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JP2023103421A - 製剤 - Google Patents

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Abstract

【課題】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集成分の送達に有用な特性を有する脂質ナノ粒子を用いる組成物を提供する。【解決手段】ＲＮＡ成分と、約５０～６０モル％のアミン脂質と、約８～１０モル％の中性脂質と、約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質とを含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約６である、脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）組成物とする。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１７年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／５６６，２４０号の優先権の利益を主張し、その記載内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書では、生物学的に活性な薬剤、特にＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡを送達するための特性が改善された脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）組成物を提供する。ＬＮＰ組成物は、細胞膜を通過するＲＮＡ剤の送達を容易にし、特定の実施形態では、かかる組成物により、遺伝子編集用の成分及び組成物を生細胞内に導入する。
細胞への送達が特に困難な生物学的活性薬剤としては、タンパク質、核酸系薬物、及びその誘導体が挙げられる。有望な遺伝子編集技術を細胞内に送達するための組成物、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム成分を送達するための組成物は特に関心が持たれる。
現在、細胞の遺伝子をインビボで編集するための成分及びシステムは多数存在し、疾患の治療に非常に大きな可能性を提供している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムは細胞内ではリボ核タンパク質複合体として活性である。ＲＮＡ依存性ヌクレアーゼは細胞内のＤＮＡ配列に結合し、切断を導く。この部位特異的ヌクレアーゼ活性は、細胞自身の自然の過程を介した遺伝子編集を促進する。例えば、細胞は、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に応答して、非相同末端結合（「ＮＨＥＪ」）として知られる誤りがちな修復過程を用いる。ＮＨＥＪの際、細胞によりＤＮＡ末端でヌクレオチドの付加または除去が行われ、切断された配列から変化した配列が生じる場合がある。他の状況では、細胞は、相同組換え修復（「ＨＤＲ」）または相同組換え（「ＨＲ」）という機構によりＤＳＢを修復し、その際、内在性または外来性の鋳型を使用して切断の修復を導くことができる。これらの編集技術のいくつかでは、一本鎖切断（ＳＳＢ）またはＤＳＢを修復する細胞機構が利用される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓのタンパク質及び核酸成分を細胞、例えば、患者の細胞などに送達するための組成物が必要とされている。特に、ＣＲＩＳＰＲタンパク質成分をコードするｍＲＮＡを送達するための組成物、及びＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを送達するための組成物は特に関心が持たれる。ＲＮＡ成分を安定化させ送達することができる、インビトロ及びインビボでの送達に有用な特性を有する組成物も特に関心が持たれる。
本明細書では、有用な特性、特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集成分の送達に有用な特性を有する脂質ナノ粒子を用いる組成物を提供する。
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物はＲＮＡ成分及び脂質成分を含み、ここで、かかる脂質成分は、（１）約５０～６０モル％のアミン脂質、（２）約８～１０モル％の中性脂質、及び（３）約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質を含み、脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約６である。さらなる実施形態では、ＬＮＰ組成物は、（１）ＲＮＡ成分、（２）約５０～６０モル％のアミン脂質、（３）約２７～３９．５モル％のヘルパー脂質、（４）約８～１０モル％の中性脂質、及び（５）約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質を含み、ここで、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約５～７である。
他の実施形態では、ＬＮＰ組成物はＲＮＡ成分及び脂質成分を含み、ここで、かかる脂質成分は、（１）約５０～６０モル％のアミン脂質、（２）約５～１５モル％の中性脂質、及び（３）約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質を含み、脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～１０である。さらなる実施形態では、ＬＮＰ組成物は、（１）約４０～６０モル％のアミン脂質、（２）約５～１５モル％の中性脂質、及び（３）約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質が含まれる脂質成分を含み、ここで、かかる脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約６である。別の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、（１）約５０～６０モル％のアミン脂質、（２）約５～１５モル％の中性脂質、及び（３）約１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質が含まれる脂質成分を含み、ここで、かかる脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約６である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物はＲＮＡ成分及び脂質成分を含み、ここで、かかる脂質成分は、（１）約４０～６０モル％のアミン脂質、（２）約０～５モル％の中性脂質、例えば、リン脂質、及び（３）約１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質を含み、脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～１０である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物はＲＮＡ成分及び脂質成分を含み、ここで、かかる脂質成分は、（１）約４０～６０モル％のアミン脂質、（２）約１モル％未満の中性脂質、例えば、リン脂質、及び（３）約１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質を含み、脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～１０である。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は中性脂質を本質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物はＲＮＡ成分及び脂質成分を含み、ここで、脂質成分は、（１）約４０～６０モル％のアミン脂質、及び（２）約１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質を含み、脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～１０であり、かつ、ＬＮＰ組成物は中性脂質、例えば、リン脂質を含まない。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は中性リン脂質を本質的に含まないかまたは含まない。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は中性脂質、例えば、リン脂質を本質的に含まないかまたは含まない。
特定の実施形態では、ＲＮＡ成分は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼまたはクラス２Ｃａｓヌクレアーゼ）などのｍＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ成分はｇＲＮＡを含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集成分であるＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡをＬＮＰ組成物に入れて送達した後のマウス肝臓において達成されたＴＴＲ遺伝子編集の割合を示し、１ｍｐｋ（図１Ａ））または０．５ｍｐｋ（図１Ｂ）の単回投与の場合を示す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物の粒子分布データを示す。 ＬＮＰ組成物の物理化学的性質を示し、対数で表す組成物のモル質量差（図３Ａ）及び組成物の分子量測定値の平均（図３Ｂ）を比較する。 図３のＬＮＰ組成物を分析する、多分散度計算を図４Ａに、またＢｕｒｃｈａｒｄ－Ｓｔｏｃｋｍｅｙｅｒ分析を図４Ｂに示す。 ＰＥＧ脂質濃度を高めたＬＮＰ組成物がラットにおける単回投与後に及ぼす血清ＴＴＲノックダウン、肝臓での遺伝子編集、及びサイトカインＭＣＰ－１レベルに対する効果を評価する実験結果を記載する。図５Ａは血清ＴＴＲレベルをグラフで表し、図５Ｂは肝臓試料での編集率をグラフで表し、図５ＣはＭＣＰ－１レベルをｐｇ／ｍＬ単位で示している。 ＬＮＰ組成物では各種ＰＥＧ脂質で遺伝子編集効力が維持されることを示す（血清ＴＴＲレベル（図６Ａ及び図６Ｂ）及び編集率（図６Ｃ）により測定）。 図６－１の続きである。 マウスにおいて、リピドＡ類似体は、単回投与後の肝臓での編集率（％）で測定した場合に、ＬＮＰ組成物中の遺伝子編集カーゴを効果的に送達することを示す。 図７－１の続きである。 図７－２の続きである。 図７－３の続きである。 カニクイザル初代肝細胞における各種ＬＮＰ組成物での編集率の用量反応曲線を示す。 図８－１の続きである。 図９Ａ及び図９Ｂは、ｇＲＮＡとｍＲＮＡの比をさまざまに変えた場合のマウスにおける単回投与後の血清ＴＴＲ及び編集率についての結果を示し、図９Ｃ及び図９Ｄは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの量は一定のままｇＲＮＡをさまざまに変えた場合のマウスにおける単回投与後の肝臓での血清ＴＴＲ及び編集率についての結果を示す。 図９－１の続きである。 図１０Ａ及び図１０Ｂは、中性脂質を用いたＬＮＰ組成物及び中性脂質を用いないＬＮＰ組成物を投与した後の血清ＴＴＲ及び肝臓編集の結果を示す。
本開示は、細胞に送達するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分ＲＮＡ（「カーゴ」）などのＲＮＡの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物の実施形態及びそれらの使用方法を提供する。ＬＮＰ組成物は、従来の送達技術と比較して改善された特性を示し得る。ＬＮＰ組成物は、本明細書で定義されるようなＲＮＡ成分及び脂質成分を含有してよい。特定の実施形態では、ＲＮＡ成分には、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼが含まれる。特定の実施形態では、カーゴまたはＲＮＡ成分には、クラス２ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸が含まれる。遺伝子編集方法及び工学的に操作された細胞の作製方法も提供される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓカーゴ
ＬＮＰ製剤を介して送達されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓカーゴには目的タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子が含まれてよい。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなタンパク質とＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子とを発現させるためのｍＲＮＡ、またはＣａｓヌクレアーゼが含まれる。Ｃａｓ９タンパク質の細胞内発現を可能にするＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、例えば、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどを含むＬＮＰ組成物を提供する。さらに、カーゴは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を１つ以上含有してよい。組成物中に例えば、修復または組換えなどのための鋳型核酸も含まれてよく、または鋳型核酸を本明細書に記載する方法において使用してよい。
「ｍＲＮＡ」とは、ポリペプチドに翻訳され得る（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として使用され得る）オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。ｍＲＮＡは、リボース残基またはその類似体、例えば、２’－メトキシリボース残基など、リン酸塩－糖骨格を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡリン酸塩－糖骨格の糖は本質的にリボース残基、２’－メトキシリボース残基、またはその組み合わせからなる。一般に、ｍＲＮＡは実質的な量のチミジン残基を含有しない（例えば、チミジン残基が０であるかまたは３０、２０、１０、５、４、３、もしくは２より少ない、あるいはチミジン含量が１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．２％未満、または０．１％未満である）。ｍＲＮＡは、そのウリジンの位置のうち一部または全部において修飾ウリジンを含有することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系
開示される製剤の成分の一つは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子、例えば、ＣａｓヌクレアーゼなどをコードするｍＲＮＡである。
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ここで、ＤＮＡ結合活性は配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。例示的なＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子としては、Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ及びその不活性型（「ｄＣａｓ ＤＮＡ結合物質」）が挙げられる。本明細書で使用する場合、「Ｃａｓヌクレアーゼ」には、Ｃａｓクリベース、Ｃａｓニッカーゼ、及びｄＣａｓ ＤＮＡ結合物質が包含される。Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ及びｄＣａｓ ＤＮＡ結合物質としては、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍ複合体またはＣｍｒ複合体、そのサブユニットのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはＣｍｒ２、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓｃａｄｅ複合体、そのサブユニットのＣａｓ３、及びクラス２Ｃａｓヌクレアーゼが挙げられる。本明細書で使用する場合、「クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡ誘導型のＤＮＡ結合活性のある一本鎖ポリペプチドである。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼには、ＲＮＡ誘導によるＤＮＡクリベース活性またはニッカーゼ活性をさらに有するクラス２Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａという変異型）、及びクリベース／ニッカーゼ活性が不活性化されているクラス２ ｄＣａｓ ＤＮＡ結合物質が含まれる。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９というタンパク質（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａという変異型）、ＨｙｐａＣａｓ９タンパク質（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａという変異型）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）タンパク質（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａという変異型）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）タンパク質（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａという変異型）、及びその改変体が挙げられる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５））はＣａｓ９に相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりその全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１及び表Ｓ３を参照のこと。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子はクラス２Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子はクリベース活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子は、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ（これは、例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣａｓヌクレアーゼであってよい）などのＣａｓヌクレアーゼを含む。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ３タンパク質ならびにその改変体が挙げられる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び他の原核生物（例えば、次段落の一覧を参照のこと）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のもの、ならびにその改変型（例えば、工学的に操作されたもの、または変異体）が挙げられる。例えば、Ｕ．Ｓ．２０１６／０３１２１９８ Ａ１、Ｕ．Ｓ．２０１６／０３１２１９９ Ａ１を参照のこと。Ｃａｓヌクレアーゼの他の例としては、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍ複合体もしくはＣｍｒ複合体またはそのサブユニットのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、もしくはＣｍｒ２、及びＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓｃａｄｅ複合体、またはそのサブユニットのＣａｓ３が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、またはＩＩＣ型の系のものであってよい。さまざまなＣＲＩＳＰＲ系及びＣａｓヌクレアーゼの考察については、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７－４７７（２０１１）、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照のこと。
Ｃａｓヌクレアーゼが由来し得る非限定的な例示的種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅに由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
野生型Ｃａｓ９はＲｕｖＣ及びＨＮＨという２つのヌクレアーゼドメインを有する。ＲｕｖＣドメインは非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインは標的ＤＮＡ鎖を切断する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つ以上のＲｕｖＣドメイン及び／または２つ以上のＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは野生型Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡに二本鎖切断を誘導することができる。特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ｄｓＤＮＡを切断するか、ｄｓＤＮＡの１本鎖を切断するか、またはＤＮＡのクリベース活性もニッカーゼ活性も持たない場合がある。例示的なＣａｓ９アミノ酸配列を配列番号３として記載する。開始コドン及び終止コドンを含む、例示的なＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＯＲＦ配列を配列番号４として記載する。融合タンパク質に含めるのに好適な例示的Ｃａｓ９ ｍＲＮＡコード配列を配列番号１０として記載する。
いくつかの実施形態では、キメラＣａｓヌクレアーゼを使用し、その場合、かかるタンパク質の１つのドメインまたは領域は、異なるタンパク質の一部で置換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインを、Ｆｏｋ１などの異なるヌクレアーゼに由来するドメインで置き換えてよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは修飾ヌクレアーゼであってよい。
他の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来してよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣａｓｃａｄｅ複合体の成分であってよい。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ３タンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来してよい。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＲＮＡ切断活性を有してよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子は一本鎖ニッカーゼ活性を有し、すなわち、一本のＤＮＡ鎖を切断して、「ニック」としても知られる一本鎖の切れ目を生じさせることができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子はＣａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、ｄｓＤＮＡにニックをつくる、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの１本の鎖を切断するが、もう１本の鎖は切断しない酵素である。いくつかの実施形態では、ＣａｓニッカーゼはＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上述のＣａｓヌクレアーゼ）の変形の１種であり、例えば、触媒ドメイン内の１つ以上の変化（例えば、点変異）によって、エンドヌクレアーゼによる分解活性部位が不活性化されている。Ｃａｓニッカーゼ及び例示的な触媒ドメイン改変に関する考察については、例えば、米国特許第８，８８９，３５６号を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼなどのＣａｓニッカーゼは不活性化されたＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインを有する。例示的なＣａｓ９ニッカーゼのアミノ酸配列を配列番号６として記載する。開始コドン及び終止コドンが含まれる例示的なＣａｓ９ニッカーゼｍＲＮＡのＯＲＦ配列を配列番号７として記載する。融合タンパク質に含めるのに好適な例示的Ｃａｓ９ニッカーゼｍＲＮＡのコード配列を配列番号１１として記載する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子は、機能するヌクレアーゼドメインを１つのみ含有するよう修飾される。例えば、因子のタンパク質は、ヌクレアーゼドメインの１つを変異させるかまたは完全もしくは部分的に欠失させてその核酸切断活性を低下させるよう修飾されてよい。いくつかの実施形態では、活性を低下させたＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼを使用する。いくつかの実施形態では、不活性なＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼを使用する。いくつかの実施形態では、活性を低下させたＨＮＨドメインを有するニッカーゼを使用する。いくつかの実施形態では、不活性なＨＮＨドメインを有するニッカーゼを使用する。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存されたアミノ酸を置換してヌクレアーゼ活性を低下または変化させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含んでよい。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）：７５９－７７１を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含んでよい。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、及びＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照のこと。さらなる例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ）に基づく）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ニッカーゼをコードするｍＲＮＡは、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれに相補的な一対のガイドＲＮＡと組み合わせて提供される。この実施形態では、ガイドＲＮＡはニッカーゼを標的配列へと導き、標的配列の反対鎖にニックを生じさせることによりＤＳＢを導入する（すなわち、ダブルニッキング）。いくつかの実施形態では、ダブルニッキングの使用により特異性が改善され、オフターゲット作用が低減され得る。いくつかの実施形態では、ニッカーゼを、対抗するＤＮＡ鎖を標的にする２つの別々のガイドＲＮＡと共に使用して、標的ＤＮＡにダブルニックを作製する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼを、近接するよう選択された２つの別々のガイドＲＮＡと共に使用して、標的ＤＮＡにダブルニックを作製する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子にはクリベース活性及びニッカーゼ活性がない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子はｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。ｄＣａｓポリペプチドはＤＮＡ結合活性を有するが、本質的に触媒（クリベース／ニッカーゼ）活性がない。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓポリペプチドはｄＣａｓ９ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、クリベース活性及びニッカーゼ活性がないＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子またはｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、上述のＣａｓヌクレアーゼ）の変形の１種であり、例えば、その触媒ドメイン内の１つ以上の変化（例えば、点変異）によってそのエンドヌクレアーゼによる分解活性部位が不活性化されている。例えば、Ｕ．Ｓ．２０１４／０１８６９５８ Ａ１、Ｕ．Ｓ．２０１５／０１６６９８０ Ａ１を参照のこと。例示的なｄＣａｓ９アミノ酸配列を配列番号８として記載する。開始コドン及び終止コドンが含まれる例示的なＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＯＲＦ配列を配列番号９として記載する。融合タンパク質に含めるのに好適な例示的Ｃａｓ９ ｍＲＮＡコード配列を配列番号１２として記載する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子は、１つ以上の異種機能ドメイン（例えば、融合ポリペプチドであるかまたはそれを含む）を含む。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、細胞の核内へのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子の輸送を容易にし得る。例えば、異種機能ドメインは核局在化シグナル（ＮＬＳ）であってよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を１～１０のＮＬＳ（複数可）と融合させてよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を１～５のＮＬＳ（複数可）と融合させてよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を１つのＮＬＳと融合させてよい。１つのＮＬＳを使用する場合、かかるＮＬＳを、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子配列のＮ末端またはＣ末端にて連結させてよい。かかる１つのＮＬＳを、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子配列の内部に挿入してもよい。他の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を２つ以上のＮＬＳと融合させてよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を２つ、３つ、４つ、または５つのＮＬＳと融合させてよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を２つのＮＬＳと融合させてよい。特定の状況では、２つのＮＬＳは同一であっても（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳが２つ）異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を、２つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列とカルボキシ末端で連結して融合させる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を２つのＮＬＳと融合させて、その際、１つはＮ末端で連結し、１つはＣ末端で連結してよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を３つのＮＬＳと融合させてよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をＮＬＳと融合させなくてよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳであるＰＫＫＫＲＫＶまたはＰＫＫＫＲＲＶのような一分（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）配列であってよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、ヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫのような二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）配列であってよい。特定の実施形態では、単一のＰＫＫＫＲＫＶ ＮＬＳをＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子のＣ末端で連結させてよい。任意選択で１つ以上のリンカーが融合部位において含まれる。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子の細胞内半減期を改変する能力があってよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子の半減期を延長させる能力があってよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子の半減期は短縮されてよい。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子の安定性を増大させる能力があってよい。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子の安定性を低下させる能力があってよい。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、タンパク質分解のシグナルペプチドとして作用してよい。いくつかの実施形態では、タンパク質分解は、例えば、プロテアソーム、リソソームのプロテアーゼ、またはカルパインプロテアーゼなどのタンパク質分解酵素によって媒介されてよい。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインはＰＥＳＴ配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子は、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖の付加によって修飾されてよい。いくつかの実施形態では、ユビキチンはユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であってよい。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ；インターフェロン誘導性遺伝子１５（ＩＳＧ１５）としても知られる）、ユビキチン関連修飾因子１（ＵＲＭ１）、神経前駆細胞発現し発生段階で下方制御されたタンパク質８（ＮＥＤＤ８；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではＲｕｂ１とも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ１０）、オートファジー８（ＡＴＧ８）及びオートファジー１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜アンカー型ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチンフォールド修飾因子１（ＵＦＭ１）、及びユビキチン様タンパク質５（ＵＢＬ５）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインはマーカードメインであってよい。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ、及びレポーター遺伝子配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、マーカードメインは蛍光タンパク質であってよい。適切な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、タグＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、及びオレンジ色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）または他の適切な任意の蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態では、マーカードメインは精製タグ及び／またはエピトープタグであってよい。非限定的な例示的タグとしては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、８ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、ポリ－Ｈｉｓ、及びカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的レポーター遺伝子としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質が挙げられる。
さらなる実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を、特定の細胞小器官、細胞型、組織、または臓器に指向させてよい。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をミトコンドリアに指向させてよい。
さらなる実施形態では、異種機能ドメインはエフェクタードメインであってよい。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をその標的配列へ配向させる場合、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをｇＲＮＡによって標的配列へ配向させる場合、エフェクタードメインは標的配列を修飾するかまたはそれに影響を与えてよい。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、非Ｃａｓヌクレアーゼドメイン）、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制因子ドメインから選んでよい。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインはＦｏｋＩヌクレアーゼなどのヌクレアーゼである。例えば、米国特許第９，０２３，６４９号を参照のこと。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは転写活性化因子または転写抑制因子である。例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃｅｌｌ １５２：１１７３－８３（２０１３）、Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３－６（２０１３）、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，”ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｓｆｏｒｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３－８（２０１３）、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，”Ｃｅｌｌ １５４：４４２－５１（２０１３）を参照のこと。したがって、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子は本質的に、ガイドＲＮＡを使用して所望の標的配列と結合させるために配向可能な転写因子になる。特定の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは脱メチル化ドメインまたはメチルトランスフェラーゼドメインなどのメチル化ドメインである。特定の実施形態では、エフェクタードメインは塩基編集ドメインなどのＤＮＡ修飾ドメインである。特定の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、デアミナーゼドメインなど、ＤＮＡ内に特定の修飾を導入する核酸編集ドメインである。例えば、ＷＯ２０１５／０８９４０６、Ｕ．Ｓ．２０１６／０３０４８４６を参照のこと。ＷＯ２０１５／０８９４０６及びＵ．Ｓ．２０１６／０３０４８４６に記載の核酸編集ドメイン、デアミナーゼドメイン、及びＣａｓ９変異型は参照により本明細書に組み込まれる。
ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）と相互作用する少なくとも１つのドメインを含んでよい。さらに、ヌクレアーゼをｇＲＮＡによって標的配列に配向させてよい。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ系では、ｇＲＮＡはヌクレアーゼ及び標的配列と相互作用し、それにより標的配列への結合が導かれるようにする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは目標とする切断に対する特異性を提供する一方、ヌクレアーゼは汎用性があってよく、異なるｇＲＮＡと対形成して異なる標的配列を切断し得る。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼは、上掲の型、オルソログ、及び例示的種のｇＲＮＡ足場構造と対形成してよい。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
本開示のいくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤のカーゴには少なくとも１つのｇＲＮＡが含まれる。ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼまたはクラス２Ｃａｓヌクレアーゼを標的核酸分子上の標的配列に誘導してよい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはクラス２Ｃａｓヌクレアーゼと結合して、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼによる切断の特異性を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼは、ＬＮＰ組成物により送達され得るリボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体のようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体などを形成してよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体であってよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体はＣｐｆ１／ガイドＲＮＡ複合体などのＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体であってよい。Ｃａｓヌクレアーゼと特異的ｇＲＮＡとを対形成させてよい。各クラス２Ｃａｓヌクレアーゼと対形成するｇＲＮＡ足場構造は個々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって異なる。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び単に「ガイド」は本明細書では同じ意味で使用され、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとしても知られる）、またはｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡの組み合わせ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）のいずれも指す。ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子として会合していても（単一ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）、または２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）であってもよい。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」とはそれぞれの型を指す。ｔｒＲＮＡは、天然に生じる配列、または天然に生じる配列と比較して修飾または変形を有するｔｒＲＮＡ配列のいずれであってもよい。
本明細書で使用する場合、「ガイド配列」とは、ガイドＲＮＡ内にある配列であって、標的配列に相補的であり、かつ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子が結合または修飾（例えば、切断）を行うためにガイドＲＮＡを標的配列へと導くよう機能する配列を指す。「ガイド配列」は、「指向性配列」または「スペーサー配列」とも呼ばれ得る。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）及び関連Ｃａｓ９相同体／オルソログの場合、長さが２０塩基対であり得る。それより短いかまたは長い配列、例えば、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長の配列をガイドとして使用することができる。いくつかの実施形態では、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、ガイド配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列の間の相補性または同一性の程度は約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、ガイド配列と標的領域は１００％相補的であっても同一であってもよい。他の実施形態では、ガイド配列と標的領域には少なくとも１つのミスマッチが含有されてよい。例えば、ガイド配列と標的配列には、１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチが含有されてよく、その場合、標的配列の全長は少なくとも１７塩基対、１８塩基対、１９塩基対、２０塩基対、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ガイド配列と標的領域には１～４つのミスマッチが含有されてよく、その場合、ガイド配列は少なくとも１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列と標的領域には１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチが含有されてよく、その場合、ガイド配列は２０個のヌクレオチドを含む。
Ｃａｓタンパク質のための基質となる核酸は二本鎖核酸であるため、Ｃａｓタンパク質の標的配列にはゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖の両方（すなわち、所与の配列と、かかる配列の逆相補鎖）が含まれる。したがって、ガイド配列が「標的配列に相補的である」という場合は、かかるガイド配列がガイドＲＮＡを導いて標的配列の逆相補鎖に結合させ得ることを理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、ガイド配列が標的配列の逆相補鎖と結合する場合、かかるガイド配列は、ガイド配列のＴがＵで置換される以外は標的配列（例えば、ＰＡＭを含まない標的配列）の特定のヌクレオチドと同一である。
指向性配列の長さは使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系及び成分によって異なってよい。例えば、異なる細菌種に由来する異なるクラス２Ｃａｓヌクレアーゼでは最適な指向性配列長がさまざまである。したがって、指向性配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０超のヌクレオチド長を含んでよい。いくつかの実施形態では、指向性配列長は、天然に生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイド配列よりも０ヌクレオチド、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、または５ヌクレオチド長いかまたは短い。特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ足場は同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する。いくつかの実施形態では、指向性配列は１８～２４個のヌクレオチドを含むかまたはそれからなってよい。いくつかの実施形態では、指向性配列は１９～２１個のヌクレオチドを含むかまたはそれからなってよい。いくつかの実施形態では、指向性配列は２０個のヌクレオチドを含むかまたはそれからなってよい。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質によるＲＮＡ誘導性ＤＮＡ切断を媒介することができる「Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡ」である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質によるＲＮＡ誘導性ＤＮＡ切断を媒介することができる「Ｃｐｆ１ ｓｇＲＮＡ」である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質との活性複合体を形成してＲＮＡ誘導性ＤＮＡ切断を媒介するのに十分な、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質との活性複合体を形成してＲＮＡ誘導性ＤＮＡ切断を媒介するのに十分なｃｒＲＮＡを含む。Ｚｅｔｓｃｈｅ ２０１５を参照のこと。
本発明の特定の実施形態はまた、本明細書に記載のｇＲＮＡをコードする核酸、例えば、発現カセットも提供する。「ガイドＲＮＡ核酸」は、本明細書ではガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡ）及びガイドＲＮＡ発現カセットを指すために使用される、１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸である。
いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡ分子であってよい。いくつかの実施形態では、核酸は、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、天然に生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来の繰り返し配列の全部または一部が隣接する指向性配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの別々の核酸によってコードされてよい。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは単一核酸によってコードされてよい。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは単一核酸の反対鎖によってコードされてよい。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは単一核酸の同一鎖によってコードされてよい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸はｓｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸はＣａｓ９ヌクレアーゼｓｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸はＣｐｆ１ヌクレアーゼｓｇＲＮＡをコードする。
ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写性または調節性の制御配列、例えば、プロモーター、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲなどに機能的に連結されてよい。一例では、プロモーターは、ｔＲＮＡプロモーター、例えば、ｔＲＮＡＬｙｓ３、またはｔＲＮＡキメラであってよい。Ｍｅｆｆｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２０１５ ２１：１６８３－９、Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７ ３５：２６２０－２６２８を参照のこと。特定の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識されてよい。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定的な例としてはＵ６プロモーター及びＨ１プロモーターも挙げられる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに機能的に連結されてよい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸は修飾核酸である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ核酸には、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸には、５’末端修飾、例えば、核酸を安定させ、かつ、核酸の組み込みを妨げる修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドなどが含まれる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸は、各鎖に５’末端修飾を有する二本鎖ＤＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ核酸には、逆位ジデオキシ－Ｔまたは逆位脱塩基ヌクレオシドもしくはヌクレオチドが５’末端修飾として含まれる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸には、ビオチン、デスチオビオテン－ＴＥＧ、ジゴキシゲニン、ならびに蛍光マーカー、例えば、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒなどといった標識が含まれる。
特定の実施形態では、２つ以上のｇＲＮＡ核酸、例えば、ｇＲＮＡなどをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系と共に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系により２つ以上の標的配列が切断されるよう、ｇＲＮＡ核酸ごとに異なる指向性配列を含有してよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体内で特性、例えば、活性または安定性などが同一であっても異なっていてもよい。２つ以上のｇＲＮＡを使用する場合、それぞれのｇＲＮＡは同一ｇＲＮＡ核酸上または異なるｇＲＮＡ核酸上のいずれでもコードされ得る。２つ以上のｇＲＮＡの発現誘導に使用するプロモーターは同一であっても異なっていてもよい。
修飾ＲＮＡ
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は修飾ＲＮＡを含む。
修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡまたはｍＲＮＡなどに存在し得る。例えば、１つ以上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡまたはｍＲＮＡは「修飾」ＲＮＡと呼ばれ、標準残基Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵの代わりまたは追加で使用される、天然に生じない成分もしくは構成及び／または天然に生じる成分もしくは構成が１つ以上存在することを表す。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、本明細書で「修飾」と呼ばれる非標準ヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成される。
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドには、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合におけるリン酸基の非連結酸素のうちの一方もしくは両方及び／またはリン酸基の連結酸素のうち１つ以上の変化、例えば、置換（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の２’位のヒドロキシルなどの変化、例えば、置換（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）「デホスホ」リンカーでのリン酸部分の大幅な置換（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）非標準核酸塩基を用いるなど、天然に生じる核酸塩基の修飾または置換（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボース－リン酸骨格の置換または修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基を除去、修飾もしくは置換するか、または部分、キャップもしくリンカーを結合させる修飾（そのような３’または５’のキャップ修飾は糖修飾及び／または骨格修飾を含んでよい）、及び（ｖｉｉ）糖の修飾または置換（例示的な糖修飾）のうち１つ以上が含まれ得る。特定の実施形態は、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または核酸に対する５’末端修飾を含む。特定の実施形態は、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または核酸に対する３’末端修飾を含む。修飾ＲＮＡは、５’末端及び３’末端の修飾を含有し得る。修飾ＲＮＡは、末端ではない位置に１つ以上の修飾残基を含有し得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡには少なくとも１つの修飾残基が含まれる。特定の実施形態では、ｍＲＮＡには少なくとも１つの修飾残基が含まれる。
本明細書で使用する場合、第１の配列と第２の配列のアラインメントにより、第１の配列が、第２の配列全体の位置のＸ％以上と一致することが示される場合、第１の配列は、第２の配列「に対する同一性が少なくともＸ％である配列を含む」とみなされる。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧに対する同一性が１００％の配列を含むが、これは、アラインメントにより、第２の配列の３つの位置すべてに対して一致が見られる１００％という同一性が示されると考えられるためである。関連するヌクレオチド（チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンなど）が同一の補体を有する限り（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンのいずれについてもアデノシンであり、別の例では、シトシン及び５－メチルシトシンはいずれもグアノシンまたは修飾グアノシンを補体として有する）、ＲＮＡとＤＮＡの違い（一般に、ウリジンをチミジンに交換、またはその逆）及び修飾ウリジンなどのヌクレオシド類似体の存在は、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の違いに寄与しない。したがって、例えば、Ｘが任意の修飾ウリジン、例えば、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、または５－メトキシウリジンなどである５’－ＡＸＧという配列はＡＵＧと１００％同一であるとみなされ、両配列とも同じ配列（５’－ＣＡＵ）に対して完全に相補的である。例示的なアラインメントアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムであり、これらは当該技術分野で周知である。当業者は、所与の整列させるべき配列対にどのアルゴリズム及びパラメータ設定を選択するのが適切かを理解するが、概して長さが同様で、期待されるアミノ酸同一性が５０％超またはヌクレオチド同一性が７５％超である配列の場合、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋウェブサーバーにてＥＢＩより提供されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムインターフェースのデフォルト設定で用いるのが一般に適切である。
ｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する組成物または製剤は、本明細書に記載するようなＣａｓヌクレアーゼ、またはクラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼまたはクラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡを提供するか、使用するか、または投与する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦは、「修飾ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子ＯＲＦ」または単に「修飾ＯＲＦ」であり、ＯＲＦが、以下の方法のうち１つ以上の方法で修飾されることを示す簡略表現として使用される：（１）修飾ＯＲＦはウリジン含量が、その最小ウリジン含量から、かかる最小ウリジン含量の１５０％までの範囲である、（２）修飾ＯＲＦはウリジンジヌクレオチド含量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含量から、かかる最小ウリジンジヌクレオチド含量の１５０％までの範囲である、（３）修飾ＯＲＦは、配列番号１、４、７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つに対する同一性が少なくとも９０％である、（４）修飾ＯＲＦは、コドンの少なくとも７５％が所与のアミノ酸についての最小ウリジンコドン（複数可）、例えば、ウリジンが最も少ないコドン（複数可）（最小ウリジンコドンは、ウリジンを２つ有するフェニルアラニンのコドンを除いては、通常０または１つである）である、１セットのコドンからなる、または（５）修飾ＯＲＦは少なくとも１つの修飾ウリジンを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＯＲＦは、上述の方法のうち少なくとも２つ、３つ、または４つの方法で修飾される。いくつかの実施形態では、修飾ＯＲＦは少なくとも１つの修飾ウリジンを含み、上記（１）～（４）のうち少なくとも１つ、２つ、３つ、またはすべての方法で修飾される。
本明細書では「修飾ウリジン」は、水素結合受容体がウリジンの場合と同じであり、かつ、ウリジンとの構造上の違いが１つ以上ある、チミジン以外のヌクレオシドを指すために使用される。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、置換ウリジン、すなわち、１つ以上の非プロトン置換基（例えば、メトキシなどのアルコキシ）がプロトンに取って代わるウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、置換プソイドウリジン、すなわち、１つ以上の非プロトン置換基（例えば、メチルなどのアルキル）がプロトンに取って代わるプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、置換ウリジン、プソイドウリジン、または置換プソイドウリジンのいずれかである。
本明細書で使用する「ウリジン位置」とは、ポリヌクレオチドにおいてウリジンまたは修飾ウリジンが占めている位置を指す。したがって、例えば、「ウリジン位置の１００％が修飾ウリジン」であるポリヌクレオチドは、それと同じ配列の従来のＲＮＡ（この場合、塩基はいずれも標準塩基のＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧである）ではウリジンであるはずのどの位置においても修飾ウリジンを含有する。特に明記しない限り、本開示内または本開示に添付の配列表（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｂｌｅ）もしくは配列表（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ）に記載のポリヌクレオチド配列におけるＵはウリジンまたは修飾ウリジンであり得る。
Figure 2023103421000001
上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦは、コドンのうち少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が最小ウリジンコドンの表に記載のコドンである、１セットのコドンで構成されてよい。上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦは、配列番号１、４、７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つに対する同一性が少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％である配列を含んでよい。
上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦは、配列番号１、４、７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つに対する同一性が少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％である配列を含んでよい。
上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦは、ウリジン含量が、その最小ウリジン含量から、かかる最小ウリジン含量の１５０％、１４５％、１４０％、１３５％、１３０％、１２５％、１２０％、１１５％、１１０％、１０５％、１０４％、１０３％、１０２％、または１０１％までの範囲であってよい。
上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含量から、かかる最小ウリジンジヌクレオチド含量の１５０％、１４５％、１４０％、１３５％、１３０％、１２５％、１２０％、１１５％、１１０％、１０５％、１０４％、１０３％、１０２％、または１０１％までの範囲であってよい。
上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦはウリジン位置の少なくとも１つ、複数、またはすべてにおいて修飾ウリジンを含んでよい。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５位において、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルなどで修飾されたウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、１位において、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルなどで修飾されたプソイドウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、またはその組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５－ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはＮ１－メチル－プソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンとＮ１－メチル－プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンと５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはＮ１－メチルプソイドウリジンと５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５－ヨードウリジンとＮ１－メチル－プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンと５－ヨードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５－ヨードウリジンと５－メトキシウリジンの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％は修飾ウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は修飾ウリジン、例えば、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、プソイドウリジン、またはその組み合わせである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％はプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％はＮ１－メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は５－ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は５－メトキシウリジンであり、残りのウリジン位置はＮ１－メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は５－ヨードウリジンであり、残りのウリジン位置はＮ１－メチルプソイドウリジンである。
上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦは、可能な限り低いウリジンジヌクレオチド（ＵＵ）含量など、低いウリジンジヌクレオチド含量を含んでよく、例えば、（ａ）どの位置にも最小ウリジンコドン（上述）を使用し、（ｂ）所与のＯＲＦと同じアミノ酸配列をコードするＯＲＦである。ウリジンジヌクレオチド（ＵＵ）含量は、ＯＲＦ内のＵＵジヌクレオチドの計数として絶対値で表すか、またはウリジンジヌクレオチドのウリジンが占めている位置の割合として比率で表すことができる（例えば、ＡＵＵＡＵの場合であれば、５つの位置のうち２つがウリジンジヌクレオチドのウリジンで占められているのでウリジンジヌクレオチド含量は４０％となる）。最小ウリジンジヌクレオチド含量を評価するために、修飾ウリジン残基はウリジンと同等であるとみなす。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、発現された哺乳類ｍＲＮＡ、例えば、構成的に発現しているｍＲＮＡなどに由来するＵＴＲを少なくとも１つ含む。ｍＲＮＡは、健常成体哺乳類の少なくとも１つの組織で継続的に転写されている場合、哺乳類で構成的に発現されているとみなされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、発現された哺乳類のＲＮＡ、例えば、構成的に発現された哺乳類のｍＲＮＡなどに由来する５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’と３’の両ＵＴＲを含む。アクチンｍＲＮＡは構成的に発現しているｍＲＮＡの一例である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１７－ベータヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４（ＨＳＤ１７Ｂ４またはＨＳＤ）由来の少なくとも１つのＵＴＲ、例えば、ＨＳＤ由来の５’ＵＴＲなどを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、グロビンｍＲＮＡ、例えば、ヒトアルファグロビン（ＨＢＡ）ｍＲＮＡ、ヒトベータグロビン（ＨＢＢ）ｍＲＮＡ、またはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）ベータグロビン（ＸＢＧ）ｍＲＮＡなどに由来する少なくとも１つのＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、グロビンｍＲＮＡ、例えば、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧなどに由来する５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’と３’の両ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウスＨｂａ－ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧに由来する５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス、マウスＨｂａ－ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧに由来する３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス、マウスＨｂａ－ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＸＢＧ、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ベータ－アクチン、アルファ－チューブリン、腫瘍タンパク質（ｐ５３）、または上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に由来する５’と３’の両ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、同じ供給源に由来する５’と３’の両ＵＴＲ、例えば、アクチン、アルブミン、またはグロビン、例えば、ＨＢＡ、ＨＢＢ、もしくはＸＢＧなどのような構成的に発現しているｍＲＮＡなどに由来する５’と３’の両ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは５’ＵＴＲを含まず、例えば、５’キャップと開始コドンの間にはさらなるヌクレオチドはない。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは５’キャップと開始コドンの間にコザック配列（以下に記載）を含むが、さらなる５’ＵＴＲは何もない。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは３’ＵＴＲを含まず、例えば、終止コドンとポリＡ尾部の間にはさらなるヌクレオチドはない。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはコザック配列を含む。コザック配列は、翻訳開始及びｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドの全体としての収率に影響を及ぼし得る。コザック配列には、開始コドンとして機能し得るメチオニンコドンが含まれる。最小コザック配列はＮＮＮＲＵＧＮであり、以下のうち少なくとも１つが真である、すなわち、１番目のＮはＡまたはＧであり、かつ２番目のＮはＧである。ヌクレオチド配列においては、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）を意味する。いくつかの実施形態では、コザック配列はＲＮＮＲＵＧＮ、ＮＮＮＲＵＧＧ、ＲＮＮＲＵＧＧ、ＲＮＮＡＵＧＮ、ＮＮＮＡＵＧＧ、またはＲＮＮＡＵＧＧである。いくつかの実施形態では、コザック配列はｒｃｃＲＵＧｇであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチを最高で１つもしくは２つ有する。いくつかの実施形態では、コザック配列はｒｃｃＡＵＧｇであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチを最高で１つもしくは２つ有する。いくつかの実施形態では、コザック配列はｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチを最高で１つ、２つ、もしくは３つ有する。いくつかの実施形態では、コザック配列はｇｃｃＡｃｃＡＵＧであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチを最高で１つ、２つ、３つ、もしくは４つ有する。いくつかの実施形態では、コザック配列はＧＣＣＡＣＣＡＵＧである。いくつかの実施形態では、コザック配列はｇｃｃｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチを最高で１つ、２つ、３つ、もしくは４つ有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、配列番号４３に対する同一性が少なくとも９０％である配列を含み、ここで、任意選択で、配列番号４３のＯＲＦ（すなわち、配列番号４）は、配列番号７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つの代替的ＯＲＦで置換される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、配列番号４４に対する同一性が少なくとも９０％である配列を含み、ここで、任意選択で、配列番号４４のＯＲＦ（すなわち、配列番号４）は、配列番号７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つの代替的ＯＲＦで置換される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、配列番号５６に対する同一性が少なくとも９０％である配列を含み、ここで、任意選択で、配列番号５６のＯＲＦ（すなわち、配列番号４）は、配列番号７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つの代替的ＯＲＦで置換される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、配列番号５７に対する同一性が少なくとも９０％である配列を含み、ここで、任意選択で、配列番号５７のＯＲＦ（すなわち、配列番号４）は、配列番号７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つの代替的ＯＲＦで置換される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、配列番号５８に対する同一性が少なくとも９０％である配列を含み、ここで、任意選択で、配列番号５８のＯＲＦ（すなわち、配列番号４）は、配列番号７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つの代替的ＯＲＦで置換される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、配列番号５９に対する同一性が少なくとも９０％である配列を含み、ここで、任意選択で、配列番号５９のＯＲＦ（すなわち、配列番号４）は、配列番号７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つの代替的ＯＲＦで置換される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、配列番号６０に対する同一性が少なくとも９０％である配列を含み、ここで、任意選択で、配列番号６０のＯＲＦ（すなわち、配列番号４）は、配列番号７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つの代替的ＯＲＦで置換される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、配列番号６１に対する同一性が少なくとも９０％である配列を含み、ここで、任意選択で、配列番号６１のＯＲＦ（すなわち、配列番号４）は、配列番号７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つの代替的ＯＲＦで置換される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つの代替的ＯＲＦを含む。
いくつかの実施形態では、任意選択で置換された、配列番号４３、４４、または５６～６１の配列に対する同一性の程度は９５％である。いくつかの実施形態では、任意選択で置換された、配列番号４３、４４、または５６～６１の配列に対する同一性の程度は９８％である。いくつかの実施形態では、任意選択で置換された、配列番号４３、４４、または５６～６１の配列に対する同一性の程度は９９％である。いくつかの実施形態では、任意選択で置換された、配列番号４３、４４、または５６～６１の配列に対する同一性の程度は１００％である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示するｍＲＮＡは、５’キャップ、例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２などを含む。５’キャップは一般に、ｍＲＮＡの５’から３’方向への鎖の１番目のヌクレオチドの５’位に５’－三リン酸を介して連結されている７－メチルグアニンリボヌクレオチド（これを、以下に考察するように、例えば、ＡＲＣＡに関してさらに修飾してよい）であり、すなわち、第１のキャップ近傍ヌクレオチドである。Ｃａｐ０では、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近傍ヌクレオチドのリボースはいずれも２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１では、ｍＲＮＡの第１及び第２の転写されたヌクレオチドのリボースはそれぞれ、２’－メトキシ及び２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ２では、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近傍ヌクレオチドのリボースはいずれも２’－メトキシを含む。例えば、Ｋａｔｉｂａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（３３）：１２０２５－３０、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１４（１１）：Ｅ２１０６－Ｅ２１１５を参照のこと。ヒトｍＲＮＡなど哺乳類ｍＲＮＡを含め、高等真核生物のほとんどの内在性ｍＲＮＡはＣａｐ１またはＣａｐ２を含む。Ｃａｐ０、ならびにＣａｐ１及びＣａｐ２とは異なる他のキャップ構造は、ヒトなどの哺乳類ではＩＦＩＴ－１及びＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の成分によって「非自己」として認識されるために免疫原性である場合があり、これによりＩ型インターフェロンを含めサイトカインレベルが上昇し得る。ＩＦＩＴ－１及びＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の成分はまた、Ｃａｐ１またはＣａｐ２以外のキャップを有するｍＲＮＡの結合についてｅＩＦ４Ｅと競合する場合もあり、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する可能性がある。
キャップは共転写によって含めることができる。例えば、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＡＭ８０４５）は、グアニンリボヌクレオチドの５’位に連結された７－メチルグアニン３’－メトキシ－５’－三リン酸を含む、インビトロでの転写開始時に転写産物内に組み込まれ得るキャップアナログである。ＡＲＣＡでは、第１キャップ近傍ヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるＣａｐ０のキャップになる。例えば、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ‘ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ’ ｃａｐ ａｎａｌｏｇｓ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ）ＧｐｐｐＧ ａｎｄ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’ｄｅｏｘｙ）ＧｐｐｐＧ，”ＲＮＡ ７：１４８６－１４９５を参照のこと。ＡＲＣＡの構造を以下に示す。
Figure 2023103421000002
ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１１３）またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１３３）を使用すると、共転写によってＣａｐ１構造を得ることができる。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ及びＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧの３’－Ｏ－メチル化型もそれぞれＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓよりカタログ番号Ｎ－７４１３及びＮ－７４３３として入手可能である。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ構造を以下に示す。
Figure 2023103421000003
別法として、転写後にＲＮＡにキャップを付加することができる。例えば、ワクシニアのキャッピング酵素が市販されているが（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ２０８０Ｓ）、これは、そのＤ１サブユニットにより与えられるＲＮＡトリホスファターゼ活性及びグアニリルトランスフェラーゼ活性、ならびにそのＤ１２サブユニットにより与えられるグアニンメチルトランスフェラーゼを有する。したがって、この酵素は、Ｓ－アデノシルメチオニン及びＧＴＰの存在下、Ｃａｐ０を与えるようＲＮＡに７－メチルグアニンを付加することができる。例えば、Ｇｕｏ，Ｐ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，４０２３－４０２７、Ｍａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２４４７２－２４４７９を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはさらにポリアデニル化（ポリＡ）尾部を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個のアデニン、任意選択で最高３００個のアデニンを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、または１００個のアデニンヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリＡ尾部は、ポリＡ尾部内の１つ以上の位置において１個以上の非アデニンヌクレオチド「アンカー」で「中断」される。ポリＡ尾部は少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドを含んでよいが、１個以上の非アデニンヌクレオチドも含む。本明細書で使用する場合、「非アデニンヌクレオチド」とは、アデニンを含まない任意の天然または非天然のヌクレオチドを指す。グアニン、チミン、及びシトシンヌクレオチドは例示的な非アデニンヌクレオチドである。したがって、本明細書に記載するｍＲＮＡのポリＡ尾部は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子または目的配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する連続するアデニンヌクレオチドを含んでよい。いくつかの例では、ｍＲＮＡのポリＡ尾部は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子または目的配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する非連続的なアデニンヌクレオチドを含み、ここで、非アデニンヌクレオチドによりアデニンヌクレオチドが規則的または不規則に空いた間隔で中断される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはさらにポリアデニル化（ポリＡ）尾部を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個のアデニン、任意選択で最高３００個のアデニンを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、または１００個のアデニンヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリＡ尾部は、ポリＡ尾部内の１つ以上の位置において１個以上の非アデニンヌクレオチド「アンカー」で「中断」される。ポリＡ尾部は少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドを含んでよいが、１個以上の非アデニンヌクレオチドも含む。本明細書で使用する場合、「非アデニンヌクレオチド」とは、アデニンを含まない任意の天然または非天然のヌクレオチドを指す。グアニン、チミン、及びシトシンヌクレオチドは例示的な非アデニンヌクレオチドである。したがって、本明細書に記載するｍＲＮＡのポリＡ尾部は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子または目的配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する連続するアデニンヌクレオチドを含んでよい。いくつかの例では、ｍＲＮＡのポリＡ尾部は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子または目的配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する非連続的なアデニンヌクレオチドを含み、ここで、非アデニンヌクレオチドによりアデニンヌクレオチドが規則的または不規則に空いた間隔で中断される。
いくつかの実施形態では、連続するアデニンヌクレオチドの長く伸びた領域にポリ（Ａ）結合タンパク質が結合できるよう、連続するアデニンヌクレオチドを中断するため１個以上の非アデニンヌクレオチドを配する。いくつかの実施形態では、少なくとも８個、９個、１０個、１１個、または１２個連続するアデニンヌクレオチドの後に１個以上の非アデニンヌクレオチド（複数可）を位置させる。いくつかの実施形態では、少なくとも８～５０個連続するアデニンヌクレオチドの後に１個以上の非アデニンヌクレオチドを位置させる。いくつかの実施形態では、少なくとも８～１００個連続するアデニンヌクレオチドの後に１個以上の非アデニンヌクレオチドを位置させる。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のアデニンヌクレオチドの後にあり、その後に少なくとも８個連続するアデニンヌクレオチドが続く。
ポリＡ尾部は、連続するアデニンヌクレオチドの配列を１つ、その後に１個以上の非アデニンヌクレオチド、任意選択でその後にさらなるアデニンヌクレオチドを含んでよい。
いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、非アデニンヌクレオチドを１個、または非アデニンヌクレオチドが２～１０個連続する長い領域を１つ含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも８個、９個、１０個、１１個、または１２個連続するアデニンヌクレオチドの後に非アデニンヌクレオチド（複数可）を位置させる。いくつかの例では、少なくとも８～５０個連続するアデニンヌクレオチドの後に１個以上の非アデニンヌクレオチドを位置させる。いくつかの実施形態では、少なくとも８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、または５０個連続するアデニンヌクレオチドの後に１個以上の非アデニンヌクレオチドを位置させる。
いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドはグアニン、シトシン、またはチミンである。いくつかの例では、非アデニンヌクレオチドはグアニンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドはシトシンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドはチミンヌクレオチドである。２個以上の非アデニンヌクレオチドが存在するいくつかの例では、非アデニンヌクレオチドは、ａ）グアニンヌクレオチド及びチミンヌクレオチド、ｂ）グアニンヌクレオチド及びシトシンヌクレオチド、ｃ）チミンヌクレオチド及びシトシンヌクレオチド、またはｄ）グアニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド及びシトシンヌクレオチドから選択してよい。非アデニンヌクレオチドを含む例示的なポリＡ尾部を配列番号６２として記載する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを精製する。いくつかの実施形態では、沈殿方法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿、アルコール沈殿など、または同等の方法、例えば、本明細書に記載の方法など）を使用してｍＲＮＡを精製する。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣを用いる方法など、クロマトグラフィーを用いる方法または同等の方法（例えば、本明細書に記載の方法）を使用してｍＲＮＡを精製する。いくつかの実施形態では、沈殿方法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿）及びＨＰＬＣを用いる方法の両方を使用してｍＲＮＡを精製する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のｍＲＮＡと組み合わせて少なくとも１つのｇＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｍＲＮＡとは別の分子として提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書に開示のｍＲＮＡの一部として、例えば、ＵＴＲの一部として提供される。
化学修飾ｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡを化学的に修飾する。１つ以上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡは「修飾」ｇＲＮＡまたは「化学修飾」ｇＲＮＡと呼ばれ、標準残基Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵの代わりに使用されるかまたは追加で使用される天然には生じない成分もしくは構成及び／または天然に生じる成分もしくは構成が１つ以上存在することを表す。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは非標準のヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成され、これを本明細書では「修飾」と呼ぶ。修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドには、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合におけるリン酸基の非連結酸素のうちの一方もしくは両方及び／またはリン酸基の連結酸素のうち１つ以上の変化、例えば、置換（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の２’位のヒドロキシルなどの変化、例えば、置換（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）「デホスホ」リンカーでのリン酸部分の大幅な置換（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）非標準核酸塩基を用いるなど、天然に生じる核酸塩基の修飾または置換（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボース－リン酸骨格の置換または修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基を除去、修飾もしくは置換するか、または部分、キャップもしくリンカーを結合させる修飾（そのような３’または５’のキャップ修飾は糖修飾及び／または骨格修飾を含んでよい）、及び（ｖｉｉ）糖の修飾または置換（例示的な糖修飾）のうち１つ以上が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、一部または全部のウリジン位置において修飾ウリジンを含む。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５位において、例えば、ハロゲンまたはＣ１－Ｃ６アルコキシなどで修飾されたウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、１位において、例えば、Ｃ１－Ｃ６アルキルなどで修飾されたプソイドウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、またはその組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５－ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはＮ１－メチル－プソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンとＮ１－メチル－プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンと５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはＮ１－メチルプソイドウリジンと５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５－ヨードウリジンとＮ１－メチル－プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンと５－ヨードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５－ヨードウリジンと５－メトキシウリジンの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％は修飾ウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は修飾ウリジン、例えば、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、プソイドウリジン、またはその組み合わせである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％はプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％はＮ１－メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は５－ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は５－メトキシウリジンであり、残りのウリジン位置はＮ１－メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％は５－ヨードウリジンであり、残りのウリジン位置はＮ１－メチルプソイドウリジンである。
上掲のような化学修飾を組み合わせて、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の修飾を有し得るヌクレオシド及びヌクレオチド（総称して「残基」と呼ぶ）を含む修飾ｇＲＮＡを得ることができる。例えば、修飾残基は修飾糖及び修飾核酸塩基を有し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのどの塩基も修飾する、例えば、塩基すべてがホスホロチオアート基などの修飾リン酸基を有する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の全部または実質的に全部をホスホロチオアート基で置き換える。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端またはその近傍に少なくとも１つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端またはその近傍に少なくとも１つの修飾残基を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは修飾残基を１つ、２つ、３つ、またはそれ以上含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡの位置のうち少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）は修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
非修飾核酸は、例えば、細胞内または血清中に見られるヌクレアーゼなどによって分解される傾向があり得る。例えば、ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。したがって、一態様では、本明細書に記載するｇＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有して、例えば、細胞内または血清中のヌクレアーゼに対する安定性を導入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ｇＲＮＡ分子は、インビボでもエキソビボでも細胞集団に導入した場合に低い自然免疫応答を示し得る。用語「自然免疫応答」には、一本鎖核酸などの外来性核酸に対する細胞応答が含まれ、サイトカインの発現及び放出、特にインターフェロンの放出、ならびに細胞死の誘導を行う。
骨格修飾のいくつかの実施形態では、修飾残基のリン酸基は、酸素の１つ以上を異なる置換基で置き換えることによって修飾することができる。さらに、修飾残基、例えば、修飾核酸に存在する修飾残基には、本明細書に記載する修飾リン酸基での非修飾リン酸部分の大幅な置換が含まれ得る。いくつかの実施形態では、リン酸骨格の骨格修飾には、非荷電リンカーまたは電荷分布が非対称的な荷電リンカーのいずれかをもたらす変化が含まれ得る。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオアート、ホスホロセレナート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミダート、ホスホン酸アルキルまたはホスホン酸アリール及びホスホトリエステルが挙げられる。非修飾リン酸基のリン原子はアキラルである。ただし、非架橋酸素のうちの１個を上記の原子または原子団の１つで置き換えることにより、そのリン原子をキラルにすることができる。不斉リン原子は、「Ｒ」立体配置（本明細書ではＲｐ）または「Ｓ」立体配置（本明細書ではＳｐ）のいずれも有することができる。骨格はまた、架橋酸素（すなわち、リン酸基とヌクレオシドを連結する酸素）を窒素（架橋ホスホロアミダート）、硫黄（架橋ホスホロチオアート）及び炭素（架橋メチレンホスホナート）で置き換えることによって修飾することもできる。置き換えは、連結酸素のいずれか、または連結酸素の両方において出現してよい。
特定の骨格修飾では、リン酸基をリン不含のコネクタで置き換えることができる。いくつかの実施形態では、荷電リン酸基を中性部分で置き換えることができる。リン酸基に換わることができる部分の例としては、限定することなく、例えば、メチルホスホナート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カルボナート、カルボキシメチル、カルバマート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホナート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ及びメチレンオキシメチルイミノを挙げることができる。
鋳型核酸
本明細書に開示する組成物及び方法には鋳型核酸が含まれ得る。鋳型を使用して、Ｃａｓヌクレアーゼの標的部位またはその近傍にて核酸配列を変化させるかまたは挿入してよい。いくつかの実施形態では、方法は、細胞に鋳型を導入することを含む。いくつかの実施形態では、単一の鋳型が提供され得る。他の実施形態では、２つ以上の標的部位にて編集が生じるよう２つ以上の鋳型が提供され得る。例えば、ある細胞の単一遺伝子、またはある細胞の２つの異なる遺伝子を編集するため、異なる鋳型が提供され得る。
いくつかの実施形態では、鋳型を相同組換えで使用してよい。いくつかの実施形態では、相同組換えにより、標的核酸分子内への鋳型配列または鋳型配列の一部の組み込みがもたらされ得る。他の実施形態では、鋳型を、核酸の切断部位でＤＮＡ鎖の侵入が起こる相同組換え修復で使用してよい。いくつかの実施形態では、相同組換え修復により、鋳型配列が、編集された標的核酸分子内に含まれるということがもたらされ得る。さらに別の実施形態では、非相同末端結合によって媒介される遺伝子編集で鋳型を使用してよい。いくつかの実施形態では、鋳型配列には、切断部位近傍の核酸配列に対する類似性は全くない。いくつかの実施形態では、鋳型または鋳型配列の一部を組み込む。いくつかの実施形態では、鋳型には、隣接する末端逆位反復（ＩＴＲ）配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、鋳型は、切断部位のそれぞれ上流及び下流に位置する配列に相補的な、第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアーム（第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列とも呼ばれる）を含んでよい。鋳型が２つのホモロジーアームを含有する場合、各アームは長さが同じであっても異なっていてもよく、ホモロジーアームに挟まれた配列は、ホモロジーアームに挟まれた標的配列と実質的に類似であるかもしくは同一であり得る、または全く無関係の配列であり得る。いくつかの実施形態では、鋳型上の第１のヌクレオチド配列と切断部位の上流の配列との相補性または同一性パーセントの程度、及び鋳型上の第２のヌクレオチド配列と切断部位の下流の配列との相補性または同一性パーセントの程度により、鋳型と標的核酸分子の間の相同組換え、例えば、高忠実度相同組換えなどが可能になり得る。いくつかの実施形態では、相補性の程度は約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、相補性の程度は約９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、相補性の程度は少なくとも９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、相補性の程度は１００％であってよい。いくつかの実施形態では、同一性パーセントは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、同一性パーセントは約９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、同一性パーセントは少なくとも９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、同一性パーセントは１００％であってよい。
いくつかの実施形態では、鋳型配列は、標的細胞の内在性配列に対応するか、それを含むか、またはそれからなってよい。さらに、または別法として、鋳型配列は、標的細胞の外来配列に対応するか、それを含むか、またはそれからなってよい。本明細書で使用する場合、用語「内在性配列」とは、その細胞にとって天然である配列を指す。用語「外来配列」とは、その細胞にとって天然ではない配列、またはその細胞のゲノムにおける天然での位置が別の異なる位置にある配列を指す。いくつかの実施形態では、内在性配列は細胞のゲノム配列であってよい。いくつかの実施形態では、内在性配列は染色体の配列または染色体外の配列であってよい。いくつかの実施形態では、内在性配列は細胞のプラスミド配列であってよい。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、切断部位またはその近傍において細胞の内在性配列の一部と実質的に同一であってよいが、少なくとも１つのヌクレオチドの変化を含む。いくつかの実施形態では、切断された標的核酸分子を鋳型で編集することにより、標的核酸分子の１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む変異がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、変異により、標的配列を含む遺伝子により発現されたタンパク質において１つ以上のアミノ酸の変化がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、変異は、標的遺伝子により発現されたＲＮＡに１つ以上のヌクレオチドの変化をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は標的遺伝子の発現レベルを変化させ得る。いくつかの実施形態では、変異は標的遺伝子の発現の増大または低下をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は遺伝子ノックダウンをもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は遺伝子ノックアウトをもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は遺伝子機能の回復をもたらし得る。いくつかの実施形態では、切断された標的核酸分子を鋳型で編集することにより、ＤＮＡなどの標的核酸分子エキソン配列、イントロン配列、制御配列、転写制御配列、翻訳制御配列、スプライシング部位、または非コード配列の変化がもたらされ得る。
他の実施形態では、鋳型配列は外来配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、外来配列は、外来性プロモーター配列に機能的に連結された、タンパク質またはＲＮＡをコードする配列を含んでよく、外来配列が標的核酸分子に組み込まれた際に、かかる組み込み配列でコードされたタンパク質またはＲＮＡを細胞が発現することができるようにしてよい。他の実施形態では、外来配列が標的核酸分子内に組み込まれた際、かかる組み込み配列の発現は内在性プロモーター配列によって制御されてよい。いくつかの実施形態では、外来配列は、タンパク質または該タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ配列を提供してよい。さらに別の実施形態では、外来配列は、エキソン配列、イントロン配列、制御配列、転写制御配列、翻訳制御配列、スプライシング部位、または非コード配列を含むかまたはそれからなってよい。いくつかの実施形態では、外来配列の組み込みにより遺伝子機能の回復がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、外来配列の組み込みにより遺伝子ノックインがもたらされ得る。いくつかの実施形態では、外来配列の組み込みにより遺伝子ノックアウトがもたらされ得る。
鋳型は、適切な任意の長さであってよい。いくつかの実施形態では、鋳型は、１０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長、１０００ヌクレオチド長、１５００ヌクレオチド長、２０００ヌクレオチド長、２５００ヌクレオチド長、３０００ヌクレオチド長、３５００ヌクレオチド長、４０００ヌクレオチド長、４５００ヌクレオチド長、５０００ヌクレオチド長、５５００ヌクレオチド長、６０００ヌクレオチド長、またはそれ以上のヌクレオチド長を含んでよい。鋳型は一本鎖核酸であってよい。鋳型は二本鎖または部分的二本鎖の核酸であり得る。特定の実施形態では、一本鎖鋳型は、２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１２５ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１７５ヌクレオチド長、または２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型は、標的配列（すなわち、「ホモロジーアーム」）を含む標的核酸分子の一部に相補的なヌクレオチド配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、鋳型は、標的核酸分子上の切断部位の上流または下流に位置する配列に相補的なホモロジーアームを含んでよい。
いくつかの実施形態では、鋳型は、末端逆位反復（ＩＴＲ）配列が隣接して含有されるｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、鋳型は、ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノサークル、またはＰＣＲ産物として提供される。
核酸の精製
いくつかの実施形態では、核酸を精製する。いくつかの実施形態では、沈殿方法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿、アルコール沈殿、または同等の方法、例えば、本明細書に記載の方法など）を使用して核酸を精製する。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣを用いる方法など、クロマトグラフィーを用いる方法または同等の方法（例えば、本明細書に記載の方法）を使用して核酸を精製する。いくつかの実施形態では、沈殿方法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿）及びＨＰＬＣを用いる方法の両方を使用して核酸を精製する。
標的配列
いくつかの実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を標的核酸分子上の標的配列に配向させ、切断してよい。例えば、標的配列は、Ｃａｓヌクレアーゼによって認識され、切断されてよい。特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼの標的配列は、かかるヌクレアーゼの特異的ＰＡＭ配列の近傍に位置する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的核酸分子の標的配列にクラス２Ｃａｓヌクレアーゼを配向させ、そこで、ｇＲＮＡは標的配列とハイブリダイズし、クラス２Ｃａｓタンパク質が標的配列を切断してよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼの特異的ＰＡＭに隣接するかまたはそれを含む標的配列とハイブリダイズし、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼはかかる標的配列を切断する。いくつかの実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡの指向性配列に相補的であってよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの指向性配列と、それに対応する、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする標的配列の部分との相補性の程度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの指向性配列と、それに対応する、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする標的配列の部分との同一性パーセントは、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、標的の相同性領域は特異的ＰＡＭ配列に隣接している。いくつかの実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡの指向性配列と１００％相補的な配列を含んでよい。他の実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡの指向性配列と比べて少なくとも１つのミスマッチ、欠失、または挿入を含んでよい。
標的配列の長さは使用するヌクレアーゼ系によって異なってよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系用のガイドＲＮＡの指向性配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０超のヌクレオチド長を含んでよく、標的配列は対応する長さであり、任意選択でＰＡＭ配列に隣接する。いくつかの実施形態では、標的配列は１５～２４ヌクレオチド長を含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列は１７～２１ヌクレオチド長を含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列は２０ヌクレオチド長を含んでよい。ニッカーゼを使用する場合、標的配列は、ＤＮＡ分子の反対鎖を切断する一対のニッカーゼによって認識される一対の標的配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＤＮＡ分子の同じ鎖を切断する一対のニッカーゼによって認識される一対の標的配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、１つ以上のＣａｓヌクレアーゼによって認識される標的配列の一部を含んでよい。
標的核酸分子は、細胞にとって内在性または外来性であるどのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であってもよい。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、細胞由来または細胞内のエピソームＤＮＡ、プラスミド、ゲノムＤＮＡ、ウイルスゲノム、ミトコンドリアＤＮＡ、または染色体ＤＮＡであってよい。いくつかの実施形態では、標的核酸分子の標的配列は、ヒト細胞などの細胞由来または細胞内のゲノム配列であってよい。
さらなる実施形態では、標的配列はウイルス配列であってよい。さらなる実施形態では、標的配列は病原体配列であってよい。さらに別の実施形態では、標的配列は合成配列であってよい。さらなる実施形態では、標的配列は染色体配列であってよい。特定の実施形態では、標的配列は転座接合部、例えば、がんに関連した転座を含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列はヒト染色体など真核生物の染色体上にあってよい。特定の実施形態では、標的配列は肝臓特異的配列であり、その場合、その配列は肝細胞に発現する。
いくつかの実施形態では、標的配列は遺伝子のコード配列内、遺伝子のイントロン配列内、制御配列内、遺伝子の転写制御配列内、遺伝子の翻訳制御配列内、スプライシング部位または遺伝子間の非コード配列内に位置してよい。いくつかの実施形態では、遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であってよい。他の実施形態では、遺伝子はノンコーディングＲＮＡ遺伝子であってよい。いくつかの実施形態では、標的配列は疾患関連遺伝子の全部または一部を含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、ゲノムの非遺伝子機能部位、例えば、足場部位または遺伝子座制御領域のようなクロマチン組織の側面を制御する部位に位置してよい。
クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼが関係する実施形態では、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）に隣接してよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、標的配列の３’末端に隣接するかまたはその１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、または４ヌクレオチド以内にあってよい。ＰＡＭの長さ及び配列は、使用するＣａｓタンパク質によって異なってよい。例えば、ＰＡＭは、特定のＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オルソログについてのコンセンサス配列または特定のＰＡＭ配列から選択してよく、これには、関連開示それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５２０：１８６－１９１（２０１５）の図１、及びＺｅｔｓｃｈｅ ２０１５の図Ｓ５に開示のものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、２ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、または１０ヌクレオチド長であってよい。非限定的な例示的ＰＡＭ配列としては、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧ、ＮＧ、ＮＡＡＡＡＮ、ＮＮＡＡＡＡＷ、ＮＮＮＮＡＣＡ、ＧＮＮＮＣＮＮＡ、ＴＴＮ、及びＮＮＮＮＧＡＴＴが挙げられる（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドとして定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかとして定義される）。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＧＧであってよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＧＧＮＧであってよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＴＴＮであってよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＮＡＡＡＡＷであってよい。
脂質製剤
本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓカーゴなど、ＲＮＡのＬＮＰ製剤のさまざまな実施形態を開示する。そのようなＬＮＰ製剤には、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質とともに「アミン脂質」が含まれる。いくつかの実施形態では、そのようなＬＮＰ製剤には、ヘルパー脂質及びＰＥＧ脂質とともに「アミン脂質」が含まれる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤には、１パーセント未満の中性リン脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤には、０．５パーセント未満の中性リン脂質が含まれる。「脂質ナノ粒子」は、互いに分子間力によって物理的に会合している複数（すなわち２つ以上）の脂質分子を含む粒子を意味する。
アミン脂質
生物学的に活性な薬剤を送達するためのＬＮＰ組成物は、リピドＡのアセタール類似体など、リピドＡまたはその同等物として定義される「アミン脂質」を含む。
いくつかの実施形態では、アミン脂質はリピドＡであり、これは（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる。リピドＡは、
Figure 2023103421000004
 のように表され得る。
リピドＡはＷＯ２０１５／０９５３４０（例えば、８４～８６頁）に従って合成してよい。特定の実施形態では、アミン脂質はリピドＡと同等物である。
特定の実施形態では、アミン脂質はリピドＡの類似体である。特定の実施形態では、リピドＡ類似体はリピドＡのアセタール類似体である。特定のＬＮＰ組成物では、アセタール類似体はＣ４－Ｃ１２アセタール類似体である。いくつかの実施形態では、アセタール類似体はＣ５－Ｃ１２アセタール類似体である。さらなる実施形態では、アセタール類似体はＣ５－Ｃ１０アセタール類似体である。さらなる実施形態では、アセタール類似体は、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、及びＣ１２のアセタール類似体から選ばれる。
本明細書に記載するＬＮＰでの使用に好適なアミン脂質はインビボで生物分解性であり、ＲＮＡなどの生物学的に活性な物質を細胞に送達するのに好適である。アミン脂質は毒性が低い（例えば、１０ｍｇ／ｋｇ以上のＲＮＡカーゴ量で動物モデルでの忍容性があり、有害作用がない）。特定の実施形態では、アミン脂質を含むＬＮＰには、アミン脂質の少なくとも７５％が８時間以内、１０時間以内、１２時間以内、２４時間以内、もしくは４８時間以内、または３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、もしくは１０日以内に血漿から消失するものが含まれる。特定の実施形態では、アミン脂質を含むＬＮＰには、ｍＲＮＡまたはｇＲＮＡの少なくとも５０％が８時間以内、１０時間以内、１２時間以内、２４時間以内、もしくは４８時間以内、または３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、もしくは１０日以内に血漿から消失するものが含まれる。特定の実施形態では、アミン脂質を含むＬＮＰには、例えば、脂質（例えば、アミン脂質）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、または別の成分を測定して、ＬＮＰの少なくとも５０％が８時間以内、１０時間以内、１２時間以内、２４時間以内、もしくは４８時間以内、または３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、もしくは１０日以内に血漿から消失するものが含まれる。特定の実施形態では、ＬＮＰの脂質、ＲＮＡ、または核酸成分を脂質に封入した場合と遊離の場合とで測定する。
脂質クリアランスは、文献に記載のとおり測定してよい。Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｐｉｄｓ Ｅｎａｂｌｉｎｇ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１３，２１（８），１５７０－７８（「Ｍａｉｅｒ」）を参照のこと。例えば、Ｍａｉｅｒでは、ルシフェラーゼ－指向性ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰ－ｓｉＲＮＡ系を０．３ｍｇ／ｋｇにて６～８週齢雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに側尾静脈を介して静脈内ボーラス注射により投与した。投与から０．０８３時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、９６時間、及び１６８時間の後、血液、肝臓、及び脾臓の各試料を採取した。マウスを生理食塩水で灌流してから組織を採取し、血液試料を処理して血漿を得た。全試料を処理し、ＬＣ－ＭＳで分析した。さらに、Ｍａｉｅｒは、ＬＮＰ－ｓｉＲＮＡ製剤投与後の毒性評価の手法を記載している。例えば、雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに対しルシフェラーゼ－指向性ｓｉＲＮＡを０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇ（動物５匹／群）にて５ｍＬ／ｋｇの投与容量で単一静脈内ボーラス注射により投与した。２４時間後、約１ｍＬの血液を覚醒動物の頚静脈から得、血清を単離した。投与から７２時間後、全動物を剖検用に安楽死させた。臨床徴候、体重、血清化学検査、臓器重量及び組織病理学の評価を実施した。Ｍａｉｅｒは、ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ製剤を評価するための方法を記載しており、これらの方法を本開示のＬＮＰ組成物の投与に関するクリアランス、薬物動態、及び毒性の評価に適用してよい。
アミン脂質はクリアランス速度の増大を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、脂質クリアランス速度、例えば、血液、血清、または血漿から脂質が消失する速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、ＲＮＡクリアランス速度、例えば、血液、血清、または血漿からｍＲＮＡまたはｇＲＮＡが消失する速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、血液、血清、または血漿からＬＮＰが消失する速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、肝組織または脾臓組織などの組織からＬＮＰが消失する速度である。特定の実施形態では、高クリアランス速度は実質的に有害作用のない安全性プロファイルをもたらす。アミン脂質は、循環中及び組織内でのＬＮＰの蓄積を低下させ得る。いくつかの実施形態では、循環中及び組織内でのＬＮＰの蓄積低下は、実質的に有害作用のない安全性プロファイルをもたらす。
本開示のアミン脂質は、それが含まれている培地のｐＨに応じてイオン化され得る（例えば、塩を形成してよい）。例えば、わずかに酸性の培地では、アミン脂質はプロトン化されてよく、したがって正電荷を帯びてよい。逆に、例えば、血液などのようにｐＨが約７．３５であるわずかに塩基性の培地ではアミン脂質はプロトン化されない場合があり、したがって電荷を帯びない場合がある。いくつかの実施形態では、本開示のアミン脂質は、ｐＨが少なくとも約９でプロトン化され得る。いくつかの実施形態では、本開示のアミン脂質は、ｐＨが少なくとも約９でプロトン化され得る。いくつかの実施形態では、本開示のアミン脂質は、ｐＨが少なくとも約１０でプロトン化され得る。
アミン脂質が優勢にプロトン化されるｐＨは、その内因性ｐＫａに関連している。いくつかの実施形態では、本開示のアミン脂質は各々独立して、ｐＫａが約５．１～約７．４の範囲にあってよい。いくつかの実施形態では、本開示のアミン脂質は各々独立して、ｐＫａが約５．５～約６．６の範囲にあってよい。いくつかの実施形態では、本開示のアミン脂質は各々独立して、ｐＫａが約５．６～約６．４の範囲にあってよい。いくつかの実施形態では、本開示のアミン脂質は各々独立して、ｐＫａが約５．８～約６．２の範囲にあってよい。例えば、本開示のアミン脂質は各々独立して、ｐＫａが約５．８～約６．５の範囲にあってよい。ｐＫａが約５．１～約７．４の範囲のカチオン性脂質はカーゴをインビボで、例えば、肝臓などに送達する際に有効であることが見出されていることから、アミン脂質のｐＫａはＬＮＰの製剤化において考慮すべき重要な事項であり得る。さらに、ｐＫａが約５．３～約６．４の範囲のカチオン性脂質はインビボで、例えば、腫瘍などに送達する際に有効であることが見出されている。例えば、ＷＯ２０１４／１３６０８６を参照のこと。
さらなる脂質
本開示の脂質組成物での使用に好適な「中性脂質」としては、例えば、多種多様な中性脂質、非荷電脂質または両性イオン型脂質などが挙げられる。本開示での使用に好適な中性リン脂質の例としては、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシン）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ｄｉｌａｕｒｙｌｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン及びその組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）及びジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択されてよい。別の実施形態では、中性リン脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であってよい。別の実施形態では、中性リン脂質はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）であってよい。
「ヘルパー脂質」としては、ステロイド、ステロール、及びアルキルレソルシノールが挙げられる。本開示での使用に好適なヘルパー脂質としては、コレステロール、５－ヘプタデシルレソルシノール、及びコレステロールヘミスクシナートが挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールであってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールヘミスクシナートであってよい。
ＰＥＧ脂質は、ナノ粒子がインビボ（例えば、血液中）で存在できる時間の長さを変化させるステルス脂質である。ＰＥＧ脂質は、例えば、粒子の凝集抑制及び粒径制御などにより製剤工程の補助となり得る。本明細書で使用するＰＥＧ脂質により、ＬＮＰの薬物動態特性が調節され得る。典型的に、ＰＥＧ脂質は、脂質部分と、ＰＥＧに基づくポリマー部分とを含む。
いくつかの実施形態では、脂質部分はジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから得ることができ、これには、独立して、アルキル鎖長に約Ｃ４から約Ｃ４０の飽和もしくは不飽和の炭素原子を含むジアルキルグリセロール基またはジアルキルグリカミド基を含むものが含まれ、ここで、かかる鎖は、例えば、アミドまたはエステルなど、１つ以上の官能基を含んでよい。いくつかの実施形態では、アルキル鎖長は約Ｃ１０からＣ２０を含む。ジアルキルグリセロール基またはジアルキルグリカミド基はさらに１つ以上の置換アルキル基を含むことができる。鎖長は対称でも非対称でもよい。
特に明記しない限り、本明細書で使用する「ＰＥＧ」という用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。一実施形態では、ＰＥＧ部分は、任意選択で置換された、エチレングリコールまたはエチレンオキシドの直鎖ポリマーまたは分岐ポリマーである。別法として、ＰＥＧ部分を、例えば、１つ以上のアルキル基、アルコキシ基、アシル基、ヒドロキシ基、またはアリール基などによって置換してよい。一実施形態では、ＰＥＧ部分には、ＰＥＧ－ポリウレタンまたはＰＥＧ－ポリプロピレンなどのＰＥＧ共重合体（例えば、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９２）を参照のこと）が含まれ、別法として、ＰＥＧ部分はＰＥＧ共重合体を含まず、例えば、ＰＥＧモノポリマーであってよい。一実施形態では、ＰＥＧは分子量が約１３０～約５０，０００であり、下位実施形態では約１５０～約３０，０００であり、下位実施形態では約１５０～約２０，０００であり、下位実施形態では約１５０～約１５，０００であり、下位実施形態では、約１５０～約１０，０００であり、下位実施形態では約１５０～約６，０００であり、下位実施形態では約１５０～約５，０００であり、下位実施形態では約１５０～約４，０００であり、下位実施形態では約１５０～約３，０００であり、下位実施形態では約３００～約３，０００であり、下位実施形態では約１，０００～約３，０００であり、下位実施形態では約１，５００～約２，５００である。
特定の実施形態では、ＰＥＧ（例えば、ステルス脂質などの脂質部分または脂質に結合させたもの）は「ＰＥＧ－２Ｋ」であり、「ＰＥＧ ２０００」とも呼ばれ、平均分子量は約２，０００ダルトンである。ＰＥＧ－２Ｋは本明細書では以下の式（Ｉ）
Figure 2023103421000005
 で表され、ここで、ｎは４５であり、数平均重合度は約４５のサブユニッを含むことを意味する。しかしながら、当該技術分野で公知の他のＰＥＧ実施形態を使用してよく、これには、例えば、数平均重合度が約２３のサブユニット（ｎ＝２３）、及び／または６８のサブユニット（ｎ＝６８）を含む実施形態が含まれる。いくつかの実施形態では、ｎは約３０から約６０であってよい。いくつかの実施形態では、ｎは約３５から約５５であってよい。いくつかの実施形態では、ｎは約４０から約５０であってよい。いくつかの実施形態では、ｎは約４２から約４８であってよい。いくつかの実施形態では、ｎは４５であってよい。いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｈ、置換アルキル、及び非置換アルキルから選択してよい。いくつかの実施形態では、Ｒは非置換アルキルであってよい。いくつかの実施形態では、Ｒはメチルであってよい。
本明細書に記載のいずれの実施形態においても、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）（カタログ番号ＧＭ－０２０、ＮＯＦ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）製）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）（カタログ番号ＤＳＰＥ－０２０ＣＮ、ＮＯＦ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）製）、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリストイルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、及びＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスタ－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）（カタログ番号８８０１５０Ｐ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）製）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）（カタログ番号８８０１２０Ｃ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）製）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ；ＧＳ－０２０、ＮＯＦ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）製）、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリラート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ）、及び１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択してよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであってよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧであってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥであってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡであってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－Ｃ－ＤＭＡであってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＷＯ２０１６／０１０８４０で段落［００２４０］から段落［００２４４］までにて開示されている化合物Ｓ０２７であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡであってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－Ｃ１１であってよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－Ｃ１４であってよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－Ｃ１６であってよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－Ｃ１８であってよい。
ＬＮＰ製剤
本開示の実施形態は、製剤中の成分脂質のそれぞれのモル比に従って表される脂質組成物を提供する。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約３０モル％～約６０モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約４０モル％～約６０モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約４５モル％～約６０モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約５０モル％～約６０モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約５５モル％～約６０モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約５０モル％～約５５モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約５０モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約５５モル％であってよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰバッチのアミン脂質のモル％は、標的モル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％になる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰバッチのアミン脂質のモル％は、標的モル％の±４モル％、±３モル％、±２モル％、±１．５モル％、±１モル％、±０．５モル％、または±０．２５モル％になる。モル％数値はいずれもＬＮＰ組成物脂質成分に対する割合として与えられる。特定の実施形態では、アミン脂質のモル％のＬＮＰロット間変動は１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
一実施形態では、中性脂質、例えば、中性リン脂質などのモル％は約５モル％～約１５モル％であってよい。一実施形態では、中性脂質、例えば、中性リン脂質などのモル％は約７モル％～約１２モル％であってよい。一実施形態では、中性脂質、例えば、中性リン脂質などのモル％は約０モル％～約５モル％であってよい。一実施形態では、中性脂質、例えば、中性リン脂質などのモル％は約０モル％～約１０モル％であってよい。一実施形態では、中性脂質、例えば、中性リン脂質などのモル％は約５モル％～約１０モル％であってよい。一実施形態では、中性脂質、例えば、中性リン脂質などのモル％は約８モル％～約１０モル％であってよい。
一実施形態では、中性脂質、例えば、中性リン脂質などのモル％は約５モル％、約６モル％、約７モル％、約８モル％、約９モル％、約１０モル％、約１１モル％、約１２モル％、約１３モル％、約１４モル％、または約１５モル％であってよい。一実施形態では、中性脂質、例えば、中性リン脂質などのモル％は約９モル％であってよい。
一実施形態では、中性脂質、例えば、中性リン脂質などのモル％は約１モル％～約５モル％であってよい。一実施形態では、中性脂質のモル％は約０．１モル％～約１モル％であってよい。一実施形態では、中性リン脂質などの中性脂質のモル％は約０．１モル％、約０．２モル％、約０．５モル％、１モル％、約１．５モル％、約２モル％、約２．５モル％、約３モル％、約３．５モル％、約４モル％、約４．５モル％、または約５モル％であってよい。
一実施形態では、中性脂質、例えば、中性リン脂質などのモル％は約１モル％未満であってよい。一実施形態では、中性脂質、例えば、中性リン脂質などのモル％は約０．５モル％未満であってよい。一実施形態では、中性脂質、例えば、中性リン脂質などのモル％は約０モル％、約０．１モル％、約０．２モル％、約０．３モル％、約０．４モル％、約０．５モル％、約０．６モル％、約０．７モル％、約０．８モル％、約０．９モル％、または約１モル％であってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の製剤は中性脂質を含まない（すなわち、中性脂質は０モル％）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の製剤は中性脂質を本質的に含まない（すなわち、中性脂質は約０モル％）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の製剤は中性リン脂質を含まない（すなわち、中性リン脂質は０モル％）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の製剤は中性リン脂質を本質的に含まない（すなわち、中性リン脂質は約０モル％）。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰバッチの中性脂質のモル％は、標的中性脂質のモル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％になる。特定の実施形態では、ＬＮＰロット間変動は１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は約２０モル％～約６０モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は約２５モル％～約５５モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は約２５モル％～約５０モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は約２５モル％～約４０モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は約３０モル％～約５０モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は約３０モル％～約４０モル％であってよい。一実施形態では、脂質成分が１００モル％となるようアミン脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質の濃度に基づいてヘルパー脂質のモル％を調整する。一実施形態では、脂質成分が１００モル％となるようアミン脂質及びＰＥＧ脂質の濃度に基づいてヘルパー脂質のモル％を調整する。一実施形態では、脂質成分が少なくとも９９モル％となるようアミン脂質及びＰＥＧ脂質の濃度に基づいてヘルパー脂質のモル％を調整する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰバッチのヘルパーのモル％は、標的のモル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％になる。特定の実施形態では、ＬＮＰロット間変動は１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約１モル％～約１０モル％であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約２モル％～約１０モル％であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約２モル％～約８モル％であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約２モル％～約４モル％であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約２．５モル％～約４モル％であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約３モル％であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約２．５モル％であってよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰバッチのＰＥＧ脂質のモル％は、標的ＰＥＧ脂質のモル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％になる。特定の実施形態では、ＬＮＰロット間変動は１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
特定の実施形態では、カーゴには、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ、またはＣａｓ９）をコードするｍＲＮＡ、及びｇＲＮＡもしくはｇＲＮＡをコードする核酸、またはｍＲＮＡとｇＲＮＡの組み合わせが含まれる。一実施形態では、ＬＮＰ組成物はリピドＡまたはその同等物を含んでよい。いくつかの態様では、アミン脂質はリピドＡである。いくつかの態様では、アミン脂質はリピドＡ同等物、例えば、リピドＡの類似体である。特定の態様では、アミン脂質はリピドＡのアセタール類似体である。さまざまな実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質を含む。特定の実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールである。特定の実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。具体的な実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、リピドＡ、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。特定の実施形態では、アミン脂質は、リピドＡ、及びリピドＡのアセタール類似体などリピドＡ同等物から選択される。さらなる実施形態では、ＬＮＰ組成物は、リピドＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。
さまざまな実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含む。さまざまな実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性リン脂質、及びＰＥＧ脂質を含む。さまざまな実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質からなる脂質成分を含む。さまざまな実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質を含む。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は中性リン脂質などの中性脂質を含まない。さまざまな実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質からなる脂質成分を含む。特定の実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＤＳＰＥのうち１つ以上から選ばれる。特定の実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。特定の実施形態では、中性脂質はＤＰＰＣである。特定の実施形態では、中性脂質はＤＡＰＣである。特定の実施形態では、中性脂質はＤＭＰＣである。特定の実施形態では、中性脂質はＤＯＰＣである。特定の実施形態では、中性脂質はＤＯＰＥである。特定の実施形態では、中性脂質はＤＳＰＥである。特定の実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールである。具体的な実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、リピドＡ、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、リピドＡ、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質からなる脂質成分を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ脂質からなる脂質成分を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。特定の実施形態では、アミン脂質は、リピドＡ及びリピドＡのアセタール類似体などリピドＡ同等物から選択される。特定の実施形態では、アミン脂質は、Ｃ５－Ｃ１２またはＣ４－Ｃ１２の、リピドＡのアセタール類似体である。さらなる実施形態では、ＬＮＰ組成物は、リピドＡ、コレステロール、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。
本開示の実施形態はまた、アミン脂質の正電荷のアミン基（Ｎ）と封入されるべき核酸の負電荷のリン酸基（Ｐ）とのモル比に従って表される脂質組成物も提供する。これは、式Ｎ／Ｐで数学的に表され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含む脂質成分と、核酸成分とを含んでよく、ここで、Ｎ／Ｐ比は約３～１０である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質を含む脂質成分と、核酸成分とを含んでよく、ここで、Ｎ／Ｐ比は約３～１０である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びヘルパー脂質を含む脂質成分と、ＲＮＡ成分とを含んでよく、ここで、Ｎ／Ｐ比は約３～１０である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質を含む脂質成分と、ＲＮＡ成分とを含んでよく、ここで、Ｎ／Ｐ比は約３～１０である。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約５～７であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約３～７であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約４．５～８であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約６であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は６±１であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は６±０．５であってよい。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は標的Ｎ／Ｐ比の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％になる。特定の実施形態では、ＬＮＰロット間変動は１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
いくつかの実施形態では、核酸成分、例えば、ＲＮＡ成分は、ｍＲＮＡ、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどを含んでよい。ＲＮＡ成分には、ＲＮＡが、任意選択でさらなる核酸及び／またはタンパク質、例えば、ＲＮＰカーゴなどと共に含まれる。一実施形態では、ＲＮＡはＣａｓ９ ｍＲＮＡを含む。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むいくつかの組成物では、ＬＮＰはさらにｇＲＮＡなどのｇＲＮＡ核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ成分はＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ成分はクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含んでよい。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質を含んでよい。クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む特定のＬＮＰ組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む他の組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ－Ｃ１１である。クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む特定の組成物では、アミン脂質は、リピドＡ及びその同等物、例えば、リピドＡのアセタール類似体などから選択される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物はｇＲＮＡを含んでよい。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ｇＲＮＡ、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含んでよい。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ｇＲＮＡ、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質を含んでよい。ｇＲＮＡを含む特定のＬＮＰ組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。ｇＲＮＡを含むいくつかの組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。ｇＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ－Ｃ１１である。特定の実施形態では、アミン脂質は、リピドＡ及びその同等物、例えば、リピドＡのアセタール類似体などから選択される。
一実施形態では、ＬＮＰ組成物はｓｇＲＮＡを含んでよい。一実施形態では、ＬＮＰ組成物はＣａｓ９ ｓｇＲＮＡを含んでよい。一実施形態では、ＬＮＰ組成物はＣｐｆ１ ｓｇＲＮＡを含んでよい。ｓｇＲＮＡを含むいくつかの組成物では、ＬＮＰには、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質が含まれる。ｓｇＲＮＡを含むいくつかの組成物では、ＬＮＰには、アミン脂質、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質が含まれる。ｓｇＲＮＡを含む特定の組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。ｓｇＲＮＡを含む他の組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。ｓｇＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ－Ｃ１１である。特定の実施形態では、アミン脂質は、リピドＡ及びその同等物、例えば、リピドＡのアセタール類似体などから選択される。
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、ｓｇＲＮＡであってよいｇＲＮＡとを含む。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含んでよい。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質からなる脂質成分、ならびにＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとｇＲＮＡとからなる核酸成分を含んでよい。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質からなる脂質成分、ならびにＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとｇＲＮＡとからなる核酸成分を含んでよい。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む特定の組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むいくつかの組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む特定の組成物は、約１モル％未満の中性脂質、例えば、中性リン脂質を含む。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む特定の組成物は、約０．５モル％未満の中性脂質、例えば、中性リン脂質を含む。特定の組成物では、ＬＮＰは中性脂質、例えば、中性リン脂質を含まない。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ－Ｃ１１である。特定の実施形態では、アミン脂質は、リピドＡ及びその同等物、例えば、リピドＡのアセタール類似体などから選択される。
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物には、クラス２Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及び少なくとも１つのｇＲＮＡが含まれる。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物には、ｇＲＮＡと、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとが約２５：１～約１：２５の比で含まれる。特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤には、ｇＲＮＡと、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとが約１０：１～約１：１０の比で含まれる。特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤には、ｇＲＮＡと、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとが約８：１～約１：８の比で含まれる。本明細書で測定した比は重量基準である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤には、ｇＲＮＡと、クラス２Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとが約５：１～約１：５の比で含まれる。いくつかの実施形態では、比の範囲は、約３：１～１：３、約２：１～１：２、約５：１～１：２、約５：１～１：１、約３：１～１：２、約３：１～１：１、約３：１、約２：１～１：１である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとｍＲＮＡの比は約３：１または約２：１である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとクラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとの比は約１：１である。比は、約２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５であってよい。
本明細書に開示するＬＮＰ組成物には鋳型核酸が含まれ得る。鋳型核酸を、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、例えば、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどと共に合剤にしてよい。いくつかの実施形態では、鋳型核酸をガイドＲＮＡと共に合剤にしてよい。いくつかの実施形態では、鋳型核酸を、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの両方と共に合剤にしてよい。いくつかの実施形態では、鋳型核酸を、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはガイドＲＮＡとは別に製剤化してよい。鋳型核酸をＬＮＰ組成物と共に送達しても、ＬＮＰ組成物とは別に送達してもよい。いくつかの実施形態では、鋳型核酸は、所望の修復機構に応じて一本鎖でも二本鎖でもよい。鋳型は、標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡに隣接する配列に対する相同性領域を有してよい。
いくつかの実施形態では、水性ＲＮＡ溶液と有機溶媒系脂質溶液、例えば、１００％エタノールなどとを混合することによってＬＮＰを形成する。適切な溶液または溶媒には、水、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＮａＣｌ、クエン酸緩衝液、エタノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、イソプロパノールが含まれるか、またはそれらを含有してよい。薬理学的に許容される緩衝液を、例えば、ＬＮＰをインビボで投与するためなどに使用してよい。特定の実施形態では、緩衝液を使用して、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ６．５以上に維持する。特定の実施形態では、緩衝液を使用して、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ７．０以上に維持する。特定の実施形態では、組成物はｐＨが約７．２～約７．７の範囲である。さらなる実施形態では、組成物はｐＨが約７．３～約７．７の範囲、または約７．４～約７．６の範囲である。さらなる実施形態では、組成物はｐＨが約７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、または７．７である。マイクロｐＨプローブで組成物のｐＨを測定してよい。特定の実施形態では、組成物に凍結保護剤が含まれる。凍結保護剤の非限定的な例としては、ショ糖、トレハロース、グリセロール、ＤＭＳＯ、及びエチレングリコールが挙げられる。例示的な組成物には、例えば、ショ糖などの凍結保護剤が最高１０％まで含まれてよい。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物には約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９、または１０％の凍結保護剤が含まれてよい。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物には約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９、または１０％のショ糖が含まれてよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物には緩衝液が含まれてよい。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、またはその混合物を含んでよい。特定の例示的な実施形態では、緩衝液はＮａＣｌを含む。特定の実施形態では、ＮａＣｌを除外する。ＮａＣｌの例示的な量は、約２０ｍＭから約４５ｍＭに及んでよい。ＮａＣｌの例示的な量は、約４０ｍＭから約５０ｍＭに及んでよい。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの量は約４５ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液はＴｒｉｓ緩衝液である。Ｔｒｉｓの例示的な量は、約２０ｍＭから約６０ｍＭに及んでよい。Ｔｒｉｓの例示的な量は、約４０ｍＭから約６０ｍＭに及んでよい。いくつかの実施形態では、Ｔｒｉｓの量は約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液はＮａＣｌ及びＴｒｉｓを含む。ＬＮＰ組成物の特定の例示的な実施形態では、５％のショ糖と４５ｍＭのＮａＣｌとを溶解させたＴｒｉｓ緩衝液が含有される。他の例示的な実施形態では、組成物は、約５ｗ／ｖ％の量のショ糖、約４５ｍＭのＮａＣｌ、及び約５０ｍＭのｐＨ７．５のＴｒｉｓを含有する。塩、緩衝液、及び凍結保護剤の量は、製剤全体としての浸透圧が維持されるよう変えてよい。例えば、最終浸透圧は４５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満に維持してよい。さらなる実施形態では、浸透圧は３５０ｍＯｓｍ／Ｌと２５０ｍＯｓｍ／Ｌの間である。特定の実施形態では最終浸透圧は３００＋／－２０ｍＯｓｍ／Ｌである。
いくつかの実施形態では、マイクロ流体混合、Ｔ－混合、または交差混合を使用する。特定の態様では、流量、合流部サイズ、合流部の位置関係、合流部の形状、管径、溶液、及び／またはＲＮＡ濃度及び脂質濃度を変えてよい。ＬＮＰまたはＬＮＰ組成物を、例えば、透析、接線流ろ過、またはクロマトグラフィーなどにより濃縮または精製してよい。ＬＮＰは、例えば、懸濁液、エマルジョン、または凍結乾燥粉末などとして保存してよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物を２～８℃で保存し、特定の態様では、ＬＮＰ組成物を室温で保存する。さらなる実施形態では、ＬＮＰ組成物を、例えば、－２０℃または－８０℃などで凍結保存する。他の実施形態では、ＬＮＰ組成物を約０℃～約－８０℃の範囲の温度で保存する。凍結ＬＮＰ組成物を、使用前に、例えば、氷上、室温、または２５℃で解凍してよい。
ＬＮＰは、例えば、ミクロ粒子（単層小胞及び多層小胞、例えば、「リポソーム」という、いくつかの実施形態では実質的に球状である、ラメラ相の脂質二重層などを含み、さらに特定の実施形態では水性核、例えば、ＲＮＡ分子の実質的な部分を含むことができる）、エマルジョンの分散相、ミセル、または懸濁液の内相などであってよい。
さらに、ＬＮＰ組成物は生物分解性であり、治療的有効量において細胞毒性濃度まで生体内に蓄積することがない。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、治療用量において、実質的有害作用をもたらす自然免疫応答を引き起こさない。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＬＮＰ組成物は、治療用量において毒性を生じない。
いくつかの実施形態では、ｐｄｉは約０．００５から約０．７５に及んでよい。いくつかの実施形態では、ｐｄｉは約０．０１から約０．５に及んでよい。いくつかの実施形態では、ｐｄｉは約ゼロから約０．４に及んでよい。いくつかの実施形態では、ｐｄｉは約ゼロから約０．３５に及んでよい。いくつかの実施形態では、ｐｄｉは約ゼロから約０．３５に及んでよい。いくつかの実施形態では、ｐｄｉは約ゼロから約０．３に及んでよい。いくつかの実施形態では、ｐｄｉは約ゼロから約０．２５に及んでよい。いくつかの実施形態では、ｐｄｉは約ゼロから約０．２に及んでよい。いくつかの実施形態では、ｐｄｉは約０．０８未満、０．１未満、０．１５未満、０．２未満、または０．４未満であってよい。
本明細書に開示するＬＮＰは大きさ（例えば、Ｚ－平均径）が約１～約２５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは大きさが約１０～約２００ｎｍである。さらなる実施形態では、ＬＮＰは大きさが約２０～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは大きさが約５０～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは大きさが約５０～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは大きさが約５０～約１２０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは大きさが約６０～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは大きさが約７５～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは大きさが約７５～約１２０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは大きさが約７５～約１００ｎｍである。特に指定しない限り、本明細書で言及する大きさはいずれも、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒで動的光散乱法により測定した完全形成粒子の平均サイズ（径）である。計数率が約２００～４００ｋｃｐｓとなるよう、ナノ粒子試料をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈する。データは強度測定値の加重平均として提示される（Ｚ－平均径）。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、平均封入率が約５０％～約１００％の範囲で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、平均封入率が約５０％～約７０％の範囲で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、平均封入率が約７０％～約９０％の範囲で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、平均封入率が約９０％～約１００％の範囲で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、平均封入率が約７５％～約９５％の範囲で形成される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、平均分子量が約１．００Ｅ＋０５ｇ／ｍｏｌ～約１．００Ｅ＋１０ｇ／ｍｏｌの範囲で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、平均分子量が約５．００Ｅ＋０５ｇ／ｍｏｌ～約７．００Ｅ＋０７ｇ／ｍｏｌの範囲で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、平均分子量が約１．００Ｅ＋０６ｇ／ｍｏｌ～約１．００Ｅ＋１０ｇ／ｍｏｌの範囲で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、平均分子量が約１．００Ｅ＋０７ｇ／ｍｏｌ～約１．００Ｅ＋０９ｇ／ｍｏｌの範囲で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、平均分子量が約５．００Ｅ＋０６ｇ／ｍｏｌ～約５．００Ｅ＋０９ｇ／ｍｏｌの範囲で形成される。
いくつかの実施形態では、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ；重量平均モル質量（Ｍｗ）と数平均モル質量（Ｍｎ）の比）は約１．０００から約２．０００に及んでよい。いくつかの実施形態では、Ｍｗ／Ｍｎは約１．００から約１．５００に及んでよい。いくつかの実施形態では、Ｍｗ／Ｍｎは約１．０２０から約１．４００に及んでよい。いくつかの実施形態では、Ｍｗ／Ｍｎは約１．０１０から約１．１００に及んでよい。いくつかの実施形態では、Ｍｗ／Ｍｎは約１．１００から約１．３５０に及んでよい。
細胞を工学的に操作する方法；工学的に操作された細胞
本明細書に開示するＬＮＰ組成物は、インビボ及びインビトロの両方において、遺伝子編集による細胞の工学的操作方法で使用してよい。いくつかの実施形態では、方法には、細胞と本明細書に記載のＬＮＰ組成物との接触を伴う。
いくつかの実施形態では、方法には、ヒトなどの哺乳類などの対象の細胞を接触させることを伴う。いくつかの実施形態では、細胞は臓器、例えば、肝臓、例えば、哺乳類の肝臓、例えば、ヒトの肝臓にある。いくつかの実施形態では、細胞は肝臓細胞、例えば、哺乳類の肝臓細胞、例えば、ヒト肝臓細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は肝細胞、例えば、哺乳類の肝細胞、例えば、ヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、肝臓細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト肝臓細胞は肝臓の類洞壁内皮細胞（ＬＳＥＣ）であってよい。いくつかの実施形態では、ヒト肝臓細胞はクッパー細胞であってよい。いくつかの実施形態では、ヒト肝臓細胞は肝星細胞であってよい。いくつかの実施形態では、ヒト肝臓細胞は腫瘍細胞であってよい。いくつかの実施形態では、ヒト肝臓細胞は肝臓幹細胞であってよい。さらなる実施形態では、細胞はＡｐｏＥ結合受容体を含む。いくつかの実施形態では、肝細胞などの肝臓細胞はインサイチュである。いくつかの実施形態では、肝細胞などの肝臓細胞は、例えば、初代培養のような培養などで単離されている。本明細書に開示する使用に対応する方法も提供し、これは、本明細書に開示するＬＮＰ組成物を対象に投与すること、または上記のような細胞と本明細書に開示するＬＮＰ組成物とを接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、工学的に操作された細胞、例えば、先行段落での細胞型のうちいずれか１つに由来する工学的に操作された細胞を提供する。そのような工学的に操作された細胞は本明細書に記載する方法に従って作製される。いくつかの実施形態では、工学的に操作された細胞は対象体内の組織または臓器、例えば、肝臓などの内部にある。
本明細書に記載する方法及び細胞のいくつかでは、細胞は、標的配列のヌクレオチドの修飾、例えば、挿入もしくは欠失（「インデル」）または置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個、２個、３個、４個または５個またはそれ以上のヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個または２個のヌクレオチドの挿入を含む。他の実施形態では、修飾は、標的配列の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個または２個のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列にフレームシフト突然変異をもたらすインデルを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個またはそれ以上のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個または２個のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、鋳型核酸、例えば、本明細書に記載する鋳型核酸のいずれかの組み込みにより生じたヌクレオチドの挿入、欠失、または置換のうち１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、工学的に操作された細胞を含む細胞集団、例えば、本明細書に記載する方法に従って工学的に操作された細胞を含む細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、集団は、インビトロで培養された工学的操作をされた細胞を含む。いくつかの実施形態では、集団は、対象体内の組織または臓器、例えば、肝臓などの内部にある。いくつかの実施形態では、集団内の細胞のうち少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％またはそれ以上を工学的に操作する。特定の実施形態では、本明細書に開示する方法により、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の編集効率（または「編集率」）がもたらされ、これはインデルの検出により定義される。他の実施形態では、本明細書に開示する方法により、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のＤＮＡ修飾効率がもたらされ、これは、挿入、欠失、置換によるか、または他の方法によるかを問わず、配列変化の検出により定義される。特定の実施形態では、本明細書に開示する方法により、細胞集団における編集効率レベルまたはＤＮＡ修飾効率レベルは、約５％～約１００％、約１０％～約５０％、約２０～約１００％、約２０～約８０％、約４０～約１００％、または約４０～約８０％になる。
本明細書に記載する方法及び細胞のいくつかでは、集団内の細胞は、標的配列における修飾、例えば、インデルまたは置換などを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個、２個、３個、４個または５個またはそれ以上のヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個または２個のヌクレオチドの挿入を含む。他の実施形態では、修飾は、標的配列の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個または２個のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾により標的配列にフレームシフト突然変異がもたらされる。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列にフレームシフト突然変異をもたらすインデルを含む。いくつかの実施形態では、集団の工学的操作された細胞のうち少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％またはそれ以上はフレームシフト突然変異を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個またはそれ以上のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個または２個のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、鋳型核酸、例えば、本明細書に記載する鋳型核酸のいずれかの組み込みにより生じたヌクレオチドの挿入、欠失、または置換のうち１つ以上を含む。
遺伝子編集方法
インビボ及びインビトロで遺伝子編集を行うために本明細書に開示するＬＮＰ組成物を使用してよい。一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のＬＮＰ組成物を、それを必要とする対象に投与してよい。一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のＬＮＰ組成物は細胞と接触し得る。一実施形態では、治療的有効量の本明細書に記載する組成物は、それを必要とする対象の細胞と接触し得る。一実施形態では、遺伝子操作された細胞は、細胞と本明細書に記載のＬＮＰ組成物とを接触させることにより作製され得る。さまざまな実施形態では、方法は、上記のように鋳型核酸を細胞または対象に導入することを含む。
いくつかの実施形態では、方法には、肝臓障害に関連した細胞に対するＬＮＰ組成物の投与を伴う。いくつかの実施形態では、方法には、肝臓障害の治療を伴う。特定の実施形態では、方法には、肝細胞とＬＮＰ組成物との接触を伴う。特定の実施形態では、方法には、肝細胞とＬＮＰ組成物との接触を伴う。いくつかの実施形態では、方法には、ＡｐｏＥ結合細胞とＬＮＰ組成物との接触を伴う。
一実施形態では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物をＡｐｏＥ結合細胞などの細胞に投与してよい。さらなる実施形態では、鋳型核酸も細胞に導入される。特定の例では、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物をＡｐｏＥ結合細胞などの細胞に投与してよい。一実施形態では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及び鋳型を含むＬＮＰ組成物を細胞に投与してよい。特定の例では、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を肝細胞に投与してよい。場合によっては、肝細胞は対象内にある。
特定の実施形態では、対象はＬＮＰ組成物の単回投与を受けてよい。他の例では、対象はＬＮＰ組成物の多回投与を受けてよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物を２～５回投与する。２用量以上を投与する場合、用量は、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１４日、２１日、もしくは２８日の間隔を置くか、約２か月、３か月、４か月、５か月、もしくは６か月の間隔を置くか、または約１年、２年、３年、４年、もしくは５年の間隔を置いて投与してよい。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物の再投与時、編集が改善する。
一実施形態では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物は、ｇＲＮＡを含む組成物の投与とは別に細胞に投与してよい。一実施形態では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物は、細胞への鋳型核酸の投与とは別に細胞に投与してよい。一実施形態では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を細胞に投与し、その後、ｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を逐次投与してから、鋳型を細胞に投与してよい。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を投与してからｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を投与する実施形態では、投与と投与の間を約４時間、６時間、８時間、１２時間、もしくは２４時間、または２日、３日、４日、５日、６日、もしくは７日空けてよい。
一実施形態では、ＬＮＰ組成物を使用して、遺伝子ノックアウトを生じさせる遺伝子を編集してよい。一実施形態では、ＬＮＰ組成物を使用して、細胞集団に遺伝子ノックダウンを生じさせる遺伝子を編集してよい。別の実施形態では、ＬＮＰ組成物を使用して、遺伝子修正を生じさせる遺伝子を編集してよい。さらなる実施形態では、ＬＮＰ組成物を使用して、遺伝子挿入を生じさせる細胞を編集してよい。
一実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与により、持続的反応を生じさせる遺伝子編集がもたらされ得る。例えば、投与により、反応の持続時間が１日、１か月、１年、またはそれ以上になり得る。本明細書で使用する場合、「反応の持続時間」とは、本明細書に開示するＬＮＰ組成物を使用して細胞が編集された後、それにより生じる修飾が、ＬＮＰ組成物投与後のある一定期間、依然として存在することを意味する。修飾は、標的タンパク質レベルの測定によって検出され得る。修飾は、標的ＤＮＡの検出によって検出され得る。いくつかの実施形態では、反応の持続時間は少なくとも１週間であり得る。他の実施形態では、反応の持続時間は少なくとも２週間であり得る。一実施形態では、反応の持続時間は少なくとも１か月であり得る。いくつかの実施形態では、反応の持続時間は少なくとも２か月であり得る。一実施形態では、反応の持続時間は少なくとも４か月であり得る。一実施形態では、反応の持続時間は少なくとも６か月であり得る。特定の実施形態では、反応の持続時間は約２６週間であり得る。いくつかの実施形態では、反応の持続時間は少なくとも１年であり得る。いくつかの実施形態では、反応の持続時間は少なくとも５年であり得る。いくつかの実施形態では、反応の持続時間は少なくとも１０年であり得る。いくつかの実施形態では、持続的反応は少なくとも０．５か月、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１５か月、１８か月、２１か月、または２４か月の後、標的タンパク質レベルの測定によっても標的ＤＮＡの検出によっても検出可能である。いくつかの実施形態では、持続的反応は少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１２年、１４年、１６年、１８年、または２０年の後、標的タンパク質レベルの測定によっても標的ＤＮＡの検出によっても検出可能である。
ＬＮＰ組成物は、非経口投与が可能である。ＬＮＰ組成物を血流中、組織内、筋内、または内臓内へ直接投与してよい。投与は、例えば、注射または注入などで全身投与してよい。投与は局所投与であってよい。適切な投与手段としては、静脈内、動脈内、髄腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、網膜下、硝子体内、前房内、筋肉内、滑膜内、皮内、及び皮下が挙げられる。適切な投与デバイスとしては、針（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇマイクロニードル）インジェクター、無針、浸透圧ポンプ、及び注入技術が挙げられる。
ＬＮＰ組成物は必ずというわけではないが一般に、１つ以上の薬理学的に許容される添加剤を含む製剤として投与される。用語「添加剤」には、本開示の化合物（複数可）以外の任意の成分、他の脂質成分（複数可）及び生物学的に活性な薬剤が含まれる。添加剤により、機能的（例えば、薬物放出速度制御）特徴及び／または非機能的（例えば、処理補助または希釈剤）特徴のいずれが製剤に付与されてもよい。添加剤の選択は、個々の投与方法、添加剤が溶解度及び安定性に及ぼす影響、及び剤形の性質などの要因によって大きく異なる。
非経口製剤は典型的に水性もしくは油性の溶液または懸濁液である。製剤が水性の場合、添加剤は糖（グルコース、マンニトール、ソルビトール等が含まれるが、これに限定されるわけではない）、塩、炭水化物及び緩衝剤（好ましくはｐＨが３～９）などであるが、一部の用途ではこれらは、滅菌非水溶液を用いるか、または滅菌パイロジェンフリー水（ＷＦＩ）などの適切なビヒクルと併せて使用する乾燥形態としてさらに好適に製剤化されてよい。
本発明は例示実施形態と併せて記載されるが、それらは、本発明を記載の実施形態に限定することを意図するものではないと理解される。むしろ、本発明は、代替案、変更、及び具体的な特徴の同等物を含む同等物のすべてを包含することを意図し、これらは添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る。
上述された一般的記載及び詳細な説明の両方、ならびに以下の実施例は例示及び説明するのみであり、教示を限定するものではない。本明細書で使用する項目見出しは構成のみを目的としており、所望の主題を何ら限定するもではないと解釈されるべきである。参照により組み込まれる文献が本明細書で定義した用語と矛盾する場合、本明細書が優先する。本出願に記載されるすべての範囲には、特に断らない限り、端点が包含される。
本出願で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で特に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれることに留意すべきである。したがって、例えば、「組成物（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」への言及には複数の組成物が含まれ、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及には複数の細胞が含まれ、他も同様である。「または」の使用は包括的なものであり、特に断らない限り、「及び／または」を意味する。
数字範囲には、その範囲を定義する数字が含まれる。測定値及び測定可能な値は概数であり、測定に関連する有効数字及び誤差を考慮すべきであると理解される。用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」とは、当業者により決定された特定の値について許容される誤差を意味し、値の測定法または決定法によって幾分異なる。範囲の前または列挙されている値の前に「約（ａｂｏｕｔ）」などの修飾語の使用により、範囲の各端点または列挙にある各々の値が修飾を受ける。「約（ａｂｏｕｔ）」には値または端点も含まれる。例えば、「約５０～５５」では「約５０～約５５」が包含される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は限定的なものではない。
上記明細書で特に断りがない限り、明細書中、さまざまな成分を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という記述がある実施形態は、記述の成分「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」かまたはそれ「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことも意図され、明細書中、さまざまな成分「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という記述がある実施形態は、記述の成分を「含む（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」かまたはそれ「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことも意図され、明細書中、さまざまな成分「について（ａｂｏｕｔ）」という記述がある実施形態は、記述の成分「にて（ａｔ）」であることも意図され、また、明細書中、さまざまな成分「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という記述がある実施形態は、記述の成分「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」かまたはそれを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ことも意図される（このような互換性は請求項内でこれらの用語を使用する
際には適用されない）。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］ＲＮＡ成分と、
脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
約５０～６０モル％のアミン脂質と、
約８～１０モル％の中性脂質と、
約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質と
を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約６である、前記脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）組成物。
［実施形態２］ＲＮＡ成分と、
約５０～６０モル％のアミン脂質と、
約２７～３９．５モル％のヘルパー脂質と、
約８～１０モル％の中性脂質と、
約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質と
を含み、ここで、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約５～７である、前記ＬＮＰ組成物。
［実施形態３］前記Ｎ／Ｐ比は約６である、実施形態２に記載のＬＮＰ組成物。
［実施形態４］ＲＮＡ成分と、
脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
約５０～６０モル％のアミン脂質と、
約５～１５モル％の中性脂質と、
約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質と
を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～１０である、前記ＬＮＰ組成物。
［実施形態５］ＲＮＡ成分と、
脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
約４０～６０モル％のアミン脂質と、
約５～１５モル％の中性脂質と、
約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質と
を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約６である、前記ＬＮＰ組成物。
［実施形態６］ＲＮＡ成分と、
脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
約５０～６０モル％のアミン脂質と、
約５～１５モル％の中性脂質と、
約１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質と
を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約６である、前記ＬＮＰ組成物。
［実施形態７］ＲＮＡ成分と、
脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
約４０～６０モル％のアミン脂質と、
約０～１０モル％の中性脂質と、
約１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質と
を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～１０である、前記ＬＮＰ組成物。
［実施形態８］ＲＮＡ成分と、
脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
約４０～６０モル％のアミン脂質と、
約１モル％未満の中性脂質と、
約１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質と
を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～１０である、前記ＬＮＰ組成物。
［実施形態９］ＲＮＡ成分と、
脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
約４０～６０モル％のアミン脂質と、
約１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質と
を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～１０であり、かつ
前記ＬＮＰ組成物は中性リン脂質を本質的に含まないかまたは含まない、前記ＬＮＰ組成物。
［実施形態１０］ＲＮＡ成分と、
脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
約５０～６０モル％のアミン脂質と、
約８～１０モル％の中性脂質と、
約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質と
を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～７である、前記ＬＮＰ組成物。
［実施形態１１］前記ＲＮＡ成分はｍＲＮＡを含む、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態１２］前記ＲＮＡ成分は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子、例えば、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどを含む、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態１３］前記ＲＮＡ成分はクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態１４］前記ＲＮＡ成分はＣａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態１５］前記ｍＲＮＡは修飾ｍＲＮＡである、実施形態１１～１４のいずれかに記載の組成物。
［実施形態１６］前記ＲＮＡ成分は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡを含み、ここで、前記オープンリーディングフレームはウリジン含量が、その最小ウリジン含量から、前記最小ウリジン含量の１５０％までの範囲である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態１７］前記ＲＮＡ成分は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡを含み、ここで、前記オープンリーディングフレームはウリジンジヌクレオチド含量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含量から、前記最小ウリジンジヌクレオチド含量の１５０％までの範囲である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態１８］前記ＲＮＡ成分は、配列番号１、４、７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つに対する同一性が少なくとも９０％である配列を含むｍＲＮＡを含み、ここで、前記ｍＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするオープンリーディングフレームを含む、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態１９］前記ＲＮＡ成分はｇＲＮＡ核酸を含む、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
［実施形態２０］前記ｇＲＮＡ核酸はｇＲＮＡである、実施形態１９に記載の組成物。
［実施形態２１］前記ＲＮＡ成分はクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態２２］前記ｇＲＮＡ核酸は、二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）であるかまたはそれをコードする、実施形態１９～２１のいずれかに記載の組成物。
［実施形態２３］前記ｇＲＮＡ核酸は、ｓｇＲＮＡであるかまたはそれをコードする、実施形態１９～２１のいずれかに記載の組成物。
［実施形態２４］前記ｇＲＮＡは修飾されている、実施形態１９～２３のいずれかに記載の組成物。
［実施形態２５］前記ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオアート（ＰＳ）結合、及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドから選ばれる修飾を含む、実施形態２４に記載の組成物。
［実施形態２６］前記ｇＲＮＡは、５’末端の最初の５ヌクレオチドの１つ以上における修飾を含む、実施形態２４～２５のいずれかに記載の組成物。
［実施形態２７］前記ｇＲＮＡは、３’末端の最後の５ヌクレオチドの１つ以上における修飾を含む、実施形態２４～２６のいずれかに記載の組成物。
［実施形態２８］前記ｇＲＮＡは、最初の４ヌクレオチド間にＰＳ結合を含む、実施形態２４～２７のいずれかに記載の組成物。
［実施形態２９］前記ｇＲＮＡは、最後の４ヌクレオチド間にＰＳ結合を含む、実施形態２４～２８のいずれかに記載の組成物。
［実施形態３０］５’末端の最初の３ヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む、実施形態２４～２９のいずれかに記載の組成物。
［実施形態３１］３’末端の最後の３ヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む、実施形態２４～３０のいずれかに記載の組成物。
［実施形態３２］前記ｇＲＮＡ及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、重量基準で約１０：１～約１：１０の範囲の比で存在する、実施形態１９～３１のいずれかに記載の組成物。
［実施形態３３］前記ｇＲＮＡ及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、重量基準で約５：１～約１：５の範囲の比で存在する、実施形態１９～３１のいずれかに記載の組成物。
［実施形態３４］前記ｇＲＮＡ及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、重量基準で約３：１～約１：１の範囲の比で存在する、実施形態１９～３３のいずれかに記載の組成物。
［実施形態３５］前記ｇＲＮＡ及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、重量基準で約２：１～約１：１の範囲の比で存在する、実施形態１９～３４のいずれかに記載の組成物。
［実施形態３６］前記ｇＲＮＡ及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、重量基準で約２：１の比で存在する、実施形態１９～３５のいずれかに記載の組成物。
［実施形態３７］前記ｇＲＮＡ及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、重量基準で約１：１の比で存在する、実施形態１９～３５のいずれかに記載の組成物。
［実施形態３８］少なくとも１つの鋳型をさらに含む、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態３９］前記ＰＥＧ脂質のモル％は約３である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態４０］前記アミン脂質のモル％は約５０である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態４１］前記アミン脂質のモル％は約５５である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態４２］前記アミン脂質のモル％は±３モル％である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態４３］前記アミン脂質のモル％は±２モル％である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態４４］前記アミン脂質のモル％は４７～５３モル％である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態４５］前記アミン脂質のモル％は４８～５３モル％である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態４６］前記アミン脂質のモル％は５３～５７モル％である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態４７］前記Ｎ／Ｐ比は６±１である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。［実施形態４８］前記Ｎ／Ｐ比は６±０．５である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態４９］前記アミン脂質はリピドＡである、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態５０］前記アミン脂質はリピドＡの類似体である、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態５１］前記類似体はアセタール類似体である、実施形態５０に記載の組成物。［実施形態５２］前記アセタール類似体はＣ４－Ｃ１２アセタール類似体である、実施形態５１に記載の組成物。
［実施形態５３］前記アセタール類似体はＣ５－Ｃ１２アセタール類似体である、実施形態５０に記載の組成物。
［実施形態５４］前記アセタール類似体はＣ５－Ｃ１０アセタール類似体である、実施形態５０に記載の組成物。
［実施形態５５］前記アセタール類似体は、Ｃ４類似体、Ｃ５類似体、Ｃ６類似体、Ｃ７類似体、Ｃ９類似体、Ｃ１０類似体、Ｃ１１類似体、及びＣ１２類似体から選ばれる、実施形態５０に記載の組成物。
［実施形態５６］前記ヘルパー脂質はコレステロールである、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態５７］前記中性脂質はＤＳＰＣである、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態５８］前記中性脂質はＤＰＰＣである、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態５９］前記ＰＥＧ脂質はジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）を含む、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態６０］前記ＰＥＧ脂質はＰＥＧ－２ｋを含む、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態６１］前記ＰＥＧ脂質はＰＥＧ－ＤＭＧである、先行実施形態いずれかに記載の組成物。
［実施形態６２］前記ＰＥＧ－ＤＭＧはＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、実施形態６１に記載の組成物。
［実施形態６３］前記ＬＮＰ組成物は中性脂質を本質的に含まない、実施形態９に記載の組成物。
［実施形態６４］前記中性脂質はリン脂質である、実施形態６３に記載の組成物。
［実施形態６５］細胞を、実施形態１２～６４のいずれかに記載のＬＮＰ組成物と接触させることを含む、遺伝子編集方法。
［実施形態６６］クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ核酸を細胞に送達することを含む遺伝子編集方法であって、前記クラス２Ｃａｓ ｍＲＮＡ及び前記ガイドＲＮＡ核酸は、実施形態１３～６４のいずれかに記載の少なくとも１つのＬＮＰ組成物として製剤化される、前記方法。
［実施形態６７］細胞を、実施形態１２～６４のいずれかに記載の少なくとも１つのＬＮＰ組成物と接触させることを含む、遺伝子操作された細胞を作製する方法。
［実施形態６８］前記ＬＮＰ組成物を少なくとも２回投与する、実施形態６５～６７のいずれかに記載の方法。
［実施形態６９］前記ＬＮＰ組成物を２～５回投与する、実施形態６８に記載の方法。
［実施形態７０］再投与時に編集が改善する、実施形態６８または６９に記載の方法。
［実施形態７１］少なくとも１つの鋳型核酸を前記細胞に導入することをさらに含む、実施形態６５～７０のいずれかに記載の方法。
［実施形態７２］前記ｍＲＮＡを第１のＬＮＰ組成物に製剤化し、前記ガイドＲＮＡ核酸を第２のＬＮＰ組成物に製剤化する、実施形態６５～７１のいずれかに記載の方法。
［実施形態７３］前記第１及び第２のＬＮＰ組成物を同時に投与する、実施形態７２に記載の方法。
［実施形態７４］前記第１及び第２のＬＮＰ組成物を順次投与する、実施形態７２に記載の方法。
［実施形態７５］前記ｍＲＮＡ及び前記ガイドＲＮＡ核酸を単一のＬＮＰ組成物に製剤化する、実施形態６５～７３のいずれかに記載の方法。
実施例１－マウスにおけるインビボでの編集用ＬＮＰ組成物
さまざまなＬＮＰ組成物の小規模調製物を調製し、それらの特性を調べた。マウスにおける肝臓での編集割合についてのアッセイでは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと、化学修飾したマウスＴＴＲ配列指向性ｓｇＲＮＡとをＬＮＰ中に製剤化し、その際、ＰＥＧのモル％、リピドＡのモル％、及びＮ：Ｐ比を下記表２に記載のようにさまざまに変えた。
Figure 2023103421000006
図１では、ＬＮＰ製剤は、「％ＣＬ；Ｎ：Ｐ」で表わされる、それらのリピドＡモル％及びＮ：Ｐ比に基づいてＸ軸上で識別されている。図１の凡例で示されるように、２モル％、２．５モル％、３モル％、４モル％、または５モル％の濃度のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧは、（１）４５モル％のリピドＡ；Ｎ：Ｐ比４．５（「４５；４．５」）、（２）４５モル％のリピドＡ；Ｎ：Ｐ比６（「４５；６」）、（３）５０モル％のリピドＡ；Ｎ：Ｐ比４．５（「５０；４．５」）、（４）５０モル％のリピドＡ；Ｎ：Ｐ比６（「５０；６」）、（５）５５モル％のリピドＡ；Ｎ：Ｐ比４．５（「５５；４．５」）、及び（６）５５モル％のリピドＡ；Ｎ：Ｐ比６（「５５；６」）で製剤化した。ＤＳＰＣのモル％は、９モル％で一定に維持され、各製剤の脂質成分の残部が１００モル％になるようコレステロール（モル％）を加えた。３０種の製剤の各々を以下に記載のように製剤化し、１ｋｇ当たり１ｍｇまたは１ｋｇ当たり０．５ｍｇのトータルＲＮＡ用量（それぞれ、図１Ａ及び図１Ｂ）にて単回投与で投与した。
ＬＮＰ製剤－ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ
脂質ナノ粒子成分を、脂質成分を上記のモル比で１００％エタノールに溶解させた。ＲＮＡカーゴを２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０に溶解させ、ＲＮＡカーゴの濃度を約０．４５ｍｇ／ｍＬとした。ＬＮＰは、脂質アミンとＲＮＡリン酸塩（Ｎ：Ｐ）のモル比を約４．５または約６、ｍＲＮＡとｇＲＮＡの比を重量基準で１：１にして製剤化された。
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標） Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを製造者の操作手順に従って使用し、脂質とＲＮＡ溶液のマイクロ流体混合によってＬＮＰを生成した。混合中は水性溶媒と有機溶媒の比を２：１に維持しつつ、異なる流量を使用した。混合した後、ＬＮＰを回収し、水に希釈（約１：１ｖ／ｖ）して、室温で１時間保持し、さらに水で希釈（約１：１ｖ／ｖ）してから最終の緩衝液交換を行った。５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のショ糖、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）への最終緩衝液交換はＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）で完了させた。必要に応じ、Ａｍｉｃｏｎ １００ｋＤａ遠心式フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で遠心分離にかけて製剤を濃縮した。その後、得られる混合物を、０．２μｍ滅菌フィルターを使用してろ過した。最終ＬＮＰは、以降の使用時まで－８０℃にて保存した。
製剤分析法
本開示のＬＮＰの多分散指数（「ｐｄｉ」）及び大きさの特徴付けには、動的光散乱法（「ＤＬＳ」）を使用する。ＤＬＳは、試料を光源に当てて得られる光の散乱を測定する。ＤＬＳ測定から決定されるＰＤＩは、集団における粒径（およその平均粒径）分布を表し、完全に均一な集団の場合、ＰＤＩはゼロである。
特定ｐＨにおけるＬＮＰの表面電荷の特徴付けには電気泳動光散乱法を使用する。表面電荷、またはゼータ電位は、ＬＮＰ懸濁液中の粒子間の静電的反発力／静電的引力の大きさの尺度である。
非対称流フィールド・フロー・フラクショネーション－多角度光散乱法（ＡＦ４－ＭＡＬＳ）を使用して、流体力学的半径により製剤中の粒子を分離し、その後、分画粒子の分子量、流体力学的半径及び根平均二乗半径を測定する。これにより、分子量及び粒度分布ならびに二次的特徴、例えば、Ｂｕｒｃｈａｒｄ－Ｓｔｏｃｋｍｅｙｅｒプロット（粒子の内核密度を示唆する、根平均二乗（「ｒｍｓ」）半径と流体力学的半径の経時的な比）及びｒｍｓコンホメーションプロット（得られる線形フィットの傾きがコンパクトなまとまり（ｃｏｍｐａｃｔｎｅｓｓ）と伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）の程度を与える、ｒｍｓ半径の対数と分子量の対数の対比）などを評価することができるようになる。
製剤の粒度分布及び粒子濃度の決定にはナノ粒子トラッキング解析法（ＮＴＡ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）を使用することができる。ＬＮＰ試料を適切に希釈し、顕微鏡スライド上に注入する。粒子がゆっくりと視野を通って注がれると、カメラが散乱光を記録する。ムービーが取得されるとナノ粒子トラッキング解析は画素を追跡して拡散係数を算出することによりムービーを処理する。この拡散係数は、粒子の流体力学的半径に翻訳され得る。この装置は、解析時に計数された個々の粒子数を計数して、粒子濃度も与える。
ＬＮＰの粒径、形態、及び構造的特徴の決定には低温電子顕微鏡法（「ｃｒｙｏ－ＥＭ」）を使用することができる。
ＬＮＰの脂質組成分析は、液体クロマトグラフィー、その後の荷電化粒子検出（ＬＣ－ＣＡＤ）により決定することができる。この分析では、実際の脂質含量と理論上の脂質含量の対比が得られる。
ＬＮＰ製剤を、平均粒径、多分散指数（ｐｄｉ）、トータルＲＮＡ含量、ＲＮＡの封入率、及びゼータ電位について分析する。脂質分析、ＡＦ４－ＭＡＬＳ、ＮＴＡ、及び／またはｃｒｙｏ－ＥＭによってＬＮＰ製剤をさらに特徴付けしてよい。平均粒径及び多分散度は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＤＬＳ装置を使用して動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定する。ＤＬＳで測定する前に、ＬＮＰ試料をＰＢＳに３０Ｘ希釈した。平均粒径の強度基準の測定値であるＺ－平均径が数平均径及びｐｄｉと共に報告された。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ装置は、ＬＮＰのゼータ電位の測定にも使用される。測定に先立ち、試料を０．１Ｘ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に１：１７（５０μＬを８００μＬに）で希釈する。
トータルＲＮＡ濃度及び遊離のＲＮＡの決定には蛍光を基にしたアッセイ（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する。封入率は、（トータルＲＮＡ－遊離のＲＮＡ）／トータルＲＮＡで算出する。トータルＲＮＡを決定するため０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００を含有している１× ＴＥ緩衝液を用いるか、または遊離のＲＮＡを決定するため１× ＴＥ緩衝液を用いてＬＮＰ試料を適切に希釈する。製剤を作製するために使用され、その後１× ＴＥ緩衝液＋／－０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００に希釈された、開始時のＲＮＡ溶液を使用して標準曲線を作成する。その後、希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）色素（製造者の取扱説明書に従う）を標準液及び試料のそれぞれに加え、光のない状態で室温にて約１０分間インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、励起、オートカットオフ及び発光波長をそれぞれ４８８ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５２５ｎｍに設定して試料の読み取りを行った。適切な標準曲線によりトータルＲＮＡ及び遊離ＲＮＡを決定する。
封入率は、（トータルＲＮＡ－遊離のＲＮＡ）／トータルＲＮＡで算出する。同様の手法を使用して、ＤＮＡに基づくかまたは核酸を含有するカーゴ成分の封入率を決定してよい。一本鎖ＤＮＡにはＯｌｉｇｒｅｅｎ Ｄｙｅを使用してよく、二本鎖ＤＮＡにはＰｉｃｏｇｒｅｅｎ Ｄｙｅを使用してよい。
ＡＦ４－ＭＡＬＳを使用して、分子量及び粒度分布、ならびにそれらの計算値による二次統計を調べる。ＬＮＰを適宜希釈し、それらが集められているＨＰＬＣオートサンプラーを使用してＡＦ４分離チャンネルに注入し、その後、チャンネルを横切る交差流中に指数勾配で溶出させる。流体はすべてＨＰＬＣポンプ及びＷｙａｔｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ装置で駆動される。粒子はＡＦ４のチャンネル流から溶出し、ＵＶ検出器、多角度光散乱検出器、準弾性光散乱検出器及び示差屈折率検出器を通る。Ｄｅｂｅｙｅモデルを使用して生データを処理し、検出器信号から分子量及びｒｍｓ半径を決定する。
荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）に連結したＨＰＬＣにより、ＬＮＰ中の脂質成分を定量的に分析する。クロマトグラフィーによる４種の脂質成分の分離は逆相ＨＰＬＣにより達成された。ＣＡＤは非揮発性化合物を漏れなく検出する質量基準の検出器であり、分析対象物の構造にかかわらずシグナルは一定である。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡのカーゴ
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡカーゴをインビトロ転写により調製した。直鎖状にしたプラスミドＤＮＡ鋳型及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロ転写により、１Ｘ ＮＬＳ（配列番号４８）を含むキャップ化しポリアデニル化したＣａｓ９ ｍＲＮＡを作製した。ＸｂａＩを以下の２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、及び１×反応緩衝液という条件で用いて３７℃で２時間インキュベートすることにより、Ｔ７プロモーター及び１００ｎｔのポリ（Ａ／Ｔ）領域を含有しているプラスミドＤＮＡを直鎖状にした。反応物を６５℃で２０分間加熱してＸｂａＩを不活性化した。直鎖状にしたプラスミドをシリカマキシスピンカラム（Ｅｐｏｃｈ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して酵素及び緩衝塩により精製し、アガロースゲルで分析し、直鎖化を確認した。Ｃａｓ９修飾ｍＲＮＡを作製するためのＩＶＴ反応物を以下の条件で３７℃にて４時間インキュベートした：５０ｎｇ／μＬの直鎖状プラスミド；ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１－メチルｐｓｅｕｄｏ－ＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を各２ｍＭずつ；１０ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）；１Ｕ／μＬのマウスＲＮＡｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）；０．００４Ｕ／μＬのＥ．ｃｏｌｉ無機ピロホスファターゼ（ＮＥＢ）；及び１×反応緩衝液。４時間インキュベーションした後、ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加えて最終濃度０．０１Ｕ／μＬとし、反応物をさらに３０分間インキュベートしてＤＮＡ鋳型を除去した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキットを製造者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の操作手順に従って使用し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを酵素及びヌクレオチドにより精製した。別法として、ＬｉＣｌ沈殿法でＣａｓ９ ｍＲＮＡを精製した。
本実施例でのｓｇＲＮＡは化学合成したものであり、市販業者により供給されたものであった。ｓｇ２８２配列を以下に記載し、２‘－Ｏ－メチル修飾及びホスホロチオアート結合は以下の通り表される（ｍ＝２’－ＯＭｅ；＊＝ホスホロチオアート）：
ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＡ＊ＣＡＧＣＣＡＣＧＵＣＵＡＣＡＧＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ。（配列番号４２）。
ＬＮＰ
最終ＬＮＰの特徴付けを行い、封入率、多分散指数、及び平均粒径を上記の分析方法に従って決定した。
マウスにＬＮＰを投与し（１ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇでの単回投与）、ゲノムＤＮＡを単離して下記のＮＧＳ分析に供した。
インビボでのＬＮＰ送達
各試験では６週齢から１０週齢までの雌ＣＤ－１マウスを使用した。動物の体重を測定し、体重に従って群に分け、群の平均体重に基づいて投与溶液を調製した。ＬＮＰを、動物１匹当たり０．２ｍＬの容量（体重１キログラム当たり約１０ｍＬ）で側尾静脈を介して投与した。投与の約６時間後、動物を有害作用について観察した。投与の２４時間後に体重を測定し、さまざまな時点において動物をイソフルラン麻酔下、心臓穿刺を介した放血により安楽死させた。血液を血清分離剤入り管または本明細書に記載のような血漿用の緩衝クエン酸ナトリウム含有チューブに採取した。インビボでの編集を行う試験用に、各動物の中葉または３つの独立した葉（例えば、右中葉、左中葉、及び左側葉）から肝組織を採取し、ＤＮＡの抽出及び分析に供した。
マウスのコホートを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）及び血清ＴＴＲレベルによって肝臓での編集について測定した（データ図示せず）。
トランスサイレチン（ＴＴＲ）ＥＬＩＳＡ分析
血液を採取し、示されているように血清を単離した。マウスプレアルブミン（トランスサイレチン）ＥＬＩＳキット（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、カタログＯＫＩＡ００１１１）を使用してマウスの血清総ＴＴＲレベルを決定した。ラット特異的ＥＬＩＳキット（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、カタログ番号ＯＫＩＡ００１５９）を製造者の操作手順に従って使用し、ラット血清ＴＴＲレベルを測定した。簡単に言うと、血清をキットのサンプル希釈剤で段階的に希釈し、最終希釈度１０，０００倍とした。その後、この希釈サンプルをＥＬＩＳＡプレートに加えた後、使用説明書に従ってアッセイを行った。
ＮＧＳシークエンシング
手短に言えば、ゲノムにおける標的位置での編集効率を定量的に決定するため、ゲノムＤＮＡを単離し、ディープシークエンシングを利用して、遺伝子編集により導入された挿入及び欠失の存在を同定した。
標的部位（例えば、ＴＴＲ）周辺にＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅させた。プライマー配列を以下に提供する。製造者の操作手順（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従ってさらなるＰＣＲを実施し、シークエンシングに必要な化学を追加した。アンプリコンの配列決定をＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置で行った。品質スコアの低いものを除去した後、読み取ったものをヒト基準ゲノム（例えば、ｈｇ３８）に対して整列させた。読み取りを含有している結果ファイルを基準ゲノム（ＢＡＭファイル）に対してマッピングし、ここで、目的の標的領域と重複した読み取りを選択し、野生型の読み取り数と挿入、置換、または欠失含有する読み取り数との比を計算した。
編集割合（例えば、「編集効率」または「編集率」）は、野生型などの配列読み取り総数に対する、挿入または欠失を含む配列読み取り総数と定義される。
図１は、ＮＧＳにより測定したマウス肝臓における編集割合を示す。図１Ａに示すように、１ｋｇ当たり１ｍｇのＲＮＡを投与した場合、インビボでの編集割合は肝臓での編集が約２０％～６０％超である。１ｋｇ当たり０．５ｍｇを投与した図１Ｂでは、約１０％～６０％の肝臓での編集が観察された。このマウスにおけるインビボ試験では、全組成物ともＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを肝細胞に効果的に送達し、各ＬＮＰ組成物のＮＧＳにより測定された、標的部位における活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ活性が認められた。５％のＰＥＧ脂質を含有するＬＮＰは封入率が低く（データ図示せず）、効力が幾分低かった。
実施例２－ＬＮＰ組成物分析法
ＬＮＰの特性解析は、リピドＡ及びＰＥＧ脂質を増量して製剤化したＬＮＰにおいて、改善された物理化学的パラメータを示している。ＰＥＧ脂質を２モル％または３モル％含む組成物（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）を下記表３に記載する。
Figure 2023103421000007
ＬＮＰ製剤－交差流
脂質含有エタノールを、２容量のＲＮＡ溶液及び１容積の水と衝突噴流混合してＬＮＰを形成した。脂質含有エタノールを、混合交差部を介して２容量のＲＮＡ溶液と混合する。第４流の水を、インラインＴ字部を介して交差部の出口流と混合する。（ＷＯ２０１６０１０８４０の図２を参照のこと）。ＬＮＰを室温で１時間維持し、その後、水でさらに希釈した（約１：１ｖ／ｖ）。希釈したＬＮＰを、フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）で接線流ろ過を使用して濃縮し、その後、緩衝液を、血液透析濾過によって５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のショ糖、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）に交換した。別法として、ＴＳＳへの最終緩衝液交換をＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）で完了させた。必要に応じ、Ａｍｉｃｏｎ １００ｋＤａ遠心式フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で遠心分離にかけて製剤を濃縮した。その後、得られる混合物を、０．２μｍ滅菌フィルターを使用してろ過した。最終ＬＮＰを以降の使用時まで４℃または－８０℃で保存した。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを実施例１に記載のように調製したが、キャップ化及びポリアデニル化したＣａｓ９ Ｕ除去（Ｃａｓ９ Ｕｄｅｐ）ｍＲＮＡが配列番号４３を含む点が異なっている。Ｓｇ２８２は実施例１に記載され、ｓｇ５３４（「Ｇ５３４」）の配列を以下に記載する：
ｍＡ＊ｍＣ＊ｍＧ＊ＣＡＡＡＵＡＵＣＡＧＵＣＣＡＧＣＧＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号７２）
ＬＮＰ製剤を、平均粒径、多分散度（ｐｄｉ）、トータルＲＮＡ含量及びＲＮＡの封入率について実施例１に記載のように分析した。
平均粒径、多分散度（ＰＤＩ）、トータルＲＮＡ含量及びＲＮＡの封入率の分析を表４に示す。ＬＮＰ組成物の理論上の脂質濃度に加え、脂質分析により、下記表５に示すような実際の脂質のモル％レベルが示された．
Figure 2023103421000008
Figure 2023103421000009
Figure 2023103421000010
物理化学的性質をさらに分析するため、ＬＮＰ８９７、ＬＮＰ８９８、ＬＮＰ９６６、及びＬＮＰ９６９を非対称流フィールド・フロー・フラクショネーション－多角度光散乱法（ＡＦ４－ＭＡＬＳ）分析に供した。ＡＦ４－ＭＡＬＳ装置は粒径及び分子量分布を測定し、粒子のコンホメーション及び密度についての情報を提供する。
ＬＮＰは、それらが集められているＨＰＬＣオートサンプラーを使用してＡＦ４分離チャンネルに注入し、その後、チャンネルを横切る交差流中に指数勾配で溶出させる。流体はすべてＨＰＬＣポンプ及びＷｙａｔｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ装置で駆動される。粒子はＡＦ４のチャンネル流から溶出し、ＵＶ検出器、Ｗｙａｔｔ Ｈｅｌｅｏｓ ＩＩ多角度光散乱検出器、準弾性光散乱検出器及びＷｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ示差屈折率検出器を通る。Ｄｅｂｅｙｅモデルを使用してＷｙａｔｔ Ａｓｔｒａ ７ソフトウェアで生データを処理し、検出器信号から分子量及びｒｍｓ半径を決定する。
ＬＮＰについての対数で表すモル質量差プロットを図２Ａとして示す。手短に言えば、Ｘ軸はモル質量（ｇ／ｍｏｌ）を示し、Ｙ軸は微分数（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を示す。対数で表すモル質量差プロットにより、具体的な製剤について測定した異なる分子量の分布が示される。これにより、製剤中の分子量ならびに分子量の全体的分布の様子に関するデータが与えられ、粒子の異質性に関し平均分子量よりも良好な像が得られる。
異なるモル質量モーメントを測定し、重量平均モル質量（Ｍｗ）と数平均モル質量（Ｍｎ）の比を計算してＭｗ／Ｍｎの多分散度を得ることによって、各種ＬＮＰ製剤の異質性を決定する。これらの各種製剤の多分散度グラフを図２Ｂに記載する。
図２Ａに示すように、データは、ＰＥＧが３モル％、及びリピドＡが５０モル％及び５５モル％の場合にＮ／Ｐ６．０で粒子分布が密になっていることを示す。これは、図２Ｂに示すように多分散度が密であることに反映されている。
実施例３－ＡＦ４ ＭＡＬＳデータ－さらなる製剤
ＬＮＰの特性解析は、リピドＡを増量して製剤化したＬＮＰにおいて、改善された物理化学的パラメータを示している。４５モル％、５０モル％、または５５モル％いずれかのリピドＡを２つの異なるｇＲＮＡと共に含む組成物を下記表６に記載する。
Figure 2023103421000011
ＬＮＰを実施例２に記載のように形成した。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを上記のように調製した。
ＬＮＰ組成物の特徴付けを行い、封入率、多分散指数、及び平均粒径を実施例１に記載のように決定した。
平均粒径、多分散度（ＰＤＩ）、トータルＲＮＡ含量及びＲＮＡの封入率の分析を表７に示す。ＬＮＰ組成物の理論上の脂質濃度に加え、脂質分析により、下記表８に示すような実際の脂質のモル％レベルが示された。
Figure 2023103421000012
Figure 2023103421000013
Figure 2023103421000014
Figure 2023103421000015
物理化学的性質をさらに分析するため、ＬＮＰ１０２１、ＬＮＰ１０２２、ＬＮＰ１０２３、ＬＮＰ１０２４及びＬＮＰ１０２５を非対称流フィールド・フロー・フラクショネーション－多角度光散乱法（ＡＦ４－ＭＡＬＳ）分析に供した。ＡＦ４－ＭＡＬＳ装置は粒径及び分子量分布を測定し、粒子のコンホメーション及び密度についての情報を提供する。
ＬＮＰに、実施例１に記載のようにＡＦ４－ＭＡＬＳを実施した。
ＬＮＰについての対数で表すモル質量差プロットを図３Ａとして示す。手短に言えば、Ｘ軸はモル質量（ｇ／ｍｏｌ）を示し、Ｙ軸は微分数（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を示す。対数で表すモル質量差プロットにより、具体的な製剤について算出した異なる分子量の分布が示される。これにより、製剤中の分子量ならびに分子量の全体的分布の様子に関するデータが与えられ、粒子の異質性に関し平均分子量よりも良好な像が得られる。
図３Ｂでは平均分子量をプロットした。平均分子量は分布全体の平均であるが、その分布の形状に関する情報は得られない。ＬＮＰ１０２２及びＬＮＰ１０２５は平均分子量が同じであるが、分布はＬＮＰ１０２２の方がわずかに広い。
異なるモル質量モーメントを調べ、重量平均モル質量（Ｍｗ）と数平均モル質量（Ｍｎ）の比を計算してＭｗ／Ｍｎの多分散度を得ることによって、各種ＬＮＰ製剤の異質性を算出する。これらの各種製剤の多分散度グラフを図４Ａに記載する。
さらに、ＬＮＰ製剤のＢｕｒｃｈａｒｄ－Ｓｔｏｃｋｍｅｙｅｒプロットを図４Ｂとして示す。Ｂｕｒｃｈａｒｄ－Ｓｔｏｃｋｍｅｙｅｒプロットでは、ＡＦ４チャンネルからの製剤の溶出液全体における、ｒｍｓ半径と流体力学的半径との比が示される。これにより、脂質ナノ粒子の内部密度に関する情報が得られる。図４Ｂは、この測定において、ＬＮＰ１０２１、ＬＮＰ１０２２及びＬＮＰ１０２３は異なるプロファイルを有することを示している。
実施例４－ＰＥＧ脂質増量では効力が維持されサイトカイン応答が低下する
別の試験では、ＰＥＧ脂質を２モル％または３モル％含むＬＮＰ製剤で、ＰＥＧ ＤＭＧ脂質を比較した。ＰＥＧ ＤＭＧを２モル％、または３モル％いずれかで含む組成物を下記表９に記載する。
Figure 2023103421000016
Figure 2023103421000017
実施例２に記載の方法でＬＮＰを形成した。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを実施例１に記載のように調製し、ｓｇ３９０（「Ｇ３９０」）の配列を以下に記載する：
ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＣ＊ＧＡＧＵＣＵＧＧＡＧＡＧＣＵＧＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号６９）。
ＬＮＰ製剤を、平均粒径、多分散度（ｐｄｉ）、トータルＲＮＡ含量及びＲＮＡの封入率について実施例１に記載のように分析した。
平均粒径、多分散度（ＰＤＩ）、トータルＲＮＡ含量及びＲＮＡの封入率の分析を表１０に示す。ＬＮＰ組成物の理論上の脂質濃度に加え、脂質分析により、下記表１１に示すような実際の脂質のモル％レベルが示された。
Figure 2023103421000018
Figure 2023103421000019
Figure 2023103421000020
ラット血清サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ磁気ビーズマルチプレックスアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰ磁気ビーズアッセイ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ製、カタログ番号ＲＥＣＹＴＭＡＧ－６５Ｋ）を使用して、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファ及びＩＦＮ－ガンマを分析して評価した。アッセイビーズをＢｉｏＲａｄ ＢｉｏＰｌｅｘ－２００で読み取り、ＢｉｏＰｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアバージョン６．１で４パラメータロジスティックフィットを使用して、標準曲線からサイトカイン濃度を計算した。データは図５にグラフ化されている。図５Ａ（血清ＴＴＲ）、図５Ｂ（肝臓での編集）、及び図５Ｃ（サイトカインｐ ＭＣＰ１）を参照のこと。
ラット特異的ＥＬＩＳキット（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、カタログ番号ＯＫＩＡ００１５９）を製造者の操作手順に従って使用し、ラット血清ＴＴＲレベルを測定した。簡単に言えば、血清をキットのサンプル希釈剤で段階的に希釈し、最終希釈度１０，０００倍とした。その後、この希釈サンプルをＥＬＩＳＡプレートに加えた後、使用説明書に従ってアッセイを行った。
約１０ｍｇの肝組織からゲノムＤＮＡを単離し、上記のようにＮＧＳを使用して解析した。増幅用ＰＣＲプライマー配列を以下に記載する。
図５Ａ及び図５Ｂは、ＰＥＧが２モル％及び３モル％の各製剤において、血清ＴＴＲノックダウン及び肝臓での編集が十分であったことを示す。図５Ｃは、ＰＥＧが３モル％の製剤使用時、ＭＣＰ－１応答が低下していることを示す。
実施例５－非ヒト霊長類へのＬＮＰ送達
実施例１に記載のように調製したＬＮＰ製剤を用いて３つの試験を行った。特定のモル量及びカーゴを表１２～表２６に記載する。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含有している各製剤はｍＲＮＡ：ｇＲＮＡ比が重量基準で１：１であった。ＬＮＰ投与量（単位：ｍｇ／ｋｇ、トータルＲＮＡ含量）、投与経路、及び動物へのデキサメタゾンでの前処置の有無を表に示す。デキサメタゾン（Ｄｅｘ）の前処置を受けた動物の場合、ＬＮＰまたはビヒクルの投与の１時間前に、Ｄｅｘを２ｍｇ／ｋｇでＩＶボーラス注射により投与した。
血液化学分析では、測定した各因子についての下記表で示されている時間に動物から血液を採取した。処理の前後ＮＨＰでサイトカイン誘導を測定した。拘束した覚醒動物の末梢静脈から最低の０．５ｍＬの全血を４ｍＬ血清分離剤入り管に採取した。血液を室温で最低限３０分間凝血させ、その後、２０００ｘｇで１５分の遠心分離にかけた。血清を２本の１２０μＬポリプロピレン製マイクロチューブに分注し、分析まで－６０～－８６℃で保存した。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）製非ヒト霊長類Ｕ－Ｐｌｅｘ Ｃｙｔｏｋｉｎｅカスタムキットを使用して分析した。ＩＬ－６及びＭＣＰ－１に重点を置いて、以下のパラメータ、すなわち、ＩＮＦ－ｇ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＭＣＰ－１及びＴＮＦ－ａを分析に含めた。キット試薬及び標準液を製造者の操作手順で指示されているように調製した。ＮＨＰ血清はそのまま使用した。ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００でプレートの読み取りを実施し、ＭＳＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙワークベンチソフトウェアバージョン４０１２で分析を実施した。
処置前後の動物で酵素免疫測定法により補体レベルを測定した。拘束した覚醒動物の末梢静脈から全血（０．５ｍＬ）を０．５ｍＬのｋ２ＥＤＴＡを含有する管に採取した。血液を２０００ｘｇで１５分の遠心分離にかけた。血漿を２本の１２０μＬポリプロピレン製マイクロチューブに分注し、分析まで－６０～－８６℃で保存した。Ｑｕｉｄｅｌ ＭｉｃｒｏＶｕｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｐｌｕｓ ＥＩＡキット（Ｃ３ａ－カタログ番号Ａ０３１）または（Ｂｂ－カタログ番号Ａ０２７）を使用して分析した。キット試薬及び標準液を製造者の操作手順で指示されているように調製した。ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００で光学濃度を４５０ｎｍにしてプレートの読み取りを実施した。４－パラメータ曲線フィッティングを使用して結果を分析した。
サイトカイン誘導及び補体活性化についてのデータを下記表に記載する。「ＢＬＱ」は、定量限界未満であることを意味する。
Figure 2023103421000021
Figure 2023103421000022
Figure 2023103421000023
Figure 2023103421000024
Figure 2023103421000025
Figure 2023103421000026
Figure 2023103421000027
Figure 2023103421000028
Figure 2023103421000029
Figure 2023103421000030
Figure 2023103421000031
Figure 2023103421000032
Figure 2023103421000033
Figure 2023103421000034
Figure 2023103421000035
Figure 2023103421000036
Figure 2023103421000037
Figure 2023103421000038
Figure 2023103421000039
Figure 2023103421000040
Figure 2023103421000041
Figure 2023103421000042
Figure 2023103421000043
Figure 2023103421000044
Figure 2023103421000045
Figure 2023103421000046
Figure 2023103421000047
実施例６－ＰＥＧ脂質スクリーニング
別の試験では、ＰＥＧ脂質を２モル％または３モル％含むＬＮＰ製剤で代替的ＰＥＧ脂質を比較した。
試験では３種のＰＥＧ脂質を使用し、脂質１（ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ；Ｎｏｆ）は、以下のように表される。
Figure 2023103421000048
Ｈｅｙｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７（２００５），ｐｐ．２７８－２７９（「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ」を参照のこと）に記載のように合成される脂質２は、以下のように表すことができ、
Figure 2023103421000049
 ＷＯ２０１６／０１０８４０（化合物Ｓ０２７、段落［００２４０］から段落［００２４４］を参照のこと）及びＷＯ２０１１／０７６８０７に開示される脂質３は、以下のように表すことができる。
Figure 2023103421000050
各ＰＥＧ脂質を２モル％及び３モル％用いてリピドＡを製剤化した。脂質ナノ粒子成分を、脂質成分を上記のモル比で１００％エタノールに溶解させた。手短に言えば、ＲＮＡカーゴを２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０に調製し、ＲＮＡカーゴの濃度を約０．４５ｍｇ／ｍＬとした。ＬＮＰは、脂質アミンとＲＮＡリン酸塩（Ｎ：Ｐ）のモル比を約４．５、ｍＲＮＡとｇＲＮＡの比を重量基準で１：１にして製剤化された。
Figure 2023103421000051
Figure 2023103421000052
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｓｇ２８２、及びＬＮＰを実施例１に記載のように調製した。
脂質１、脂質２、または脂質３を含むＬＮＰ組成物を雌ＣＤ―１マウスに投与し、１ｍｇ／ｋｇ体重及び０．５ｍｇ／ｋｇ体重で実施例１に記載のように評価した。マウスのコホートを、実施例１の方法に従って次世代シーケンシング（ＮＧＳ）及び血清ＴＴＲレベルによって肝臓での編集について測定した。
図６Ａ及び図６Ｂでは、ＰＥＧ脂質製剤間の血清ＴＴＲレベル比較している。図６Ａは血清ＴＴＲをμｇ／ｍＬ単位で示し、図６Ｂはノックダウンの割合（ＴＳＳ％）としてのデータを示す。図６Ｃは肝臓で達成された編集率を示す。データは、被験ＰＥＧ脂質の各々を含むＬＮＰ組成物は２モル％及び３モル％において効力を示し、脂質１は一貫して脂質２及び脂質３よりも性能が良好であることを示す。
実施例７－リピドＡ類似体
リピドＡの構造類似体を多数合成し、本明細書に記載のＬＮＰ組成物で試験した。
合成：リピドＡは、４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタン酸（ＷＯ２０１５／０９５３４０の実施例１３の「中間体１３ｂ」）と、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－ヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアート（「中間体１３ｃ」）とを反応させてから、中間体１３ｂと中間体１３ｃの生成物を、３－ジエチルアミノ－１－プロパノールと反応させて頭部基を付加することにより作られる。（ＷＯ２０１５／０９５３４０の８４～８６頁を参照のこと）。
ＷＯ２０１５／０９５３４０の中間体１３ｂ（４，４ビス（オクチルオキシ）ブタン酸）を４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタンニトリルにより以下のとおり合成した。
中間体１３ａ：４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタンニトリル
Figure 2023103421000053
４，４－ジエトキシブタンニトリル（９．４ｇ、６０ｍｍｏｌ）及びオクタン－１－オール（２３．１ｇ、１７８ｍｍｏｌ）の混合物にピリジニウムｐ－トルエンスルホン酸（７４８ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を室温で加えた。混合物を１０５℃に温め、反応槽を開にし、空気に触れる状態で、還流冷却器を取り付けずに１８時間撹拌した。その後、反応混合物を室温まで冷却し、シリカゲル（酢酸エチル含有ヘキサンの勾配０～５％）で精製して１０．１ｇ（３１．０ｍｍｏｌ）の中間体１３ａを澄明な油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．５５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．２， ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４３ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．２， ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９４ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．４， ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６３ － １．５０ （ｍ， ４Ｈ）， １．３８ － １．１９ （ｍ， ２０Ｈ）， ０．９３ － ０．８２ （ｍ， ６Ｈ） ｐｐｍ。
次に、中間体１３ａ（８．４２ｇ、３１ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（３０ｍＬ）に、３１ｍＬの水性水酸化カリウム（２．５Ｍ、３０．９ｍＬ、７７．３ｍｍｏｌ）を室温で加えた。反応槽に還流冷却器を取り付けた時点で、混合物を１１０℃まで加熱し、２４時間撹拌した。その後、混合物を室温まで冷却し、水性塩化水素酸（１Ｎ）で酸性化してｐＨ５とし、ヘキサン中に３回抽出した。合わせた有機抽出物を水（２回）及び食塩水で洗浄して無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、減圧濃縮し、８．１５ｇ（２３．６ｍｍｏｌ）の中間体１３ｂを澄明な油状物として得、これをそれ以上精製せずに使用した。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．５０ （ｔ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５７ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４１ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９２ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．４， ５．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５６ （ｍ， ４Ｈ）， １．３７ － １．２１ （ｍ， ２０Ｈ）， ０．９２ － ０．８３ （ｍ， ６Ｈ） ｐｐｍ（下記の構造）。
中間体１３ｂ
Figure 2023103421000054
上記方法を使用して、Ｃ（炭素数５、６、７、９、及び１０）－アセタール酸性中間体（中間体Ｂ３～Ｆ３と呼び、以下に表す）を、適切なアルカン－１－オール試薬を使用して調製した。
中間体Ｂ３、４，４－ビス（ペンチルオキシ）ブタン酸
Figure 2023103421000055
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．５２ （ｔ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５８ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４１ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９４ （ｍ， ２Ｈ）， １．５７ （ｍ， ４Ｈ）， １．３２ （ｍ， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ， ８Ｈ）， ０．９５ － ０．８３ （ｍ， ６Ｈ） ｐｐｍ。
中間体Ｃ３：４，４－ビス（ヘキシルオキシ）ブタン酸
Figure 2023103421000056
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７９ （ｑ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５４ （ｍ， ４Ｈ）， １．２９ （ｍ， １２Ｈ）， ０．９４ － ０．８２ （ｍ， ６Ｈ） ｐｐｍ。
中間体Ｄ３：４，４－ビス（ヘプチルオキシ）ブタン酸
Figure 2023103421000057
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．８５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．４６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５２ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．２６ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８５ （ｑ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５３ （ｍ， ４Ｈ）， １．２９ （ｍ， １６Ｈ）， ０．９４ － ０．８０ （ｍ， ６Ｈ） ｐｐｍ。
中間体Ｅ３：４，４－ビス（ノニルオキシ）ブタン酸
Figure 2023103421000058
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ５．３２ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．４４ （ｔ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．３， ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３８ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．４， ６．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７８ （ｑ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５３ （ｍ， ４Ｈ）， １．２７ （ｍ， ２４Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ６Ｈ） ｐｐｍ。
中間体Ｆ３：４，４－ビス（デシルオキシ）ブタン酸：
Figure 2023103421000059
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２９ （ｄｄ， Ｊ ＝ １０．８， ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９０ － １．８２ （ｍ， ２Ｈ）， １．５５ （ｍ， ４Ｈ）， １．２７ （ｍ， ２８Ｈ）， ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ６Ｈ） ｐｐｍ。
リピドＡのアセタール類似体（Ｃ（８））は、Ｃ（炭素数５、６、７、９、または１０）－アセタール酸性中間体（Ｂ３～Ｆ３）と、中間体１３ｃとを反応させてから、そのステップの生成物を３－ジエチルアミノ－１－プロパノールと反応させることによって合成した。（ＷＯ２０１５／０９５３４０の８４～８６頁を参照のこと）。各類似体を合成し、１ＨＮＭＲで特徴付けを行った（データ図示せず）。
リピドＡ類似体を４５モル％、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを２モル％、ＤＳＰＣを９モル％、及びコレステロールを４４モル％にし、Ｎ：Ｐ比４．５にてＣ７、Ｃ９、及びＣ１０の類似体を製剤化した。それぞれの類似体は、リピドＡ類似体を５５モル％、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを２．５モル％、ＤＳＰＣを９モル％、及びコレステロールを３８．５モル％にし、Ｎ：Ｐ比６にても製剤化された。脂質ナノ粒子成分を、脂質成分を上記のモル比で１００％エタノールに溶解させた。ＲＮＡカーゴを２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０に調製し、ＲＮＡカーゴの濃度を約０．４５ｍｇ／ｍＬとした。
ＲＮＡカーゴには、配列番号４３を含むＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇ２８２が含まれ、上記のように調製した。ＬＮＰを実施例１に記載のように形成した。
Ｃ（５）及びＣ（６）リピドＡ類似体を含むＬＮＰ組成物を含めた拡張パネルのアセタール類似体を、先のパネルと共に試験した。２つの新たな類似体は、リピドＡ類似体を５５モル％、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋを２．５モル％、ＤＰＳＣを９モル％、及びコレステロールを３３．５モル％にし、Ｎ／Ｐ比６にて、上記のように製剤化した。分析により、ＬＮＰの大きさはいずれも１２０ｎｍを下回り、ＰＤＩは０．２未満、及び封入されたＲＮＡの割合（％）は８０％より高いことが示された。製剤の分析結果を下記表２８に記載する。
Figure 2023103421000060
水に溶解させた６－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（「ＴＮＳ」）を使用し、類似体をｐＫａについて評価した。本アッセイでは、０．１Ｍのリン酸緩衝液を４．５～１０．５の範囲の異なるｐＨ値で調製した。各類似体を１００％エタノール中に個々に調製した。その後、脂質及びＴＮＳを個々のｐＨ緩衝液に加えてプレートに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダーで波長３２１～４８８ｎｍにて分析した。値をプロットしてｐＫａを生成した。対数ＩＣ５０をｐＫａとして使用する。
雌ＣＤ―１マウスに、実施例１に記載のように、０．３ｍｇ／ｋｇ（図７Ａ－図７Ｅ）、または１ｋｇ当たり０．１ｍｇ（図７Ｆ－図７Ｇ）を投与した。手短に言えば、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た雌ＣＤ－１マウス（ｎ＝５／群）にＬＮＰ組成物をさまざまな用量で投与した。剖検時（投与後７日）、ＴＴＲ分析用に血清を採取し、編集分析用に肝臓を採取した。血清ＴＴＲアッセイ及び編集率アッセイを実施例１に記載のように実施した。図７Ａから図７Ｅの血清ＴＴＲレベル及び肝臓での編集では、すべての類似体が、体重１キログラム当たり０．３ミリグラムにおいてリピドＡに匹敵する性能であることが示されている。図７Ｆ～図７Ｇでは、リピドＡが最も効力が高かったが、新たに合成した類似体はいずれもＴＴＲノックダウン及び肝臓での編集が適切であることが示されている。
実施例８－用量反応曲線－初代Ｃｙｎｏ肝細胞
肝臓の初代肝細胞。初代カニクイザル肝臓肝細胞（ＰＣＨ）（Ｇｉｂｃｏ）を解凍し、添加物を含有する肝細胞融解培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログＣＭ７０００）に再懸濁させ、その後、８０ｇで４分間遠心分離にかけた。上清を廃棄し、ペレット状にした細胞を添加物入り肝細胞播種培地パック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログＡ１２１７６０１及びＣＭ３０００）に再懸濁させた。細胞を計数し、Ｂｉｏ－ｃｏａｔコラーゲンＩコート９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ８７７２７２）に５０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。播種細胞を沈殿させ、組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２雰囲気）に入れて２４時間接着させてから、ＬＮＰを投与した。インキュベーション後、細胞を単層形成について確認し、肝細胞培地及び無血清の添加物パック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログＡ１２１７６０１及びＣＭ４０００）で培地を交換した。
本試験用のＬＮＰ製剤（ＬＮＰ１０２１、ＬＮＰ１０２２、ＬＮＰ１０２３、ＬＮＰ１０２４、ＬＮＰ１０２５、及びＬＮＰ８９７）を上記のように調製した。
カニクイザル初代肝細胞で修飾ｓｇＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子製剤をさまざまな用量で試験し、用量反応曲線を作成した。播種して２４時間培養した後、６％のカニクイザル血清を含有する肝細胞維持培地でＬＮＰを３７℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＬＮＰをカニクイザル初代肝細胞に、８．２倍の用量反応曲線で１００ｎｇのｍＲＮＡで開始して加えた。細胞を、処理後７２時間溶解させ、実施例１に記載のようにＮＧＳ分析を行った。各種ＬＮＰ組成物について編集率を決定したデータを図８Ａにグラフ化している。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（配列番号４８）及びＵ－除去Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（配列番号４３）での編集率（％）を図８Ｂに記載する。ＬＮＰ組成物は表２（ＬＮＰ８９７）及び表５（ＬＮＰ１０２１、ＬＮＰ１０２２、ＬＮＰ１０２３、ＬＮＰ１０２４、及びＬＮＰ１０２５）に記載されている。
結果は比較効力評価の定量的評価を示しており、ｍＲＮＡ及びＬＮＰ組成物の両方が効力に影響を与えることを示している。
実施例９－ＲＮＡカーゴ：ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ合剤
この試験では、ｇＲＮＡとｍＲＮＡの比が異なる場合のマウスにおけるインビボでの有効性を評価した。ＯＲＦの配列番号４、ＨＳＤ ５’ＵＴＲ、ヒトアルブミン３’ＵＴＲ、コザック配列、及びポリＡ尾部を有するＣｌｅａｎＣａｐ（商標）キャップ化Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、実施例１に示すウリジン三リン酸の代わりにＮ１－メチルプソイドウリジン三リン酸を用いてＩＶＴ合成により作製した。
ＬＮＰ製剤を、リピドＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのモル比を５０：３８：９：３にし、Ｎ：Ｐ比６にて記載ｍＲＮＡ及びｓｇ２８２（配列番号４２；Ｇ２８２）から実施例２に記載のように調製した。製剤のｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ重量比は表２９に示すとおりであった．
Figure 2023103421000061
インビボでの特性解析をするため、上記のＬＮＰを、１ｋｇ当たり０．１ｍｇのトータルＲＮＡ（ガイドＲＮＡ（ｍｇ）＋ｍＲＮＡ（ｍｇ））にてマウスに投与した（ｎ＝５／群）。投与後７～９日目、動物を屠殺して血液及び肝臓を採取し、血清ＴＴＲ及び肝臓での編集を実施例１に記載のように測定した。血清ＴＴＲ及び肝臓での編集の結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。陰性対照マウスにはＴＳＳビヒクルを投与した。
さらに、上記ＬＮＰをマウスに投与し、その際、ｍＲＮＡを１ｋｇ当たり０．０５ｍｇのｍＲＮＡ（ｎ＝５／群）という一定用量にし、ｇＲＮＡを１ｋｇ当たり０．０６ｍｇ～１ｋｇ当たり０．４ｍｇで用量を変えた。投与後７～９日目、動物を屠殺して血液及び肝臓を採取し、血清ＴＴＲ及び肝臓での編集を測定した。血清ＴＴＲ及び肝臓での編集の結果を図９Ｃ及び図９Ｄに示す。陰性対照マウスにはＴＳＳビヒクルを投与した。
実施例１０－中性脂質
ＬＮＰのインビボでの有効性を評価するため、実施例２のｍＲＮＡ、及びｓｇ５３４（配列番号７２；Ｇ５３４）を用いて実施例２に記載のようにＬＮＰ製剤を調製した。脂質ナノ粒子成分を下記の脂質成分モル比で１００％エタノールに溶解させた。手短に言えば、２５ｍＭのクエン酸塩及び１００ｍＭのＮａＣｌの緩衝液（ｐＨ５．０）にＲＮＡカーゴを調製し、ＲＮＡカーゴの濃度を約０．４５ｍｇ／ｍＬとした。ＬＮＰは、脂質アミンとＲＮＡリン酸塩（Ｎ：Ｐ）のモル比を約６、ｍＲＮＡとｇＲＮＡの比を重量基準で１：２にして製剤化された。
ＬＮＰ製剤を、平均粒径、多分散度（ｐｄｉ）、トータルＲＮＡ含量及びＲＮＡの封入率について実施例１に記載のように分析した。平均粒径、多分散度（ＰＤＩ）、トータルＲＮＡ含量及びＲＮＡの封入率の分析を表３０に示す。脂質のモル比は、アミン脂質（リピドＡ）／中性脂質／ヘルパー脂質（コレステロール）／ＰＥＧ脂質（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）として記載される。中性脂質は、示されているように、ＤＳＰ、ＤＰＰＣであるかまたは不含であった。
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インビボでの特性解析をするため、雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに上記のＬＮＰを体重１ｋｇ当たり０．３ｍｇのトータルＲＮＡ（ガイドＲＮＡ及びｍＲＮＡ）にて静脈内投与した。ラットは１群当たり５匹であった。投与後７日目、動物を屠殺して血液及び肝臓を採取し、血清ＴＴＲ及び肝臓での編集を実施例１に記載のように測定した。陰性対照動物にはＴＳＳビヒクルを投与した。血清ＴＴＲ及び肝臓での編集の結果を図１０Ａ及び図１０Ｂ、及び表３０（上記）に示す。
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配列そのものについては下記配列表を参照のこと。転写産物配列には一般に、ＡＲＣＡと共に使用するための最初の３ヌクレオチドとしてＧＧＧが含まれるか、またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）と共に使用するための最初の３ヌクレオチドとしてＡＧＧが含まれる。したがって、最初の３ヌクレオチドは、ワクシニアのキャッピング酵素などの、他のキャッピング手法と共に使用するために修飾され得る。プロモーター及びポリＡ配列は転写産物配列には含まれない。Ｔ７プロモーター（配列番号３１）などのプロモーター及び配列番号６２または６３などのポリＡ配列は、開示の転写産物配列に５’末端及び３’末端でそれぞれ付加することができる。ほとんどのヌクレオチド配列はＤＮＡとして提供されるが、それらはＴをＵに変えることにより容易にＲＮＡに変換可能である。
配列表
以下の配列表は、本明細書に開示する配列の一覧を提供する。ＤＮＡ配列（Ｔを含む）がＲＮＡに関して参照される場合は、ＴをＵに置き換えなければならず（状況に応じて修飾の場合と非修飾の場合がある）、その逆の場合は、逆の置き換えをしなければならないと理解される。
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＊＝ＰＳ結合；「ｍ」＝２’－Ｏ－Ｍｅヌクレオチド
マウスのＧ０００２８２ ＮＧＳプライマー配列
フォワードプライマー：
ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＧＴＴＣＣＡＧＡＧＴＣＴＡＴＣＡＣＣＧ
リバースプライマー：
ＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＡＡＴＡＡＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧＡＡＣ
ラットＧ０００３９０ＮＧＳプライマー配列
フォワードプライマー：
ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＡＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＡ
リバースプライマー：
ＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＡＧＴＡＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＴＡＡＡＡＣＴＴ
ＧＦＰ配列：
ＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＣＴＴＧＴＴＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＣＧＴＴＧＣＡＧＧＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＧＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＴＡＣＣＡＴＧＡＧＡＡＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＴＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＴＴＧＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＧ
配列表
SEQUENCE LISTING

<110> INTELLIA THERAPEUTICS, INC.

<120> FORMULATIONS

<130> PA23-236

<150> US 62/566,240
<151> 2017-09-29

<160> 84

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 4140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"

<400> 1
atggacaaga agtacagcat cggactggac atcggaacaa acagcgtcgg atgggcagtc 60

atcacagacg aatacaaggt cccgagcaag aagttcaagg tcctgggaaa cacagacaga 120

cacagcatca agaagaacct gatcggagca ctgctgttcg acagcggaga aacagcagaa 180

gcaacaagac tgaagagaac agcaagaaga agatacacaa gaagaaagaa cagaatctgc 240

tacctgcagg aaatcttcag caacgaaatg gcaaaggtcg acgacagctt cttccacaga 300

ctggaagaaa gcttcctggt cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gatcttcgga 360

aacatcgtcg acgaagtcgc ataccacgaa aagtacccga caatctacca cctgagaaag 420

aagctggtcg acagcacaga caaggcagac ctgagactga tctacctggc actggcacac 480

atgatcaagt tcagaggaca cttcctgatc gaaggagacc tgaacccgga caacagcgac 540

gtcgacaagc tgttcatcca gctggtccag acatacaacc agctgttcga agaaaacccg 600

atcaacgcaa gcggagtcga cgcaaaggca atcctgagcg caagactgag caagagcaga 660

agactggaaa acctgatcgc acagctgccg ggagaaaaga agaacggact gttcggaaac 720

ctgatcgcac tgagcctggg actgacaccg aacttcaaga gcaacttcga cctggcagaa 780

gacgcaaagc tgcagctgag caaggacaca tacgacgacg acctggacaa cctgctggca 840

cagatcggag accagtacgc agacctgttc ctggcagcaa agaacctgag cgacgcaatc 900

ctgctgagcg acatcctgag agtcaacaca gaaatcacaa aggcaccgct gagcgcaagc 960

atgatcaaga gatacgacga acaccaccag gacctgacac tgctgaaggc actggtcaga 1020

cagcagctgc cggaaaagta caaggaaatc ttcttcgacc agagcaagaa cggatacgca 1080

ggatacatcg acggaggagc aagccaggaa gaattctaca agttcatcaa gccgatcctg 1140

gaaaagatgg acggaacaga agaactgctg gtcaagctga acagagaaga cctgctgaga 1200

aagcagagaa cattcgacaa cggaagcatc ccgcaccaga tccacctggg agaactgcac 1260

gcaatcctga gaagacagga agacttctac ccgttcctga aggacaacag agaaaagatc 1320

gaaaagatcc tgacattcag aatcccgtac tacgtcggac cgctggcaag aggaaacagc 1380

agattcgcat ggatgacaag aaagagcgaa gaaacaatca caccgtggaa cttcgaagaa 1440

gtcgtcgaca agggagcaag cgcacagagc ttcatcgaaa gaatgacaaa cttcgacaag 1500

aacctgccga acgaaaaggt cctgccgaag cacagcctgc tgtacgaata cttcacagtc 1560

tacaacgaac tgacaaaggt caagtacgtc acagaaggaa tgagaaagcc ggcattcctg 1620

agcggagaac agaagaaggc aatcgtcgac ctgctgttca agacaaacag aaaggtcaca 1680

gtcaagcagc tgaaggaaga ctacttcaag aagatcgaat gcttcgacag cgtcgaaatc 1740

agcggagtcg aagacagatt caacgcaagc ctgggaacat accacgacct gctgaagatc 1800

atcaaggaca aggacttcct ggacaacgaa gaaaacgaag acatcctgga agacatcgtc 1860

ctgacactga cactgttcga agacagagaa atgatcgaag aaagactgaa gacatacgca 1920

cacctgttcg acgacaaggt catgaagcag ctgaagagaa gaagatacac aggatgggga 1980

agactgagca gaaagctgat caacggaatc agagacaagc agagcggaaa gacaatcctg 2040

gacttcctga agagcgacgg attcgcaaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100

agcctgacat tcaaggaaga catccagaag gcacaggtca gcggacaggg agacagcctg 2160

cacgaacaca tcgcaaacct ggcaggaagc ccggcaatca agaagggaat cctgcagaca 2220

gtcaaggtcg tcgacgaact ggtcaaggtc atgggaagac acaagccgga aaacatcgtc 2280

atcgaaatgg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340

atgaagagaa tcgaagaagg aatcaaggaa ctgggaagcc agatcctgaa ggaacacccg 2400

gtcgaaaaca cacagctgca gaacgaaaag ctgtacctgt actacctgca gaacggaaga 2460

gacatgtacg tcgaccagga actggacatc aacagactga gcgactacga cgtcgaccac 2520

atcgtcccgc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtcct gacaagaagc 2580

gacaagaaca gaggaaagag cgacaacgtc ccgagcgaag aagtcgtcaa gaagatgaag 2640

aactactgga gacagctgct gaacgcaaag ctgatcacac agagaaagtt cgacaacctg 2700

acaaaggcag agagaggagg actgagcgaa ctggacaagg caggattcat caagagacag 2760

ctggtcgaaa caagacagat cacaaagcac gtcgcacaga tcctggacag cagaatgaac 2820

acaaagtacg acgaaaacga caagctgatc agagaagtca aggtcatcac actgaagagc 2880

aagctggtca gcgacttcag aaaggacttc cagttctaca aggtcagaga aatcaacaac 2940

taccaccacg cacacgacgc atacctgaac gcagtcgtcg gaacagcact gatcaagaag 3000

tacccgaagc tggaaagcga attcgtctac ggagactaca aggtctacga cgtcagaaag 3060

atgatcgcaa agagcgaaca ggaaatcgga aaggcaacag caaagtactt cttctacagc 3120

aacatcatga acttcttcaa gacagaaatc acactggcaa acggagaaat cagaaagaga 3180

ccgctgatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtct gggacaaggg aagagacttc 3240

gcaacagtca gaaaggtcct gagcatgccg caggtcaaca tcgtcaagaa gacagaagtc 3300

cagacaggag gattcagcaa ggaaagcatc ctgccgaaga gaaacagcga caagctgatc 3360

gcaagaaaga aggactggga cccgaagaag tacggaggat tcgacagccc gacagtcgca 3420

tacagcgtcc tggtcgtcgc aaaggtcgaa aagggaaaga gcaagaagct gaagagcgtc 3480

aaggaactgc tgggaatcac aatcatggaa agaagcagct tcgaaaagaa cccgatcgac 3540

ttcctggaag caaagggata caaggaagtc aagaaggacc tgatcatcaa gctgccgaag 3600

tacagcctgt tcgaactgga aaacggaaga aagagaatgc tggcaagcgc aggagaactg 3660

cagaagggaa acgaactggc actgccgagc aagtacgtca acttcctgta cctggcaagc 3720

cactacgaaa agctgaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagct gttcgtcgaa 3780

cagcacaagc actacctgga cgaaatcatc gaacagatca gcgaattcag caagagagtc 3840

atcctggcag acgcaaacct ggacaaggtc ctgagcgcat acaacaagca cagagacaag 3900

ccgatcagag aacaggcaga aaacatcatc cacctgttca cactgacaaa cctgggagca 3960

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<213> Artificial Sequence

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tatctgcaag agatcttttc gaacgaaatg gcaaaggtcg acgacagctt cttccaccgc 300

ctggaagaat ctttcctggt ggaggaggac aagaagcatg aacggcatcc tatctttgga 360

aacatcgtcg acgaagtggc gtaccacgaa aagtacccga ccatctacca tctgcggaag 420

aagttggttg actcaactga caaggccgac ctcagattga tctacttggc cctcgcccat 480

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atcaatgcta gcggcgtcga tgccaaggcc atcctgtccg cccggctgtc gaagtcgcgg 660

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ttgatcgctc tctcactggg actcactccc aatttcaagt ccaattttga cctggccgag 780

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gcacgcaaga aagacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgauucgcc gacugucgca 3420

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aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960

gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020

guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080

cugagccagc ugggaggaga cggaggagga agcccgaaga agaagagaaa gguc 4134


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gacaagaagu acagcaucgg acuggcaauc ggaacaaaca gcgucggaug ggcagucauc 60

acagacgaau acaagguccc gagcaagaag uucaaggucc ugggaaacac agacagacac 120

agcaucaaga agaaccugau cggagcacug cuguucgaca gcggagaaac agcagaagca 180

acaagacuga agagaacagc aagaagaaga uacacaagaa gaaagaacag aaucugcuac 240

cugcaggaaa ucuucagcaa cgaaauggca aaggucgacg acagcuucuu ccacagacug 300

gaagaaagcu uccuggucga agaagacaag aagcacgaaa gacacccgau cuucggaaac 360

aucgucgacg aagucgcaua ccacgaaaag uacccgacaa ucuaccaccu gagaaagaag 420

cuggucgaca gcacagacaa ggcagaccug agacugaucu accuggcacu ggcacacaug 480

aucaaguuca gaggacacuu ccugaucgaa ggagaccuga acccggacaa cagcgacguc 540

gacaagcugu ucauccagcu gguccagaca uacaaccagc uguucgaaga aaacccgauc 600

aacgcaagcg gagucgacgc aaaggcaauc cugagcgcaa gacugagcaa gagcagaaga 660

cuggaaaacc ugaucgcaca gcugccggga gaaaagaaga acggacuguu cggaaaccug 720

aucgcacuga gccugggacu gacaccgaac uucaagagca acuucgaccu ggcagaagac 780

gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840

aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900

cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960

aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020

cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080

uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140

aagauggacg gaacagaaga acugcugguc aagcugaaca gagaagaccu gcugagaaag 1200

cagagaacau ucgacaacgg aagcaucccg caccagaucc accugggaga acugcacgca 1260

auccugagaa gacaggaaga cuucuacccg uuccugaagg acaacagaga aaagaucgaa 1320

aagauccuga cauucagaau cccguacuac gucggaccgc uggcaagagg aaacagcaga 1380

uucgcaugga ugacaagaaa gagcgaagaa acaaucacac cguggaacuu cgaagaaguc 1440

gucgacaagg gagcaagcgc acagagcuuc aucgaaagaa ugacaaacuu cgacaagaac 1500

cugccgaacg aaaagguccu gccgaagcac agccugcugu acgaauacuu cacagucuac 1560

aacgaacuga caaaggucaa guacgucaca gaaggaauga gaaagccggc auuccugagc 1620

ggagaacaga agaaggcaau cgucgaccug cuguucaaga caaacagaaa ggucacaguc 1680

aagcagcuga aggaagacua cuucaagaag aucgaaugcu ucgacagcgu cgaaaucagc 1740

ggagucgaag acagauucaa cgcaagccug ggaacauacc acgaccugcu gaagaucauc 1800

aaggacaagg acuuccugga caacgaagaa aacgaagaca uccuggaaga caucguccug 1860

acacugacac uguucgaaga cagagaaaug aucgaagaaa gacugaagac auacgcacac 1920

cuguucgacg acaaggucau gaagcagcug aagagaagaa gauacacagg auggggaaga 1980

cugagcagaa agcugaucaa cggaaucaga gacaagcaga gcggaaagac aauccuggac 2040

uuccugaaga gcgacggauu cgcaaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100

cugacauuca aggaagacau ccagaaggca caggucagcg gacagggaga cagccugcac 2160

gaacacaucg caaaccuggc aggaagcccg gcaaucaaga agggaauccu gcagacaguc 2220

aaggucgucg acgaacuggu caaggucaug ggaagacaca agccggaaaa caucgucauc 2280

gaaauggcaa gagaaaacca gacaacacag aagggacaga agaacagcag agaaagaaug 2340

aagagaaucg aagaaggaau caaggaacug ggaagccaga uccugaagga acacccgguc 2400

gaaaacacac agcugcagaa cgaaaagcug uaccuguacu accugcagaa cggaagagac 2460

auguacgucg accaggaacu ggacaucaac agacugagcg acuacgacgu cgacgcaauc 2520

gucccgcaga gcuuccugaa ggacgacagc aucgacaaca agguccugac aagaagcgac 2580

aagaacagag gaaagagcga caacgucccg agcgaagaag ucgucaagaa gaugaagaac 2640

uacuggagac agcugcugaa cgcaaagcug aucacacaga gaaaguucga caaccugaca 2700

aaggcagaga gaggaggacu gagcgaacug gacaaggcag gauucaucaa gagacagcug 2760

gucgaaacaa gacagaucac aaagcacguc gcacagaucc uggacagcag aaugaacaca 2820

aaguacgacg aaaacgacaa gcugaucaga gaagucaagg ucaucacacu gaagagcaag 2880

cuggucagcg acuucagaaa ggacuuccag uucuacaagg ucagagaaau caacaacuac 2940

caccacgcac acgacgcaua ccugaacgca gucgucggaa cagcacugau caagaaguac 3000

ccgaagcugg aaagcgaauu cgucuacgga gacuacaagg ucuacgacgu cagaaagaug 3060

aucgcaaaga gcgaacagga aaucggaaag gcaacagcaa aguacuucuu cuacagcaac 3120

aucaugaacu ucuucaagac agaaaucaca cuggcaaacg gagaaaucag aaagagaccg 3180

cugaucgaaa caaacggaga aacaggagaa aucgucuggg acaagggaag agacuucgca 3240

acagucagaa agguccugag caugccgcag gucaacaucg ucaagaagac agaaguccag 3300

acaggaggau ucagcaagga aagcauccug ccgaagagaa acagcgacaa gcugaucgca 3360

agaaagaagg acugggaccc gaagaaguac ggaggauucg acagcccgac agucgcauac 3420

agcguccugg ucgucgcaaa ggucgaaaag ggaaagagca agaagcugaa gagcgucaag 3480

gaacugcugg gaaucacaau cauggaaaga agcagcuucg aaaagaaccc gaucgacuuc 3540

cuggaagcaa agggauacaa ggaagucaag aaggaccuga ucaucaagcu gccgaaguac 3600

agccuguucg aacuggaaaa cggaagaaag agaaugcugg caagcgcagg agaacugcag 3660

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uacgaaaagc ugaagggaag cccggaagac aacgaacaga agcagcuguu cgucgaacag 3780

cacaagcacu accuggacga aaucaucgaa cagaucagcg aauucagcaa gagagucauc 3840

cuggcagacg caaaccugga caagguccug agcgcauaca acaagcacag agacaagccg 3900

aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960

gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020

guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080

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Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15


Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30


Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45


Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60


Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80


Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95


Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110


His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125


His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140


Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160


Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175


Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190


Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205


Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220


Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240


Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255


Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270


Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285


Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300


Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320


Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335


Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350


Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365


Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380


Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400


Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415


Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430


Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445


Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460


Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480


Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495


Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510


Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525


Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540


Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560


Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575


Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590


Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605


Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620


Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640


His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655


Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670


Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685


Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700


Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720


His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735


Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750


Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765


Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780


Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800


Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815


Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830


Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845


Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860


Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880


Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895


Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910


Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925


Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940


Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960


Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975


Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990


Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005


Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020


Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035


Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050


Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065


Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080


Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095


Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110


Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125


Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140


Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155


Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170


Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185


Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200


Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215


Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230


Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245


Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260


His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275


Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290


Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305


Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320


Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335


Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350


Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365


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aucacagacg aauacaaggu cccgagcaag aaguucaagg uccugggaaa cacagacaga 120

cacagcauca agaagaaccu gaucggagca cugcuguucg acagcggaga aacagcagaa 180

gcaacaagac ugaagagaac agcaagaaga agauacacaa gaagaaagaa cagaaucugc 240

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aacaucgucg acgaagucgc auaccacgaa aaguacccga caaucuacca ccugagaaag 420

aagcuggucg acagcacaga caaggcagac cugagacuga ucuaccuggc acuggcacac 480

augaucaagu ucagaggaca cuuccugauc gaaggagacc ugaacccgga caacagcgac 540

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augaucaaga gauacgacga acaccaccag gaccugacac ugcugaaggc acuggucaga 1020

cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca 1080

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gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga 1200

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gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc 1320

gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc 1380

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aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700

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gacaagaagu acagcaucgg acuggacauc ggaacaaaca gcgucggaug ggcagucauc 60

acagacgaau acaagguccc gagcaagaag uucaaggucc ugggaaacac agacagacac 120

agcaucaaga agaaccugau cggagcacug cuguucgaca gcggagaaac agcagaagca 180

acaagacuga agagaacagc aagaagaaga uacacaagaa gaaagaacag aaucugcuac 240

cugcaggaaa ucuucagcaa cgaaauggca aaggucgacg acagcuucuu ccacagacug 300

gaagaaagcu uccuggucga agaagacaag aagcacgaaa gacacccgau cuucggaaac 360

aucgucgacg aagucgcaua ccacgaaaag uacccgacaa ucuaccaccu gagaaagaag 420

cuggucgaca gcacagacaa ggcagaccug agacugaucu accuggcacu ggcacacaug 480

aucaaguuca gaggacacuu ccugaucgaa ggagaccuga acccggacaa cagcgacguc 540

gacaagcugu ucauccagcu gguccagaca uacaaccagc uguucgaaga aaacccgauc 600

aacgcaagcg gagucgacgc aaaggcaauc cugagcgcaa gacugagcaa gagcagaaga 660

cuggaaaacc ugaucgcaca gcugccggga gaaaagaaga acggacuguu cggaaaccug 720

aucgcacuga gccugggacu gacaccgaac uucaagagca acuucgaccu ggcagaagac 780

gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840

aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900

cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960

aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020

cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080

uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140

aagauggacg gaacagaaga acugcugguc aagcugaaca gagaagaccu gcugagaaag 1200

cagagaacau ucgacaacgg aagcaucccg caccagaucc accugggaga acugcacgca 1260

auccugagaa gacaggaaga cuucuacccg uuccugaagg acaacagaga aaagaucgaa 1320

aagauccuga cauucagaau cccguacuac gucggaccgc uggcaagagg aaacagcaga 1380

uucgcaugga ugacaagaaa gagcgaagaa acaaucacac cguggaacuu cgaagaaguc 1440

gucgacaagg gagcaagcgc acagagcuuc aucgaaagaa ugacaaacuu cgacaagaac 1500

cugccgaacg aaaagguccu gccgaagcac agccugcugu acgaauacuu cacagucuac 1560

aacgaacuga caaaggucaa guacgucaca gaaggaauga gaaagccggc auuccugagc 1620

ggagaacaga agaaggcaau cgucgaccug cuguucaaga caaacagaaa ggucacaguc 1680

aagcagcuga aggaagacua cuucaagaag aucgaaugcu ucgacagcgu cgaaaucagc 1740

ggagucgaag acagauucaa cgcaagccug ggaacauacc acgaccugcu gaagaucauc 1800

aaggacaagg acuuccugga caacgaagaa aacgaagaca uccuggaaga caucguccug 1860

acacugacac uguucgaaga cagagaaaug aucgaagaaa gacugaagac auacgcacac 1920

cuguucgacg acaaggucau gaagcagcug aagagaagaa gauacacagg auggggaaga 1980

cugagcagaa agcugaucaa cggaaucaga gacaagcaga gcggaaagac aauccuggac 2040

uuccugaaga gcgacggauu cgcaaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100

cugacauuca aggaagacau ccagaaggca caggucagcg gacagggaga cagccugcac 2160

gaacacaucg caaaccuggc aggaagcccg gcaaucaaga agggaauccu gcagacaguc 2220

aaggucgucg acgaacuggu caaggucaug ggaagacaca agccggaaaa caucgucauc 2280

gaaauggcaa gagaaaacca gacaacacag aagggacaga agaacagcag agaaagaaug 2340

aagagaaucg aagaaggaau caaggaacug ggaagccaga uccugaagga acacccgguc 2400

gaaaacacac agcugcagaa cgaaaagcug uaccuguacu accugcagaa cggaagagac 2460

auguacgucg accaggaacu ggacaucaac agacugagcg acuacgacgu cgaccacauc 2520

gucccgcaga gcuuccugaa ggacgacagc aucgacaaca agguccugac aagaagcgac 2580

aagaacagag gaaagagcga caacgucccg agcgaagaag ucgucaagaa gaugaagaac 2640

uacuggagac agcugcugaa cgcaaagcug aucacacaga gaaaguucga caaccugaca 2700

aaggcagaga gaggaggacu gagcgaacug gacaaggcag gauucaucaa gagacagcug 2760

gucgaaacaa gacagaucac aaagcacguc gcacagaucc uggacagcag aaugaacaca 2820

aaguacgacg aaaacgacaa gcugaucaga gaagucaagg ucaucacacu gaagagcaag 2880

cuggucagcg acuucagaaa ggacuuccag uucuacaagg ucagagaaau caacaacuac 2940

caccacgcac acgacgcaua ccugaacgca gucgucggaa cagcacugau caagaaguac 3000

ccgaagcugg aaagcgaauu cgucuacgga gacuacaagg ucuacgacgu cagaaagaug 3060

aucgcaaaga gcgaacagga aaucggaaag gcaacagcaa aguacuucuu cuacagcaac 3120

aucaugaacu ucuucaagac agaaaucaca cuggcaaacg gagaaaucag aaagagaccg 3180

cugaucgaaa caaacggaga aacaggagaa aucgucuggg acaagggaag agacuucgca 3240

acagucagaa agguccugag caugccgcag gucaacaucg ucaagaagac agaaguccag 3300

acaggaggau ucagcaagga aagcauccug ccgaagagaa acagcgacaa gcugaucgca 3360

agaaagaagg acugggaccc gaagaaguac ggaggauucg acagcccgac agucgcauac 3420

agcguccugg ucgucgcaaa ggucgaaaag ggaaagagca agaagcugaa gagcgucaag 3480

gaacugcugg gaaucacaau cauggaaaga agcagcuucg aaaagaaccc gaucgacuuc 3540

cuggaagcaa agggauacaa ggaagucaag aaggaccuga ucaucaagcu gccgaaguac 3600

agccuguucg aacuggaaaa cggaagaaag agaaugcugg caagcgcagg agaacugcag 3660

aagggaaacg aacuggcacu gccgagcaag uacgucaacu uccuguaccu ggcaagccac 3720

uacgaaaagc ugaagggaag cccggaagac aacgaacaga agcagcuguu cgucgaacag 3780

cacaagcacu accuggacga aaucaucgaa cagaucagcg aauucagcaa gagagucauc 3840

cuggcagacg caaaccugga caagguccug agcgcauaca acaagcacag agacaagccg 3900

aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960

gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020

guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080

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Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
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Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
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Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45


Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60


Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80


Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95


Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110


His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125


His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140


Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160


Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175


Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190


Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205


Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220


Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240


Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255


Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270


Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285


Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300


Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320


Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335


Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350


Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365


Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380


Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400


Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415


Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430


Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445


Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460


Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480


Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495


Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510


Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525


Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540


Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560


Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575


Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590


Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605


Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620


Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640


His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655


Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670


Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685


Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700


Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720


His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735


Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750


Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765


Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780


Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800


Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815


Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830


Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845


Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860


Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880


Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895


Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910


Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925


Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940


Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960


Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975


Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990


Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005


Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020


Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035


Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050


Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065


Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080


Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095


Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110


Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125


Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140


Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155


Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170


Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185


Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200


Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215


Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230


Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245


Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260


His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275


Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290


Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305


Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320


Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335


Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350


Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365


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<212> RNA
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auggacaaga aguacagcau cggacuggca aucggaacaa acagcgucgg augggcaguc 60

aucacagacg aauacaaggu cccgagcaag aaguucaagg uccugggaaa cacagacaga 120

cacagcauca agaagaaccu gaucggagca cugcuguucg acagcggaga aacagcagaa 180

gcaacaagac ugaagagaac agcaagaaga agauacacaa gaagaaagaa cagaaucugc 240

uaccugcagg aaaucuucag caacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu cuuccacaga 300

cuggaagaaa gcuuccuggu cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gaucuucgga 360

aacaucgucg acgaagucgc auaccacgaa aaguacccga caaucuacca ccugagaaag 420

aagcuggucg acagcacaga caaggcagac cugagacuga ucuaccuggc acuggcacac 480

augaucaagu ucagaggaca cuuccugauc gaaggagacc ugaacccgga caacagcgac 540

gucgacaagc uguucaucca gcugguccag acauacaacc agcuguucga agaaaacccg 600

aucaacgcaa gcggagucga cgcaaaggca auccugagcg caagacugag caagagcaga 660

agacuggaaa accugaucgc acagcugccg ggagaaaaga agaacggacu guucggaaac 720

cugaucgcac ugagccuggg acugacaccg aacuucaaga gcaacuucga ccuggcagaa 780

gacgcaaagc ugcagcugag caaggacaca uacgacgacg accuggacaa ccugcuggca 840

cagaucggag accaguacgc agaccuguuc cuggcagcaa agaaccugag cgacgcaauc 900

cugcugagcg acauccugag agucaacaca gaaaucacaa aggcaccgcu gagcgcaagc 960

augaucaaga gauacgacga acaccaccag gaccugacac ugcugaaggc acuggucaga 1020

cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca 1080

ggauacaucg acggaggagc aagccaggaa gaauucuaca aguucaucaa gccgauccug 1140

gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga 1200

aagcagagaa cauucgacaa cggaagcauc ccgcaccaga uccaccuggg agaacugcac 1260

gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc 1320

gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc 1380

agauucgcau ggaugacaag aaagagcgaa gaaacaauca caccguggaa cuucgaagaa 1440

gucgucgaca agggagcaag cgcacagagc uucaucgaaa gaaugacaaa cuucgacaag 1500

aaccugccga acgaaaaggu ccugccgaag cacagccugc uguacgaaua cuucacaguc 1560

uacaacgaac ugacaaaggu caaguacguc acagaaggaa ugagaaagcc ggcauuccug 1620

agcggagaac agaagaaggc aaucgucgac cugcuguuca agacaaacag aaaggucaca 1680

gucaagcagc ugaaggaaga cuacuucaag aagaucgaau gcuucgacag cgucgaaauc 1740

agcggagucg aagacagauu caacgcaagc cugggaacau accacgaccu gcugaagauc 1800

aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgaa gaaaacgaag acauccugga agacaucguc 1860

cugacacuga cacuguucga agacagagaa augaucgaag aaagacugaa gacauacgca 1920

caccuguucg acgacaaggu caugaagcag cugaagagaa gaagauacac aggaugggga 1980

agacugagca gaaagcugau caacggaauc agagacaagc agagcggaaa gacaauccug 2040

gacuuccuga agagcgacgg auucgcaaac agaaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100

agccugacau ucaaggaaga cauccagaag gcacagguca gcggacaggg agacagccug 2160

cacgaacaca ucgcaaaccu ggcaggaagc ccggcaauca agaagggaau ccugcagaca 2220

gucaaggucg ucgacgaacu ggucaagguc augggaagac acaagccgga aaacaucguc 2280

aucgaaaugg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340

augaagagaa ucgaagaagg aaucaaggaa cugggaagcc agauccugaa ggaacacccg 2400

gucgaaaaca cacagcugca gaacgaaaag cuguaccugu acuaccugca gaacggaaga 2460

gacauguacg ucgaccagga acuggacauc aacagacuga gcgacuacga cgucgaccac 2520

aucgucccgc agagcuuccu gaaggacgac agcaucgaca acaagguccu gacaagaagc 2580

gacaagaaca gaggaaagag cgacaacguc ccgagcgaag aagucgucaa gaagaugaag 2640

aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700

acaaaggcag agagaggagg acugagcgaa cuggacaagg caggauucau caagagacag 2760

cuggucgaaa caagacagau cacaaagcac gucgcacaga uccuggacag cagaaugaac 2820

acaaaguacg acgaaaacga caagcugauc agagaaguca aggucaucac acugaagagc 2880

aagcugguca gcgacuucag aaaggacuuc caguucuaca aggucagaga aaucaacaac 2940

uaccaccacg cacacgacgc auaccugaac gcagucgucg gaacagcacu gaucaagaag 3000

uacccgaagc uggaaagcga auucgucuac ggagacuaca aggucuacga cgucagaaag 3060

augaucgcaa agagcgaaca ggaaaucgga aaggcaacag caaaguacuu cuucuacagc 3120

aacaucauga acuucuucaa gacagaaauc acacuggcaa acggagaaau cagaaagaga 3180

ccgcugaucg aaacaaacgg agaaacagga gaaaucgucu gggacaaggg aagagacuuc 3240

gcaacaguca gaaagguccu gagcaugccg caggucaaca ucgucaagaa gacagaaguc 3300

cagacaggag gauucagcaa ggaaagcauc cugccgaaga gaaacagcga caagcugauc 3360

gcaagaaaga aggacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgacagccc gacagucgca 3420

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uacagccugu ucgaacugga aaacggaaga aagagaaugc uggcaagcgc aggagaacug 3660

cagaagggaa acgaacuggc acugccgagc aaguacguca acuuccugua ccuggcaagc 3720

cacuacgaaa agcugaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagcu guucgucgaa 3780

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auccuggcag acgcaaaccu ggacaagguc cugagcgcau acaacaagca cagagacaag 3900

ccgaucagag aacaggcaga aaacaucauc caccuguuca cacugacaaa ccugggagca 3960

ccggcagcau ucaaguacuu cgacacaaca aucgacagaa agagauacac aagcacaaag 4020

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acaagacuga agagaacagc aagaagaaga uacacaagaa gaaagaacag aaucugcuac 240

cugcaggaaa ucuucagcaa cgaaauggca aaggucgacg acagcuucuu ccacagacug 300

gaagaaagcu uccuggucga agaagacaag aagcacgaaa gacacccgau cuucggaaac 360

aucgucgacg aagucgcaua ccacgaaaag uacccgacaa ucuaccaccu gagaaagaag 420

cuggucgaca gcacagacaa ggcagaccug agacugaucu accuggcacu ggcacacaug 480

aucaaguuca gaggacacuu ccugaucgaa ggagaccuga acccggacaa cagcgacguc 540

gacaagcugu ucauccagcu gguccagaca uacaaccagc uguucgaaga aaacccgauc 600

aacgcaagcg gagucgacgc aaaggcaauc cugagcgcaa gacugagcaa gagcagaaga 660

cuggaaaacc ugaucgcaca gcugccggga gaaaagaaga acggacuguu cggaaaccug 720

aucgcacuga gccugggacu gacaccgaac uucaagagca acuucgaccu ggcagaagac 780

gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840

aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900

cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960

aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020

cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080

uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140

aagauggacg gaacagaaga acugcugguc aagcugaaca gagaagaccu gcugagaaag 1200

cagagaacau ucgacaacgg aagcaucccg caccagaucc accugggaga acugcacgca 1260

auccugagaa gacaggaaga cuucuacccg uuccugaagg acaacagaga aaagaucgaa 1320

aagauccuga cauucagaau cccguacuac gucggaccgc uggcaagagg aaacagcaga 1380

uucgcaugga ugacaagaaa gagcgaagaa acaaucacac cguggaacuu cgaagaaguc 1440

gucgacaagg gagcaagcgc acagagcuuc aucgaaagaa ugacaaacuu cgacaagaac 1500

cugccgaacg aaaagguccu gccgaagcac agccugcugu acgaauacuu cacagucuac 1560

aacgaacuga caaaggucaa guacgucaca gaaggaauga gaaagccggc auuccugagc 1620

ggagaacaga agaaggcaau cgucgaccug cuguucaaga caaacagaaa ggucacaguc 1680

aagcagcuga aggaagacua cuucaagaag aucgaaugcu ucgacagcgu cgaaaucagc 1740

ggagucgaag acagauucaa cgcaagccug ggaacauacc acgaccugcu gaagaucauc 1800

aaggacaagg acuuccugga caacgaagaa aacgaagaca uccuggaaga caucguccug 1860

acacugacac uguucgaaga cagagaaaug aucgaagaaa gacugaagac auacgcacac 1920

cuguucgacg acaaggucau gaagcagcug aagagaagaa gauacacagg auggggaaga 1980

cugagcagaa agcugaucaa cggaaucaga gacaagcaga gcggaaagac aauccuggac 2040

uuccugaaga gcgacggauu cgcaaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100

cugacauuca aggaagacau ccagaaggca caggucagcg gacagggaga cagccugcac 2160

gaacacaucg caaaccuggc aggaagcccg gcaaucaaga agggaauccu gcagacaguc 2220

aaggucgucg acgaacuggu caaggucaug ggaagacaca agccggaaaa caucgucauc 2280

gaaauggcaa gagaaaacca gacaacacag aagggacaga agaacagcag agaaagaaug 2340

aagagaaucg aagaaggaau caaggaacug ggaagccaga uccugaagga acacccgguc 2400

gaaaacacac agcugcagaa cgaaaagcug uaccuguacu accugcagaa cggaagagac 2460

auguacgucg accaggaacu ggacaucaac agacugagcg acuacgacgu cgaccacauc 2520

gucccgcaga gcuuccugaa ggacgacagc aucgacaaca agguccugac aagaagcgac 2580

aagaacagag gaaagagcga caacgucccg agcgaagaag ucgucaagaa gaugaagaac 2640

uacuggagac agcugcugaa cgcaaagcug aucacacaga gaaaguucga caaccugaca 2700

aaggcagaga gaggaggacu gagcgaacug gacaaggcag gauucaucaa gagacagcug 2760

gucgaaacaa gacagaucac aaagcacguc gcacagaucc uggacagcag aaugaacaca 2820

aaguacgacg aaaacgacaa gcugaucaga gaagucaagg ucaucacacu gaagagcaag 2880

cuggucagcg acuucagaaa ggacuuccag uucuacaagg ucagagaaau caacaacuac 2940

caccacgcac acgacgcaua ccugaacgca gucgucggaa cagcacugau caagaaguac 3000

ccgaagcugg aaagcgaauu cgucuacgga gacuacaagg ucuacgacgu cagaaagaug 3060

aucgcaaaga gcgaacagga aaucggaaag gcaacagcaa aguacuucuu cuacagcaac 3120

aucaugaacu ucuucaagac agaaaucaca cuggcaaacg gagaaaucag aaagagaccg 3180

cugaucgaaa caaacggaga aacaggagaa aucgucuggg acaagggaag agacuucgca 3240

acagucagaa agguccugag caugccgcag gucaacaucg ucaagaagac agaaguccag 3300

acaggaggau ucagcaagga aagcauccug ccgaagagaa acagcgacaa gcugaucgca 3360

agaaagaagg acugggaccc gaagaaguac ggaggauucg acagcccgac agucgcauac 3420

agcguccugg ucgucgcaaa ggucgaaaag ggaaagagca agaagcugaa gagcgucaag 3480

gaacugcugg gaaucacaau cauggaaaga agcagcuucg aaaagaaccc gaucgacuuc 3540

cuggaagcaa agggauacaa ggaagucaag aaggaccuga ucaucaagcu gccgaaguac 3600

agccuguucg aacuggaaaa cggaagaaag agaaugcugg caagcgcagg agaacugcag 3660

aagggaaacg aacuggcacu gccgagcaag uacgucaacu uccuguaccu ggcaagccac 3720

uacgaaaagc ugaagggaag cccggaagac aacgaacaga agcagcuguu cgucgaacag 3780

cacaagcacu accuggacga aaucaucgaa cagaucagcg aauucagcaa gagagucauc 3840

cuggcagacg caaaccugga caagguccug agcgcauaca acaagcacag agacaagccg 3900

aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960

gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020

guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080

cugagccagc ugggaggaga c 4101


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Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
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Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
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Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
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Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60


Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80


Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95


Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110


His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125


His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140


Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160


Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175


Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190


Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205


Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220


Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240


Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255


Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270


Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285


Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300


Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320


Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335


Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350


Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365


Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380


Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400


Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415


Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430


Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445


Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460


Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480


Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495


Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510


Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525


Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540


Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560


Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575


Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590


Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605


Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620


Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640


His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655


Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670


Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685


Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700


Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720


His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735


Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750


Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765


Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780


Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800


Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815


Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830


Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845


Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860


Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880


Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895


Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910


Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925


Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940


Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960


Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975


Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990


Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005


Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020


Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035


Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050


Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065


Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080


Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095


Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110


Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125


Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140


Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155


Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170


Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185


Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200


Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215


Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230


Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245


Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260


His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275


Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290


Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305


Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320


Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335


Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350


Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365


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<211> 4107
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auggacaaga aguacagcau cggacuggca aucggaacaa acagcgucgg augggcaguc 60

aucacagacg aauacaaggu cccgagcaag aaguucaagg uccugggaaa cacagacaga 120

cacagcauca agaagaaccu gaucggagca cugcuguucg acagcggaga aacagcagaa 180

gcaacaagac ugaagagaac agcaagaaga agauacacaa gaagaaagaa cagaaucugc 240

uaccugcagg aaaucuucag caacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu cuuccacaga 300

cuggaagaaa gcuuccuggu cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gaucuucgga 360

aacaucgucg acgaagucgc auaccacgaa aaguacccga caaucuacca ccugagaaag 420

aagcuggucg acagcacaga caaggcagac cugagacuga ucuaccuggc acuggcacac 480

augaucaagu ucagaggaca cuuccugauc gaaggagacc ugaacccgga caacagcgac 540

gucgacaagc uguucaucca gcugguccag acauacaacc agcuguucga agaaaacccg 600

aucaacgcaa gcggagucga cgcaaaggca auccugagcg caagacugag caagagcaga 660

agacuggaaa accugaucgc acagcugccg ggagaaaaga agaacggacu guucggaaac 720

cugaucgcac ugagccuggg acugacaccg aacuucaaga gcaacuucga ccuggcagaa 780

gacgcaaagc ugcagcugag caaggacaca uacgacgacg accuggacaa ccugcuggca 840

cagaucggag accaguacgc agaccuguuc cuggcagcaa agaaccugag cgacgcaauc 900

cugcugagcg acauccugag agucaacaca gaaaucacaa aggcaccgcu gagcgcaagc 960

augaucaaga gauacgacga acaccaccag gaccugacac ugcugaaggc acuggucaga 1020

cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca 1080

ggauacaucg acggaggagc aagccaggaa gaauucuaca aguucaucaa gccgauccug 1140

gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga 1200

aagcagagaa cauucgacaa cggaagcauc ccgcaccaga uccaccuggg agaacugcac 1260

gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc 1320

gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc 1380

agauucgcau ggaugacaag aaagagcgaa gaaacaauca caccguggaa cuucgaagaa 1440

gucgucgaca agggagcaag cgcacagagc uucaucgaaa gaaugacaaa cuucgacaag 1500

aaccugccga acgaaaaggu ccugccgaag cacagccugc uguacgaaua cuucacaguc 1560

uacaacgaac ugacaaaggu caaguacguc acagaaggaa ugagaaagcc ggcauuccug 1620

agcggagaac agaagaaggc aaucgucgac cugcuguuca agacaaacag aaaggucaca 1680

gucaagcagc ugaaggaaga cuacuucaag aagaucgaau gcuucgacag cgucgaaauc 1740

agcggagucg aagacagauu caacgcaagc cugggaacau accacgaccu gcugaagauc 1800

aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgaa gaaaacgaag acauccugga agacaucguc 1860

cugacacuga cacuguucga agacagagaa augaucgaag aaagacugaa gacauacgca 1920

caccuguucg acgacaaggu caugaagcag cugaagagaa gaagauacac aggaugggga 1980

agacugagca gaaagcugau caacggaauc agagacaagc agagcggaaa gacaauccug 2040

gacuuccuga agagcgacgg auucgcaaac agaaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100

agccugacau ucaaggaaga cauccagaag gcacagguca gcggacaggg agacagccug 2160

cacgaacaca ucgcaaaccu ggcaggaagc ccggcaauca agaagggaau ccugcagaca 2220

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augaagagaa ucgaagaagg aaucaaggaa cugggaagcc agauccugaa ggaacacccg 2400

gucgaaaaca cacagcugca gaacgaaaag cuguaccugu acuaccugca gaacggaaga 2460

gacauguacg ucgaccagga acuggacauc aacagacuga gcgacuacga cgucgacgca 2520

aucgucccgc agagcuuccu gaaggacgac agcaucgaca acaagguccu gacaagaagc 2580

gacaagaaca gaggaaagag cgacaacguc ccgagcgaag aagucgucaa gaagaugaag 2640

aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700

acaaaggcag agagaggagg acugagcgaa cuggacaagg caggauucau caagagacag 2760

cuggucgaaa caagacagau cacaaagcac gucgcacaga uccuggacag cagaaugaac 2820

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augaucgcaa agagcgaaca ggaaaucgga aaggcaacag caaaguacuu cuucuacagc 3120

aacaucauga acuucuucaa gacagaaauc acacuggcaa acggagaaau cagaaagaga 3180

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gcaacaguca gaaagguccu gagcaugccg caggucaaca ucgucaagaa gacagaaguc 3300

cagacaggag gauucagcaa ggaaagcauc cugccgaaga gaaacagcga caagcugauc 3360

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uuccuggaag caaagggaua caaggaaguc aagaaggacc ugaucaucaa gcugccgaag 3600

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cacuacgaaa agcugaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagcu guucgucgaa 3780

cagcacaagc acuaccugga cgaaaucauc gaacagauca gcgaauucag caagagaguc 3840

auccuggcag acgcaaaccu ggacaagguc cugagcgcau acaacaagca cagagacaag 3900

ccgaucagag aacaggcaga aaacaucauc caccuguuca cacugacaaa ccugggagca 3960

ccggcagcau ucaaguacuu cgacacaaca aucgacagaa agagauacac aagcacaaag 4020

gaaguccugg acgcaacacu gauccaccag agcaucacag gacuguacga aacaagaauc 4080

gaccugagcc agcugggagg agacuag 4107


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gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840

aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900

cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960

aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020

cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080

uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140

aagauggacg gaacagaaga acugcugguc aagcugaaca gagaagaccu gcugagaaag 1200

cagagaacau ucgacaacgg aagcaucccg caccagaucc accugggaga acugcacgca 1260

auccugagaa gacaggaaga cuucuacccg uuccugaagg acaacagaga aaagaucgaa 1320

aagauccuga cauucagaau cccguacuac gucggaccgc uggcaagagg aaacagcaga 1380

uucgcaugga ugacaagaaa gagcgaagaa acaaucacac cguggaacuu cgaagaaguc 1440

gucgacaagg gagcaagcgc acagagcuuc aucgaaagaa ugacaaacuu cgacaagaac 1500

cugccgaacg aaaagguccu gccgaagcac agccugcugu acgaauacuu cacagucuac 1560

aacgaacuga caaaggucaa guacgucaca gaaggaauga gaaagccggc auuccugagc 1620

ggagaacaga agaaggcaau cgucgaccug cuguucaaga caaacagaaa ggucacaguc 1680

aagcagcuga aggaagacua cuucaagaag aucgaaugcu ucgacagcgu cgaaaucagc 1740

ggagucgaag acagauucaa cgcaagccug ggaacauacc acgaccugcu gaagaucauc 1800

aaggacaagg acuuccugga caacgaagaa aacgaagaca uccuggaaga caucguccug 1860

acacugacac uguucgaaga cagagaaaug aucgaagaaa gacugaagac auacgcacac 1920

cuguucgacg acaaggucau gaagcagcug aagagaagaa gauacacagg auggggaaga 1980

cugagcagaa agcugaucaa cggaaucaga gacaagcaga gcggaaagac aauccuggac 2040

uuccugaaga gcgacggauu cgcaaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100

cugacauuca aggaagacau ccagaaggca caggucagcg gacagggaga cagccugcac 2160

gaacacaucg caaaccuggc aggaagcccg gcaaucaaga agggaauccu gcagacaguc 2220

aaggucgucg acgaacuggu caaggucaug ggaagacaca agccggaaaa caucgucauc 2280

gaaauggcaa gagaaaacca gacaacacag aagggacaga agaacagcag agaaagaaug 2340

aagagaaucg aagaaggaau caaggaacug ggaagccaga uccugaagga acacccgguc 2400

gaaaacacac agcugcagaa cgaaaagcug uaccuguacu accugcagaa cggaagagac 2460

auguacgucg accaggaacu ggacaucaac agacugagcg acuacgacgu cgacgcaauc 2520

gucccgcaga gcuuccugaa ggacgacagc aucgacaaca agguccugac aagaagcgac 2580

aagaacagag gaaagagcga caacgucccg agcgaagaag ucgucaagaa gaugaagaac 2640

uacuggagac agcugcugaa cgcaaagcug aucacacaga gaaaguucga caaccugaca 2700

aaggcagaga gaggaggacu gagcgaacug gacaaggcag gauucaucaa gagacagcug 2760

gucgaaacaa gacagaucac aaagcacguc gcacagaucc uggacagcag aaugaacaca 2820

aaguacgacg aaaacgacaa gcugaucaga gaagucaagg ucaucacacu gaagagcaag 2880

cuggucagcg acuucagaaa ggacuuccag uucuacaagg ucagagaaau caacaacuac 2940

caccacgcac acgacgcaua ccugaacgca gucgucggaa cagcacugau caagaaguac 3000

ccgaagcugg aaagcgaauu cgucuacgga gacuacaagg ucuacgacgu cagaaagaug 3060

aucgcaaaga gcgaacagga aaucggaaag gcaacagcaa aguacuucuu cuacagcaac 3120

aucaugaacu ucuucaagac agaaaucaca cuggcaaacg gagaaaucag aaagagaccg 3180

cugaucgaaa caaacggaga aacaggagaa aucgucuggg acaagggaag agacuucgca 3240

acagucagaa agguccugag caugccgcag gucaacaucg ucaagaagac agaaguccag 3300

acaggaggau ucagcaagga aagcauccug ccgaagagaa acagcgacaa gcugaucgca 3360

agaaagaagg acugggaccc gaagaaguac ggaggauucg acagcccgac agucgcauac 3420

agcguccugg ucgucgcaaa ggucgaaaag ggaaagagca agaagcugaa gagcgucaag 3480

gaacugcugg gaaucacaau cauggaaaga agcagcuucg aaaagaaccc gaucgacuuc 3540

cuggaagcaa agggauacaa ggaagucaag aaggaccuga ucaucaagcu gccgaaguac 3600

agccuguucg aacuggaaaa cggaagaaag agaaugcugg caagcgcagg agaacugcag 3660

aagggaaacg aacuggcacu gccgagcaag uacgucaacu uccuguaccu ggcaagccac 3720

uacgaaaagc ugaagggaag cccggaagac aacgaacaga agcagcuguu cgucgaacag 3780

cacaagcacu accuggacga aaucaucgaa cagaucagcg aauucagcaa gagagucauc 3840

cuggcagacg caaaccugga caagguccug agcgcauaca acaagcacag agacaagccg 3900

aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960

gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020

guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080

cugagccagc ugggaggaga cggaggagga agc 4113


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polypeptide"

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Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15


Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30


Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45


Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60


Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80


Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95


Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110


His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125


His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140


Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160


Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175


Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190


Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205


Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220


Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240


Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255


Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270


Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285


Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300


Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320


Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335


Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350


Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365


Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380


Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400


Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415


Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430


Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445


Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460


Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480


Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495


Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510


Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525


Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540


Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560


Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575


Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590


Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605


Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620


Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640


His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655


Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670


Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685


Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700


Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720


His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735


Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750


Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765


Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780


Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800


Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815


Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830


Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845


Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860


Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880


Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895


Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910


Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925


Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940


Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960


Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975


Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990


Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005


Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020


Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035


Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050


Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065


Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080


Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095


Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110


Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125


Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140


Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155


Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170


Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185


Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200


Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215


Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230


Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245


Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260


His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275


Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290


Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305


Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320


Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335


Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350


Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365


Gly Ser Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Gly Ser Pro
1370 1375 1380


Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Ser Gly
1385 1390


<210> 23
<211> 4179
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
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polynucleotide"

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auggacaaga aguacagcau cggacuggac aucggaacaa acagcgucgg augggcaguc 60

aucacagacg aauacaaggu cccgagcaag aaguucaagg uccugggaaa cacagacaga 120

cacagcauca agaagaaccu gaucggagca cugcuguucg acagcggaga aacagcagaa 180

gcaacaagac ugaagagaac agcaagaaga agauacacaa gaagaaagaa cagaaucugc 240

uaccugcagg aaaucuucag caacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu cuuccacaga 300

cuggaagaaa gcuuccuggu cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gaucuucgga 360

aacaucgucg acgaagucgc auaccacgaa aaguacccga caaucuacca ccugagaaag 420

aagcuggucg acagcacaga caaggcagac cugagacuga ucuaccuggc acuggcacac 480

augaucaagu ucagaggaca cuuccugauc gaaggagacc ugaacccgga caacagcgac 540

gucgacaagc uguucaucca gcugguccag acauacaacc agcuguucga agaaaacccg 600

aucaacgcaa gcggagucga cgcaaaggca auccugagcg caagacugag caagagcaga 660

agacuggaaa accugaucgc acagcugccg ggagaaaaga agaacggacu guucggaaac 720

cugaucgcac ugagccuggg acugacaccg aacuucaaga gcaacuucga ccuggcagaa 780

gacgcaaagc ugcagcugag caaggacaca uacgacgacg accuggacaa ccugcuggca 840

cagaucggag accaguacgc agaccuguuc cuggcagcaa agaaccugag cgacgcaauc 900

cugcugagcg acauccugag agucaacaca gaaaucacaa aggcaccgcu gagcgcaagc 960

augaucaaga gauacgacga acaccaccag gaccugacac ugcugaaggc acuggucaga 1020

cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca 1080

ggauacaucg acggaggagc aagccaggaa gaauucuaca aguucaucaa gccgauccug 1140

gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga 1200

aagcagagaa cauucgacaa cggaagcauc ccgcaccaga uccaccuggg agaacugcac 1260

gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc 1320

gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc 1380

agauucgcau ggaugacaag aaagagcgaa gaaacaauca caccguggaa cuucgaagaa 1440

gucgucgaca agggagcaag cgcacagagc uucaucgaaa gaaugacaaa cuucgacaag 1500

aaccugccga acgaaaaggu ccugccgaag cacagccugc uguacgaaua cuucacaguc 1560

uacaacgaac ugacaaaggu caaguacguc acagaaggaa ugagaaagcc ggcauuccug 1620

agcggagaac agaagaaggc aaucgucgac cugcuguuca agacaaacag aaaggucaca 1680

gucaagcagc ugaaggaaga cuacuucaag aagaucgaau gcuucgacag cgucgaaauc 1740

agcggagucg aagacagauu caacgcaagc cugggaacau accacgaccu gcugaagauc 1800

aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgaa gaaaacgaag acauccugga agacaucguc 1860

cugacacuga cacuguucga agacagagaa augaucgaag aaagacugaa gacauacgca 1920

caccuguucg acgacaaggu caugaagcag cugaagagaa gaagauacac aggaugggga 1980

agacugagca gaaagcugau caacggaauc agagacaagc agagcggaaa gacaauccug 2040

gacuuccuga agagcgacgg auucgcaaac agaaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100

agccugacau ucaaggaaga cauccagaag gcacagguca gcggacaggg agacagccug 2160

cacgaacaca ucgcaaaccu ggcaggaagc ccggcaauca agaagggaau ccugcagaca 2220

gucaaggucg ucgacgaacu ggucaagguc augggaagac acaagccgga aaacaucguc 2280

aucgaaaugg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340

augaagagaa ucgaagaagg aaucaaggaa cugggaagcc agauccugaa ggaacacccg 2400

gucgaaaaca cacagcugca gaacgaaaag cuguaccugu acuaccugca gaacggaaga 2460

gacauguacg ucgaccagga acuggacauc aacagacuga gcgacuacga cgucgaccac 2520

aucgucccgc agagcuuccu gaaggacgac agcaucgaca acaagguccu gacaagaagc 2580

gacaagaaca gaggaaagag cgacaacguc ccgagcgaag aagucgucaa gaagaugaag 2640

aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700

acaaaggcag agagaggagg acugagcgaa cuggacaagg caggauucau caagagacag 2760

cuggucgaaa caagacagau cacaaagcac gucgcacaga uccuggacag cagaaugaac 2820

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aagcugguca gcgacuucag aaaggacuuc caguucuaca aggucagaga aaucaacaac 2940

uaccaccacg cacacgacgc auaccugaac gcagucgucg gaacagcacu gaucaagaag 3000

uacccgaagc uggaaagcga auucgucuac ggagacuaca aggucuacga cgucagaaag 3060

augaucgcaa agagcgaaca ggaaaucgga aaggcaacag caaaguacuu cuucuacagc 3120

aacaucauga acuucuucaa gacagaaauc acacuggcaa acggagaaau cagaaagaga 3180

ccgcugaucg aaacaaacgg agaaacagga gaaaucgucu gggacaaggg aagagacuuc 3240

gcaacaguca gaaagguccu gagcaugccg caggucaaca ucgucaagaa gacagaaguc 3300

cagacaggag gauucagcaa ggaaagcauc cugccgaaga gaaacagcga caagcugauc 3360

gcaagaaaga aggacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgacagccc gacagucgca 3420

uacagcgucc uggucgucgc aaaggucgaa aagggaaaga gcaagaagcu gaagagcguc 3480

aaggaacugc ugggaaucac aaucauggaa agaagcagcu ucgaaaagaa cccgaucgac 3540

uuccuggaag caaagggaua caaggaaguc aagaaggacc ugaucaucaa gcugccgaag 3600

uacagccugu ucgaacugga aaacggaaga aagagaaugc uggcaagcgc aggagaacug 3660

cagaagggaa acgaacuggc acugccgagc aaguacguca acuuccugua ccuggcaagc 3720

cacuacgaaa agcugaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagcu guucgucgaa 3780

cagcacaagc acuaccugga cgaaaucauc gaacagauca gcgaauucag caagagaguc 3840

auccuggcag acgcaaaccu ggacaagguc cugagcgcau acaacaagca cagagacaag 3900

ccgaucagag aacaggcaga aaacaucauc caccuguuca cacugacaaa ccugggagca 3960

ccggcagcau ucaaguacuu cgacacaaca aucgacagaa agagauacac aagcacaaag 4020

gaaguccugg acgcaacacu gauccaccag agcaucacag gacuguacga aacaagaauc 4080

gaccugagcc agcugggagg agacggaagc ggaagcccga agaagaagag aaaggucgac 4140

ggaagcccga agaagaagag aaaggucgac agcggauag 4179


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<211> 4173
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gacaagaagu acagcaucgg acuggacauc ggaacaaaca gcgucggaug ggcagucauc 60

acagacgaau acaagguccc gagcaagaag uucaaggucc ugggaaacac agacagacac 120

agcaucaaga agaaccugau cggagcacug cuguucgaca gcggagaaac agcagaagca 180

acaagacuga agagaacagc aagaagaaga uacacaagaa gaaagaacag aaucugcuac 240

cugcaggaaa ucuucagcaa cgaaauggca aaggucgacg acagcuucuu ccacagacug 300

gaagaaagcu uccuggucga agaagacaag aagcacgaaa gacacccgau cuucggaaac 360

aucgucgacg aagucgcaua ccacgaaaag uacccgacaa ucuaccaccu gagaaagaag 420

cuggucgaca gcacagacaa ggcagaccug agacugaucu accuggcacu ggcacacaug 480

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cuggaaaacc ugaucgcaca gcugccggga gaaaagaaga acggacuguu cggaaaccug 720

aucgcacuga gccugggacu gacaccgaac uucaagagca acuucgaccu ggcagaagac 780

gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840

aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900

cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960

aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020

cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080

uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140

aagauggacg gaacagaaga acugcugguc aagcugaaca gagaagaccu gcugagaaag 1200

cagagaacau ucgacaacgg aagcaucccg caccagaucc accugggaga acugcacgca 1260

auccugagaa gacaggaaga cuucuacccg uuccugaagg acaacagaga aaagaucgaa 1320

aagauccuga cauucagaau cccguacuac gucggaccgc uggcaagagg aaacagcaga 1380

uucgcaugga ugacaagaaa gagcgaagaa acaaucacac cguggaacuu cgaagaaguc 1440

gucgacaagg gagcaagcgc acagagcuuc aucgaaagaa ugacaaacuu cgacaagaac 1500

cugccgaacg aaaagguccu gccgaagcac agccugcugu acgaauacuu cacagucuac 1560

aacgaacuga caaaggucaa guacgucaca gaaggaauga gaaagccggc auuccugagc 1620

ggagaacaga agaaggcaau cgucgaccug cuguucaaga caaacagaaa ggucacaguc 1680

aagcagcuga aggaagacua cuucaagaag aucgaaugcu ucgacagcgu cgaaaucagc 1740

ggagucgaag acagauucaa cgcaagccug ggaacauacc acgaccugcu gaagaucauc 1800

aaggacaagg acuuccugga caacgaagaa aacgaagaca uccuggaaga caucguccug 1860

acacugacac uguucgaaga cagagaaaug aucgaagaaa gacugaagac auacgcacac 1920

cuguucgacg acaaggucau gaagcagcug aagagaagaa gauacacagg auggggaaga 1980

cugagcagaa agcugaucaa cggaaucaga gacaagcaga gcggaaagac aauccuggac 2040

uuccugaaga gcgacggauu cgcaaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100

cugacauuca aggaagacau ccagaaggca caggucagcg gacagggaga cagccugcac 2160

gaacacaucg caaaccuggc aggaagcccg gcaaucaaga agggaauccu gcagacaguc 2220

aaggucgucg acgaacuggu caaggucaug ggaagacaca agccggaaaa caucgucauc 2280

gaaauggcaa gagaaaacca gacaacacag aagggacaga agaacagcag agaaagaaug 2340

aagagaaucg aagaaggaau caaggaacug ggaagccaga uccugaagga acacccgguc 2400

gaaaacacac agcugcagaa cgaaaagcug uaccuguacu accugcagaa cggaagagac 2460

auguacgucg accaggaacu ggacaucaac agacugagcg acuacgacgu cgaccacauc 2520

gucccgcaga gcuuccugaa ggacgacagc aucgacaaca agguccugac aagaagcgac 2580

aagaacagag gaaagagcga caacgucccg agcgaagaag ucgucaagaa gaugaagaac 2640

uacuggagac agcugcugaa cgcaaagcug aucacacaga gaaaguucga caaccugaca 2700

aaggcagaga gaggaggacu gagcgaacug gacaaggcag gauucaucaa gagacagcug 2760

gucgaaacaa gacagaucac aaagcacguc gcacagaucc uggacagcag aaugaacaca 2820

aaguacgacg aaaacgacaa gcugaucaga gaagucaagg ucaucacacu gaagagcaag 2880

cuggucagcg acuucagaaa ggacuuccag uucuacaagg ucagagaaau caacaacuac 2940

caccacgcac acgacgcaua ccugaacgca gucgucggaa cagcacugau caagaaguac 3000

ccgaagcugg aaagcgaauu cgucuacgga gacuacaagg ucuacgacgu cagaaagaug 3060

aucgcaaaga gcgaacagga aaucggaaag gcaacagcaa aguacuucuu cuacagcaac 3120

aucaugaacu ucuucaagac agaaaucaca cuggcaaacg gagaaaucag aaagagaccg 3180

cugaucgaaa caaacggaga aacaggagaa aucgucuggg acaagggaag agacuucgca 3240

acagucagaa agguccugag caugccgcag gucaacaucg ucaagaagac agaaguccag 3300

acaggaggau ucagcaagga aagcauccug ccgaagagaa acagcgacaa gcugaucgca 3360

agaaagaagg acugggaccc gaagaaguac ggaggauucg acagcccgac agucgcauac 3420

agcguccugg ucgucgcaaa ggucgaaaag ggaaagagca agaagcugaa gagcgucaag 3480

gaacugcugg gaaucacaau cauggaaaga agcagcuucg aaaagaaccc gaucgacuuc 3540

cuggaagcaa agggauacaa ggaagucaag aaggaccuga ucaucaagcu gccgaaguac 3600

agccuguucg aacuggaaaa cggaagaaag agaaugcugg caagcgcagg agaacugcag 3660

aagggaaacg aacuggcacu gccgagcaag uacgucaacu uccuguaccu ggcaagccac 3720

uacgaaaagc ugaagggaag cccggaagac aacgaacaga agcagcuguu cgucgaacag 3780

cacaagcacu accuggacga aaucaucgaa cagaucagcg aauucagcaa gagagucauc 3840

cuggcagacg caaaccugga caagguccug agcgcauaca acaagcacag agacaagccg 3900

aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960

gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020

guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080

cugagccagc ugggaggaga cggaagcgga agcccgaaga agaagagaaa ggucgacgga 4140

agcccgaaga agaagagaaa ggucgacagc gga 4173


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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"

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Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15


Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30


Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45


Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60


Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80


Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95


Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110


His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125


His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140


Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160


Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175


Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190


Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205


Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220


Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240


Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255


Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270


Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285


Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300


Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320


Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335


Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350


Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365


Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380


Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400


Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415


Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430


Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445


Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460


Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480


Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495


Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510


Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525


Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540


Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560


Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575


Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590


Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605


Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620


Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640


His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655


Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670


Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685


Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700


Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720


His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735


Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750


Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765


Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780


Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800


Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815


Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830


Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845


Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860


Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880


Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895


Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910


Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925


Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940


Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960


Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975


Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990


Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005


Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020


Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035


Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050


Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065


Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080


Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095


Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110


Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125


Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140


Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155


Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170


Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185


Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200


Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215


Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230


Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245


Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260


His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275


Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290


Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305


Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320


Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335


Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350


Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365


Gly Ser Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Gly Ser Pro
1370 1375 1380


Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Ser Gly
1385 1390


<210> 26
<211> 4179
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"

<400> 26
auggacaaga aguacagcau cggacuggca aucggaacaa acagcgucgg augggcaguc 60

aucacagacg aauacaaggu cccgagcaag aaguucaagg uccugggaaa cacagacaga 120

cacagcauca agaagaaccu gaucggagca cugcuguucg acagcggaga aacagcagaa 180

gcaacaagac ugaagagaac agcaagaaga agauacacaa gaagaaagaa cagaaucugc 240

uaccugcagg aaaucuucag caacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu cuuccacaga 300

cuggaagaaa gcuuccuggu cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gaucuucgga 360

aacaucgucg acgaagucgc auaccacgaa aaguacccga caaucuacca ccugagaaag 420

aagcuggucg acagcacaga caaggcagac cugagacuga ucuaccuggc acuggcacac 480

augaucaagu ucagaggaca cuuccugauc gaaggagacc ugaacccgga caacagcgac 540

gucgacaagc uguucaucca gcugguccag acauacaacc agcuguucga agaaaacccg 600

aucaacgcaa gcggagucga cgcaaaggca auccugagcg caagacugag caagagcaga 660

agacuggaaa accugaucgc acagcugccg ggagaaaaga agaacggacu guucggaaac 720

cugaucgcac ugagccuggg acugacaccg aacuucaaga gcaacuucga ccuggcagaa 780

gacgcaaagc ugcagcugag caaggacaca uacgacgacg accuggacaa ccugcuggca 840

cagaucggag accaguacgc agaccuguuc cuggcagcaa agaaccugag cgacgcaauc 900

cugcugagcg acauccugag agucaacaca gaaaucacaa aggcaccgcu gagcgcaagc 960

augaucaaga gauacgacga acaccaccag gaccugacac ugcugaaggc acuggucaga 1020

cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca 1080

ggauacaucg acggaggagc aagccaggaa gaauucuaca aguucaucaa gccgauccug 1140

gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga 1200

aagcagagaa cauucgacaa cggaagcauc ccgcaccaga uccaccuggg agaacugcac 1260

gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc 1320

gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc 1380

agauucgcau ggaugacaag aaagagcgaa gaaacaauca caccguggaa cuucgaagaa 1440

gucgucgaca agggagcaag cgcacagagc uucaucgaaa gaaugacaaa cuucgacaag 1500

aaccugccga acgaaaaggu ccugccgaag cacagccugc uguacgaaua cuucacaguc 1560

uacaacgaac ugacaaaggu caaguacguc acagaaggaa ugagaaagcc ggcauuccug 1620

agcggagaac agaagaaggc aaucgucgac cugcuguuca agacaaacag aaaggucaca 1680

gucaagcagc ugaaggaaga cuacuucaag aagaucgaau gcuucgacag cgucgaaauc 1740

agcggagucg aagacagauu caacgcaagc cugggaacau accacgaccu gcugaagauc 1800

aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgaa gaaaacgaag acauccugga agacaucguc 1860

cugacacuga cacuguucga agacagagaa augaucgaag aaagacugaa gacauacgca 1920

caccuguucg acgacaaggu caugaagcag cugaagagaa gaagauacac aggaugggga 1980

agacugagca gaaagcugau caacggaauc agagacaagc agagcggaaa gacaauccug 2040

gacuuccuga agagcgacgg auucgcaaac agaaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100

agccugacau ucaaggaaga cauccagaag gcacagguca gcggacaggg agacagccug 2160

cacgaacaca ucgcaaaccu ggcaggaagc ccggcaauca agaagggaau ccugcagaca 2220

gucaaggucg ucgacgaacu ggucaagguc augggaagac acaagccgga aaacaucguc 2280

aucgaaaugg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340

augaagagaa ucgaagaagg aaucaaggaa cugggaagcc agauccugaa ggaacacccg 2400

gucgaaaaca cacagcugca gaacgaaaag cuguaccugu acuaccugca gaacggaaga 2460

gacauguacg ucgaccagga acuggacauc aacagacuga gcgacuacga cgucgaccac 2520

aucgucccgc agagcuuccu gaaggacgac agcaucgaca acaagguccu gacaagaagc 2580

gacaagaaca gaggaaagag cgacaacguc ccgagcgaag aagucgucaa gaagaugaag 2640

aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700

acaaaggcag agagaggagg acugagcgaa cuggacaagg caggauucau caagagacag 2760

cuggucgaaa caagacagau cacaaagcac gucgcacaga uccuggacag cagaaugaac 2820

acaaaguacg acgaaaacga caagcugauc agagaaguca aggucaucac acugaagagc 2880

aagcugguca gcgacuucag aaaggacuuc caguucuaca aggucagaga aaucaacaac 2940

uaccaccacg cacacgacgc auaccugaac gcagucgucg gaacagcacu gaucaagaag 3000

uacccgaagc uggaaagcga auucgucuac ggagacuaca aggucuacga cgucagaaag 3060

augaucgcaa agagcgaaca ggaaaucgga aaggcaacag caaaguacuu cuucuacagc 3120

aacaucauga acuucuucaa gacagaaauc acacuggcaa acggagaaau cagaaagaga 3180

ccgcugaucg aaacaaacgg agaaacagga gaaaucgucu gggacaaggg aagagacuuc 3240

gcaacaguca gaaagguccu gagcaugccg caggucaaca ucgucaagaa gacagaaguc 3300

cagacaggag gauucagcaa ggaaagcauc cugccgaaga gaaacagcga caagcugauc 3360

gcaagaaaga aggacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgacagccc gacagucgca 3420

uacagcgucc uggucgucgc aaaggucgaa aagggaaaga gcaagaagcu gaagagcguc 3480

aaggaacugc ugggaaucac aaucauggaa agaagcagcu ucgaaaagaa cccgaucgac 3540

uuccuggaag caaagggaua caaggaaguc aagaaggacc ugaucaucaa gcugccgaag 3600

uacagccugu ucgaacugga aaacggaaga aagagaaugc uggcaagcgc aggagaacug 3660

cagaagggaa acgaacuggc acugccgagc aaguacguca acuuccugua ccuggcaagc 3720

cacuacgaaa agcugaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagcu guucgucgaa 3780

cagcacaagc acuaccugga cgaaaucauc gaacagauca gcgaauucag caagagaguc 3840

auccuggcag acgcaaaccu ggacaagguc cugagcgcau acaacaagca cagagacaag 3900

ccgaucagag aacaggcaga aaacaucauc caccuguuca cacugacaaa ccugggagca 3960

ccggcagcau ucaaguacuu cgacacaaca aucgacagaa agagauacac aagcacaaag 4020

gaaguccugg acgcaacacu gauccaccag agcaucacag gacuguacga aacaagaauc 4080

gaccugagcc agcugggagg agacggaagc ggaagcccga agaagaagag aaaggucgac 4140

ggaagcccga agaagaagag aaaggucgac agcggauag 4179


<210> 27
<211> 4173
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polynucleotide"

<400> 27
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acagacgaau acaagguccc gagcaagaag uucaaggucc ugggaaacac agacagacac 120

agcaucaaga agaaccugau cggagcacug cuguucgaca gcggagaaac agcagaagca 180

acaagacuga agagaacagc aagaagaaga uacacaagaa gaaagaacag aaucugcuac 240

cugcaggaaa ucuucagcaa cgaaauggca aaggucgacg acagcuucuu ccacagacug 300

gaagaaagcu uccuggucga agaagacaag aagcacgaaa gacacccgau cuucggaaac 360

aucgucgacg aagucgcaua ccacgaaaag uacccgacaa ucuaccaccu gagaaagaag 420

cuggucgaca gcacagacaa ggcagaccug agacugaucu accuggcacu ggcacacaug 480

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cuggaaaacc ugaucgcaca gcugccggga gaaaagaaga acggacuguu cggaaaccug 720

aucgcacuga gccugggacu gacaccgaac uucaagagca acuucgaccu ggcagaagac 780

gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840

aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900

cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960

aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020

cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080

uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140

aagauggacg gaacagaaga acugcugguc aagcugaaca gagaagaccu gcugagaaag 1200

cagagaacau ucgacaacgg aagcaucccg caccagaucc accugggaga acugcacgca 1260

auccugagaa gacaggaaga cuucuacccg uuccugaagg acaacagaga aaagaucgaa 1320

aagauccuga cauucagaau cccguacuac gucggaccgc uggcaagagg aaacagcaga 1380

uucgcaugga ugacaagaaa gagcgaagaa acaaucacac cguggaacuu cgaagaaguc 1440

gucgacaagg gagcaagcgc acagagcuuc aucgaaagaa ugacaaacuu cgacaagaac 1500

cugccgaacg aaaagguccu gccgaagcac agccugcugu acgaauacuu cacagucuac 1560

aacgaacuga caaaggucaa guacgucaca gaaggaauga gaaagccggc auuccugagc 1620

ggagaacaga agaaggcaau cgucgaccug cuguucaaga caaacagaaa ggucacaguc 1680

aagcagcuga aggaagacua cuucaagaag aucgaaugcu ucgacagcgu cgaaaucagc 1740

ggagucgaag acagauucaa cgcaagccug ggaacauacc acgaccugcu gaagaucauc 1800

aaggacaagg acuuccugga caacgaagaa aacgaagaca uccuggaaga caucguccug 1860

acacugacac uguucgaaga cagagaaaug aucgaagaaa gacugaagac auacgcacac 1920

cuguucgacg acaaggucau gaagcagcug aagagaagaa gauacacagg auggggaaga 1980

cugagcagaa agcugaucaa cggaaucaga gacaagcaga gcggaaagac aauccuggac 2040

uuccugaaga gcgacggauu cgcaaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100

cugacauuca aggaagacau ccagaaggca caggucagcg gacagggaga cagccugcac 2160

gaacacaucg caaaccuggc aggaagcccg gcaaucaaga agggaauccu gcagacaguc 2220

aaggucgucg acgaacuggu caaggucaug ggaagacaca agccggaaaa caucgucauc 2280

gaaauggcaa gagaaaacca gacaacacag aagggacaga agaacagcag agaaagaaug 2340

aagagaaucg aagaaggaau caaggaacug ggaagccaga uccugaagga acacccgguc 2400

gaaaacacac agcugcagaa cgaaaagcug uaccuguacu accugcagaa cggaagagac 2460

auguacgucg accaggaacu ggacaucaac agacugagcg acuacgacgu cgaccacauc 2520

gucccgcaga gcuuccugaa ggacgacagc aucgacaaca agguccugac aagaagcgac 2580

aagaacagag gaaagagcga caacgucccg agcgaagaag ucgucaagaa gaugaagaac 2640

uacuggagac agcugcugaa cgcaaagcug aucacacaga gaaaguucga caaccugaca 2700

aaggcagaga gaggaggacu gagcgaacug gacaaggcag gauucaucaa gagacagcug 2760

gucgaaacaa gacagaucac aaagcacguc gcacagaucc uggacagcag aaugaacaca 2820

aaguacgacg aaaacgacaa gcugaucaga gaagucaagg ucaucacacu gaagagcaag 2880

cuggucagcg acuucagaaa ggacuuccag uucuacaagg ucagagaaau caacaacuac 2940

caccacgcac acgacgcaua ccugaacgca gucgucggaa cagcacugau caagaaguac 3000

ccgaagcugg aaagcgaauu cgucuacgga gacuacaagg ucuacgacgu cagaaagaug 3060

aucgcaaaga gcgaacagga aaucggaaag gcaacagcaa aguacuucuu cuacagcaac 3120

aucaugaacu ucuucaagac agaaaucaca cuggcaaacg gagaaaucag aaagagaccg 3180

cugaucgaaa caaacggaga aacaggagaa aucgucuggg acaagggaag agacuucgca 3240

acagucagaa agguccugag caugccgcag gucaacaucg ucaagaagac agaaguccag 3300

acaggaggau ucagcaagga aagcauccug ccgaagagaa acagcgacaa gcugaucgca 3360

agaaagaagg acugggaccc gaagaaguac ggaggauucg acagcccgac agucgcauac 3420

agcguccugg ucgucgcaaa ggucgaaaag ggaaagagca agaagcugaa gagcgucaag 3480

gaacugcugg gaaucacaau cauggaaaga agcagcuucg aaaagaaccc gaucgacuuc 3540

cuggaagcaa agggauacaa ggaagucaag aaggaccuga ucaucaagcu gccgaaguac 3600

agccuguucg aacuggaaaa cggaagaaag agaaugcugg caagcgcagg agaacugcag 3660

aagggaaacg aacuggcacu gccgagcaag uacgucaacu uccuguaccu ggcaagccac 3720

uacgaaaagc ugaagggaag cccggaagac aacgaacaga agcagcuguu cgucgaacag 3780

cacaagcacu accuggacga aaucaucgaa cagaucagcg aauucagcaa gagagucauc 3840

cuggcagacg caaaccugga caagguccug agcgcauaca acaagcacag agacaagccg 3900

aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960

gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020

guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080

cugagccagc ugggaggaga cggaagcgga agcccgaaga agaagagaaa ggucgacgga 4140

agcccgaaga agaagagaaa ggucgacagc gga 4173


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Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15


Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30


Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45


Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60


Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80


Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95


Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110


His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125


His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140


Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160


Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175


Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190


Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205


Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220


Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240


Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255


Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270


Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285


Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300


Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320


Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335


Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350


Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365


Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380


Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400


Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415


Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430


Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445


Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460


Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480


Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495


Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510


Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525


Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540


Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560


Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575


Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590


Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605


Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620


Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640


His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655


Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670


Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685


Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700


Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720


His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735


Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750


Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765


Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780


Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800


Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815


Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830


Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845


Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860


Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880


Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895


Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910


Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925


Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940


Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960


Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975


Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990


Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005


Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020


Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035


Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050


Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065


Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080


Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095


Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110


Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125


Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140


Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155


Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170


Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185


Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200


Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215


Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230


Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245


Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260


His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275


Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290


Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305


Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320


Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335


Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350


Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365


Gly Ser Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Gly Ser Pro
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Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Ser Gly
1385 1390


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<211> 4179
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<213> Artificial Sequence

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auggacaaga aguacagcau cggacuggca aucggaacaa acagcgucgg augggcaguc 60

aucacagacg aauacaaggu cccgagcaag aaguucaagg uccugggaaa cacagacaga 120

cacagcauca agaagaaccu gaucggagca cugcuguucg acagcggaga aacagcagaa 180

gcaacaagac ugaagagaac agcaagaaga agauacacaa gaagaaagaa cagaaucugc 240

uaccugcagg aaaucuucag caacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu cuuccacaga 300

cuggaagaaa gcuuccuggu cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gaucuucgga 360

aacaucgucg acgaagucgc auaccacgaa aaguacccga caaucuacca ccugagaaag 420

aagcuggucg acagcacaga caaggcagac cugagacuga ucuaccuggc acuggcacac 480

augaucaagu ucagaggaca cuuccugauc gaaggagacc ugaacccgga caacagcgac 540

gucgacaagc uguucaucca gcugguccag acauacaacc agcuguucga agaaaacccg 600

aucaacgcaa gcggagucga cgcaaaggca auccugagcg caagacugag caagagcaga 660

agacuggaaa accugaucgc acagcugccg ggagaaaaga agaacggacu guucggaaac 720

cugaucgcac ugagccuggg acugacaccg aacuucaaga gcaacuucga ccuggcagaa 780

gacgcaaagc ugcagcugag caaggacaca uacgacgacg accuggacaa ccugcuggca 840

cagaucggag accaguacgc agaccuguuc cuggcagcaa agaaccugag cgacgcaauc 900

cugcugagcg acauccugag agucaacaca gaaaucacaa aggcaccgcu gagcgcaagc 960

augaucaaga gauacgacga acaccaccag gaccugacac ugcugaaggc acuggucaga 1020

cagcagcugc cggaaaagua caaggaaauc uucuucgacc agagcaagaa cggauacgca 1080

ggauacaucg acggaggagc aagccaggaa gaauucuaca aguucaucaa gccgauccug 1140

gaaaagaugg acggaacaga agaacugcug gucaagcuga acagagaaga ccugcugaga 1200

aagcagagaa cauucgacaa cggaagcauc ccgcaccaga uccaccuggg agaacugcac 1260

gcaauccuga gaagacagga agacuucuac ccguuccuga aggacaacag agaaaagauc 1320

gaaaagaucc ugacauucag aaucccguac uacgucggac cgcuggcaag aggaaacagc 1380

agauucgcau ggaugacaag aaagagcgaa gaaacaauca caccguggaa cuucgaagaa 1440

gucgucgaca agggagcaag cgcacagagc uucaucgaaa gaaugacaaa cuucgacaag 1500

aaccugccga acgaaaaggu ccugccgaag cacagccugc uguacgaaua cuucacaguc 1560

uacaacgaac ugacaaaggu caaguacguc acagaaggaa ugagaaagcc ggcauuccug 1620

agcggagaac agaagaaggc aaucgucgac cugcuguuca agacaaacag aaaggucaca 1680

gucaagcagc ugaaggaaga cuacuucaag aagaucgaau gcuucgacag cgucgaaauc 1740

agcggagucg aagacagauu caacgcaagc cugggaacau accacgaccu gcugaagauc 1800

aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgaa gaaaacgaag acauccugga agacaucguc 1860

cugacacuga cacuguucga agacagagaa augaucgaag aaagacugaa gacauacgca 1920

caccuguucg acgacaaggu caugaagcag cugaagagaa gaagauacac aggaugggga 1980

agacugagca gaaagcugau caacggaauc agagacaagc agagcggaaa gacaauccug 2040

gacuuccuga agagcgacgg auucgcaaac agaaacuuca ugcagcugau ccacgacgac 2100

agccugacau ucaaggaaga cauccagaag gcacagguca gcggacaggg agacagccug 2160

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gucaaggucg ucgacgaacu ggucaagguc augggaagac acaagccgga aaacaucguc 2280

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augaagagaa ucgaagaagg aaucaaggaa cugggaagcc agauccugaa ggaacacccg 2400

gucgaaaaca cacagcugca gaacgaaaag cuguaccugu acuaccugca gaacggaaga 2460

gacauguacg ucgaccagga acuggacauc aacagacuga gcgacuacga cgucgacgca 2520

aucgucccgc agagcuuccu gaaggacgac agcaucgaca acaagguccu gacaagaagc 2580

gacaagaaca gaggaaagag cgacaacguc ccgagcgaag aagucgucaa gaagaugaag 2640

aacuacugga gacagcugcu gaacgcaaag cugaucacac agagaaaguu cgacaaccug 2700

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cuggucgaaa caagacagau cacaaagcac gucgcacaga uccuggacag cagaaugaac 2820

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aacaucauga acuucuucaa gacagaaauc acacuggcaa acggagaaau cagaaagaga 3180

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cagacaggag gauucagcaa ggaaagcauc cugccgaaga gaaacagcga caagcugauc 3360

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aaggaacugc ugggaaucac aaucauggaa agaagcagcu ucgaaaagaa cccgaucgac 3540

uuccuggaag caaagggaua caaggaaguc aagaaggacc ugaucaucaa gcugccgaag 3600

uacagccugu ucgaacugga aaacggaaga aagagaaugc uggcaagcgc aggagaacug 3660

cagaagggaa acgaacuggc acugccgagc aaguacguca acuuccugua ccuggcaagc 3720

cacuacgaaa agcugaaggg aagcccggaa gacaacgaac agaagcagcu guucgucgaa 3780

cagcacaagc acuaccugga cgaaaucauc gaacagauca gcgaauucag caagagaguc 3840

auccuggcag acgcaaaccu ggacaagguc cugagcgcau acaacaagca cagagacaag 3900

ccgaucagag aacaggcaga aaacaucauc caccuguuca cacugacaaa ccugggagca 3960

ccggcagcau ucaaguacuu cgacacaaca aucgacagaa agagauacac aagcacaaag 4020

gaaguccugg acgcaacacu gauccaccag agcaucacag gacuguacga aacaagaauc 4080

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ggaagcccga agaagaagag aaaggucgac agcggauag 4179


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<211> 4173
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polynucleotide"

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gacaagaagu acagcaucgg acuggcaauc ggaacaaaca gcgucggaug ggcagucauc 60

acagacgaau acaagguccc gagcaagaag uucaaggucc ugggaaacac agacagacac 120

agcaucaaga agaaccugau cggagcacug cuguucgaca gcggagaaac agcagaagca 180

acaagacuga agagaacagc aagaagaaga uacacaagaa gaaagaacag aaucugcuac 240

cugcaggaaa ucuucagcaa cgaaauggca aaggucgacg acagcuucuu ccacagacug 300

gaagaaagcu uccuggucga agaagacaag aagcacgaaa gacacccgau cuucggaaac 360

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gcaaagcugc agcugagcaa ggacacauac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcacag 840

aucggagacc aguacgcaga ccuguuccug gcagcaaaga accugagcga cgcaauccug 900

cugagcgaca uccugagagu caacacagaa aucacaaagg caccgcugag cgcaagcaug 960

aucaagagau acgacgaaca ccaccaggac cugacacugc ugaaggcacu ggucagacag 1020

cagcugccgg aaaaguacaa ggaaaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg auacgcagga 1080

uacaucgacg gaggagcaag ccaggaagaa uucuacaagu ucaucaagcc gauccuggaa 1140

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uucgcaugga ugacaagaaa gagcgaagaa acaaucacac cguggaacuu cgaagaaguc 1440

gucgacaagg gagcaagcgc acagagcuuc aucgaaagaa ugacaaacuu cgacaagaac 1500

cugccgaacg aaaagguccu gccgaagcac agccugcugu acgaauacuu cacagucuac 1560

aacgaacuga caaaggucaa guacgucaca gaaggaauga gaaagccggc auuccugagc 1620

ggagaacaga agaaggcaau cgucgaccug cuguucaaga caaacagaaa ggucacaguc 1680

aagcagcuga aggaagacua cuucaagaag aucgaaugcu ucgacagcgu cgaaaucagc 1740

ggagucgaag acagauucaa cgcaagccug ggaacauacc acgaccugcu gaagaucauc 1800

aaggacaagg acuuccugga caacgaagaa aacgaagaca uccuggaaga caucguccug 1860

acacugacac uguucgaaga cagagaaaug aucgaagaaa gacugaagac auacgcacac 1920

cuguucgacg acaaggucau gaagcagcug aagagaagaa gauacacagg auggggaaga 1980

cugagcagaa agcugaucaa cggaaucaga gacaagcaga gcggaaagac aauccuggac 2040

uuccugaaga gcgacggauu cgcaaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100

cugacauuca aggaagacau ccagaaggca caggucagcg gacagggaga cagccugcac 2160

gaacacaucg caaaccuggc aggaagcccg gcaaucaaga agggaauccu gcagacaguc 2220

aaggucgucg acgaacuggu caaggucaug ggaagacaca agccggaaaa caucgucauc 2280

gaaauggcaa gagaaaacca gacaacacag aagggacaga agaacagcag agaaagaaug 2340

aagagaaucg aagaaggaau caaggaacug ggaagccaga uccugaagga acacccgguc 2400

gaaaacacac agcugcagaa cgaaaagcug uaccuguacu accugcagaa cggaagagac 2460

auguacgucg accaggaacu ggacaucaac agacugagcg acuacgacgu cgacgcaauc 2520

gucccgcaga gcuuccugaa ggacgacagc aucgacaaca agguccugac aagaagcgac 2580

aagaacagag gaaagagcga caacgucccg agcgaagaag ucgucaagaa gaugaagaac 2640

uacuggagac agcugcugaa cgcaaagcug aucacacaga gaaaguucga caaccugaca 2700

aaggcagaga gaggaggacu gagcgaacug gacaaggcag gauucaucaa gagacagcug 2760

gucgaaacaa gacagaucac aaagcacguc gcacagaucc uggacagcag aaugaacaca 2820

aaguacgacg aaaacgacaa gcugaucaga gaagucaagg ucaucacacu gaagagcaag 2880

cuggucagcg acuucagaaa ggacuuccag uucuacaagg ucagagaaau caacaacuac 2940

caccacgcac acgacgcaua ccugaacgca gucgucggaa cagcacugau caagaaguac 3000

ccgaagcugg aaagcgaauu cgucuacgga gacuacaagg ucuacgacgu cagaaagaug 3060

aucgcaaaga gcgaacagga aaucggaaag gcaacagcaa aguacuucuu cuacagcaac 3120

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cugaucgaaa caaacggaga aacaggagaa aucgucuggg acaagggaag agacuucgca 3240

acagucagaa agguccugag caugccgcag gucaacaucg ucaagaagac agaaguccag 3300

acaggaggau ucagcaagga aagcauccug ccgaagagaa acagcgacaa gcugaucgca 3360

agaaagaagg acugggaccc gaagaaguac ggaggauucg acagcccgac agucgcauac 3420

agcguccugg ucgucgcaaa ggucgaaaag ggaaagagca agaagcugaa gagcgucaag 3480

gaacugcugg gaaucacaau cauggaaaga agcagcuucg aaaagaaccc gaucgacuuc 3540

cuggaagcaa agggauacaa ggaagucaag aaggaccuga ucaucaagcu gccgaaguac 3600

agccuguucg aacuggaaaa cggaagaaag agaaugcugg caagcgcagg agaacugcag 3660

aagggaaacg aacuggcacu gccgagcaag uacgucaacu uccuguaccu ggcaagccac 3720

uacgaaaagc ugaagggaag cccggaagac aacgaacaga agcagcuguu cgucgaacag 3780

cacaagcacu accuggacga aaucaucgaa cagaucagcg aauucagcaa gagagucauc 3840

cuggcagacg caaaccugga caagguccug agcgcauaca acaagcacag agacaagccg 3900

aucagagaac aggcagaaaa caucauccac cuguucacac ugacaaaccu gggagcaccg 3960

gcagcauuca aguacuucga cacaacaauc gacagaaaga gauacacaag cacaaaggaa 4020

guccuggacg caacacugau ccaccagagc aucacaggac uguacgaaac aagaaucgac 4080

cugagccagc ugggaggaga cggaagcgga agcccgaaga agaagagaaa ggucgacgga 4140

agcccgaaga agaagagaaa ggucgacagc gga 4173


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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"

<400> 31
taatacgact cactata 17


<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 32
acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc 50


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<211> 132
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 33
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60

taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120

tattttcatt gc 132


<210> 34
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<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 34
cataaaccct ggcgcgctcg cggcccggca ctcttctggt ccccacagac tcagagagaa 60

cccacc 66


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<211> 110
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 35
gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc 60

ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg agtgggcggc 110


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<212> DNA
<213> Xenopus laevis

<400> 36
aagctcagaa taaacgctca actttggcc 29


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<211> 130
<212> DNA
<213> Xenopus laevis

<400> 37
accagcctca agaacacccg aatggagtct ctaagctaca taataccaac ttacacttta 60

caaaatgttg tcccccaaaa tgtagccatt cgtatctgct cctaataaaa agaaagtttc 120

ttcacattct 130


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<212> DNA
<213> Bos sp.

<400> 38
cagggtcctg tggacagctc accagct 27


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<212> DNA
<213> Bos sp.

<400> 39
ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 60

tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg ca 102


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<212> DNA
<213> Mus musculus

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gctgccttct gcggggcttg ccttctggcc atgcccttct tctctccctt gcacctgtac 60

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<212> DNA
<213> Unknown

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HSD17B4 5' UTR sequence"

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tcccgcagtc ggcgtccagc ggctctgctt gttcgtgtgt gtgtcgttgc aggccttatt 60

c 61


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<212> RNA
<213> Artificial Sequence

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<222> (1)..(4)
<223> Phosphorothioate linkage

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<222> (29)..(40)
<223> 2'-O-methyl modified

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<221> modified_base
<222> (69)..(100)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(100)
<223> Phosphorothioate linkage

<400> 42
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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<211> 4411
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"

<400> 43
gggtcccgca gtcggcgtcc agcggctctg cttgttcgtg tgtgtgtcgt tgcaggcctt 60

attcggatcc gccaccatgg acaagaagta cagcatcgga ctggacatcg gaacaaacag 120

cgtcggatgg gcagtcatca cagacgaata caaggtcccg agcaagaagt tcaaggtcct 180

gggaaacaca gacagacaca gcatcaagaa gaacctgatc ggagcactgc tgttcgacag 240

cggagaaaca gcagaagcaa caagactgaa gagaacagca agaagaagat acacaagaag 300

aaagaacaga atctgctacc tgcaggaaat cttcagcaac gaaatggcaa aggtcgacga 360

cagcttcttc cacagactgg aagaaagctt cctggtcgaa gaagacaaga agcacgaaag 420

acacccgatc ttcggaaaca tcgtcgacga agtcgcatac cacgaaaagt acccgacaat 480

ctaccacctg agaaagaagc tggtcgacag cacagacaag gcagacctga gactgatcta 540

cctggcactg gcacacatga tcaagttcag aggacacttc ctgatcgaag gagacctgaa 600

cccggacaac agcgacgtcg acaagctgtt catccagctg gtccagacat acaaccagct 660

gttcgaagaa aacccgatca acgcaagcgg agtcgacgca aaggcaatcc tgagcgcaag 720

actgagcaag agcagaagac tggaaaacct gatcgcacag ctgccgggag aaaagaagaa 780

cggactgttc ggaaacctga tcgcactgag cctgggactg acaccgaact tcaagagcaa 840

cttcgacctg gcagaagacg caaagctgca gctgagcaag gacacatacg acgacgacct 900

ggacaacctg ctggcacaga tcggagacca gtacgcagac ctgttcctgg cagcaaagaa 960

cctgagcgac gcaatcctgc tgagcgacat cctgagagtc aacacagaaa tcacaaaggc 1020

accgctgagc gcaagcatga tcaagagata cgacgaacac caccaggacc tgacactgct 1080

gaaggcactg gtcagacagc agctgccgga aaagtacaag gaaatcttct tcgaccagag 1140

caagaacgga tacgcaggat acatcgacgg aggagcaagc caggaagaat tctacaagtt 1200

catcaagccg atcctggaaa agatggacgg aacagaagaa ctgctggtca agctgaacag 1260

agaagacctg ctgagaaagc agagaacatt cgacaacgga agcatcccgc accagatcca 1320

cctgggagaa ctgcacgcaa tcctgagaag acaggaagac ttctacccgt tcctgaagga 1380

caacagagaa aagatcgaaa agatcctgac attcagaatc ccgtactacg tcggaccgct 1440

ggcaagagga aacagcagat tcgcatggat gacaagaaag agcgaagaaa caatcacacc 1500

gtggaacttc gaagaagtcg tcgacaaggg agcaagcgca cagagcttca tcgaaagaat 1560

gacaaacttc gacaagaacc tgccgaacga aaaggtcctg ccgaagcaca gcctgctgta 1620

cgaatacttc acagtctaca acgaactgac aaaggtcaag tacgtcacag aaggaatgag 1680

aaagccggca ttcctgagcg gagaacagaa gaaggcaatc gtcgacctgc tgttcaagac 1740

aaacagaaag gtcacagtca agcagctgaa ggaagactac ttcaagaaga tcgaatgctt 1800

cgacagcgtc gaaatcagcg gagtcgaaga cagattcaac gcaagcctgg gaacatacca 1860

cgacctgctg aagatcatca aggacaagga cttcctggac aacgaagaaa acgaagacat 1920

cctggaagac atcgtcctga cactgacact gttcgaagac agagaaatga tcgaagaaag 1980

actgaagaca tacgcacacc tgttcgacga caaggtcatg aagcagctga agagaagaag 2040

atacacagga tggggaagac tgagcagaaa gctgatcaac ggaatcagag acaagcagag 2100

cggaaagaca atcctggact tcctgaagag cgacggattc gcaaacagaa acttcatgca 2160

gctgatccac gacgacagcc tgacattcaa ggaagacatc cagaaggcac aggtcagcgg 2220

acagggagac agcctgcacg aacacatcgc aaacctggca ggaagcccgg caatcaagaa 2280

gggaatcctg cagacagtca aggtcgtcga cgaactggtc aaggtcatgg gaagacacaa 2340

gccggaaaac atcgtcatcg aaatggcaag agaaaaccag acaacacaga agggacagaa 2400

gaacagcaga gaaagaatga agagaatcga agaaggaatc aaggaactgg gaagccagat 2460

cctgaaggaa cacccggtcg aaaacacaca gctgcagaac gaaaagctgt acctgtacta 2520

cctgcagaac ggaagagaca tgtacgtcga ccaggaactg gacatcaaca gactgagcga 2580

ctacgacgtc gaccacatcg tcccgcagag cttcctgaag gacgacagca tcgacaacaa 2640

ggtcctgaca agaagcgaca agaacagagg aaagagcgac aacgtcccga gcgaagaagt 2700

cgtcaagaag atgaagaact actggagaca gctgctgaac gcaaagctga tcacacagag 2760

aaagttcgac aacctgacaa aggcagagag aggaggactg agcgaactgg acaaggcagg 2820

attcatcaag agacagctgg tcgaaacaag acagatcaca aagcacgtcg cacagatcct 2880

ggacagcaga atgaacacaa agtacgacga aaacgacaag ctgatcagag aagtcaaggt 2940

catcacactg aagagcaagc tggtcagcga cttcagaaag gacttccagt tctacaaggt 3000

cagagaaatc aacaactacc accacgcaca cgacgcatac ctgaacgcag tcgtcggaac 3060

agcactgatc aagaagtacc cgaagctgga aagcgaattc gtctacggag actacaaggt 3120

ctacgacgtc agaaagatga tcgcaaagag cgaacaggaa atcggaaagg caacagcaaa 3180

gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt cttcaagaca gaaatcacac tggcaaacgg 3240

agaaatcaga aagagaccgc tgatcgaaac aaacggagaa acaggagaaa tcgtctggga 3300

caagggaaga gacttcgcaa cagtcagaaa ggtcctgagc atgccgcagg tcaacatcgt 3360

caagaagaca gaagtccaga caggaggatt cagcaaggaa agcatcctgc cgaagagaaa 3420

cagcgacaag ctgatcgcaa gaaagaagga ctgggacccg aagaagtacg gaggattcga 3480

cagcccgaca gtcgcataca gcgtcctggt cgtcgcaaag gtcgaaaagg gaaagagcaa 3540

gaagctgaag agcgtcaagg aactgctggg aatcacaatc atggaaagaa gcagcttcga 3600

aaagaacccg atcgacttcc tggaagcaaa gggatacaag gaagtcaaga aggacctgat 3660

catcaagctg ccgaagtaca gcctgttcga actggaaaac ggaagaaaga gaatgctggc 3720

aagcgcagga gaactgcaga agggaaacga actggcactg ccgagcaagt acgtcaactt 3780

cctgtacctg gcaagccact acgaaaagct gaagggaagc ccggaagaca acgaacagaa 3840

gcagctgttc gtcgaacagc acaagcacta cctggacgaa atcatcgaac agatcagcga 3900

attcagcaag agagtcatcc tggcagacgc aaacctggac aaggtcctga gcgcatacaa 3960

caagcacaga gacaagccga tcagagaaca ggcagaaaac atcatccacc tgttcacact 4020

gacaaacctg ggagcaccgg cagcattcaa gtacttcgac acaacaatcg acagaaagag 4080

atacacaagc acaaaggaag tcctggacgc aacactgatc caccagagca tcacaggact 4140

gtacgaaaca agaatcgacc tgagccagct gggaggagac ggaggaggaa gcccgaagaa 4200

gaagagaaag gtctagctag ccatcacatt taaaagcatc tcagcctacc atgagaataa 4260

gagaaagaaa atgaagatca atagcttatt catctctttt tctttttcgt tggtgtaaag 4320

ccaacaccct gtctaaaaaa cataaatttc tttaatcatt ttgcctcttt tctctgtgct 4380

tcaattaata aaaaatggaa agaacctcga g 4411


<210> 44
<211> 4405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"

<400> 44
gggtcccgca gtcggcgtcc agcggctctg cttgttcgtg tgtgtgtcgt tgcaggcctt 60

attcggatcc atggacaaga agtacagcat cggactggac atcggaacaa acagcgtcgg 120

atgggcagtc atcacagacg aatacaaggt cccgagcaag aagttcaagg tcctgggaaa 180

cacagacaga cacagcatca agaagaacct gatcggagca ctgctgttcg acagcggaga 240

aacagcagaa gcaacaagac tgaagagaac agcaagaaga agatacacaa gaagaaagaa 300

cagaatctgc tacctgcagg aaatcttcag caacgaaatg gcaaaggtcg acgacagctt 360

cttccacaga ctggaagaaa gcttcctggt cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc 420

gatcttcgga aacatcgtcg acgaagtcgc ataccacgaa aagtacccga caatctacca 480

cctgagaaag aagctggtcg acagcacaga caaggcagac ctgagactga tctacctggc 540

actggcacac atgatcaagt tcagaggaca cttcctgatc gaaggagacc tgaacccgga 600

caacagcgac gtcgacaagc tgttcatcca gctggtccag acatacaacc agctgttcga 660

agaaaacccg atcaacgcaa gcggagtcga cgcaaaggca atcctgagcg caagactgag 720

caagagcaga agactggaaa acctgatcgc acagctgccg ggagaaaaga agaacggact 780

gttcggaaac ctgatcgcac tgagcctggg actgacaccg aacttcaaga gcaacttcga 840

cctggcagaa gacgcaaagc tgcagctgag caaggacaca tacgacgacg acctggacaa 900

cctgctggca cagatcggag accagtacgc agacctgttc ctggcagcaa agaacctgag 960

cgacgcaatc ctgctgagcg acatcctgag agtcaacaca gaaatcacaa aggcaccgct 1020

gagcgcaagc atgatcaaga gatacgacga acaccaccag gacctgacac tgctgaaggc 1080

actggtcaga cagcagctgc cggaaaagta caaggaaatc ttcttcgacc agagcaagaa 1140

cggatacgca ggatacatcg acggaggagc aagccaggaa gaattctaca agttcatcaa 1200

gccgatcctg gaaaagatgg acggaacaga agaactgctg gtcaagctga acagagaaga 1260

cctgctgaga aagcagagaa cattcgacaa cggaagcatc ccgcaccaga tccacctggg 1320

agaactgcac gcaatcctga gaagacagga agacttctac ccgttcctga aggacaacag 1380

agaaaagatc gaaaagatcc tgacattcag aatcccgtac tacgtcggac cgctggcaag 1440

aggaaacagc agattcgcat ggatgacaag aaagagcgaa gaaacaatca caccgtggaa 1500

cttcgaagaa gtcgtcgaca agggagcaag cgcacagagc ttcatcgaaa gaatgacaaa 1560

cttcgacaag aacctgccga acgaaaaggt cctgccgaag cacagcctgc tgtacgaata 1620

cttcacagtc tacaacgaac tgacaaaggt caagtacgtc acagaaggaa tgagaaagcc 1680

ggcattcctg agcggagaac agaagaaggc aatcgtcgac ctgctgttca agacaaacag 1740

aaaggtcaca gtcaagcagc tgaaggaaga ctacttcaag aagatcgaat gcttcgacag 1800

cgtcgaaatc agcggagtcg aagacagatt caacgcaagc ctgggaacat accacgacct 1860

gctgaagatc atcaaggaca aggacttcct ggacaacgaa gaaaacgaag acatcctgga 1920

agacatcgtc ctgacactga cactgttcga agacagagaa atgatcgaag aaagactgaa 1980

gacatacgca cacctgttcg acgacaaggt catgaagcag ctgaagagaa gaagatacac 2040

aggatgggga agactgagca gaaagctgat caacggaatc agagacaagc agagcggaaa 2100

gacaatcctg gacttcctga agagcgacgg attcgcaaac agaaacttca tgcagctgat 2160

ccacgacgac agcctgacat tcaaggaaga catccagaag gcacaggtca gcggacaggg 2220

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cctgcagaca gtcaaggtcg tcgacgaact ggtcaaggtc atgggaagac acaagccgga 2340

aaacatcgtc atcgaaatgg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag 2400

cagagaaaga atgaagagaa tcgaagaagg aatcaaggaa ctgggaagcc agatcctgaa 2460

ggaacacccg gtcgaaaaca cacagctgca gaacgaaaag ctgtacctgt actacctgca 2520

gaacggaaga gacatgtacg tcgaccagga actggacatc aacagactga gcgactacga 2580

cgtcgaccac atcgtcccgc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtcct 2640

gacaagaagc gacaagaaca gaggaaagag cgacaacgtc ccgagcgaag aagtcgtcaa 2700

gaagatgaag aactactgga gacagctgct gaacgcaaag ctgatcacac agagaaagtt 2760

cgacaacctg acaaaggcag agagaggagg actgagcgaa ctggacaagg caggattcat 2820

caagagacag ctggtcgaaa caagacagat cacaaagcac gtcgcacaga tcctggacag 2880

cagaatgaac acaaagtacg acgaaaacga caagctgatc agagaagtca aggtcatcac 2940

actgaagagc aagctggtca gcgacttcag aaaggacttc cagttctaca aggtcagaga 3000

aatcaacaac taccaccacg cacacgacgc atacctgaac gcagtcgtcg gaacagcact 3060

gatcaagaag tacccgaagc tggaaagcga attcgtctac ggagactaca aggtctacga 3120

cgtcagaaag atgatcgcaa agagcgaaca ggaaatcgga aaggcaacag caaagtactt 3180

cttctacagc aacatcatga acttcttcaa gacagaaatc acactggcaa acggagaaat 3240

cagaaagaga ccgctgatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtct gggacaaggg 3300

aagagacttc gcaacagtca gaaaggtcct gagcatgccg caggtcaaca tcgtcaagaa 3360

gacagaagtc cagacaggag gattcagcaa ggaaagcatc ctgccgaaga gaaacagcga 3420

caagctgatc gcaagaaaga aggactggga cccgaagaag tacggaggat tcgacagccc 3480

gacagtcgca tacagcgtcc tggtcgtcgc aaaggtcgaa aagggaaaga gcaagaagct 3540

gaagagcgtc aaggaactgc tgggaatcac aatcatggaa agaagcagct tcgaaaagaa 3600

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cagagacaag ccgatcagag aacaggcaga aaacatcatc cacctgttca cactgacaaa 4020

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agtcttcgaa agagcagaag tcccgaagac aggagactcg ctggcaatgg caagaagact 240

ggcaagatcg gtcagaagac tgacaagaag aagagcacac agactgctga gaacaagaag 300

actgctgaag agagaaggag tcctgcaggc agcaaacttc gacgaaaacg gactgatcaa 360

gtcgctgccg aacacaccgt ggcagctgag agcagcagca ctggacagaa agctgacacc 420

gctggaatgg tcggcagtcc tgctgcacct gatcaagcac agaggatacc tgtcgcagag 480

aaagaacgaa ggagaaacag cagacaagga actgggagca ctgctgaagg gagtcgcagg 540

aaacgcacac gcactgcaga caggagactt cagaacaccg gcagaactgg cactgaacaa 600

gttcgaaaag gaatcgggac acatcagaaa ccagagatcg gactactcgc acacattctc 660

gagaaaggac ctgcaggcag aactgatcct gctgttcgaa aagcagaagg aattcggaaa 720

cccgcacgtc tcgggaggac tgaaggaagg aatcgaaaca ctgctgatga cacagagacc 780

ggcactgtcg ggagacgcag tccagaagat gctgggacac tgcacattcg aaccggcaga 840

accgaaggca gcaaagaaca catacacagc agaaagattc atctggctga caaagctgaa 900

caacctgaga atcctggaac agggatcgga aagaccgctg acagacacag aaagagcaac 960

actgatggac gaaccgtaca gaaagtcgaa gctgacatac gcacaggcaa gaaagctgct 1020

gggactggaa gacacagcat tcttcaaggg actgagatac ggaaaggaca acgcagaagc 1080

atcgacactg atggaaatga aggcatacca cgcaatctcg agagcactgg aaaaggaagg 1140

actgaaggac aagaagtcgc cgctgaacct gtcgccggaa ctgcaggacg aaatcggaac 1200

agcattctcg ctgttcaaga cagacgaaga catcacagga agactgaagg acagaatcca 1260

gccggaaatc ctggaagcac tgctgaagca catctcgttc gacaagttcg tccagatctc 1320

gctgaaggca ctgagaagaa tcgtcccgct gatggaacag ggaaagagat acgacgaagc 1380

atgcgcagaa atctacggag accactacgg aaagaagaac acagaagaaa agatctacct 1440

gccgccgatc ccggcagacg aaatcagaaa cccggtcgtc ctgagagcac tgtcgcaggc 1500

aagaaaggtc atcaacggag tcgtcagaag atacggatcg ccggcaagaa tccacatcga 1560

aacagcaaga gaagtcggaa agtcgttcaa ggacagaaag gaaatcgaaa agagacagga 1620

agaaaacaga aaggacagag aaaaggcagc agcaaagttc agagaatact tcccgaactt 1680

cgtcggagaa ccgaagtcga aggacatcct gaagctgaga ctgtacgaac agcagcacgg 1740

aaagtgcctg tactcgggaa aggaaatcaa cctgggaaga ctgaacgaaa agggatacgt 1800

cgaaatcgac cacgcactgc cgttctcgag aacatgggac gactcgttca acaacaaggt 1860

cctggtcctg ggatcggaaa accagaacaa gggaaaccag acaccgtacg aatacttcaa 1920

cggaaaggac aactcgagag aatggcagga attcaaggca agagtcgaaa catcgagatt 1980

cccgagatcg aagaagcaga gaatcctgct gcagaagttc gacgaagacg gattcaagga 2040

aagaaacctg aacgacacaa gatacgtcaa cagattcctg tgccagttcg tcgcagacag 2100

aatgagactg acaggaaagg gaaagaagag agtcttcgca tcgaacggac agatcacaaa 2160

cctgctgaga ggattctggg gactgagaaa ggtcagagca gaaaacgaca gacaccacgc 2220

actggacgca gtcgtcgtcg catgctcgac agtcgcaatg cagcagaaga tcacaagatt 2280

cgtcagatac aaggaaatga acgcattcga cggaaagaca atcgacaagg aaacaggaga 2340

agtcctgcac cagaagacac acttcccgca gccgtgggaa ttcttcgcac aggaagtcat 2400

gatcagagtc ttcggaaagc cggacggaaa gccggaattc gaagaagcag acacactgga 2460

aaagctgaga acactgctgg cagaaaagct gtcgtcgaga ccggaagcag tccacgaata 2520

cgtcacaccg ctgttcgtct cgagagcacc gaacagaaag atgtcgggac agggacacat 2580

ggaaacagtc aagtcggcaa agagactgga cgaaggagtc tcggtcctga gagtcccgct 2640

gacacagctg aagctgaagg acctggaaaa gatggtcaac agagaaagag aaccgaagct 2700

gtacgaagca ctgaaggcaa gactggaagc acacaaggac gacccggcaa aggcattcgc 2760

agaaccgttc tacaagtacg acaaggcagg aaacagaaca cagcaggtca aggcagtcag 2820

agtcgaacag gtccagaaga caggagtctg ggtcagaaac cacaacggaa tcgcagacaa 2880

cgcaacaatg gtcagagtag acgtcttcga aaagggagac aagtactacc tggtcccgat 2940

ctactcgtgg caggtcgcaa agggaatcct gccggacaga gcagtcgtcc agggaaagga 3000

cgaagaagac tggcagctga tcgacgactc gttcaacttc aagttctcgc tgcacccgaa 3060

cgacctggtc gaagtcatca caaagaaggc aagaatgttc ggatacttcg catcgtgcca 3120

cagaggaaca ggaaacatca acatcagaat ccacgacctg gaccacaaga tcggaaagaa 3180

cggaatcctg gaaggaatcg gagtcaagac agcactgtcg ttccagaagt accagatcga 3240

cgaactggga aaggaaatca gaccgtgcag actgaagaag agaccgccgg tcagatccgg 3300

aaagagaaca gcagacggat cggaattcga atcgccgaag aagaagagaa aggtcgaatg 3360

atagctagct cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt 3420

ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg 3480

ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt 3540

gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 3600

atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatgg 3636


<210> 68
<211> 1103
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis

<400> 68
Met Ala Ala Phe Lys Pro Asn Ser Ile Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp
1 5 10 15


Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Met Val Glu Ile Asp Glu Glu
20 25 30


Glu Asn Pro Ile Arg Leu Ile Asp Leu Gly Val Arg Val Phe Glu Arg
35 40 45


Ala Glu Val Pro Lys Thr Gly Asp Ser Leu Ala Met Ala Arg Arg Leu
50 55 60


Ala Arg Ser Val Arg Arg Leu Thr Arg Arg Arg Ala His Arg Leu Leu
65 70 75 80


Arg Thr Arg Arg Leu Leu Lys Arg Glu Gly Val Leu Gln Ala Ala Asn
85 90 95


Phe Asp Glu Asn Gly Leu Ile Lys Ser Leu Pro Asn Thr Pro Trp Gln
100 105 110


Leu Arg Ala Ala Ala Leu Asp Arg Lys Leu Thr Pro Leu Glu Trp Ser
115 120 125


Ala Val Leu Leu His Leu Ile Lys His Arg Gly Tyr Leu Ser Gln Arg
130 135 140


Lys Asn Glu Gly Glu Thr Ala Asp Lys Glu Leu Gly Ala Leu Leu Lys
145 150 155 160


Gly Val Ala Gly Asn Ala His Ala Leu Gln Thr Gly Asp Phe Arg Thr
165 170 175


Pro Ala Glu Leu Ala Leu Asn Lys Phe Glu Lys Glu Ser Gly His Ile
180 185 190


Arg Asn Gln Arg Ser Asp Tyr Ser His Thr Phe Ser Arg Lys Asp Leu
195 200 205


Gln Ala Glu Leu Ile Leu Leu Phe Glu Lys Gln Lys Glu Phe Gly Asn
210 215 220


Pro His Val Ser Gly Gly Leu Lys Glu Gly Ile Glu Thr Leu Leu Met
225 230 235 240


Thr Gln Arg Pro Ala Leu Ser Gly Asp Ala Val Gln Lys Met Leu Gly
245 250 255


His Cys Thr Phe Glu Pro Ala Glu Pro Lys Ala Ala Lys Asn Thr Tyr
260 265 270


Thr Ala Glu Arg Phe Ile Trp Leu Thr Lys Leu Asn Asn Leu Arg Ile
275 280 285


Leu Glu Gln Gly Ser Glu Arg Pro Leu Thr Asp Thr Glu Arg Ala Thr
290 295 300


Leu Met Asp Glu Pro Tyr Arg Lys Ser Lys Leu Thr Tyr Ala Gln Ala
305 310 315 320


Arg Lys Leu Leu Gly Leu Glu Asp Thr Ala Phe Phe Lys Gly Leu Arg
325 330 335


Tyr Gly Lys Asp Asn Ala Glu Ala Ser Thr Leu Met Glu Met Lys Ala
340 345 350


Tyr His Ala Ile Ser Arg Ala Leu Glu Lys Glu Gly Leu Lys Asp Lys
355 360 365


Lys Ser Pro Leu Asn Leu Ser Pro Glu Leu Gln Asp Glu Ile Gly Thr
370 375 380


Ala Phe Ser Leu Phe Lys Thr Asp Glu Asp Ile Thr Gly Arg Leu Lys
385 390 395 400


Asp Arg Ile Gln Pro Glu Ile Leu Glu Ala Leu Leu Lys His Ile Ser
405 410 415


Phe Asp Lys Phe Val Gln Ile Ser Leu Lys Ala Leu Arg Arg Ile Val
420 425 430


Pro Leu Met Glu Gln Gly Lys Arg Tyr Asp Glu Ala Cys Ala Glu Ile
435 440 445


Tyr Gly Asp His Tyr Gly Lys Lys Asn Thr Glu Glu Lys Ile Tyr Leu
450 455 460


Pro Pro Ile Pro Ala Asp Glu Ile Arg Asn Pro Val Val Leu Arg Ala
465 470 475 480


Leu Ser Gln Ala Arg Lys Val Ile Asn Gly Val Val Arg Arg Tyr Gly
485 490 495


Ser Pro Ala Arg Ile His Ile Glu Thr Ala Arg Glu Val Gly Lys Ser
500 505 510


Phe Lys Asp Arg Lys Glu Ile Glu Lys Arg Gln Glu Glu Asn Arg Lys
515 520 525


Asp Arg Glu Lys Ala Ala Ala Lys Phe Arg Glu Tyr Phe Pro Asn Phe
530 535 540


Val Gly Glu Pro Lys Ser Lys Asp Ile Leu Lys Leu Arg Leu Tyr Glu
545 550 555 560


Gln Gln His Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Gly Lys Glu Ile Asn Leu Gly
565 570 575


Arg Leu Asn Glu Lys Gly Tyr Val Glu Ile Asp His Ala Leu Pro Phe
580 585 590


Ser Arg Thr Trp Asp Asp Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Leu Gly
595 600 605


Ser Glu Asn Gln Asn Lys Gly Asn Gln Thr Pro Tyr Glu Tyr Phe Asn
610 615 620


Gly Lys Asp Asn Ser Arg Glu Trp Gln Glu Phe Lys Ala Arg Val Glu
625 630 635 640


Thr Ser Arg Phe Pro Arg Ser Lys Lys Gln Arg Ile Leu Leu Gln Lys
645 650 655


Phe Asp Glu Asp Gly Phe Lys Glu Arg Asn Leu Asn Asp Thr Arg Tyr
660 665 670


Val Asn Arg Phe Leu Cys Gln Phe Val Ala Asp Arg Met Arg Leu Thr
675 680 685


Gly Lys Gly Lys Lys Arg Val Phe Ala Ser Asn Gly Gln Ile Thr Asn
690 695 700


Leu Leu Arg Gly Phe Trp Gly Leu Arg Lys Val Arg Ala Glu Asn Asp
705 710 715 720


Arg His His Ala Leu Asp Ala Val Val Val Ala Cys Ser Thr Val Ala
725 730 735


Met Gln Gln Lys Ile Thr Arg Phe Val Arg Tyr Lys Glu Met Asn Ala
740 745 750


Phe Asp Gly Lys Thr Ile Asp Lys Glu Thr Gly Glu Val Leu His Gln
755 760 765


Lys Thr His Phe Pro Gln Pro Trp Glu Phe Phe Ala Gln Glu Val Met
770 775 780


Ile Arg Val Phe Gly Lys Pro Asp Gly Lys Pro Glu Phe Glu Glu Ala
785 790 795 800


Asp Thr Leu Glu Lys Leu Arg Thr Leu Leu Ala Glu Lys Leu Ser Ser
805 810 815


Arg Pro Glu Ala Val His Glu Tyr Val Thr Pro Leu Phe Val Ser Arg
820 825 830


Ala Pro Asn Arg Lys Met Ser Gly Gln Gly His Met Glu Thr Val Lys
835 840 845


Ser Ala Lys Arg Leu Asp Glu Gly Val Ser Val Leu Arg Val Pro Leu
850 855 860


Thr Gln Leu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Lys Met Val Asn Arg Glu Arg
865 870 875 880


Glu Pro Lys Leu Tyr Glu Ala Leu Lys Ala Arg Leu Glu Ala His Lys
885 890 895


Asp Asp Pro Ala Lys Ala Phe Ala Glu Pro Phe Tyr Lys Tyr Asp Lys
900 905 910


Ala Gly Asn Arg Thr Gln Gln Val Lys Ala Val Arg Val Glu Gln Val
915 920 925


Gln Lys Thr Gly Val Trp Val Arg Asn His Asn Gly Ile Ala Asp Asn
930 935 940


Ala Thr Met Val Arg Val Asp Val Phe Glu Lys Gly Asp Lys Tyr Tyr
945 950 955 960


Leu Val Pro Ile Tyr Ser Trp Gln Val Ala Lys Gly Ile Leu Pro Asp
965 970 975


Arg Ala Val Val Gln Gly Lys Asp Glu Glu Asp Trp Gln Leu Ile Asp
980 985 990


Asp Ser Phe Asn Phe Lys Phe Ser Leu His Pro Asn Asp Leu Val Glu
995 1000 1005


Val Ile Thr Lys Lys Ala Arg Met Phe Gly Tyr Phe Ala Ser Cys
1010 1015 1020


His Arg Gly Thr Gly Asn Ile Asn Ile Arg Ile His Asp Leu Asp
1025 1030 1035


His Lys Ile Gly Lys Asn Gly Ile Leu Glu Gly Ile Gly Val Lys
1040 1045 1050


Thr Ala Leu Ser Phe Gln Lys Tyr Gln Ile Asp Glu Leu Gly Lys
1055 1060 1065


Glu Ile Arg Pro Cys Arg Leu Lys Lys Arg Pro Pro Val Arg Ser
1070 1075 1080


Gly Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys
1085 1090 1095


Lys Arg Lys Val Glu
1100


<210> 69
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"


<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Phosphorothioate linkage

<220>
<221> modified_base
<222> (29)..(40)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> modified_base
<222> (69)..(100)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(100)
<223> Phosphorothioate linkage

<400> 69
gccgagucug gagagcugca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


<210> 70
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"


<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Phosphorothioate linkage

<220>
<221> modified_base
<222> (29)..(40)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> modified_base
<222> (69)..(100)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(100)
<223> Phosphorothioate linkage

<400> 70
acacaaauac caguccagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


<210> 71
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"


<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Phosphorothioate linkage

<220>
<221> modified_base
<222> (29)..(40)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> modified_base
<222> (69)..(100)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(100)
<223> Phosphorothioate linkage

<400> 71
aaaguucuag augccguccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


<210> 72
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"


<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Phosphorothioate linkage

<220>
<221> modified_base
<222> (29)..(40)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> modified_base
<222> (69)..(100)
<223> 2'-O-methyl modified

<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(100)
<223> Phosphorothioate linkage

<400> 72
acgcaaauau caguccagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> Simian virus 40

<400> 73
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5


<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> Simian virus 40

<400> 74
Pro Lys Lys Lys Arg Arg Val
1 5


<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> Unknown

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown:
Nucleoplasmin bipartite NLS sequence"

<400> 75
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15


<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag"

<400> 76
His His His His His His
1 5


<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
8xHis tag"

<400> 77
His His His His His His His His
1 5


<210> 78
<211> 10
<212> RNA
<213> Unknown

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown:
Kozak sequence"

<400> 78
gccrccaugg 10


<210> 79
<211> 13
<212> RNA
<213> Unknown

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown:
Kozak sequence"

<400> 79
gccgccrcca ugg 13


<210> 80
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"

<400> 80
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat ctgttttgtt ccagagtcta tcaccg 56


<210> 81
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"

<400> 81
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctac acgaataaga gcaaatggga ac 52


<210> 82
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"

<400> 82
cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat cttgcatttc atgagaccga aaaca 55


<210> 83
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"

<400> 83
ggagttcaga cgtgtgctct tccgatctgc tacagtagag ctgtacataa aactt 55


<210> 84
<211> 3783
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"

<400> 84
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ctaatacgac tcactatagg 420

gtcccgcagt cggcgtccag cggctctgct tgttcgtgtg tgtgtcgttg caggccttat 480

tcggatccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg 540

agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 600

ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 660

ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 720

acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 780

ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 840

acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 900

tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc 960

agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 1020

agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 1080

acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc 1140

acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 1200

acaagtaata ggaattatgc agtctagcca tcacatttaa aagcatctca gcctaccatg 1260

agaataagag aaagaaaatg aagatcaata gcttattcat ctctttttct ttttcgttgg 1320

tgtaaagcca acaccctgtc taaaaaacat aaatttcttt aatcattttg cctcttttct 1380

ctgtgcttca attaataaaa aatggaaaga acctcgagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500

aaaaaaaaaa aaaaaaaatc tagacttaag cttgatgagc tctagcttgg cgtaatcatg 1560

gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 1620

cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 1680

gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 1740

cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 1800

tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 1860

aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 1920

gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 1980

ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 2040

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 2100

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 2160

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 2220

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 2280

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 2340

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 2400

aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 2460

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 2520

gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 2580

tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 2640

gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 2700

tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 2760

ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 2820

ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 2880

tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 2940

aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 3000

gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 3060

gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 3120

ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 3180

gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 3240

gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 3300

gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 3360

tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 3420

gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 3480

agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 3540

aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 3600

ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 3660

gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta 3720

agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg 3780

tcg 3783

Claims (75)

  1. ＲＮＡ成分と、
    脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
    約５０～６０モル％のアミン脂質と、
    約８～１０モル％の中性脂質と、
    約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質と
    を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
    ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約６である、前記脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）組成物。
  2. ＲＮＡ成分と、
    約５０～６０モル％のアミン脂質と、
    約２７～３９．５モル％のヘルパー脂質と、
    約８～１０モル％の中性脂質と、
    約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質と
    を含み、ここで、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約５～７である、前記ＬＮＰ組成物。
  3. 前記Ｎ／Ｐ比は約６である、請求項２に記載のＬＮＰ組成物。
  4. ＲＮＡ成分と、
    脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
    約５０～６０モル％のアミン脂質と、
    約５～１５モル％の中性脂質と、
    約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質と
    を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
    ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～１０である、前記ＬＮＰ組成物。
  5. ＲＮＡ成分と、
    脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
    約４０～６０モル％のアミン脂質と、
    約５～１５モル％の中性脂質と、
    約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質と
    を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
    ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約６である、前記ＬＮＰ組成物。
  6. ＲＮＡ成分と、
    脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
    約５０～６０モル％のアミン脂質と、
    約５～１５モル％の中性脂質と、
    約１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質と
    を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
    ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約６である、前記ＬＮＰ組成物。
  7. ＲＮＡ成分と、
    脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
    約４０～６０モル％のアミン脂質と、
    約０～１０モル％の中性脂質と、
    約１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質と
    を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
    ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～１０である、前記ＬＮＰ組成物。
  8. ＲＮＡ成分と、
    脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
    約４０～６０モル％のアミン脂質と、
    約１モル％未満の中性脂質と、
    約１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質と
    を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
    ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～１０である、前記ＬＮＰ組成物。
  9. ＲＮＡ成分と、
    脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
    約４０～６０モル％のアミン脂質と、
    約１．５～１０モル％のＰＥＧ脂質と
    を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
    ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～１０であり、かつ
    前記ＬＮＰ組成物は中性リン脂質を本質的に含まないかまたは含まない、前記ＬＮＰ組成物。
  10. ＲＮＡ成分と、
    脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分は、
    約５０～６０モル％のアミン脂質と、
    約８～１０モル％の中性脂質と、
    約２．５～４モル％のＰＥＧ脂質と
    を含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
    ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３～７である、前記ＬＮＰ組成物。
  11. 前記ＲＮＡ成分はｍＲＮＡを含む、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  12. 前記ＲＮＡ成分は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子、例えば、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどを含む、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  13. 前記ＲＮＡ成分はクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  14. 前記ＲＮＡ成分はＣａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  15. 前記ｍＲＮＡは修飾ｍＲＮＡである、請求項１１～１４のいずれかに記載の組成物。
  16. 前記ＲＮＡ成分は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡを含み、ここで、前記オープンリーディングフレームはウリジン含量が、その最小ウリジン含量から、前記最小ウリジン含量の１５０％までの範囲である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  17. 前記ＲＮＡ成分は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡを含み、ここで、前記オープンリーディングフレームはウリジンジヌクレオチド含量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含量から、前記最小ウリジンジヌクレオチド含量の１５０％までの範囲である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  18. 前記ＲＮＡ成分は、配列番号１、４、７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つに対する同一性が少なくとも９０％である配列を含むｍＲＮＡを含み、ここで、前記ｍＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするオープンリーディングフレームを含む、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  19. 前記ＲＮＡ成分はｇＲＮＡ核酸を含む、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
  20. 前記ｇＲＮＡ核酸はｇＲＮＡである、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ＲＮＡ成分はクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  22. 前記ｇＲＮＡ核酸は、二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）であるかまたはそれをコードする、請求項１９～２１のいずれかに記載の組成物。
  23. 前記ｇＲＮＡ核酸は、ｓｇＲＮＡであるかまたはそれをコードする、請求項１９～２１のいずれかに記載の組成物。
  24. 前記ｇＲＮＡは修飾されている、請求項１９～２３のいずれかに記載の組成物。
  25. 前記ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオアート（ＰＳ）結合、及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドから選ばれる修飾を含む、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記ｇＲＮＡは、５’末端の最初の５ヌクレオチドの１つ以上における修飾を含む、請求項２４～２５のいずれかに記載の組成物。
  27. 前記ｇＲＮＡは、３’末端の最後の５ヌクレオチドの１つ以上における修飾を含む、請求項２４～２６のいずれかに記載の組成物。
  28. 前記ｇＲＮＡは、最初の４ヌクレオチド間にＰＳ結合を含む、請求項２４～２７のいずれかに記載の組成物。
  29. 前記ｇＲＮＡは、最後の４ヌクレオチド間にＰＳ結合を含む、請求項２４～２８のいずれかに記載の組成物。
  30. ５’末端の最初の３ヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項２４～２９のいずれかに記載の組成物。
  31. ３’末端の最後の３ヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項２４～３０のいずれかに記載の組成物。
  32. 前記ｇＲＮＡ及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、重量基準で約１０：１～約１：１０の範囲の比で存在する、請求項１９～３１のいずれかに記載の組成物。
  33. 前記ｇＲＮＡ及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、重量基準で約５：１～約１：５の範囲の比で存在する、請求項１９～３１のいずれかに記載の組成物。
  34. 前記ｇＲＮＡ及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、重量基準で約３：１～約１：１の範囲の比で存在する、請求項１９～３３のいずれかに記載の組成物。
  35. 前記ｇＲＮＡ及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、重量基準で約２：１～約１：１の範囲の比で存在する、請求項１９～３４のいずれかに記載の組成物。
  36. 前記ｇＲＮＡ及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、重量基準で約２：１の比で存在する、請求項１９～３５のいずれかに記載の組成物。
  37. 前記ｇＲＮＡ及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは、重量基準で約１：１の比で存在する、請求項１９～３５のいずれかに記載の組成物。
  38. 少なくとも１つの鋳型をさらに含む、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  39. 前記ＰＥＧ脂質のモル％は約３である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  40. 前記アミン脂質のモル％は約５０である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  41. 前記アミン脂質のモル％は約５５である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  42. 前記アミン脂質のモル％は±３モル％である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  43. 前記アミン脂質のモル％は±２モル％である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  44. 前記アミン脂質のモル％は４７～５３モル％である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  45. 前記アミン脂質のモル％は４８～５３モル％である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  46. 前記アミン脂質のモル％は５３～５７モル％である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  47. 前記Ｎ／Ｐ比は６±１である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  48. 前記Ｎ／Ｐ比は６±０．５である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  49. 前記アミン脂質はリピドＡである、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  50. 前記アミン脂質はリピドＡの類似体である、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  51. 前記類似体はアセタール類似体である、請求項５０に記載の組成物。
  52. 前記アセタール類似体はＣ４－Ｃ１２アセタール類似体である、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記アセタール類似体はＣ５－Ｃ１２アセタール類似体である、請求項５０に記載の組成物。
  54. 前記アセタール類似体はＣ５－Ｃ１０アセタール類似体である、請求項５０に記載の組成物。
  55. 前記アセタール類似体は、Ｃ４類似体、Ｃ５類似体、Ｃ６類似体、Ｃ７類似体、Ｃ９類似体、Ｃ１０類似体、Ｃ１１類似体、及びＣ１２類似体から選ばれる、請求項５０に記載の組成物。
  56. 前記ヘルパー脂質はコレステロールである、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  57. 前記中性脂質はＤＳＰＣである、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  58. 前記中性脂質はＤＰＰＣである、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  59. 前記ＰＥＧ脂質はジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）を含む、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  60. 前記ＰＥＧ脂質はＰＥＧ－２ｋを含む、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  61. 前記ＰＥＧ脂質はＰＥＧ－ＤＭＧである、先行請求項いずれかに記載の組成物。
  62. 前記ＰＥＧ－ＤＭＧはＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、請求項６１に記載の組成物。
  63. 前記ＬＮＰ組成物は中性脂質を本質的に含まない、請求項９に記載の組成物。
  64. 前記中性脂質はリン脂質である、請求項６３に記載の組成物。
  65. 細胞を、請求項１２～６４のいずれかに記載のＬＮＰ組成物と接触させることを含む、遺伝子編集方法。
  66. クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ核酸を細胞に送達することを含む遺伝子編集方法であって、前記クラス２Ｃａｓ ｍＲＮＡ及び前記ガイドＲＮＡ核酸は、請求項１３～６４のいずれかに記載の少なくとも１つのＬＮＰ組成物として製剤化される、前記方法。
  67. 細胞を、請求項１２～６４のいずれかに記載の少なくとも１つのＬＮＰ組成物と接触させることを含む、遺伝子操作された細胞を作製する方法。
  68. 前記ＬＮＰ組成物を少なくとも２回投与する、請求項６５～６７のいずれかに記載の方法。
  69. 前記ＬＮＰ組成物を２～５回投与する、請求項６８に記載の方法。
  70. 再投与時に編集が改善する、請求項６８または６９に記載の方法。
  71. 少なくとも１つの鋳型核酸を前記細胞に導入することをさらに含む、請求項６５～７０のいずれかに記載の方法。
  72. 前記ｍＲＮＡを第１のＬＮＰ組成物に製剤化し、前記ガイドＲＮＡ核酸を第２のＬＮＰ組成物に製剤化する、請求項６５～７１のいずれかに記載の方法。
  73. 前記第１及び第２のＬＮＰ組成物を同時に投与する、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記第１及び第２のＬＮＰ組成物を順次投与する、請求項７２に記載の方法。
  75. 前記ｍＲＮＡ及び前記ガイドＲＮＡ核酸を単一のＬＮＰ組成物に製剤化する、請求項６５～７３のいずれかに記載の方法。
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