JP2023549131A - ヒトミトコンドリア核分裂蛋白質１のペプチド阻害剤と使用方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、ミトコンドリア核分裂タンパク質１（ＦＩＳ１）阻害ペプチドと、該ペプチドをコード化するポリヌクレオチドとベクター、並びに２型糖尿病関連の動脈疾患と血管機能不全などの疾患の治療に該ペプチドを使用する方法を提供する。
【選択図】図１

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年１１月６日付出願の米国仮特許出願第６３／１１０，４５７ 号に基づき、その優先権を主張するとともに、その全文を参照により本願に援用する。

［連邦政府による資金提供を受けた研究の記載］
本発明は、米国立衛生研究所による助成金第Ｒ０１ ＨＬ１２８２４０号及び第Ｒ０１－ＧＭ０６７１８０号に基づく資金提供を受けてなされたものであり、連邦政府が本発明に対する特定の権利を有する。

［配列表］
本出願に添付する配列表については、２０２１年１１月５日付で作成した「６５００５３＿００８３４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と称するＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表ファイル（ファイルサイズ：１１．４ＫＢ）として提出する。該配列表は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本願と共に電子的に提出し、その全体を参照により本願に援用する。

本発明の分野は、核分裂蛋白質１ペプチドと融合ペプチド、並びに血管疾患や２型糖尿病などの疾患の治療方法に関する。

２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）患者においては、大血管と微小血管の疾患が発病する以前に血管内皮機能障害が認められる。新たに得られたデータでは、ミトコンドリアの形態と機能の異常が、Ｔ２ＤＭ罹患者由来のヒト血管内皮機能不全の発病に関与していることを示唆している^１，２。Ｔ２ＤＭ罹患者由来内皮細胞内のミトコンドリアは超酸化物を過剰に産生している。かかる超酸化物の過剰産生は、部分的にはミトコンドリア内膜の分極化によって引き起こされる^２。内皮細胞におけるミトコンドリア反応性酸素種（ｍｔＲＯＳ）の過剰産生は深刻な後成的変化を引き起こすとともに細胞シグナル伝達経路を活性化し、それが内皮炎症や血管機能不全につながる^３。以前に行った研究からも明らかなとおり、Ｔ２ＤＭ罹患者由来のヒト抵抗細動脈において、ミトコンドリアを標的とした抗酸化物質や薬理作用物質を投薬してミトコンドリア内膜を部分的に脱分極すると、内皮細胞依存性血管拡張能障害の好転を図れる^２，４。

残念ながら、血管疾患の予防と治療を目的とした抗酸化療法に関する第ＩＩＩ相臨床試験では、別途実施した小規模な生理学的試験且つ又は非ランダム化試験で見られるプラスの効果を検証できず、また、ミトコンドリア内膜を標的にして薬理作用を奏する既存の作用物質は、臨床使用を妨げる毒性プロファイルを有する^７。

したがって、２型糖尿病患者などにおける血管機能不全の治療を標的とした別の療法が求められている。

本開示は、ミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）活性阻害ペプチドとその使用方法を提供する。

本開示の１態様では、（ａ）配列番号：３８（ＸＬＰＹＰＺ）のアミノ酸配列、又は配列番号３８に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）活性阻害ペプチドであり、ＸとＺが０～３０個のアミノ酸又は随意に１～２０個のアミノ酸からなるペプチドであり得ることを特徴とするミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）活性阻害ペプチドを提供する。一部の態様では、阻害ペプチドが、配列番号３３～３７から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号３３～３７に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含み、５～５０個のアミノ酸又は随意に５～３０個のアミノ酸長さのペプチドであることを特徴とする。

本開示の別の態様では、（ａ）配列番号１（ＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ）のアミノ酸配列、又は配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を含むＦｉｓ１阻害ペプチドを提供する。本開示の別の態様では、（ｂ）担体ペプチドやタグペプチド又は細胞結合ペプチドをコード化するアミノ酸配列又は担体に連結している（ａ）配列番号１（ＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ）のアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を含むＦｉｓ１阻害ペプチドを提供する。

本開示の別の態様では、（ａ）配列番号１、１６～２１、２６又は２９のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号１、１６～２１、２６又は２９に対して少なくとも８０％の配列類似性、好ましくは少なくとも９０％の類似性を持つ配列を含むミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）活性阻害ペプチドを提供する。一部の態様では、（ａ）を含む阻害ペプチドが、（ｂ）担体ペプチドやタグペプチド又は細胞結合ペプチドをコード化するアミノ酸配列又は担体に連結している。一部の態様では、細胞透過性ペプチド配列である担体ペプチド、又は随意にＴＡＴ（配列番号２）や、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列類似性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列に、阻害ペプチドが連結又は付着している。一部の態様において、（ａ）と（ｂ）はペプチドであり、リンカアミノ酸配列によって連結している。一部の態様では、リンカー配列の配列番号が４、１１、１２、１３、１４又は１５である。

本開示の別の態様では、配列番号１（ＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ）のアミノ酸配列、又は配列番号１に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を含むＦｉｓ１阻害ペプチドを提供する。別の態様では、Ｆｉｓ１阻害ペプチドが、配列番号３（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＧＳＧＳＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ）又は配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を持つペプチドである。

別の態様では、阻害ペプチドが、配列番号３、配列番号３１又は配列番号３２、若しくは配列番号３、配列番号３１又は配列番号３２に対して少なくとも８０％の配列類似性、好ましくは９０％程度の配列同一性を持つペプチドである。

本開示では、更に別の態様において、２型糖尿病に関連する血管合併症の治療方法であり、血管合併症の治療を目的として本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量投与することを含む方法を提供する。

本開示の別の態様では、血管拡張能障害の治療を必要とする被検体において血管拡張障害の好転を図る方法であり、被検体における血管拡張能の回復を目的として本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量投与することを含む方法を提供する。１態様では、被検体が２型糖尿病罹患者である。

本開示の別の態様では、ヒト微小血管内皮細胞における酸化窒素（ＮＯ）の生体利用効率を高める方法であり、ヒト内皮細胞におけるＮＯ生体利用効率の向上を目的として本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量投与することを含む方法を提供する。

Ｆｉｓ１のトランスフェクションによって、高グルコース状態と低グルコース状態のいずれにおいてもアセチルコリンに対する反応が増大し、対照（ｓｉＲＮＡ）と比較して血管拡張が改善することを示す図。Ａ．Ｆｉｓ１発現の分子阻害が、高グルコース状態での内皮血管拡張に及ぼす影響。高グルコース状態が原因で生じる血管拡張能障害は、Ｆｉｓ１ノックダウン条件下で改善された（全般的なＰ＝０．０００２、＊対照ｓｉＲＮＡとＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡのＡｃｈ適応用量間のＰ≦０．０００２、Ｎ＝６名）。このＦｉｓ１ノックダウン条件下での血管拡張の改善は、Ｌ－ＮＡＭＥによって覆される場合がある（Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡとｓｉＦｉｓ１＋Ｌ－ＮＡＭＥ間のＰ＜０．０００１、対照ｓｉＲＮＡとｓｉＲＮＡ＋Ｌ－ＮＡＭＥ間のＰ＝０．００２）。Ｂ．低グルコース状態での内皮血管拡張に対するＦｉｓ１発現の分子ノックダウンの影響。低グルコース状態が原因で生じる血管拡張能障害は、Ｆｉｓ１ノックダウン条件下で改善された（全般的なＰ＝０．０００８、＊対照ｓｉＲＮＡとＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡのＡｃｈ適応用量間のＰ≦０．０００３、Ｎ＝６名）。このＦｉｓ１ノックダウン条件下での血管拡張の改善は、Ｌ－ＮＡＭＥによって覆される場合がある（Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡとＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡ＋Ｌ－ＮＡＭＥ間のＰ＝０．０００２）。Ａｃｈ…アセチルコリン。 高グルコース状態と低グルコース状態におけるＦｉｓ１濃度の低下に伴い、ヒト細動脈におけるＮＯの生体利用効率が増加することを示す図。Ａ．低グルコース（ＬＧ）：（ｎ＝８、全般的なＰ＝０．０１、対照ｓｉＲＮＡとＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡ間のＰ＝０．０３、対照ｓｉＲＮＡ＋Ｌ－ＮＡＭＥとＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡ間のＰ＝０．００３、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡとＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡ＋Ｌ－ＮＡＭＥ間のＰ＝０．０３）。図中、四角形の各要素は２５及び７５パーセンタイルを示す。横線は中央値を示す。Ｂ．高グルコース：（ｎ＝９、全般的なＰ＝０．０４、スクランブルｓｉＲＮＡとＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡ間のＰ＝０．０１、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡと対照ｓｉＲＮＡ＋Ｌ－ＮＡＭＥ間のＰ＝０．０３、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡとＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡ＋Ｌ－ＮＡＭＥ間のＰ＝０．０４７）。 糖尿病（ＤＭ）罹患細動脈におけるＦｉｓ１発現の抑制により、内皮細胞依存性血管拡張能障害が好転し（ｎ＝６、Ｐ＝０．００２）、この効果がＬ－ＮＡＭＥによって阻害されることを示す図（Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡとＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡ＋Ｌ－ＮＡＭＥ間のＰ＜０．０００４）。＊ それ以外のものをＡｃｈ適応用量で投薬した例に対比した場合のＰ＜０．０００５。Ａｃｈ…アセチルコリン。 高グルコース（３３ｍＭ）と低グルコース（２．５ｍＭ）状態でＦｉｓ１を分子阻害すると、単層内皮細胞間の定常接合安定性が改善することを示す図。Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡと対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクト（導入）したヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ－１）における電気細胞基質インピーダンスセンシング測定（ＥＣＩＳ）の、高グルコース状態と正常グルコース値状態間（Ａ）及び正常グルコース値状態と低グルコース状態間（Ｂ）の比較を示す図であり、図中、四角形の各要素は２５～７５パーセンタイルを示す。横線は中央値を示す。分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定（各処理におけるｎ＝４）を行った（高グルコース試験と低グルコース試験の両方における全般的なＰ＜０．００１）；＊－Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。ＨＧ…高グルコース、ＬＧ…低グルコース、ＮＧ…正常グルコース値。 高グルコース（３３ｍＭ）と低グルコース（２．５ｍＭ）状態におけるＦｉｓ１の分子阻害は、正常グルコース（５ｍＭ）状態の場合と比べてミトコンドリア生体エネルギー合成状態に変化を及ぼさないことを示す図。予め高グルコース（６時間）と正常グルコース（５ｍＭ、２時間）、及び低グルコース（２時間）で培養した後にＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡと対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクト（導入）したヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ－１）における細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ、ｎ＝５）（Ａ）と酸素消費速度（ＯＣＲ、ｎ＝５）（Ｂ）の測定値を示す。野生型（ＷＴ）細胞とは、トランスフェクションを行わずに正常グルコース状態で増殖したＨＭＥＣ－１細胞を示す。ＥＣＡＲとＯＣＲを基底条件下で測定し、続いてオリゴマイシン（２．５μＭ）、ＦＣＣＰ（１ μＭ）、並びにロテノン（１μＭ）とアンチマイシンＡ（１μＭ）を順次加えた。各処理方法の間に統計的有意差は認められなかった。 新規ペプチドｐｅｐ２１３のＦｉｓ１に対する結合を示す図。（Ａ）非標識化ｐ８４７０の量を漸増（０～２０００μＭ）しながら滴定した５０μＭの１５Ｎ－Ｆｉｓ１サンプルの１Ｈ－１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルの重なりを示す図。（Ｂ）滴定系列の全スペクトルにトレンド分析を適用し、正規化主成分１の値（ＰＣ１）をリガンド枯渇モデルにフィッティング（適合）して、見かけのＫＤ＝７±２μＭを求めることにより、（Ａ）におけるＮＭＲデータに基づいてＦｉｓ１に結合するｐｅｐ２１３の親和性を求めたことを示す図。（Ｃ）トリプトファン固有蛍光分析による親和性測定を示す図。トリプトファンを含有しないｐｅｐ２１３の量を漸増しながら（０～１０００μＭ）、単一のトリプトファンを含有するＦｉｓ１を滴定した。平均放射波長を求めてフィッティングすることで、見かけのＫｄ＝３．３±０．１μＭを求めた。パネルＢとパネルＣにおける適合残基を各パネルの上に示した。 Ｐｅｐ２１３－ｔａｔが、高グルコースに曝露した健常なヒト血管及びＴ２ＤＭ罹患者由来のヒト血管内で、内皮細胞依存性血管拡張能障害を好転させることを示す図。（Ａ）アセチルコリンによる内皮細胞依存性血管拡張の高グルコース誘発性減弱は、ｔａｔ配列に１～１０μＭのｐｅｐ２１３（ｎ＝５、Ｐ＜０．０００１）を付着して細胞侵入を容易にする処理を施すことで好転したが、このｐｅｐ２１３－ｔａｔ処理により得られた改善はＬ－ＮＡＭＥによって覆される結果となった（ｐｅｐ２１３とｐｅｐ－２１３＋Ｌ－ＮＡＭＥ間のＰ＜０．０００１、＊Ａｃｈ適応濃度でのｐｅｐ２１３とそれ以外の全ての曝露間のＰ＜０．０００１）ことを示す図。（Ｂ）Ｔ２ＤＭ被検体から採取した血管では、Ａｃｈによる内皮細胞依存性血管拡張の減弱がｐｅｐ２１３により好転した（全般的なＰ＜０．００１、＊Ａｃｈ適応濃度でのｐｅｐ２１３とそれ以外全ての曝露間のＰ＜０．０５）。Ａｃｈ…アセチルコリン、Ｔ２ＤＭ…２型糖尿病。 ｐｅｐ２１３－ｔａｔが、スクランブル化ペプチド対照と比べた場合、高グルコースに曝露した健常なヒト血管及びＴ２ＤＭ罹患者由来のヒト血管内における内皮細胞依存性血管拡張の減弱を好転させることを示す図。（Ａ）予め高グルコース（３３ｍＭ）に６時間曝露した後のアセチルコリン誘発性内皮細胞依存性血管拡張状態に対して、１μＭのｐｅｐ２１３－ｔａｔによる処理を施すことにより、ｔａｔ配列に付着したｐｅｐ２１３と同じアミノ酸を含有するスクランブル化ペプチドと比べて該拡張状態を好転できることを示す図（ｎ＝５、全般的なＰ＜０．００１、＊Ａｃｈ適応濃度でのＰ＜０．０５）。（Ｂ）Ｔ２ＤＭ被検体由来の血管でも同様の結果が認められることを示す図（ｎ＝４、全般的なＰ＜０．００１、＊Ａｃｈ適応濃度でのＰ＜０．０５）。 ｓｉＲＮＡ処理によるヒト細動脈内でのＦｉｓ１ノックダウン効率を示す図。ｓｉＲＮＡ Ｆｉｓ１をトランスフェクトしたヒト細動脈はスクランブル化対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細動脈よりＦｉｓ１濃度が有意に低下した（ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。 Ｄｒｐ１ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、高グルコース誘発性内皮細胞依存性血管拡張能障害を予防できる（全般的なＰ＜０．０００１、＊対照ｓｉＲＮＡとＤｒｐ１ ｓｉＲＮＡのＡｃｈ適応用量間のＰ≦０．０００１、ｎ＝６）が、Ｄｒｐ１ノックダウン条件下での血管拡張の改善が、Ｌ－ＮＡＭＥによって覆されることを示す図（Ｄｒｐ１ ｓｉＲＮＡとＤｒｐ１ ｓｉＲＮＡ＋Ｌ－ＮＡＭＥ間のＰ＜０．０００１）。 高グルコース又は低グルコース状態に曝露した健常なヒト細動脈において、Ｄｒｐ１ ｓｉＲＮＡによるＤｒｐ１発現をノックダウンすることにより、細動脈内の１酸化窒素（ＮＯ）生体利用効率の低下を予防できることを示す図。（Ａ）高グルコース（ＨＧ、３３ｍＭ、６時間曝露）：ｎ＝９、Ｐ＝全体で０．０２、Ｄｒｐ１ ｓｉＲＮＡとそれ以外の全ての曝露との間のＰ＜０．０５）。（Ｂ）低グルコース（ＬＧ、２．５ｍＭ、２時間曝露）：ｎ＝５、全般的なＰ＝０．００３、Ｄｒｐ１ ｓｉＲＮＡとそれ以外全ての曝露との間のＰ＝０．０３以下）。 Ｔ２ＤＭ罹患者由来のヒト細動脈において、Ｄｒｐ１ ｓｉＲＮＡを用いてＤｒｐ１発現の抑制を行ったところ、内皮細胞依存性血管拡張能障害を好転させる傾向が見られた（ｎ＝４、Ｐ＝０．０７６）ことを示す図。 ｓｉＲＮＡ処理によるＨＭＥＣ－１細胞のＦｉｓ１ノックダウン効率を示す図。Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡ Ｆｉｓ１をトランスフェクトしたＨＭＥＣ‐１細胞では、スクランブル化対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞（Ｐ＝０．０００２）と非トランスフェクト化ＨＭＥＣ－１細胞（Ｐ＝０．０００１）に比べてＦｉｓ１濃度が有意に低下した（ｎ＝３、全般的なＰ＜０．０００１）。 ＨＭＥＣ－１細胞では、Ｃａ＋２ イオノフォア Ａ２３１８７による活性後、Ｓｅｒ１１７７でのｅＮＯＳのリン酸化とＮＯの産生が増加したことを示す図。（Ａ）Ａ２３１８７を加えた場合と加えない場合のｐ－ｅＮＯＳ－（Ｓｅｒ１１７７）及びβ－アクチンの代表的なウエスタンブロットを示す図。（Ｂ）Ａ２３１８７を用いて処理した場合と用いずに処理した場合のｐ－ｅＮＯＳ－（Ｓｅｒ１１７７）の定量的測定（Ｐ＝０．０３、ｎ＝６）を示す図。（Ｃ）ＤＡＦ ２－ＤＡ（５ｕＭ）を用いて測定したＮＯ産生量がＡ ２３１８７の添加により増加した（ｎ＝４、Ｐ＝０．０２）ことを示す図。 Ｆｉｓ１ノックダウンにより、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした不死化培養ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ－１）のＮＯ産生が改善されたことを示す図（ｎ＝７、全般的なＰ＜０．０００１、ｓｉＦｉｓ１基底とｓｉＦｉｓ１刺激状態間のＰ＜０．０００１、ｓｉＲＮＡ基底とｓｉＦｉｓ１刺激状態間のＰ＝０．０００３、ｓｉＦｉｓ１刺激状態とｓｉＲＮＡ刺激状態間のＰ＝０．０２）。Ｌ－ＮＡＭＥに曝露した細胞を、Ｌ－ＮＡＭＥで２時間培養した後、更にＤＡＦ２－ＤＡ（５ｕＭ）で１５分間培養してから蛍光強度を測定した。 高グルコース（３３ｍＭ）及び低グルコース（２．５ｍＭ）状態におけるＦｉｓ１の分子阻害によって、他のミトコンドリア蛋白質の発現への変化が認められなかったことを示す図。ｓｉＲＮＡ Ｆｉｓ１をトランスフェクト化又はスクランブル化した不死化ＨＭＥＣ－１細胞を、高グルコース（ＨＧ、３３ｍＭ、６時間）、正常グルコース値（ＮＧ、５ｍＭ、２時間）、低グルコース（ＬＧ、２．５ｍＭ、２時間）の異なるグルコース状態で予め培養し、その不死化ＨＭＥＣ－１細胞から任意に選択した所定のミトコンドリア蛋白質の発現を測定した。各蛋白質の発現を正規化して、各サンプル間の総蛋白量を得た（各蛋白質のサンプル数ｎ＝４～１０）。異なるグルコース濃度に曝露して比較した場合、いくつかのミトコンドリア蛋白質の発現に違いが見られるが、Ｆｉｓ１発現をｓｉＲＮＡでノックダウンしても、Ｆｉｓ１以外のミトコンドリア蛋白質の発現には影響を及ぼさなかった。統計的有意差を、ｐ＜０．０５の場合は「＊」で、ｐ＜０．０１の場合は「＊＊」で、ｐ＜０．００１の場合は「＊＊＊」で、ｐ＜０．０００１の場合は「＊＊＊＊」で示す。 ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）における１酸化窒素（ＮＯ）の生体利用効率が増加したことを示す図。１μＭのｐｅｐ２１３－ｔａｔを用いて、ＨＭＶＥＣ細胞を３７℃で１時間処理し、ＮＯをジアミノフルオレセイン－２ジアセテート（ＤＡＦ２－ＤＡ）染色法で測定した（Ｎ＝３、＊Ｐ＝０．０４）。 Ｆｉｓ１の過剰発現を伴う細動脈における内皮細胞依存性血管拡張能障害はｅＮＯＳ依存性であることを示す図。健常なヒト抵抗細動脈（培養時間を４８時間とし、ヒトＦｉｓ１の内皮特異的過剰発現を目的としてプラスミドをトランスフェクトしたもの）におけるＦｉｓ１の過剰発現によって、ｅＮＯＳ依存性の血管拡張能障害が生じる。（このことは、ｅＮＯＳ阻害剤Ｌ－ＮＡＭＥを使用した場合、アセチルコリンが喪失しても内皮細胞依存性血管拡張を誘発できることから判断できる。）Ｎ＝５、全般的なＰ＜０．００１。＊アセチルコリンの適応用量でのＰ＜０．０５。Ａｃｈ…アセチルコリン。 抵抗細動脈における内皮細胞依存性血管拡張能障害をｐｅｐ２１３により好転できることを示す図。細胞浸透性を改善する目的でｔａｔ配列に付着したｐｅｐ２１３（１μＭのｐｅｐ２１３－ｔａｔ）に１時間曝露することにより、内皮細胞内でＦｉｓ１の過剰発現（レンチウイルスベクターを用いて内皮特異的なヒトＦｉｓ１の過剰発現を目的としたプラスミドを血管にトランスフェクトすることにより達成したヒトＦｉｓ１の過剰発現）を示す健常なヒト抵抗細動脈における内皮細胞依存性血管拡張能障害を好転できる。ｐｅｐ２１３と同じアミノ酸を順不同な配列で用いてスクランブル化した１μＭのペプチドでは、アセチルコリンによる内皮細胞依存性血管拡張に何ら効果を示さなかった。ｐｅｐ２１３－ｔａｔは、ｅＮＯＳ依存的に内皮細胞依存性血管拡張の改善をもたらす。（このことは、ｅＮＯＳ阻害剤Ｌ－ＮＡＭＥを使用した場合、アセチルコリンが喪失しても内皮細胞依存性血管拡張を誘発できることから判断できる。）Ｎ＝５、全般的なＰ＜０．００１。＊アセチルコリンの適応用量でのＰ＜０．０５。Ａｃｈ…アセチルコリン。 ｐｅｐ２１３とＦｉｓ１の結晶構造及びｐｅｐ２１３のペプチドマッピングを示す図。（Ａ）共錯体構造を見ても、塩橋形成や水素結合やファンデルワールス相互作用を含む様々な結合相互作用を介して、ｐｅｐ２１３がＦｉｓ１と結び合っていることが明らかである。（Ｂ）マイクロスケール熱泳動を用いて、Ｆｉｓ１－ｐｅｐ２１３相互作用に欠かせないｐｅｐ２１３残基を断定した。ｐｅｐ２１３の各残基をアラニンで順次置換し、計１４個のペプチドを得た。結合親和性の値を用いて反応のΔＧ°（ΔＧ°＝－ＲＴｌｎＫ）を求め、これを用いてΔＧ°の値を計算した（ΔＧ°_{ｐｅｐ２１３}－ΔＧ°_異形）。ΔΔＧ°値が低いことからも分かるように、ペプチドの各末端の残基の部分集合は結合に対して有意な寄与を示さない。

本発明は、ペプチドと、該ペプチドをコード化する核酸配列及びベクターと、該ペプチド又はベクターを含有する組成物と、これらを用いて、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）や血管疾患などの内皮機能不全や血管機能不全に関連する疾患を治療する方法を提供する。

糖尿病に伴う内皮機能不全をはじめとする様々な疾患にミトコンドリアの過剰な核分裂が関与していると考えられてきた。ミトコンドリア核分裂とは、ミトコンドリアが個々の小さいミトコンドリアに分裂することであり、生体外では、遺伝的又は薬理学的に核分裂を阻害することで血管拡張を改善できる。かかる阻害には、ミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）をコード化する遺伝子の、ＲＮＡｉを介した遺伝的サイレンシングが含まれる。これらのデータは、Ｆｉｓ１の阻害が血管拡張能障害を伴う病態を改善する可能性があることを示唆している。本発明者らは、Ｆｉｓ１の阻害剤を同定するために、ミクロモルからサブミクロモルの親和性を持つ組換えＦｉｓ１に結合する高親和性１４残基ペプチドｐｅｐ２１３（配列番号１）を開発した。ヒト内皮血管に細胞透過性のｐｅｐ２１３を適用すると血管拡張が回復するため、このペプチドはＦｉｓ１の 生体内活性を阻害して治療効果を奏し得ることが示唆された。ｐｅｐ２１３は、ファージディスプレイスクリーニング法によりペプチドから派生させたものであり、最初の３２残基が欠けている重度短縮型Ｆｉｓ１に結合した新規ペプチドである。更に、本発明者らは、ｐｅｐ２１３に含まれるアミノ酸のうちＦｉｓ１への結合に必要な基幹アミノ酸に焦点を当てて、共結晶化と突然変異生成の分析を実施した（図２０参照）。

（１）２型糖尿病罹患者から採取したヒト内皮細胞におけるミトコンドリア核分裂１蛋白質（Ｆｉｓ１）の発現増加と、（２）Ｆｉｓ１又はダイナミン関連蛋白質１（Ｆｉｓ１と結合してミトコンドリア核分裂を誘発し得るＤｒｐ１）の発現の分子ノックダウンによる、高グルコース誘発性のミトコンドリア超酸化物産生増加及び内皮細胞由来の１酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）のＳｅｒ１１７７活性化部位におけるリン酸化能障害の阻止と、（３）ヒト抵抗細動脈において、Ｄｒｐ１を薬理的・分子的にノックダウンすることで、低グルコース誘発性の内皮機能不全を好転できること、とを実証した先行研究に基づき、ミトコンドリア核分裂に関与する蛋白質及びペプチドを標的とすることが有望な代替手段として期待されている^１，８。Ｆｉｓ１は、そのミトコンドリア動態における役割から、薬理的標的として特に注目されており、低酸素血症や高血糖症などに対する病理学的刺激手段として最も活躍すると考えられている^９－１２。

本開示では、実施例においても説明するように、Ｆｉｓ１発現のノックダウンが、２型糖尿病患者から採取した抵抗血管と高・低グルコース濃度に急性曝露した健常な個人から採取した血管において、内皮細胞依存性血管拡張及び１酸化窒素（ＮＯ）産生を好転できるかどうかを調べる試験を実施した。更に、高グルコース又は低グルコース状態での内皮細胞関門機能や酸素消費及び解糖に対するＦｉｓ１ノックダウンの影響も調べた。本発明者らは次に、Ｆｉｓ１に結合してＦｉｓ－１媒介性の核分裂を阻止する新規ペプチドを設計し、Ｔ２ＤＭ罹患者由来のヒト抵抗小動脈と高グルコース濃度に曝露した健常なヒト血管の内皮細胞依存性血管拡張に好ましく作用するかを調べるための試験も行った。Ｆｉｓ１を薬理学的標的とすることで、Ｔ２ＤＭにおける血管疾患の課題に対する有用な治療手段が得られる。

［ペプチド及び組成物］
本発明は、組換えＦｉｓ１、好ましくはマイクロモルからサブマイクロモルの親和性を有する組換えＦｉｓ１に結合する新規ペプチドを提供する。

本開示の第１の実施形態では、（ａ）配列番号３８（ＸＬＰＹＰＺ）のアミノ酸配列、又は配列番号３８に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）活性阻害ペプチドであり、ＸとＺが０～３０個のアミノ酸、又は随意に１～２０個のアミノ酸、又は随意に１～１０個のアミノ酸からなるペプチドであることを特徴とするミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）活性阻害ペプチドを提供する。別の実施形態では、配列番号３８のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を含む。別の態様では、請求項１の阻害ペプチドが、（ａ）配列番号３３～３７から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号３３～３７に対して少なくとも８０％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を含み、５～５０程度のアミノ酸長さ又は随意に５～３０個のアミノ酸長さのペプチドであることを特徴とする。アミノ酸の長さは、１０～２０程度のアミノ酸、又は１２～１６程度のアミノ酸であることが好ましい。上記以外にも適切な長さを企図し得る。また、後述の如く、（ａ）が（ｂ）の担体ペプチド又はタグに連結していることが望ましい。

更なる実施形態では、１４量体ペプチドｐｅｐ２１３（配列番号１、１６～２１、２６又は２９、一実施形態において好ましくは配列番号１）又は少なくとも８０％の配列同一性、随意に少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列が、細胞透過性融合ペプチド（例：ｐｅｐ２１３－ＴＡＴ、配列番号３又は配列番号３１又は３２、若しくは配列番号３、３１又は３２と少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列）として得られる場合、生体内でＦｉｓ１活性を阻害する機能を有する。この阻害ペプチドは、拡張能が減弱している内皮細胞及び血管の拡張能を回復する機能も有する。このように、該ペプチドは、内皮細胞依存性血管拡張障害を好転させる機能を有するため、２型糖尿病に関連する血管機能不全などの血管疾患の治療に使用できる。更に、図１９と図２０に示す共結晶化とペプチド変異解析の結果では、１４量体中のアミノ酸のうち、Ｆｉｓ１結合に重要なアミノ酸を明らかに示している。したがって、一部の態様では、修飾ｐｅｐ２１３ペプチド（例： 配列番号１６～２９、好ましくは配列番号１６～２１、２６又は２９、若しくは１つ又は複数のアミノ酸Ｘが任意のアミノ酸、好ましくはアラニン又はグリシンに置換された配列番号３０、など）が企図される。

１実施形態では、ミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）活性阻害ペプチドが、担体ペプチドやタグペプチド又は細胞結合ペプチドと連結した本開示に係る阻害ペプチドを含む、又はそれからなる。１態様では、ミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）活性阻害ペプチドが、（ａ）配列番号３８（ＸＰＬＰＹＰＺ）のアミノ酸配列、又は配列番号３８に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含み、ＸとＺが０～３０個のアミノ酸、又は随意に１～２０個のアミノ酸、又は随意に１～１０個のアミノ酸からなるペプチドである（該アミノ酸ペプチドは任意の適切なアミノ酸を含み得る）。別の実施形態では、配列番号３８のアミノ酸配列、又は少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を含む。別の態様では、請求項１の阻害ペプチドが、（ａ）配列番号３３～３７から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号３３～３７に対して少なくとも８０％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を含み、５～５０程度のアミノ酸長さ又は随意に５～３０個のアミノ酸長さのペプチドであることを特徴とする。別の態様では、該阻害剤が、（ａ）配列番号１（ＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ）のアミノ酸配列、又は配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を含む、又はそれからなる。別の実施形態では、Ｆｉｓ１阻害ペプチドが、（ｂ）担体ペプチドやタグペプチド又は細胞結合ペプチドをコード化するアミノ酸配列又は担体に連結している（ａ）配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を含む、又はそれからなる。本出願では、「Ｆｉｓ１の阻害ペプチド」及び「Ｆｉｓ１阻害ペプチド」という用語を、細胞内でＦｉｓ１の活性を阻害できるペプチドを指す同義語として用いる。

１実施形態では、ミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）活性阻害ペプチドが、（ａ）配列番号１、１６～２１のアミノ酸配列又は配列番号１、１６～２１に対して少なくとも８０％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列である、又はそれを含む、若しくはそれからなる。別の実施形態では、Ｆｉｓ１の阻害ペプチドが、（ｂ）担体ペプチドやタグペプチド又は細胞結合ペプチドをコード化するアミノ酸配列又は担体に連結している（ａ）配列番号１、１６～２１、２６又は２９のアミノ酸配列、又は配列番号１、１６～２１、２６又は２９に対して少なくとも８０％の配列同一性を又は少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を含む、又はそれからなる。

別の実施形態では、図２０に示す変異ペプチド分析に基づき、ミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）活性阻害ペプチドが、（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列であるか、又はそれを含む、若しくはそれから構成されてなり、該アミノ酸配列における１つ又は複数のＸが任意のアミノ酸（例：アラニンやグリシンなど）又はそれに対応する配列番号１からのアミノ酸であることを特徴とする。別の実施形態では、該阻害剤ペプチドが、配列番号３０を含む、又はそれから構成されてなり、該配列番号３０における２つ以上のＸが任意のアミノ酸である、或いは、３つ以上のＸが任意のアミノ酸である、或いは、４つ以上のＸが任意のアミノ酸である、或いは、５つ以上のＸが任意のアミノ酸である、或いは、６つ以上のＸが任意のアミノ酸である、或いは、７つ又は８つのＸが任意のアミノ酸であることを特徴とする。

別の実施形態では、該阻害ペプチドが、（ｂ）担体ペプチドやタグペプチド又は細胞結合ペプチドをコード化するアミノ酸配列（例：配列番号３２）又は担体に連結している（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む、又はそれからなる。

本出願では、「Ｆｉｓ１の阻害ペプチド」及び「Ｆｉｓ１阻害ペプチド」という用語を、細胞内でＦｉｓ１の活性を阻害できるペプチドを指す同義語として用いる。

Ｆｉｓ１の阻害ペプチドは、該阻害ペプチドに連結した担体又は担体ペプチド、タグペプチド又は細胞結合ペプチドを更に含む。適切な担体ペプチド、タグペプチド、又は細胞結合ペプチドとしては、当技術分野で周知・納得されているものを用いることができる。１実施形態において、担体ペプチドは細胞透過性ペプチドである。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ：Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）とは、細胞膜を通り抜けて細胞の内部に到達するペプチドのことである。適切な担体ペプチドの例としては、には、例えば配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を持ち細胞内に浸透できる配列を持つＴＡＴが挙げられる。その他の適切なＣＰＰとしては、当技術分野で周知のものを使用でき、その例としては、ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、Ｒ８、トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）、エキセントリー（Ｘｅｎｔｒｙ）などが挙げられる。（例として、Ｐａｔｅｌ，Ｓ．Ｇ．，Ｓａｙｅｒｓ，Ｅ．Ｊ．，Ｈｅ，Ｌ． ｅｔ ａｌ． ゛Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ″．ＳＣＩ Ｒｅｐ ９、６２９８（２０１９）／／ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－４２４５６－８
を参照のこと、また参照により本出願に援用する）。他の適切な担体としては、当技術分野で周知のものを使用できる。他の担体の例としては、ポリマー複合体、ポリマーナノ粒子、脂質ベースの担体、デンドリマー、カーボンナノチューブ、金ナノ粒子などのナノ担体が含まれるが、これらに限定されない。脂質ベースの担体は、リポソームとミセルの両方を含む。該担体は、共有結合的又は非共有結合的のいずれかによっても連結し得る。一部の実施形態において、ペプチドは担体と共役結合し得る。

一部の実施形態において、本開示に係るペプチドは更に外因性のタグ又は作用物質を含む。本開示で用いられる「タグ」又は「作用物質」という用語は、本発明のペプチドの精製・同定・検出又は治療的使用を可能にする如何なる有用な部分を含む。本発明では、阻害ペプチドの機能性を妨げないものであれは、如何なるタグ又は作用物質を使用できる。適切なタグは、当技術分野で周知のものであり得るが、それに限らず、親和性タグやエピトープタグ（例：ｃＭｙｃ、ＨＩＳ、ＦＬＡＧ、Ｖ５－ｔａｇ、ＨＡ－ｔａｇ、ＮＥ－ｔａｇ、Ｓ－ｔａｇ、Ｔｙ－ｔａｇなど）及び蛍光タグ（ＲＦＰ、ＧＦＰなど）を使用できる。エピトープタグは、一般的に「精製タグ」、すなわち、ポリペプチドの、他の非特異蛋白やペプチドからの単離を容易にするタグとして使用される。

一部の実施形態では、担体ペプチド又はタグがポリペプチドであり、阻害ペプチドとタグが１つの核酸配列にコード化されて同時に翻訳される。一部の実施形態では、タグを切断可能であり、ペプチドの産生・精製後に取り除くことができる。

一部の実施形態では、阻害ペプチドと担体ペプチド又はタグが、リンカー配列を介して連結されている。適切なペプチドリンカーは、３～１０個のアミノ酸又は３～２５個のアミノ酸のポリペプチドからなり得る。一部の実施形態では、ペプチドリンカーが、セリンとグリシンから選択されるアミノ酸配列（例えばＧＳＧＳＧＳ（配列番号４）など）を持つポリペプチドからなり得る。他の適切なリンカーとしては、当業者が納得し得るものを用いることができ、例えば、ＳＧＳＧ（配列番号１１）、Ｇ_ｎ（ｎは１から１０までの整数）、（ＳＧＳＧ）_ｎ（ｎは１から１０までの整数、配列番号１１）、ＧＳＧＳ（配列番号１２）、ＳＳＳＳ（配列番号１３）、ＧＧＧＳ（配列番号１４）、ＧＧＣ、ＧＧＳ、（ＧＧＣ）_８）、（Ｇ_４Ｓ）_３、及び ＧＧＡＡＹ（配列番号１５）などが挙げられる。ペプチドリンカーはプロテアーゼによって切断可能となり得る。一部の実施形態では、ペプチドリンカーが、配列番号４のアミノ酸配列を持つポリペプチドからなる。本出願では、その他当技術分野で周知の適切なリンカーを使用することが企図される。

１実施形態において、Ｆｉｓ１阻害ペプチドは、配列番号３（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＧＳＧＳＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ）又は配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を持つペプチドからなり得る。実施例に示されているように、この阻害ペプチドは生体内でＦｉｓ１活性を阻害することができる。

別の実施形態では、Ｆｉｓ１阻害ペプチドが、配列番号３１（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＸＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ）又は配列番号３１と少なくとも８０％の配列類似性又は少なくとも９０％の配列同一性を持つペプチドからなり、Ｘは本開示に係るリンカである。別の実施形態では、ＦＩｓ１阻害ペプチドが、配列番号３２又は配列番号３２と少なくとも８０％の配列類似性又は少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を含み、Ｘは、その少なくとも１つが任意のアミノ酸（例：アラニンなど）であり、Ｙは、本開示に係るリンカである（表２を参照）。一部の実施形態では、配列番号３２が、該配列内の任意のアミノ酸（アラニンなど）から選択される２つ以上のアミノ酸、或いは同配列内の任意のアミノ酸（アラニンなど）から選択される３つ以上、又は４つ以上、若しくは５つ以上のアミノ酸を含むＸを持つと企図される、或いは６つ以上のＸが、配列番号３２内の任意のアミノ酸（アラニンなど）から選択されるアミノ酸である、或いは７つ又は８つのＸが、配列番号３２内の任意のアミノ酸（アラニンなど）から選択されるアミノ酸であるとも企図される。Ｙは、本開示に係るリンカーであり、例えば配列番号４、１１～１５などである。つまり、配列番号３２は配列番号２－リンカ－配列番号３０であり、配列番号３１は配列番号２－リンカ－配列番号１である。リンカーは、本開示に係る如何なるリンカーであり得る。

本開示で用いられる「蛋白質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」という用語は、α－アミノ基と隣接残基のカルボキシ基との間のペプチド結合によって相互に接続される一連のアミノ酸残基を指す同義語として用いられる。「蛋白質」や「ポリペプチド」という用語は比較的大きなポリペプチドを指す場合が多く、「ペプチド」という用語は小さなポリペプチドを指す場合が多いが、当技術分野ではこれらの用語の意味が重なり合っている。「蛋白質」には修飾アミノ酸（リン酸化、糖化、グリコシル化アミノ酸など）やアミノ酸類似体が含まれる場合がある。

阻害ペプチドは、タグや担体ペプチドに直接連結、間接的に連結、又は共役結合しているものであり得る。本開示で用いる「共役結合」という用語は、２つのものが共有結合により接合することを指す。その際、２つのものを直接共有結合することも、標準的な合成カップリング法で各基を連結することによって共有結合することも可能である。例えば、２つのポリペプチドを同時に発現させることで連結させて、融合蛋白又はキメラ蛋白を形成し得る。１つ又は複数のアミノ酸をポリペプチドに挿入し（すなわち、対応する核酸配列をベクターに取り込むことにより）連結基として機能させることも可能である。例えば、一部の実施形態では、ポリセリンとポリグリシンリンカが阻害ペプチド配列とタグ又は担体ペプチドとの間に含まれる。その他に考えられる連結基としては、カルボン酸又はアミノ基を銘々有するアミノ酸側鎖を持つポリペプチドとのアミドカップリングを可能にすることを目的として末端をアミノ基又はカルボン酸基に置換したポリエチレングリコール又は炭化水素が挙げられる。或いは、アミノ基やカルボン酸基をアジド基やアルキン基などの他の結合パートナーを用いて該置換を行い、銅触媒下でトリアゾールを形成することもできる。

また、本開示は、本開示に係る阻害性Ｆｉｓ１ペプチドをコード化するポリヌクレオチドも提供する。本出願では、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸配列」という用語を、ヌクレオチド配列又はその断片を意味する同義語として使用する。これらの語句は、ゲノム起源又は天然起源又は合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡを指し、単鎖又は二本鎖の分子、並びにかかる分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖を含む。１実施形態では、ポリヌクレオチドが、異種プロモータ配列と、配列番号１（ＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ）又は配列番号１６～２１、２６又は２９、或いは配列番号１６～２１、２６又は２９に対して少なくとも８０％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列のペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドが、異種プロモータ配列と、担体又はタグペプチド（例えば、配列番号３、３１又は３２又は配列番号３、３１又は３２と少なくとも８０％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列）に連結した配列番号１のペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む。

１実施形態では、ポリヌクレオチドが、異種プロモータ配列と、配列番号１（ＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ）又は配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列のペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドが、異種プロモータ配列と、担体又はタグペプチド（例えば、配列番号３又は配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列）に連結した配列番号１のペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む。

上記及び本出願全体に用いられている「配列同一性」という用語については、「少なくとも８０％の配列同一性」とい表現が用いられている場合、約８０％の如何なる配列同一性（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性）を含むものとする。同様に、「少なくとも９０％の配列同一性」とい表現が用いられている場合は、特定の配列番号に対する約９０％以上の配列同一性（例えば、９１％、９２％、９３％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性）を含むものとする。

一部の実施形態において、ポリヌクレオチドはベクターである。一部の実施形態では、ベクターによって、本開示に係る阻害ペプチドを発現することができ、このベクターは、本開示に係る阻害性Ｆｉｓ１ペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列に操作可能に接続された異種プロモータを含む。 このベクターは、異種バックボーン配列を更に含み得る。本発明での使用に適したベクターは、本発明に係る阻害ペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列に操作可能に接続されたプロモータを含む。ベクターは宿主細胞における翻訳制御を可能にする適切な制御配列も含み得る。一部の実施形態では、ベクターが、１つ又は複数の担体ペプチド又はタグの核酸配列を更に含む。一部の実施形態では、ベクターが、シグナル配列などの別の制御配列を更に含む。

本開示で用いられる「ベクター」という用語は、連結先である他の核酸を伝播する機能を有する核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクターと、導入先の宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターが含まれる。特定のベクターは、それらが操作可能に連結している核酸の発現を仕向ける機能を有する。本出願においては、このようなベクターを、「発現ベクター」（又は単に「ベクター」）と呼ぶ。ベクターという用語は、最も一般的に使用されるベクター形式である「プラスミド」を含む。プラスミドは円形の二本鎖ＤＮＡループであり、更に別のＤＮＡ断片（例えば阻害性Ｆｉｓ１ペプチドをコード化するもの）をライゲーション（結紮）し得る。しかしながら、ウイルスベクターのような他の形態の発現ベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス及びアデナ関連ウイルス）も本発明で使用し得る。特定のベクター（例えば、細菌起源の複製を伴う細菌ベクターと哺乳類のエピソームベクターなど）は、導入先の宿主細胞において自己複製する機能を有する。他のベクターは、宿主細胞への導入時に該宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって該宿主ゲノムと共に複製される。１実施形態では、ベクターが、ウイルス機構を利用して宿主細胞で発現するペプチドを運ぶウイルスベクターを含む。

一部の実施形態において、本発明のベクターは異種バックボーン配列を更に含む。本開示で用いられている「異種核酸配列」という用語は、ヒト以外の核酸配列、例えば、ヒトには生来見られない細菌、ウイルスその他ヒト以外の核酸配列などを指す。ベクターの伝播、且つ又はコード化されたペプチドの発現には、異種バックボーン配列が必要となる場合がある。一般的に用いられる発現ベクター及びプラスミドの多くは、ＣＭＶプロモータなど、ヒト以外の核酸配列を含有している。

本発明の実施に適したプロモータとしては、構造性プロモータ、誘発型プロモータ、時間的に制御されるプロモータ、発生的に制御されるプロモータ、化学的に制御されるプロモータ、物理的に制御される（例：光又は温度によって制御される）プロモータ、組織優先的プロモータ、及び組織特異的プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロモータとして「異種プロモータ」というものを挙げているが、これは操作可能なポリヌクレオチドと自然に関連付けられないプロモータを指す用語である。哺乳類細胞における典型的なプロモータには、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）や、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＳＶ４０ウイルスなどのプロモータや、翻訳伸長因子ＥＦ－ｌαプロモータ、ユビキチンプロモーターなどがある。これ以外にも幅広い多くのプロモータを、様々な細胞の種類に応じて使用できることは、当業者であれば熟知しているはずである。

蛋白質及び核酸配列の同定は、当技術分野で周知の局所配列検索基本ツール（ＢＬＡＳＴ：Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて評価する（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ２２６７－２２６８； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９－３４０２）。ＢＬＡＳＴプログラムは、照会するアミノ酸又は核酸配列と試験する配列（蛋白質又は核酸配列データベースから得ることが好ましい）との間で類似度スコアの高い断片（本出願では「高得点セグメントペア」と呼ぶ）を同定することによって相同配列を同定する。高得点セグメントペアの統計的有意性については、統計的有意性の公式（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０）を用いて評価することが好ましい。前記統計的有意性の公式の開示はその全体を参照により本願に援用する。ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際、デフォルトのパラメータ、又はユーザが提供する改良パラメータを使用できる。

「配列同一性の割合（％）」又は「類似率（％）」は、比較用画面に最適に整列させた２本の配列を比較することによって決定される。その際、比較用画面内で２本の配列を最適に整列できるように、ポリヌクレオチド又はペプチド配列の画面表示される部分には、参照配列（追加・削除などの変更なし）と照らし合わせた場合に追加又は削除された箇所が存在し得る（すなわち、参照配列との格差が見られる場合がある）。上記割合（％）を計算する方法としては、両配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が発生する部位の数を判断し、一致する部位の数を求め、該一致する部位の数を比較用画面内の全ての部位の数で割り、その計算結果に１００を掛けて、配列同一性の割合（％）を算出する方法を用いる。

「実質的な同一性」又は「実質的な類似性」という用語は、ポリヌクレオチド又はペプチドが少なくとも７５％の配列同一性を持つ配列を含むことを意味する。つまり、同一率は７５％～１００％の任意の整数値であり得る。より好ましい実施形態では、本出願に記載のプログラムを用いて（好ましくは、上記のようにＢＬＡＳＴに標準パラメータを用いて）参照配列と比較した場合の同一率として、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が含まれる。これらの値を適切に調節することで、コドン縮退や、アミノ酸の類似性、読取枠の位置などを考慮ながら、２つのヌクレオチド配列によりコード化した蛋白質のうち、対応するもの同士の同一性を決定することが可能になる。

本発明においては、アミノ酸配列の「実質的な同一性」とは、通常、ポリペプチド配列の同一性が少なくとも７５％であることを意味する。ポリペプチドの同一率は、７５％から１００％の任意の整数であることが好ましい。より好ましい実施形態では、上記同一率として、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．７％、９９％が含まれる。

また、本開示は、阻害性Ｆｉｓ１ペプチドと薬学的に許容可能な担体を含む組成物も提供する。選択した投薬経路と標準的な薬務に基づいて、薬学的に許容可能な担体を選択すべきである。該組成物は、医薬品の分野における標準的な慣行に従って剤形に処方し得る（Ａｌｐｈｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．，（１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａを参照）。適切な剤形としては、例えば、液剤、非経口液剤、又は懸濁液を含み得る。一部の実施形態において、該組成物は本開示に係る単離及び精製されたＦｉｓ１阻害ペプチドを含む。他の実施形態において、該組成物は、本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドをコード化する核酸配列を含む単離及び精製されたポリペプチド又はベクターを含む。

別の態様として、本開示は、本開示に係るベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明では、ベクターによってコード化されたペプチドの発現を可能にするものであれば、如何なる宿主細胞を使用し得る。一般的な宿主細胞の例としては、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌など）や酵母菌（例えば、出芽酵母など）や真核細胞株が挙げられる。有利な点として、昆虫又は哺乳類の細胞株を用いてヒトと同様のｍＲＮＡスプライシングを行うことができる。多くの発現系及び細胞株（市販されているものの多くを含む）を用いて本発明のペプチドを発現し得ることは、当業者であれば承知されよう。

［方法］
本開示は、本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを用いた血管機能不全の治療方法を提供する。該方法は、血管機能不全を治療するために本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量投与することを含む。一部の実施形態において、血管機能不全は２型糖尿病に関連する。本開示は、一部の実施形態において、２型糖尿病に関連する血管合併症を治療する方法を提供する。該方法は、２型糖尿病に関連する１種類又は複数種の血管合併症を軽減するために、本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量投与することを含む。

更に、本開示は、血管拡張能障害の治療を必要とする被検体において血管拡張障害の好転を図る方法であり、被検体における血管拡張機能の回復を目的として本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、被検体は２型糖尿病罹患者である。更に、ヒト抵抗動脈において、２型糖尿病に関連し高グルコースにより誘発された内皮細胞依存性血管拡張障害を抱え持つ被検体を対象とする場合もある。この障害は１酸化窒素合成酵素依存性のものであり得る。

本開示は、別の実施形態において、ヒト微小血管内皮細胞における酸化窒素（ＮＯ）の生体利用効率を高める方法であり、ヒト内皮細胞におけるＮＯ生体利用効率の向上を目的として本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、内皮細胞が血管機能不全を抱え持つ被検体の生体内内皮細胞である。

本開示は、別の実施形態において、糖尿病により誘発された内皮組織の細胞傷害を予防する方法であり、本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドの有効量を投与することを含む方法を提供する。過剰なミトコンドリア核分裂が糖尿病症例における内皮組織機能障害に関与していると考えられており、Ｆｉｓ１を減少させることで糖尿病誘発性の細胞傷害を防ぐことができる。

本開示は、更に別の実施形態において、ミトコンドリア核分裂を要すると判明しているＲＡＳ媒介性癌の治療方法を提供する。該方法は、本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量投与することを含む。特定の理論に縛られることを望むものではないが、ミトコンドリア核分裂を遮断する能力を与えることによって癌の進行を阻止できる可能性があるので、Ｆｉｓ１阻害剤が癌の進行を抑制するのに有効な作用を発揮し得る、と考えられる。

別の実施形態では、Ｆｉｓ１阻害ペプチドを神経変性疾患の治療に使用し得る。該方法は、神経変性疾患を治療するために本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量投与することを含む。

本実施形態のＦｉｓ１阻害ペプチドは、幾つもの理由からＤｒｐよりも好ましい標的であると考えられている。まず、標的がＤｒｐ１である場合、Ｄｒｐ１は、胚致死性であるとともに、核分裂において膜変形・切断などを担う唯一の力学的酵素であり、癌以外の場合には適した標的とは言えない。Ｆｉｓ１ノックアウトも胚致死性であるが、ストレス状態でのみ誘発されるため、Ｄｒｐ１よりも好ましい標的であると考えられている。

過剰なミトコンドリア核分裂は、糖尿病症例［Ｓｈｅｎｏｕｄａ， Ｓ． Ｍ．， Ｗｉｄｌａｎｓｋｙ， Ｍ． Ｅ．， Ｃｈｅｎ， Ｋ．， Ｘｕ， Ｇ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ， Ｍ．， Ｔａｂｉｔ， Ｃ． Ｅ．， ．．． ＆ Ｖｉｔａ， Ｊ． Ａ．（２０１１）ａｎｄ Ｋｉｚｈａｋｅｋｕｔｔｕ ．．．Ｗｉｄｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ（２０１２）］及び急性肺機能不全症例における内皮組織機能障害に関係があるとされている。Ｆｉｓ１を標的とすることで、糖尿病患者の血管系損傷を防ぐ際に、Ｆｉｓ１－Ｄｒｐ１軸に焦点を置いた新規薬理学的アプローチをとることが可能になる。前述のように、Ｄｒｐ１のペプチド阻害剤を介してＦｉｓ１／Ｄｒｐ１軸を標的とすることは、心筋症だけでなく神経変性疾患の症例において効果を示す多くの所見が得られている。

更に、本開示は、内皮機能不全を治療するための方法であり、内皮機能不全を治療するために本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量投与することを含む方法を提供する。１実施形態では、内皮機能不全にアテローム性動脈硬化症が含まれる。別の実施形態において、内皮機能不全は、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、冠状動脈疾患、腎血管性疾患、及び末梢動脈疾患のうちのいずれかの疾患と関連している。

「有効量」又は「治療的有効量」という用語は、有益な又は望ましい生物学的且つ又は臨床的結果をもたらし得る十分な量を指す。例えば、本願発明によるペプチドの治療的に有効な量を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて組成物を形成し得る。該組成物は、当技術分野で認識されている如何なる様態で投与し得る。かかる方法で使用する用量、投与方法、及び薬学的に許容可能である適切な担体と希釈剤及び賦形剤は、当技術分野に精通した者であれば容易に判断できるが、目前の所定の状況により異なる。

例えば動物実験や臨床試験の結果に基づいて、患者の体重、吸収率、半減期、疾患の重症度などを考慮しながら推定することで適切な投与量を判断し得る。投与回数と治療の過程は個人によって異なり得る。自己免疫疾患の発症又は進行を予防することを目的とした一部の実施形態では、追加投与によるブースター効果を要し得る。ブースター投与の適切な日程については、当技術分野に精通した者であれば容易に判断し得る。例えば、当該ペプチド又はベクターを、毎月、隔月、又は４ヶ月毎、６ヶ月毎、或いは年に１回、２年に１回、若しくはその間の任意の時間間隔で投与し得る。

該組成物の剤形は、単位用量剤型であることが好ましい。かかる剤形の場合、調製物を、適切な量の活性成分を含有するべく単位用量に分ける。調製物を包装したものや、錠剤・カプセルを小分けして包含させたパックや、粉末を包含させたバイアルやアンプルなど、調整剤を個々に適した数量包含した包装を単位用量剤型とし得る。更に、カプセルや錠剤、カシェー剤（オブラートカプセルなど）又はトローチ剤自体を単位用量剤型とし得るし、或いは、これらのいずれかを適切な数包装したものを単位用量剤型とし得る。

本開示で用いられている「被検体」又は「患者」という用語は、哺乳類と非哺乳類の両方を指す。「哺乳類」には、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、チンパンジーなどの類人猿やサルなど）、農用動物（例えば、牛、馬、羊、山羊、豚など）、愛玩動物（ウサギ、犬、猫など）、実験動物（ラット、マウス、モルモットなど）といった哺乳綱に属する如何なる動物を含む。非哺乳類の例には、鳥類が含まれるが、これに限定されない。「被検体」という用語は、特定の年齢や性別を示すものではない。１実施形態では、被検体をヒトとする。特定の実施形態において、ヒトとは、血管疾患又は血管機能不全を患うヒト、又は血管機能不全に関連する疾患（２型糖尿病など）を患うヒトである。

本開示で用いられている「投与する」及び「投与」という用語は、本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを含む医薬品製剤又は組成物を被検体に提供する如何なる方法を指す。かかる方法は、当業者に周知のものであり、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、膣内投与、眼球投与、耳内投与、脳内投与、直腸投与、舌下投与、口腔投与、並びに静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、髄腔内投与及び皮下投与などの注射剤を含む非経口投与を含むが、必ずしもこれらに限定されない。継続投与又は間欠投与を行うことができる。様々な態様において、製剤を治療的に投与可能、つまり既存の疾患や病態を治療するために投与可能である。

当該ペプチド又はベクターを投与し易くするために、当技術分野で周知の薬学的に許容可能な適切な担体と混合し得る。「薬学的に許容可能」という用語は、規制機関（例えば、連邦政府や州政府の機関など）により、被検体への投与が承認された組成物を指す。「担体」という用語は、医薬組成物を投与できる状態にするための希釈剤、賦形剤、又は媒介物を指し得る。薬学的に許容可能な担体としては、当技術分野で周知のものを使用でき、希釈剤や防腐剤、可溶化剤、乳化剤、リポソーム、ナノ粒子などを含むが、必ずしもこれらに限定されない。適切な医薬品担体の例がＥ．Ｗ．マーティン著の『レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）』に記載されている。更に、かかる薬学的に許容可能な担体は、水性又は非水性溶媒中の溶液、懸濁液、及び乳濁液であり得る。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な水性溶媒担体としては、等張溶液、アルコール／水溶液、乳濁液又は懸濁液（生理食塩水及び緩衝液を含む）が含まれる。かかる担体の例としては、水、油（植物油など）、エタノール、生理食塩水（リン酸緩衝食塩水、塩化ナトリウム水溶液など）、ブドウ糖水溶液（含水グルコース）及び関連する糖溶液、グリセリン、又はプロピレングリコールやポリエチレングリコールなどのグリコールが挙げられるが、これらに限定されない。分解防止剤や抗酸化剤、防腐剤を添加してもよい。適切な抗酸化剤としては、亜硫酸、アスコルビン酸、クエン酸及びその塩、並びにエチレンジアミン四酢酸ナトリウムが挙げられる。適切な防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチルパラベン又はプロピルパラベン、及びクロルブタノールが挙げられる。非経口投与のための組成物は、水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液又は乳濁液の形をとり得る。該組成物には、生理学的条件を近似するために必要な場合、ｐＨ調整・緩衝剤や毒性調整剤（酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）のような薬学的に許容可能な物質を更に含有し得る。

ペプチドの活性を維持する従来から周知の滅菌技術によって該組成物を滅菌することも可能である。投与方法に応じて処方を選ぶ必要がある。緩衝液としては、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸；アスコルビン酸をはじめとする抗酸化物質；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどの蛋白質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；且つ又はＴＷＥＥＮ（登録商標）ブランドの界面活性剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）界面活性剤などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。薬学的に許容可能な担体としては、０．０１～０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液、又は０．９％生理食塩水が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。他の適切且つ薬学的に許容可能な担体も企図される。

本発明において、「治療する」又は「治療」とは、疾患・病態又は障害と闘う目的で被検体の管理とケアを行うことを言い表す言葉である。治療には、症状又は合併症の発症を削減・抑制又は予防するため、症状又は合併症を軽減又は緩和するため、又は疾患・病態又は障害を排除するために、本発明のペプチドを投与することが含まれる。好ましい１実施形態において、この疾患は血管機能不全である。特定の１実施形態において、この疾患は血管機能不全を伴う２型糖尿病である。

［キット］
前者の方法に関して説明した開示の態様は、文脈上別段の定めがある場合を除き、後者の方法及びキットに適用可能であり、その逆もまた同様である。

本開示に係る方法を実施するために適切なキットも含まれている。本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチド、又はそのＦｉｓ１変異ペプチドを含む組成物、及び使用説明書をキット化したものを含み得る。別の実施形態において、該キットは、本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドをコード化する核酸配列、又は製造・精製のためにＦｉｓ１阻害ペプチドを産生できる細胞を含み得る。製造・精製又は使用に関する説明書もキットに含み得る。該キットは、本開示に係るＦｉｓ１阻害ペプチドを含む医薬組成物を更に含み得る。

すでに説明したもの以外にも、本発明の進歩性ある概念を逸脱することなく様々な変更を加え得ることは当事者にとって明らかなはずである。本開示を解釈する際には、文脈と一致する可能な限り広い範囲で全ての用語を解釈するべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語、またその語形の変形は、要素・構成部分又は工程について非排他的に触れていると解釈すべきであり、したがって、それが触れている要素・構成部分又は工程を、明示的に触れていない他の要素・構成部分又は工程と組み合わせることもできる。特定の要素を「含む」として説明した実施形態は、当該の要素「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とも、当該の要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とも企図される。「～から本質的になる」及び「～からなる」という表現は、米国特許審査便覧及び関連する連邦巡回控訴裁判所の解釈に沿って解釈するべきである。「～から本質的になる」という移行句は、特許請求された発明の特定の材料又は工程「及び基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼさないそれら」に、特許請求の範囲を限定する。「～からなる」とは、特許請求の範囲で指定されていない要素・工程又は成分を除外する閉鎖用語である。例えば、「～からなる」配列に関しては、配列番号で列挙された配列を指し、その一部としてその配列番号を含み得るより大きな配列を指す。

本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献については、その全体を参照により本願に援用する。矛盾が発生した場合は、本明細書が、各定義も含め、優先される。

本発明の他の特徴及び利点は、本発明の好ましい実施形態の説明及び特許請求の範囲から明らかである。別段の定めがない限り、本開示で用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されているものと同じ意味を持つものとする。本発明の実施又は試験には、本開示に係る方法及び材料と類似又は同等の方法及び材料を使用することができるが、よりふさわしい方法と材料は以下のとおりである。また、当該の材料と方法及び実施例は、あくまでも例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

［実施例１］
新規ペプチドＰｅｐ２１３によるＦｉｓ１の阻害又は分子抑制によって、ヒト抵抗動脈における糖尿病誘発性及び高グルコース誘発性の内皮機能不全の好転を図る。

２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）患者においては、大血管疾患や微小血管疾患が発病する以前に血管内皮機能障害が認められる。新たに得られたデータでは、ミトコンドリアの形態と機能の異常がＴ２ＤＭ罹患者由来のヒト血管内皮機能不全の発病に関与していることを示唆している^１，２。Ｔ２ＤＭ罹患者由来の内皮細胞内ではミトコンドリアが超酸化物を過剰に産生している。超酸化物の過剰産生は、部分的にはミトコンドリア内膜の分極化によって引き起こされる^２。内皮細胞におけるミトコンドリア反応性酸素種（ｍｔＲＯＳ）の過剰産生は深刻な後成的変化を引き起こすとともに細胞シグナル伝達経路を活性化し、それが内皮炎症や血管機能不全につながる^３。前記の如く、Ｔ２ＤＭ罹患者由来のヒト抵抗細動脈において、ミトコンドリアを標的とした抗酸化物質や薬理作用物質を投薬してミトコンドリア内膜を部分的に脱分極すると、内皮細胞依存性血管拡張能障害の好転を図れる^２，４。

残念ながら、血管疾患の予防と治療を目的とした抗酸化療法の第ＩＩＩ相臨床試験では、別途実施した小規模な生理学的試験且つ又は非ランダム化試験で見られるプラスの効果を検証できず、また、ミトコンドリア内膜を標的にして薬理作用を奏する既存の作用物質は、臨床使用を妨げる毒性プロファイルを有する^７。

（１）２型糖尿病罹患者から採取したヒト内皮細胞におけるミトコンドリア核分裂１蛋白質（Ｆｉｓ１）の発現増加と、（２）Ｆｉｓ１又はダイナミン関連蛋白質１（Ｆｉｓ１と結合してミトコンドリア核分裂を誘発し得るＤｒｐ１）の発現の分子ノックダウンによる、高グルコース誘発性のミトコンドリア超酸化物産生増加及び内皮細胞由来の１酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）のＳｅｒ１１７７活性化部位におけるリン酸化能減弱の阻止と、（３）ヒト抵抗細動脈において、Ｄｒｐ１を薬理的・分子的にノックダウンすることで、低グルコース誘発性の内皮機能不全を好転できること、とを実証した先行研究に基づき、ミトコンドリア核分裂に関与する蛋白質を標的とすることが有望な代替手段として期待されている^１，８。Ｆｉｓ１は、そのミトコンドリアの動態における役割から、薬理的標的として特に注目されており、低酸素血症や高血糖症などの病理学的刺激手段として最も活躍すると考えられている^９－１２。

本実施例において、本発明者らは、Ｆｉｓ１発現のノックダウンが、２型糖尿病患者から採取した抵抗血管と高・低グルコース濃度に急性曝露した健常な個人から採取した血管において、内皮細胞依存性血管拡張及び１酸化窒素（ＮＯ）産生を好転できるかどうかを調べる試験を実施した。更に、本発明者らは、高グルコース又は低グルコース状態での内皮細胞関門機能や酸素消費及び解糖に対するＦｉｓ１ノックダウンの影響も調べた。最後に、本発明者らは、Ｆｉｓ１に結合してＦｉｓ－１媒介性の核分裂を阻止する新規ペプチド（ｐｅｐ２１３（配列番号１））を設計して試験を行い、Ｔ２ＤＭ罹患者由来のヒト抵抗小動脈と高グルコース濃度に曝露した健常なヒト血管の内皮細胞依存性血管拡張に好ましく作用することを実証した。結果として、Ｆｉｓ１を薬理学的標的とすることで、Ｔ２ＤＭにおける血管疾患の課題に対する有用な治療手段を提供できることを支持する所見が得られた。

［結果のまとめ］
Ｆｉｓ１をノックダウンすることで、Ｔ２ＤＭ動脈における内皮細胞依存性血管拡張が改善され（Ｐ＝０．００２）、健常血管においてはＨＧ誘発性の内皮細胞依存性血管拡張（Ｐ＝０．０００８）とＬＧ誘発性の血管拡張を阻害した（Ｐ＝０．０００２）。Ｆｉｓ１のノックダウンにより、ＮＯの生体利用効率を維持でき、ＨＧ又はＬＧに曝露した細胞の内皮層の統合性が改善された（Ｐ＜０．００１）。Ｆｉｓ１のノックダウンは、他のミトコンドリア動態や自食作用関連蛋白質（オートファジー蛋白質）の発現には有意な影響を及ぼさず、内皮細胞の代謝には全く影響を及ぼさなかった。ｐｅｐ２１３はＦｉｓ１に対して低いマイクロモル親和性（３．３－７μＭ）を示した。ｔａｔ配列連結型ｐｅｐ２１３は、ＨＧに曝露されたＴ２ＤＭ及び非Ｔ２ＤＭ血管における内皮細胞依存性血管拡張を改善した。

［方法］
〈被検体の募集と選考〉
前述の心血管系リスク因子を伴わない健常な個人とＴ２ＤＭ罹患者を６７名（２１～７５歳）募集した^２，１３。Ｔ２ＤＭ罹患者は、Ｔ２ＤＭの治療を目的として薬剤を服用していた者、又は米国糖尿病協会によるＴ２ＤＭ診断基準を満たした者である^１４。ウィスコンシン医科大学の治験審査委員会が治験方法を審査した後、全被検体が書面によるインフォームドコンセントフォームに署名した上で治験活動を進めた。スクリーニングを行って、全ての被検体が治験選択基準を満たしていることを確認した。全被検体の身長と体重を測定し、心拍数と血圧についてはそれぞれ３回測定した。Ｔ２ＤＭの有無にかかわらず、アテローム性動脈硬化症（冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳卒中又は心筋梗塞の既往）、慢性肝疾患、血漿クレアチニン上昇（男性では＞１．５ｍｇ／ｄＬ、女性では＞１．４ｍｇ／ｄＬ）のいずれかの既往が分かっている者、癌寛解の診断を受けてから１年未満の者、アスピリン以外の抗凝血剤又は抗血小板薬を定期的に服用している者、登録後１年以内に喫煙した者は試験から除外した。Ｔ２ＤＭを抱え持たない者でも、ＬＤＬコレステロール値が≧１６０ｍｇ／ｄｌの者、又は高血圧（血圧≧１４０／９０ｍｍＨｇ）の者、若しくはこれらのいずれかの状態の治療を目的として薬剤を服用していた者も除外した。ｐｅｐ２１３－ｔａｔとスクランブル化した対照ペプチドの内皮細胞依存性血管拡張への影響を比較するための試験に試供した血管（Ｔ２ＤＭ非罹患者Ｎ＝５名、Ｔ２ＤＭ罹患者Ｎ＝４ Ｔ２ＤＭ）は、ウィスコンシン医科大学の治験審査委員会により別途審査・承認済みの治験実施計画書に従って、術時に医療廃棄物として処理された皮下脂肪組織から得たものである。

〈ヒト抵抗動脈の採取〉
以前にも説明したように、ヒト抵抗動脈については、脂肪組織サンプルのうち、臀部脂肪体の上部外側象限部から抵抗動脈を得た^{２，８，１３，１５，１６}。簡潔に説明すると、滅菌及び１％リドカインにより麻酔を行った後、臀部脂肪体の上部外側象限に１～１．５ｃｍの切り込みを入れた。体積約８ｃｍ^３の脂肪組織を鋭的剥離により摘出した。止血後、吸収性真皮深層縫合糸を１～２針縫って創傷を閉じ、表皮層をダーマボンド又はステリストリップを使用して閉じた。

〈細胞培養〉
抗生物質を含まないＭＣＤＢ１３１（ライフテクノロジーズ社、米カリフォルニア州カールスバッド市）に対して１０ｍＭのグルタミン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、米マサチューセッツ州ウォルサム市）と１０％ ＦＢＳ（シグマアルドリッチ社、米ミズーリ州セントルイス市）、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、及び１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン（シグマ－アルドリッチ社）を補足添加して得た培地を用いて、ＡＴＣＣ社（米バージニア州マナサス 市）から購入した不死化ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ－１）を培養した。高グルコース（３３ｍｍ）、正常グルコース（５ｍｍ）、又は低グルコース（２．５ｍｍ）状態に関する検定を行うために、抗生物質を含まないＭＣＤＢ１３１に上記の補足添加を行ってから、グルコースと滅菌ＰＢＳを添加してグルコース濃度を調整した。ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）をロンザ社（スイス連邦バーゼル市）から購入し、それに微小血管内皮細胞成長培地２ブレットキット（ロンザ社）を補足添加した。

［培養内皮細胞とヒト血管のトランスフェクション手順］
〈Ｆｉｓ１とＤｒｐ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブル化対照の培養細胞へのトランスフェクション〉
Ｆｉｓ１及びＤｒｐ１ ｓｉＲＮＡの構造モデル（後述の配列）をオリジーン社（米メリーランド州ロックビル市）から取得した。オプティ－ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ社）内のＲＮＡｉ構造モデル２０ｎＭに、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）媒介物を添加した。得られた混合物を培養培地で希釈し、ＨＭＥＣ‐１細胞と共に４時間培養した後、通常の培養培地に交換した。その後、細胞を２４時間培養してから処理と分析を行った。培養後、処理を施した細胞を高グルコース状態に６時間、低グルコース状態に２時間曝露してから、ＮＯ産生、生体エネルギー合成、蛋白質発現、及び内皮層の統合性を測定した。

〈ヒト抵抗動脈におけるＦｉｓ１とＤｒｐ１ ｓｉＲＮＡ及びスクランブル化対照のトランスフェクション〉
ヒト抵抗動脈にｓｉＲＮＡ構造モデルを前述の如くトランスフェクトした^８，１３。簡潔に説明すると、脂肪組織から剥離した抵抗動脈を、培養ミオグラフチャンバー（２０４ ＣＭ、ＤＭＴ社、米ミシガン州アナーバー市）内で懸濁した。該血管の一端を微小臓器チャンバー内のガラスピペットの上の縫合した。該動脈の第二端をガラスピペットに縫合する前に、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡ、Ｄｒｐ１ ｓｉＲＮＡ（インビトロジェン社のリポフェクタミンＲＮＡｉマックスを使用したオプティＭＥＭ内の２０ｎＭ）、又は対照スクランブル化ｓｉＲＮＡ（２０ｎＭ）を血管内腔にゆっくりと注入した。その後、該血管の未縫合端を別のガラスピペットに縛り付けて、該血管をチャンバー内に吊り下げた状態で、３７ ℃の生理的緩衝液に浸浴させ、６０ｍｍＨｇに加圧した。４～６時間培養後、ｓｉＲＮＡを低せん断速度（□＜５ ｄｙｎ／ｃｍ^２）で２４時間をかけて内腔からゆっくりと洗い流した。

〈内皮細胞依存性血管活性の測定〉
健常者由来の抵抗動脈を、正常グルコース状態（ＮＧ、グルコース値５ｍｍ）、低グルコース（ＬＧ、グルコース値２．５ｍＭ；２時間）、高グルコース（ＨＧ、グルコース値３３ｍＭ；６時間）のいずれかに曝露した。Ｔ２ＤＭ患者由来の血管における全ての試験は５ｍｍグルコース状態で実施された。エンドセリン－１（米シグマ アルドリッチ社）を使って、予め血管を静止直径の約５０％に収縮しておいた。その後、アセチルコリン（Ａｃｈ）の用量を１０^－１０から１０^－５Ｍまで少しずつ増やしながら、収縮した動脈をアセチルコリン（Ａｃｈ）に曝露し、デジタルキャリパゲージとビデオ顕微鏡を用いて血管径の変化を測定した。該用量が１０^－５Ｍに達した後、血管を２００μＭのパパベリンに曝露し、平滑筋の反応性を調べた。３０分間の洗浄期間後、同じ動脈を再び収縮させ、１酸化窒素合成酵素の直接阻害剤であるＬ－ＮＧ－ニトロアルギニンメチルエステル（Ｌ－ＮＡＭＥ、１００μＭ）を用いて３０分間培養してから、１０^－１０～１０^－５ＭのＡｃｈに曝露した後、血管拡張を再測定した。

〈１酸化窒素（ＮＯ）生体利用効率の測定〉
（培養細胞）：蛍光ＮＯマーカーと、４，５－ジアミノフルオレセインジアセテート（ＤＡＦ２－ＤＡ）を用いて、ＨＭＥＣ－１細胞と動脈における１酸化窒素（ＮＯ）の生体利用効率を測定した。暗室内で、Ｌ－ＮＡＭＥ（１００μＭ）を用いて、又はそれを用いずに、細胞を２時間培養し、続いてＤＡＦ２－ＤＡ（５μＭ）を用いて３７℃で１５分間培養した。スペクトラフルーアー プラスプレートリーダー（テカン社、米ノースカロライナ州モリスビル市）を用い、励起波長と発光波長をそれぞれ４８５ｎｍと５３５ｎｍに設定して蛍光強度を測定した。

（ヒト抵抗動脈）：健常な被検体の部分集合から２本の血管を採取した後、４種類の条件で実験を行えるように各血管を半分に切断した。当該の条件としては、Ｌ－ＮＡＭＥへの３０分間曝露を併用して及び併用無しでＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡ又はＤｒｐ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合と、室温でのＬ－ＮＡＭＥへの曝露を併用して及び併用無しでスクランブル化ｓｉＲＮＡ対照をトランスフェクトした場合が含まれる。その後、１０^－５ＭのＡｃｈとＤＡＦ２－ＤＡ（最終濃度５μＭ）を各血管に加え、３７℃で３０分間培養した。次に、当該動脈をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、スライドに載せて、蛍光顕微鏡で撮像した。未処理及び無染色の動脈を蛍光バックグラウンド干渉用の対照として使用した。処理済み血管と対照血管の両方を同じゲイン設定で測定し、その結果をメタモーフ７．８ソフトウェア（ユニバーサルイメージング社、米ペンシルベニア州ウェストチェスター市）で分析した。

〈内皮層の統合性の測定〉
ウェル毎に４０，０００個のヒト微小血管内皮（ＨＭＥＣ－１）細胞を播種し、金電極アレイプレート（アプライドバイオフィジクス社製８Ｗ１０Ｅ＋）上で５０％コンフルエント状態になるまで増殖した。該細胞に、Ｆｉｓ－１ ｓｉＲＮＡ（２０ｎｍ）又はスクランブル化ｓｉＲＮＡ（２０ｎｍ）を予めトランスフェクトしておき、実験当日に、該トランスフェクト化細胞を、異なるグルコース条件で曝露した（高グルコース（３３ｍＭ）状態に６時間、正常グルコース（５ｍＭ）状態に２時間、低グルコース（２．５ｍＭ）状態に２時間曝露）。単分子層の統合性を、６４，０００ Ｈｚ、キャパシタンス１０ｎＦ未満で確認した。次に、電気細胞基質インピーダンスセンシング（ＥＣＩＳ）により該細胞の機能分析を行い、単細胞層にわたっての経上皮／経体皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を、ＥＣＩＳ ＺＴｈｅｔａ装置（アプライドバイオフィジクス社、米ニューヨーク州トロイ市）を用いてリアルタイムで測定した。４，０００ Ｈｚを基準として、１２５ Ｈｚ、２５０ Ｈｚ、５００ Ｈｚ、１，０００ Ｈｚ、２，０００ Ｈｚ、４，０００ Ｈｚ、８，０００ Ｈｚ、１６，０００ Ｈｚ、３２，０００ Ｈｚ、及び６４，０００ Ｈｚの周波数で抵抗を測定した。

〈ミトコンドリアの生体エネルギー測定〉：
ＸＦｅ９６分析装置（シーホース バイオサイエンス社、米マサチューセッツ州ノースビレリカ市）を用いて、酸素消費速度（ＯＣＲ）と細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を測定し、ミトコンドリアの生体エネルギー合成状態を測定した。ウェルを９６個備えるシーホース社製マイクロプレートに４～６時間かけてＨＭＥＣ－１細胞（２０，０００個／ウェル）を播種してから細胞を該プレートに接着させる処理を行った。Ｆｉｓ１を標的としたｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡスクランブル化対照を細胞に予めトランスフェクトしておいた。該培地を吸引して捨て、高グルコース培地に交換して６時間、又は正常グルコース培地に交換して２時間培養した。高グルコース培地、正常グルコース培地、又は低グルコース培地を取り出し、最終グルコース濃度が初期培地濃度と同じになるようにグルコース４５％を６００μＬ、Ｌ－グルタミン（２００ｍＭ）を１．５ ｍＬ、ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）を１．５ ｍＬ添加したＸＦ系培地であるダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ、ｐＨ ７．４０）と交換した。その後、二酸化炭素を使わない培養器において３７ ℃で１時間細胞を培養して、温度とｐＨの較正を行った。ミトコンドリア ストレス試験中に、オリゴマイシンＡ（最終ウェル濃度２．５ μＭ）、ＦＣＣＰ（カルボニルシアニド ４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン、最終ウェル濃度１μＭ）、及びロテノン＆アンチマイシン Ａ（最終ウェル濃度１ μＭ）といった薬物を２５μＬ単位で順次注入した。解糖ストレス試験中には、グルコース（最終ウェル濃度１０ｍｍ）、オリゴマイシンＡ（最終ウェル濃度２．５ μＭ）、及び２－デオキシグルコース（最終ウェル濃度５０ｍｍ）といった薬物を２５μＬ単位で順次注入した。

これらの測定の後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、１：５００に希釈したＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）１．５μｇ／ｍＬで２４時間染色した。細胞の数については、サイテーション５細胞撮像用マルチモードリーダー（バイオテック社、米バーモント州）の自動細胞計測機能を用いてＯＣＲとＥＣＡＲを測定し、その測定値を正規化することで細胞数を得た。

〈ミトコンドリア蛋白質の測定〉
ウェル当たり０．３×１０^６個のＨＭＥＣ－１細胞を６つのウェルプレート上で培養し、ｓｉＦｉｓ１とｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。４～６時間かけてトランスフェクションを行った後、培地を正常細胞培養培地に交換し、一晩培養を続けた。細胞を、ＨＧ（３３ｍＭ）で６時間、ＮＧ（５ｍＭ）又はＬＧ（２．５ｍＭ）で２時間処理した。その後、該プレートを細胞洗浄緩衝液で２回洗浄し、５０μＬのＲＩＰＡ溶解緩衝液（プロテインシンプル社、米カリフォルニア州サンノゼ市）を各ウェルに添加した。該細胞を氷の上でそっと削り取り、標識を付けたチューブに移した。溶解物を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、液体窒素下で瞬間凍結（スナップフリーズ）した後、－８０℃で一晩放置した。細胞ペレットと上清を解凍した後、ボルテックスミキサーを用いて短時間攪拌し、１０，０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。標識を付けたチューブに該上清を移し、ブラッドフォードアッセイで蛋白質濃度を定量化するとともに、ＷＥＳ（プロテインシンプル社）を利用した自動キャピラリー電気泳動装置の免疫検出法により蛋白質発現を評価した。蛋白質の分析と検出には、１２－２３０ｋＤａのＷＥＳ分離モジュールと２５個のキャピラリーカートリッジを用いた。溶解物を０．１倍のサンプル緩衝液中で、サンプルがマスター経口混合物に対して４：１となるように希釈し、９５℃で５分間変性した。免疫検出のために、ブロッキング緩衝液、一次抗体、二次抗体、化学発光基質、サンプル、ビオチン化サイズマーカー、洗浄緩衝液を、付属のマイクロプレート上の指定ウェルに仕込んだ。該プレートを１０００Ｘｇで５分間遠心分離してからＷＥＳに仕込んだ。蛋白質の検出にはデフォルトの分離パラメータを使用した。プロテインシンプル社のソフトウェア「コンパス フォー ＳＷ」（バージョン３．１．７）によってデータを解析し、特異的な抗体ピークを積分した。全サンプルをまたいで蛋白質の発現を正規化することで総蛋白量を得た。ビオチン系の蛋白質標識を用いてＷＥＳアッセイを追加で行って総蛋白量を分析した。また、コンパス フォー ＳＷを用いて総蛋白質を抗体ピークの積分として分析した。プレート間の信号強度の変動性を補正するために、プレート間における対照サンプルのキャリーオーバーを使用した。総蛋白質に対するサンプルの抗体ピーク積分の商の平均を求めた。

〈ＮＭＲ滴定実験〉
Ｆｉｓ１に対するペプチド結合親和性を求めるために、ＮＭＲ滴定実験を薬剤フラグメント滴定と同様に行った。｛エグナー、２０１８ ＃１０１２６｝ まず、ペプチドをＦｉｓ１透析緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％ｖ／ｖのアジ化ナトリウム）において再懸濁し、最終濃度を６ｍＭとした。次に、５０μＭの^１５Ｎ－ｈＦｉｓ１を２２０μＬと、漸増する異なる量のペプチド（０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１５０μＭ、４００μＭ、８００μＭ、１６００μＭ、２０００μＭ）を準備して３ｍｍのＮＭＲチューブに仕込んだ。各サンプルについて、^１Ｈ、^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを、Ｚ軸傾斜式三重共鳴クリオプローブとサンプルジェットオートサンプラーを備えたブルカー アバンスＩＩ６００ＭＨｚ分光計を用いて２５oＣの温度で収集し、これにより、各サンプルの自動同調とシミング及びデータ収集が可能になった。^１Ｈ、^１５Ｎ ＨＳＱＣの実験では、^１Ｈ及び１５Ｎ次元の複素点（銘々１０２４点及び３００点）でのスキャンを８回行った。スペクトルの処理は、ＮＭＲＰｉｐｅを使用した自動パイソンスクリプトで行い、タイタービューとＣＡＲＡソフトウェアを使用して化学シフトを測定した。｛デラリオ、１９９５ ＃１０１２７｝｛マッセ、２００５ ＃１０１２８｝ トレンド分析によって、滴定系列における各スペクトルに対するペプチド結合親和性を決定した。｛許、２０１６＃１０１２９｝ ｛許、２０１７＃１０１３１｝ トレンド分析は、主成分分析を行うことでデータの変化を明らかにする分析であり、各濃度点を一意のデータ点として扱い、本開示では、漸増する異なる量のペプチドの各^１Ｈ，^１５Ｎスペクトルが入力データである。主成分分析の実行後、主成分１（ＰＣ１）の値を正規化して最大ＰＣ１の値（０から１の範囲）を得た。次に、正規化されたＰＣ１値をペプチド濃度に対してプロットし、蛋白質濃度を一定に保った状態でリガンド枯渇関数にフィッティングする（式１）。

（式中、△＝調整後化学シフト変化、ｄ_ｍａｘ＝最大化学シフト摂動、Ｋ_ｄ＝結合解離定数、ｐ＝［蛋白質］、そしてｌ＝［リガンド］である。）

ＸＥＡＳＹソフトウェアとアドビ イラストレーターを用いてスペクトルを重ね合わせて表示した。

〈ｐｅｐ２１３の合成〉：
ペプチドｐｅｐ２１３（ＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ、配列番号１）及びＴＡＴ－ｐ２１３（ＹＧＲＫＲＱＲＲＧＳＧＳＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ、配列番号３）は全て、Ｎ末端アセチル化とＣ末端アミド化を行い、ＨＰＬＣにより９５％以上の純度を維持した状態で、ジェンスクリプト社（ニュージャージー州ピスカタウェイ市）から購入したものである。ＴＡＴ－ｐ ２１３融合ペプチドは ＴＡＴ細胞透過性配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号２）とｐｅｐ２１３との間にＧＳＧＳＧＳ（配列番号４）リンカーを含んでいた。

〈内在性トリプトファン蛍光〉
ＰＴＩモデル＃８１４蛍光光度計を用いて、スターナセルズ３－Ｑ－１０石英蛍光光度計の矩形セル内で、２９５ｎｍのλ_ｅｘ及び３００～４００ｎｍのλ_ｅｍ（光路長が１０ｍｍ及び励起／発光スリット幅が４／６ｎｍ）でトリプトファン蛍光データをそれぞれ収集した。高濃度ペプチド原液（ｐｅｐ２１３）を最終的に得られるｈＦｉｓ１透析懸濁液中に再懸濁し、０μＭ、１μＭ、３μＭ、７μＭ、１０μＭ、３０μＭ、７０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、７００μＭ、及び１０００μＭペプチド点を有する濃縮系列を調製した。滴定点毎に、Ｆｉｓ１を除くサンプルについてトリプトファン発光スペクトルを測定し、次にサンプルに４００μＭのｈＦｉｓ１を５μＬ加えて、１０μＭのｈＦｉｓ１の最終濃度とトリプトファン発光スペクトルを再収集した。ペプチドからの緩衝蛍光及びチロシン蛍光バックグラウンドを考慮するために、Ｆｉｓ１を欠いたスペクトルからバックグラウンド蛍光強度を差し引いて、差分発光スペクトルを生成した。各ペプチド濃度における平均発光波長を式３に従って計算して、ペプチド濃度の自然対数の関数としてプロットしてから、それをボルツマンＳ字型モデルにフィッティングした（式４）。｛ロイヤー、１９９３ ＃１０１３２｝

（式中、〈 λ 〉＝平均発光波長、Ｉ_ｎ＝波長λ_ｎで発光する蛍光強度及び３１０～３７０ｎｍのλ_ｎで計算した総和である。）

（式中、λ＝平均発光波長、Ａ＝転移前相、Ｂ＝転移後相、Ｋ_Ｄ＝平衡解離定数、ｐ＝ペプチド濃度の自然対数、そしてｃ＝転移相の傾きである。）

〈内皮細胞のＮＯ生体利用効率及び内皮依存血管拡張に対するｐｅｐ２１３の影響〉
これらの試験を目的として、被検体の部分集合から、Ｔ２ＤＭの有無にかかわらず無作為に血管を選択した。健常な被検体由来の血管を、ＨＧ（３３ｍＭ）で６時間前処理し、その後、細胞取り込みを容易にするためにＴＡＴ配列に付着させた１μＭ又は１０μＭのｐｅｐ２１３に曝露した。Ｔ２ＤＭ被検体の血管をＮＧ条件下（５ｍＭ）で培養し、１μＭ又は１０μＭのｐｅｐ２１３－ＴＡＴに曝露した。アセチルコリンの用量増加に伴う内皮細胞依存性血管拡張、パパベリンに対する平滑筋の反応性、Ｌ－ＮＡＭＥを用いた場合のアセチルコリンに対する血管拡張反応のｅＮＯＳ依存性を前記同様に評価した^{２，４，８，１３，１５}。

〈統計分析〉
統計分析は、グラフパッド プリズムＶ７．０３（Ｗｉｎｄｏｗｓ向けグラフパッド プリズムバージョン８．０．０、グラフパッド ソフトウェア社、米カリフォルニア州サンディエゴ市）又はシグマプロットバージョン１２．５（シスタットソフトウェア社、米カリフォルニア州）のいずれかを用いて行った。Ｐ＜０．０５を統計的有意差とした。特に明記されていない限り、データを平均±ＳＥで示す。事後試験を伴う二元分散分析により全ての機能血管データを解析し、各群間の違いを（ダネットの多重比較検定によって）判断し、そして用量反応を（テューキーの多重比較検定によって）判断した。また、ＴＥＥＲアッセイデータと生体エネルギー学的データについても、二元分散分析、引き続き事後試験（テューキーの多重比較検定）によって解析することで、ＨＧ、ＬＧ、及びＮＧ処理間の違いを判断した。ヒト血管のＤＡＦ２－ＤＡ蛍光強度、ＨＭＥＣ－１細胞におけるＦｉｓ１ノックダウン効率、ウエスタンブロット法によるミトコンドリア蛋白質量の測定を、一元配置分散分析で解析した後、テューキーの多重比較検定を行って各群間の違いを評価した。ｓｉＦｉｓ１及びスクランブル化ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＭＥＣ－１細胞のＤＡＦ２－ＤＡ蛍光強度を、二元分散分析と事後試験（テューキーの多重比較検定）により解析した。Ａ ２３１８７で刺激したＨＭＥＣ－１細胞におけるＰ－ｅＮＯＳとβ－アクチンの産生と相対比を、スチューデントの対応ありｔ検定を用いて解析した。

〈詳細結果〉
（被検体の特徴）
計６７の被検体（Ｔ２ＤＭ罹患者１４名、健常対照５３名）を募集した。本プロジェクトの各試験に参加した被検体の特徴に関する詳細を表１に示す。健常者はＴ２ＤＭ群と比較して年齢が有意に若齢であった（３９±１５歳対５５±１２歳、Ｐ＝０．０００２）。本試験の健常対照群では、体重指数、胴回り、収縮期血圧、空腹時血糖、グリコシル化血色素が有意に低かった。健常者はＨＤＬコレステロール値も高目であった。健常被検体には、心代謝薬の慢性使用が一切見られなかった。

更に、ヒト血管に関する各調査の被検体特性を、付表１（Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡ又はスクランブル化対照を血管にトランスフェクトして内皮依存血管拡張試験を行った被検体の特性）と、付表２（Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡ又はスクランブル化対照を血管にトランスフェクトしてＮＯ生体利用効率の試験を行った被検体被検体の特性）と、付表３（Ｄｒｐ１ ｓｉＲＮＡ又はスクランブル化対照を血管にトランスフェクトして内皮依存血管拡張試験を行った被検体の特性）、付表４（Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡ又はスクランブル化対照を血管にトランスフェクトしてＮＯ生体利用効率の試験を行った被検体被検体の特性）と、付表５（血管をｐｅｐ２１３に曝露して血管活性の試験を行った被検体被検体の特性）に示した。

〈Ｆｉｓ１又はＤｒｐ１の抑制による内皮細胞依存性の血管拡張への影響と、ヒト血管におけるＮＯ生体利用効率〉
本願発明者らは、治験実施計画書に従って、Ｔ２ＤＭ患者に認められたのと同じ濃度のグルコースを用いて培養した健常なヒト抵抗血管における血管拡張を測定した（図１Ａ－Ｂ）。高グルコース（３３ｍＭ）と低グルコース（２．５ｍｍ）の両方で、Ｌ－ＮＡＭＥによる阻害に基づくｅＮＯＳ活性に主に関連していると思われるアセチルコリンに対する内皮細胞依存性血管拡張反応が鈍化した点は、これまでの所見と一致する。この機能的障害にミトコンドリア核分裂蛋白質Ｆｉｓ１が関与している可能性があるかどうかを検討するために、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡを健常血管にトランスフェクトして、Ｆｉｓ１ ｍＲＮＡを約３０％減少させた（図９）。これらの健常なヒト抵抗血管では、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、内皮細胞依存性血管拡張能のＨＧ誘発性障害とＬＧ誘発性障害を予防できた（図１Ａ－Ｂ）。Ｌ－ＮＡＭＥを投与した場合、両者に対する予防効果が完全に阻止されたため、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡ関連の改善はｅＮＯＳに依存していることが示唆される。

この解釈を支持するべく、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行ったところ、ＨＧ［図２Ａ；Ｎ＝９、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡとそれ以外の全ての曝露（スクランブル化対照、スクランブル化対照＋Ｌ－ＮＡＭＥ、及びＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡ＋Ｌ－ＮＡＭＥ）との間のＰ＝０．０４）］及びＬＧ（図２Ｂ、ｎ＝８、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡとそれ以外の全ての曝露との間のＰ＝０．０１）に曝露した健常なヒト血管内で、ＮＯに対する感受性が高い色素ＤＡＦ２－ＤＡの蛍光発光が有意に増加した。いずれの場合も、Ｌ－ＮＡＭＥの投与によってＤＡＦ ２－ＤＡ蛍光増加効果が完全に破棄される結果となった。これらのデータは、Ｔ２ＤＭ患者に見られるストレス状態でＦｉｓ１サイレンシングを行うことによって、ＮＯ依存的に血管拡張を改善できるという考えを支持している。次に、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡ処理によって、Ｔ２ＤＭ患者の抵抗血管における血管拡張活性を改善できるかどうかを検討した。Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡにより処理を施すことにより、内皮細胞依存性血管拡張能障害が好転した（図３、ｎ＝６、全体でＰ＝０．００２）。健常被検体由来血管の場合と同様に、糖尿病被検体由来血管へのＦｉｓ１ ｓｉＲＮＡトランスフェクションの好ましい効果が、Ｌ－ＮＡＭＥにより全面的に減弱した。Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、いずれの試験においても、パパベリンの血管拡張に影響しなかった（具体的なデータは省略）。健常者や糖尿病罹患者由来の血管でＤｒｐ１の遺伝的サイレンシングを行った場合も同様の所見が得られ（図１０－１２）、これは、過剰なミトコンドリア核分裂が糖尿病罹患内皮細胞のＮＯ依存性血管拡張能障害において大きな役割を果たしている、という見解と一致する。

〈Ｆｉｓ１発現、ＮＯ産生、ｅＮＯＳ活性化、及び核分裂・融合・自食作用に関連するミトコンドリア蛋白質の発現に対するＦｉｓ１トランスフェクションの影響〉
Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＭＥＣ－１細胞では、Ｆｉｓ１発現が７０％減少した（図１３）。ｅＮＯＳ活性化とＮＯ生体利用効率を増加させるような刺激に対するＨＭＥＣ－１の反応性を確認した結果、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７によって、Ｓｅｒ１１７７活性化部位でのｅＮＯＳリン酸化及び非トランスフェクト化ＨＭＥＣ－１細胞でのＤＡＦ２－ＤＡ蛍光強度の両方が有意に増加することが分かった（図１４Ａ、Ｎ＝６、Ｐ＝０．０３、図１４Ｂ、Ｎ＝４、Ｐ＝０．０２）。また、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡトランスフェクションでは、スクランブル化対照ｓｉＲＮＡのトランスフェクションと比較して、Ａ２３１８７で刺激したＨＭＥＣ－１細胞からのＤＡＦ２－ＤＡシグナルが有意に増加した（図１５、Ｎ＝７、Ｐ＜０．０００１）。Ｆｉｓ１発現をノックダウンしても、ミトコンドリアの核分裂や融合又は自食作用に関与するミトコンドリア蛋白質（チトクロームｃ、ＭＦＮ１、ＭＦＮ２、Ｄｒｐ１、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＭＦＦ、ＰＯＬＧ、ＮＤＵＦ８８、Ｐ６２、ＯＰＡ１、又はＡＭＰキナーゼなど）の発現は有意な変化を示さなかった（図１６）。ＨＧ、ＬＧ及びＮＧの各培養条件下では、これら蛋白質の発現に対する影響が明らかに欠けていた。高グルコース状態や低グルコース状態は、これらの蛋白質のいくつかの発現に影響を与えたが、Ｆｉｓ１ノックダウンによる影響は、所与のグルコース曝露例に全く認められなかった。

〈Ｆｉｓ１ノックダウンの影響と内皮細胞層の統合性〉：
Ｆｉｓ１抑制がＨＧとＮＧ条件下での内皮細胞層の統合性に与える影響を図４Ａに示す。ＮＧ条件下では、Ｆｉｓ１発現のノックダウンは控えめであるが、内皮細胞層の抵抗の統計的に有意な低下が見られた。ＨＧ条件下では、内皮細胞層の抵抗が、Ｆｉｓ１ノックダウンの有無にかかわらず、ＮＧ条件下の場合よりも有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。Ｆｉｓ１ノックダウンにより、ＨＧ条件下では抵抗が増加するが、依然としてＮＧ条件下で測定した抵抗よりも低い状態が続いた。ＬＧについても同様の所見が得られた（図４Ｂ）。

〈Ｆｉｓ１ノックダウンの酸素消費と解糖に対する影響〉
グルコース曝露の有無にかかわらず、Ｆｉｓ１のノックダウンによる細胞外酸性化速度又は酸素消費量への影響は認められなかったことから（ＮＧ、ＨＧ、ＬＧ；全測定のｎ＝５、Ｆｉｇｕｒｅ５）、Ｆｉｓ１の阻害はミトコンドリアの生物エネルギー合成に有意な影響を及ぼさないことが示唆される。

〈ｐｅｐ２１３のＦｉｓ１に対する親和性の測定〉
以前の研究では、ファージディスプレイ法を用いて短縮型蛋白質に照らしたスクリーニングを行うことにより、Ｆｉｓ１に結合すると期待されるペプチドをいくつか同定している^１７。本願発明者らは、これらのペプチド部分集合についてＦｉｓ１への結合を調べたところ、親和性が弱い（高μＭ）ことが見出された。これらのデータをもとに、本願発明者らは、 Ｆｉｓ１との親和性が高く且つその活性を阻害すると推測される新規ペプチドｐｅｐ２１３（配列番号１）を設計した。安定同位体^１５Ｎで均一に標識化したＦｉｓ１のＮＭＲサンプルに、ペプチドの用量を漸増しながら加えて滴定した。得られた ^１Ｈ －^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを重ね合わせたところ、ｐｅｐ２１３の添加により多くのシグナルが変化することが分かった（図６Ａ）。結果として得られたデータを、単一部位結合モデルに大域的にフィッティングでき、見掛けのＫ_Ｄ＝７±２ μＭとなった（図６Ｂ）。トリプトファン蛍光実験において、ｐ２１３添加時のトリプトファン発光スペクトルの変化を結合等温線にフィッティングしたところ、類似した見掛けのＫ_Ｄ＝３．３±０．１μＭとなったことから、上記の親和性を確認できた（図６Ｃ）。ｐｅｐ２１３と同じアミノ酸組成（但し順不同）からなる別のペプチド（スクランブル化したｐｅｐ２１３）では、２ｍＭにて^１５Ｎ－Ｆｉｓ１を加えても化学シフトの摂動を示さなかったことから、Ｆｉｓ１－ｐｅｐ２１３ 相互作用は特異的であると推定される（図６Ｄ）。

〈ヒト抵抗血管における内皮細胞依存性血管拡張に対するｐｅｐ２１３の影響〉
ＴＡＴペプチドに付着したｐｅｐ２１３への曝露を通じて細胞の取り込みを容易化すると、高グルコースに曝露した健常被検体由来の血管（図７Ａ、Ｎ＝６、全体でＰ＜０．０００１）とＴ２ＤＭ被検体由良の血管（図７Ｂ、Ｎ＝４、全体でＰ＜０．０５）の両方において内皮細胞依存性血管拡張が大幅に改善された。いずれの場合も、ｐｅｐ２１３－ＴＡＴで見られる改善が、Ｌ－ＮＡＭＥを用いた処理により覆された。ｐｅｐ２１３－ＴＡＴは、高グルコース誘発性の内皮細胞依存性血管拡張能減弱とＴ２ＤＭ被検体由来の血管における内皮細胞依存性血管拡張能障害を好転させたが、同じアミノ酸を順不同な配列で用いてスクランブル化したペプチドはいずれの血管においても何ら影響を示さなかった（図８ Ｎ＝５、Ｐ＜０．００１）。これらの試験のいずれにおいてもパパベリン反応に差が見られなかったことから（具体的なデータは省略）、ｐｅｐ２１３－ＴＡＴは平滑筋反応に影響を及ぼさないことが示唆される。更に、ｐｅｐ２１３－ＴＡＴに１時間曝露したヒト微小血管内皮細胞では、ＤＡＦ２－ＤＡ蛍光の発光が有意に増加した（図１７、Ｎ＝３、Ｐ＝０．０４）。

［考察］
これらの調査を通じて、新たな所見をいくつか得ることができた。第１に、ヒト微小血管内皮細胞は、ＮＯを産生して内皮依存的に拡張することで内皮細胞層関門機能を維持するという能力を有するが、その能力に及ぼされる高グルコース曝露と低グルコース曝露のマイナスの影響をＦｉｓ１の分子阻害によって阻止できる。また、Ｆｉｓ１発現の分子阻害によって、Ｔ２ＤＭ患者由来の内皮細胞依存性血管拡張能の障害を好転できる。更に、内皮細胞の代謝や、ミトコンドリアの融合・核分裂・自己作用に関与する他の蛋白質の発現に変化をもたらすことなく上記の好ましい効果を奏することができる。また、本願発明者らは、Ｆｉｓ１上の極めて重要な結合部位の構造に関する知見に基づいて、Ｆｉｓ１に対するミクロモル結合親和性の低いペプチドｐｅｐ２１３を設計し、２種類の独立した方法でその結合を確認した。最後に、ｐｅｐ２１３は生理活性を持ち、ヒト微小血管内皮細胞でＮＯ生体利用効率を向上させるとともに、ヒト抵抗動脈において高グルコース誘発性の内皮細胞依存性血管拡能減弱と２型糖尿病関連の内皮細胞依存性血管拡能障害を、１酸化窒素合成酵素依存的に好転させることを本開示で示したが、これらの所見は、急性及び慢性血糖異常経過中の内皮機能不全において、過剰なＦｉｓ１の発現と活性が重大な力学的役割を果たすことを示唆している。また、これらのデータは、Ｆｉｓ１を標的とした薬理療法が２型糖尿病患者における血管の健康状態を改善する手段として有望であるという考えを支持している。

ミトコンドリアの動態調節に関与するミトコンドリア蛋白質を標的とすることにより、２型糖尿病患者や高グルコース濃度に曝露された患者におけるヒト血管内皮機能に好ましい影響をもたらし得るかどうかを検討することの重要性を支持する論理的根拠が存在する。ミトコンドリア網状組織の動態の適切なバランスを維持することが、ミトコンドリアの正常機能の維持に欠かせない。ミトコンドリア動態が正常であれば、ミトコンドリアは、代謝需要の増加する領域に移動したり、損傷したミトコンドリアを修復したり、ミトコンドリアエネルギーの合成を正常に維持したり、活性酸素種の産生を制限したり、取り返しがつかないほどに損傷を受けたミトコンドリア成分を単離することで自己作用（オートファジー）を可能にしたりできる^{１８－２２}。グルコースや遊離脂肪酸の上昇など、過剰な栄養素への急性・慢性的な曝露によって、ミトコンドリア網状組織が刺激され、ヒト内皮細胞をはじめとする複数種の細胞で核分裂が起こり、ミトコンドリア内で過剰なＲＯＳが産生されることになる^{１，２２－２４}。培養内皮細胞を用いた精液研究では、高グルコースが原因でミトコンドリア内に過剰のＲＯＳが産生されて、細胞シグナル伝達経路とエピゲノム経路を通じて急性・慢性の内皮細胞機能不全が生じることを実証している^３，２５。また、本願発明者らは、以前に行った研究で、２型糖尿病患者由来の抵抗動脈においてミトコンドリア超酸化物濃度を低下させることで、ヒト抵抗細動脈における内皮細胞依存性血管拡張能障害を好転できることも実証している^２。

これらのデータは、ミトコンドリア動態蛋白質を標的にして過剰なミトコンドリア核分裂を抑制することが、急性又は慢性的に異常なグルコース値にさらされた血管の健全性を維持するのに有益であることを示唆している。ミトコンドリアの融合や核分裂の過程に関与する蛋白質は複数存在するが、ミトコンドリア外膜に位置するＤｒｐ１用ドッキング蛋白質であるＦｉｓ１が、糖尿病や高グルコースへの急性曝露経過中や、いくつかの種類の細胞については過剰な遊離脂肪酸への急性曝露経過中に過剰発現することは繰り返し示されている^{１，２６－２９}。Ｆｉｓ１が必ずしも全ての核分裂に必要というわけではないが^３０、低酸素症や過度のグルコース曝露などの細胞ストレス条件下ではＦｉｓ１－Ｄｒｐ１媒介性核分裂が好ましいと考えられる^９－１２。ヒトの脈管構造を用いて行ったこれまでの研究では、２型糖尿病罹患者由来の内皮細胞でＦｉｓ１が過剰に発現していることが判明している^１。更に、培養ヒト大動脈内皮細胞においては、高グルコースへの曝露によってＦｉｓ１の過剰発現が生じ、また、高グルコースに曝露したヒト大動脈内皮細胞においては、Ｆｉｓ１又はＤｒｐ１発現の分子サイレンシングによって、そのＳｅｒ１１７７活性化部位におけるｅＮＯＳのリン酸化が増大する^１。また、本願発明者らは以前に行った研究で、低グルコース曝露が（臨床的に関連性のある度合いでなされた場合）ヒト内皮細胞におけるミトコンドリア核分裂やｍｔＲＯＳの過剰産生につながるが、かかる核分裂や過剰産生は、ミトコンドリア核分裂蛋白質の活性を抑制することによって覆すことができる^８。本願発明者らが新たに得たデータでは、Ｆｉｓ１の分子阻害によって、無傷のヒト抵抗動脈における内皮細胞依存性血管拡張能障害が好転し、これらの血管における一酸化窒素の生体利用効率が向上するとともに、急性血糖異常経過中に内皮細胞層の統合性を保護できることを示し、これまでの研究で示した翻訳効果が大幅に拡大した。更に、たとえＦｉｓ１を標的としても、内皮細胞のミトコンドリア代謝や、その動態又は自己作用に関与する他のミトコンドリア蛋白質の発現に影響しないことが判明し、Ｆｉｓ１を標的とした際に期待される標的以外の効果を治療の一環として検討するために行った今回の調査結果の妥当性を追認できた。

本願発明者らは、主要な相互作用表面でＦｉｓ１に結合するように設計したｐｅｐ２１３によって、培養内皮細胞におけるＮＯ生体利用効率を向上できるとともに、２型糖尿病誘発性の内皮細胞依存性血管拡張能障害と高グルコース誘発性の内皮細胞依存性血管拡張能減弱を両方とも好転できることを見出した。本願発明者らが今回新規ｐｅｐ２１３を使って得たデータは、同者らの分子データと併せて、Ｆｉｓ１の直接的な薬理学的阻害が糖尿病性脈管構造に好影響を与えるという考えを支持している。興味深いことに、２型糖尿病の治療を目的としていくつかの薬を投与したところ、そのうち２種類は、Ｔ２ＤＭの心血管系リスクを低下させるだけではなく、Ｆｉｓ１発現且つ又はＤｒｐ１発現の減少をもたらすことにより「標的外」効果としてミトコンドリア核分裂を阻害する。エンパグリフロジン、及びＴ２ＤＭ患者の心血管系リスクと死亡率及び微小血管性腎疾患に効果を示すＳＧＬＴ２阻害剤^{３１，３２}をＴ２ＤＭ（ＯＬＥＦＴ）のラットモデルに使用したところ、Ｆｉｓ１の過剰発現を減少させるだけでなく、ミトコンドリア核分裂も減少させ、更に、心筋細胞のミトコンドリア活性酸素分解酵素ＳＯＤ２を上昇させた^３３。従来からＴ２ＤＭの血糖管理ために用いられている第１選択薬であり心血管機能にも効果のあるメトホルミンは、ＡｐｏＥノックアウト型マウスにおいて、Ｄｒｐ１媒介性核分裂を抑制することにより、アテローム性動脈硬化形成を抑制する^３４。ジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤であるビルダグリプチンは、糖尿病マウスの大動脈内皮において、ＮＯ産生を増加させるとともに、Ｆｉｓ１とＤｒｐ１の発現を減少させ、細胞質からのＤｒｐ１の転座を減少させ、且つミトコンドリア核分裂とＲＯＳ産生を減少させることが判明している薬物群の一つである^３５。本願発明者らが得たデータの枠組みの中で解釈すると、これら一般的な糖尿病治療薬は、Ｆｉｓ１とＤｒｐ１の発現且つ又は相互作用に対する標的外効果に一部起因する効果として、Ｔ２ＤＭの血管系改善効果をもたらし得ると考えられている。これらの改善が血糖管理の改善によるものか、Ｆｉｓ１又はＤｒｐ１の相互作用による直接的阻害によるものかについて、今後調査してみる価値がある。

本願発明者らが実施した試験にはいくつかの限界がある。まず、高血糖症その他の病理的刺激の発生との関連性が最も高い軸はＦｉｓ１－Ｄｒｐ１軸であるという結論を従来のデータが支持していること、また、本願発明者らが以前に行った研究結果では糖尿病性内皮細胞におけるＦｉｓ１の病態生理的役割が支持されていることから、本願発明者らはＦｉｓ１－Ｄｒｐ１軸に主な焦点を当てて、Ｔ２ＤＭ及び異常グルコース曝露症例における血管系効果を調節した^{１，９－１２}。Ｆｉｓ１を阻害することによりＤｒｐ１や他のミトコンドリアドッキング蛋白質（ＭＦＦ、ＭｉＤ４９／５１）との相互作用が阻害されるかどうかは不明であり、今後調査してみる価値がある。また、ミトコンドリア融合蛋白質（例：ＯＰＡ１、Ｍｆｎ１、Ｍｆｎ２など）には意図的に焦点を当てなかった。新たなデータから、Ｔ２ＤＭ患者の組織でＭｆｎ２発現が下方制御されていることと、Ｆｉｓ１が融合蛋白質のＧＴＰａｓｅ活性を阻害することで核分裂を促進して生体利用効率を更に低下させる可能性があることが示唆されている^{１，３６－３８}。ヒト血管内皮機能の調節における融合経路の役割と、そのＦｉｓ１との相互作用の可能性についても、更なる調査を行ってみる価値がある。本願発明者らは、今回の実験では浸透圧の制御を行っていないが、これまでの研究では、ミトコンドリアによる血管機能の制御に関して無傷の血管と内皮細胞を用いて類似した実験を行っており、その際、本願発明者らの結果を左右し得る浸透圧の相違は一切認められていない^４，８。疾患との関連性が高いヒト由来組織について本願発明者らが得た所見の新規性、並びに、ミトコンドリア核分裂機構を標的としてヒト脈管構造に対する糖尿病の悪影響を鈍化・好転させるための新規治療介入法の開発は、上記の限界を相殺するに十分なものである。

〈補足結果〉
本願発明者らは、以前に行った研究でも、ミトコンドリア核分裂において膜変形・切断などを担う唯一の力学的酵素であるＤｒｐ１の遺伝子サイレンシングを行って、糖尿病性内皮細胞におけるＮＯ依存性血管拡張能の減弱におけるミトコンドリアの過剰核分裂の役割を支持する同様の所見を報告している^８。当該の試験では、ｓｉＲＮＡをＤｒｐ１に導入することで、ヒト細動脈におけるＤｒｐ１の発現が大幅に減少し、健常なヒト由来の抵抗動脈における内皮細胞依存性血管拡張能のＬＧ 誘発性障害を予防できることが明らかになった^８。今回の試験では、Ｄｒｐ１の遺伝子的サイレンシングにより、内皮細胞依存性血管拡張能のＨＧ誘発性障害も予防できることが明らかになった（図１０、Ｎ＝６、ＨＧ以外の全ての曝露に対する全体のＰ＜０．０００１）。この効果は、Ｌ－ＮＡＭＥによって完全に破棄されることになったが、パパベリンによっては破棄されなかった（具体的なデータは省略）。また、ＨＧに曝露した健常なヒト血管（図１１Ａ、ｎ＝９、Ｐ＝全体で０．０２、Ｄｒｐ１ ｓｉＲＮＡとスクランブル化対照、スクランブル化対照＋ Ｌ－ＮＡＭＥ、Ｄｒｐ１ ｓｉＲＮＡ＋Ｌ－ＮＡＭＥとの間のＰ＜０．０５）とＬＧに曝露した健常なヒト血管（図１１Ｂ、ｎ＝９、Ｐ＝全体で０．００３、Ｆｉｓ１ ｓｉＲＮＡとそれ以外の曝露との間のＰ＜０．０４）でもＤＡＦ２－ＤＡ蛍光発光が有意に増加した。いずれの場合も、Ｌ－ＮＡＭＥの投与によってＤＡＦ ２－ＤＡ蛍光増加効果が完全に破棄される。また、Ｄｒｐ１ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションでは、２型糖尿病罹患者由来のヒト血管内で内皮細胞依存性血管拡張が改善される傾向を示した（図１２）。

［結論］
本開示に記載した研究では、Ｔ２ＤＭ罹患者由来の無傷抵抗血管と急性血糖異常経過中の血管内皮機能の調節におけるＦｉｓ１の極めて重要な役割を実証した。本願発明者らは、Ｔ２ＤＭ患者由来の血管における血管系機能に対するこの相互作用の重要性を実証するために、Ｆｉｓ１の主要結合表面を閉鎖するべく特別に設計した新規ペプチドｐｅｐ２１３を用いた。更に、本願発明者らは、Ｆｉｓ１濃度の低下が内皮機能の向上をもたらすが、他の重要なミトコンドリア蛋白質やミトコンドリア酸素消費量には影響しないことを示した。これらのデータを以前の研究結果と併せて検討すると、Ｔ２ＤＭ関連の血管合併症を軽減することを目的としてＦｉｓ１の薬理学的標的化に関する更なる研究を行う必要性が認められる。

［実施例２］
本願発明者らは更に、健常なヒト由来の抵抗動脈（ヒトＦｉｓ１の内皮特異的過剰発現を目的としてプラスミドを培養時間４８時間でトランスフェクトした抵抗動脈）におけるＦｉｓ１の過剰発現が、ｅＮＯＳ依存的な血管拡張能障害につながることを明らかにした（このことは、ｅＮＯＳ阻害剤Ｌ－ＮＡＭＥを使用した場合、アセチルコリンが喪失しても内皮細胞依存性血管拡張を誘発できることから判断できる。）Ｎ＝５、全般的なＰ＜０．００１、図１８に示すように、アセチルコリンの適応用量で＊Ｐ＜０．０５であった。更に、本発明のペプチド、例えばｐｅｐ２１３は、抵抗動脈における内皮細胞依存性血管拡張能障害を好転できる。細胞浸透性を改善する目的でｔａｔ配列に付着したｐｅｐ２１３（１μＭ ｐｅｐ２１３－ｔａｔ）に１時間曝露することにより、内皮細胞内でＦｉｓ１を過剰発現（レンチウイルスベクターを用いて内皮特異的なヒトＦｉｓ１の過剰発現を目的としたプラスミドを血管にトランスフェクトすることにより達成したヒトＦｉｓ１の過剰発現）を示す健常なヒト抵抗細動脈における内皮細胞依存性血管拡張能障害を好転できる。ｐｅｐ２１３と同じアミノ酸を順不同に用いてスクランブル化したペプチド１μＭではアセチルコリンによる内皮細胞依存性血管拡張に何ら効果を示さなかった。ｐｅｐ２１３－ｔａｔは、ｅＮＯＳ依存的に内皮細胞依存性血管拡張の改善をもたらす。（このことは、ｅＮＯＳ阻害剤Ｌ－ＮＡＭＥを使用した場合、アセチルコリンが喪失しても内皮細胞依存性血管拡張を誘発できることから判断できる。）Ｎ＝５、全般的なＰ＜０．００１、＊アセチルコリンの適応用量でのＰ＜０．０５。

更に、組換えヒトＦｉｓ１とＰｅｐ２１３の共結晶化を行った。その後、ペプチドをＦｉｓ１緩衝液において再懸濁した。懸滴型蒸気拡散法により結晶を成長させ、抗凍結剤溶液に高速移送した後に液体窒素に入れて急速冷凍した。米先端放射光施設（イリノイ州アルゴンヌ市）のＬＳ－ＣＡＴビームライン２１－ＩＤ－Ｆで、ＭＤ２－Ｓマイクロ回折装置とレイオニクスＭＸ３００検出器を用いて複数のデータセットを遠隔収集した。検出器距離２６０ｍｍで、合計１８０°のデータを０．５°ずつ収集した。ＸＤＳを用いて全てのデータを処理した。フェニックスフェイザーＭＲを用いて分子置換を行い、その後フェニックスオートビルドを用いてモデルの自動構築を行った。フェニックス．リファインとウィンクートを用いて改良・微調整を行った。最終的な構造分解能は１．８５Aであった。共錯体構造（Ａ）を見ても、塩橋形成や水素結合やファンデルワールス相互作用を含む様々な結合相互作用を介して、ｐｅｐ２１３がＦｉｓ１と結び合っていることが分かる。

Ｆｉｓ１結合に重要なＰｅｐ２１３は、表２に示すように、１４個のアミノ酸をそれぞれアラニンに順次置換することにより断定した。Ｆｉｓ１－ｐｅｐ２１３相互作用に欠かせないｐｅｐ２１３残基を断定するためにマイクロスケール熱泳動を用いた。ｐｅｐ２１３の各残基をアラニンで順次置換し、計１４個のペプチドを得た。その後、ペプチドをＦｉｓ１緩衝液において再懸濁した。ナノテンパーモノリスＮＴ．１１５装置を用いて、２５℃でマイクロスケール熱泳動実験を行い、各ペプチドの１６点希釈系列（１：１希釈）を、定濃度の蛍光標識Ｆｉｓ１に対して定量した。ナノテンパーモノリスに附属している親和性分析ソフトウェアによりデータ分析を行ってＫ_Ｄ値を断定した。結合親和性の値を用いて反応のΔＧ°（ΔＧ°＝－RTlnK）を求め、これを用いてΔΔＧ °値（ΔＧ°_{ｐｅｐ２１３}－ΔＧ°_異形）を計算した。ΔΔＧ°値が低いことからも分かるように、ペプチドの各末端の残基の部分集合は結合に対して有意な寄与を示していない。

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１７． Ｓｅｒａｓｉｎｇｈｅ ＭＮ， Ｓｅｎｅｖｉｒａｔｎｅ ＡＭ， Ｓｍｒｃｋａ ＡＶ ａｎｄ Ｙｏｏｎ Ｙ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｑｕｅ ｐｒｏｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈＦｉｓ１． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１０；２８５：６２０－３０．
１８． Ｃｈｅｎ Ｈ ａｎｄ Ｃｈａｎ ＤＣ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ－－ｆｕｓｉｏｎ， ｆｉｓｓｉｏｎ， ｍｏｖｅｍｅｎｔ， ａｎｄ ｍｉｔｏｐｈａｇｙ－－ｉｎ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００９；１８：Ｒ１６９－Ｒ１７６．
１９． Ｃｈａｎ ＤＣ． Ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｓｓｉｏｎ： ｉｎｔｅｒｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｈｅａｌｔｈ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ． ２０１２；４６：２６５－２８７．
２０． Ｄｅｔｍｅｒ ＳＡ ａｎｄ Ｃｈａｎ ＤＣ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００７；８：８７０－９．
２１． Ｓｕｅｎ ＤＦ， Ｎｏｒｒｉｓ ＫＬ ａｎｄ Ｙｏｕｌｅ ＲＪ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２００８；２２：１５７７－９０．
２２． Ｙｕ Ｔ， Ｒｏｂｏｔｈａｍ ＪＬ ａｎｄ Ｙｏｏｎ Ｙ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００６；１０３：２６５３－２６５８．
２３． Ｍｏｌｉｎａ ＡＪ， Ｗｉｋｓｔｒｏｍ ＪＤ， Ｓｔｉｌｅｓ Ｌ， Ｌａｓ Ｇ， Ｍｏｈａｍｅｄ Ｈ， Ｅｌｏｒｚａ Ａ， Ｗａｌｚｅｒ Ｇ， Ｔｗｉｇ Ｇ， Ｋａｔｚ Ｓ， Ｃｏｒｋｅｙ ＢＥ ａｎｄ Ｓｈｉｒｉｈａｉ ＯＳ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｎｕｔｒｉｅｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ２００９；５８：２３０３－１５．
２４． Ｊｈｅｎｇ ＨＦ， Ｔｓａｉ ＰＪ， Ｇｕｏ ＳＭ， Ｋｕｏ ＬＨ， Ｃｈａｎｇ ＣＳ， Ｓｕ ＩＪ， Ｃｈａｎｇ ＣＲ ａｎｄ Ｔｓａｉ ＹＳ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｉｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０１２；３２：３０９－１９．
２５． Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｔ， Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ Ｄ， Ｄｕ ＸＬ， Ｙａｍａｇｉｓｈｉ Ｓ， Ｍａｔｓｕｍｕｒａ Ｔ， Ｋａｎｅｄａ Ｙ， Ｙｏｒｅｋ ＭＡ， Ｂｅｅｂｅ Ｄ， Ｏａｔｅｓ ＰＪ， Ｈａｍｍｅｓ ＨＰ， Ｇｉａｒｄｉｎｏ Ｉ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ｍ． Ｎｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｌｏｃｋｓ ｔｈｒｅｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃａｅｍｉｃ ｄａｍａｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ． ２０００；４０４：７８７－７９０．
２６． Ｌｉｕ Ｎ， Ｗｕ Ｊ， Ｚｈａｎｇ Ｌ， Ｇａｏ Ｚ， Ｓｕｎ Ｙ， Ｙｕ Ｍ， Ｚｈａｏ Ｙ， Ｄｏｎｇ Ｓ， Ｌｕ Ｆ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ Ｗ． Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｓｕｌｐｈｉｄｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｍｉｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ ｈｉｇｈ－ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｐａｌｍｉｔａｔｅ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ２０１７；２１：３１９０－３２０３．
２７． Ｇｉｏｓｃｉａ－Ｒｙａｎ ＲＡ， Ｂａｔｔｓｏｎ ＭＬ， Ｃｕｅｖａｓ ＬＭ， Ｚｉｇｌｅｒ ＭＣ， Ｓｉｎｄｌｅｒ ＡＬ ａｎｄ Ｓｅａｌｓ ＤＲ． Ｖｏｌｕｎｔａｒｙ ａｅｒｏｂｉｃ ｅｘｅｒｃｉｓｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ａｒｔｅｒｉａｌ ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｈｅａｌｔｈ ｗｉｔｈ ａｇｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ａｇｉｎｇ （Ａｌｂａｎｙ ＮＹ）． ２０１６；８：２８９７－２９１４．
２８． Ｃｈｏｉ ＨＹ， Ｐａｒｋ ＪＨ， Ｊａｎｇ ＷＢ， Ｊｉ ＳＴ， Ｊｕｎｇ ＳＹ， Ｋｉｍ ｄａ Ｙ， Ｋａｎｇ Ｓ， Ｋｉｍ ＹＪ， Ｙｕｎ Ｊ， Ｋｉｍ ＪＨ， Ｂａｅｋ ＳＨ ａｎｄ Ｋｗｏｎ ＳＭ． Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｃａｕｓｅｓ Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆｉｓｓｉｏｎ： Ｒｏｌｅ ｏｆ ａ ＧＬＵＴ１ Ｂｌｏｃｋｅｒ． Ｂｉｏｍｏｌ Ｔｈｅｒ （Ｓｅｏｕｌ）． ２０１６；２４：３６３－７０．
２９． Ｚｈａｎｇ Ｙ， Ｆｅｎｇ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｑ， Ｚｈａｏ Ｓ， Ｙａｎｇ Ｓ， Ｔｉａｎ Ｌ， Ｍｅｎｇ Ｐ， Ｌｉ Ｊ ａｎｄ Ｌｉ Ｈ． Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃａｅｍｉａ Ｓｔｒｅｓｓ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｒｅｎａｌ Ｉｎｊｕｒｙ ｉｓ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＭＫＰ１ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ， ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＪＮＫ－ＣａＭＫＩＩ－Ｆｉｓ１ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｘｉｓ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０１８；５１：１７７８－１７９８．
３０． Ｌｏｓｏｎ ＯＣ， Ｓｏｎｇ Ｚ， Ｃｈｅｎ Ｈ ａｎｄ Ｃｈａｎ ＤＣ． Ｆｉｓ１， Ｍｆｆ， ＭｉＤ４９， ａｎｄ ＭｉＤ５１ ｍｅｄｉａｔｅ Ｄｒｐ１ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｉｓｓｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ． ２０１３；２４：６５９－６７．
３１． Ｚｉｎｍａｎ Ｂ， Ｗａｎｎｅｒ Ｃ， Ｌａｃｈｉｎ ＪＭ， Ｆｉｔｃｈｅｔｔ Ｄ， Ｂｌｕｈｍｋｉ Ｅ， Ｈａｎｔｅｌ Ｓ， Ｍａｔｔｈｅｕｓ Ｍ， Ｄｅｖｉｎｓ Ｔ， Ｊｏｈａｎｓｅｎ ＯＥ， Ｗｏｅｒｌｅ ＨＪ， Ｂｒｏｅｄｌ ＵＣ， Ｉｎｚｕｃｃｈｉ ＳＥ ａｎｄ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ Ｅ－ＲＯ． Ｅｍｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ， ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ Ｔｙｐｅ ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１５；３７３：２１１７－２８．
３２． Ｗａｎｎｅｒ Ｃ， Ｉｎｚｕｃｃｈｉ ＳＥ， Ｌａｃｈｉｎ ＪＭ， Ｆｉｔｃｈｅｔｔ Ｄ， ｖｏｎ Ｅｙｎａｔｔｅｎ Ｍ， Ｍａｔｔｈｅｕｓ Ｍ， Ｊｏｈａｎｓｅｎ ＯＥ， Ｗｏｅｒｌｅ ＨＪ， Ｂｒｏｅｄｌ ＵＣ， Ｚｉｎｍａｎ Ｂ ａｎｄ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ Ｅ－ＲＯ． Ｅｍｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｔｙｐｅ ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１６；３７５：３２３－３４．
３３． Ｍｉｚｕｎｏ Ｍ， Ｋｕｎｏ Ａ， Ｙａｎｏ Ｔ， Ｍｉｋｉ Ｔ， Ｏｓｈｉｍａ Ｈ， Ｓａｔｏ Ｔ， Ｎａｋａｔａ Ｋ， Ｋｉｍｕｒａ Ｙ， Ｔａｎｎｏ Ｍ ａｎｄ Ｍｉｕｒａ Ｔ． Ｅｍｐａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｓ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｓｉｚｅ ａｆｔｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｈｅａｒｔｓ． Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｐ． ２０１８；６：ｅ１３７４１．
３４． Ｗａｎｇ Ｑ， Ｚｈａｎｇ Ｍ， Ｔｏｒｒｅｓ Ｇ， Ｗｕ Ｓ， Ｏｕｙａｎｇ Ｃ， Ｘｉｅ Ｚ ａｎｄ Ｚｏｕ ＭＨ． Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ－Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｖｉａ ｔｈｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｐ１－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆｉｓｓｉｏｎ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ２０１７；６６：１９３－２０５．
３５． Ｌｉｕ Ｈ， Ｘｉａｎｇ Ｈ， Ｚｈａｏ Ｓ， Ｓａｎｇ Ｈ， Ｌｖ Ｆ， Ｃｈｅｎ Ｒ， Ｓｈｕ Ｚ， Ｃｈｅｎ ＡＦ， Ｃｈｅｎ Ｓ ａｎｄ Ｌｕ Ｈ． Ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｉｓｓｉｏｎ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ２０１９；２３：７９８－８１０．
３６． Ｙｕ Ｒ， Ｊｉｎ ＳＢ， Ｌｅｎｄａｈｌ Ｕ， Ｎｉｓｔｅｒ Ｍ ａｎｄ Ｚｈａｏ Ｊ． Ｈｕｍａｎ Ｆｉｓ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ． ＥＭＢＯ Ｊ． ２０１９；３８．
３７． Ｂａｃｈ Ｄ， Ｐｉｃｈ Ｓ， Ｓｏｒｉａｎｏ ＦＸ， Ｖｅｇａ Ｎ， Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ Ｂ， Ｏｒｉｏｌａ Ｊ， Ｄａｕｇａａｒｄ ＪＲ， Ｌｌｏｂｅｒａｓ Ｊ， Ｃａｍｐｓ Ｍ， Ｚｉｅｒａｔｈ ＪＲ， Ｒａｂａｓａ－Ｌｈｏｒｅｔ Ｒ， Ｗａｌｌｂｅｒｇ－Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ Ｈ， Ｌａｖｉｌｌｅ Ｍ， Ｐａｌａｃｉｎ Ｍ， Ｖｉｄａｌ Ｈ， Ｒｉｖｅｒａ Ｆ， Ｂｒａｎｄ Ｍ ａｎｄ Ｚｏｒｚａｎｏ Ａ． Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ－２ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｌｔｅｒｅｄ ｉｎ ｏｂｅｓｉｔｙ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００３；２７８：１７１９０－７．
３８． Ｌｕｇｕｓ ＪＪ， Ｎｇｏｈ ＧＡ， Ｂａｃｈｓｃｈｍｉｄ ＭＭ ａｎｄ Ｗａｌｓｈ Ｋ． Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２０１１；５１：８８５－８９３．

Claims (25)

1. （ａ）配列番号３８（ＸＬＰＹＰＨＺ）のアミノ酸配列、又は配列番号３８に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）活性阻害ペプチドであり、ＸとＺが０～３０個のアミノ酸、任意に１～２０個のアミノ酸からなるペプチドであり得る、ミトコンドリア核分裂蛋白質１（Ｆｉｓ１）活性阻害ペプチド。
2. （ａ）配列番号３３～３７から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号３３～３７に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含み、５～５０個のアミノ酸、任意に５～３０個のアミノ酸長さのペプチドである、請求項１に記載の阻害ペプチド。
3. 前記アミノ酸配列が、（ａ）配列番号１（ＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ）のアミノ酸配列又は配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列、又は配列番号１６～２１、２６及び２９のいずれか１つ又は配列番号１６～２１、２６及び２９に対して９０％の配列類似性を持つ配列を含む、請求項１または請求項２に記載の阻害ペプチド。
4. 前記阻害ペプチドが、（ｂ）担体ペプチド、タグペプチド、又は細胞結合ペプチドをコード化するアミノ酸配列又は担体に連結している（ａ）を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の阻害ペプチド。
5. 前記阻害ペプチドが担体ペプチドを含むことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の阻害ペプチド。
6. 前記担体ペプチドが、細胞透過性ペプチド配列、任意にＴＡＴ（配列番号２）又は配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列である、請求項１～５のいずれか１項に記載の阻害ペプチド。
7. 前記（ａ）と（ｂ）が両方ともペプチドであり、リンカー配列によって連結されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の阻害ペプチド。
8. 前記リンカー配列が配列番号４、１１、１２、１３、１４、又は１５である、請求項７に記載の阻害ペプチド。
9. 前記ペプチドが、配列番号３（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＧＳＧＳＳＨＫＨＤＰＬＰＹＰＨＦＬＬ）、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３９、又は配列番号３、配列番号３１、配列番号３２又は配列番号３９に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つペプチドを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の阻害ペプチド。
10. Ｆｉｓ １阻害ペプチドをコード化するポリヌクレオチドであり、異種プロモータ配列及び請求項１～９のいずれか１項に記載のペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
11. 前記ポリヌクレオチドがベクターである、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
12. 阻害性ペプチドを発現することができるベクターであり、請求項１～９のいずれか１項に記載のペプチド又は請求項１０に記載のポリヌクレオチドをコード化するポリヌクレオチドに操作可能に接続しているプロモータを含むベクター。
13. 異種バックボーン配列を更に含む、請求項１２に記載のベクター。
14. 請求項１２又は請求項１３に記載のベクターを含み、阻害ペプチドを発現することができる宿主細胞。
15. ２型糖尿病に関連する血管合併症を治療する方法であって、請求項１～９のいずれか１項に記載のＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量を投与することを含む方法。
16. 血管拡張能障害の治療を必要とする被検体において血管拡張障害の好転を図る方法であって、前記被検体における血管拡張能の回復を目的として請求項１～９のいずれか１項に記載のＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量を投与することを含む方法。
17. 前記被検体が２型糖尿病を罹患している、請求項１５又は請求項１６に記載の方法。
18. 前記被検体が、一酸化窒素合成酵素依存的にヒト抵抗動脈における高グルコース誘発性及び２型糖尿病に関連した内皮細胞依存性血管拡張能障害を有する、請求項１５又は請求項１６の方法。
19. ヒトの微小血管内皮細胞における酸化窒素（ＮＯ）の生体利用効率を高める方法であって、ヒト内皮細胞におけるＮＯ生体利用効率を増加させるために、請求項１～９のいずれか１項に記載のＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量投与することを含む方法。
20. 前記内皮細胞が、血管機能不全を有する被検体の生体内のものである、請求項１９に記載の方法。
21. 内皮機能不全を治療するための方法であって、内皮機能不全を治療するために請求項１～９のいずれか１項に記載のＦｉｓ１阻害ペプチドを有効量投与することを含む方法。
22. 前記内皮機能不全がアテローム性動脈硬化症を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 内皮機能不全が、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、冠状動脈疾患、腎血管性疾患、及び末梢動脈疾患のうちのいずれかの疾患と関連している、請求項２１に記載の方法。
24. 請求項１～９のいずれか１項に記載のペプチド又は前記ペプチドを発現することができる請求項１０又は請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１２又は請求項１３に記載のベクター、又は請求項１４に記載の細胞、及び使用説明書を含むキット。
25. 請求項１～９のいずれかに記載の阻害ペプチドと、薬学的に許容可能な担体を含む組成物。