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JP2022534866A - 粒子特性評価のための方法及びシステム - Google Patents

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カサス，ザンドール
ボーア，ピーテリャン ヴァンデン
マロビチコ，アントン
ゴンザレス，ミッシェル ペレス
ザーリー，ヘイヘム
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Vrije Universiteit Brussel VUB
Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
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Abstract

粒子特性を導出する方法及びシステムについて説明する。本方法は、液体環境における少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動を、少なくとも１つの瞬間にイメージングすることと、イメージングされた液体環境における自由浮遊粒子の移動に基づいて、少なくとも１つの移動パラメータを、少なくとも１つの瞬間に決定することと、移動パラメータから、少なくとも１つの粒子の特性を導出することと、を含む。

Description

本発明は、粒子の特性評価の分野に関するものである。より詳細には、本発明は、光学ナノモーション検出による生細胞などの粒子の特性評価に関するものである。
世界的な規模で広スペクトルの抗菌薬が幅広くかつ多くの場合に管理されずに使用されているため、耐性株の出現が促進され、グローバルヘルス、食糧安全保障及び開発に対する最大の脅威の１つとなっている。広スペクトルの抗生物質及び抗真菌薬の使用を合理化するための選択肢の１つとして、医療機関に患者が入院した時点で、所定の微生物と闘うのに最も適した薬物を同定する迅速な感度検出を採用することが挙げられる。このような早期診断を行うことで、最も適切な治療を直ちに開始し、耐性を誘発することが記録に残っている広スペクトルの薬物の使用を回避できることが望ましい。標準的な抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）の方法は、抗真菌薬の存在下で２４～４８時間の間に細菌又は真菌の増殖を測定することにある。
数年前、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）に基づいたナノメカニカルセンサにより、化学物質が細菌の生存率に与える影響を数分という時間枠で評価することができた。
この検出は、生物がナノメートルスケールで振動し、これらの振動を、当該生物が付着させられたＡＦＭカンチレバーに伝達するという観察に基づいている。これらの振動は、生物が生きている間は持続するが、任意の化学的又は物理的な手段で細胞の生存率が低下するとすぐに停止する。
これらの振動は、生きている細菌及びそのオルガネラ、例えばミトコンドリア及び核、酵母、植物及び哺乳類の細胞に存在する。抗生物質又は抗真菌薬の感受性試験は、ＡＦＭカンチレバーに微生物を付着させ、異なる抗菌薬の機能としてその振動をモニタリングすることによって行われる。近年、抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）のための他のナノモーション法が開発されている。これらは、細菌のｚ方向の動作のプラズモニックイメージング、付着した細菌のサブミクロンスケールのｘｙ方向の動作の追跡、共振結晶の位相雑音による付着した細菌の振動のセンシング、及び付着した細菌のサブセルラーゆらぎイメージング（Sub-Cellular Fluctuation Imaging）（全反射照明蛍光顕微鏡に基づく）に基づいている。これらのナノモーション法は、従来の細胞培養に基づいた手法では、増殖の遅い生物の場合には数日又は数週間を要するのに対し、数分～数時間の時間枠で完全な抗生物質感受性試験を達成することができる。しかしながら、これらのいずれのも方法にもいくつかの欠点があり、中でも最も困難なのは、対象となる生物を表面上に付着させることである。
発明の概要
本発明の実施形態の目的は、例えば細胞などの粒子を特性評価するための良好な方法及びシステムを提供することである。
粒子の特性評価が、粒子の生存率及び／又は代謝活性に関する情報を提供できることは、本発明の実施形態の利点である。
本発明の実施形態の利点は、方法及びシステムが、例えば生細胞などの様々な粒子に適用可能であることである。特性評価は、いくつかの実施形態では、例えば、バイオテクノロジー用途、臨床微生物学、抗生物質／抗真菌薬感受性試験、細胞の生存率の特性評価、代謝モニタリング、診断及び薬物スクリーニング、並びに基礎研究において使用することができる。
本発明の実施形態の利点は、粒子、例えば細胞の特性評価を、ハイスループットアプローチで行えることである。
本発明の実施形態の利点は、粒子の特性評価のために粒子を標識する必要がないことである。
本発明の実施形態の利点は、粒子、例えば細胞の特性評価を、表面、例えば機械的物体の表面又はより大きな粒子の表面に付着させる必要なく行えることである。
本発明の実施形態の利点は、本システム及び方法が、増殖にも、細胞の複製／分裂の速度にも依存しないため、測定の継続時間を短くできることである。
本発明の実施形態の利点は、粒子の特性評価を比較的単純な測定システムで行えることである。
本発明の実施形態の利点は、粒子の特性評価を、粒子が表面に接続されている必要なく行えることである。後者は、粒子を表面に連結するためのリンカー分子を必要としないことに起因する。これにより、一部の粒子を既知のリンカー分子で連結する際に発生する問題や、一部のリンカー分子が粒子に悪影響を及ぼすという問題を回避することができる。
本発明の実施形態の利点は、細胞の特性評価及び／又は解析を、自動化された方法で、及び／又は、自動的に行えることである。
本発明の実施形態の利点は、本方法及びシステムが、複数の方法、例えば、例えばマイクロウェルプレートなどのマイクロウェル内、又は、液滴マイクロフルイディクス内での粒子の特性評価に適用できることである。
本発明の実施形態の利点は、本方法及びシステムが、複数の粒子の特性評価にも、個々の粒子の特性評価にも適用できることである。
本発明の実施形態の利点は、本方法及びシステムが、複数の粒子、例えば、複数の細胞の特性評価に使用できることである。一実施形態では、本方法及びシステムは、単一細胞の癌細胞スクリーニングを行うために使用することができる。一実施形態では、本方法及びシステムは、例えば、細菌細胞又は酵母細胞、植物細胞及びオルガネラ、例えば、ミトコンドリア及び核に適用することができる。一実施形態では、本方法及びシステムは、例えば、癌細胞などの動物細胞に適用することができる。
本発明の実施形態の利点は、癌細胞又は腫瘍細胞に対する化学療法薬への反応を行えることである。本発明の実施形態の利点は、本方法及びシステムが、例えば、どの薬物が腫瘍内のほとんど又はすべての癌細胞を死滅させることができるかを試験するために、スクリーニングを行うために適用できることである。
本発明の実施形態の利点は、本方法及びシステムが、用量反応曲線を決定するために、及び／又は、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するために、及び／又は、最小殺真菌濃度（ＭＦＣ）を決定するために、及び／又は、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を決定するために適用できることである。
本発明の実施形態の利点は、本方法及びシステムが、植物細胞に及ぼす農薬の耐性又は有効性を決定するために適用できることである。
したがって、本方法は、特定の実施形態では、細菌又は真菌によって引き起こされる特定の感染症を治療するために使用すべき特定の抗生物質／抗真菌薬を決定するために、又は、微生物単離体の抗菌薬耐性プロファイルを決定し、抗菌薬治療の決定を導くために、使用することができる。
本発明の実施形態の利点は、サンプルの輸送時間及び試験のための時間を大幅に短縮することができるので、耐性病原体の診断及び適切で効果的な抗菌薬療法の決定までの時間の遅延を回避できることである。これにより、患者の死亡率の減少、より良好な臨床結果、広域スペクトル抗菌薬の使用量の低下、及びそれに対応して抗菌薬に対する耐性の減少をもたらすことができる。
本発明の実施形態の利点は、迅速な抗菌薬感受性試験を行えること、パーソナライズされた療法（狭域スペクトル抗菌薬投与を使用）を使用できること、及び可能な限り早い治療段階で治療を与えられることである。
本発明の実施形態の利点は、運動性細胞及び非運動性細胞で機能することである。
一態様では、本発明は、粒子特性を導出する方法に関することができ、本方法は、
液体環境における少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動を、少なくとも１つの瞬間にイメージングすることと、
イメージングされた液体環境における自由浮遊粒子の移動に基づいて、少なくとも１つの移動パラメータを、少なくとも１つの瞬間に決定することと、
少なくとも１つの移動パラメータから、少なくとも１つの粒子の特性を導出することと
を含む。
本方法は、単一粒子の単一特性の導出、単一粒子の２つ以上の特性の導出、２つ以上の粒子の単一特性の導出、又は２つ以上の粒子の２つ以上の特性の導出を含められることに留意すべきである。
したがって、前記少なくとも１つの粒子は、複数の粒子を含んでいてもよい。このように、本方法は、１つの粒子の特性だけでなく、粒子群の特性についても洞察を与えることができる。例えば、本方法は、複数の粒子の他の１つ又は複数の粒子の特性と比較して、１つ又は複数の粒子の特性を決定するために使用することができる。例えば、本方法は、細胞集団又は群のどの細胞が薬物に対して耐性を持ち、どの細胞が耐性を持たないかを決定するために使用することができる。
単一特性に関して提供される記述及び説明は、２つ以上の特性の場合にも同様に適用され、その逆もまた同様である。同様に、単一粒子に関する記述は、２つ以上の粒子の場合にも適用され、その逆もまた同様である。
この目的のために、単一粒子の移動が少なくとも１つの瞬間にイメージングされるか、又は、２つ以上、特に複数の粒子の移動が好ましくは少なくとも１つの瞬間にまとめてイメージングされることが考えられる。これに関連して、２つ以上の粒子の個々の特性を同時に導出できることに留意すべきである。すなわち、以下でさらに詳しく説明するように、例えば２つの粒子の１つ又は複数の画像を記録し、その後、前記１つ又は複数の画像を解析することにより、粒子の一方に関連する特性を導出するとともに、他方の粒子に関連する特性を導出することも可能である。
さらに、１つ又は複数の粒子の移動を繰り返しイメージングすることも考えられる。
本方法は、
液体環境における少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動を、少なくとも複数の瞬間にイメージングすることと、
前記複数の瞬間のそれぞれについて、イメージングされた自由浮遊粒子の移動に基づいて移動パラメータを決定することと、
前記異なる移動パラメータから、少なくとも１つの粒子の特性を導出することと
を含んでいてもよい。
１つ又は複数の粒子の移動がイメージングされる少なくとも１つの瞬間は、好ましくは、数ミリ秒～数分の範囲の時間、例えば１ミリ秒～６０分の範囲の時間に対応する。したがって、粒子の移動がイメージングされる少なくとも瞬間は、１秒以上の期間に対応し、より好ましくは５秒以上の期間に対応し、さらにより好ましくは１０秒以上の期間に対応することが考えられる。しかしながら、１２０秒以上の期間などのより長い期間も同様に考えられる。
少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動は、好ましくは、時間の関数としてイメージングされ、時間の関数として移動パラメータが決定される。
したがって、本方法は、少なくとも１つの粒子の移動を時間の関数としてイメージングするステップを含んでいてもよい。その結果、本方法により、時間の関数として少なくとも１つの粒子に関連する特性の決定が可能になる。
本方法は、ｉ）少なくとも２つの瞬間に、少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動をイメージングし、それによって、少なくとも第１のイメージングされた移動と第２のイメージングされた移動とを得ることと、ｉｉ）第１のイメージングされた移動と第２のイメージングされた移動との間の変化を決定することであって、前記変化が移動パラメータを示している、こととを含んでいてもよい。
すなわち、粒子の移動の２つ以上の画像を検出し、前記画像の変化を決定することが好ましく、前記変化が１つ以上の移動パラメータを示している。次いで、前記１つ又は複数の移動パラメータから、粒子の１つ又は複数の特性を導出することができる。言い換えれば、本方法では、２つ以上の画像を記録することで、１つ又は複数の粒子の１つ又は複数の特性を導出することができる。
さらに、２つの連続した画像が、直ちに相次いで記録されるか、又は、互いに時間的に遅れて記録されることが好ましい。連続する２つの画像の記録の間の時間的な遅延は、好ましくは少なくとも１ミリ秒以上、より好ましくは少なくとも１秒以上、さらにより好ましくは少なくとも１分以上、例えば３０分以上、又は少なくとも６０分以上である。
この変化は、好ましくは、自由浮遊粒子の空間変位、及び／又は、自由浮遊粒子の空間変位に関連する速度、及び／又は、自由浮遊粒子の空間変位に関連する加速度、及び／又は、自由浮遊粒子の空間変位の分布、及び／又は、自由浮遊粒子の空間変位に関連する速度の分布、及び／又は、自由浮遊粒子の空間変位に関連する加速度の分布に対応する。
少なくとも１つの粒子は、少なくとも１つの細胞及び／又は少なくとも１つのオルガネラであってもよい。少なくとも１つの粒子は、好ましくは、少なくとも１つの生細胞及び／又は少なくとも１つの生オルガネラである。少なくとも１つの細胞は、原核細胞及び／又は真核細胞であり得る。また、少なくとも１つの細胞は、運動性細胞及び／又は非運動性細胞であり得る。少なくとも１つの細胞は、好ましくは、細菌細胞及び／又は真菌細胞、例えば酵母細胞、及び／又は哺乳類細胞及び／又は昆虫細胞及び／又は植物細胞である。少なくとも１つのオルガネラは、好ましくは、ミトコンドリア及び／又は核若しくは他のサブセルラー構造である。複数の粒子は、細胞群の形態で提供することができる。この目的のために、いくつかの細胞の集合体を、例えば、バイオプシーから採取することができる。
生きた物質は、死んだ物質又は正常な機能が損なわれた物質とは別の挙動を示すが、これは特に物質の変位挙動に現れる。空間変位を導出したり、関連する速度若しくは関連する加速度又は変位若しくは速度若しくは加速度の分布などの更なる特性又は数値を推定したりすることによって、物質の状態に関する情報を得ることができる。例えば、死んだ細胞又は正常な機能が損なわれた細胞の空間変位は、活性細胞の空間変位に比べて小さい。さらに、空間変位の非対称な分布又は空間変位に関連する速度若しくは加速度の非対称な分布は、活性細胞の非ランダムな挙動に起因すると考えることができる。また、非活性又は死んだ細胞は、その空間変位及び／又は速度及び／又は加速度の分布が小さく、むしろ対称的である。
少なくとも１つの粒子の特性は、少なくとも１つの粒子の生存率又は代謝活性又は代謝活性のレベル又は代謝状態又は活力又は感度又は耐性であってもよい。耐性は、好ましくは、抗菌耐性及び／又は抗真菌耐性及び／又は抗癌耐性などの薬物に対する耐性に対応する。
前記移動パラメータから少なくとも１つの粒子の特性を導出することに、粒子の移動量、特に粒子の並進量及び／又は回転量及び／又は変形量が、少なくとも１つの粒子の生存率及び／又は代謝活性及び／又は代謝活性のレベル及び／又は活力及び／又は感度及び／又は耐性に比例することを考慮に入れることが含まれていてもよい。
本方法は、少なくとも１つの粒子の粒子活性及び／又は生存率及び／又は代謝活性及び／又は代謝活性のレベル及び／又は代謝状態及び／又は活力及び／又は感度及び／又は耐性を導出することを含んでいてもよい。本方法は、好ましくは、抗菌耐性及び／又は抗真菌耐性及び／又は抗癌耐性などの薬物に対する少なくとも１つの粒子の耐性を導出することを含む。
したがって、少なくとも１つの移動パラメータを得るために、粒子の２つ以上のイメージングされた移動から、空間変位、空間変位に関連する速度、空間変位に関連する加速度、空間変位の分布、空間変位に関連する速度の分布、及び空間変位に関連する加速度のうちの少なくとも１つを決定し、次いで、粒子の特性のうちの少なくとも１つを前記１つ又は複数の移動パラメータから決定することが好ましい。
この目的のために、空間変位、及び／又は、空間変位に関連する速度、及び／又は、空間変位に関連する加速度、及び／又は、空間変位の分布、及び／又は、空間変位に関連する速度の分布、及び／又は、空間変位に関連する加速度の分布が、少なくとも１つの移動パラメータに対応していることが特に好ましい。
さらに、空間変位、及び／又は、空間変位に関連する速度、及び／又は、空間変位に関連する加速度、及び／又は、空間変位の分布、及び／又は、空間変位に関連する速度の分布、及び／又は、空間変位に関連する加速度の分布が、時間の関数として決定されることが好ましい。
さらに、空間変位は、少なくとも１つの空間方向に関して決定されることが好ましい。特に、空間変位、及びその結果としての速度及び／又は加速度などの関連する数値は、単一の空間方向に関してのみ決定することができる。しかしながら、同様に、２つ以上の空間方向に関して、空間変位、及びその結果としての速度及び／又は加速度などの関連する量を決定することも考えられる。前記２つ以上の空間方向は、好ましくは互いに直角に延びる。
したがって、空間変位は、単一の空間方向に関してのみ決定され、その空間変位から移動パラメータが推定されるか、又は、どの空間変位が移動パラメータに対応しているかが考えられる。前記空間方向は、Ｘ方向と言うことができ、Ｘ方向に関する空間変位は、例えば、Ｘ方向の移動又はＸ方向の変位又はＸ方向の動作と言うことができる。このように、本明細書で言及される移動は、変位及び動作として理解され、その逆もまた同様であることに留意すべきである。
空間変位又は関連する数値は、好ましくは、前記粒子が流れを受ける液体環境に提供される場合、少なくとも１つの粒子の単一の空間方向に関して決定される。実際には、液体環境をある空間方向に沿って流動させ、別の空間方向に関して粒子の空間変位を測定することが好ましい。例えば、液体環境は、Ｘ方向に沿って流動し、粒子の空間変位は、Ｘ方向に垂直に走るＹ方向に関して測定することができる。液体環境は、好ましくは、マイクロ流体デバイスのチャネル内に存在する強制層流又は強制乱流などの強制対流に供される（以下も参照）。
しかしながら、同様に、空間変位は、２つの空間方向に関して決定され、その空間変位から移動パラメータが推定されるか、又は、どの空間変位が移動パラメータに対応しているかが考えられる。前記２つの空間方向は、Ｘ方向及びＹ方向と言うことができ、Ｘ方向及びＹ方向に関する空間変位は、例えば、Ｘ，Ｙ方向の移動、又はＸ，Ｙ方向の変位、又はＸ、Ｙ方向の動作と言うことができる。
同様に、空間変位は、３つの空間方向に関して決定され、その空間変位から移動パラメータが推定されるか、又は、どの空間変位が移動パラメータに対応しているかが考えられる。前記３つの空間方向は、Ｘ方向、Ｙ方向及びＺ方向と言うことができ、Ｘ方向及びＹ方向及びＺ方向に関する空間変位は、例えば、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向の移動、又はＸ，Ｙ，Ｚ方向の動作、又はＸ，Ｙ，Ｚ方向の動作と言うことができる。
Ｘ方向、Ｙ方向及びＺ方向は、直交座標系を基準とすることができ、Ｘ方向及びＹ方向は、水平面、すなわちＸＹ平面に広がると言える。さらに、Ｘ方向及びＹ方向は、Ｚ方向に対して垂直に延びることができる。また、Ｚ方向は、１つ又は複数の粒子のイメージングが行われる方向と同様、垂直方向とも言うことができる。しかしながら、座標基準系を提供するために、任意の他のシステムも同様に使用することができる。例えば、極座標系及び／又は円座標系及び／又は円筒座標系も同様に可能である。
本方法は、少なくとも１つの粒子のＸ方向の移動及び／又はＹ方向の移動及び／又はＺ方向の移動及び／又はＸ，Ｙ方向の移動及び／又はＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動を導出することを含んでいてもよい。
本方法は、１つ又は複数の空間方向のそれぞれに関する少なくとも１つの粒子の空間変位を、ナノメートルからマイクロメートルの範囲、例えば、約１ナノメートルから１０００マイクロメートルの範囲、より好ましくは約１ナノメートルから１００マイクロメートルの範囲で導出することを含んでいてもよい。そのため、この目的のために、本方法は、少なくとも１つの空間方向に関して、少なくとも第１のイメージングされた移動と第２のイメージングされた移動との間の空間変位を、約１ナノメートルから１０００マイクロメートルの範囲、より好ましくは約１ナノメートルから５００マイクロメートルの範囲、特に好ましくは約１００ナノメートルから１００マイクロメートルの範囲でイメージングできることが好ましい。
本方法は、空間変位の量及び／又は関連する数値の量を決定することを含んでいてもよく、前記量から粒子の特性が導出される。
前記量、すなわち、粒子が１つ又は複数の空間方向に関して移動する距離、又は関連する速度若しくは加速度の量から、粒子の状態に関する情報を導出することができる（上記も参照）。追加的又は代替的に、本方法は、空間変位の量を一定期間内に決定することをさらに含んでいてもよい。言い換えれば、１つ又は複数の空間方向に関して、一定期間内に粒子が移動する１つ又は複数の距離、好ましくは総距離を決定することが好ましい。次いで、粒子の状態に関する情報を前記距離から導出することができる。
空間変位は、前記空間変位に関連する１つ又は複数の周波数を得るために、空間周波数変換することができ、前記１つ又は複数の周波数から粒子の特性を導出することができる。
特に、第１のステップで時間の関数として粒子の空間変位を決定し、次いで前記空間変位を周波数領域に変換することが好ましい。例えば、生細胞は、死んだ細胞とは別の周波数領域で振動することが分かっている。そのため、空間変位に関連する周波数を決定することで、調査対象の粒子の状態を決定することも可能になる。
このように、以上のことから、本方法は、空間変位の速度の計算及び／又は空間変位の分布の決定及び／又は周波数領域解析の実行を含んでいてもよいと言える。
これに関連して、本方法はさらに、時間の関数として粒子の移動を周波数領域に変換するために、変換アルゴリズムの使用を含むことが好ましく、それによって、粒子のイメージングされた移動に関連する１つ又は複数の振動周波数が得られる。前記変換アルゴリズムは、好ましくは、フーリエ変換など、空間から周波数領域への変換を行う。
前記移動は振動であってもよく、前記移動パラメータは振動による移動パラメータである。
空間変位の分布は、好ましくは、いわゆるバイオリン図及び／又は箱ひげ図の生成など、従来の統計解析によって決定される。周波数領域解析も同様に、好ましくは、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）又はウェーブレットなどの既知の方法によって行われる。したがって、この方法は、好ましくは、これらの解析及び計算などの１つ以上を実行することができる１つ以上の対応するアルゴリズムを使用することを含む。
空間変位は、好ましくは、自由浮遊粒子の並進及び／又は自由浮遊粒子の回転及び／又は自由浮遊粒子の変形に対応する。回転は、１つ又は複数の空間方向に対して粒子が示す角度変位と言うことができる。角度変位は、好ましくは円筒座標で示される。
粒子の変形は、粒子の形状の変化として理解することができる。形状の変化は、例えば、細胞内の浸透圧の変化、細胞内の細胞骨格の再編成、細胞質空間の容積の変化、核の容積の変化によって引き起こされうる。このように、形状又は変形の変化を解析することで、細胞の状態に関する情報を得ることができる。
少なくとも１つの粒子の全体の移動を決定してもよい。この目的のために、自由浮遊粒子全体の空間変位が決定されることが考えられる。自由浮遊粒子全体の空間変位は、好ましくは、粒子の質量中心の空間変位から決定される。
しかしながら、自由浮遊粒子の少なくとも１つの部分の空間変位が決定されることも同様に考えられる。自由浮遊粒子の少なくとも１つの部分の空間変位は、好ましくは、粒子の形状の変更から決定される。言い換えれば、粒子の一部の空間変位は、好ましくは、粒子の静止した質量中心に対して導出される。粒子の一部の空間変位は、例えば、細胞内の浸透圧の変化、細胞骨格の再編成、及び／又は、細胞オルガネラの変位によって引き起こされる、細胞の形状の変形でありうる。
本方法は、粒子又は粒子の一部を含む領域を用いて、少なくとも１つの粒子を検出することを含んでいてもよい。
この解析は、粒子全体の移動を決定すること、粒子壁の変位を決定すること、及びオルガネラの変位を決定することのいずれか又はそれらの組み合わせを含んでいてもよい。
空間変位は、相互相関アルゴリズムを用いて決定することができる。考えられる相互相関アルゴリズムは、当該技術分野で周知である。この目的のために、検出された変位又は動作又は移動をサブピクセルの解像度で比較することが好ましい。特に、１つ以上の空間方向に関する変化がサブピクセルの解像度で検出され、周波数領域及び／又は時間領域での解析のために前記データセットが使用される。
本方法は、ナノモーションの解析に基づいて相互相関を行うことを含んでいてもよい。
ここで、「ナノモーション」という表現は、調査対象の粒子が示す動作、すなわち移動又は変位を意味する。粒子の種類によっては、前記動作はナノメートルの範囲であることもある。
本方法は、少なくとも１つの瞬間の少なくとも１つの粒子の移動を描写する１つ以上の画像を相互相関させることを含んでいてもよい。特に、少なくとも１つの粒子の連続した画像を相互に相関させることが好ましい。
このように、本方法は、相互相関アルゴリズムを使用することを含んでいてもよい。
相互相関アルゴリズムにより、少なくとも１つの粒子の移動を定量化することが可能になり、特に、Ｘ方向及び／又はＹ方向及び／又はＺ方向などの１つ又は複数の空間方向に関する移動を定量化することが可能になる。Ｘ方向に関する定量化は、Ｘ方向に関する調査対象の粒子の移動に関連する数値などとして理解される。この目的のために、相互相関アルゴリズムは、好ましくは、各画像すなわちフレームの空間方向に関する移動に関連する数値を計算するように構成されている。
粒子の移動の変化を定量化することで、粒子の生存率又は粒子の代謝活性のレベル、代謝状態、例えば休眠状態、静止細胞、異なる化学物質に対する感度又は耐性など、粒子の特性の変化を決定することができる。
本方法は、バイオリン図及び／又は箱ひげ図などの１つ又は複数の統計解析を行うことをさらに含んでいてもよい。例えば、粒子のイメージングされた移動、特にフレームごとのイメージングされた移動をバイオリン図及び／又は箱ひげ図としてプロットすることが考えられる（以下も参照）。
移動パラメータは、単一粒子のイメージングされた移動から決定することができる。当然のことながら、２つ以上の粒子のイメージングされた移動から２つ以上の移動パラメータを決定することができ、各移動パラメータは特定の粒子に関連付けられる。しかしながら、同様に、２つ以上の、好ましくは複数の粒子のイメージングされた移動から移動パラメータが決定され、空間変位及び／又は関連する速度又は空間変位若しくは速度の分布に関連する代表値又は平均値が使用されることも考えられる。この後者のケースは、好ましくは、複数の粒子、例えば細胞集団を調査する場合に適用される。
本方法は、移動パラメータの決定のために１つ又は複数の粒子を選択することをさらに含んでいてもよく、前記選択は、手動選択及び／又は自動選択に対応する。例えば、１つ又は複数の粒子を手動で選択する場合、ユーザは、Ｘ方向に関する変位を追跡するために、Ｘ方向などの１つの空間方向に関する変位に使用される粒子の少なくとも一部に四角いボックス又は円などの任意の選択マークを描き、Ｙ方向などの第２の空間方向に関する変位に使用される粒子の少なくとも一部に第２の四角いボックスを描くことができる。自動選択は、好ましくは、１つ又は複数のモルフォロジー演算子及び／又はハフ変換及び／又はニューロンネットワーク及び／又はディープラーニング技術を適用して行われる。
したがって、特に１つ又は複数の単一粒子を個別に調査する場合は、画像から前記１つ又は複数の単一粒子を選択することが好ましい。前述のように、前記選択は手動で行ったり、当該技術分野で周知の１つ以上のアルゴリズムを用いて行ったりすることもできる。
そのため、以上のことから、本方法は、１つ又は複数の粒子を選択するために、及び／又は、空間変位などの運動パラメータを決定するために、及び／又は、少なくとも１つの粒子の空間変位などの運動パラメータを定量化するために、少なくとも１つのアルゴリズムを使用することを含んでいてもよいと言える。
この方法は、ニューラルネットワークを使用することを含んでいてもよい。前記ニューラルネットワークは、細胞などの粒子の変位やナノモーションが検出される前に、それらの粒子の選択に適用することができる。前記ニューラルネットワークは、シミュレートされた粒子の複数の合成画像を生成し、前記合成画像を粒子検出モデルに提供して、モデルをトレーニングし、モデルを更新し、モデルを評価し、モデルを改善して、トレーニングされたモデルを得るように働く。
本方法は、トレーニングされたモデルを用いて少なくとも１つの粒子を検出することを含んでいてもよい。
本方法は、トレーニングされたモデルを用いて少なくとも１つの粒子の検出を精密化することを含んでいてもよい。
本方法は、ディープラーニング技術を使用することを含んでいてもよい。ディープラーニング技術は、好ましくは、個々の粒子を検出し、個々の粒子の動作を追跡するように働くアルゴリズムに対応する。
しかしながら、当該技術分野で使用される異なる画像認識アルゴリズムも同様に使用することができる。
少なくとも１つの自由浮遊粒子は、静止した液体環境及び／又は流動する液体環境に提供することができる。流動する液体環境は、流れの方向に沿って流動する液体などの、移動する液体環境として理解することができる。この目的のために、液体環境は、それが流動する液体環境になるように、流れ、特に好ましくは強制対流に供されることが好ましい。したがって、液体環境が人工的な流れに供されることが考えられる。
少なくとも１つの自由浮遊粒子は、物体の表面又はより大きな粒子の表面に結合していない粒子であってもよい。代わりに、自由浮遊粒子は、好ましくは、液体環境に分散している粒子である。液体環境は、チャンバ又はリザーバ又はチャネルなどの制限要素、好ましくはマイクロ流体デバイスのチャネルに提供することができる。言い換えれば、マイクロ解析チャンバやマクロ解析チャンバなどの解析チャンバ内への粒子堆積、又はペトリ皿への粒子堆積、又はマイクロ流体チャネルへの粒子堆積が考えられる。したがって、制限要素は、粒子が添加された液体を含むか、又は包含する物理的構造として理解される。制限要素は、好ましくは未処理である。未処理の制限要素は、制限要素への粒子の付着又は繋留に関して変更されていない制限要素として理解される。その結果、粒子は制限要素に付着又は繋留しないが、自由に浮遊している。
しかしながら、同様に、液体環境が無制限に提供されることも考えられる。例えば、以下でさらに説明するように、粒子が添加された液体を、粒子の移動をイメージングするために使用される光学センサに直接配置することができる。例えば、マイクロ液滴又はマクロ液滴を光学センサ上に配置することで、液体環境を提供することができる。また、この場合、粒子は任意の表面などに繋留又は付着されておらず、自由に浮遊している。
液体環境は、粒子の移動が対流によって妨害されない拡散環境であってもよい。言い換えれば、粒子の移動は、好ましくは対流のない状態でイメージングされる。液体は、好ましくは生体適合性及び／又は水性の人工流体又は自然流体などの任意の種類の液体に対応することができ、例えば、細胞などの粒子が生存でき、物理化学的な薬剤に曝露されたときの粒子の代謝又は生存を試験することができる生物学的な流体が挙げられる（以下も参照）。自然流体の例は、尿、脳脊髄液、喀痰、又は血液である。追加的又は代替的に、液体環境を、好ましくは強制対流に供することができる。
少なくとも１つの自由浮遊粒子は、１つ又は複数の化学的刺激及び／又は１つ又は複数の物理的刺激に供することができ、前記１つ又は複数の化学的刺激及び／又は物理的刺激の作用前及び／又は作用中及び／又は作用後に、少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動がイメージングされる。
化学的刺激は、例えば、化学物質、薬物若しくは薬剤の添加、又は生体分子にさらすことに対応しうる。物理的刺激は、粒子を含む液体環境の温度の変化、光、例えばＵＶ光の照射、液体環境の圧力の印加又は変化などに対応しうる。
したがって、本方法は、１つ又は複数の化合物を液体環境に添加することを含んでいてもよく、１つ又は複数の化合物が少なくとも１つの自由浮遊粒子に与える影響が、移動パラメータから導出される。
１つ又は複数の化合物は、液体環境と本質的に非混和性でありうる。追加的又は代替的に、１つ又は複数の化合物は、１つ又は複数の更なる化合物に提供することができ、１つ又は複数の更なる化合物は、好ましくは、液体環境と本質的に非混和性である。
例えば、油などの液体環境を構成する液体と非混和性である１つ又は複数の第１の化合物の液滴などを第１のステップで液体に添加し、次いで、抗生物質又は抗真菌薬などの１つ又は複数の第２の化合物を液滴に添加することが考えられる。その後、粒子を液滴と相互作用又は連通させ、液滴に含まれる第２の化合物が粒子に与える影響を調査することができる。この目的のために、液滴を構成する化合物は、互いに同じであっても異なっていてもよいことに留意すべきである。同様に、液滴に添加される化合物は、互いに同じであっても異なっていてもよい。また、同じ種類の化合物を、濃度を変えて液滴に加えることも考えられる。同様に、異なる液滴に異なる物理的刺激を適用するなどの更なる変更も考えられる。
したがって、本方法は、化学的刺激及び／又は物理的刺激に反応する少なくとも１つの粒子の調査を含んでいてもよい。特に、本方法は、抗生物質感受性試験及び／又は抗真菌薬感受性試験及び／又は細胞生存率の特性評価及び／又は代謝モニタリング及び／又は診断及び／又は薬物スクリーニングを行うステップを含んでいてもよい。
前記調査の結果は、物理的及び／又は化学的な曝露の前及び／又は間及び／又は後に、並びに１つ又は複数の単一粒子及び／又は複数の粒子について示すことができる。
少なくとも１つの浮遊粒子の移動は、好ましくは少なくとも１つの光学センサでイメージングされ、光学センサは、好ましくはＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラである。
したがって、本方法は、好ましくは、カメラなどの少なくとも１つの光学センサの提供を含むことが好ましい。前記光学センサは、１つ又は複数の画像を検出するように構成されている。
前記少なくとも１つの光学センサは、好ましくは、前記少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動を、１マイクロ秒以上、好ましくは１秒以上、より好ましくは１０秒以上、特に好ましくは５０秒以上のフレームレートでイメージングする。追加的又は代替的に、少なくとも１つの光学センサは、少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動をサブピクセルの解像度でイメージングする。
光学センサのフレームレートは、好ましくは、調査対象の粒子の振動よりも高い。前記フレームレートは、好ましくは少なくとも２ヘルツであり、より好ましくは少なくとも４ヘルツであり、特に好ましくは少なくとも６ヘルツである。しかしながら、より高いフレームレートも同様に考えられることに留意すべきである。例えば、少なくとも１００ヘルツ、又は少なくとも５００ヘルツ、又は少なくとも１０００ヘルツのフレームレートも可能である。
本方法は、複数の瞬間において、所定の期間にわたって映像を記録することにより、少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動をイメージングすることを含んでいてもよい。
少なくとも１つの光学センサは、少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動をイメージングする間、静止していてもよい。マイクロ流体デバイスの流体チャネルに沿って流動する粒子のように、粒子の空間変位を１つの空間方向で調査する場合は、静止した光学センサが好ましい。或いは、少なくとも１つの光学センサは、少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動をイメージングする間に移動させることもできる。
少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動は、顕微鏡などの少なくとも１つの拡大装置によって拡大しながらイメージングすることができる。
そのため、本方法は、少なくとも１つの粒子の移動を拡大することをさらに含んでいてもよい。このように、本方法はさらに、拡大装置、例えば顕微鏡の提供を含むことが好ましい。
したがって、粒子の移動は、ＣＣＤチップ若しくはＣＭＯＳチップなどの光学センサを用いたビデオ録画若しくはオンラインでの動作解析、又は顕微鏡などの拡大装置と光学センサとの組み合わせによってモニタリングすることができる。顕微鏡は、例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、又は超解像顕微鏡でありうる。３つの空間方向に関する空間変位を決定する必要がある場合、共焦点顕微鏡を使用することが好ましい。
本方法は、異なる画像を登録することを含んでいてもよい。
前記イメージングは、少なくとも１つの粒子の移動を光学的に記録することを含んでいてもよい。
前記イメージングは、光学系及びカメラを用いて光学的に記録することを含んでいてもよい。
前記イメージングは、所定の期間にわたって前記粒子の動画を記録することを含んでいてもよい。
さらに、移動パラメータは、粒子の移動がイメージングされている間及び／又は粒子の移動がイメージングされた後に決定することができる。追加的又は代替的に、粒子の特性は、粒子の移動がイメージングされている間及び／又は粒子の移動がイメージングされた後に、移動パラメータから導出することができる。言い換えれば、本方法により、画像が記録されている間及び／又は画像が記録された後に、イメージングされた移動データのデータ処理が可能になりうる。
さらに、本方法は、ｉ）解析用緩衝液及び／又は増殖培地中に粒子の懸濁液を調製するなどの粒子調製を行うステップ、ｉｉ）前記懸濁液の希釈及び／又は濃縮、例えば細胞数を増やすための増殖培地中でのインキュベーションを行うステップ、ｉｉｉ）蛍光標識を行うステップ、及びｉｖ）粒子堆積の前又は後に物理的及び／又は化学的刺激に曝露するステップを含んでいてもよい。これらのステップのうち１つ又は複数のステップのみを適用できることに留意すべきである。言い換えれば、これらのステップのうちの１つ又は複数は省略されることが考えられる。例えば、粒子の蛍光標識を行わないことも考えられる。蛍光標識は、粒子の検出を容易にするが、必須のステップではない。
一態様では、本発明は、プログラムがコンピュータシステムによって実行されると、コンピュータシステムに上述のような方法を実行させる命令を含むコンピュータプログラム製品に関するものである。
別の態様では、本発明はまた、コンピュータシステムによって実行されると、コンピュータシステムに上述のような方法を実行させる命令を含むコンピュータ可読媒体に関するものである。
一態様では、本発明は、粒子特性を導出するためのプロセッサに関し、当該プロセッサは、
液体環境における少なくとも１つの自由浮遊粒子の、少なくとも１つの瞬間にイメージングされた移動を得るための入力手段と、
液体環境における自由浮遊粒子のイメージングされた移動に基づいて、少なくとも１つの瞬間に少なくとも１つの移動パラメータを決定し、少なくとも１つの移動パラメータから、少なくとも１つの粒子の少なくとも１つの特性を導出するためのプロセッサと
を含む。
プロセッサは、上述のような方法を実行するように構成されていてもよい。
一態様では、本発明はまた、粒子特性を導出するためのシステムに関するものであり、当該のシステムは、
液体環境における少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動を少なくとも１つの瞬間にイメージングするための、少なくとも１つの光学センサ、好ましくはカメラを含む光学系と、
上述のようなプロセッサと
を含む。
上で既に説明したように、光学センサは、好ましくはＣＣＤチップ又はＣＭＯＳチップである。本システムは、顕微鏡などの拡大装置をさらに含んでいてもよい。顕微鏡は、例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、又は超解像顕微鏡でありうる。
更なる態様では、本発明は、抗生物質感受性試験のための上述のようなシステムの使用に関するものである。
更なる態様では、本発明は、抗真菌薬感受性試験のための上述のようなシステムの使用に関するものである。
この目的のために、試験されるべき粒子を基板に堆積させることが好ましい。例えば、試験されるべき粒子を含む生物学的流体は、リザーバ、ウェル又はマイクロウェルに配置されうる。その後、粒子の移動は、時間の関数としてイメージングされる。その後、粒子は、薬物又は物理的若しくは化学的な薬剤／刺激に曝露される。その後、前述の刺激に曝露されたときの粒子の移動の変化が記録され、このようにして得られたデータが上述のように処理される。
以下に非限定的な一例を示す：
顕微鏡の倍率４００倍で撮影した１２秒間の動画（１０００フレーム）を記録することで、細胞のＸ，Ｙ方向の変位をモニタリングする。これらの動画を定期的に記録することで、細胞の時間的な挙動が、異なる濃度の抗真菌薬の関数として特徴付けられる。単一細胞の細胞変位を追跡するために、相互相関画像登録アルゴリズムが使用される。各フレームにおける細胞変位、追跡された細胞の軌跡とともに、総変位の二乗平均平方根も計算される。単一細胞の変位、すなわちナノモーションが、フレームごとの変位の分布をバイオリン図としてプロットすることで特徴付けられる。２０個の細胞のセットの動作は、フレームごとのグループ化された細胞変位をバイオリン図としてプロットし、１０００フレームにわたる２０個の細胞の総変位を箱ひげ図としてプロットすることによって特徴付けられる。
更なる態様では、本発明は、細胞の生存率の特性評価のための、及び／又は、代謝モニタリングのための、上述のようなシステムの使用に関するものである。
すなわち、既に述べたように、本発明による方法は、細胞などの粒子の空間変位及び／又は前記空間変位に関連する振動を決定することができ、前記空間変位又は振動は、細胞の状態を示している。実際、細胞の生存率が低下すると、振動又は空間変位の変化が測定される。同様の知見は、細胞などの粒子の代謝又は代謝状態又は活力などの特性評価に適用される。
更なる態様では、本発明は、診断及び／又は薬物スクリーニング及び／又は抗有糸分裂性薬剤感受性試験のための上述のようなシステムの使用に関するものである。
診断の場合は、上述のような方法を用いて、特定の抗真菌薬に対して耐性のある菌株を見つけること及び／又は特定の抗真菌薬に対して持続性のある菌株を見つけることが好ましい。薬物スクリーニングの場合は、上述のような方法を用いて、空間変位又は前記空間変位に関連する振動を低減する化合物を見つけることが好ましい。このようにして、効果的な静真菌性若しくは殺真菌性の化合物又は静菌性若しくは殺菌性の化合物を効率的に見つけることができる。
本明細書で方法に関して提供されるあらゆる記述及び説明は、同様に、コンピュータプログラム製品、コンピュータ可読媒体、プロセッサ、システム、前記システムの使用にも適用されことに留意すべきであり、その逆もまた同様である。本発明の具体的かつ好ましい態様は、添付の独立請求項及び従属請求項に記載されている。従属請求項の特徴は、独立請求項の特徴及び他の従属請求項の特徴と適宜組み合わせることができ、単に請求項に明示的に記載されているだけではない。
本発明のこれらの態様及び他の態様は、以下に説明する実施形態を参照することで明らかになり、説明されるであろう。
以下、本発明の好ましい実施形態を、図面を参照して説明するが、当該図面は、本発明の好ましい実施形態を説明するためのものであり、これを限定するためのものではない。
本発明の実施形態で用いることができる、相互相関光学ナノモーション検出法の概要を示し、細胞を増殖培地に入れた期間と、それに続けて抗真菌処理を行った期間とを示す図である。 異なる時点で１０００フレーム（８３フレーム／秒）の動画を記録したことを示す図である。 ボックス内の細胞の移動を検出し、分析したことを示す図である。 相互相関アルゴリズムを用いて、個々の細胞のｘｙ方向の変位を計算したことを示す図である。 サンプリングポイントごとに、２０個の細胞の総変位の平均値を計算したことを示す図である。 エタノール及び抗真菌薬が酵母細胞の光学ナノモーション検出（ＯＮＭＤ）に与える影響、特にエタノール（７０％ｖ／ｖ）及びカスポファンギン（１００μｇ／ｍｌ）が１２秒間（１０００フレーム、８３ｆｐｓ）の間にC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４、C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）ＤＳＹ５６２のｘｙ方向の変位に与える影響を示す図であり、円内のドットは、抗真菌薬であるカスポファンギン又はエタノールで処理した後の細胞の位置を表している。 エタノール及び抗真菌薬が酵母細胞の光学ナノモーション検出（ＯＮＭＤ）に与える影響、特にエタノール（７０％ｖ／ｖ）及びカスポファンギン（１００μｇ／ｍｌ）が１２秒間（１０００フレーム、８３ｆｐｓ）の間にC. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）ＤＳＹ４６０６及びS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２細胞のｘｙ方向の変位に与える影響を示す図であり、円内のドットは、抗真菌薬であるカスポファンギン又はエタノールで処理した後の細胞の位置を表している。 エタノール及び抗真菌薬が酵母細胞の光学ナノモーション検出（ＯＮＭＤ）に与える影響、特にエタノール（７０％ｖ／ｖ）が１２秒間の測定中にC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４、C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）ＤＳＹ５６２、C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）ＤＳＹ４６０６、及びS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２の総変位に与える影響を時間の関数として示す図であり（備考：エタノール溶液を同じウェルに上部で添加し、混合を拡散によってのみ行ったことで、生存率への影響が観察される時間が長くなる）、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定：＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 エタノール及び抗真菌薬が酵母細胞の光学ナノモーション検出（ＯＮＭＤ）に与える影響、特にアムホテリシンＢ（１００μｇ／ｍｌ）、カスポファンギン（１００μｇ／ｍｌ）及びフルコナゾール（４００μｇ／ｍｌ）がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４に与える影響を示す図であり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 エタノール及び抗真菌薬が酵母細胞の光学ナノモーション検出（ＯＮＭＤ）に与える影響、特にカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）がカンジン耐性のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ４６１４臨床株に与える影響を示す図であり、「対照」は、ＹＰＤ増殖培地中で増殖した未処理の細胞を表しており、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定：＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 エタノール及び抗真菌薬が酵母細胞の光学ナノモーション検出（ＯＮＭＤ）に与える影響、特にカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）が超感受性（排出系の変異体）C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４株に与える影響を示す図であり、「対照」は、ＹＰＤ増殖培地中で増殖した未処理の細胞を表しており、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定：＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 エタノール及び抗真菌薬が酵母細胞の光学ナノモーション検出（ＯＮＭＤ）に与える影響、特にC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に対する１時間処理後のアムホテリシンＢ用量反応曲線の影響を示す図であり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定：＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 エタノール及び抗真菌薬が酵母細胞の光学ナノモーション検出（ＯＮＭＤ）に与える影響、特にC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に対する２時間処理後のアムホテリシンＢ用量反応曲線の影響を示す図であり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 エタノール及び抗真菌薬が酵母細胞の光学ナノモーション検出（ＯＮＭＤ）に与える影響、特にC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４に対するアムホテリシンＢ用量反応曲線の影響を示す図であり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 温度及び栄養環境が酵母細胞の光学ナノモーションに与える影響、特に温度がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４、C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）ＤＳＹ４６０６、S. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２の全変位に与える影響を示す図であり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 温度及び栄養環境が酵母細胞の光学ナノモーションに与える影響、特に温度が全変位に与える影響を示す図であり、自動検出法で得られた結果であり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 温度及び栄養環境が酵母細胞の光学ナノモーションに与える影響、特にＰＢＳ又はＹＰＤ増殖培地中に存在するS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２の総変位の時間発展を示す図であり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 温度及び栄養環境が酵母細胞の光学ナノモーションに与える影響を、特にディープラーニングによる細胞検出法で示す図であり、異なる動画を処理した際に、高い信頼度で自動的に検出された細胞を矢印で示し、いくつかの細胞は見逃されているが、ほとんどの細胞は高い信頼度で適切に検出されており、白矢印で示された細胞は信頼度の高い細胞を示し、黒矢印で示された細胞は信頼度が閾値内である細胞を示し、検出されたアーチファクトは周りを四角で囲まずに括弧内に低い値で示している。 カンジダの結果を補足したものを示す図であり、特にカスポファンギンがC. glabrata（カンジダ・グラブラータ）ＤＳＹ５６２に与える影響を示し、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 カンジダの結果を補足したものを示す図であり、特にカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）がC. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）ＤＳＹ４６０６の臨床野生型及び耐性株ＤＳＹ４５９０に与える影響を示し、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 S. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）の結果、特にカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）がS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２に与える影響を示す図であり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 S. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）の結果、特にフルコナゾール（４００μｇ／ｍｌ）がS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２に与える影響を示す図であり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 カンジダの結果をさらに補足したものを示す図であり、特にカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）を用いてC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４（超感受性）を処理し、異なる表面処理（コンカナバリンＡ、未処理のガラス、及びＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧ）を比較したものであり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 カンジダの結果をさらに補足したものを示す図であり、特にカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）を用いてC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４（野生型）を処理し、異なる表面処理（コンカナバリンＡ、未処理のガラス、及びＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧ）を比較したものであり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 カンジダの結果をさらに補足したものを示す図であり、特にカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）を用いてＤＳＹ４６１４（カスポファンギン耐性）を処理し、異なる表面処理（コンカナバリンＡ、未処理のガラス、及びＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧ）を比較したものであり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 カンジダの結果をさらに補足したものを示す図であり、特にエタノール（７０％ｖ／ｖ）を用いてC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４、C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）ＤＳＹ５６２、C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）ＤＳＹ４６０６及びS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２を処理し、より長い動画を低フレームレート（１２００フレーム、１０．５フレーム／秒）で解析したものであり、箱ひげ図は１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の１．５×ＩＱＲ内にある；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．１、ｎｓ：非有意。 細胞移動の周波数範囲及び臨界周波数の決定、特に、１つのC. albicans（カンジダ・アルビカンス）細胞移動を水平方向及び垂直方向に光学的に記録した２つの信号から得られた典型的なＦＦＴスペクトルとともに、それらの平均値も示す図である（挿入図：同じく４０ＨｚまでのＦＴＴスペクトル）。 細胞移動の周波数範囲及び臨界周波数の決定、特にＰＢＳ中の１つの典型的なS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２細胞の３時間後のＤＲＩＭ法による臨界周波数の決定を示す図である（ｆｃｒｉｔ（臨界周波数）＝２．５４Ｈｚ）。 細胞移動の周波数範囲及び臨界周波数の決定、特に未処理のカスポファンギン耐性ＤＳＹ４６１４、感受性（ＤＳＹ１０２４）及び野生型（ＤＳＹ２９４ C. albicans（カンジダ・アルビカンス））のｆｃｒｉｔのヒストグラムを示す図である。 細胞移動の周波数範囲及び臨界周波数の決定、特にカスポファンギンで処理した耐性、超感受性及び野生型のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）のｆｃｒｉｔのヒストグラムを示す図であり、結果は１～５時間の処理からプールしている。 細胞の手動による選択を用いた、本発明の実施形態による粒子を特性評価する方法の例示的なアルゴリズムを示す図である。 細胞のディープラーニングによる選択を用いた、本発明の実施形態による粒子を特性評価する方法の例示的なアルゴリズムを示す図である。 本発明の実施形態で使用することができる、検出のトレーニングのための例示的なアルゴリズムを示す図である。 本発明の実施形態で使用することができる、検出のトレーニングのための例示的なアルゴリズムを示す図である。 ４つのIbidi社製マイクロウェルを用いて、抗真菌薬がナノモーション（１２秒間の測定中の平均変位）に与える影響を時間の関数として示す図である（備考：抗真菌薬を同じウェルに上部で添加し、混合を拡散によってのみ行ったことで、生存率への影響が観察される時間が長くなる。（１）カスポファンギンがC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４臨床株に与える影響、（２）アムホテリシンＢがC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４に与える影響、（３）フルコナゾールがC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４に与える影響、（４）フルコナゾールがS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４１に与える影響。エラーバーは、１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の変位からの標準偏差を表している；スチューデントの対応ありｔ検定；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１）。 温度がS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４１、臨床株C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４及びC. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）ＤＳＹ４６０６の平均変位に与える影響。温度を段階的に上昇させた後、温度が安定してから１５分後に、１条件につき２０個の単一細胞の移動を約１２秒間記録し、解析した。 カンジダ・アルビカンス：野生型、感受性株及び耐性株；並びにS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２の移動を示す図であり、５時間培養時のカスポファンギンの効果を示し、ＹＰＤ培地中のカスポファンギン濃度は１０μｇ／ｌである。 細胞を増殖培地に入れた期間と、それに続けて抗真菌処理を行った期間とを示す図である。 異なる時点で１０００フレームの動画を記録したことを示す図である。 相互相関アルゴリズムを用いて、個々の細胞（典型的には２０個の細胞）のＸ，Ｙ方向の変位を計算したことを示す図である。 各細胞について、フレームごとの変位を計算し、この分布をバイオリン図と箱ひげ図とを組み合わせて表した図である。 ある条件／サンプリングポイントにおける全細胞のフレームごとの変位を、バイオリン図と箱ひげ図とを組み合わせて表した図である。 各条件／サンプリングポイントについて、２０個の細胞の総変位の平均値を計算し、箱ひげ図で表した図である。 ＹＰＤ増殖培地中で増殖する２０個のS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２細胞の２時間後のフレームごとの変位の分布（上パネル）と、２０個の細胞の変位をマージした分布の時間発展（下パネル）とを示す図である。 ＰＢＳ中に存在する２０個のS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２細胞の２時間後のフレームごとの変位の分布（上パネル）と、２０個の細胞の変位をマージした分布の時間発展（下パネル）とを示す図である。 増殖培地中のグループ化された変位の時間発展を示す図であり、温度がS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２及びC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４の変位分布（２０個の細胞）に与える影響を示している。 温度がS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２及びC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４の総変位に与える影響を示す図である（ウィルコクソンの検定：＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎｓ：非有意）。 エタノールの存在下での酵母細胞の細胞ナノモーションを観察することによる生死の境目、特にC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４の０分（上パネル）、１０分（中パネル）及び６０分（下パネル）における２０個の細胞の変位の分布を示す図である。 エタノールの存在下での酵母細胞の細胞ナノモーションを観察することによる生死の境目、特にC. glabrata（カンジダ・グラブラータ）ＤＳＹ５６２の０分（上パネル）、１０分（中パネル）及び６０分（下パネル）における２０個の細胞の変位の分布を示す図である。 エタノールの存在下での酵母細胞の細胞ナノモーションを観察することによる生死の境目、特にC. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）ＤＳＹ４６０６の０分（上パネル）、１０分（中パネル）及び６０分（下パネル）における２０個の細胞の変位の分布を示す図である。 エタノールの存在下での酵母細胞の細胞ナノモーションを観察することによる生死の境目、特にS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２の０分（上パネル）、１０分（中パネル）及び６０分（下パネル）における２０個の細胞の変位の分布を示す図である。 エタノールの存在下での酵母細胞の細胞ナノモーションを観察することによる生死の境目、特に２０個の細胞のフレームごとの変位の時間発展（上パネル）と、１２秒間の測定中の総変位を時間の関数として表した対応するグラフ（下パネル）とを示す図である（ウィルコクソンの検定：＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．１；ｎｓ：C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４については非有意）。 エタノールの存在下での酵母細胞の細胞ナノモーションを観察することによる生死の境目、特に２０個の細胞のフレームごとの変位の時間発展（上パネル）と、１２秒間の測定中の総変位を時間の関数として表した対応するグラフ（下パネル）とを示す図である（ウィルコクソンの検定：＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．１；ｎｓ：C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）ＤＳＹ５６２については非有意）。 エタノールの存在下での酵母細胞の細胞ナノモーションを観察することによる生死の境目、特に２０個の細胞のフレームごとの変位の時間発展（上パネル）と、１２秒間の測定中の総変位を時間の関数として表した対応するグラフ（下パネル）とを示す図である（ウィルコクソンの検定：＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．１；ｎｓ：C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）ＤＳＹ４６０６については非有意）。 エタノールの存在下での酵母細胞の細胞ナノモーションを観察することによる生死の境目、特に２０個の細胞のフレームごとの変位の時間発展（上パネル）と、１２秒間の測定中の総変位を時間の関数として表した対応するグラフ（下パネル）とを示す図である（ウィルコクソンの検定：＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．１；ｎｓ：S. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２については非有意）。 抗真菌薬アムホテリシンＢ（５００μｇ／ｍｌ）がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４の細胞ナノモーションに与える効果、特に２０個の細胞の変位分布の時間発展（上パネル）と、１２秒間の総変位の対応するグラフ（下パネル）とを示す図である。 抗真菌薬カスポファンギン（１００μｇ／ｍｌ）がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４の細胞ナノモーションに与える効果、特に２０個の細胞の変位分布の時間発展（上パネル）と、１２秒間の総変位の対応するグラフ（下パネル）とを示す図である。 抗真菌薬フルコナゾール（４００μｇ／ｍｌ）がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４の細胞ナノモーションに与える効果、特に２０個の細胞の変位分布の時間発展（上パネル）と、１２秒間の総変位の対応するグラフ（下パネル）とを示す図である。 抗真菌薬カスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）が超感受性のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４の細胞ナノモーションに与える効果、特に２０個の細胞の変位分布の時間発展（上パネル）と、対応する総変位のグラフ（下パネル）と示す図である。 抗真菌薬カスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）がカンジン耐性のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４の細胞ナノモーションに与える効果、特に２０個の細胞の変位分布の時間発展（上パネル）と、対応する総変位のグラフ（下パネル）と示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４に与える影響、特に１時間処理後の細胞変位（左パネル）と２０個の細胞の総変位（右パネル）とをウィルコクソンの検定（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．１；ｎｓ：非有意）で調べたものを示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４に与える影響、特に２時間処理後の細胞変位（左パネル）と２０個の細胞の総変位（右パネル）とをウィルコクソンの検定（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．１；ｎｓ：非有意）を用いて調べたものを示す図である。 栄養環境が酵母細胞の細胞ナノモーションに与える影響、特にＹＰＤ増殖培地中で増殖する２０個のS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２細胞のフレームごとの変位の分布を示す図である。 栄養環境が酵母細胞の細胞ナノモーションに与える影響、特にＰＢＳ中に存在する２０個のS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２細胞のフレームごとの変位の分布を示す図である。 栄養環境が酵母細胞の細胞ナノモーションに与える影響、特に、ＹＰＤ増殖培地中の細胞（Ｃ）について、１２秒間の測定中の総変位の時間発展を時間の関数として、ウィルコクソンの検定（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊Ｐ＜０．１；ｎｓ：非有意）を用いて調べたものを示す図である。 栄養環境が酵母細胞の細胞ナノモーションに与える影響、特にＰＢＳ中の細胞について、１２秒間の測定中の総変位の時間発展を時間の関数として、ウィルコクソンの検定（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊Ｐ＜０．１；ｎｓ：非有意）を用いて調べたものを示す図である。 シリカマイクロビーズの移動と、コンカナバリンＡによるガラス表面への細胞の接着とを示す図であり、特にガラス表面上の２０個のビーズの変位／フレームを示している。 シリカマイクロビーズの移動と、コンカナバリンＡによるガラス表面への細胞の接着とを示す図であり、特にＰＬＬ－ＰＥＧで処理した表面上の２０個のビーズの変位／フレームを示している。 シリカマイクロビーズの移動と、コンカナバリンＡによるガラス表面への細胞の接着とを示す図であり、特にガラス及びＰＬＬ－ＰＥＧで処理した表面上の２０個のビーズすべてのフレームごとの変位を示している。 シリカマイクロビーズの移動と、コンカナバリンＡによるガラス表面への細胞の接着とを示す図であり、特にガラス及びＰＬＬ－ＰＥＧで処理した表面上のビーズの１２秒間の測定中の総変位を、ウィルコクソンの検定（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）を用いて調べたものを示す図である。 シリカマイクロビーズの移動と、コンカナバリンＡによるガラス表面への細胞の接着とを示す図であり、特に野生型C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４について、２０個の未処理の細胞（上パネル）及びカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）で処理した細胞の５時間後の変位／フレーム（下パネル）を示している。 シリカマイクロビーズの移動と、コンカナバリンＡによるガラス表面への細胞の接着とを示す図であり、特に超感受性C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４株について、２０個の未処理の細胞（上パネル）及びカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）で処理した細胞の５時間後の変位／フレーム（下パネル）を示している。 シリカマイクロビーズの移動と、コンカナバリンＡによるガラス表面への細胞の接着とを示す図であり、特に２０個のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４細胞のフレームごとの変位を示している。 シリカマイクロビーズの移動と、コンカナバリンＡによるガラス表面への細胞の接着とを示す図であり、特に２０個のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４細胞のフレームごとの変位を示している。 シリカマイクロビーズの移動と、コンカナバリンＡによる細胞のガラス表面への接着とを示す図であり、特に２０個の（Ｈ）C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４の１２秒間の測定中の総変位を示している。 シリカマイクロビーズの移動と、コンカナバリンＡによるガラス表面への細胞の接着とを示す図であり、特に２０個の（Ｋ）C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４細胞の１２秒間の測定中の総変位を示している。 温度が酵母細胞の細胞ナノモーションに与える影響を示す図であり、特にS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２について、温度（１３℃、２０℃、２５℃）の関数としての２０個の細胞のフレームごとの変位の分布を示している。 温度が酵母細胞の細胞ナノモーションに与える影響を示す図であり、特にS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２について、温度（３０℃、３５℃）の関数としての２０個の細胞のフレームごとの変位の分布を示している。 温度が酵母細胞の細胞ナノモーションに与える影響を示す図であり、特にC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４について、温度（１３℃、２０℃、２５℃）の関数としての２０個の細胞のフレームごとの変位の分布を示している。 温度が酵母細胞の細胞ナノモーションに与える影響を示す図であり、特にC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４について、温度（３０℃、３５℃）の関数としての２０個の細胞のフレームごとの変位の分布を示している。 抗真菌薬がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）の細胞ナノモーションに与える影響を示す図であり、２０個のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４細胞をアムホテリシンＢ（５００μｇ／ｍｌ）で処理したときの変位／フレームを示している。 抗真菌薬がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）の細胞ナノモーションに与える影響を示す図であり、２０個のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４細胞をカスポファンギン（１００μｇ／ｍｌ）で処理したときの変位／フレームを示している。 抗真菌薬がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）の細胞ナノモーションに与える影響を示す図であり、２０個のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４細胞をフルコナゾール（４００μｇ／ｍｌ）で処理したときの変位／フレームを示している。 ２０個の（Ｄ）超感受性のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４細胞の変位／フレームを示す図である。 ２０個の（Ｄ）超感受性のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４細胞（Ｅ）カンジン耐性のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ４６１４細胞をカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）で処理したときの変位／フレームを示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に未処理の細胞の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に０．１μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に０．１μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に１μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に４μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に１０μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に５０μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に１００μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に未処理の細胞の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に０．１μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に０．５μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に１μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に４μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に１０μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に５０μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響、特に１００μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に未処理の細胞の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に０．１μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に０．５μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に１μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に４μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に１０μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に５０μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に１００μｇ／ｍｌの場合の１時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に未処理の細胞の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に０．１μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に０．５μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に１μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に４μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に１０μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に５０μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 アムホテリシンＢ濃度の増加がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に与える影響、特に１００μｇ／ｍｌの場合の２時間後のフレームごとの細胞変位を示す図である。 １時間処理した後の２０個の細胞のフレームごとの細胞変位（左パネル）とフレームごとの総変位（右パネル）とを、ウィルコクソンの検定（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊Ｐ＜０．１；ｎｓ：非有意）を用いて調べたものを示す図である。 ２時間処理した後の２０個の細胞のフレームごとの細胞変位（左パネル）とフレームごとの総変位（右パネル）とを、ウィルコクソンの検定（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊Ｐ＜０．１；ｎｓ：非有意）を用いて調べたものを示す図である。 表面がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）の細胞移動に与える影響、特にＰＬＬ－ＰＥＧで処理したガラス表面上での２０個のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４の未処理の細胞（上パネル）及びカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）で処理した細胞（下パネル）の変位／フレームを示す図である。 ＰＬＬ－ＰＥＧで処理した表面上での２０個の細胞すべてのフレームごとの変位を示す図である。 ＰＬＬ－ＰＥＧで処理した表面上での２０個の細胞の１２秒間の測定中の総変位を、ウィルコクソンの検定（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１）を用いて調べたものを示す図である。 表面がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）の細胞移動に与える影響、特にガラス表面上での２０個のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４の未処理の細胞（上パネル）及びカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）で処理した細胞（下パネル）の変位／フレームを示す図である。 ガラス処理表面上での２０個の細胞すべてのフレームごとの変位を示す図である。 ガラス処理表面上での２０個の細胞の１２秒間の測定中の総変位を、ウィルコクソンの検定（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１）を用いて調べたものを示す図である。 ＰＬＬ－ＰＥＧで処理した表面上での２０個のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４の未処理の細胞及びカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）で処理した細胞の）の変位／フレームを示す図である。 ＰＬＬ－ＰＥＧで処理した表面上での２０個の細胞のフレームごとの変位を示す図である。 ＰＬＬ－ＰＥＧで処理した表面上での２０個の細胞の１２秒間の測定中の総変位を、ウィルコクソンの検定（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１）を用いて調べたものを示す図である。 ガラス表面上での２０個のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４の未処理の細胞（上パネル）及びカスポファンギン（１０μｇ／ｍｌ）で処理した細胞（下パネル）の変位／フレームを示す図である。 ガラス処理表面上での２０個の細胞すべてのフレームごとの変位を示す図である。 ガラス処理表面上での２０個の細胞の１２秒間の測定中の総変位を、ウィルコクソンの検定（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１）を用いて調べたものを示す図である。 相互相関アルゴリズムによって解析される個々の細胞を手動で選択する例を示す図である。
本発明を特定の実施形態に関して、また特定の図面を参照して説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。寸法及び相対的な寸法は、本発明の実施化には対応していない。
さらに、本明細書及び特許請求の範囲における第１、第２などの用語は、類似の要素を区別するために使用されており、時間的、空間的、順位的又は他の任意の方法での順序を記述するために必ずしも使用されていない。このように使用されている用語は、適切な状況下では交換可能であり、本明細書に記載されている本発明の実施形態は、本明細書に記載又は図示されている以外の順序で実施可能であることを理解されたい。
さらに、本明細書及び特許請求の範囲に記載されている「上（top）」、「下（under）」などの用語は、説明のために使用されており、必ずしも相対的な位置を記述するためのものではない。このように使用されている用語は、適切な状況下では交換可能であり、本明細書に記載されている本発明の実施形態は、本明細書に記載又は図示されている以外の他の向きでも実施可能であることを理解されたい。
特許請求の範囲で使用されている「～を含む」という用語は、それ以降に記載されている手段に限定されると解釈すべきではなく、他の要素又はステップを除外するものではないことに留意されたい。したがって、言及されているように、記載された特徴、整数、ステップ若しくは構成要素の存在を特定するものと解釈されるが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ若しくは構成要素、又はそれらのグループの存在又は追加を排除するものではない。したがって、「手段Ａ及びＢを含む装置」という表現の範囲は、構成要素Ａ及びＢのみからなる装置に限定されるべきではなく、本発明に関しては、装置の関連する構成要素がＡ及びＢのみであることを意味する。
本明細書を通じて「一実施形態」又は「ある実施形態」に言及することは、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の様々な場所で「一実施形態では」又は「ある実施形態では」という表現が現れるのは、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではないが、そうであってもよい。さらに、特定の特徴、構造又は特性は、本開示から当業者に明らかになるような任意の適切な方法で、１つ又は複数の実施形態で組み合わせてもよい。
同様に、本発明の例示的な実施形態の説明では、開示を合理化し、様々な発明的態様の１つ又は複数の理解を助ける目的で、本発明の様々な特徴が、単一の実施形態、図、又はその説明にまとめられることがあることを理解すべきである。しかしながら、このような開示方法は、請求項に記載された発明が、各請求項に明示的に記載された以上の特徴を必要とするという意図を反映していると解釈されるべきではない。むしろ、以下の請求項が反映するように、発明的態様は、単一の前述の開示された実施形態のすべての特徴よりも少ないものにある。したがって、詳細な説明に続く請求項は、ここで明示的にこの詳細な説明に組み込まれ、各請求項は、この発明の別個の実施形態として独立している。
さらに、本明細書に記載されている一部の実施形態は、他の実施形態に含まれる一部の特徴を含むが、他の特徴は含まず、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、当業者に理解されるように、本発明の範囲内であり、異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、以下の請求項において、特許請求された実施形態のいずれかを任意に組み合わせて使用することができる。
本明細書では、多数の具体的な詳細が記載されている。しかしながら、本発明の実施形態は、これらの具体的な詳細がなくても実施することができると理解される。他の例では、周知の方法、構造及び技術は、本明細書の理解を不明瞭にしないために、詳細に示されていない。
一態様では、本発明は、粒子特性を導出するための方法に関することができる。本方法は、１つの粒子又は複数の粒子の特性を検出することを含んでいてもよい。粒子は、一例として細胞であるなど、任意のタイプの粒子であってもよい。本方法は、液体環境における少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動を、少なくとも１つの瞬間にイメージングすることを含む。粒子は、表面又はより大きな粒子に付着している必要はない。したがって、それらは付着していなくてもよい。イメージングは、光学的なイメージングであってもよい。イメージングは、ビデオ録画であってもよい。このようなビデオ録画は、例えば、少なくとも２秒、少なくとも５秒、又は少なくとも１０秒などの所定の時間にわたる移動のビデオであってもよい。これらのビデオ録画は、複数回繰り返されてもよい。これは、録画の間に所定の時間間隔を置いた異なる録画に対応してもよい。
本方法はまた、液体環境における自由浮遊粒子のイメージングされた移動に基づいて、少なくとも１つの瞬間に移動パラメータを決定することを含む。移動パラメータは、粒子のｘ，ｙ方向の移動であってもよい。移動パラメータは、自由浮遊粒子の振動運動の振動周波数であってもよい。本方法はまた、移動パラメータから、少なくとも１つの粒子の特性を導出することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、移動パラメータを決定するために、本方法は、画像を登録するためのアルゴリズムを利用してもよい。このようなアルゴリズムの一例として、経時的な粒子の移動の導出には、例えば、Manuale Guizar-Sicairos et al. in Optics Letters 33, 156-158 (2008)に「Efficient subpixel image registration algorithms」と題して記載されているような画像を登録するためのアルゴリズムを利用してもよい。或いは、他のアルゴリズムを使用してもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は、図８に示されているようなアルゴリズムであってもよい。他の実施形態では、この方法は、図９に示されているようなアルゴリズムであってもよい。
いくつかの実施形態では、ナノモーションを測定する前に細胞を自動的に選択するために、自己学習アルゴリズムを利用してもよい。例えば、ニューラルネットワークを利用してもよい。一例では、図１０Ａ，１０Ｂに示すような自己学習アルゴリズムを利用してもよい。このような方法は、例えば、シミュレートされた細胞の画像、例えば、約５００００枚以上の大量の画像を生成し、ひいては合成細胞画像のセットを得て、かかる画像を細胞検出モデルに提供して、モデルをトレーニングし、モデルを更新し、モデルを評価し、モデルを改善して、最終的にトレーニングされたモデルを得ることを含んでいてもよい。
説明のために、本発明の実施形態はこれに限定されるものではないが、本発明の実施形態の特徴及び利点を以下に説明する。以下の例は、光学ナノモーション検出を用いて、単一細胞の抗真菌感受性を、迅速に、ラベルフリーで、及び付着物なしで特性評価する方法の利点を示す。
近年、世界的規模で真菌症が急増していることから、以下のような例が考えられる。抗真菌薬耐性酵母株の出現は、今日、人類にとって深刻な課題となっている。これらの菌の蔓延を抑制するための選択肢の１つが、治療及び臨床管理の判断材料となる迅速な抗真菌薬感受性試験（ＡＦＳＴ）の開発である。以下に示す例示的な実施形態では、非常に基本的な実験材料、すなわち光学顕微鏡、カメラ及びコンピュータを用いて、単一の真菌細胞の抗真菌薬に対する感受性を評価することができる、迅速で簡単な方法を説明している。有利なことに、この技術はラベルフリーであり、細胞を基材上に付着させる必要がないため、発展途上国の遠隔地の医師の診療所であっても、劇的に単純化され、適用範囲が広がる。顕微鏡で連続して記録された光学画像の相互相関に基づく「光学ナノモーション検出」（ＯＮＭＤ）法が開発され、記録された「ナノモーション」の大きさが細胞の活動に比例することが実証された。ビデオ解析パイプラインには、ディープラーニングによる単一細胞検出アルゴリズムが実装されており、ビデオシーケンス内の数百から数千の細胞の中から個々の細胞を自動的に検出することができる。その結果、開発された方法は、単一の細胞だけでなく、細胞集団全体のナノモーションパターンも扱うことができる。本例では、この方法を、Candida albicans（カンジダ・アルビカンス）、C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）及びC. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）の各菌株（臨床株を含む）、及びモデル酵母Saccharomyces cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）の各種抗真菌薬に対する感受性を評価するために適用した。さらに、C. albicans（カンジダ・アルビカンス）株に対するアムホテリシンＢの用量反応曲線を設定して、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定した。この方法は、生死の境目を検出することのほかに、細胞の代謝活性にも敏感であることが、細胞のナノモーションパターンと温度及び栄養素の有無との間に相関関係が見られたことから実証された。この特定の例では、酵母のナノモーションパターンを周波数領域で解析したところ、生死の境目で最も変化する振動周波数が０．５～４Ｈｚであることが明らかになった。
本例では、ビデオカメラを備えた光学顕微鏡を用いて、生細胞のナノメートルスケールの振動を検出できることを示している。この振動をモニタリングするには、薬物の有無にかかわらず、細胞の１２秒間の動画を定期的に（本例では１時間ごとに）記録し、サブピクセルスケールの移動を強調できるアルゴリズムで動画を処理する（図１）。興味深いことに、従来の技術とは異なり、細胞をカンチレバーや基材に付着する必要がない。細胞が付着していないので、中～高倍率の光学顕微鏡で細胞の振動が検出しやすくなる。また、この技術はラベルフリーのため、非常に迅速で簡単なセットアップが可能である。重要なことに、ディープラーニングによる検出アルゴリズムと、データ処理を劇的に高速化する更なる自動化とにより、この方法は、単一の細胞だけでなく、全集団（１００～１０００個の細胞）にも適用可能である。
この方法は、異なるカンジダ種及びモデル酵母であるS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）など、様々な種類の酵母で試験された。これらのカンジダ種は、ヒトの真菌感染症であるカンジダ症に関与している可能性があり、獲得した耐性のために治療が困難になることがある。評価した酵母株の中には、適用された抗真菌薬に対して超感受性又は耐性を持つものがあり、その生存率が脅かされた。いずれの場合も、古典的な感受性試験と同様の結果が得られた。抗真菌薬の投与量依存性と温度依存性の試験を行い、光学ナノモーション検出（ＯＮＭＤ）が生死の境目の検出に限らず、代謝率の変化もモニタリングできることを実証した。
単一細胞を追跡するために、本例では相互相関画像登録アルゴリズムを使用した。この方法は、生きた細胞内のケラチンネットワークの微妙な変化や，筋芽細胞の変位を効率的に追跡できることが確認された。このアルゴリズムは、最初のフレームと後続の各フレームとの間の相互相関ピークの初期推定に基づいている。このアルゴリズムは、サブピクセル（サブμｍ）の解像度で画像変換の数値を提供し、重い計算を必要としない。我々のプログラムは、各フレームの細胞の変位を計算し、追跡されたセルの軌跡とともに変位の二乗平均平方根もＭＳ Ｅｘｃｅｌファイルに保存する。
最初の実験では、エタノールが様々なカンジダ菌株及びモデル酵母であるS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）のナノモーションに及ぼす抗菌活性を評価した。そのため、高濃度エタノール（７０％）がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）、C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）、C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）及びS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）の各細胞のｘｙ方向の変位に与える影響を調べた（図２ａ及び２ｂの下パネル）。その結果、エタノールで処理された細胞では、ｘｙ方向の変位が迅速かつ劇的に減少することがわかる。１０００フレームにわたる総変位は、わずか１０分の処理で有意に減少した（図２ｃ）。エタノールを加えて拡散混合してから１０分後、C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）、C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）及びS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）では、有意な減少（ｔ検定）が検出された。C. albicans（カンジダ・アルビカンス）は、６０分後にのみ総変位の有意な減少が測定されたことから、エタノール耐性がやや高いと思われる。エタノールは、カンジダ菌がグルコースを代謝して得られる産物の１つである。エタノールは唯一の炭素源として使用することができ、その耐性は菌株に依存することが確認されていた。S. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）もエタノールを産生することができ、中程度の濃度（５～７％）で増殖速度に影響を与え、高濃度（１０％超）では細胞膜の完全性が損なわれ、最終的にはアポトーシスによる細胞死に至る。エタノールは酵母の細胞膜の流動性を変化させ、膜貫通電位を散逸させるため、イオン種の透過性及び代謝物の漏出を引き起こす。エタノールは細胞内を自由に拡散し、細胞内のタンパク質を直接摂動し、変性させる。
次のステップでは、ＡＦＳＴを行うためのＯＮＭＤの効率を評価した。酵母細胞を抗真菌薬で処理すると、ｘｙ方向の変位が有意に減少した。一例として、図２ａ及び２ｂ（上パネル）は、C. albicans（カンジダ・アルビカンス）、C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）、C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）及びS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）の各細胞をカスポファンギンで処理した後に、変位が減少したことを示している。抗真菌薬のアムホテリシンＢ、カスポファンギン及びフルコナゾールのC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株に与える影響を図２ｄに示す。３種類の抗真菌薬ともに、１時間の処理で平均総変位の有意な減少が検出された（図２ｄ）。アムホテリシンＢは、この株に最も効果的な抗真菌薬であり、既に１時間後にはナノモーションシグナルが、死んだ細胞で記録された値に近い値まで減少した。ポリエン系のアムホテリシンＢは細胞膜のエルゴステロールに選択的に結合して細孔を形成させる（結果的に死滅が早まる）が、アゾール系のフルコナゾールはチトクロームＰ４５０依存性のラノステロール－１４－α－デメチラーゼを選択的に阻害し、エキノカンジン系のカスポファンギンは真菌のβ－１，３－グルカン合成酵素を阻害する。報告されているC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ株に対するアムホテリシンＢのＭＩＣ値は０．５μｇ／ｍｌであった。カスポファンギンは、カンジン耐性のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ４６１４臨床株のナノモーションには影響を与えなかったが（図２ｅ）、超感受性（排出系の変異体）（表１）C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４株は死滅させた（図２ｆ）。報告されているC. albicans（カンジダ・アルビカンス）に対するカスポファンギンのＭＩＣ値は０．０３～８μｇ／ｍｌの範囲である。カスポファンギンをC. glabrata（カンジダ・グラブラータ）ＤＳＹ５６２臨床野生型株にナノモーションＡＦＳＴで作用させたところ、２時間後には細胞が死滅した（図４ａ）。カスポファンギンは、C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）ＤＳＹ４６０６臨床野生型株も速やかに死滅させたが（図４ｂの右パネル）、耐性のＤＳＹ４５９０臨床株は処理の影響を受けなかった（図４ｂの左パネル）。S. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２に対するカスポファンギンの影響は、処理３時間後に総変位の有意な減少が観察された（図５ａ）。フルコナゾールがS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）に与える影響は、処理１時間後には見られなかったが（図５ｂ）、C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４に与える影響とは対照的に（図２ｄ）、処理５時間後には総変位の有意な減少が明らかになった。これは、S. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）に対するフルコナゾールのＭＩＣ値（１～８μｇ／ｍｌ）が、C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４に対するＭＩＣ値（０．３μｇ／ｌ）と比較して大きいことから説明できる。
C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株に対するアムホテリシンＢの用量反応曲線もＯＮＭＤ法を用いて調べた（図２ｇ及び２ｈ）。平均総変位は、１０μｇ／ｍｌの濃度では１時間後に増加し（図２ｇｌ）、４μｇ／ｍｌの濃度では２時間後に増加したが（図２ｈ）、薬物濃度がより高くなると減少した。C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４臨床野生型株においても、同様のアムホテリシンＢの用量反応曲線が記録された（図２ｉ）。これは、アムホテリシンの作用機序が、そのＭＩＣを中心とした細胞の移動を活発にすること、すなわち、抗真菌作用が細胞の代謝活性を高めることを示している。また、Bordetella pertussis（ボルデテラ・パーツシス）という細菌のナノモーション（ＡＦＭ－カンチレバー法で測定）が、抗生物質のＭＩＣ付近で増加することも以前に観察されていた。今回の結果は、低濃度でもナノモーションの変化として検出できるようになるまでには時間がかかること、ＯＮＭＤによって細胞死のダイナミクスを記録できることも示している。ナノモーションの変化が観察される最低濃度は、ＭＩＣ値に相当する。この菌株のＭＩＣ値は１～４μｇ／ｍｌであり、古典的な「マイクロタイタープレート法」では０．３μｇ／ｍｌ、C. albicans（カンジダ・アルビカンス）では０．１～４．０μｇ／ｍｌと報告されていた。
次の実験セットでは、化学的・物理的な刺激による酵母の代謝変化をモニタリングするためのＯＮＭＤ法の能力を調べた。まず、（１３～３５℃の範囲の）温度がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）、C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）及びS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）に与える影響を評価した（図３ａ）。この３つの酵母株ともに、３０℃付近で最大の活性が検出された。この値は、記録されている最適な増殖温度、すなわちC. albicans（カンジダ・アルビカンス）では３３～３８℃、S. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４２４７では３０～３５℃と一致している。次に、栄養素が酵母細胞のＯＮＭ活性に与える影響を、増殖培地に懸濁した細胞の総変位とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した細胞の総変位とを比較することによって評価した。図３ｃに示されているように、増殖培地中の細胞のナノモーション活性は、ＰＢＳ中で得られた測定値とは対照的に１時間後に有意に増加した。
最後に、ＯＮＭＤを用いて表面に付着した細胞のＡＦＳＴを行えるかどうかを評価した。そのため、コンカナバリンＡをコーティングしたガラス表面上に、C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４（感受性）、ＤＳＹ２９４（野生型）及びＤＳＹ４６１４（カスポファンギン耐性）を強く付着させた（図６ａ～６ｃの上パネル）。コンカナバリンＡはレクチンの一種で、酵母の細胞壁をマンノース糖鎖を介してガラスの表面に架橋させる。このような場合、ゆるやかに付着した大腸菌細胞に対して抗生物質感受性試験を行ったＳｙａｌらとは対照的に、総変位の有意な減少は検出されなかった。最終的にカスポファンギンのＡＦＳＴを、防汚コーティングされた表面、すなわちＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧで処理されたスライドグラス上に付着した酵母細胞に対して行った。これらの実験では、未処理のガラス表面で得られた結果とある程度同等の結果が得られた（図６ａ～６ｃ）。しかしながら、超感受性株と野生型株との場合、未処理のガラス表面ではナノモーションのより早い有意な減少が検出された。耐性株では、未処理のガラスとＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧコーティングガラスとで同等の結果が得られた。これらの実験結果から、本手法は、浮遊している非付着細胞の「自然な」ナノモーションを観察するものであると結論づけられる。
生死の境目を分ける振動パターンの違いを明らかにするため、周波数領域での数値解析を行った（図７ａ，ｂ）。各周波数領域は、低周波限界と高周波限界とによって特徴付けられる。現行の記録方法では、低周波限界は信号持続時間の逆数として決定され、これは１２秒間で０．０８３Ｈｚに相当する。高周波限界の計算はより複雑で、細胞ごとに異なる。高周波限界は臨界周波数（ｆｃｒｉｔ）と名付けられ、その計算方法が考案された。これらの解析から、未処理の耐性C. albicans（カンジダ・アルビカンス）細胞は、ｆｃｒｉｔが０．７～１．５Ｈｚの範囲で変化する周波数範囲（０．０８３－ｆｃｒｉｔ）で最大の活性を示すことが明らかになった。興味深いことに、C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型細胞も、より高い周波数（２．５～３．０Ｈｚ）でｆｃｒｉｔを有していた（図７ｃ）。一方、カスポファンギン処理細胞は、ｆｃｒｉｔの幅が広がり、その幅は超感受性（感度の高い）ＤＳＹ１０２４細胞で最も広がった（図７ｄ）。この場合、２Ｈｚ付近にｆｃｒｉｔが追加されていることが観察された。これらの結果から、酵母の生細胞と死細胞との間の周波数領域における振動パターンの最大の違いは、超低周波領域にあることが明らかになった。これらの結果は、０．８～１．６ｋＨｚの範囲でS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）の定期的な動作を強調したGimzewskiらの発表を補完するものである。これらの測定は、フィルターの孔に機械的に捕捉された酵母細胞のＡＦＭにより行った。残念ながら、現在のＯＮＭＤのセットアップでは、このような高いサンプリングレートを実現することができず、これらの結果を立証又は裏付けることができない。
データ処理を高速化するために、個々の酵母細胞（図３ｄ）を検出し、そのナノモーションをサブピクセルの解像度で追跡するディープラーニングアルゴリズムを開発した。ディープラーニングモデルは、物体及び細胞の自動検出タスクで幅広く成功している。中規模の浅いＹＯＬＯアーキテクチャを使用した。手動で細胞を選択する場合と比較して、このアプローチでは、かなり多くの細胞（１００～１０００個）を自動的に解析することができる。この原理を実証するために、温度が３種類の酵母株に与える影響を示すビデオデータを再解析した（図３ｂ）。最初の分析では、温度条件ごとに手動で２０個の細胞を選択していたが、今回はより多くの細胞を自動的に検出することができた：C. albicans（カンジダ・アルビカンス）では１９４個の細胞（１条件あたり平均３９個）、C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）では１５９個の細胞（１条件あたり平均３２個）、S. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）では１４７個の細胞（１条件あたり平均２９個）を解析した。予想通り、解析対象のサンプル数が増えると、総変位の分布がより小さくなり、計算された平均変位の値がより正確なものになった（図３ｂ対３ａ）。
この方法の効率をさらに高め，計算コストを削減するために、低周波数の記録速度で追加実験を行った（８３ｆｐｓの代わりに１０．５ｆｐｓ）。これは、酵母の生細胞と死細胞との間で最大の差が生じるのは４Ｈｚ未満の周波数であるという結果を受けてのことである。C. albicans（カンジダ・アルビカンス）、C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）、C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）及びS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）について、８３ｆｐｓという高フレームレート取得のために、先ほどと同様にエタノールを持ちチア処理を行った（図６ｄ）。これらの結果は、より小さなデータファイルでも、より高速な解析で同等の結果が得られることを示している。
さらに実例として、抗真菌薬にさらされた細胞の平均変位を調査し、図１１ａ、図１１ｂ、及び図１２に示した。個々の細胞の２Ｄ変位は、サブμｍの解像度で細胞変位をモニタリングする専用アルゴリズムを使用して決定した。本例では、Ibidi社製（ドイツ）のマイクロウェルインサート（底面の直径が４００μｍの円錐形）において移動を測定した。抗真菌薬にさらされた細胞の平均変位を、数個の細胞及び抗真菌化合物の未処理の対照と比較した（図１Ａ）。スチューデントのｔ検定を行い，細胞の移動の減少が有意であるかどうかを決定した。図１１ａでは、１２秒間の測定中の平均変位に与える影響を、時間の関数として示している。測定は４つのIbidi社製マイクロウェルで行った。抗真菌薬を同じウェルに上部で添加し、混合を拡散によってのみ行ったことで、生存率への影響が観察される時間が長くなった。（１）カスポファンギンがC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４臨床株に与える影響、（２）アムホテリシンＢがC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４に与える影響、（３）フルコナゾールがC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４に与える影響、及び（４）フルコナゾールがS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４１に与える影響を示した。エラーバーは、１２秒間の間に記録された２０個の単一細胞の変位からの標準偏差を表している；スチューデントの対応ありｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１）。また、温度の関数としての細胞（C. albicans（カンジダ・アルビカンス）、C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）及びS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ））の活性を調べた。温度がS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４１、臨床株であるC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４及びC. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）ＤＳＹ４６０６の平均変位に与える影響を図１１ｂに示す。温度を段階的に上昇させた後、温度が安定してから１５分後に、１条件につき２０個の単一細胞の移動を約１２秒間記録し、解析した。
カスポファンギンが野生型、耐性及び感受性のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）、及びS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）の平均変位に与える影響を図１２に示す。５時間のインキュベーション中のカスポファンギンの影響を示す。ＹＰＤ培地中のカスポファンギン濃度は１０μｇ／ｌであった。
４つのウェルにおける細胞の測定移動を示す実験は、本発明の実施形態の特徴及び利点を示している。
最初に述べたように、化学物質が細菌の生存率に与える影響を評価するためのＡＦＭベースのアッセイが以前に開発されていた［８］。この検出法は、生物がナノメートルスケールで振動し、これらの振動を、当該生物が付着したＡＦＭカンチレバーに伝達するという観察に基づいている。これらの振動は、細胞の生存率が低下するとすぐに停止する。これらの振動は、生きた細菌、酵母、植物及び哺乳類の細胞に存在することが実証されている［９］。表面に付着した生きた細菌細胞のナノモーションは、細菌のｚ方向の移動のプラズモニックイメージング［１０］、付着した細菌のサブミクロンスケールのｘ－ｙ方向の移動の追跡［１１］、共振結晶の位相雑音による付着した細菌の振動のセンシング［１２］、及びサブセルラーゆらぎイメージング［１３］など、他の検出方法を用いて確認されている。
既に述べたように、ビデオカメラを搭載した光学顕微鏡では、ガラス表面に堆積した単一の酵母細胞の移動を検出できることがわかっている。生きた単一の酵母細胞は、細胞の細胞活動に比例した大きさの特定の細胞移動をナノメートルスケールで示す。我々は、古典的な光学顕微鏡を用いて、付着していない単一酵母細胞のこの細胞ナノモーションパターンを特徴付けた。短時間での細胞変位の分布は、ランダムな移動とは異なる。このようなナノモーションの変位分布の範囲及び形状は、細胞の代謝状態によって大きく変化する。また、ナノモーションの周波数パターンを解析した結果、生きた単一の酵母細胞は、約２Ｈｚの比較的低い周波数で振動していることが明らかになった。この技術は非常にシンプルであるため、様々な応用が期待されるが、中でも抗真菌薬感受性試験が最も簡単な方法であると思われる。
図１３～２４は、本発明をさらに説明するものである。特に、この光学ナノモーション検出（ＯＮＭＤ）法を用いて、付着していない酵母細胞のナノモーションを調べた。統計解析はさらに、Ｐｒｉｓｍ８（ＧｒａｐｈＰａｄ）で作成したバイオリン図と箱ひげ図（１０～９０パーセンタイル）とに基づいて行った。条件間の有意差を決定するために、ウィルコクソンの符号付き順位和検定法を実施した（１０００フレームにわたる平均総変位の箱ひげ図）。
倍率４００倍で撮影した１２秒間の動画（１０００フレーム）を記録することで、細胞のｘ－ｙ方向の移動をモニタリングした（図１３）。これらの動画を定期的に記録することで、細胞の時間的な挙動を、異なる化学的・物理的刺激の関数として特徴付けた（図１３Ａ～Ｂ）。単一細胞の移動を追跡するために、相互相関画像登録アルゴリズムを使用した［１４］。このアルゴリズムは、最初のフレームとそれに続くすべてのフレームとの間の相互相関ピークの初期推定に基づいている。これにより、サブピクセル（サブμｍ）の解像度で画像変換の数値が提供される。各フレームにおける細胞変位、追跡された細胞の軌跡（図１３Ｃ）とともに、総変位の二乗平均平方根（図１３Ｆ）も計算した。単一細胞のナノモーションは、フレームごとの変位の分布をバイオリン図としてプロットすることで特徴付けた（図１３Ｄ）。２０個の細胞セットの移動は、フレームごとにグループ化された細胞変位をバイオリン図でプロットし、１０００フレームにわたる２０個の細胞の総変位を箱ひげ図でプロットすることによって特徴付けた（図１３Ｅ）。
さらに一連の実験では、（ＹＰＤ増殖培地中での増殖により）栄養素の存在下で増殖したSaccharomyces cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）細胞の場合と、栄養素のない生理的ＰＢＳ緩衝液中で増殖した場合の単一細胞のナノモーションを比較した。４時間の間、１時間ごとに単細胞の変位を記録した（図１４Ａ～Ｂ及び１７Ａ～Ｂ）。活発に増殖する単一細胞が、変位の大きな分布を示した。変位の分布は対称的ではなく、これは細胞の非ランダムな挙動を反映しており（ｘ－ｙ方向の変位グラフ（図２ａ～２ｂ）からも観察できる）、すなわち、細胞は時々ジャンプすることができる。この移動の挙動は、変位分布を表すバイオリン図の形状にも反映されている。このセットでは、少数の細胞（１～３個）が非常に小さな変位分布を示しており、不活性と分類することができる。対照的に、栄養素がない場合、特に３～４時間培養した後には、有意に多くの不活性細胞が存在した（図１４Ｂ及び１７Ｂ）。この挙動は、グループ化された変位のバイオリン図（図１４Ａ－Ｂの下パネル）及び総変位の箱ひげ図（図１７Ｃ～Ｄ）にも反映されている。これらの箱ひげ図のプロットでは、細胞が新しい増殖条件に適応していることが明らかに観察されえ、すなわち、ＰＢＳ中で得られた測定値とは対照的に、１時間後に総変位が有意に増加している。
また、細胞ナノモーションを、同じ条件で記録したシリカビーズの移動と比較した（図１８Ａ～Ｄ）。変位の分布は対称的であった。移動の大きさは、生きた細胞に比べてはるかに小さく、死んだ細胞と同程度であった（図１８Ｅ）。
温度が酵母のナノモーションパターンに与える影響を評価するために、１３～３５℃の範囲の異なる温度で細胞振動をモニタリングした（図１４Ｃ～Ｄ及び１９）。各菌株は、グループ化された変位の分布が異なることによって特徴付けられる。いずれの酵母株も、約３０℃で最大の活性が検出された。この値は、S. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）ＢＹ４７４２［１５］及びC. albicans（カンジダ・アルビカンス）［１６］の最適な増殖温度として記録されている３０～３５℃と一致している。これらの実験により、細胞活動の大きさは、変位の分布の大きさと、１０００フレームにわたる総変位とに比例することが示された。
次に、カンジダ及びS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）の細胞が殺傷剤にさらされたときの細胞の移動を特徴付けた。カンジダ属は、獲得した耐性のために治療が困難でありうるヒトの真菌感染症であるカンジダ症に関与している可能性がある［１７］。評価した酵母株の中には、適用された抗真菌薬に対して超感受性又は耐性を持つものがあり、その生存率が脅かされた。まず、高濃度エタノール（７０％）がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）、C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）、C. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）及びS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）の各細胞に与える影響を調べた。エタノールを添加すると、ｘ－ｙ方向の変位が迅速かつ劇的に減少する（図２ａ～２ｂ）。単一細胞の変位分布（図１５）、２０個の細胞のグループ化された変位（図１５Ｅ～Ｆの上パネル）及び総変位（図１５Ｅ～Ｆの下パネル）が減少した。エタノールを添加してから１０分後には、すべての菌株において、２０個の細胞をセットにした場合の変位量の減少が観察された。C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）とS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）とは、総変位量の有意な減少が６０分後にのみ観察されたことから、C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）とC. lusitaniae（カンジダ・ルシタニアエ）とに比べてややエタノール耐性が高い。エタノール耐性は菌株に依存し［１８，１９］、増殖速度に影響を与え、細胞膜の完全性を損ない［２０］、イオン種の透過性及び代謝物の漏出を引き起こし［２１］、細胞内を自由に拡散し、細胞内のタンパク質を直接摂動し、変性させる［２２］。
第二に、様々な濃度の異なる抗真菌薬を細胞にさらすことで、細胞の死滅が細胞ナノモーションの変化に与える影響を評価した。抗真菌薬で細胞を処理した後、ｘ－ｙ方向の変位が有意に減少した（図２ａ～２ｂ）。アムホテリシンＢ、カスポファンギン及びフルコナゾールがC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４野生型株の細胞移動に与える影響を図１６Ａ～Ｃ及び２０Ａ～Ｃに示す。ポリエン系のアムホテリシンＢは細胞膜のエルゴステロールに選択的に結合して細孔を形成させる（結果的に死滅が早まる）が、アゾール系のフルコナゾールはチトクロームＰ４５０依存性のラノステロール－１４－ａ－デメチラーゼを選択的に阻害し、エキノカンジン系のカスポファンギンは真菌のｂ－１，３－グルカン合成酵素を阻害する［２３］。３種類の抗真菌薬ともに、１時間の処理後に細胞変位及び総変位の有意な減少が検出された。高濃度のアムホテリシンＢは非常に効果的で、既に１時間後には、２０個の細胞セット全体で、細胞ナノモーションが死細胞で記録された値に近い値まで減少した（図２０Ａ）。カスポファンギンは、カンジン耐性のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ４６１４株のナノモーションには影響を与えなかったが（図１６Ｅ）、超感受性（排出系の変異体）C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ１０２４株は死滅させた（図１６Ｄ）（表１）。報告されているC. albicans（カンジダ・アルビカンス）に対するカスポファンギンのＭＩＣ値は０．０３～８μｇ／ｍｌの範囲である［２４～２６］。フルコナゾールは、C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４株の細胞ナノモーションを１時間後に有意に減少させた（図１６Ｃ）。
生死の境目を観察するために、C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４臨床野生型株を、最小殺真菌濃度（ＭＩＣ）（C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ株では０．５μｇ／ｍｌと報告されている［６，２７］）を含む低濃度のアムホテリシンにさらした。全変位曲線を見ると、１０μｇ／ｍｌの濃度では１時間後に増加し（図１６Ｆ）、２時間の処理では増加が抑えられた（図１６Ｇ）。C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１野生型株でも、同様のアムホテリシンＢ反応が記録された（図２２）。単一細胞レベルでは、より多くの細胞が０．１～０．５μｇ／ｍｌの範囲のアムホテリシンＢ濃度に対して有意に減少した移動を示し（図２１～２２）、これはこの株のＭＩＣ値として報告されている０．３μｇ／ｍｌに対応している［２４］。
細胞がガラス表面と大きく相互作用し、このことが測定された変位に影響を与えているかどうかを評価するために、細胞を寄せ付けない表面（ＰＬＬ－ＰＥＧコーティングされたガラス表面）上での細胞のナノモーションを、処理していないガラス表面上でのものと比較した。カスポファンギンで処理したC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４及びＤＳＹ１０２４では、同等の結果が得られた（図２３）。ＰＬＬ－ＰＥＧをコーティングした表面上でのシリカビーズの移動を見ると、変位分布及び総変位量にわずかな影響があることがわかった（図１８Ａ～Ｄ）。カンジダ細胞をコンカナバリンＡでガラス表面に付着させると、変位は強く減少し、カスポファンギン処理した細胞とそうでない細胞との間に有意な差は検出されなかった（図１８Ｆ～Ｋ）。
生死の境目を分ける振動パターンの違いを明らかにするため、周波数領域での数値解析を行った（図７ａ～７ｄ）。各周波数領域は、低周波限界と高周波限界とによって特徴付けられる。現行の記録方法では、低周波限界は信号持続時間の逆数として決定され、これは１２秒間で０．０８３Ｈｚに相当する。高周波限界の計算はより複雑で、細胞ごとに異なる。我々は、高周波数限界を臨界周波数（ｆｃｒｉｔ）と名付け、その計算方法を考案した。これらの解析から、未処理の耐性C. albicans（カンジダ・アルビカンス）細胞は、fcritが０．７～１．５Ｈｚの範囲で変化する周波数範囲（０．０８３－ｆｃｒｉｔ）で最大の活性を示すことが明らかになった。興味深いことに、C. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４も、より高い周波数（２．５～３．０Ｈｚ）でｆｃｒｉｔを示した（図７Ｃ）。一方、カスポファンギン処理細胞は、ｆｃｒｉｔの幅が広がり、その幅は超感受性のＤＳＹ１０２４細胞で最も広がった（図７Ｄ）。この場合、２Ｈｚ付近にｆｃｒｉｔが追加されていることも確認された。これらの結果から、低濃度の抗真菌剤にさらされた瀕死の細胞は、細胞の振動周波数が増加することによって特徴付けられ、酵母の生細胞と死細胞との間の周波数領域における振動パターンの最大の違いは、超低周波領域にあることが明らかになった。
このデータ処理は、個々の酵母細胞を検出するディープラーニングアルゴリズムを用いることで、さらに高速化された（図３ｄ）。ディープラーニングモデルは、自動化された対象［２８，２９］や細胞の検出［３０，３１］タスクで広く成功している。手動で細胞を選択する場合と比較して、このアプローチでは、非常に多くの細胞（１００～１０００個）を自動的に解析することができる。開発したアルゴリズムは、中規模の浅いＹＯＬＯ［３０］アーキテクチャに基づいている。
今回、新たに開発されたＡＦＳＴのＯＮＭＤ法は、基本的な実験材料、すなわち光学顕微鏡、カメラ及びコンピュータを用いていた。この技術はラベルフリーで、生きたサンプルを基材上に付着させる必要がない。この技術は、多数の酵母種の抗真菌性及び代謝活性を迅速に測定することを可能にし、おそらく細菌などの他の微生物や哺乳類細胞にも拡張することができる。また、この技術により、生きた酵母細胞が４Ｈｚ未満の比較的低い周波数で振動していることも明らかであった。この方法は、単一の細胞だけでなく、細胞集団全体のナノモーションパターンも扱うことができる。ＯＮＭＤは、大きな集団の中の単一の耐性細胞を検出できる可能性を秘めている。現在のＯＮＭＤ法の限界は、ｘ－ｙ方向の移動しか記録されないことである。ｚ軸方向の移動も考慮することで、測定範囲を拡大することができ［１０］、本手法の感度をさらに高めることができる。
酵母の細胞ナノモーションを、その代謝活性と結びつけるために、栄養素があるときとないときの細胞のナノモーションを比較したり、最適な増殖温度で最大の細胞移動を検出したりすることもできる。生きた単一細胞のナノモーションは、ｘ－ｙ方向の変位グラフと１０００フレーム間の変位の分布とから明らかなように、非ランダムな挙動を示す。
アムホテリシンＢの濃度上昇がC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＤＳＹ２９４及びC. albicans（カンジダ・アルビカンス）ＣＡＦ２－１に影響を与えるナノモーション解析から見えてきたのは、単一細胞のフレームごとの変位の分布に基づく解析の方が、細胞集団全体の総変位基づく解析よりも感度が高いように思われることである。この抗真菌薬のＭＩＣと同程度に低い濃度の影響は、２０個の細胞集団で顕著になった。さらに、アムホテリシンＢの濃度がＭＩＣの１０倍程度になると、細胞ナノモーションが増大するという結果が得られた。これは、アムホテリシンＢの作用機序（細胞膜のエルゴステロールに選択的に結合し、細孔の形成を引き起こす［３２］）が細胞の移動を増加させること、すなわち、抗真菌作用が細胞の代謝活性を増加させることを示しており、おそらくこれは排出ポンプの活性が増加することに因るものと考えられる。また、細菌Bordetella pertussis（ボルデテラ・パーツシス）のナノモーション（ＡＦＭ－カンチレバー法で測定）が抗生物質に対して増加することが以前に観察されていた［３３］。
ナノモーションの周波数パターンを解析したところ，生きた酵母の単一細胞は、約２Ｈｚという比較的低い周波数で振動していることが明らかになった。これらの結果は、S. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）の細胞壁が０．８～１．６ｋＨｚの範囲で定期的に運動していることを強調したGimzewskiら［３４］が発表した結果を補完するものである。これらの測定は、フィルターの孔に機械的に捕捉された酵母細胞のＡＦＭにより行った。超音波加振と干渉計とによる移動の検出により、単一のS. cerevisiae（サッカロミセス・セレビシエ）細胞の共振周波数を３３０ｋＨｚの範囲で検出することができたが、これは細胞の剛体振動に相当するものである［３５］。このような高い周波数範囲は、我々の光学顕微鏡のセットアップでは測定できない。そのため、我々が観察した低周波の振動は、おそらく単一酵母細胞のボディ全体の変位に相当するものと思われる。今後、高速光学顕微鏡やＡＦＭに基づく測定を伴った実験を行うことで、細胞振動の全スペクトルが明らかとなり、細胞壁の低周波振動が寄与している可能性を示すことができるだろう。
観察された振動を引き起こす可能性のある分子プロセスは、まだ詳細には調査されていない。分子アクター（プロセス）を遮断したり活性化したりする実験を追加することで、観察された現象をより深く理解することができるだろう。ナノモーション信号は、エネルギー消費と局所的な移動又は分子の再分布を結びつける、多くの代謝関連のソースから生じる振動で構成されている［３６］。細胞ナノモーションは、ＤＮＡの複製、ＤＮＡの転写、タンパク質の組み立て、細胞骨格の再編成、イオンポンプの活動、オルガネラの輸送などのプロセスから生じる可能性がある。細胞骨格の関与は、骨芽細胞のアクチン細胞骨格をサイトカラシンで解重合することにより、（ＡＦＭカンチレバー法で測定した）細胞の移動が減少することで既に実証されている［９］。また、タンパク質の構造変化（ヒトのトポイソメラーゼＩＩで実証されたように［３７］）もナノモーションに寄与する可能性がある。
ディープラーニングアルゴリズムを用いて細胞認識を自動化することで、手動での細胞検出を回避し、解析対象となる細胞の数を増やし、処理時間を短縮することができた。さらに、これにより、より多くの細胞集団を解析する道が開かれた。今後の展開としては、専用のマイクロ流体チップの開発や、データ取得やデータ処理のステップをローエンドのコンピュータで実行するためのソフトウェアの最適化などが挙げられる。これらの開発により、最終的には、病院や発展途上国の遠隔地の医師の診療所でも直接使用できる、簡単に操作できるモバイル装置が実現する可能性があり、これにより、可能な限り初期の治療段階で抗真菌感受性試験を実施し、個別に効果的な抗真菌治療を行うための適切な判断を下すことができる。使用するソフトウェアは、ＹＯＬＯディープラーニングアーキテクチャの代わりにＭｏｂｉｌｅＮｅｔを使用することで、ローエンドコンピュータでデータ取得及び／又はデータ処理のステップを実行することができる。
上述の例では、菌株及び細胞の増殖は以下の通りであった：
すべての酵母株（表１）は、ＹＰＤ寒天（２０ｇ／ｌ）プレートからのコロニーをＹＰＤ（１０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌペプトン、２０ｇ／ｌデキストロース）培地１０ｍｌに接種することによって培養した。培養液をエルレンマイヤーフラスコ（３０℃及び２００ｒｐｍ）で一晩培養した。一晩培養したものを５ｍｌのＹＰＤ培地中で１０倍～２０倍に希釈してＯＤ６００ｎｍを０．５にした後、エルレンマイヤーフラスコ内で３０℃及び２００ｒｐｍで１時間増殖させた。その後、細胞濃度（ＯＤ６００ｎｍ値）に応じて培養液をさらに希釈し、可視化に最適な細胞数を得た。
本例では、光学ナノモーション実験を以下のように行った：
４ウェルのＦｕｌＴｒａｃマイクロインサート（Ibidi社製、ドイツ）を用いて、イメージングマイクロディッシュ（Ibidi社製、ドイツ）のマイクロウェルの１つに、各酵母細胞培養液を１０μｌずつ分注した。測定を開始する前に、酵母細胞を１０分間沈降させた。細胞の移動は、４０倍の対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ ＴＥ－２０００顕微鏡を用いて、ＥＭＣＣＤカメラ（Andor iXon, Oxford Instruments社製）により、８４ｆｐｓのフレームレートで１０００フレームの動画を撮影して観察した。ペトリ皿は、顕微鏡ステージトップインキュベーター（Ibidi社製、ドイツ）を用いて３０℃に保った。
エタノールが細胞の生存率に与える影響を、参照としてＹＰＤ培地中で増殖した細胞と比較した。そのため、まず細胞のナノモーションビデオを記録し、次に（約１分後）、２００μｌのエタノール（７０％ｖ／ｖ）を４つのマイクロインサートウェルのトップチャンバに加えた。カスポファンギン、アムホテリシンＢ及びフルコナゾールを抗真菌薬として、抗真菌薬感受性試験において、細胞生存率への影響を評価するために使用した。抗真菌薬による処理を開始する前に、ＹＰＤ培地中の酵母細胞の参照用（未処理）ビデオを録画した（時間＝０時間）。次いで（時間＝１分）、４つのマイクロウェルの上のチャンバ（２００μｌ）に、ある濃度の抗真菌薬２００μｌを加えた。測定は、５時間の間、１時間ごとに行った。生物学的参照粒子として、直径３μｍのシリカマイクロビーズ（単分散シリカ標準品、Whitehouse Scientific社）を使用した。ビーズはＹＰＤ培地に溶解し、測定は３０℃で行った。
温度が代謝に与える影響を評価する実験では、マイクロウェルの周囲を循環する水（循環式の水浴）の温度を調節することで、マイクロウェル内の温度を制御した。温度は１３℃～２０℃、２５℃、３０℃、最終的には３５℃へと段階的に変化させた。酵母細胞を各温度に２０分間順応させてから、細胞のナノモーションを測定した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水：８ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ、０．２０ｍｇ／ｍｌのＫＣｌ、１．４４ｍｇ／ｍｌのＮａ２ＨＰＯ４、０．２４ｍｇ／ｍｌのＫＨ２ＰＯ４）中の細胞活性をＹＰＤ培地と比較する実験では、一晩培養した細胞をＹＰＤ培地又はＰＢＳのいずれかで１０００倍に希釈し、直ちにマイクロウェルに分注した。ガラス表面処理の実験では、コンカナバリンＡ（２ｍｇ／ｍｌ、Sigma社製）又はＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧ（０．１ｍｇ／ｍｌ、SuSoS AG社製、スイス）をガラス表面にコーティングし、このガラス表面をコーティング液と３０分間インキュベートした。
本例で使用したナノモーション検出ソフトウェアは以下の通りであった：
光学ナノモーション検出アルゴリズムは、各フレームのセルの変位を計算し、追跡したセルの軌跡とともに、変位の二乗平均値もＭＳ Ｅｘｃｅｌファイルに保存する。このプログラムの主要部分は、Guizar-Sicairosら［１４］のアルゴリズムに基づいており、オープンソースの画像処理ライブラリｓｃｉ－ｋｉｔ ｉｍａｇｅ［３８］でＭａｔｌａｂからＰｙｔｈｏｎに移植されている。ＮＤ２ Ｎｉｋｏｎフォーマットの動画を取り込むために、Ｐｙｔｈｏｎパッケージｎｄ２ ｒｅａｄｅｒ（Verweij R, Online: http://www.lighthacking.nl/nd2reader/）を用いた。
使用したディープラーニング細胞検出アルゴリズムは以下の通りである：
先に説明したナノモーション解析は、個々の細胞の位置から始まるが、これは現在、最初のビデオフレーム内の細胞のバウンディングボックスを手動で選択することで提供されている。しかしながら、特にＭＩＣや異なる温度条件の影響を決定する場合、ビデオの数やビデオ内に存在する細胞の数がかなり多くなる可能性がある。さらに重要なことは、最初のビデオフレームのみではなく、数フレームごとに細胞の検出を行うことで、初期位置から離れてしまった細胞の位置を修正することができることである。このような場合、手動での検出作業はマルチフレームのアノテーションに数時間を要するため、細胞の自動検出プロセスに置き換える必要がある。そのため、ディープラーニングアルゴリズム、すなわち中規模のＹＯＬＯアーキテクチャを用いて、セルの検出を自動化することにした。学習プロセスは、ランダムに生成された５０，０００枚の合成細胞画像セットを用いて行われる。これらの合成画像は、我々が以前に提案した位相差イメージングモデル［３９］を用いて得られたもので、細胞の分布、照明及びイメージングアーチファクトなどの点で、顕微鏡で得られた細胞画像と非常によく似ている。ＹＯＬＯモデルを学習させた後、このモデルを使って実際の顕微鏡画像内の細胞を自動的に検出し、各検出結果を初期位置として、前述の相互相関アルゴリズムを使って光学ナノモーションを計算する。全体的な処理パイプラインは、大量のビデオシーケンスから始まり、フレームごとに自動化された単一細胞の検出を行う。次に、連続したフレーム間の急激な変化を補正するために、フレーム間の細胞の位置と検出信頼度とを平均化することで、結果を精緻化する。最後に、高い信頼度（すなわち０．６超）で検出された細胞の位置が、ナノモーション解析アルゴリズムの入力として提供される（図３ｄ）。
プロセスの更なる自動化は以下の通りであった：
全体的なプロセスは、一連のフレームを、細胞を含む画像として読み込み、１０フレームごとに上述の細胞検出プロセスを適用して、自動的に検出された個々の細胞の位置を示すバウンディングボックスのセットを得ることである。それらの位置に基づいて、ビデオ解析処理の展開に合わせて時間的に細胞を追跡する。最後に、サブシーケンスリファインメントの段階で、バウンディングボックスで示された細胞の輪郭を見つけて、その中心がバウンディングボックスのそれとほぼ一致することを確認し、次いで、不一致があれば、細胞の検出信頼度に比例してペナルティを課す。さらに、バウンディングボックスの位置と検出信頼度とをフレーム間で平均化することで、セルの検出位置の急激な変化を防ぐ。
光学的に記録された細胞移動の周波数領域と臨界周波数との計算は以下の通りであった：
光学的に記録された酵母の細胞移動の周波数領域と臨界周波数とを計算するために、水平方向（ｘ）と垂直方向（ｙ）との２つの細胞移動の信号に対して算出されたＦＦＴ振幅スペクトルの計算に基づく手法を開発した。この方法をDouble Region Interpolation Method（ＤＲＩＭ）と名付けた。考え方としては、平均化された振幅に対して、２つの異なる周波数領域で２つの線形補間を行う。１つは、細胞の活動領域から十分に離れた、スペクトルの広帯域ノイズ部分で行う（例：５～１０Ｈｚ）。もう１つは、細胞が活動している低周波領域で行う。この２本の直線の交点が、細胞活性領域の上限臨界周波数を決定する。
細胞移動の周波数範囲を決定するための手法は、水平方向（ｘ）と、他方で垂直方向（ｙ）との移動について得られた２つの離調信号にＦＦＴアルゴリズムを直接適用することに基づいている。ｘとｙとの両方のスペクトルは類似したプロファイルを有しているが、一部の振幅はわずかに異なっていた。そのため、両方向の細胞の移動の周波数を均等に取り込むために、周波数ごとの平均値を求めた。信号は８３フレーム／秒のサンプリング周波数で記録されていたので、４１Ｈｚまでの周波数を目視で確認したところ、細胞の移動は数Ｈｚに限られていることが確認できた（図７ａの挿入図）。各信号には１０００個のサンプル（１２．０４８２秒の時間）が含まれているため、各ＦＦＴスペクトルは最初の１２秒から取られ、その結果、周波数分解能は０．０８３Ｈｚとなった。この分解能を維持するために、各１２秒の信号全体にＦＦＴを適用し、短い移動窓を作らないようにした。細胞の移動の周波数範囲を決定する作業は、その上限と下限との両方の臨界周波数を評価することを意味する。
図２４は、相互相関プログラム、特に相互相関アルゴリズムによって解析される個々の細胞を手動で選択する様子を示している。２つのボックスが、細胞の少なくとも一部を囲むように配置されている。ボックス１（白矢印）はｘ軸のシフト追跡に、ボックス２（黒矢印）はｙ軸のシフト追跡に使用される。
データの入手状況は以下の通りであった：
本論文内のプロットや本研究の他の知見を裏付けるデータは、要請に応じて対応する著者から入手可能である。
Figure 2022534866000001
本研究で使用した酵母の菌株
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Claims (45)

  1. 粒子特性を導出する方法であって、前記方法が、
    － 液体環境における少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動を、少なくとも１つの瞬間にイメージングすることと、
    － 前記イメージングされた液体環境における前記自由浮遊粒子の移動に基づいて、少なくとも１つの移動パラメータを、少なくとも１つの瞬間に決定することと、
    － 前記少なくとも１つの移動パラメータから、前記少なくとも１つの粒子の少なくとも１つの特性を導出することと
    を含む、方法。
  2. 前記少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動を時間の関数としてイメージングし、前記移動パラメータを時間の関数として決定する、請求項１記載の方法。
  3. 前記方法が、
    － 少なくとも２つの瞬間に、前記少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動をイメージングし、それによって少なくとも第１のイメージングされた移動と第２のイメージングされた移動とを得ることと、
    － 前記第１のイメージングされた移動と前記第２のイメージングされた移動との間の変化を決定することであって、前記変化が前記移動パラメータを示している、ことと
    を含む、請求項１又は２記載の方法。
  4. 前記変化が、前記自由浮遊粒子の空間変位、及び／又は、前記自由浮遊粒子の前記空間変位に関連する速度、及び／又は、前記自由浮遊粒子の前記空間変位に関連する加速度、及び／又は、前記自由浮遊粒子の前記空間変位の分布、及び／又は、前記自由浮遊粒子の前記空間変位に関連する前記速度の分布、及び／又は、前記自由浮遊粒子の前記空間変位に関連する前記加速度の分布に対応する、請求項３記載の方法。
  5. 前記空間変位、及び／又は、前記空間変位に関連する前記速度、及び／又は、前記空間変位に関連する前記加速度、及び／又は、前記空間変位の前記分布、及び／又は、前記空間変位に関連する前記速度の前記分布、及び／又は、前記空間変位に関連する前記加速度の前記分布を、時間の関数として決定する、請求項４記載の方法。
  6. 前記空間変位を、少なくとも１つの空間方向に関して決定し、前記空間変位を、好ましくは２つ以上の空間方向に関して決定し、前記２つ以上の空間方向は、好ましくは互いに垂直に延びている、請求項４又は５記載の方法。
  7. 前記空間変位の量を測定し、
    前記量から前記粒子の特性を導出し、及び／又は、前記空間変位の量を一定期間内に決定する、請求項４～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 前記空間変位を、前記空間変位に関連する１つ以上の周波数を得るために、空間周波数変換し、前記１つ以上の周波数から前記粒子の特性を導出する、請求項４～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 前記空間変位が、前記自由浮遊粒子の並進、及び／又は、前記自由浮遊粒子の回転、及び／又は、前記自由浮遊粒子の変形に対応する、請求項４～８のいずれか１項記載の方法。
  10. 前記自由浮遊粒子全体の空間変位、又は、前記自由浮遊粒子の少なくとも１つの部分の空間変位を決定し、
    前記自由浮遊粒子全体の前記空間変位を、好ましくは、前記粒子の質量中心の前記空間変位から決定し、及び／又は、
    前記自由浮遊粒子の少なくとも１つの部分の前記空間変位を、好ましくは、前記粒子の形状の変更から決定する、請求項４～９のいずれか１項記載の方法。
  11. 前記空間変位を、相互相関アルゴリズムを用いて決定する、請求項４～１０のいずれか１項記載の方法。
  12. 前記移動パラメータを、単一粒子のイメージングされた移動から決定するか、又は
    前記移動パラメータを、２つ以上の、好ましくは複数の粒子のイメージングされた移動から決定する、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 前記移動パラメータの決定のために１つ以上の粒子を選択することをさらに含み、前記選択は、手動選択及び／又は自動選択に対応し、前記自動選択は、好ましくは、１つ以上のモルフォロジー演算子及び／又はハフ変換及び／又はニューロンネットワーク及び／又はディープラーニング技術を適用して行う、請求項１～１２のいずれか１項記載の方法。
  14. 前記少なくとも１つの自由浮遊粒子を、静止した液体環境及び／又は流動する液体環境に提供し、及び／又は、
    前記液体環境を強制対流に供し、及び／又は、
    前記液体環境を、チャンバ又はリザーバ又はチャネルなどの制限要素、好ましくはマイクロ流体デバイスのチャネルに提供するか、又は、液体環境を無制限に提供する、請求項１～１３のいずれか１項記載の方法。
  15. 前記少なくとも１つの自由浮遊粒子を、１つ以上の化学的刺激及び／又は１つ以上の物理的刺激に供し、前記１つ以上の化学的刺激及び／又は物理的刺激の作用前及び／又は作用中及び／又は作用後に、前記少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動をイメージングする、請求項１～１４のいずれか１項記載の方法。
  16. １つ以上の化合物を前記液体環境に添加し、前記１つ以上の化合物が前記少なくとも１つの自由浮遊粒子に与える影響を、前記移動パラメータから導出する、請求項１～１５のいずれか１項記載の方法。
  17. 前記１つ以上の化合物が前記液体環境と本質的に非混和性であり、及び／又は、
    前記１つ以上の化合物を１つ以上の更なる化合物に提供し、前記１つ以上の更なる化合物は、好ましくは、前記液体環境と本質的に非混和性であり、及び／又は、
    前記１つ以上の化合物が抗生物質又は抗真菌薬などの１つ以上の薬剤に対応する、請求項１６記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動を少なくとも１つの光学センサでイメージングし、前記光学センサは、好ましくはＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラである、請求項１～１７のいずれか１項記載の方法。
  19. 前記少なくとも１つの光学センサが、１マイクロ秒以上、好ましくは１秒以上、より好ましくは１０秒以上、特に好ましくは５０秒以上のフレームレートで、前記少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動をイメージングし、及び／又は、
    前記少なくとも１つの光学センサが、前記少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動をサブピクセルの解像度でイメージングする、請求項１８記載の方法。
  20. 前記少なくとも１つの光学センサが、前記少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動のイメージング中に静止しているか、又は、前記少なくとも１つの光学センサが、前記少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動のイメージング中に移動している、請求項１８又は１９記載の方法。
  21. 前記少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動を、顕微鏡などの少なくとも１つの拡大装置によって拡大しながらイメージングする、請求項１～２０のいずれか１項記載の方法。
  22. 前記液体環境を前記少なくとも１つの光学センサ上に直接配置する、請求項１８～２１のいずれか１項記載の方法。
  23. 前記移動パラメータを、前記粒子の移動がイメージングされている間、及び／又は、前記粒子の移動がイメージングされた後に決定し、及び／又は、
    前記粒子の特性を、前記粒子の移動がイメージングされている間、及び／又は、前記粒子の移動がイメージングされた後に、前記移動パラメータから導出する、請求項１～２２のいずれか１項記載の方法。
  24. 前記方法が、
    － 液体環境における少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動を、少なくとも複数の瞬間にイメージングすることと、
    － 前記複数の瞬間のそれぞれについて、前記イメージングされた自由浮遊粒子の移動に基づいて移動パラメータを決定することと、
    － 前記異なる移動パラメータから、少なくとも１つの粒子の特性を導出することと
    を含む、請求項１～２３のいずれか１項記載の方法。
  25. 前記方法が、複数の瞬間において、所定の期間にわたって映像を記録することにより、少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動をイメージングすることを含む、請求項２４記載の方法。
  26. 前記少なくとも１つの自由浮遊粒子が、物体の表面又はより大きな粒子の表面に結合していない粒子である、請求項１～２５のいずれか１項記載の方法。
  27. 前記移動が振動であり、前記移動パラメータが振動による移動パラメータであり、及び／又は、
    前記方法が、異なる画像を登録することを含む、請求項１～２６のいずれか１項記載の方法。
  28. 前記イメージングが、前記少なくとも１つの粒子の移動を光学的に記録することを含み、及び／又は、
    前記イメージングが、光学系及びカメラを用いて光学的に記録することを含み、及び／又は、
    前記イメージングが、所定の期間にわたって前記粒子の動画を記録することを含む、請求項１～２７のいずれか１項記載の方法。
  29. 前記方法が、ニューラルネットワークを使用すること、及び／又は、ディープラーニング技術を使用することを含み、及び／又は、
    前記方法が、トレーニングされたモデルを用いて少なくとも１つの粒子を検出することを含み、好ましくは、前記方法は、トレーニングされたモデルを用いて前記少なくとも１つの粒子の検出を精密化することを含む、請求項１～２８のいずれか１項記載の方法。
  30. 前記少なくとも１つの粒子が複数の粒子を含む、請求項１～２９のいずれか１項記載の方法。
  31. 前記液体環境が、前記粒子の移動が対流によって妨げられない拡散環境であり、及び／又は、
    前記液体環境が、自然流体、例えば生物学的流体、好ましくは尿、脳脊髄液、痰、又は血液であり、及び／又は、
    前記液体環境が人工流体である、請求項１～３０のいずれか１項記載の方法。
  32. 前記少なくとも１つの粒子の特性が、前記少なくとも１つの粒子の生存率又は代謝活性又は代謝活性のレベル又は代謝状態又は活力又は感度又は耐性である、請求項１～３１のいずれか１項記載の方法。
  33. 前記移動パラメータから前記少なくとも１つの粒子の特性を導出することが、前記粒子の移動量、特に並進量及び／又は回転量及び／又は変形量が、前記少なくとも１つの粒子の生存率及び／又は代謝活性及び／又は代謝活性のレベル及び／又は活力及び／又は感度及び／又は耐性に比例することを考慮に入れることを含む、請求項１～３２のいずれか１項記載の方法。
  34. 前記少なくとも１つの粒子の全体の移動を決定し、及び／又は、
    前記方法が、前記少なくとも１つの粒子のＸ方向の移動及び／又はＹ方向の移動及び／又はＺ方向の移動及び／又はＸ，Ｙ方向の移動及び／又はＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動を導出することを含み、及び／又は、
    前記方法が、前記少なくとも１つの粒子の粒子活性及び／又は生存率及び／又は代謝活性及び／又は代謝活性のレベル及び／又は代謝状態及び／又は活力及び／又は感受性及び／又は耐性を導出することを含む、請求項１～３３のいずれか１項記載の方法。
  35. 前記少なくとも１つの粒子が、少なくとも１つの細胞、特に原核細胞及び／又は真核細胞及び／又は運動性細胞及び／又は非運動性細胞及び／又は少なくとも１つのオルガネラであり、好ましくは、前記少なくとも１つの粒子が、細菌細胞、真菌細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、ミトコンドリア及び核のうちの少なくとも１つである、請求項１～３４のいずれか１項記載の方法。
  36. 前記方法が、ナノモーションの解析に基づいて相互相関を行うことを含み、及び／又は、
    前記解析が、前記粒子全体の移動を決定すること、粒子壁の変位を決定すること、及びオルガネラの変位を決定することのいずれか又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～３５のいずれか１項記載の方法。
  37. コンピュータプログラム製品であって、前記プログラムがコンピュータシステムによって実行されると、前記コンピュータシステムに請求項１～３６のいずれか１項記載の方法を実行させる命令を含む、前記コンピュータプログラム製品。
  38. コンピュータ可読媒体であって、コンピュータシステムによって実行されると、前記コンピュータシステムに請求項１～３６のいずれか１項記載の方法を実行させる命令を含む、前記コンピュータ可読媒体。
  39. 粒子特性を導出するためのプロセッサであって、前記プロセッサは、
    － 液体環境における少なくとも１つの自由浮遊粒子の、少なくとも１つの瞬間にイメージングされた移動を得るための入力手段と、
    － 前記液体環境における前記自由浮遊粒子のイメージングされた移動に基づいて、少なくとも１つの瞬間に少なくとも１つの移動パラメータを決定し、前記少なくとも１つの移動パラメータから、前記少なくとも１つの粒子の少なくとも１つの特性を導出するためのプロセッサと
    を含む、前記プロセッサ。
  40. 前記プロセッサが、請求項１～３６のいずれか１項記載の方法を実行するように構成されている、請求項３９記載のプロセッサ。
  41. 粒子特性を導出するためのシステムであって、前記システムは、
    － 液体環境における少なくとも１つの自由浮遊粒子の移動を少なくとも１つの瞬間にイメージングするための、少なくとも１つの光学センサ、好ましくはカメラを含む光学系と、
    － 請求項３９又は４０記載のプロセッサと
    を含む、前記システム。
  42. 抗生物質感受性試験のための、請求項４１記載のシステムの使用。
  43. 抗真菌薬感受性試験のための、請求項４１記載のシステムの使用。
  44. 細胞の生存率の特性評価及び／又は代謝のモニタリングのための、請求項４１記載のシステムの使用。
  45. 診断及び／又は薬物スクリーニング及び／又は抗有糸分裂性薬剤感受性試験のための、請求項４１記載のシステムの使用。
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