JP2022521772A - 核酸を検出するための係留酵素の使用 - Google Patents

Abstract

本出願は、試料中の標的核酸分子の検出方法に関する。本方法は、標的核酸分子を含む試料及び捕捉オリゴヌクレオチド分子を用意する工程を含む。一実施形態において、上記捕捉オリゴヌクレオチド分子は、（ｉ）３０～６０塩基対の長さを有し、（ｉｉ）その３’末端に４～８塩基対のオーバーハングを有し、（ｉｉｉ）５’尾部を有し、（ｉｖ）３’末端と５’尾部との間に標的特異的部分を有し、（ｖ）４０～５０％のデオキシアデノシン二リン酸含有量を有し、（ｖｉ）３’末端または５’尾部にデオキシチミジンリン酸を有さず、且つ（ｖｉｉ）上記捕捉オリゴヌクレオチド分子のＡＴＰ含有量の４０～５０％であるＡＴＰ含有量を有する上記３’末端及び５’尾部を有する。本検出方法の別の態様において、特定の試薬が固体支持体に結合している。本出願はまた、本出願の方法を実施するのに有用な組成物及びキットにも関する。

Description

本出願は、２０１９年２月２６日出願の米国仮特許出願第６２／８１０，４４８号の優先権を主張し、該出願は本記述をもって、参照によりその全体が援用される。

分野
本出願は、核酸を検出するための係留（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）酵素の使用に関する。

背景
核酸増幅を使用して、試料中に特定のテンプレート核酸が存在するかどうかを決定することができる。増幅産物が生成する場合、これは当該試料中に当該テンプレート核酸が存在したことを示す。逆に、いずれの増幅産物も生成しない場合は、該試料中にテンプレート核酸がないことを示す。かかる技法は、診断用途、例えば、試料中に病原体が存在するかどうかを決定する場合に非常に重要である。

核酸は、様々な熱サイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）技法及び等温技法によって増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの熱サイクリング技法は、温度サイクリングを使用してＤＮＡ合成のサイクルを繰り返し、テンプレートＤＮＡの当初の量に応じて大量の新しいＤＮＡを合成する。最近、増幅反応を駆動するための熱サイクリングに依拠しない多くの等温技術も開発されている。ＲＮＡ合成ステップを伴わない増幅反応を目的として、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用する等温技法が開発されている。同様に、ＲＮＡ合成ステップを伴う増幅反応については、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ、及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用する等温技法が開発されている。

それにもかかわらず、微生物の同定及び分類、感染症の診断、遺伝的異常の検出及びキャラクタリゼーション、がんに関連する遺伝的変化の識別、疾患に対する遺伝的感受性の研究、ならびに様々な種類の治療に対する応答の測定のためには、特定の核酸配列の検出及び／または定量化は重要な技法である。かかる手順は、食品、水、工業及び環境上の試料、原種、及び特定の微生物の存在を監視する必要がある場合がある他の種類の材料中の微生物の検出ならびに定量にも有用である。他の用途は、法科学、人類学、考古学、及び生物学にあり、これらの分野において、核酸配列の関連性の測定を使用して、犯罪容疑者を特定し、父性紛争を解決し、系統樹（ｇｅｎｅａｌｏｇｉｃａｌ ｔｒｅｅ）及び進化系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ）を構築し、且つ様々な生命の分類を支援している。

過去２０年間の分子生物学の分野における進歩により、患者及び他の対象から得られた試験試料中の特定の核酸配列の検出が可能になっている。かかる検査試料としては、血清、尿、便、唾液、羊水、及びその他の体液が挙げられる。したがって、核酸配列を検出及び／または定量化するための多くの方法が当技術分野で周知である。しかしながら、高感度の核酸増幅システムの固有の結果として副生成物の発生がある。副生成物には、一部のシステムにおいて増幅反応を妨害し、それによって特異性を低下させる可能性のある分子が含まれる。これは、プライマー伸長及び転写産物の形成に必要なプライマー及び酵素を含む限られた増幅資源が、副生成物の形成に転用されるためである。場合によっては、副生成物の出現により、様々な分子技法によるアンプリコン生成の解析が複雑になる場合もある。さらに、対象となる多くの場合において、求める核酸配列について試験をしている試料中に、特定の核酸配列が非常に低濃度でしか存在しない。かかる場合、アッセイ感度を高めることができないと、求める分子の存在を検出することができない。

本出願は、当技術分野におけるこれらの及び他の欠陥を克服することを目的とする。

概要
本出願の一態様は、試料中の標的核酸分子の検出方法に関する。本方法は、標的核酸分子を含む試料を用意する工程と、上記試料を、上記標的核酸分子の少なくとも一部に相補的な捕捉オリゴヌクレオチド分子と接触させて、その結果、上記捕捉オリゴヌクレオチド分子を標的ヌクレオチド分子の相補的部分にハイブリダイズさせ、二本鎖核酸分子を形成させる工程とを含む。上記捕捉オリゴヌクレオチド分子は、（ｉ）３０～６０塩基対の長さを有し、（ｉｉ）その３’末端に４～８塩基対のオーバーハングを有し、（ｉｉｉ）５’尾部を有し、（ｉｖ）３’末端と５’尾部との間に標的特異的部分を有し、（ｖ）４０～５０％のデオキシアデノシン二リン酸含有量を有し、（ｖｉ）３’末端または５’尾部にデオキシチミジンリン酸を有さず、且つ（ｖｉｉ）上記捕捉オリゴヌクレオチド分子のＡＴＰ含有量の４０～５０％であるＡＴＰ含有量を有する上記３’末端及び５’尾部を有する。上記二本鎖核酸分子、ポリメラーゼ、及びｄＮＴＰ混合物を互いに接触させて、ポリメラーゼ伸長混合物を形成させる。上記ポリメラーゼ伸長混合物を、上記標的核酸分子が伸長され遊離リン酸を放出する条件に供する。次いで上記放出された遊離リン酸からアデノシン三リン酸を生成させ、上記遊離リン酸から生成した上記アデノシン三リン酸をルシフェラーゼで代謝させて、上記試料中に上記標的核酸分子が存在することを示す生物発光読み出しシグナルを生成させる。

本出願の別の態様は、試料中の標的核酸分子の検出方法に関する。本方法は、標的核酸分子を含む試料を用意する工程と、上記試料を、上記標的核酸分子の少なくとも一部に相補的な捕捉オリゴヌクレオチド分子と接触させて、その結果、上記捕捉オリゴヌクレオチド分子を上記標的核酸分子の相補的部分にハイブリダイズさせ、二本鎖核酸分子を形成させる工程とを含む。上記二本鎖核酸分子、ポリメラーゼ、及びｄＮＴＰ混合物を互いに接触させて、ポリメラーゼ伸長混合物を形成させる。上記ポリメラーゼ伸長混合物を、上記標的核酸分子が伸長され遊離リン酸を放出する条件に供する。次いで上記放出された遊離リン酸からアデノシン三リン酸を酵素的に生成させ、上記遊離リン酸から生成した上記アデノシン三リン酸をルシフェラーゼで代謝させて、上記試料中に上記標的核酸分子が存在することを示す生物発光読み出しシグナルを生成させる。ＤＮＡポリメラーゼ、上記ルシフェラーゼ、及びアデノシン三リン酸を生成する酵素はそれぞれ固体支持体に結合している。

本出願の別の態様は、試料中の標的核酸分子を検出するためのキットに関する。上記キットは、上記標的核酸分子の少なくとも一部に相補的であり、その結果、上記標的核酸分子の相補的部分にハイブリダイズし、二本鎖核酸分子を形成する、捕捉オリゴヌクレオチド分子と、固体支持体に結合したポリメラーゼと、ｄＮＴＰ混合物と、放出された遊離リン酸からアデノシン三リン酸を生成させるための、固体支持体に結合した酵素と、生物発光読み出しシグナルを生成させるための、固体支持体に結合したルシフェラーゼとを含む。

本出願の別の態様は、試料中の標的核酸分子を検出するためのキットに関する。上記キットは、上記標的核酸分子の少なくとも一部に相補的であり、その結果、上記標的核酸分子の相補的部分にハイブリダイズし、二本鎖核酸分子を形成する捕捉オリゴヌクレオチド分子を含む。上記捕捉オリゴヌクレオチド分子は、（ｉ）３０～６０塩基対（ｂｐ）の長さを有し、（ｉｉ）その３’末端に４～８塩基対のオーバーハングを有し、（ｉｉｉ）５’尾部を有し、（ｉｖ）３’末端と５’尾部との間に標的特異的部分を有し、（ｖ）４０～５０％のデオキシアデノシン二リン酸含有量を有し、（ｖｉ）３’末端または５’尾部にデオキシチミジンリン酸を有さず、且つ（ｖｉｉ）上記捕捉オリゴヌクレオチド分子のＡＴＰ含有量の４０～５０％であるＡＴＰ含有量を有する上記３’末端及び５’尾部を有する。上記キットはまた、ポリメラーゼと、ｄＮＴＰ混合物と、放出された遊離リン酸からアデノシン三リン酸を生成させるための酵素と、生物発光読み出しシグナルを生成させるためのルシフェラーゼも含む。

本出願の別の最後の態様は、捕捉オリゴヌクレオチド分子を含む組成物であって、上記捕捉オリゴヌクレオチド分子が、（ｉ）３０～６０塩基対の長さを有し、（ｉｉ）その３’末端に４～８塩基対のオーバーハングを有し、（ｉｉｉ）５’尾部を有し、（ｉｖ）３’末端と５’尾部との間に標的特異的部分を有し、（ｖ）４０～５０％のデオキシアデノシン二リン酸含有量を有し、（ｖｉ）３’末端または５’尾部にデオキシチミジンリン酸を有さず、且つ（ｖｉｉ）前記捕捉オリゴヌクレオチド分子のＡＴＰ含有量の４０～５０％であるＡＴＰ含有量を有する前記３’末端及び５’尾部を有する、上記組成物に関する。

本出願は、例えば、酵素反応であって、当該酵素が表面（例えばナノ粒子）に係留されている上記酵素反応を使用することによって核酸を検出する方法における顕著な進歩を開示する。本明細書に記載のアッセイは一般的な発光出力に変換される。すなわち、特定の実施形態において、上記アッセイはすべて、光を放出する及び読み取ることが可能な生物発光（ＢＬ）タンパク質または基質と繋がっており、その光の量は、当該の系または生物学的試料中の標的核酸の量と相関する。この技法は、様々な核酸分子の定性的ならびに定量的な結果を生み出すのに好適である。

本出願は、他の検出方法及びシステムに勝る複数の利点を与える。これらの利点としては以下が挙げられる。すなわち、１）速度－酵素反応を使用したアッセイが迅速に行われ、数分以内に読み出し情報が得られること；２）発光に基づく読み出し情報が使用され、大きな励起のための要素（蛍光に必要な要素など）を必要としない、独立型で携帯性の高いシステム及びデバイスが可能になること；３）感度－各ハイブリダイゼーションイベントで複数種の遊離リン酸が放出され、酵素反応アッセイにより、検出及び読み出しの両方のステップでシグナル増幅が促進されることに起因；４）低い製造コスト－例えばナノ粒子を始めとする、かかるシステムの可能性のある構成要素は、安価な材料から製造することができ、容易に大量生産することができること；５）多重化能力－生化学反応の併用によって、本出願の特定の実施形態において、単一のシステムで複数種の核酸分子を検出することができる場合があること；６）係留酵素の使用によって容易に最大限の酵素の安定性及び活性が得られること；７）係留酵素を使用することによって、反応及び読み出しが当該の系の特定の領域（例えば、カードの特定の領域）に限定され、リーダー中の光検出器の大きさ低減されること；８）係留酵素を使用することによって、反応及び読み出しが限定され、これによりインラインでの陰性対照及びバックグラウンド発光用の対照が可能となること；９）係留酵素を使用することによって、反応及び読み出しが限定され、これにより同一系内の他の核酸分子の検出に由来する光の混入が低減されること；１０）捕捉オリゴヌクレオチドの固定化によって、当該の系の特定の領域（例えば、カードの特定の領域）において複数の標的オリゴヌクレオチドを検出する能力が向上すること；１１）等温増幅を使用することによって、温度サイクリングを必要とせずに周囲温度での検出が可能になること；ならびに１２）捕捉オリゴヌクレオチドの設計によって、副生成物の干渉／阻害のない単一ステップ反応が可能になり、生物発光酵素を上記単一ステップ反応に導入することができることにより、代謝されたＡＰ分子から放出される遊離リン酸（ＡＴＰ生成反応に戻される）から生じるさらなるレベルのシグナル増幅が可能になることである。

係留酵素技術（ＴＥＴ）－ｍｉＲＮＡ反応の実施形態を示す図である。ｍｉＲＮＡ（または他の一本鎖核酸ポリマー）が捕捉オリゴヌクレオチド内の相補的挿入配列にアニーリングし、二本鎖を生成する。これによりＤＮＡポリメラーゼが結合して重合反応を開始することができ、この重合反応により、ヌクレオチドの取り込み（等温複製）を通じて遊離リン酸（ＰＰｉ）が放出される。次いで、ＡＤＰ、ＮＡＤ＋、及びＧＡＰの存在下で、これらのＰＰｉ基は、結合したＧＡＰＤＨ－ＰＧＫの酵素反応によって使用され、ＡＴＰを生成する。最後に、ルシフェラーゼがＡＴＰを加水分解して生物発光シグナルを生成させる。 ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応の別の実施形態を示す図である。ｍｉＲＮＡ（または他の一本鎖核酸ポリマー）が捕捉オリゴヌクレオチド内の相補的挿入配列にアニーリングし、二本鎖を生成する。これによりＤＮＡポリメラーゼが結合して重合反応を開始することができ、この重合反応により、ヌクレオチドの取り込み（等温複製）を通じて遊離リン酸（ＰＰｉ）が放出される。次いで、ＡＰＳの存在下で、これらのＰＰｉ基は、酵素ＡＴＰ－スルフリラーゼによって使用され、ＡＴＰを生成する。最後に、ルシフェラーゼがＡＴＰを加水分解して生物発光シグナルを生成させる。 捕捉オリゴヌクレオチド（Ｃａｐオリゴ）の設計及び特徴を示す図である。 上記反応混合物からｄＡＴＰを除外することにより、アッセイの速度論及び感度が向上することを示す図である。 ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイが標的オリゴヌクレオチドの３’末端におけるミスマッチ（ｍｍ）ヌクレオチドを検出することができること、ならびにデータの様々な解析または定量化を示す図である。 ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイが標的オリゴヌクレオチドの３’末端におけるミスマッチヌクレオチドを検出することができること、ならびにデータの様々な解析または定量化を示す図である。 ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイが標的オリゴヌクレオチドの３’末端におけるミスマッチヌクレオチドを検出することができること、ならびにデータの様々な解析または定量化を示す図である。 ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイが標的オリゴヌクレオチドの３’末端におけるミスマッチヌクレオチドを検出することができること、ならびにデータの様々な解析または定量化を示す図である。 Ａ及びＢは、標的オリゴヌクレオチドの検出に対するＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイの感度の範囲の試験を示す図である。 Ａ～Ｃは、捕捉オリゴヌクレオチドの５’及び３’尾部の設計がＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応速度論に影響を与えることを示す図である。 Ａ及びＢは、捕捉オリゴヌクレオチドのｄＡＴＰ含有量がＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応速度論に影響を与えることを示す図である。 Ａ及びＢは、捕捉オリゴヌクレオチドの３’尾部長がＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応活性及び速度論に影響を与えることを示す図である。 Ａ～Ｃは、ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイが、ＭＩＲ－３４０標的オリゴヌクレオチド（肺癌関連マイクロＲＮＡ）の配列の変異に感受性であることを示す図である。 Ａ及びＢは、ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイがヒト血清中に天然に存在するｍｉＲＮＡを検出できることを示す図である。 ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイが、ヒト血漿中に天然に存在するｍｉＲＮＡを検出することができることを示す図である。 Ａ及びＢは、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）処理によってＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ活性が消失することを示す図である。 Ａ及びＢは、（非配向性）ＮＰ固定化での反応と溶液中での反応を用いた標的オリゴヌクレオチド検出の比較を示す図である。 Ａ及びＢは、市販ＢＳＴ２．０をビオチン－ストレプトアビジン結合を介してＮＰ上に固定化することによって、ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応アッセイが阻害されることを示す図である。 Ａ～Ｃは、ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイが温度によってわずかに影響を受けるのみであることを示す図である。 Ａ～Ｃは、ヒト血清中のｍｉＲＮＡを検出するための２種の異なる捕捉オリゴヌクレオチド設計の試験（非係留）を示す図である。 Ｄ及びＥは、ヒト血清中のｍｉＲＮＡを検出するための２種の異なる捕捉オリゴヌクレオチド設計の試験（非係留）を示す図である。 ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイにおける種々のＤＮＡポリメラーゼの活性の比較を示す図である。 図１８Ａ－１の続きの図である。 ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイにおける種々のＤＮＡポリメラーゼの活性の比較を示す図である。 Ａ及びＢは、係留された場合と溶液中の場合での、ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡを使用した標的オリゴヌクレオチド検出の比較を示す図である。 Ｃ及びＤは、係留された場合と溶液中の場合での、ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡを使用した標的オリゴヌクレオチド検出の比較を示す図である。 Ａ～Ｃは、係留された場合と溶液中の場合でのＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイにおける、Ｈｉｓ－Ｓｉ－クレノウとＨｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴの活性の比較を示す図である。 Ａ及びＢは、Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＡＴＰＳ／Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴ／ＮＰの様々な比率を使用した標的オリゴヌクレオチド検出の比較を示す図である。 Ａ～Ｃは、ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ（Ｈｉｓ－Ｓｉ－酵素）及びＤＮＡ捕捉オリゴヌクレオチドを使用したｍｉＲＮＡ（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）検出を示す図である。 Ａ～Ｃは、異なる非係留ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｉｓ－Ｓｉ－クレノウとＨｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴ）の標的オリゴヌクレオチドミスマッチに対する感度の試験の比較を示す図である。 捕捉オリゴヌクレオチドが溶液中にある場合と固定化されている場合（非配向性）でのＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応の試験の比較を示す図である。 捕捉オリゴヌクレオチドが溶液中にある場合とビオチン－ストレプトアビジンを介してＳｉＯ_２ ＮＰに固定化されている場合のＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応の試験の比較を示す図である。 捕捉オリゴヌクレオチドが溶液中にある場合とビオチン－ストレプトアビジンを介してＳｉＯ_２ ＮＰに固定化されている場合のＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応の試験の比較を示す図である。

詳細な説明
本出願の一態様は、試料中の標的核酸分子の検出方法に関する。本方法は、標的核酸分子を含む試料を用意する工程と、上記試料を、上記標的核酸分子の少なくとも一部に相補的な捕捉オリゴヌクレオチド分子と接触させて、その結果、上記捕捉オリゴヌクレオチド分子を標的ヌクレオチド分子の相補的部分にハイブリダイズさせ、二本鎖核酸分子を形成させる工程とを含む。上記捕捉オリゴヌクレオチド分子は、（ｉ）３０～６０塩基対の長さを有し、（ｉｉ）その３’末端に４～８塩基対のオーバーハングを有し、（ｉｉｉ）５’尾部を有し、（ｉｖ）３’末端と５’尾部との間に標的特異的部分を有し、（ｖ）４０～５０％のデオキシアデノシン二リン酸含有量を有し、（ｖｉ）３’末端または５’尾部にデオキシチミジンリン酸を有さず、且つ（ｖｉｉ）上記捕捉オリゴヌクレオチド分子のＡＴＰ含有量の４０～５０％であるＡＴＰ含有量を有する上記３’末端及び５’尾部を有する。上記二本鎖核酸分子、ポリメラーゼ、及びｄＮＴＰ混合物を互いに接触させて、ポリメラーゼ伸長混合物を形成させる。上記ポリメラーゼ伸長混合物を、上記標的核酸分子が伸長され遊離リン酸を放出する条件に供する。次いで上記放出された遊離リン酸からアデノシン三リン酸を生成させ、上記遊離リン酸から生成した上記アデノシン三リン酸をルシフェラーゼで代謝させて、上記試料中に上記標的核酸分子が存在することを示す生物発光読み出しシグナルを生成させる。

本出願の別の態様は、試料中の標的核酸分子の検出方法に関する。本方法は、標的核酸分子を含む試料を用意する工程と、上記試料を、上記標的核酸分子の少なくとも一部に相補的な捕捉オリゴヌクレオチド分子と接触させて、その結果、上記捕捉オリゴヌクレオチド分子を上記標的核酸分子の相補的部分にハイブリダイズさせ、二本鎖核酸分子を形成させる工程とを含む。上記二本鎖核酸分子、ポリメラーゼ、及びｄＮＴＰ混合物を互いに接触させて、ポリメラーゼ伸長混合物を形成させる。上記ポリメラーゼ伸長混合物を、上記標的核酸分子が伸長され遊離リン酸を放出する条件に供する。次いで上記放出された遊離リン酸からアデノシン三リン酸を酵素的に生成させ、上記遊離リン酸から生成した上記アデノシン三リン酸をルシフェラーゼで代謝させて、上記試料中に上記標的核酸分子が存在することを示す生物発光読み出しシグナルを生成させる。ＤＮＡポリメラーゼ、上記ルシフェラーゼ、及びアデノシン三リン酸を生成する酵素はそれぞれ固体支持体に結合している。

図１に示すように、ＤＮＡポリメラーゼが１つのナノ粒子に係留されており、ＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、及びルシフェラーゼ（「Ｌｕｃ」）が別のナノ粒子に係留されている。ｍｉＲＮＡ標的が、用意した、係留されたまたは溶液中のいずれかの捕捉オリゴヌクレオチド内の相補的挿入配列にアニーリングし、二本鎖を生成する。これによりＤＮＡポリメラーゼが結合して重合反応を開始することができ、この重合反応により、ヌクレオチドの取り込みを通じて遊離リン酸（ＰＰｉ）が放出される。ＡＤＰ、ＮＡＤ＋、及びグリセルアルデヒド３－リン酸がアッセイに添加される。これらの成分の存在下で、遊離リン酸が係留されたＧＡＰＤＨ及びＰＧＫによって使用され、ＡＴＰを生成する。次いでこのＡＴＰは、ルシフェリンと共に、係留されたＬｕｃによって使用されることになり、生物発光シグナルを生成する。放出される光の量は当該系中のＡＴＰの量に正比例し、その結果該系中の標的ｍｉＲＮＡの量に対応する。放出される光は、一実施形態において、その放出されたシグナルを捕捉するように配置された光検出器によって定量的及び／または定性的に読み取ることができる。

あるいは、図２に示すように、ＤＮＡポリメラーゼが１つのナノ粒子に係留されており、ＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ－ｓｕｌ）及びルシフェラーゼ（「Ｌｕｃ」）は別のナノ粒子に係留されている。ｍｉＲＮＡ標的が、用意した、係留されたまたは溶液中のいずれかの捕捉オリゴヌクレオチド内の相補的挿入配列にアニーリングし、二本鎖を生成する。これによりＤＮＡポリメラーゼが結合して重合反応を開始することができ、この重合反応により、ヌクレオチドの取り込みを通じて遊離リン酸（ＰＰｉ）が放出される。アデノシン５’－ホスホ硫酸（ＡＰＳ）がアッセイに添加される。ＡＰＳの存在下で、遊離リン酸が係留されたたＡＴＰ－ｓｕｌによって使用され、ＡＴＰを生成する。次いでこのＡＴＰは、ルシフェリンと共に、係留されたＬｕｃによって使用されることになり、生物発光シグナルを生成する。放出される光の量は当該系中のＡＴＰの量に正比例し、その結果該系中の標的ｍｉＲＮＡの量に対応する。放出される光は、一実施形態において、その放出されたシグナルを捕捉するように配置された光検出器によって定量的及び／または定性的に読み取ることができる。

本出願にかかる好適な生物学的試料としては、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、組織を含む、但しこれらに限定されない生物学的試料が挙げられる。工業上の試料としては、食品、飲料、及び合成材料が挙げられる。環境上の試料としては、水、空気、または地表の試料が挙げられる。

用語「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらの下位カテゴリー（ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）を含むヌクレオチド（例えば、天然及び非天然の両方の、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド）のポリマーをいう。核酸は一本鎖であってもよく、通常、５’－３’ホスホジエステル結合を含むこととなるが、場合によっては、ヌクレオチド類似体が他の結合を有する場合もある。核酸は、天然に存在する塩基（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシル、及びチミジン）ならびに非天然の塩基を含んでいてもよい。

本明細書では、「標的核酸」または「標的」とは、検出または分析の対照である、試料中の核酸配列の一部をいう。用語「標的」は、標的配列のすべての変異体、例えば、１種以上の変異による変異体及び野生型変異体を含む。

一実施形態において、上記標的核酸分子はマイクロＲＮＡである。

本明細書では、「捕捉オリゴヌクレオチド」とは、標準的な塩基対形成によって標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする核酸フラグメントをいう。本明細書では、「特異的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、捕捉オリゴヌクレオチドがそれらの標的配列、またはそれらの複製物にハイブリダイズして、安定な捕捉オリゴヌクレオチド：標的ハイブリッドを形成すると同時に、安定な捕捉オリゴヌクレオチド：非標的ハイブリッドの形成が最小限に抑制されることを意味する。したがって、捕捉オリゴヌクレオチドは、標的配列、またはその複製物に対して、非標的配列に対するよりも十分に大きな程度でハイブリダイズする。好適なハイブリダイゼーション条件は当技術分野で周知であり、配列組成に基づいて予測することができるか、または慣用的な試験方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２^ｎｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９（該文献は本記述をもってその全体が援用される）を参照のこと）を使用することによって決定することができる。

図３は捕捉オリゴヌクレオチドの設計の一実施形態を示す。図３に示すように、捕捉オリゴヌクレオチドは、長さが、５’伸長尾部、内部の相補的挿入配列、及び３’尾部を含めて３０～６０ヌクレオチドであってよい。５’伸長尾部配列及び３’尾部配列にはｄＴＴＰを含まない。５’伸長尾部及び３’尾部のＡＴＰ含有量は、当該オリゴヌクレオチド全体の４０～５０％である。最適な捕捉オリゴヌクレオチド配列は、３’尾部に４～８個のさらなるヌクレオチドを含む。捕捉オリゴヌクレオチドは、それ自体とハイブリダイズして、標的核酸へのハイブリダイゼーションを妨害する形態のヘアピン構造を形成しないように設計されていることが好ましい。

本明細書では、「ルシフェラーゼ」とは、以下のように発光反応を触媒するオキシゲナーゼをいう。

したがって、ルシフェラーゼは、生物発光反応（生物発光を生成する反応）を触媒する酵素または発光タンパク質をいい、別段の明示がない限り、天然に存在するルシフェラーゼ、組換えルシフェラーゼ、または変異ルシフェラーゼである。天然に存在する場合、ルシフェラーゼは、当業者によって生物から容易に得ることができる。上記ルシフェラーゼが天然に存在するルシフェラーゼ、または組換えもしくは変異ルシフェラーゼ（例えば、天然に存在するルシフェラーゼのルシフェラーゼ－ルシフェリン反応における活性を保持するルシフェラーゼ）である場合、当該ルシフェラーゼをコードする核酸が発現される。ルシフェラーゼは、細菌、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などの培養物から容易に入手することができる。さらに、組換えまたは変異ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼをコードする核酸を使用するインビトロ無細胞系から容易に得ることができる。ルシフェラーゼはＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩから入手可能である。ルシフェラーゼの改変された変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）または変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）である複数のルシフェラーゼも当技術分野で公知であり、それらは、例えば、Ｔｈｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ， “Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｎｇ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，” Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７（６）：６４６－６５７ （２０１０）（該文献は本記述をもってその全体が援用される）に記載される。

本出願にかかる「ポリメラーゼ伸長」反応としては、全ての形態の、テンプレート指向性のポリメラーゼによって触媒される核酸合成反応が挙げられる。プライマー伸長反応の条件及び試薬は当技術分野で公知であり、任意の標準的な方法、試薬、及び酵素等をこの段階で使用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ ．， （ｅｄｉｔｏｒｓ）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（該文献は本記述をもってその全体が援用される）を参照のこと）。したがって、その最も基本的な形態での上記伸長反応は、プライマー、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、及び好適なポリメラーゼ酵素、例えば、クレノウ、または実際に任意の利用可能且つ適宜の酵素ポリメラーゼの存在下で行われる。例として、本出願の方法での使用に好適なポリメラーゼは当技術分野で周知であり、全長ＢＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメントＢＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、ＢＳＴ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウフラグメント（３’→５’エキソ）、及びＤＮＡポリメラーゼＩ（ラージクレノウフラグメント）が挙げられるが、これらに限定はされない。上記条件は、当技術分野で公知の手順に従って、取捨により選択することができる。

本出願の方法で使用するためのポリメラーゼ伸長技法は、等温技法（すなわち、単一の温度で実施される、または増幅過程の主要な態様が単一の温度で実行される技法）である。かかる技法は、増幅されるテンプレート鎖をコピーし、結合した二重鎖を形成するポリメラーゼの能力に依拠する。上記等温技法は、二重鎖の２本のストランドを分離／置換し、テンプレートを再コピーするための鎖置換型ポリメラーゼに依拠する。この周知の特性は、多数の科学論文の主題となっている（例えば、Ｙ． Ｍａｓａｍｕｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４６：２６９２－２７０１ （１９７１）；Ｒ． Ｌ． Ｌｅｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８：１１１７４－１１１８４ （１９８３）；及びＲ． Ｃ． Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ａｎｄ Ｂ． Ｍ． Ｏｌｉｖｅｒａ， Ｃｅｌｌ ３１：５３－６０ （１９８２）（該文献は本記述をもってそれらの全体が援用される）を参照のこと）。

簡単に説明すると、本出願の方法で使用される場合、ポリメラーゼ伸長は、ＤＮＡポリメラーゼが捕捉オリゴヌクレオチド－標的ハイブリッド（すなわち、二本鎖ＤＮＡ）に結合し、捕捉オリゴヌクレオチド配列に基づいて相補的ＤＮＡ鎖を伸長する際に起こる。上記伸長反応は、反応混合物に添加されたデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）混合物中で与えられる利用可能なヌクレオチドを使用して生じる。これらのｄＮＴＰには、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、及びデオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）が含まれる。一実施形態において、デオキシアデノシン三リン酸は上記ポリメラーゼ伸長混合物から除外される。

上術のように、本出願の方法で使用するためのポリメラーゼ伸長技法は、等温技法（すなわち、単一の温度で実施される、または増幅過程の主要な態様が単一の温度で実行される技法）である。したがって、特定の実施形態において、上記ポリメラーゼ伸長反応は、０～１００℃、５～１００℃、１０～１００℃、１５～１００℃、２０～１００℃、２５～１００℃、３０～１００℃、３５～１００℃、４０～１００℃、４５～１００℃、５０～１００℃、５５～１００℃、６０～１００℃、６５～１００℃、７０～１００℃、７５～１００℃、８０～１００℃、８５～１００℃、９０～１００℃、または９５～１００℃の温度で実施される。一実施形態において、上記ポリメラーゼ伸長反応は２５～４０℃の温度で実施される。

上記ポリメラーゼ伸長反応によって、ＤＮＡ鎖に付加されたヌクレオチド毎に２つのリン酸基（ＰＰｉ）が放出すされる。本出願の方法において、次にこれらの遊離リン酸（ＰＰｉ）の放出を使用して、試料中の標的核酸分子の検出を容易にすることができる。詳細には、酵素反応によるＰＰｉのＡＴＰへの変換と、それに続くシグナル伝達分子ルシフェラーゼを使用したＡＴＰの生体発光検出により、標的核酸分子の有無を検出することができる。

ルシフェラーゼ及びルシフェリンを組み合わせて使用して標的核酸を同定する。というのも、生成する光の量は生成するＡＴＰの量に実質的に比例し、同様に、取り込まれるヌクレオチド及び存在する標的核酸の量に正比例することによる。したがって、本方法は、ルシフェリン及びＯ_２を用意することを含み、ルシフェリン及びＯ_２が反応混合物に添加される。

上記のように、本明細書に記載の方法は、ポリメラーゼ伸長混合物を、標的核酸分子が伸長され遊離リン酸を放出する条件に供することを含む。次に、放出された遊離リン酸から、酵素反応を介してアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、次いでＡＴＰをルシフェラーゼで代謝させて生物発光読み出しシグナルを生成させる。この態様によれば、一実施形態において、アデノシン三リン酸を生成することは、放出された遊離リン酸を、結合したグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＧＡＰＤＨ－ＰＧＫ）の酵素反応に供して、アデノシン三リン酸を生成させることを含む。

この実施形態において、上記酵素反応は、ＧＡＰＤＨが、ＰＰｉ、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、及びグリセルアルデヒド３－リン酸（ＧＡＰ）の存在下で、ＰＧＫと反応して、ＡＴＰを生成することを含む。次いでＡＴＰはルシフェラーゼと反応して、測定可能なシグナルを生成する。反応スキームを以下に示す。

別の実施形態において、アデノシン三リン酸は、放出された遊離リン酸をアデノシン三リン酸スルフリラーゼ（ＡＴＰ－ｓｕｌ）の存在下でアデノシン５’－ホスホ硫酸（ＡＰＳ）と接触させ、アデノシン三リン酸を生成させることによって生成させることができる。次いで、ＡＴＰがルシフェラーゼと反応して測定可能なシグナルを生成する。反応スキームを以下に示す。

上記の実施形態によれば、上記グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ、上記ホスホグリセリン酸キナーゼ、及び／または上記アデノシン三リン酸スルフリラーゼは、上記の固体支持体に結合していてもよい。

生成する光の量は、ルミノメーターなどの、妥当な光において鋭敏なデバイスを使用して容易に決定することができる。したがって、ルミノメトリー法は定量化が可能であるという利点がある。

一実施形態において、上記生物発光読み出しシグナルを定量化して、試料中の標的核酸分子の存在または濃度を決定する。標的核酸の量は、発光シグナルのピークの大きさ、及び／またはシグナルがそのピークの大きさに到達するのに要する時間、及び／またはある期間にわたって放出されるシグナルの積分量、及び／または発光が生成する速度から決定することができる。

一実施形態において、標的核酸分子は１リットル当たり１０^－５モル未満の濃度で試料中に存在する。

一実施形態において、試料中の標的核酸分子の存在は、生物発光シグナル生成の初期速度の計算、生物発光のピークに達するのに要する時間の計算、及び生物発光シグナルのピークの大きさまたは生物発光の、時間ゼロから生物発光のピークまで積分した生物発光シグナルの計算を含む手順によって決定される。

これらの手順は、個別に使用してもよく、またはより良好な定量を行うための、２種以上の手順を組み込んだ分析方法の一部として使用してもよい。各手順または手順の組み合わせについて、閾値を事前に決定し、既知量の標的核酸標的に合わせて較正してもよい。所定の値はまた、所望の標的オリゴヌクレオチドに類似しているが同一ではない配列（すなわち変異）を識別するのに有用である場合がある。さらに、これらの分析手順によって得られる値をカットオフ値に対して評価して、存在／非存在の測定を行ってもよく、または定量的な読み取りを可能にするための尺度として評価してもよい。

一実施形態において、複数種の標的核酸分子を検出するために、複数種の捕捉オリゴヌクレオチド分子が添加される。

この実施形態に従って企図される方法は、複数種の捕捉オリゴヌクレオチドを利用して、複数種の所定の核酸標的配列のうちの１種以上が試料中に存在するかまたは存在しないかを決定する多重アッセイである。かかる多重アッセイが特に有用な分野は、通常の分析出力で対象の核酸が存在しないことを示すスクリーニングアッセイである。

上記の方法の多重化された実施形態では、試料は、複数種の異なる捕捉オリゴヌクレオチドと混合される。この実施形態において、１種の捕捉オリゴヌクレオチドによるある特定の結果に関する分析出力は、すべての捕捉オリゴヌクレオチドによる反対の結果に関する分析出力と区別可能である。

この実施形態によれば、例えば、１つの固体支持体が、複数種の標的核酸に特異的な複数種の捕捉オリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。それぞれの捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体の画定された位置もしくは領域に局在化させてもよく、またはイン・サイチュウで、固体支持体の表面上の画定された位置もしくは領域で合成してもよい。かかる支持体によって、複数の、捕捉オリゴヌクレオチドが結合した標的核酸を並行して分析することが容易になる。かかる支持体は大量処理スクリーニングにも適している。

特定の実施形態において、本出願の反応は溶液中で行われる。用語「溶液中」とは、溶液中または懸濁液中で標的核酸が検出される任意のアッセイをいう。例えば、標的核酸に対する第１のハイブリダイゼーションは第１の捕捉オリゴヌクレオチドを用いて行うことができ、標的核酸に対する第２のハイブリダイゼーションは第２の捕捉オリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。かかる複数のハイブリダイゼーションは、いずれの望ましくない（例えば、非ハイブリダイゼーション配列）成分を除去するための洗浄ステップを含んでいてもよい。

特定の実施形態において、本出願にかかる方法の酵素は固体支持体に結合していてもよい。他の実施形態において、本方法の酵素は溶液中に残っていてもよい。

好適な支持体としては、有機または無機材料が挙げられ、任意且つ適宜の大きさまたは形状の材料（例えば、スキャフォールドシート、プラットフォーム、及び／またはナノ粒子）であってよい。本出願にかかるアッセイの成分を係留または固定化することは、例えば、上記成分を空間的に閉じ込めるのみならず、例えば、特定のアッセイの一部として段階反応もしくは逐次反応を実施する際に、上記成分の安定性及び／または機能を向上させるのにも役立つ。特定の実施形態において、上記支持材料としては、例えば、ヌクレオチド配列またはゲルが挙げられる。特定の実施形態において、本出願にかかるアッセイの酵素または成分は、例えば、ナノ粒子もしくは、プラットフォームなどの支持材料のチャネル（例えばマイクロ流体チャネル）の管腔表面上に固定化されるか、またはそれらに係留されていてもよい。

本出願にかかるアッセイの成分（例えば酵素）を表面上に固定化するためには、いくつかの技法を使用することができる。例えば、成分は、非特異的に結合させてもよく、または特異的であるが非配向性の化学反応（カルボキシ－アミド結合など）を介して結合させてもよい。配向性酵素固定化も本出願の方法に従って使用することができる。配向性酵素固定化により、例えば、係留された酵素の活性及び安定性が最適化されるように結合タグ（例えばアフィニティータグ）を配置することを含む、いくつかの利点が与えられる（Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ，” Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １６（９）：１０１３－２０ （２００９）（該文献は本記述をもってその全体が援用される）を参照のこと）。

核酸検出に関与する酵素の表面への係留方法の一例は配向性固定化の使用である。本出願にかかるアッセイの特定の実施形態において、アッセイの反応に関与する組換え酵素またはアッセイ成分は、アフィニティータグを用いて操作され、上記酵素がシリカもしくはニッケルなどの表面、またはニッケル－ニトリロ三酢酸など表面の成分に結合することが可能になる。例えば、アフィニティータグは、固定化しようとするタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端に結合することができるか、または固定化しようとするタンパク質内に包埋することができる。係留するドメインの最適な位置は、当該酵素の触媒ドメイン（複数可）、基質結合ドメイン（複数可）の性質及び位置、ならびに該酵素に起こることが必要ないずれかの高次構造の変化に依存することとなる。

アフィニティータグ付きタンパク質の使用は、本出願の方法で使用されるタンパク質（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ、ルシフェラーゼなど）は、対応する捕捉結合部分を含む固体支持体への固定化を容易にするための適宜の結合タグとの融合物として容易に発現させることが可能であることから、特に利便性がある。本出願のこの実施形態に従って使用することができる好適な捕捉部分及び結合タグパートナーとしては、Ｈｉｓ－Ｓｉ、Ｈｉｓ、Ｓｉ、ビオチン、ストレプトアビジン、Ｐｔ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｉｓ－Ｐｔ、Ｈｉｓ－Ａｕ、Ｈｉｓ－Ａｇ、ＧＳＴ、抗体、及びエピトープタグが挙げられるが、これらに限定はされない。オリゴヌクレオチドを固体支持体に共有結合させる方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｇｏｓｈ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５（１３）： ５３５３－５３７２ （１９８７）， Ｊｏｏｓ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｇｌａｓｓ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，” Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４７（１）：９６－１０１ （１９９７）；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．， “Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｔｏ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ， Ｄｙｎａｂｅａｄｓ， ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｏｕｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６（２２）：１０８６１－８０ （１９８８）を参照されたく、これらの文献は本記述をもってそれらの全体が援用される。

特定の実施形態において、上記ＤＮＡポリメラーゼ及び／または上記ルシフェラーゼは固体支持体に結合されている。

本出願のこの態様によれば、上記ＤＮＡポリメラーゼ及び／または上記ルシフェラーゼは、Ｈｉｓ－Ｓｉ、Ｈｉｓ、Ｓｉ、ビオチン、ストレプトアビジン、Ｐｔ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｉｓ－Ｐｔ、Ｈｉｓ－Ａｕ、Ｈｉｓ－Ａｇ、ＧＳＴ、抗体、及びエピトープタグからなる群より選択されるリンカーを用いて固体支持体に結合することができる。

支持体、プラットフォーム、またはスキャフォールドとして機能する表面は、例えば、種々のナノ粒子、または核酸の鎖を含む複数の形態をとることができ、種々の幾何学を含むことができる。

本出願にかかる特定の実施形態において、上記支持体はナノ粒子である。本明細書では、用語「ナノ粒子」とは、任意の粒子であって、その平均径がナノメートルの範囲にある、すなわち、平均径が最大で１μｍの上記粒子をいう。使用されるナノ粒子は、当業者に公知となる任意且つ適宜の有機または無機の物質で製造ことができる。例えば、ナノ粒子は、任意のポリマー、酸化鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）、金、銀、炭素、シリカ、ＣｄＳｅ、及び／またはＣｄＳから構成されていてもよい。一実施形態において、上記ナノ粒子は磁性ナノ粒子である。別の実施形態において、上記ナノ粒子は磁性のシリカ被覆ナノ粒子（「ＭＳＰ」）である。

ナノ粒子（ＮＰ）に加えて、種々の材料の支持体またはスキャフォールドが、ロッド、平面、グラフェンシート、ナノチューブ、ＤＮＡスキャフォールド、ゲル、ミクロスフェア、またはより大きな支持体のマイクロチャネルの内部チャネル壁の形態をとることができる。量子ドットも、本出願にかかる支持体としての使用が企図される。酵素固定化は、非特異的結合、化学修飾、アフィニティータグ、または他の複合体化技法によって実現することができる。

本出願にかかる一実施形態において、上記方法は、陽性対照及び／または陰性対照を実施することをさらに含む。標的核酸の診断量または予後量の検出は、対照量との比較によって実施される。標的核酸の対照量は、標的核酸の試験量と比較されることになる任意の量または量の範囲であってよい。対照量は、本出願にかかるアッセイの一部として実施される陽性対照または陰性対照試料中の標的核酸の量であってよい。対照量は、絶対量（例えば、μｇ／ｍｌ）または相対量（例えばシグナルの相対強度）のいずれかであってよい。

本出願の方法で使用するための例示的な陰性対照としては、標的オリゴヌクレオチドを標的とするブロッキングオリゴヌクレオチド（標的オリゴヌクレオチドに対して完全にまたは部分的に相補的な配列）、捕捉オリゴヌクレオチドを標的とするブロッキングオリゴヌクレオチド（伸長を阻害するために３’／５’末端において修飾）、反応混合物に添加されたリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、捕捉オリゴヌクレオチドを含まない反応混合物、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含まない反応混合物、及び基質のいずれかを含まない反応混合物が挙げられる。本出願の方法で使用するための例示的な陽性対照としては、様々な濃度（飽和量を含む）の標的オリゴヌクレオチド模倣物（当該の試料に由来する標的オリゴヌクレオチドの配列と同一の配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド）、及び上記ポリメラーゼによる伸長が可能である、オーバーハングを有する一本鎖配列をもつ、事前にアニーリングされた二本鎖ＤＮＡが挙げられる。

様々な関連する態様において、本出願はまた、本明細書に記載の方法を実施するためのデバイス及びキットにも関する。かかるキットは、臨床環境または研究環境で利用することができる、または臨床現場での検査または現場での使用のいずれかに適合することができる、モニター、試薬、及び手順を含む。特に、本明細書に記載の方法を実施する際に使用される、開示される試薬を含むキットは、捕捉された標的核酸分子を検出する、及び標的の捕捉後に生成する生物発光シグナルを測定するためのいくつかの手段のいずれかを、適宜の説明書と共に含む。好適なキットは、標的核酸分子を検出するためのアッセイを実施するのに十分な試薬を含む。

かかるキットは、本出願の任意の方法に有用であることを理解されたい。特定の成分の選択は、特定の方法であって、当該キットがその方法を実施するように設計されている上記方法によって異なる。ＡＴＰの放出及び生物発光シグナルの検出によって測定される分析出力を検出するために、さらなる成分を添加してもよい。

上記のように、本キットは任意選択で、本明細書に記載の方法によって標的核酸を検出するための説明書をさらに含む。かかるキット中に存在する上記説明書は、本出願の様々な方法を実施するための、本キットの構成要素の使用方法について使用者に説明する。これらの説明書には、発光による検出を含む、本出願の検出方法の説明が含まれていてもよい。

したがって、本出願の別の態様は、試料中の標的核酸分子を検出するためのキットに関する。上記キットは、
上記標的核酸分子の少なくとも一部に相補的であり、その結果、上記標的核酸分子の相補的部分にハイブリダイズし、二本鎖核酸分子を形成する捕捉オリゴヌクレオチド分子と、
固体支持体に結合したポリメラーゼと、
ｄＮＴＰ混合物と、
放出された遊離リン酸からアデノシン三リン酸を生成させるための、固体支持体に結合した酵素と、
生物発光読み出しシグナルを生成させるための、固体支持体に結合したルシフェラーゼと
を含む。

本出願の別の態様は、試料中の標的核酸分子を検出するためのキットに関する。上記キットは、上記標的核酸分子の少なくとも一部に相補的であり、その結果、上記標的核酸分子の相補的部分にハイブリダイズし、二本鎖核酸分子を形成する捕捉オリゴヌクレオチド分子を含む。上記捕捉オリゴヌクレオチド分子は、（ｉ）３０～６０塩基対の長さを有し、（ｉｉ）その３’末端に４～８塩基対のオーバーハングを有し、（ｉｉｉ）５’尾部を有し、（ｉｖ）３’末端と５’尾部との間に標的特異的部分を有し、（ｖ）４０～５０％のデオキシアデノシン二リン酸含有量を有し、（ｖｉ）３’末端または５’尾部にデオキシチミジンリン酸を有さず、且つ（ｖｉｉ）上記捕捉オリゴヌクレオチド分子のＡＴＰ含有量の４０～５０％であるＡＴＰ含有量を有する上記３’末端及び５’尾部を有する。上記キットはまた、ポリメラーゼと、ｄＮＴＰ混合物と、放出された遊離リン酸からアデノシン三リン酸を生成させるための酵素と、生物発光読み出しシグナルを生成させるためのルシフェラーゼも含む。

上記のキットはまた、複数種の標的核酸分子を検出するための複数種の捕捉オリゴヌクレオチド分子を含んでいてもよい。多重化捕捉オリゴヌクレオチドに媒介される特異的核酸検出を企図するキットにおいて、該キットは、対象とする複数種の核酸標的のための複数種の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。上記キットが複数種の捕捉オリゴヌクレオチドを含む場合、該捕捉オリゴヌクレオチドのそれぞれは、異なる標的核酸配列を識別する（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）ように設計されていることが好ましい。

本出願の最後の態様は、捕捉オリゴヌクレオチド分子を含む組成物であって、上記捕捉オリゴヌクレオチド分子が、（ｉ）３０～６０塩基対の長さを有し、（ｉｉ）その３’末端に４～８塩基対のオーバーハングを有し、（ｉｉｉ）５’尾部、を有し（ｉｖ）３’末端と５’尾部との間に標的特異的部分を有し、（ｖ）４０～５０％のデオキシアデノシン二リン酸含有量を有し、（ｖｉ）３’末端または５’尾部にデオキシチミジンリン酸を有さず、且つ（ｖｉｉ）上記捕捉オリゴヌクレオチド分子のＡＴＰ含有量の４０～５０％であるＡＴＰ含有量を有する上記３’末端及び５’尾部を有する、上記組成物に関する。

以下の実施例は本開示の実施形態の実施を例示することを意図しているが、その範囲を限定することは何ら意図しない。

実施例１ 反応混合物からｄＡＴＰを除外することによりアッセイの速度論及び感度が向上
０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、０．２５μｌ クレノウ（ＮＥＢ、Ｌｇフラグメント、Ｍ０２１０Ｓ、５０００Ｕ／ｍｌ）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２（配列番号：７）、１μＭ）、１．８μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各３３ｍＭ）、及び＋／－ ｄＡＴＰを混合することによって、総容量１００ｕｌの反応混合物を調製した。この反応混合物を、１μｌの標的オリゴヌクレオチド（Ｒ６（配列番号：６）、１μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加した。次いで、この反応混合物を直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で２０００秒間、発光シグナルを読み取った。

図４に示すように、２つの同一の反応混合物を上記の条件を使用して試験した。但し、反応混合物Ａに添加されたヌクレオチド混合物ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）を除外した。ｄＡＴＰのルシフェラーゼへの結合及びｄＡＴＰのルシフェラーゼによる加水分解によって、初期発光シグナルの減弱（１）、応答位相のピークの遅延（ｄｅｌａｙｅｄ ｐｅａｋ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｈａｓｅ）（２）、及びシグナル全体の大きさの低下（３）が生じる。このことは、純粋な塩基配列決定と、ここで使用される、生物発光が読み出し情報として生成する係留検出法との関係を示している。これらのデータの結果として、上記補足オリゴヌクレオチドは、上記反応混合物中にｄＡＴＰが存在しなくてもよいように、その配列中にｄＴＰＳを全く含まないように設計される。

実施例２ ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイにより標的オリゴヌクレオチドの３’末端のミスマッチヌクレオチドの検出が可能
０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、０．２５μｌ クレノウ（ＮＥＢ、Ｌｇフラグメント、Ｍ０２１０Ｓ、５０００Ｕ／ｍｌ）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２（配列番号：７）、１００ｕＭ）、及び１．８μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各３３ｍＭ）を混合することによって、総容量１００μｌの反応混合物を調製した。この反応混合物を、１μｌの各標的オリゴヌクレオチド（Ｒ１～Ｒ６（配列番号：１～６）、１００μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で３５００秒間、発光シグナルを読み取った。

図５Ａは、図５Ｂに示す、標的オリゴヌクレオチド配列の３’末端におけるミスマッチヌクレオチド（下線付き文字で示す）の割合が増加するにつれて発光シグナルが減少することを示す。２種の相補的標的オリゴヌクレオチド（捕捉オリゴヌクレオチド内でシフトし且つ重複する配列に相補的なＲ１（配列番号：１）及びＲ６（配列番号：６））ならびに４種のミスマッチオリゴヌクレオチド（ミスマッチヌクレオチドの割合を付記して表示）を試験し、ヌクレオチドミスマッチ時のＴＥＴ反応の強力な阻害を実証し、これを図５Ｃにまとめた。図５Ｄは、標的オリゴヌクレオチドの存在及び捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを決定するための、想定されるデータ解析手順の図解を示し（図５Ａに示した標的オリゴヌクレオチドＲ１（配列番号：１）及びＲ６（配列番号：６）に関するデータに対して示す）、但し、ａ／ａ’：発光シグナル生成の初期速度（勾配）の計算、ｂ／ｂ’：発光のピークまでの時間、ｃ／ｃ’：発光シグナルのピークの大きさ、ｄ／ｄ’：時間０からピークまで積分した発光シグナルである。

実施例３ ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイの使用した標的オリゴヌクレオチド検出の感度範囲の決定
０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、０．２５μｌ クレノウ（ＮＥＢ、Ｌｇフラグメント、Ｍ０２１０Ｓ、５０００Ｕ／ｍｌ）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、０．５μｌ 捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２（配列番号：７）（図７のＡを参照のこと）、１μＭ）、及び１．８μｌのｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ混合物（各３３ｍＭ）を混合することによって、総容量１００μｌの反応混合物を調製した。この反応混合物を、反応混合物を、漸減する濃度の標的オリゴヌクレオチド（Ｒ６（配列番号：６）、０ｍＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で２０００秒間、発光シグナルを読み取った。

図６のＡは、標的オリゴヌクレオチドの濃度の漸減に応答した発光シグナルを示している。１ピコモル濃度（１０^－１２ｍｏｌ／Ｌ）～１マイクロモル濃度（１０^－６ｍｏｌ／Ｌ）の濃度の検出範囲が示されている。図６のＢは、さらなる最適化が必要ではあるが、反応速度論から計算した図６のＡのまとめ（すなわち、ピコＭで表した上記オリゴヌクレオチドの濃度の関数としての初期反応段階の傾き）が、高感度及び広いダイナミックレンジを示すことを表している。

実施例４ 捕捉オリゴヌクレオチドの５’及び３’尾部の設計がＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応速度に影響
０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、０．２５μｌ クレノウ（ＮＥＢ、Ｌｇフラグメント、Ｍ０２１０Ｓ、５０００Ｕ／ｍｌ）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 標的オリゴヌクレオチド（Ｒ６（配列番号：６）、１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各３３ｍＭ）を混合することによって、総容量１００μｌの反応混合物を調製した。この反応混合物を、１μｌの各捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２～Ｔ６（配列番号：７～１１）、１００μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で１０００秒間、発光シグナルを読み取った。

図７のＡに示すように、数種の設計の捕捉オリゴヌクレオチドを生成させた（Ｔ２～Ｔ６（配列番号：７～１１））。すべての設計に類似する相補的挿入配列（Ｒ６標的オリゴヌクレオチドに相補的、下線付き文字で示す）が含まれる。図７のＢは、種々の捕捉オリゴヌクレオチド（図７のＡに提示）の存在下で測定した、標的オリゴヌクレオチドの添加に応答した発光シグナルを示す。図７のＣは図７のＢのまとめであり、種々の捕捉オリゴヌクレオチドについて計算した反応勾配によって示される、アニーリング速度論の違いを示している。

実施例５ 捕捉オリゴヌクレオチドｄＡＴＰの含有量がＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応速度論に影響
０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、０．２５μｌ クレノウ（ＮＥＢ、Ｌｇフラグメント、Ｍ０２１０Ｓ、５０００Ｕ／ｍｌ）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 標的オリゴヌクレオチド（Ｒ６（配列番号：６）、１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各３３ｍＭ）を混合することによって、総容量１００μｌの反応混合物を調製した。この反応混合物を、１μｌの各捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ１（配列番号：１２）＋Ｔ１Ａ～Ｔ１Ｅ（配列番号：１３～１７）、１００μＭ））が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で１０００秒間、発光シグナルを読み取った。

図８のＡに示すように、上記標的オリゴヌクレオチド、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐの検出のために、漸増する割合のｄＡＴＰ（２７％～６３％）を含む６種の捕捉オリゴヌクレオチドを設計した（すべてが、下線付き文字で示す類似する相補的挿入配列を有する）。図８のＢは、上記捕捉オリゴヌクレオチド配列内のｄＡＴＰ含有量が４０％～５０％で最上の活性を示すデータのまとめである。この知見は驚くべきものであり、顕著な向上を表している。

実施例６ 捕捉オリゴヌクレオチドの３’尾部長がＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応の活性及び反応速度論に影響
０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、０．２５μｌ クレノウ（ＮＥＢ、Ｌｇフラグメント、Ｍ０２１０Ｓ、５０００Ｕ／ｍｌ）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 標的オリゴヌクレオチド（Ｒ６（配列番号：６）、１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各３３ｍＭ）を混合することによって、総容量１００μｌの反応混合物を調製した。この反応混合物を、１μｌの各捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ１～Ｔ９（配列番号：１２及び配列番号：１８～２５）、１００μＭ））が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で１０００秒間、発光シグナルを読み取った。

図９のＡに示すように、上記標的オリゴヌクレオチド、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐの検出のために、９種の捕捉オリゴヌクレオチドを設計した。上記９種の捕捉オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡの相補的挿入部位に続く、該オリゴヌクレオチドの配列の３’末端に、漸減する数のヌクレオチド（下線付き文字で示す）を含む。図９のＢは、５～８個のヌクレオチドが上記標的オリゴヌクレオチドの相補的挿入配列の３’に付加されると、最適なＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイの活性が得られることを示している。

実施例７ ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイはＭＩＲ－３４０標的オリゴヌクレオチドの配列の変異に敏感
０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、０．２５μｌ クレノウ（ＮＥＢ、Ｌｇフラグメント、Ｍ０２１０Ｓ、５０００Ｕ／ｍｌ）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２、１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各３３ｍＭ）を混合することによって、総容量１００μｌの反応混合物を調製した。この反応混合物を、１μｌの各標的オリゴヌクレオチド（ＭＩＲ－３４０＃１～ＭＩＲ－３４０＃７（配列番号：２７～３３）、１００μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で１２００秒間、発光シグナルを読み取った。

図１０のＡに示すように、ＭＩＲ３４０標的オリゴヌクレオチド（ＭＩＲ－３４０＃１（配列番号：２７））及び種々の変異配列（ＭＩＲ－３４０＃２－＃７）（配列番号：２８～３３）をこの実験で使用し、且つ２種の対照（未変異のＭＩＲ－３４０＃２に対するもの、及びいずれの標的オリゴヌクレオチドも除外した反応混合物である対照）も使用した（変異ヌクレオチドを下線付き文字で示す）。図１０のＢ及びＣは、Ａに示す種々の変異に対して測定した発光シグナル及び速度論を示す。図１０のＡのデータは、試験したすべての変異により、測定したシグナルにおいて検出可能な差異が誘発されたことを示す。

実施例８ ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイはヒト血清及びヒト血漿中の天然に存在するｍｉＲＮＡを検出することが可能
０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、０．２５μｌ クレノウ（ＮＥＢ、Ｌｇフラグメント、Ｍ０２１０Ｓ、５０００Ｕ／ｍｌ）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌの、図１０のＡに列挙する、天然に存在するｍｉＲＮＡを標的とする捕捉オリゴヌクレオチド（１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各３３ｍＭ）を混合することによって、総容量４０μｌの反応混合物を調製した。この反応混合物を、６０μｌのヒト血清またはヒト血漿が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で５００秒間、発光シグナルを読み取った。

図１１のＡに示すように、市販のヒト血清中の６種の異なる天然に存在するｍｉＲＮＡを検出するように、６種の捕捉オリゴヌクレオチドを設計した。ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応のリアルタイムでの速度論を示す。図１１のＢは図１１のＡのまとめであり、生物発光シグナルを５００秒間積分し、試験した血清試料中の種々のｍｉＲＮＡの相対量を示す。

図１２に示すように、３名のヒトドナー由来の血漿試料（Ｇｕｔｈｒｉｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓａｙｒｅ ＰＡにて採取）を、６種の天然に存在するｍｉＲＮＡのパネルについてＴＥＴ－ｍｉＲＮＡを用いて試験した。

実施例９ リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）処理によってＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ活性が消失
０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、０．２５μｌ クレノウ（ＮＥＢ、Ｌｇフラグメント、Ｍ０２１０Ｓ、５０００Ｕ／ｍｌ）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌの、図１２に記載の天然に存在するｍｉＲＮＡを標的とする捕捉オリゴヌクレオチド（１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各３３ｍＭ）を混合することによって、総容量４０μｌの反応混合物を調製した。この反応混合物を、６０μｌのヒト血漿が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で５００秒間、発光シグナルを読み取った。

図１３のＡは、３名の対象由来の血漿試料（Ｇｕｔｈｒｉｅ（Ｓａｙｒｅ， ＰＡ）にて採取）を、４種の天然に存在するｍｉＲＮＡのパネルについてＴＥＴ－ｍｉＲＮＡを用いて試験した結果示す。図１３のＢは、室温で３０分間ＲＮアーゼ－Ａで処理した後に観測された、シグナルの顕著な減少を示す。

実施例１０ ＮＰへの固定化による反応と溶液中での反応による標的オリゴヌクレオチド検出の分析
ストレプトアビジンでコーティングしたミクロスフェア（５００ｎｍ ＳｉＯ_２，Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＮ，ＵＳＡ）上に、製造元の説明に従ってビオチン化酵素を固定化し、次いで未結合のタンパク質を遠心分離によって３回洗浄した。ＮＰに係留した酵素または係留していない酵素の等量を、反応混合物当りの総容量が１００μｌの、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 捕捉オリゴヌクレオチド（Ｃａｐ－ＨＡＳ－ＭＩＲ－４５１ａ、１μＭ）、及び１．８μｌのｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ混合物（各３３ｍＭ）の反応混合物に添加した。この反応混合物を、標的オリゴヌクレオチド（ＨＡＳ－ＭＩＲ－４５１ａ、１μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で２０００秒間、発光シグナルを読み取った。

市販のヒト血清試料に等量の標的オリゴヌクレオチド、ＨＳＡ－ＭＩＲ－４５１ａをスパイクし、これを、可溶性の酵素ルシフェラーゼ／ＡＴＰ－スルフリラーゼ／クレノウ（図１４のＡ、溶液）、またはＮＰに係留した上記酵素（図１４のＢ、ＮＰ）を含むＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応混合物に添加した。ビオチン化による非配向性固定化を使用して、ＤＮＡポリメラーゼ及びＡＴＰ－スルフリラーゼをＮＰに係留したことに留意されたい。ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）及びクレノウ（ＮＥＢ、Ｌｇフラグメント、Ｍ０２１０Ｓ、５０００Ｕ／ｍｌ）を、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用し、製造元の説明に従ってビオチン化した。

実施例１１ ビオチン－ストレプトアビジン結合を介した市販ＢＳＴ２．０のＮＰへの固定化によりＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応アッセイが阻害される
ＢＳＴ２．０（ＮＥＢ、Ｍ０５３７Ｓ、８０００Ｕ／ｍｌ）を、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用し、製造元の説明に従ってビオチン化した。ストレプトアビジンでコーティングしたミクロスフェア（５００ｎｍ ＳｉＯ_２，Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＮ，ＵＳＡ）上に、製造元の説明に従って上記ビオチン化酵素を固定化し、次いで未結合のタンパク質を遠心分離によって３回洗浄した。ＮＰに係留したＢＳＴ２．０または係留していないＢＳＴ２．０の等量を、反応混合物当りの総容量が１００μｌの、０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 捕捉オリゴヌクレオチド（Ｃａｐ－ＨＳＡ－ＭＩＲ－４５１ａ、１μＭ）、及び１．８μｌのｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ混合物（各３３ｍＭ）の反応混合物に添加した。この反応混合物を、標的オリゴヌクレオチド（ＨＳＡ－ＭＩＲ－４５１ａ、１μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で２０００秒間、発光シグナルを読み取った。

市販のヒト血清試料に等量のＨＳＡ－ＭＩＲ－４５１ａをスパイクし、これを、可溶性の酵素ルシフェラーゼ／ＡＴＰ－スルフリラーゼ／Ｂｓｔ２．０（図１５のＡ、溶液）、またはビオチン化を介してＢｓｔ２．０をＮＰ上に固定化したものに換えたもの（図１５のＢ、ＮＰ）を含むＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応混合物に添加した。これらのデータは、その活性にビオチン化が悪影響を及ぼしたことを示しており、Ｂｓｔ２．０が非配向性固定化を介してＮＰに係留された場合はさらに悪影響があった。

実施例１２ ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイは温度の影響をわずかにしか受けない
０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、０．２５μｌ クレノウ（ＮＥＢ、Ｌｇフラグメント、Ｍ０２１０Ｓ、５０００Ｕ／ｍｌ）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌのＨａｓ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ ｍｉＲＮＡを標的とする捕捉オリゴヌクレオチド（１００μＭ）、１．８μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各３３ｍＭ）、及びＨａｓ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐオリゴヌクレオチドを混合することによって、総容量１００μｌの反応混合物を調製した。この反応混合物を白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、示した種々の温度において発光シグナルを読み取った。発光は４００ミリ秒の積分時間で１０００秒間測定した。

図１６のＡに示すように、市販のヒト血清試料に等量の標的オリゴヌクレオチドをスパイクし、これを種々の温度（２５℃～４０℃）でＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応混合物に添加した。初期における反応速度論のパラメータ（勾配から測定、図１６のＢ）及び効率（積分シグナルから測定、図１６のＣ）に僅かな差異が観測されたのみであった。

実施例１３ ヒト血清中のｍｉＲＮＡを検出するための２種の異なる捕捉オリゴヌクレオチド設計の分析
０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、０．２５μｌ クレノウ（ＮＥＢ、Ｌｇフラグメント、Ｍ０２１０Ｓ、５０００Ｕ／ｍｌ）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌのＣＡＰ１（ない列番号３４）またはＣＡＰ２（配列番号：３５）捕捉オリゴヌクレオチド（１００μＭ）、１．８μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各３３ｍＭ）、及び被検オリゴヌクレオチドを混合することによって、総容量１００μｌの反応混合物を調製した。この反応混合物を白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温で発光シグナルを読み取った。発光は４００ミリ秒の積分時間で１０００秒間測定した。

図１７Ａは、ヒト血漿中の天然に存在する６種の異なるｍｉＲＮＡを検出するために試験した２種の捕捉オリゴヌクレオチドの設計を示す。ＣＡＰ１はランダムなヌクレオチド配列であり、ＣＡＰ２においては、５’尾部及び３’尾部はアデノシンのみを含む。図１７Ｂは、天然に存在するｍｉＲＮＡ、ならびに類似の配列であるＤＮＡ系標的オリゴヌクレオチド（試験オリゴヌクレオチド）の両方を検出するＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応のリアルタイム速度論を示す。図１７Ｃは図１７Ｂに示したデータの拡大部分であり、種々のｍｉＲＮＡ分子の発光シグナルを示す。図１７Ｄは図１７Ａのまとめであり、発光シグナルを５００秒間積分し、種々のｍｉＲＮＡの相対量を示す。図１７Ｅは天然に存在するｍｉＲＮＡ（図１７Ｃに示す）のみの測定値のまとめである。

実施例１４ ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイにおける種々のＤＮＡポリメラーゼ活性の比較
０．０５μｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０３９４Ｓ、３００Ｕ／ｍｌ）、ＤＮＡポリメラーゼ（図１７Ａに示す）、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ（実験室での自家製）、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌのｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ ｍｉＲＮＡを標的とする捕捉オリゴヌクレオチド（１００μＭ）、１．８μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各３３ｍＭ）、及びｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐオリゴヌクレオチドを混合することによって、総容量１００μｌの反応混合物を調製した。この反応混合物を白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で５００秒間、発光シグナルを読み取った。

図１８Ａは、この実験で使用したＤＮＡポリメラーゼ、及びいくつかのそれらの重要な特徴の一覧である。図１８Ｂに示すように、市販のヒト血清試料に等量のｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをスパイクし、これを種々のＤＮＡ－ポリメラーゼの存在下で（室温で）ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応混合物に添加した。反応速度論の棒グラフ（反応の初期勾配から計算）は、Ｂｓｔ、クレノウ、及びＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡ－Ｐｏｌｙがこれらの実験条件下で最速の反応速度論を与えることを示す。対照１（ＣＴＲＬ１）の反応混合物は捕捉オリゴヌクレオチド含まない一方、対照２（ＣＴＲＬ２）はＤＮＡポリメラーゼを含まない。前の図のデータを得るために使用したＢｓｔ及びクレノウ変異体の棒を強調表示している。

実施例１５ ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡを係留して使用した場合と溶液で使用した場合での標的オリゴヌクレオチドの検出の比較
等量のＮＰ係留酵素または非係留酵素、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２（配列番号：７）、１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ混合物（各３３ｍＭ）からなる反応混合物を調製した。この反応混合物を、漸増する量の標的オリゴヌクレオチド（Ｒ６（配列番号：６）、２００ｎＭ、５００ｎＭ、及び１ｕＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で１４００秒間、発光シグナルを読み取った。

図１９ＡはＨｉｓ－Ｓｉ－酵素の設計の概略図である（ＡＴＰＳ：ＡＴＰ－スルフリラーゼ、ＤＮＡ－Ｐｏｌ：ＤＮＡポリメラーゼ、Ｌｕｃ：ルシフェラーゼ）。以下をコードする遺伝子、すなわち、ＡＴＰ－スルフリラーゼ（ＭＥＴ３、硫酸アデニリルトランスフェラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、ＢＳＴ（バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ）遺伝子）、及びクレノウ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＬＤ９３－１ ＤＮＡポリメラーゼＩ）を、Ｈｉｓ－Ｓｉタグと融合させてｐＥＴ１７ｂベクター中に挿入し、細菌タンパク質を発現させた。上記Ｈｉｓ－Ｓｉ－タンパク質はＮｉ－ＮＴＡビーズを使用して精製し、使用するまでソルビトールを含む天然タンパク質緩衝液（ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｕｆｆｅｒ）（ＮＰＢ）中で保存した。図１９Ｂは、上記反応混合物を使用して実施した、係留の場合と溶液中の場合の酵素活性の測定を示す。これらのデータは、ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ酵素が５００ｎｍ ＳｉＯ_２ ＮＰに固定化されている場合（ＮＰ、左の図）、または溶液中の場合（Ｓｏｌ、右）の個々の反応混合物の速度論を示す。図１９Ｃは反応速度論（当該の反応混合物の初期勾配から計算）の棒グラフであり、ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ酵素がＮＰに係留されている場合、カップリング反応がより速い反応速度論で起きていることを示す。図１９Ｄは、漸増する濃度のＲ６標的オリゴヌクレオチドの検出におけるＮＰ ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応のまとめである。

実施例１６ ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡアッセイにおけるＨｉｓ－Ｓｉ－クレノウとＨｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴの活性の比較（係留と非係留の比較）
等量のＮＰ係留酵素または非係留酵素、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２（配列番号：７）、１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ混合物（各３３ｍＭ）からなる反応緩衝液使用して、係留の場合と溶液中の場合の酵素活性の測定を実施した。この反応混合物を、標的オリゴヌクレオチド（Ｒ６（配列番号：６）、１μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で１２００秒間、発光シグナルを読み取った。

図２０のＡに示すように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のラージクレノウフラグメント（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＬＤ９３－１ ＤＮＡポリメラーゼＩ）を、Ｈｉｓ－Ｓｉアフィニティータグの下流の融合タンパク質として発現させた。図２０のＢは、Ｈｉｓ－Ｓｉ－クレノウの溶液中での活性を、ＤＮＡ－ｐｏｌ Ｉ、Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴ２（バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｔｅａｒｏ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来）の活性と比較して示す。Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴは、初期反応速度及び全体にわたる活性に関する限り、わずかにより良好な活性速度論を示した。図２０のＣは、上記反応酵素が５００ｎｍ ＳｉＯ_２ナノ粒子に係留する場合の上記２種のＤＮＡポリメラーゼの活性の比較を示す。ここでも、Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴはより良好活性を示した。さらに、上記反応混合物が係留酵素を含んでいた場合には、クレノウとＢＳＴの両方が活性の向上を示した。

実施例１７ 種々の比率のＨｉｓ－Ｓｉ－ＡＴＰＳ／Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴ／ＮＰを使用した標的オリゴヌクレオチド検出の比較
２０μｌ ＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴ（図２０のＢに示す、種々の酵素／ＮＰの比率の）、２０μｌ ＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＡＴＰＳ、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２（配列番号：７）、１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ混合物（各３３ｍＭ）からなる反応混合物を使用して酵素活性の測定を実施した。この反応混合物を、１μｌの標的オリゴヌクレオチド（Ｒ６、１００μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で２０００秒間、発光シグナルを読み取った。

図２１のＡは、Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴ２（ＤＮＡ－Ｐｏｌ）：ＡＴＰＳの比率が０．１：１から２．５：１へと漸増する場合の実験のまとめである。図２１のＢは、Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴ２（ＤＮＡ－Ｐｏｌ）：ＮＰの比率が０．１：１から１０：１へと漸増する場合の実験のまとめである。

実施例１８ ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ（Ｈｉｓ－Ｓｉ－酵素）及びＤＮＡ捕捉オリゴヌクレオチドを使用したｍｉＲＮＡ（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）検出
２０μｌ ＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴ、２０μｌ ＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＡＴＰＳ、５μｌ ＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２（配列番号：７）、１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ混合物（各３３ｍＭ）からなる反応混合物を使用して酵素活性の測定を実施した。この反応混合物を、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的オリゴヌクレオチド（Ｒ５（配列番号：３８及び３９）またはＲ６（配列番号：３６及び３７）、１μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で２５００秒間、発光シグナルを読み取った。

図２２のＡは、製造会社（ＩＤＴ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）によって提供されたままの標的オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ及びＤＮＡ）の配列、及びそれらを検出するように設計した捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２）の配列を示す。図２２のＢは、係留酵素を使用して、ＲＮＡと相当するＤＮＡ標的オリゴヌクレオチドを検出するＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応を示す。図２２のＣは、図２２のＡに示すデータのまとめであり、計算した反応の初期速度（勾配）を示す。

実施例１９ 異なる非係留ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｉｓ－Ｓｉ－クレノウとＨｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴ）の標的オリゴヌクレオチドのミスマッチに対する感度を比較する分析
２０μｌ ＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴまたはＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－クレノウ、２０μｌ ＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＡＴＰＳ、５μｌ ＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ の捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２（配列番号：７）、１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ混合物（各３３ｍＭ）からなる反応混合物を使用して酵素活性の測定を実施した。この反応混合物を、１μｌの各標的オリゴヌクレオチド（１μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で２０００秒間、発光シグナルを読み取った。

図２３のＡに示すように、本実施例で試験した標的オリゴヌクレオチド中の、該標的オリゴヌクレオチド配列の３’末端に、漸増する割合の捕捉オリゴヌクレオチドＴ２の配列に対するミスマッチヌクレオチドを導入した（下線付き文字で示す）。Ｒ１（配列番号：１）及びＲ６（配列番号：６）オリゴヌクレオチドの両方が捕捉オリゴヌクレオチド配列とマッチするが、それらのＧＣ含量は異なるレベルである。図２３のＢは、種々のオリゴヌクレオチドに対するＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応の初期速度のまとめであり、クレノウを用いた場合及びＢＳＴを用いた場合の両方の場合において、１００％マッチの配列では、初期の反応勾配から計算される、顕著に速い速度論を示す。図２３のＣは、種々のミスマッチオリゴヌクレオチドの存在下と、１００％マッチオリゴヌクレオチドの存在下での反応速度の比を計算することによって、上記２種のＤＮＡポリメラーゼが、標的オリゴヌクレオチド中のミスマッチ含有量に対してどの程度敏感であるかの尺度が提供されることを示しており、ＢＳＴポリメラーゼはミスマッチの割合に応じて２～５倍より敏感になる。

実施例２０ 捕捉オリゴヌクレオチドが溶液中の場合と固定化される（非配向性）場合でのＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応の係留化の比較
２０μｌ ＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴまたはＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－クレノウ、２０μｌ ＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＡＴＰＳ、５μｌ ＮＰ－Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌ 捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２（配列番号：７）、１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ混合物（各３３ｍＭ）からなる反応混合物を使用して酵素活性の測定を実施した。この反応混合物を、１μｌの標的オリゴヌクレオチド（１μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で１５００秒間、発光シグナルを読み取った。

上記ＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応は、捕捉オリゴヌクレオチドを、溶液中の形態、または非特異的吸着によってＳｉＯ_２ ＮＰ上に固定化した形態（捕捉オリゴヌクレオチドをＳｉＯ_２ ＮＰと室温で３０分間インキュベートし、次いで遠心分離により洗浄して、天然タンパク質緩衝液中に保存）のいずれかで使用して実施した。図２４は、ＮＰ上に上記捕捉オリゴヌクレオチドを吸着させることにより、標的オリゴヌクレオチドを検出する該捕捉オリゴヌクレオチドの能力が著しく低下することを示す。

実施例２１ 捕捉オリゴヌクレオチドが溶液中の場合とビオチン－ストレプトアビジンを介してＳｉＯ_２ ＮＰに固定化されている場合のＴＥＴ－ｍｉＲＮＡ反応を比較する分析
２０μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＢＳＴ、２０μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ＡＴＰＳ、５μｌ Ｈｉｓ－Ｓｉ－ルシフェラーゼ、５μｌ ルシフェリン（２００ｍＭ）、５μｌの２０×ルシフェラーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、２μｌ ＡＰＳ（３０ｍＭ）、１μｌのＮＰ－捕捉オリゴヌクレオチド（Ｔ２（配列番号：７）、１００μＭ）、及び１．８μｌのｄＣＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ混合物（各３３ｍＭ）からなる反応混合物を使用して酵素活性の測定を実施した。この反応混合物を、１μｌの標的オリゴヌクレオチド（Ｒ６（配列番号：６）、１μＭ）が入った白色９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、直ちにＴＥＣＡＮプレートリーダー中に載置し、室温、４００ミリ秒の積分時間で２０００秒間、発光シグナルを読み取った。

図２５Ａは、生成した固定化可能な２種の形態の捕捉オリゴヌクレオチドを同定し、上記オリゴヌクレオチドにおいて、ビオチンタグは５’または３’末端のいずれかに結合している（ビオチン化オリゴヌクレオチドはＩＤＴ，ＣＡ，ＵＳＡから購入した）。上記３’及び５’ビオチン化オリゴヌクレオチドを、ストレプトアビジンでコーティングされたＳｉＯ_２ ＮＰ（５００ｎｍ，Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＮ，ＵＳＡ）上に、製造元の説明に従って固定化し、次いで未結合のたんぱく質を遠心分離によって３回洗浄した。ＴＥＴ－ｍＲＮＡ反応は、酵素（ＤＮＡ－Ｐｏｌ、ＡＴＰ、及びＬｕｃ）が溶液中であり、ストレプトアビジンでコーティングされた５００ｎｍ ＳｉＯ_２ ＮＰに係留した捕捉オリゴヌクレオチドを使用すると、低い活性を示した。図２５Ｂは、５’ビオチン化した捕捉オリゴヌクレオチドの存在下で、ＴＥＴ－ｍＲＮＡ酵素も（Ｓｉタグを介して）ＮＰに固定化された場合に、顕著により高い活性が得られたが、３’ビオチン化した捕捉オリゴヌクレオチドは、非常に低い活性しか示さないか、または全く活性を示さなかったことを示す。

本明細書において、好ましい実施形態を詳細に描き且つ説明してきたが、関連技術分野の当業者であれば、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な改変、追加、置換などを行うことができること、及び、したがって、これらは添付の特許請求の範囲において規定される本発明の範囲内にあると見なされることは明らかであろう。

Claims (37)

1. 試料中の標的核酸分子の検出方法であって、
   標的核酸分子を含む試料を用意する工程と、
   前記試料を、前記標的核酸分子の少なくとも一部に相補的な捕捉オリゴヌクレオチド分子と接触させて、その結果、前記捕捉オリゴヌクレオチド分子を標的ヌクレオチド分子の相補的部分にハイブリダイズさせ、二本鎖核酸分子を形成させる工程であって、前記捕捉オリゴヌクレオチド分子は、（ｉ）３０～６０塩基対の長さを有し、（ｉｉ）その３’末端に４～８塩基対のオーバーハングを有し、（ｉｉｉ）５’尾部を有し、（ｉｖ）前記３’末端と前記５’尾部との間に標的特異的部分を有し、（ｖ）４０～５０％のデオキシアデノシン二リン酸含有量を有し、（ｖｉ）前記３’末端または前記５’尾部にデオキシチミジンリン酸を有さず、且つ（ｖｉｉ）前記捕捉オリゴヌクレオチド分子のＡＴＰ含有量の４０～５０％であるＡＴＰ含有量を有する前記３’末端及び前記５’尾部を有する、工程と、
   前記二本鎖核酸分子、ポリメラーゼ、及びｄＮＴＰ混合物を接触させて、ポリメラーゼ伸長混合物を形成させる工程と、
   前記ポリメラーゼ伸長混合物を、前記標的核酸分子が伸長され遊離リン酸を放出する条件に供する工程と、
   前記放出された遊離リン酸からアデノシン三リン酸を生成させる工程と、
   前記遊離リン酸から生成した前記アデノシン三リン酸をルシフェラーゼで代謝させて、前記試料中に前記標的核酸分子が存在することを示す生物発光読み出しシグナルを生成させる工程と
   を含む前記方法。
2. ＤＮＡポリメラーゼが固体支持体に結合している、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｈｉｓ－Ｓｉ、Ｈｉｓ、Ｓｉ、ビオチン、ストレプトアビジン、Ｐｔ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｉｓ－Ｐｔ、Ｈｉｓ－Ａｕ、Ｈｉｓ－Ａｇ、ＧＳＴ、抗体、及びエピトープタグからなる群より選択されるリンカーによって前記固体支持体に結合している、請求項２に記載の方法。
4. 前記ルシフェラーゼが固体支持体に結合している、請求項１に記載の方法。
5. 前記ルシフェラーゼが、Ｈｉｓ－Ｓｉ、Ｈｉｓ、Ｓｉ、ビオチン、ストレプトアビジン、Ｐｔ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｉｓ－Ｐｔ、Ｈｉｓ－Ａｕ、Ｈｉｓ－Ａｇ、ＧＳＴ、抗体、及びエピトープタグからなる群より選択されるリンカーによって前記固体支持体に結合している、請求項４に記載の方法。
6. 前記アデノシン三リン酸を生成させる工程が、前記放出された遊離リン酸を、結合したグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ－ホスホグリセリン酸キナーゼの酵素反応に供して、アデノシン三リン酸を生成させることを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記放出された遊離リン酸を、結合したグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ－ホスホグリセリン酸キナーゼの酵素反応に供する工程が、アデノシン二リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、及びグリセルアルデヒド３－リン酸を接触させて、前記結合したグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ－ホスホグリセリン酸キナーゼの酵素反応を達成させることを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ及び前記ホスホグリセリン酸キナーゼが固体支持体に結合している、請求項７に記載の方法。
9. 前記アデノシン三リン酸を生成させる工程が、前記放出された遊離リン酸をアデノシン三リン酸スルフリラーゼの存在下でアデノシン５’－ホスホ硫酸と接触させて、アデノシン三リン酸を生成させることを含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記アデノシン三リン酸スルフリラーゼが固体支持体に結合している、請求項９に記載の方法。
11. 前記標的核酸分子が、前記試料中に１リットル当たり１０^－５モル未満の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
12. 前記標的核酸分子がマイクロＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
13. 前記供する工程が０～１００℃の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
14. 前記供する工程が２５～４０℃の温度で実施される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ポリメラーゼが、全長ＢＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメントＢＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、ＢＳＴ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウフラグメント（３’→５’エキソ）、及びＤＮＡポリメラーゼＩ（ラージクレノウフラグメント）である、請求項１に記載の方法。
16. 前記生物発光読み出しシグナルを定量化して、前記試料中の前記標的核酸分子の存在または濃度を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
17. 前記試料中の前記標的核酸分子の存在が決定される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記試料中の前記標的核酸分子の存在が、
    生物発光シグナル生成の初期速度を計算する工程と、
    ピーク生物発光を達成するために必要な期間を計算する工程と、
    生物発光シグナルのピークの大きさまたは時間ゼロからピーク生物発光までの積分生物発光シグナルを計算する工程と
    を含む手順によって決定される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記試料中の前記標的核酸分子の濃度が決定される、請求項１６に記載の方法。
20. デオキシアデノシン三リン酸が前記ポリメラーゼ伸長混合物から除外される、請求項１に記載の方法。
21. 前記試料が、血液、尿、脳脊髄液、唾液、組織、及び合成材料からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
22. 溶液中で実施される、請求項１に記載の方法。
23. 複数種の標的核酸分子を検出するために、複数種の捕捉オリゴヌクレオチド分子が提供される、請求項１に記載の方法。
24. 試料中の標的核酸分子の検出方法であって、
    標的核酸分子を含む試料を用意する工程と、
    前記試料を、前記標的核酸分子の少なくとも一部に相補的な捕捉オリゴヌクレオチド分子と接触させて、その結果、前記捕捉オリゴヌクレオチド分子を前記標的核酸分子の相補的部分にハイブリダイズさせ、二本鎖核酸分子を形成させる工程と、
    前記二本鎖核酸分子、ポリメラーゼ、及びｄＮＴＰ混合物を接触させて、ポリメラーゼ伸長混合物を形成させる工程と、
    前記ポリメラーゼ伸長混合物を、前記標的核酸分子が伸長され遊離リン酸を放出する条件に供する工程と、
    前記放出された遊離リン酸からアデノシン三リン酸を酵素的に生成させる工程と、
    前記遊離リン酸から生成した前記アデノシン三リン酸をルシフェラーゼで代謝させて、前記試料中に前記標的核酸分子が存在することを示す生物発光読み出しシグナルを生成させる工程であって、ＤＮＡポリメラーゼ、ルシフェラーゼ、及びアデノシン三リン酸を生成する酵素はそれぞれ固体支持体に結合している、工程と
    を含む前記方法。
25. 前記捕捉オリゴヌクレオチド分子が、３０～６０塩基対の長さを有する、請求項２４に記載の方法。
26. 前記捕捉オリゴヌクレオチド分子が、その３’末端に４～８塩基対のオーバーハングを有する、請求項２４に記載の方法。
27. 前記捕捉オリゴヌクレオチド分子が５’尾部を有する、請求項２６に記載の方法。
28. 前記捕捉オリゴヌクレオチド分子が、前記３’末端と前記５’尾部との間に標的特異的部分を有する、請求項２７に記載の方法。
29. 前記捕捉オリゴヌクレオチド分子が、４０～５０％のデオキシアデノシン二リン酸含有量を有する、請求項２４に記載の方法。
30. 前記捕捉オリゴヌクレオチド分子が、前記３’末端または前記５’尾部にデオキシチミジンリン酸を有さない、請求項２７に記載の方法。
31. 前記捕捉オリゴヌクレオチド分子が、共に前記捕捉オリゴヌクレオチド分子のＡＴＰ含有量の４０～５０％であるＡＴＰ含有量を有する３’末端及び５’尾部を有する、請求項２４に記載の方法。
32. 複数種の標的核酸分子を検出するために、複数種の捕捉オリゴヌクレオチド分子が提供される、請求項２４に記載の方法。
33. 試料中の標的核酸分子を検出するためのキットであって、
    前記標的核酸分子の少なくとも一部に相補的であり、その結果、前記標的核酸分子の相補的部分にハイブリダイズし、二本鎖核酸分子を形成する、捕捉オリゴヌクレオチド分子と、
    固体支持体に結合したポリメラーゼと、
    ｄＮＴＰ混合物と、
    放出された遊離リン酸からアデノシン三リン酸を生成させるための、固体支持体に結合した酵素と、
    生物発光読み出しシグナルを生成させるための、固体支持体に結合したルシフェラーゼと
    を含む前記キット。
34. 複数種の標的核酸分子を検出するための複数種の捕捉オリゴヌクレオチド分子を含む、請求項３３に記載のキット。
35. 試料中の標的核酸分子を検出するためのキットであって、
    前記標的核酸分子の少なくとも一部に相補的であり、その結果、前記標的核酸分子の相補的部分にハイブリダイズし、二本鎖核酸分子を形成する、捕捉オリゴヌクレオチド分子であり、（ｉ）３０～６０塩基対の長さを有し、（ｉｉ）その３’末端に４～８塩基対のオーバーハングを有し、（ｉｉｉ）５’尾部を有し、（ｉｖ）前記３’末端と前記５’尾部との間に標的特異的部分を有し、（ｖ）４０～５０％のデオキシアデノシン二リン酸含有量を有し、（ｖｉ）前記３’末端または前記５’尾部にデオキシチミジンリン酸を有さず、且つ（ｖｉｉ）前記捕捉オリゴヌクレオチド分子のＡＴＰ含有量の４０～５０％であるＡＴＰ含有量を有する前記３’末端及び前記５’尾部を有する、前記捕捉オリゴヌクレオチド分子と、
    ポリメラーゼと、
    ｄＮＴＰ混合物と、
    放出された遊離リン酸からアデノシン三リン酸を生成させるための酵素と、
    生物発光読み出しシグナルを生成させるためのルシフェラーゼと
    を含む前記キット。
36. 複数種の標的核酸分子を検出するための複数種の捕捉オリゴヌクレオチド分子を含む、請求項３５に記載のキット。
37. 捕捉オリゴヌクレオチド分子を含む組成物であって、前記捕捉オリゴヌクレオチド分子が、（ｉ）３０～６０塩基対の長さを有し、（ｉｉ）その３’末端に４～８塩基対のオーバーハングを有し、（ｉｉｉ）５’尾部を有し、（ｉｖ）前記３’末端と前記５’尾部との間に標的特異的部分を有し、（ｖ）４０～５０％のデオキシアデノシン二リン酸含有量を有し、（ｖｉ）前記３’末端または前記５’尾部にデオキシチミジンリン酸を有さず、且つ（ｖｉｉ）前記捕捉オリゴヌクレオチド分子のＡＴＰ含有量の４０～５０％であるＡＴＰ含有量を有する前記３’末端及び前記５’尾部を有する、前記組成物。

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