JP2023512559A - 体液においてｔｂを検出するためのｃｒｉｓｐｒに基づくアッセイ - Google Patents

Abstract

本開示は、体液サンプルにおいてヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の存在を検出するための方法を記載する。方法は、ガイドＲＮＡおよびレポーター分子と共にＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を利用し、それにより、ガイドＲＮＡが標的ヌクレオチド断片とハイブリダイズする場合に、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がレポーター分子を切断することで、検出可能なシグナルを生じる。

Description

先行関連出願
本出願は、２０２０年２月６日出願の米国特許出願第６２／９７１，２１０号に基づく優先権を主張し、該出願は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書中に組み入れられる。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
適用なし。

本開示は、一般的に、血清、血漿、尿および脳脊髄液（ＣＳＦ）などの循環体液中で結核（ＴＢ）を検出する方法に関し、より詳細には、ＣＲＩＳＰＲに基づくレポーターシステムを用いて血清中で結核を検出する方法に関する。

結核（ＴＢ）は、毎年数百万人が罹患する重病であり、全世界で上位１０の死因のうちに入る。診断の遅れが死亡につながり得る。喀痰サンプルが、肺結核を診断するために主に用いられるが、一部の患者、例えば、非常に重症であるかまたは非常に若い患者は、喀痰を吐き出すことができない。

現在、ＴＢ診断は、喀痰サンプルを必要とするＸｐｅｒｔ ＭＴＢ／ＲＩＦ（登録商標）に依存する。喀痰中の細菌量は多いが、サンプルとして回収するのが困難な場合がある。加えて、喀痰は、すべてのＴＢ患者、特に肺外結核患者からは回収できない場合があり、肺外結核（ＥＰＴＢ）は、特にＨＩＶ患者では一般的である。

血液は、喀痰よりも回収が容易かつ信頼度が高いので、特にＨＩＶ感染患者では、血液がＴＢ検出に対する代替的な候補である。しかしながら、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）は、血液検査では稀にしか検出されない。ＴＢ血液培養は、陽性になるまで数週間を要する場合があり、かつ、ある特定の設備を有する施設を必要とする。核酸増幅検査は、血液では低い感度（２０～５５％）に起因して理想的とは言えず、これは、低い細菌量、ＰＣＲ阻害因子の存在、またはこれらの検査に対して典型的に利用されるサンプルの体積の少なさが原因であり得る。

したがって、高い特異度を有する、結核のための高感度血清検査に対する必要性がある。

本開示は、血清サンプルにおいてヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（「ＭＴＢ」）を検出するための方法を記載する。本開示の方法を図示する図１を参照されたい。最初のステップでは、核酸を、血清サンプルなどのサンプルから抽出する。続いて、存在する場合にはＭＴＢ特異的配列を標的として、核酸を増幅する。次に、増幅産物を、レポーター分子と共にｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲシステムと反応させる。ＭＴＢ特異的配列が存在する場合、ｇＲＮＡがこれにハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化し、その後ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がレポーター分子を切断することで、レポーター分子により生成されるシグナルの測定に基づいて、ＭＴＢの存在を決定することができる。

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）は、細菌および古細菌などの原核生物のゲノム内に見出されるＤＮＡ配列のファミリーである。これらの配列は、以前に原核生物に感染したバクテリオファージのＤＮＡ断片に由来し、後続の感染中に類似のファージ由来ＤＮＡを検出および破壊するために用いられ、したがって、原核生物免疫系の重要な部分として機能する。

ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（「Ｃａｓ９」）は、ＣＲＩＳＰＲ配列に対して相補的なＤＮＡの特異的鎖を認識および切断するためのガイドとしてＣＲＩＳＰＲ配列を用いる酵素である。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、２個の小さなｃｒＲＮＡ分子およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む４成分系である。２個のＲＮＡ配列は、１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）へと融合されたもので、ガイドＲＮＡにより特定されるＤＮＡ標的を見出しかつ切断するためにＣａｓ９をガイドする。Ｃａｓ９酵素は、ＣＲＩＳＰＲ配列と一緒に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９として知られる技術の基礎を形成し、この技術は、生物内で遺伝子を編集するために用いることができる。ガイドＲＮＡのヌクレオチド配列を操作することにより、人工的Ｃａｓ９システムを、切断に対していずれかのＤＮＡ配列を標的化するためにプログラムすることができる。

Ｃａｓファミリーの別のメンバーであるヌクレアーゼＣａｓ１２ａ（以前にはＣｐｆ１として公知であった）は、以下の点をはじめとするＣａｓ９とのいくつかの重要な差異を示した：Ｃａｓ９により生成される「平滑」切断部とは対照的な、二本鎖ＤＮＡ中の「ジグザグ」切断部を生じさせること、「Ｔリッチ」プロトスペーサー隣接モチーフに依存すること、したがってＣａｓ９に対する代替的な標的化部位を提供すること、および標的化の成功のために１個のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡしか必要としないこと。

Ｃａｓ１３（４種類のサブタイプ：Ｃａｓ１３ａ～ｄを含む）は、Ｃａｓ９と同様に機能し、標的特異性をコードするために約６４ｎｔガイドＲＮＡを用いる。Ｃａｓ１３タンパク質は、ｃｒＲＮＡ中の短いヘアピンの認識を介してガイドＲＮＡと複合体を形成し、かつ標的特異性は、標的領域に対して相補的な２８～３０ｎｔスペーサーによりコードされる。プログラム可能なリボヌクレアーゼ活性に加えて、すべてのＣａｓ１３は、標的転写産物の認識および切断後に付随的活性を示し、これによりスペーサーに対する相補性とは無関係にいずれかの近傍の転写産物の非特異的分解がもたらされる。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ａ（以前にはＣｐｆ１として公知であった）、Ｃａｓ９またはＣａｓ１３である。しかしながら、高い特異度を有する有効な検出を達成できる限り、他のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いることができる。

特定の遺伝子中でのその長さおよび位置を変化させることによりｇＲＮＡを適正に設計することによって、所望の特異度および感度を伴ってＤＮＡ断片を標的化することができる。したがって、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ－ｇＲＮＡ法を用いて、血清中でのＭＴＢの高感度かつ高特異度の検出を数時間のうちに達成することができる。５μＬの血清サンプル中の単一コピーのＭＴＢ ＤＮＡを検出できることが予期される。

方法はまた、ＭＴＢと非結核性抗酸菌（ＮＴＭ）とを区別し、かつ菌種特異的ＤＮＡ断片を標的化することによりマイコバクテリウム属（Mycobacterium）菌種を特定するためにも用いることができる。ＮＴＭ感染は、ＭＴＢにより生じるものと類似の症状を有し、１５０種類を超える異なるＮＴＭ菌種が記載されてきているので、肺検体でのこれらの生物の特定は、活動性感染と常に一致するわけではない。診断を確立するためには補助的なＸ線所見および臨床所見が必要であり、ＮＴＭ感染を治療または撲滅することは、困難であった。

ＭＴＢ検出を強化するために、さらなる変法を行うことができる。一実施形態では、抗ＤＮＡ抗体を用いてまず処理することにより、血清サンプルから抽出されるＤＮＡを、さらに富化することができる。別の実施形態では、サンプルからヒトＤＮＡを枯渇させるために、血清サンプルから抽出されるＤＮＡを、抗ヒトＤＮＡ抗体を用いてさらに処理することができる。

一実施形態では、抗ヒトＤＮＡ抗体は、抗５－メチルシチジン（５ｍＣ）抗体である。しかしながら、抗ＣｐＧ ＤＮＡメチル化などのメチル化ＤＮＡに結合できる限り、他の抗体またはタンパク質を用いることができ、５－メチルシチジン（５－ｍＣ）５－ヒドロキシメチル－（５－ｈｍＣ）、５－ホルミル－（５－ｆＣ）および５－カルボキシル－（５－ｃａＣ）シトシン抗体；ＣｐＧ ＤＮＡメチル化結合性タンパク質、メチル－ＣｐＧ結合性ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質：ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＭＢＤ５、ＭＢＤ６、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、Ｋａｉｓｏおよびそれらの抗体；ならびに抗Ｎ７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、５－メチルシチジン（５ｍＣ）およびそれらの酸化型５－ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、シュードウリジン（Ψ）およびイノシン（Ｉ）ＲＮＡ抗体などのメチル化ＲＮＡ；ならびにメチルＲＮＡ結合性タンパク質ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、ＦＴＯ、ＡＬＫＢＨ５、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＴＨＤＣ１、ＺＮＦ２１７およびそれらの抗体が挙げられる。

増幅に先立って細胞外小胞（ＥＶ）を単離することにより、さらなる富化を達成することができる。ＥＶは、多小胞体（multi-vesicular body）が形質膜に融合する際に、エンドソーム細胞区画から生じる小型の膜性小胞である。分泌されたＥＶは、比較的安定であり、親細胞／細菌由来のタンパク質、ポリペプチド、遺伝子、可溶性因子および膜結合型受容体／リガンドの効果的な担体として作用し、したがって、ヒト血清または血漿から超遠心分離により単離されるＥＶは、ＭＴＢ ＤＮＡまたはＲＮＡ収量を増加させることができる。

ＥＶを単離するために、１００，０００ｇ（４２，０００ｒｐｍ）を超える超遠心分離が、一般的に行われる。しかしながら、当業者は、密度勾配分離、ポリマーに基づく沈殿、免疫学的選別、マイクロ流体単離、サイズ排除クロマトグラフィー、膜ろ過、膜親和性単離などの、ＥＶを単離するための他の方法を理解する。

密度勾配分離とは、異なる密度プロフィールのスクロース溶液上にサンプルを積載し、続いて超遠心分離を行って、それによりＥＶをタンパク質凝集物および他の不純物から分離できる方法を指す。例えば、密度勾配超遠心分離は、５０％、３０％、および１０％イオジキサノール層上に血漿サンプルを積載することにより行い、続いて１２０，０００×ｇで２４時間遠心分離することができる。１０種類の画分（Ｆ１～１０）を上部から下部に向かって回収し、最も高いＥＶ含有量を有する画分を、続いてさらに精製することができる。

ポリマーに基づく沈殿は、生物学的サンプルをポリマー含有沈殿溶液と混合するステップ、それに続くインキュベーションおよび低速での遠心分離を含む。用いられる最も一般的なポリマーのうちの１種は、ポリエチレングリコールである。

免疫選別技術は、細胞外小胞上の公知の表面マーカーを標的化する、抗体に基づく分離方法を用いる。これらのマーカーのうちの一部は、小胞の表面上の、十分に特性決定されているテトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）または免疫調節因子分子（ＭＨＣ ＩおよびＩＩ）を含む。

マイクロ流体単離は、微小流路中にＥＶを捕捉することに基づき、生物流体の低体積入力に対する選択肢であり得る。

サイズ排除クロマトグラフィーは、分子量ではなくサイズに基づいて巨大分子を分離するために用いられる。この技術は、複数の孔およびトンネルを含有する多孔性ポリマービーズを詰めたカラムを利用する。分子はその直径に応じてビーズを通過する。小さな半径を有する分子は、カラムの孔を通して移動するのにより長い時間がかかり、巨大分子はより早くカラムから溶出される。サイズ排除クロマトグラフィーは、大きな分子と小さな分子との正確な分離を可能にする。さらに、様々な溶出溶液を、この方法に利用することができる。

膜ろ過もまた、エクソソームの単離のために用いることができる。微小小胞のサイズによって、この方法は、タンパク質および他の巨大分子からのＥＶの分離を可能にする。ＥＶはまた、多孔性構造を介して捕捉することによっても単離することができる。特に、微小円柱状多孔性ケイ素線毛状構造（micropillar porous silicon ciliated structure）が、４０～１００ｎｍのＥＶを単離するために設計された。標準的ろ過技術に加えて、接線流ろ過もまた、ＥＶの効果的な単離のために用いることができる。この方法は、遊離ペプチドおよび他の小型化合物を除去することにより、十分に決定されたサイズを有するＥＶの単離のために用いられる。

各技術はその利点および欠点を有するので、様々なＤＮＡ増幅技術を用いることができる。本開示の方法は、ＰＣＲ、ＲＰＡ、ＲＣＡ、ＬＡＭＰなどの一般的なＤＮＡ増幅技術、および任意の新規に開発された増幅方法を利用することができる。

方法は、増幅とＣＲＩＳＰＲ検出とを組み合わせる。増幅ステップでは、反応バッファー中のハイブリダイゼーションエンハンサー成分を、ＤＮＡ増幅の各サイクル中に特異的プライマー－鋳型ハイブリダイゼーションを強化するために用いることができ、それにより、ミスプライミングが防止され、かつＤＮＡ増幅特異度および収量が改善される。本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ検出に対して５μＬの血清サンプル中の単一コピーから、ＭＴＢ ＤＮＡを増幅できることを予期する。

ハイブリダイゼーションエンハンサーは、ガイドＲＮＡと標的配列とのハイブリダイゼーションをさらに改善し、かつミスマッチを低減することができるので、ＣＲＩＳＰＲ検出ステップまでさらに持ち越すことができる。そのようなエンハンサーは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性を安定化および強化し、かつシグナルを増幅できることが期待される。

一実施形態では、ハイブリダイゼーションエンハンサーは、熱安定性ＡｃｃｕＰｒｉｍｅアクセサリータンパク質である。これらは、ＰＣＲの各サイクル中に特異的プライマー－鋳型ハイブリダイゼーションを強化し、それにより、ミスプライミングが防止され、かつＰＣＲ特異度および収量が改善される。ハイブリダイゼーションの特異度を強化できる限り、他のハイブリダイゼーションエンハンサーもまた用いることができる。ハイブリダイゼーションエンハンサーの非限定例としては、アニオン性ポリマー、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションバッファーおよび類似のバッファー成分、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅアクセサリータンパク質、ＵＬＴＲＡｈｙｂ（商標）超高感度ハイブリダイゼーションバッファーなどが挙げられる。

本明細書中で用いる場合、「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」または「ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質」または「ＣＲＩＳＰＲ酵素」とは、限定するものではないが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（以前にはＣｐｆ１として公知であった）、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃ２ｃ１、Ｃｃ３、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄをはじめとする、クラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を指す。一実施形態では、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、好ましくはＣｐｆ１エフェクタータンパク質である。

本明細書中で用いる場合、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」とは、相補的標的ＤＮＡ配列に結合して、標的ＤＮＡ鎖との緊密な接触へとＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをガイドする非コードＲＮＡ配列を指す。

本明細書中で用いる場合、「レポーター分子」とは、蛍光およびクエンチャー、金ナノ粒子またはビオチン－ＦＡＭを用いて標識された一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡを指し、レポーターの解離を、蛍光リーダーまたは、例えば、紙側方流動アッセイ（paper lateral flow assay）もしくは分光計などでの比色変化のいずれかにより検出することができる。

本明細書中で用いる場合、「標的ＤＮＡ断片」は、ＭＴＢ特異的ＤＮＡ配列の一部分である。例えば、ＩＳ６１１０は、ＭＴＢゲノム当たり複数コピーで存在するＭＴＢ複合体特異的挿入配列である。４９５位、５１６位および５３３位でのｇｒｙＢ突然変異が、フルオロキノロン耐性ＭＴＢに存在することが報告されており、ｅｓｘＢは、その病原性に寄与する、ＭＴＢにより分泌されるＣＦＴ－１０タンパク質である。したがって、これらのＤＮＡ断片を標的化することにより、ＭＴＢの検出が容易になることになる。さらなる標的ＤＮＡ断片はまた、以下のＭＴＢ遺伝子からも選択することができる：ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｅｍｂＢ、ｅｉｓおよびｐｎｃＡ。

本明細書中で用いる場合、「ＤＮＡ増幅」または「核酸増幅」とは、それにより遺伝子またはＤＮＡの断片のコピー数が、他の遺伝子の比例する増加を伴わずに増加する、天然および人工的プロセスを指す。

本明細書中で用いる場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、ＤＮＡポリメラーゼおよび標的領域の各末端に対して相補的な２種類のプライマー（フォワードおよびリバース）をｄＮＴＰと共に用いることにより、ＤＮＡ鎖の特異的標的領域を増幅する方法を指す。

本明細書中で用いる場合、「リコンビナーゼポリメラーゼ増幅」またはＲＰＡとは、リコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質および鎖置換性ポリメラーゼを用いて、特異的標的領域を増幅する方法を指す。リコンビナーゼは、オリゴヌクレオチドプライマーを相同配列と二重鎖ＤＮＡに対形成させ、一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質が、ＤＮＡの置き換えられた鎖に結合して、プライマーが取り除かれることを防止する。３７～４２℃の至適温度で、反応が迅速に進み、かつＰＣＲにより必要とされる熱的または化学的融解を必要とせずに、特異的ＤＮＡ増幅が生じる。

本明細書中で用いる場合、「核酸配列に基づく増幅」またはＮＡＳＢＡとは、１つの温度で、単一混合物において、核酸、特にＲＮＡ配列を継続的に増幅するための、プライマー依存的方法を指す。３種類の酵素が用いられる：逆転写酵素、リボヌクレアーゼＨ、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。２種類のプライマーが用いられる：第１のプライマーは、標的配列に対して相補的な３’－末端配列およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの５’－末端センス配列を含み；第２のプライマーは、Ｐ１プライミングされるＤＮＡ鎖に対して相補的な配列を含む。最初に、ＲＮＡ鋳型を反応混合物に加え、ここで第１のプライマーが鋳型の３’末端でその相補的部位に結合する。逆転写酵素は、逆向きの相補的ＤＮＡ鎖を合成し、プライマーの３’末端を伸長して、ＲＮＡ鋳型に沿って上流へと移動する。このとき、リボヌクレアーゼＨが、ＤＮＡ－ＲＮＡ化合物からＲＮＡ鋳型を破壊する（リボヌクレアーゼＨは、一本鎖ＲＮＡでなく、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリット中のＲＮＡのみを破壊する）。続いて、第２のプライマーが、（アンチセンス）ＤＮＡ鎖の５’末端に結合する。その後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが二本鎖上のプロモーター領域に結合すると、逆転写酵素は、結合したプライマーから別のＤＮＡ鎖を再び合成して、二本鎖ＤＮＡを生じる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは３’から５’方向にのみ転写することができるので、センスＤＮＡが転写され、アンチセンスＲＮＡが生成される。これが繰り返され、ポリメラーゼは鋳型の相補的ＲＮＡ鎖を継続的に生成して、増幅が起こる。

このとき、その前のステップと同様のサイクル相が始まることができる。しかしながら、ここで、第２のプライマーは最初に（－）ＲＮＡに結合し、このとき、逆転写酵素は（＋）ｃＤＮＡ／（－）ＲＮＡ二重鎖を生成する。リボヌクレアーゼＨが再びＲＮＡを分解し、第１のプライマーが今や一本鎖である＋（ｃＤＮＡ）に結合し、続いて逆転写酵素が相補的（－）ＤＮＡを生成し、ｄｓＤＮＡ二重鎖がつくられる。最後に、Ｔ７ポリメラーゼは、プロモーター領域に結合し、（－）ＲＮＡを生成し、サイクルが完了する。

本明細書中で用いる場合、「ローリングサークル増幅」またはＲＣＡとは、環状ＤＮＡ鋳型および特別なＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼを用いて、短いＤＮＡまたはＲＮＡプライマーが増幅されて、長い一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが形成される、等温酵素的プロセスを指す。ＲＣＡ産物は、環状鋳型に対して相補的な数十から数百個のタンデム反復を含有するコンカテマーである。

本明細書中で用いる場合、「ループ媒介等温増幅」またはＬＡＭＰとは、２種類または３種類のプライマーセットおよび複製活性に加えて高い鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いて、６０～６５℃の一定温度で標的配列が増幅される、単一チューブＤＮＡ増幅法を指す。典型的には、４種類の異なるプライマーが、標的遺伝子上の６箇所の異なる領域を増幅するために用いられ、これにより特異度が増加する。追加のペアの「ループプライマー」は、反応をさらに加速させることができる。

本明細書中で用いる場合、「レポーター分子」とは、検出可能なレポーター基に連結されたヌクレオチドを有する分子を指し、これにより、ヌクレオチドが一致する配列とハイブリダイズする場合に、レポーター基が検出可能なシグナルを生成する。非限定的なレポーター分子としては、蛍光およびクエンチャー、金ナノ粒子、ビオチン－ＦＡＭを用いて標識された一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。

本明細書中で用いる場合、「抗ヒトＤＮＡ抗体」とは、抗原として二本鎖ヒトＤＮＡを標的とする、抗核抗体を指す。

本明細書中で用いる場合、「抗ＭＴＢ抗体」とは、その特異的メチル化パターンにより、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）ＤＮＡを標的とする抗体を指す。

特許請求の範囲または明細書中で用語「含む」と組み合わせて用いられる場合、単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の使用は、文脈がそうでないことを指示しない限り、１または２以上を意味する。

用語「約」とは、明記された値±測定誤差の余地または測定方法が示されない場合には±１０％を意味する。

特許請求の範囲での用語「または」の使用は、選択肢のみを指すことが明示的に示されていない限り、または選択肢が相互に排他的である場合、「および／または」を意味するために用いられる。

用語「含む」、「有する」、「が挙げられる」および「含有する」（ならびにそれらの変形）は、オープンエンドな連結動詞であり、特許請求の範囲で用いられる場合、他の要素の追加を許容する。

語句「からなる」は、閉じており、かつすべての追加的要素を除外する。

語句「本質的に～からなる」は、追加の物質的要素を除外するが、本発明の性質を実質的に変化させない非物質的要素の包含を許容する。

以下の略語が本明細書中で用いられる：

本開示の方法の図示を示す図である。 血清サンプルの蛍光結果を示す図である。

本開示は、血清サンプルにおいてＭＴＢ ＤＮＡを検出する新規方法を提供する。方法は、ａ）血清サンプルから核酸を抽出するステップ；ｂ）標的核酸配列を増幅するステップ、およびｃ）ＣＲＩＳＰＲ媒介システムを用いて標的核酸配列の存在を検出するステップを含み、ＣＲＩＳＰＲ媒介システムは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、標的核酸配列とハイブリダイズするガイドＲＮＡ、およびレポーター分子を含む。

ＤＮＡ増幅ステップで用いられるプライマーは、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）菌種の間で保存されているか、またはある特定の薬物耐性に関して報告されているＭＴＢ遺伝子配列のみを増幅するために設計される。例えば、ＩＳ６１１０は、ＭＴＢ特異的挿入配列である。ｅｓｘＢ、ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｅｍｂＢ、ｅｉｓおよびｐｎｃＡなどの他のＭＴＢ特異的遺伝子もまた増幅することができる。

ヒト型結核菌（M. tuberculosis）ＩＳ６１１０のＤＮＡ配列は、受託番号Ｘ１７３４８．１に見出すことができる。Ｈ３７Ｒｖ株由来のヒト型結核菌（M. tuberculosis）ｅｓｘＢのＤＮＡ配列は、ＡＬ１２３４５６．３（４３５２２７４～４３５２５７６）に見出すことができる。Ｈ３７Ｒｖ株由来のヒト型結核菌（M. tuberculosis）ｇｒｙＢのＤＮＡ配列は、ＡＬ１２３４５６．３（５２４０～７２６７）に見出すことができる。プライマーの設計では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質により認識可能なＰＡＭを増幅することに焦点が置かれる。

ｇＲＮＡ配列は、標的断片およびＤＮＡ増幅ステップで用いられるプライマーに従って設計された。言い換えれば、ｇＲＮＡ配列は、ＩＳ６１１０、ＩＳ９８６、ｅｓｘＢ、ｇｒｙＢ、ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｅｍｂＢ、ｅｉｓまたはｐｎｃＡのうちの一部である。これらの遺伝子は、表１に列挙される。

本発明は、標的断片としてのＩＳ６１１０、ｅｓｘＢ、ｇｒｙＢに関して例示される。しかしながら、これらの標的は例に過ぎず、本発明は、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）菌種の中の他の保存領域に広く適用することができる。以下の実施例は、例示的であることのみが意図され、添付の特許請求の範囲を過度に限定することは意図されない。

[実施例１]
４種類のサンプルを、以下の通りに回収／調製した。本開示の方法は、４種類すべてのサンプルに対して行われた。

１．ＤＮＡ抽出

血清サンプルからＤＮＡを抽出するために、以下の材料を用いた：Ｓ＆Ｐ ５×消化バッファー、プロテイナーゼＫ、Ｓ＆Ｐ ＤＮＡ結合バッファー、Ｚｙｍｏ－Ｓｐｉｎ（商標）ＩＩＩ－Ｓカラムアセンブリ、Ｓ＆Ｐ ＤＮＡ Ｐｒｅｐ洗浄バッファー、Ｓ＆Ｐ ＤＮＡ洗浄バッファー、ＤＮＡ溶出バッファー（１０ｎＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、ｐＨ８．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）、および１．５ｍＬチューブを含む、Ｑｕｉｃｋ－ｃｆＤＮＡ（商標）血清＆血漿キット（Ｄ４０７６）。

血清サンプルが－８０℃で保存される場合、まずサンプルを室温に３０分間置き、融解させる。１００μＬの融解血清を、ＤＮＡ低結合性チューブの中で２５μＬのＳ＆Ｐ ５×消化バッファーおよび１０μＬのプロテイナーゼＫと混合した。

その後、混合物を、消化のために５５℃で３０分間インキュベートし、続いて、消化済みサンプルに２容積のＳ＆Ｐ ＤＮＡ結合バッファーを添加し、十分に混合した。

続いて、混合物全体を、１．５ｍＬチューブの中のＺｙｍｏ－Ｓｐｉｎ（商標）ＩＩＩ－Ｓカラムアセンブリに移し、１０００ｇで２分間遠心分離した。フロースルーを廃棄した。

４００μＬのＳ＆Ｐ ＤＮＡ Ｐｒｅｐバッファーをカラムに添加し、１００００ｇ以上で３０秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。４００μＬのＳ＆Ｐ洗浄バッファーを用いてカラムを２回洗浄し、それぞれ１００００ｇ以上で１分間遠心分離した。

続いて、カラムを１．５ｍＬ ＤＮアーゼ不含チューブに移した。４０μＬのＤＮＡ溶出バッファーをカラムマトリックスに直接添加し、室温で３分間インキュベートし、続いて、最大速度で３０秒間遠心分離した。次に、回収したＤＮＡを、さらなる使用まで－２０℃で保存した。

２．ＤＮＡ増幅
ＤＮＡ増幅の例としてＰＣＲを行ったが、上述の通り、他のＤＮＡ増幅技術を用いることができる。ＰＣＲを行うために、以下の材料を用いた：ＤＥＰＣ処理水（１９０７０４１）、プライマーＦおよびプライマーＲ（以下の表中のリスト）、１０×ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲバッファー、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼシステム。

ＭＴＢゲノムのＩＳ６１１０、ｅｓｘＢおよびｇｒｙＢを増幅するために、３ペアのプライマーを設計した。ＩＳ６１１０を選択した理由は、上述の通り、ＭＴＢゲノムがその複数コピーを有し、これにより感度を増加できるからである。ｅｓｘＢは異なるマイコバクテリウム属（Mycobacterium）菌種の間で保存されているので、ｅｓｘＢに対するプライマーを設計した。ｇｒｙＢに対するプライマーは、ＭＴＢがフルオロキノロン耐性であるか否かを特異的に検出するために設計した。本ステップで用いられる設計されたプライマーを、以下に列記する：

以下の成分を、室温で、滅菌薄壁０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに添加した：

チューブの内容物を十分に混合し、簡潔に遠心分離して内容物を回収した。チューブをサーマルサイクラーにおいて９５℃で２分間インキュベートして、ＤＮＡ鋳型を完全に変性させ、かつ酵素を活性化した。

続いて、３５サイクルのＰＣＲ増幅を以下の通りに行った：変性：９５℃３０秒間；アニーリング：６０℃３０秒間、伸長：７２℃３０秒間。３５サイクルの完了後、反応混合物の温度を４℃で維持した。次に、得られたＰＣＲ産物を、次のステップまで－２０℃で保存した。

３．ＣＲＩＳＰＲ検出
増幅ステップ後、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いるＭＴＢ検出を、以下の材料を用いて行った：ＤＥＰＣ処理水（１９０７０４１）、ＥｎＧｅｎ（登録商標）Ｌｂａ Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）２．１、ｇＲＮＡ（以下の表中のリスト）、蛍光レポーター（５’－６－ＦＡＭ－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－ＢＨＱ１）、およびＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６ウェルハーフエリアマイクロプレート。

上述の通り、ｇＲＮＡ配列を、標的断片およびＰＣＲプライマーに従って設計した。それらを以下に列記する：

ＣＲＩＳＰＲ検出ステップを行うために、以下の成分をハーフエリアマイクロプレートウェルに添加し、十分に混合し、室温で１０分間インキュベートした：

バッファー溶液からＰＣＲ産物を分離するのではなく、バッファー溶液混合物を含むＰＣＲ産物をＣＲＩＳＰＲ検出混合物に添加したことに留意されたい。これもまた、検出感度を増大させる。

システムを、振動させながら暗所にて３７℃で２０分間インキュベートした。プレートリーダーを用いて蛍光シグナルを測定した。結果を図２に示す。サンプルが陰性対照のシグナル強度に対して２倍高いシグナル強度を生じる場合に、陽性であると規定される。図２に見て取れる通り、陽性サンプル１、２、および４は、陽性対照と同等の蛍光強度を示す一方、陰性サンプル３は陰性対照と同等の蛍光強度を示す。

予測的な例１
最良の結果を得るために、ＣＲＩＳＰＲ検出ステップでの（Ｃａｓ１２ａ：ｇＲＮＡ：レポーター分子）の比率を変化させ、それ以外は、ＤＮＡ抽出、ＤＮＡ増幅およびＣＲＩＳＰＲ検出ステップは実施例１と同じである。この最適化比率は、本方法の特異度および感度をさらに改善する。

予測的な例２
本方法の感度をさらに改善するために、血清サンプルからのＭＴＢ－ＤＮＡ富化および／またはヒトＤＮＡ枯渇が、ＤＮＡ増幅ステップに先立って行われる。ヒトＤＮＡは、抗ヒトＤＮＡ抗体のエピトープとして機能する特異的メチル化パターンを有する。血清サンプル中のヒトＤＮＡを枯渇させるために抗ヒトＤＮＡ抗体を用いて抽出済みＤＮＡを処理することにより、本開示の方法の感度がさらに改善されることが予期される。

同様に、ＭＴＢ ＤＮＡは、系統または菌種特異的でありかつ抗ＭＴＢ抗体に対するエピトープとして機能することができる、それ自体の特異的メチル化パターンを有する。したがって、ＭＴＢ ＤＮＡ断片のみを捕捉するために抗ＭＴＢ抗体を用いて血清サンプルを処理することにより、本方法の感度をさらに改善することができる。

以下の参考文献は、すべての目的のためにその全体で参照により組み入れられる。

Claims (22)

1. 体液サンプルにおいてヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（ＭＴＢ）を検出する方法であって、
   ａ）体液サンプルからＭＴＢ標的核酸配列を増幅するステップ；および
   ｂ）ＣＲＩＳＰＲ媒介システムを用いて前記ＭＴＢ標的核酸配列の存在を検出するステップ
   を含み、
   前記ＣＲＩＳＰＲ媒介システムが、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、ＭＴＢ標的核酸断片とハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質による切断時に検出可能であるレポーター分子を含む、方法。
2. ａ－１）前記体液サンプルから核酸を抽出するステップ
   をステップａ）の前にさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記標的核酸断片がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
4. ステップａ－１）において、前記抽出ステップが、
   ａ－２）抗ヒトＤＮＡ抗体を用いてヒトＤＮＡを枯渇させるステップ
   をさらに含む、請求項２に記載の方法。
5. ステップａ－１）において、前記抽出ステップが、
   ａ－３）抗ＭＴＢ抗体を用いてＭＴＢ細菌ＤＮＡを富化するステップ
   をさらに含む、請求項２に記載の方法。
6. ステップａ－１）において、前記抽出ステップが、
   ａ－４）超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、ポリマー沈殿、膜ろ過または膜親和性単離のうちの少なくとも１種により細胞外小胞を単離するステップ
   をさらに含む、請求項２に記載の方法。
7. ステップａ）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、またはループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）を用いて行われる、請求項３に記載の方法。
8. ステップａ）がＰＣＲを用いて行われる、請求項７に記載の方法。
9. ハイブリダイゼーションエンハンサーが前記ＰＣＲで用いられ、前記ハイブリダイゼーションエンハンサーが検出ステップｂ）に移行される、請求項８に記載の方法。
10. ステップｂ）において、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ９およびＣａｓ１３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
11. 前記レポーター分子が、蛍光およびクエンチャー、金ナノ粒子、またはビオチン－ＦＡＭを用いて標識された一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
12. 前記レポーター分子が、５’－６－ＦＡＭ－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－ＢＨＱ１である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記体液サンプルが、血清、血漿または尿から取得される、請求項１に記載の方法。
14. ステップａ）が室温で行われる、請求項２に記載の方法。
15. 前記標的ＤＮＡ配列が、ＩＳ６１１０、ＩＳ９８６、ｅｓｘＢ、ｇｒｙＢ、ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｅｍｂＢ、ｅｉｓおよびｐｎｃＡのうちの一部である、請求項２に記載の方法。
16. 前記ＤＮＡ増幅のためにステップｂ）でプライマーのペアが用いられ、前記プライマーが配列番号１および２である、請求項２に記載の方法。
17. 前記ＤＮＡ増幅のためにステップｂ）でプライマーのペアが用いられ、前記プライマーが配列番号３および４である、請求項２に記載の方法。
18. 前記ＤＮＡ増幅のためにステップｂ）でプライマーのペアが用いられ、前記プライマーが配列番号５および６である、請求項２に記載の方法。
19. ステップｃ）において、前記ｇＲＮＡが、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のうちの少なくとも１つを有する、請求項１に記載の方法。
20. 前記標的核酸断片である、請求項１に記載の方法。
21. 血清サンプルにおいてヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（ＭＴＢ）を検出する方法であって、
    ａ）血清サンプルからＤＮＡを抽出してＤＮＡサンプルを生成するステップ；
    ｂ）ＰＣＲまたはＲＰＡを用いて前記ＤＮＡサンプルからＭＴＢ標的ＤＮＡ配列を増幅し、増幅されたＤＮＡを生成するステップであり、プライマーのペアが用いられ、前記プライマーが配列番号１と２、３と４または５と６である、ステップ；および
    ｃ）ＣＲＩＳＰＲ媒介システムを用いて前記増幅されたＤＮＡにおいてＭＴＢ標的ＤＮＡ断片の存在を検出するステップ
    を含み、
    前記ＣＲＩＳＰＲ媒介システムが、Ｃａｓ１２ａ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびＣａｓ１２ａによる切断時に検出可能であるレポーター分子を含み、
    前記ｇＲＮＡが、配列番号７、８または９である、方法。
22. ステップａ）において、前記抽出ステップが、
    ａ－１）抗ヒトＤＮＡ抗体を用いて前記血清サンプルもしくは前記ＤＮＡサンプルからヒトＤＮＡを枯渇させるステップ、
    ａ－２）抗ＭＴＢ抗体を用いることにより、前記血清サンプルもしくは前記ＤＮＡサンプルからＭＴＢ細菌ＤＮＡを富化するステップ、または
    ａ－３）超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、ポリマー沈殿、膜ろ過もしくは膜親和性単離のうちの少なくとも１種により細胞外小胞を単離するステップ
    のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
    

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