す。データは、それぞれの単一培養物（下部プロット）と比較した、コピー数（上部プロット）または共培養後の倍率変化遺伝子発現として提示される。（Ｄ）ＨＧＳＣ細胞株との共培養の前に、トロゴサイトーシス阻害剤であるサイトカラシンＤ（１０μｇ）とともにＮＫ－９２細胞をプレインキュベートすると、トロゴサイトーシスが部分的に阻害される（Ｅ）共培養の後の、ＰＫＨ６７で標識されたＯＶＣＡＲ４細胞からＮＫ－９２細胞へのＣＤ９を伴う膜断片の移入（上のヒストグラムのＰＫＨ６７および下のヒストグラムのＣＤ９）を示す。（Ｆ）顕微鏡によるトロゴサイトーシスの視覚化。ＯＶＣＡＲ４細胞およびＮＫ－９２細胞を、それぞれＰＫＨ６７およびＰＫＨ２６で標識した。３時間の共培養後、細胞をパラホルムアルデヒド中に固定し、ＣＤ４５およびＣＤ９に対する抗体で染色した。細胞を、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８００顕微鏡で全チャネルにおいて撮像した。単一培養で成長した細胞については２０倍で、共培養については６０倍で画像を示す。画像の明るさおよびコントラストを向上させて、印刷画像を最適化した。 非ＨＧＳＣ細胞からのＣＤ９のトロゴサイトーシスを決定する。（Ａ）１１個のＨＧＳＣおよび１５個の非ＨＧＳＣ腫瘍細胞株を、ＣＤ９発現についてＣｙＴＯＦによってスクリーニングした。（Ｂ）棒グラフは、ＣＤ９発現のレベルによってランク付けされた細胞を示す。細胞株を、ＮＫ－９２細胞との共培養のために選択し、それらは、ＨＧＳＣ Ｅ、ＥＶ、およびＶ細胞株（マゼンタ）、高レベルのＣＤ９を有する非ＨＧＳＣ細胞株（緑色）、および低レベルのＣＤ９を有する非ＨＧＳＣ細胞株（黄色）である。（Ｃ）ＣＤ９を獲得した非ＨＧＳＣ腫瘍細胞の頻度を示す代表的なフロープロット（Ｄ）ＮＫ－９２細胞のサイトカラシンＤ（１０μＭ）とのプレインキュベーションは、トロゴサイトーシスの部分的阻害をもたらす。 ＣＤ９＋およびＣＤ９－のＮＫ－９２による、細胞内サイトカイン産生を示す。ＨＧＳＣおよびＮＫ－９２細胞を、ＰＭＡ／イオノマイシンまたはビヒクル対照とともに６時間、およびブレフェルジンＡ／モネンシンとともに４時間、１：１の比率で共培養した。２つの陽性対照があり、それらは、単一培養±ＰＭＡで成長したＮＫ－９２細胞、およびＮＫ－９２細胞を有するＫ５６２細胞株（ＨＬＡ－ｎｕｌｌ赤血球白血病）との間の共培養で成長したＮＫ－９２細胞である（方法）。細胞をＣｙＴＯＦのために処理し、ＮＫ細胞抗体パネルで染色した。ＣＤ９＋およびＣＤ９－細胞を、ＣＤ４５＋細胞集団から手動でゲート化した。プロットは、標準偏差を伴う３つの複製の平均値を示す。スチューデントの両側ｔ検定は、ＣＤ９＋ＮＫ－９２細胞とＣＤ９－ＮＫ－９２細胞との間の統計的に有意な機能的差を決定した。（Ａ）各サイトカインを産生するＣＤ９＋およびＣＤ９－細胞の頻度を示す。（Ｂ）ＣＤ９＋およびＣＤ９－ＮＫ－９２細胞で産生された各サイトカインのレベル（生の中央値数）を示す。ｐ値：＊≦０．０１、＊＊≦０．００１、＊＊＊≦０．０００１、＊＊＊＊≦０．００００１である。 ＨＧＳＣ細胞株に対するＮＫ－９２細胞の細胞傷害性ＨＧＳＣ細胞株（ＯＶＣＡＲ４（Ｅ）、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ（ＥＶ）、およびＴＹＫ－ｎｕ（Ｖ））を、４時間の共培養後のカルセイン放出アッセイによって測定されるように、ＮＫ－９２媒介性細胞傷害性に対するそれらの感受性についてアッセイした（ｎ＝３）。（Ａ）ＮＫ－９２細胞は、示される標的：エフェクター比で、対照Ｋ５６２細胞株と比較して、ＨＧＳＣ細胞株に対する細胞傷害性が低減している。（Ｂ）ＣＤ９遮断抗体の存在下でカルセイン放出アッセイを実施すると、アイソタイプ対照と比較して、ＮＫ－９２細胞傷害性を著しく回復する。データを、２つの抗体濃度および異なる標的：エフェクター細胞比で実施した４つの複製について示す。両側ｔ検定で決定された統計的有意性を示す。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、ｐ≦０．００１である。（Ｃ）共培養後のＦＡＣＳ選別ＣＤ９＋ＮＫ－９２は、単一培養で成長したそれらのＣＤ９－対応物と比較して、細胞傷害性機能が低減している。

卵巣がん患者の予後およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞免疫療法による治療に対する応答性を予測するための組成物、方法、およびキットが提供される。特に、ＮＫ細胞免疫療法から利益を受ける可能性が高い、ＮＫ細胞を活性化するＮＫ受容体リガンドを担持する卵巣がん腫瘍細胞を有する患者と、ＮＫ細胞免疫療法から利益を受ける可能性が低い、ＮＫ細胞を阻害するＮＫ受容体リガンドを担持する卵巣がん腫瘍細胞を有する患者とを区別するために、卵巣がん腫瘍におけるＮＫ受容体リガンド分布を決定するための方法が提供される。加えて、卵巣がん患者の予後不良を示す脱落膜様ＮＫ細胞のマーカー、ならびにより積極的な抗がん治療を必要とする、卵巣がんの治療を必要とする個体を特定するために、腫瘍浸潤ＮＫ細胞の集団における脱落膜様ＮＫ細胞の頻度を決定する方法が開示される。

本組成物、方法、およびキットを説明する前に、本発明は、記載された特定の方法または組成物に限定されるものではなく、それ自体が勿論、変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までのそれぞれの間に介在する値もまた、具体的に開示されていることが理解される。任意の記載値または記載された範囲内の間に介在する値と、任意の他の記載値またはその記載された範囲内の間に介在する値との間の、それぞれより小さい範囲が、本発明に包含される。これらの小さい範囲の上限および下限は、独立して範囲に含まれていても、除外されていてもよく、いずれか、どちらでもない、または両方の限定が小さい範囲に含まれている各範囲も、記載されている範囲の中で任意の具体的に除外されている限定に従うことを条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限定の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限定のいずれかまたは両方を除外する範囲も、同様に本発明に含まれる。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験に使用することができるが、ここでは、いくつかの潜在的かつ好ましい方法および材料を説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本開示は、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先されることを理解されたい。

本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に記載および例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他の一部の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、またはこれらと組み合わされ得る別個の構成要素および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序、または論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ（バイオマーカー）」への言及は、複数のかかるバイオマーカーを含み、「ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ポリペプチド）」への言及は、例えば、当業者に既知のペプチドおよびタンパク質など１つ以上のポリペプチドおよびその等価物への言及を含む。

本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前に専らそれらの開示のために提供されている。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が先行発明を理由に、そのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる場合がある。

定義
「ＣＤ９」は、テトラスパニンファミリーとしても知られる膜貫通４スーパーファミリーのメンバーである。これは、４つの膜貫通領域からなり、テトラスパニンファミリー全体にわたって保存されているジスルフィド結合を含有する２つの細胞外ループを有する、細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ９が脂質および他のタンパク質と相互作用することを可能にするパルミトイル化部位に関して、それらの異なるパルミトイル化部位は、それらが膜上でテトラスパニン濃縮マイクロドメイン（ＴＥＭ）に組織化することを可能にする。これらのＴＥＭは、エクソソームの生合成を含む多くの細胞プロセスにおいて役割を果たすと考えられている。

ＣＤ９は、細胞接着および移動を調節することができる。それは、異なる種類のがんで様々な役割を果たす。ＣＤ９の過剰発現は、ある特定の種類の黒色腫、乳がん、肺がん、膵臓がん、および結腸がんにおいて転移を減少させることが示された。しかしながら、他の研究において、ＣＤ９は、肺がん、スキルス胃がん、肝細胞がん、急性リンパ芽球性白血病、および乳がんなどの様々な細胞株における転移性がんにおいて、移行を増加させるか、または高度に発現することが示されている。

ＣＤ９は、ＣＤ１１７、ＣＤ２９、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ８１、ＰＴＧＦＲＮ、ＴＳＰＡＮ４、ＣＤ６３、ＡＤＡＭ１７、およびＣＤ８１と相互作用することが示されている。ヒトＣＤ９の参照配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＮＰ＿００１３１７２４１およびＮＰ＿００１７６０でアクセスされ得る。

抗ＣＤ９剤。本明細書で使用される場合、「抗ＣＤ９剤」という用語は、ＮＫ細胞上のＣＤ９の存在を低減する任意の薬剤を指す。好適な抗ＣＤ９試薬の非限定的な例は、がん細胞からＮＫ細胞へのＣＤ９のトロゴサイトーシス移入を低減する。好適な抗ＣＤ９剤の有効性は、その薬剤をアッセイすることによって評価することができる。例示的なアッセイでは、標的細胞は、候補薬剤の存在または非存在下でインキュベートされる。本発明の方法で使用するための薬剤は、薬剤の非存在下でのレベルと比較して、ＮＫ細胞媒介性殺傷を、例えば、少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも１４０％、少なくとも１６０％、少なくとも１８０％、または少なくとも２００％）上方制御する。

上方制御されたＮＫ細胞媒介性殺傷のためのマーカーとしては、例えば、グランザイムＢ、パーフォリン、およびＭＩＰ１βの発現が挙げられる。ＮＫ細胞の脱顆粒は、ＣＤ１０７ａで測定することができる。ＶＥＧＦレベルは、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮγと同様に、活性ＮＫ細胞で高い。対照的に、下方制御されたＮＫ細胞は、ＩＬ－８およびＩＬ－１０を発現する。

抗ＣＤ９抗体。いくつかの実施形態では、表題の抗ＣＤ９剤は、ＣＤ９に特異的に結合する抗体（すなわち、抗ＣＤ９抗体）である。抗体は、がん細胞からのＮＫ細胞へのＣＤ９の移入を低減し得る。いくつかの実施形態では、好適な抗ＣＤ９抗体は、結合時にＣＤ９を活性化しない。好適な抗ＣＤ９抗体としては、完全ヒト、ヒト化、またはキメラバージョンのかかる抗体が挙げられる。ヒト化抗体は、抗原性が低いため、ヒトにおけるインビボ用途に特に有用である。同様に、カニン化、フェリニン化などの抗体は、それぞれ、イヌ、ネコ、および他の種における用途に特に有用である。目的の抗体としては、ヒト化抗体、または例えば、ラマもしくはラクダなどのラクダ科由来のカニン化、フェリニン化、平衡化、ウシ化、ブタ化抗体、およびそれらの変異体が挙げられる。

抗ＣＤ９抗体は既知であり、当該技術分野で使用されており、例えば、各々が参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ（２０１９）２３（６）：４４０８－４４２１，Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ９ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｍｐａｉｒｓ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃａｒｇｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＷＯ２０１７／１１９８１１Ａ１ ａｎｔｉ－ＣＤ９ ａｎｔｉｂｏｄｙを参照されたい。

いくつかの実施形態では、治療有効用量の抗ＣＤ９剤は、約４０μｇ／ｍｌ以上（例えば、約５０ｕｇ／ｍｌ以上、約６０ｕｇ／ｍｌ以上、約７５ｕｇ／ｍｌ以上、約１００ｕｇ／ｍｌ以上、約１２５ｕｇ／ｍｌ以上、または約１５０ｕｇ／ｍｌ以上）の持続的な血清レベルをもたらす。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約４０μｇ／ｍｌ～約３００ｕｇ／ｍｌ（例えば、約４０ｕｇ／ｍｌ～約２５０ｕｇ／ｍｌ、約４０ｕｇ／ｍｌ～約２００ｕｇ／ｍｌ、約４０ｕｇ／ｍｌ～約１５０ｕｇ／ｍｌ、約４０ｕｇ／ｍｌ～約１００ｕｇ／ｍｌ、約５０ｕｇ／ｍｌ～約３００ｕｇ／ｍｌ、約５０ｕｇ／ｍｌ～約２５０ｕｇ／ｍｌ、約５０ｕｇ／ｍｌ～約２００ｕｇ／ｍｌ、約５０ｕｇ／ｍｌ～約１５０ｕｇ／ｍｌ、約７５ｕｇ／ｍｌ～約３００ｕｇ／ｍｌ、約７５ｕｇ／ｍｌ～約２５０ｕｇ／ｍｌ、約７５ｕｇ／ｍｌ～約２００ｕｇ／ｍｌ、約７５ｕｇ／ｍｌ～約１５０ｕｇ／ｍｌ、約１００ｕｇ／ｍｌ～約３００ｕｇ／ｍｌ、約１００ｕｇ／ｍｌ～約２５０ｕｇ／ｍｌ、または約１００ｕｇ／ｍｌ～約２００ｕｇ／ｍｌ）のその範囲の持続的な血清レベルをもたらす。いくつかの実施形態では、固形腫瘍を治療するための治療有効用量は、約１００μｇ／ｍｌ以上の持続的な血清レベル（例えば、約１００ｕｇ／ｍｌ～約２００ｕｇ／ｍｌの範囲の持続的な血清レベル）をもたらす。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞療法。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、がん免疫監視の重要なメディエーターである。ＮＫ細胞は、不均一な集団である。ヒトでは、ＮＫ細胞の多くの亜型があり、それらは、ＣＤ５６、ＣＤ１６など、例えば、ＩＦＮγ産生ＣＤ５６^高ＣＤ１６^＋、細胞傷害性ＣＤ５６^低ＣＤ１６^高、脱落膜様ＮＫ細胞ＣＤ５６^＋ＣＤ９^＋ＣＸＣＲ３^＋ＫＩＲ^＋ＣＤ３^－ＣＤ１６^－などを含むマーカーの発現レベルによって変化し得る。

活性化および阻害性受容体からのシグナルは、ＮＫ細胞の定常応答性を調整する。キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）などの阻害性受容体は、ＮＫ細胞の自己反応性を防止する負のシグナルを送達する。ＫＩＲおよび他の阻害性受容体は、ＭＨＣ Ｉ分子を認識する。ＮＫＧ２Ｄを含む活性化受容体は、標的細胞上のストレス誘導リガンドに結合すると活性化シグナルを提供する。ＮＫ細胞は、細胞形質転換中に健康な細胞の表面上に発現される分子のレパートリーの変化を感知し、それに応答する。これにより、ＮＫ細胞は、がんに対する重要なセンチネルとして、かつがん免疫療法の主要な標的として位置付けられる。

化学療法および放射線療法は、少なくとも部分的に、免疫系を介してそれらの効果を媒介する。化学療法および放射線療法の両方が、腫瘍細胞における細胞ストレスを誘導し、ＮＫ活性化リガンドの上方制御、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の放出、および免疫原性細胞死の誘導をもたらす。異なるメカニズムを通じて、遺伝毒性剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ－３）阻害剤、およびプロテアソーム阻害剤はすべて、ＮＫ活性化リガンドの腫瘍表面発現を増加させることができる。いくつかの化学療法剤は、腫瘍上のＭＨＣ ＩなどのＮＫ阻害性リガンドを下方制御する。

ＮＫ療法は、有効用量の非改変細胞または改変細胞のいずれかのＮＫ細胞を患者に投与することによってか、または内因性ＮＫ細胞を活性化することによって、アプローチすることができる。がん免疫療法のために同種異系ＮＫ細胞および自己ＮＫ細胞が検討されてきた。ＮＫ細胞は、単離し、患者の末梢血からエクスビボで拡大することができる。アプローチとしては、活性化サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８）の異なる組み合わせ、およびエクスビボ拡大中に重要な因子を供給するためのフィーダー細胞の使用が挙げられる。既製の使用のために、患者のための容易に入手可能なＮＫ細胞のバンクを提供するために、追加の戦略が調査されている。

例えば、ヒト細胞株ＮＫ９２は、同種異系ＮＫ治療薬として臨床的に調査されている。ＮＫ９２（Ｎｅｕｋｏｐｌａｓｔ（商標））は、例えば、１×１０^９細胞／ｍ^２用量、３×１０^９細胞／ｍ^２用量、５×１０^９細胞／ｍ^２用量などの複数用量で注入されている。

ＮＫ細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および臍帯血から得られる幹細胞の両方で、幹細胞から分化され得る。ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞は、インビトロおよびインビボの両方で、様々な由来の腫瘍に対して高い細胞傷害性を有することが示されており、拡大された臍帯血由来ＮＫ細胞を使用して、臨床試験が開始されている。末梢血ｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞は、低いＫＩＲ発現を示し、インビトロでがん細胞株に対して細胞傷害性および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の両方を実施する能力を示す。

ＣＡＲ－ＮＫ細胞。養子ＮＫ療法における有望な手段は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の使用である。通常、レンチウイルス構築物においてコードされるＣＡＲは、細胞外抗原標的化ドメイン（エクトドメイン）、膜貫通領域、および１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの３つの主要なドメインからなる。標的に対する特異性は、エクトドメインによって付与され、これは、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｈｅｒ２、ＲＯＲ１）に対して反応性である。ＣＡＲは、現在、ＮＫ抗腫瘍活性を増強するために使用されている。

抗体療法はまた、インビボでＮＫ細胞を活性化するための既製のアプローチを提供する。ＡＤＣＣを介してＮＫ細胞を活性化するために腫瘍結合モノクローナル抗体に依存する従来のアプローチに加えて、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）は、可撓性リンカーを介してともに複合体化された、異なる特異性を有する２つのｓｃＦｖからなる小分子である。一方のｓｃＦｖは、腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３）を標的とし、他方は、ＮＫ細胞受容体（ＣＤ１６）に特異的である。これにより、がん細胞とＮＫ細胞とが効果的に結合し、免疫シナプスの形成を促進し、ＮＫ細胞がそれらの細胞溶解機能を特異的かつ効果的に実行することを可能にする。

ＢｉＫＥの主要標的は、それが追加の共刺激なしでＮＫ活性化を強力に誘導するため、ＣＤ１６であった。ＢｉＫＥは、自己ＮＫ細胞を腫瘍細胞に対して再指向し、これらの条件で見られる免疫抑制を克服することができた。三重特異的および四重特異的キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥおよびＴｅｔｒａＫＥ）などの追加のｓｃＦｖは、より多くの腫瘍抗原を標的とするか、またはエンゲージャー構築物にＩＬ－１５を添加することによって、治療上の利益をさらに増強することができる。

ＮＫ細胞は、多くのチェックポイント受容体を発現し、そのうちのいくつかは、がん免疫療法によって標的化されている。ＫＩＲの大部分は、阻害性であり、ＨＬＡ分子を認識する。欠損した自己認識を複製するために、ヒト化拮抗抗体リリルマブを標的とする阻害性ＫＩＲ（ＫＩＲ２ＤＬ１～３およびＫＩＲ２ＤＳ１～２）は、臨床開発中であるが、有効性の欠如は、ＮＫ細胞応答性の喪失およびトロゴサイトーシスを介した表面ＫＩＲ２Ｄ発現の喪失と関連付けられた。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ペプチド結合ＨＬＡ－Ｅを認識する、ＮＫ細胞およびＴ細胞上に発現するヘテロ二量体阻害性受容体である。固形腫瘍および血液悪性腫瘍の両方において、ＨＬＡ－Ｅは、ＮＫ細胞およびＴ細胞による認識を回避するために上方制御され、その発現は、予後不良と関連付けられる。例えば、モナリズマブによるＮＫＧ２Ａの遮断は、様々な腫瘍モデルにおいて、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方によって増強された抗腫瘍免疫を示した。阻害性受容体ＴＩＭ－３は、ヒトＮＫ細胞上で構成的に発現され、サイトカイン刺激に応答して上方制御される。ＰＤ－１と同様に、ＴＩＭ－３発現は、ＩＦＮ－γを産生し、細胞傷害性顆粒を放出するＮＫ細胞、ならびに枯渇した表現型を有するＮＫ細胞をマークすることができる。

「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、本明細書では、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含むように使用される。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖、および一本鎖ＤＮＡ、ならびに三本鎖、二本鎖、および一本鎖ＲＮＡを含む。それはまた、例えば、メチル化による、および／またはキャッピングによる改変、ならびにポリヌクレオチドの非改変形態を含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、ならびにプリンまたはピリミジン塩基のＮ－もしくはＣ－グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語の間には、意図された長さの区別はなく、これらの用語は、互換的に使用される。

「単離された」とは、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを指す場合、示される分子が、その分子が天然に見られる生物全体から分離され、離れているか、または同じ種類の他の生物学的マクロ分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して「単離された」という用語は、天然において通常それと会合する配列の全体もしくは一部を欠く核酸分子、または天然に存在するが、それと関連する異種配列を有する配列、または染色体から解離した分子である。

「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ならびにハイブリッド抗体、変更された抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体を包含する。抗体という用語は、ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３－２９９、および米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、二重特異性抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体（ＢｉＴＥ）、三重特異性抗体、および他の多重特異性抗体（例えば、Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．８：１３０、Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．１８５：１２２－１３４を参照されたい）、Ｆ（ａｂ′）_２およびＦ（ａｂ）断片、Ｆ_ｖ分子（非共有ヘテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６９：２６５９－２６６２、およびＥｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１－４０９６を参照されたい）、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）、ナノボディまたは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １１：３２８７－３３０３、Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９１１：１５－２６を参照されたい）、二量体および三量体抗体断片構築物、ミニボディ（例えば、Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１：１５７９－１５８４、Ｃｕｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４９Ｂ：１２０－１２６を参照されたい）、ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６、および１９９４年９月２１日公開の英国特許公開第ＧＢ２，２７６，１６９号を参照されたい）、ならびにかかる分子から得られる任意の機能断片であり、親抗体分子の特異的結合特性を保持する機能断片を含む。

「特異的に（または選択的に）結合する」という語句は、抗体の抗原（例えば、バイオマーカー）への結合に関して、タンパク質および他の生物学的製剤の不均一な集団における抗原の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下では、特定の抗体は、バックグラウンドにわたって少なくとも２回特定の抗原に結合し、試料中に存在する他の抗原に有意な量で実質的に結合しない。かかる条件下での抗原への特異的結合は、特定の抗原に対するその特異性について選択される抗体を必要とし得る。例えば、ラット、マウス、またはヒトなどの特定の種由来の抗原に発生した抗体を選択して、多型変異体および対立遺伝子を除いて、抗原と特異的に免疫反応し、他のタンパク質とは反応しないそれらの抗体のみを得ることができる。この選択は、他の種由来の分子と交差反応する抗体を減算することによって達成され得る。様々なイムノアッセイ形式を使用して、特定の抗原と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用される（例えば、特定の免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイ形式および状態の説明については、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照されたい）。典型的には、特定のまたは選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的にはバックグラウンドの１０～１００倍を超える。

「分析の提供」は、本明細書では、口頭または書面による分析（すなわち、文書、報告書など）の送達を指すために使用される。書面による分析は、印刷された文書または電子文書であり得る。好適な分析（例えば、口頭または書面による報告）は、対象の情報（名前、年齢など）を特定すること、何の種類の卵巣がん試料が使用されたか、かつ／もしくはそれがどのように使用されたかの説明、試料をアッセイするために使用された技術、アッセイの結果（例えば、測定されたバイオマーカーのレベルおよび／もしくはバイオマーカーレベルの経時的または治療前アッセイと比較した治療後アッセイにおける倍率変化）、個体が脱落膜様ＮＫを有することが決定されたか否か（すなわち、腫瘍細胞に対する免疫寛容）に関する評価、治療のための推奨（例えば、脱落膜様ＮＫが卵巣腫瘍組織の試料中で検出された場合のＮＫ細胞免疫療法）、ならびに／または療法を継続するか、もしくは変更するか、追加療法のための推奨戦略など以情報のうちのいずれかまたはすべてを提供する。報告は、好適な媒体または基質（例えば、紙）上の印刷情報、または電子形式を含むが、これらに限定されない任意の形式であり得る。電子形式の場合、報告は、情報が記録された、コンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）、フラッシュドライブなどの中にあり得る。加えて、報告は、ウェブサイトアドレスとして存在し得、これをインターネットを介して使用して、リモートサイトで情報にアクセスすることができる。

本発明の主題方法を使用して治療することができるがんの種類としては、副腎皮質がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆道がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳がん、中枢神経系（ＣＮＳ）がん、末梢神経系（ＰＮＳ）がん、乳がん、子宮頸がん、小児非ホジキンリンパ腫、結腸および直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング腫瘍（例えば、ユーイング肉腫）、眼がん、胆嚢がん、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍、妊娠トロホブラスト疾患、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がんおよび下咽頭がん、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、小児白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、肝臓がん、肺がん、肺カルチノイド腫瘍、非ホジキンリンパ腫、男性乳がん、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔および中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、メラノーマ皮膚がん、非メラノーマ皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん（例えば、子宮肉腫）、移行細胞がん、膣がん、外陰部がん、中皮腫、扁平上皮細胞または類表皮がん、気管支腺腫、絨毛がん、頭頸部がん、奇形腫、またはヴァルデンストロームマクログロブリン血症が挙げられるが、これらに限定されない。

ＣＤ９を発現するがんが、特に目的のものである。

いくつかの実施形態では、がんは、卵巣がんである。卵巣がんは、診断されるときには進行しているため、致命的であることが多い。症状は通常、初期段階では存在せず、進行段階では非特異的である。評価には、通常、超音波検査、ＣＴまたはＭＲＩ、および腫瘍マーカー（例えば、がん抗原１２５）の測定が含まれる。診断は、組織学的分析による。病期分類は、外科的なものである。治療には、子宮切除、両側サルピンゴ卵巣切除、できるだけ多くの関与組織の切除（細胞除去）、およびがんが局所的でない限り、化学療法が必要である。おそらく、卵巣がん症例の５～１０％は、常染色体優性ＢＲＣＡ遺伝子の変異に関連しており、これは、５０～８５％の乳がんを発症する生涯リスクに関連している。ＢＲＣＡ１変異を有する女性は、２０～４０％の卵巣がんを発症する生涯リスクを有する。ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＳＴＫ１１／ＬＫＢ１、ＣＤＨ１、ＣＨＥＫ２、ＲＡＤ５１、ＢＲＩＰ１、ＰＡＬＢ２、ＡＴＭ、ＭＬＨ１、およびＭＳＨ２を含む他のいくつかの遺伝子における変異は、遺伝性乳がんおよび／または卵巣がんと関連付けられている。

卵巣がんは、組織学的に多様である。卵巣がんの少なくとも８０％は、上皮由来であり、これらのがんの７５％は、漿液性嚢胞腺がんであり、約１０％は、浸潤性粘液性がんである。卵巣がんの約２０％は、原発性卵巣生殖細胞、もしくは性索および間質細胞由来であるか、または卵巣への転移（最も一般的には、乳房または胃腸管から）である。生殖細胞がんは、通常、３０歳未満の女性に発生する。

バイオマーカーの「基準レベル」または「基準値」は、特定の疾患状態、表現型、または特定の疾患状態もしくは表現型を発症する素因、あるいはそれらの欠如、ならびに疾患状態、表現型、または特定の疾患状態もしくは表現型を発症する素因、またはそれらの欠如の組み合わせを示すバイオマーカーのレベルを意味する。バイオマーカーの「陽性」基準レベルは、特定の疾患状態または表現型を示すレベルを意味する。バイオマーカーの「陰性」基準レベルは、特定の疾患状態または表現型の欠如を示すレベルを意味する。バイオマーカーの「基準レベル」は、バイオマーカーの絶対的もしくは相対的な量もしくは濃度、バイオマーカーの存在もしくは非存在、バイオマーカーの量もしくは濃度の範囲、バイオマーカーの最小および／もしくは最大量もしくは濃度、バイオマーカーの平均量もしくは濃度、ならびに／またはバイオマーカーの中央値の量もしくは濃度であってもよく、加えて、バイオマーカーの組み合わせの「基準レベル」は、互いに対する２つ以上のバイオマーカーの絶対的または相対的な量または濃度の比であってもよい。特定の疾患状態、表現型、またはそれらの欠如に関するバイオマーカーの適切な陽性および陰性基準レベルは、１つ以上の適切な対象における所望のバイオマーカーのレベルを測定することによって決定され得、かかる基準レベルは、特定の対象の集団に合うように調整され得る（例えば、基準レベルは、特定の年齢または性別の対象からの試料におけるバイオマーカーレベルと、特定の年齢または性別群における特定の疾患状態、表現型、またはそれらの欠如に関する基準レベルとの間で比較が行われ得るように、年齢適合または性別適合であり得る）。かかる基準レベルはまた、卵巣がん試料におけるバイオマーカーのレベルを測定するために使用される特定の技術（例えば、質量サイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ）、タンデム質量分析、免疫組織化学、ＣＯＤＥＸなど）に合うように調整されてもよいが、バイオマーカーのレベルは、使用される特定の技術に基づいて異なる場合がある。

「量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）」、「量（ａｍｏｕｎｔ）」、および「レベル」という用語は、本明細書で互換的に使用され、試料中の分子もしくは分析物の絶対定量化、または試料中の分子もしくは分析物の相対定量化、すなわち、本明細書で教示される基準値に対するなどの別の値に対するか、またはバイオマーカーに対する値の範囲に対する相対定量化を指し得る。これらの値または範囲は、単一の患者または患者の群から得ることができる。

試料の取得およびアッセイ。「アッセイする」という用語は、本明細書では、卵巣腫瘍組織の試料を操作して、試料に関連するデータを生成する物理ステップを含むように使用される。当業者によって容易に理解されるように、試料をアッセイする前に、卵巣腫瘍組織の試料を「取得」しなければならない。したがって、「アッセイする」という用語は、試料が取得されているという意味を含む。本明細書で使用される場合、「取得された」または「取得する」という用語は、抽出されたか、または単離された卵巣腫瘍組織の試料を受ける処理を包含する。例えば、試験施設は、試料をアッセイする前に、郵送で（または送達などを介して）卵巣腫瘍組織の試料を「取得する」ことができる。いくつかのかかる場合において、卵巣腫瘍組織の試料は、郵送（すなわち、送達、移送など）の前に、別の当事者によって個体から「抽出」または「単離」され、次いで、試料の到着時に、試験施設によって「取得」される。したがって、試験施設は、試料を取得し、次いで、試料をアッセイし、それによって、試料に関連するデータを生成することができる。

本明細書で使用される場合、「取得された」または「取得する」という用語は、対象からの卵巣腫瘍組織の試料の物理的抽出または単離を含むこともできる。したがって、卵巣腫瘍組織の試料は、試料を続いてアッセイする同じ人または同じ団体によって、対象から単離され（したがって、「取得され」）得る。試料が、第１の当事者または団体から「抽出」または「分離」され、次いで、第２の当事者に移送（例えば、配送、郵送など）されるとき、試料は、第１の当事者によって「取得」され（かつ第１の当事者によって「分離」され）、次いで、第２の当事者によって「取得」される（ただし、「分離」されない）。したがって、いくつかの実施形態では、取得するステップは、試料を単離するステップを含まない。

いくつかの実施形態では、取得するステップは、卵巣腫瘍組織の試料（例えば、処置前試料、処置後試料など）を単離するステップを含む。卵巣腫瘍組織の試料（例えば、生検、外科標本など）を単離するための方法およびプロトコルは、当業者に既知であり、任意の好都合な方法を使用して、卵巣腫瘍組織の試料を単離することができる。

当業者であれば、場合によっては、試料をアッセイする前に、複数の試料（例えば、処置前試料および処置後試料）が取得されるまで待つことが好都合であることが理解される。したがって、場合によっては、単離された試料（例えば、処置前試料、処置後試料など）は、すべての適切な試料が得られるまで保存される。当業者は、卵巣腫瘍組織の様々な異なる種類の試料を適切に保存する方法を理解し、特定の試料に適切な任意の好都合な保存方法（例えば、冷蔵）を使用し得る。いくつかの実施形態では、処置前試料は、処置後試料を得る前にアッセイされる。場合によっては、処置前試料および処置後試料は、並行してアッセイされる。場合によっては、複数の異なる処置後試料および／または処置前試料が並行してアッセイされる。場合によっては、試料が得られた後、直ちに、または可能な限り速やかに処理される。

「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする」、および「分析する」という用語は、任意の形態の測定を指すために本明細書で互換的に使用され、要素が存在するか否かを決定することを含む。これらの用語は、定量的および／または定性的決定の両方を含む。アッセイすることは、相対的であっても絶対的であってもよい。例えば、「アッセイする」は、発現レベルが特定の閾値未満であるか、または「それ以上」であるかを決定することであり得る（閾値は、予め決定することができるか、または対照試料をアッセイすることによって決定することができる）。一方、「発現レベルを決定するためにアッセイする」とは、特定のバイオマーカーの発現のレベル（すなわち、発現レベル、例えば、タンパク質および／またはＲＮＡ例えば、ｍＲＮＡの量）を表す定量値を（任意の好都合な測定基準を使用して）決定することを意味し得る。発現のレベルは、特定のアッセイと関連付けられた任意の単位（例えば、蛍光単位、例えば、平均蛍光強度（ＭＦＩ）または質量サイトメトリー測定値から決定される質量単位）で表すことができるか、または定義された単位（例えば、ｍＲＮＡ転写物の数、タンパク質分子の数、タンパク質の濃度など）で絶対値として表すことができる。さらに、バイオマーカーの発現のレベルは、１つ以上の追加の遺伝子（例えば、核酸および／またはそれらのコードされたタンパク質）の発現レベルと比較して、正規化された発現レベルを表す正規化された値を導出することができる。選択された特定の測定基準（または単位）は、同じ個体からの複数の試料（例えば、同じ個体から異なる時点で採取された試料）を評価するとき、同じ単位が使用される（または同じ単位への変換が実施される）限り、重要ではない。これは、単位が、ある試料から次の試料（例えば、同じ個体から異なる時点で得られた試料）への発現レベルにおける倍率変化を計算する（すなわち、比率を決定する）とき、単位は、無効になるからである。

ＲＮＡレベルを測定するために、試料中のＲＮＡの量またはレベル、例えば、ｍＲＮＡのレベルが決定される。いくつかの場合では、１つ以上の追加のＲＮＡの発現レベルも測定されてもよく、バイオマーカー発現のレベルが、１つ以上の追加のＲＮＡのレベルと比較されて、バイオマーカー発現レベルの正規化された値が提供される。ＲＮＡレベルを評価するための任意の好都合なプロトコルを用いてもよく、アッセイされた試料中の１つ以上のＲＮＡのレベルが決定される。

タンパク質レベルを測定するために、試料中のタンパク質の量またはレベルが決定される。場合によっては、タンパク質は、シグナル伝達カスケードなどによるタンパク質の活性の調節と関連付けられた翻訳後修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化）を含み、修飾タンパク質は、バイオマーカーであるため、修飾タンパク質の量が測定される。いくつかの実施形態では、細胞外タンパク質レベルが測定される。例えば、場合によっては、測定されるタンパク質（すなわち、ポリペプチド）は、分泌タンパク質（例えば、サイトカイン）であり、したがって、濃度は、流体中で測定することができる。いくつかの実施形態では、濃度は、１つのタンパク質のレベルを別のタンパク質と比較することによって測定される相対値である。他の実施形態では、濃度は、重量／体積または重量／重量の絶対測定値である。

いくつかの場合では、１つ以上の追加のタンパク質の濃度も測定され得、バイオマーカー濃度が、１つ以上の追加のタンパク質のレベルと比較されて、バイオマーカー濃度の正規化された値が提供される。タンパク質レベルを評価するための任意の好都合なプロトコルを用いてもよく、アッセイされた試料中の１つ以上のタンパク質のレベルが決定される。

当業者には、タンパク質レベルのための様々な異なるアッセイ様式が知られており、任意の好都合な方法が使用され得るが、タンパク質レベルをアッセイするための代表的で好都合な種類のプロトコルは、抗体ベースの方法であるＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＡベースのアッセイでは、目的のタンパク質に特異的な１つ以上の抗体は、選択された固体表面、好ましくは、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルなどのタンパク質親和性を示す表面上に固定され得る。不完全に吸着された材料を除去するために洗浄した後、アッセイプレートウェルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、または粉ミルク溶液などの試験試料に関して抗原的に中性であることが知られている非特異的な「遮断」タンパク質でコーティングされる。これにより、固定化表面上の非特異的吸着部位の遮断が可能になり、それによって、表面上への抗原の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドを低減する。非結合ブロックタンパク質を除去するために洗浄した後、固定化表面を、免疫複合体（抗原／抗体）形成を助長する条件下で、試験される試料と接触させる。インキュベーション後、抗血清接触表面を洗浄し、非免疫複合体化材料を除去する。次いで、結合した免疫複合体を、第１の抗体とは異なる標的に対する特異性を有する第２の抗体に供し、第２の抗体の結合を検出することによって、免疫複合体形成の発生および量を決定してもよい。ある特定の実施形態では、第２の抗体は、適切な発色基質とともにインキュベートすると、色沈殿を生成する関連酵素、例えば、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、またはアルカリホスファターゼを有する。第２の抗体とのかかるインキュベーション、および非結合物質を除去するための洗浄後、例えば、ウレアーゼ標識の場合は尿素およびブロモクレゾールパープル、またはペルオキシダーゼ標識の場合は２，２’－アジノ－ジ（３－エチル－ベンズチアゾリン）－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）およびＨ_２Ｏ_２などの発色性基質とインキュベーションすることによって、標識の量を定量する。次いで、例えば、可視スペクトル分光光度計を使用して、色生成の程度を測定することによって、定量化が達成される。

先行する形式は、試料を最初にアッセイプレートに結合させることによって変更され得る。次いで、一次抗体をアッセイプレートとともにインキュベートし、続いて、一次抗体に対する特異性を有する標識された第２の抗体を使用して結合した一次抗体を検出する。抗体（複数可）が固定化されている固体基質は、多種多様な材料から作製され、例えば、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子などの多種多様な形状で作製され得る。基質は、シグナル対ノイズ比を最大化するため、バックグラウンド結合を最小化するため、ならびに分離およびコストを容易にするために選択され得る。洗浄は、例えば、リザーバからビーズもしくはディップスティックを除去すること、マイクロタイタープレートウェルなどのリザーバを空にするか、もしくは希釈すること、または洗浄液もしくは溶媒でビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラム、もしくはフィルタをすすぐことによって、使用される基質に最も適切な様式で行われ得る。

代替として、試料中の１つ以上のタンパク質のレベルを測定するための非ＥＬＩＳＡベースの方法が用いられてもよい。代表的な例示的な方法としては、抗体ベースの方法（例えば、免疫蛍光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、プロテオミクスアレイ、ｘＭＡＰ微粒子技術（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術）、免疫組織化学、フローサイトメトリー、質量サイトメトリー、ＣＹＴＯＦなど）、ならびに非抗体ベースの方法（例えば、質量分析またはタンデム質量分析）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「診断」は、概して、対象が所与の疾患、障害、または機能障害に影響される可能性が高いか否かについての決定を含む。当業者は、多くの場合、１つ以上の診断指標、すなわち、バイオマーカーに基づいて診断を行い、その存在、非存在、または量が疾患、障害、または機能障害の有無を示す。

本明細書で使用される「予後」は、概して、臨床状態または疾患の可能な経過および転帰の予測を指す。患者の予後は、通常、疾患の好ましいか、または好ましくない経過または転帰を示す、疾患の因子または症状を評価することによって行われる。「予後」という用語は、必ずしも、１００％の精度で状態の経過または結果を予測する能力を指すものではないことを理解されたい。代わりに、当業者は、「予後」という用語が、特定の経過または転帰が生じる可能性の増加を指すこと、すなわち、経過または転帰が、所与の状態を示していない個体と比較して、所与の状態を示している患者で生じる可能性がより高いことを理解する。

「約」という用語は、特に所与の量に関して、プラスまたはマイナス５％の偏差を包含することを意味する。

「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、診断、治療、または療法が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。「哺乳動物」は、治療の目的では、哺乳動物に分類される任意の動物を指し、これには、ヒト、家畜および農場動物、ならびにイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの動物園、スポーツ、またはペット動物が含まれる。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。

「治療有効用量」または「治療用量」は、所望の臨床結果をもたらす（すなわち、治療有効性を達成する）ために十分な量である。治療有効用量は、１回以上の投与で投与することができる。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーにも適用される。全長タンパク質およびその断片の両方が、定義に包含される。これらの用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、ヒドロキシル化、酸化なども含む。

本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」などの用語は、対象、個体、または患者に対する、または患者における効果を得る目的で、薬剤を投与すること、または手順を実施することを指す。この効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防止するという点で予防的であり得、かつ／または疾患および／もしくは疾患の症状に対する部分的もしくは完全な治癒をもたらすという点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおけるがんの治療を含み、（ａ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、および（ｂ）疾患またはその症状を緩和すること、すなわち、疾患またはその症状の後退を引き起こすことを含む。

治療するとは、疾患の治療もしくは改善もしくは予防の成功のいかなる兆候をも指し得、これには、症状の軽減、寛解、縮小、あるいは患者に対して疾患状態をより許容可能にすること、変性もしくは減少の速度の遅延、または変性の最終点を衰弱しにくくすることなどの任意の客観的もしくは主観的パラメータが含まれる。症状の治療または改善は、医師による検査の結果を含む、客観的または主観的パラメータに基づき得る。したがって、「治療する」という用語は、疾患または他の疾患に関連する症状または状態の発症を予防もしくは遅延させるか、緩和するか、または阻止もしくは阻害するために、操作された細胞を投与することを含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状、または疾患の副作用の低減、排除、または予防を指す。

本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、疾患または障害を治療または管理するために十分な、例えば、操作されたＮＫ細胞の注入などの治療剤のその量を指す。治療有効量とは、疾患の発症を遅延または最小限にするために十分な、例えば、がんの成長および拡散を遅延または最小限にするために十分な治療剤の量を指すことができる。治療有効量はまた、疾患の治療または管理において治療的利益を提供する治療剤の量を指す場合がある。さらに、本発明の治療剤に関しての治療有効量は、疾患の治療または管理において治療的利益を提供する治療剤単独の、または他の治療と組み合わせた量を意味する。

本明細書で使用される場合、「投与レジメン」という用語は、対象に個別に、典型的には、期間で区切られて投与される一連の単位用量（典型的には、２つ以上）を指す。いくつかの実施形態では、所与の治療剤は、１つ以上の用量を含み得る、推奨される投与レジメンを有する。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、複数の用量を含み、各用量は、同じ長さの期間によって互いに分離され、いくつかの実施形態では、投与レジメンは、複数の用量を含み、少なくとも２つの異なる期間が個々の用量を分離する。いくつかの実施形態では、投与レジメン内のすべての用量は、同じ単位用量の量である。いくつかの実施形態では、投与レジメン内の異なる用量は、異なる量である。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、第１の投薬量の第１の用量、続いて、第１の投薬量とは異なる第２の投薬量の１つ以上の追加の用量を含む。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、第１の投薬量の第１の用量、続いて、第１の投薬量と同じ第２の投薬量の１つ以上の追加の用量を含む。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、関連集団にわたって投与されるときに、所望のまたは有益な転帰と相関する（すなわち、治療的投与レジメンである）。

「との組み合わせ」、「併用療法」、および「併用生成物」は、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の操作されたタンパク質および細胞を、追加の療法、例えば、手術、放射線、化学療法などと組み合わせて患者に同時投与することを指す。組み合わせて投与する場合、各構成要素は、同時に、または異なる時点で任意の順序で順次投与することができる。したがって、各構成要素は、所望の治療効果を提供するために、別々に、しかし時間内に十分に近い間隔で投与することができる。

「併用投与」とは、組み合わせが治療効果を有するような時間で、操作されたタンパク質および細胞、既知の治療剤などの１つ以上の構成要素の投与を意味する。かかる併用投与は、構成要素の同時投与（すなわち、同時に）、事前投与、または後続投与を伴い得る。当業者であれば、投与の適切なタイミング、順番、および投与量を決定することに困難はない。

「組み合わせて」という用語の使用は、障害を有する対象に予防剤および／または治療剤が投与される順序を制限するものではない。第１の予防剤または治療剤は、障害を有する対象への第２の予防剤または治療剤の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）に、それと同時に、またはその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）に投与され得る。

ＮＫ細胞およびＣＤ９遮断剤は、単独で、または放射線療法、化学療法、免疫抑制剤、および免疫調節療法などの他の治療的介入と組み合わせて使用され得る。

化学療法には、Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ（メトトレキサート注射）、Ａｂｒａｘａｎｅ（パクリタキセル注射）、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（ブレンツキシマブベドチン注射）、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（ドキソルビシン）、Ａｄｒｕｃｉｌ注射（５－ＦＵ（フルオロウラシル））、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス）、Ａｆｉｎｉｔｏｒ Ｄｉｓｐｅｒｚ（エベロリムス）、Ａｌｉｍｔａ（ＰＥＭＥＴ ＥＸＥＤ）、Ａｌｋｅｒａｎ注射（メルファラン注射）、Ａｌｋｅｒａｎ錠（メルファラン）、Ａｒｅｄｉａ（パミドロネート）、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（アナストロゾール）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（エクセメスタン）、Ａｒｒａｎｏｎ（ネララビン）、Ａｒｚｅｒｒａ（オファツムマブ注射）、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（ブレオマイシン）、Ｂｏｓｕｌｉｆ（ボスチニブ）、Ｂｕｓｕｌｆｅｘ注射（ブスルファン注射）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（イリノテカン）、Ｃａｐｒｅｌｓａ（バンデタニブ）、Ｃａｓｏｄｅｘ（ビカルタミド）、ＣｅｅＮＵ（ロムスチン）、ＣｅｅＮＵ用量包装（ロムスチン）、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（ダウノルビシン）、Ｃｌｏｌａｒ（クロファラビン注射）、Ｃｏｍｅｔｒｉｑ（カボザンチニブ）、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（ダクチノマイシン）、ＣｙｔｏｓａｒＵ（シタラビン）、Ｃｙｔｏｘａｎ（シトキサン）、Ｃｙｔｏｘａｎ注射（シクロホスファミド注射）、Ｄａｃｏｇｅｎ（デシタビン）、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（ダウノルビシン脂質複合体注射）、Ｄｅｃａｄｒｏｎ（デキサメタゾン）、ＤｅｐｏＣｙｔ（シタラビン脂質複合体注射）、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ Ｉｎｔｅｎｓｏｌ（デキサメタゾン）、Ｄｅｘｐａｋ Ｔａｐｅｒｐａｋ（デキサメタゾン）、Ｄｏｃｅｆｒｅｚ（ドセタキセル）、Ｄｏｘｉｌ（ドキソルビシン脂質複合体注射）、Ｄｒｏｘｉａ（ヒドロキシ尿素）、ＤＴＩＣ（ダカルバジン）、Ｅｌｉｇａｒｄ（リュープロリド）、Ｅｌｌｅｎｃｅ（Ｅｌｌｅｎｃｅ（エピルビシン））、Ｅｌｏｘａｔｉｎ（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（オキサリプラチン））、Ｅｌｓｐａｒ（アスパラギナーゼ）、Ｅｍｃｙｔ（エストラムスティン）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、Ｅｒｉｖｅｄｇｅ（ビスモデギブ）、Ｅｒｗｉｎａｚｅ（アスパラギナーゼＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、Ｅｔｈｙｏｌ（アミフォスチン）、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（エトポシド注射）、Ｅｕｌｅｘｉｎ（フルタミド）、Ｆａｒｅｓｔｏｎ（トレミフェン）、Ｆａｓｌｏｄｅｘ（フルベストラント）、Ｆｅｍａｒａ（レトロゾール）、Ｆｉｒｍａｇｏｎ（デガレリックス注射）、Ｆｌｕｄａｒａ（フルダラビン）、Ｆｏｌｅｘ（メトトレキサート注射）、Ｆｏｌｏｔｙｎ（プララトレキサート注射）、ＦＵＤＲ（ＦＵＤＲ（フロクスウリジン））、Ｇｅｍｚａｒ（ゲムシタビン）、Ｇｉｌｏｔｒｉｆ（アファチニブ）、Ｇｌｅｅｖｅｃ（メシル酸イマチニブ）、Ｇｌｉａｄｅｌ Ｗａｆｅｒ（カルムスチンウェハー）、Ｈａｌａｖｅｎ（エリブリン注射）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（アルトレタミン）、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（トポテカン）、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（トポテカン）、Ｈｙｄｒｅａ（ヒドロキシ尿素）、ｌｃｌｕｓｉｇ（ポナチニブ）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ ＰＦＳ（イダルビシン）、Ｉｆｅｘ（イホスファミド）、Ｉｎｌｙｔａ（アキシチニブ）、Ｉｎｔｒｏｎ Ａ ａｌｆａｂ（インターフェロンアルファ－２ａ）、Ｉｒｅｓｓａ（ゲフィチニブ）、Ｉｓｔｏｄａｘ（ロミデプシン注射）、Ｉｘｅｍｐｒａ（イキサベピロン注射）、Ｊａｋａｆｉ（ルクソリチニブ）、Ｊｅｖｔａｎａ（カバジタキセル注射）、Ｋａｄｃｙｌａ（アドトラスツズマブエムタンシン）、Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（カルフィルゾミブ）、Ｌｅｕｋｅｒａｎ（クロラムブシル）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（サルグラモスチム）、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（クラドリビン）、Ｌｕｐｒｏｎ（リュープロリド）、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（リュープロリド）、Ｌｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔＰＥＤ（リュープロリド）、Ｌｙｓｏｄｒｅｎ（ミトタン）、Ｍａｒｑｉｂｏ Ｋｉｔ（ビンクリスチンＬｉｐｉｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ注射）、Ｍａｔｕｌａｎｅ（プロカルバジン）、Ｍｅｇａｃｅ（メゲストロール）、Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（トラメチニブ）、Ｍｅｓｎｅｘ（メスナ）、Ｍｅｓｎｅｘ（メスナ注射）、Ｍｅｔａｓｔｒｏｎ（ストロンチウム－８９クロリド）、Ｍｅｘａｔｅ（メトトレキサート注射）、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（メクロレタミン）、Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（マイトマイシン）、Ｍｙｌｅｒａｎ（ブスルファン）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（ビノレルビン）、Ｎｅｏｓａｒ注射（シクロホスファミド注射）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（フィルグラスチム）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（ペグフィルグラスチム）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（フィルグラスチム）、Ｎｅｘａｖａｒ（ソラフェニブ）、Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（ニルタミド））、Ｎｉｐｅｎｔ（ペントスタチン）、Ｎｏｌｖａｄｅｘ（タモキシフェン）、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（ミトキサントロン）、Ｏｎｃａｓｐａｒ（ペグアスパラガーゼ）、Ｏｎｃｏｖｉｎ（ビンクリスチン）、Ｏｎｔａｋ（デニロイキンジフチトクス）、Ｏｎｘｏｌ（パクリタキセル注射）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（アリトレチノイン）、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（カルボプラチン）、Ｐｅｒｊｅｔａ（ペルツズマブ注射）、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（シスプラチン）、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（シスプラチン注射）、ＰｌａｔｉｎｏｌＡＱ（シスプラチン）、ＰｌａｔｉｎｏｌＡＱ（シスプラチン注射）、Ｐｏｍａｌｙｓｔ（ポマリドミド）、Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ Ｉｎｔｅｎｓｏｌ（プレドニゾン）、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（アルデスロイキン）、Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（メルカプトプリン）、Ｒｅｃｌａｓｔ（ゾレドロン酸）、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（レナリドマイド）、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（メトトレキサート）、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、ＲｏｆｅｒｏｎＡ ａｌｆａａ（インターフェロンアルファ－２ａ）、Ｒｕｂｅｘ（ドキソルビシン）、Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ（オクトレオチド）、Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ ＬＡＲ Ｄｅｐｏｔ（オクトレオチド）、Ｓｏｌｔａｍｏｘ（タモキシフェン）、Ｓｐｒｙｃｅｌ（ダサチニブ）、Ｓｔｅｒａｐｒｅｄ（プレドニゾン）、Ｓｔｅｒａｐｒｅｄ ＤＳ（プレドニゾン）、Ｓｔｉｖａｒｇａ（レゴラフェニブ）、Ｓｕｐｐｒｅｌｉｎ ＬＡ（ヒストレリンインプラント）、Ｓｕｔｅｎｔ（スニチニブ）、Ｓｙｌａｔｒｏｎ（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ注射（Ｓｙｌａｔｒｏｎ））、Ｓｙｎｒｉｂｏ（オマセタキシン注射）、Ｔａｂｌｏｉｄ（チオグアニン）、Ｔａｆｌｉｎａｒ（ダブラフェニブ）、Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ Ｃａｐｓｕｌｅｓ（ベキサロテン）、Ｔａｓｉｇｎａ（ダカルバジン）、Ｔａｘｏｌ（パクリタキセル注射）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（ドセタキセル）、Ｔｅｍｏｄａｒ（テモゾロミド）、Ｔｅｍｏｄａｒ（テモゾロミド注射）、Ｔｅｐａｄｉｎａ（チオテパ）、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（サリドマイド）、ＴｈｅｒａＣｙｓ ＢＣＧ（ＢＣＧ）、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（チオテパ）、ＴＩＣＥ ＢＣＧ（ＢＣＧ）、Ｔｏｐｏｓａｒ（エトポシド注射）、Ｔｏｒｉｓｅｌ（テムシロリムス）、Ｔｒｅａｎｄａ（塩酸ベンダムスチン）、Ｔｒｅｌｓｔａｒ（トリプトレリン注射）、Ｔｒｅｘａｌｌ（メトトレキサート）、Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（三酸化ヒ素）、Ｔｙｋｅｒｂ（ラパチニブ）、Ｖａｌｓｔａｒ（バルルビシン膀胱内）、Ｖａｎｔａｓ（ヒストレリンインプラント）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ）、Ｖｅｌｂａｎ（ビンクリスチン）、Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ）、Ｖｅｐｅｓｉｄ（エトポシド）、Ｖｅｐｅｓｉｄ（エトポシド注射）、Ｖｅｓａｎｏｉｄ（トレチノイン）、Ｖｉｄａｚａ（アザシチジン）、Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ（ビンクリスチン）、Ｖｉｎｃｒｅｘ（ビンクリスチン）、Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（パゾパニブ）、Ｖｕｍｏｎ（テニポシド）、Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ ＩＶ（ロイコボリン注射）、Ｘａｌｋｏｒｉ（クリゾチニブ）、Ｘｅｌｏｄａ（カペシタビン）、Ｘｔａｎｄｉ（エンザルタミド）、Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ注射）、Ｚａｌｔｒａｐ（Ｚｉｖ－アフリベルセプト注射）、Ｚａｎｏｓａｒ（ストレプトゾシン）、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（ベムラフェニブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブチウキセタン）、Ｚｏｌａｄｅｘ（ゴセレリン）、Ｚｏｌｉｎｚａ（ボリノスタット）、Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロン酸）、Ｚｏｒｔｒｅｓｓ（エベロリムス）、Ｚｙｔｉｇａ（アビラテロン）、ニモツズマブ、ならびにＰＤ－１を標的とするニボルマブ、ペンブロリズマブ／ＭＫ－３４７５、ピジリズマブ、およびＡＭＰ－２２４などの免疫チェックポイント阻害剤、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＢＭＳ－９３５５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、およびＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ならびにイピリムマブなどのＣＴＬＡ－４を標的とするもの、ならびにＫＩＲタンパク質を標的とするもの、ならびに他のＮＫ細胞特異的薬剤が含まれる。

放射線療法とは、病気を治療するために放射線、通常はＸ線の使用を意味する。Ｘ線は、１８９５年に発見され、それ以来放射線は、診断および調査（Ｘ線）および治療（放射線療法）のための医学において使用されてきた。放射線療法は、Ｘ線、コバルト照射、電子、およびより稀に陽子などの他の粒子を使用して、体外から外部放射線療法として行われ得る。放射性金属または液体（同位体）を使用して、がんを治療する内部放射線療法として、体内からも使用することができる。

細胞組成物
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞組成物は、ＣＤ９遮断剤と組み合わせて提供される。細胞は、療法のための単位用量で提供され得、意図されたレシピエントに関して同種異系、自己などであり得る。方法は、生体試料から単離され得るか、またはインビトロで前駆細胞源に由来し得る、所望の細胞、例えば、ＮＫ細胞、造血幹細胞などを取得するステップを含み得る。細胞は、任意選択で、目的のベクター、例えば、ＣＡＲ構築物で形質導入またはトランスフェクトされ、このステップは、任意の好適な培養培地で実施され得る。例えば、細胞は、患者から収集され、エクスビボで改変および／または拡大され、対象に再導入され得る。対象から収集された細胞は、例えば、末梢血（例えば、対象の末梢血）、生検（例えば、対象からの生検）などを含む任意の便利で適切な供給源から収集され得る。

自己細胞の使用が望ましくない場合、例えば、患者が改変のためのＮＫ細胞を十分に有しない場合、自己細胞を拡大する時間が不十分である場合などに、同種異系細胞、例えば、健常なドナー由来のＮＫ細胞もしくは幹細胞、またはＮＫ９２細胞などのＮＫ細胞株由来が使用され得る。

細胞は、例えば、ヒト治療のための治療的使用に好適な薬学的組成物で提供され得る。かかる細胞を含む治療製剤は、水溶液の形態で、凍結され得るか、または生理学的に許容される担体、賦形剤、もしくは安定剤とともに投与するために調製され得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。細胞は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化、投薬、および投与される。この文脈で考慮される因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、および医師に知られている他の因子が含まれる。

細胞は、任意の好適な手段、通常は非経口的手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内（ボーラスまたはゆっくりとした点滴）、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、または皮下投与が挙げられる。

当業者には、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正が行われ得ることが明らかである。

実験的
以下の実施例は、当業者に、本発明の作製および使用方法の完全な開示および説明を提供するために提示されるものであり、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験が実施されたすべてまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度等）に対する正確性を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差は考慮されるべきである。別様に示されない限り、部とは重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。

本明細書で引用されるすべての刊行物および特許出願は、各々個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、本発明の実施のための好ましいモードを含むように、本発明者によって見出されるか、または提供される特定の実施形態に関して説明されている。当業者は、本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態で多数の修正および変更を行うことができることを理解されたい。例えば、コドン冗長性によって、タンパク質配列に影響を与えることなく、基礎となるＤＮＡ配列の変更を行うことができる。生物学的機能的等価性を考慮することによって、種類または量において生物学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造の変更を行うことができる。かかる修正はすべて、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。

実施例１
高悪性度漿液性卵巣腫瘍細胞は、ＮＫ細胞を調節して、免疫寛容微小環境を作成する。
卵管卵巣の高悪性度漿液性がん（ＨＧＳＣ）は、疲弊したＴ細胞の著しい頻度を有する複雑な腫瘍免疫微小環境を示すが、免疫療法に応答しない。質量サイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）を使用して、我々は、この応答の欠如が、腫瘍内Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の特定の亜集団によって説明され得るか否かを調査した。新たに診断された化学療法未実施のＨＧＳＣ腫瘍の分析は、脱落膜様（ｄｌ）－ＮＫ細胞亜集団（ＣＤ５６＋ＣＤ９＋ＣＸＣＲ３＋ＫＩＲ＋ＣＤ３－ＣＤ１６－）の頻度は、腫瘍細胞および移行上皮間葉細胞の両方の総存在量と正の相関があることを明らかにした。脱落膜ＮＫ細胞は、胎児－母体界面で免疫寛容を付与し、胎盤を血管化する血管新生促進因子の供給源を提供する。類推によって、我々は、どのようにしてＨＧＳＣ腫瘍細胞が免疫寛容状態に対してｄｌ－ＮＫ細胞機能を操作するのかを発見しようとした。新たに診断されたＨＧＳＣ腫瘍内のＮＫ受容体リガンドの調査により、活性化および阻害性ＮＫ受容体の両方について異なる組み合わせ発現パターンを有する腫瘍細胞が特定された。この研究は、ｉ）Ｅ－カドヘリンを発現する上皮（Ｅ）、ｉｉ）Ｅ－カドヘリンおよびビメンチンを発現する移行上皮間葉（ＥＶ）、ならびにｉｉｉ）ビメンチンを発現する、より阻害性がある転移性（Ｖ）表現型を有する、３つの腫瘍区画間の異なる組み合わせＮＫ受容体リガンド発現パターンを明らかにした。さらに、Ｅ、ＥＶ、およびＶ腫瘍細胞を表現型コピーしたＨＧＳＣ細胞株のカルボプラチンによる処置は、全体的により阻害性が高いＮＫリガンド受容体表現型を生成し、それによって、カルボプラチン耐性の以前に認識されていなかったメカニズムを特定した。特筆すべきは、ＮＫ細胞株（ＮＫ－９２）は、ＨＧＳＣ細胞株とともに共培養した場合、免疫原性サイトカインおよび細胞傷害性の両方の低減によって反映される、結果としての免疫抑制特性の獲得とともに、トロゴサイトーシスによって卵巣腫瘍細胞からＣＤ９を獲得した。重要なことに、ＣＤ９は、原発性ＨＧＳＣ腫瘍において高度に発現される。ＮＫ－９２細胞株および他のＮＫ細胞源が養子免疫療法のための臨床開発中であるため、本研究からのデータは、重要な関連性を有する。

卵巣腫瘍細胞株と臨床的に関連するＮＫ－９２細胞株との間の共培養のＣｙＴＯＦ分析は、どのようにしてＨＧＳＣ腫瘍細胞がＮＫ細胞機能を誘導して、腫瘍生存に有利な免疫抑制環境を作り出すのかについての機械的な洞察を提供する。ＮＫ細胞は、現在、その腫瘍細胞殺傷活性を利用するための様々な免疫治療アプローチの中心にある。この研究から得られた単一細胞データは、ＨＧＳＣ細胞がＮＫ細胞の殺傷活性を妨げることができる重要、かつ理解されていないメカニズムを特定し、ＮＫ細胞に基づく免疫療法を最適化する際の緊急の考慮事項を提供する。

結果
ＨＧＳＣ腫瘍からのＴおよびＮＫ細胞クラスターのＣｙＴＯＦ分析および生成。ここでは、ＴおよびＮＫ細胞の亜型を特徴付けるように設計されたＣｙＴＯＦ抗体パネルを用いて、上記ＨＧＳＣ腫瘍からの免疫細胞浸潤物の分析を報告する。バーコード化試料の品質管理およびＣｙＴＯＦ処理のためのすべてのステップは、前述の通りであった（材料および方法）。各腫瘍について、免疫細胞浸潤物を、生存免疫細胞集団からＣＤ４５＋ＣＤ６６－としてゲートアウトした（材料および方法）。次いで、得られたＴおよびＮＫ免疫単一細胞データセットを組み合わせ、Ｘシフトクラスタリングを使用して、監視されていない分析に供した。ＴおよびＮＫ細胞亜集団を描写する２５個の表面マーカーを使用して、５２個のＸシフト細胞クラスター（３０個の最も近い隣接する細胞の最適な「ｋ」について計算された）を、後続の分析のために生成した。

ＨＧＳＣ腫瘍由来の腫瘍細胞クラスターと免疫細胞クラスターとの相関分析。腫瘍細胞と免疫細胞との間の相互作用を理解するために、細胞表現型の頻度間の相関を計算するネットワークアプローチを適用した。得られたペアワイズスピアマン相関係数（ｒ_ｓ）を、階層的にクラスター化されたヒートマップ上に表示した（図１Ａ）。各ＨＧＳＣ腫瘍について、ペアワイズ相関には、ｉ）５２個すべてのＴおよびＮＫ細胞クラスターの細胞頻度、ｉｉ）５６個すべての腫瘍細胞クラスターの細胞頻度、ｉｉｉ）総腫瘍細胞頻度、ｉｖ）総Ｅ細胞頻度、ｖ）総Ｖ細胞頻度、ｖｉ）総ＥＶ細胞頻度、ｖｉｉ）我々の以前の出版物に記載されている他の特徴のパラメータが含まれた。

分析の最初の部分では、任意のＴまたはＮＫ細胞クラスターが、すべての腫瘍細胞の存在量またはＥ、ＥＶ、もしくはＶ細胞の存在量と相関しているか否かを決定した。我々は、総腫瘍およびＥＶ細胞存在量の両方と相関する５つの免疫細胞クラスターの存在に注目した（スピアマンの相関係数、ｒ_ｓ＞０．５）（図１Ａ）。これらの免疫細胞クラスターのうちの３つ（３２５１５、３２５３９、および３２５５５）は、ＣＤ３およびＣＤ１６発現については陰性であったが、ＣＤ５６、ＣＤ９、ＣＸＣＲ３、およびキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現については陽性であり、この表現型は、脱落膜ＮＫ細胞に類似していた（図１Ｂ）。特に、数千のＮＫ細胞表現型のうち、ＣＤ９発現は、脱落膜ＮＫ（ｄＮＫ）細胞サブセットに排他的である。これらの３つの脱落膜様ＮＫ（ｄｌ－ＮＫ）クラスターの組み合わせた細胞頻度は、１７個の腫瘍にわたって１．３％～２８％の範囲であった。さらに、手動でゲート化されたｄｌ－ＮＫ細胞およびＥＶ腫瘍細胞によって決定された相関は、監視されていないＸシフト分析と一致した（図１Ｃおよび図９）。

さらなる２つの正に相関した免疫細胞クラスター（３２５４２および３２５４５）は、Ｔ細胞表現型（ＣＤ４およびＣＤ８の互いに排他的な発現を有するＣＤ３＋）を有したが、また、脱落膜ＮＫ細胞と表現型特性を共有した。それらは、高レベルのＣＤ５６、ＣＸＣＲ３、およびＣＤ９、ならびに低レベルの不変Ｔ細胞受容体Ｖα２４－Ｖβ１１を有し、これらの細胞がＮＫＴ様の機能を有し得ることを示唆した（図１０Ａ）。それらは、０．１～３．９％の頻度でＨＧＳＣ免疫細胞浸潤物中に存在した。

腫瘍またはＥＶ細胞存在量のいずれとも相関しない追加の３つのｄｌ－ＮＫ細胞クラスター（３２５２７、３２５０４、および３２５４０）が見つかった（図１Ａおよび図１０Ｂ）。クラスター３２５２７は、ｄｌ－ＮＫ細胞クラスター３２５５５および３２５３９と相関した（図１Ｂ）。クラスター３２５０４および３２５４０は、いずれの腫瘍特徴とも相関しなかったが、免疫細胞浸潤物の１４％～８６％の組み合わせた頻度範囲ですべての腫瘍に存在した。すべてのＴおよびＮＫ免疫細胞クラスター間の関係を視覚化するために、最小スパニングツリーを計算的に生成した。これは、クラスター３２５０４および３２５４０が、ｄｌ－ＮＫおよびＴ細胞クラスターの両方と表現型的に類似していることを明らかにした（図１１）。これらの高頻度を考えると、これらの２つのクラスターは、ｄｌ－ＮＫ細胞が由来する供給源として機能し得、これらのＮＫ細胞型とＴ細胞型との間の以前に理解されていなかった表現型可塑性を表す。

上述の８つの免疫細胞クラスターのうち、５つは、ビメンチン細胞存在量と負に相関した（ｒ_ｓ＞－０．６）（図１Ｄ）。これらのデータは、免疫浸潤物内の転移とＮＫ細胞との間の逆関係を記述する公表された報告と一致する。脱落膜ＮＫ細胞は、半同種異系胎児に免疫寛容を付与し、胎盤の成長を促進することによって、妊娠初期に重要な役割を果たす。ＨＧＳＣにおけるｄｌ－ＮＫ細胞の特定により、妊娠維持のためのＮＫ媒介性免疫寛容の同一の特徴が、ＨＧＳＣ腫瘍維持および進行のために逆転され得るという仮説を立てた。

新たに診断されたＨＧＳＣ腫瘍にわたるＮＫ受容体リガンド発現。疾患進行の異なる段階を各々表すＥ、ＥＶ、およびＶ腫瘍内細胞区画を以前に特定した後、我々は、これらの区画が、免疫寛容状態に対してＮＫ細胞機能を調節する方法を決定したかった。したがって、我々は、新たに診断された１２個の後期ＨＧＳＣ腫瘍から調製された９３５，５６３個の無傷の単一細胞を分析した（材料および方法）。目的は、Ｅ、ＥＶ、およびＶ腫瘍区画内でＮＫ受容体リガンドを発現していたＨＧＳＣ腫瘍細胞の頻度を比較することであった。我々の改変されたＨＧＳＣ ＣｙＴＯＦパネルには、現在、１２個のＮＫ受容体リガンドおよび２個のＡＤＡＭプロテアーゼ（ディスインテグリンおよび金属プロテアーゼ）に対する抗体が含まれた。パネルには、ｉ）ＮＫＧ２Ｄ活性化ＮＫ受容体に結合するＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２／５／６、ＵＬＰＢＰ３、ＵＬＰＢＰ４、およびＭＩＣＡ／Ｂ、ｉｉ）ＮＫリガンドおよびＮＫ受容体脱落に関与するＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７プロテアーゼ、ｉｉｉ）ネクチン様リガンド、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１５５、およびネクチン－４であり、これらは、活性化ＮＫ受容体であるＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１としても知られる）ならびに阻害性ＮＫ受容体である免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、およびＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥとしても知られる）に結合する、ｉｖ）阻害性キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）に結合する、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子、Ａ、Ｂ、およびＣ、ならびにｖ）活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃヘテロ二量体へよりも高い親和性で、ＮＫ阻害性受容体ヘテロ二量体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合する、ＨＬＡ－Ｅである非古典的ＨＬＡクラスＩ分子のＮＫ受容体リガンドおよびＡＤＡＭプロテアーゼに対する抗体が含まれた。。

腫瘍細胞区画にわたるＮＫ受容体リガンド発現レベル。腫瘍細胞上のＮＫ受容体リガンドの発現レベルを視覚化するために、１２個のＨＧＳＯＣ試料の各々についてのＣｙＴＯＦデータセットを、前述のように手動でゲート化し（ＣＤ４５－、ＣＤ３１－、ＦＡＰ－）、それによって、免疫細胞、血管新生細胞、および間質細胞を除外した。得られた単一細胞データファイルを組み合わせ、Ｘシフトアルゴリズムを使用してクラスター化した。腫瘍細胞を、腫瘍マーカーであるＥ－カドヘリン、ＣＤ７３、ＣＤ６１、ＣＤ９０、ＣＤ１５１、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１３３、ＲＯＲ１、ＣＤ１０、ＣＤ１３、エンドグリン、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、メソセリン、ビメンチン、およびＨＥ４で以前と同様にクラスター化した。

５６個のＸシフト腫瘍細胞クラスター内のＮＫ受容体リガンドを発現する腫瘍細胞間の空間関係を、力指向性レイアウト（ＦＤＬ）によって可視化した。１０，０００個の単一細胞を各Ｘシフトクラスターから計算的にサンプリングし、各細胞を１０隣接グラフ上で繋げた（材料および方法）。このグラフを、表現型的に関連する細胞の群を互いに隣接させた力指向性レイアウトに供した（図２、Ａ～Ｃ、材料および方法）。ＦＤＬの生成を伴う単一細胞サブサンプリングを３回繰り返し、同等の結果を得た。結果として生じたＦＤＬは、１２個すべての試料からの腫瘍細胞の複合体であり、ＥおよびＶ区画、ならびに以前に報告されたように７つのクラスターからなるＥＶ区画の存在を裏付けた（図２Ａ、Ｖ細胞およびＥＶ細胞を囲んだ上部２つのパネル）。概して、ＦＤＬは、活性化ＮＫ受容体および阻害ＮＫ受容体の両方のための受容体リガンドが、すべての腫瘍細胞全体に均等に散在するのではなく、腫瘍細胞のポケット内の３つすべての区画において可変レベルで発現されることを明らかにした（図２、Ａ～Ｃ）。

以前の研究は、ＮＫＧ２Ｄ活性化ＮＫ受容体に対するリガンドの上方制御が、ＮＫ細胞が腫瘍細胞を検出および根絶することができる主要なメカニズムであることを実証した。我々のデータは、ＵＬＰＢＰ４以外に、すべてのＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドの最高レベルが、ＥおよびＥＶ ＨＧＳＣ腫瘍区画内に見られ、Ｖ区画内に最小レベルが見られたことを明らかにした（図２Ａ）。全体的に、これらのデータは、ＥおよびＥＶ腫瘍細胞区画内のＮＫ細胞の免疫監視役割と一致する。Ｖ細胞区画全体にわたる高レベルのＵＬＢＰ４発現は、例外であり、ＵＬＢＰ４をＵＬＢＰファミリー内の機能的外れ値として記述する最近の研究と一致する。

プロテアーゼＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７については、Ｅ区画およびＥＶ１移行性腫瘍細胞サブセットにおいて、高い発現レベルを有する細胞の離散的ポケットが観察された。ＮＫＧ２Ｄリガンドと共局在化したＡＤＡＭ発現腫瘍細胞のいくつかのポケットは、ＮＫリガンド脱落を促進することによって、ＮＫ細胞殺傷活性を無効にしようとする腫瘍細胞による試みを示唆している。活性化受容体のみに結合するＮＫＧ２Ｄリガンドとは対照的に、リガンドのネクチンファミリーは、活性化ＮＫ受容体および阻害ＮＫ受容体の両方に結合する。これらのリガンドはまた、高レベルのＣＤ１１２、ＣＤ１１３、およびＣＤ１５５を共発現するＥ腫瘍細胞のポケットを伴う可変発現パターンを示すが、ＥＶ２腫瘍細胞は、高レベルのＣＤ１１２およびＣＤ１１３を共発現し、ＥＶ３腫瘍細胞およびＥＶ５について同様に、ＣＤ１１３、ＣＤ１５５、およびネクチン４は、顕著であった（図２Ｂ）。

ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥは、主にＮＫ細胞阻害性受容体に関与して、健康な細胞に自己寛容性を提供する。これらのリガンドはまた、３つすべての腫瘍区画において様々なレベルで、細胞のポケット内で共発現させた（図２Ｃ、下部パネル）。注目すべきことに、ＮＫ細胞による腫瘍破壊を阻害するそれらの役割とは対照的に、腫瘍細胞によって発現されるＭＨＣクラスＩ分子の認識は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による破壊のためにそれらを標的とする。これは、ＭＨＣ Ｉ分子が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）からのペプチド断片をＣＴＬに提示する抗原依存性メカニズムで生じる。ＨＧＳＣにおける確立されたＴＡＡは、ＭＵＣ１６、メソセリン、およびＨＥ４である。ほとんどの場合、ＴＡＡおよびＨＬＡは、互いに排他的であった（図２Ｃ）。これらのデータは、ＨＧＳＣ細胞が、ＮＫおよびＣＤ８ Ｔ細胞の両方の殺傷活性から二重回避メカニズムを進化させた可能性を示唆する。

ＮＫ受容体リガンドの発現レベルを定量化する。ＮＫ受容体リガンドの発現レベルが個々のＨＧＳＣ試料にわたってどのように変化したかを定量化するために、我々は、すべての腫瘍にわたって、Ｅ、ＥＶ、およびＶ腫瘍区画における各ＮＫ受容体リガンドおよびＡＤＡＭの箱ひげ図を作製した（図２Ｄ）。統計的分析は、ほとんどの場合、ＮＫ受容体リガンドおよびＡＤＡＭの発現レベルは、Ｅ区画とＥＶ区画との間で著しい違いはなかったことを明らかにした。しかしながら、これらのタンパク質の発現レベルは、ＵＬＢＰ４を除いて、すべて、Ｖ区画において統計的に低かった。これらのデータは、転移性Ｖ細胞が、ＮＫ受容体活性化リガンドの発現レベルを低減させることによって、免疫監視を大きく「回避した」ことを示唆する。

ＮＫ受容体リガンド発現の組み合わせ多様性を定量化する。考察したように、活性化および阻害性受容体の大きなレパートリーの組み合わせ発現パターンは、高度の表現型および機能的多様性をＮＫ細胞に与える。その結果、これらの受容体は、腫瘍細胞上に存在する活性化リガンドおよび／または阻害性リガンドの対応する複雑なレパートリーによって調節される。これは、腫瘍細胞が、腫瘍免疫微小環境を形成するために、ＮＫ細胞機能を編成する上で主要な役割を果たす可能性を有することを必然的に意味する。Ｅ、ＥＶ、およびＶ腫瘍区画の免疫微小環境内の潜在的な差異を決定するために、我々は、１２個のＮＫ受容体リガンドおよび２個のＡＤＡＭプロテアーゼの異なる組み合わせ発現パターンを有する細胞の頻度を測定するために、ブール分析を適用した。２^１４つまり１６，３８４個のＮＫ受容体リガンドの組み合わせを評価し、（Ｅ、ＥＶおよびＶ腫瘍区画における）特定のＮＫ受容体リガンドの組み合わせを保有する腫瘍細胞の頻度を比較した（図３Ａ、材料および方法）。ＮＫ受容体リガンド／ＡＤＡＭプロテアーゼの組み合わせを発現する任意の試料中の任意の区画における細胞について、１％超の閾値細胞頻度を使用して、１６３個のＮＫ受容体リガンドの組み合わせが、１２個のＨＧＳＣにおける腫瘍細胞によって発現された（図３Ａ、左側、行でのリガンドの組み合わせ）。

ブール分析は、ＥおよびＥＶ腫瘍区画における細胞が、Ｖ腫瘍区画（６７個の表現型）よりもＮＫ受容体リガンド／ＡＤＡＭ（それぞれ１０３個および１０１個の表現型）についてより大きな組み合わせ多様性を有することを実証した（図３Ｂ）。Ｅ区画とＥＶ区画（５３）との間には、Ｅ区画とＶ区画（５）およびＥＶ区画とＶ区画（６）との間よりも多くの共有表現型があった（図３Ｂ）。これらのデータは、３つの区画の各々における腫瘍細胞によって編成される免疫微小環境の差異的調節を示唆する。

異なる腫瘍細胞区画におけるＮＫ受容体リガンドの組み合わせ多様性をさらに定量化するために、我々は、シンプソンの多様度指数を計算した（図３Ｃ）。この指標は、自然生息地内の生物多様性を定量化するために生態学でしばしば使用され、最近、ＮＫおよび卵巣腫瘍ＣｙＴＯＦデータセットに適用された。ここに適用すると、ＥおよびＥＶ区画におけるシンプソンの多様度指数は、Ｖ腫瘍区画と比較して有意に高く（図３Ｃ）、これは、ＥおよびＥＶ区画におけるＮＫ受容体リガンドの組み合わせの数が、Ｖ区画と比較して多いことと一致した。

ＨＧＳＣ細胞株にわたるＮＫ受容体リガンド発現卵巣がん細胞株の遺伝子分析において、Ｄｏｍｃｋｅらは、ＨＧＳＣのより信頼性が高いインビトロモデルを提供することを目標に、切除されたＨＧＳＣ腫瘍に対する遺伝子の一致によってランク付けされた卵巣細胞株のリストを提示した。これらの細胞株の表現型がＨＧＳＣ腫瘍細胞とどのように比較されるかを決定するために、我々は、ＮＫ受容体リガンドおよびＡＤＡＭに対する抗体で改変された我々のＣｙＴＯＦ腫瘍抗体パネルを用いて、最高ランクのＨＧＳＣ細胞株のうちの１３個を分析した。Ｘシフトクラスター化およびＦＤＬ可視化を用いて実施したデータ分析は、他の測定された腫瘍マーカーに加えて、Ｅ－カドヘリンおよびビメンチンの発現レベルに基づいて、Ｅ、ＥＶ、およびＶ腫瘍区画を表現型コピーしたＨＧＳＣ細胞株を明らかにした（図Ｓ４Ａ）。

Ｅ、Ｖ、およびＥＶ細胞株にわたるＮＫ受容体リガンド／ＡＤＡＭ発現レベルの調査により、パターンは、同一ではないが、ＨＧＳＣにおけるそれらのＥ、Ｖ、およびＥＶの対応物と同等であることが明らかになった（図１２）。例えば、ＮＫＧ２Ｄ活性化リガンドは、主にＥおよびＥＶ細胞株において発現されたが、Ｖ細胞株においては非常に低いレベルで発現された（図１２ＢおよびＥ）。インビトロ実験のために、我々は、続いて、Ｅ、ＥＶ、およびＶ ＨＧＳＣ腫瘍細胞をそれぞれ表す３つのＨＧＳＣ細胞株、ＯＶＣＡＲ４、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、およびＴＹＫ－ｎｕを選択した。

カルボプラチンに応答するＮＫ受容体リガンド発現レベルの変化。遺伝毒性剤を用いたＤＮＡ損傷応答の活性化は、ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ１のリガンドの発現を増加させ、それによって、「ストレス」細胞を、よりＮＫ細胞死の影響を受けやすくすることが確立されている。したがって、我々は、３つのＨＧＳＣ細胞株を、ＨＧＳＣを有する女性のための標準的なケアレジメンの一部である、遺伝毒性剤であるカルボプラチンに曝露した。１週間後、腫瘍／ＮＫ受容体リガンド抗体パネルを使用して、ＨＧＳＣ細胞株をＣｙＴＯＦのために処理した（表１２）。

カルボプラチン処置後のＤＮＡ損傷応答は、ｐＨ２ＡＸの認識された増加によって確認された（図４）。しかしながら、測定されたＮＫ活性化受容体リガンドのうち、カルボプラチンに応答して増加したのは、ＯＶＣＡＲ４発現ＵＬＢＰ２細胞のみであった（２４％～５０％）。阻害性ＮＫ受容体についてのリガンドの評価は、ＨＬＡ－Ｅを発現する３つすべての細胞株の頻度の著しい増加およびＨＬＡ－ＡＢＣを発現するＫｕｒａｍｏｃｈｉ細胞の著しい増加を明らかにした。

カルボプラチンは、ネクチン４、特にＯＶＣＡＲ４を発現するＨＧＳＣ細胞の頻度を増加させた。カルボプラチンへの細胞の長期曝露（２つの異なる用量で）は、ＴＹＫ－ｎｕ細胞のわずかな変化（６％、９％、９％）を伴うＫｕｒａｍｏｃｈｉの１５％、２２％、および２３％と比較して、ＯＶＣＡＲ４細胞の頻度をベースラインの２４％から３９％、および４５％に増加させた（図４）。ネクチン４の過剰発現は、トロホブラストにおけるＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する感受性を増加させる。したがって、カルボプラチン曝露後の類推によって、ＯＶＣＡＲ４は、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する最大の感受性を示し、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ細胞およびＴＹＫ－ｎｕ細胞に対する感受性は、明らかに低下した（図４）。ＴＹＫ－ｎｕ細胞において、カルボプラチンは、阻害性ＣＤ９６受容体のリガンドであるＣＤ１１１、ならびにＴＩＧＩＴを介したシグナル伝達を増強する役割の著しい増加を媒介した。ＮＫ細胞の細胞傷害性に対するこの追加の回復力は、カルボプラチン耐性のまだ認識されていないメカニズムを明らかにする。

ＨＧＳＣ免疫寛容性微小環境をモデル化するためのＨＧＳＣ－ＮＫ－９２細胞株共培養。ＨＧＳＣ免疫細胞浸潤物の我々の分析からの主な所見のうちの１つは、ｄｌ－ＮＫ細胞亜集団と全体的な腫瘍細胞存在量との間の正の関連であった。ｄＮＫのようなｄｌ－ＮＫ細胞が機能的に免疫寛容であるか否かを決定するために、我々は、Ｅ、ＥＶ、およびＶ ＨＧＳＣ細胞株（ＯＶＣＡＲ４、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、およびＴＹＫ－ｎｕ）とヒトＮＫ－９２細胞株との間のインビトロ共培養実験の後に、ＮＫ ＣｙＴＯＦ抗体パネルを使用して、脱落膜ＮＫ細胞の特徴を測定した。ＮＫ－９２細胞株は、養子ＮＫ細胞免疫療法のためのその臨床開発を理由に選択した。

ＨＧＳＣ細胞株との共培養後のＮＫ－９２細胞におけるＣＤ９発現。我々は、まず、脱落膜ＮＫ細胞の表現型特徴／マーカーであるＣＤ９の発現を調査した。単一培養では、ＮＫ－９２細胞は、最小限のＣＤ９発現を示した。しかしながら、ＨＧＳＣ細胞株との共培養後、最大６０％のＮＫ－９２細胞がＣＤ９を発現した。ＯＶＣＡＲ４細胞株は、ＣＤ９発現ＮＫ－９２細胞の最大誘導を媒介し、これは、６時間で最大であり（図６Ａ）、レベルは、４８時間で依然として持続した。共培養を２つの細胞株の間で膜バリア（トランスウェル）で実施した場合、ＮＫ－９２細胞上のＣＤ９＋発現は、劇的に低減し（＜４％）、ＨＧＳＣ腫瘍とＮＫ－９２細胞との間の物理的接触の必要性を実証した（図５Ａ）。

ＮＫ－９２細胞上の表面ＣＤ９発現の出現についての１つの潜在的な説明は、ＨＧＳＣ細胞との共培養中に、細胞表面へのトラフィックに誘導される細胞内ＣＤ９プールを保持することである。これに対処するために、我々は、同じＣＤ９抗体であるが異なるコンジュゲートを有する抗体で、単一培養で成長したＮＫ－９２およびＯＶＣＡＲ４細胞を染色した（材料および方法）。ＣＤ９の連続的な細胞染色（表面、次いで細胞内）は、ＮＫ－９２細胞が表面ＣＤ９および細胞内ＣＤ９の両方を欠いていることを示した。対照的に、ＯＶＣＡＲ４細胞は、両方の細胞位置において健全なレベルのＣＤ９を発現した（図５Ｂ、ならびに材料および方法）。

共培養後にＮＫ－９２細胞上に提示されたＣＤ９が内因的に産生されなかったことをさらに確認するために、ＣＤ９＋ＮＫ－９２細胞とその陰性対応物ＣＤ９－ＮＫ－９２細胞とを、ＯＶＣＡＲ４細胞株と測定されたＣＤ９転写産物との共培養後にＦＡＣＳで選別した（図５Ｃ）。ＦＡＣＳ選別ＮＫ－９２細胞のいずれにおいても、転写産物は検出されなかった。対照的に、ＣＤ９タンパク質発現と一致する健全なレベルのＣＤ９転写産物が、それらが共培養された、ＦＡＣＳで選別されたＯＶＣＡＲ４株において見られた。測定された対照転写産物は、ＣＤ４５（ＮＫ９２に対して陽性、ＯＶＣＡＲ４に対して陰性）およびＥ－カドヘリン（ＮＫ９２に対して陰性、ＯＶＣＡＲ４に対して陽性）であった（図５Ｃ）。

ＨＧＳＣ原発腫瘍および細胞株にわたるＣＤ９発現ＣＤ９の発現がＨＧＳＣにおいてどれだけ広まっているかを決定するために、我々は１７個の原発性ＨＧＳＣ腫瘍および１１個のＨＧＳＣ細胞株をスクリーニングして、ＣＤ９発現細胞の頻度およびＣＤ９発現のレベルの両方を決定した。原発性腫瘍コホートについては、ＣＤ９＋腫瘍細胞の高頻度が、１７個すべての試料にわたって５９～９９％の範囲で全試料中に存在した（図１３）。ＨＧＳＣ細胞株については、Ｄｏｍｃｋｅらによって報告された上位のＨＧＳＣ細胞株をスクリーニングし、ＣＤ９発現細胞の高頻度を観察した。（注記：ＨＧＳＣ細胞株は、図６Ａに示される非ＨＧＳＣ細胞株と同時にスクリーニングした）。

ＮＫ－９２細胞がＣＤ９を獲得するメカニズムとしてトロゴサイトーシス。我々は、ＨＧＳＣ細胞株がＣＤ９の供給源であり、トロゴサイトーシスとして知られるプロセスによってＮＫ９２細胞に移入され得ると仮定した。これは、細胞と細胞との接触から数分以内に移入されるアンカータンパク質を含む形質膜断片に関与する。したがって、ＮＫ－９２をＯＶＣＡＲ４細胞とともに１５、３０、６０、１２０、および３６０分間共培養し、その後、蛍光ベースのフローサイトメトリーによってＮＫ－９２細胞上のＣＤ９発現を測定した。我々は、早ければ共培養の１５分後にもＮＫ－９２細胞上でＣＤ９発現を検出し、ＣＤ９＋ＮＫ－９２細胞は、３６０分まで着実に増加した（図１４）。これらのデータは、ＮＫ－９２細胞によるＣＤ９獲得のメカニズムとしてのトロゴサイトーシスと一致する。特に、ＣＤ９＋ＮＫ－９２細胞の頻度は、共培養の４８時間まで維持され、これは、他のシステムにおける膜関連タンパク質の移入と完全に一致する結果である。

ＮＫ－９２細胞によるＣＤ９獲得のメカニズムがトロゴサイトーシスによるものであることをさらに確認するために、我々は、追加の一連の実験を実施した。多くの研究は、アクチン重合の阻害剤がトロゴサイトーシスを遮断するが、これらの阻害剤の効果は、細胞型に応じて変化することを示している。我々のパイロット実験は、一連のかかるトロゴサイトーシス阻害剤、コンカナバリンＡ、ワートマニン、ＥＤＴＡ、ノコダゾール、およびサイトカラシンＤを試験した。最適な結果は、ＮＫ－９２細胞をサイトカラシンＤとともに２時間プレインキュベートしたときに得られ、その後、サイトカラシンＤの存在下でのＯＶＣＡＲ４、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、およびＴＹＫ－ｎｕ ＨＧＳＣ腫瘍細胞株との共培養により、ＣＤ９＋ＮＫ－９２細胞の４０～６９％の低減がもたらされた（図５Ｄ）。

ＯＶＣＡＲ４細胞がＣＤ９＋ＮＫ－９２細胞の頻度の最大の増加（約６０％）を誘導したことを考慮して、その後の機械的実験を、このＨＧＳＣ細胞株で行った。ＣＤ９を含有する形質膜断片がＯＶＣＡＲ４細胞から移入されたことを確認するため、これらの細胞を、ＮＫ－９２細胞との共培養前に、緑色蛍光親油性膜色素であるＰＫＨ６７で標識した。２４時間後、細胞をＣＤ４５およびＣＤ９に対する抗体で染色し、蛍光ベースのフローサイトメトリーのために処理した。最高の標的細胞（ＯＶＣＡＲ４）：エフェクター細胞（ＮＫ－９２）比（５：１および２．５：１）で、約５０％のＮＫ－９２細胞がＣＤ９を発現し、緑色蛍光色素が同時に検出された。細胞比が１：５に低下すると、ＮＫ－９２細胞によるＯＶＣＡＲ４膜断片の捕捉も同様に低下した（図５Ｅ）。

トロゴサイトーシスがドナーからレシピエント細胞への膜断片の取り込みに関与することを考慮して、我々はまた、顕微鏡検査を実施して、ＯＶＣＡＲ４細胞からＮＫ－９２細胞へのＣＤ９＋形質膜断片の組み込みを可視化した。ＯＶＣＡＲ４およびＮＫ－９２細胞を、親油性蛍光色素ＰＫＨ６７（緑色）およびＰＫＨ２６（赤色）でそれぞれ標識した。３時間の共培養後、細胞をＣＤ９およびＣＤ４５に対する抗体で染色し、ＯＶＣＡＲ４細胞は、青色（ＣＤ９）および緑色（ＰＫＨ６７）に染色し、赤色（ＰＫＨ２６）および白色（ＣＤ４５）チャネルではシグナルは観察されなかった。ＮＫ－９２細胞は、赤（ＰＫＨ２６）、緑（ＰＫＨ６７）、ＣＤ４５（白）、および青（ＣＤ９）の４つすべてのチャネルで観察された（図５Ｆ（左側の列））。これらの画像は、合流したチャネル画像とともに、ＮＫ－９２が、ＯＶＣＡＲ４細胞からのＣＤ９を含むトロゴサイト化された形質膜断片を有することを実証した。逆方向のトロゴサイトーシスは、検出されなかった。

非ＨＧＳＣ細胞株からのＮＫ－９２トロゴサイトーシスの評価。ＮＫ－９２ ＣＤ９トロゴサイトーシスが非ＨＧＳＣ腫瘍細胞の特徴であるか否かを決定するために、我々は、１５個の非ＨＧＳＣならびに１１個のＨＧＳＣ腫瘍細胞株におけるＣＤ９発現細胞の頻度を確立した（図６Ａ）。ＣＤ９発現腫瘍細胞の頻度およびレベルは、細胞株にわたって変化し、最高のＣＤ９レベルから最低のＣＤ９レベルまで提示される（図６ＡおよびＢ）。共培養実験を設計する際、我々は、トロゴサイトーシス研究において、Ｄａｕｂｅｕｆらが、形質膜タンパク質の発現レベルが、それがレシピエント細胞にどの程度移入されたかを決定づけるものではないことを示したことに注目した。したがって、我々は、トロゴサイトーシス実験のために、高いＣＤ９発現を有する３つの非ＨＧＳＣ腫瘍細胞株（ＨＣＴ１１６、Ａ４３１、およびＭＣＦ７）、ならびにより低いＣＤ９発現を有する３つの腫瘍細胞株（ＨｅＬａ、ＣａＣｏ－２、およびＨｅｐＧ２）を選択した（図６Ｂ）。非ＨＧＳＣ細胞株からのＮＫ－９２トロゴサイトーシスは、高度に変化し、ＣＤ９レベルと相関せず、ＨＣＴ１１６大腸がん細胞株以外では、ＨＧＳＣ細胞株からのものほど顕著ではなかった（図５Ｃおよび６Ｃ）。サイトカラシンＤは、ＮＫ－９２におけるＣＤ９取り込みを部分的に阻害し、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７、およびＣａＣｏ２細胞株に関して最も目立った（図６Ｃ）。細胞株データは、ＨＧＳＣにおいて、ＮＫ細胞がトロゴサイトーシスによってＣＤ９を獲得する可能性が高く、このプロセスは、他の悪性腫瘍で生じ得るが、それは、それほど顕著ではないように思われることを示唆する。

ＣＤ９＋およびＣＤ９－ＮＫ－９２細胞の細胞内サイトカイン産生。ｄＮＫ細胞が免疫寛容を発揮するメカニズムのうちの１つは、細胞傷害性応答の低下および特定のセットのサイトカインの分泌によるものである。したがって、我々は、トロゴサイトーシスおよびＮＫ－９２細胞によるＣＤ９の獲得は、免疫寛容の特徴をそれらに与えると仮定した。したがって、ＨＧＳＣ細胞株との共培養後に、細胞溶解性タンパク質（パーフォリンおよびグランザイムＢ）、抗腫瘍サイトカイン（ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ）、血管新生促進性サイトカインＩＬ－８、免疫抑制性サイトカインＩＬ－１０、およびＣＤ９＋およびＣＤ９－ＮＫ－９２細胞の両方における脱顆粒のマーカーであるＣＤ１０７ａの細胞内発現レベルを測定した。具体的には、ホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）に応答して、共培養の前後のＮＫ－９２細胞機能を測定した。共培養物をＰＭＡに曝露すると、上流のＮＫ受容体シグナル伝達が回避され、それは、ＮＫ細胞機能を測定するための便利な方法である。パイロット研究では、６時間の共培養時間が、最も健全な細胞内サイトカイン産生（ＩＣＰ）を産生すると決定した。したがって、ＮＫ－９２およびＨＧＳＣ細胞株を、分泌を遮断するために添加されたブレフェルジンＡおよびモネンシンとともに、ＰＭＡの存在下で６時間共培養した（４時間の曝露）（材料および方法）。すべての実験について、２つの陽性対照を使用した。第１の対照は、単一培養で成長するＮＫ－９２細胞のためのＰＭＡ媒介性ＩＣＰであり、第２の対照は、Ｋ５６２細胞との共培養後のＮＫ－９２細胞のためのＩＣＰであった。続いて、ＮＫ細胞における脱顆粒、細胞傷害性顆粒の存在、および細胞内サイトカイン産生を測定するように設計された抗体パネルを使用して、ＣｙＴＯＦ分析のために共培養物および対照を処理した。重要なことに、ＣｙＴＯＦパネルにＣＤ９抗体を含むことにより、ＣＤ９＋およびＣＤ９－ＮＫ－９２亜集団についてのＣｙＴＯＦデータファイルをゲート化し、それらの応答を比較することができた。

ＣＤ９＋ＮＫ－９２細胞は、より免疫抑制性の表現型を有する。アッセイしたすべての細胞内タンパク質について、我々が測定した２つの測定基準は、ｉ）陽性細胞の頻度、およびｉｉ）産生された各タンパク質の量であった。タンパク質のサブセットに関して、単一培養または共培養で成長したＮＫ－９２細胞については、差異は観察されなかった。さらに、ＮＫ－９２細胞のＣＤ９＋およびＣＤ９－亜集団について、共培養後に差異は観察されなかった。したがって、ＮＫ－９２細胞の８５％超は、すべての条件（単一培養、共培養、ＰＭＡの存在および非存在）下で同等に高いレベルのグランザイムＢ、パーフォリン、およびＭＩＰ１βを産生した。ＣＤ１０７ａによって決定されるＮＫ－９２細胞の脱顆粒化、およびＭＩＰ１αの産生に関して、ＰＭＡは、単一培養および共培養において、健全な応答を誘導し、後者については、ＣＤ９＋とＣＤ９－ＮＫ－９２亜集団との間の差異は観察されなかった。ＶＥＧＦレベルは、構成的に高く、ＮＫ－９２細胞の９０％超がこの血管新生因子を単一培養において、および共培養後に産生した（図１５）。

対照的に、３つすべてのＨＧＳＣ細胞株との共培養およびＰＭＡ刺激後、統計的に大きな割合のＣＤ９＋ＮＫ－９２細胞が、ＣＤ９－ＮＫ－９２細胞と比較して、ＩＬ－８を発現するということに気付いた（図７Ａ）。ＩＬ－８は、胎盤を血管化する役割を有するｄＮＫ細胞によって産生される血管新生促進因子であり、悪性腫瘍の文脈において、腫瘍血管新生系を促進する役割を有する。また、共培養およびＰＭＡ刺激後、ＣＤ９＋ＮＫ－９２細胞において、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮγを発現するＮＫ－９２細胞の割合は、有意に低かった。免疫抑制性サイトカインＩＬ－１０については、ＣＤ９＋およびＣＤ９－ＮＫ－９２細胞の約６０％がこのサイトカインを産生した。ＣＤ９＋ＮＫ－９２細胞が腫瘍微小環境をどのように調節することができるかについてのさらなる考慮は、産生されるサイトカインの量を規制することによる（図７Ｂ）。それらの免疫寛容機能と一致して、ＣＤ９＋ＮＫ－９２細胞は、同じ共培養におけるＣＤ９－細胞と比較して、統計的に低減された量の抗腫瘍サイトカインＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮγを産生した。

細胞内サイトカインデータは、ＣＤ９発現ＮＫ－９２細胞が、細胞の頻度および産生される量の両方の観点から、サイトカイン産生を調節することによって、より多くの免疫抑制機能を有することを強く示唆する。

ＨＧＳＣ細胞株によって減衰したＮＫ－９２細胞の細胞傷害性。ｄＮＫ細胞の特徴のうちの１つは、胎児に免疫寛容を付与することと一致する低い細胞傷害性である。この特徴が、ＮＫ－９２細胞をＨＧＳＣ細胞株とともに共培養したときに明らかであったか否かを決定するために、我々は、インビトロ細胞傷害性アッセイを実施した。ＮＫ－９２細胞をＯＶＣＡＲ４、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、およびＴＹＫ－ｎｕ細胞株とともに４時間共培養した後、カルセイン放出を測定した（図８Ａ、材料および方法）。ヒトＮＫ細胞に対する最も感受性が高い標的細胞であるＫ５６２細胞株と比較して、ＮＫ－９２細胞傷害性は、３つすべてのＨＧＳＣ細胞株に対して著しく低減した。さらに、減衰の大きさは、ＯＶＣＡＲ４、細胞がよりＮＫ細胞殺傷の影響を受け、ＴＹＫ－ｎｕ細胞がＮＫ細胞殺傷の影響を受けにくいように、腫瘍進行段階とともに傾向付けられた。この結果は、ＥまたはＥＶ ＨＧＳＣ腫瘍細胞型のいずれかよりも、ＮＫ細胞機能に対してより抑制的であるＶ細胞のＮＫ受容体リガンドプロファイルと一致する（図２および３）。

遮断ＣＤ９抗体とのプレインキュベーションは、ＮＫ－９２細胞の細胞傷害性を回復させる。ＨＧＳＣ細胞株に対して観察される細胞傷害性の低減が、ＣＤ９、またはトロゴサイトーシスによってＮＫ－９２細胞に同時に移入された他の形質膜タンパク質のいずれかに起因する可能性があるか否かを決定するために、我々は、ＣＤ９遮断抗体の存在下で細胞傷害性アッセイを実施した（図８Ｂ）。データは、ＣＤ９遮断抗体が、ＯＶＣＡＲ４細胞に対するＮＫ－９２媒介性細胞傷害性を著しく増加させたことを示した。これらのデータは、ＨＧＳＣの免疫抑制において重要な役割を有するＣＤ９の強力な事例となる。

ＦＡＣＳで選別されたＣＤ９ ＮＫ－９２細胞は、細胞傷害性が低減している。ＣＤ９＋とＣＤ９－ＮＫ－９２細胞との間の細胞傷害性を直接比較するために、我々は、ＯＶＣＡＲ４との共培養後にＣＤ９＋ＮＫ－９２細胞をＦＡＣＳで選別した。カルセイン放出細胞傷害性アッセイは、単一培養で成長したＮＫ－９２細胞と比較して（低バックグラウンドＣＤ９タンパク質およびｍＲＮＡ）、ＣＤ９＋ＮＫ９２細胞による殺傷活性の統計的に有意な減衰を明らかにした（図８Ｂ）。減衰は、Ｋ５６２細胞では３３％、ＯＶＣＡＲ４では４９％、およびＫｕｒａｍｏｃｈｉでは７５％であった。開始時にＴＹＫ－ｎｕ細胞株に対する細胞傷害性が非常に低かったため、殺傷のさらなる低減は、最小限であり、統計学的に有意ではなかった。これらのデータは、ＮＫ－９２細胞上でのＣＤ９の存在が、それらにより免疫寛容な表現型を与えることを実証する。

宿主の免疫寛容を克服するために、免疫チェックポイント阻害剤を用いて免疫系を再活性化することは、腫瘍学の分野における画期的な治療アプローチである。しかしながら、免疫チェックポイント阻害剤を受けているＨＧＳＣの女性を対象としたいくつかの臨床試験のデータは、失望的である。これらのデータの１つの説明は、Ｔ細胞媒介性免疫抑制の任意の逆転をオーバーライドする追加の細胞型の存在であり得る。これと一致して、新たに診断された化学療法未実施のＨＧＳＣ腫瘍の我々のＣｙＴＯＦデータ分析は、腫瘍およびＥＶ細胞の全体的な存在量と正の相関があった以前に特定されていなかったｄｌ－ＮＫ細胞亜集団を明らかにした（図１および図１０Ａ）。ｄｌ－ＮＫ細胞の存在は、大腸および肺腫瘍において報告されているが、我々が知る限りでは、これがＨＧＳＣにおけるこの免疫細胞型の最初の報告である。

脱落膜ＮＫ細胞は、妊娠初期の全リンパ球集団の７０％を占め、末梢ＮＫ細胞とは表現型的および機能的に異なる。それらは、胎盤の脱落、形成および、血管形成、ならびに特権的な免疫寛容性母体－胎児区画の作成に重要である幅広い分泌タンパク質を産生する。さらに、ｄＮＫ細胞は、細胞傷害性が低いが、それらは、細胞傷害性顆粒を含有し、これは、妊娠中に感染に対する免疫を提供するために一時的に活性化され得る。

この研究は、ｄｌ－ＮＫ細胞が、免疫寛容性および血管新生促進性腫瘍微小環境を作成するための取り入れられた脱落膜特性を有し、ＨＧＳＣ腫瘍細胞がこの目的に向けてｄｌ－ＮＫ特性を操作するという仮説に基づいた。我々のアプローチは、新たに診断された化学療法未実施の後期ＨＧＳＣ腫瘍上でのＮＫ受容体リガンド発現の最初に報告されたマルチパラメータ単一細胞分析を実施するためにＣｙＴＯＦを利用し、さらに、インビトロ研究において、ＨＧＳＣ腫瘍細胞がＮＫ細胞機能をどのように調節するかを決定する。全体として、本研究におけるデータは、ＨＧＳＣ腫瘍細胞によって媒介される免疫抑制の以前に認識されていなかったメカニズムを明らかにする。これには、ＮＫ受容体に結合するリガンドの組み合わせ発現、ならびにトロゴサイトーシスによるＣＤ９のＮＫおよびおそらく他の免疫細胞型への移入能力が含まれる。

データ分析は、Ｅ細胞およびＥＶ細胞が、Ｖ細胞よりも多くのＮＫ活性化受容体リガンドを発現したことを明らかにし、上皮から転移移行を受ける細胞がＮＫＧ２Ｄリガンドを失うという以前の報告と一致した。これらの所見の例外は、細胞傷害性ではなく免疫回避を促進し得る、高レベルのＮＫＧ２Ｄリガンド、ＵＬＢＰファミリー内の機能的外れ値であるＵＬＢＰ４であった。この考え方と一致して、最近の研究は、タンパク質分解性脱落および／またはＵＬＢＰ４を構成的に発現するエクソソームの産生が、免疫回避の代替メカニズムとしてＮＫＧ２Ｄ受容体の活性化を調節することを示した。

ブールおよびシンプソンの分析は、ＥおよびＥＶ区画が、Ｖ腫瘍区画（６７）よりもＮＫ受容体リガンドの組み合わせ多様性（それぞれ１０３および１０１の組み合わせ）が大きいことを明らかにした（図３）。これらのデータは、腫瘍発生の初期段階におけるリガンドの組み合わせの数が多いほど、腫瘍免疫細胞回避および予後不良Ｖ細胞への最終的な移行の可能性を増加させ得ることを示唆する。Ｖ表現型を達成した後、これらの腫瘍細胞は、次いで、代替のより厳密な免疫回避メカニズムに切り替えることができる（図２Ｄおよび図３）。その結果、Ｖ細胞ＨＧＳＣ微小環境は、ＮＫ細胞免疫療法に対して敵対的である可能性が高い。

多数の研究が、遺伝毒性剤、後成的な修飾因子、および放射線への曝露に応答して、ＮＫ受容体活性化リガンドの上方調節を文書化した。このアプローチは、ＨＧＳＣ（特に転移性Ｖ区画）をＮＫ免疫療法により適したものにする可能性を有する。我々は、Ｅ、ＥＶ、およびＶ ＨＧＳＣ細胞株を、第１のラインのＨＧＳＣ治療レジメンで使用される化学療法剤であるカルボプラチンに曝露した（図４）。３つすべての細胞株において、カルボプラチンは、ＮＫ阻害性受容体リガンドを発現したＨＧＳＣ腫瘍細胞の割合を増加させた。さらに、ネクチン４およびＣＤ１１１を発現する腫瘍細胞の頻度の増加は、ネクチン４およびＣＤ１１１の両方が、接着、細胞移動、および幹細胞生物学において追加の役割を有するため、ＮＫ細胞を活性化するそれらの能力に限定されない場合がある。ネクチン４の発現は、ＮＫ細胞の細胞傷害性に対する腫瘍細胞の感受性を高めることができるが、ＨＧＳＣ転移および化学療法抵抗性における役割を有することが提案されている。カルボプラチンがより免疫抑制性の微小環境を作成する可能性は、ＨＧＳＣにおける白金耐性に関する未発見のメカニズムであり、これは、ＨＧＳＣ患者の転帰を改善するための大きな課題であり続けている。

脱落膜様ＮＫ細胞表現型が脱落膜ＮＫ細胞の機能的属性も伴っていたか否かについての機械的な洞察を得るために、我々は、ＮＫ－９２細胞株を有するＥ、Ｅ－Ｖ、Ｖ腫瘍区画をモデル化した３つのＨＧＳＣ細胞株間の共培養実験を設計した。ＮＫ－９２細胞株は、ＣＤ５６を発現し、阻害性ＫＩＲ受容体の発現を欠き、分子的に良好に特徴付けられている。ＮＫ－９２細胞は、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作され、ＮＫＧ２ＤなどのＮＫ受容体を活性化し、いくつかの初期段階の臨床試験において、安全基準を満たしている。

共培養において、我々は、Ｅ、ＥＶ、およびＶ ＨＧＳＣ細胞株がトロゴサイトーシスによるテトラスパニンＣＤ９の発現を誘導し、最大の誘導がＯＶＣＡＲ４細胞について一貫して観察されたことを実証した（図５Ａ～Ｆ）。我々がＨＧＳＣ細胞株で観察した高レベルのＣＤ９発現、およびＮＫ－９２細胞上でのその発現の不在は、このメカニズムと一致していた。トロゴサイトーシスは、アンカータンパク質を含有する形質膜の断片が１つの細胞から次の細胞に移入されるプロセスであり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好塩基球、およびＮＫ細胞で観察されている。これらの研究において、トロゴサイトーシスは、異なる免疫細胞表現型の間で生じ、レシピエント免疫細胞表現型に、新たな機能的特性、および他の以前にはアクセス不可能であった免疫細胞型と相互作用する機会を与えた。トロゴサイトーシスはまた、免疫細胞型と非免疫細胞型との間で生じることも観察されている。例えば、２つの別個の研究において、胆汁外トロホブラストを有するｄＮＫ細胞と、メラノーマ細胞を有する末梢ＮＫ細胞との間のインビトロ共培養実験（それぞれ）は、ＨＬＡ－ＧをＮＫ細胞上へ移入させた。そうすることで、両方のシステムにおけるＮＫ細胞の免疫寛容が向上した。さらに、最近の報告では、トロゴサイトーシスは、患者におけるキメラ抗原Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞療法に対する抵抗性の潜在的なメカニズムであると説明された。マウス白血病モデルを使用して、ＣＡＲ Ｔ細胞は、トロゴサイトーシスによって腫瘍細胞から標的抗原であるＣＤ１９を獲得し、結果は、患者の腫瘍で見られるＣＤ１９レベルの低減と一致した。これらの研究は、トロゴサイトーシスが免疫寛容、および最近の治療抵抗性において重要な役割を果たすという、ますます増大する証拠を提供する。

ＨＧＳＣ細胞株および原発腫瘍による高レベルのＣＤ９発現は、腫瘍内ＮＫ細胞のＣＤ９源を提供する（図７および図１３）。さらに、他の腫瘍浸潤免疫細胞型も、高レベルのＣＤ９発現を有する２つのＴ細胞クラスターの存在によって例示されるトロゴサイトーシスによってＣＤ９を獲得し得る（図１０Ａ）。高いＣＤ９発現レベルがＨＧＳＣの特性であるか否かを決定するために、我々は、ＣＤ９発現に関して一連の非ＨＧＳＣ腫瘍細胞株をスクリーニングした（図７Ａ、Ｂ）。ＣＤ９は、普遍的に発現したが、非ＨＧＳＣ細胞株にわたって異なるレベルで発現した。さらに、ＯＶＣＡＲ４細胞株と比較した場合、トロゴサイトーシスが観察されたが、しばしば大幅に減少した（図７Ｃ）。これらのデータに基づいて、トロゴサイトーシスは、大腸がんおよび肺がんで報告されているｄｌ－ＮＫ細胞を含むほとんどの腫瘍で生じる可能性が高い。

脱落膜ＮＫ亜集団に対するＣＤ９発現の排他性は、十分に確立されているが、これらの細胞におけるその機能的役割は、不明である。この研究では、共培養実験からのデータ分析により、トロゴサイトーシスを介したＮＫ－９２細胞によるＣＤ９発現の増加は、免疫調節性サイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＧＭ－ＣＳＦ）の著しい減少、血管新生促進性サイトカインＩＬ－８の増加、および細胞傷害の抑制と一致することが示された（図７および８）。重要なことに、ＣＤ９遮断抗体は、ＮＫ－９２細胞傷害性を著しく増加させ、ＣＤ９がＮＫ－９２細胞に低応答特性を付与するという強力な証拠を提供した（図９Ｂ）。さらに、卵巣腹水から単離された低応答性ＮＫ細胞は、活性化受容体ＤＮＡＭ１のレベルの低下を有することが示された。これらの所見はともに、腫瘍がＮＫ細胞の機能を抑制するために使用する複数の独立したメカニズムを強調する。

ＣＤ９は、普遍的な分布を示し、免疫細胞シナプスの形成における主要な役割とともに、増殖、運動性、および接着などの複数の細胞機能に関与する。したがって、ＣＤ９は、ＨＧＳＣ腫瘍免疫微小環境を調節することにおける複数の役割を有し得る可能性が高い。それは、ＡＤＡＭ１７プロテアーゼと直接結び付き、表面タンパク質エクトドメインに対するその切断活性を阻害することが示されている。したがって、ＨＧＳＣ腫瘍細胞からＮＫ－９２細胞へのＣＤ９の移入は、ＮＫ活性化受容体リガンド基質に対してＡＤＡＭ１７を再活性化することができ、それによって、免疫回避のためのさらに別のメカニズムを促進する。

我々の結果の有意性は、ＮＫ細胞免疫療法を受ける資格があるＨＧＳＣ患者のために、腫瘍微小環境内のＮＫ受容体リガンド発現を評価する重要な必要性を強調する。これは、現在、これらの患者がこの療法を受ける可能性が最も高いため、再発の状況にある患者にとって特に重要である。ＮＫ細胞の細胞傷害性（腫瘍内投与および養子投与の両方）を最大化するためには、ＮＫ受容体活性化リガンドの発現レベルにおいて有利なバランスが必ず存在しなければならない。

原発性ＨＧＳＣ腫瘍細胞におけるＣＤ９の豊富な発現（図１４）は、ＮＫ－９２または他の養子移入したＮＫ細胞が、トロゴサイトーシス、およびより免疫抑制性の表現への移行によってＣＤ９を獲得し、それによって、療法の意図を否定し得るという高い可能性を提示する。したがって、養子移入したＮＫ細胞によるＣＤ９発現の増加を監視するための末梢血検査が目的のものである。さらに、遮断ＣＤ９抗体は、ＮＫ免疫療法の前に投与され得る。この研究によって明らかになった機械的洞察をバイオマーカーに変換することは、すべての形態のＮＫ免疫療法に関連する。かかるバイオマーカーは、ＮＫ免疫療法に応答する可能性が最も高いＨＧＳＣ患者の選択を導くだけでなく、患者応答性の耐久性を監視するために使用することができる。この研究は、間違いなく、ＮＫ免疫療法が選択肢である他の悪性腫瘍に関連する。

材料および方法
患者試料。２年間にわたって収集されたＣｙＴＯＦ分析のための単一細胞懸濁液として調製された、匿名化された、新たに診断された化学療法未実施のＨＧＳＣ腫瘍をＩｎｄｉｖｕｍｅｄ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。腫瘍試料は、ヘルシンキ宣言に準拠して収集し、すべての患者は、書面によるインフォームドコンセントを提供した。ヒト組織の使用は、承認され、患者の機密保持のためのデータ保護に準拠した。ドイツ、ハンブルクの医師会で機関審査委員会の承認を得た。

ＴＰ５３およびＢＲＣＡ１／２についてのゲノム配列決定および分析。ＤＮＡを抽出し、マルチプレックスＰＣＲ（それぞれ、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキットおよびＱＩＡＧＥＮ ＧｅｎｅＲｅａｄ ＤＮａｓｅｑ標的卵巣Ｖ２パネル）により濃縮した。ＴｒｕｅＳｅｑプロトコルを使用して、プールされた試料アンプリコンからインデックスが付いたｉｌｌｕｍｉｎａの配列決定ライブラリを作製した。配列決定のための後続のプロトコルを以前に記載した。病原性変異体に留意した。

ＨＧＳＣおよび非ＨＧＳＣ悪性腫瘍由来のがん細胞株。細胞株を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって実施されたショートタンデムリピート（ＳＴＲ）プロファイリングによって認証した。卵巣がん細胞株（ＯＶＣＡＲ４、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、およびＴＹＫ－ｎｕ）、ＮＫ－９２、およびＣＤ９スクリーニングに使用される他の非ＨＧＳＣ細胞株を、それぞれのベンダーからの推奨条件に従って成長させた。

ＣｙＴＯＦのための抗体。抗体は、以前に報告されたように、社内で事前コンジュゲートまたはコンジュゲートされたもののいずれかを購入した。要するに、社内コンジュゲートに関しては、担体を含まないＰＢＳ中の抗体は、メーカーのプロトコルに従って金属キレートポリマー（ＭａｘＰＡＲ抗体コンジュゲートキット、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）に、または当社のプロトコル（１０１）によりビスマスにコンジュゲートされた。抗体安定化溶液（ＣＡＮＤＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で金属標識抗体を０．２～０．４ｍｇ／ｍＬに希釈し、４℃で保存した。細胞株および一次ヒト試料を陽性対照および陰性対照として使用して、各抗体を滴定した。実験で使用した抗体濃度は、最適なシグナル対ノイズ比に基づいた。この研究では、３つのＣｙＴＯＦ抗体パネルを使用して、ｉ）腫瘍ＴおよびＮＫ細胞、ｉｉ）腫瘍ＮＫ受容体リガンド発現、ならびにｉｉｉ）ＮＫ細胞受容体および細胞内サイトカイン発現を特徴付けた。

蛍光ベースのフローサイトメトリーのための抗体。抗体を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＣＤ９ ＢＶ４２１、ＣＤ９ ＰＥ）およびＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（ＣＤ４５ ＡＰＣ）からＣＤ９およびＣＤ４５の検出のために購入した。同じ抗体クローンをＣｙＴＯＦに使用した。Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒからの近赤外線固定可能な生／死染色を使用して、死細胞を区別した。

ＣｙＴＯＦのための試料処理および抗体染色。ＨＧＳＣ腫瘍または細胞株の凍結固定単細胞懸濁液を室温で解凍した。各試料について、１×１０^６個の細胞を、９６ウェルプレート内のクラスターチューブに分取し、透過前パラジウムバーコーディングに供した。バーコード化後、プールされた細胞をペレット化し、ＦｃＸブロック（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とともに室温で１０分間インキュベートして、非特異的抗体結合を遮断した。次いで、細胞を表面マーカーに対する抗体とともに室温で４５分間インキュベートした。細胞を、メタノールまたは１×透過性緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で４℃で透過させた（細胞内サイトカインを特徴付けるように設計されたＣｙＴＯＦ抗体パネルについてのみ、氷上で１０分間）。細胞をその後、細胞内マーカーに対する抗体で１時間室温で染色し、洗浄し、^{１９１／１９３}Ｉｒ ＤＮＡインターカレータ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で４℃にて一晩インキュベートした。細胞を洗浄し、正規化ビーズの溶液中で再懸濁した後、ＣｙＴＯＦ２に導入した。

ＣｙＴＯＦによるＣＤ９の細胞内プールの決定。ＮＫ－９２およびＯＶＣＡＲ４細胞をシスプラチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色し、１．６％のパラホルムアルデヒド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で固定し、洗浄し、ＦｃＸブロック（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とともに１０分間室温でインキュベートした。次いで、細胞をＣＤ９－ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）とともに室温で４５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、抗ＰＥ－１６５Ｈｏ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で３０分間室温で染色した。二次抗体染色後、細胞を氷上で１０分間、１×透過性緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で透過させた。続いて、細胞をＣＤ９－１５６Ｇｄ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で１時間室温で染色して、ＣＤ９の細胞内発現レベルを検出した。上記のように、細胞をＣｙＴＯＦ２に導入する前に処理した。

ＮＫ－９２細胞の細胞内サイトカイン産生を決定するためのインビトロ共培養。ＨＧＳＣ細胞株、ＯＶＣＡＲ４、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、およびＴＹＫ－ｎｕ細胞は、別段の指示がない限り、６時間、エフェクター：標的比１：１で、加湿した細胞培養インキュベーター内で３７℃で各々ＮＫ－９２細胞株と共培養した。ＨＧＳＣ細胞（１００，０００細胞／ウェル）をＵ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｓｔａｒ）にＮＫ－９２細胞（１００，０００）で播種した。共培養の最後の４時間の間に、ＰＭＡ／イオノマイシン細胞刺激カクテル（５００Ｘ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加して、細胞内サイトカイン産生を誘導した。タンパク質輸送阻害剤であるブレフェルジンＡおよびモネンシン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、それぞれ３μｇ／ｍＬおよび２μＭの最終濃度で使用した。単一培養±ＰＭＡで成長したＮＫ－９２細胞、およびＮＫ－９２細胞を有するＫ５６２細胞株（ＨＬＡ－ｎｕｌｌ赤血球白血病）（１００）との間の共培養で成長したＮＫ－９２細胞の２つの陽性対照があった。ＣＤ１０７ａ－１５１Ｅｕ抗体（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）（１μｌ）を、脱顆粒のためのマーカーとして各ウェルに添加した。すべての実験を、特定のアッセイについて記載された詳細を有する生物学的および技術的な３つの複製で実施した。

トランスウェルアッセイ。ＯＶＣＡＲ４、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、およびＴＹＫ－ｎｕ細胞を、３μｍの微細孔を有する９６ウェルデュアルチャンバトランスウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｓｔａｒ）内でＮＫ－９２とともに共培養した。ＨＧＳＣ細胞（１００，０００／ウェル）を下部チャンバに配置し、ＮＫ－９２細胞（１００，０００／ウェル）を上部チャンバに配置した。細胞を、加湿した細胞培養インキュベーター内で、３７℃にて６時間培養した。アッセイは、生物学的および技術的な３つの複製で実施した。

トロゴサイトーシス。ＯＶＣＡＲ４を、ＮＫ－９２との共培養の前にＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識した。簡潔に述べると、ＯＶＣＡＲ４を無血清培地で洗浄し、希釈剤Ｃに再懸濁した。ＰＫＨ６７の２倍作業溶液を使用直前に調製した。細胞を、２０μＭのＰＫＨ６７中での最終濃度５×１０^６細胞／ｍＬのためにＰＫＨ６７作業溶液と混合し、室温で５分間インキュベートした。標識を等体積の胎児ウシ血清でクエンチし、１分間インキュベートし、１０ｍＬの完全な培地で３回洗浄した。細胞をＵ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、ＮＫ－９２細胞とともに、標的：エフェクター比５：１、２．５：１、１：１、２．５：１、および５：１で３７℃にて２４時間共培養した。次いで、細胞をＣＤ４５およびＣＤ９抗体で染色し、フローサイトメトリーのために処理した。

ＣＤ９転写レベルを測定するための逆転写酵素定量ＰＣＲ。総ｍＲＮＡを、単一培養で成長したＯＶＣＡＲ４ ａｎｄ ＮＫ－９２細胞、ならびにＯＶＣＡＲ４細胞との共培養後のＦＡＣＳで選別されたＣＤ９＋およびＣＤ９－ＮＫ－９２細胞から、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ単離キットで単離した。ｃＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの高容量ｃＤＮＡ逆転写キットを使用して生成した。Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）Ｈｓ００１７０４２３＿ｍ１、ＣＤ４５（ＰＴＰＲＣ）Ｈｓ００８９４７１６＿ｍ１、およびＣＤ９ Ｈｓ０１１２４０２２のリアルタイムＰＣＲをＴａｑｍａｎ遺伝子発現キットを用いて実施し、ＡＢＩ７９００ＨＴ器具上で実行した。

トロゴサイトーシスを撮像するための顕微鏡検査。ＯＶＣＡＲ４およびＮＫ９２細胞を、共培養の前に膜色素ＰＫＨ６７およびＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でそれぞれ標識した。細胞を無血清培地で洗浄し、希釈液Ｃ中に再懸濁した。各膜染料の２倍作業溶液を使用直前に調製した。細胞（５×１０^６細胞／ｍＬ）を、最終濃度２０ｍＭのために、それらそれぞれの染料の作業溶液と混合した。室温で５分間インキュベーションした後、標識を等体積の胎児ウシ血清でクエンチし、１分間インキュベートし、１０ｍＬの完全な培地で３回洗浄した。細胞をＵ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、ＮＫ－９２細胞とともにエフェクター：標的比１：１で３７℃にて３時間共培養した。次いで、細胞を最終濃度１．６％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＣＤ４５およびＣＤ９抗体で染色し、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８００顕微鏡で画像化するために顕微鏡スライドに播種した。

トロゴサイトーシス阻害。ＮＫ－９２細胞を、サイトカラシンＤ（完全培地内で１０μＭ）で２時間前処理した。次いで、それらを、サイトカラシンＤの連続的存在下で１：１の比率で示されるように、がん細胞株とともにさらに２時間共培養し、その後、細胞をＣＤ９、ＣＤ４５に対する抗体で染色し、上記のようにＣｙＴＯＦ分析の前に処理した。

カルセイン－ＡＭ放出細胞傷害性アッセイ。カルセイン放出アッセイは、公表されている条件に従って実施した。ＯＶＣＡＲ４、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、ＴＹＫ－ｎｕ、およびＫ５６２（対照）標的細胞をＰＢＳ中で洗浄し、カルセイン－アセトキシメチル（カルセイン－ＡＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）染色溶液（ＰＢＳ中２．５μＭ）に１×１０^６／ｍＬの細胞密度で再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。標的細胞をＵ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、ＮＫ－９２細胞と、増大するエフェクター：標的比１：１、２．５：１、５：１、および１０：１で３７℃で４時間共培養した。ＣＤ９遮断抗体による細胞傷害性アッセイについては、両方の細胞株をプレーティングした後、対照マウスＩｇＧ１ｋ、（Ａｂｃａｍ Ｃ＃ａｂ１７０１９０、クローン：１５－６Ｅ１０Ａ７）または精製マウスモノクローナルＣＤ９抗体（Ａｂｃａｍ Ｃ＃２２１５、クローン：ＭＥＭ－６１）のいずれかを、インキュベーション期間中に共培養物に添加した。次いで、細胞をスピンダウンし、１００μｌの上清を黒壁９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｓｔａｒ）に移した。カルセイン放出は、４８５ｎｍの励起波長および５３０ｎｍの発光波長（Ｅｘ／Ｅｍカルセイン：Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００蛍光プレートリーダーを備えた４９４／５１７）。対照ウェルは、ＨＧＳＣ標的細胞単独（自然溶解）を含有したか、または２％のＴｗｅｅｎ－２０（最大溶解）を伴った。特異的殺傷は、特異的殺傷＝（共培養の溶解－自然溶解）／（最大溶解－自然溶解）×１００％の式を使用して計算した。このアッセイは、生物学的および技術的な４つの複製を用いて実施した。

データ分析ツール。すべてのデータおよび統計分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ、Ｍａｔｌａｂ、Ｒ、およびＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８で実践した。ＣｙＴＯＦデータセットを、ＣｙｔｏｂａｎｋおよびＣｅｌｌＥｎｇｉｎｅ（Ｐｒｉｍｉｔｙ Ｂｉｏ）から入手可能なソフトウェアで評価した。ＮＫ受容体リガンドの組み合わせを決定するためのブール分析を、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０を使用して決定した。

データ品質の初期評価。初期データ品質を、さらなる分析から除外された死細胞およびアポトーシス細胞を決定することによって評価した。シスプラチン陰性および切断ＰＡＲＰ陰性として定義される生存細胞を実験に使用した。新たに診断されたＨＧＳＣ腫瘍を用いた実験では、前述のように、腫瘍細胞をＣＤ４５－／ＣＤ３１－／ＦＡＰ－としてゲート化し、免疫細胞をＣＤ４５＋ＣＤ６６－としてゲート化した。

腫瘍ならびにＴ細胞およびＮＫ細胞の免疫浸潤物のクラスタリング。Ｖｏｒｔｅｘクラスタリング環境を使用して、新たに診断された１２個すべてのＨＧＳＣ腫瘍からの手動でゲート化されたＣＤ４５－／ＣＤ３１－／ＦＡＰ－細胞を、密度ベースのクラスタリングアルゴリズムであるＸ－シフトでクラスタリングするためにプールした。

相関ネットワーク分析。腫瘍細胞のＣｙＴＯＦデータならびにＴ細胞およびＮＫ細胞を調べるために設計されたＣｙＴＯＦ抗体パネルを用いた同一の腫瘍の分析から、スピアマンペアワイズ相関係数（ｒ_ｓ）を計算した。相関は、ｉ）５６個の腫瘍細胞クラスターの細胞頻度、ｉｉ）５２個のＴ細胞およびＮＫ細胞クラスターの頻度、ｉｉｉ）腫瘍細胞の総存在量、ｉｖ）ＥＶ細胞の総存在量、ｖ）Ｅ－カドヘリン細胞の総存在量、ならびにｖｉ）前述の他の特徴の間で計算した。階層的に順序付けられたヒートマップをＲで生成した。

力指向性レイアウトの可視化力指向性レイアウトは、１２個すべてのＨＧＳＣ腫瘍の複合体から生成した。すべての単一セルデータファイルをマージした後、細胞をクラスター化した。１０，０００個の単一細胞を、５６個の腫瘍細胞クラスターの各々から計算的にサンプリングした。各細胞は、１０隣接グラフ上で繋げた。このグラフを、表現型的に関連する細胞群を互いに隣接させた力指向性レイアウト（ＦＤＬ）に供した（２２）。サンプリングを繰り返すことで、同等の結果が得られた。Ｅ－カドヘリン、ビメンチン、ＮＫ受容体リガンド、またはＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７の発現ごとに、レイアウトを着色した。

Ｅ、ＥＶ、およびＶ腫瘍区画におけるＮＫ受容体リガンドの組み合わせ発現。生存腫瘍細胞を、シスプラチンおよびｃＰＡＲＰに対して陰性であると新たに診断されたＨＧＳＣ腫瘍から手動でゲート化した。前述のように、腫瘍集団をＣＤ４５－／ＦＡＰ－／ＣＤ３１－としてゲート化した。その後、Ｅ、ＥＶ、およびＶ腫瘍区画をこの生存腫瘍細胞集団からゲート化した。１２個のＮＫ受容体リガンドおよび２個のＡＤＡＭプロテアーゼの組み合わせ発現パターンによって定義される腫瘍細胞亜集団の頻度を、ＭＡＴＬＡＢで決定した。この分析のために、これらのタンパク質の各々を発現する腫瘍細胞の頻度を、試料ごとに各区画で決定した。分析で使用される組み合わせは、任意の試料中の任意の区画内の細胞の１％超の閾値頻度に基づいた。

シンプソンの多様体指数。この分析は、Ｅｘｃｅｌで実施した。シンプソンの多様度指数Ｄを、下記式で計算した。Ｎは、特定のＮＫ受容体リガンドの組み合わせを有する腫瘍細胞亜集団の総数（１６３）であり、ｎは、１２個の腫瘍の各々のＥ、ＥＶ、およびＶ区画に亜集団が存在する回数である（図３Ｃ）。

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３０．Ｒ．Ｒｅｙｅｓ，Ｂ．Ｃａｒｄｅｎｅｓ，Ｙ．Ｍａｃｈａｄｏ－Ｐｉｎｅｄａ，Ｃ．Ｃａｂａｎａｓ，Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ＣＤ９：Ａ Ｋｅｙ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９，８６３ （２０１８）．

３１．Ａ．Ｋｏｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，ＣＤ３＋ＣＤ５６＋ ＮＫ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２７，１７６－１８２ （２００２）．
３２．Ｈ．Ｂ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＤ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ：ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７，３６６９－３６７６ （２００６）．
３３．Ａ．Ｌｏｐｅｚ－Ｓｏｔｏ，Ｓ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍ．Ｊ．Ｓｍｙｔｈ，Ｌ．Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３２，１３５－１５４ （２０１７）．
３４．Ｊ．Ｈａｎｎａ，Ｏ．Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，Ｗｈｅｎ ｋｉｌｌｅｒｓ ｂｅｃｏｍｅ ｈｅｌｐｅｒｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８，２０１－２０６ （２００７）．
３５．Ｍ．Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｔ．Ａ．Ｆｅｈｎｉｇｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２２，６３３－６４０ （２００１）．
３６．Ｊ．Ｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｃｉｄｕａｌ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｋｅｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ－ｍａｔｅｒｎａｌ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １２，１０６５－１０７４ （２００６）．
３７．Ｎ．Ｊａｂｒａｎｅ－Ｆｅｒｒａｔ，Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｃｉｄｕａｌ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ａｎｄ Ｄｕｒｉｎｇ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０，１３９７ （２０１９）．
３８．Ｐ．Ｄｈａｒ，Ｊ．Ｄ．Ｗｕ，ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５１，５５－６１ （２０１８）．
３９．Ｄ．Ｈ．Ｒａｕｌｅｔ，Ｓ．Ｇａｓｓｅｒ，Ｂ．Ｇ．Ｇｏｗｅｎ，Ｗ．Ｄｅｎｇ，Ｈ．Ｊｕｎｇ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１，４１３－４４１ （２０１３）．
４０．Ｐ．Ｂｏｕｔｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：ｔｈｅ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ＡＤＡＭ１７／ＴＮＦ－ａｌｐｈａ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈａｉｎ Ｂ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８２，４９－５３ （２００９）．

４１．Ｌ．Ｆｅｒｒａｒｉ ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＭＩＣＡ ａｎｄ ＭＩＣＢ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＮＫ ｃｅｌｌ－ｄｒｉｖｅｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９，１５３７－１５４２ （２０１８）．
４２．Ｌ．Ｍａｒｔｉｎｅｔ，Ｍ．Ｊ．Ｓｍｙｔｈ，Ｂａｌａｎｃｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐａｉｒｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５，２４３－２５４ （２０１５）．
４３．Ｓ．Ｆａｂｒｅ－Ｌａｆａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｃｔｉｎ－４ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ７，７３ （２００７）．
４４．Ｂ．Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｃｏｒｒｅａ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡＭ－１ ａｎｄ ｔｈｅ ＴＩＧＩＴ／ＰＶＲＩＧ／ＴＡＣＴＩＬＥ Ａｘｉｓ：Ｎｏｖｅｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｆｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒｓ １１，（２０１９）．
４５．Ｅ．Ｅ．Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ，Ｐ．Ｐａｒｈａｍ，Ｌ．Ａ．Ｇｕｅｔｈｌｅｉｎ，Ｔｗｏ ｔｏ Ｔａｎｇｏ：Ｃｏ－ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｍｉｎｉｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ＭＨＣ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０，１７７ （２０１９）．
４６．Ｔ．Ｋａｍｉｙａ，Ｓ．Ｖ．Ｓｅｏｗ，Ｄ．Ｗｏｎｇ，Ｍ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃａｍｐａｎａ，Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ａ ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ ｔｕｍｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １３０，２０９４－２１０６ （２０１９）．
４７．Ｔ．Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗｉｔｔｅｎｂｒｉｎｋ，Ｍ．Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ａ．Ｓｔｅｉｎｌｅ，Ｃｕｔｔｉｎｇ ａｎ ＮＫＧ２Ｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｓｈｏｒｔ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｃｕｌｉａｒ Ｈｕｍａｎ ＮＫＧ２Ｄ Ｌｉｇａｎｄ ＵＬＢＰ４．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９，６２０ （２０１８）．
４８．Ｓ．Ｃ．Ｗｅｉ，Ｃ．Ｒ．Ｄｕｆｆｙ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ８，１０６９－１０８６ （２０１８）．
４９．Ｃ．Ａ．Ｂｒｅｎｎｉｃｋ，Ｍ．Ｍ．Ｇｅｏｒｇｅ，Ｗ．Ｌ．Ｃｏｒｗｉｎ，Ｐ．Ｋ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｈ．Ｅｂｒａｈｉｍｉ－Ｎｉｋ，Ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅｓ ａｓ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔｓ：ｋｅｙ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ９，３６１－３７１ （２０１７）．
５０．Ｊ．Ｍ．Ｖｙａｓ，Ａ．Ｇ．Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｅｎ，Ｈ．Ｌ．Ｐｌｏｅｇｈ，Ｔｈｅ ｋｎｏｗｎ ｕｎｋｎｏｗｎｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８，６０７－６１８ （２００８）．

５１．Ｓ．Ｄｏｍｃｋｅ，Ｒ．Ｓｉｎｈａ，Ｄ．Ａ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｃ．Ｓａｎｄｅｒ，Ｎ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｓ ｔｕｍｏｕｒ ｍｏｄｅｌｓ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４，２１２６ （２０１３）．
５２．Ｃ．Ｃｅｒｂｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ＤＮＡＭ－１ Ｌｉｇａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ，Ｉｎｆｅｃｔｅｄ，ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４，５０８ （２０１４）．
５３．Ｓ．Ｇａｓｓｅｒ，Ｓ．Ｏｒｓｕｌｉｃ，Ｅ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｈ．Ｒａｕｌｅｔ，Ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｌｉｇａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ ４３６，１１８６－１１９０ （２００５）．
５４．Ｌ．Ｋｒｅｎｎｉｎｇ，Ｊ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ｒ．Ｈ．Ｍｅｄｅｍａ，Ｌｉｆｅ ｏｒ Ｄｅａｔｈ ａｆｔｅｒ ａ Ｂｒｅａｋ：Ｗｈａｔ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ Ｃｈｏｉｃｅ？ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，（２０１９）．
５５．Ｍ．Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｎｅｃｔｉｎ－４ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｅ－ｅｃｌａｍｐｓｉａ：ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣ ｍｅｄｉｃａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９，１６６ （２０１８）．
５６．Ｅ．Ｊｏｌｙ，Ｄ．Ｈｕｄｒｉｓｉｅｒ，Ｗｈａｔ ｉｓ ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｗｈａｔ ｉｓ ｉｔｓ ｐｕｒｐｏｓｅ？ Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４，８１５ （２００３）．
５７．Ａ．Ｄａｎｃｅ，Ｃｏｒｅ Ｃｏｎｃｅｐｔ：Ｃｅｌｌｓ ｎｉｂｂｌｅ ｏｎｅ ａｎｏｔｈｅｒ ｖｉａ ｔｈｅ ｕｎｄｅｒ－ａｐｐｒｅｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１６，１７６０８－１７６１０ （２０１９）．
５８．Ｊ．Ｒｅｅｄ，Ｓ．Ａ．Ｗｅｔｚｅｌ，Ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ＣＤ４（＋） Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｄｒｉｖｅｓ ＴＨ２－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０２，２８７３－２８８７ （２０１９）．
５９．Ａ．Ａｕｃｈｅｒ，Ｅ．Ｍａｇｄｅｌｅｉｎｅ，Ｅ．Ｊｏｌｙ，Ｄ．Ｈｕｄｒｉｓｉｅｒ，Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ １１１，５６２１－５６２８ （２００８）．
６０．Ｒ．Ｇａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＡＰＣｓ ｏｎｔｏ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８８，７４４－７５２ （２０１２）．

６１．Ｓ．Ｄａｕｂｅｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｃｅｒｔａｉｎ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎｔｏ Ｔ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５，ｅ８７１６ （２０１０）．
６２．Ｙ．Ｔ．Ｂｒｙｃｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６１２，３３５－３５２ （２０１０）．
６３．Ｊ．Ｃ．Ｓｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｗｏｒｋｆｌｏｗ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ ７３，２８９－２９８ （２００８）．
６４．Ｇ．Ａｌｔｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｍａｌｅｎｆａｎｔ，Ｍ．Ａｌｔｆｅｌｄ，ＣＤ１０７ａ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ２９４，１５－２２ （２００４）．
６５．Ｓ．Ｓｈａｂｒｉｓｈ，Ｍ．Ｇｕｐｔａ，Ｍ．Ｍａｄｋａｉｋａｒ，Ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｆｏｒ Ｒｏｕｔｉｎｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１６，３７６９５９０ （２０１６）．
６６．Ｌ．Ｌａｍｏｒｅａｕｘ，Ｍ．Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｒ．Ｋｏｕｐ，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １，１５０７－１５１６ （２００６）．
６７．Ｊ．Ｙｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９０，４４７－４５４ （１９９８）．
６８．Ａ．Ｓ．Ｃｅｒｄｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａ ｄｅｃｉｄｕａｌ ＮＫ－ｌｉｋｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｂｙ ａ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｏｆ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９０，３９３９－３９４８ （２０１３）．
６９．Ｈ．Ｄ．Ｋｏｐｃｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｄｅｃｉｄｕａｌ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒｍ ｉｍｍａｔｕｒｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｓｙｎａｐｓｅｓ ａｎｄ ａｒｅ ｎｏｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０２，１５５６３－１５５６８ （２００５）．
７０．Ａ．Ｂｒｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ＭＭＰ９－ＴＩＭＰ２ ａｘｉｓ ａｒｅ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ，ｄｅｃｉｄｕａｌ ＮＫ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｆａｓｅｂ ｊ ３２，５３６５－５３７７ （２０１８）．

７１．Ａ．Ｒ．Ｖｅｎｋｉｔａｒａｍａｎ，Ｌｉｎｋｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＢＲＣＡ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４，４６１－４８７ （２００９）．
７２．Ｒ．Ｖｅｎｔｏ－Ｔｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｍａｔｅｒｎａｌ－ｆｅｔａｌ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５６３，３４７－３５３ （２０１８）．
７３．Ｌ．Ｈｕｅｒｇｏ－Ｚａｐｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，ＮＫ－ｃｅｌｌ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｔｏ－Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｖｉａ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７８，３９１３－３９２５ （２０１８）．
７４．Ａ．Ｌａｂａｎｉ－Ｍｏｔｌａｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ＤＮＡＭ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｂｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ＮＫ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ ３７，５４５５－５４６６ （２０１６）．
７５．Ｓ．Ｇａｓｓｅｒ，Ｄ．Ｈ．Ｒａｕｌｅｔ，Ｔｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｒｏｕｓｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６，３９５９－３９６２ （２００６）．
７６．Ｓ．Ｂｕｇｉｄｅ，Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｗａｊａｐｅｙｅｅ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｚｅｓｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ２ （ＥＺＨ２） ｉｎｄｕｃｅｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１５，Ｅ３５０９－ｅ３５１８ （２０１８）．
７７．Ａ．Ｙｕｒｔｓｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ２６，１０５－１１３ （２０１３）．
７８．Ｇ．Ｂｅｌａａｌｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｌｏｗ ｏｒ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ１１１ （ｎｅｃｔｉｎ １）．Ｌｅｕｋｅｍｉａ １７，１１３７－１１４５ （２００３）．
７９．Ｍ．Ｓ．Ｄｅｒｙｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｃｔｉｎ ４ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ａｓ ａ ｓｅｒｕｍ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １３４，８３５－８４５ （２０１０）．
８０．Ｇ．Ｄａｍｉａ，Ｍ．Ｂｒｏｇｇｉｎｉ，Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ：Ｒｏｌｅ ｏｆ ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ．Ｃａｎｃｅｒｓ １１，（２０１９）．

８１．Ｄ．Ｈｕｄｒｉｓｉｅｒ，Ｐ．Ｂｏｎｇｒａｎｄ，Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｎｔｏ Ｔ ｃｅｌｌｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．Ｆａｓｅｂ ｊ １６，４７７－４８６ （２００２）．
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９１．Ｊ．Ａ．Ｂｅｌｉｓｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｓｈｏｗ ａｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｂｉｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ｔｕｍｏｕｒ ｍａｒｋｅｒ ＭＵＣ１６ （ＣＡ１２５）．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２２，４１８－４２９ （２００７）．
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９４．Ｇ．Ｏｋｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ１５５ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＤＮＡＭ－１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１７，（２０２０）．
９５．Ｍ．Ｖｉｔａｌｅ，Ｃ．Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｇ．Ｐｉｅｔｒａ，Ｍ．Ｃ．Ｍｉｎｇａｒｉ，Ｌ．Ｍｏｒｅｔｔａ，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｎ ＮＫ－ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，１５８２－１５９２ （２０１４）．
９６．Ａ．Ｗ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｃｌｏｎａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ １７３，１７５５－１７６９．ｅ１７２２ （２０１８）．
９７．Ｄ．Ｗ．Ｇａｒｓｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ Ｐａｔｈｗａｙ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏｓｓ Ａｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｈｉｇｈ－Ｇｒａｄｅ Ｓｅｒｏｕｓ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２４，５６９－５８０ （２０１８）．
９８．Ｌ．Ｇ．Ｍｅｚａ Ｇｕｚｍａｎ，Ｎ．Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｓ．Ｅ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ：Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃａｎｃｅｒｓ １２，（２０２０）．
９９．Ｄ．Ｌ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３４，９３－１０１ （２０１６）．
１００．Ａ．Ｔｒｅｍｂｌａｙ－ＭｃＬｅａｎ，Ｓ．Ｃｏｅｎｒａａｄｓ，Ｚ．Ｋｉａｎｉ，Ｆ．Ｐ．Ｄｕｐｕｙ，Ｎ．Ｆ．Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＢＭＣ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０，８ （２０１９）．

１０１．Ｇ．Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｏｍｉｃ ｍａｓｓ ｔａｇ ｏｆ ｂｉｓｍｕｔｈ－２０９ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｍａｓｓ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ ９１，１１５０－１１６３ （２０１７）．
１０２．Ｓ．Ｃ．Ｂｅｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｍａｓｓ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｃｒｏｓｓ ａ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３２，６８７－６９６ （２０１１）．
１０３．Ｓ．Ｌｏｒｅｎｚｏ－Ｈｅｒｒｅｒｏ，Ｃ．Ｓｏｒｄｏ－Ｂａｈａｍｏｎｄｅ，Ｓ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ａ．Ｌｏｐｅｚ－Ｓｏｔｏ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｃａｌｃｅｉｎ ａｓｓａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ６３１，４８３－４９５ （２０２０）．
１０４．Ｎ．Ｓ．Ｒａｍａｄｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｐ４１－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｃｏｍｂａｔ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ，７６０２８０ （２０１９）．
１０５．Ｎ．Ｋｏｔｅｃｈａ，Ｐ．Ｏ．Ｋｒｕｔｚｉｋ，Ｊ．Ｍ．Ｉｒｉｓｈ，Ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ／ ｅｄｉｔｏｒｉａｌ ｂｏａｒｄ，Ｊ．Ｐａｕｌ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｍａｎａｇｉｎｇ ｅｄｉｔｏｒ．．．［ｅｔ ａｌ．］Ｃｈａｐｔｅｒ １０，Ｕｎｉｔ１０ １７ （２０１０）．

相互参照
本出願は、２０１９年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／８９７，７７５号の利益を主張し、その出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府による資金提供を受けた研究または開発の記載
本発明は、国防総省によって付与された契約ＯＣ１１０６７４の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に特定の権利を有する。

Claims (37)

1. ＮＫ細胞免疫療法でがんを有する個体を治療するための方法であって、
   ＮＫ細胞免疫療法を受ける資格がある個体について、がん微小環境内のＣＤ９発現を評価することと、
   前記がん内のＣＤ９陽性のレベルを決定することと、
   前記がんの前記ＣＤ９陽性が高い場合に、有効用量のＣＤ９またはトロゴサイトーシス遮断剤と組み合わせてＮＫ細胞免疫療法を前記個体に投与することと
   を含む、方法。
2. 前記がんが、固形がんである、請求項１に記載の方法。
3. 前記がんが、卵巣がんである、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記卵巣がんが、高悪性度漿液性がんである、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＣＤ９遮断剤が、ＣＤ９に結合する抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ＣＤ９遮断剤が、ＮＫ細胞免疫療法の前に投与される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ＣＤ９遮断剤が、腫瘍内に投与される、請求項６に記載の方法。
8. ＮＫ細胞が、トロゴサイトーシスを阻害する薬剤を投与する前に、前処置される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ＮＫ細胞免疫療法が、有効用量のインビトロ拡大自己または同種異系ＮＫ細胞集団を投与することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ＮＫ細胞免疫療法が、有効用量のインビトロ拡大ヒトＮＫ細胞株を投与することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ＮＫ細胞が、投与前に遺伝子改変される、請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記ＮＫ細胞免疫療法が、内因性ＮＫ細胞を活性化する薬剤を投与することを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
13. 卵巣がんを有する患者の予後不良を予測し、前記患者を前記卵巣がんについて治療する予後の方法であって、
    前記患者から卵巣腫瘍組織の試料を取得することであって、前記卵巣腫瘍組織が、浸潤ＮＫ細胞の集団を含む、取得することと、
    前記浸潤ＮＫ細胞の集団における脱落膜様ＮＫ細胞の頻度を測定することであって、ＮＫ細胞の対照集団についての基準値範囲と比較した脱落膜様ＮＫ細胞の頻度の増加が、前記患者が予後不良であることを示す、測定することと、
    前記患者が予後不良であると特定された場合に、前記患者を手術、放射線療法、化学療法、標的療法、抗血管新生療法、もしくは免疫療法、またはこれらの任意の組み合わせで治療することと
    を含む、予後の方法。
14. 前記脱落膜様ＮＫ細胞の頻度を前記測定することが、ＣＤ９マーカーを発現する少なくとも１つのＮＫ細胞を検出することを含み、前記ＣＤ９マーカーの発現が、前記ＮＫ細胞が脱落膜様ＮＫ細胞であることを示す、請求項１３に記載の方法。
15. ＣＤ５６およびケモカイン受容体ＣＸＣＲ３からなる群から選択される１つ以上の追加のマーカーと組み合わせて、ＣＤ９マーカーを発現する少なくとも１つの脱落膜様ＮＫ細胞を検出することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記浸潤ＮＫ細胞の集団における前記脱落膜様ＮＫ細胞の前記頻度が、少なくとも２９％である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記浸潤ＮＫ細胞の集団における前記脱落膜様ＮＫ細胞の前記頻度が、少なくとも６０％である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記卵巣腫瘍組織の試料中のがん細胞上の１つ以上の活性化ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルを測定することをさらに含み、対照卵巣細胞上の前記ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルと比較した１つ以上の活性化ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルの低下と組み合わせた、前記脱落膜様ＮＫ細胞の頻度の増加が、前記患者が予後不良であることを示す、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記卵巣腫瘍組織の試料中のがん細胞上の１つ以上の阻害性ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルを測定することをさらに含み、対照卵巣細胞上の前記ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルと比較した１つ以上の阻害性ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルの増加と組み合わせた、前記脱落膜様ＮＫ細胞の頻度の増加が、前記患者が予後不良であることを示す、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. ＮＫ受容体リガンドのレベルが、Ｅ－カドヘリンを発現する卵巣がん細胞（Ｅ腫瘍区画）、Ｅ－カドヘリンおよびビメンチンを共発現する卵巣がん細胞（ＥＶ腫瘍区画）、ならびにビメンチンを発現する卵巣がん細胞（Ｖ腫瘍区画）において測定される、請求項１８または１９に記載の方法。
21. 活性化ＮＫ受容体リガンドが前記卵巣がん細胞上で検出され、かつ前記１つ以上の阻害性ＮＫ受容体リガンドの発現のレベルの増加が前記卵巣がん細胞上で検出されない場合に、ＮＫ細胞免疫療法を前記患者に投与することをさらに含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
22. ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、およびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも３つのサイトカインを産生する前記浸潤ＮＫ細胞の集団におけるＮＫ細胞の頻度を測定することをさらに含み、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、およびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも３つのサイトカインを産生する前記ＮＫ細胞の頻度の低下と組み合わせた、前記脱落膜様ＮＫ細胞の頻度の増加が、前記患者が予後不良であることを示す、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記浸潤ＮＫ細胞の集団によって産生されるパーフォリンおよびグランザイムＢのレベルを測定することをさらに含み、ＮＫ細胞の対照集団についての前記パーフォリンの前記レベルおよび前記グランザイムＢの前記レベルと比較した前記パーフォリンおよび前記グランザイムＢの前記レベルの低下と組み合わせた、前記脱落膜様ＮＫ細胞の頻度の増加が、前記患者が予後不良であることを示す、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記卵巣がんが、高悪性度漿液性卵巣がんである、請求項１３～２４のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記卵巣腫瘍組織の試料が、生検または外科標本である、請求項１３～２５のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記浸潤ＮＫ細胞の集団における前記脱落膜様ＮＫ細胞の頻度を前記測定することが、フローサイトメトリー、飛行時間によるサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、免疫組織化学、免疫蛍光、インデックス化によるＣＯ検出（ＣＯＤＥＸ）、多重イオンビーム撮像（ＭＩＢＩ）、または他の多パラメータ単一細胞分析技術を実施することを含む、請求項１３～２６のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記ＮＫ細胞免疫療法が、前記患者へのＮＫ細胞を活性化する１つ以上のサイトカインの投与、前記患者へのＮＫ細胞の養子移入、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１３～２７のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記患者が、ヒトである、請求項１３～２８のいずれか一項に記載の方法。
29. 卵巣がんを有する患者がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞免疫療法から利益を受けるか否かを予測し、前記患者を前記卵巣がんについて治療する方法であって、
    前記患者から卵巣腫瘍組織の試料を取得することと、
    前記卵巣腫瘍組織におけるがん細胞上のＮＫ受容体リガンド分布を測定することであって、１つ以上の活性化ＮＫ受容体リガンドの検出が、前記患者がＮＫ細胞免疫療法から利益を受けることを示し、１つ以上の阻害性ＮＫ受容体リガンドの検出が、前記患者がＮＫ細胞免疫療法から利益を受けないことを示す、測定することと、
    前記ＮＫ受容体リガンド分布が前記患者がＮＫ細胞免疫療法から利益を受けることを示す場合に、前記患者にＮＫ細胞免疫療法を投与することと
    を含む、方法。
30. 前記方法が、前記ＮＫ細胞免疫療法による前記患者の治療前に実施される、請求項３０に記載の方法。
31. 前記患者が、免疫療法を受けている、請求項１７に記載の方法。
32. 前記ＮＫ細胞免疫療法が、前記患者へのＮＫ細胞を活性化する１つ以上のサイトカインの投与、前記患者へのＮＫ細胞の養子移入、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の方法。
33. ＮＫ細胞免疫療法を投与することが、ＮＫ活性化受容体を含む操作されたＮＫ細胞を投与することを含む、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記活性化ＮＫ受容体リガンドが、ＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化する、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記活性化ＮＫ受容体リガンドが、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＰＢＰ３、ＵＬＰＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、およびＭＩＣＡ／Ｂからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
36. 前記卵巣腫瘍組織の試料中のＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも３つのサイトカインを産生する浸潤ＮＫ細胞の集団におけるＮＫ細胞の頻度を測定することをさらに含み、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＴＮＦα、およびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも３つのサイトカインを産生する前記ＮＫ細胞の頻度の低下が、前記患者がＮＫ細胞免疫療法から利益を受けないことを示す、請求項３０～３６のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記卵巣腫瘍組織の試料中の浸潤ＮＫ細胞の集団によって産生されるパーフォリンおよびグランザイムＢのレベルを測定することをさらに含み、ＮＫ細胞の対照集団についての前記パーフォリンの前記レベルおよび前記グランザイムＢの前記レベルと比較した前記パーフォリンおよび前記グランザイムＢの前記レベルの低下が、前記患者がＮＫ細胞免疫療法から利益を受けないことを示す、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法。

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