JP2022535648A - ゲンチオオリゴ糖の製造における耐熱性β－グルコシダーゼの使用 - Google Patents
ゲンチオオリゴ糖の製造における耐熱性β－グルコシダーゼの使用 Download PDFInfo
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Abstract
ゲンチオオリゴ糖の製造における耐熱性β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌの使用。該耐熱性β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ．ＫＯＬ６に由来し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＳＨＩ Ｉを発現宿主とすることにより、枯草菌におけるｔｓｂｇｌ遺伝子の高効率発現を実現する。前記β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌは、最適温度が９０℃、最適ｐＨが６．０であり、９０℃では高い熱安定性を有する。１２００ｇ／Ｌグルコースを基質とする反応系に前記β－グルコシダーゼを添加して、ｐＨ６．０、９０℃で酵素反応を行うと、ゲンチオオリゴ糖の収率は１７８．２ｇ／Ｌに達する。この酵素は、食品などの産業への利用に適しており、ゲンチオオリゴ糖の工業的生産に適用できる。
【選択図】図７
【選択図】図７
Description
本発明は、ゲンチオオリゴ糖の製造における耐熱性β－グルコシダーゼの使用に関し、遺伝子工学及び酵素工学の分野に属する。
β－グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）は非還元末端のβ－Ｄ－グルコシド結合を特異的に加水分解してグルコースと対応する配位基を放出し得るグルコシド加水分解酵素（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｓｅ、ＧＨ）である。β－グルコシダーゼは生体内に広く存在し、重要な作用を発揮し、そのアミノ酸配列の特徴の違いにより、主にＧＨ１、ＧＨ３、ＧＨ５、ＧＨ９、ＧＨ３０及びＧＨ１１６の６つのファミリーに分布し、その中のほとんどのβ－グルコシダーゼはＧＨ１、ＧＨ３ファミリーに属する。ＧＨ１とＧＨ３ファミリーのβ－グルコシダーゼは、タンパク質フォールディング、理化学的性質、触媒特性や基質特異性などに差異がある。β－グルコシダーゼは様々な業界に適用でき、例えば、バイオエタノール業界でセロビオースを分解して、生成物の阻害作用を除去したり、加水分解果汁中の風味前駆体である配糖体の呈味増強剤として機能したり、一部のβ－グルコシダーゼは配糖体転化能を有するため一定の合成活性を有しており、従来の化学的方法の代わりとして希少オリゴ糖やアルキルグリコシドなどを合成して食品や化粧品工業に適用でき、その中でも、β－グルコシダーゼにより産生されるゲンチオオリゴ糖は人体の腸内プロバイオティクスの成長を誘導することができ、人体に有益である。
ゲンチオオリゴ糖は、２つ以上のβ－１．６－グルコシド結合により連結されるグルコースからなり、ゲンチオビオースと少量のゲンチオトリオースとゲンチオテトラオースを主成分とする新規機能性オリゴ糖である。ゲンチオオリゴ糖はカロリーが低く、食品に使用するとう虫歯のリスクが低く、また、腫瘍を抑制したり、栄養吸収や代謝などを促進したりする機能もある。
ゲンチオオリゴ糖の製造方法は多く、初期の研究では、リンドウ属植物の根、茎から抽出するが、還元ビターアーモンドベンゼン法と酸法を利用してデンプンを加水分解した後、その副産物から精製して獲得することもでき、しかし、原料、市場価格などの制限により、その工業化生産が困難になっている。酵素法による製造は、現在、ゲンチオオリゴ糖の工業的生産の主要な手段であり、その常用の反応条件は、低水分活性、高基質濃度下で、β－グルコシダーゼの配糖体転化活性を利用してゲンチオオリゴ糖を合成することであり、得られたゲンチオオリゴ糖の収率はいずれも低く、ほぼ５０ｇ／Ｌであり、転化率は８％程度である。ゲンチオオリゴ糖の収率に影響する２つの重要な要素は反応温度と酵素の配糖体転化活性である。ゲンチオオリゴ糖の収率は温度が高くなるにつれて増加し、その主な理由は、基質であるブドウ糖が高い温度で溶解度が増加し、且つ、受容体である水分子もそれに応じて減少し、それにより、配糖体転化反応の発生を促進し、ゲンチオオリゴ糖の蓄積量を増加させ、同時に高温でも雑菌汚染を防止できることであり、工業的生産の観点から、長時間運転の連続生産系では、酵素の不活性化現象がより顕著になり、生産に深刻な影響を与える。したがって、高温に自然に耐えるβ－グルコシダーゼは工業的生産に非常に重要である。また、現在、ほとんどの研究では、ゲンチオオリゴ糖の製造には主にＧＨ３ファミリーのβ－グルコシダーゼが使用されているが、ＧＨ１ファミリーのβ－グルコシダーゼに対する研究は非常に少なく、ゲンチオオリゴ糖の製造におけるＧＨ１ファミリーのβ－グルコシダーゼの使用はまだ開発されていない。
本発明は、ヌクレオチド配列が配列番号１で示されるβ－グルコシダーゼＴＳＢＧｌをコードする遺伝子を提供する。
本発明の一実施形態においては、前記β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌのアミノ酸配列は配列番号２で示される。
本発明は、β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌをコードする遺伝子を運ぶベクターを提供する。
本発明の一実施形態においては、前記ベクターの出発ベクターは発現ベクターｐＢＳＭμＬ３であり、ベクター配列は公開番号ＣＮ１０７０５８２０５Ａの特許に記載されている。
本発明は、枯草菌を発現宿主として、アミノ酸配列が配列番号２で示されるβ－グルコシダーゼＴＳＢＧｌを発現する組換え菌を提供する。
本発明の一実施形態においては、前記枯草菌は公開番号ＣＮ１０８１０２９９７Ａの特許に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＳＨ１１である。
本発明はβ－グルコシダーゼの生産方法を提供し、前記方法の具体的なステップは以下のとおりである。
（１）前記組換え菌を３５～４０℃で２～５時間培養して、菌液を得る。
（２）菌液を２５００～３５００ｒｐｍで３～６分遠心分離して、６０～９０体積％の上清を除去し、残りの１０～４０体積％の上清をＬＢプレートに塗布し、３５～４０℃のインキュベータで１０～１６時間培養する。
（３）ＬＢプレートから単一コロニーをＬＢ液体培地に採取して７～１１時間培養した後、２～６ｍＬの培養液を１００ｍＬ ＴＢ培地に播種し、３５～４０℃で１．５～３時間培養し、さらに３０～３４℃で４５～５０時間培養する。
（４）培養終了後、培養して得た菌液を７０００～９０００ｒｐｍで１５～２５分遠心分離し、菌体を収集する。
（５）菌体に４５～５５ｍＬのクエン酸－リン酸二ナトリウム緩衝液を加えて、菌体を再懸濁する。
（６）高圧ホモジナイザーを用いて細胞壁を破壊し、９０００～１２０００ｒｐｍで１５～２５分遠心分離した後、細胞壁破壊上清液である粗酵素液を収集する。
（１）前記組換え菌を３５～４０℃で２～５時間培養して、菌液を得る。
（２）菌液を２５００～３５００ｒｐｍで３～６分遠心分離して、６０～９０体積％の上清を除去し、残りの１０～４０体積％の上清をＬＢプレートに塗布し、３５～４０℃のインキュベータで１０～１６時間培養する。
（３）ＬＢプレートから単一コロニーをＬＢ液体培地に採取して７～１１時間培養した後、２～６ｍＬの培養液を１００ｍＬ ＴＢ培地に播種し、３５～４０℃で１．５～３時間培養し、さらに３０～３４℃で４５～５０時間培養する。
（４）培養終了後、培養して得た菌液を７０００～９０００ｒｐｍで１５～２５分遠心分離し、菌体を収集する。
（５）菌体に４５～５５ｍＬのクエン酸－リン酸二ナトリウム緩衝液を加えて、菌体を再懸濁する。
（６）高圧ホモジナイザーを用いて細胞壁を破壊し、９０００～１２０００ｒｐｍで１５～２５分遠心分離した後、細胞壁破壊上清液である粗酵素液を収集する。
本発明の一実施形態においては、ステップ（２）及び（３）培地中、５～１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンが含有される。
本発明の一実施形態においては、ステップ（５）では、クエン酸－リン酸二ナトリウム緩衝液の濃度は４０～６０ｍＭ、ｐＨは５．０～７．０である。
本発明はゲンチオオリゴ糖の収率向上方法を提供し、前記方法は、前記組換え菌を発酵して得たβ－グルコシダーゼを、グルコースを基質とした系にて反応させて反応液を得、反応液を精製してゲンチオオリゴ糖を得ることである。
本発明の一実施形態においては、前記β－グルコシダーゼの添加量は３００～７００Ｕ／ｇである。
本発明の一実施形態においては、前記β－グルコシダーゼの添加量は４００～６００Ｕ／ｇである。
本発明の一実施形態においては、前記グルコースの濃度は８００～１５００ｇ／Ｌである。
本発明の一実施形態においては、前記グルコースの濃度は１０００～１３００ｇ／Ｌである。
本発明の一実施形態においては、前記方法は、６０～１００℃で２０～３０時間反応させることである。
本発明の一実施形態においては、前記方法は、８０～１００℃で２２～２５時間反応させることである。
本発明は、また、食品及び化粧品の分野でのゲンチオオリゴ糖の製造における前記遺伝子の使用を保護する。
本発明は、また、食品及び化粧品の分野でのゲンチオオリゴ糖含有製品の製造における前記ベクターｐＢＳＭμＬ３－ｔｓｂｇｌの使用を保護する。
本発明は、また、食品及び化粧品の分野でのゲンチオオリゴ糖含有製品の製造における前記β－グルコシダーゼの生産方法の使用を保護する。
本発明は、また、食品及び化粧品の分野でのゲンチオオリゴ糖含有製品の製造における前記ゲンチオオリゴ糖の収率向上方法の使用を保護する。
本発明は、また、食品及び化粧品の分野でのゲンチオオリゴ糖の製造における前記組換え菌の使用を保護する。
本発明の有益な效果は以下のとおりである。本発明は、β－グルコシダーゼの高効率発現方法を提供する。化学法によりＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ． ＫＯＬ６に由来するβ－グルコシダーゼＴＳＢＧｌをコードするヌクレオチド配列を合成し、シャトルプラスミドｐＢＳＭμＬ３を発現ベクター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＳＨ１１を発現宿主とすることによって、枯草菌におけるｔｓｂｇｌ遺伝子の高効率発現を可能とし、β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌは、最適温度が９０～１００℃、最適ｐＨが６．０であり、９０℃では高い熱安定性を有する。β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌは、グルコースを利用して転化しゲンチオオリゴ糖を生成することができ、特に１２００ｇ／Ｌグルコースという高濃度条件下でグルコースを利用して生産することができ、この場合、ゲンチオオリゴ糖の収率は１７８．２ｇ／Ｌに達し、β－グルコシダーゼ法によりゲンチオオリゴ糖を合成する場合の最高収率である。したがって、この酵素は食品、医薬などの産業への利用に適しており、ゲンチオオリゴ糖の工業的生産に適用できる。
β－グルコシダーゼの酵素活性の分析：
（１）酵素活性単位の定義：１ｍｌの酵素液がｐＮＰＧを１分加水分解して１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを生成する酵素活性を１酵素活性単位とする。
相対酵素活性の計算方法：酵素活性＝（Ａ４０５＋０．００２）＊反応系＊希釈倍数／（０．００７４＊反応時間＊酵素添加量）。
（２）酵素活性の測定ステップ
反応系を１ｍＬとして、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液９６０μＬに、適切に希釈した（好ましくは、反応停止時の反応液の４０５ｎｍ吸光度が０．２～１．２の範囲である）粗酵素液２０μＬを加え、次に１００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＮＰＧを２０μＬ加え、６０℃の恒温ウォーターバスにて１０分反応させ、１０分後、直ぐ１ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３溶液２００μＬを加えて反応を停止し、氷浴で５分処理し、４０５ｎｍで光吸収値を測定する。加熱により不活化した酵素液を同様な方法で処理してブランクコントロールとする。
ＬＢ培地：酵母粉５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ。
ＴＢ培地：酵母粉２４ｇ／Ｌ、グリセリン５ｇ／Ｌ、トリプトン１２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １６．４３ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２．３１ｇ／Ｌ。
ＲＭ培地：酵母エキス５．０ｇ／Ｌ、トリプトン１０．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０．０ｇ／Ｌ、ソルビトール９０．０ｇ／Ｌ、マンニトール７０．０ｇ／Ｌ。
（１）酵素活性単位の定義：１ｍｌの酵素液がｐＮＰＧを１分加水分解して１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを生成する酵素活性を１酵素活性単位とする。
相対酵素活性の計算方法：酵素活性＝（Ａ４０５＋０．００２）＊反応系＊希釈倍数／（０．００７４＊反応時間＊酵素添加量）。
（２）酵素活性の測定ステップ
反応系を１ｍＬとして、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液９６０μＬに、適切に希釈した（好ましくは、反応停止時の反応液の４０５ｎｍ吸光度が０．２～１．２の範囲である）粗酵素液２０μＬを加え、次に１００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＮＰＧを２０μＬ加え、６０℃の恒温ウォーターバスにて１０分反応させ、１０分後、直ぐ１ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３溶液２００μＬを加えて反応を停止し、氷浴で５分処理し、４０５ｎｍで光吸収値を測定する。加熱により不活化した酵素液を同様な方法で処理してブランクコントロールとする。
ＬＢ培地：酵母粉５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ。
ＴＢ培地：酵母粉２４ｇ／Ｌ、グリセリン５ｇ／Ｌ、トリプトン１２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １６．４３ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２．３１ｇ／Ｌ。
ＲＭ培地：酵母エキス５．０ｇ／Ｌ、トリプトン１０．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０．０ｇ／Ｌ、ソルビトール９０．０ｇ／Ｌ、マンニトール７０．０ｇ／Ｌ。
β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌの精製：
（１）組換え菌の細胞壁破壊上清液５００ｍＬに３５％の固体硫酸アンモニウム５０ｍＬを加えて一晩（１２時間）塩析する。
（２）塩析後の粗酵素液を４℃、１００００ｒｐｍで２０分遠心分離し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾールを含有するｐＨ７．４の緩衝液Ａで沈殿を溶解し、緩衝液Ａにて一晩（１２時間）透析した後、０．２２μｍ膜でろ過し、注入（充填）サンプルとする。
（３）Ｎｉアフィニティーカラムを緩衝液Ａで平衡化した後、注入サンプルをＮｉカラムに吸い込み、完全に吸着した後、緩衝液Ａを１００ｍＬ、２０～４８０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液Ａを１００ｍＬ、４８０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液Ａを１００ｍＬのそれぞれを用いて、流速１ｍＬ／分で溶出することで、４８０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液Ａで目的蛋白であるβ－グルコシダーゼを溶出し、この画分の溶出液を収集する。
（４）上述４８０ｍＭイミダゾールを含有する蛋白溶出液をｐＨ６．０、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液にて一晩透析して、精製したβ－グルコシダーゼの酵素製品を得る。
（５）精製後の組換えβ－グルコシダーゼを電気泳動する。精製後の電気泳動図を図２に示す。
（１）組換え菌の細胞壁破壊上清液５００ｍＬに３５％の固体硫酸アンモニウム５０ｍＬを加えて一晩（１２時間）塩析する。
（２）塩析後の粗酵素液を４℃、１００００ｒｐｍで２０分遠心分離し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾールを含有するｐＨ７．４の緩衝液Ａで沈殿を溶解し、緩衝液Ａにて一晩（１２時間）透析した後、０．２２μｍ膜でろ過し、注入（充填）サンプルとする。
（３）Ｎｉアフィニティーカラムを緩衝液Ａで平衡化した後、注入サンプルをＮｉカラムに吸い込み、完全に吸着した後、緩衝液Ａを１００ｍＬ、２０～４８０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液Ａを１００ｍＬ、４８０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液Ａを１００ｍＬのそれぞれを用いて、流速１ｍＬ／分で溶出することで、４８０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液Ａで目的蛋白であるβ－グルコシダーゼを溶出し、この画分の溶出液を収集する。
（４）上述４８０ｍＭイミダゾールを含有する蛋白溶出液をｐＨ６．０、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液にて一晩透析して、精製したβ－グルコシダーゼの酵素製品を得る。
（５）精製後の組換えβ－グルコシダーゼを電気泳動する。精製後の電気泳動図を図２に示す。
実施例１：ｔｓｂｇｌ遺伝子含有発現ベクターの構築
Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおけるサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ ＫＯＬ６）β－グルコシダーゼＴｓｂｇｌのアミノ酸配列（ＷＰ＿１０１５１０３５８）に従って、ヌクレオチド配列が配列番号１で示される遺伝子を化学的に合成した。
合成した遺伝子断片とｐＥＴ－２４ａを酵素消化後（酵素消化部位：Ｎｄｅ ＩとＥｃｏＲ Ｉ）、連結して連結産物を得て、連結産物を熱ショック形質転換法により大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ．ＪＭ１０９に形質転換した。形質転換産物を得て、形質転換産物をＬＢ固体培地（０．０５ｍｇ／ｍＬカナマイシン含有）に塗布し、３７℃の恒温インキュベータで８～１２時間倒置培養し、形質転換体を得た。
熱ショック形質転換法：
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ．ＪＭ１０９コンピテント細胞を氷に５分放置しておき、コンピテント細胞が完全に溶けた後、完全なプラスミド又はＰＣＲ産物を１０μＬ加え、優しくピペッティングして均一にした後、氷に４５分放置した。
（２）コンピテント細胞を４２℃の水浴鍋に入れて９０秒熱ショックし、熱ショック終了後、氷に５分放置した。
（３）氷浴終了後、コンピテント細胞にＬＢ液体培地０．８ｍＬを加え、均一に混合した後、３７℃のシェーカーに入れて約６０分振とう培養した。
（４）培養が終了したコンピテント細胞を３０００ｒｐｍで５分遠心分離し、一部の上清液を捨てて、２００μＬ程度の発酵液を残して菌体を再びピペッティングして再懸濁させ、１０μｇ／ｍＬアンピシリン抗生物質含有のＬＢ固体プレートに塗布し、３７℃インキュベータで約１０時間静置培養し、プレートに単一コロニーを成長させた。
モノクローナルコロニーを１０μｇ／ｍＬアンピシリン含有の耐性ＬＢ液体培地に播種し、３７℃、１２０～１８０ｒｐｍの条件下、振とうフラスコ培養を８～１２時間行った後、プラスミドを抽出して酵素消化による検証及び配列決定による検証を行い、検証が正確であると組換えプラスミドｐＥＴ２４ａ－ｔｓｂｇｌが得られた。
プラスミドｐＥＴ２４ａ－ｔｓｂｇｌとｐＢＳＭμＬ３をテンプレートとして、上下流に１５ｂｐホモロジーアームを含む目的遺伝子プライマーとベクタープライマーをそれぞれ設計し、ホモロジーアームを備える目的遺伝子断片ｔｓｂｇｌ（プライマー１と２）及びテンプレート断片ｐＢＳＭμＬ３（プライマー３と４）をＰＣＲにより増幅した。
プライマー１：ＴＡＡＧＧＡＧＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＧＧＡＡＧ（配列番号３）；
プライマー２：ＴＴＴＡＴＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＣＣＧＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＣ（配列番号４）；
プライマー３：ＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣ（配列番号５）；
プライマー４：ＣＡＴＴＣＴＴＧＡＣＡＣＴＣＣＴＴＡＴＴＴＧ（配列番号６）。
ＰＣＲ系：２×Ｓｕｐｅｒ ＰｆｘＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５μＬ、２本のプライマー各１．２５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ２２μＬ、テンプレート０．５μＬ。
反応条件：（１）９４℃、４分、（２）９４℃、１分、（３）５５℃、１分、（４）７２℃、２分、（２）～（４）を３５サイクル増幅後、（５）７２℃、５分、（６）４℃で温度を保持し；それぞれ増幅して目的遺伝子断片ｔｓｂｇｌ及びテンプレート断片ｐＢＳＭμＬ３を得た。
増幅した断片をゲル回収キット（天根生化科技有限公司）で回収し、配列決定による検証を行い、配列決定による検証の結果が正確である２本の回収断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔキットで連結し、連結系として遺伝子断片４００ ｎｇ、ベクター断片２００ｎｇ、５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｅｍｉｘ２μＬを用いて、水で１０μＬとなるまで補充し、連結系を５０℃で２５分反応し、連結産物を得て、連結産物をクローン宿主ＪＭ１０９（具体的な実施形態は以上の熱ショック形質転換法を参照）に形質転換して、ＬＢ固体培地（１０μｇ／ｍＬアンピシリン含有）に塗布し、３７℃で８～１０時間培養後、単一コロニーをピックアップして１００ｍｇ／Ｌアンピシリン含有のＬＢ液体培地に播種し、３７℃で１０時間培養後、菌体を収集してプラスミドを抽出し（プラスミド抽出キットは天根生化科技有限公司から購入）、ｐＢＳＭμＬ３－ｔｓｂｇｌプラスミド（図１）を得、酵素消化により検証をして専門会社に配列決定による検証をしてもらった。
Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおけるサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ ＫＯＬ６）β－グルコシダーゼＴｓｂｇｌのアミノ酸配列（ＷＰ＿１０１５１０３５８）に従って、ヌクレオチド配列が配列番号１で示される遺伝子を化学的に合成した。
合成した遺伝子断片とｐＥＴ－２４ａを酵素消化後（酵素消化部位：Ｎｄｅ ＩとＥｃｏＲ Ｉ）、連結して連結産物を得て、連結産物を熱ショック形質転換法により大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ．ＪＭ１０９に形質転換した。形質転換産物を得て、形質転換産物をＬＢ固体培地（０．０５ｍｇ／ｍＬカナマイシン含有）に塗布し、３７℃の恒温インキュベータで８～１２時間倒置培養し、形質転換体を得た。
熱ショック形質転換法：
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ．ＪＭ１０９コンピテント細胞を氷に５分放置しておき、コンピテント細胞が完全に溶けた後、完全なプラスミド又はＰＣＲ産物を１０μＬ加え、優しくピペッティングして均一にした後、氷に４５分放置した。
（２）コンピテント細胞を４２℃の水浴鍋に入れて９０秒熱ショックし、熱ショック終了後、氷に５分放置した。
（３）氷浴終了後、コンピテント細胞にＬＢ液体培地０．８ｍＬを加え、均一に混合した後、３７℃のシェーカーに入れて約６０分振とう培養した。
（４）培養が終了したコンピテント細胞を３０００ｒｐｍで５分遠心分離し、一部の上清液を捨てて、２００μＬ程度の発酵液を残して菌体を再びピペッティングして再懸濁させ、１０μｇ／ｍＬアンピシリン抗生物質含有のＬＢ固体プレートに塗布し、３７℃インキュベータで約１０時間静置培養し、プレートに単一コロニーを成長させた。
モノクローナルコロニーを１０μｇ／ｍＬアンピシリン含有の耐性ＬＢ液体培地に播種し、３７℃、１２０～１８０ｒｐｍの条件下、振とうフラスコ培養を８～１２時間行った後、プラスミドを抽出して酵素消化による検証及び配列決定による検証を行い、検証が正確であると組換えプラスミドｐＥＴ２４ａ－ｔｓｂｇｌが得られた。
プラスミドｐＥＴ２４ａ－ｔｓｂｇｌとｐＢＳＭμＬ３をテンプレートとして、上下流に１５ｂｐホモロジーアームを含む目的遺伝子プライマーとベクタープライマーをそれぞれ設計し、ホモロジーアームを備える目的遺伝子断片ｔｓｂｇｌ（プライマー１と２）及びテンプレート断片ｐＢＳＭμＬ３（プライマー３と４）をＰＣＲにより増幅した。
プライマー１：ＴＡＡＧＧＡＧＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＧＧＡＡＧ（配列番号３）；
プライマー２：ＴＴＴＡＴＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＣＣＧＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＣ（配列番号４）；
プライマー３：ＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣ（配列番号５）；
プライマー４：ＣＡＴＴＣＴＴＧＡＣＡＣＴＣＣＴＴＡＴＴＴＧ（配列番号６）。
ＰＣＲ系：２×Ｓｕｐｅｒ ＰｆｘＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５μＬ、２本のプライマー各１．２５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ２２μＬ、テンプレート０．５μＬ。
反応条件：（１）９４℃、４分、（２）９４℃、１分、（３）５５℃、１分、（４）７２℃、２分、（２）～（４）を３５サイクル増幅後、（５）７２℃、５分、（６）４℃で温度を保持し；それぞれ増幅して目的遺伝子断片ｔｓｂｇｌ及びテンプレート断片ｐＢＳＭμＬ３を得た。
増幅した断片をゲル回収キット（天根生化科技有限公司）で回収し、配列決定による検証を行い、配列決定による検証の結果が正確である２本の回収断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔキットで連結し、連結系として遺伝子断片４００ ｎｇ、ベクター断片２００ｎｇ、５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｅｍｉｘ２μＬを用いて、水で１０μＬとなるまで補充し、連結系を５０℃で２５分反応し、連結産物を得て、連結産物をクローン宿主ＪＭ１０９（具体的な実施形態は以上の熱ショック形質転換法を参照）に形質転換して、ＬＢ固体培地（１０μｇ／ｍＬアンピシリン含有）に塗布し、３７℃で８～１０時間培養後、単一コロニーをピックアップして１００ｍｇ／Ｌアンピシリン含有のＬＢ液体培地に播種し、３７℃で１０時間培養後、菌体を収集してプラスミドを抽出し（プラスミド抽出キットは天根生化科技有限公司から購入）、ｐＢＳＭμＬ３－ｔｓｂｇｌプラスミド（図１）を得、酵素消化により検証をして専門会社に配列決定による検証をしてもらった。
実施例２：枯草菌発現宿主の形質転換培養及び粗酵素液の抽出
酵素消化による検証及び配列決定の結果が正確である組換えプラスミドｐＢＳＭμＬ３－ｔｓｂｇｌを線形化した後、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＳＨ１１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＳＨ１１は公開番号ＣＮ１０８１０２９９７Ａの特許に記載）にエレクトロプロレーションした。組換えプラスミドｐＢＳＭμＬ３－ｔｓｂｇｌをＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＳＨ１１コンピテント細胞に電気ショックで形質転換した：
（１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＳＨ１１コンピテント細胞を氷上に５分放置しておき、コンピテント細胞が完全に溶けた後、組換えプラスミド１０μＬを加え、優しくピペッティングして均一にした後、氷上に１５分放置した。
（２）エレクトロポレーターを予め起動して３０分予熱し、電気ショック電圧を２４００Ｖに設定して、氷浴が終了したコンピテント細胞を、事前に予冷した直径２ｍｍのエレクトロポレーションキュベットに加え、エレクトロポレーションキュベットの外壁に付いた水を拭いた後、エレクトロポレーションキュベットをエレクトロポレーターに入れて電気ショック（エレクトロポレーション）をした。
（３）電気ショック終了後、事前に予冷したＲＭ培地１ｍＬを素早く加え、均一にピペッティングした後、菌液を殺菌したＥＰ管１．５ｍＬに移し、３７℃のシェーカーに入れて、２００ｒｐｍで３時間振とう培養した。
（４）培養が終了した菌液を３０００ｒｐｍで５分遠心分離し、一部の上清液を捨てて、２００μＬ程度の上清液を残して菌体を改めてピペッティングして再懸濁させ、テトラサイクリン耐性を有するＬＢ固体プレートに塗布し、３７℃のインキュベータで約１０時間培養し、プレートに単一コロニーを成長させた。
（５）単一コロニーを取り、配列決定により検証をして、プラスミドｐＢＳＭμＬ３－ｔｓｂｇｌを含有する陽性形質転換体を得た。
組換えプラスミドｐＢＳＭμＬ３－ｔｓｂｇｌを含有する陽性形質転換体をＬＢ液体培地（１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン含有）に播種して８～１０時間培養した後、培養液５ｍＬをＴＢ培地１００ｍＬに播種し、３７℃で２時間培養し、さらに３３℃で４８時間培養し、発酵終了後、８０００ｒｐｍで２０分遠心分離して菌体を収集した。５０ｍＭ、ｐＨ６．０クエン酸－リン酸二ナトリウム緩衝液５０ｍＬを菌体に加え、菌体を十分に再懸濁させた後、高圧ホモジナイザーを用いて細胞壁を破壊し、１００００ｒｐｍで２０分遠心分離後、細胞壁破壊上清液である粗酵素液を収集し、ＯＤ６００が５である粗酵素液の酵素活性は１０．４１Ｕ／ｍＬであった。
収集した粗酵素液を精製して、電気泳動を行い、精製後の電気泳動図を図２に示す。
酵素消化による検証及び配列決定の結果が正確である組換えプラスミドｐＢＳＭμＬ３－ｔｓｂｇｌを線形化した後、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＳＨ１１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＳＨ１１は公開番号ＣＮ１０８１０２９９７Ａの特許に記載）にエレクトロプロレーションした。組換えプラスミドｐＢＳＭμＬ３－ｔｓｂｇｌをＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＳＨ１１コンピテント細胞に電気ショックで形質転換した：
（１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＳＨ１１コンピテント細胞を氷上に５分放置しておき、コンピテント細胞が完全に溶けた後、組換えプラスミド１０μＬを加え、優しくピペッティングして均一にした後、氷上に１５分放置した。
（２）エレクトロポレーターを予め起動して３０分予熱し、電気ショック電圧を２４００Ｖに設定して、氷浴が終了したコンピテント細胞を、事前に予冷した直径２ｍｍのエレクトロポレーションキュベットに加え、エレクトロポレーションキュベットの外壁に付いた水を拭いた後、エレクトロポレーションキュベットをエレクトロポレーターに入れて電気ショック（エレクトロポレーション）をした。
（３）電気ショック終了後、事前に予冷したＲＭ培地１ｍＬを素早く加え、均一にピペッティングした後、菌液を殺菌したＥＰ管１．５ｍＬに移し、３７℃のシェーカーに入れて、２００ｒｐｍで３時間振とう培養した。
（４）培養が終了した菌液を３０００ｒｐｍで５分遠心分離し、一部の上清液を捨てて、２００μＬ程度の上清液を残して菌体を改めてピペッティングして再懸濁させ、テトラサイクリン耐性を有するＬＢ固体プレートに塗布し、３７℃のインキュベータで約１０時間培養し、プレートに単一コロニーを成長させた。
（５）単一コロニーを取り、配列決定により検証をして、プラスミドｐＢＳＭμＬ３－ｔｓｂｇｌを含有する陽性形質転換体を得た。
組換えプラスミドｐＢＳＭμＬ３－ｔｓｂｇｌを含有する陽性形質転換体をＬＢ液体培地（１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン含有）に播種して８～１０時間培養した後、培養液５ｍＬをＴＢ培地１００ｍＬに播種し、３７℃で２時間培養し、さらに３３℃で４８時間培養し、発酵終了後、８０００ｒｐｍで２０分遠心分離して菌体を収集した。５０ｍＭ、ｐＨ６．０クエン酸－リン酸二ナトリウム緩衝液５０ｍＬを菌体に加え、菌体を十分に再懸濁させた後、高圧ホモジナイザーを用いて細胞壁を破壊し、１００００ｒｐｍで２０分遠心分離後、細胞壁破壊上清液である粗酵素液を収集し、ＯＤ６００が５である粗酵素液の酵素活性は１０．４１Ｕ／ｍＬであった。
収集した粗酵素液を精製して、電気泳動を行い、精製後の電気泳動図を図２に示す。
実施例３：β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌの使用条件の決定
（１）β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌの最適温度
ｐＮＰＧを基質として、実施例２で得た精製後のβ－グルコシダーゼを酵素活性測定反応系に加え、ｐＨを６．０として様々な温度で反応させ、酵素活性を測定し、その相対酵素活性を算出して、結果を図３に示し、具体的なデータを表１に示し、以上から、β－グルコシダーゼの最適温度は９０℃であることが分かり、９０～１００℃では、相対酵素活性は８５％以上に達する。
（２）β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌの最適ｐＨ
ｐＮＰＧを基質として、実施例２で得た精製後のβ－グルコシダーゼを酵素活性測定反応系に加え、様々なｐＨ下、９０℃の恒温水浴にて１０分反応させた。反応後の酵素活性を測定し、その相対酵素活性を算出し、結果を図４に示し、具体的なデータを表２に示し、以上から、β－グルコシダーゼの最適ｐＨは６．０であることが分かった。
（３）β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌの熱安定性
ｐＮＰＧを基質として、実施例３で得た精製後のβ－グルコシダーゼを酵素活性測定反応系に加え、ｐＨ６．０では、それぞれ７０℃、８０℃、９０℃の温水浴にて６０分間反応させ、６０分間内に酵素の酵素活性を測定し、その相対酵素活性を算出し、結果を図５に示し、６０分間になったときには、β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌは、７０℃、８０℃、９０℃での相対酵素活性がそれぞれ９９．１８％、９９．３１％、９９．８１％であった。β－グルコシダーゼは、９０℃では高い熱安定性を有した。
（１）β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌの最適温度
ｐＮＰＧを基質として、実施例２で得た精製後のβ－グルコシダーゼを酵素活性測定反応系に加え、ｐＨを６．０として様々な温度で反応させ、酵素活性を測定し、その相対酵素活性を算出して、結果を図３に示し、具体的なデータを表１に示し、以上から、β－グルコシダーゼの最適温度は９０℃であることが分かり、９０～１００℃では、相対酵素活性は８５％以上に達する。
ｐＮＰＧを基質として、実施例２で得た精製後のβ－グルコシダーゼを酵素活性測定反応系に加え、様々なｐＨ下、９０℃の恒温水浴にて１０分反応させた。反応後の酵素活性を測定し、その相対酵素活性を算出し、結果を図４に示し、具体的なデータを表２に示し、以上から、β－グルコシダーゼの最適ｐＨは６．０であることが分かった。
ｐＮＰＧを基質として、実施例３で得た精製後のβ－グルコシダーゼを酵素活性測定反応系に加え、ｐＨ６．０では、それぞれ７０℃、８０℃、９０℃の温水浴にて６０分間反応させ、６０分間内に酵素の酵素活性を測定し、その相対酵素活性を算出し、結果を図５に示し、６０分間になったときには、β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌは、７０℃、８０℃、９０℃での相対酵素活性がそれぞれ９９．１８％、９９．３１％、９９．８１％であった。β－グルコシダーゼは、９０℃では高い熱安定性を有した。
実施例４：ゲンチオオリゴ糖の製造におけるβ－グルコシダーゼＴＳＢＧｌの使用
８００ｇ／Ｌのグルコースを基質として、ｐＨ６、９０℃で２４時間時間反応させ、酵素添加量を３００Ｕ／ｇ、４００Ｕ／ｇ、５００Ｕ／ｇ、６００Ｕ／ｇ、７００Ｕ／ｇとして、高濃度グルコースを基質として逆加水分解活性によりゲンチオオリゴ糖を合成する場合の酵素添加量を研究した。
図６に示す実験結果から、所定の範囲では、基質の転化率は酵素添加量の増加に伴い向上し続けて、酵素添加量が５００Ｕ／ｇグルコースに達すると、基質の転化率は１０．９４％に達し、さらに酵素添加量を増加させると、転化率はほぼ変わらなかった。総合的に考慮すると、５００Ｕ／ｇの酵素添加量を選択し、この場合、基質の転化率は１０．９４％、ゲンチオオリゴ糖の収率は７３ｇ／Ｌに達する。
８００ｇ／Ｌのグルコースを基質として、ｐＨ６、９０℃で２４時間時間反応させ、酵素添加量を３００Ｕ／ｇ、４００Ｕ／ｇ、５００Ｕ／ｇ、６００Ｕ／ｇ、７００Ｕ／ｇとして、高濃度グルコースを基質として逆加水分解活性によりゲンチオオリゴ糖を合成する場合の酵素添加量を研究した。
図６に示す実験結果から、所定の範囲では、基質の転化率は酵素添加量の増加に伴い向上し続けて、酵素添加量が５００Ｕ／ｇグルコースに達すると、基質の転化率は１０．９４％に達し、さらに酵素添加量を増加させると、転化率はほぼ変わらなかった。総合的に考慮すると、５００Ｕ／ｇの酵素添加量を選択し、この場合、基質の転化率は１０．９４％、ゲンチオオリゴ糖の収率は７３ｇ／Ｌに達する。
実施例５：β－グルコシダーゼＴＳＢＧｌの高基質濃度でのゲンチオオリゴ糖の製造における使用
具体的な実施方法は実施例４を参照できるが、酵素添加量を５００Ｕ／ｇグルコースとし、且つβ－グルコシダーゼＴＳＢＧｌの高温反応の特性により高温でより高い基質濃度下の逆加水分解合成反応を可能とする点が異なり、このため、グルコース基質の濃度（それぞれ８００ｇ／Ｌ、９００ｇ／Ｌ、１０００ｇ／Ｌ、１１００ｇ／Ｌ、１２００ｇ／Ｌ）によるゲンチオオリゴ糖の逆加水分解合成の場合の収率及び転化率への影響を調べた。
図７に示す実験結果から、グルコース基質の最終濃度が８００ｇ／Ｌ、９００ｇ／Ｌ、１０００ｇ／Ｌ及び１１００ｇ／Ｌである場合、基質の転化率はそれぞれ１０．４２％、１２．７２％、１４．４３％、１４．８２％であり、グルコース基質の最終濃度が１２００ｇ／Ｌである場合、ゲンチオオリゴ糖の収率は１７８．２ｇ／Ｌに達し、基質の転化率は１４．８５％であり、これは、今まで該方法によりゲンチオオリゴ糖を合成する最高収率であった。
具体的な実施方法は実施例４を参照できるが、酵素添加量を５００Ｕ／ｇグルコースとし、且つβ－グルコシダーゼＴＳＢＧｌの高温反応の特性により高温でより高い基質濃度下の逆加水分解合成反応を可能とする点が異なり、このため、グルコース基質の濃度（それぞれ８００ｇ／Ｌ、９００ｇ／Ｌ、１０００ｇ／Ｌ、１１００ｇ／Ｌ、１２００ｇ／Ｌ）によるゲンチオオリゴ糖の逆加水分解合成の場合の収率及び転化率への影響を調べた。
図７に示す実験結果から、グルコース基質の最終濃度が８００ｇ／Ｌ、９００ｇ／Ｌ、１０００ｇ／Ｌ及び１１００ｇ／Ｌである場合、基質の転化率はそれぞれ１０．４２％、１２．７２％、１４．４３％、１４．８２％であり、グルコース基質の最終濃度が１２００ｇ／Ｌである場合、ゲンチオオリゴ糖の収率は１７８．２ｇ／Ｌに達し、基質の転化率は１４．８５％であり、これは、今まで該方法によりゲンチオオリゴ糖を合成する最高収率であった。
好適な実施例をもって本発明を以上のように開示したが、本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、各種の変化や修正を行うことができ、このため、本発明の特許範囲は特許請求の範囲により定められるべきである。
Claims (12)
- 組換え菌が発現するβ－グルコシダーゼを利用してグルコースによるゲンチオオリゴ糖の生成を触媒し、前記組換え菌は枯草菌を発現宿主として、アミノ酸配列が配列番号２で示されるβ－グルコシダーゼを発現することを特徴とする、ゲンチオオリゴ糖の収率向上方法。
- 前記β－グルコシダーゼの添加量が３００～８００Ｕ／ｇグルコースであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記グルコースの濃度は８００～１５００ｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- ６０～１００℃、ｐＨ５．０～７．０で２０～３０時間反応させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- β－グルコシダーゼをコードする遺伝子であって、
前記遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１で示されることを特徴とする遺伝子。 - 請求項５に記載の遺伝子を運ぶベクター。
- ｐＢＳＭμＬ３であることを特徴とする、請求項６に記載のベクター。
- 枯草菌を発現宿主として、アミノ酸配列が配列番号２で示されるβ－グルコシダーゼを発現することを特徴とする、組換え菌。
- 枯草菌を発現宿主とし、請求項５又は７に記載のベクターを含有することを特徴とする、組換え菌。
- 請求項８に記載の組換え菌の発酵によりβ－グルコシダーゼを生産することを特徴とする、β－グルコシダーゼを生産する方法。
- 食品及び化粧品の分野におけるゲンチオオリゴ糖含有製品の調製における請求項１～４又は請求項１０のいずれか１項に記載の方法の使用。
- 食品及び化粧品の分野におけるゲンチオオリゴ糖含有製品の調製における請求項５に記載の遺伝子、又は請求項６又は７に記載のベクター、又は請求項８又は９に記載の組換え菌の使用。
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