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JP2024507808A - 逆ペプチド - Google Patents

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JP2024507808A JP2023549664A JP2023549664A JP2024507808A JP 2024507808 A JP2024507808 A JP 2024507808A JP 2023549664 A JP2023549664 A JP 2023549664A JP 2023549664 A JP2023549664 A JP 2023549664A JP 2024507808 A JP2024507808 A JP 2024507808A
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Abstract

Figure 2024507808000001
本発明は、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる免疫原性ペプチドに関する。本発明はまた、このようなペプチドをコードするポリヌクレオチド、ウイルス感染を処置および予防するためのこのようなペプチドおよびポリヌクレオチドの使用、ならびに本発明のペプチドを含む複合体に関する。

Description

優先権
本出願は、２０２１年２月１６日に出願されたＧＲ２０２１０１０００９９および２０２１年６月２日に出願されたＵＳ６３／１９６，１２８の優先権を主張し、その内容および要素は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる免疫原性ペプチドに関する。本発明はまた、このようなペプチドをコードするポリヌクレオチド、ウイルス感染を処置および予防するためのこのようなペプチドおよびポリヌクレオチドの使用、ならびに本発明のペプチドを含む複合体に関する。
コロナウイルスは、哺乳動物および鳥類において疾患を引き起こす関連ウイルスの群である。コロナウイルス感染症の症状は種によって異なる。例えば、ニワトリにおけるコロナウイルス感染症は上気道疾患を引き起こすのに対して、ウシおよびブタにおけるコロナウイルス感染症は下痢を引き起こす傾向がある。
ヒトでは、コロナウイルスは気道感染症を引き起こす。風邪などの一部のコロナウイルスによる感染によって引き起こされる疾患は軽度であり得る。他のコロナウイルスは、ＳＡＲＳ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、ＭＥＲＳ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）およびＣＯＶＩＤ－１９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）などのより重篤で潜在的に致死的な疾患を引き起こす。コロナウイルス感染症の大流行の制御は、正確な検査および／または有効なワクチン接種を伴う戦略に依存するので、ワクチンおよび検査の提供が非常に望ましい。
本発明は、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる免疫原性ペプチドに関する。換言すれば、免疫原性ペプチドは、コロナウイルスのゲノムの逆相補配列の少なくとも一部によってコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる。免疫原性ペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープなどのエピトープを含む。本発明はまた、免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ウイルス感染を処置および予防するためのこのような免疫原性ペプチドおよびポリヌクレオチドの使用、ならびに免疫原性ペプチドを含む複合体に関する。
本発明者らは、驚くべきことに、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞上のＭＨＣクラスＩ分子によって提示され、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＯＲＦによって（すなわち、ＯＲＦ１ａｂポリタンパク質遺伝子の逆相補配列の一部によって）コードされる、いくつかの免疫原性ペプチドを特定した。ＯＲＦはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の間で広く保存されており、したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する選択的利点を与えると考えられる。保存されたＯＲＦによってコードされる１つまたは複数の免疫原性ペプチドを医薬組成物に含めることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御能力および／または治療能力を付与することができる。保存されたＯＲＦによってコードされる１つまたは複数の免疫原性ペプチドを医薬組成物に含めることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の１種または複数のコロナウイルス（またはコロナウイルス株）に対する防御能力および／または治療能力を付与することもできる。複数のこのような免疫原性ペプチド（例えば、それぞれ異なるＨＬＡスーパータイプに結合することができる）を医薬組成物に含めることにより、異なるＨＬＡ型を有する個体において予防的および／または治療的に有効な広域スペクトル組成物を提供することができる。同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御能力は、本発明者らによって特定された免疫原性ペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）ベースの組成物によって付与され得る。
本発明者らによって特定された免疫原性ペプチドはまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的免疫応答および／または他のコロナウイルスに特異的な免疫応答の調査において有用性を有し得る。この目的のために、本発明の免疫原性ペプチドは、ＭＨＣ分子に結合した免疫原性ペプチドを含む複合体として提供され得る。
本発明者らはまた、驚くべきことに、エンデミック風邪コロナウイルス２２９Ｅに感染した細胞上のＭＨＣクラスＩ分子によって提示され、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでゲノムの一部によって（すなわち、ゲノムの逆相補配列の一部によって）コードされるＯＲＦによってコードされる免疫原性ペプチドを特定した。
したがって、本発明は、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされるポリペプチド由来のエピトープを含む免疫原性ペプチドを提供する。
本発明はさらに、
－本発明の免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）；
－本発明の免疫原性ペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を含む医薬組成物；
－コロナウイルス感染症を予防および／または処置する方法であって、本発明の医薬組成物を個体に投与するステップを含む方法；
－個体のコロナウイルス感染症を予防および／または処置する方法における使用のための本発明の医薬組成物；ならびに
－ＭＨＣ分子に結合した本発明の免疫原性ペプチドを含む複合体
を提供する。
本明細書に記載される発明は、そのような組み合わせが明らかに許容されないまたは明示的に回避される場合を除いて、態様および／または好ましい特徴の全ての組み合わせを含む。
翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦの位置を示す概略図である。 翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムの一部によってコードされるＯＲＦ内の配列番号２～１２のペプチドの位置を示す概略図である。 ペプチドＡＬＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮ（配列番号２）のフラグメント質量スペクトルを示す図である。 ペプチドＬＨＳＲＴＳＦＣＭＶＧＦＳ（配列番号３）のフラグメント質量スペクトルを示す図である。 ペプチドＬＳＩＰＣＡＳＳＤＦＳＴ（配列番号４）のフラグメント質量スペクトルを示す図である。 ペプチドＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮＮＬＡＰＦ（配列番号５）のフラグメント質量スペクトルを示す図である。 ペプチドＬＹＶＡＬＬＶＡＬＬＴＣＱ（配列番号６）のフラグメント質量スペクトルを示す図である。 ペプチドＱＴＩＧＬＣＮＮＬＡＰ（配列番号７）のフラグメント質量スペクトルを示す図である。 ペプチドＲＬＳＩＰＣＡＳＳＤＦ（配列番号８）のフラグメント質量スペクトルを示す図である。 ペプチドＴＣＱＴＩＧＬＣＮＮＬＡＰＦＬ（配列番号９）のフラグメント質量スペクトルを示す図である。 ペプチドＴＬＨＳＲＴＳＦＣＭＶ（配列番号１０）のフラグメント質量スペクトルを示す図である。 ペプチドＶＡＬＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮ（配列番号１１）のフラグメント質量スペクトルを示す図である。 ペプチドＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ（配列番号１２）のフラグメント質量スペクトルを示す図である。 英国ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株におけるＯＲＦ１００変異性（実施例３）を示す図である。グラフは、ＯＲＦ１００の各位置についての正規化シャノンエントロピーを示す。０の値は高度に保存された位置に対応し、１は２０個のアミノ酸のいずれかが見出される確率が等しい位置を表すことに留意されたい。 クレード、サンプリング日、地理的位置に関係ないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のＯＲＦ１００変異性（実施例４）を示す図である。グラフは、ＯＲＦ１００の各位置についての正規化シャノンエントロピーを示す。０の値は高度に保存された位置に対応し、１は２０個のアミノ酸のいずれかが見出される確率が等しい位置を表すことに留意されたい。 図１５の拡大図である。 コンセンサス配列と初期ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列およびコウモリトコロナウイルスＯＲＦ１００配列のアラインメントを示す図である。 ネガティブセンスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドによるＰＢＭＣ（ドナーＥＶＢ０００２８、ＥＶＢ０００３１およびＥＶＢ０００３３由来）の刺激からのＥＬＩＳＰＯＴデータを示す図である。 ネガティブセンスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドによるＰＢＭＣ（ドナーＥＶＢ０００２８、ＥＶＢ０００３１およびＥＶＢ０００３３由来）の刺激からのＥＬＩＳＰＯＴデータを示す図である。 ネガティブセンスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドによるＰＢＭＣ（ドナーＥＶＢ０００２８、ＥＶＢ０００３１およびＥＶＢ０００３３由来）の刺激からのＥＬＩＳＰＯＴデータを示す図である。 ネガティブセンスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドによるＰＢＭＣ（ドナーＥＶＢ０００２８、ＥＶＢ０００３１およびＥＶＢ０００３３由来）の刺激からのＥＬＩＳＰＯＴデータを示す図である。 ネガティブセンスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドによるＰＢＭＣ（ドナーＥＶＢ０００２８、ＥＶＢ０００３１およびＥＶＢ０００３３由来）の刺激からのＥＬＩＳＰＯＴデータを示す図である。 ＥＶＢ０００２８由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００２８由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００２８由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００２８由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００２８由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００２８由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００２８由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００２８由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００２８由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００３３由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００３３由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００３３由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００３３由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００３３由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００３３由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００３３由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００３３由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 ＥＶＢ０００３３由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す図である。 Ａ＊２４０２／ＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ－ＡＰＣ ＭＨＣデキストラマー染色分析を示す図である。 Ａ＊２４０２／ＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ－ＡＰＣ ＭＨＣデキストラマー染色分析を示す図である。 Ａ＊２４０２／ＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ－ＡＰＣ ＭＨＣデキストラマー染色分析を示す図である。 Ａ＊２４０２／ＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ－ＡＰＣ ＭＨＣデキストラマー染色分析を示す図である。 Ａ＊２４０２／ＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ－ＡＰＣ ＭＨＣデキストラマー染色分析を示す図である。 Ａ＊２４０２／ＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ－ＡＰＣ ＭＨＣデキストラマー染色分析を示す図である。 ＯＲＦ１００をコードするポリヌクレオチドについての予想されるサイズのポリヌクレオチドに関連するバンドを示す図である。 ペプチドＲＬＳＩＰＣＡＳＳＤＦ（確認済）についての質量スペクトルの検証を示す図である。Ａ．細胞溶解物からのフラグメント質量スペクトル；Ｂ．合成ペプチドからのフラグメント質量スペクトル。矢印は、各群における同一性を示す一部の典型的なイオンピークを指す。 ペプチドＲＬＳＩＰＣＡＳＳＤＦ（確認済）についての質量スペクトルの検証を示す図である。Ａ．細胞溶解物からのフラグメント質量スペクトル；Ｂ．合成ペプチドからのフラグメント質量スペクトル。矢印は、各群における同一性を示す一部の典型的なイオンピークを指す。 ペプチドＴＬＨＳＲＴＳＦＣＭＶ（確認済）についての質量スペクトルの検証を示す図である。Ａ．細胞溶解物からのフラグメント質量スペクトル；Ｂ．合成ペプチドからのフラグメント質量スペクトル。矢印は、各群における同一性を示す一部の典型的なイオンピークを指す。両群は同じ前駆イオンピーク：Ａ（６４１．４３）およびＢ（６４１．４５）を有する。別の一致するイオンピークはＹ６：パネルＡ（３４４．２４）およびパネルＢ（３３５．２１）である。この差は、水分子の損失および電荷＋２に起因し、よって、パネルＢは、８質量／電荷の減少を示す。 ペプチドＴＬＨＳＲＴＳＦＣＭＶ（確認済）についての質量スペクトルの検証を示す図である。Ａ．細胞溶解物からのフラグメント質量スペクトル；Ｂ．合成ペプチドからのフラグメント質量スペクトル。矢印は、各群における同一性を示す一部の典型的なイオンピークを指す。両群は同じ前駆イオンピーク：Ａ（６４１．４３）およびＢ（６４１．４５）を有する。別の一致するイオンピークはＹ６：パネルＡ（３４４．２４）およびパネルＢ（３３５．２１）である。この差は、水分子の損失および電荷＋２に起因し、よって、パネルＢは、８質量／電荷の減少を示す。 ペプチドＶＡＬＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮ（確認済）についての質量スペクトルの検証を示す図である。Ａ．細胞溶解物からのフラグメント質量スペクトル；Ｂ．合成ペプチドからのフラグメント質量スペクトル。矢印は、各群における同一性を示す一部の典型的なイオンピークを指す。合成ペプチド（パネルＢ）と比較して、細胞溶解物中のペプチド（パネルＡ）は低い存在量を示し、８００～１２００（ｍ／ｚ）の領域のフラグメントイオンピークが少なくなる。しかしながら、両パネルにはまだＹ４、Ｂ８などのシグネチャフラグメントイオンピークが存在する（矢印参照）。 ペプチドＶＡＬＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮ（確認済）についての質量スペクトルの検証を示す図である。Ａ．細胞溶解物からのフラグメント質量スペクトル；Ｂ．合成ペプチドからのフラグメント質量スペクトル。矢印は、各群における同一性を示す一部の典型的なイオンピークを指す。合成ペプチド（パネルＢ）と比較して、細胞溶解物中のペプチド（パネルＡ）は低い存在量を示し、８００～１２００（ｍ／ｚ）の領域のフラグメントイオンピークが少なくなる。しかしながら、両パネルにはまだＹ４、Ｂ８などのシグネチャフラグメントイオンピークが存在する（矢印参照）。 ペプチドＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ（確認済）についての質量スペクトルの検証を示す図である。Ａ．細胞溶解物からのフラグメント質量スペクトル；Ｂ．合成ペプチドからのフラグメント質量スペクトル。矢印は、各群における同一性を示す一部の典型的なイオンピークを指す。 ペプチドＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ（確認済）についての質量スペクトルの検証を示す図である。Ａ．細胞溶解物からのフラグメント質量スペクトル；Ｂ．合成ペプチドからのフラグメント質量スペクトル。矢印は、各群における同一性を示す一部の典型的なイオンピークを指す。 対照群および感染群におけるＨｃｏＶ２２９Ｅ由来ペプチドの概要を示す図である。 対照群および感染群における自己由来ペプチドの概要を示す図である。
配列表の説明
配列番号１－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦのポリヌクレオチド配列。各ｎは、ｔおよびｕから独立して選択される。一態様では、各ｎが、例えば、ｔであり得る。すなわち、ｎの全てがｔであってもよい。別の態様では、各ｎが、例えば、ｕであり得る。すなわち、ｎの全てがｕであってもよい。さらなる態様では、ｎの一部がｔであり得、ｎの一部がｕであり得る。すなわち、配列は、ｔとｕの組み合わせを含み得る。
配列番号２－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる免疫原性ペプチド。
配列番号３－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる免疫原性ペプチド。
配列番号４－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる免疫原性ペプチド。
配列番号５－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる免疫原性ペプチド。
配列番号６－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる免疫原性ペプチド。
配列番号７－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる免疫原性ペプチド。
配列番号８－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる免疫原性ペプチド。
配列番号９－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる免疫原性ペプチド。
配列番号１０－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる免疫原性ペプチド。
配列番号１１－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる免疫原性ペプチド。
配列番号１２－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる免疫原性ペプチド。
配列番号１３－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるコンセンサスアミノ酸配列。
配列番号１４－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスで重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２分離株ＷＩＶ０４（ＭＮ９９６５２８．１）のゲノムによってコードされるＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列。
配列番号１５－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスで武漢海鮮市場肺炎ウイルス分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１（ＮＣ０４５５１２．２）のゲノムによってコードされるＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列。
配列番号１６－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコウモリコロナウイルス分離株ＲａＴＧ１３（ＭＮ９９６５３２．１）のゲノムによってコードされるＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列。
配列番号１７－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコウモリＳＡＲＳ様コロナウイルス分離株ｂａｔ－ＳＬ－ＣｏＶＺＸＣ２１（ＭＧ７７２９３４．１）のゲノムによってコードされるＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列。
配列番号１８－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコウモリＳＡＲＳ様コロナウイルス分離株ｂａｔ－ＳＬ－ＣｏＶＺＣ４５（ＭＧ７７２９３３．１）のゲノムによってコードされるＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列。
配列番号１９－実施例で使用したオリゴ。
配列番号２０－実施例で使用したオリゴ。
配列番号２１－実施例で使用したオリゴ。
配列番号２２－実施例で使用したオリゴ。
配列番号２３－実施例で使用した増幅プライマー。
配列番号２４－実施例で使用した増幅プライマー。
配列番号２５：実施例で使用したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ鋳型プライマー。
キー：ＬＮＳＯＲＦ１００についてのＴ７プロモーターコザックプライマー
配列番号２６：実施例で使用したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ鋳型プライマー。
キー：ポリ（Ａ）プライマー
配列番号２７～４５－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡと同じセンスでエンデミック風邪コロナウイルス２２９Ｅ（ＮＰ＿０７３５４９．１）のゲノムによってコードされるアミノ酸配列。
配列番号４６－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでエンデミック風邪コロナウイルス（ＮＰ＿０７３５４９．１）のゲノムによってコードされるＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列。
配列番号５７～５２－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡと同じセンスでエンデミック風邪コロナウイルス２２９Ｅのゲノムによってコードされるアミノ酸配列。
配列番号５３－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでエンデミック風邪コロナウイルス２２９Ｅ（ＮＰ＿０７３５４９．１）のゲノムによってコードされるＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列。
配列番号５４～６２－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡと同じセンスでエンデミック風邪コロナウイルス２２９Ｅ（ＮＰ＿０７３５４９．１）のゲノムによってコードされるアミノ酸配列。
ここで、本発明の態様および実施形態を、添付の図面を参照して説明する。さらなる態様および実施形態は、当業者には明らかであろう。本文で言及される全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスは、それらのゲノムＲＮＡのセンスまたは極性に応じてポジティブセンスまたはネガティブセンスとして分類される。ネガティブセンスｓｓＲＮＡウイルスでは、ネガティブセンス（３’→５’）ゲノムＲＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、一般に翻訳前にＲＮＡポリメラーゼによってポジティブセンスＲＮＡに変換されなければならない。コロナウイルスなどのポジティブセンスｓｓＲＮＡウイルスでは、ポジティブセンス（５’→３’）ゲノムＲＮＡはｍＲＮＡとしても機能することができ、宿主細胞内でタンパク質に翻訳され得る。すなわち、ネガティブセンスｓｓＲＮＡウイルスの複製は、一般に、ゲノムに相補的なｍＲＮＡを形成するゲノムの転写、およびｍＲＮＡの翻訳後に起こる。ポジティブセンスｓｓＲＮＡウイルスの複製は、一般に、ｍＲＮＡとして二倍になるゲノムＲＮＡの翻訳後に起こる。
伝統的に、ｓｓＲＮＡウイルスのネガティブセンスＲＮＡはノンコーディングであると考えられてきた。しかしながら、非標準翻訳が可能であり得る。インフルエンザウイルスなどのある特定のネガティブセンスｓｓＲＮＡウイルスのネガティブセンスゲノムＲＮＡは、実際には５’→３’方向に翻訳可能であり、標準翻訳（すなわち、相補的ｍＲＮＡを形成する３’→５’への転写、およびｍＲＮＡの５’→３’への翻訳）を介して得られるものとは異なる遺伝子産物をもたらし得るようである。同様に、ポジティブセンスｓｓＲＮＡウイルスのゲノムに相補的なＲＮＡも、実際には翻訳可能であり得る。
コロナウイルスはポジティブセンスｓｓＲＮＡウイルスである。本発明者らは、コロナウイルスにおける非標準翻訳から得られるポリペプチドが、コロナウイルスに感染した個体の免疫系によって認識されるペプチドを含み得ることを実証するデータを得た。例えば、コロナウイルスにおける非標準翻訳から得られるポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子による提示およびＣＤ８＋Ｔ細胞上に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識が可能なペプチドを含み得る。換言すれば、コロナウイルスにおける非標準翻訳から得られるポリペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであるペプチドを含み得る。コロナウイルスにおける非標準翻訳から得られるポリペプチドは、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子による提示およびＣＤ４＋Ｔ細胞上に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識が可能なペプチドを含み得る。換言すれば、コロナウイルスにおける非標準翻訳から得られるポリペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープであるペプチドを含み得る。コロナウイルスにおける非標準翻訳から得られるポリペプチドは、例えば、抗体への特異的結合および／またはＢ細胞上に存在するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）による認識が可能なペプチドを含み得る。換言すれば、コロナウイルスにおける非標準翻訳から得られるポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープであるペプチドを含み得る。いずれのこのような免疫原性ペプチドも、コロナウイルスに対する免疫応答を誘導するために、例えば医薬組成物で個体に投与され得る。このようにして、予防および／または治療を達成することができる。
一般的定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」を含み、「免疫原性ペプチド（ａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は２つ以上のこのような免疫原性ペプチドを含むなどである。
一般に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、それだけに限らないが、～を含む、を意味することを意図している。例えば、「エピトープを含む免疫原性ペプチド」という句は、免疫原性ペプチドがエピトープを含むが、免疫原性ペプチドが追加のアミノ酸も含み得ることを意味すると解釈されるべきである。
本開示の一部の態様では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句で置き換えられる。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は限定的であることを意図している。例えば、「エピトープからなる免疫原性ペプチド」という句は、免疫原性ペプチドがエピトープを含み、追加のアミノ酸を含まないことを意味すると理解されるべきである。
本開示の目的のために、２つの配列（例えば、２つのポリヌクレオチドまたは２つのアミノ酸配列）のパーセント同一性を決定するために、最適な比較目的のために配列を整列させる（例えば、第２の配列との最適なアラインメントのために第１の配列にギャップを導入することができる）。次いで、ヌクレオチド／アミノ酸位置のヌクレオチド／アミノ酸残基を比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基によって占められる場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／参照配列中の位置の総数×１００）。
典型的には、配列比較は、参照配列の長さにわたって行われる。例えば、使用者が、所与の（「試験」）配列が配列番号Ｘとある特定のパーセンテージ同一性を有するかどうかを決定したい場合、配列番号Ｘが参照配列となるだろう。例えば、配列が配列番号Ｘ（参照配列の一例）と少なくとも８０％同一であるかどうかを評価するために、当業者は、配列番号Ｘの長さにわたってアラインメントを行い、試験配列中のいくつの位置が配列番号Ｘの位置と同一であるかを特定するであろう。位置の少なくとも８０％が同一である場合、試験配列は配列番号Ｘと少なくとも８０％同一である。配列が配列番号Ｘよりも短い場合、ギャップまたは欠落している位置は非同一位置であると見なされるべきである。
当業者であれば、２つの配列間の相同性または同一性を決定するために利用可能な様々なコンピュータプログラムを知っている。例えば、２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。標準的な分子生物学技術については、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第３版２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
本発明の免疫原性ペプチド
本発明は、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされるポリペプチド由来のエピトープを含む免疫原性ペプチドを提供する。この免疫原性ペプチドは、以下の考察から明らかになるいくつかの利点を有する。重要な利点をここに要約する。
第１に、免疫原性ペプチドはエピトープを含む。エピトープは、例えば、配列番号２～１２、４６および５３のうちの１つに示されるペプチド、および本発明者らによって新たに特定されたペプチドなどのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであり得る。したがって、免疫原性ペプチドは、コロナウイルスまたは複数のコロナウイルスに対する免疫応答を刺激することができる。免疫応答は、例えば、エピトープがＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである場合、細胞性免疫応答（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答）であり得る。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、感染細胞に対するそれらの細胞傷害活性を介してウイルス排除を媒介する。したがって、細胞性免疫の刺激は、コロナウイルス感染に対する有益な防御を提供し得る。免疫応答は、例えば、エピトープがＢ細胞エピトープである場合、体液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞応答または抗体応答）であり得る。体液性免疫応答は、抗体結合を介してウイルスの中和および／または排除を媒介する。したがって、体液性免疫の刺激は、コロナウイルス感染に対する有益な防御を提供し得る。免疫応答は、例えば、エピトープがＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープである場合、ヘルパーＴ細胞応答（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答）であり得る。Ｔヘルパーリンパ球は、サイトカインなどの免疫メディエーターを分泌することによって他の免疫細胞の活性を「助ける」。したがって、ヘルパーＴ細胞応答の刺激は、コロナウイルスに対する細胞性および／または体液性免疫応答を促進または増強し、ウイルスに対する有益な防御を提供し得る。
第２に、免疫原性ペプチドに含まれるエピトープが由来するポリペプチドをコードするＯＲＦは、複数のコロナウイルスまたはコロナウイルス株間で保存され得る。したがって、ポリペプチドは、複数のコロナウイルスまたはコロナウイルス株間で保存され得る。したがって、エピトープ自体は、複数のコロナウイルスまたはコロナウイルス株間で保存され得る。例えば、ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なる株間で保存され得る。したがって、免疫原性ペプチドを含む医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複数の異なる株に対する交差防御（ｃｒｏｓｓ－ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）および／または治療上の利益を提供し得る。このようにして、免疫原性ペプチドを含む医薬組成物は、当技術分野で最近報告された変異などの変異によって引き起こされる問題に対抗して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する広域予防または処置を提供するのに適している。換言すれば、免疫原性ペプチドを含む単一医薬組成物が、多種多様な既存および新興のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対する防御免疫および／または治療免疫を誘導し得る。これにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が変異した場合に新たなワクチンまたは処置を開発する必要性が低減または排除され得る。ＯＲＦおよび／またはエピトープは、異なるヒトコロナウイルス間で保存され得る。したがって、免疫原性ペプチドを含む医薬組成物は、複数の異なるヒトコロナウイルスに対する交差防御および／または治療上の利益を提供し得る。このようにして、免疫原性ペプチド（または免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む医薬組成物は、既存および新興のヒトコロナウイルスを含む様々なヒトコロナウイルスに対する広域予防および／または処置を提供するのに適している。
ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、ヒトコロナウイルスと他の動物のコロナウイルスとの間で保存され得る。このようにして、本発明の免疫原性ペプチドを含む医薬組成物は、動物コロナウイルスがヒト集団において確立されるのを防ぐことができる。換言すれば、本発明の免疫原性ペプチドを含む医薬組成物は、既存のヒトコロナウイルスから防御するのと同様に、種の境界線を横断する動物コロナウイルスを防ぐことができる。これは、さらなるパンデミックヒトコロナウイルスの出現を防止し得る。
第３に、免疫原性ペプチドは、異なるＨＬＡスーパータイプに結合することが可能であり得る。それぞれ異なるＨＬＡスーパータイプに結合すること可能なエピトープを含む本発明の複数の免疫原性ペプチドを医薬組成物に含めることにより、異なるＨＬＡ型を有する個体において有効な医薬組成物が得られる。このようにして、単一医薬組成物を使用して、ヒト集団の大部分においてコロナウイルスに対する防御を付与することができる。これは、ウイルス感染の発生および拡散を制御する費用対効果の高い手段を提供する。同様に、単一治療用組成物を使用して、ヒト集団の大部分においてコロナウイルスを処置することができる。これは、コロナウイルス感染症を処置する費用対効果の高い手段を提供する。
第４に、免疫原性ペプチドをコードするＯＲＦによってコードされるポリペプチドは、ヒトにおけるコロナウイルスの適合度を高め得る。換言すれば、ポリペプチドは、それがコードされるコロナウイルスに対する選択的利点を付与し得る。したがって、本発明の免疫原性ペプチドを含む医薬組成物は、選択的利点を付与されたコロナウイルスに関連するエピトープを標的化し得る。したがって、本発明の医薬組成物は、コロナウイルスの新興および／または潜在的パンデミック株に対する有効な予防または処置を提供するようにうまく設計され得る。したがって、本発明の医薬組成物は、コロナウイルスのエンデミック株またはコロナウイルスの季節性株に対する有効な予防または処置を提供するようにうまく設計され得る。
第５に、免疫原性ペプチドは、ナノ粒子、例えば金ナノ粒子に付着され得る。以下により詳細に記載されるように、ナノ粒子への付着により、免疫原性ペプチドを含む医薬（例えば、ワクチン）組成物中にアジュバントを含める必要性が低減または排除される。したがって、本発明の免疫原性ペプチドを含む医薬組成物は、個体への投与時に有害な臨床効果を引き起こす可能性が低い。
免疫原性ペプチド
免疫原性ペプチドは、免疫応答を誘発することができるペプチドである。本発明の免疫原性ペプチドは、翻訳可能なそのポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のエピトープを含む。
エピトープは、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープであり得る。エピトープは、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープなどの入れ子状エピトープ（ｎｅｓｔｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ）であり得る。好ましくは、エピトープはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、（ｉ）クラスＩ ＭＨＣ分子による提示、および（ｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識が可能なペプチドである。好ましくは、ＴＣＲによる認識は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらす。ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化は、増殖、サイトカイン産生および／または細胞傷害性効果の増加をもたらし得る。典型的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは約９アミノ酸長である。しかしながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープはより短くても長くてもよい。例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長であり得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、約８～１５、９～１４、１０～１３または１１～１２アミノ酸長であり得る。
ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、（ｉ）クラスＩＩ ＭＨＣ分子による提示、および（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識が可能なペプチドである。好ましくは、ＴＣＲによる認識は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化をもたらす。ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化は、増殖および／またはサイトカイン産生の増加をもたらし得る。典型的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは約１２～１５アミノ酸長である。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープはより短くても長くてもよい。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９アミノ酸長であり得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、約８～１９、９～１８、１０～１７、１１～１６、１２～１４または１３～１５アミノ酸長であり得る。
Ｂ細胞エピトープは、Ｂ細胞上に存在するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）または抗体による認識が可能なペプチドである。したがって、Ｂ細胞エピトープは抗体結合エピトープであり得る。ＢＣＲによる認識は、例えば、Ｂ細胞の活性化および／または成熟をもたらし得る。Ｂ細胞活性化は、増殖および／または抗体産生の増加をもたらし得る。Ｂ細胞エピトープは、線状エピトープ、すなわちＯＲＦによってコードされる一次アミノ酸配列によって定義されるエピトープであり得る。あるいは、エピトープは、立体構造エピトープ、すなわちＯＲＦによってコードされる天然タンパク質の立体構造によって定義されるエピトープであり得る。この場合、エピトープは連続的（すなわち、抗体と相互作用する成分が、タンパク質上で連続的に互いに隣接して位置する）または不連続的（すなわち、抗体と相互作用する成分が、折り畳まれた天然タンパク質構造において互いに近づけられる、タンパク質の分離した部分に位置する）であり得る。典型的には、Ｂ細胞エピトープまたは抗体結合エピトープは約５～２０アミノ酸長である。例えば、Ｂ細胞エピトープは、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長であり得る。Ｂ細胞エピトープは、約６～１９、７～１８、８～１７、９～１６、１０～１５、１１～１４または１２～１３アミノ酸長であり得る。
免疫原性ペプチドに含まれるエピトープは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチドに由来する。換言すれば、エピトープは、本質的に、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチドに含まれ得る、またはその一部を形成し得る。すなわち、エピトープは、コロナウイルスのゲノムの逆相補配列の少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチドに含まれ得る、またはその一部を形成し得る。ポリペプチドは、コロナウイルスの表面上またはコロナウイルスビリオン内で発現され得る。ウイルスによるポリペプチドの発現は一過性であり得る、すなわち、ポリペプチドが、そのライフサイクルのある特定の時点および／またはある特定の環境条件下でのみコロナウイルスによって発現され得る。あるいは、コロナウイルスは、ポリペプチドの持続的発現を有し得る。ポリペプチドは、コロナウイルスの代謝または複製に関与するペプチドなどの構造ペプチドまたは機能ペプチドであり得る。しかしながら、場合によっては、ポリペプチドの目的および／または機能は未知であり得る。
エピトープを生じさせるポリペプチドは、ヒトにおけるコロナウイルスの適合度を高め得る。例えば、ポリペプチドは、ヒト宿主細胞におけるウイルスの生存および／または複製を改善し得る。したがって、ポリペプチドは、コロナウイルスに対する選択的利点を付与し得る。換言すれば、ポリペプチドの発現は、ポリペプチドを発現しないコロナウイルスよりも良好にコロナウイルスが生存および／または増殖することを可能にし得る。この場合、進化的選択プロセスは、ゲノムの少なくとも一部が、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスで、ポリペプチドをコードするＯＲＦをコードするウイルスを選択し得る。したがって、ＯＲＦ（その結果、ポリペプチドおよび／またはエピトープ）は、異なるコロナウイルス間または所与のコロナウイルスの異なる株間で保存され得る。
ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、例えば、２種以上（例えば、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、２０種以上、５０種以上、１００種以上、２５０種以上、５００種以上、７５０種以上または１０００種以上）のヒトコロナウイルス間で保存され得る。例えば、ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２種以上の異なる株間で保存され得る。ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と１種または複数の他のヒトコロナウイルスとの間で保存され得る。例えば、ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、（ｂ）２２９Ｅ、（ｃ）ＮＬ６３、（ｄ）ＯＣ４３、（ｅ）ＨＫＵ１および（ｆ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶの１つまたは複数との間で保存され得る。ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ｄ）；（ｅ）；（ｆ）；（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ａ）および（ｅ）；（ａ）および（ｆ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｅ）；（ｂ）および（ｆ）；（ｃ）および（ｄ）；（ｃ）および（ｅ）；（ｃ）および（ｆ）；（ｄ）および（ｅ）；（ｄ）および（ｆ）；（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）および（ｆ）；（ａ）、（ｃ）および（ｄ）；（ａ）、（ｃ）および（ｅ）；（ａ）、（ｃ）および（ｆ）；（ａ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｄ）および（ｆ）；（ａ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｃ）、（ｄ）および（ｆ）；（ｃ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）との間で保存され得る。ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と１種または複数のエンデミック風邪コロナウイルスとの間で保存され得る。例えば、ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と、（ｉ）２２９Ｅ、（ｉｉ）ＮＬ６３、（ｉｉｉ）ＯＣ４３および（ｉｖ）ＨＫＵ１の１つまたは複数との間で保存され得る。ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；または（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）との間で保存され得る。ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、２２９Ｅと１種または複数の他のヒトコロナウイルスとの間で保存され得る。
ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、例えば、１種または複数（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、２０種以上、５０種以上、１００種以上、２５０種以上、５００種以上、７５０種以上または１０００種以上）のヒトコロナウイルスと１種または複数（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、２０種以上、５０種以上、１００種以上、２５０種以上、５００種以上、７５０種以上または１０００種以上）の動物コロナウイルス間で保存され得る。例えば、ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、例えば、１種または複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと１種または複数の動物コロナウイルスとの間で保存され得る。１種または複数の動物コロナウイルスは、コウモリに感染することができるコロナウイルスを含み得る。
ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、例えば、２種以上の動物コロナウイルス間で保存され得る。例えば、ＯＲＦ、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、２０種以上、５０種以上、１００種以上、２５０種以上、５００種以上、７５０種以上または１０００種以上の動物コロナウイルス間で保存され得る。２種以上の動物コロナウイルスは、同じ種の動物に感染することができるコロナウイルスを含み得る。２種以上の動物コロナウイルスは、異なる種の動物に感染することができるコロナウイルスを含み得る。２種以上の動物コロナウイルスは、コウモリに感染することができるコロナウイルスを含み得る。
翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスで各ウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦ間に少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）の同一性がある場合、ＯＲＦ（その結果、ポリペプチドおよび／またはエピトープ）は２種以上の異なるコロナウイルス間で保存されている。
免疫原性ペプチドに含まれるエピトープは、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、（ｂ）２２９Ｅ、（ｃ）ＮＬ６３、（ｄ）ＯＣ４３、（ｅ）ＨＫＵ１および（ｆ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶの１つまたは複数において約１００コドン長の予測ＯＲＦによってコードされるポリペプチド中に存在し得る。この場合、（ａ）～（ｆ）の１つまたは複数における約１００コドン長の予測ＯＲＦ中のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの存在は、免疫原性ペプチドを含む医薬組成物が（ａ）～（ｆ）の１つまたは複数による感染に対する防御および／または処置を提供することを示し得る。免疫原性ペプチドに含まれるエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２において約１００コドン長のＯＲＦによってコードされるポリペプチド、ならびに（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、（ｂ）２２９Ｅ、（ｃ）ＮＬ６３、（ｄ）ＯＣ４３、（ｅ）ＨＫＵ１および（ｆ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶの１つまたは複数において約１００コドン長の予測ＯＲＦによってコードされるポリペプチド中に存在し得る。この場合、（ａ）～（ｆ）の１つまたは複数における約１００コドン長の予測ＯＲＦ中のエピトープの存在は、免疫原性ペプチドを含む医薬組成物が ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および（ａ）～（ｆ）の１つまたは複数に対する交差防御および／または治療上の利益を提供することを示し得る。
免疫原性ペプチドは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のただ１つのエピトープを含み得る。あるいは、免疫原性ペプチドは、２つ以上、例えば３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１５以上または２０以上のこのようなエピトープを含み得る。免疫原性ペプチドが、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来の２つ以上のエピトープを含む場合、エピトープの各々は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープから独立して選択され得る。例えば、免疫原性ペプチドは、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来の２つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み得る。免疫原性ペプチドは、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来の２つ以上のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含み得る。免疫原性ペプチドは、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来の２つ以上のＢ細胞エピトープを含み得る。免疫原性ペプチドは、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来の１つまたは複数（例えば、２つ以上）のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープと、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来の１つまたは複数（例えば、２つ以上）のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとを含み得る。免疫原性ペプチドは、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来の１つまたは複数（例えば、２つ以上）のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープと、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来の１つまたは複数（例えば、２つ以上）のＢ細胞エピトープとを含み得る。免疫原性ペプチドは、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来の１つまたは複数（例えば、２つ以上）のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープと、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来の１つまたは複数（例えば、２つ以上）のＢ細胞エピトープとを含み得る。
翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来の１つまたは複数のエピトープと同様に、免疫原性ペプチドは、１つもしくは複数の他のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、１つもしくは複数の他のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープおよび／または１つもしくは複数の他のＢ細胞エピトープを含み得る。例えば、免疫原性ペプチドは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープではない１つまたは複数、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上または２０以上のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み得る。免疫原性ペプチドは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープではない１つまたは複数、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上または２０以上のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含み得る。免疫原性ペプチドは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のＢ細胞エピトープではない１つまたは複数、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上または２０以上のＢ細胞エピトープを含み得る。
多くのコロナウイルスＢ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが当技術分野で公知である。Ｂ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを特定する方法が当技術分野で公知である。エピトープマッピング法には、Ｘ線共結晶学、アレイベースのオリゴペプチドスキャン（重複ペプチドスキャンまたはペプスキャン分析と呼ばれることもある）、部位特異的突然変異誘発、ハイスループット突然変異誘発マッピング、水素－重水素交換、架橋結合質量分析、ファージディスプレイおよび限定分解（ｌｉｍｉｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）が含まれる。ＭＨＣモチーフ予測方法論も使用され得る。以下に記載されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを直接特定するために、コロナウイルス感染細胞によって提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを特定することができる。
好ましくは、免疫原性ペプチドは、配列番号２～１２、４６および５３に示される配列、または配列番号２～１２、４６および５３から選択される関連配列との少なくとも５０％の配列同一性を有するそのバリアントの１つまたは複数を含むか、またはそれからなる。バリアントは、例えば、配列番号２～１２、４６および５３から選択される関連配列との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有し得る。配列番号２～１２の各々は、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを表す。配列番号４６および５３の各々は、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスで２２９Ｅのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを表す。配列番号２～１２を表１に示す。表１はまた、配列番号２～１２の各々が結合するＨＬＡスーパータイプを示す。表１に示されるＨＬＡ結合は、（ｉ）伝統的なモチーフパターンの分析および（ｉｉ）２つの結合予測プログラム（ＭＨＣｆｌｕｒｒｙおよびＰＳＳＭＨＣｐａｎ、ＫＤ＜＝１μＭについて選択）のアウトプットからの統合した結果を表す。
＜表１＞
配列番号４６および５３を表１５に示す。
免疫原性ペプチドは、配列番号２～１２に示される配列の全てを含み得る、またはからなり得る。免疫原性ペプチドは、配列番号２～１２の各々のバリアントを含み得る、またはからなり得、バリアントは、配列番号２～１２から選択される関連配列との少なくとも５０％の配列同一性を有する。バリアントは、例えば、配列番号２～１２から選択される関連配列との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。免疫原性ペプチドは、配列番号４６および５３に示される配列の両方を含み得る、またはからなり得る。免疫原性ペプチドは、配列番号４６および５３の各々のバリアントを含み得る、またはからなり得、バリアントは、配列番号４６および５３から選択される関連配列との少なくとも５０％の配列同一性を有する。バリアントは、例えば、配列番号４６および５３から選択される関連配列との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
免疫原性ペプチドは、配列：ＭＳＰＴＴＳＶＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦＣＭＶＧＦＳＴＴＳＳＥＴＧＦＲＳＳＱＡＲＬＳＩＰＣＡＳＳＤＦＳＴＳＮＥＦＤＶＳＴＧＦＶＬＱＲＱＲＩＨＱＶＦＧＬＹＶＡＬＬＶＡＬＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮＮＬＡＰＦＬＫＥＧＶ（配列番号１３）またはこれとの少なくとも５０％の配列同一性を有するバリアントを含むポリペプチドを含み得る。バリアントは、例えば、配列番号１３との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
免疫原性ペプチドは、配列番号１４～１８のいずれかの配列、またはこれとの少なくとも５０％の配列同一性を有するバリアントを含むポリペプチドを含み得る。バリアントは、例えば、配列番号１４～１８から選択されるそれぞれの配列との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
本明細書に記載される免疫原性ペプチドのいずれも、任意の数のアミノ酸を含み得る、すなわち任意の長さであり得る。例えば、免疫原性ペプチドは、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５または約１００アミノ酸長であり得る。例えば、免疫原性ペプチドは、約８～約１００、約９～約９５、約１０～約９０、約１５～約８５、約２０～約８０、約２５～約７５、約３０～約７０、約３５～約６５、約４０～約６０、約４５～約５５または約５０アミノ酸長であり得る。典型的には、免疫原性ペプチドは、約８～約３０、３５または４０アミノ酸長、例えば約９～約２９、約１０～約２８、約１１～約２７、約１２～約２６、約１３～約２５、約１３～約２４、約１４～約２３、約１５～約２２、約１６～約２１、約１７～約２０または約１８～約２９アミノ酸長である。
本明細書に記載される免疫原性ペプチドのいずれも、ポリペプチド抗原から、例えばタンパク質分解的切断によって化学的に誘導され得る。より典型的には、免疫原性ペプチドは、当技術分野で周知の方法を使用して合成され得る。
「ペプチド」という用語は、アミノ酸残基がペプチド（－ＣＯ－ＮＨ－）結合によって連結されている分子だけでなく、ペプチド結合が逆転している分子も含む。このようなレトロインベルソペプチド模倣物は、当技術分野で公知の方法、例えば全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｚｉｅｒｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９、３２３０～３２３７に記載される方法を使用して作製され得る。このアプローチは、側鎖の配向ではなく、骨格を伴う変化を含む擬似ペプチドの作製を伴う。Ｍｅｚｉｅｒｅら（１９９７）は、少なくともＭＨＣクラスＩＩおよびＴヘルパー細胞応答について、これらの擬似ペプチドが有用であることを示している。ＣＯ－ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ－ＣＯ結合を含有するレトロインベルソペプチドは、タンパク質分解に対してはるかに耐性である。
同様に、アミノ酸残基の炭素原子間の間隔を保持する適切なリンカー部分が使用される限り、ペプチド結合は完全に省略されてもよい；リンカー部分が、ペプチド結合と実質的に同じ電荷分布および実質的に同じ平面性を有する場合が特に好ましい。ペプチドが、エキソ型タンパク質分解消化（ｅｘｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）に対する感受性を低下させるのを助けるために、そのＮ末端またはＣ末端で都合よくブロックされ得ることも理解されよう。例えば、ペプチドのＮ末端アミノ基は、カルボン酸と反応することによって保護され得、ペプチドのＣ末端カルボキシル基は、アミンと反応することによって保護され得る。修飾の他の例としては、グリコシル化およびリン酸化が挙げられる。別の可能な修飾は、ＲまたはＫの側鎖アミン上の水素がメチレン基で置き換えられ得るものである（－ＮＨ２が－ＮＨ（Ｍｅ）または－Ｎ（Ｍｅ）２に修飾され得る）。
「ペプチド」という用語はまた、インビボでペプチドの半減期を増加または減少させるペプチドバリアントを含む。本発明に従って使用されるペプチドの半減期を増加させることができる類似体の例としては、ペプチドのペプトイド類似体、ペプチドのＤ－アミノ酸誘導体およびペプチド－ペプトイドハイブリッドが挙げられる。本発明に従って使用されるバリアントポリペプチドのさらなる実施形態は、ポリペプチドのＤ－アミノ酸形態を含む。Ｌ－アミノ酸ではなくＤ－アミノ酸を使用するポリペプチドの調製は、正常な代謝プロセスによるこのような薬剤の望ましくない分解を大幅に減少させ、その投与頻度と共に、投与する必要がある薬剤の量を減少させる。
免疫原性ペプチドは、例えば、少なくとも２つの異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用し得る。これにより、免疫原性ペプチドが、より高い割合の個体または個体由来の細胞試料においてＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することが可能になる。免疫原性ペプチドは、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０の異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用し得る。各免疫原性ペプチドは、例えば、任意の組み合わせのＡ１、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１９、Ａ２、Ａ２０３、Ａ２１０、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２４０３、Ａ２５、Ａ２６、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３２、Ａ３３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ４３、Ａ６６、Ａ６８、Ａ６９、Ａ７４、Ａ８０、Ａ９、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３７、Ｂ３８、Ｂ３９、Ｂ４０、Ｂ４１、Ｂ４２、Ｂ４４、Ｂ４５、Ｂ４６、Ｂ４７、Ｂ４８、Ｂ４９、Ｂ５、Ｂ５０、Ｂ５１、Ｂ５１０２、Ｂ５１０３、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ５４、Ｂ５５、Ｂ５６、Ｂ５７、Ｂ５８、Ｂ５９、Ｂ６０、Ｂ６１、Ｂ６２、Ｂ６３、Ｂ６４、Ｂ６５、Ｂ６７、Ｂ７、Ｂ７０、Ｂ７０３、Ｂ７１、Ｂ７２、Ｂ７３、Ｂ７５、Ｂ７６、Ｂ７７、Ｂ７８、Ｂ８、Ｂ８１、Ｂ８２、Ｃ１、Ｃ１０、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９、または当技術分野で公知の任意の他のＨＬＡスーパータイプの２つ以上と相互作用し得る。
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ
本発明の免疫原性ペプチドは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のエピトープを含む。換言すれば、本発明の免疫原性ペプチドは、コロナウイルスのゲノムの逆相補配列の少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のエピトープを含む。エピトープは、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。したがって、本発明の免疫原性ペプチドは、コロナウイルスのゲノムの逆相補配列の少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み得る。
免疫原性ポリペプチドに含めるためのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを直接特定するために、コロナウイルス感染細胞によって提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを特定することができる。これは、単独で、またはＭＨＣモチーフ予測方法論によって特定された潜在的なＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの有用性を確認するために使用することができる効率的かつ論理的な方法である。
この方法を実施するために、細胞をコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に感染させ、約３７℃の温度で約７２時間培養で維持する。培養後、細胞を収穫し、洗浄する。次に、細胞を、例えば、ホモジナイゼーションおよび緩衝液中での凍結／解凍によって溶解する。溶解緩衝液は、例えば、約１％のＮＰ４０を含有し得る。溶解物から、例えば約３０００ｒｐｍで約１０分間の遠心分離によって、細胞片を除去することができる。次いで、ＭＨＣ／ペプチド複合体を溶解物から単離することができる。このようにする多数の方法が当技術分野で公知である。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／１８６１９９号パンフレットに記載されるように、イムノアフィニティークロマトグラフィーを使用してＭＨＣ／ペプチド複合体を単離することができる。あるいは、免疫プロテオミクスプロトコルを使用してもよい。いずれの場合でも、その後、ペプチド含有画分を、例えば高速液体クロマトグラフィーを使用して洗浄することができる。ペプチド含有画分を質量分析によって分析して、画分の配列を特定する。次いで、取得したスペクトルデータを、コロナウイルスについてデータベース化された全てのタンパク質に対して検索して、コロナウイルスに関連するペプチド配列を特定することができる。場合により、合成ペプチドを特定された配列に従って作製し、質量分析に供して、ペプチド含有画分中のペプチドとのそれらの同一性を確認することができる。
この方法および当技術分野で公知の同様の方法では、任意の型の細胞を任意の型のコロナウイルスに感染させることができる。コロナウイルスを以下に詳細に記載する。細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり得る。細胞は、ＨｅｐＧ２細胞などのヘパトーマ細胞、ＪＹ細胞などのＥＢＶ形質転換リンパ芽球様Ｂ細胞、またはＴ２細胞などのリンパ芽球であり得る。
ｓｓＲＮＡウイルス感染細胞によって提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの直接特定は、ＭＨＣモチーフ予測方法論と比較して有利である。免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）は、機能的方法ではなくモチーフ予測方法によって生成され、高いＭＨＣ結合スコアおよび制限されたＣＴＬ特性評価を有する一部の共有エピトープを含む、多数の予測ＨＬＡ特異的ｓｓＲＮＡウイルスＴ細胞エピトープを含む。ドミナントエピトープとサブドミナントエピトープの両方がウイルス感染細胞によって提示され得るので、データベースを使用して自然に提示されたエピトープの順位制を分類することは困難である。したがって、免疫エピトープデータベースのみからでは、列挙されたエピトープのいずれが、医薬組成物に含めると、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を効率的に誘導すると予想され得るかは明らかではない。上に示される直接特定方法は、エピトープの有用性を確認するための機序を提供する。
コロナウイルス感染細胞によって提示されるエピトープに基づく医薬組成物は、ウイルスタンパク質サブユニットまたはモチーフ予測エピトープに基づくワクチンよりも優れ得る。免疫系によるタンパク質プロセシングは、天然ウイルスエピトープを変化させる可能性がある。ペプチドが既にタンパク質プロセシングを受けているので、医薬組成物を感染細胞によって提示されることが実証されたペプチドに基づくことにより、この不確実性の原因が取り除かれる。
ポリペプチド
本発明の免疫原性ペプチドは、ポリペプチド由来のエピトープを含む。ポリペプチドは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる。すなわち、ポリペプチドは、コロナウイルスのゲノムの逆相補配列の少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされる。
ポリペプチドは、任意の数のアミノ酸を含み得る、すなわち任意の長さであり得る。典型的には、ポリペプチドは、約１００アミノ酸長、例えば約９０～約１１０、約９１～約１０９、約９２～約１０８、約９３～約１０７、約９４～約１０６、約９５～約１０５、約９６～約１０４、約９７～約１０３、約９８～約１０２または約９９～約１０１アミノ酸長である。
ポリペプチドは、本発明の免疫原性ペプチドに含まれるエピトープからなり得る。あるいは、ポリペプチドは、本発明の免疫原性ペプチドに含まれるエピトープを含み得る。ポリペプチドは、例えば、それぞれ本発明の異なる免疫原性ペプチドに含まれる２つ以上の異なるエピトープを含み得る。例えば、ポリペプチドは、それぞれ本発明の異なる免疫原性ペプチドに含まれる２つ以上の異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み得る。例えば、ポリペプチドは、それぞれ配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；および配列番号１２から選択される２つ以上の異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み得る。ポリペプチドは、例えば、それぞれ配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；および配列番号１２から選択される３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上または１１以上の異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み得る。
ポリペプチドは、例えば、それぞれ配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号４６；および配列番号５３から選択される２つ以上の異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み得る。ポリペプチドは、例えば、それぞれ配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号４６；および配列番号５３から選択される３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上または１１以上の異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み得る。ポリペプチドは、例えば、それぞれ配列番号４６および配列番号５３から選択される２つの異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み得る。
ポリペプチドは、配列番号２～１２に示される配列の全てを含み得る、またはからなり得る。ポリペプチドは、配列番号２～１２、４６および５３に示される配列の全てを含み得る、またはからなり得る。ポリペプチドは、配列番号２～１２の１つもしくは複数、または全部のバリアントを含み得る、またはからなり得、バリアントは、配列番号２～１２から選択される関連配列との少なくとも５０％の配列同一性を有する。バリアントは、例えば、配列番号２～１２から選択される関連配列との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。ポリペプチドは、配列番号４６および５３の１つもしくは複数、または全部のバリアントを含み得る、またはからなり得、バリアントは、配列番号４６および５３から選択される関連配列との少なくとも５０％の配列同一性を有する。バリアントは、例えば、配列番号４６および５３から選択される関連配列との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
ポリペプチドは、例えば、配列ＭＳＰＴＴＳＶＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦＣＭＶＧＦＳＴＴＳＳＥＴＧＦＲＳＳＱＡＲＬＳＩＰＣＡＳＳＤＦＳＴＳＮＥＦＤＶＳＴＧＦＶＬＱＲＱＲＩＨＱＶＦＧＬＹＶＡＬＬＶＡＬＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮＮＬＡＰＦＬＫＥＧＶ（配列番号１３）またはこれとの少なくとも５０％の配列同一性を有するバリアントを含み得る。バリアントは、例えば、配列番号１３との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
ポリペプチドは、配列番号１４～１８のいずれかの配列またはこれとの少なくとも５０％の配列同一性を有するバリアントを含むポリペプチドを含み得る。バリアントは、例えば、配列番号１４～１８から選択されるそれぞれの配列との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
ポリペプチドは、配列番号４６および５２に示される配列の両方を含み得る、またはからなり得る。ポリペプチドは、配列番号４６および５３の１つもしくは複数、または両方のバリアントを含み得る、またはからなり得、バリアントは、配列番号４６および５３から選択される関連配列との少なくとも５０％の配列同一性を有する。バリアントは、例えば、配列番号４６および５３から選択される関連配列との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
免疫原性ペプチドに含まれるエピトープは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチドに由来する。換言すれば、免疫原性ペプチドに含まれるエピトープは、コロナウイルスのゲノムの逆相補配列の少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチドに由来する。
リーディングフレームは、核酸配列によってコードされるアミノ酸のコドンを構成する、ＲＮＡ配列などの核酸配列中の３つの連続するヌクレオチドのグループである。ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）は、翻訳可能なリーディングフレームの一部である。ＯＲＦは、開始コドンおよび終止コドンを含むコドンの連続伸長である。ＯＲＦ内で、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）は、ＲＮＡのタンパク質への翻訳のための開始部位として機能し得る。
本発明において、ＯＲＦは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされる。コロナウイルスはポジティブセンスｓｓＲＮＡウイルスである。ポジティブセンスｓｓＲＮＡウイルスでは、ウイルスゲノムＲＮＡはｍＲＮＡと同じセンスであり、介在する転写なしに翻訳可能である、すなわちゲノムＲＮＡがｍＲＮＡとして二倍になる。ここで、ＯＲＦは、ウイルスゲノムＲＮＡ、したがってｍＲＮＡとは反対のセンスでコードされる。したがって、ＯＲＦはネガティブセンスであり得る。すなわち、ＯＲＦは、翻訳可能になる前にゲノムＲＮＡが転写されることを必要とし得る。
ＯＲＦは、例えば、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノム全体によってコードされ得る。あるいは、ＯＲＦは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの一部のみによってコードされ得る。例えば、ＯＲＦは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの約１％～約９９％、例えば約２％～約９８％、約３％～約９７％、約５％～約９５％、約１０％～約９０％、約１５％～約８５％、約２０％～約８０％、約２５％～約７５％、約３０％～約７０％、約４０％～約６０％または約５０％によってコードされ得る。
ＯＲＦは任意の長さであり得る。好ましくは、ＯＲＦは、約１００コドン長、例えば約９０～約１１０、約９１～約１０９、約９２～約１０８、約９３～約１０７、約９４～約１０６、約９５～約１０５、約９６～約１０４、約９７～約１０３、約９８～約１０２または約９９～約１０１コドン長である。ＯＲＦは、例えば、少なくとも９０、例えば、少なくとも９１、少なくとも９２、少なくとも９３、少なくとも９４、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８、少なくとも９９、少なくとも１００、少なくとも１０１、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、または少なくとも１０９、少なくとも１１０コドン長であり得る。ＯＲＦは、約３００ヌクレオチド長、例えば約２７０～約３３０、約２７３～約３２７、約２７６～約３２４、約２７９～約３２１、約２８２～約３１８、約２８５～約３１５、約２８８～約３１２、約２９１～約３０９、約２９４～約３０６または約２９７～約３０３ヌクレオチド長であり得る。ＯＲＦは、例えば、少なくとも２７０、例えば少なくとも２７３、少なくとも２７５、少なくとも２７８、少なくとも２９１、少なくとも２９４、少なくとも２９７、少なくとも３００、少なくとも３０３、少なくとも３０６、少なくとも３０９、少なくとも３１２、少なくとも３１５、少なくとも３１８、少なくとも３２１、少なくとも３２４、または少なくとも３２７、少なくとも３３０ヌクレオチド長であり得る。
ＯＲＦは、例えば、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされ得る。ＯＲＦに対応するポジティブセンスゲノムの部分は、例えば、ｐｐ１ａ／ｐｐ１ａｂ／ｎｓｐ３をコードし得る。ＯＲＦに対応するポジティブセンスゲノムの部分は、例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０４５５１２）の完全なゲノム配列の残基６１８９～６４８９を含み得る、またはからなり得る。
ＯＲＦは、例えば、配列：ａｎｇｎｃｎｃｃｎａｃａａｃｎｎｃｇｇｎａｇｎｎｎｎｃａｃａｎｎａｃａｃｎｃａａｇａａｃｇｎｃｎｎｎｃｎｇｎａｎｇｇｎａｇｇａｎｎｎｎｃｃａｃｎａｃｎｎｃｎｎｃａｇａｇａｃｎｇｇｎｎｎｎａｇａｎｃｎｎｃｇｃａｇｇｃａａｇａｎｎａｎｃｃａｎｎｃｃｃｎｇｃｇｃｇｎｃｃｎｃｎｇａｃｎｎｃａｇｎａｃａｎｃａａａｃｇａａｎｎｎｇａｎｇｎｎｎｃａａｃｎｇｇｎｎｎｎｇｎｇｃｎｃｃａａａｇａｃａａｃｇｎａｎａｃａｃｃａｇｇｎａｎｎｎｇｇｎｎｎａｎａｃｇｎｇｇｃｎｎｎａｎｎａｇｎｎｇｃａｎｎｇｎｎａａｃａｎｇｃｃａａａｃａａｎａｇｇｎｎｎａｎｇｎａａｃａａｎｎｎａｇｃｎｃｃｎｎｎｃｎｎａａａａｇａｇｇｇｎｇｎｇｎａｇ（配列番号１）またはこれとの少なくとも５０％の配列同一性を有するバリアントを含み得る。配列番号１中、各ｎは、ｔおよびｕから独立して選択される。一態様では、各ｎが、例えば、ｔであり得る。すなわち、ｎの全てがｔであってもよい。別の態様では、各ｎが、例えば、ｕであり得る。すなわち、ｎの全てがｕであってもよい。さらなる態様では、ｎの一部がｔであり得、ｎの一部がｕであり得る。すなわち、配列は、ｔとｕの組み合わせを含み得る。バリアントは、例えば、配列番号１との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
ＯＲＦは、例えば、配列：ＭＳＰＴＴＳＶＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦＣＭＶＧＦＳＴＴＳＳＥＴＧＦＲＳＳＱＡＲＬＳＩＰＣＡＳＳＤＦＳＴＳＮＥＦＤＶＳＴＧＦＶＬＱＲＱＲＩＨＱＶＦＧＬＹＶＡＬＬＶＡＬＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮＮＬＡＰＦＬＫＥＧＶ（配列番号１３）またはこれとの少なくとも５０％の配列同一性を有するバリアントを含むポリペプチドをコードし得る。バリアントは、例えば、配列番号１３との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
ＯＲＦは、例えば、配列番号１４～１８のいずれかの配列またはこれとの少なくとも５０％の配列同一性を有するバリアントを含むポリペプチドを含み得る。バリアントは、例えば、配列番号１４～１８から選択されるそれぞれの配列との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
上述のように、免疫原性ペプチドに含まれるエピトープを生じさせるポリペプチドをコードするＯＲＦは、異なるコロナウイルスまたはコロナウイルス株間で保存され得る。例えば、ＯＲＦは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なる株間で、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と１種または複数の他のヒトコロナウイルス、例えば（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、（ｂ）２２９Ｅ、（ｃ）ＮＬ６３、（ｄ）ＯＣ４３、（ｅ）ＨＫＵ１および／または（ｆ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶとの間で保存され得る。ＯＲＦは、ヒトコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と１種または複数の動物コロナウイルスとの間で保存され得る。ＯＲＦは、２２９Ｅの異なる株間で、または２２９Ｅと１種または複数の他のヒトコロナウイルス、例えば（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、（ｃ）ＮＬ６３、（ｄ）ＯＣ４３、（ｅ）ＨＫＵ１および／または（ｆ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶとの間で保存され得る。翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスで各ウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦ間に少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）の同一性がある場合、ＯＲＦは２種以上の異なるコロナウイルスまたはコロナウイルス株間で保存され得る。例えば、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスで各ウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦ間に約７５％（例えば、約７０％～約８０％、例えば約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７６％、約７７％、約７８％または約７９％）の同一性がある場合、ＯＲＦは２種以上の異なるコロナウイルスまたはコロナウイルス株間で保存され得る。ＯＲＦによってコードされるポリペプチドは、ヒトにおけるコロナウイルスの適合度を高め得る、すなわち、コロナウイルスに対する選択的利点を付与し得る。
ＯＲＦは、２種以上（例えば、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、２０種以上、５０種以上、１００種以上、２５０種以上、５００種以上、７５０種以上または１０００種以上）のコロナウイルスまたはコロナウイルス株間で保存され得る。例えば、ＯＲＦは、２種以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株間で保存され得る。ＯＲＦは、（ａ）１種または複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス；（ｂ）１種または複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ウイルス；（ｃ）１種または複数の２２９Ｅウイルス；（ｄ）１種または複数のＮＬ６３ウイルス；（ｅ）１種または複数のＯＣ４３ウイルス；（ｆ）１種または複数のＨＫＵ１ウイルス；および（ｇ）１種または複数のＭＥＲＳ－ＣｏＶウイルスのうちの２つ以上の間で保存され得る。
ＯＲＦによってコードされるポリペプチドおよび／またはこれが含むエピトープも、２種以上のコロナウイルスまたはコロナウイルス株間で同様に保存され得る。したがって、本発明の免疫原性ペプチドを含む医薬組成物（例えば、ワクチン）は、複数のコロナウイルスまたはコロナウイルス株に対する交差防御を提供することが可能であり得る。したがって、本発明の免疫原性ペプチドを含む単一医薬組成物は、様々な既存および新興のコロナウイルスに対する防御免疫を誘導することが可能であり得る。本発明の免疫原性ペプチドを含む単一医薬組成物は、様々なエンデミックおよび季節性コロナウイルスに対する防御免疫を誘導することが可能であり得る。例えば、一態様では、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、２種以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス間で保存され得る。この場合、本発明の免疫原性ペプチドを含む医薬組成物（例えば、ワクチン）は、２種以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対する防御を提供することが可能であり得る。別の態様では、ポリペプチドおよび／またはエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、（ｂ）２２９Ｅ、（ｃ）ＮＬ６３、（ｄ）ＯＣ４３、（ｅ）ＨＫＵ１および（ｆ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶの１つまたは複数との間で保存され得る。ポリペプチドおよび／またはエピトープは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ｄ）；（ｅ）；（ｆ）；（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ａ）および（ｅ）；（ａ）および（ｆ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｅ）；（ｂ）および（ｆ）；（ｃ）および（ｄ）；（ｃ）および（ｅ）；（ｃ）および（ｆ）；（ｄ）および（ｅ）；（ｄ）および（ｆ）；（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）および（ｆ）；（ａ）、（ｃ）および（ｄ）；（ａ）、（ｃ）および（ｅ）；（ａ）、（ｃ）および（ｆ）；（ａ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｄ）および（ｆ）；（ａ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｃ）、（ｄ）および（ｆ）；（ｃ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）との間で保存され得る。この場合、本発明の免疫原性ペプチドを含む医薬組成物（例えば、ワクチン）は、複数の異なるヒトコロナウイルスによる感染からヒト対象を防御することが可能であり得る。ポリペプチドおよび／またはエピトープは、ヒトコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と１種または複数の動物コロナウイルスとの間で保存され得る。この場合、本発明の免疫原性ペプチドを含む医薬組成物（例えば、ワクチン）は、動物コロナウイルスが種の境界線を横断するのを防ぐことが可能であり得る。
コロナウイルス
ＯＲＦは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされる。上に示されるように、コロナウイルスはポジティブセンスｓｓＲＮＡウイルスである。
ＯＲＦは、例えば、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの全てによってコードされ得る。好ましくは、ＯＲＦは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの一部によってコードされる。例えば、ＯＲＦは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの約１％～約９９％、例えば約２％～約９８％、約３％～約９７％、約５％～約９５％、約１０％～約９０％、約１５％～約８５％、約２０％～約８０％、約２５％～約７５％、約３０％～約７０％、約４０％～約６０％または約５０％によってコードされ得る。ＯＲＦは、上記のように、任意の長さであり得る。
コロナウイルスは、例えば、ヒトコロナウイルスであり得る。コロナウイルスは、例えば、コウモリコロナウイルスなどの動物コロナウイルスであり得る。コロナウイルスは、例えば、人畜共通コロナウイルスであり得る。例示的なヒト、動物および人畜共通コロナウイルスは当技術分野で周知である。
コロナウイルスは、例えば、ベータコロナウイルス（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）属のメンバーであり得る。コロナウイルスは、例えば、サルベコロナウイルス（Ｓａｒｂｅｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）亜属のメンバーであり得る。
コロナウイルスは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスであり得る。コロナウイルスは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ウイルスであり得る。コロナウイルスは、例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶウイルスであり得る。コロナウイルスは、例えば、エンデミック風邪コロナウイルスであり得る。エンデミック風邪コロナウイルスには、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３およびＨＫＵ１が含まれる。コロナウイルスは、例えば、エンデミック風邪コロナウイルス２２９Ｅであり得る。
コロナウイルスは、例えば、パンデミックコロナウイルスであり得る。パンデミックコロナウイルスは、パンデミックを引き起こした、または引き起こす可能性があるコロナウイルスとして定義され得る。コロナウイルスは、例えば、エンデミックコロナウイルスであり得る。エンデミックコロナウイルスは、感染が外部インプットなしに所与の地理的地域においてベースラインレベルで常に維持されるコロナウイルスとして定義され得る。エンデミックコロナウイルスは当技術分野で周知であり、風邪コロナウイルスを含む。コロナウイルスは、例えば、季節性コロナウイルスであり得る。季節性コロナウイルスは、１つまたは複数の規則的な年間ピークである季節性を示す感染パターンを有するコロナウイルスである。
ある特定のコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および２２９Ｅのポジティブセンスゲノムは、遺伝子「ｏｒｆ１ａｂ」を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２では、ｏｒｆ１ａｂ遺伝子はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ ４３７４０５７８に対応する。通常の方法で翻訳されると（すなわち、転写なしで相補的ｍＲＮＡを形成する）、ｏｒｆ１ａｂ遺伝子は、ポリタンパク質ＰＰ１ａｂおよびＰＰ１ａをコードする重複したオープンリーディングフレームを含む。ポリタンパク質が切断されて、１６個の非構造タンパク質、ＮＳＰ１～１６が得られる。本発明者らは、ｏｒｆ１ａｂ遺伝子が、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスで、本発明の免疫原性ペプチドに含まれるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを生じさせるポリペプチドをコードするＯＲＦもコードすることを発見した。換言すれば、本発明者らは、ｏｒｆ１ａｂ遺伝子のネガティブセンス（すなわち、逆相補配列）も、本発明の免疫原性ペプチドに含まれるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを生じさせるポリペプチドをコードするＯＲＦをコードすることを発見した。換言すれば、ｏｒｆ１ａｂ遺伝子の少なくとも一部は転写されて、本発明の免疫原性ペプチドに含まれるエピトープを生じさせるポリペプチドをコードするＯＲＦを含む相補的ｍＲＮＡを生じることができる。したがって、本発明の免疫原性ペプチドに含まれるエピトープを生じさせるポリペプチドをコードするＯＲＦは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでｏｒｆ１ａｂ遺伝子の少なくとも一部によってコードされ得る。
ＯＲＦは、例えば、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのｏｒｆ１ａｂ遺伝子の全てによってコードされ得る。好ましくは、ＯＲＦは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのｏｒｆ１ａｂ遺伝子の一部によってコードされる。例えば、ＯＲＦは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのｏｒｆ１ａｂ遺伝子の約１％～約９９％、例えば約２％～約９８％、約３％～約９７％、約５％～約９５％、約１０％～約９０％、約１５％～約８５％、約２０％～約８０％、約２５％～約７５％、約３０％～約７０％、約４０％～約６０％または約５０％によってコードされ得る。ＯＲＦは、上記のように、任意の長さであり得る。ｏｒｆ１ａｂ遺伝子は、例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含み得る。ＯＲＦは、例えば、配列番号１のヌクレオチド１～３０３によってコードされ得る。
本発明のポリヌクレオチド
本発明は、本発明の免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の免疫原性ペプチドは、上に詳細に記載されている。本発明の免疫原性ペプチドに関連して上に記載される態様のいずれも、本発明のポリヌクレオチドに適用され得る。
ポリヌクレオチドはＲＮＡを含み得る。ポリヌクレオチドはＤＮＡを含み得る。ポリヌクレオチドはＲＮＡとＤＮＡの両方を含み得る。好ましくは、ポリヌクレオチドはＲＮＡを含むか、またはそれからなる。より好ましくは、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡを含むか、またはそれからなる。
ポリヌクレオチドは、配列：ａｎｇｎｃｎｃｃｎａｃａａｃｎｎｃｇｇｎａｇｎｎｎｎｃａｃａｎｎａｃａｃｎｃａａｇａａｃｇｎｃｎｎｎｃｎｇｎａｎｇｇｎａｇｇａｎｎｎｎｃｃａｃｎａｃｎｎｃｎｎｃａｇａｇａｃｎｇｇｎｎｎｎａｇａｎｃｎｎｃｇｃａｇｇｃａａｇａｎｎａｎｃｃａｎｎｃｃｃｎｇｃｇｃｇｎｃｃｎｃｎｇａｃｎｎｃａｇｎａｃａｎｃａａａｃｇａａｎｎｎｇａｎｇｎｎｎｃａａｃｎｇｇｎｎｎｎｇｎｇｃｎｃｃａａａｇａｃａａｃｇｎａｎａｃａｃｃａｇｇｎａｎｎｎｇｇｎｎｎａｎａｃｇｎｇｇｃｎｎｎａｎｎａｇｎｎｇｃａｎｎｇｎｎａａｃａｎｇｃｃａａａｃａａｎａｇｇｎｎｎａｎｇｎａａｃａａｎｎｎａｇｃｎｃｃｎｎｎｃｎｎａａａａｇａｇｇｇｎｇｎｇｎａｇ（配列番号１）またはこれとの少なくとも５０％の配列同一性を有するバリアントを含み得る。配列番号１中、各ｎは、ｔおよびｕから独立して選択される。一態様では、各ｎが、例えば、ｔであり得る。すなわち、ｎの全てがｔであってもよい。別の態様では、各ｎが、例えば、ｕであり得る。すなわち、ｎの全てがｕであってもよい。さらなる態様では、ｎの一部がｔであり得、ｎの一部がｕであり得る。すなわち、配列は、ｔとｕの組み合わせを含み得る。バリアントは、例えば、配列番号１との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
ポリヌクレオチドは、配列：ａｎｇｎｃｎｃｃｎａｃａａｃｎｎｃｇｇｎａｇｎｎｎｎｃａｃａｎｎａｃａｃｎｃａａｇａａｃｇｎｃｎｎｎｃｎｇｎａｎｇｇｎａｇｇａｎｎｎｎｃｃａｃｎａｃｎｎｃｎｎｃａｇａｇａｃｎｇｇｎｎｎｎａｇａｎｃｎｎｃｇｃａｇｇｃａａｇａｎｎａｎｃｃａｎｎｃｃｃｎｇｃｇｃｇｎｃｃｎｃｎｇａｃｎｎｃａｇｎａｃａｎｃａａａｃｇａａｎｎｎｇａｎｇｎｎｎｃａａｃｎｇｇｎｎｎｎｇｎｇｃｎｃｃａａａｇａｃａａｃｇｎａｎａｃａｃｃａｇｇｎａｎｎｎｇｇｎｎｎａｎａｃｇｎｇｇｃｎｎｎａｎｎａｇｎｎｇｃａｎｎｇｎｎａａｃａｎｇｃｃａａａｃａａｎａｇｇｎｎｎａｎｇｎａａｃａａｎｎｎａｇｃｎｃｃｎｎｎｃｎｎａａａａｇａｇｇｇｎｇｎｇｎａｇ（配列番号１）の一部またはこれとの少なくとも５０％の配列同一性を有するバリアントを含み得る。配列番号１中、各ｎは、ｔおよびｕから独立して選択される。一態様では、各ｎが、例えば、ｔであり得る。すなわち、ｎの全てがｔであってもよい。別の態様では、各ｎが、例えば、ｕであり得る。すなわち、ｎの全てがｕであってもよい。さらなる態様では、ｎの一部がｔであり得、ｎの一部がｕであり得る。すなわち、配列は、ｔとｕの組み合わせを含み得る。バリアントは、例えば、配列番号１の一部との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。配列番号１の一部は、例えば、開始コドン（ＡＴＧ）が除外されていることを除いて、配列番号１と同一であり得る。配列番号１の一部は、例えば、終止コドン（ＴＡＧ）が除外されていることを除いて、配列番号１と同一であり得る。配列番号１の一部は、例えば、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）が除外されていることを除いて、配列番号１と同一であり得る。配列番号１の一部は、例えば、任意の組み合わせの、配列番号２～１２または配列番号２～１２から選択される関連配列との少なくとも５０％の配列同一性を有するそのバリアントの１つまたは複数（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上または１１）をコードし得る。
医薬組成物
本発明は、本発明の免疫原性ペプチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。本発明の免疫原性ペプチドおよび本発明のポリヌクレオチドは、上に詳細に記載されている。本発明の免疫原性ペプチドまたは本発明のポリヌクレオチドに関連して上に記載される態様のいずれも、本発明のポリヌクレオチドに適用され得る。
医薬組成物は、例えば、ワクチンなどの予防用組成物であり得る。医薬組成物は、例えば、治療用組成物であり得る。医薬組成物は、予防効果、治療効果、または予防効果と治療効果の両方を有し得る。換言すれば、医薬組成物は、コロナウイルス感染症の予防、コロナウイルス感染症の処置、またはコロナウイルス感染症の予防と処置の両方における有用性を有し得る。
ペプチド組成物
医薬組成物は、１つまたは複数の免疫原性ペプチド、例えば約１～約５０、約２～約４０、約３～約３０、約４～約２５、約５～約２０、約６～約１５、約７、約８、約９または約１０の免疫原性ペプチドを含み得る。１つまたは複数の免疫原性ペプチドの各々が、例えば、本発明の免疫原性ペプチドであり得る。あるいは、医薬組成物は、（ｉ）本発明の免疫原性ペプチドと（ｉｉ）他の免疫原性ペプチドの混合物を含有し得る。
一態様では、医薬組成物は、２つ以上の免疫原性ペプチドを含む。２つ以上の免疫原性ペプチドの各々が本発明の免疫原性ペプチドであり得る。医薬組成物は、例えば、それぞれ本発明の異なる免疫原性ペプチドを含む２つ以上の免疫原性ペプチドを含み得る。換言すれば、医薬組成物は、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチドの異なるフラグメントを含む、２つ以上の免疫原性ペプチドを含み得る。医薬組成物は、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチドとは異なるエピトープ（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ）を含む、約１～約５０、約２～約４０、約３～約３０、約４～約２５、約５～約２０、約６～約１５、約７、約８、約９または約１０の免疫原性ペプチドを含み得る。一部の態様では、免疫原性ペプチドの各々は、異なるＨＬＡサブタイプと相互作用し得る。
医薬組成物は、（ｉ）それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のエピトープを含む、１つまたは複数（例えば、約２～約４０、約３～約３０、約４～約２５、約５～約２０、約６～約１５、約７、約８、約９または約１０）の免疫原性ペプチドと、（ｉｉ）１つまたは複数の他の免疫原性ペプチド（すなわち、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のエピトープを含まない免疫原性ペプチド）とを含み得る。他の免疫原性ペプチドは、１つまたは複数のエピトープ、例えば約２～４０、約３～約３０、約４～約２５、約５～約２０、約６～約１５、約７、約８、約９または約１０のエピトープを含み得る。１つまたは複数のエピトープの各々は、例えば、Ｂ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープおよび／またはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであり得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、例えば、１種または複数のコロナウイルスによって発現され、（ｉ）クラスＩＩ ＭＨＣ分子による提示および（ｉｉ）ＣＤ４＋Ｔ細胞上に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識が可能なペプチドであり得る。あるいは、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、１種または複数のコロナウイルスによって発現されないＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープであり得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、例えば、１種または複数のコロナウイルスによって発現され、（ｉ）クラスＩ ＭＨＣ分子による提示および（ｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識が可能なペプチドであり得る。好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープではないＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、１種または複数のコロナウイルスによって発現されないＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであり得る。Ｂ細胞エピトープは、例えば、１種または複数のコロナウイルスによって発現され、Ｂ細胞上に存在するＢ細胞受容体（ＢＣＲ）による認識が可能であるペプチドであり得る。好ましくは、Ｂ細胞エピトープは、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のＢ細胞エピトープではないＢ細胞エピトープである。Ｂ細胞エピトープは、１種または複数のコロナウイルスによって発現されないＢ細胞エピトープであり得る。
多くのＢ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（例えば、コロナウイルス由来のＢ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ）が当技術分野で公知である。Ｂ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを特定する方法が当技術分野で公知である。エピトープマッピング法には、Ｘ線共結晶学、アレイベースのオリゴペプチドスキャン（重複ペプチドスキャンまたはペプスキャン分析と呼ばれることもある）、部位特異的突然変異誘発、ハイスループット突然変異誘発マッピング、水素－重水素交換、架橋結合質量分析、ファージディスプレイおよび限定分解（ｌｉｍｉｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）が含まれる。ＭＨＣモチーフ予測方法論も使用され得る。上記のように、医薬組成物に含めるためのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを直接特定するために、コロナウイルス感染細胞によって提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを特定することができる。Ｂ細胞エピトープは、エピトープマッピング法を使用して特定され得る。これらの方法には、タンパク質の既知のまたはモデル化された構造が、表面エピトープを予測するためのアルゴリズムベースのアプローチにおいて使用される構造的アプローチ、および抗体への全タンパク質、タンパク質フラグメントまたはペプチドの結合が、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して定量化され得る機能的アプローチが含まれる。競合マッピング、抗原修飾またはタンパク質断片化法も使用され得る。
医薬組成物は、少なくとも２つの異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用する少なくとも１つの免疫原性ペプチドを含み得る。これにより、医薬組成物が、より高い割合の医薬組成物が投与される個体で免疫応答を誘発することが可能になり得る。これは、医薬組成物が、免疫原性ペプチドと相互作用するＨＬＡスーパータイプの全ての個体において免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答など）を誘発することができるはずであるからである。医薬組成物は、例えば、それぞれ翻訳および少なくとも２つの異なるＨＬＡスーパータイプとの相互作用が可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０の免疫原性ペプチドを含み得る。各免疫原性ペプチドは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０の異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用し得る。各免疫原性ペプチドは、任意の組み合わせのＡ１、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１９、Ａ２、Ａ２０３、Ａ２１０、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２４０３、Ａ２５、Ａ２６、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３２、Ａ３３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ４３、Ａ６６、Ａ６８、Ａ６９、Ａ７４、Ａ８０、Ａ９、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３７、Ｂ３８、Ｂ３９、Ｂ４０、Ｂ４１、Ｂ４２、Ｂ４４、Ｂ４５、Ｂ４６、Ｂ４７、Ｂ４８、Ｂ４９、Ｂ５、Ｂ５０、Ｂ５１、Ｂ５１０２、Ｂ５１０３、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ５４、Ｂ５５、Ｂ５６、Ｂ５７、Ｂ５８、Ｂ５９、Ｂ６０、Ｂ６１、Ｂ６２、Ｂ６３、Ｂ６４、Ｂ６５、Ｂ６７、Ｂ７、Ｂ７０、Ｂ７０３、Ｂ７１、Ｂ７２、Ｂ７３、Ｂ７５、Ｂ７６、Ｂ７７、Ｂ７８、Ｂ８、Ｂ８１、Ｂ８２、Ｃ１、Ｃ１０、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９、または当技術分野で公知の任意の他のＨＬＡスーパータイプの２つ以上と相互作用し得る。
医薬組成物は、それぞれ異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用する少なくとも２つの免疫原性ペプチドを含み得る。例えば、医薬組成物は、（ｉ）それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチドとは異なるエピトープを含み、（ｉｉ）それぞれ異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用する、２つ以上の免疫原性ペプチドを含み得る。２つ以上のこのような免疫原性ペプチドを医薬組成物に含めることにより、医薬組成物が、より高い割合の医薬組成物が投与される個体で免疫応答を誘発することが可能になる。これは、医薬組成物が、２つ以上の免疫原性ペプチドに含まれるエピトープの１つと相互作用するＨＬＡスーパータイプの全ての個体において免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答）を誘発することができるはずであるからである。各エピトープは、Ａ１、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１９、Ａ２、Ａ２０３、Ａ２１０、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２４０３、Ａ２５、Ａ２６、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３２、Ａ３３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ４３、Ａ６６、Ａ６８、Ａ６９、Ａ７４、Ａ８０、Ａ９、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３７、Ｂ３８、Ｂ３９、Ｂ４０、Ｂ４１、Ｂ４２、Ｂ４４、Ｂ４５、Ｂ４６、Ｂ４７、Ｂ４８、Ｂ４９、Ｂ５、Ｂ５０、Ｂ５１、Ｂ５１０２、Ｂ５１０３、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ５４、Ｂ５５、Ｂ５６、Ｂ５７、Ｂ５８、Ｂ５９、Ｂ６０、Ｂ６１、Ｂ６２、Ｂ６３、Ｂ６４、Ｂ６５、Ｂ６７、Ｂ７、Ｂ７０、Ｂ７０３、Ｂ７１、Ｂ７２、Ｂ７３、Ｂ７５、Ｂ７６、Ｂ７７、Ｂ７８、Ｂ８、Ｂ８１、Ｂ８２、Ｃ１、Ｃ１０、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８もしくはＣ９、または当技術分野で公知の任意の他のＨＬＡスーパータイプと相互作用し得る。このようなエピトープを含む免疫原性ペプチドの任意の組み合わせが可能である。
ポリヌクレオチド組成物
医薬組成物は、１つまたは複数のポリヌクレオチド、例えば約１～約５０、約２～約４０、約３～約３０、約４～約２５、約５～約２０、約６～約１５、約７、約８、約９または約１０のポリヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のポリヌクレオチドの各々が、例えば、本発明のポリヌクレオチドであり得る。あるいは、医薬組成物は、（ｉ）本発明のポリヌクレオチドと（ｉｉ）他のポリヌクレオチドの混合物を含有し得る。
各ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡなどのＲＮＡを含み得る。各ポリヌクレオチドはＤＮＡを含み得る。各ポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含み得る。好ましくは、各ポリヌクレオチドはＲＮＡを含むか、またはそれからなる。より好ましくは、各ポリヌクレオチドはｍＲＮＡを含むか、またはそれからなる。
一態様では、医薬組成物は、２つ以上のポリヌクレオチドを含む。２つ以上のポリヌクレオチドの各々が本発明のポリヌクレオチドであり得る。医薬組成物は、例えば、それぞれ本発明の異なる免疫原性ペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。換言すれば、医薬組成物は、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチドの異なるフラグメントをコードする、２つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。医薬組成物は、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチドとは異なるエピトープをコードする、約１～約５０、約２～約４０、約３～約３０、約４～約２５、約５～約２０、約６～約１５、約７、約８、約９または約１０のポリヌクレオチドを含み得る。一部の態様では、異なるエピトープの各々は、異なるＨＬＡサブタイプと相互作用し得る。
医薬組成物は、それぞれ翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のエピトープを含む免疫原性ペプチドをコードする、１つまたは複数（例えば、約２～約４０、約３～約３０、約４～約２５、約５～約２０、約６～約１５、約７、約８、約９または約１０）のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）１つまたは複数の他のポリヌクレオチド（すなわち、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のエピトープを含む免疫原性ペプチドをコードしないポリヌクレオチド）とを含み得る。他のポリヌクレオチドは、１つまたは複数のエピトープ、例えば約２～４０、約３～約３０、約４～約２５、約５～約２０、約６～約１５、約７、約８、約９または約１０個のエピトープをコードし得る。エピトープは、例えば、ペプチドワクチンに関連して上に記載されるように、Ｂ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープおよび／またはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであり得る。
医薬組成物は、少なくとも２つの異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用する免疫原性ペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み得る。これにより、医薬組成物が、より高い割合の医薬組成物が投与される個体で免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞応答）を誘発することが可能になる。これは、医薬組成物が、エピトープと相互作用するＨＬＡスーパータイプの全ての個体において免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答など）を誘発することができるはずであるからである。医薬組成物は、例えば、それぞれ翻訳および少なくとも２つの異なるＨＬＡスーパータイプとの相互作用が可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチド由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドをコードする、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０のポリヌクレオチドを含み得る。各免疫原性ペプチドは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０の異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用し得る。各免疫原性ペプチドは、任意の組み合わせのＡ１、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１９、Ａ２、Ａ２０３、Ａ２１０、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２４０３、Ａ２５、Ａ２６、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３２、Ａ３３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ４３、Ａ６６、Ａ６８、Ａ６９、Ａ７４、Ａ８０、Ａ９、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３７、Ｂ３８、Ｂ３９、Ｂ４０、Ｂ４１、Ｂ４２、Ｂ４４、Ｂ４５、Ｂ４６、Ｂ４７、Ｂ４８、Ｂ４９、Ｂ５、Ｂ５０、Ｂ５１、Ｂ５１０２、Ｂ５１０３、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ５４、Ｂ５５、Ｂ５６、Ｂ５７、Ｂ５８、Ｂ５９、Ｂ６０、Ｂ６１、Ｂ６２、Ｂ６３、Ｂ６４、Ｂ６５、Ｂ６７、Ｂ７、Ｂ７０、Ｂ７０３、Ｂ７１、Ｂ７２、Ｂ７３、Ｂ７５、Ｂ７６、Ｂ７７、Ｂ７８、Ｂ８、Ｂ８１、Ｂ８２、Ｃ１、Ｃ１０、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９、または当技術分野で公知の任意の他のＨＬＡスーパータイプの２つ以上と相互作用し得る。
医薬組成物は、それぞれ異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用する免疫原性ペプチドをコードする少なくとも２つのポリヌクレオチドを含み得る。例えば、医薬組成物は、それぞれ、（ｉ）翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるＯＲＦによってコードされるポリペプチドとは異なるエピトープを含み、（ｉｉ）異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用する、免疫原性ペプチドをコードする、２つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。２つ以上のこのようなポリヌクレオチドを医薬組成物に含めることにより、医薬組成物が、より高い割合の組成物が投与される個体で免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答）を誘発することが可能になる。これは、医薬組成物が、２つ以上のポリヌクレオチドによってコードされるエピトープの１つと相互作用するＨＬＡスーパータイプの全ての個体において免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答）を誘発することができるはずであるからである。各エピトープは、Ａ１、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１９、Ａ２、Ａ２０３、Ａ２１０、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２４０３、Ａ２５、Ａ２６、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３２、Ａ３３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ４３、Ａ６６、Ａ６８、Ａ６９、Ａ７４、Ａ８０、Ａ９、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３７、Ｂ３８、Ｂ３９、Ｂ４０、Ｂ４１、Ｂ４２、Ｂ４４、Ｂ４５、Ｂ４６、Ｂ４７、Ｂ４８、Ｂ４９、Ｂ５、Ｂ５０、Ｂ５１、Ｂ５１０２、Ｂ５１０３、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ５４、Ｂ５５、Ｂ５６、Ｂ５７、Ｂ５８、Ｂ５９、Ｂ６０、Ｂ６１、Ｂ６２、Ｂ６３、Ｂ６４、Ｂ６５、Ｂ６７、Ｂ７、Ｂ７０、Ｂ７０３、Ｂ７１、Ｂ７２、Ｂ７３、Ｂ７５、Ｂ７６、Ｂ７７、Ｂ７８、Ｂ８、Ｂ８１、Ｂ８２、Ｃ１、Ｃ１０、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８もしくはＣ９、または当技術分野で公知の任意の他のＨＬＡスーパータイプと相互作用し得る。このようなエピトープを含む免疫原性ペプチドの任意の組み合わせが可能である。
ナノ粒子
本発明の医薬組成物に含まれるいずれの免疫原性ペプチドまたはポリヌクレオチドもナノ粒子に付着され得る。ナノ粒子、例えば金ナノ粒子への付着は、本明細書に記載されるように有益である。
ペプチドまたはポリヌクレオチドのナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）への付着により、ウイルスまたはアジュバントを医薬組成物に含める必要性が低減または排除される。ナノ粒子は、ペプチドまたはポリヌクレオチドに対する免疫応答を有効に誘導するのに役立つ免疫「デンジャーシグナル」を含み得る。ナノ粒子は、堅牢な免疫応答に必要な樹状細胞（ＤＣ）の活性化および成熟を誘導し得る。ナノ粒子は、抗原提示細胞などの細胞によるナノ粒子、したがってペプチドまたはポリヌクレオチドの取り込みを改善する非自己成分を含有し得る。したがって、ペプチドまたはポリヌクレオチドのナノ粒子への付着により、抗原提示細胞がウイルス特異的Ｔ細胞および／またはＢ細胞を刺激する能力が高まり得る。ナノ粒子への付着はまた、皮下、皮内、経皮および経口／頬側経路を介した医薬組成物の送達を促進し、投与における柔軟性を提供する。
ナノ粒子は、リガンドを固定するための基質として使用することができる１～１００ナノメートル（ｎｍ）の間のサイズの粒子である。本発明の医薬組成物において、ナノ粒子は、１～１００、２０～９０、３０～８０、４０～７０または５０～６０ｎｍの平均直径を有し得る。好ましくは、ナノ粒子は、２０～４０ｎｍの平均直径を有する。２０～４０ｎｍの平均直径は、ナノ粒子のサイトゾルへの取り込みを促進する。平均直径は、透過型電子顕微鏡法などの当技術分野で周知の技術を使用して測定することができる。
免疫原性ペプチドなどの抗原の送達に適したナノ粒子は、当技術分野で公知である。このようなナノ粒子を作製する方法も公知である。ポリヌクレオチドの送達に適したナノ粒子、およびそれらの作製方法も当技術分野で公知である。
ナノ粒子は、例えば、ポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、または自己集合性タンパク質であり得る。ナノ粒子は、好ましくはリン酸カルシウムナノ粒子、シリコンナノ粒子または金ナノ粒子である。
ナノ粒子はポリマーナノ粒子であり得る。ポリマーナノ粒子は、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ（ｄ，ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ｇ－グルタミン酸）（ｇ－ＰＧＡ）ｍ ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、またはポリスチレンなどの１つまたは複数の合成ポリマーを含み得る。ポリマーナノ粒子は、多糖類、例えばプルラン、アルギネート、イヌリンおよびキトサンなどの１つまたは複数の天然ポリマーを含み得る。ポリマーナノ粒子の使用は、ナノ粒子に含まれ得るポリマーの特性のために有利であり得る。例えば、上に列挙される天然および合成ポリマーは、良好な生体適合性および生分解性、非毒性の性質ならびに／または所望の形状およびサイズに操作される能力を有し得る。ポリマーナノ粒子はヒドロゲルナノ粒子を形成し得る。ヒドロゲルナノ粒子は、ナノサイズの親水性三次元ポリマーネットワークの一種である。ヒドロゲルナノ粒子は、柔軟なメッシュサイズ、多価コンジュゲーションのための大きな表面積、高い含水量、および抗原の高い負荷容量を含む好ましい特性を有する。ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＡ）、ＰＬＧＡ、ＰＥＧおよび多糖類などのポリマーは、ヒドロゲルナノ粒子を形成するのに特に適している。
ナノ粒子は無機ナノ粒子であり得る。典型的には、無機ナノ粒子は剛性構造を有し、非生分解性である。しかしながら、無機ナノ粒子は生分解性であり得る。無機ナノ粒子は、抗原が封入され得るシェルを含み得る。無機ナノ粒子は、抗原が共有結合的に付着し得るコアを含み得る。コアは金属を含み得る。例えば、コアは、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）または銅（Ｃｕ）原子を含み得る。コアは、２種類以上の原子から形成され得る。例えば、コアは、Ａｕ／Ａｇ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ａｇ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｐｔ、Ａｕ／ＰｄまたはＡｕ／Ａｇ／Ｃｕ／Ｐｄの合金などの合金を含み得る。コアはリン酸カルシウム（ＣａＰ）を含み得る。コアは、半導体材料、例えばセレン化カドミウムを含み得る。ナノ粒子は、金グリコールナノ粒子などの金ナノ粒子であり得る。
他の例示的な無機ナノ粒子には、カーボンナノ粒子およびシリカベースのナノ粒子が含まれる。カーボンナノ粒子は良好な生体適合性を有し、ナノチューブおよびメソポーラス球に合成することができる。シリカベースのナノ粒子（ＳｉＮＰ）は生体適合性であり、それらの治療用途に適合するように調整可能な構造パラメータを用いて調製することができる。
ナノ粒子は、元素ケイ素ナノ粒子などのシリコンナノ粒子であり得る。ナノ粒子はメソポーラスであり得る、またはハニカム細孔構造を有し得る。好ましくは、ナノ粒子は、ハニカム細孔構造を有する元素ケイ素粒子である。このようなナノ粒子は当技術分野で公知であり、ほぼあらゆる負荷物、投与経路、標的または放出プロファイルに合わせることができる調整可能かつ制御された薬物負荷、標的化および放出を提供する。例えば、このようなナノ粒子は、その負荷物のバイオアベイラビリティを増加させ得る、ならびに／または経口投与された活性物質の腸透過性および吸収を改善し得る。ナノ粒子は、その多孔質構造および大きな表面積のために、非常に高い負荷容量を有し得る。ナノ粒子は、それらの物理的特性に応じて、数日間、数週間または数か月間にわたってそれらの負荷物を放出し得る。ケイ素は人体の天然に存在する元素であるため、ナノ粒子は免疫系からの応答を誘発し得ない。これは、ナノ粒子のインビボ安全性に有利である。
上記のＳｉＮＰのいずれも、生分解性または非生分解性であり得る。生分解性ＳｉＮＰは、ケイ素の生物学的に利用可能な形態であるオルトケイ酸に溶解し得る。オルトケイ酸は、骨、結合組織、毛髪および皮膚の健康に有益であることが示されている。
ナノ粒子はリポソームであり得る。リポソームは、典型的には、生分解性の非毒性リン脂質から形成され、水性コアを有する自己集合性リン脂質二重層シェルを含む。リポソームは、単一リン脂質二重層を含む単層小胞、または水の層によって分離されたいくつかの同心リン脂質シェルを含む多層小胞であり得る。結果として、親水性分子をリン脂質二重層内の水性コアまたは疎水性分子に組み込むようにリポソームを調整することができる。リポソームは、送達のために抗原をコア内に封入し得る。リポソームは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をシェルに組み込んで、ビロソームを形成し得る。いくつかのリポソーム系製品が当技術分野で確立されており、ヒトでの使用が承認されている。
ナノ粒子は免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）であり得る。ＩＳＣＯＭは、典型的にはコロイド状サポニン含有ミセルから形成されるケージ様粒子である。ＩＳＣＯＭは、コレステロール、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）およびサポニン（例えば、シャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の木由来Ｑｕｉｌ Ａ）を含み得る。ＩＳＣＯＭは、伝統的には、単純ヘルペスウイルス１型、Ｂ型肝炎ウイルスまたはインフルエンザウイルス由来のエンベロープタンパク質などのウイルスエンベロープタンパク質を捕捉するために使用されてきた。
ナノ粒子はウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり得る。ＶＬＰは、生体適合性カプシドタンパク質の自己集合によって形成される、感染性核酸を欠く自己集合性ナノ粒子である。ＶＬＰは、典型的には、直径が約２０～約１５０ｎｍ、例えば約２０～約４０ｎｍ、約３０～約１４０ｎｍ、約４０～約１３０ｎｍ、約５０～約１２０ｎｍ、約６０～約１１０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍまたは約８０～約９０ｎｍである。ＶＬＰは、免疫系との相互作用のために自然に最適化された、進化したウイルス構造の力を有利に利用する。自然に最適化されたナノ粒子サイズおよび反復的構造秩序は、ＶＬＰがアジュバントの非存在下でさえ強力な免疫応答を誘導することを意味する。
ナノ粒子は自己集合性タンパク質であり得る。例えば、ナノ粒子はフェリチンを含み得る。フェリチンは、ほぼ球形の１０ｎｍ構造に自己集合し得るタンパク質である。ナノ粒子は、主要ヴォールトタンパク質（ｍａｊｏｒ ｖａｕｌｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＶＰ）を含み得る。９６単位のＭＶＰは、およそ幅４０ｎｍおよび長さ７０ｎｍのサイズを有する樽形ヴォールトナノ粒子に自己集合することができる。
ナノ粒子はリン酸カルシウム（ＣａＰ）ナノ粒子であり得る。ＣａＰナノ粒子は、１個または複数（例えば、２個以上、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上または５００個以上）のＣａＰ分子を含むコアを含み得る。ＣａＰナノ粒子およびその作製方法は当技術分野で公知である。例えば、ＣＡＰナノ粒子の安定なナノ懸濁液は、一定の混合下でカルシウムおよびリン酸塩の無機塩溶液を所定の比で混合することによって作製され得る。
ＣａＰナノ粒子は、約８０～約１００ｎｍ、例えば約８２～約９８ｎｍ、約８４～約９６ｎｍ、約８６～約９４ｎｍまたは約８８～約９２ｎｍの平均粒径を有し得る。この粒径は、他のより大きな粒径よりも、免疫細胞取り込みおよび免疫応答に関して優れた性能をもたらし得る。例えば、１か月、２か月、３か月、６か月、１２か月、１８か月、２４か月、３６か月または４８か月の期間にわたって測定した場合、粒径は安定であり得る（すなわち、有意な変化を示さない）。
ＣａＰナノ粒子は、ナノ粒子の表面に吸着された、または粒子合成中にＣａＰと共沈殿した１つまたは複数の抗原と共製剤化することができる。例えば、免疫原性ペプチドなどのペプチドは、ペプチドをＤＭＳＯに溶解し（例えば、約１０ ｍｇ／ｍｌの濃度で）、Ｎ－アセチル－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）（例えば、０．０９３ ｍｏｌ／Ｌで）および超純水と一緒にＣａＰナノ粒子の懸濁液に添加し、室温で約４時間（例えば、１時間、２時間、３時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間または１０時間）混合することによって、ＣａＰナノ粒子に付着させることができる。
医薬組成物は、約０．１５～約０．８％、例えば０．２～約０．７５％、０．２５～約０．７％、０．３～約０．６％、０．３５～約０．６５％、０．４～約０．６％または０．４５～約０．５５％のＣａＰナノ粒子を含み得る。好ましくは、医薬組成物は約０．３％のＣａＰナノ粒子を含む。
ＣａＰナノ粒子は、骨および歯などのヒト硬組織との化学的類似性のために高度の生体適合性を有する。したがって、有利なことに、ＣａＰナノ粒子は、治療用途に使用される場合、非毒性である。ＣａＰナノ粒子は、筋肉内、皮下、経口または吸入経路を介した投与に安全である。ＣａＰナノ粒子は商業的に合成するのも簡単である。さらに、ＣａＰナノ粒子は、抗原の徐放に関連し得、ナノ粒子に付着したペプチドに対する免疫応答の誘導を増強し得る。ＣａＰナノ粒子は、アジュバントとしても薬物送達ビヒクルとしても使用され得る。
ナノ粒子は、金グリコナノ粒子（ｇｌｙｃｏｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などの金ナノ粒子であり得る。金ナノ粒子は当技術分野で公知であり、特にその各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００２／３２４０４号パンフレット、国際公開第２００６／０３７９７９号パンフレット、国際公開第２００７／１２２３８８号パンフレット、国際公開第２００７／０１５１０５号パンフレットおよび国際公開第２０１３／０３４７２６号パンフレットに記載されている。各ペプチドに付着した金ナノ粒子は、その各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００２／３２４０４号パンフレット、国際公開第２００６／０３７９７９号パンフレット、国際公開第２００７／１２２３８８号パンフレット、国際公開第２００７／０１５１０５号パンフレットおよび国際公開第２０１３／０３４７２６号パンフレットのいずれかに記載される金ナノ粒子であり得る。
金ナノ粒子は、金（Ａｕ）原子を含むコアを含む。コアは、１個または複数のＦｅ、ＣｕまたはＧｄ原子をさらに含み得る。コアは、Ａｕ／Ｆｅ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｇｄ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｆｅ／ＧｄまたはＡｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄなどの金合金から形成され得る。コア中の原子の総数は、１００～５００個の原子、例えば１５０～４５０個、２００～４００個または２５０～３５０個の原子であり得る。金ナノ粒子は、１～１００、２０～９０、３０～８０、４０～７０または５０～６０ｎｍの平均直径を有し得る。好ましくは、金ナノ粒子は、２０～４０ｎｍの平均直径を有する。
ナノ粒子は、α－ガラクトースおよび／またはβ－ＧｌｃＮＨＡｃでコーティングされた表面を含み得る。例えば、ナノ粒子は、α－ガラクトースおよび／またはβ－ＧｌｃＮＨＡｃで不動態化された表面を含み得る。この場合、ナノ粒子は、例えば、金属および／または半導体原子を含むコアを含むナノ粒子であり得る。例えば、ナノ粒子は金ナノ粒子であり得る。β－ＧｌｃＮＨＡｃは、抗原提示細胞を活性化することができる細菌病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）である。このようにして、β－ＧｌｃＮＨＡｃでコーティングまたは不動態化された表面を含むナノ粒子は、免疫応答を非特異的に刺激し得る。したがって、このようなナノ粒子への免疫原性ペプチドの付着により、本発明の医薬組成物の個体への投与によって誘発される免疫応答が改善され得る。
ペプチドまたはポリヌクレオチド以外の１つまたは複数のリガンドを、上記のいずれかの種類のナノ粒子であり得るナノ粒子に連結してもよい。リガンドは、コアの表面を部分的または完全に覆うことができる「コロナ」、層またはコーティングを形成し得る。コロナは、ナノ粒子コアを取り囲むまたは部分的に取り囲む有機層であると考えられ得る。コロナは、ナノ粒子のコアの不動態化をもたらす、またはこれに関与し得る。したがって、場合によっては、コロナがコアを安定化させるのに十分に完全なコーティング層であり得る。コロナは、本発明のナノ粒子の水溶性などの溶解性を促進し得る。
ナノ粒子は、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個または少なくとも５０個のリガンドを含み得る。リガンドは、１つまたは複数のペプチド、タンパク質ドメイン、核酸分子、脂質基、炭水化物基、アニオン性基、またはカチオン性基、糖脂質および／または糖タンパク質を含み得る。炭水化物基は、多糖、オリゴ糖または単糖基（例えば、グルコース）であり得る。リガンドの１つまたは複数は非自己成分であってもよく、これにより、ナノ粒子が病原性成分との類似性のために抗原提示細胞によって取り込まれる可能性が高くなる。例えば、１つまたは複数のリガンドは、炭水化物部分（例えば、細菌炭水化物部分）、界面活性剤部分および／またはグルタチオン部分を含み得る。例示的なリガンドには、グルコース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルタチオン、２’－チオエチル－β－Ｄ－グルコピラノシドおよび２’－チオエチル－Ｄ－グルコピラノシドが含まれる。好ましいリガンドには、糖ナノ粒子を形成する複合糖質が含まれる。
コアへのリガンドの連結は、リンカーによって促進され得る。リンカーは、チオール基、アルキル基、グリコール基またはペプチド基を含み得る。例えば、リンカーは、Ｃ２～Ｃ１５アルキルおよび／またはＣ２～Ｃ１５グリコールを含み得る。リンカーは、コアに共有結合付着することができる硫黄含有基、アミノ含有基、リン酸含有基または酸素含有基を含み得る。あるいは、リガンドは、例えば、リガンドに含まれる硫黄含有基、アミノ含有基、リン酸含有基または酸素含有基を介してコアに直接連結され得る。
ナノ粒子への付着
典型的には、免疫原性ペプチドまたはポリヌクレオチドは、ナノ粒子のコアに付着され得るが、コロナまたはリガンドへの付着も可能であり得る。免疫原性ペプチドは、そのＮ末端でナノ粒子に付着され得る。
ペプチドまたはポリヌクレオチドは、例えば、ペプチドまたはポリヌクレオチド中の硫黄含有基、アミノ含有基、リン酸含有基または酸素含有基中の原子とナノ粒子またはそのコア中の原子の共有結合によって、ナノ粒子に直接付着され得る。
リンカーは、ペプチドまたはポリヌクレオチドをナノ粒子に連結するために使用され得る。リンカーは、コア中の原子に共有結合付着することができる硫黄含有基、アミノ含有基、リン酸含有基または酸素含有基を含み得る。例えば、リンカーは、チオール基、アルキル基、グリコール基またはペプチド基を含み得る。
リンカーは、ペプチド部分および非ペプチド部分を含み得る。ペプチド部分は、配列Ｘ１Ｘ２Ｚ１（式中、Ｘ１はＡおよびＧから選択されるアミノ酸であり；Ｘ２はＡおよびＧから選択されるアミノ酸であり；Ｚ１はＹおよびＦから選択されるアミノ酸である）を含み得る。ペプチド部分は、配列ＡＡＹまたはＦＬＡＡＹを含み得る。リンカーのペプチド部分は、ペプチドのＮ末端に連結され得る。リンカーの非ペプチド部分は、Ｃ２～Ｃ１５アルキルおよび／またはＣ２～Ｃ１５グリコール、例えばチオエチル基またはチオプロピル基を含み得る。
リンカーは、（ｉ）ＨＳ－（ＣＨ２）２－ＣＯＮＨ－ＡＡＹ；（ｉｉ）ＨＳ－（ＣＨ２）２－ＣＯＮＨ－ＬＡＡＹ；（ｉｉｉ）ＨＳ－（ＣＨ２）３－ＣＯＮＨ－ＡＡＹ；（ｉｖ）ＨＳ－（ＣＨ２）３－ＣＯＮＨ－ＦＬＡＡＹ；（ｖ）ＨＳ－（ＣＨ２）１０－（ＣＨ２ＯＣＨ２）７－ＣＯＮＨ－ＡＡＹ；および（ｖｉ）ＨＳ－（ＣＨ２）１０－（ＣＨ２ＯＣＨ２）７－ＣＯＮＨ－ＦＬＡＡＹであり得る。この場合、リンカーの非ペプチド部分のチオール基がリンカーをコアに連結する。
ペプチドまたはポリヌクレオチドをナノ粒子に付着させるための他の適切なリンカーは当技術分野で公知であり、当業者によって容易に特定および実施され得る。
上で説明されるように、医薬組成物は、複数の免疫原性ペプチドまたは複数のポリヌクレオチドを含み得る。医薬組成物が２つ以上の免疫原性ペプチドまたはポリヌクレオチドを含む場合、２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上または２０以上）の免疫原性ペプチドまたはポリヌクレオチドを同じナノ粒子に付着させてもよい。２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上または２０以上）の免疫原性ペプチドまたはポリヌクレオチドをそれぞれ異なるナノ粒子に付着させてもよい。しかしながら、免疫原性ペプチドまたはポリヌクレオチドが付着しているナノ粒子が同じ種類のナノ粒子であってもよい。例えば、各免疫原性ペプチドまたはポリヌクレオチドを金ナノ粒子または金グリコールナノ粒子に付着させてもよい。各免疫原性ペプチドまたはポリヌクレオチドをＣａＰナノ粒子に付着させてもよい。免疫原性ペプチドまたはポリヌクレオチドが付着しているナノ粒子が異なる種類のナノ粒子であってもよい。例えば、１つの免疫原性ペプチドまたはポリヌクレオチドを金ナノ粒子に付着させ、別の免疫原性ペプチドまたはポリヌクレオチドをＣａＰナノ粒子に付着させてもよい。
組成物は、生理学的に許容される担体または希釈剤と共に調製され得る。典型的には、このような組成物は、ペプチドおよび／またはペプチド連結ナノ粒子の液体懸濁液として調製される。
医薬品、方法および治療的使用
本発明は、コロナウイルス感染症を予防および／または処置する方法であって、本発明の医薬組成物を個体に投与するステップを含む方法を提供する。本発明はまた、個体のコロナウイルス感染症を予防および／または処置する方法における使用のための、本発明の医薬組成物を提供する。本発明はさらに、個体のコロナウイルス感染症を処置および／または予防するための医薬品の製造における、免疫原性ペプチド、およびこのようなペプチドをコードするヌクレオチドの使用を提供する。
典型的には、個体はヒトである。しかしながら、個体は、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、鳥類、コウモリなどの動物であってもよい。
コロナウイルス感染症は、人畜共通ウイルスによって引き起こされ得る。コロナウイルス感染症はパンデミックウイルス感染症または潜在的パンデミックウイルス感染症であり得る。コロナウイルス感染症は、エンデミックコロナウイルスによって引き起こされる感染症であり得る。コロナウイルス発明は季節性コロナウイルス感染症であり得る。コロナウイルス感染症は、ヒトコロナウイルスによって引き起こされ得る。コロナウイルス感染症は、コウモリコロナウイルスなどの動物コロナウイルスによって引き起こされ得る。コロナウイルス感染症は、人畜共通コロナウイルスによって引き起こされ得る。例示的なヒト、動物および人畜共通コロナウイルスは当技術分野で周知である。
ヒトコロナウイルスは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスであり得る。ヒトコロナウイルスは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ウイルスであり得る。ヒトコロナウイルスは、例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶウイルスであり得る。ヒトコロナウイルスは、例えば、エンデミック風邪コロナウイルスであり得る。上に示されるように、エンデミック風邪コロナウイルスには、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３およびＨＫＵ１が含まれる。
医薬組成物は、好ましくは薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。医薬組成物は、任意の適切な方法を使用して製剤化され得る。標準的な薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いた細胞の製剤化は、薬学分野における日常的な方法を使用して行われ得る。製剤の正確な性質は、投与される細胞および所望の投与経路を含むいくつかの因子に依存する。製剤の適切な種類は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｅｒｎ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、米国に完全に記載されている。
医薬組成物は、任意の経路によって投与され得る。適切な経路には、それだけに限らないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、皮内、経皮および経口／頬側経路が含まれる。
ナノ粒子は、薬学的に許容され、有効成分と適合性である賦形剤と混合され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなどおよびこれらの組み合わせである。
さらに、所望であれば、医薬組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、および／またはｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有し得る。
ペプチド、ペプチド連結ナノ粒子、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド連結ナノ粒子は、投与製剤と適合する方法で投与され、このような量で治療上有効である。投与される量は、処置される対象、処置される疾患および対象の免疫系の能力に依存する。投与が必要とされるペプチド、ポリヌクレオチドまたはナノ粒子の正確な量は、実務家の判断に依存し得、各対象に特有であり得る。
任意の適切な数のペプチド、ペプチド連結ナノ粒子、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド連結ナノ粒子が対象に投与され得る。例えば、患者１ｋｇ当たり少なくともまたは約０．２×１０６、０．２５×１０６、０．５×１０６、１．５×１０６、４．０×１０６または５．０×１０６個のペプチド、ペプチド連結ナノ粒子、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド連結ナノ粒子が投与され得る。例えば、少なくともまたは約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９個のペプチド、ペプチド連結ナノ粒子、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド連結ナノ粒子が投与され得る。目安として、投与されるペプチド、ペプチド連結ナノ粒子、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド連結ナノ粒子の数は、１０５～１０９個、好ましくは１０６～１０８個であり得る。
複合体
本発明は、ＭＨＣ分子に結合した本発明の免疫原性ペプチドを含む複合体を提供する。したがって、複合体は、例えば、ＭＨＣ分子に結合した配列番号２～１２、４６および６３のいずれか１つを含むか、またはそれからなる免疫原性ペプチドを含み得る。したがって、複合体は、例えば、配列番号２～１２、４６および６３から選択される関連配列との少なくとも５０％の配列同一性を有する免疫原性ペプチドを含み得る。バリアントは、例えば、配列番号２～１２、４６および６３から選択される関連配列との少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
ペプチド：ＭＨＣ結合は当技術分野で周知である。好ましくは、複合体に含まれるペプチドとＭＨＣ分子との間の結合は非共有結合性である。結合は、例えば、静電相互作用、水素結合、ファンデルワールス力および／または疎水性相互作用によって媒介され得る。
ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子であり得る。好ましくは、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩ分子である。ＭＨＣ分子は、任意のＨＬＡスーパータイプのものであり得る。例えば、ＭＨＣクラスＩ分子は、スーパータイプＡ１、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１９、Ａ２、Ａ２０３、Ａ２１０、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２４０３、Ａ２５、Ａ２６、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３、Ａ３０、Ａ３１、Ａ３２、Ａ３３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ４３、Ａ６６、Ａ６８、Ａ６９、Ａ７４、Ａ８０、Ａ９、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３７、Ｂ３８、Ｂ３９、Ｂ４０、Ｂ４１、Ｂ４２、Ｂ４４、Ｂ４５、Ｂ４６、Ｂ４７、Ｂ４８、Ｂ４９、Ｂ５、Ｂ５０、Ｂ５１、Ｂ５１０２、Ｂ５１０３、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ５４、Ｂ５５、Ｂ５６、Ｂ５７、Ｂ５８、Ｂ５９、Ｂ６０、Ｂ６１、Ｂ６２、Ｂ６３、Ｂ６４、Ｂ６５、Ｂ６７、Ｂ７、Ｂ７０、Ｂ７０３、Ｂ７１、Ｂ７２、Ｂ７３、Ｂ７５、Ｂ７６、Ｂ７７、Ｂ７８、Ｂ８、Ｂ８１、Ｂ８２、Ｃ１、Ｃ１０、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８またはＣ９のものであり得る。
複合体は、本発明の２つ以上の免疫原性ペプチドと、２個以上のＭＨＣ分子とを含み得る。例えば、複合体は、３つ以上、例えば４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上または２０以上の本発明の免疫原性ペプチドを含み得る。複合体は、３個以上、例えば４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上または２０個以上のＭＨＣ分子を含み得る。複合体は、例えば、それぞれ、３つ以上、例えば４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上または２０以上の本発明の免疫原性ペプチドと、３個以上、例えば４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上または２０個以上のＭＨＣ分子とを含み得る。複合体は、ＭＨＣ分子と同じ数の本発明の免疫原性ペプチドを含み得る。複合体は、ＭＨＣ分子の数とは異なる数の本発明の免疫原性ペプチドを含み得る。複合体は、例えば、４個のＭＨＣ分子を含み得る。複合体は、ＭＨＣ四量体を含み得る、またはからなり得る。複合体は、例えば、１２個のＭＨＣ分子を含み得る。複合体は、ＭＨＣ十二量体を含み得る、またはからなり得る。
複合体が２つ以上の本発明の免疫原性ペプチドを含む場合、２つ以上の免疫原性ペプチドの各々が同じであってもよい。あるいは、２つ以上の免疫原性ペプチドの各々が異なっていてもよい。複合体が３つ以上の本発明の免疫原性ペプチドを含む場合、３つ以上の免疫原性ペプチドの各々が同じであってもよい。複合体が３つ以上の本発明の免疫原性ペプチドを含む場合、３つ以上のペプチドの各々が異なっていてもよい。複合体が３つ以上の本発明の免疫原性ペプチドを含む場合、３つ以上の免疫原性ペプチドの一部が同じであってもよく、３つ以上の免疫原性ペプチドの一部が異なっていてもよい。
複合体が２個以上のＭＨＣ分子を含む場合、２個以上のＭＨＣ分子の各々が同じであってもよい。あるいは、２個以上のＭＨＣの各々が異なっていてもよい。複合体が３個以上のＭＨＣ分子を含む場合、３個以上のＭＨＣ分子の各々が同じであってもよい。複合体が３個以上のＭＨＣ分子を含む場合、３個以上のＭＨＣ分子の各々が異なっていてもよい。複合体が３個以上のＭＨＣ分子を含む場合、３個以上のＭＨＣ分子の一部が同じであってもよく、３個以上のＭＨＣ分子の一部が異なっていてもよい。
複合体が２つ以上の本発明の免疫原性ペプチドおよび２個以上のＭＨＣ分子を含む場合、各免疫原性ペプチドを２個以上のＭＨＣ分子のうちの１個に結合してもよい。すなわち、複合体に含まれる各免疫原性ペプチドを複合体に含まれるあるＭＨＣ分子に結合してもよい。好ましくは、複合体に含まれる各免疫原性ペプチドが複合体に含まれる異なるＭＨＣ分子に結合している。すなわち、複合体に含まれる各ＭＨＣ分子が、好ましくは複合体に含まれる１つ以下の免疫原性ペプチドに結合している。しかしながら、複合体は、ＭＨＣ分子に結合していない１つまたは複数の本発明の免疫原性ペプチドを含んでいてもよい。複合体は、本発明のペプチドに結合していない１個または複数のＭＨＣ分子を含んでいてもよい。
複合体に含まれる１個または複数のＭＨＣ分子は互いに連結していてもよい。例えば、複合体中の１個または複数のＭＨＣ分子の各々を骨格分子またはナノ粒子に付着させてもよい。複合体に含まれる１個または複数のＭＨＣ分子をデキストラン骨格に付着させてもよい。すなわち、複合体は、ＭＨＣデキストラマーを含み得る、またはからなり得る。１個または複数のＭＨＣ分子をデキストラン骨格に付着させる機序は当技術分野で公知である。任意の数のＭＨＣ分子をデキストラン骨格に付着させてもよい。例えば、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、例えば４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上または２０以上の本発明のペプチドおよび３個以上、例えば４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上または２０個以上のＭＨＣ分子をデキストラン骨格に付着させてもよい。
複合体はフルオロフォアを含み得る。フルオロフォアは当技術分野で周知であり、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリトリン）およびＡＰＣ（アロフィコシアニン）を含む。複合体は、任意の数のフルオロフォアを含み得る。例えば、複合体は、２つ以上、３つ以上、例えば４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上または２０以上の本発明のペプチドと、３個以上、例えば４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上または２０個以上のフルオロフォアとを含み得る。複合体が複数のフルオロフォアを含む場合、複合体に含まれるフルオロフォアは同じであっても異なっていてもよい。複合体がデキストラン骨格などの骨格を含む場合、フルオロフォアは好ましくはデキストラン骨格に付着している。フルオロフォアをデキストラン骨格に付着させる機序は当技術分野で公知である。
それらの特定の形態で、または開示される機能を実施するための手段、または開示される結果を取得するための方法もしくはプロセスに関して表現される、前記説明、または以下の特許請求の範囲、または添付の図面に開示される特徴は、必要に応じて、別個に、またはこのような特徴の任意の組み合わせで、本発明をその多様な形態で実現するために利用され得る。
本発明を上記の例示的な実施形態と併せて説明してきたが、本開示が与えられると、多くの等価な修正および変形が当業者には明らかであろう。したがって、上に示される本発明の例示的な実施形態は例示的であり、限定的ではないと見なされる。記載される実施形態に対する様々な変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得る。
疑義を避けるために、本明細書で提供されるいずれの理論的説明も、読者の理解を改善する目的で提供される。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれにも拘束されることを望まない。
本明細書で使用されるいずれの節の見出しも、構成上の目的のためのものにすぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例１－試料調製
３段階プロトコルを使用して試料を調製した：
１．ウイルスストックの作製
２．感染細胞上清および溶解物試料の作製
３．回収された試料の不活性化検証
ステップ１：ウイルスストックの作製
ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２株（ワシントンおよびイタリア）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。Ｖｅｒｏ細胞をＴ－７５フラスコに播種した（４＊１０＾６細胞／フラスコ）。ウイルスを２ｍＬの培養培地に希釈して、０．０２～０．０５のＭＯＩを達成した。細胞を１５分ごとに揺動させながら３７℃で１時間感染させ、接種材料を広げた。１時間後、８ｍＬの培養培地をフラスコに添加し、フラスコを３７℃および５％ ＣＯ２で３日間インキュベーターに戻した。感染後３日で、５ｍＬの培養培地をフラスコから捨て、５ｍＬの新鮮な培地を添加した。感染後５日で、上清を回収し（約１０ｍＬ）、シリンジ濾過して（０．２ミクロンＰＥＳフィルタシリンジ）、５０ｍＬ三角フラスコに入れた。濾過した上清を等分し、－８０℃で凍結した。Ｖｅｒｏ細胞を用いた標準的なプラークアッセイを使用して、ウイルスを力価測定した。
ステップ２：感染細胞上清および溶解物試料の作製
ＭＨＣ関連ペプチドを単離するために、以下のように試料を回収した。試料回収のために十分な数の細胞に感染させるために、新たなウイルスストックを各実験のために作製した。ＨｅｐＧ２細胞をＴ－１７５フラスコまたはＴ－１５０皿（１＊１０＾７細胞／フラスコ）で増殖させ、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２に感染させた。ウイルスを５ｍｌの培養培地に希釈して、０．０１のＭＯＩを達成した。細胞を１５分ごとに揺動させながら３７℃で１時間感染させ、接種材料を広げた。１時間後、１５ｍＬの培養培地をフラスコに添加し（合計２０ｍＬの培地）、フラスコを３７℃および５％ ＣＯ２で３日間インキュベーターに戻した。
７２時間で、上清を新鮮な培養培地（総体積２０ｍＬ）に１：１希釈し、これを使用してＴ－１５０皿で増殖させたＨｅｐＧ２細胞（１＊１０＾７細胞／皿）を感染させた。感染後２４時間で、感染細胞を、細胞スクレーパーを使用して、２ｍＭ ＥＤＴＡを補充したＰＢＳ中で収穫した。細胞を１５００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を除去し、細胞ペレットを０．１％トリフルオロ酢酸溶液（試料当たり３ｍＬ）に再懸濁した。試料を室温で１０分間ロッカー上でインキュベートし、１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンした。ＴＦＡ上清を回収し、－８０℃で保存した。
細胞ペレットを再懸濁し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（試料当たり３ｍＬ）を補充したＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１５００ｒｐｍで５分間ペレット化した。細胞ペレットを溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ－４０およびプロテアーゼ阻害剤カクテル、試料当たり３ｍＬ）に再懸濁した。再懸濁した細胞を－８０℃で凍結し、その後、３７℃の水浴中で２回解凍して細胞を溶解した。試料を３０００ｒｐｍで１０分間スピンダウンして破片を捨て、細胞溶解物を－８０℃で凍結した。
ステップ３：回収された試料の不活性化検証
ＢＳＬ－３実験室から回収した試料を除去する前に、各試料を個別に試験して、検出可能なウイルスが存在しないことを確認した。Ｖｅｒｏ細胞を用いた標準的なプラークアッセイ（検出限界約５０ ＰＦＵ／ｍＬ）を使用して検証を実施した。不活性化を確認したら、試料をＢＳＬ－３から取り出し、出荷した。
実施例２－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染細胞からのＭＨＣクラスＩペプチドの発見
方法
１．ＳＣＶ２感染ＨｅｐＧ２細胞の調製
ＨｅｐＧ２細胞（全細胞１．４×１０８個）を２つの別々のバッチで増殖させ、両バッチを独立して感染させた。バッチ１では、細胞をＳＣＶ２（ＭＯＩ＝０．０１）で７２時間感染させ、上清を回収した。バッチ２では、細胞をラウンド１感染からの上清（培地で１：１希釈）で４８時間感染させた。フローサイトメトリー法を使用して、ＳＣＶ２感染後の各バッチについて感染効率を試験した。上清および細胞溶解物をＶｅｒｏ細胞培地に１０倍連続希釈し（プラークアッセイプロトコルによる）、これを使用してＶｅｒｏ細胞に感染させてウイルス粒子の存在を測定した。プラーク数を、不活化尺度として感染後４８時間で計数した。
２．質量分析試料分析を使用したＳＣＶ２ ＭＨＣクラスＩペプチドの発見
ａ）試料調製－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＵＳＡ＿ＷＡ１株に感染したＨｅｐＧ２細胞を収穫し、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞ペレットを０．１％ ＴＦＡで処理し、上清を回収した。細胞ペレットを溶解緩衝液で処理し、免疫プロテオミクスプロトコルを使用して処理してＭＨＣクラスＩペプチドを単離および精製した。２つの試料（ステップ１および２からの試料）をプールし、洗浄し、オフラインＨＰＬＣシステムで分画した。各画分をＵＰＬＣ－Ｎａｎｏ－ＭＳ／ＭＳシステムで分析した。
ｂ）ＤＤＡモード－試料を、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＬＳＣｎａｎｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＥｃｌｉｐｓｅ ｔｒｉｐｌｏｉｄ質量分析計を使用して分析した。試料を、溶融シリカトラップカラムＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ １００、７５μｍ×２ｃｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に充填した。０．１％ ＴＦＡで洗浄した後、トラップカラムをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ用の分析カラム（Ｎａｎｏｅａｓｅ ＭＺペプチドＢＥＨ Ｃ１８、１３０Ａ、１．７μｍ、７５μｍ×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）とインラインにした。４～９０％Ｂ（Ａ：０．２％ギ酸、Ｂ：０．０８％ギ酸、８０％ ＡＣＮ）：５分で４～１５％Ｂ、５０分で１５～５０％Ｂおよび１５分で５０～９０％Ｂのセグメント化された線形勾配を使用してペプチドを溶出した。分解能：２４００００、正規化（ＡＧＣ）標的：正常（１Ｅ６）の２５０％、最大注入時間：５０ｍｓで、３７５～１５００の周期的な一連のフルスキャンを用いたデータ依存型取得手順を使用して、質量分析データ（ＣＩＤまたはＨＣＤモード）を取得した。トップＳ（１秒）および３０秒の動的排除を使用して、５Ｅ３の強度閾値を用いてＭＳＭＳについて電荷ステージ２～７の親イオンを選択した。選択されたイオンは、アイソレーションウインドウ：１．２ｍ／ｚ、正規化ＡＧＣ標的２００％でイオントラップに伝送され、相対衝突エネルギー３５％で断片化され、高速走査速度でイオントラップ内で走査された。
３．データベース検索
全ての生スペクトルファイルのデータベース検索を、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。ＳＥＱＵＥＳＴを、ポジティブセンス配列とネガティブセンス配列の両方を含むＳＣＶ２タンパク質配列データベースに対するデータベース検索に使用した。対応する逆データベースに対するデータベース検索も実施して、ペプチド／タンパク質特定の偽発見率（ＦＤＲ）を評価した。データベース検索パラメータには、酵素消化がない場合の最大２回の切断ミス、前駆体質量許容差１０ ｐｐｍ、プロダクトイオン質量許容差０．４Ｄａ、および可変修飾としてのメチオニン酸化が含まれた。各実行からの結果を、高としてのペプチド信頼度値でフィルタリングして、ペプチドレベルで５％未満のＦＤＲを得た。タンパク質レベルでは、検索パラメータは、各タンパク質について最小数のペプチド１、ランク１のペプチドのみの計数、およびスコアが最も高いタンパク質のみのペプチドの計数を含み、全てのデータフィルタリングに適用した。さらに、タンパク質グループ化が可能になり、厳密な最大最節約原理を適用した。その後、手動評価を各質量スペクトルに適用した。
結果
結果を図２～図１３および以下の表２に示す。
＜表２＞
実施例３－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２英国株のｏｒｆ１ａｂ遺伝子によってコードされるＯＲＦのコンセンサス配列の決定
数千の英国ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列をダウンロードした。ｏｒｆ１ａｂ遺伝子によってコードされる最長ネガティブセンスＯＲＦ（すなわち、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子によってコードされる最長ＯＲＦ）を各配列について決定した。ＬＮＳＯＲＦ１００の位置の各々についての正規化シャノンエントロピーを計算した。１の値は、関連する位置が２０個のアミノ酸のいずれかによって占められ得ることを意味する。０の値は、１つのアミノ酸のみが関連する位置を占めることを意味する。換言すれば、正規化シャノンエントロピーにおいて、より小さい数は、所与の位置のアミノ酸がより高度に保存されていることを示す。
アミノ酸出現頻度を以下の表３に示す。アミノ酸分率を以下の表４に示す。対応する正規化シャノンエントロピーおよび誘導されたコンセンサス配列（配列番号１３）を以下の表５に示す。図１４に示されるように、ＯＲＦは英国ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株間で十分に保存されている。
＜表３＞
＜表４＞
＜表５＞
実施例４－翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子によってコードされるＯＲＦのコンセンサス配列の決定
２３８，７５４個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２高品質ゲノム（すなわち、登録者によって検証された任意の変異、挿入または欠失を含む完全な高カバレッジ）をＧＩＳＡＩＤからダウンロードした。クレード、サンプリング日および地理的位置に関係なく、ゲノムをダウンロードした。ｏｒｆ１ａｂ遺伝子によってコードされる最長ネガティブセンスＯＲＦ（すなわち、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｏｒｆ１ａｂ遺伝子によってコードされる最長ＯＲＦ）を各配列について決定した。これらの配列の全てのうち、２３５，３５４個は１００残基のネガティブセンスＯＲＦを有していた。これらのＯＲＦ配列を分析して、コンセンサス配列および配列中の各位置についてのシャノンエントロピーを決定した。
アミノ酸出現頻度および誘導されたコンセンサス配列（配列番号１３）を以下の表６に示す。図１５および図１６に示されるように、ＯＲＦはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株間で十分に保存されている。
＜表６＞
誘導されたコンセンサス配列（ＭＳＰＴＴＳＶＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦＣＭＶＧＦＳＴＴＳＳＥＴＧＦＲＳＳＱＡＲＬＳＩＰＣＡＳＳＤＦＳＴＳＮＥＦＤＶＳＴＧＦＶＬＱＲＱＲＩＨＱＶＦＧＬＹＶＡＬＬＶＡＬＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮＮＬＡＰＦＬＫＥＧＶ；配列番号１３）は、実施例３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２英国株に由来するコンセンサス配列と同一である。
配列番号１３と同一の１００アミノ酸ＯＲＦ（配列番号１４）はまた、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスで重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２分離株ＷＩＶ０４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９９６５２８．１）のゲノムによってもコードされる。配列番号１３と同一の１００アミノ酸ＯＲＦ（配列番号１５）はまた、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスで「武漢海鮮市場肺炎ウイルス」（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ０４５５１２．２）のゲノムによってもコードされる。さらに、配列番号１３との９６％の配列同一性を有する１００アミノ酸ＯＲＦ（配列番号１６）は、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコウモリコロナウイルス分離株ＲａＴＧ１３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９９６５３２．１）のゲノムによってコードされる。配列番号１３との９１％の配列同一性を有する１００アミノ酸ＯＲＦ（配列番号１７）は、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコウモリＳＡＲＳ様コロナウイルス分離株ｂａｔ－ＳＬ－ＣｏＶＺＸＣ２１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＧ７７２９３４．１）のゲノムによってコードされる。配列番号１３との２９％の配列同一性を有する１００アミノ酸ＯＲＦ（配列番号１８）は、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコウモリＳＡＲＳ様コロナウイルス分離株ｂａｔ－ＳＬ－ＣｏＶＺＣ４５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＧ７７２９３３．１）のゲノムによってコードされる。図１７は、コンセンサス配列（配列番号１３）とこれらの初期ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列およびコウモリトコロナウイルスＯＲＦ１００配列のアラインメントを示す。
「外れ値」配列
外れ値配列の数が非常に多いため（２３８，７５４個中３，４００個、ダウンロードした全配列の１．４％が、１００残基長の最長ネガティブセンスＯＲＦを生成しなかった）、各配列を手動で分析することは実現不可能であろう。重複する最長ネガティブセンスＯＲＦ配列を除外し、同じ長さの類似の配列も除外した。これらの２４４個の配列から２４個を無作為に選び、Ｅｘｏｎｅｒａｔｅを使用してＯＲＦ１００コンセンサス配列をゲノムデータとアラインメントした。ゲノムデータを大まかに見ると、調べた配列のいくつかにおいて割り当てられていない塩基のいくつかの伸長が示されたので、ＬＮＳＯＲＦスクリプトを、ミスリードおよび曖昧な塩基に対処するために調整する必要があり得る。
＜表７＞
分析された外れ値配列の全てがＯＲＦ１００配列を含み、誤認の原因は分析された配列中の配列決定ギャップの存在および曖昧な塩基の存在に起因する。
実施例５－ネガティブセンスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドのパネルによる初代ヒト末梢血単核細胞の刺激およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ネガティブセンスペプチドＭＨＣデキストラマーによる染色
概要
７つのネガティブセンスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドのパネルを使用して、内部血液ドナー（ＥＶＢ０００２８、ＥＶＢ０００３１、ＥＶＢ０００３３）からのヒトＰＢＭＣを刺激した。その後、細胞をＩＦＮ－γおよび様々なＴ細胞マーカーの産生について分析した。
方法
Ａ）ＰＢＭＣ調製
静脈穿刺前に血液ドナーからインフォームドコンセントを得た。ドナーに内部番号を割り当てた。６０ｍＬの血液を、同意したボランティアからＥＤＴＡチューブに採取した。全血を以下のように緩衝液（ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン）に希釈した：血液３０ｍＬ＋緩衝液２０ｍＬ。
２５ｍＬの希釈血液を、５０ｍＬファルコンチューブ中１８ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ溶液上に慎重に重層した。血液試料を室温で、３００×ｇ、減速度設定０で２０分間遠心分離した。
血漿を慎重に取り出し、清潔な５０ｍＬファルコンチューブに分注し、ドナーの番号で標識し、さらなる分析まで－８００℃で保存した。
バフィーコート（ＰＢＭＣ）層を慎重に取り出し、清潔な５０ｍＬファルコンチューブに分注した。細胞試料を緩衝液を用いて５０ｍＬまで満たし、１０分間、４０℃、３００×ｇで遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを５０ｍＬの緩衝液に再懸濁し、上記のように遠心分離した。これをもう一度繰り返した。次いで、細胞を計数し、ＡＢ培地（Ｌ－グルタミン、５０ｍＬの熱不活性化ＡＢ血清、５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、５ｍＬ（２００ ｇ／Ｌ）グルコースを補充した５００ｍＬのＲＰＭＩ １６４０）中２．５×１０＾６／ｍＬで再懸濁した。
Ｂ）ペプチド刺激
次いで、細胞を２４ウェルプレートのウェルに１ｍＬ体積で等分した。
５０ ＩＵのＩＬ－２を含むＡＢ培地を調製した。以下のペプチドの各々を、５０ ＩＵのＩＬ－２を含むＡＢ培地に２０μＭ濃度に希釈した：
ＬＳＩＰＣＡＳＳＤＦＳＴ（配列番号４）
ＬＹＶＡＬＬＶＡＬＬＴＣＱ（配列番号６）
ＲＬＳＩＰＣＡＳＳＤＦ（配列番号８）
ＴＣＱＴＩＧＬＣＮＮＬＡＰＦＬ（配列番号９）
ＴＬＨＳＲＴＳＦＣＭＶ（配列番号１０）
ＶＡＬＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮ（配列番号１１）
ＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ（配列番号１２）
希釈したペプチドをＰＢＭＣに添加し、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに入れた。２日目、４日目および６日目に、細胞に半枯渇によって供給した。手短に言えば、１ｍＬの培地を各ウェルから取り出し、５０ ＩＵ ＩＬ－２を含む１ｍＬの新鮮なＡＢ培地を補充した。
Ｃ）ＥＬＩＳＰＯＴ調製
無血清ＥＬＩＳＰＯＴ培地を調製した（５００ｍＬ ＲＰＭＩ １６４０＋１％ ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン）。ヒトＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍａｂｔｅｃｈ）をＰＢＳで４回洗浄し、室温で少なくとも３０分間、ＡＢ培地でブロッキングした。ＰＢＭＣを収穫し、１０分間、３００×ｇ、４０℃で遠心分離し、無血清培地に再懸濁し、計数した。細胞を５×１０＾６細胞／ｍＬで再懸濁した。ＰＢＭＣを５０μＬ／ウェルでＥＬＩＳＰＯＴウェルのウェルに添加した。
ペプチドを、４００μＭの濃度でＰＢＭＣを再刺激するために調製し、５０μＬの体積でＥＬＩＳＰＯＴウェルに添加し、ウェル中の最終濃度を２００μＭとした。
プレートを、蓋をして３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートし、箔に包んだ。
２４時間後、Ｍａｂｔｅｃｈプロトコルに従ってＥＬＩＳＰＯＴプレートを発色させた。
乾燥後、プレートをＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔアナライザーを使用してスキャンし、スポットを計数し、品質管理し、データを棒グラフとしてプロットした。
Ｄ）Ｔ細胞マーカーのフローサイトメトリー分析
刺激後７日で、残りのＰＢＭＣを１ ｘ１０＾６細胞／ｍＬの濃度でフローサイトメトリー緩衝液（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、少なくとも１０分間ブロッキングした。次いで、細胞を９６ウェルプレートに等分し、遠心分離し（５分／４０℃／３００×ｇ）、４５μＬ緩衝液に再懸濁した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色液を１０００μＬ中１μＬで添加し（Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ ＩＲ）、細胞を暗所中、４０℃で１０分間インキュベートした。１２０μＬの緩衝液を添加し、試料を５分間遠心分離し、上清を捨て、２００μＬの緩衝液で洗浄を繰り返した。次いで、細胞を、Ｔ細胞マーカーに対する抗体を適切な濃度で含有する緩衝液（最終染色体積５０μＬ）に再懸濁し、暗所中４０℃で少なくとも３０分間インキュベートした。
＜表８＞
＜表９＞
１２０μＬの緩衝液を細胞試料に添加し、５分間遠心分離し、上清を捨てた。次いで、この洗浄ステップを繰り返した。コンペンセーションビーズを個々の抗体と共に同じ濃度でインキュベートした。抗体染色コンペンセーションビーズならびに未染色およびＮＩＲ染色細胞を使用して、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターの電圧を調整した。
ＣＤ３ゲーティング細胞で少なくとも１５００００のイベントを取得するように取得を設定した。
Ｅ）デキストラマー染色試料のフローサイトメトリー分析
ＰＢＭＣを、前の節に記載されるように調製した。細胞を計数し、１０～５０×１０＾６／ｍｌを調製した。細胞を、５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳに再懸濁し、Ｕ底９６ウェルプレートの１ウェル当たり１００μＬの細胞懸濁液を添加した。細胞を、Ｉｍｍｕｄｅｘ染色プロトコルに従う前に、前記のように、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ ＩＲで染色した。１０μＬのＭＨＣデキストラマーを試料に添加し、完全に混合し、暗所中、室温で１０分間インキュベートした。試料を、２００μＬの緩衝液を添加し、４０℃で５分間遠心分離することによって５回洗浄した。次いで、試料を、前記のようにＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ３細胞表面マーカーについて染色した。試料を２００μＬのフローサイトメトリー緩衝液に再懸濁することによって２回洗浄し、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターで分析した。
使用したＭＨＣデキストラマー：Ａ＊２４０２／ＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ－ＡＰＣ
Ｆ）ＨＬＡタイピング（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）
ＰＢＭＣ試料からの細胞ペレットを、ＨＬＡタイピングのためにＰｒｏＩｍｍｕｎｅ Ｌｔｄに凍結して送った。
Ｇ）結合親和性予測
個々のドナーのＨＬＡプロファイルに基づいて、ＭＨＣ分子に対する個々のペプチドの結合親和性を予測するために、アルゴリズムＰＳＳ ＭＨＣ Ｐａｎを使用してＫＤ値を得た。
結果
図１８は、ネガティブセンスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドによるＰＢＭＣ（ドナーＥＶＢ０００２８、ＥＶＢ０００３１およびＥＶＢ０００３３由来）の刺激からのＥＬＩＳＰＯＴデータを示す。ＰＢＭＣを、方法の節に記載されるように７日間、個々のペプチドと共にインキュベートした。次いで、細胞をＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで使用し、そこでこれらを同じペプチドで２４時間再刺激した。プレートを発色させ、ＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ａｎａｌｙｓｅｒを使用してスポットを計数し、３連値の平均－／＋標準偏差としてプロットした。（Ａ）および（Ｂ）は、陽性対照として使用した、（Ａ）抗ＣＤ３抗体ありおよび（Ｂ）抗ＣＤ３抗体なしのＥＶＢ０００２８からの結果を示す。（Ｃ）はＥＶＢ０００３１からの結果を示す。（Ｄ）および（Ｅ）は、陽性対照として使用した（Ｄ）抗ＣＤ３抗体ありおよび（Ｅ）抗ＣＤ３抗体なしのＥＶＢ０００３３からの結果を示す。
全３人の対象ドナーからの結果は、ペプチドＬＹＶＡＬＬＶＡＬＬＴＣＱに対する強い反応性を示した。ＥＶＢ０００２８およびＥＶＢ０００３１はペプチドＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦに対しても強く反応し、ＥＶＢ０００３３はＶＡＬＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮに対しても強く反応した。
図１９は、ＥＶＢ０００２８由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す。ＰＢＭＣを細胞表面マーカーに対する抗体のパネル（前の節に列挙される）で染色して、ナイーブＴ細胞（Ａ）、セントラルメモリーＴ細胞（Ｂ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｃ）および（Ｄ）、ならびに常在性メモリーＴ細胞（Ｅ）などの異なるＴ細胞集団を特徴づけた。さらに、活性化マーカーも分析した（Ｆ）～（Ｉ）。ＣＤ３＋Ｔ細胞集団でゲーティングされた陽性細胞のパーセンテージをプロットした。
ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで得られた結果と同様に、ペプチドＬＹＶＡＬＬＶＡＬＬＴＣＱおよびＶＡＬＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮは、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＯＸ４０／ＣＤ２５、ＰＤＬ１／ＣＤ２５の上方制御に示されるように、ＥＶＢ０００２８由来のＣＤ３＋細胞において活性化を誘導した。
図２０は、ＥＶＢ０００３３由来のＰＢＭＣの刺激後のＴ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析を示す。ＰＢＭＣを細胞表面マーカーに対する抗体のパネル（前の節に列挙される）で染色して、ナイーブＴ細胞（Ａ）、セントラルメモリーＴ細胞（Ｂ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｃ）および（Ｄ）、ならびに常在性メモリーＴ細胞（Ｅ）などの異なるＴ細胞集団を特徴づけた。さらに、活性化マーカーも分析した（Ｆ）～（Ｉ）。ＣＤ３＋Ｔ細胞集団でゲーティングされた陽性細胞のパーセンテージをプロットした。
ＥＶＢ０００３３由来のＣＤ３＋細胞は、ペプチドＬＹＶＡＬＬＶＡＬＬＴＣＱおよびＶＡＬＬＴＣＱＴＩＧＬＣＮによって同様に活性化されたが、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＯＸ４０／ＣＤ２５、ＰＤＬ１／ＣＤ２５の上方制御に示されるように、後者の方がはるかに程度は低かった。
図２１は、Ａ＊２４０２／ＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ－ＡＰＣ ＭＨＣデキストラマー染色分析を示す。ＥＶＢ０００２８、ＥＶＢ０００３１およびＥＶＢ０００３３由来の非刺激ＰＢＭＣを、前記のプロトコルに従って調製した。次いで、ＰＢＭＣをＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ－ＡＰＣまたは陰性対照デキストラマーのいずれかと共にインキュベートし、引き続いてＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８に対する抗体と共にインキュベートした。細胞をＣＤ３＋細胞のみまたはＣＤ３＋とＣＤ８＋細胞のいずれかでゲーティングし、ＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ－ＡＰＣについて陽性の細胞のパーセンテージを棒グラフとしてプロットした。全３人の対象由来のＰＢＭＣは、ＶＦＴＬＨＳＲＴＳＦ－ＡＰＣデキストラマーに結合することができるＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を示した。
しかしながら、完全なＨＬＡタイピング結果（表１０）は、ＨＬＡ－Ａ２４：０２を有するＥＶＢ０００３３のみを示したので、ＭＨＣ－デキストラマーへのＴ細胞受容体の何らかの非特異的結合が生じているかどうかという疑問が生じる。
＜表１０＞
＜表１１＞
実施例６－ＯＲＦ１００をコードするポリヌクレオチドの調製
ＯＲＦ１００コンセンサスアミノ酸配列（配列番号１３）をコードするポリヌクレオチド配列を、２１ｂｐの重複および１００ｂｐの配列長に適合させたＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６９、２１１（全体が参照により本明細書に組み込まれる）に概説される方法を使用して、重複オリゴヌクレオチドを使用して合成した。図２２は、ＯＲＦ１００をコードするポリヌクレオチドについての予想されるサイズのポリヌクレオチドに関連するバンドを示す。
以下のオリゴをこの方法で使用した：
ＣＶＮＳ１００＿ＦＯ１
順方向オリゴ１（配列番号１９）：
ａｔｇｔｃｔｃｃｔａｃａａｃｔｔｃｇｇｔａｇｔｔｔｔｃａｃａｔｔａｃａｃｔｃａａｇａａｃｇｔｃｔｔｔｃｔｇｔａｔｇｇｔａｇｇａｔｔｔｔｃｃａｃｔａｃｔｔｃｔｔｃａｇａｇａｃｔｇｇｔｔｔ
ＣＶＮＳ１００＿ＲＯ１
逆方向１（配列番号２０）：
ａｔｃａａａｔｔｃｇｔｔｔｇａｔｇｔａｃｔｇａａｇｔｃａｇａｇｇａｃｇｃｇｃａｇｇｇａａｔｇｇａｔａａｔｃｔｔｇｃｃｔｇｃｇａａｇａｔｃｔａａａａｃｃａｇｔｃｔｃｔｇａａｇａａｇｔａ
ＣＶＮＳ１００＿ＲＯ２
逆方向２（配列番号２１）：
ｃｔａａｔａａａｇｃｃａｃｇｔａｔａａａｃｃａａａｔａｃｃｔｇｇｔｇｔａｔａｃｇｔｔｇｔｃｔｔｔｇｇａｇｃａｃａａａａｃｃａｇｔｔｇａａａｃａｔｃａａａｔｔｃｇｔｔｔｇａｔｇｔａｃｔ
ＣＶＮＳ１００＿ＲＯ３
逆方向３（配列番号２２）：
ｃｔａｃａｃａｃｃｃｔｃｔｔｔｔａａｇａａａｇｇａｇｃｔａａａｔｔｇｔｔａｃａｔａａａｃｃｔａｔｔｇｔｔｔｇｇｃａｔｇｔｔａａｃａａｔｇｃａａｃｔａａｔａａａｇｃｃａｃｇｔａｔａａａｃ
以下の増幅プライマーをこの方法で使用した：
ＣＶＮＳ１００＿Ｆｗｄ
順方向（配列番号２３）：ＡＴＧＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＣＴＴＣＧ Ｔｍ＝５６℃
ＣＶＮＳ１００＿Ｒｅｖ
逆方向（配列番号２４）：ＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＡ Ｔｍ＝５７℃
合成されたポリヌクレオチドは、配列番号１（ａｔｇｔｃｔｃｃｔａｃａａｃｔｔｃｇｇｔａｇｔｔｔｔｃａｃａｔｔａｃａｃｔｃａａｇａａｃｇｔｃｔｔｔｃｔｇｔａｔｇｇｔａｇｇａｔｔｔｔｃｃａｃｔａｃｔｔｃｔｔｃａｇａｇａｃｔｇｇｔｔｔｔａｇａｔｃｔｔｃｇｃａｇｇｃａａｇａｔｔａｔｃｃａｔｔｃｃｃｔｇｃｇｃｇｔｃｃｔｃｔｇａｃｔｔｃａｇｔａｃａｔｃａａａｃｇａａｔｔｔｇａｔｇｔｔｔｃａａｃｔｇｇｔｔｔｔｇｔｇｃｔｃｃａａａｇａｃａａｃｇｔａｔａｃａｃｃａｇｇｔａｔｔｔｇｇｔｔｔａｔａｃｇｔｇｇｃｔｔｔａｔｔａｇｔｔｇｃａｔｔｇｔｔａａｃａｔｇｃｃａａａｃａａｔａｇｇｔｔｔａｔｇｔａａｃａａｔｔｔａｇｃｔｃｃｔｔｔｃｔｔａａａａｇａｇｇｇｔｇｔｇｔａｇ）の配列を有する。
Ｔ７プロモーターを、第２のＰＣＲによって付着させ、引き続いて、合成されたポリヌクレオチドを精製し、次いで、これをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｉｓｈｅｒｓｃｉ．ｃｏ．ｕｋ／ｓｈｏｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔ／１０２１９１０４）のための鋳型として使用する。ＧＦＰが並行反応において陽性対照として使用されるであろう。第２のＰＣＲのためのプライマーは以下である：
ＣＶＮＳ１００＿Ｆｗｄ＿Ｔ７
順方向（配列番号２５）：ｇａａａｔＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧｃｃｇｃｃａｃｃＡＴＧＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＣＴＴＣＧ
キー：ＬＮＳＯＲＦ１００についてのＴ７プロモーターコザックプライマー
ＣＶＮＳ１００＿Ｒｅｖ＿ＡＡＡ
逆方向（配列番号２６）：ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＡ
キー：ポリ（Ａ）プライマー
ＯＲＦ１１コンセンサスアミノ酸配列（配列番号１３）をコードするポリヌクレオチド配列を使用して、細胞をＯＲＦ１００ ｍＲＮＡでトランスフェクトすることができる。このようなトランスフェクションは、有益な研究ツールを提供し得る。例えば、トランスフェクト細胞の表面上のＭＨＣ上に提示されたペプチドを精製することができ、その結果、これらのペプチドがＯＲＦ１００由来であるかどうか、およびそれらがＳＡＲ－ＣｏＶ－２リガンドーム（ｌｉｇａｎｄｏｍｅ）に見られるＯＲＦ１００配列と一致するかどうかを決定することができる。この場合、ＧＦＰは、細胞を蛍光させ、ＧＦＰ由来ペプチドをそれらのＭＨＣクラスＩ分子上に表示する追加の読み出しを提供するはずであるので、陽性対照として使用され得る。
実施例７－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来のＴ細胞エピトープ（ペプチド）の確認
目的
合成ペプチド質量分析を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞における４つのネガティブセンスペプチドの特定を確認すること。
方法
４つのペプチド（表１２）を合成し、比較目的のためにマススペクトルデータを生成した。標的ペプチドを合成し、質量分析を実行して、実験によって生成されたスペクトル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞分析から単離されたペプチド）を合成ペプチドと比較して、ペプチドの配列を確認した。
質量分析
試料を、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＬＳＣｎａｎｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＥｃｌｉｐｓｅ ｔｒｉｐｌｏｉｄ質量分析計を使用して分析した。試料を、溶融シリカトラップカラムＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ １００、７５μｍ×２ｃｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に充填した。０．１％ ＴＦＡで洗浄した後、トラップカラムをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ用の分析カラム（Ｎａｎｏｅａｓｅ ＭＺペプチドＢＥＨ Ｃ１８、１３０Ａ、１．７μｍ、７５μｍ×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）とインラインにした。４～９０％Ｂ（Ａ：０．２％ギ酸、Ｂ：０．０８％ギ酸、８０％ ＡＣＮ）：５分で４～１５％Ｂ、５０分で１５～５０％Ｂおよび１５分で５０～９０％Ｂのセグメント化された線形勾配を使用してペプチドを溶出した。分解能：２４００００、正規化（ＡＧＣ）標的：正常（１Ｅ６）の２５０％、最大注入時間：５０ｍｓで、３７５～１５００の周期的な一連のフルスキャンを用いたデータ依存型取得手順を使用して、質量分析データ（ＣＩＤまたはＨＣＤモード）を取得した。トップＳ（１秒）および３０秒の動的排除を使用して、５Ｅ３の強度閾値を用いてＭＳＭＳについて電荷ステージ２～７の親イオンを選択した。選択されたイオンは、アイソレーションウインドウ：１．２ｍ／ｚ、正規化ＡＧＣ標的２００％でイオントラップに伝送され、相対衝突エネルギー３５％で断片化され、高速走査速度でイオントラップ内で走査された。
合成ペプチドによるペプチド検証
前の試験で特定されたペプチドを検証するための合成ペプチドをＣｈｉｎａ ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（Ｓｕｚｈｏｕ、中国）から入手した。次いで、合成ペプチドを上記と同一の実験条件下でＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供し、それらのＭＳ／ＭＳデータに基づいてそれらの配列を確認した。候補ペプチド配列を、それらのＭＳ／ＭＳスペクトルとそれらの合成類似体のＭＳ／ＭＳスペクトルの比較によって確認した。
結果
この実施例に提示されるデータは、合成ペプチドを使用した確認試験によって生成された。その理由は、一部のペプチド（天然または合成）は、質量分析では不十分な断片化特性を有し、低品質のスペクトルを生成する可能性があり、これにより、ペプチドが検索ソフトウェアにより中程度から低いヒットであると分類されるからである。しかしながら、合成ペプチドを使用して確認試験を実行し、実験スペクトルと合成ペプチドスペクトルが一致する場合、ソフトウェアが中～低信頼度スペクトルとして特定したとしても、ペプチド配列を確認することができる。
結果を表１２および１３ならびに図２３～図２６に示す。
＜表１２＞
＜表１３＞
実施例８
序論
ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨｃｏＶ－２２９Ｅ）は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む７種のヒトコロナウイルスのうちの１つに属する。これはヒトおよびコウモリに感染し得る。本プロジェクトは、感染後に、ＨｃｏＶ－２２９Ｅ感染後細胞ペレットおよび全細胞溶解物中のＭＨＣクラスＩペプチドを特定するように設計された。ＨｅｐＧ２細胞に感染させ、収穫し、溶解し、ＭＨＣクラスＩペプチドを抽出して、質量分析のためのペプチド試料混合物を生成した。さらに、対照試料（モック感染）を回収し、同じ手順または感染試料に従って処理した。Ｅｃｌｉｐｓｅ ｔｒｉｐｌｏｉｄ質量分析計と連結された超高圧液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システムをペプチドの分離および特定に使用した。１つの衝突モード（ＣＩＤ）を感染試料の質量分析に適用した。リアルタイム試料取得のためにデータ依存型取得（ＤＤＡ）法を実施した。生成されたデータセットを、データベース検索および比較のためにＳＥＱＵＥＳＴ ＨＴソフトウェアを使用して処理した。
方法
１．ＨｃｏＶ－２２９Ｅ感染ＨｅｐＧ２細胞の調製（ＧＭＵによって実施）
ＨｅｐＧ２細胞（２ｘ１０＾７個の全細胞）を増殖させ、ＨｃｏＶ－２２９Ｅ（ＭＯＩ＝０．１）に２４時間感染させた。
２．質量分析試料分析を使用したＨｃｏＶ－２２９Ｅ ＭＨＣクラスＩペプチドの発見
ａ）試料調製：ＨｃｏＶ－２２９Ｅ株に感染したＨｅｐＧ２細胞を収穫し、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞ペレットを０．１％ ＴＦＡで処理し、上清を回収した（ＧＭＵによって提供）。細胞ペレットを溶解緩衝液で処理し、免疫プロテオミクスプロトコルを使用して処理して（ＧＭＵによって提供）ＭＨＣクラスＩペプチドを単離および精製した。２つの試料（ステップ１および２からの試料）をプールし、洗浄し、オフラインＨＰＬＣシステムで分画した。各画分をＵＰＬＣ－Ｎａｎｏ－ＭＳ／ＭＳシステムで分析した。
ｂ）ＤＤＡモード：試料を、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＬＳＣｎａｎｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＥｃｌｉｐｓｅ ｔｒｉｐｌｏｉｄ質量分析計を使用して分析した。試料を、溶融シリカトラップカラムＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ １００、７５μｍ×２ｃｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に充填した。０．１％ ＴＦＡで洗浄した後、トラップカラムをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ用の分析カラム（Ｎａｎｏｅａｓｅ ＭＺペプチドＢＥＨ Ｃ１８、１３０Ａ、１．７μｍ、７５μｍ×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）とインラインにした。３０分で４～１５％Ｂ（ここでは、Ａ：０．２％ギ酸、およびＢ：０．１６％ギ酸、８０％アセトニトリル）、４０分で１５～２５％Ｂ、４４分で２５～５０％Ｂ、および１１分で５０～９０％Ｂの勾配からセグメント化された線形勾配を使用してペプチドを溶出した。次いで、溶液Ｂは、次の実行のために５分間４％で戻る。分解能：２４００００、正規化（ＡＧＣ）標的：正常（１Ｅ６）の２５０％、最大注入時間：５０ｍｓで、３７５～１５００の周期的な一連のフルスキャンを用いたデータ依存型取得手順を使用して、質量分析データ（ＣＩＤモード）を取得した。トップＳ（１秒）および３０秒の動的排除を使用して、５Ｅ３の強度閾値を用いてＭＳＭＳについて電荷ステージ２～７の親イオンを選択した。選択されたイオンは、アイソレーションウインドウ：１．２ｍ／ｚ、正規化ＡＧＣ標的２００％でイオントラップに伝送され、相対衝突エネルギー３５％で断片化され、高速走査速度でイオントラップ内で走査された。分解能：１２００００、対照（ＡＧＣ）標的：１Ｅ６、最大注入時間：１００ｍｓで、３５０～１５００の周期的な一連のフルスキャンを用いたデータ依存型取得手順を使用して、質量分析データを取得した。
３．データベース検索
全ての生スペクトルファイルのデータベース検索を、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。ＳＥＱＵＥＳＴを、ＨｃｏＶ ２２９Ｅタンパク質配列データベース１）ポジティブセンス翻訳２）ネガティブセンス翻訳および３）ＩＰＩヒトデータベースに対するデータベース検索に使用した。対応する逆データベースに対するデータベース検索も実施して、ペプチド／タンパク質特定の偽発見率（ＦＤＲ）を評価した。データベース検索パラメータには、酵素消化がない場合の最大２回の切断ミス、前駆体質量許容差１０ ｐｐｍ、プロダクトイオン質量許容差０．４Ｄａ、および可変修飾としてのメチオニン酸化が含まれた。各実行からの結果を、高としてのペプチド信頼度値でフィルタリングして、ペプチドレベルで１％未満のＦＤＲを得た。タンパク質レベルでは、検索パラメータは、各タンパク質について最小数のペプチド１、ランク１のペプチドのみの計数、およびスコアが最も高いタンパク質のみのペプチドの計数を含み、全てのデータフィルタリングに適用した。さらに、タンパク質グループ化が可能になり、厳密な最大最節約原理を適用した。その後、手動評価を各質量スペクトルに適用した。
結果
＜表１４＞
注：ａ．事前スクリーニング基準（信頼度高、アミノ酸長８～１５ａａ、ランク：１、チャージ２についてはＸＣｏｒｒ＞１．５、チャージ３についてはＸＣｏｒｒ＞２）によって生成された完全なリスト。
＜表１５＞
配列番号４６（ＬＩＡＧＫＬＬＰＰＶ）および５３（ＰＳＬＶＭＰＰＳＰＳＰＬＶ）は、風邪コロナウイルス２２９Ｅ由来の逆ペプチドである。すなわち、配列番号４６（ＬＩＡＧＫＬＬＰＰＶ）および５３（ＰＳＬＶＭＰＰＳＰＳＰＬＶ）は、翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスで２２９Ｅ風邪コロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされるポリペプチド由来のエピトープである。
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩエピトープ結合予測プログラムを実行することにより、配列番号４６（ＬＡＩＧＫＬＬＰＰＶ）が以下のＨＬＡ結合：Ａ２：２９を有すると予測された。
＜配列表＞
SEQ ID NO: 1
angncnccnacaacnncggnagnnnncacannacacncaagaacgncnnncngnanggnaggannnnccacnacnncnncagagacnggnnnnagancnncgcaggcaagannanccanncccngcgcgnccncngacnncagnacancaaacgaannngangnnncaacnggnnnngngcnccaaagacaacgnanacaccaggnannnggnnnanacgnggcnnnannagnngcanngnnaacangccaaacaanaggnnnangnaacaannnagcnccnnncnnaaaagagggngngnag

SEQ ID NO: 2
ALLTCQTIGLCN

SEQ ID NO: 3
LHSRTSFCMVGFS

SEQ ID NO: 4
LSIPCASSDFST

SEQ ID NO: 5
LTCQTIGLCNNLAPF

SEQ ID NO: 6
LYVALLVALLTCQ

SEQ ID NO: 7
QTIGLCNNLAP

SEQ ID NO: 8
RLSIPCASSDF

SEQ ID NO: 9
TCQTIGLCNNLAPFL

SEQ ID NO: 10
TLHSRTSFCMV

SEQ ID NO: 11
VALLTCQTIGLCN

SEQ ID NO: 12
VFTLHSRTSF

SEQ ID NO: 13
MSPTTSVVFTLHSRTSFCMVGFSTTSSETGFRSSQARLSIPCASSDFSTSNEFDVSTGFVLQRQRIHQVFGLYVALLVALLTCQTIGLCNNLAPFLKEGV

SEQ ID NO: 14
MSPTTSVVFTLHSRTSFCMVGFSTTSSETGFRSSQARLSIPCASSDFSTSNEFDVSTGFVLQRQRIHQVFGLYVALLVALLTCQTIGLCNNLAPFLKEGV

SEQ ID NO: 15
MSPTTSVVFTLHSRTSFCMVGFSTTSSETGFRSSQARLSIPCASSDFSTSNEFDVSTGFVLQRQRIHQVFGLYVALLVALLTCQTIGLCNNLAPFLKEGV

SEQ ID NO: 16
MSPTTSVVFTLHSRMSFCMVGFSTTSSETGFRSSQARLSIPCVSSDFSTSKEFDVSTGFVFQRQRIHQVFGLYVALLVALLTCQTIGLCNNLAPFLKEGV

SEQ ID NO: 17
MSPTTSVVFTLHSRMSFCMVGFSTTSSETGFRTSQARLSIPCVSPNFSASKEFDVSTGFVLQRQRMHQIFGLYVALLVALLTCQTIGLCNNLAPFLKEGV

SEQ ID NO: 18
MSPTTSVVFTLHSRMSFCMVGFSTTSSETGFRTSQARLSIPCVSPNSSASKEFDVSTGFVLQRQRMHQIFGLYVALLVALLTCQTIGLCSNLAPFLKEGV

SEQ ID NO: 19
atgtctcctacaacttcggtagttttcacattacactcaagaacgtctttctgtatggtaggattttccactacttcttcagagactggttt

SEQ ID NO: 20
atcaaattcgtttgatgtactgaagtcagaggacgcgcagggaatggataatcttgcctgcgaagatctaaaaccagtctctgaagaagta

SEQ ID NO: 21
ctaataaagccacgtataaaccaaatacctggtgtatacgttgtctttggagcacaaaaccagttgaaacatcaaattcgtttgatgtact

SEQ ID NO: 22
ctacacaccctcttttaagaaaggagctaaattgttacataaacctattgtttggcatgttaacaatgcaactaataaagccacgtataaac

SEQ ID NO: 23
ATGTCTCCTACAACTTCG

SEQ ID NO: 24
CTACACACCCTCTTTTAAGA

SEQ ID NO: 25
gaaatTAATACGACTCACTATAGGGccgccaccATGTCTCCTACAACTTCG

SEQ ID NO: 26
tttttttttttttttttttttttttttttttttCTACACACCCTCTTTTAAGA

SEQ ID NO: 27
AMLKCVAFCDE

SEQ ID NO: 28
ANGCSTIAQAV

SEQ ID NO: 29
AQGVFGVNM

SEQ ID NO: 30
ARLEPCNGTDID

SEQ ID NO: 31
AVTTGDVKIM

SEQ ID NO: 32
DIVVVDEVSMCTNYD

SEQ ID NO: 33
DSLCAKAVTAY

SEQ ID NO: 34
EDFLNMDIGVFIQ

SEQ ID NO: 35
EVNADIVVVDEVSMC

SEQ ID NO: 36
FVGADGELPV

SEQ ID NO: 37
FVKSICNSAVAV

SEQ ID NO: 38
FYCTNNTLVSGDAHI

SEQ ID NO: 39
GAKVVNANVLTK

SEQ ID NO: 40
GYIADISAF

SEQ ID NO: 41
IACSKSARLKRFPVN

SEQ ID NO: 42
IADFLAGSSDV

SEQ ID NO: 43
IFAQTSDTA

SEQ ID NO: 44
IVQMIADFLA

SEQ ID NO: 45
KFLNAFDVFVTAIQ

SEQ ID NO: 46
LIAGKLLPPV

SEQ ID NO: 47
LNCALGAFAIFCC

SEQ ID NO: 48
MHGVTLKI

SEQ ID NO: 49
MKVKATKGEGDGGI

SEQ ID NO: 50
NAMLKCVAF

SEQ ID NO: 51
NEADYRCACYA

SEQ ID NO: 52
PNLNLGILQVT

SEQ ID NO: 53
PSLVMPPSPSPLV

SEQ ID NO: 54
QAAAAMYKEARAVN

SEQ ID NO: 55
QTSQALQTVATALNK

SEQ ID NO: 56
SEISANGCSTIAQA

SEQ ID NO: 57
SNFNTLFATTIPN

SEQ ID NO: 58
TIQGPPGSGKS

SEQ ID NO: 59
TNVPLQVGFSNG

SEQ ID NO: 60
VGGTIQIL

SEQ ID NO: 61
VLFSATAVKTGGK

SEQ ID NO: 62
VLNNGFGGKQI

SEQ ID NO: 63
VTSGLGTVDAD

Claims (26)

  1. 翻訳可能なポジティブセンスＲＮＡとは反対のセンスでコロナウイルスのゲノムの少なくとも一部によってコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされるポリペプチド由来のエピトープを含む免疫原性ペプチド。
  2. 前記ポリペプチドが、ヒトにおける前記コロナウイルスの適合度を高める、請求項１に記載の免疫原性ペプチド。
  3. 前記ＯＲＦがネガティブセンスである、請求項１または２に記載の免疫原性ペプチド。
  4. 前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、または風邪ウイルス、場合により２９９Ｅである、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  5. 前記ＯＲＦが、ｏｒｆ１ａｂ遺伝子の少なくとも一部によってコードされる、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  6. 前記ＯＲＦが約１００コドン長である、請求項５に記載の免疫原性ペプチド。
  7. 前記ＯＲＦが、配列番号１の配列もしくはそのバリアントを含むか、または配列番号１３の配列もしくはそのバリアントを含むポリペプチドをコードする、請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  8. 前記エピトープが、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープである、請求項１から７のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  9. 前記エピトープが２種以上のコロナウイルス間で保存されており、場合により、前記エピトープが、（ｉ）２種以上のヒトコロナウイルス間、（ｉｉ）２種以上の動物コロナウイルス間、または（ｉｉｉ）１種もしくは複数のヒトコロナウイルスと１種もしくは複数の動物コロナウイルスとの間で保存されている、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  10. 前記エピトープが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、（ｂ）２２９Ｅ、（ｃ）ＮＬ６３、（ｄ）ＯＣ４３、（ｅ）ＨＫＵ１および（ｆ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶの１つまたは複数との間で保存されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  11. 前記エピトープが、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、（ｂ）２２９Ｅ、（ｃ）ＮＬ６３、（ｄ）ＯＣ４３、（ｅ）ＨＫＵ１および（ｆ）ＭＥＲＳ－ＣｏＶの１つまたは複数において約１００コドン長の予測ＯＲＦによってコードされるポリペプチド中に存在する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  12. 配列番号２～１２に示されるペプチドの１つまたは複数を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  13. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  14. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチドまたは請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
  15. （ａ）場合により、請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチドである、２つ以上の免疫原性ペプチド；または
    （ｂ）場合により、請求項１３に記載のポリヌクレオチドである、２つ以上のポリヌクレオチド
    を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. （ａ）少なくとも２つの異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用する少なくとも１つの免疫原性ペプチド、もしくはそれぞれ異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用する少なくとも２つの免疫原性ペプチド；または
    （ｂ）少なくとも２つの異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用する免疫原性ペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、もしくは各免疫原性ペプチドが異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用する、異なる免疫原性ペプチドをそれぞれコードする少なくとも２つのヌクレオチド
    を含む、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
  17. コロナウイルス感染症を予防および／または処置する方法であって、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の医薬組成物を個体に投与するステップを含む、方法。
  18. 個体のコロナウイルス感染症を予防および／または処置する方法における使用のための、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  19. 個体のコロナウイルス感染症を予防および／または処置するための医薬品の製造における、請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド、請求項１３に記載のポリヌクレオチド、または請求項１４から１６のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
  20. 前記コロナウイルス感染症が人畜共通ウイルスによって引き起こされる、請求項１７に記載の方法、請求項１８に記載の使用のための医薬組成物、または請求項１９に記載の使用。
  21. 前記個体がヒトである、請求項１７もしくは２０に記載の方法、請求項１８もしくは２０に記載の使用のための医薬組成物、または請求項１９もしくは２０に記載の使用。
  22. 前記コロナウイルス感染症が、エンデミックウイルス感染症、季節性ウイルス感染症、またはパンデミックウイルス感染症である、請求項１７、２０および２１のいずれか一項に記載の方法；請求項１８、２０もしくは２１のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物；または請求項１９、２０もしくは２１のいずれか一項に記載の使用。
  23. ＭＨＣ分子に結合した請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチドを含む複合体。
  24. ２つ以上の請求項１から１２のいずれか一項に記載のペプチドと２個以上のＭＨＣ分子とを含み、場合により、各ペプチドが前記２個以上のＭＨＣ分子の異なる分子に結合している、請求項２３に記載の複合体。
  25. 前記２個以上のＭＨＣ分子の各々がデキストラン骨格に付着している、請求項２４に記載の複合体。
  26. フルオロフォアをさらに含み、場合により、前記フルオロフォアが前記デキストラン骨格に付着している、請求項２５に記載の複合体。
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