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JP2022524166A - リボ核酸の無細胞生産 - Google Patents

リボ核酸の無細胞生産 Download PDF

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Abstract

本発明は、核酸、詳細にはＲＮＡ、具体的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のインビトロ生産に関する。
【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、その全体が本明細書に組み込まれる２０１９年３月２９日出願の米国特許仮出願第６２／８２６，９８３号の優先権を主張する。
本発明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる「ヌクレオシド三リン酸及びリボ核酸生産のための方法及び組成物」と標題された２０１８年１０月１１日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５５３５に開示の方法に関する。
技術分野
本発明は、核酸、詳細にはＲＮＡ、具体的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、より具体的には真核ｍＲＮＡのインビトロ生産に関する。本明細書に開示の試薬及び方法は、低コスト、高効率、及び商業的に有用な規模でのｍＲＮＡのインビトロ生産を可能にする。
リボ核酸（ＲＮＡ）は生物に偏在しており、細胞において情報の重要なメッセンジャーの役を務め、タンパク質を調節及び合成するためのＤＮＡからの指示を担っている。ＲＮＡは生物工学において重要であり、それというのも、細胞におけるｍＲＮＡレベルの合成調節が、農業作物保護、抗がん治療薬、遺伝子療法、ワクチン、免疫系調節、疾患検出、及び動物の健康などの分野において有用であるためである。機能性一本鎖（例えば、ｍＲＮＡ）及び二本鎖ＲＮＡ分子は、生細胞及びインビトロで、精製組み換え酵素及び精製ヌクレオチド三リン酸を使用して生産されている（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる欧州特許第１６３１６７５号、米国特許出願公開第２０１４／０２７１５５９Ａ１号、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５５３５を参照されたい）。それにもかかわらず、広範な商業用途を可能にする規模でのＲＮＡ、具体的にはｍＲＮＡの生産には現在、大変な費用が掛かる。より安価であり；より速成であり；好ましくは、製品安全性及び品質に有利であるように、プロセスのさらに安定した制御を得る手段として専門試薬の外部供給者を必要とせずに、容易に実行され；かつ従来技術方法と比較可能な品質及びグレードのＲＮＡ、具体的にはｍＲＮＡを生成する方法が必要とされている。
本明細書において、インビトロでＲＮＡ、詳細にはｍＲＮＡを商業的に有用な量及びコストで生産するための試薬及び方法を提供する。
下記のとおり、一態様では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が５’ヌクレオシド一リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；ならびに（ｃ）ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｉｉ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ポリＡテールを備えたｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレート、ならびにｖｉｉｉ）１つまたは複数のキャッピング試薬を、ｍＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後にＤＮＡを消化する条件下で添加することを含む。
第２の態様では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、この方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が５’ヌクレオシド一リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；（ｃ）ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナーならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｉｉ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレート、ならびにｖｉｉｉ）１つまたは複数のキャッピング試薬を、キャップドＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後にＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびにｄ）（ｉ）ステップ（ｃ）において生産された前記反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、ｍＲＮＡを生産する条件下でさらにインキュベートすること、または（ｉｉ）ステップ（ｃ）の反応混合物からのＲＮＡポリメラーゼを、不活性化または物理的分離により除去し、続いて、反応混合物をポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でさらにインキュベートすることにより、ｍＲＮＡを生産することを含む。
第３の態様では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が５’ヌクレオシド一リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；（ｃ）ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｉｉ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ポリＡテールを備えたｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレートを、非キャップドＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択で、ｖｉｉｉ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後にＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびに（ｄ）バッファー条件をステップ（ｃ）からの前記反応混合物から交換し、かつ前記反応混合物をキャッピング酵素、ＧＴＰ、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、ｍＲＮＡを生産することを含む。
第４の態様では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が５’ヌクレオシド一リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；（ｃ）ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｉｉ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、及びｖｉｉ）ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレートを、非キャップド非テール化ＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｖｉｉｉ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後にＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ｄ）（ｉ）さらに、ステップ（ｃ）で生産された前記反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、非キャップドＲＮＡを生産する条件下でインキュベートすること；または（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼを、ステップ（ｃ）の反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、非キャップドＲＮＡを、反応混合物をポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でさらにインキュベートすることにより生産すること；ならびにｅ）バッファー条件をステップ（ｃ）からの前記反応混合物から交換し、かつ前記反応混合物を、キャッピング酵素、ＧＴＰ、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、ｍＲＮＡを生産することを含む。
第５の態様では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；ならびに（ｃ）ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ならびに任意選択でｉｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ポリＡテールを備えたｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレート、ならびにｖｉｉｉ）１つまたは複数のキャッピング試薬を、ｍＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産の後にＤＮＡを消化する条件下で添加することを含む。
第６の態様では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；（ｃ）ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナーならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ならびに任意選択でｉｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレート、ならびにｖｉｉｉ）１つまたは複数のキャッピング試薬を、キャップドＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後にＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびにｄ）（ｉ）ステップ（ｃ）で生産された前記反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、ｍＲＮＡを生産する条件下でさらにインキュベートすること、または（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼを、ステップ（ｃ）の反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、ｍＲＮＡを、反応混合物をポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でさらにインキュベートすることにより生産することを含む。
第７の態様では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；（ｃ）ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ならびに任意選択でｉｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ及びｖｉｉ）ポリＡテールを備えたｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレートを、非キャップドＲＮＡを生産する条件下で添加し；さらに任意選択でｖｉｉｉ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産の後にＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびに（ｄ）バッファー条件をステップ（ｃ）からの前記反応混合物から交換し、かつ前記反応混合物を、キャッピング酵素、ＧＴＰ、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、ｍＲＮＡを生産することを含む。
第８の態様では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；（ｃ）ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ならびに任意選択でｉｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ及びｖｉｉ）ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレートを、非キャップド非テール化ＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｖｉｉｉ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後にＤＮＡを消化する条件下で添加すること；（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された前記反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、非キャップドＲＮＡを生産する条件下でさらにインキュベートするか；または（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼを、ステップ（ｃ）の反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、非キャップドＲＮＡを、反応混合物をポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でさらにインキュベートすることにより生産すること；ならびにｅ）バッファー条件をステップ（ｃ）からの前記反応混合物から交換し、かつ前記反応混合物を、キャッピング酵素、ＧＴＰ、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、ｍＲＮＡを生産することを含む。
本発明のこれら及び他の特徴及び利点は、添付の特許請求の範囲と一緒に、次の詳細な説明から、さらに完全に理解されるであろう。特許請求の範囲は、特許請求の範囲における詳述により定義され、本明細書に記載の特徴及び利点の具体的な論述により定義されるものではないことに注意する。
ｍＲＮＡを生産する方法の図。ＤＮＡテンプレートにおいてコードされるポリＡテール及びキャッピング試薬を介してのキャッピング。 ポリＡテールの酵素的添加及びキャッピング試薬を介してのキャッピング。 ＤＮＡテンプレートにおいてコードされるポリＡテール及びキャッピング酵素を介してのキャッピング。 ポリＡテールの酵素的添加及びキャッピング酵素を介してのキャッピング。 ＲＮＡを生産するための生合成経路。出発物質として細胞ＲＮＡを使用して、ＮＴＰ、及び下流のＲＮＡを生産するための生合成経路が図示されている。この経路では、リボヌクレアーゼが、細胞ＲＮＡをＮＭＰまたはＮＤＰに分解するために使用される（ｂ）。 ＲＮＡ産物１。ＲＮＡポリメラーゼと、解重合により生産されたＮＭＰ（－ＮＭＰ）または精製ＮＭＰ（＋ＮＭＰ、それぞれ４ｍＭ）とを含む反応物中で生産されたＲＮＡ産物のアガロースゲルが示されている。略語：－２ｌｏｇ：２－ｌｏｇ ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＮＭＰ：５’－ＮＭＰの等モル混合物、ＲＮＡ Ｐｏｌ：熱安定性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、テンプレート１：線状ＤＮＡテンプレート、テンプレート２：プラスミドＤＮＡテンプレート。 ＲＮＡ産物２。ＲＮＡポリメラーゼと、精製ＲＮＡの解重合により生産されたＮＭＰとを含む反応物中で生産されたＲＮＡ産物のアガロースゲルが示されている。陰性対照として、ＲＮＡポリメラーゼの非存在下で反応を行った。略語：－２ｌｏｇ：２－ｌｏｇ ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＮＭＰ：５’－ヌクレオシド一リン酸の等モル混合物、ＲＮＡ Ｐｏｌ：熱安定性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、テンプレート１：線状ＤＮＡテンプレート、テンプレート２：プラスミドＤＮＡテンプレート。 ＲＮＡ産物３。３７℃で野生型ポリメラーゼ（Ｗ）または熱安定性ポリメラーゼ変異体（Ｔ）を使用する無細胞ＲＮＡ（ＣＦＲ）合成により生産されたＲＮＡ産物のアガロースゲルが示されている。略語：－２ｌｏｇ：２－ｌｏｇ ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｗ：野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔ：熱安定性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、テンプレート１：線状ＤＮＡテンプレート、テンプレート２：プラスミドＤＮＡテンプレート。 経時的に生産されるヌクレオチド。精製ＲＮアーゼＲまたはヌクレアーゼＰ１を使用しての様々な供給源のＲＮＡの解重合中に経時的に生産される酸可溶性ヌクレオチド（ｍＭ）のグラフ。酸可溶性ヌクレオチドをＵＶ吸光度により測定した。 ヌクレアーゼＰ１により生産される利用可能なＮＭＰ。ヌクレアーゼＰ１を使用してのＥ．ｃｏｌｉまたは酵母からのＲＮＡの解重合中に経時的に生産される利用可能な５’－ＮＭＰのパーセントのグラフが示されている。利用可能な５’－ＮＭＰのパーセントを液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）により決定した。 種々の溶解産物温度の分析。Ｅ．ｃｏｌｉからの溶解産物の種々の温度にわたるＲＮＡ解重合でのヌクレオム（ｎｕｃｌｅｏｍｉｃ）プロファイルプロット。２０の分析物の累積濃度が示されている。ヌクレオシドは、白色斑点パターンで示されており、わずかに生産された。５０℃でのデータも収集したが、図示されていない。 ＮＴＰの無細胞合成の分析。４８℃での１時間のインキュベーション後に、ヌクレオチド供給源にかかわらず、ＮＴＰの無細胞合成が同様のＮＴＰ滴定量をもたらすことを示すグラフが提供されている。ヌクレオチドの各供給源（細胞ＲＮＡ、精製ＮＭＰ、または精製ＮＤＰ）について、約４ｍＭの各ヌクレオチドを得るために十分な量の基質を反応物に添加した。例えば、ＮＤＰとの反応は、４ｍＭのＡＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、及びＵＤＰをそれぞれ含む。 ＣＦＲ ｍＲＮＡトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現。インビトロ転写により生産されるｍＲＮＡが対照として示されている。蛍光顕微鏡画像が示されている。 異なる非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡから生じたＧＦＰ発現の定量化。相対蛍光単位（ＲＦＵ）が示されている。ＵＴＲ供給遺伝子：ＨＳＤ、５’ヒドロキシステロールデヒドロゲナーゼ、３’アルブミン；ＣＯＸ、５’シトクロムオキシダーゼ、３’アルブミン；ＨＢＧ、５’，３’ヒトβ－グロビン；ＸＢＧ、５’，３’キセノパスβ－グロビン。 ｍＲＮＡの毛細管ゲル電気泳動分析。インビトロ転写（ＩＶＴ）及びＣＦＲにより生産されたｍＲＮＡについての毛細管ゲル電気泳動結果が、目的のｍＲＮＡ種を表す全核酸に対する各試料におけるパーセンテージと共に示されている。 ＣＦＲまたはＩＶＴ生産されたＲＮＡにおけるｍＲＮＡ。イムノブロットが示されている。Ｒｅｆは、商業的に利用可能な基準ｍＲＮＡ。 ｍＲＮＡ調製物の内毒素分析。１ｍＬあたりの内毒素単位（ＥＵ）が示されている。 逆相イオン対高速液体クロマトグラフィー後のｍＲＮＡの収率及び組成。クロマトグラムならびに核酸、タンパク質、塩、未反応ＮＭＰ、及び他の乾燥固体の質量パーセントの分析が試料について、目的のｍＲＮＡ種を表す核酸のパーセンテージ（上部）及び全体純度（試料中の核酸％×目的の種である核酸％、下部）と共に示されている。 酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）－ＣＦＲ ｍＲＮＡを使用してのＨｅＬａ抽出物における血球凝集素（ＨＡ）の生産の定量化。濃度はｎｇ／ｍＬで示されている。ＨＢＧ（５’，３’ヒトβ－グロビン）及びＸＢＧ（５’，３’キセノパスβ－グロビン）は、異なるＵＴＲを表す。粗製及びＨＰＬＣ精製試料の両方が示されている。 ＣＦＲ ｍＲＮＡを使用してのＨｅＬａ抽出物におけるＨＡの生産のウェスタンブロット。インビトロ転写を介して生産されたｍＲＮＡからの生産に対する比較が示されている。矢印は、ＨＡタンパク質の予測サイズ（６３ｋＤａ）を強調している。 ＣＦＲ ｍＲＮＡを使用してのＨｅＬａ抽出物におけるホタルルシフェラーゼ発現のルミネセンス定量化。ＨＢＧ（５’，３’ヒトβ－グロビン）及びＸＢＧ（５’，３’キセノパスβ－グロビン）は、異なるＵＴＲを表す。－ｍＲＮＡ、ＲＮＡなし（陰性対照）。 ＣＦＲ ｍＲＮＡを使用してのＨｅＬａ細胞におけるホタルルシフェラーゼ発現のルミネセンス定量化。ＨＢＧ（１）及びＨＢＧ（２）は、示されているとおり、高レベル及び低レベルのリポフェクタミンを表す。複数の時点が示されている。 ＣＦＲ ｍＲＮＡを使用してのマウスにおけるルシフェラーゼ発現のインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）画像。ＬＮＰ、ナノ粒子。ＧｅｎＶｏｙ、市販の配合物。矢印は、ルシフェラーゼの発現を示すルミネセンスの領域を強調している。 ＣＦＲ ｍＲＮＡを使用してのインビボでのルシフェラーゼ発現のルミネセンス定量化。投与後０～７２時間の測定値が、ＩＶＴ ｍＲＮＡからの結果に対して示されている（ラベルを参照されたい）。 ＡＲＣＡキャッピングを伴うヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ。（Ａ）ＣＦＲ生産されたｍＲＮＡ対ＩＶＴ生産されたｍＲＮＡの純度；（Ｂ）ヌクレオシド修飾及びキャッピングの定量化（ＧＬＢ － ＧｒｅｅｎＬｉｇｈｔ Ｂｉｏ；ＩＶＴ － インビトロ転写）。 マウスにおける標的遺伝子発現。Ｄ－ルシフェリンの注射後５、２４、４８、及び７２時間目の標的遺伝子発現。ｍＲＮＡの特許権下脂質ナノ粒子製剤を０．２μｇ用量（左）及び１μｇ用量でＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０／群、ＩＭ）に処方することにより、遺伝子発現が達成された。 マウスにおける血清免疫。不活性化Ｈ１Ｎ１で処置された陽性対照マウスに対する、３０μｇ及び３μｇ用量の血球凝集素ｍＲＮＡで処置されたマウスからの力価。円形は、その後の攻撃研究のために選択されたマウスを示している。 体重変化。ＨＡ ｍＲＮＡ（３０μｇ）または不活性化Ｈ１Ｎ１を投与されたマウスはインフルエンザ関連体重減少から防御された一方で、未処置マウス（円形）及びＦＬｕｃ ｍＲＮＡで処置されたマウス（３０μｇ；四角形）は体重減少を示した。 ＲＮＡ生産。（Ａ）非キャップドＩＶＴ生産されたｍＲＮＡ（参照）の電気泳動図；（Ｂ）細胞ＲＮＡ由来ヌクレオチドを使用してＣＦＲ生産されたｍＲＮＡの電気泳動図；及び（Ｃ）精製ヌクレオシド一リン酸の等モル混合物を使用して非キャップドＣＦＲ生産されたｍＲＮＡの電気泳動図（それぞれ５ｍＭ）。 ＣＦＲ生産されたｍＲＮＡ及びポリＡテール長さ。０、５０、１００、または１５０ヌクレオチド長さのポリＡテールを備えた、ＣＦＲ生産されたｍＲＮＡの電気泳動図の重ね合わせ。
好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書では、ＲＮＡ、具体的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、より具体的には真核ｍＲＮＡを無細胞生産（生合成）するための方法、組成物、細胞、構築物、及びシステムを提供する。以下でさらに具体的に記載するとおりのある特定の実施形態では、本開示は、ＲＮＡのための構成単位を供給するために、安価で規模変更可能な出発物質（または「バイオマス」）を使用する、無細胞ＲＮＡ（ＣＦＲ）生産のための方法を提供する。以下でさらに具体的に記載するとおりのある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、次に一般的に記載される本開示の方法のステップを含む。
細胞ＲＮＡのヌクレオシド一リン酸への変換
ＲＮＡのヌクレオシド一リン酸「構成単位」を生産するために、細胞（内因性）ＲＮＡを無細胞反応混合物中で、細胞ＲＮＡ（特に、リボソームまたはｒＲＮＡ；メッセンジャーまたはｍＲＮＡ；及びトランスファーＲＮＡまたはｔＲＮＡを含む）をその構成５’ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）に解重合する１つまたは複数の酵素と共にインキュベートする。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ解重合酵素は、細胞ＲＮＡを５’－ＮＭＰに解重合するリボヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼＰ１、ＲＮアーゼＲ）である。細胞をＲＮＡの供給源として、ヌクレアーゼを発現するように操作することができるか、またはヌクレアーゼは、別の細胞により産生されて、それを反応に導入することができる。例えば、酵母からの細胞ＲＮＡを、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍにより産生されたヌクレアーゼＰ１により解重合してもよいであろう。ヌクレアーゼＰ１は、一本鎖ＲＮＡ及びＲＮＡに対するＤＮＡを５’ヌクレオシド一リン酸へと加水分解する亜鉛依存性単一ヌクレアーゼである。この酵素は塩基特異性を有さない。
その後（すなわち、細胞ＲＮＡが解重合されたら）、一部の実施形態では、ヌクレアーゼを排除するか（例えば、濾過、沈殿、捕捉、及び／またはクロマトグラフィーなどの物理的分離により）、または不活性化する（例えば、温度、ｐＨ、塩、界面活性剤、アルコールまたは他の溶媒、及び／または化学的阻害剤により）。本明細書に記載のＲＮＡ合成方法をインビトロ転写（ＩＶＴ）のＲＮＡ合成方法と対比するために、本明細書に記載のＲＮＡ合成方法を「無細胞」ＲＮＡ合成と表示する。ＩＶＴ法も技術的には無細胞であるが、この方法は、三リン酸化されているヌクレオチド基質の直接的な添加に依存しており、したがって、追加のエネルギーを必要としない。「無細胞」という用語は、対比のために、三リン酸化されていることを必要としないヌクレオチド基質（例えば、５’－ヌクレオシド一リン酸及び／またはヌクレオシド二リン酸）を許容するＲＮＡ合成法を表示するために使用され、それというのも、この方法は、リン酸化度が低いヌクレオチドをそれらのそれぞれの三リン酸化形態へと変換するために、１つのキナーゼ酵素（または複数の酵素）及びエネルギー供給源（例えば、ポリリン酸またはヘキサメタリン酸のようなリン酸ドナー）を供給するためである。
細胞ＲＮＡのヌクレオシド二リン酸への変換
他の実施形態では、細胞ＲＮＡをヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）に解重合する。代替の実施形態では、ＲＮＡ解重合酵素は、リン酸の存在下で細胞ＲＮＡをＮＤＰに解重合するリボヌクレアーゼ（例えば、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ））である。細胞をＲＮＡの供給源として、細胞特異的ヌクレアーゼを発現するように操作することができるか、またはヌクレアーゼは、別の細胞により産生されて、それを反応に導入することができる。その後（すなわち、細胞ＲＮＡが解重合されたら）、一部の実施形態では、ヌクレアーゼを排除するか（例えば、濾過、沈殿、捕捉、及び／またはクロマトグラフィーなどの物理的分離により）、または不活性化する（例えば、温度、ｐＨ、塩、界面活性剤、アルコールまたは他の溶媒、及び／または化学的阻害剤により）。
ヌクレオシド三リン酸の生産
解重合の後に、ＮＭＰまたはＮＤＰのＮＴＰ（ヌクレオシド三リン酸）へのリン酸化が生じる条件下で、一部の実施形態では、混合物中の個々のＮＭＰ（すなわち、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰ）のそれぞれをリン酸化するために特異的なヌクレオシド一リン酸キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫ）、及びポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）を含む複数または混合物のキナーゼ酵素を使用して、無細胞反応混合物をインキュベートする。解重合反応がＮＤＰを生産する場合には（例えば、ＰＮＰアーゼを使用するとき）、ＮＤＫ及びＰＰＫとの可逆的反応を介して生成したあらゆるＮＭＰを回収するために、混合物は、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫ）、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）、及び任意選択で、１つまたは複数のヌクレオシド一リン酸キナーゼからなるであろう。キナーゼは、発酵において高い力価で生産することができる（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において）。次いで、細胞を溶解して（例えば、高圧均質化を使用して）、キナーゼを含有する細胞抽出物を生産することができる。次いで、細胞抽出物中に存在する不所望な酵素活性（特に、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ及び／またはヒドロラーゼ）を、キナーゼ含有細胞抽出物から、例えば、加熱により、キナーゼ活性を不活性化することなく除去する（すなわち、排除または不活性化する）；ある特定の実施形態では、熱を使用して、そのような不所望な酵素活性を不活性化する場合、キナーゼは、キナーゼ活性を含む調製物をもたらす、その熱安定性バリアントであり得る。ある特定の実施形態では、不所望な酵素活性を排除するか（例えば、濾過、沈殿、捕捉、及び／またはクロマトグラフィーなどの物理的分離により）、または不活性化する（例えば、温度、ｐＨ、塩、界面活性剤、アルコールまたは他の溶媒、及び／または化学的阻害剤により）。次いで、ＮＭＰまたはＮＤＰを、調製物と共に、エネルギー供給源（例えば、ヘキサメタリン酸などのポリリン酸）の存在下でインキュベートして、無細胞反応混合物中でＮＴＰを生産する。最小限でも、ＰＰＫ及びエネルギー供給源が、ＮＭＰまたはＮＤＰをＮＴＰに変換するために必要とされる。任意選択で、ＮＤＫ及び個別のＮＭＰのそれぞれに特異的であるヌクレオシド一リン酸キナーゼが含まれる。
ＲＮＡへの重合
ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）及び操作されたテンプレート（例えば、操作細胞により発現されて、無細胞反応混合物の細胞構成成分として含まれるか、または無細胞反応混合物に後で添加されるＤＮＡテンプレート）を使用して、上記のとおりに生産されるＮＴＰを後で、または同時に、ＲＮＡへと重合させることができる（同じ反応混合物中または別の反応混合物中のいずれかで）。真核ｍＲＮＡを生産するための一部の実施形態では、テンプレートでコードされる配列の３’末端にポリアデニラート配列が続き、したがって、生じるＲＮＡが真核ｍＲＮＡに特徴的なポリアデニラート（ポリＡ）テールを含むＤＮＡテンプレートを提供する。本明細書で使用される場合、非テール化という用語は、「ポリＡテールを含まないＲＮＡ」を説明するために使用される。別法では、テンプレートでコードされる配列の３’末端に位置するポリアデニラート配列をコードしないＤＮＡテンプレートでは、ポリＡポリメラーゼを添加し、かつＡＴＰの存在下でインキュベートすることにより、ポリＡテールを酵素的に付加することができる。ＡＴＰを直接的に添加することもできるであろうし、またはポリリン酸キナーゼ及びポリリン酸を使用してＡＭＰ及び／またはＡＤＰをリン酸化することにより生産することもできるであろう。真核ｍＲＮＡ生産はさらに、５’キャップの付加を伴い、これは、以下でより具体的に記載するとおり、当技術分野で公知のキャッピング酵素またはキャッピング試薬を使用して達成することができる。本明細書で使用される場合、非キャップドという用語は、キャップを含まないＲＮＡを意味する。
合成されるＲＮＡ
下記のとおり、一実施形態では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が５’ヌクレオシド一リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；ならびに（ｃ）ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｉｉ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ポリＡテールを備えたｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレート、ｖｉｉｉ）１つまたは複数のキャッピング試薬をｍＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産の後にＤＮＡを消化する条件下で添加することを含む。
第２の実施形態では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が５’ヌクレオシド一リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；（ｃ）ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナーならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｉｉ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）非テール化ＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレート、ならびにｖｉｉｉ）１つまたは複数のキャッピング試薬を、キャップドＲＮＡを生産する条件下で添加し；さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産の後にＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびにｄ）（ｉ）ステップ（ｃ）で生産された前記反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、ｍＲＮＡを生産する条件下でさらにインキュベートするか、または（ｉｉ）不活性化または物理的分離により、ＲＮＡポリメラーゼをステップ（ｃ）の反応混合物から除去し、続いて、反応混合物をポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でさらにインキュベートすることにより、ｍＲＮＡを生産することを含む。
第３の実施形態では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が５’ヌクレオシド一リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；（ｃ）ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｉｉ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ポリＡテールを備えたｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレートを、非キャップドＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｖｉｉｉ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産の後にＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびに（ｄ）バッファー条件をステップ（ｃ）からの前記反応混合物から交換し、かつ前記反応混合物を、キャッピング酵素、ＧＴＰ、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、ｍＲＮＡを生産することを含む。
第４の実施形態では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が５’ヌクレオシド一リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；（ｃ）ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｉｉ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレートを、非キャップド非テール化ＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｖｉｉｉ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後にＤＮＡを消化する条件下で添加し；ｄ）（ｉ）ステップ（ｃ）で生産された前記反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、非キャップドＲＮＡを生産する条件下でさらにインキュベートするか；または（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼを、ステップ（ｃ）の反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でさらにインキュベートすることにより、非キャップドＲＮＡを生産すること；ならびにｅ）バッファー条件をステップ（ｃ）からの前記反応混合物から交換し、前記反応混合物を、キャッピング酵素、ＧＴＰ、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、ｍＲＮＡを生産することを含む。
第５の実施形態では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；ならびに（ｃ）ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ならびに任意選択でｉｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ポリＡテールを備えたｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレート、ｖｉｉｉ）１つまたは複数のキャッピング試薬を、ｍＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産の後にＤＮＡを消化する条件下で添加することを含む。
第６の実施形態では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；（ｃ）ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー、ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ならびに任意選択でｉｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）非テール化ＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレート、ならびにｖｉｉｉ）１つまたは複数のキャッピング試薬を、キャップドＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後にＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびにｄ）（ｉ）ステップ（ｃ）で生産された前記反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、ｍＲＮＡを生産する条件下でさらにインキュベートするか、または（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼを、ステップ（ｃ）の反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、反応混合物をポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でさらにインキュベートすることにより、ｍＲＮＡを生産することを含む。
第７の実施形態では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が、ヌクレオシド二リン酸を含むこと；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；（ｃ）ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ならびに任意選択でｉｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ及びｖｉｉ）ポリＡテールを備えたｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレートを、非キャップドＲＮＡを生産する条件下で添加し；さらに任意選択でｖｉｉｉ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後にＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびに（ｄ）バッファー条件をステップ（ｃ）からの前記反応混合物から交換し、かつ前記反応混合物を、キャッピング酵素、ＧＴＰ、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、ｍＲＮＡを生産することを含む。
第８の実施形態では、本開示は、真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法を特徴とし、その方法は、（ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートして、その際、生じる第１の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含み；（ｂ）前記反応混合物を、ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；（ｃ）ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ならびに任意選択でｉｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ならびにｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ及びｖｉｉ）ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレートを、非キャップド非テール化ＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｖｉｉｉ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後にＤＮＡを消化する条件下で添加すること；（ｄ）ステップ（ｃ）で生産された前記反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、非キャップドＲＮＡを生産する条件下でさらにインキュベートするか；または（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼを、不活性化または物理的分離によりステップ（ｃ）の反応混合物から除去し、続いて、反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でさらにインキュベートすることにより、非キャップドＲＮＡを生産すること；ならびにｅ）バッファー条件をステップ（ｃ）からの前記反応混合物から交換し、かつ前記反応混合物を、キャッピング酵素、ＧＴＰ、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、ｍＲＮＡを生産することを含む。
さらなる実施形態では、前記の実施形態のそれぞれで、ステップ（ｃ）（ｉ）～（ｃ）（ｖ）を、同時にではなく、（ｃ）の残りのステップの前に実行して、ヌクレオチド三リン酸を生産することができる。
前記の実施形態では、第２の反応混合物を、第２の反応混合物を混合するか、または列挙された構成成分を第１の反応混合物に添加して、第２の反応混合物を作製することにより得ることができる。
さらに、上記のとおり、各実施形態のステップ（ａ）及び（ｂ）に記載のとおりの細胞ＲＮＡの解重合以外の方法により生産されたヌクレオチド（例えば、発酵プロセス、化学的プロセス、または化学酵素的プロセスから得られたヌクレオチド）も、ステップ（ｃ）においてヌクレオチドとして使用することができ、それにより、各実施形態のステップ（ａ）及び（ｂ）の必要性が排除される。そのようなヌクレオチドには、ＮＭＰ、ＮＤＰ、ＮＴＰ、またはそれらの混合物が含まれ得る。さらに、そのようなヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの混合物のうちの１つまたは複数からなってよい。そのようなヌクレオチドはさらに、１つもしくは複数の非修飾ＮＭＰ及び１つもしくは複数の修飾ＮＴＰ、またはシュードＵＴＰを含む非修飾ＡＭＰ、ＣＭＰ、及びＧＭＰ、または非修飾ＡＭＰ、ＧＭＰ、シュードＵＴＰ及び５－メチルＣＴＰからなってよい。部分的に修飾されて生じるｍＲＮＡを得るために、修飾ヌクレオチドを細胞由来ヌクレオチドに添加することができる。このことと一致して、そのようなヌクレオチドの使用により、本明細書の実施形態に記載のとおりのｍＲＮＡを生産することができる。
一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールがＤＮＡテンプレートにおいてコードされる、細胞ＲＮＡを使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、１つまたは複数のキャッピング酵素を含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）１つまたは複数の反応物中で、細胞ＲＮＡを、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ヌクレアーゼＰ１）と組み合わせ、かつその反応物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物及び（ｉｉ）ステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＭＰ調製物及び酵素調製物を生産すること、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、ならびにｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及びテンプレートにおいてコードされる配列の３’末端に位置するポリアデニラート配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレートの存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、非キャップドＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、ならびに（ｅ）バッファーを交換し、かつステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数のキャッピング酵素調製物を、ステップ（ｄ）の反応混合物に、メチルドナー（例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン）と一緒に添加し、かつＧＴＰの存在下でインキュベートし、それによりｍＲＮＡを生産することを含む。一態様では、ステップ（ｄ）における無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、エネルギー及びリン酸供給源、ＤＮＡテンプレート、ならびにＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、ならびにエネルギー及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物をＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。任意選択で、ＲＮＡ合成の後に、反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールが酵素的に付加される、細胞ＲＮＡを使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ポリＡポリメラーゼ、１つまたは複数のキャッピング酵素を含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）１つまたは複数の反応物中で、細胞ＲＮＡを、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ヌクレアーゼＰ１）と組み合わせ、かつその反応物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物及び（ｉｉ）ステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＭＰ調製物及び酵素調製物を生産すること、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、ならびにｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレートの存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、非キャップド非テール化ＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｅ）無細胞反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理すること；（ｆ）ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、酵素的にポリＡテールを付加して、非キャップドＲＮＡを生産すること、ならびに（ｇ）バッファーを交換し、かつステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数のキャッピング酵素調製物を、ステップ（ｆ）の反応混合物に、メチルドナー（例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン）と一緒に添加し、かつＧＴＰの存在下でインキュベートし、それによりｍＲＮＡを生産することを含む。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物をＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールがＤＮＡテンプレートにおいてコードされる、細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）細胞ＲＮＡ、キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼを含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）細胞ＲＮＡを含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ヌクレアーゼＰ１）と組み合わせ、かつ細胞溶解産物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物ならびに（ｉｉ）キナーゼ、及びＲＮＡポリメラーゼを含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＭＰ調製物及び酵素調製物を生産すること、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、キャッピング試薬、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及びテンプレートにおいてコードされる配列の３’末端に位置するポリアデニラート配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレート、ならびにキャッピング試薬の存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、ＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産することを含む。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物をＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。任意選択で、ＲＮＡ合成の後に、反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールが酵素的に付加される、細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）細胞ＲＮＡ、キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ポリＡポリメラーゼを含む細胞の１つまたは複数の溶媒物を溶解し、それにより、１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）細胞ＲＮＡを含むステップ（ａ）で生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ヌクレアーゼＰ１）と組み合わせ、かつその細胞溶解産物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物ならびに（ｉｉ）キナーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及びポリＡポリメラーゼを含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＭＰ調製物及び酵素調製物を生産すること、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、非テール化ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレート、ならびにキャッピング試薬の存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、非テール化ＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｅ）無細胞反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理すること；ならびに（ｆ）ポリＡテールを酵素的にポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で付加し、それにより、ｍＲＮＡを生産することを含む。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物をＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールがテンプレートにおいてコードされる、プロモーターを含むＤＮＡテンプレートを含む細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及びテンプレートにおいてコードされる配列の３’末端に位置するポリアデニラート配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレート、１つまたは複数のキャッピング酵素を含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより、１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）１つまたは複数の反応物中で、細胞ＲＮＡを、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ヌクレアーゼＰ１）と組み合わせ、かつその反応物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物及び（ｉｉ）ステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＭＰ調製物、酵素調製物、及びＤＮＡテンプレート調製物を生産すること、（ｄ）ＤＮＡテンプレートを、コードされるポリＡテールに隣接する３’側を切断する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして、線状化ＤＮＡテンプレートの調製物を生産し、続いて、制限エンドヌクレアーゼを不活性化または除去すること、（ｅ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、ならびにＤＮＡテンプレートの存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、非キャップドＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、ならびに（ｅ）バッファーを交換し、かつステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数のキャッピング酵素調製物を、ステップ（ｄ）の反応混合物に、メチルドナー（例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン）と一緒に添加し、かつＧＴＰの存在下でインキュベートし、それによりｍＲＮＡを生産することを含む。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物をＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールを酵素的に付加する、プロモーターを含むＤＮＡテンプレートを含む細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。ＲＮＡ合成方法を含む方法は、（ａ）キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ポリＡポリメラーゼ、非テール化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレート、１つまたは複数のキャッピング酵素を含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより、１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）１つまたは複数の反応物中で、細胞ＲＮＡを、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ヌクレアーゼＰ１）と組み合わせ、その反応物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物及び（ｉｉ）ステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＭＰ調製物、酵素調製物、及びＤＮＡテンプレート調製物を生産し、ＤＮＡテンプレートを、コードされる非テール化ＲＮＡに隣接する３’側を切断する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして、線状化ＤＮＡテンプレートの調製物を生産し、続いて、制限エンドヌクレアーゼを不活性化または除去すること、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、ならびにＤＮＡテンプレートの存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、非キャップド非テール化ＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｅ）無細胞反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理すること、（ｆ）ポリＡテールを酵素的に、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で付加し、それにより、非キャップドＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｇ）バッファーを交換し、かつステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数のキャッピング酵素調製物を、ステップ（ｆ）の反応混合物に、メチルドナー（例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン）と一緒に添加し、かつＧＴＰの存在下でインキュベートし、それによりｍＲＮＡを生産することを含み得る。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物を、ＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールがテンプレートでコードされる、細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）細胞ＲＮＡ、キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及びテンプレートでコードされる配列の３’末端に位置するポリアデニラート配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレートを含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）細胞ＲＮＡを含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ヌクレアーゼＰ１）と組み合わせ、かつその細胞溶解産物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物ならびに（ｉｉ）キナーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及び１つまたは複数のキャッピング酵素を含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＭＰ調製物、酵素調製物及びＤＮＡテンプレート調製物を生産すること、（ｄ）ＤＮＡテンプレートを、コードされるポリＡテールに隣接する３’側を切断する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして、線状化ＤＮＡテンプレートの調製物を生産し、続いて、制限エンドヌクレアーゼを不活性化または除去すること；（ｅ）（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、キャッピング試薬、ならびにＤＮＡテンプレートの存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、ｍＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産することを含む。任意選択で、ＲＮＡ合成の後に、反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理する。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物をＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールを酵素的に付加する、ＤＮＡテンプレートを含む細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。ＲＮＡ合成方法を含む方法は、（ａ）１つまたは複数の反応物中で、細胞ＲＮＡ、キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ポリＡポリメラーゼ、非テール化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレートを含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）細胞ＲＮＡを含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ヌクレアーゼＰ１）と組み合わせ、かつその細胞溶解産物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物ならびに（ｉｉ）キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’－ＮＭＰ調製物、酵素調製物、及びＤＮＡテンプレート調製物を生産すること、（ｄ）ＤＮＡテンプレートを、コードされる非テール化ＲＮＡに隣接する３’側を切断する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして、線状化ＤＮＡテンプレートの調製物を生産し、続いて、制限エンドヌクレアーゼを不活性化または除去すること；（ｅ）（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、キャッピング試薬、及びＤＮＡテンプレートの存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、非テール化ＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｆ）無細胞反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理すること、ならびに（ｇ）ポリＡテールを酵素的に、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でインキュベートすることにより付加し、それによりｍＲＮＡを生産することを含み得る。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物をＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールがＤＮＡテンプレートでコードされる、細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、１つまたは複数のキャッピング酵素を含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより、１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）１つまたは複数の反応物中で、細胞ＲＮＡを、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ＰＮＰアーゼ）と組み合わせ、かつその反応物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物及び（ｉｉ）ステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、ＮＤＰ調製物及び酵素調製物を生産すること、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、ならびにｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及びテンプレートでコードされる配列の３’末端に位置するポリアデニラート配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレート、ならびにキャッピング試薬の存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、非キャップドＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｅ）バッファーを交換し、かつステップ（ｃ）で生産された１つまたは複数のキャッピング酵素調製物を、ステップ（ｄ）の反応混合物に、メチルドナー（例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン）と一緒に添加し、かつＧＴＰの存在下でインキュベートし、それによりｍＲＮＡを生産することを含む。任意選択で、ＲＮＡ合成後に、反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理する。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物を、ＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールを酵素的に付加する、プロモーターを含むＤＮＡテンプレートを含む細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ポリＡポリメラーゼ、１つまたは複数のキャッピング酵素を含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）１つまたは複数の反応物中で、細胞ＲＮＡを、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ヌクレアーゼＰ１）と組み合わせ、かつその反応物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド一リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物及び（ｉｉ）ステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＤＰ調製物及び酵素調製物を生産すること、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）ならびに非テール化ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレートの存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、非キャップド非テール化ＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｅ）無細胞反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理すること；（ｆ）ポリＡテールを酵素的に、ポリＡポリメラーゼを添加することにより付加し、かつＡＴＰの存在下でインキュベートし、それにより、非キャップドＲＮＡを生産すること；（ｇ）バッファーを交換し、かつステップ（ｃ）で生産された１つまたは複数のキャッピング酵素調製物を、ステップ（ｆ）の反応混合物に、メチルドナー（例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン）と一緒に添加し、かつＧＴＰの存在下でインキュベートし、それによりｍＲＮＡを生産することを含む。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物を、ＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールがＤＮＡテンプレート中でコードされる、細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）細胞ＲＮＡ、キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼを含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより、１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）細胞ＲＮＡを含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ＰＮＰアーゼ）と組み合わせ、かつその細胞溶解産物を、ＲＮＡの解重合を生じさせる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物ならびに（ｉｉ）キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＤＰ調製物及び酵素調製物を生産すること、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、キャッピング試薬、ならびにｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及びテンプレートにおいてコードされる配列の３’末端に位置するポリアデニラート配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレートの存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、ｍＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産することを含む。任意選択で、ＲＮＡ合成後に、反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理する。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物をＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールを酵素的に付加する、プロモーターを含むＤＮＡテンプレートを含む細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）細胞ＲＮＡ、キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ポリＡポリメラーゼを含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより、１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）細胞ＲＮＡを含むステップ（ａ）で生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ＰＮＰアーゼ）と組み合わせ、かつその細胞溶解産物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物ならびに（ｉｉ）キナーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及び１つまたは複数のキャッピング酵素を含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＭＰ調製物及び酵素調製物を生産すること、（ｄ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、キャッピング試薬、ならびに非テール化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレートの存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、非テール化ＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｅ）無細胞反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理すること；（ｆ）ポリＡテールを酵素的に、ポリＡポリメラーゼを添加することにより付加し、かつＡＴＰの存在下でインキュベートし、それにより、ｍＲＮＡを生産することを含む。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物をＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールがＤＮＡテンプレートにおいてコードされる、細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及びテンプレートにおいてコードされる配列の３’末端に位置するポリアデニラート配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレート、１つまたは複数のキャッピング酵素を含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより、１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）１つまたは複数の反応物中で、細胞ＲＮＡを、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ＰＮＰアーゼ）と組み合わせ、かつその反応物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物及び（ｉｉ）ステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＤＰ調製物、酵素調製物、及びＤＮＡテンプレート調製物を生産すること、ｄ）ＤＮＡテンプレートを、コードされるポリＡテールに隣接する３’側を切断する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして、線状化ＤＮＡテンプレートの調製物を生産し、続いて、制限エンドヌクレアーゼを不活性化または除去すること、（ｅ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、ならびにＤＮＡテンプレートの存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、非キャップドＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｆ）バッファーを交換し、かつステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数のキャッピング酵素調製物を、ステップ（ｅ）の反応混合物に、メチルドナー（例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン）と一緒に添加し、かつＧＴＰの存在下でインキュベートし、それによりｍＲＮＡを生産することを含む。任意選択で、ＲＮＡ合成の後に、反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理する。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物を、ＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールがＤＮＡテンプレートにおいてコードされる、細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ポリＡポリメラーゼ、非テール化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレート、及び１つまたは複数のキャッピング酵素を含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより、１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）１つまたは複数の反応物中で、細胞ＲＮＡを、ＲＮＡをする酵素（例えば、ＰＮＰアーゼ）と組み合わせ、かつその反応物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物及び（ｉｉ）ステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＤＰ調製物、酵素調製物、及びＤＮＡテンプレート調製物を生産すること、（ｄ）ＤＮＡテンプレートを、コードされる非テール化ＲＮＡに隣接する３’側を切断する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして、線状化ＤＮＡテンプレートの調製物を生産し、続いて、制限エンドヌクレアーゼを不活性化または除去すること、（ｅ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）ならびにＤＮＡテンプレートの存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、非キャップド非テール化ＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｆ）無細胞反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理すること；（ｇ）ポリＡテールを酵素的に、ポリＡポリメラーゼを添加することにより付加し、かつＡＴＰの存在下でインキュベートし、それにより、非キャップドＲＮＡを生産すること；（ｈ）バッファーを交換し、かつステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数のキャッピング酵素調製物を、ステップ（ｅ）の反応混合物に、メチルドナー（例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン）と一緒に添加し、かつＧＴＰの存在下でインキュベートし、それによりｍＲＮＡを生産することを含む。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物を、ＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、ＲＮＡ合成方法は、（ａ）１つまたは複数の反応物中で、細胞ＲＮＡ、キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及びテンプレートにおいてコードされる配列の３’末端に位置するポリアデニラート配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレートを含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより、１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）細胞ＲＮＡを含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ＰＮＰアーゼ）と組み合わせ、かつその細胞溶解産物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物ならびに（ｉｉ）キナーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及び１つまたは複数のキャッピング酵素を含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＤＰ調製物、酵素調製物、及びＤＮＡテンプレート調製物を生産すること、ｄ）ＤＮＡテンプレートを、コードされるポリＡテールに隣接する３’側を切断する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして、線状化ＤＮＡテンプレートの調製物を生産し、続いて、制限エンドヌクレアーゼを不活性化または除去すること；（ｅ）ステップ（ｃ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）、キャッピング試薬、及びＤＮＡテンプレートの存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、ｍＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産することを含み得る。任意選択で、ＲＮＡ合成の後に、反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理する。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物をＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
さらなる一実施形態では、前記方法は、ポリＡテールが酵素的に付加される、ＤＮＡテンプレートを含む細胞溶解産物を使用しての無細胞ＲＮＡ合成を対象とする。前記方法は、（ａ）１つまたは複数の反応物中で、細胞ＲＮＡ、キナーゼ（例えば、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、ポリＡポリメラーゼ、非テール化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレートを含む細胞の１つまたは複数の培養物を溶解し、それにより、１つまたは複数の細胞溶解産物を生産すること、（ｂ）細胞ＲＮＡを含むステップ（ａ）において生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ＰＮＰアーゼ）と組み合わせ、かつその細胞溶解産物を、ＲＮＡの解重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｃ）（ｉ）ステップ（ｂ）において生産された５’ヌクレオシド二リン酸を含む無細胞反応混合物ならびに（ｉｉ）キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含むステップ（ａ）で生産された１つまたは複数の細胞溶解産物を、不所望な酵素活性を排除または不活性化する１つまたは複数の処理で処理して、５’ＮＤＰ調製物、酵素調製物、及びＤＮＡテンプレート調製物を生産すること、（ｄ）ＤＮＡテンプレートを、コードされる非テール化ＲＮＡに隣接する３’側を切断する制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートして、線状化ＤＮＡテンプレートの調製物を生産し、続いて、制限エンドヌクレアーゼを不活性化または除去すること、（ｅ）ステップ（ｃ～ｄ）において生産された１つまたは複数の調製物を、キナーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞反応混合物中で組み合わせ、かつ無細胞反応混合物を、エネルギー及びリン酸供給源（例えば、ポリリン酸）ならびにキャッピング試薬の存在下で、ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合が生じる条件下でインキュベートし、それにより、非テール化ＲＮＡを含む無細胞反応混合物を生産すること、（ｇ）無細胞反応混合物をデオキシリボヌクレアーゼで処理すること；（ｈ）ポリＡテールを酵素的に、ポリＡポリメラーゼを添加することにより付加し、かつＡＴＰの存在下でインキュベートし、それによりｍＲＮＡを生産することを含む。一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、リン酸の供給源、ＤＮＡテンプレート、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。さらなる一態様では、無細胞反応混合物は、ＮＭＰ、キナーゼ、及びリン酸供給源を含む。次いで、反応混合物をＤＮＡテンプレート及びＲＮＡポリメラーゼと混合する。
ｍＲＮＡを合成するさらなる実施形態は、上で論述されたとおり、それぞれＮＭＰまたはＮＤＰに解重合された細胞ＲＮＡから生産された非キャップドｍＲＮＡのいずれかに配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含めることを含む。さらに他の実施形態では、先行の実施形態のいずれかにより生産された非キャップドｍＲＮＡを後で、キャッピング酵素（複数可）を使用してキャッピングして、キャップドｍＲＮＡを生産する。さらに他の実施形態では、それぞれＮＭＰまたはＮＤＰに解重合された細胞ＲＮＡから生産された非キャップドｍＲＮＡを後で、キャッピング酵素（複数可）を使用してキャッピングして、キャップドｍＲＮＡを生産する。さらに他の実施形態では、先行の実施形態のいずれかのＲＮＡポリメラーゼ含有ステップはまた、キャップ類似体を含み、それにより、非キャップドＲＮＡの代わりにキャップドｍＲＮＡを生産して、その後の酵素的キャッピングステップ（複数可）の必要性を不要にする。
上で論述されたとおり、ＲＮＡ最終産物の例には、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が含まれる。一部の実施形態では、ＲＮＡ最終産物（生合成ＲＮＡ）の濃度は、少なくとも１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌである。例えば、ＲＮＡ最終産物の濃度は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｇ／Ｌ、またはそれ以上であり得る。多くの実施形態で、ＲＮＡ最終産物の濃度は少なくとも１ｇ／Ｌである。単一バッチは、１０，０００Ｌまでであるか、それを超え得る。
無細胞生産
「無細胞生産」は、生細胞を使用することなく生体分子または化学化合物を合成するための生物学的プロセスの使用である。そのような方法では最初に、細胞を溶解し、細胞溶解産物を生じさせる。両方とも酵素を含有する未精製（粗製）の部分または部分的に精製された部分を、所望の産物を生産するために使用することができる。一部の実施形態では、そのようなプロセスにおいて使用される酵素は、細胞溶解産物に添加することができる精製酵素である。非限定的例として、細胞を培養し、収集し、高圧均質化または他の細胞溶解方法（例えば、化学的細胞溶解）により溶解することができる。無細胞反応は、バッチまたはフェド－バッチ方式で行うことができる。一部の事例では、酵素経路は、反応器のワーキング体積を満たし、細胞内環境においてよりも希釈され得る。それでも、膜結合する触媒を含めて、細胞触媒の実質的に全てを得ることができる。
本明細書に記載の実施形態の多くが、特定の酵素を含む「培養細胞を溶解すること」に関するが、この語句は、単一の培養物（例えば、ＲＮＡを合成するために必要とされる酵素を全て含有）から得られた細胞のクローン集団を溶解すること、さらには、異なる細胞培養物（例えば、ＲＮＡ及び／または細胞ＲＮＡ基質を合成するために必要とされる１つまたは複数の酵素をそれぞれ含有）からそれぞれ得られた細胞の１つより多いクローン集団よりを溶解することを包含することが意図されていることは理解されるべきである。例えば、一部の実施形態では、特定のキナーゼを発現する細胞（例えば、操作細胞）の集団を一緒に培養して、１つの細胞溶解産物を生産するために使用することができ、かつ異なるキナーゼを発現する細胞（例えば、操作細胞）の別の集団を一緒に培養して、別の細胞溶解産物を生産するために使用することができる。次いで、異なるキナーゼをそれぞれ含むこれらの２つ以上の細胞溶解産物を、本開示の無細胞ｍＲＮＡ生合成方法において使用するために組み合わせることができる。その酵素活性が維持されることが望ましいキナーゼなどの酵素の存在下で、不所望な酵素活性を不活性化するために熱を使用する本発明の実施形態では、キナーゼなど、そのような酵素の熱安定性バリアントを有利には使用する。
バイオマスリボ核酸のヌクレオシド一リン酸への解重合
本開示は、一連の酵素反応を伴う無細胞プロセスを介しての、バイオマスからのＲＮＡ（例えば、内因性細胞ＲＮＡ）の所望の合成ｍＲＮＡへの変換に基づく。最初に、細胞ＲＮＡから得られた反応混合物中に存在するＲＮＡ（例えば、内因性ＲＮＡ）を、ヌクレアーゼにより、その構成モノマーに変換する。本明細書で使用され、かつ当技術分野で理解されるとおり、「バイオマス」という用語は、細胞材料の総質量を意味することが意図されており、それには、これに限定されないが、炭水化物、ＤＮＡ、脂質、タンパク質、ＲＮＡ、及びその断片が含まれる。任意選択で、モノマーに変換する前に、ＲＮＡを粗く精製することができる。バイオマス（例えば、内因性ＲＮＡ）からのＲＮＡには典型的には、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、他のＲＮＡ、またはそれらの組み合わせが含まれる。適切なヌクレアーゼ、例えば、５’－ヌクレオシド一リン酸（５’－ＮＭＰ）を生産するヌクレアーゼでのＲＮＡの解重合または分解は、簡単に「モノマー」とも称される５’－ＮＭＰのプールをもたらす。ヌクレオシド二リン酸に変換され、さらに、ヌクレオシド三リン酸に変換されるこれらのモノマーを、ｍＲＮＡを下流で重合／合成するための出発物質として使用する。一部の実施形態では、前記モノマーは、修飾された骨格系列を有するか、または代替の塩基、すなわち、チオアートであり、かつ特化ヌクレアーゼで解重合され、特化キナーゼでリン酸化される。商業的量のＮＴＰの生産は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる「ヌクレオシド三リン酸及びリボ核酸生産のための方法及び組成物」と標題されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５５３５において記載されているとおりに企図される。
ｍＲＮＡを合成するために必要とされるＲＮＡ（例えば、内因性ＲＮＡ）の量は、例えば、特定のｍＲＮＡの所望の長さ及び収量、さらには、細胞のＲＮＡ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞または酵母細胞に由来する内因性ＲＮＡ）のヌクレオチド組成に対するｍＲＮＡのヌクレオチド組成に応じて変化し得る。典型的には、細菌細胞では、例えば、ＲＮＡ（例えば、内因性ＲＮＡ）含有率は、全細胞量の５～５０％の範囲であるのに対して、真核細胞では、その量は約２０％である。出発物質の質量パーセントは、例えば、次の式：（ＲＮＡのキログラム（ｋｇ）／乾燥細胞重量のキログラム）×１００％を使用して計算することができる。
内因性ＲＮＡは、化学的または酵素的手段により、その構成モノマーに解重合または分解することができる。しかしながら、ＲＮＡの化学的加水分解は典型的には、２’－及び３’－ＮＭＰを生産し、これらはＲＮＡに重合させることができず、したがって、酵素的分解方法よりも利点が少ない。したがって、本明細書において提供されるとおりの方法、組成物、及びシステムは、内因性ＲＮＡを解重合するために、主に酵素を使用する。「ＲＮＡを解重合する酵素」は、ＲＮＡ分子中の２個のヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の加水分解を触媒する。したがって、「ＲＮＡを解重合する酵素」は、ＲＮＡ（細胞ＲＮＡ）を、そのモノマー形態であるヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）またはヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）のいずれかに変換する。酵素に応じて、ＲＮＡの酵素的解重合は、３’－ＮＭＰ、５’－ＮＭＰ、３’－ＮＭＰと５’－ＮＭＰの組み合わせ、または５’－ＮＤＰをもたらし得る。３’－ＮＴＰ（３’－ＮＭＰから変換された３’－ＮＤＰから変換される）を重合させることは不可能であるので、ヌクレアーゼＰ１またはＰＮＰアーゼなどの５’－ＮＭＰ（次いで５’－ＮＤＰに、次いで５’－ＮＴＰに変換される）または５’－ＮＤＰ（次いで５’－ＮＴＰに変換される）をもたらす酵素が好ましい。一部の実施形態では、３’－ＮＭＰをもたらす酵素を、操作細胞のゲノムＤＮＡから除去して、ＲＮＡ生産の効率を上昇させる。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合のために使用される酵素は、ヌクレアーゼＰ１である。一部の実施形態では、使用されるヌクレアーゼＰ１の濃度は、０．１～３．０ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０ｍｇ／ｍＬ）である。一部の実施形態では、使用されるヌクレアーゼＰ１の濃度は１～３ｍｇ／ｍＬである。
ＲＮＡを解重合する酵素の例には、限定ではないが、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ、例えば、ＲＮアーゼＲ）を含むヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼＰ１）、及びホスホジエステラーゼが含まれる。ヌクレアーゼは、核酸の、より小さな構成成分（例えば、ヌクレオシド一リン酸、またはオリゴヌクレオチドとも称されるモノマー）への分解を触媒する。ホスホジエステラーゼは、ホスホジエステル結合の分解を触媒する。ＲＮＡを解重合するこれらの酵素は、全長遺伝子または遺伝子融合（例えば、２つの異なる酵素活性をコードする少なくとも２つの異なる遺伝子（または遺伝子の断片）を含むＤＮＡ）によりコードされ得る。
ＲＮアーゼは、細胞において、ＲＮＡ成熟及びターンオーバーを制御するように機能する。各ＲＮアーゼは特異的基質選択性を有する。したがって、一部の実施形態では、異なるＲＮアーゼの組み合わせ、または異なるヌクレアーゼの組み合わせを一般的に、バイオマス由来ＲＮＡ（例えば、内因性ＲＮＡ）を解重合するために使用することができる。ＲＮＡを解重合するために、例えば、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、または１～１０の異なるヌクレアーゼを組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡを解重合するために、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０の異なるヌクレアーゼを組み合わせて使用することができる。本明細書において提示されるとおりに使用するためのヌクレアーゼの非限定的例は、表１に含まれる。一部の実施形態では、使用されるヌクレアーゼはヌクレアーゼＰ１である。
Figure 2022524166000001
ＲＮＡを解重合する酵素（例えば、ＲＮアーゼ）は、宿主細胞に内因性であってもよいし（宿主由来）、または宿主細胞に外因性に（例えば、エピソームベクター上に、または宿主細胞のゲノムに組み込んで）導入された操作核酸によりコードされてもよい。別法では、酵素を反応物に、商業的に供給される単離タンパク質を含む単離タンパク質として添加することができる。他の代替物として、酵素を内因性に生産する細胞または酵素を生産するように操作された細胞から部分的に精製された酵素を含めて、部分的に精製された酵素を反応物中で使用することができる。
無細胞反応混合物中で細胞ＲＮＡをインキュベートするために、ＲＮＡの解重合をもたらす条件は当技術分野で公知であるか、または当技術分野で通常の技能を有する者であれば、例えば、ｐＨ、温度、時間、及び細胞溶解産物の塩濃度、さらには、任意の外因性補因子を含む特定のヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼＰ１）活性のための最適な条件を考慮して決定することができる。これらの反応条件の例には、既に記載のものが含まれる（例えば、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０５： １１５－１１７、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ＥＰ１５８７９４７Ｂ１、またはＣｈｅｎｇ ａｎｄ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， ２００２， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７７：２１６２４－２１６２９を参照されたい）。
一部の実施形態では、金属イオン（例えば、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋）を解重合反応から枯渇させる。一部の実施形態では、金属イオン（例えば、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋）の濃度は、８ｍＭまたはそれ未満（例えば、８ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ未満、５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、３ｍＭ未満、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満及び０．０５ｍＭ未満）である。一部の実施形態では、金属イオン（例えば、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋）の濃度は、０．１ｍＭ～８ｍＭ、０．１ｍＭ～７ｍＭ、または０．１ｍＭ～５ｍＭである。一部の実施形態では、金属イオンはＺｎ２＋である。
ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物のｐＨは３～８の値を有し得る。一部の実施形態では、細胞溶解産物のｐＨ値は、３～８、４～８、５～８、６～８、７～８、３～７、４～７、５～７、６～７、３～６、４～６、５～６、３～５、３～４、または４～５である。一部の実施形態では、細胞溶解産物のｐＨ値は、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、または８．０である。一部の実施形態では、細胞溶解産物のｐＨ値は、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、または５．５である。一部の有利な実施形態では、ｐＨは５．８である。細胞溶解産物のｐＨを、必要に応じて調整することができる。
ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物の温度は１５℃～９９℃であり得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物の温度は、１５～９５℃、１５～９０℃、１５～８０℃、１５～７０℃、１５～６０℃、１５～５０℃、１５～４０℃、１５～３０℃、２５～９５℃、２５～９０℃、２５～８０℃、２５～７０℃、２５～６０℃、２５～５０℃、２５～４０℃、２５～３０℃、３０～９５℃、３０～９０℃、３０～８０℃、３０～７０℃、３０～６０℃、３０～５０℃、４０～９５℃、４０～９０℃、４０～８０℃、４０～７０℃、４０～６０℃、４０～５０℃、５０～９５℃、５０～９０℃、５０～８０℃、５０～７０℃、５０～６０℃、６０～９５℃、６０～９０℃、６０～８０℃、または６０～７０℃である。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物の温度は７０℃である。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物の温度は、１５℃、２５℃、３２℃、３７℃、４０℃、４２℃、４５℃、５０℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、または８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、または９９℃である。
一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の無細胞反応混合物を２４時間にわたって、７０℃の温度でインキュベートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の反応混合物を５～３０分間にわたって、７０℃の温度でインキュベートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の反応混合物は５～５．５のｐＨを有し、１５分間にわたって、７０℃の温度でインキュベートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の反応混合物を、ＲＮＡからＮＤＰへ、またはＲＮＡから５’－ＮＭＰへの変換率６５％超が生じる条件下でインキュベートしてよい。一部の実施形態では、ＲＮＡを５０ｍＭ／時、１００ｍＭ／時または２００ｍＭ／時の速度（または少なくともその速度）で、ＮＤＰまたは５’－ＮＭＰに変換する。他の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の反応混合物を比較的高い温度（例えば、５０℃～７０℃）でインキュベートする。
ＲＮＡ解重合反応を行うために生産される細胞溶解産物は、５分（ｍｉｎ）～７２時間（ｈｒ）にわたってインキュベートすることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物を５～１０分、５～１５分、５～２０分、５～３０分、または５分～４８時間にわたってインキュベートする。例えば、ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物を、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、または４８時間にわたってインキュベートすることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物を２４時間にわたって、３７℃の温度でインキュベートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物を５～１０分間にわたって、７０℃の温度でインキュベートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物は５～５．５のｐＨを有し、それを１５分間にわたって、７０℃の温度でインキュベートする。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物を、ＲＮＡから５’－ＮＭＰへの変換率６５％超が生じる条件下でインキュベートすることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡを、５０ｍＭ／時、１００ｍＭ／時または２００ｍＭ／時の速度（または少なくともその速度）で、５’－ＮＭＰに変換する。
一部の実施形態では、例えば、酵素の凝集を防止するために、塩を細胞溶解産物に添加する。例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、またはそれらの組み合わせを細胞溶解産物に添加することができる。ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物中の塩の濃度は５ｍＭ～１Ｍであり得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ解重合反応中の細胞溶解産物中の塩の濃度は、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、または１Ｍである。一部の実施形態では、細胞溶解産物は、４０～６０ｍＭリン酸カリウム、１～５ｍＭ ＭｎＣｌ２、及び／または１０～５０ｍＭ ＭｇＣｌ２（例えば、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を含む混合物を含む。
一部の実施形態では、例えば、特定のｐＨ値及び／または塩濃度を得るために、バッファーを細胞溶解産物に添加する。バッファーの例には、限定ではないが、リン酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、リンゴ酸バッファー、ＭＥＳバッファー、ヒスチジンバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、ビス－トリスバッファー、及びエタノールアミンバッファーが含まれる。
一部の実施形態では、ヌクレアーゼＰ１を使用して、バイオマスを解重合する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼＰ１を、その後のステップの前に、反応物から濾別する。
ＲＮＡの解重合は、５’－ＡＭＰ、５’－ＵＭＰ、５’－ＣＭＰ、及び５’－ＧＭＰを含む５’－ＮＭＰの生産をもたらし得る。ＲＮＡの解重合が、いずれの所定の比のＮＭＰももたらさず、細胞ＲＮＡの組成に依存するであろうことは理解されるべきである。
一部の実施形態では、ＰＮＰアーゼを使用して、バイオマスを解重合する。一部の実施形態では、ＰＮＰアーゼを、その後のステップの前に、不活性化する、または反応物から排除する。
リン酸の存在下でのＲＮＡの解重合は、５’－ＡＤＰ、５’－ＵＤＰ、５’－ＣＤＰ、及び５’－ＧＤＰを含む５’－ＮＤＰの生産をもたらし得る。ＲＮＡの解重合が、いずれの所定の比のＮＤＰももたらさず、細胞ＲＮＡの組成に依存するであろうことは理解されるべきである。本明細書で使用される場合、ＮＤＰを作製するためのＰＮＰアーゼの使用は、リン酸の使用を必要とする。
一部の実施形態では、溶解すると、細胞中の内因性ＲＮＡのうちの５０～９８％が、５’－ＮＭＰまたは５’－ＮＤＰに変換（解重合）される。例えば、５０～９５％、５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％、７５～９８％、７５～９５％、７５～９０％、７５～８５％または７５～８０％のＲＮＡが５’－ＮＭＰに変換（解重合）される。一部の実施形態では、溶解すると、細胞中の内因性ＲＮＡのうちの６５～７０％が５’－ＮＭＰｓまたは５’ＮＤＰに変換（解重合）される。より低い収率も許容される。
ＲＮＡ解重合酵素の排除または不活性化
内因性及び／または外因性ヌクレアーゼによるバイオマス（例えば、内因性ＲＮＡ）からそのモノマー構成成分（例えば、ＮＭＰまたはＮＤＰ）へのＲＮＡの変換の後に、反応混合物または細胞溶解産物中に、ＲＮＡ生合成に有害作用を有し得るヌクレアーゼ及びホスファターゼを含む複数の酵素が残留し得る。例えば、解重合のために使用されるヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼＰ１）が、バイオマスの解重合後にも活性なままであり得る。別の例として、細胞ＲＮＡ供給源は、多数の天然ホスファターゼを含有し、そのうちの多くが、ＮＴＰ、ＮＤＰ、及びＮＭＰを脱リン酸化する。ＲＮＡ解重合後に細胞ＲＮＡから得られたＮＭＰの脱リン酸化は、非リン酸化ヌクレオシドの蓄積をもたらし、かつ利用可能なＮＭＰ基質の減少、したがって、合成ＲＮＡ収率の低下をもたらし得る。
不所望な酵素活性の排除または不活性化
細胞から得られた材料を含む反応混合物（例えば、細胞溶解産物（複数可）または細胞溶解産物（複数可）から得られた酵素調製物）では、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して、不所望な天然酵素活性を除去、排除、または不活性化することが有利であり得る。不所望な天然酵素活性には、例えば、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、及びヒドロラーゼが含まれる。ＮＭＰへのＲＮＡ解重合後のＮＤＰまたはＮＴＰの脱リン酸化は、ＮＭＰがＮＤＰ及びＮＴＰへとリン酸化され、次いで、ＮＭＰまたはヌクレオシド出発点へと脱リン酸化される無益なエネルギーサイクル（合成ＲＮＡの低収率をもたらすエネルギーサイクル）をもたらし得る。無益なサイクルは、エネルギー入力単位（例えば、ポリリン酸、ＡＴＰ、または高エネルギーリン酸の他の供給源）あたりのＲＮＡ生産収率を低下させる。
不所望な酵素活性を除去、排除、または不活性化するために、多数の方法を利用することができる。一部の実施形態では、不所望な酵素活性を、有害な酵素コードする遺伝子を、宿主ゲノムから除去することにより除去する。本明細書において提供されるとおりのＲＮＡ生合成に有害な酵素は宿主細胞ゲノムから、操作中に欠失させることができるが、ただし、その酵素が、宿主細胞（例えば、細菌細胞）の生存及び／または増殖に必須ではないことを条件とする。酵素または酵素活性の欠失は、例えば、宿主細胞ゲノムにおいて、その酵素をコードする遺伝子を欠失させる、または修飾することにより達成することができる。特定の酵素の発現及び／または活性がなければ、宿主細胞が生存することができない場合に、その酵素は「宿主細胞の生存に必須」である。同様に、特定の酵素の発現及び／または活性がなければ、宿主細胞が分裂及び／または増殖することができない場合に、その酵素は「宿主細胞の増殖に必須」である。
ＲＮＡの生合成に有害な酵素が宿主細胞の生存及び／または増殖に必須な場合、他の方法を使用することができる。一部の実施形態では、酵素活性を熱不活性化により排除する。一部の実施形態では、酵素活性をｐＨの変化により排除する。一部の実施形態では、酵素活性を、塩濃度の変化により排除する。一部の実施形態では、酵素活性をアルコールまたは別の有機溶媒での処理により排除する。一部の実施形態では、酵素活性を界面活性剤処理により排除する。一部の実施形態では、酵素活性を、化学的阻害剤の使用を介して排除する。一部の実施形態では、酵素活性を、これに限定されないが、濾過、沈殿、及び捕捉、及び／またはクロマトグラフィーの方法を含む物理的分離により排除する。一部の実施形態では、使用されるクロマトグラフィーは、固定化金属クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、捕捉方法は、酵素がヘキサヒスチジンタグを有することを必要とする。前述のアプローチの任意の組み合わせも使用することができる。
一部の実施形態では、天然酵素活性を、遺伝子改変、細胞からの酵素分泌、局在化（例えば、細胞周辺ターゲティング）、及び／またはプロテアーゼターゲティングを介して除去する。他の実施形態では、天然酵素活性を、温度、ｐＨ、塩、界面活性剤、アルコールまたは他の溶媒、及び／または化学的阻害剤を介して不活性化する。また他の実施形態では、天然酵素活性を、沈殿、濾過、捕捉、及び／またはクロマトグラフィーなどの物理的分離を介して排除する。
望ましくない（例えば、天然）酵素活性（複数可）を、遺伝的、条件的、または分離アプローチを使用して除去してもよい。一部の実施形態では、遺伝的アプローチを使用して、不所望な酵素活性を除去する。したがって、一部の実施形態では、細胞を、不所望な酵素活性を低下させる、または除去するように修飾する。不所望な酵素活性（複数可）を低下させる、または除去するために使用してもよい遺伝的アプローチの例には、これに限定されないが、分泌、遺伝子ノックアウト、及びプロテアーゼターゲティングが含まれる。一部の実施形態では、条件的アプローチを使用して、不所望な酵素活性を除去する。したがって、一部の実施形態では、不所望な活性を示す不所望な酵素が、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または反応混合物中に残存し、かつ選択的に不活性化される。不所望な酵素活性を低下させる、または除去するために使用してもよい条件的アプローチの例には、これに限定されないが、温度変化、ｐＨ、塩、界面活性剤、アルコールまたは他の溶媒、及び／または化学的阻害剤が含まれる。一部の実施形態では、分離／精製アプローチを使用して、不所望な酵素活性を除去する。したがって、一部の実施形態では、不所望な活性を示す不所望な酵素を、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または反応混合物から物理的に分離する。不所望な酵素活性を低下させる、または排除するために使用してもよい分離アプローチの例には、これに限定されないが、濾過、沈殿、捕捉、及び／またはクロマトグラフィーなどの物理的分離が含まれる。
本明細書において提供される様々な実施形態で、細胞から調製される酵素または経路酵素を発現する細胞の溶解産物を、ＮＴＰ及び／またはＲＮＡを生産するための反応混合物において使用する。これらの細胞または細胞溶解産物には、ＮＴＰ及び／またはＲＮＡ生産に対して有害作用を有し得る酵素が存在する。そのような酵素の非限定的例には、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞により発現されるものなど、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、デアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、及び／またはヒドロラーゼが含まれる。ホスファターゼはリン酸基を除去して（例えば、ＮＭＰをヌクレオシドに変換するか、ＮＤＰをＮＭＰに変換するか、またはＮＴＰをＮＤＰに変換する）、ヌクレオチドリン酸化／脱リン酸化の無益なサイクルにより、ＮＴＰ生産を減少させる。ヌクレアーゼは核酸をモノマーまたはオリゴマーに切断して、ＲＮＡ産物の分解（例えば、ＲＮアーゼ）及び／またはＤＮＡテンプレートの分解（例えば、ＤＮアーゼにより）をもたらす。プロテアーゼは、タンパク質をアミノ酸またはペプチドに切断して、経路酵素を分解する。デアミナーゼはアミノ基を除去して、経路中間体を有用でない基質（例えば、キサンチン及びヒポキサンチン）に変換することによりＮＴＰ濃度を低下させ、かつＲＮＡ産物における変異（例えば、ＣからＵへ）をもたらし得る。ヒドロラーゼ（例えば、ヌクレオシドヒドロラーゼまたはヌクレオチドヒドロラーゼ）はヌクレオシドまたはヌクレオチドを塩基及び糖部分に切断して、ヌクレオチドの不可逆的分解により、ＮＴＰ濃度を低下させる。オキシドレダクターゼは、ある分子（オキシダント）から別の分子（レダクタント）への電子の移動を触媒する。酸化及び／または還元反応は、例えば、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ中の核酸塩基を損傷して、転写及び／または翻訳においてエラーをもたらし得るか、またはタンパク質もしくは酵素を損傷して、機能の低下をもたらし得る。
したがって、多くの実施形態において、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または反応混合物中のこれらの天然の酵素活性または他の不所望な酵素活性を除去、排除、または不活性化することが有利である。
熱不活性化する、宿主細胞のゲノムから欠失または物理的に除去することができる酵素の例には、限定ではないが、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＩＩＩ、ＲＮアーゼＩ、ＲＮアーゼＲ、ヌクレアーゼＰ１、ＰＮＰアーゼ、ＲＮアーゼＩＩ、及びＲＮアーゼＴ）、ホスファターゼ（例えば、ヌクレオシドモノホスファターゼ、ヌクレオシドジホスファターゼ、ヌクレオシドトリホスファターゼ）、及びＲＮＡを解重合するか、またはヌクレオチドを脱リン酸化する他の酵素が含まれる。ＲＮＡを解重合する酵素には、ＲＮＡ分子を切断する、部分的に加水分解する、または完全に加水分解することができる任意の酵素が含まれる。
酵素を不活性化する技術の例には、条件的アプローチが含まれる。一部の実施形態では、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または反応混合物は、選択的に不活性化される不所望な活性を示す酵素を含む。一部の実施形態では、不所望な活性を示す酵素を、酵素を排除条件（例えば、高温または低温、酸性または塩基性ｐＨ値、高塩または低塩、界面活性剤、及び／または有機溶媒）に暴露することにより、選択的に不活性化する。一部の実施形態では、不所望な酵素活性を沈殿またはクロマトグラフィーにより排除する。
「熱不活性化」は、無細胞反応混合物を、内因性ヌクレアーゼ、ホスファターゼ、または他の酵素を不活性化する（または少なくとも部分的に不活性化する）ために十分な温度に加熱するプロセスを指す。一般的に、熱不活性化のプロセスは、有害な酵素の分解（アンフォールディング）を伴う。内因性細胞タンパク質が変性する温度は、生体の間で変化する。Ｅ．ｃｏｌｉでは、例えば、内因性細胞酵素は一般的に、４１℃を超える温度で変性する。変性温度は、他の生体では、４１℃よりも高く、または低くあり得る。本明細書で提供されるとおりの反応混合物の酵素を、５５℃～９５℃、またはそれより高い温度で熱不活性化することができる。一部の実施形態では、反応混合物の酵素を、５５～９０℃、５５～８０℃、５５～７０℃、５５～６０℃、６０～９５℃、６０～９０℃、６０～８０℃、６０～７０℃、７０～９５℃、７０～９０℃または７０～８０℃の温度で熱不活性化することができる。例えば、無細胞反応混合物中の酵素を、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃ ８５℃、９０℃、または９５℃の温度で熱不活性化することができる。一部の実施形態では、無細胞反応混合物の酵素を、５５～９５℃の温度で熱不活性化することができる。一部の実施形態では、無細胞反応混合物の酵素を、７０℃の温度で熱不活性化することができる。一部の実施形態では、無細胞反応混合物の酵素を、６０℃の温度で熱不活性化することができる。有害な酵素の化学的阻害剤を導入することも可能であり得る。そのような阻害剤には、これに限定されないが、オルトバナジン酸ナトリウム（タンパク質ホスホチロシルホスファターゼの阻害剤）、フッ化ナトリウム（ホスホセリル及びホスホトレオニルホスファターゼの阻害剤）、ピロリン酸ナトリウム（ホスファターゼ阻害剤）、リン酸ナトリウム、及び／またはリン酸カリウムが含まれ得る。
不所望な酵素の熱不活性化を達成するために無細胞反応混合物を高温でインキュベートする時間は、例えば、無細胞反応混合物の体積及びバイオマスをそこから調製した生体に応じて変化し得る。一部の実施形態では、無細胞反応混合物を５５℃～９９℃の温度で、０．５分（ｍｉｎ）～２４時間（ｈｒ）にわたってインキュベートする。例えば、無細胞反応混合物を、５５℃～９９℃の温度で、０．５分、１分、２分、４分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、または１時間にわたってインキュベートすることができる。一部の実施形態では、無細胞反応混合物を、５５℃～９９℃の温度で、３０分、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、３６、４２、または４８時間にわたってインキュベートする。
一部の実施形態では、酵素を、６０～８０℃の温度で、１０～２０分間にわたって熱不活性化する。一部の実施形態では、酵素を７０℃の温度で、１５分間にわたって熱不活性化する。
一部の実施形態では、内因性ＲＮＡを解重合する酵素は、酵素を熱に対してより感受性にする１つまたは複数の修飾（例えば、変異）を含む。これらの酵素は、「熱感受性酵素」と称される。熱感受性酵素は、それらの野生型カウンターパートの温度よりも低い温度で変性し、不活性化され、及び／または熱感受性酵素の活性を低下させるために必要な時間は、それらの野生型カウンターパートの時間よりも短い。
熱不活性化された酵素が一部の事例では、多少の程度の活性を維持し得ることは理解されるべきである。例えば、熱不活性化酵素の活性レベルは、熱不活性化されていない同じ酵素の活性レベルの５０％未満であり得る。一部の実施形態では、熱不活性化酵素の活性レベルは、熱不活性化されていない同じ酵素の活性レベルの４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．１％未満である。
したがって、酵素の活性を完全に排除する、または低下させることができる。酵素の変性（熱不活性化）形態がその天然形態の酵素により触媒される反応をもはや触媒しない場合に、その酵素は完全に不活性であると判断される。熱不活性化酵素の活性が、加熱されていない酵素の活性と比べて（例えば、その天然環境において）少なくとも５０％低下している場合に、その熱不活性化変性酵素は「不活性化された」と判断される。一部の実施形態では、熱不活性化酵素の活性を、加熱されていない酵素の活性と比べて５０～１００％低下させる。例えば、熱不活性化酵素の活性を、加熱されていない酵素の活性と比べて５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％、５０～７５％、５０～７０％、５０～６５％、５０～６０％、または５０～５５％低下させる。一部の実施形態では、熱不活性化酵素の活性を、加熱されていない酵素の活性と比べて２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％低下させる。
一部の実施形態では、反応混合物を、不所望な活性を示す酵素を一時的に、または不可逆的に不活性化する酸または塩基（ｐＨ変化）に暴露する。「酸または塩基不活性化」は、反応混合物を、不所望な酵素（複数可）を不活性化する（または少なくとも部分的に不活性化する）ために十分なｐＨに調整するプロセスを指す。一般的に、酸または塩基不活性化のプロセスは、酵素（複数可）の変性（アンフォールディング）を伴う。酵素が変性するｐＨは生体の間で変化する。Ｅ．ｃｏｌｉでは、例えば、天然酵素は一般的に、７．５超または６．５未満のｐＨで変性する。その変性ｐＨは、他の生体での変性ｐＨよりも高いか、または低いことがあり得る。本明細書において提供されるとおりの反応混合物の酵素は７．５～１４、またはそれより高いｐＨで塩基不活性化することができる。一部の実施形態では、無細胞反応混合物の酵素を８～１４、８．５～１４、９～１４、９．５～１４、１０～１４、１０．５～１４、１１～１４、１１．５～１４、１２～１４、１２．５～１４、１３～１４、または１３．５～１４のｐＨで塩基不活性化する。一部の実施形態では、無細胞反応混合物の酵素を７．５～１３．５、７．５～１３、７．５～１２．５、７．５～１２、７．５～１１．５、７．５～１１、７．５～１０．５、７．５～１０、７．５～９．５、７．５～９、７．５～８．５、または７．５～８のｐＨで塩基不活性化する。例えば、無細胞反応混合物の酵素は、およそ７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、または１４のｐＨで塩基不活性化することができる。本明細書において提供されるとおりの無細胞反応混合物の酵素を６．５～０、またはそれ未満のｐＨで酸不活性化することができる。一部の実施形態では、無細胞反応混合物の酵素を６．５～０．５、６．５～１、６．５～１．５、６．５～２、６．５～２．５、６．５～３、６．５～３．５、６．５～４、６．５～４．５、６．５～５、または６．５～６のｐＨで酸不活性化する。一部の実施形態では、無細胞反応混合物の酵素を６～０、５．５～０、５～０、４．５～０、４～０、３．５～０、３～０、２．５～０、２～０、１．５～０、１～０、または０．５～０のｐＨで酸不活性化する。例えば、無細胞反応混合物の酵素を、およそ６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、０．５、または０のｐＨで酸不活性化することができる。
一部の実施形態では、無細胞反応混合物を、不所望な活性を示す酵素を一時的に、または不可逆的に不活性化する高塩または低塩（塩濃度の変化）に暴露する。「塩不活性化」は、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または無細胞反応混合物を、酵素を不活性化する（または部分的に不活性化する）ために十分な塩濃度に調整するプロセスを指す。一般的に、塩不活性化のプロセスは、酵素の変性（アンフォールディング）を伴う。酵素が変性する濃度は生体の間で変化する。Ｅ．ｃｏｌｉでは、例えば、天然酵素は一般的に、６００ｍＭ超の塩濃度で変性する。変性塩濃度は、他の生体での変性塩濃度よりも高いか、または低いことがあり得る。塩は、アニオンとカチオンとの組み合わせである。本明細書に記載のとおりの無細胞反応混合物中の不所望な酵素活性を塩不活性化するために使用することができるカチオンの非限定的例には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム及びアンモニウムが含まれる。本明細書に記載のとおりの無細胞反応混合物中の不所望な酵素活性を塩不活性化するために使用することができるアニオンの非限定的例には、アセタート、クロリド、スルファート、及びホスファートが含まれる。本明細書に記載のとおりの無細胞反応混合物の酵素は６００～１０００ｍＭ、またはそれ以上の塩濃度で塩不活性化することができる。一部の実施形態では、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または無細胞反応混合物の酵素を７００～１０００ｍＭ、７５０～１０００ｍＭ、８００～１０００ｍＭ、８５０～１０００ｍＭ、９００～１０００ｍＭ、９５０～１０００ｍＭの塩濃度で塩不活性化することができる。一部の実施形態では、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または無細胞反応混合物の酵素を６００～９５０ｍＭ、６００～９００ｍＭ、６００～８５０ｍＭ、６００～８００ｍＭ、６００～７５０ｍＭ、６００～７００ｍＭ、または６００～６５０ｍＭの塩濃度で塩不活性化することができる。例えば、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または無細胞反応混合物の酵素を、およそ６００ｍＭ、６５０ｍＭ、７００ｍＭ、７５０ｍＭ、８００ｍＭ、８５０ｍＭ、９００ｍＭ、９５０ｍＭ、または１０００ｍＭの塩濃度で塩不活性化することができる。本明細書に記載のとおりの酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または無細胞反応混合物の酵素を４００～１ｍＭ、またはそれ以下の塩濃度で塩不活性化することができる。一部の実施形態では、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または無細胞反応混合物の酵素を３５０～１ｍＭ、３００～１ｍＭ、２５０～１ｍＭ、２００～１ｍＭ、１５０～１ｍＭ、１００～１ｍＭ、または５０～１ｍＭの塩濃度で塩不活性化することができる。一部の実施形態では、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または無細胞反応混合物の酵素を４００～５０ｍＭ、４００～１００ｍＭ、４００～１５０ｍＭ、４００～２００ｍＭ、４００～２５０ｍＭ、４００～３００ｍＭ、または４００～３５０ｍＭの塩濃度で塩不活性化することができる。例えば、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または無細胞反応混合物の酵素を、およそ４００ｍＭ、３５０ｍＭ、３００ｍＭ、２５０ｍＭ、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、５０ｍＭ、または１ｍＭの塩濃度で塩不活性化することができる。
一部の実施形態では、不所望な活性を示す酵素を不活性化するために、有機溶媒を酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または反応混合物に添加する。有機溶媒の非限定的例には、エタノール、メタノール、エーテル、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、及びトルエンが含まれる。
一部の実施形態では、不所望な活性を示す酵素を不活性化するために、界面活性剤を、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または反応混合物を添加する。界面活性剤の非限定的例には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、エチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＥＴＭＡＢ）、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド（ＬＴＡＢ）、及びラウリルトリメチルアンモニウムクロリド（ＬＴＡＣ）が含まれる。
一部の実施形態では、不所望な活性を示す酵素を不活性化するために、化学的阻害剤を酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または反応混合物に添加する。化学的阻害剤の非限定的例には、オルトバナジン酸ナトリウム（タンパク質ホスホチロシルホスファターゼの阻害剤）、フッ化ナトリウム（ホスホセリル及びホスホトレオニルホスファターゼの阻害剤）、ピロリン酸ナトリウム（ホスファターゼ阻害剤）、リン酸ナトリウム、及び／またはリン酸カリウムが含まれる。一部の実施形態では、化学的阻害剤を化学的阻害剤ライブラリから選択する。
本明細書において使用される条件的アプローチのいずれについても、細胞溶解産物または無細胞反応混合物中に存在する経路酵素のいずれも、排除条件（例えば、高温または低温、酸性または塩基性ｐＨ値、高塩または低塩、界面活性剤及び／または有機溶媒）に暴露することができることは理解されるべきである。したがって、一部の実施形態では、経路酵素（例えば、ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、及び／またはポリメラーゼ）は排除条件に耐え得る。排除条件への暴露後に、酵素が、（不活性化条件への暴露前の酵素活性と比べて）その酵素活性の少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）を維持する場合に、その酵素は排除条件に耐えると判断される。
例えば、酵素調製物、細胞溶解産物、及び／または無細胞反応混合物の天然酵素を熱不活性化する（例えば、少なくとも５５℃、または５５～９５℃の温度に、少なくとも３０秒または３０秒～６０分間にわたって暴露する）場合、経路酵素は熱安定性酵素であり得る。したがって、一部の実施形態では、ポリリン酸キナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、ＮＤＰキナーゼ、ヌクレオシドキナーゼ、ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、リボキナーゼ、ホスホペントムターゼ、及びポリメラーゼのうちの少なくとも１つは、その熱安定性バリアントである。酵素が、（ａ）天然酵素を変性する高温（すなわち４２℃）に一時的に曝露された後に活性を維持するか、または（ｂ）中温から高温に一時的に曝露された後に、天然酵素は低速で機能するのに、高速で機能する場合に、その酵素（例えば、キナーゼまたはポリメラーゼ）は熱安定性と判断される。熱安定な酵素は公知であり、かつ使用するための熱安定性酵素の非限定的例を本明細書において提示する。排除条件に耐え得る経路酵素の他の非限定的例も本明細書において提示する。一部の実施形態では、不所望な活性を示す天然酵素を反応混合物から物理的に除去する。一部の実施形態では、不所望な活性を示す酵素を、無細胞反応混合物から沈殿させる。一部の実施形態では、不所望な活性を示す酵素を反応混合物から濾過する（例えば、サイズに基づき）。一部の実施形態では、不所望な活性を示す酵素を反応混合物から、捕捉及び／またはクロマトグラフィー（例えば、固定相に対する示差アフィニティーにより）を介して除去する。一部の実施形態では、不所望な活性を示す酵素を反応混合物から、アフィニティークロマトグラフィーにより除去する。アフィニティークロマトグラフィーの例には、これに限定されないが、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、金属結合クロマトグラフィー（例えば、ニッケルクロマトグラフィー）、レクチンクロマトグラフィー、及びＧＳＴクロマトグラフィーが含まれる。一部の実施形態では、不所望な活性を示す酵素を反応混合物から、交換クロマトグラフィーを介して除去する。アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）の例には、これに限定されないが、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）クロマトグラフィー、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）クロマトグラフィー、及び第四級アミン（Ｑ）クロマトグラフィーが含まれる。カチオン交換クロマトグラフィーの例には、これに限定されないが、カルボキシメチル（ＣＭ）クロマトグラフィー、スルホエチル（ＳＥ）クロマトグラフィー、スルホプロピル（ＳＰ）クロマトグラフィー、リン酸（Ｐ）クロマトグラフィー、及びスルホン酸（Ｓ）クロマトグラフィーが含まれる。一部の実施形態では、不所望な活性を示す酵素を反応混合物から、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を介して除去する。疎水性相互作用クロマトグラフィーの例には、これに限定されないが、フェニルセファロースクロマトグラフィー、ブチルセファロースクロマトグラフィー、オクチルセファロースクロマトグラフィー、カプトフェニルクロマトグラフィー、トヨパールブチルクロマトグラフィー、トヨパールフェニルクロマトグラフィー、トヨパールヘキシルクロマトグラフィー、トヨパールエーテルクロマトグラフィー、及びトヨパールＰＰＧクロマトグラフィーが含まれる。上に詳述した化学のいずれも、別法で経路酵素を固定化または捕捉するために使用することができるであろう。
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍからのヌクレアーゼＰ１、亜鉛依存性酵素は、ＲＮＡ及び熱変性ＤＮＡ中の３’－５’－ホスホジエステル結合と、３’－リン酸で終止するモノ－及びオリゴヌクレオチド中の３’－ホスホモノエステル結合との両方を、塩基特異性を伴わずに加水分解する。ヌクレアーゼＰ１は、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを、リボヌクレオシド５’－モノリン酸のレベルまで完全に加水分解することができる
Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＩは、インタクトな細菌細胞の細胞周辺腔に局在化しており、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｔＲＮＡを含む広範なＲＮＡ分子の解重合を触媒する。生理学的条件下では、この酵素の細胞周辺局在化は、この酵素が細胞内でＲＮＡ安定性に対してわずかな影響しか有さないことを意味するが；しかしながら、細菌細胞溶解産物中で周辺質及び細胞質を混合すると、ＲＮアーゼＩが細胞ＲＮＡにアクセスすることが可能になる。細胞溶解産物中のＲＮアーゼＩの存在は、ＲＮＡ分解により合成ＲＮＡの収率を低下させ得る。ＲＮアーゼＩも、ＲＮアーゼＩをコードする遺伝子、ｒｎａも、細胞生存に必須ではなく、したがって、一部の実施形態では、ｒｎａを操作宿主細胞において欠失または変異させる。他の実施形態では、反応混合物中のＲＮアーゼＩを、内因性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化する。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＲ及びＲＮアーゼＴは、ｄｓＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ、さらには小さな非構造化ＲＮＡ分子の解重合を触媒する。この酵素も、この酵素をコードする遺伝子、ｒｎｒ及びｒｎｔもそれぞれ、細菌の細胞生存に必須ではなく、したがって、一部の実施形態では、ｒｎｒ及び／またはｒｎｔを操作宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞）中で欠失または変異させる。他の実施形態では、無細胞反応混合物中のＲＮアーゼＲ及び／またはＲＮアーゼＴを、内因性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化することができる。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＥ及びＰＮＰアーゼは、細胞においてｍＲＮＡターンオーバーを担うデグラドソームの構成成分である。ＲＮアーゼＥは、細胞ｍＲＮＡプールをターンオーバーするために、ＰＮＰアーゼ及びＲＮアーゼＩＩと一緒に機能すると考えられる。ＲＮアーゼＥをコードする遺伝子、ｒｎｅの破壊は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて致命的である。したがって、一部の実施形態では、無細胞反応混合物中のＲＮアーゼＥを、内因性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化することができる。ＰＮＰアーゼも、ＰＮＰアーゼをコードする遺伝子、ｐｎｐも、細胞生存に必須ではなく、したがって、一部の実施形態では、ｐｎｐを操作宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞）中で欠失または変異させる。他の実施形態では、反応混合物中のＰＮＰアーゼを、内因性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化する。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＩＩは、３’から５’方向でｍＲＮＡ及びｔＲＮＡの両方を解重合する。ＲＮアーゼＩＩも、ＲＮアーゼＩＩをコードする遺伝子、ｒｎｂも、細胞生存に必須ではなく、したがって、一部の実施形態では、ｒｎｂを操作宿主細胞中で欠失または変異させる。他の実施形態では、反応混合物中のＲＮアーゼＩＩを、内因性ＲＮＡの解重合後に熱不活性化することができる。
ｐｎｐもｒｎｂも宿主細胞の生存に必須ではないが、同時に両方を破壊することは致命的であり得る。したがって、一部の実施形態では、ＰＮＰアーゼ及びＲＮアーゼＩＩの両方を熱不活性化する。
ヌクレオシド一リン酸またはヌクレオシド二リン酸のヌクレオシド三リン酸へのリン酸化
細胞ＲＮＡをその構成モノマーに変換した後、かつＲＮＡを解重合するヌクレアーゼ（複数可）及び不所望な酵素活性の排除または不活性化の後に、生じたヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）またはヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）をリン酸化し、その後、それらを重合して、一本鎖ｍＲＮＡなどの所望の合成ＲＮＡを形成する。このプロセスはエネルギー依存的であり、したがって、エネルギー供給源、典型的には、例えば、ホスホエノールピルビン酸、ＡＴＰ、またはポリリン酸などの高エネルギーリン酸供給源を必要とする。
一部の実施形態では、エネルギー供給源は、細胞溶解産物に直接添加されるＡＴＰである。他の実施形態では、エネルギー供給源を、ＡＴＰ再生系を使用して供給する。例えば、ポリリン酸及びポリリン酸キナーゼを使用して、ＡＴＰを生産することができる。他の例には、ＡＴＰを生産するためにアセチル－リン酸及び酢酸キナーゼ；ＡＴＰを生産するためにホスホ－クレアチン及びクレアチンキナーゼ；ならびにＡＴＰを生産するためにホスホエノールピルビン酸及びピルビン酸キナーゼを使用することが含まれた。他のＡＴＰ（または他のエネルギー）再生系を使用することができる。一部の実施形態では、エネルギー供給源の少なくとも１つの構成成分を細胞溶解産物、細胞溶解産物混合物、または無細胞反応混合物に添加する。エネルギー供給源の「構成成分」には、エネルギー（例えば、ＡＴＰ）を生産するために必要とされる基質（複数可）及び酵素（複数可）が含まれる。これらの成分の非限定的例には、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼ、アセチル－リン酸と酢酸キナーゼ、ホスホ－クレアチンとクレアチンキナーゼ、及びホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼが含まれる。一部の実施形態では、ポリリン酸キナーゼは、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓポリリン酸キナーゼ２（ＤｇＰＰＫ２）である。一部の実施形態では、ポリリン酸キナーゼは、配列番号１で表されるキナーゼである。
キナーゼは、ＡＴＰなどの高エネルギーのリン酸供与分子から、特異的基質／分子へのリン酸基の転移を触媒する酵素である。このプロセスはリン酸化と称され、その際、基質は、高エネルギーＡＴＰ分子から供与されるリン酸基を獲得する。このエステル交換は、リン酸化基質及びＡＤＰを生産する。本開示のキナーゼは、一部の実施形態では、ＮＭＰをＮＤＰに、かつＮＤＰをＮＴＰに変換する。ヌクレオチド特異的（ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ）及び汎特異的（ｐａｎｓｐｅｃｉｆｉｃ）（ＮＤＰ）転移酵素の両方が、本発明において使用するために企図される。
一部の実施形態では、キナーゼは、ＡＴＰからＮＭＰへの高エネルギーリン酸の転移を触媒してＡＤＰ及びＮＤＰをもたらすヌクレオシド一リン酸キナーゼである。一部の実施形態では、細胞溶解産物は、次の４つのヌクレオシド一リン酸キナーゼのうちの１つまたは複数（または全部）を含む：ウリジル酸キナーゼ、シチジル酸キナーゼ、グアニル酸キナーゼ及びアデニル酸キナーゼ。例示的なヌクレオシド一リン酸キナーゼは表２～５において列挙されている。酵素の熱安定なバリアントが本開示には包含される。一部の実施形態では、ヌクレオシド一リン酸キナーゼのうちの１つまたは複数が熱安定性である。好ましい一実施形態では、ヌクレオシド一リン酸キナーゼの全部が熱安定性である。一部の実施形態では、熱安定性キナーゼの望ましくない活性を、任意のＮＴＰまたはＲＮＡ生産反応において使用する前に、熱不活性化する。一部の実施形態では、ウリジン酸キナーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来するか、またはそれから得る。一部の実施形態では、ウリジル酸キナーゼは、配列番号１４で表されるキナーゼである。一部の実施形態では、シチジル酸キナーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓに由来するか、またはそれから得る。一部の実施形態では、シチジル酸キナーゼは、配列番号１３で表されるキナーゼである。一部の実施形態では、グアニル酸キナーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａに由来するか、またはそれから得る。一部の実施形態では、グアニル酸キナーゼは、配列番号１５で表されるキナーゼである。一部の実施形態では、アデニル酸キナーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。一部の実施形態では、アデニル酸キナーゼは、配列番号１２で表されるキナーゼである。
Figure 2022524166000002
Figure 2022524166000003
Figure 2022524166000004
Figure 2022524166000005
Figure 2022524166000006
Figure 2022524166000007
Figure 2022524166000008
一部の実施形態では、キナーゼは、ホスホリル基をＮＤＰに転移させてＮＴＰをもたらすヌクレオシド二リン酸キナーゼである。ホスホリル基のドナーは、限定ではないが、ＡＴＰ、ポリリン酸ポリマー、またはホスホエノールピルビン酸であり得る。ＮＤＰをＮＴＰに変換するキナーゼの非限定的例には、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、及びピルビン酸キナーゼが含まれる。前述の酵素の熱安定なバリアントは本開示に包含される。一部の実施形態では、ＮＤＰキナーゼ（複数可）は、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓから得られる。
ＮＭＰのＮＴＰへのリン酸化は、一部の実施形態では、ポリリン酸依存性キナーゼ経路により生じ、その際、高エネルギーリン酸が、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）を介してポリリン酸からＡＤＰに転移される。一部の実施形態では、ポリリン酸キナーゼは、高エネルギーリン酸をポリリン酸からＡＤＰに転移してＡＴＰを形成するポリリン酸キナーゼ１（ＰＰＫ１）ファミリーに属する。続いて、このＡＴＰはＮＭＰキナーゼにより使用されて、ＮＭＰをそれらの同源リボヌクレオチド二リン酸（ＮＤＰ）に変換する。ＮＭＰキナーゼには、これに限定されないが、ＡＭＰキナーゼ、ＵＭＰキナーゼ、ＧＭＰキナーゼ、及び／またはＣＭＰキナーゼが含まれる。さらに続いて、ＡＴＰは、ヌクレオチド二リン酸キナーゼにより使用されてＮＤＰをＮＴＰに変換する。一部の実施形態では、本明細書に開示の方法で使用されるポリリン酸キナーゼは、ポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）ファミリーキナーゼである。一部の特定の実施形態では、ポリリン酸キナーゼは、高エネルギーリン酸をポリリン酸からＮＤＰに転移してＮＴＰを形成するクラスＩ ＰＰＫ２ファミリーに属する。この系により生産されたＡＴＰは高エネルギーリン酸ドナーとして、ＮＭＰをＮＤＰに変換するために使用される。一部の特定の実施形態では、ポリリン酸キナーゼは、高エネルギーリン酸をポリリン酸からＮＭＰ及びＮＤＰに転移してＮＴＰを形成するクラスＩＩＩ ＰＰＫ２ファミリーに属する。一部の実施形態では、クラスＩＩＩ ＰＰＫ２を単独で使用して、ＮＭＰからＮＴＰを生産する。他の実施形態では、クラスＩＩＩ ＰＰＫ２を他のキナーゼと組み合わせて使用する。クラスＩＩＩ ＰＰＫ２は、ＡＤＰ、ＡＭＰ、及びポリリン酸からＡＴＰを生産し、続いて、ＮＭＰ及びＮＤＰキナーゼにより使用されてＮＭＰをＮＴＰに変換する。例示的なポリリン酸キナーゼを表６に列挙する。
Figure 2022524166000009
Figure 2022524166000010
一部の実施形態では、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ＧＭＰ、ＮＤＰ、及びＰＰＫキナーゼの一部または全部を反応後に熱不活性化する。他の実施形態では、本明細書において提供される無細胞反応混合物中で使用されるＰＰＫ２酵素は熱安定性であり得る。例えば、ＰＰＫ２酵素は、ポリリン酸重合よりもＡＴＰ合成に有利で、ＡＤＰ及びＡＭＰの両方をＡＴＰに変換する熱安定性クラスＩＩＩ ＰＰＫ２酵素であり得る。一部の実施形態では、ポリリン酸キナーゼは、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓに由来するか、またはそれから得られるクラスＩＩＩ ＰＰＫ２酵素である。一部の実施形態では、ポリリン酸キナーゼは、配列番号１で表されるキナーゼである。一部の実施形態では、ＰＰＫ２酵素を使用して、例えば、１時間あたり１０～８００ｍＭ（例えば、１時間あたり１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、または８００ｍＭ）の範囲の速度で、ヘキサメタリン酸などのポリリン酸をＡＴＰに変換する。
本開示はまた、融合酵素を包含する。融合酵素は、異なる酵素の活性にそれぞれ対応する複数の活性を示し得る。例えば、独立したヌクレオシド一リン酸キナーゼ及び独立したヌクレオシド二リン酸キナーゼを使用するのではなく、ヌクレオシド一リン酸キナーゼ活性及びヌクレオシド二リン酸キナーゼ活性の両方を有する融合酵素（または任意の他の酵素）を使用することができる。
本開示が、本明細書に記載の酵素のうちのいずれか１つまたは複数、さらには、酵素のバリアント（例えば、「ＰＰＫ２バリアント」）の使用も具体化していることは理解されるべきである。バリアント酵素は、基準酵素と、ある一定程度の配列同一性を共有し得る。「同一性」という用語は、配列を比較することにより決定されるとおりの２種以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関連を指す。同一性は、特定の数理モデルまたはコンピュータープログラム（例えば、「アルゴリズム」）により処理された、ギャップアラインメント（もしあるならば）を含む２つ以上の小さな配列間の同一マッチのパーセントを測るものである。関連分子の同一性は、公知の方法により容易に計算することができる。「同一性パーセント（％）」は、アミノ酸または核酸配列に適用される場合、配列をアラインさせ、かつ必要な場合には、最大同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後に、第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸または核酸配列中の残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージと定義される。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算の際に導入されるギャップ及びペナルティーにより値が異なり得る。特定の配列のバリアントは、本明細書において記載されていて、かつ当業者に知られている配列アラインメントプログラム及びパラメーターにより決定されるとおり、その特定の基準配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ただし１００％未満の配列同一性を有し得る。
２つの配列間での配列の比較及び同一性パーセントの決定は、数理アルゴリズムを使用して達成することができる。同一性を決定するための技術は、公共利用可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピューターソフトウェアには、これに限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １： ３８７， １９８４）、ＢＬＡＳＴスーツ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９）、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３， １９９０）が含まれる。他の技術には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １４７： １９５；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ． Ｂ． ｅｔ ａｌ．， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３；及びＦａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ （ＦＯＧＳＡＡ） （Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ３： １７４６， ２０１３）が含まれる。
ＤＮＡテンプレート
一部の実施形態では、反応物は、本明細書に開示の方法に従って生産されるｍＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートを含む。ｍＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートは、操作細胞から得るか（例えば、プラスミド上か、またはゲノムＤＮＡ内に組み込み）、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して生産することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡテンプレートを無細胞反応混合物に、ＲＮＡの生合成中に（例えば、熱不活性化ステップ後に）添加する。一部の実施形態では、細胞溶解産物中のＤＮＡテンプレート濃度は０．００５～１．０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、細胞溶解産物中のＤＮＡテンプレート濃度は０．００５ｇ／Ｌ、０．０１ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、または１．０ｇ／Ｌである。
ＤＮＡテンプレートは、プロモーター、任意選択で誘導性プロモーターを含む。ＤＮＡテンプレートはまた、プロモーターに作動可能に結合している所望のＲＮＡ産物をコードするヌクレオチド配列（オープンリーディングフレーム、またはＯＲＦ）を含む。任意選択で、ＤＮＡテンプレートは転写ターミネーターを含む。
プロモーターまたはターミネーターは、天然に存在する配列または操作配列であり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、天然に存在する配列である。他の実施形態では、プロモーターは操作配列である。一部の実施形態では、プロモーターを、転写活性を増強するように操作する。一部の実施形態では、ターミネーターは、天然に存在する配列である。他の実施形態では、ターミネーターは操作配列である。ＤＮＡテンプレートを、一部の事例では、ｍＲＮＡの転写を選択的に促進する転写プロモーターを有するように操作することができる。
ｍＲＮＡは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を、コード配列の片側または両側に含んでよい。５’側に位置する場合、５’ＵＴＲ（またはリーダー配列）と呼ばれるか、または３’側に位置する場合、３’ＵＴＲ（またはトレイラー配列）と呼ばれる。ＵＴＲは、本明細書に記載の機能に限らず、様々な生物学的機能を有し得る。５’ＵＴＲは、翻訳を制御する二次構造を形成し得て、場合によっては、それ自体翻訳され得る。５’ＵＴＲは有利には、リボソームが結合してｍＲＮＡの翻訳を開始することを可能にする、リボソームにより認識される配列を含む。一部の５’ＵＴＲは、タンパク質と相互作用することが見い出されている。一部の５’ＵＴＲ配列は、ｍＲＮＡ局在化に関連していて、シグナル及び細胞機構を移出する。メッセンジャーＲＮＡの３’－非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の配列及び構造は、それらの安定性、局在化、及び発現を管理し得る。３’ＵＴＲ調節エレメントは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、それらの関連機構、及びＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）を含む広範囲の様々なトランス活性化因子により認識される。次いで、これらの因子により、共通の機械的戦略が、３’ＵＴＲによりコードされる調節プログラムを実行することとなる。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、転写開始の効率を改善して転写反応（例えば、無細胞反応）からのＲＮＡ産物収率を最大化する、５’ＵＴＲの５’末端に位置する初期転写配列（ＩＴＳ）を含んでよい。ＩＴＳは、約６～１５ヌクレオチドの短い配列である。存在する場合、ＩＴＳは、転写の初期段階（開始及びプロモータークリアランスによる伸長相への遷移）において重要な役割を有し、所与のプロモーターからの転写の全体速度及び収率に影響を及ぼす。一部の実施形態では、ＩＴＳは、天然に存在するＩＴＳ、例えば、Ｔ７クラスＩＩＩプロモーターの下流で見い出されるコンセンサスＩＴＳである。一部の実施形態では、コンセンサスＴ７クラスＩＩＩプロモーターＩＴＳは、６ヌクレオチド長さ（ＧＧＧＡＧＡ）である。一部の実施形態では、ＩＴＳは、合成ＩＴＳ、例えば、ＧＧＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴ（配列番号１７）である。一部の実施形態では、ＩＴＳは、合成ＩＴＳの６～１５ヌクレオチド（「短縮化ＩＴＳ」）、例えば、ＧＧＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴ（配列番号１７）である。
一部の実施形態では、ＤＮＡテンプレートによりコードされる転写ＲＮＡは、１つまたは複数の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ＵＴＲを、ｍＲＮＡコード配列と戦略的または経験的にマッチさせて、ｍＲＮＡの翻訳レベル及びプロセシングを最適化することができ；言い換えると、これらは、ｍＲＮＡのモジュラー成分である。ＤＮＡテンプレートは、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡにどちらも隣接していないか、または両方とも隣接している、ｍＲＮＡ５’ＵＴＲ配列、ｍＲＮＡ３’ＵＴＲ配列をコードするＤＮＡを含み得る。これらの方法で使用されるＵＴＲ配列は複数の種及び遺伝子に由来し得て、５’及び３’配列は、両方とも存在する場合、同じ種または遺伝子に由来する必要はない。ＵＴＲ配列を、特異的な二次構造、結合部位、または他の要素を含むように操作することができる。本発明の方法で使用することができるＵＴＲには、これに限定されないが、表７に列挙のＵＴＲが含まれる。
Figure 2022524166000011
本開示は、生じるｍＲＮＡの３’末端に、ｍＲＮＡのためのポリアデニラート「テール」配列をコードするＤＮＡテンプレートを企図する。一部の実施形態では、ポリアデニラートテールは、５０～２５０ヌクレオチド長さである。本開示はまた、ポリアデニラートテールがコードされないＤＮＡテンプレートを企図する。任意選択で、ＤＮＡテンプレートは、ポリアデニル化シグナルをコードする。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化ポリメラーゼにより読み取られる。任意選択で、ＤＮＡテンプレートは、生じるｍＲＮＡの３’末端にリボザイム配列をコードするので、リボザイムがポリアデニラートテールに対して３’に配置されることとなる。
一部の実施形態では、ＤＮＡテンプレートは線状である。ＤＮＡテンプレートは、ポリメラーゼ連鎖反応を介して生成することができる。ＤＮＡテンプレートは、カセットまたは環状プラスミド、線状化環状プラスミド、もしくは線状プラスミドを含むプラスミドに含まれ得る。使用されるプラスミドは、高コピー、または中程度コピー複製起源で、これに限定されないが、ｐＵＣファミリーまたはｐＥＴファミリーを含めて、いずれも当技術分野で公知であり得る。
ＤＮＡテンプレートは、制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素としても公知）切断部位を含み得る。ＤＮＡテンプレートがそのための部位を含む制限エンドヌクレアーゼは、タイプＩＩＳ多様性制限エンドヌクレアーゼであり得る。一部の実施形態では、制限酵素は、平滑末端の手法で切断するか、または５’オーバーハングをもたらす。一部の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、Ｔ７ポリメラーゼの不所望な転写活性を回避するために、３’オーバーハングを伴わずに切断する。一部の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、切断部位の５’末端側への配列要求を有さない。一部の実施形態では、制限酵素がポリアデニラートテール生成配列後に切断するように、制限エンドヌクレアーゼ部位を位置させる。一部の実施形態では、制限酵素がポリアデニラートテール生成配列後に、最後のアデニン塩基後に付加される追加のヌクレオチドを含まずに切断するように、制限エンドヌクレアーゼ部位を位置させる。制限エンドヌクレアーゼ部位を含む環状プラスミドを用いる実施形態では、環状プラスミドを、対応する制限エンドヌクレアーゼで処理して、それを線状化することができる。一部の実施形態では、制限酵素は、培養物中の細胞により産生される。一部の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼを、制限エンドヌクレアーゼを産生する細胞から得られる細胞溶解産物から調製する。一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡ及び制限エンドヌクレアーゼを、ＤＮＡテンプレートの線状化が生じる条件下で一緒にインキュベートする。一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡ及び／または制限エンドヌクレアーゼを線状化の前後に精製する。環状プラスミドは転写ターミネーター配列を含み得る。ＤＮＡテンプレートは典型的には、プラスミドなどのベクター上で提示されるが、他のテンプレート形式を使用することもできる（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成される線状ＤＮＡテンプレート、化学合成、または当技術分野で公知の他の手段）。
一部の実施形態では、反応混合物中で、１つよりも多いＤＮＡテンプレートを使用する。一部の実施形態では、２、３、４、または５つの異なるＤＮＡテンプレートを反応混合物中で使用する。一部の実施形態では、１つよりも多いｍＲＮＡ配列を単一のテンプレートでコードする。
一部の実施形態では、ＤＮＡテンプレートを含む溶解産物を、重合ステップの前に熱不活性化ステップで処理する。
ヌクレオシド三リン酸のリボ核酸への重合
ＮＴＰを上に開示したとおりに生産し、かつ１つまたは複数のＤＮＡテンプレートを得た後に、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｍＲＮＡの生合成を、ＮＴＰをＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡ）へと重合することにより達成する。前記方法のこのステップで、ＤＮＡテンプレートを目的のＲＮＡに転写する。
精製ＡＭＰまたはＡＤＰ及びリン酸ドナーをＰＰＫの存在下で使用して、ＡＴＰを生産することができる。別の態様では、細胞ＲＮＡから得られたＡＭＰまたはＡＤＰ及びリン酸ドナーをＰＰＫの存在下で使用して、ＡＴＰを生産することができる。
同様に、ＧＴＰを反応物に直接添加することができるか、または１つまたは複数のキナーゼの存在下の精製ＧＭＰまたはＧＤＰ及びリン酸ドナーを使用して、ＧＴＰを生産することもできる。また別の態様では、細胞ＲＮＡから得られたＧＭＰまたはＧＤＰ及びリン酸ドナーを１つまたは複数のキナーゼの存在下で使用して、ＧＴＰを生産することができる。
ＲＮＡ重合は、ＮＴＰ、転写プロモーターを含むＤＮＡテンプレート、及び転写プロモーターを認識して転写を開始するポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）を必要とする。典型的には、本明細書において提供されるとおりに使用するためのポリメラーゼは、その同源転写プロモーターについて高度に選択的であり、高い忠実度を有し、かつ高度に効率的である単一サブユニットポリメラーゼである。そのようなポリメラーゼの例には、限定ではないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ファージプロモーターに高度に特異的なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。この９９ｋＤ酵素は、Ｔ７プロモーターの制御下で、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡ合成を触媒する。バクテリオファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ファージプロモーターに高度に特異的なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。この９９ｋＤ酵素は、Ｔ３プロモーターの制御下で、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡ合成を触媒する。バクテリオファージＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６ファージプロモーターに高度に特異的なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。９８．５ｋＤポリメラーゼは、ＳＰ６プロモーターの制御下で、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡ合成を触媒する。Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６ポリメラーゼのそれぞれは、３７～４０℃で最適に活性である。一部の実施形態では、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６ポリメラーゼの熱安定性バリアントを使用する。熱安定なバリアントポリメラーゼは典型的には、４０℃超（または約４０～６０℃）の温度で最適に活性である。一部の実施形態では、ポリメラーゼは熱安定性ではない。一部の実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼを使用する。一部の実施形態では、前記方法で使用されるＴ７ポリメラーゼを沈殿及び遠心分離により精製するか、または部分的に精製し、その後、重合反応において使用する。一部の実施形態では、沈殿及び遠心分離により精製されたか、または部分的に精製されたＴ７ポリメラーゼをクロマトグラフィーによりさらに精製するか、または部分的に精製し、その後、重合反応において使用する。
Figure 2022524166000012
本明細書に開示のとおり、「ＲＮＡを生合成するための条件」とも称される「ヌクレオシド三リン酸の生産及びヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件」は、当技術分野の通常の技能の者であれば、例えば、ｐＨ、温度、時間、及び細胞溶解産物の塩濃度、さらには任意の外因性補因子を含むポリメラーゼ活性に最適な条件を考慮して決定することができる。
ＲＮＡ生合成中の無細胞反応混合物のｐＨは、３．０～８．０の値を有し得る。一部の実施形態では、無細胞反応混合物のｐＨ値は、３～８、４～８、５～８、６～８、７～８、３～７、４～７、５～７、６～７、３～６、４～６、５～６、３～５、３～４、または４～５である。一部の実施形態では、無細胞反応混合物のｐＨ値は、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、または８．０である。有利な実施形態では、ＲＮＡの生合成中の無細胞反応混合物のｐＨ値は７．０～７．５である。
ＲＮＡ生合成中の無細胞反応混合物の温度は１５℃～９５℃であり得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ生合成中の無細胞反応混合物の温度は、３０～６０℃、３０～５０℃，４０～６０℃、４０～５０℃、５０～７０℃、５０～６０℃である。一部の実施形態では、ＲＮＡ生合成中の無細胞反応混合物の温度は、３０℃、３２℃、３７℃、４０℃、４２℃、４５℃、５０℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、または６０℃である。有利な実施形態では、ＲＮＡ生合成中の無細胞反応混合物の温度は３７～５５℃である。
ＲＮＡ生合成中の無細胞反応混合物は、１５分（ｍｉｎ）～７２時間（ｈｒｓ）にわたってインキュベートすることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ生合成中の無細胞反応混合物を３０分～４８時間にわたってインキュベートする。例えば、ＲＮＡ生合成中の無細胞反応混合物は、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、または８時間にわたってインキュベートすることができる。一部の有利な実施形態では、ＲＮＡ生合成中の無細胞反応混合物を１～４時間にわたってインキュベートする。
一部のポリメラーゼ活性は、金属イオンの存在を必要とし得る。したがって、一部の実施形態では、金属イオンを細胞溶解産物に添加する。金属イオンの非限定的例には、Ｍｇ２＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｎｉ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、及びＭｎ２＋が含まれる。他の金属イオンを使用することもできる。一部の実施形態では、１種よりも多い金属イオンを使用することができる。細胞溶解産物中の金属イオンの濃度は、０．１ｍＭ～１００ｍＭ、または１０ｍＭ～５０ｍＭであり得る。一部の実施形態では、細胞溶解産物中の金属イオンの濃度は、０．１、０．２、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍＭである。Ｍｇ２＋が、前記反応における好ましい金属イオンである。
熱安定性酵素
本開示の無細胞ＲＮＡ－生合成法の利点の１つは、内因性ＲＮＡを合成ｍＲＮＡに変換するために必要とされる全ての酵素が、例えば、単一の操作細胞で発現され得る（ただし、発現される必要はない）ことである。例えば、操作細胞のクローン集団を所望の細胞密度まで培養し、細胞を溶解し、内因性ＲＮＡがそのモノマー形態に解重合する条件下で（例えば、５５～９９℃の温度で）インキュベートし、内因性ヌクレアーゼ及びホスファターゼを不活性化するために十分な温度（例えば、５５～９９℃）に掛け、ｓｓＲＮＡの重合が生じる条件（例えば、５５～９９℃）下でインキュベートする。最終産物の合成ＲＮＡに処理するために、ＮＭＰからＮＤＰへ（例えば、ヌクレオシド一リン酸キナーゼ及び／またはポリリン酸キナーゼ）、ＮＤＰからＮＴＰへ（例えば、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ及び／またはポリリン酸キナーゼ）、及びＮＴＰからＲＮＡへ（例えば、ポリメラーゼ）の変換に必要とされる酵素は、内因性ヌクレアーゼ（及び／または外因性ヌクレアーゼ）及びホスファターゼの熱不活性化中の変性を回避するために、熱安定性であり得る。熱安定性は、相対的に高い温度で変性に耐える酵素の特質を指す。例えば、ある酵素が４２℃の温度で変性される（不活性化される）場合、同様の活性（例えば、キナーゼ活性）を有する酵素が、４２℃で変性しなければ、「熱安定性」と判断される。
酵素が（ａ）他の天然酵素を変性する高温に一時的に曝露された後に活性を維持しているか、または（ｂ）中温から高温に一時的に曝露された後に、天然酵素は低速で機能するのに、高速で機能する場合に、その酵素（例えば、キナーゼまたはポリメラーゼ）は熱安定性と判断される。
一部の実施形態では、熱安定性酵素は、そうでなければ同様の（非熱安定性の）天然酵素を変性するであろう相対的に高い温度（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉから得られたキナーゼでは４１℃超、多くのＲＮＡポリメラーゼでは３７℃超）に一時的に曝露した後に、５０％超の活性を維持する。一部の実施形態では、熱安定性酵素は、そうでなければ同様の（非熱安定性の）天然酵素を変性するであろう相対的に高い温度に一時的に曝露した後に、５０％～１００％の活性を維持する。例えば、熱安定性酵素は、そうでなければ同様の（非熱安定性の）天然酵素を変性するであろう相対的に高い温度に一時的に曝露した後に、５０～９０％、５０～８５％、５０～８０％、５０～７５％、５０～７０％、５０～６５％、５０～６０％、または５０～５５％の活性を維持し得る。一部の実施形態では、熱安定性酵素は、そうでなければ同様の（非熱安定性の）天然酵素を変性するであろう相対的に高い温度に一時的に曝露した後に、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の活性を維持する。
一部の実施形態では、中温から高温（例えば、４２～８０℃）に一時的に曝露した後の熱安定性酵素の活性は、同様の（非熱安定性の）天然酵素の活性よりも高い（例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％高い）。
熱安定性キナーゼの活性は、例えば、キナーゼがリン酸化することができるＮＭＰまたはＮＤＰの量により測定することができる。したがって、一部の実施形態では、熱安定性キナーゼは、相対的に高い温度（例えば、４２℃）で、３７℃で同様の変換を完了するために必要とされる同じ時間量で、ＮＭＰの５０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの５０％超をＮＴＰに変換する。一部の実施形態では、熱安定性キナーゼは、相対的に高い温度（例えば、４２℃）で、３７℃で同様の変換を完了するために必要とされる同じ時間量で、ＮＭＰの６０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの６０％超をＮＴＰに変換する。一部の実施形態では、熱安定性キナーゼは、相対的に高い温度（例えば、４２℃）で、３７℃で同様の変換を完了するために必要とされる同じ時間量で、ＮＭＰの７０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの７０％超をＮＴＰに変換する。一部の実施形態では、熱安定性キナーゼは、相対的に高い温度（例えば、４２℃）で、３７℃で同様の変換を完了するために必要とされる同じ時間量で、ＮＭＰの８０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの８０％超をＮＴＰに変換する。一部の実施形態では、熱安定性キナーゼは、相対的に高い温度（例えば、４２℃）で、３７℃で同様の変換を完了するために必要とされる同じ時間量で、ＮＭＰの９０％超をＮＤＰに、またはＮＤＰの９０％超をＮＴＰに変換する。
熱安定性ポリメラーゼの活性は、例えば、忠実度及び重合反応速度（例えば、重合速度）に基づき評価される。したがって、１単位の熱安定性Ｔ７ポリメラーゼは、例えば、３０分で、３７℃超の温度で（例えば、５０℃で）、１０ｎｍｏｌｅのＮＴＰを酸不溶性物質に組み込むことができる。
熱安定性酵素（例えば、キナーゼまたはポリメラーゼ）は、４２℃～９９℃、またはそれ以上の温度で活性であり続け得る（反応を触媒することができる）。一部の実施形態では、熱安定性酵素は、４２～９５℃、４２～９０℃、４２～８５℃、４２～８０℃、４２～７０℃、４２～６０℃、４２～５０℃、５０～８０℃、５０～７０℃、５０～６０℃、６０～８０℃、６０～７０℃、または７０～８０℃の温度で活性であり続ける。例えば、熱安定性酵素は、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、または９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、または９９℃の温度で活性であり続け得る。熱安定性酵素は、相対的に高い温度で、１５分～４８時間、またはそれ以上にわたって活性であり続け得る。例えば、熱安定性酵素は、相対的に高い温度で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、３６、４２、または４８時間にわたって活性であり続け得る。
熱安定性ＲＮＡポリメラーゼは、野生型酵素を修飾することにより調製することができる。そのような修飾（例えば、変異）は公知である。例えば、バリアント熱安定性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、次の点変異のうちの１つまたは複数を含み得る：Ｖ４２６Ｌ、Ａ７０２Ｖ、Ｖ７９５Ｉ、Ｓ４３０Ｐ、Ｆ８４９Ｉ、Ｓ６３３Ｉ、Ｆ８８０Ｙ、Ｃ５１０Ｒ、及びＳ７６７Ｇ（それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＥＰ２３７７９２８及びＥＰ１２６１６９６Ａ１）。他のバリアント及び組み換え熱安定性ポリメラーゼも本開示に包含される。野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼも使用することができる。
一部の実施形態では、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼを、ｍＲＮＡを生産するために使用する。例えば、１～２％の総タンパク質濃度を有する熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（例えば、４０～６０℃の温度でインキュベートされる）を使用して、ｍＲＮＡを、２ｇ／Ｌ／時を超える速度（または、例えば、２ｇ／Ｌ／時～１０ｇ／Ｌ／時）で合成することができる。別の例として、３～５％の総タンパク質濃度を有する熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（例えば、４０～６０℃の温度でインキュベートされる）を使用して、ｍＲＮＡを、１０ｇ／Ｌ／時を超える速度（または、例えば、１０ｇ／Ｌ／時～２０ｇ／Ｌ／時）で合成することができる。
本開示の多くの実施形態が熱安定性酵素の使用を記載しているが、他の酵素を使用することもできることは理解されるべきである。本明細書において論述される酵素は熱安定性である必要はないが、論述された全ての酵素の熱安定性バリアントが本開示に包含される。一部の実施形態では、精製ポリメラーゼを外因的に、熱不活性化細胞溶解産物に添加して、例えば、熱安定性酵素（複数可）の活性の何らかの低下または減損を補償することができる。
ポリアデニラートテールの酵素的添加
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとも呼ばれるポリＡポリメラーゼ、ＥＣ２．７．７．１９を使用して、ポリアデニラートテールを酵素的に付加する。この酵素は、ＲＮＡ及びＡＴＰを基質として使用し、ＲＮＡの３’末端へのＡヌクレオチドの付加を触媒する。一部の実施形態では、ＲＮＡ合成後の別のステップで、例えば、熱不活性化によりＲＮＡポリメラーゼを不活性化した後に、ポリＡポリメラーゼを用いるポリアデニル化を実行する。一部の実施形態では、ポリＡポリメラーゼをこの段階で、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、及びポリリン酸と共に添加する。一部の実施形態では、添加されるＡＭＰは精製されている。一部の実施形態では、ＡＭＰを、ＮＭＰの混合物の一部として、または細胞溶解産物として供給する。
操作細胞
本開示の操作細胞は、ＲＮＡを生合成するために必要とされる酵素活性のうちの少なくとも１つ、多く、または全部を含み得る。「操作細胞」は、少なくとも１つの操作（例えば、組み換えまたは合成）核酸を含むか、またはそれらの天然に存在するカウンターパートとは構造的及び／または機能的に別個であるように別段に修飾されている細胞である。したがって、操作核酸を含む細胞が「操作細胞」と判断される。
本開示の操作細胞は、一部の実施形態では、ＲＮＡ、ＲＮＡを解重合する酵素、キナーゼ、及び／またはポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、操作細胞はさらに、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合しているプロモーターを含むＤＮＡテンプレートを含む。
操作細胞は、一部の実施形態では、選択マーカーを発現する。選択マーカーは典型的には、細胞のトランスフェクション後に（または外来核酸を細胞に導入するために使用される他の手順後に）、操作核酸を取り込んでいる操作細胞を選択するために使用される。したがって、産物をコードする核酸は、選択マーカーもコードし得る。選択マーカーの例には、限定ではないが、抗生物質に対する耐性または感受性を上昇または低下させるタンパク質をコードする遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐震遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びクロラムフェニコール耐性遺伝子）または他の化合物が含まれる。選択マーカーの追加の例には、限定ではないが、細胞が、さもなければ必須の栄養素が欠乏している培地中で増殖することを可能にするタンパク質をコードする遺伝子（栄養要求マーカー）が含まれる。他の選択マーカーを本開示に従って使用することができる。
核酸（例えば、操作核酸）によりコードされる産物が細胞により産生される場合に、操作細胞は、産物を「発現する」。遺伝子発現が、核酸の形態の遺伝的指令がタンパク質（例えば、酵素）などの産物を合成するために使用されるプロセスを指すことは、当技術分野で公知である。
操作細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。一部の実施形態では、操作細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、または他の種類の細胞である。例には、これに限定されないが、酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、またはＶｉｂｒｉｏ細胞が含まれる。これらの細胞は、商業的に供給され得る。これらの細胞を培養物中で、標準的な高生産性方法を使用して増殖させることができる。
本開示の操作細菌細胞には、限定ではないが、操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｓｐｐ．、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｐ．、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｐ．、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、ａｎｄ Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐｐ．が含まれる。
本開示の操作酵母細胞には、限定ではないが、操作されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＰｉｃｈｉａ．が含まれる。
一部の実施形態では、本開示の操作細胞は、操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ細胞、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ細胞である。一部の実施形態では、本開示の操作細胞は、操作Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である。本明細書で使用される場合、種「から」という語句では、本発明者らは、遺伝子及び遺伝子産物が、その種において天然にコードされて、産生されること、ならびにその用語が、そのような種からの単離及び異種の種、特に、細菌、酵母、または他の組み換え宿主における組み換え産生を包含することを意味している。
一部の実施形態では、本開示の無細胞ＲＮＡ生合成法は、単一の操作細胞で発現され得る(ただし、発現される必要はない）。例えば、操作細胞のクローン集団を所望の細胞密度まで培養し、細胞を溶解し、内因性ＲＮＡがそのモノマー形態に解重合される条件下で（例えば、３０～３７℃の温度で）インキュベートし、内因性ヌクレアーゼ及びホスファターゼを不活性化するために十分な温度（例えば、４０～９９℃）に掛け、ｓｓＲＮＡの重合が生じる条件（例えば、３０～５０℃）下でインキュベートする。最終産物の合成ＲＮＡに処理するために、ＮＭＰからＮＤＰへ（例えば、ヌクレオシド一リン酸キナーゼ及び／またはポリリン酸キナーゼ）、ＮＤＰからＮＴＰへ（例えば、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ及び／またはポリリン酸キナーゼ）、及びＮＴＰからＲＮＡへ（例えば、ポリメラーゼ）の変換に必要とされる酵素は、内因性ヌクレアーゼ（及び／または外因性ヌクレアーゼ）及びホスファターゼの熱不活性化中の変性を回避するために、熱安定性であり得る。熱安定性は、相対的に高い温度で変性に耐える酵素の特質を指す。例えば、ある酵素が４２℃の温度で変性される（不活性化される）場合、同様の活性（例えば、キナーゼ活性）を有する酵素が、４２℃で変性しなければ、「熱安定性」と判断される。
操作核酸
「核酸」は、一緒に共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドであり、一部の事例では、ホスホジエステル結合（例えば、ホスホジエステル「骨格」）を含み得る。核酸（例えば、核酸の構成成分、または一部）は、天然に存在し得るか、または操作され得る。「天然に存在する」核酸は、ヒト介入の非存在下で天然に存在する細胞中に存在する。「操作核酸」には、組み換え核酸及び合成核酸が含まれる。「組み換え核酸」は、（例えば、同じ種からの、または異なる種からの）核酸分子を結合することにより構築される分子を指し、典型的には、生細胞において複製され得る。「合成核酸」は、生物学的に合成されるか、化学的に合成されるか、または他の手段により合成もしくは増幅される分子を指す。合成核酸には、化学的に修飾されているか、または別段に修飾されているが、天然に存在する核酸分子と塩基対合し得る核酸が含まれる。組み換え及び合成核酸には、前述のいずれかの複製から生じる分子も含まれる。操作核酸は、天然に存在する核酸の部分を含み得るが、全体としては、操作核酸は天然に存在せず、ヒトの介入を必要とする。一部の実施形態では、本開示の産物をコードする核酸は、組み換え核酸または合成核酸である。他の実施形態では、産物をコードする核酸は天然に存在する。
本明細書において提供されるとおり、ＲＮＡをコードする操作核酸は、核酸の制御領域であり、核酸の残りの部分の転写の開始及び速度がそこで制御される「プロモーター」に作動可能に結合していてよい。プロモーターは、調節する核酸の発現を駆動するか、または転写を駆動する。
所与の遺伝子または配列のコーディングセグメントの上流に配置された５’非コード配列を単離することにより得ることができるとおり、プロモーターは、遺伝子または配列と天然に会合したものであり得る。そのようなプロモーターは「内因性」と称され得る。
一部の実施形態では、コーディング核酸配列は、組換えまたは異種プロモーターの制御下に位置し得て、異種プロモーターはその天然環境においてコードされた配列と通常は会合しないプロモーターを指す。そのようなプロモーターには、他の遺伝子のプロモーター；任意の他の細胞から単離されるプロモーター；及び当技術分野で公知の遺伝子工学の方法により、発現を変化させる異なる転写制御領域及び／または変異の異なる要素を含むものなどの「天然に存在しない」合成プロモーターまたはエンハンサーが含まれる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に生産することに加えて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む組換えクローニング及び／または核酸増幅技術を用いて配列を生産することができる。
プロモーターは、その核酸の転写開始及び／または発現を制御（「駆動」）するように調節する核酸に関して正確な機能的配置及び配向にある場合、「作動可能に結合されている」と判断される。
本開示の操作核酸は、構成プロモーターまたは誘導性プロモーターを含み得る。「構成プロモーター」は、細胞において常に活性であるプロモーターを指す。「誘導性プロモーター」は、誘導剤もしくは誘導剤の存在下で、それにより影響を受けて、またはそれと接触した場合に、または抑制を引き起こす因子の非存在下で活性化された場合に、転写活性を開始または増強するプロモーターを指す。本開示に従って使用するための誘導性プロモーターには、本明細書において記載されているか、または当技術分野の通常の技能の者に公知である任意の誘導性プロモーターが含まれる。誘導性プロモーターの例には、限定ではないが、アルコール制御プロモーター、テトラサイクリン制御プロモーター、ステロイド制御プロモーター、金属制御プロモーター、病原性制御プロモーター、温度／熱誘導性、リン酸制御（例えば、ＰｈｏＡ）、及び光制御プロモーターなどの化学的／生化学的に制御される、及び物理的に制御されるプロモーターが含まれる。
誘導因子または誘導剤は、誘導性プロモーターからの転写活性の制御において活性であるように誘導性プロモーターと接触する内因性または通常は外因性の条件（例えば、光）、化合物（例えば、化学または非化学化合物）またはタンパク質であり得る。したがって、核酸の「転写を調節するシグナル」は、誘導性プロモーターに作用する誘導因子シグナルを指す。転写を調節するシグナルは、使用される制御システムに応じて、転写を活性化または不活性化し得る。転写の活性化は、転写を駆動するようにプロモーターに対して直接的に作用すること、またはプロモーターが転写を駆動することを阻止するリプレッサーを不活性化することにより、プロモーターに対して間接的に作用することを伴い得る。逆に、転写の非活性化は、転写を阻止するようにプロモーターに直接的に作用すること、またはプロモーターに作用するリプレッサーを活性化することにより、プロモーターに間接的に作用することを伴い得る。
限定ではないが、形質転換、トランスフェクション（例えば、化学的（例えば、リン酸カルシウム、陽イオン性ポリマー、またはリポソーム）または非化学的（例えば、電気穿孔、ソノポレーション、インペールフェクション、光学的トランスフェクション、高水圧（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ）トランスフェクション））、及び形質導入（例えば、ウイルス形質導入）を含む、当技術分野で公知の任意の手段を使用して、操作核酸を宿主細胞に導入することができる。
天然に存在する細胞内核酸によりコードされる酵素または他のタンパク質は、「内因性酵素」または「内因性タンパク質」と称され得る。
細胞培養物及び細胞溶解産物
多くの実施形態で、操作細胞を培養する。「培養すること」は、細胞を制御条件下で、典型的にはそれらの天然環境外で増殖させるプロセスを指す。例えば、操作細菌細胞などの操作細胞を、液体「培養培地」とも称される液体栄養素ブロス中の細胞懸濁液として増殖させることができる。
一般的に使用される細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ増殖培地の例には、限定ではないが、ＬＢ（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ）Ｍｉｌｌｅｒ ｂｒｏｔｈ（１％ＮａＣｌ）：１％ペプトン、０．５％酵母抽出物、及び１％ＮａＣｌ；ＬＢ（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ）Ｌｅｎｎｏｘ Ｂｒｏｔｈ（０．５％ＮａＣｌ）；１％ペプトン、０．５％酵母抽出物、及び０．５％ＮａＣｌ；ＳＯＢ培地（Ｓｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｂｒｏｔｈ）：２％ペプトン、０．５％酵母抽出物、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４；ＳＯＣ培地（異化リプレッサーを含むＳｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌ ｂｒｏｔｈ）：ＳＯＢ＋２０ｍＭグルコース；２ｘＹＴ ｂｒｏｔｈ（２ｘ酵母抽出物及びトリプトン）：１．６％ペプトン、１％酵母抽出物、及び０．５％ＮａＣｌ；ＴＢ（テリフィックブロス）培地：１．２％ペプトン、２．４％酵母抽出物、７２ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４４及び０．４％グリセロール；ならびにＳＢ（Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ）培地：３．２％ペプトン、２％酵母抽出物、及び０．５％ＮａＣｌ及びまたはＫｏｒｚ培地（Ｋｏｒｚ， Ｄ Ｊ ｅｔ ａｌ． １９９５）が含まれる。高密度細菌Ｅ．ｃｏｌｉ増殖培地の例には、これに限定されないが、ＤＮＡＧｒｏ（商標）培地、ＰｒｏＧｒｏ（商標）培地、ＡｕｔｏＸ（商標）培地、ＤｅｔｏＸ（商標）培地、ＩｎｄｕＸ（商標）培地、及びＳｅｃＰｒｏ（商標）培地が含まれる。
一部の実施形態では、操作細胞を、酵素または核酸の発現が生じる条件下で培養する。そのような培養条件は、発現される特定の産物及び産物の所望の量に依存し得る。
一部の実施形態では、操作細胞を３０℃～４０℃の温度で培養する。例えば、操作細胞を３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃または４０℃の温度で培養することができる。典型的には、操作Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などの操作細胞を３７℃の温度で培養する。
一部の実施形態では、操作細胞を１２時間～７２時間、またはそれ以上の期間にわたって培養する。例えば、操作細胞を１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、または７２時間の期間にわたって培養することができる。典型的には、操作細菌細胞などの操作細胞を１２～２４時間の期間にわたって培養する。一部の実施形態では、操作細胞を１２～２４時間にわたって３７℃の温度で培養する。
一部の実施形態では、操作細胞を（例えば、液体細胞培養培地中で）、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の波長で測定して５～２００の光学密度まで培養する。一部の実施形態では、操作細胞を５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、または２００のＯＤ６００まで培養する。
一部の実施形態では、操作細胞を１×１０８（ＯＤ＜１）～２×１０１１（ＯＤ約２００）生細胞／細胞培養培地ｍｌの密度まで培養する。一部の実施形態では、操作細胞を１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、または２×１０１１生細胞／ｍｌの密度まで培養する（換算係数：ＯＤ１＝８×１０８細胞／ｍｌ）。
一部の実施形態では、操作細胞をバイオリアクター内で培養する。バイオリアクターは簡単には、細胞がその中で培養される容器、例えば、単回使用することができる（使い捨て）か、オートクレーブ処理可能であるか、または殺菌可能であり得る培養フラスコ、ディッシュ、またはバッグを指す。バイオリアクターは、ガラス製であってもよいし、またはポリマーベースであってもよいし、または他の材料から作製されていてもよい。バイオリアクターの例には、限定ではないが、撹拌タンク（例えば、十分に混合される）バイオリアクター及び管型（例えば、プラグフロー）バイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、膜撹拌タンク、スピンフィルター撹拌タンク、ビブロミキサー、流動床リアクター、及び膜バイオリアクターが含まれる。バイオリアクターの運転モードは、バッチまたは連続プロセスであってよく、培養される操作細胞に依存する。バイオリアクターは、供給及び産物流が連続的に供給され、システムから取り出される場合に連続的である。バッチバイオリアクターは、連続再循環流を有し得るが、栄養素の連続供給または産物収集は伴わない。間欠的収集及び供給バッチ（またはバッチフィード）培養では、細胞を、より低い生細胞密度で、バッチ培地と同様の組成である培地に接種する。栄養素がやや不足し、かつ細胞が定常期に近づくまで、細胞を、本質的に外部操作を伴わずに指数的に増殖させる。この時点で、間欠的収集バッチ供給プロセスでは、細胞及び産物の一部を収集することができ、除去された培養培地に新鮮な培地を補給する。このプロセスを複数回繰り返すことができる。組み換えタンパク質及び抗体の生産では、フェッドバッチプロセスを使用することができる。細胞は指数的に増殖するが、栄養素は欠乏していくので、濃縮供給培地（例えば、１０～１５倍濃縮基本培地）を連続的または間欠的に添加して追加の栄養素を供給し、細胞濃度及び増殖期のさらなる増大を可能にする。培養培地（ブロス）を除去することなく、新鮮な培地を細胞濃度に比例して添加することができる。培地の添加を適応させるために、フェッドバッチ培養をバイオリアクターの全容量よりもかなり少ない容積（例えば、最大容積の約４０％～５０％）で開始する。
本開示の一部の方法は、ＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡ、より具体的にはｍＲＮＡ）の大規模生産を対象とする。大規模生産方法では、操作細胞を液体培養培地中で、５リットル（Ｌ）～２５０，０００Ｌ、またはそれ以上の体積で増殖させることができる。一部の実施形態では、操作細胞を液体培養培地中で、１０Ｌ、１００Ｌ、１０００Ｌ、１００００Ｌ、または１０００００Ｌよりも大きな（またはそれに等しい）体積で増殖させることができる。一部の実施形態では、操作細胞を液体培養培地中で、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、３５Ｌ、４０Ｌ、４５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、５０００Ｌ、１００００Ｌ、１０００００Ｌ、１５００００Ｌ、２０００００Ｌ、２５００００Ｌ、またはそれ以上の体積で増殖させる。一部の実施形態では、操作細胞を液体培養培地中で、５Ｌ～１０Ｌ、５Ｌ～１５Ｌ、５Ｌ～２０Ｌ、５Ｌ～２５Ｌ、５Ｌ～３０Ｌ、５Ｌ～３５Ｌ、５Ｌ～４０Ｌ、５Ｌ～４５Ｌ、１０Ｌ～１５Ｌ、１０Ｌ～２０Ｌ、１０Ｌ～２５Ｌ、２０Ｌ～３０Ｌ、１０Ｌ～３５Ｌ、１０Ｌ～４０Ｌ、１０Ｌ～４５Ｌ、１０Ｌ～５０Ｌ、１５Ｌ～２０Ｌ、１５Ｌ～２５Ｌ、１５Ｌ～３０Ｌ、１５Ｌ～３５Ｌ、１５Ｌ～４０Ｌ、１５Ｌ～４５Ｌ、または１５～５０Ｌの体積で増殖させることができる。一部の実施形態では、操作細胞を液体培養培地中で、１００Ｌ～３０００００Ｌ、１００Ｌ～２０００００Ｌ、または１００Ｌ～１０００００Ｌの体積で増殖させることができる。
典型的には、操作細胞の培養の後に、細胞の溶解を続ける。「溶解すること」は、細胞を例えばウイルス、酵素、機械、または浸透圧機構により分解するプロセスを指す。「細胞溶解産物」は、例えば、細胞器官、膜脂質、タンパク質、核酸及び逆膜小胞を含む溶解細胞（例えば、溶解操作細胞）の内容物を含有する流体を指す。本開示の細胞溶解産物は、本明細書において提供されるとおり、操作細胞の任意の集団を溶解することにより生産することができる。
「溶解すること」と称される細胞溶解の方法は当技術分野で公知であり、そのいずれも、本開示に従って使用することができる。そのような細胞溶解方法には、限定ではないが、均質化などの物理的溶解が含まれる。
細胞溶解は、慎重に制御された細胞環境を撹乱して、未制御の内因性プロテアーゼ及びホスファターゼによるタンパク質分解及び修飾を生じさせ得る。したがって、一部の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤及び／またはホスファターゼ阻害剤を、細胞溶解産物または溶解前の細胞に添加することができるか、またはこれらの活性を熱不活性化または遺伝子不活性化により除去することができる。
一部の実施形態では、細胞溶解産物を、少なくとも１つの栄養素と組み合わせることができる。例えば、細胞溶解産物を、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、またはＣａＣｌ２と組み合わせることができる。他の栄養素の例には、限定ではないが、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、オロチン酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム、三塩基性リン酸カリウム、リン酸ナトリウム一塩基性、二塩基性リン酸ナトリウム、三塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸アンモニウム、二塩基性リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及び水酸化アンモニウムが含まれる。
一部の実施形態では、細胞溶解産物を少なくとも１つの補因子と組み合わせることができる。例えば、細胞溶解産物を、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、または酵素（例えば、無機イオン及び補酵素）の活性に必要とされる他の非タンパク質化学化合物と組み合わせることができる。
一部の実施形態では、細胞溶解産物を、ＲＮＡ解重合が生じる条件下でインキュベートする。一部の実施形態では、細胞溶解産物を、ｓｓＲＮＡまたはより具体的にはｍＲＮＡの生産が生じる条件下でインキュベートする。
単一反応で使用される細胞溶解産物の体積は様々であり得る。一部の実施形態では、細胞溶解産物の体積は、０．００１～１０ｍ３である。例えば、細胞溶解産物の体積は、０．００１ｍ３、０．０１ｍ３、０．１ｍ３、１ｍ３、５ｍ３、１０ｍ３であり得る。
一部の実施形態では、細胞溶解産物をＲＮＡ解重合の前にさらに処理する。確立された技術、例えば、ＴＲＩｚｏｌ試薬もしくは塩の使用、または沈殿を使用して、全細胞ＲＮＡを培養細胞から回収することができる。
キャッピング
ｍＲＮＡキャップは、これに限定されないが、リボソームサブユニットの動員、リボソーム構築及び翻訳の促進、ならびにエキソヌクレアーゼ活性からのｍＲＮＡの保護を含む様々な機能を果たす。
キャッピングは、様々な方法を使用して達成することができる。一部の実施形態では、キャッピングを、１つまたは複数の酵素を使用して達成する。キャッピングのプロセスは、表９に表されている様々な酵素活性を必要とする。一部の実施形態では、１つのタンパク質が４つ全ての機能を果たす。一部の実施形態では、４つの活性を２、３、または４つの酵素により達成する。
Figure 2022524166000013
キャッピングは、ＲＮＡ重合ステップ後に実行することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ重合反応をキャッピング前に不活性化する。一部の実施形態では、キャッピング酵素を反応物に、メチルドナー（例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン）、及びポリリン酸を伴うＧＴＰまたはＧＭＰのいずれかと共に添加する。一部の実施形態では、ＧＭＰを反応物中に存在するキナーゼによりＧＴＰに変換する。メッセンジャーＲＮＡを、様々な酵素を使用してキャッピングすることができる。本発明の方法で使用することができるメッセンジャーＲＮＡをキャッピングする際に使用可能な酵素の非包括的なリストが表１０に含まれる。
Figure 2022524166000014
一部の実施形態では、ｍＲＮＡを、キャップ類似体を使用してキャッピングする。キャップ類似体には、ジヌクレオチドキャップ類似体（例えば、標準的なキャップ類似体または抗リバースキャップ類似体、ＡＲＣＡ）または３＋ヌクレオチドキャップ類似体（例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ製のＣｌｅａｎＣａｐ）、非メチル化キャップ類似体、オイルメチル化（ｏｉｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）キャップ類似体が含まれ得る。一部の実施形態では、キャップ類似体を重合反応物に添加する。
一部の実施形態では、１つまたは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列が、キャップの代わりに、またはそれに加えて含まれる。一部の実施形態では、ＩＲＥＳ配列を５’ＵＴＲ配列に組み込む。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）またはクリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）などのウイルスゲノムに由来する。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子（Ａｐａｆ－１）、ミエリン転写因子２（ＭＹＴ－２）、またはｃ－ｍｙｃをコードするものなどの細胞ｍＲＮＡに由来する。
キャッピングを、ｍＲＮＡ合成プロセスの様々な異なるステップで実行することができる。キャッピングは同時転写で、または転写後に起こり得る。これらの方法は、ＲＮＡ合成後に、及び酵素的ポリアデニル化を実行する場合には酵素的ポリアデニル化ステップの前または後に実行することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡを、精製前に反応ミックス中でキャッピングする。他の実施形態では、ＲＮＡを、精製した後にキャッピングする。
一部の実施形態では、５’，３’エキソリボヌクレアーゼ１（ｘｒｎ１）などの補助酵素を使用すると、より効率的なキャッピングを達成することができる。ｘｒｎ１処理は、キャッピングすることができないＧＭＰから出発したｍＲＮＡを分解してＮＭＰモノマーに戻すことを可能にし、次いで、それをｍＲＮＡを生産するために再び使用することができる。この分解はＧＴＰまたはＧＤＰから出発したｍＲＮＡに影響を及ぼさないので、これは、キャッピングすることができるｍＲＮＡの生産を増大させるであろう。一部の実施形態では、特異的なエキソヌクレアーゼを使用しての一リン酸化ｍＲＮＡ再循環を実行する。ＣＦＲ反応における標準的な酵素に加えて、ｘｒｎ１などの５’－一リン酸特異的エキソリボヌクレアーゼを添加する。ｘｒｎ１を使用すると、５’一リン酸を有するｍＲＮＡを分解して、ＮＭＰをＣＦＲ反応に戻して再循環させることができる。これは、ＣＦＲで生産されたｍＲＮＡ中のキャッピング不可能なｍＲＮＡを分解するために使用することもできる。
下流プロセシング
本明細書において提供される方法及びシステムは、一部の実施形態では、ｍＲＮＡ産物を０．５～１０ｇ／Ｌ（例えば、０．５、１、２、３、４、５、または１０ｇ／Ｌ）の濃度でもたらす。下流プロセシングにより、純度がＲＮＡ９９重量％まで（例えば、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９重量％）大きく上昇する。下流プロセシングの例は、タンパク質沈澱剤（例えば、塩化リチウム）の添加からの出発、続く、タンパク質、脂質、及び多少のＤＮＡを産物流から除去するディスクスタック遠心分離（ＤＳＣ）で示される。次いで、限外濾過を実施して、塩及び量を取り出す。産物流への塩化リチウムの添加はＲＮＡ産物の沈澱をもたらし、これを続いて、ディスクスタック遠心分離を使用してバルクの液体から分離して、例えば、純度約８０％のＲＮＡ産物流を得る。さらなるクロマトグラフィー研磨により、純度約９９％の産物が得られる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ産物を塩化リチウム沈殿プロトコルにより沈澱させる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ産物を、Ｗｅｉｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， “ＨＰＬＣ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｌｏｎｇ ＲＮＡ．” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｃｌｉｆｔｏｎ， ＮＪ）， ９６９， ４３に記載の逆相イオン対高速液体クロマトグラフィープロトコルにより超精製する。一部の実施形態では、逆相ＨＰＬＣを使用して、不所望な免疫応答につながり得る汚染性核酸産物、例えば、二本鎖核酸をｍＲＮＡ調製物から除去することができる。他の精製方法も使用することができる。
次の実施例は、本開示の具体的な実施形態、及びその様々な使用の例示である。これらは、単に例示を目的として記載するものであって、本開示の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。
実施例１． 無細胞反応
無細胞ＲＮＡ合成反応を次の構成成分から組み立てた：
ＮＭＰミックス：５’ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）が生じるようにヌクレアーゼＰ１で処理された酵母ＲＮＡ。ヌクレアーゼＰ１を限外濾過により取り出し、無細胞反応で使用する前に混合物を中性ｐＨに調節した。
キナーゼ：次のキナーゼを過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株を高細胞密度発酵で増殖させて、高圧均質化により溶解した：
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣＭＰキナーゼ（Ｃｍｋ）
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＵＭＰキナーゼ（ＰｙｒＨ）
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＧＭＰキナーゼ（Ｇｍｋ）
Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来のＮＤＰキナーゼ（Ｎｄｋ）
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ由来のポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ２）
ＲＮＡポリメラーゼ：Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを含む熱安定性変異Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをＥ．ｃｏｌｉで、高細胞密度発酵で過剰発現させた（野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼも、これらの反応において成功裏に使用された）。細胞を高圧均質化により溶解し、タンパク質を高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により精製した。
無細胞ＲＮＡ合成反応物を表１１に従って組み立てた。反応物の構築前に、キナーゼ溶解産物をリン酸カリウムバッファー中で同等の総タンパク質濃度に希釈し、組み合わせた。硫酸マグネシウム及びヘキサメタリン酸ナトリウムを添加し、次いで、溶解産物ミックスを（７０℃で１５分間にわたって）熱処理して、キナーゼ溶解産物からのオフ経路酵素活性を不活性化した。
Figure 2022524166000015
ＣＦＲを４８℃で６０分間にわたってインキュベートし、次いで、ＴＵＲＢＯ ＤＮアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処理した。不溶性のデブリを遠心分離によりペレット化し、上清を新たな管に移した。ＲＮＡを塩化リチウム沈殿により、標準的な技術に従って回収した。
実施例２：ｍＲＮＡのキャッピング
実施例１において生産された細胞溶解産物を、ワクシニアウイルス酵素を含む市販のキット（例えば、Ｖａｃｃｉｎｉａ ｃａｐｐｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してキャッピング反応に掛けた。反応を、製品仕様書により推奨されるとおりに実行した。
実施例３：線状テンプレートのＰＣＲ生産
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むＤＮＡテンプレート配列を線状ｄｓＤＮＡ ｇＢｌｏｃｋｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として合成し、かつｐＣＲ４－ＴＯＰＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。線状ＤＮＡテンプレートをＰＣＲにより、ポリＡテールをコードするリバースプライマーを使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製した。このテンプレートＤＮＡを、実施例１に記載の手順で使用した。
実施例４：ＨｅＬａ細胞でのＧＦＰ発現
先行の実施例に記載の無細胞プロセスにより生産されて、塩化リチウム沈殿で粗く精製されているか、またはインビトロ転写（ＩＶＴ）により生産された、ＸＢＧ（ベータ－グロビン、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）ＵＴＲを備えた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及び５’ＩＴＳをコードするｍＲＮＡ０．１μｇで、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸリポフェクタミン３％を、製造者指示書に従ってトランスフェクションのために使用した。緑色蛍光タンパク質発現を比較した。
結果
ＣＦＲは、ＩＶＴにより生じたものと同等の緑色蛍光タンパク質発現をもたらした（図１０）。まとめると、この結果は、無細胞反応方法がインビトロ転写（ＩＶＴ）方法に匹敵し得ることを実証している。
実施例５：種々のＵＴＲを用いての発現
ＧＦＰをコードするｍＲＮＡを、ＣＦＲを使用して生産し、ＨｅＬａ細胞抽出物中でアッセイした。４つの異なる非翻訳領域（ＵＴＲ）（５’ヒドロキシステロールデヒドロゲナーゼ、３’アルブミン（ＨＳＤ）；５’シトクロムオキシダーゼ、３’アルブミン（ＣＯＸ）；５’，５’ヒトβ－グロビン（ＨＢＧ）；５’，３’キセノパスβ－グロビン（ＸＢＧ）、それぞれ５’ＩＴＳを含む）を含むｍＲＮＡを調製した（これらのＵＴＲは表７に詳述されている）。ＧＦＰの発現を、反応物の緑色蛍光をモニタリングすることにより定量化した（例えば、適切に設定されたｑＰＣＲ機器または蛍光マイクロプレートリーダーで）。
結果
ＣＦＲにより生産された４つのＵＴＲを備えたｍＲＮＡは全て、活発なＧＦＰ発現（図１１）をもたらした。ＸＢＧ、ＨＢＧ、ＣＯＸ、及びＨＳＤ ＵＴＲは全て、３００，０００ＲＦＵまたはそれ以上のＧＦＰをもたらした。
実施例６：ＲＮＡ精製
ＣＦＲプロセスからのｍＲＮＡ及びインビトロ転写（ＩＶＴ）により生産されたｍＲＮＡを、塩化リチウム沈殿を使用して粗く精製した。ＲＮＡの相対存在度を、毛細管ゲル電気泳動を使用してＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒで決定した。ＣＦＲにより作製されたｍＲＮＡを、塩化リチウム沈殿により粗く精製するだけにしたか、または次のとおり、逆相イオン対高速液体クロマトグラフィー（超精製または「研磨」）、続く、塩化リチウム沈殿で精製した。
ＨＰＬＣ精製は本質的に、Ｗｅｉｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， “ＨＰＬＣ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｌｏｎｇ ＲＮＡ．” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｃｌｉｆｔｏｎ， ＮＪ）， ９６９， ４３のプロトコルに従った。
ＲＮＡＳｅｐ Ｓｅｍｉ－Ｐｒｅｐ（ＡＤＳ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号ＲＰＣ－９９－２１１０）２１．２×１００ｍＭを使用し、８０℃で維持した。使用された移動相は次のとおりであった：
Ａ － ０．１Ｍ酢酸テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７．０
Ｂ － ０．１Ｍ ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０、２５％アセトニトリル
試料をカラムに注入し、次の勾配プログラムを使用して３ｍｌ／分のポンプ速度で分離した：
０．０分、Ａ６２％、Ｂ３８％
２０．０分、Ａ４０％、Ｂ６０％
２０．０１分、Ａ０％、Ｂ１００％
２２．００分、Ａ０％、Ｂ１００％
２２．０１分、Ａ６２％、Ｂ３８％
２８．０分、Ａ６２％、Ｂ３８％。
所望のｍＲＮＡ種を含有する画分を貯留し、事前湿潤３０ｋＤａカットオフ遠心濾過フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ ＵＦＣ９０３０９６）を使用して濃縮した。濃縮ｍＲＮＡ試料を、標準的な技術に従ってＬｉＣｌで沈殿させた。
Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， “Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ： ＨＰＬＣ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ， ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍＲＮＡ．” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３９（２１）， ｅ１４２に従って免疫ブロット技術を使用して、粗く精製されたか、または超精製されたＣＦＲ ｍＲＮＡをｄｓＲＮＡについて検査した。ＥｎｄｏＳａｆｅ－ＭＣＳシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、製造者指示書）を使用して、粗く精製されたか、または超精製されたＣＦＲ ｍＲＮＡを内毒素についても検査し、ＩＶＴにより生産された粗く精製されたか、または超精製されたＣＦＲ ｍＲＮＡと比較した。粗製及び超精製の産物を下記のとおり、質量ベースの純度分析に掛けた。
残留タンパク質をビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、キット指示書に従って定量化した。残留カチオンを、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２， “Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｉｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｗａｔｅｒｓ ｂｙ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ａ ｈｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙ ｃａｔｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ， ９５６（１－２）， １８１－１８６の方法により定量化した。残留アニオンを、Ｂｏｙｌｅｓ， １９９２， “Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｉｏｎｓ ｉｎ ａｌｌ ｐｈａｓｅｓ ｏｆ ｂｅｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ， ５０（２）， ６１－６３の方法により定量化した。残留ヌクレオチドを、Ｅｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９７９， “Ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ， １７４（２）， ４０９－４１９；及びＨａｒｔｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９７５， “Ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｂｏｎｄｅｄ ａｎｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ， １１２， ６５１－６６２の方法に従って定量化した。
結果
無細胞プロセスにより作製されたｍＲＮＡは、所望のｍＲＮＡの７０％未満の核酸純度をもたらすが、達成された純度は、インビトロ転写で達成されたものと同様である（ＩＶＴ；図１２）。ＨＰＬＣプロセスにより、ｄｓＲＮＡの大部分が除去される（図１３）。内毒素が除去される（図１４）。ＨＰＬＣプロセスを使用してのＲＮＡのその後の「研磨」は、目的のｍＲＮＡ種に相当する総核酸をかなり高いパーセンテージ、８５％でもたらす。市販のＲＮＡ調製物は、目的の種を７８％で含有した（図１５）。
実施例７：インフルエンザ抗原の発現
５’ＩＴＳをそれぞれ含むＨＢＧまたはＸＢＧ ＵＴＲのいずれかを備えた、Ｈ１Ｎ１ Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４インフルエンザウイルス由来の血球凝集素タンパク質（ＨＡ）をコードするｍＲＮＡを、ＣＦＲシステムを使用して生産し、ＬｉＣｌ沈澱させたか、またはＨＰＬＣを使用して超精製した。ＨＡをＨｅＬａ抽出物中で、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。初めに、マイクロプレートを捕捉抗体（ウサギ抗インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４血球凝集素モノクローナル抗体、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でコーティングし、次いで、洗浄し、ブロックした。翻訳されたＨＡを含有するＨｅＬａ細胞抽出物を希釈し、次いで、プレートに施与し、１時間にわたって室温でインキュベートした。次いで、ウェルを洗浄し、その後、検出抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたウサギ抗インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を施与した。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質（３’，３’，５’，５’－テトラメチルベンジジン）を添加し、かつ６５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して定量化した。
ＣＦＲ生産されたｍＲＮＡをウェスタンブロットにより、インビトロ転写（ＩＶＴ）により生産されたｍＲＮＡと比較して分析した。翻訳されたＨＡも細胞抽出物中で、ウェスタンブロット法により、アフィニティー精製されたウサギ抗インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４ポリクローナル一次抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）及びアフィニティー精製されたヤギ抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用して検出した。
結果
ＨＡが成功裏に生産され、試料を超精製に掛けた場合には、最終調製物の濃度はさらに高かった（図１６）。生産は、ＩＶＴで達成されたものと同様であった（図１７）。
実施例８：ルシフェラーゼの無細胞生産
５’ＩＴＳをそれぞれ含むＨＢＧまたはＸＢＧ ＵＴＲを備えた、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを、ＣＦＲプロセスを使用して生産した。１－Ｓｔｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ ＩＶＴ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、ＤＮアーゼ処理されたキャップドｍＲＮＡ（純度修正）５００ｎｇを精製ＤＮＡの代わりに添加したことを除いてキット指示書に従って使用して、翻訳をＨｅＬａ細胞抽出物中で測定した。Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をキット指示書に従って使用して、ホタルルシフェラーゼの発現を測定した。読み取り値を提示するＰｒｏｍｅｇａキットを用いて、ホタルルシフェラーゼからのルミネセンスをＨｅＬａ抽出物及びＨｅＬａ細胞の両方で測定した。ＨｅＬａ細胞トランスフェクションを実施例４においてのとおりに実行した。
結果
機能性ルシフェラーゼを、ＨｅＬａ抽出物（図１８）及びＨｅＬａ細胞（図１９）の両方で生産した。ＨｅＬａ抽出物では、ＸＢＧと比較して、ＨＢＧ ＵＴＲで高いルシフェラーゼ発現が観察された。ＨｅＬａ細胞では、トランスフェクション条件（１：１ウェルあたりリポフェクタミン０．１５ｕＬ、２：１ウェルあたりリポフェクタミン０．３０ｕＬ、それぞれの場合にｍＲＮＡ１００ｎｇをトランスフェクト）にかかわらず、ＨＢＧ ＵＴＲを備えたルシフェラーゼｍＲＮＡが高レベルのルシフェラーゼ発現を生じた。
実施例９．：インビボでの無細胞ＲＮＡ生産されたルシフェラーゼの発現
ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを、ＩＶＴ及びＣＦＲ方法の両方を使用して生産し、ＨＰＬＣ精製し、キャッピングした。ｍＲＮＡはＨＢＧ ＵＴＲ及び５’ＩＴＳを含んだ。ｍＲＮＡをＣＦＲ及びＩＶＴの両方のために２つの配合物で生産した：「社内」脂質ナノ粒子（研究者により最適化された文献配合物）及び外部脂質ナノ粒子（事業パートナーにより、またはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓキットを用いて作製）。「社内」ＬＮＰを、Ｐａｒｄｉ ｅｔ ａｌ． ｕｓｉｎｇ Ｄ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ ａｓ ｔｈｅ ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ： Ｐａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ２１７， ３４５－３５１に従って配合した。「ＧｅｎＶｏｙ」ＬＮＰを、ＧｅｎＶｏｙ－ＩＬＭ Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ Ｌｉｐｉｄ Ｍｉｘ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して配合した。両方の配合物を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｂｅｎｃｈｔｏｐマイクロ流体ミキサー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者指示書に従って使用して生産した。
４つの処理（２つの生産方法、２つの配合物）のそれぞれを、３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの実験群に、４０、１５、または５μｇの単一の皮内用量で投与する。動物に、Ｄ－ルシフェリン１５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与し、ｍＲＮＡ投与から６時間後にインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）で撮像し、かつルミネセンスを７２時間にわたって測定した。
結果
ＣＦＲ生産されたｍＲＮＡは、ルシフェラーゼ発現の誘導において、少なくともＩＶＴと同様に強力である。早期の時点では、内部配合物でＣＦＲ生産されたｍＲＮＡは、比較的高いルシフェラーゼ発現をもたらした。４０及び１５μｇ投与で、同様のレベルの発現が達成される（図２０、２１）。
実施例１０：抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャッピングを備えたヌクレオシド変性ｍＲＮＡの生産
合成反応のためのヌクレオチド供給源が非修飾ヌクレオシド一リン酸アデノシン及びグアノシン及びシュードウリジン、ψ及び５－メチルシチジン、ｍ５Ｃからなることを除いて実施例９に記載のとおりに、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡを、ＣＦＲを使用して生産し、ＨＰＬＣ精製した。非修飾及び修飾ヌクレオシドを反応物に、１ｍＭで添加されたＧＭＰを除いて、それぞれ５ｍＭで添加した。キャップ類似体（ＡＲＣＡ）を４ｍＭで添加した。反応物を４時間にわたって３７℃でインキュベートし、その後、反応物をＤＮアーゼ処理し、ＬｉＣｌ沈殿により回収し、ＨＰＬＣにより精製した。テンプレートを、本出願において既に記載したとおりＰＣＲにより生産し、これは５’及び３’非翻訳領域に隣接する目的の遺伝子、さらには３’ポリＡテールを含んだ。続いて、ｍＲＮＡを純度、ヌクレオシド修飾の組み込み、キャッピング、及びマウスにおける遺伝子発現について分析した。
ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、及びホスファターゼ酵素の混合物を使用して試料をモノヌクレオシドに消化することにより、ヌクレオシド修飾の定量化を達成し、モノヌクレオシドを、ＬＣ－ＭＳを使用して定量化した。修飾ヌクレオシド（例えば、ψ）の相対濃度を非修飾（例えば、Ｕ）と比較した。同様に、ｍ７Ｇキャップでは、ｍ７Ｇの相対濃度をＩＶＴ基準と比較した。
ｍＲＮＡを脂質ナノ粒子配合物に配合し、続いて、表示の用量でＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｎ＝１群あたりマウス１０匹）に筋肉内経路を介して注射することにより、マウスにおける標的遺伝子発現の決定を得た。続いて、マウスにＤ－ルシフェリンを図２３に表示の時間に注射し、続いて、インビボ撮像（ＩＶＩＳ）した。
結果
ＣＦＲ生産されたｍＲＮＡ及びＩＶＴにより生産された同じ配列の参照標準において、同様の純度が観察された（図２２Ａ）。ＣＦＲ生産されたｍＲＮＡ及びＩＶＴにより生産された同じ配列の参照標準のヌクレオシド修飾及びキャッピングの定量化は図２２Ｂにおいて示されている。ＣＦＲ生産されたｍＲＮＡは、ＩＶＴに対して同様の修飾ヌクレオシドでの置換効率及び同様のキャッピングを示した。図２３は、マウスにおける標的遺伝子発現のグラフ表示を提示している。１μｇ及び０．１μｇ用量の両方で、ＣＦＲ生産されたｍＲＮＡは、全ての時点でＩＶＴと同様に効力があった。
実施例１１：マウスをインフルエンザ感染から防御するインフルエンザワクチンモデルの生産
インフルエンザワクチンモデルをコードするｍＲＮＡをＣＦＲを使用して生産し、ＨＰＬＣ精製し、本出願の実施例９に記載のとおりに脂質ナノ粒子にカプセル封入した。ｍＲＮＡは、Ｐｅｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１２ （ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２４３６）に従ってインフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）由来の全長血球凝集素（ＨＡ）タンパク質、またはホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をコードした。ｍＲＮＡ配列は、５’及び３’ＨＢＧ ＵＴＲ、５’ＩＴＳ、ならびに３’Ａ１００テールを含んだ。テンプレートをＰＣＲにより生産した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｎ＝１群あたりマウス８匹）を表示用量で２回免疫化した（０日目に初回免疫化及び２１日目にブースト；筋肉内）。不活性化Ｈ１Ｎ１ウイルスを投与されたマウスは陽性対照として役立った。血清免疫を処置マウスで定量化し、かつインフルエンザ攻撃からの防御を測定した。血清免疫をマウスにおいて、赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイにより決定した。血液を尾静脈により４２日目に採取し、ＨＡＩ決定のために血清に処理した。インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）での攻撃後に、インフルエンザ攻撃をマウスの体重変化により測定した。６３日目に、マウスに生ウイルスを鼻腔内投与し、その後１０日間にわたって、体重をモニターした。
結果
ＨＡＩアッセイにより測定されたとおりのマウスにおける血清免疫が図２４に示されている。ＨＡ ｍＲＮＡの両方の用量で処置されたマウスはＨＡ不活性化抗体を産生し、その際、３０μｇ用量群における力価は、不活性化Ｈ１Ｎ１対照群のものを上回った。これらの群からのマウス（図２４中の円形）をその後の攻撃研究のために選択した。
インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）での攻撃後のマウスの体重が図２５に示されている。ＨＡ ｍＲＮＡまたは不活性化Ｈ１Ｎ１対照を投与されたマウスは、インフルエンザ感染に随伴する体重減少から防御されたのに対して、未処置マウス及びＦＬｕｃ ｍＲＮＡを投与されたマウスでは、ヒト研究の終点に達するまで体重が減少し（２５％の総体重減少）、と殺した。
これらの結果は、ＣＦＲ生産されたｍＲＮＡがインフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４に対して有効な免疫応答をもたらし、したがって、マウスにおいて防御的及び特異的ワクチンとして作用し得ることを実証している。
実施例１２：様々なヌクレオチド供給源からのｍＲＮＡの生産
実施例１１に記載の、インフルエンザ血球凝集素をコードするｍＲＮＡを、細胞ＲＮＡ由来ヌクレオチドを利用するか、または精製ヌクレオシド一リン酸を使用してＣＦＲにより生産した。細胞ＲＮＡ由来ヌクレオチド混合物をキナーゼ、マグネシウム、及びヘキサメタリン酸ナトリウム（ＨＭＰ）と共に１時間にわたって４８℃でプレインキュベートし、その後、温度を３７℃に低下させ、かつテンプレート及びポリメラーゼを添加したことを除いて、本出願の実施例９に記載のとおりにｍＲＮＡを生産した。反応物をさらに、２時間にわたって３７℃でインキュベートした。対照として、同じ配列を慣用のインビトロ転写（ＩＶＴ）により生産した。反応物をＤＮアーゼ処理し、ＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿により精製し、かつＲＮＡ特質をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して電気泳動により評価した。
結果
図２６Ａは、純度の基準としてのＩＶＴ生産された非キャップドｍＲＮＡの電気泳動図である。図２６Ｂは、細胞ＲＮＡ由来ヌクレオチドを使用してＣＦＲ生産された非キャップドｍＲＮＡの電気泳動図である。図２６Ｃは、それぞれ５ｍＭの精製ヌクレオシド一リン酸（ＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、及びＵＭＰ）の等モル混合物を使用してＣＦＲ生産された非キャップドｍＲＮＡの電気泳動図である。ＣＦＲ反応を図２６Ｂにおいてのものと同様に実行した。ＣＦＲにより生産されたｍＲＮＡは、ヌクレオチド源にかかわらずＩＶＴと同様の純度を示した。
実施例１３：線状化プラスミドテンプレートからコードされるポリＡテールを備えたｍＲＮＡの生産
ＥＧＦＰをコードする非キャップドｍＲＮＡを、本出願の他の箇所に記載のとおりにＣＦＲにより生産した。ｐＵＣ複製開始点、選択マーカー、Ｔ７プロモーター、５’及び３’ＨＢＧ ＵＴＲに隣接するＥＧＦＰ遺伝子、３’ポリＡテール、及び線状化のための固有ＢｓｐＱＩ部位からなる最小化テンプレートプラスミドを構築した。０、５０、１００、または１５０ＡのヌクレオチドからなるポリＡテールがテンプレートプラスミドにおいてコードされた。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０ｂにおいて培養し、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、ＢｓｐＱＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）での消化により線状化し、ＣＦＲにおいて使用する前にフェノール／クロロホルム抽出により精製した。ｍＲＮＡを合成し、塩化リチウム沈殿により精製し、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して電気泳動により分析した。
結果
図２７は、０、５０、１００、または１５０のヌクレオチド長さのポリＡテールを備えたＣＦＲ生産されたｍＲＮＡの電気泳動図の重ね合わせである。各試料における主なピークは、所望のサイズの全長ｍＲＮＡを表しており、ＣＦＲシステムがプラスミドテンプレート及びコードされるポリＡテールと適合性であることを実証している。
本発明を詳細に、かつその具体的な態様及び／または実施形態を参照して記載してきたが、添付の特許請求の範囲において定義されている本発明の範囲から逸脱することなく、変更及び変形が可能であることは明らかであろう。より具体的には、本発明の一部の態様は特に有利であると本明細書において同定され得るが、本発明が本発明のこれらの特定の態様に限定されるものではないことが企図されている。本明細書に開示のパーセンテージは、開示の値から±１０、２０、または３０％の量で変動し得て、企図されている発明の範囲内にとどまる。
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、または文脈から別段に明らかでない限り、１つまたは１つよりも多いことを意味し得る。群の１つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む請求項または記載は、反対の指示がない限り、または文脈から別段に明らかでない限り、群のメンバーのうちの１つ、１つより多く、または全部が所与の産物またはプロセスに存在するか、そこで使用されるか、または別段に関連するならば、満たされていると判断される。本発明は、群のうちの正確に１つのメンバーが所与の産物またはプロセスに存在するか、そこで使用されるか、または別段に関連する実施形態を含む。本発明は、群のメンバーのうちの１つより多く、または全部が所与の産物またはプロセスに存在するか、そこで使用されるか、または別段に関連する実施形態を含む。
さらに、本発明は、列挙された請求項のうちの１つまたは複数からの１つまたは複数の制限事項、要素、条項、記述用語が別の請求項に導入される全ての変形、組み合わせ、順列を包含する。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項を、同じ基本請求項に従属する任意の他の請求項に見出される１つまたは複数の制限事項を含むように改変することができる。要素が、例えば、マーカッシュ群形式でリストとして提示されている場合、その要素の各亜群も開示されており、任意の要素（複数可）を群から除去することができる。一般に、本発明または本発明の態様が、特定の要素及び／または特徴を含むと言及されている場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素及び／または特徴からなるか、または本質的になることは理解されるべきである。簡略を目的として、それらの実施形態は、本明細書にこのとおりの言葉で具体的に示されていない。「～を含む」及び「～を含有する」という用語は、オープンであることが意図されており、追加の要素またはステップを含めることを許容することも留意される。範囲が与えられている場合、終点は含まれる。さらに、別段に示されていない限り、または文脈及び当業者の理解から別段に明白でない限り、範囲として表現されている値は、文脈が別段に明らかに要求していない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態における述べられた範囲内の任意の具体的な値またはサブ範囲を仮定することができる。
本出願は、多様な発行された特許、公開された特許出願、雑誌論文、及び他の刊行物を参照し、それらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参考文献のいずれかと本明細書との間に矛盾が存在する場合、本明細書が優先されることとなる。加えて、本発明の任意の特定の実施形態であって従来技術に該当するものは、請求項のうちの任意の１つまたは複数から明示的に取り除くことができる。そのような実施形態は、当業者に公知であると考えられるため、それらは、除外が本明細書において明示的に記載されていない場合であっても、取り除くことができる。本発明の任意の特定の実施形態は、任意の請求項から、任意の理由で、先行技術の存在に関連するか否かに関わらず、取り除くことができる。
当業者は、本明細書に記載の具体的な実施形態の多くの均等物を認識することになるか、これらをルーチン以下の実験を用いて確認することができる。本明細書に記載の本実施形態の範囲は、上記記載に限定されるように意図されておらず、むしろ添付の特許請求の範囲に示されたとおりである。当業者は、本記載の様々な変更及び改変が、以下の特許請求の範囲で定義される本発明の意図または範囲から逸脱することなく成され得ることを認めるであろう。
配列
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ ＤＳＭ １１３００ ＰＰＫ２
ＭＱＬＤＲＹＲＶＰＰＧＱＲＶＲＬＳＮＷＰＴＤＤＤＧＧＬＳＫＡＥＧＥＡＬＬＰＤＬＱＱＲＬＡＮＬＱＥＲＬＹＡＥＳＱＱＡＬＬＩＶＬＱＡＲＤＡＧＧＫＤＧＴＶＫＨＶＩＧＡＦＮＰＳＧＶＱＶＳＮＦＫＶＰＴＥＥＥＲＡＨＤＦＬＷＲＩＨＲＱＴＰＲＬＧＭＩＧＶＦＮＲＳＱＹＥＤＶＬＶＴＲＶＨＨＬＩＤＤＱＴＡＱＲＲＬＫＨＩＣＡＦＥＳＬＬＴＤＳＧＴＲＩＶＫＦＹＬＨＩＳＰＥＥＱＫＫＲＬＥＡＲＬＡＤＰＳＫＨＷＫＦＮＰＧＤＬＱＥＲＡＨＷＤＡＹＴＡＶＹＥＤＶＬＴＴＳＴＰＡＡＰＷＹＶＶＰＡＤＲＫＷＦＲＮＬＬＶＳＱＩＬＶＱＴＬＥＥＭＮＰＱＦＰＡＰＡＦＮＡＡＤＬＲＩＶ（配列番号１）
Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ ＤＭ １２７９ ＰＰＫ２
ＭＧＦＣＳＩＥＦＬＭＧＡＱＭＫＫＹＲＶＱＰＤＧＲＦＥＬＫＲＦＤＰＤＤＴＳＡＦＥＧＧＫＱＡＡＬＥＡＬＡＶＬＮＲＲＬＥＫＬＱＥＬＬＹＡＥＧＱＨＫＶＬＶＶＬＱＡＭＤＡＧＧＫＤＧＴＩＲＶＶＦＤＧＶＮＰＳＧＶＲＶＡＳＦＧＶＰＴＥＱＥＬＡＲＤＹＬＷＲＶＨＱＱＶＰＲＫＧＥＬＶＩＦＮＲＳＨＹＥＤＶＬＶＶＲＶＫＮＬＶＰＱＱＶＷＱＫＲＹＲＨＩＲＥＦＥＲＭＬＡＤＥＧＴＴＩＬＫＦＦＬＨＩＳＫＤＥＱＲＱＲＬＱＥＲＬＤＮＰＥＫＲＷＫＦＲＭＧＤＬＥＤＲＲＬＷＤＲＹＱＥＡＹＥＡＡＩＲＥＴＳＴＥＹＡＰＷＹＶＩＰＡＮＫＮＷＹＲＮＷＬＶＳＨＩＬＶＥＴＬＥＧＬＡＭＱＹＰＱＰＥＴＡＳＥＫＩＶＩＥ（配列番号２）
Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ ＤＳＭ ９９４６ ＰＰＫ２
ＭＡＫＴＩＧＡＴＬＮＬＱＤＩＤＰＲＳＴＰＧＦＮＧＤＫＥＫＡＬＡＬＬＥＫＬＴＡＲＬＤＥＬＱＥＱＬＹＡＥＨＱＨＲＶＬＶＩＬＱＧＭＤＴＳＧＫＤＧＴＩＲＨＶＦＫＮＶＤＰＬＧＶＲＶＶＡＦＫＡＰＴＰＰＥＬＥＲＤＹＬＷＲＶＨＱＨＶＰＡＮＧＥＬＶＩＦＮＲＳＨＹＥＤＶＬＶＡＲＶＨＮＬＶＰＰＡＩＷＳＲＲＹＤＨＩＮＡＦＥＫＭＬＶＤＥＧＴＴＶＬＫＦＦＬＨＩＳＫＥＥＱＫＫＲＬＬＥＲＬＶＥＡＤＫＨＷＫＦＤＰＱＤＬＶＥＲＧＹＷＥＤＹＭＥＡＹＱＤＶＬＤＫＴＨＴＱＹＡＰＷＨＶＩＰＡＤＲＫＷＹＲＮＬＱＶＳＲＬＬＶＥＡＬＥＧＬＲＭＫＹＰＲＰＫＬＮＩＰＲＬＫＳＥＬＥＫＭ（配列番号３）
Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ－１ ＰＰＫ２
ＭＩＰＱＤＦＬＤＥＩＮＰＤＲＹＩＶＰＡＧＧＮＦＨＷＫＤＹＤＰＧＤＴＡＧＬＫＳＫＶＥＡＱＥＬＬＡＡＧＩＫＫＬＡＡＹＱＤＶＬＹＡＱＮＩＹＧＬＬＩＩＦＱＡＭＤＡＡＧＫＤＳＴＩＫＨＶＭＳＧＬＮＰＱＡＣＲＶＹＳＦＫＡＰＳＡＥＥＬＤＨＤＦＬＷＲＡＮＲＡＬＰＥＲＧＣＩＧＩＦＮＲＳＹＹＥＥＶＬＶＶＲＶＨＰＤＬＬＮＲＱＱＬＰＰＥＴＫＴＫＨＩＷＫＥＲＦＥＤＩＮＨＹＥＲＹＬＴＲＮＧＩＬＩＬＫＦＦＬＨＩＳＫＡＥＱＫＫＲＦＬＥＲＩＳＲＰＥＫＮＷＫＦＳＩＥＤＶＲＤＲＡＨＷＤＤＹＱＱＡＹＡＤＶＦＲＨＴＳＴＫＷＡＰＷＨＩＩＰＡＮＨＫＷＦＡＲＬＭＶＡＨＦＩＹＱＫＬＡＳＬＮＬＨＹＰＭＬＳＥＡＨＲＥＱＬＬＥＡＫＡＬＬＥＮＥＰＤＥＤ（配列番号４）
Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＵＮＩ－１ ＰＰＫ２
ＭＧＥＡＭＥＲＹＦＩＫＰＧＥＫＶＲＬＫＤＷＳＰＤＰＰＫＤＦＥＧＤＫＥＳＴＲＡＡＶＡＥＬＮＲＫＬＥＶＬＱＥＲＬＹＡＥＲＫＨＫＶＬＶＩＬＱＧＭＤＴＳＧＫＤＧＶＩＲＳＶＦＥＧＶＮＰＱＧＶＫＶＡＮＦＫＶＰＴＱＥＥＬＤＨＤＹＬＷＲＶＨＫＶＶＰＧＫＧＥＩＶＩＦＮＲＳＨＹＥＤＶＬＶＶＲＶＨＮＬＶＰＰＥＶＷＫＫＲＹＥＱＩＮＱＦＥＲＬＬＨＥＴＧＴＴＩＬＫＦＦＬＦＩＳＲＥＥＱＫＱＲＬＬＥＲＬＡＤＰＡＫＨＷＫＦＮＰＧＤＬＫＥＲＡＬＷＥＥＹＥＫＡＹＥＤＶＬＳＲＴＳＴＥＹＡＰＷＩＬＶＰＡＤＫＫＷＹＲＤＷＶＩＳＲＶＬＶＥＴＬＥＧＬＥＩＱＬＰＰＰＬＡＤＡＥＴＹＲＲＱＬＬＥＥＤＡＰＥＳＲ（配列番号５）
Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ ＤＳＭ １４５３５ ＰＰＫ２
ＭＤＶＤＲＹＲＶＰＰＧＳＴＩＨＬＳＱＷＰＰＤＤＲＳＬＹＥＧＤＫＫＱＧＫＱＤＬＳＡＬＮＲＲＬＥＴＬＱＥＬＬＹＡＥＧＫＨＫＶＬＩＩＬＱＧＭＤＴＳＧＫＤＧＶＩＲＨＶＦＮＧＶＮＰＱＧＶＫＶＡＳＦＫＶＰＴＡＶＥＬＡＨＤＦＬＷＲＩＨＲＱＴＰＧＳＧＥＩＶＩＦＮＲＳＨＹＥＤＶＬＶＶＲＶＨＧＬＶＰＰＥＶＷＡＲＲＹＥＨＩＮＡＦＥＫＬＬＶＤＥＧＴＴＩＬＫＦＦＬＨＩＳＫＥＥＱＲＱＲＬＬＥＲＬＥＭＰＥＫＲＷＫＦＳＶＧＤＬＡＥＲＫＲＷＤＥＹＭＡＡＹＥＡＶＬＳＫＴＳＴＥＹＡＰＷＹＩＶＰＳＤＲＫＷＹＲＮＬＶＩＳＨＶＩＩＮＡＬＥＧＬＮＭＲＹＰＱＰＥＤＩＡＦＤＴＩＶＩＥ（配列番号６）
Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ ＴＬＳ ＰＰＫ２
ＭＫＬＤＬＤＡＦＲＩＱＰＧＫＫＰＮＬＡＫＲＰＴＲＩＤＰＶＹＲＳＫＧＥＹＨＥＬＬＡＮＨＶＡＥＬＳＫＬＱＮＶＬＹＡＤＮＲＹＡＩＬＬＩＦＱＡＭＤＡＡＧＫＤＳＡＩＫＨＶＭＳＧＶＮＰＱＧＣＱＶＹＳＦＫＨＰＳＡＴＥＬＥＨＤＦＬＷＲＴＮＣＶＬＰＥＲＧＲＩＧＩＦＮＲＳＹＹＥＥＶＬＶＶＲＶＨＰＥＩＬＥＭＱＮＩＰＨＮＬＡＨＮＧＫＶＷＤＨＲＹＲＳＩＶＳＨＥＱＨＬＨＣＮＧＴＲＩＶＫＦＹＬＨＬＳＫＥＥＱＲＫＲＦＬＥＲＩＤＤＰＮＫＮＷＫＦＳＴＡＤＬＥＥＲＫＦＷＤＱＹＭＥＡＹＥＳＣＬＱＥＴＳＴＫＤＳＰＷＦＡＶＰＡＤＤＫＫＮＡＲＬＩＶＳＲＩＶＬＤＴＬＥＳＬＮＬＫＹＰＥＰＳＰＥＲＲＫＥＬＬＤＩＲＫＲＬＥＮＰＥＮＧＫ（配列番号７）
Ｏｃｅａｎｉｔｈｅｒｍｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ ＤＳＭ １４９７７ ＰＰＫ２
ＭＤＶＳＲＹＲＶＰＰＧＳＧＦＤＰＥＡＷＰＴＲＥＤＤＤＦＡＧＧＫＫＥＡＫＫＥＬＡＲＬＡＶＲＬＧＥＬＱＡＲＬＹＡＥＧＲＱＡＬＬＩＶＬＱＧＭＤＴＡＧＫＤＧＴＩＲＨＶＦＲＡＶＮＰＱＧＶＲＶＴＳＦＫＫＰＴＡＬＥＬＡＨＤＹＬＷＲＶＨＲＨＡＰＡＲＧＥＩＧＩＦＮＲＳＨＹＥＤＶＬＶＶＲＶＨＥＬＶＰＰＥＶＷＧＲＲＹＤＨＩＮＡＦＥＲＬＬＡＤＥＧＴＲＩＶＫＦＦＬＨＩＳＫＤＥＱＫＲＲＬＥＡＲＬＥＮＰＲＫＨＷＫＦＮＰＡＤＬＳＥＲＡＲＷＧＤＹＡＡＡＹＡＥＡＬＳＲＴＳＳＤＲＡＰＷＹＡＶＰＡＤＲＫＷＱＲＮＲＩＶＡＱＶＬＶＤＡＬＥＡＭＤＰＲＦＰＲＶＤＦＤＰＡＳＶＲＶＥ（配列番号８）
Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ ＤＳＭ １３９４１ ＰＰＫ２
ＭＹＡＱＲＶＶＰＧＭＲＶＲＬＨＤＩＤＰＤＡＮＧＧＬＮＫＤＥＧＲＡＲＦＡＥＬＮＡＥＬＤＶＭＱＥＥＬＹＡＡＧＩＨＡＬＬＬＩＬＱＧＭＤＴＡＧＫＤＧＡＩＲＮＶＭＬＮＬＮＰＱＧＣＲＶＥＳＦＫＶＰＴＥＥＥＬＡＨＤＦＬＷＲＶＨＲＶＶＰＲＫＧＭＶＧＶＦＮＲＳＨＹＥＤＶＬＶＶＲＶＨＳＬＶＰＥＳＶＷＲＡＲＹＤＱＩＮＡＦＥＲＬＬＡＤＴＧＴＩＩＶＫＣＦＬＨＩＳＫＥＥＱＥＱＲＬＬＡＲＥＲＤＶＳＫＡＷＫＬＳＡＧＤＷＲＥＲＡＦＷＤＤＹＭＡＡＹＥＥＡＬＴＲＣＳＴＤＹＡＰＷＹＩＩＰＡＮＲＫＷＹＲＤＬＡＩＳＥＡＬＶＥＴＬＲＰＹＲＤＤＷＲＲＡＬＤＡＭＳＲＡＲＲＡＥＬＥＡＦＲＡＥＱＨＡＭＥＧＲＰＱＧＡＧＧＶＳＲＲ（配列番号９）
Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｓｐ． ＲＳ－１ ＰＰＫ２
ＭＨＹＡＨＴＶＩＰＧＴＱＶＲＬＲＤＩＤＰＤＡＳＧＧＬＴＫＤＥＧＲＥＲＦＡＳＦＮＡＴＬＤＡＭＱＥＥＬＹＡＡＧＶＨＡＬＬＬＩＬＱＧＭＤＴＡＧＫＤＧＡＩＲＮＶＭＨＮＬＮＰＱＧＣＲＶＥＳＦＫＶＰＴＥＥＥＬＡＨＤＦＬＷＲＶＨＫＶＶＰＲＫＧＭＶＧＶＦＮＲＳＨＹＥＤＶＬＶＶＲＶＨＳＬＶＰＥＨＶＷＲＡＲＹＤＱＩＮＡＦＥＲＬＬＴＤＴＧＴＩＩＶＫＣＦＬＨＩＳＫＤＥＱＥＫＲＬＬＡＲＥＱＤＶＴＫＡＷＫＬＳＡＧＤＷＲＥＲＥＲＷＤＥＹＭＡＡＹＥＥＡＬＴＲＣＳＴＥＹＡＰＷＹＩＩＰＡＮＲＫＷＹＲＤＬＡＩＳＥＶＬＶＥＴＬＲＰＹＲＤＤＷＱＲＡＬＤＡＭＳＱＡＲＬＡＥＬＫＡＦＲＨＱＱＴＡＧＡＴＲＬ（配列番号１０）
Ｔｒｕｅｐｅｒａ ｒａｄｉｏｖｉｃｔｒｉｘ ＤＳＭ １７０９３ ＰＰＫ２
ＭＳＱＧＳＡＫＧＬＧＫＬＤＫＫＶＹＡＲＥＬＡＬＬＱＬＥＬＶＫＬＱＧＷＩＫＡＱＧＬＫＶＶＶＬＦＥＧＲＤＡＡＧＫＧＳＴＩＴＲＩＴＱＰＬＮＰＲＶＣＲＶＶＡＬＧＡＰＴＥＲＥＲＴＱＷＹＦＱＲＹＶＨＨＬＰＡＡＧＥＭＶＬＦＤＲＳＷＹＮＲＡＧＶＥＲＶＭＧＦＣＴＥＡＥＹＲＥＦＬＨＡＣＰＴＦＥＲＬＬＬＤＡＧＩＩＬＩＫＹＷＦＳＶＳＡＡＥＱＥＲＲＭＲＲＲＮＥＮＰＡＫＲＷＫＬＳＰＭＤＬＥＡＲＡＲＷＶＡＹＳＫＡＫＤＡＭＦＹＨＴＤＴＫＡＳＰＷＹＶＶＮＡＥＤＫＲＲＡＨＬＳＣＩＡＨＬＬＳＬＩＰＹＥＤＬＴＰＰＰＬＥＭＰＰＲＤＬＡＧＡＤＥＧＹＥＲＰＤＫＡＨＱＴＷＶＰＤＹＶＰＰＴＲ（配列番号１１）
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ａｄｋ
ＭＤＶＧＱＡＶＩＦＬＧＰＰＧＡＧＫＧＴＱＡＳＲＬＡＱＥＬＧＦＫＫＬＳＴＧＤＩＬＲＤＨＶＡＲＧＴＰＬＧＥＲＶＲＰＩＭＥＲＧＤＬＶＰＤＤＬＩＬＥＬＩＲＥＥＬＡＥＲＶＩＦＤＧＦＰＲＴＬＡＱＡＥＡＬＤＲＬＬＳＥＴＧＴＲＬＬＧＶＶＬＶＥＶＰＥＥＥＬＶＲＲＩＬＲＲＡＥＬＥＧＲＳＤＤＮＥＥＴＶＲＲＲＬＥＶＹＲＥＫＴＥＰＬＶＧＹＹＥＡＲＧＶＬＫＲＶＤＧＬＧＴＰＤＥＶＹＡＲＩＲＡＡＬＧＩ（配列番号１２）
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃｍｋ
ＭＲＧＩＶＴＩＤＧＰＳＡＳＧＫＳＳＶＡＲＲＶＡＡＡＬＧＶＰＹＬＳＳＧＬＬＹＲＡＡＡＦＬＡＬＲＡＧＶＤＰＧＤＥＥＧＬＬＡＬＬＥＧＬＧＶＲＬＬＡＱＡＥＧＮＲＶＬＡＤＧＥＤＬＴＳＦＬＨＴＰＥＶＤＲＶＶＳＡＶＡＲＬＰＧＶＲＡＷＶＮＲＲＬＫＥＶＰＰＰＦＶＡＥＧＲＤＭＧＴＡＶＦＰＥＡＡＨＫＦＹＬＴＡＳＰＥＶＲＡＷＲＲＡＲＥＲＰＱＡＹＥＥＶＬＲＤＬＬＲＲＤＥＲＤＫＡＱＳＡＰＡＰＤＡＬＶＬＤＴＧＧＭＴＬＤＥＶＶＡＷＶＬＡＨＩＲＲ（配列番号１３）
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＰｙｒＨ
ＭＲＩＶＦＤＩＧＧＳＶＬＶＰＥＮＰＤＩＤＦＩＫＥＩＡＹＱＬＴＫＶＳＥＤＨＥＶＡＶＶＶＧＧＧＫＬＡＲＫＹＩＥＶＡＥＫＦＮＳＳＥＴＦＫＤＦＩＧＩＱＩＴＲＡＮＡＭＬＬＩＡＡＬＲＥＫＡＹＰＶＶＶＥＤＦＷＥＡＷＫＡＶＱＬＫＫＩＰＶＭＧＧＴＨＰＧＨＴＴＤＡＶＡＡＬＬＡＥＦＬＫＡＤＬＬＶＶＩＴＮＶＤＧＶＹＴＡＤＰＫＫＤＰＴＡＫＫＩＫＫＭＫＰＥＥＬＬＥＩＶＧＫＧＩＥＫＡＧＳＳＳＶＩＤＰＬＡＡＫＩＩＡＲＳＧＩＫＴＩＶＩＧＫＥＤＡＫＤＬＦＲＶＩＫＧＤＨＮＧＴＴＩＥＰ（配列番号１４）
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ Ｇｍｋ
ＭＫＧＱＬＦＶＩＣＧＰＳＧＡＧＫＴＳＩＩＫＥＶＬＫＲＬＤＮＶＶＦＳＶＳＣＴＴＲＰＫＲＰＨＥＥＤＧＫＤＹＦＦＩＴＥＥＥＦＬＫＲＶＥＲＧＥＦＬＥＷＡＲＶＨＧＨＬＹＧＴＬＲＳＦＶＥＳＨＩＮＥＧＫＤＶＶＬＤＩＤＶＱＧＡＬＳＶＫＫＫＹＳＮＴＶＦＩＹＶＡＰＰＳＹＡＤＬＲＥＲＩＬＫＲＧＴＥＫＥＡＤＶＬＶＲＬＥＮＡＫＷＥＬＭＦＭＤＥＦＤＹＩＶＶＮＥＮＬＥＤＡＶＥＭＶＶＳＩＶＲＳＥＲＡＫＶＴＲＮＱＤＫＩＥＲＦＫＭＥＶＫＧＷＫＫＬ（配列番号１５）
Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ Ｎｄｋ
ＭＡＶＥＲＴＬＩＩＶＫＰＤＡＭＥＫＧＡＬＧＫＩＬＤＲＦＩＱＥＧＦＱＩＫＡＬＫＭＦＲＦＴＰＥＫＡＧＥＦＹＹＶＨＲＥＲＰＦＦＱＥＬＶＥＦＭＳＳＧＰＶＶＡＡＶＬＥＧＥＤＡＩＫＲＶＲＥＩＩＧＰＴＤＳＥＥＡＲＫＶＡＰＮＳＩＲＡＱＦＧＴＤＫＧＫＮＡＩＨＡＳＤＳＰＥＳＡＱＹＥＩＣＦＩＦＳＧＬＥＩＶ（配列番号１６）
ＩＴＳ
ＧＧＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴ（配列番号１７）
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１４． Ｓｈｌｙａｐｎｉｋｏｖ Ｓ．Ｖ．， Ｌｕｎｉｎ Ｖ．Ｖ．， Ｐｅｒｂａｎｄｔ Ｍ．， Ｐｏｌｙａｋｏｖ Ｋ．Ｍ．， Ｌｕｎｉｎ Ｖ．Ｙ．， Ｌｅｖｄｉｋｏｖ Ｖ．Ｍ．， Ｂｅｔｚｅｌ Ｃ．， Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ Ａ．Ｍ． ２０００． Ａｔｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｔ １．１ Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ ５６：５６７－５７２．
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１６． Ｚｕｏ Ｙ．， Ｚｈｅｎｇ Ｈ．， Ｗａｎｇ Ｙ．， Ｃｈｒｕｓｚｃｚ Ｍ．， Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋｉ Ｍ．， Ｓｋａｒｉｎａ Ｔ．， Ｓａｖｃｈｅｎｋｏ Ａ．， Ｍａｌｈｏｔｒａ Ａ．， Ｍｉｎｏｒ Ｗ． ２００７． Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＲＮａｓｅ Ｔ， ａｎ ｅｘｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｄ ｔｕｒｎｏｖｅｒ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １５：４１７－４２８．
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２０． Ｍｏｔｏｍｕｒａ， Ｋ．， Ｈｉｒｏｔａ， Ｒ．， Ｏｋａｄａ， Ｍ．， Ｉｋｅｄａ， Ｔ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｔ．， ＆ Ｋｕｒｏｄａ， Ａ． （２０１４）． Ａ Ｎｅｗ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｋｉｎａｓｅ ２ （Ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ＰＰＫ２） Ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｂｏｔｈ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ８０（８）， ２６０２－２６０８． ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＡＥＭ．０３９７１－１３
２１． Ｅｌｋｉｎ， Ｓ． Ｒ．， Ｋｕｍａｒ， Ａ．， Ｐｒｉｃｅ， Ｃ． Ｗ．， ＆ Ｃｏｌｕｍｂｕｓ， Ｌ． （２０１３）． Ａ Ｂｒｏａｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ８１（４）， ５６８－５８２． ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｐｒｏｔ．２４２１２
２２． Ｈａｎｓｅｎ， Ｔ．， Ａｒｎｆｏｒｓ， Ｌ．， Ｌａｄｅｎｓｔｅｉｎ， Ｒ．， ＆ Ｓｃｈｏｎｈｅｉｔ， Ｐ． （２００７）． Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ－Ｂ （ＭＪ０４０６） ｆｒｏｍ Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ａ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ａ ｂｒｏａｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ， １１（１）， １０５．
２３． Ｏｔａ， Ｈ．， Ｓａｋａｓｅｇａｗａ， Ｓ．， Ｙａｓｕｄａ， Ｙ．， Ｉｍａｍｕｒａ， Ｓ．， ＆ Ｔａｍｕｒａ， Ｔ． （２００８）． Ａ ｎｏｖｅｌ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ： ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ Ｂ－ｔｙｐｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ． Ｔｈｅ ＦＥＢＳ ｊｏｕｒｎａｌ， ２７５（２３）， ５８６５．
２４． Ｔｏｍｏｉｋｅ， Ｆ．， Ｎａｋａｇａｗａ， Ｎ．， Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ， Ｓ．， ＆ Ｍａｓｕｉ， Ｒ． （２０１１）． Ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｌｉｍｉｔｓ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｕｒｉｄｉｎｅ－ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｔｏ ｃｙｔｉｄｉｎｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５０（２１）， ４５９７．
２５． Ｈｅｎｎｅ Ａ．， Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ Ｈ．， Ｒａａｓｃｈ Ｃ．， Ｗｉｅｚｅｒ Ａ．， Ｈａｒｔｓｃｈ Ｔ．， Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ Ｈ．， Ｊｏｈａｎｎ Ａ．， Ｌｉｅｎａｒｄ Ｔ．， Ｇｏｈｌ Ｏ．， Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ａｒｉａｓ Ｒ．， Ｊａｃｏｂｉ Ｃ．， Ｓｔａｒｋｕｖｉｅｎｅ Ｖ．， Ｓｃｈｌｅｎｃｚｅｃｋ Ｓ．， Ｄｅｎｃｋｅｒ Ｓ．， Ｈｕｂｅｒ Ｒ．， Ｋｌｅｎｋ Ｈ．－Ｐ．， Ｋｒａｍｅｒ Ｗ．， Ｍｅｒｋｌ Ｒ．， Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ Ｇ．， Ｆｒｉｔｚ Ｈ．－Ｊ． ２００４． Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒｅｍｅ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：５４７－５５３．
２６． Ｔａｎ ＺＷ， Ｌｉｕ Ｊ， Ｚｈａｎｇ ＸＦ， Ｍｅｎｇ ＦＧ， Ｚｈａｎｇ ＹＺ．Ｎａｎ Ｆａｎｇ Ｙｉ Ｋｅ Ｄａ Ｘｕｅ Ｘｕｅ Ｂａｏ． ２０１０． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ２７ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．．Ｊａｎ；３０（１）：１－６
２７． Ｍａｅｄｅｒ Ｄ．Ｌ．， Ｗｅｉｓｓ Ｒ．Ｂ．， Ｄｕｎｎ Ｄ．Ｍ．， Ｃｈｅｒｒｙ Ｊ．Ｌ．， Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｊ．Ｍ．， ＤｉＲｕｇｇｉｅｒｏ Ｊ．， Ｒｏｂｂ Ｆ．Ｔ． １９９９． Ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅａ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ａｎｄ Ｐ． ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２：１２９９－１３０５．
２８． Ｍｅｔｈｅ， Ｂ． Ａ．， Ｎｅｌｓｏｎ， Ｋ． Ｅ．， Ｄｅｍｉｎｇ， Ｊ． Ｗ．， Ｍｏｍｅｎ， Ｂ．， Ｍｅｌａｍｕｄ， Ｅ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ．， … Ｆｒａｓｅｒ， Ｃ． Ｍ． （２００５）． Ｔｈｅ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ ａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ ３４Ｈ ｔｈｒｏｕｇｈ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， １０２（３１）， １０９１３－１０９１８． ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５０４７６６１０２
２９． Ｍｅｄｉｇｕｅ， Ｃ．， Ｋｒｉｎ， Ｅ．， Ｐａｓｃａｌ， Ｇ．， Ｂａｒｂｅ， Ｖ．， Ｂｅｒｎｓｅｌ， Ａ．， Ｂｅｒｔｉｎ， Ｐ． Ｎ．， … Ｄａｎｃｈｉｎ， Ａ． （２００５）． Ｃｏｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｏｌｄ： Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍａｒｉｎｅ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ ＴＡＣ１２５． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １５（１０）， １３２５－１３３５． ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／ｇｒ．４１２６９０５
３０． Ａｙａｌａ－ｄｅｌ－Ｒｉｏ， Ｈ． Ｌ．， Ｃｈａｉｎ， Ｐ． Ｓ．， Ｇｒｚｙｍｓｋｉ， Ｊ． Ｊ．， Ｐｏｎｄｅｒ， Ｍ． Ａ．， Ｉｖａｎｏｖａ， Ｎ．， Ｂｅｒｇｈｏｌｚ， Ｐ． Ｗ．， … Ｔｉｅｄｊｅ， Ｊ． Ｍ． （２０１０）． Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｒｃｔｉｃｕｓ ２７３－４， ａ Ｐｓｙｃｈｒｏａｃｔｉｖｅ Ｓｉｂｅｒｉａｎ Ｐｅｒｍａｆｒｏｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｒｅｖｅａｌｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｏ Ｌｏｗ－Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｇｒｏｗｔｈ ． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ７６（７）， ２３０４－２３１２． ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＡＥＭ．０２１０１－０９
３１． Ｆｅｉｌ， Ｈ．， Ｆｅｉｌ， Ｗ． Ｓ．， Ｃｈａｉｎ， Ｐ．， Ｌａｒｉｍｅｒ， Ｆ．， ＤｉＢａｒｔｏｌｏ， Ｇ．， Ｃｏｐｅｌａｎｄ， Ａ．， … Ｌｉｎｄｏｗ， Ｓ． Ｅ． （２００５）． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｓｙｒｉｎｇａｅ Ｂ７２８ａ ａｎｄ ｐｖ． ｔｏｍａｔｏ ＤＣ３０００． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， １０２（３１）， １１０６４－１１０６９． ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５０４９３０１０２
３２． Ｓｏｎｇ， Ｓ．， Ｉｎｏｕｙｅ， Ｓ．， Ｋａｗａｉ， Ｍ．， Ｆｕｋａｍｉ－Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｋ．， Ｇｏ， Ｍ．， ＆ Ｎａｋａｚａｗａ， Ａ． （１９９６）． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｂｉｕｍ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ． Ｇｅｎｅ， １７５（１）， ６５－７０．
３３． Ｍａｓｕｉ Ｒ．， Ｋｕｒｏｋａｗａ Ｋ．， Ｎａｋａｇａｗａ Ｎ．， Ｔｏｋｕｎａｇａ Ｆ．， Ｋｏｙａｍａ Ｙ．， Ｓｈｉｂａｔａ Ｔ．， Ｏｓｈｉｍａ Ｔ．， Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｓ．， Ｙａｓｕｎａｇａ Ｔ．， Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ Ｓ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８． Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ （ＮＯＶ－２００４） ｔｏ ｔｈｅ ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ ｄａｔａｂａｓｅｓ．
３４． Ｎｇ， Ｗ． Ｖ．， Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｓ． Ｐ．， Ｍａｈａｉｒａｓ， Ｇ． Ｇ．， Ｂｅｒｑｕｉｓｔ， Ｂ．， Ｐａｎ， Ｍ．， Ｓｈｕｋｌａ， Ｈ． Ｄ．， … ＤａｓＳａｒｍａ， Ｓ． （２０００）． Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ＮＲＣ－１． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， ９７（２２）， １２１７６－１２１８１．
３５． Ｍａｒｃｏ－Ｍａｒｉｎ Ｃ．， Ｅｓｃａｍｉｌｌａ－Ｈｏｎｒｕｂｉａ Ｊ．Ｍ．， Ｒｕｂｉｏ Ｖ． ２００５． Ｆｉｒｓｔ－ｔｉｍｅ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｘ－ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ－ａｒｃｈａｅａｌ ｔｙｐｅ ＵＭＰ ｋｉｎａｓｅ， ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １７４７：２７１－２７５．
３６． Ｍａｒｃｏ－Ｍａｒｉｎ Ｃ．， Ｅｓｃａｍｉｌｌａ－Ｈｏｎｒｕｂｉａ Ｊ．Ｍ．， Ｒｕｂｉｏ Ｖ． ２００５． Ｆｉｒｓｔ－ｔｉｍｅ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｘ－ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ－ａｒｃｈａｅａｌ ｔｙｐｅ ＵＭＰ ｋｉｎａｓｅ， ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １７４７：２７１－２７５．
３７． Ｊｅｎｓｅｎ， Ｋ． Ｓ．， Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ， Ｅ．， ＆ Ｊｅｎｓｅｎ， Ｋ． Ｆ． （２００７）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ｕｒｉｄｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｓｈｏｗｓ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＵＴＰ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｌａｃｋ ｏｆ ＧＴＰ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４６（１０）， ２７４５－２７５７．
３８． Ｎｅｌｓｏｎ Ｋ．Ｅ．， Ｃｌａｙｔｏｎ Ｒ．Ａ．， Ｇｉｌｌ Ｓ．Ｒ．， Ｇｗｉｎｎ Ｍ．Ｌ．， Ｄｏｄｓｏｎ Ｒ．Ｊ．， Ｈａｆｔ Ｄ．Ｈ．， Ｈｉｃｋｅｙ Ｅ．Ｋ．， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｊ．Ｄ．， Ｎｅｌｓｏｎ Ｗ．Ｃ．， Ｋｅｔｃｈｕｍ Ｋ．Ａ．， ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｌ．Ａ．， Ｕｔｔｅｒｂａｃｋ Ｔ．Ｒ．， Ｍａｌｅｋ Ｊ．Ａ．， Ｌｉｎｈｅｒ Ｋ．Ｄ．， Ｇａｒｒｅｔｔ Ｍ．Ｍ．， Ｓｔｅｗａｒｔ Ａ．Ｍ．， Ｃｏｔｔｏｎ Ｍ．Ｄ．， Ｐｒａｔｔ Ｍ．Ｓ． Ｆｒａｓｅｒ Ｃ．Ｍ． １９９９． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｌａｔｅｒａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｒｃｈａｅａ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ． Ｎａｔｕｒｅ ３９９：３２３－３２９．
３９． Ｒｉｌｅｙ， Ｍ．， Ｓｔａｌｅｙ， Ｊ． Ｔ．， Ｄａｎｃｈｉｎ， Ａ．， Ｗａｎｇ， Ｔ． Ｚ．， Ｂｒｅｔｔｉｎ， Ｔ． Ｓ．， Ｈａｕｓｅｒ， Ｌ． Ｊ．， … Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｌ． Ｓ． （２００８）． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ａｎ ｅｘｔｒｅｍｅ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅ， Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ ｉｎｇｒａｈａｍｉｉ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ９， ２１０． ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／１４７１－２１６４－９－２１０
４０． Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ， Ｍ．， Ｔｏｋｕｎａｇａ， Ｈ．， Ｈｉｒａｔｓｕｋａ， Ｋ．， Ｙｏｎｅｚａｗａ， Ｙ．， Ｔｓｕｒｕｍａｒｕ， Ｈ．， Ａｒａｋａｗａ， Ｔ．， ＆ Ｔｏｋｕｎａｇａ， Ｍ． （２００１）． ＮａＣｌ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｈａｌｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅｏｎ， Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ， ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｎａｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓａｌｔ． ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ， ４９３（２－３）， １３４．
４１． Ｐｏｌｏｓｉｎａ， Ｙ． Ｙ．， Ｚａｍｙａｔｋｉｎ， Ｄ． Ｆ．， Ｋｏｓｔｙｕｋｏｖａ， Ａ． Ｓ．， Ｆｉｌｉｍｏｎｏｖ， Ｖ． Ｖ．， ＆ Ｆｅｄｏｒｏｖ， Ｏ． Ｖ． （２００２）． Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｎａｔｒｉａｌｂａ ｍａｇａｄｉｉ ＮＤＰ ｋｉｎａｓｅ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｈａｌｏｐｈｉｌｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ： ｌｉｆｅ ｕｎｄｅｒ ｅｘｔｒｅｍｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ６（２）， １３５．
４２． Ｐｏｌｏｓｉｎａ， Ｙ． Ｙ．， Ｚａｍｙａｔｋｉｎ， Ｄ． Ｆ．， Ｋｏｓｔｙｕｋｏｖａ， Ａ． Ｓ．， Ｆｉｌｉｍｏｎｏｖ， Ｖ． Ｖ．， ＆ Ｆｅｄｏｒｏｖ， Ｏ． Ｖ． （２００２）． Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｎａｔｒｉａｌｂａ ｍａｇａｄｉｉ ＮＤＰ ｋｉｎａｓｅ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｈａｌｏｐｈｉｌｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ： ｌｉｆｅ ｕｎｄｅｒ ｅｘｔｒｅｍｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ６（２）， １３５．
４３． Ｕｄａｏｎｄｏ， Ｚ．， Ｍｏｌｉｎａ， Ｌ．， Ｄａｎｉｅｌｓ， Ｃ．， Ｇｏｍｅｚ， Ｍ． Ｊ．， Ｍｏｌｉｎａ－Ｈｅｎａｒｅｓ， Ｍ． Ａ．， Ｍａｔｉｌｌａ， Ｍ． Ａ．， … Ｒａｍｏｓ， Ｊ． Ｌ． （２０１３）． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｇａｎｉｃ－ｓｏｌｖｅｎｔ ｔｏｌｅｒａｎｔ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＤＯＴ－Ｔ１Ｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｉｔｓ ａｎｎｏｔａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６（５）， ５９８－６１１． ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／１７５１－７９１５．１２０６１
４４． Ｎｏｌｌｉｎｇ， Ｊ．， Ｂｒｅｔｏｎ， Ｇ．， Ｏｍｅｌｃｈｅｎｋｏ， Ｍ． Ｖ．， Ｍａｋａｒｏｖａ， Ｋ． Ｓ．， Ｚｅｎｇ， Ｑ．， Ｇｉｂｓｏｎ， Ｒ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｒ． （２００１）． Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｌｖｅｎｔ－Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １８３（１６）， ４８２３－４８３８． ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＪＢ．１８３．１６．４８２３－４８３８．２００１
４５． Ｂｒｕｎｅ， Ｍ．， Ｓｃｈｕｍａｎｎ， Ｒ．， ＆ Ｗｉｔｔｉｎｇｈｏｆｅｒ， Ｆ． （１９８５）． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ （ａｄｋ） ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １３（１９）， ７１３９－７１５１．
４６． Ｐｅｌ， Ｈ． Ｊ．， ｄｅ Ｗｉｎｄｅ， Ｊ． Ｈ．， Ａｒｃｈｅｒ， Ｄ． Ｂ．， Ｄｙｅｒ， Ｐ． Ｓ．， Ｈｏｆｍａｎｎ， Ｇ．， Ｓｃｈａａｐ， Ｐ． Ｊ．， ．．． ＆ Ａｎｄｅｒｓｅｎ， Ｍ． Ｒ． （２００７）． Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＣＢＳ ５１３．８８． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２５（２）， ２２１．
４７． Ｍａｇｄｏｌｅｎ， Ｖ．， Ｏｅｃｈｓｎｅｒ， Ｕ．， ＆ Ｂａｎｄｌｏｗ， Ｗ． （１９８７）． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｙｅａｓｔ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １２（６）， ４０５．
４８． Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｓ．， Ｓｋｏｕｖ， Ｊ．， Ｋａｊｉｔａｎｉ， Ｍ．， ＆ Ｉｓｈｉｈａｍａ， Ａ． （１９８４）． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｐｓＡ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ ｇｅｎｅｒａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ： ＭＧＧ， １９６（１）， １３５．
４９． Ｓｍａｌｌｓｈａｗ， Ｊ．， ＆ Ｋｅｌｌｎ， Ｒ． Ａ． （１９９２）． Ｃｌｏｎｉｎｇ， ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ｐｙｒＨ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＵＭＰ ｋｉｎａｓｅ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． Ａｄｖ．）， １１， ５９－６５．
５０． Ｌｉｌｊｅｌｕｎｄ， Ｐ．， Ｓａｎｎｉ， Ａ．， Ｆｒｉｅｓｅｎ， Ｊ． Ｄ．， ＆ Ｌａｃｒｏｕｔｅ， Ｆ． （１９８９）． Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｕｒｉｄｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， １６５（１）， ４６４．
５１． Ｇｅｎｔｒｙ， Ｄ．， Ｂｅｎｇｒａ， Ｃ．， Ｉｋｅｈａｒａ， Ｋ．， ＆ Ｃａｓｈｅｌ， Ｍ． （１９９３）． Ｇｕａｎｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６８（１９）， １４３１６．
５２． Ｋｏｎｒａｄ， Ｍ． （１９９２）． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｇｕａｎｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６７（３６）， ２５６５２．
５３． Ｈａｍａ， Ｈ．， Ａｌｍａｕｌａ， Ｎ．， Ｌｅｒｎｅｒ， Ｃ． Ｇ．， Ｉｎｏｕｙｅ， Ｓ．， ＆ Ｉｎｏｕｙｅ， Ｍ． （１９９１）． Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；ｉｔｓ ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ． Ｇｅｎｅ， １０５（１）， ３１．
５４． Ｂｅｓｉｒ， Ｈ．， Ｚｅｔｈ， Ｋ．， Ｂｒａｃｈｅｒ， Ａ．， Ｈｅｉｄｅｒ， Ｕ．， Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ， Ｍ．， Ｔｏｋｕｎａｇａ， Ｍ．， ＆ Ｏｅｓｔｅｒｈｅｌｔ， Ｄ． （２００５）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｈａｌｏｐｈｉｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ． ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ， ５７９（２９）， ６５９５．
５５． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， Ｍ． ＆ Ｒｅｕｖｅｎ Ｎ． （１９９１）． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｖｅｒｓｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｔｉｃ ｍＲＮＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． ＰＮＡＳ， ８８， ３２７７－３２８０．
５６． Ｎｗｏｋｅｊｉ， Ａ． Ｏ．， Ｋｉｌｂｙ， Ｐ． Ｍ．， Ｐｏｒｔｗｏｏｄ， Ｄ． Ｅ．， ＆ Ｄｉｃｋｍａｎ， Ｍ． Ｊ． （２０１６）． ＲＮＡＳｗｉｆｔ： Ａ ｒａｐｉｄ， ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｒｅｅ ｆｒｏｍ ｐｈｅｎｏｌ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５１２， ３６ －４６．
５７． Ｍｏｈａｎｔｙ， Ｂ． Ｋ．， Ｇｉｌａｄｉ， Ｈ．， Ｍａｐｌｅｓ， Ｖ． Ｆ．， ＆ Ｋｕｓｈｎｅｒ， Ｓ． Ｒ． （２００８）． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｄｅｃａｙ， ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， ａｎｄ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ４４７， ３－２９．
５８． Ｋｏｒｚ， Ｄ． Ｊ．， Ｒｉｎａｓ， Ｕ．， Ｈｅｌｌｍｕｔｈ， Ｋ．， Ｓａｎｄｅｒｓ， Ｅ． Ａ．， ＆ Ｄｅｃｋｗｅｒ， Ｗ． Ｄ． （１９９５）． Ｓｉｍｐｌｅ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３９（１）， ５９－６５４
５９． Ｐｈｕｅ， Ｊ． Ｎ．， Ｌｅｅ， Ｓ． Ｊ．， Ｔｒｉｎｈ， Ｌ．， ＆ Ｓｈｉｌｏａｃｈ， Ｊ． （２００８）． Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ （ＢＬ２１）， ａ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ （ＤＨ５ａｌｐｈａ）． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １０１（４）， ８３１．
６０． ｄｅ Ｋｏｒｔｅ， Ｄ．， Ｈａｖｅｒｋｏｒｔ， Ｗ． Ａ．， Ｒｏｏｓ， Ｄ．， ＆ ｖａｎ Ｇｅｎｎｉｐ， Ａ． Ｈ． （１９８５）． Ａｎｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ． Ｃｌｉｎｉｃａ ｃｈｉｍｉｃａ ａｃｔａ；ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １４８（３）， １８５．］

Claims (101)

  1. 真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法であって、
    （ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、前記細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が５’ヌクレオシド一リン酸を含むこと；ならびに
    （ｂ）前記反応混合物を、前記ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；ならびに
    （ｃ）ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｉｉ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼ、ｖ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ポリＡテールを備えたｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレート、ｖｉｉｉ）１つまたは複数のキャッピング試薬を、ｍＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後に前記ＤＮＡを消化する条件下で添加することを含む、前記方法。
  2. 真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法であって、
    （ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、前記細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が５’ヌクレオシド一リン酸を含むこと；ならびに
    （ｂ）前記反応混合物を、前記ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；ならびに
    （ｃ）ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナーならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｉｉ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼ、ｖ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレート、ならびにｖｉｉｉ）１つまたは複数のキャッピング試薬を、キャップドＲＮＡを生産する条件下で添加し；さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後に前記ＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびに
    ｄ）（ｉ）さらにステップ（ｃ）において生産された前記反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、ｍＲＮＡを生産する条件下でインキュベートすること、または
    （ｉｉ）前記ＲＮＡポリメラーゼを、ステップ（ｃ）の前記反応混合物から不活性化もしくは物理的分離により除去し、続いて、前記反応混合物をポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でさらにインキュベートすることにより、ｍＲＮＡを生産することを含む、前記方法。
  3. 真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法であって、
    （ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、前記細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が５’ヌクレオシド一リン酸を含むこと；ならびに
    （ｂ）前記反応混合物を、前記ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；ならびに
    （ｃ）ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｉｉ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼ、ｖ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ポリＡテールを備えたｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレートを、非キャップドＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択で、ｖｉｉｉ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後に前記ＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびに
    （ｄ）ステップ（ｃ）からの前記反応混合物からのバッファーを交換し、かつ前記反応混合物をキャッピング酵素、ＧＴＰ、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、ｍＲＮＡを生産することを含む、前記方法。
  4. 真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法であって、
    （ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、前記細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物が５’ヌクレオシド一リン酸を含むこと；ならびに
    （ｂ）前記反応混合物を、前記ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；ならびに
    （ｃ）ヌクレオシド一リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｉｉ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼ、ｖ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレートを、非キャップド非テール化ＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｖｉｉｉ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後に前記ＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびに
    ｄ）（ｉ）さらに、ステップ（ｃ）で生産された前記反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、非キャップドＲＮＡを生産する条件下でインキュベートすること；または
    （ｉｉ）前記ＲＮＡポリメラーゼを、ステップ（ｃ）の前記反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、非キャップドＲＮＡを、前記反応混合物をポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でさらにインキュベートすることにより生産すること；ならびに
    ｅ）ステップ（ｃ）からの前記反応混合物からのバッファーを交換し、かつ前記反応混合物を、キャッピング酵素、ＧＴＰ、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、ｍＲＮＡを生産することを含む、前記方法。
  5. ステップ（ｃ）（ｉ）～（ｃ）（ｖ）を（ｃ）の残りのステップと同時ではなく、その前に実行して、ヌクレオチド三リン酸を生産する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記キャッピング試薬がジヌクレオチド、トリヌクレオチド、またはテトラヌクレオチドキャッピング試薬である、請求項１または２に記載の方法。
  7. 前記細胞ＲＮＡをバイオマスから得る、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  8. ＲＮＡを５’ヌクレオシド一リン酸に解重合する前記酵素がヌクレアーゼＰ１である、請求項１～４のいずれか１項に記載のステップ（ａ）の方法。
  9. ステップ（ｃ）の前記第２の反応混合物が、前記ＰＰＫ、ＮＭＰキナーゼ、前記ＮＤＰキナーゼ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレート、及び／または前記ＲＮＡポリメラーゼを産生する細胞から得られる酵素調製物を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記少なくとも１つのシチジン一リン酸キナーゼがＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記少なくとも１つのウリジン一リン酸キナーゼがＰｙｒｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つのグアノシン一リン酸キナーゼがＴｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａに由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記少なくとも１つのヌクレオシド二リン酸キナーゼがＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓに由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記少なくとも１つのポリリン酸キナーゼがＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓに由来するクラスＩＩＩポリリン酸キナーゼ２である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記リン酸ドナーがヘキサメタリン酸である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記ＤＮＡテンプレートが、ｉ）生じるｍＲＮＡのためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする配列；及び／またはｉｉ）転写プロモーター、ｉｉｉ）生じるｍＲＮＡのための５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をコードする配列、ｉｖ）生じるｍＲＮＡのための３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）及び任意選択で、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位をコードする配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記ＤＮＡテンプレートがさらに、１つまたは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素をコードする配列を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＤＮＡテンプレートがポリメラーゼ連鎖反応により生産される、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 前記ＤＮＡテンプレートがプラスミドでコードされる、請求項１７または１８に記載の方法。
  21. 前記プラスミドが、１つまたは複数のｍＲＮＡをコードする１つまたは複数のＤＮＡテンプレートを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. プラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化する、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. プラスミドＤＮＡを、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化する、請求項２２に記載の方法。
  24. プラスミドＤＮＡ及び／または制限エンドヌクレアーゼを線状化の前または後に精製する、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼが熱安定性である、請求項２または４に記載の方法。
  26. ステップ３ｄまたは４ｅの前記１つまたは複数のキャッピング酵素がホスファターゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、及び／またはグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項３または４に記載の方法。
  27. 前記メチルドナーがＳ－アデノシルメチオニンである、請求項３または４に記載の方法。
  28. 前記１つまたは複数のキャッピング酵素をワクシニアウイルス及び／またはブルータングウイルスから得る、請求項３または４に記載の方法。
  29. 前記１つまたは複数のキャッピング酵素がホスファターゼ活性を有する、請求項３または４に記載の方法。
  30. 前記１つまたは複数のキャッピング酵素がメチルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項３または４に記載の方法。
  31. 前記１つまたは複数のキャッピング酵素がグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項３または４に記載の方法。
  32. ＰＰＫ、任意選択でＮＭＰキナーゼ、任意選択でＮＤＰキナーゼ、任意選択で制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレート、ＲＮＡポリメラーゼ、ポリＡポリメラーゼ、及び／またはキャッピング酵素を含む前記第２の反応混合物を、１つまたは複数の細胞溶解産物から調製し、その際、前記細胞溶解産物中に存在する場合、不所望な酵素活性を排除する、不活性化する、または部分的に不活性化する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記不所望な酵素活性を、物理的分離により排除するか、または熱処理により不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記酵素を不活性化するか、または部分的に不活性化する温度が７０℃～９５℃である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記酵素を不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する温度が５５℃に等しいか、またはそれよりも高い、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記第２の反応混合物が、クロマトグラフィーにより細胞溶解産物から精製された１つまたは複数の酵素を含む、請求項３２に記載の方法。
  37. 前記キャッピング酵素を、クロマトグラフィーを使用して不所望な酵素活性から分離する、請求項３２に記載の方法。
  38. 濾過、抽出、沈殿、またはクロマトグラフィーによる前記ｍＲＮＡの精製をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記ｍＲＮＡを塩化リチウム沈殿によりさらに精製する、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ｍＲＮＡを高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製する、請求項３８または３９に記載の方法。
  41. 請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法により生産されたｍＲＮＡ。
  42. 真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法であって、
    （ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、前記細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと；
    （ｂ）前記反応混合物を、前記ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；ならびに
    （ｃ）ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ならびに任意選択でｉｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ポリＡテールを備えたｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレート、ｖｉｉｉ）１つまたは複数のキャッピング試薬を、ｍＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産の後に前記ＤＮＡを消化する条件下で添加することを含む、前記方法。
  43. 真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法であって、
    （ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、前記細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと；ならびに
    （ｂ）前記反応混合物を、前記ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；
    （ｃ）ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナーならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ならびに任意選択でｉｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ、ｖｉｉ）ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレート;ｖｉｉｉ）１つまたは複数のキャッピング試薬を、キャップドＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後に前記ＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびに
    ｄ）（ｉ）ステップ（ｃ）で生産された前記反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、ｍＲＮＡを生産する条件下でさらにインキュベートすること、または
    （ｉｉ）前記ＲＮＡポリメラーゼを、ステップ（ｃ）の前記反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、ｍＲＮＡを、前記反応混合物をポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でさらにインキュベートすることにより生産することを含む、前記方法。
  44. 真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法であって、
    （ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、前記細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと；
    （ｂ）前記反応混合物を、前記ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；
    （ｃ）ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ならびに任意選択でｉｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ及びｖｉｉ）ポリＡテールを備えたｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレートを、非キャップドＲＮＡを生産する条件下で添加し；さらに任意選択でｖｉｉｉ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産の後に前記ＤＮＡを消化する条件下で添加すること；ならびに
    （ｄ）ステップ（ｃ）からの前記反応混合物からのバッファーを交換し、かつ前記反応混合物を、キャッピング酵素、ＧＴＰ、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、ｍＲＮＡを生産することを含む、前記方法。
  45. 真核メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を合成するための無細胞反応方法であって、
    （ａ）反応混合物中で、細胞ＲＮＡと、ＲＮＡを解重合する１つまたは複数の酵素とを、前記細胞ＲＮＡが実質的に解重合される条件下でインキュベートし、その際、生じる第１の反応混合物がヌクレオシド二リン酸を含むこと；ならびに
    （ｂ）前記反応混合物を、前記ＲＮＡ解重合酵素が排除または不活性化される条件下で処理すること；ならびに
    （ｃ）ヌクレオシド二リン酸を含む前記反応混合物を、ｉ）少なくとも１つのポリリン酸（ＰＰＫ）キナーゼ及びリン酸ドナー；ならびに任意選択でｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシド－二リン酸（ＮＤＰ）キナーゼ、ならびに任意選択でｉｉｉ）少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ、ｉｖ）少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）キナーゼ、ｖ）少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）キナーゼを含む第２の反応混合物と共に、ｖｉ）ヌクレオチド三リン酸が生産される条件下でインキュベートし、さらにｖｉｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼ及びｖｉｉｉ）ｍＲＮＡをコードする少なくとも１つのＤＮＡテンプレートを、非キャップド非テール化ＲＮＡを生産する条件下で添加し、さらに任意選択でｉｘ）少なくとも１つのデオキシリボヌクレアーゼを、ＲＮＡ生産後に前記ＤＮＡを消化する条件下で添加すること；
    （ｄ）（ｉ）ステップ（ｃ）で生産された前記反応混合物を、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下で、非キャップドＲＮＡを生産する条件下でさらにインキュベートすること；または
    （ｉｉ）前記ＲＮＡポリメラーゼを、ステップ（ｃ）の前記反応混合物から不活性化または物理的分離により除去し、続いて、前記反応混合物をポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰの存在下でさらにインキュベートすることにより、非キャップドＲＮＡを産生すること；ならびに
    ｅ）ステップ（ｃ）からの前記反応混合物からのバッファーを交換し、かつ前記反応混合物をキャッピング酵素、ＧＴＰ、及びメチルドナーの存在下でインキュベートして、ｍＲＮＡを生産することを含む、前記方法。
  46. ステップ（ｃ）（ｉ）～（ｃ）（ｖ）を、（ｃ）の残りのステップと同時ではなく、その前に実行して、ヌクレオチド三リン酸を生産する、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記キャッピング試薬がジヌクレオチド、トリヌクレオチド、またはテトラヌクレオチドキャッピング試薬である、請求項４２または４３に記載の方法。
  48. 前記細胞ＲＮＡをバイオマスから得る、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記ＲＮＡ解重合酵素が、５’ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）を作製するリボヌクレアーゼである、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  50. ＲＮＡを５’ヌクレオシド二リン酸に解重合する酵素がＰＮＰアーゼである、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  51. ステップ（ｃ）の前記第２の反応混合物が、ＰＰＫ、ＮＤＰキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレート、及び／または前記ＲＮＡポリメラーゼを産生する細胞から得られる酵素調製物を含む、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記少なくとも１つのシチジン一リン酸キナーゼがＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記少なくとも１つのウリジン一リン酸キナーゼがＰｙｒｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来する、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記少なくとも１つのグアノシン一リン酸キナーゼがＴｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａに由来する、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記少なくとも１つのヌクレオシド二リン酸キナーゼがＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓに由来する、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記少なくとも１つのポリリン酸キナーゼが、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓに由来するクラスＩＩＩポリリン酸キナーゼ２である、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記リン酸ドナーがヘキサメタリン酸である、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記ＲＮＡポリメラーゼがバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体である、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記ＤＮＡテンプレートが、ｉ）生じるｍＲＮＡのためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする配列；及び／またはｉｉ）転写プロモーター、ｉｉｉ）生じるｍＲＮＡのための５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をコードする配列、ｉｖ）生じるｍＲＮＡのためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする配列、ｖ）生じるｍＲＮＡのための３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）及び任意選択で、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位をコードする配列を含む、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記ＤＮＡテンプレートがさらに、１つまたは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素をコードする配列を含む、請求項５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記ＤＮＡテンプレートがポリメラーゼ連鎖反応により生産される、請求項５９または６０に記載の方法。
  62. 前記ＤＮＡテンプレートがプラスミドでコードされる、請求項５９または６０に記載の方法。
  63. 前記プラスミドが、１つまたは複数のｍＲＮＡをコードする１つまたは複数のＤＮＡテンプレートを含む、請求項６２に記載の方法。
  64. プラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化する、請求項６２または６３に記載の方法。
  65. プラスミドＤＮＡを、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化する、請求項６４に記載の方法。
  66. プラスミドＤＮＡ及び／または制限エンドヌクレアーゼを線状化の前または後に精製する、請求項６４または６５に記載の方法。
  67. 前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼが熱安定性である、請求項４３または４５に記載の方法。
  68. ステップ４４ｄまたは４５ｅの前記１つまたは複数のキャッピング酵素が、ホスファターゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、及び／またはグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項４４または４５に記載の方法。
  69. 前記メチルドナーがＳ－アデノシルメチオニンである、請求項４４または４５に記載の方法。
  70. 前記１つまたは複数のキャッピング酵素をワクシニアウイルス及び／またはブルータングウイルスから得る、請求項４４または４５に記載の方法。
  71. 前記１つまたは複数のキャッピング酵素がホスファターゼ活性を有する、請求項４４または４５に記載の方法。
  72. 前記１つまたは複数のキャッピング酵素がメチルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項４４または４５に記載の方法。
  73. 前記１つまたは複数のキャッピング酵素がグアニリルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項４４または４５に記載の方法。
  74. 前記ＰＰＫ、任意選択で前記ＮＤＰキナーゼ、任意選択でＮＭＰキナーゼ、任意選択で制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレート、前記ＲＮＡポリメラーゼ、前記ポリＡポリメラーゼ、及び／または前記キャッピング酵素を含む前記第２の反応混合物を１つまたは複数の細胞溶解産物から調製し、その際、前記細胞溶解産物中に存在する場合、不所望な酵素活性を排除する、不活性化する、または部分的に不活性化する、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記不所望な酵素活性を、物理的分離により排除するか、または熱処理により不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記酵素を不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する温度が７０℃～９５℃である、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記酵素を不活性化するか、もしくは部分的に不活性化する温度が５５℃に等しいか、またはそれよりも高い、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記ＲＮＡポリメラーゼに、ヘキサヒスチジン－タグ付けし、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製する、請求項３２または７４に記載の方法。
  79. 前記キャッピング酵素を、クロマトグラフィーを使用して不所望な酵素活性から分離する、請求項７４に記載の方法。
  80. 濾過、抽出、沈殿、またはクロマトグラフィーによる前記ｍＲＮＡの精製をさらに含む、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記ｍＲＮＡを塩化リチウム沈殿によりさらに精製する、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記ｍＲＮＡを高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製する、請求項８０または８１に記載の方法。
  83. 前記ｍＲＮＡを、逆相イオン対高速液体クロマトグラフィーを使用してさらに精製する、請求項３８～４０または請求項８０～８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 請求項４２～８３のいずれか１項に記載の方法により生産されたｍＲＮＡ。
  85. ステップ（ａ）及び（ｂ）以外の手段により生産されたヌクレオチドをステップ（ｃ）の前記反応混合物に添加し、それにより、ステップ（ａ）及び（ｂ）の必要性を排除する、請求項１～４０または４２～８３のいずれか１項に記載の方法。
  86. 前記ヌクレオチドがＮＭＰ、ＮＤＰ、ＮＴＰ、またはそれらの混合物を含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記ヌクレオチドが、非修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの混合物のうちの１つまたは複数からなる、請求項８５に記載の方法。
  88. 修飾ヌクレオチドでの１つまたは複数の非修飾ヌクレオチドの１００％置換を伴うｍＲＮＡを作成するために、前記ヌクレオチドが１つまたは複数の非修飾ＮＭＰ及び１つまたは複数の修飾ＮＴＰからなる、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記ヌクレオチドが、非修飾ＡＭＰ、ＣＭＰ、及びＧＭＰ、ならびにシュードウリジン三リン酸（シュードＵＴＰ）を含む、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記ヌクレオチドが、非修飾ＡＭＰ及びＧＭＰをシュードＵＴＰ及び５－メチルシチジン三リン酸（５－メチルＣＴＰ）と共に含む、請求項８８に記載の方法。
  91. 前記ヌクレオチドが、非修飾ＡＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、及びＧＭＰのうちの１つまたは複数を、シュードＵＴＰ及び／または５－メチルＣＴＰと共に含有する混合物を含む、請求項８７に記載の方法。
  92. 修飾ヌクレオチドを細胞ＲＮＡ由来ヌクレオチドに添加して、部分的に修飾されたｍＲＮＡを達成する、請求項１～９１のいずれか１項に記載の方法。
  93. ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）において、前記ＡＴＰを直接的に添加する、請求項２、４、４３、または４５のいずれか１項に記載の方法。
  94. ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）において、精製ＡＭＰまたはＡＤＰ及びリン酸ドナーをＰＰＫの存在下で添加して、ＡＴＰを生産する、請求項２、４、４３、または４５のいずれか１項に記載の方法。
  95. ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）において、細胞ＲＮＡから得られたＡＭＰまたはＡＤＰ及びリン酸ドナーをＰＰＫの存在下で添加して、ＡＴＰを生産する、請求項２、４、４３、または４５のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記ＧＴＰを直接添加する、請求項３ｄ、４ｅ、４４ｄ、または４５ｅのいずれか１項に記載の方法。
  97. 精製ＧＭＰまたはＧＤＰ及びリン酸ドナーを１つまたは複数のキナーゼの存在下で添加して、ＧＴＰを生産する、請求項３ｄ、４ｅ、４４ｄ、または４５ｅのいずれか１項に記載の方法。
  98. 細胞ＲＮＡから得られたＧＭＰまたはＧＤＰ及びリン酸ドナーを１つまたは複数のキナーゼの存在下で添加して、ＧＴＰを生産する、請求項３ｄ、４ｅ、４４ｄ、または４５ｅのいずれか１項に記載の方法。
  99. ステップ（ｃ）の前記第２の反応混合物が、ＰＰＫ、ＮＤＰキナーゼ、ＮＭＰキナーゼ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレート、及び／または前記ＲＮＡポリメラーゼを産生する細胞から得られた細胞溶解産物を含む、請求項９または５１に記載の方法。
  100. 前記バイオマスが酵母を含む、請求項７または４８に記載の方法。
  101. 請求項８５～１００のいずれか１項に記載の方法により生産されたｍＲＮＡ。
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