[go: up one dir, main page]

JP2023500796A - 嫌気性条件下で細胞の代謝活性をモニターするためのレゾルフィンの使用 - Google Patents

嫌気性条件下で細胞の代謝活性をモニターするためのレゾルフィンの使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2023500796A
JP2023500796A JP2022522819A JP2022522819A JP2023500796A JP 2023500796 A JP2023500796 A JP 2023500796A JP 2022522819 A JP2022522819 A JP 2022522819A JP 2022522819 A JP2022522819 A JP 2022522819A JP 2023500796 A JP2023500796 A JP 2023500796A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
microwells
resorufin
cell culture
platform
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022522819A
Other languages
English (en)
Inventor
ダン，ジュード
ジュエル，タリア
ホロック，アレクサンダー
Original Assignee
アイソレーション バイオ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アイソレーション バイオ インコーポレイテッド filed Critical アイソレーション バイオ インコーポレイテッド
Publication of JP2023500796A publication Critical patent/JP2023500796A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/38—Caps; Covers; Plugs; Pouring means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/40—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pressure
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本発明は、嫌気的環境内にレゾルフィンを含む細胞培養過程で少なくとも１つの細胞の状態を同定する方法に関する。この方法において、細胞培養過程でレゾルフィンのジヒドロレゾルフィンへの還元程度が測定され、一方細胞培養は嫌気的環境内で維持される。細胞培養液は嫌気性チャンバー内に位置する微細加工チップのマイクロウェルに負荷される場合があり、その測定は細胞培養過程での蛍光によって行われる。

Description

関連出願の参照
この出願は、2020年4月13日に提出された米国仮出願No.63/009,398および2019年10月18日に提出された米国仮出願No.62/923,321に対して優先権を主張するものであり、上記の各特許出願の開示の全体を参照により本明細書に援用する。
細胞の生存能力、代謝活性および／または増殖の決定は、広範囲の応用において重要である。
レサズリン（7-ハイドロキシ-3H-フェノキサジン-3-オン10-オキサイド）は青色の色素であり、それ自身は弱蛍光性であるが、不可逆的に還元されると、ピンク色で高度蛍光性のレゾルフィンになる。還元性環境は細胞の成長と強く関連し、レサズリンは非毒性であることが知られているため、動物細胞、細菌および真菌において細胞計数、細胞生存、および細胞増殖などの細胞培養アッセイに一般に使用されている。
レサズリンの還元は以下の図に示されている。
Figure 2023500796000002
好気性（酸化）状態では、レサズリンは酸化状態に入り、細胞の成長または増殖によってレサズフィンに還元される。したがって、レサズリンの変化（すなわち色および／または蛍光）のモニタリングは好気性条件での細胞の成長または増殖を示すために使用し得る。しかし、嫌気性環境では環境自体がこの分子を還元してしまうため、レサズリンは同じようには使用できない。そのため、細胞成長／増殖が起きているか、いないかを区別できない。
細胞の代謝活性を嫌気性チャンバーで示す最も一般的な方法は、（１）比色指示薬と（２）吸光度法とである。しかし、これらの感度が低いため、こうした方法は微量の液体を含む反応チャンバーで信頼性の高い結果を得るのが困難である。
本発明の一つの態様において、本発明は嫌気的環境でレゾルフィンを含む細胞培養過程で少なくとも１つの細胞の状態を同定する方法を提供する。本方法においては、嫌気的環境で細胞培養を維持する一方、細胞培養過程でのレゾルフィンのジヒドロレゾルフィンへの還元の程度が計測される。
本発明のいくつかの実施形態において、この測定が細胞培養過程で蛍光を測定することを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞が微細加工チップの１つまたはそれ以上のマイクロウェルに負荷され得る。
本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞が液滴ベースのプラットフォームの１つまたはそれ以上の液滴に負荷され得る。少なくとも１つの細胞が原核細胞、真核細胞、または細菌細胞を含み得る。
本発明のいくつかの実施形態においては、測定は複数回行われる。
本発明のいくつかの実施形態においては、細胞培養過程で、最初にレゾルフィンを培養基と混合することにより調製されるステップと、次いでレゾルフィンを負荷した培養基に前記少なくとも１つの細胞を組み合わせるステップとを含むことにより作製し得る。
本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞の状態が少なくとも１つの細胞の代謝活性を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、この方法はさらに、レゾルフィンのジハイドロレゾルフィンへの還元の測定された程度に基づき細胞培養過程で少なくとも１つの生物学的実体の存在の有無を決定するステップを含む。
本発明のもう一つの態様において、複数の実験単位を含む高密度細胞培養プラットフォームの使用方法が提供される。この方法には、試料を高密度細胞培養プラットフォームに負荷し、複数の実験単位のうちの少なくとも１つの実験単位が少なくとも１つの細胞、ある量の栄養素およびレゾルフィンを含むステップと、嫌気的環境内の少なくとも１つの実験単位の少なくとも１つの細胞から複数の細胞を培養するステップと、少なくとも１つの実験単位の内容の蛍光を測定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、当該高密度細胞培養プラットフォームが実験単位としてマイクロウェルのアレイを確定する上面を有する微細加工装置であり、そのマイクロウェルが少なくとも１cm2当たり500のマイクロウェルもしくは少なくとも１cm2当たり750のマイクロウェルの表面密度を有する。本発明のいくつかの実施形態において、前記マイクロウェルのそれぞれの容量は５nL以下である。本発明のいくつかの実施形態において、この方法にはさらに、測定された蛍光に基づいて少なくとも１つの実験単位内の少なくとも１つの生物学的実体の存在の有無を決定するステップを含む。本発明のいくつかの実施形態において、この方法はさらに、測定された蛍光に基づいて複数の細胞から１つまたはそれ以上の標的位置にいくつかの細胞を選択し移動させるべきかどうかを決定するステップを含む。
いくつかの実施形態において、高密度細胞培養プラットフォームが液滴ベースのプラットフォームであり、その複数の実験単位のそれぞれが液滴ベースのプラットフォームの液滴を含む。
いくつかの実施形態に記載の微細加工装置またはチップを説明する透視図である。 それぞれがいくつかの実施形態に記載の微細加工装置またはチップの寸法を説明する上面図、側面図、端面図である。 それぞれがいくつかの実施形態に記載の微細加工装置またはチップを説明する分解組立図および上面図である。 ０、15および39時間培養後のマイクロウェルのアレイを有する微細加工チップの画像である。 0時間対15時間培養後のウェルの蛍光信号強度を示す。図４Ｃは0時間対39時間培養後のウェルの蛍光信号強度を示す。 本発明の方法の実施形態の微細加工チッププラットフォームで培養された、特定の代謝サンプルから回収した種レベルでの分離を示す棒グラフである。 異なる培養基を用いた本発明の方法の実施形態の微細加工チッププラットフォームで培養された、特定の代謝サンプルから回収した菌株の属レベルでの相対菌の数を示す棒グラフである。
発明の詳細な説明
本発明は細胞の生存能力、代謝活性、細胞増殖および細胞毒性アッセイに関するものであり、特に高生産性装置との使用に適している。
本発明の一つの目的は、レゾルフィンを用いて細胞成長、代謝活性および／または生存能力に基づき嫌気性条件もしくは嫌気性環境中で細胞を分析および／またはスクリーニングする方法を提供することである。
本発明は、いくつかの実施形態において、高密度細胞培養プラットフォームで実施される。培養プラットフォームはマイクロスケール実験単位の高密度アレイを含む高度に分割されたシステムであることができる。そこでは各マイクロスケール実験単位が１つまたはそれ以上の細胞を収容し、細胞培養、成長及び増殖のため他のマイクロスケール実験単位から独立した別個の環境を提供できる。
本発明のいくつかの実施形態において、高密度細胞培養プラットフォームは、微細加工装置（もしくは「チップ」）でありうる。本明細書で使用される場合、微細加工装置またはチップはマイクロウェル（または実験単位）のアレイを画定する場合がある。例えば、「高密度の」マイクロウェルを備える微細加工チップはcm2当たり約150マイクロウェルからcm2当たり約160,000マイクロウェルを含むことができる（例えば、１cm2当たり少なくとも150マイクロウェル、１cm2当たり少なくとも250マイクロウェル、１cm2当たり少なくとも400マイクロウェル、１cm2当たり少なくとも500マイクロウェル、１cm2当たり少なくとも750マイクロウェル、１cm2当たり少なくとも1,000マイクロウェル、１cm2当たり少なくとも2,500マイクロウェル、１cm2当たり少なくとも5,000マイクロウェル、１cm2当たり少なくとも7,500マイクロウェル、１cm2当たり少なくとも10,000マイクロウェル、１cm2当たり少なくとも50,000マイクロウェル、１cm2当たり少なくとも100,000マイクロウェル、１cm2当たり少なくとも160,000マイクロウェル）。微細加工チップの基板は、約10,000,000以上のマイクロウェルまたは場所を含む場合がある。例えば、マイクロウェルのアレイは、少なくとも96の場所、少なくとも1,000の場所、少なくとも5,000の場所、少なくとも10,000の場所、少なくとも50,000の場所、少なくとも100,000の場所、少なくとも500,000の場所、少なくとも1,000,000の場所、少なくとも5,000,000の場所、少なくとも10,000,000の場所を含む場合がある。マイクロウェルのアレイは格子状パターンを形成し、離れた領域または区域にまとめ得る。マイクロウェルの寸法はナノスケール（例えば、直径約１から100ナノメートル）からミクロスケールまでにわたる場合がある。例えば、各マイクロウェルは、直径約１μmから約800μm、直径約25μmから約500μm、または直径約30μmから約100μmのことがある。マイクロウェルは、直径約１μm以下、約５μm以下、約10μm以下、約25μm以下、約50μm以下、約100μm以下、約200μm以下、約300μm以下、約400μm以下、約500μm以下、約600μm以下、約700μm以下、約800μm以下の場合がある。例示的な実施形態において、マイクロウェルの直径は約100μm以下、または50μm以下であり得る。マイクロウェルは、深さ約25μmから約100μm、例えば、約１μm、約５μm、約10μm、約25μm、約50μm、約100μmの場合がある。また、これより深い場合もあり、例えば、約200μm、約300μm、約400μm、約500μmの場合がある。微細加工チップは、上面と底面の２つの主要な表面を持つことができる。ここでマイクロウェルは上面において開口部を有する。各マイクロウェルは、任意の形態の開口部または横断面を持つことができ、例えば、円形、六角形、正方形、またはその他の形状であり得る。各マイクロウェルは側壁を含むことができる。開口部または横断面が円形でないマイクロウェルの場合、本明細書に説明されているマイクロウェルの直径とは、相当面積を有する円形の有効径を表す。例えば、一辺の長さが10x10ミクロンの正方形のマイクロウェルの場合、相当面積(100平方ミクロン)を持つ円の直径は11.3ミクロンである。各マイクロウェルは側壁を含む場合がある。その側壁は直線、斜め、および／または湾曲状の断面形状を持つ場合がある。各マイクロウェルは底面を有し、これは平坦、円形、あるいは他の形態であり得る。微細加工チップ（その上にマイクロウェルを伴う）は重合体、例えば環状オレフィン重合体から精密射出成形またはエンボス加工などの他の行程を介して作成されることができる。その他の構成材料、例えばシリコンやガラスも利用可能である。チップは大幅に平面的な主要表面を持つ場合がある。図１は、微細加工チップの概略図を示し、このチップの縁は一般にチップ上の行と列の方向に並行である。
微細加工チップ上の高密度マイクロウェルは、少なくとも１つの生物学的実体（例、少なくとも１つの細胞）を含む試料を受容するために使用される。「生物学的実体」という用語は、有機体、細胞、細胞構成要素、細胞産物、およびウイルスを含み得るがこれらに限定されず、「種」という用語は、分類の単位を記述するために使用される場合があり、操作的分類単位（OTU）、遺伝子型、系統型、表現型、生態型、歴史、行動または相互作用、産物、変異型、および進化的に有意の単位を含むが、これらに限定されない。微細加工チップ上の高密度マイクロウェルは、さまざまな実験、例えば、さまざまな種の細菌、好気性、嫌気性、および／または通性好気性微生物などのその他の微生物（または細菌）の増殖または培養などを行うために使用され得る。マイクロウェルは哺乳類細胞などの真核細胞を用いる実験を行うために使用される場合がある。また、マイクロウェルは、さまざまなゲノム実験またはプロテオーム実験を行うために使用でき、細胞産物または構成要素、またはその他の生物学的物資または実体、例えば、細胞表面（例、細胞膜または壁）、代謝産物、ビタミン、ホルモン、神経伝達物質、抗体、アミノ酸、酵素、タンパク質、単糖類、ATP、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド（例、DNAまたはRNA）、化学物質、例えば色素、酵素基質などを含み得る。
微細加工チップ上のマイクロウェルの蛍光スクリーニングは、分光学的方法によるマイクロウェルの検索に関わる場合があり、例えば、マイクロウェルから発せられる蛍光を検出する、あるいはマイクロウェルから発せられる蛍光のないことを検出する蛍光検出器を使用することができる。また、ある基準（例えば、ある波長で蛍光を発する、もしくはある波長で蛍光を発しない）を満たすことを判定するマイクロウェルが選択されることができ、少なくとも１つのマイクロウェルの内容もしくは少なくとも１つのマイクロウェルの内容の一部が第二の場所に移動され得る。
いくつかの実施形態において、高密度細胞培養プラットフォームは、液滴ベースであることができ、例えば、微細加工チップ上の実験単位としてのウェルのアレイの代わりに、個別の液滴の集団が細胞、培養基、およびその他の細胞培養のための構成要素を保持するために使用され得る。液滴生成方法は、特にチップ上細胞選別機タイプの機器類と組み合わせたとき、複雑な環境サンプルから微生物を増殖させ、スクリーニングするために使用され得る。液滴は数百Hzで作成され得、これは、数時間で数百万の液滴が作成され得ることを意味する。単純な微小流体チップベースの装置は、液滴を生成するために使用される場合があり、液滴は、単一細胞を含むように操作しうる。細胞懸濁液を含む液滴を生成するシステムは、１つまたは少数の細胞を含む場合がある。液滴は乳濁液、二重乳濁液、ヒドロゲル、泡、および複合粒子などであり得る。例えば、液滴を混和できない液体の中に懸濁し、お互いから離れ、どの面も接触や汚染の起こらないようにする場合がある。水滴の容積は、10flと１μLの間であり得、高度単分散液滴は数ナノメートルから500μmまで作成しうる。液滴ベースの微小流体システムは、小液滴を生成、操作、および／またはインキュベーションするために使用される場合がある。細胞の生存と増殖は、バルク溶液における実験の管理と類似する場合がある。液滴の蛍光スクリーニングは、チップ上で、例えば、１秒当たり500滴の速度でなされ得る。液滴は一列にマイクロチャンネルを通し、分光法で、例えば、液滴から発せられる蛍光を検出する、もしくは液滴から発せられる蛍光のないことを検出する蛍光検出器を使用して、検査可能であり、ある基準（例、ある波長で蛍光を発する、もしくはある波長で蛍光を発しない）を満たすと判定されるこうした液滴は、ダイバージョンを介して分岐流路へと選択可能であり、そこから液滴は貯留、または回収され得る。ダイバージョンまたは流れの切り替えは弁、ポンプ、外部電場の適用等で達成し得る。
さまざまな実施形態において、１つの細胞は古細菌、細菌、あるいは真核細胞（例、真菌）である場合がある。例えば、１つの細胞は、好気性、嫌気性、あるいは通性好気性微生物のような微生物である場合がある。ウイルスはバクテリオファージである場合がある。他の細胞構成要素／産物は、タンパク質、アミノ酸、酵素、単糖類、アデノシン三リン酸(ATP)、脂質、核酸（例、DNAおよびRNA)、ヌクレオシド、ヌクレオチド、細胞膜／壁）、鞭毛、線毛、細胞小器官、代謝産物、ビタミン、ホルモン、神経伝達物質、抗体などを含む場合があるが、これらに限定はされない。
細胞の培養の場合、栄養素がしばしば提供される。栄養素は定義される場合もあり（例、化学的に定義される、あるいは合成培養基）、あるいは定義されない場合もある（例、基礎または複合培地）。栄養素は実験室で調製された、および／または市販用に製造された培養基（例、２つ以上の化学物質の混合物）を含むことも、あるいはこれらの構成要素であることもある。栄養素は、液体培養液（例、普通ブイヨン）を含むことも、その構成要素であることもあり、例としてはマリンブロス、溶原生ブロス（例、LBブロス）、等がある。栄養素は、寒天を混ぜた液体培地を含むことも、その構成要素であることもあり、固形培地および／または市販の製造された寒天プレート、例えば血液寒天培地を形成することがある。
栄養素は選択培地を含むことも、その構成要素であることもある。例えば、選択培地は特定の生物学的実体のみ、あるいは特定の特性（例、抗生物質抵抗性、または特定の代謝産物の合成）を有する生物学的実体のみの増殖のために使用される場合がある。栄養素は、鑑別培地を含む場合もあり、その構成要素であることもあり、あるタイプの生物学的実体を他のタイプの生物学的実体から、またはその他のタイプの生物学的実体から、特定の指示薬（例、中性赤、フェノール赤、エオシンy、またはメチレン青）の存在下における生化学的特性を用いて区別する。
栄養素は、自然環境からの抽出成分または自然環境由来の培養基を含む場合もあり、その構成要素である場合もある。例えば、栄養素は、特定のタイプの生物学的実体にとって自然な環境、異なる環境、または複数の環境由来のことがあり得る。環境には、１つまたはそれ以上の生物学的組織（例、結合織、筋肉、神経組織、上皮組織、植物表皮、血管組織、基本組織など）、生物学的液体またはその他の生物学的生成物（例、羊水、胆汁、血液、脳脊髄液、耳垢、浸出液、糞便物質、胃液、間質液、細胞内液、リンパ液、乳、粘液、瘤胃内容、唾液、皮脂、精液、汗、尿、膣分泌液、吐物、など）、微生物懸濁液、空気（例えば、異なる気体内容を含む）、超臨界二酸化炭素、土壌（例えば、鉱物、有機物質、気体、液体、有機体などを含む）、堆積物（例、農業、海洋、など）、有機生命体（例、植物、昆虫、孫田の小有機体と微生物）、死んだ有機物質、飼料（例、イネ科植物、マメ科植物、貯蔵牧草、作物残渣など）、鉱物、油、油脂製品（例、動物、野菜、石油化学）、水（例、天然由来淡水、飲料水、海水など）、下水（例、汚水、商業排水、産業排水、および／または農業排水、および表面流出水）を含むが、これらに限定はされない。
図１はいくつかの実施形態に記載の微細加工装置またはチップを説明する透視図である。チップ100は、上面102に射出成形特性を持つ顕微鏡スライド形式で形成された基盤を含む。この特性には、４つの離れたマイクロウェルアレイ（またはマイクロアレイ）104並びにエジェクターマーク106を含む。各マイクロアレイのマイクロウェルは格子状パターンで配列し、チップ100の縁の周りおよびマイクロアレイ104の間にはウェルのない縁がある。
図２Ａ-２Ｃはそれぞれ、いくつかの実施形態に記載のチップ100の寸法を説明する上面図、側面図、端面図である。図２Ａでは、チップ100の上面は、約25.5mm×75.5mmである。図２Ｂでは、チップ100の端面は約25.5 mm×0.8mmである。図２Ｃでは、チップ100の側面は約75.5mm×0.8mmである。
微細加工装置に試料が負荷された後、膜が微細加工装置の少なくとも一部に被せられる。図３Ａは微細加工装置300の分解組立図で、いくつかの実施形態に記載の図３Ｂの上面から見て示したものである。装置300は例えば、土壌細菌を収容するウェルのアレイ302を持つチップを含む。膜304はウェルのアレイ302の上面に置かれる。ガスケット306は膜304の上に置かれる。充填孔310を有するカバー308は、ガスケット306の上に置かれる。最後にシーリングテープ312がカバー308に被せられる。
膜は、１つまたはそれ以上の実験単位またはマイクロウェルを含め、微細加工装置の少なくとも一部をカバーし得る。例えば、微細加工装置に試料が負荷された後、少なくとも一枚の膜が、高密度マイクロウェルの少なくとも１つのマイクロウェルに被せられる。複数の膜が微細加工装置の複数部分に被せられることができる。例えば、別々の膜が、マイクロウェルの高密度アレイの別々のサブセクションに被せられ得る。
膜は微細加工装置に結合、付着、部分的に付着、貼付、密封、および／または部分的に密封されマイクロウェルの高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルの少なくとも１つの生物学的実体を保持することができる。例えば、膜はラミネート加工を用い、微細加工装置に可逆的に貼付できる。マイクロウェルの高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルの中の少なくとも１つの生物学的実体にアクセスするために、膜は、穴を開け、剥がし、取り外し、部分的に取り外し、除去し、および／または部分的に除去することができる。
少なくとも１つの実験単位、ウェル、またはマイクロウェルの細胞集団の一部は、（例えば、吸着を介して）膜に付着しうる。もしそうなら、少なくとも１つの実験単位、ウェル、またはマイクロウェルの細胞集団のその一部は膜に付着したままであるため、少なくとも１つの実験単位、ウェル、またはマイクロウェルの細胞集団は膜を剥がすことにより採取し得る。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの実験単位、ウェル、またはマイクロウェルの細胞集団は、針や吸引装置などの採取装置で膜に穴をあけ、少なくとも１つの実験単位における細胞集団の一部を目標位置に移動させることによりサンプリング可能である。
膜は不透過性、半透過性、選択的透過性、特異的透過性、および／または部分的透過性であり得、少なくとも１つの栄養素をマイクロウェルの高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルへ拡散させることができる。例えば、膜は、天然素材および／または合成素材を含み得る。膜は、ヒドロゲル層および／または濾紙を含み得る。いくつかの実施形態において、マイクロウェルに少なくともいくつか、またはすべての細胞を保持するのに十分小さい細孔径を持つ膜が選択される。哺乳類細胞の場合、細孔径は数ミクロンで、まだ細胞を保持できる場合がある。しかし、いくつかの実施形態において、細孔径は、0.2μm以下、例えば、0.1μmの場合がある。膜は、決まった細孔径のある場合も、ない場合もある複雑な構造を有する場合があることは理解されている。
一つの態様において、本発明は嫌気性条件下もしくは大気中の純粋または混合細胞培養における少なくとも１つの細胞の状態、例えば、代謝活性を評価する方法を提供する。細胞培養液はペトリ皿または96ウェルプレート、384ウェルプレートの区画などの伝統的細胞培養プラットフォームに負荷され得る。もしくは細胞は本明細書に記載されているように高密度細胞培養プラットフォームの１つまたはそれ以上の実験単位に負荷され得る。細胞培養プラットフォームは嫌気性条件下で細胞代謝活性に必要な二酸化炭素と水素を供給された嫌気性チャンバーで維持される場合もある。細胞培養はそうしたガスに対して透過性のある膜でおおわれている場合もある。モニターされている領域（例えばプレートのウェル、または微細加工チップ上のマイクロウェル、膜は剥がす必要のあることもその必要がないこともある）でのレゾルフィンの転換は、培養プラットフォームにおける異なる細胞負荷場所間の区別のできる十分な解像度を用い、レゾルフィンから発せられる蛍光強度によりモニター可能である。測定結果は細胞培養における細胞（単数または複数）の代謝活性レベルを示し得る。
本明細書で使用される場合、細胞の代謝活性には、細胞成長、細胞分裂及び増殖における細胞活性が含まれる。少なくとも１つの細胞には原核細胞、真核細胞、細菌、などが含まれ得る。
いくつかの実施形態において、測定されたレゾルフィンの蛍光に基づいて細胞培養液中に少なくとも１つの生物学的実体が存在するかどうかが決定される。例えば、測定された蛍光に基づいて、嫌気性細菌の種が存在するかどうかを判断できる。いくつかの実施形態において、測定された結果に基づいて、細胞培養からのいくつかの細胞を取捨選択し、標的位置に移動させることができる。
嫌気性条件下では、レサズリンは細胞培養基または環境により容易に還元される可能性があるため、細胞の代謝活性の指示薬として使用するには不適当である。こうした環境では、レゾルフィン=>ジハイドロレゾルフィン反応がより大きな還元電位を要し、レゾルフィンのジハイドロレゾルフィンへの還元が、より一般的なレサズリン=>レゾルフィン反応と類似した方法で細胞の代謝活性を検出するために使用し得る。こうした環境でレゾルフィンを使用する際には、細胞をレゾルフィンの還元電位以上のそれに保てるが、まだ酸素を除去するのに十分低く、かつ細胞が生存し続けられることが望ましい。培養基の種類、PH、および試薬または培養基内の他の種は細胞の、そしてレゾルフィンの還元電位に影響を及ぼし得る。
レゾルフィンは粉末形状で入手可能である。これは次いで嫌気性環境内、例えば嫌気性チャンバーの細胞培養基に導入することができる。細胞培養基に残存する酸素は、嫌気性チャンバーの気体を吸い出すか、CO2、N2またはその他の気体で流し出すことができる。次いで、レゾルフィンを負荷された培養基は、蛍光モニタリングを受ける培養プラットフォームに負荷することができる。
他の実施形態において、複数の実験単位を含む高密度細胞培養プラットフォームを使用する方法が提供され、これには試料をプラットフォームに負荷し、少なくとも１つの実験単位が少なくとも１つの細胞、ある量の栄養素（または培養基）、レゾルフィンを含むようにすること、嫌気環境内の少なくとも１つの実験単位の少なくとも１つの細胞から複数の細胞を培養すること、および少なくとも１つの実験単位の内容の蛍光を測定することを含む。この測定は、所定の時間、もしくは最後の２つ測定の間の差が所定の許容範囲内に達するまで、レゾルフィンを加えた後、培養過程の間の複数の時点で行われ得る。
いくつかの実施形態において、高密度細胞培養プラットフォームは微細加工装置であり、実験単位としてマイクロウェルのアレイを画定する上面を有し、そのマイクロウェルは１cm2当たり少なくとも500マイクロウェルまたは１cm2当たり少なくとも750のマイクロウェルの表面密度を有する。いくつかの実施形態において、マイクロウェルはそれぞれ５nL以下の容量を持つ場合がある。
いくつかの実施形態において、測定された蛍光に基づいて、少なくとも１つのマイクロウェルに少なくとも１つの生物学的実体が存在するかどうかが決定される。いくつかの実施形態において、測定された蛍光に基づいて、この方法はさらに少なくとも１つの実験単位（例えばマイクロウェル）からいくつかの細胞（１つもしくはそれ以上の細胞）を選択すること、選択された少なくとも１つの細胞を標的位置（例えば同じチップ上の他のマイクロウェル、目的細胞培養区画、または96ウェルプレートの中の１つのウェル、など）に移動させることを含む。
この例では、嫌気的条件下で微細加工チップのマイクロウェルでのBacteroides fragilisの成長がレゾルフィン指示薬でモニターされた。図４Ａは、０、15、39時間での培養後の微細加工チップを示しており（532nmで励起された蛍光）、ここで個々のウェルにおける細菌の成長が蛍光強度（または明るさ）の減少として示されている。図４Ｂは0時間対15時間における信号強度を示し、図４Ｃは、0時間対39時間における信号強度を示し、ここでは信号の減弱したマイクロウェルを表す青（暗）点が「陽性」で細菌を含み、灰色（明色調の点）が「陰性」であり、空である。この結果はされに、マイクロウェルから細菌細胞を96ウェルプレートに移すことにより確認されており、このプレートでは陰性は陰性に留まり、陽性はさらに成長を示した（培養基の混濁で示されている）。
この例ではヒト腸管内菌叢(HGM)試料が処理され分析された。より具体的には、人糞便試料からのクローン性集団が微細加工チップで嫌気的に培養され、微生物集団の１%未満を占める多くの分離株が回収された。
分離株ライブラリーを組み立てる上での重要な側面の１つは、ライブラリーがその由来微生物群を代表するようにすることである。ペトリ皿を使った培養では、希少種、および／または成長の遅い種を見逃す可能性がある。そうした種は微生物の全体の混合体のごく一部を占めるだけかもしれないが、希少種、および／または成長の遅い種は、微生物群の全体的平衡を維持する上で重要な役割を果たしている可能性があり、最重要な種である可能性さえある。希少種は、使用されている培養基に十分適応していない場合、または元来ゆっくり成長する場合、または多数存在し急速に発育する種に負けてしまう場合には見逃される可能性がある。
この例では、適切に希釈された複合試料が希釈され、微細加工装置（またはアレイ）のマイクロウェルに分配され、各マイクロウェルが１つの細菌しか含まぬようにし、従って株の間の直接的発育競争がないようにされる。第２に、高密度アレイプラットフォームにおいては複数の並行実験が容易かつ迅速に実施できるため、いくつかの異なる培養基を戦略的に検査することによりライブラリーの多様性を高めることが実用的である。
微細加工チップとその操作は完全に嫌気性チャンバーの中のことであり、アレイ負荷とシーリングから、アレイのインキュベーション、培養細胞の成長モニター用のアレイの画像撮影、規模拡大用の96ウェルプレートにおける代謝上活性のある培養細胞の移動およびシーリングまで、すべての段階が行われた。そして、これら96ウェルプレートのインキュベーションはすべて試料がチャンバーを離れることなく、また数十もしくは数百ものペトリ皿を管理する必要なしに達成可能である。
レゾルフィンは、HGM試料のための嫌気性代謝の指標として使用された。嫌気的発酵の代謝副産物による、レゾルフィンのジハイドロレゾルフィンへの生物学的還元はH2によるレゾルフィンの非生物還元より迅速に起こり、培養細胞を含むウェルから空のウェルを区別することができる。嫌気性条件下でのこの識別は、時間ゼロから、後それ以降の任意の時点まで、各ウェルの信号の変化を調べることにより達成される。空のウェルの示す非生物背景信号変化より蛍光の減少が大きいウェルが培養陽性とされる。
方法
対応メタゲノムデータ(CosmosID, Maryland)のある健康なヒトの糞便試料(The BioCollective, Colorado)が培養された。全資料に対する予備実験が行われ、最適ポアソン分布、すなわち１細菌を含むウェルの数が最大となり２細菌以上を含むウェルが最小数となるように、微細加工チップのマイクロウェルのアレイに負荷するための適切な細胞密度が決定された。通常１ウェル当たり0.3細胞を目標とすると１細胞だけを含むウェルが最適数となる。
アレイと全プラスチック製消耗品および機器は嫌気性チャンバー内で一晩ガス抜きして嫌気性条件に馴染ませた。負荷装置のすべての部品は使用前にオートクレーブで滅菌した。細胞の希釈液は検査するさまざまな培養基で調整し、成長指示薬レゾルフィンと混合し、これが最終濃度50μMとなるようにし、3.0mLずつ嫌気性チャンバー内の各アレイに負荷してからシールした。次いでアレイをスキャンしレゾルフィンの緑色蛍光のゼロ時間の数値を読み、37°Cで16から65時間嫌気的にインキュベーションし、毎日画像撮影を行って活性のある培養液を含むウェルを同定した。増殖陽性を示すウェルのサブセットから一定量の検体を取りアレイから96ウェルプレートに移し、５から10日間嫌気的にインキュベーションした。分離株は部分16S RNA Sangerシークエンシングで同定した。分類群レベルで解明が不十分な分離株は以後の分析から除外した。
この例で評価された培養基はGifu嫌気性培地(GAM)、ブレインハートインフュージョン（BHI）、ブルセラ血液寒天（BRU）、ペプトン酵母エキスグルコースブロス(PYGB)、および糖質添加酵母カシトン脂肪酸寒天(YCFAC)である。
結果
対応メタゲノムデータの利用可能な健康ドナーからの固有ヒト糞便６検体が培養され、2790分離株が得られた。分離株のSangerシークエンシングが示したのは、５門、９綱、12目、19科、27属、および45種である。少なくとも６分離株が回収された23種は棒グラフで示されている（図５は健康ドナー糞便６試料から回収された種レベルの分離株を示す）。
６検体の中にはさらに分離株が５以下であった22種が同定された（以下の表１参照）。
Figure 2023500796000003
 これらの分離株は培養による捕捉の観点から相対的にまれであるのみならず、ほぼすべての場合において、対応メタゲノムデータはこれらの種あるいは属が試料に見出される率は0.2%以下であると予測していた。
種レベルでの同定のためSanger 16S RNAシークエンシングデータをメタゲノムデータから予想率と比較すると、微生物群のまれなメンバーを捕捉する上で微細加工チップベースの高密度培養プラットフォームの強みが明らかである。試料HGM-6から単離された33種は５門、８綱、10目、16科、および20属を表している（表２参照：メタゲノミクス（MTG）による百分率相対存在量を付した単一試料(HGM-6)から回収された分離株の種レベルでの分類群）。これらの33種のうち、18種は1.0%未満の存在量で存在すると予想され、まれな株を分離するこのシステムの能力を証明している。メタゲノミクス分析で同定されなかった同じ試料の中の７種も高密度プラットフォームに基づく方法論により同定された。
Figure 2023500796000004
さらに、複数の培養基が並行して評価され、試料に存在する可能性のある培養困難株が存在するかどうか決定された。図６を参照されたい。この図は、異なる培養基ごとに属レベルで捕捉された株の相対菌数を示す。
当業者に理解されていることとして、広く説明されている発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されているように、多くの変形および／または修正が発明に対してなされる場合がある。現在の実施形態は、従って、全ての点において制限的でなく、例示的なものとして見なされるべきである。

Claims (17)

  1. 嫌気的環境でレゾルフィンを含む細胞培養過程で少なくとも１つの細胞の状態を同定する方法であって、
    嫌気的環境で細胞培養を維持する一方、細胞培養過程でレゾルフィンのジハイドロレゾルフィンへの還元の程度の測定方法。
  2. 前記測定が細胞培養過程で蛍光を測定することを含むことを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
  3. 前記少なくとも１つの細胞が微細加工チップの１つまたはそれ以上のマイクロウェルに負荷されることを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
  4. 前記少なくとも１つの細胞が液滴ベースのプラットフォームの１つまたはそれ以上の液滴に負荷されることを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
  5. 前記少なくとも１つの細胞が原核細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
  6. 前記少なくとも１つの細胞が真核細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
  7. 前記少なくとも１つの細胞が細菌細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  8. 前記測定が複数回行われることを特徴とする請求項１の測定方法。
  9. 前記細胞培養過程において、最初にレゾルフィンを培養基と混合することにより調製されるステップと、次いでレゾルフィンを負荷した培養基に前記少なくとも１つの細胞を組み合わせるステップとを含むことを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
  10. 前記少なくとも１つの細胞の状態が少なくとも１つの細胞の代謝活性を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 前記レゾルフィンのジハイドロレゾルフィンへの還元の測定された程度に基づき細胞培養過程で少なくとも１つの生物学的実体の存在の有無を決定するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  12. 複数の実験単位を含む高密度細胞培養プラットフォームの使用方法で、
    試料を高密度細胞培養プラットフォームに負荷し、複数の実験単位のうちの少なくとも１つの実験単位が少なくとも１つの細胞、ある量の栄養素およびレゾルフィンを含むステップと、
    嫌気的環境内の少なくとも１つの実験単位の少なくとも１つの細胞から複数の細胞を培養するステップと、
    少なくとも１つの実験単位の内容の蛍光を測定するステップと、を含む使用方法。
  13. 前記高密度細胞培養プラットフォームが実験単位としてマイクロウェルのアレイを確定する上面を有する微細加工装置であり、そのマイクロウェルが少なくとも１cm2当たり500のマイクロウェルもしくは少なくとも１cm2当たり750のマイクロウェルの表面密度を持つことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 前記マイクロウェルのそれぞれが5nL未満の容積を有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  15. 測定された蛍光に基づいて少なくとも１つの実験単位内の少なくとも１つの生物学的実体の存在の有無を決定するステップを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  16. 測定された蛍光に基づいて複数の細胞から１つまたはそれ以上の標的位置にいくつかの細胞を選択し移動させるべきかどうかを決定するステップを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  17. 前記高密度細胞培養プラットフォームが液滴ベースのプラットフォームであり、その複数の実験単位のそれぞれが液滴ベースのプラットフォームの液滴を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。

JP2022522819A 2019-10-18 2020-10-18 嫌気性条件下で細胞の代謝活性をモニターするためのレゾルフィンの使用 Pending JP2023500796A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962923321P 2019-10-18 2019-10-18
US62/923,321 2019-10-18
US202063009398P 2020-04-13 2020-04-13
US63/009,398 2020-04-13
PCT/US2020/056208 WO2021077057A1 (en) 2019-10-18 2020-10-18 Use of resorufin for monitoring metabolic activity of cells under anaerobic condition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023500796A true JP2023500796A (ja) 2023-01-11

Family

ID=75490944

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022522819A Pending JP2023500796A (ja) 2019-10-18 2020-10-18 嫌気性条件下で細胞の代謝活性をモニターするためのレゾルフィンの使用

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20210115367A1 (ja)
EP (1) EP4045897A4 (ja)
JP (1) JP2023500796A (ja)
CN (1) CN114746741A (ja)
AU (1) AU2020365149A1 (ja)
CA (1) CA3154848A1 (ja)
IL (1) IL292224A (ja)
WO (1) WO2021077057A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018075701A1 (en) * 2016-10-19 2018-04-26 General Automation Lab Technologies, Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods for screening microorganisms and other high throughput microbiology applications

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030162164A1 (en) * 2001-04-20 2003-08-28 Biolog, Inc. Comparative phenotype analysis of cells, including testing of biologically active compounds
AU2002323649A1 (en) * 2001-09-06 2003-03-24 Genomic Profiling Systems, Inc. Rapid detection of replicating cells
US7901947B2 (en) * 2006-04-18 2011-03-08 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based particle sorting
CN101153317B (zh) * 2007-10-19 2010-12-15 北京航空航天大学 一种连续检测组织工程支架和组织植入物上活细胞量的方法
WO2012051437A1 (en) * 2010-10-13 2012-04-19 Life Technologies Corporation Compositions and assays for determining cell viability
US10449542B2 (en) * 2014-10-28 2019-10-22 The Governing Council Of The University Of Toronto Electrochemical metabolic activity detecting device
US10900073B2 (en) * 2015-04-21 2021-01-26 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods for high throughput microbiology applications
US20200317738A1 (en) * 2016-05-26 2020-10-08 University College Cork - National University Of Ireland, Cork Methods for increasing proliferation of mammalian cells
WO2018005391A1 (en) * 2016-06-30 2018-01-04 General Automation Lab Technologies, Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods using magnetic beads for high throughput microbiology applications
JP2019520826A (ja) * 2016-06-30 2019-07-25 ジェネラル オートメーション ラボ テクノロジーズ インコーポレイテッド ハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置、並びに結合的な媒体戦略を使用する方法
WO2018098402A1 (en) * 2016-11-28 2018-05-31 Sonanutech Inc. Methods, compositions, and kits for detecting bacteriophage in a sample
CN107917869B (zh) * 2017-11-16 2020-06-19 苏州浚惠生物科技有限公司 体液样本中稀有肿瘤细胞的检测分型方法及其试剂盒
EP3775255A4 (en) * 2018-03-27 2021-11-24 Selux Diagnostics, Inc. METABOLIC TEST FOR BACTERIAL GROWTH AND GRAMTYPING

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018075701A1 (en) * 2016-10-19 2018-04-26 General Automation Lab Technologies, Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods for screening microorganisms and other high throughput microbiology applications

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN J. L. ET AL.: ""Metabolic reduction of resazurin; location within the cell for cytotoxicity assays"", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 115, no. 2, JPN6024042879, 9 November 2017 (2017-11-09), pages 351 - 358, XP071153739, ISSN: 0005583581, DOI: 10.1002/bit.26475 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021077057A1 (en) 2021-04-22
CN114746741A (zh) 2022-07-12
IL292224A (en) 2022-06-01
AU2020365149A1 (en) 2022-04-28
EP4045897A4 (en) 2023-12-20
EP4045897A1 (en) 2022-08-24
US20210115367A1 (en) 2021-04-22
CA3154848A1 (en) 2021-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6837473B2 (ja) ハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置、並びに方法
US10865434B2 (en) High resolution systems, kits, apparatus, and methods for screening microorganisms and other high throughput microbiology applications
EP3532600A1 (en) High resolution systems, kits, apparatus, and methods for screening microorganisms and other high throughput microbiology applications
US20190374945A1 (en) Method for assaying biological sample on microfabricated chip
JP2019520825A (ja) 磁性粒子を用いたハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置および方法
US20200347337A1 (en) Method of selecting microorganism isolates on a high-density growth platform
JP2023500796A (ja) 嫌気性条件下で細胞の代謝活性をモニターするためのレゾルフィンの使用
EP3478415A1 (en) High resolution systems, kits, apparatus, and methods using combinatorial media strategies for high throughput microbiology applications
US20220193666A1 (en) Screening of fluorescent microbes using microfabricated device
WO2018005390A1 (en) High resolution systems, kits, apparatus, and methods using lateral flow for high throughput microbiology applications

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20231012

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20241023

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20241101

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20250430