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JP2025509607A - 異種プライムブーストワクチン組成物及び使用の方法 - Google Patents

異種プライムブーストワクチン組成物及び使用の方法 Download PDF

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JP2025509607A
JP2025509607A JP2024554858A JP2024554858A JP2025509607A JP 2025509607 A JP2025509607 A JP 2025509607A JP 2024554858 A JP2024554858 A JP 2024554858A JP 2024554858 A JP2024554858 A JP 2024554858A JP 2025509607 A JP2025509607 A JP 2025509607A
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JP2024554858A
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フィリップ サマヨア，
コンスタンス マーティン，
マシュー マンガニエロ，
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ジェネレーション バイオ カンパニー
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Abstract

本出願は、対象において免疫応答を誘導する方法を記載し、プライムブーストワクチンを投与することを含み、プライミングワクチンは、第一のペプチドをコードするＤＮＡ（例、ｃｅＤＮＡ）を含み、ブースティングワクチンは（ｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）、又は（ｉｉ）第二のペプチドを含む。また、提供されるのは、ＤＮＡを含むプライミングワクチンであって、ＤＮＡが第一のペプチドをコードする、プライミングワクチンと、（ｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）、又は（ｉｉ）第二のペプチドを含むブースティングワクチンであって、ＲＮＡが第二のペプチドをコードする、ブースティングワクチンと、を含む、ワクチンレジメンである。

Description

関連出願
本出願は、２０２２年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／３１９，５０５号に対する優先権を主張するものであり、その内容全体が、参照により本明細書中に明示的に組み入れられる。
背景
抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の大きな集団を生成して、長期間続く免疫メモリーを誘発することは、様々な動物疾患及びヒト疾患に対するワクチン設計のための望ましい目標である。典型的には、一回を上回る免疫化が、ワクチンが効率的な防御を誘導するために要求され、しばしば、有効なワクチンは、プライムブーストの形態において一回を上回る免疫化を要求する。例えば、小児集団については、五回までの免疫化が必要とされ得るが、ジフテリア、破傷風、及び百日咳（ＤＴＰ）ワクチンについての場合と同様であり、それは、生後最初の六ヶ月の間に三回、生後二年目において四回目の用量が続き、及び四～六歳の間に最終ブーストが与えられる。依然として、ワクチンの一部は、完全免疫化系列、例えば、ブースターが１０年ごとに推奨される破傷風・ジフテリアワクチンを既に受けている成人においてでさえ追加ブーストを必要とする。そのようなさらなる投与は、同じワクチン（相同ブースト）を用いて、又は異なるワクチン（異種ブースト）を用いて実施されてもよい。同じ免疫化剤の再投与を利用する相同なプライムブースト免疫化が、ワクチンの初期開発以来、使用されてきた。古典的なワクチン接種アプローチは、相同なプライムブーストレジメンに頼っていたが、従来は、より困難な疾患に対処するのに十分に強い免疫応答を誘発することができなかった。例えば、この方法は、通常、抗原に対する液性応答をブーストする際に有効であるが、初回刺激された免疫系による相同ブースト剤の迅速なクリアランスに起因して、増加数のＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する際にずっと有効ではないと一般的に考えられており、さらに、細胞免疫のブーストに失敗する。この制限を克服するための一つの戦略は、異なる抗原送達システムを使用したワクチンの連続的投与であった。このアプローチは、異種プライム／ブーストと呼ばれる。
異種プライムブーストは、特定の状況において応答を増加させることが報告されている一方で、全ての組み合わせが、いずれの組み合わせが有効であるかを決定することの重要性を示す改善された免疫を実証するわけではない。抗原の選択、ベクターの種類、送達経路、用量、アジュバント、ブーストレジメン、ベクター注射の順序、及び異なるワクチン接種間の間隔を含む多くの因子が、プライムブースト免疫化アプローチの転帰に影響を及ぼし、結果を予測することを困難にしている。広範な、耐久性のある、及び長期間続く免疫を誘発するワクチンの組み合わせを見出すことは、頑強な防御を付与するために重要である。
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、おそらく、ヒトにおける遺伝子導入のための最良の試験ベクターであり、数百の臨床治験が形質導入の安全性を実証している。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属し、より具体的には、ディペンドパルボウイルス属を構成する。ＡＡＶから由来するベクター（即ち、ｒＡＶＶ又はＡＡＶベクター）は、（ｉ）それらが、筋細胞及びニューロンを含む多種多様な非分裂及び分裂細胞型に感染（形質導入）することができる；（ｉｉ）それらがウイルス構造遺伝子を欠いており、それにより、ウイルス感染に対する宿主細胞応答、例えば、インターフェロン媒介性応答を減少させる；（ｉｉｉ）野生型ウイルスが、ヒトにおいて非病理学的であると考えられる；（ｉｖ）野生型ＡＡＶとは対照的に、宿主細胞ゲノム中に組込むことが可能であり、複製欠損ＡＡＶベクターは、複製（ｒｅｐ）遺伝子を欠き、一般的にエピソームとして持続し、このように、挿入変異誘発又は遺伝毒性のリスクを限定する；ならびに（ｖ）他のベクター系との比較において、ＡＡＶベクターは一般的に、比較的不良な免疫原であると考えられ、従って、有意な免疫応答を誘発せず（（ｉｉ）を参照のこと）、このように、ベクターＤＮＡの持続性及び、潜在的に、治療用導入遺伝子の長期発現が得られるため、遺伝物質を送達するために魅力的である。
しかし、遺伝子送達ベクターとしてＡＡＶ粒子を使用することにおいていくつかの主要な欠陥がある。ｒＡＡＶに関連付けられる一つの主要な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡのその限定されたウイルスパッケージング能力であり（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０，０００Ｄａ未満のタンパク質コード能力に限定されてきた。抗体送達に特に関連し、ＡＡＶのパッケージングの限定は、天然抗体構造を形成する重鎖及び軽鎖の両方の効率的な送達のための有意な課題を表す。第二の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の蔓延の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子治療のための候補を、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングしなければならないことである。第三の欠点は、最初の治療から除外されなかった患者への再投与を防止するカプシド免疫原性に関連する。患者における免疫系は、将来の治療を妨げる高力価の抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激するための「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに応答することができる。既存の免疫は、形質導入の効率を重度に制限し得る。一部の最近の報告によって、高用量の状況における免疫原性での懸念が示されている。別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の発生が、一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡを異種遺伝子発現の前に二本鎖ＤＮＡに変換しなければならないことを考えると、比較的遅いことである。
ベクターが未知の抗原性タンパク質を発現するアデノウイルスベクターが、遺伝子及び癌治療ならびにワクチンについて十分に試験されてきた。その広範な安全性プロファイルとは別に、アデノウイルスベクターを利用することの利点は、それが比較的安定であり、高い力価に達することが簡単で、複数の細胞株に感染することができることであり、それは、その効力に帰する。組換えアデノウイルスベクターは、その高い形質導入効率及び導入遺伝子発現のおかげで、今日広く使用されているが、集団の大半がアデノウイルス（Ｉｄ）に曝露されているため、ベクターに対する既存の免疫についての可能性がある。これは、ベクターベースのワクチンがＨＩＶ－１複製についての好ましい条件を提供したヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）第ＩＩｂ相ワクチン治験において有害であることが証明されている（Ｓｍａｉｌｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１３）５：２０５）。
抗ベクター免疫を誘導することなく、頑強な免疫原性を提供する異種プライムブーストレジメンについての当技術分野におけるニーズが残っている。
Ｓｍａｉｌｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１３）５：２０５
概要
本開示は、ＤＮＡによりコードされる第一のペプチドを含むプライミングワクチン及び第二のペプチドを含むブースターワクチンを含む、プライムブースト組成物及び方法を提供する。一部の実施形態では、第二のペプチドは、ｍＲＮＡによりコードされる。一部の実施形態によると、ＤＮＡは、例えば、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形状ＤＮＡ、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの形態であってもよい。一部の実施形態によると、プライミングワクチンはプラスミドＤＮＡを含む。一部の実施形態によると、プライミングワクチンは、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を含む。
本明細書中の実施例において実証されるように、ｃｅＤＮＡワクチンプラットフォームは、コードされるモデル抗原に対する液性応答及び細胞性応答の両方を誘発及び増強するための異種プライム／ブーストレジメンにおいてプライミングワクチンとして成功裏に用いられ得る。本明細書中に提示される結果は、異種プライムブーストレジメンが、同じワクチン単独での免疫化よりも、抗原に対する相乗的により強い応答及びより大きな防御を付与することができることを示唆する。ＤＮＡプライミングプラットフォーム、例えば、ｃｅＤＮＡベクタープラットフォームを用いてプライミングし、ｍＲＮＡベース又はペプチドベースのプラットフォームを用いてブーストすることにより（異種プライムブーストレジメン）、免疫応答を改善することができることが、本開示の知見である。本明細書中に記載される二つの免疫学的に異なるプラットフォームを使用する異種プライムブーストは、有利には、ＤＮＡ（例、ｃｅＤＮＡ）をプライミングワクチンとして使用して操作され、後続の投与（ブースト）は、初回投与（プライム）と相乗作用を与える異なる方法において免疫系を活性化するようにする。さらに、本明細書中に記載されるプライムブースト組成物及び方法は、増加したＣＤ８＋メモリーＴ細胞応答を生成する。
本明細書中に記載されるプライムブースト組成物及び方法の適用、それにおいて、プライミングワクチンがＤＮＡ（例、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形状ＤＮＡ、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター）を含み、それにおいて、ＤＮＡが第一のペプチドをコードし、及び第二のペプチドをコードするＲＮＡ、又は第二のペプチドを含むブースティングワクチンは、対象において疾患又は障害を治療する、防止する、又はその重症度を低下させる、送達において最小限に侵襲性である、反復可能で効果に応じた用量である、治療効果の迅速な発生を有する、ならびに／あるいは抗原、又は免疫原性ペプチドの持続的な発現をもたらすために有用である。
エクスビボで製造され、望ましくない細胞応答を誘発し得る従来のワクチンとは異なり、プライムワクチンとして本明細書中で使用されるｃｅＤＮＡワクチンは、より天然の様式において細胞系に提示される。抗原をコードする導入遺伝子（例、核酸配列）を細胞又は組織に送達するためにｃｅＤＮＡベクターを用いることにより、適応免疫応答がバイパスされ、所望の抗体特異性が、免疫化又は受動的移入の使用を伴うことなく産生される。すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、エンドサイトーシスを介して細胞に入り、次にエンドソーム区画から回避して、核に輸送される。転写的に活性なｃｅＤＮＡエピソームは、抗原の発現をもたらし、それは次に細胞から循環中に分泌され得る。ｃｅＤＮＡベクターによって、従って、単一注射により投与される抗体（例、本明細書中に記載される治療用抗体、又はその中の抗原結合断片）の連続的、持続的、及び長期送達が可能になり得る。これは、記載される核酸ワクチン組成物の文脈において特に有利であり、ＤＮＡプライムワクチンは、ｍＲＮＡワクチンと比較して、発現におけるより遅い増加及びより持続的な発現を示し、それは、より多くの増加した初期発現を示し得るが、発現は持続せず、より迅速に減少した。
一部の態様によると、本開示は、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導する方法を提供し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むプライミングワクチンを対象に投与することを含み、ＤＮＡが、第一のペプチドをコードし；ならびに（ｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）、それにおいて、ＲＮＡが第二のペプチドをコードする、又は（ｉｉ）対象に対する第二のペプチドを含むブースティングワクチンを投与し、それにより、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導することを含む。一部の実施形態によると、プライミングワクチンは、第一のペプチドをコードするＤＮＡを含み、ブースティングワクチンは、第二のペプチドをコードするＲＮＡを含む。一部の実施形態によると、プライミングワクチンは、第一のペプチドをコードするＤＮＡを含み、ブースティングワクチンは第二のペプチドを含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形状ＤＮＡ、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、第一及び第二のペプチドは、細菌、ウイルス、真菌、又は寄生虫の感染因子から由来する。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、第一及び第二のペプチドは、同じ病原性生物から由来する。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、第一及び第二のペプチドは、プライミングワクチン及びブースティングワクチンにおいて同じである。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、第一及び第二のペプチドのエピトープの少なくとも一つは、プライミングワクチン及びブースティングワクチンにおいて異なる。一部の実施形態によると、ＤＮＡは、隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）の間に少なくとも一つの核酸配列を含むカプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含み、少なくとも一つの核酸配列はペプチドをコードする。一部の実施形態によると、第一及び／又は第二のペプチドは、腫瘍関連抗原である、あるいは自己免疫状態に関連付けられる。本明細書中の態様又は実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、第一又は第二のペプチドは、表１～８中に示されるものの一つ又は複数から選択される。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも一つの核酸配列に連結されたプロモーター配列をさらに含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも一つのポリＡ配列を含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは、５’ＵＴＲ及び／又はイントロン配列を含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは、３’ＵＴＲ配列を含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは、エンハンサー配列を含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ＩＴＲの少なくとも一つは、機能的末端分解部位及びＲｅｐ結合部位を含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ＩＴＲの少なくとも一つ又は両方が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスからである。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲは、互いに対して対称又は非対称である。一部の実施形態によると、隣接するＩＴＲは対称又は実質的に対称である。一部の実施形態によると、隣接するＩＴＲは非対称である。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの一つは野生型である、又は隣接するＩＴＲの両方が野生型ＩＴＲである。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲは、異なるウイルス血清型から由来する。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲは、表８中に示されるウイルス血清型の任意の対から選択される。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ＩＴＲの一つ又は両方が、表９中の配列の一つ又は複数から選択される配列を含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの少なくとも一つは、ＩＴＲの全体的な三次元構造に影響を及ぼす欠失、付加、又は置換により野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列から改変される。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２からなる群から選択されるＡＡＶ血清型から由来する。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの一つ又は両方が合成である。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの一つは野生型ＩＴＲではない、又は隣接するＩＴＲの両方が野生型ＩＴＲというわけではない。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、及びＤ’から選択されるＩＴＲ領域の少なくとも一つにおける欠失、挿入、及び／又は置換により改変される。一部の実施形態によると、欠失、挿入、及び／又は置換は、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、又はＣ’領域により形成されるステム－ループ構造の全て又は一部の欠失をもたらす。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、Ｂ及びＢ’領域により形成されるステム－ループ構造の全て又は一部の欠失をもたらす欠失、挿入、及び／又は置換により改変される。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、Ｃ及びＣ’領域により形成されるステム－ループ構造の全て又は一部の欠失をもたらす欠失、挿入、及び／又は置換により改変される。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、Ｂ及びＢ’領域により形成されるステム－ループ構造の一部ならびに／あるいはＣ及びＣ’領域により形成されるステム－ループ構造の一部の欠失をもたらす欠失、挿入、及び／又は置換により改変される。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの一つ又は両方は、野生型ＩＴＲにおいて、Ｂ及びＢ’領域により形成される第一のステム－ループ構造ならびにＣ及びＣ’領域により形成される第二のステム－ループ構造を含むであろう領域中に単一のステム－ループ構造を含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの一つ又は両方は、野生型ＩＴＲにおいて、Ｂ及びＢ’領域により形成される第一のステム－ループ構造ならびにＣ及びＣ’領域により形成される第二のステム－ループ構造を含むであろう領域中に単一のステム及び二つのループを含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの一つ又は両方は、野生型ＩＴＲにおいて、Ｂ及びＢ’領域により形成される第一のステム－ループ構造ならびにＣ及びＣ’領域により形成される第二のステム－ループ構造を含むであろう領域中に単一のステム及び単一のループを含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、隣接するＩＴＲの両方は、ＩＴＲが互いに対して反転した場合に全体的な三次元対称性をもたらす様式において改変される。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ＤＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で送達される。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で送達される。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。さらなる実施形態によると、ＲＮＡは、少なくとも一つのヌクレオチド類似体を含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、免疫応答は抗体応答である。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、免疫応答はＴ細胞応答である。他のさらなる実施形態によると、免疫応答はメモリー（ＣＤ８＋）Ｔ細胞応答である。本明細書中に記載される態様及び実施形態の一部の実施形態によると、方法が、ブースティングワクチンを、プライミングワクチンを投与した後の少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１４週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約１～２週間、少なくとも約２～３週間、少なくとも約３～４週間、少なくとも約４～５週間、少なくとも約５～６週間、少なくとも約６～７週間、少なくとも約７～８週間、少なくとも約８～９週間、少なくとも約９～１０週間、少なくとも約１０～１１週間、少なくとも約１１～１２週間、少なくとも約１２～１３週間、少なくとも１３～１４週間、少なくとも約１４～１５週間、又は少なくとも約１５～１６週間に投与することを含む。本明細書中の実施形態のいずれかの他のさらなる実施形態によると、方法は、プライミングワクチンを投与した後の少なくとも８週間にブースティングワクチンを投与することを含む。本明細書中の実施形態のいずれかの他の実施形態によると、方法は、プライミングワクチンを投与した後の約８週間にブースティングワクチンを投与することを含む。本明細書中に記載される態様及び実施形態の一部の実施形態によると、プライミングワクチンの投与とブースティングワクチンの投与の間での間隔が、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約２６日、少なくとも約２７日、少なくとも約２８日、少なくとも約２９日、少なくとも約３０日、少なくとも約３１日、少なくとも約３２日、少なくとも約３３日、少なくとも約３４日、少なくとも約３５日、少なくとも約３６日、少なくとも約３７日、少なくとも約３８日、少なくとも約３９日、少なくとも約４０日、少なくとも約４１日、少なくとも約４２日、少なくとも約４３日、少なくとも約４４日、少なくとも約４５日、少なくとも約４６日、少なくとも約４７日、少なくとも約４８日、少なくとも約４９日、少なくとも約５０日、少なくとも約５１日、少なくとも約５２日、少なくとも約５３日、少なくとも約５４日、少なくとも約５５日、少なくとも約５６日、少なくとも約５７日、少なくとも約５８日、少なくとも約５９日、少なくとも約６０日、少なくとも約６１日、少なくとも約６２日、少なくとも約６３日、少なくとも約６４日、少なくとも約６５日、少なくとも約６６日、少なくとも約６７日、少なくとも約６８日、少なくとも約６９日、少なくとも約７０日、少なくとも約７１日、少なくとも約７２日、少なくとも約７３日、少なくとも約７４日、少なくとも約７５日、少なくとも約７６日、少なくとも約７７日、少なくとも約７８日、少なくとも約７９日、少なくとも約８０日、少なくとも約８１日、少なくとも約８２日、少なくとも約８３日、少なくとも約８４日、少なくとも約８５日、少なくとも約８６日、少なくとも約８７日
、少なくとも約８８日、少なくとも約８９日、少なくとも約９０日、少なくとも約９１日、少なくとも約９２日、少なくとも約９３日、少なくとも約９４日、少なくとも約９５日、少なくとも約９６日、少なくとも約９７日、少なくとも約９８日、少なくとも約９９日、少なくとも約１００日、少なくとも約１０１日、少なくとも約１０２日、少なくとも約１０３日、少なくとも約１０４日、少なくとも約１０５日、少なくとも約１０６日、少なくとも約１０７日、少なくとも約１０８日、少なくとも約１０９日、少なくとも約１１０日、少なくとも約１１１日、又は少なくとも約１１２日である。さらなる実施形態によると、プライミングワクチンの投与とブースティングワクチンの投与の間の間隔は約６４日である。本明細書中に記載される態様及び実施形態の一部の実施形態によると、方法は、対象に二つ以上の用量のブースティングワクチンを投与することを含む。本明細書中に記載される態様及び実施形態の一部の実施形態によると、方法は、ブースティングワクチンの各用量を、以前のワクチンを投与した後の少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１４週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約１～２週間、少なくとも約２～３週間、少なくとも約３～４週間、少なくとも約４～５週間、少なくとも約５～６週間、少なくとも約６～７週間、少なくとも約７～８週間、少なくとも約８～９週間、少なくとも約９～１０週間、少なくとも約１０～１１週間、少なくとも約１１～１２週間、少なくとも約１２～１３週間、少なくとも１３～１４週間、少なくとも約１４～１５週間、又は少なくとも約１５～１６週間に投与することを含む。本明細書中に記載される態様及び実施形態の一部の実施形態によると、ブースティングワクチンの各用量の投与と以前のワクチンの投与の間での間隔は、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約２６日、少なくとも約２７日、少なくとも約２８日、少なくとも約２９日、少なくとも約３０日、少なくとも約３１日、少なくとも約３２日、少なくとも約３３日、少なくとも約３４日、少なくとも約３５日、少なくとも約３６日、少なくとも約３７日、少なくとも約３８日、少なくとも約３９日、少なくとも約４０日、少なくとも約４１日、少なくとも約４２日、少なくとも約４３日、少なくとも約４４日、少なくとも約４５日、少なくとも約４６日、少なくとも約４７日、少なくとも約４８日、少なくとも約４９日、少なくとも約５０日、少なくとも約５１日、少なくとも約５２日、少なくとも約５３日、少なくとも約５４日、少なくとも約５５日、少なくとも約５６日、少なくとも約５７日、少なくとも約５８日、少なくとも約５９日、少なくとも約６０日、少なくとも約６１日、少なくとも約６２日、少なくとも約６３日、少なくとも約６４日、少なくとも約６５日、少なくとも約６６日、少なくとも約６７日、少なくとも約６８日、少なくとも約６９日、少なくとも約７０日、少なくとも約７１日、少なくとも約７２日、少なくとも約７３日、少なくとも約７４日、少なくとも約７５日、少なくとも約７６日、少なくとも約７７日、少なくとも約７８日、少なくとも約７９日、少なくとも約８０日、少なくとも約８１日、少なくとも約８２日、少なくとも約８３日、少なくとも約８４日、少なくとも約８５日、少なくとも約８６日、少なくとも約８７日、少なくとも約８８日、少なくとも約８９日、少なくとも約９０日、少なくとも約９１日、少なくとも約９２日、少なくとも約９３日、少なくとも約９４日、少なくとも約９５日、少なくとも約９６日、少なくとも約９７日、少なくとも約９８日、少なくとも約９９日、少なくとも約１００日、少なくとも約１０１日、少なくとも約１０２日、少なくとも約１０３日、少なくとも約１０４日、少なくとも約１０５日、少なくとも約１０６日、少なくとも約１０７日、少なくとも約１０８日、少なくとも約１０９日、少なくとも約１１０日、少なくとも約１１１日、又は少なくとも約１１３日である。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、対象は、細菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、又は真菌感染を有する。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、対象は、癌を有する。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、対象は、自己免疫疾患又は障害を有する。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、プライミングワクチン又はブースティングワクチンの一つ又は複数は、医薬的に許容可能な担体を含む。一部の実施形態によると、プライミングワクチン組成物及びブースティングワクチン組成物の少なくとも一つは、アジュバントをさらに含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、プライミングワクチン及びブースティングワクチンの少なくとも一つは、筋肉内、腹腔内、頬側、吸入、鼻腔内、くも膜下腔内、静脈内、皮下、皮内、及び腫瘍内から選択される経路により投与される、又は組織の間質腔中に投与される。
一部の態様によると、本開示は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むプライミングワクチンを含むワクチンレジメンを提供し、ＤＮＡが第一のペプチドをコードし、（ｉ）第二のペプチドをコードするリボ核酸（ＲＮＡ）、又は（ｉｉ）第二のペプチドを含むブースティングワクチンが続く。一部の実施形態によると、プライミングワクチンは、免疫学的有効量の第一のペプチドをコードするＤＮＡの量を含み、ブースティングワクチンは、免疫学的有効量の第二のペプチドをコードするＲＮＡを含む。一部の実施形態によると、プライミングワクチンは、免疫学的有効量の第一のペプチドをコードするＤＮＡの量を含み、ブースティングワクチンは、免疫学的有効量の第二のペプチドを含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、ＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形状ＤＮＡ、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、第一のペプチド及び第二のペプチドは、細菌感染因子、ウイルス感染因子、真菌感染因子、又は寄生虫感染因子から由来する。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、第一のペプチド及び第二のペプチドは、同じ病原性生物から由来する。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、第一のペプチド及び第二のペプチドは、プライミングワクチン及びブースティングワクチンにおいて同じである。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、第一のペプチド及び第二のペプチドのエピトープの少なくとも一つは、プライミングワクチン及びブースティングワクチンにおいて異なる。一部の実施形態によると、ＤＮＡは、隣接する逆位末端（ＩＴＲ）の間に少なくとも一つの核酸配列を含む、カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含み、少なくとも一つの核酸配列は、第一のペプチドをコードする。一部の実施形態によると、第一のペプチド及び／又は第二のペプチドは、腫瘍関連抗原である。一部の実施形態によると、第一のペプチド及び／又は第二のペプチドは、自己免疫状態に関連付けられる。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、第一のペプチド又は第二のペプチドは、表１～８中に記載されるものの一つ又は複数から選択される。
本開示はまた、本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの方法を実施すること、又は本明細書中の態様及び実施形態のいずれか一つのワクチンレジメンを対象に投与することを含む、細菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、又は真菌感染を伴う対象を治療する方法を特徴とする。
本開示はまた、本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの方法を実施すること、又は本明細書中の態様及び実施形態のいずれか一つのワクチンレジメンを対象に投与することを含む、癌を伴う対象を治療する方法を特徴とする。
本開示はまた、本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの方法を実施すること、又は本明細書中の態様及び実施形態のいずれか一つのワクチンレジメンを対象に投与することを含む、自己免疫疾患又は障害を伴う対象を治療する方法を特徴とする。
本開示はまた、本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの方法を実施すること、又は本明細書中の態様及び実施形態のいずれか一つのワクチンレジメンを対象に投与することを含む、対象において細菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、又は真菌感染を防止する方法を特徴とする。
本開示はまた、本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの方法を実施すること、又は本明細書中の態様及び実施形態のいずれか一つのワクチンレジメンを対象に投与することを含む、対象において癌を防止する方法を特徴とする。
本開示はまた、本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの方法を実施すること、又は本明細書中の態様及び実施形態のいずれか一つのワクチンレジメンを対象に投与することを含む、対象において自己免疫疾患を防止する方法を特徴とする。
本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、方法は、二つ以上の用量のブースティングワクチンを対象に投与することを含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、方法は、プライミングワクチンを投与した後の約８週間にブースティングワクチンを投与することを含む。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、方法は、対象に一つ又は複数の追加の治療薬剤を投与することをさらに含む。
他の態様によると、プライミングワクチン及びブースティングワクチンは、各々が、医薬組成物中で製剤化される。一部の実施形態によると、プライミングワクチン及びブースティングワクチンの一つ又は両方が、一つ又は複数の追加的な治療薬剤をさらに含む。他のさらなる実施形態によると、プライミングワクチン及びブースティングワクチンの一つ又は両方が、脂質をさらに含む。一部の実施形態によると、脂質は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。さらなる実施形態によると、プライミングワクチン及びブースティングワクチンの一つ又は両方が凍結乾燥される。
本開示はまた、本明細書中の態様及び実施形態のいずれか一つのワクチンレジメンを含む医薬組成物を特徴とする。一部の実施形態によると、医薬組成物は、一つ又は複数の追加の治療薬剤をさらに含む。
本開示はまた、本明細書中の態様及び実施形態のいずれか一つのワクチンレジメン、ならびに脂質を含む組成物を特徴とする。一部の実施形態によると、脂質は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。本明細書中の実施形態のいずれかのさらなる実施形態によると、組成物は凍結乾燥される。
他の態様では、本開示は、本明細書中の態様及び実施形態のいずれか一つのワクチンレジメン、ならびに使用のための説明書を含むキットを提供する。他の態様では、本開示は、本明細書中の態様及び実施形態のいずれか一つのプライミングワクチン及びブースティングワクチンの一つ又は両方、ならびに使用のための説明書を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは脂質を含む。
本開示のこれらの及び他の態様が、以下でさらに詳細に記載される。
本開示の実施形態は、上に簡単にまとめられ、下でより詳細に考察されるが、添付の図面中に描写される、本開示の例証的な実施形態への参照により理解することができる。しかし、本開示は他の等しく有効な実施形態を認め得るため、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを例証し、従って、範囲の限定と考えるべきではない。
図１は、実施例５において記載される試験の４９日目に決定されたスパイクタンパク質抗体力価を描写するグラフである。
図２は、実施例５において記載される試験の７７日目に決定されたスパイクタンパク質抗体力価を描写するグラフである。
図３は、実施例５において記載される試験の１０５日目に決定されたスパイクタンパク質抗体力価を描写するグラフである。
図４は、アッセイ７７日目にＩＦＮγ＋、ＩＦＮγ＋及びＣＤ１０７＋、ＩＦＮγ＋及びＴＮＦα＋又はＩＬ４＋であった集団におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを描写するグラフである。
図５は、実施例６において記載される試験の２１日目及び４９日目に決定されたスパイクタンパク質抗体力価を描写するグラフである。
図６は、ＣＯＶＩＤスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｃｅＤＮＡ、又はプラスミドを用いた免疫化後の８週間のマウス脾臓細胞懸濁液中のＩＦＮγ＋抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを描写するグラフである。
図７は、ｃｅＤＮＡ－ｃｅＤＮＡ、ｍＲＮＡ－ｍＲＮＡ、又はｃｅＤＮＡ－ｍＲＮＡレジメンを用いて、４、６、又は８週間間隔のいずれかで初回刺激及びブーストされたマウスにおけるＩＦＮγ＋抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを描写するグラフである。
図８は、０．３μｇ ｍＲＮＡ－３μｇ ｍＲＮＡ、１μｇ ｍＲＮＡ－３μｇ ｍＲＮＡ、３μｇ ｍＲＮＡ－３μｇ ｍＲＮＡ、３μｇ ｃｅＤＮＡ－３μｇ ｍＲＮＡ、及び１０μｇ ｃｅＤＮＡ－３μｇ ｍＲＮＡの異種プライムブーストレジメン後のＩＦＮγ＋抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを描写するグラフである。
詳細な説明
本開示は一般的に、異種プライムブースト免疫レジメンを使用して対象において免疫応答を誘導するための組成物及び方法の使用に関する。本明細書中に含まれるのは、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導する方法であって、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ＤＮＡを含むプライミングワクチンを対象に投与すること、それにおいて、ＤＮＡは第一のペプチドをコードし；ならびに（ｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）、又は（ｉｉ）第二のペプチドを含むブースティングワクチンを対象に投与すること、それにおいて、ＲＮＡは第二のペプチドをコードし、それにより、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導することを含み、予防的及び／又は治療的に使用することができる。一部の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法は、対象における目的の分子、例えば、治療用ポリペプチドの産生のために使用されることができる。
Ｉ．定義
本明細書中で他に定義されない限り、本出願との関連において使用される科学用語及び技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。本開示は、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、そのようなものとして変動し得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのみであり、もっぱら特許請求の範囲により定義される本開示の範囲を限定することを意図しない。免疫学及び分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．により公開，２０１１（ＩＳＢＮ ９７８－０－９１１９１０－１９－３）；Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓにより公開，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２０１３），Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により公開，１９９９－２０１２（ＩＳＢＮ ９７８３５２７６００９０８）；及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により公開，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒにより公開，２００６；Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）；Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにより公開，２０１４（ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ １９３６１１３４１４）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ ０４４４６０１４９Ｘ）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ ０１２４１９９５４２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）において見出すことができ、それらの内容は全て、参照によりそれらの全体において本明細書中に組み入れられる。
本明細書中で使用される用語「免疫化」又は「能動的免疫化」は、能動的免疫の産生を指し、自然に獲得された感染又は意図的なワクチン接種（人工能動的免疫）からもたらされる免疫を意味する。
本明細書中で使用される用語「アジュバント」は、製剤中の特定の免疫原との組み合わせにおいて使用される場合、結果として生じる免疫応答を増強する、又はそうでなければ改変する、もしくは修飾する薬剤を指すことを意味する。免疫応答の修飾は、免疫応答（例、抗体応答及び細胞免疫応答のいずれか又は両方）の特異性の強化又は拡大を含む。免疫応答の修飾はまた、特定の抗原特異的免疫応答を減少又は抑制することを意味し得る。
本明細書中で使用される用語「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して液性及び／又は細胞性抗原特異的応答を作製する、一つ又は複数のエピトープ（直鎖状、立体構造状のいずれか、又は両方）を含む分子を指すことを意味する。この用語は、用語「免疫原」と互換的に使用される。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５つのアミノ酸を含むが、しかし、３～４のアミノ酸ほど小さくてもよい。Ｔ細胞エピトープ、例えばＣＴＬエピトープなどは、少なくとも約７～９のアミノ酸を、及びヘルパーＴ細胞エピトープは少なくとも約１２～２０のアミノ酸を含む。通常、エピトープは、約７～１５の間のアミノ酸、例えば９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸などを含む、を含む。この用語は、タンパク質が、本明細書中に定義されるように、免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、天然配列と比較して、修飾、例えば欠失、付加、及び置換（一般的に天然において保存的）などを含むポリペプチドを含む。これらの修飾は、部位特異的変異誘発を介するように意図的であってもよく、又は、例えば抗原を産生する宿主の変異を介するなど、偶発的であってもよい。
用語「エピトープ」は、また、抗原決定基として言及されてもよく、結合剤、免疫グロブリン、又はＴ細胞受容体により特異的に結合されることができる分子決定基（例、ポリペプチド決定基）である。エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面基、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニルなどを含み、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、構造的又は機能的として定義されてもよい。機能的エピトープは、一般的に、構造エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接的に寄与する残基を有する。エピトープは、直鎖状又は立体構造状であってもよく、すなわち、非直鎖状アミノ酸で構成されてもよい。抗体又は抗体の抗原結合断片により認識されるエピトープは、抗体又は断片のＣＤＲ（例、相補的部位）と相互作用する抗原の構造的エレメントである。エピトープは、抗体のＣＤＲと相互作用して特異性を産生するいくつかのアミノ酸残基からの寄与により形成され得る。抗原性断片は、一つを上回るエピトープを含み得る。特定の実施形態では、抗体は、それが、タンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物中のその標的抗原を認識する場合、抗原に特異的に結合する。例えば、抗体は、抗体が交差競合する（一つが、他の結合又は調節効果を防止する）場合、「同じエピトープに結合する」と言う。
本明細書中で使用されるように、用語「自己免疫障害」は、一般的に、対象の免疫系が身体の自身の細胞を攻撃し、組織破壊を起こす状態を指す。自己免疫障害は、血液検査、脳脊髄液分析、筋電図（筋機能を測定する）、及び脳の磁気共鳴画像法を使用して診断され得るが、しかし、自身の抗体（又は自己抗体）についての血液中の抗体検査が特に有用である。通常、ＩｇＧクラス抗体は、自己免疫疾患と関連付けられる。
用語「Ｂリンパ球」又は「Ｂ細胞」は、特定の抗原エピトープを認識するクローン性多様性細胞表面免疫グロブリン（Ｉｇ）受容体（ＢＣＲ）を発現する抗体分泌細胞の前駆体である広範なクラスのリンパ球を指すために互換的に使用される。哺乳類Ｂ細胞発生は、初代リンパ組織（例、ヒト胎児肝臓及び胎児／成人骨髄）中で始まる一連の段階を包含し、その後の二次リンパ組織（例、ヒトリンパ節及び脾臓）中での機能的成熟を伴う。機能的／防御的終点は、最終分化形質細胞による抗体産生である。成熟Ｂ細胞は、その細胞表面免疫グロブリン（Ｉｇ）により認識されるエピトープを発現する抗原との遭遇により活性化され得る。活性化プロセスは、抗原による膜Ｉｇ分子の架橋に依存的な直接的なもの（架橋依存的Ｂ細胞活性化）又は、ヘルパーＴ細胞との密接な相互作用の状況において最も効率的に生じる間接的なもの（「同族ヘルププロセス」）であってもよい。（ＬｅＢｉｅｎ，ＴＷ＆ＴＦ Ｔｅｄｄｅｒ，Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ｈｏｗ ｔｈｅｙ ｄｅｖｅｌｏｐ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ（２００８）１１２（５）：１５７０－８０）。
本明細書中で使用されるように用語「癌」は、異常な細胞が、制御を伴わずに分裂し、他の組織に侵入することができる疾患を指す。１００を上回る種類の癌がある。大半の癌は、それらが開始する器官又は細胞の種類にちなんで名付けられ、例えば、結腸において始まる癌は結腸癌と呼ばれ；皮膚のメラノサイトにおいて始まる癌は黒色腫と呼ばれる。癌の種類は、より広範なカテゴリー中にグループ化することができる。癌の主なカテゴリーは、以下を含む：癌腫（皮膚中で又は器官の内側もしくは外側を裏打ちする、もしくは覆う組織中で発生する癌、ならびにそのサブタイプ、腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、及び移行上皮癌を含む、を意味する）；肉腫（骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、又は他の結合組織もしくは支持組織中で始まる癌を意味する）；白血病（血液形成組織（例、骨髄）中で開始し、多数の異常な血液細胞を産生させて、血液中に侵入する癌を意味する）；リンパ腫及び骨髄腫（免疫系の細胞中で始まる癌を意味する）；ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）癌（脳及び脊髄の組織中で起こる癌を意味する）。用語「骨髄異形成症候群」は、骨髄が十分な健常血液細胞（白血球、赤血球、及び血小板）を作製せず、血液及び／又は骨髄中に異常な細胞がある種類の癌を指す。骨髄異形成症候群は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）になり得る。特定の実施形態では、癌は、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳腫瘍、乳癌、原発不明の癌、骨に広がった癌、脳に広がった癌、肝臓に広がった癌、肺に広がった癌、カルチノイド、子宮頸癌、絨毛癌腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、妊娠性絨毛腫瘍（ＧＴＴ）、毛様細胞白血病、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫皮膚癌、中皮腫、男性の癌、奇胎妊娠、口及び口腔咽頭癌、骨髄腫、鼻及び副鼻腔癌、上咽頭癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、前立腺癌、希少癌、直腸癌、唾液腺癌、二次癌、皮膚癌（非黒色腫）、軟部肉腫、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、原発不明の癌、子宮癌、膣癌、及び外陰癌を含む癌から選択される。
本明細書中で使用されるように、用語「交差防御」は、ウイルス、細菌、寄生虫、又は他の病原体の少なくとも二つのサブグループ、サブタイプ、株、及び／又はバリアントに対する免疫を記載するために使用され、その一つのサブグループ、サブタイプ、株、及び／又はバリアントを用いた単一接種を伴う。
本明細書中で使用される用語「サイトカイン」は、他の細胞に対して様々な効果を有する細胞により分泌される小さな可溶性タンパク質物質を指す。サイトカインは、成長、発生、創傷治癒、及び免疫応答を含む多くの重要な生理学的機能を媒介する。それらは、細胞膜中に位置付けられるそれらの細胞特異的受容体に結合することにより作用し、それは、別個のシグナル伝達カスケードが細胞中で開始することを可能にし、それは、最終的には、標的細胞における生化学的変化及び表現型の変化に導く。一般的に、サイトカインは局所的に作用する。それらは、インターロイキンの多く、ならびにいくつかの造血成長因子を包含するＩ型サイトカイン；インターフェロン及びインターロイキン－１０を含むＩＩ型サイトカイン；ＴＮＦα及びリンホトキシンを含む腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）関連分子；インターロイキン１（ＩＬ－１）を含む免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー；ならびに多種多様な免疫機能及び炎症機能において決定的な役割を果たす分子のファミリーであるケモカインを含む。同じサイトカインは、細胞の状態に依存して、細胞に対して異なる効果を有し得る。サイトカインは、しばしば、他のサイトカインの発現を調節し、そのカスケードを誘発する。
本明細書中で使用される用語「検出可能な応答」は、検出試薬を用いて、又は用いずに実施され得るアッセイにおいて検出され得る任意のシグナル又は応答を指すことを意味する。検出可能な応答は、限定されないが、放射性崩壊及びエネルギー（例、蛍光、紫外線、赤外線、可視）放射、吸収、偏光、蛍光、リン光、透過、反射又は共鳴伝達を含む。検出可能な応答はまた、クロマトグラフィー移動度、濁度、電気泳動移動度、質量スペクトル、紫外線スペクトル、赤外線スペクトル、核磁気共鳴スペクトル、及びＸ線回折を含む。あるいは、検出可能な応答は、生物学的材料の一つ又は複数の特性、例えば融点、密度、導電率、表面音響波、触媒活性、又は元素組成物などを測定するためのアッセイの結果であってもよい。「検出試薬」は、目的の物質の存在又は非存在を示す検出可能な応答を生成する任意の分子である。検出試薬は、様々な分子、例えば抗体、核酸配列、及び酵素などのいずれかを含む。検出を促進するために、検出試薬はマーカーを含んでもよい。
本明細書中で使用される用語「エフェクター細胞」は、最終応答又は機能を行う細胞を指す。免疫系の主なエフェクター細胞は、例えば、活性化リンパ球及び食細胞である。
本明細書中で使用される用語「集団免疫」は、他のワクチン接種及び感染についての天然リザーバにおける低下により産生される集団における、ワクチン接種されていない個体に付与された防御を指す。
本明細書中で使用される用語「ヘテロサブタイプ免疫（ＨＳＩ）」は、全てのウイルス株にわたって保存された抗原の免疫認識に基づく免疫を指す。
本明細書中で使用される用語「ヘテロタイプ」は、異なる又は異常な種類又は形態（例、ウイルス、細菌、寄生虫、又は他の病原体の異なるサブグループ、サブタイプ、株、及び／又はバリアント）であることを指すために使用される。
本明細書中で使用される用語「ホモタイプ」は、同じ種類又は形態、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、又は他の病原体の同じサブグループ、サブタイプ、株、及び／又はバリアントであることを指すために使用される。
本明細書中で使用される用語「免疫応答」及び「免疫媒介性」は、これらの反応の結果が対象に有益又は有害であるかにかかわらず、外来性抗原又は自己抗原のいずれかに対する対象の免疫系の任意の機能発現を指すために、本明細書中で互換的に使用される。本明細書中で使用される抗原又は組成物に対する用語「免疫学的応答」は、目的の組成物中に存在する抗原に対する液性及び／又は細胞性免疫応答の、対象における発生を指すことを意味する。本開示の目的のために、「液性免疫応答」は、抗体分子により媒介される免疫応答を指す一方で、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球及び／又は他の白血球により媒介されるものである。細胞免疫の一つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によりコードされ、細胞の表面上に発現されるタンパク質との関連において提示されるペプチド抗原についての特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊、又はそのような微生物に感染された細胞の溶解を誘導及び促進するのに役立つ。細胞免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、その表面上にＭＨＣ分子との関連においてペプチド抗原を呈示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性を集中させるのに役立つように作用する。「細胞免疫応答」はまた、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞から由来するものを含む、活性化Ｔ細胞及び／又は他の白血球細胞により産生されるサイトカイン、ケモカイン、及び他のそのような分子の産生を指す。それ故に、免疫学的応答は、以下の効果：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるいは目的の組成物もしくはワクチン中に存在する抗原又は抗原に特異的に向けられたサプレッサーＴ細胞及び／又はγδＴ細胞の活性化の一つ又は複数を含み得る。これらの応答は、感染性を中和し、及び／又は抗体補体、もしくは抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫化宿主に防御を提供する役割を果たし得る。そのような応答は、当技術分野において周知の標準的な免疫アッセイ及び中和アッセイを使用して決定することができる。
本明細書中で使用される用語「免疫表現型」又は「免疫型」は、様々な免疫細胞集団の集合的な頻度、及び刺激に対するそれらの機能的応答（細胞シグナル伝達及び抗体応答）を指す。（Ｋａｃｚｏｒｏｗｓｋｉ，ＫＪ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１７）を参照のこと）。
本明細書中で使用される用語「免疫系」は、自然免疫系及び適応免疫系を含む、疾患に対する身体の防御系を指す。自然免疫系は、病原体に対する非特異的な第一防御ラインを提供する。それは、物理的バリア（例、皮膚）、ならびに細胞（顆粒球、ナチュラルキラー細胞）防御機構及び液性（補体系）防御機構の両方を含む。自然免疫系の反応は即時であるが、しかし、適応免疫系とは異なり、それは病原体に対する永久免疫を提供しない。適応免疫応答は、典型的には免疫学的記憶を生成する特定の抗原に対する脊椎動物免疫系の応答である。
本明細書中で使用される用語「免疫優性エピトープ」は、抗体の大部分が産生される、又はＴ細胞の大部分が応答するエピトープを指す。
本明細書中で使用される用語「免疫原量」又は「免疫学的有効量」は、抗体もしくはＴ細胞応答のいずれか、又はその両方を誘発するのに十分な、有益な効果、例えば、予防的又は治療効果を対象に対して有するのに十分な活性成分（例えば免疫原性ペプチドなど）の量を指す。
用語「免疫学的レパートリー」は、Ｔ細胞及びＢ細胞の表面上に位置付けられる膜貫通型抗原受容体タンパク質のコレクションを指す。（Ｂｅｎｉｃｈｏｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１１）１３５：１８３－１９１））受容体をコードすることに関与する組み合わせ機構は、遺伝子コードを再シャッフリングすることによりそれを行い、ヒトにおける１０１８を上回る異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（Ｖｅｎｔｕｒｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８）８：２３１－８）及びずっとより多くのＢ細胞レパートリーを生成する潜在能を伴う。これらの配列は順に転写され、次に、細胞表面上に提示されるタンパク質に翻訳される。受容体の構築のために遺伝子セグメントを再構成する組み換えプロセスは、免疫応答の発生に重要であり、再構成された受容体の正確な形成は、抗原に対するそれらの将来の結合親和性に決定的である。
そのような分子をコードするペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はポリヌクレオチドは「免疫原性」であり、このように、それが免疫応答を誘導することが可能である場合、本開示内の免疫原である。本開示では、免疫原性は、より具体的には、ＣＴＬ媒介性応答を誘導する能力として定義される。このように、免疫原は、免疫応答を誘導することが可能である分子であり、本開示では、ＣＴＬ応答を誘導することが可能な分子である。免疫原は、等価の生物学的活性及び免疫学的活性を有する一つ又は複数のアイソフォーム、配列バリアント、又はスプライスバリアントを有してもよく、このように、また、本開示の目的のために、元の天然ポリペプチドの免疫原性等価物であると考えられる。
用語「プライミング」又は「プライム」は、ワクチン（プライミングワクチン）又は免疫原性組成物の投与を指すことを意味し、それは、同じ又は異なるワクチン免疫原性組成物のその後の投与が続く場合、単一のワクチン又は免疫原性組成物を用いた投与により得られる免疫応答よりも高いレベルの免疫応答を誘導する。一部の実施形態によると、「プライミングワクチン」はＤＮＡプライミングワクチンである。一部の実施形態によると、ＤＮＡプライミングワクチンは、例えば、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形状ＤＮＡ、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの形態であってもよい。一部の実施形態によると、プライミングワクチンは、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を含む。一部の実施形態によると、プライミングワクチンはプラスミドＤＮＡを含む。
用語「ブースティング」又は「ブースト」は、プライミングワクチン又は免疫原性組成物の投与後のその後のワクチン（「ブースティングワクチン」）又は免疫原性組成物の投与を指し、それにおいて、その後の投与は、ワクチン又は免疫原性組成物の単一投与に対する免疫応答よりも高いレベルの免疫応答を産生する。ブースティングワクチンは、プライミングワクチン又は免疫原性組成物の同じ、又は異なるワクチン免疫原性組成物であることができる。
本明細書中で使用される用語「異種プライムブースト」は、免疫原性ペプチド又は抗原を用いて免疫応答をプライミングすること、ならびに異なる分子及び／又はベクターにより送達される免疫原性ペプチド又は抗原を用いた免疫応答のその後のブーストを含むレジメンを指すことを意味する。例えば、本発明の異種プライムブーストレジメンは、ｃｅＤＮＡベクターを用いたプライミング及びｍＲＮＡベクターを用いたブーストならびにｃｅＤＮＡベクターを用いたプライミング及び免疫原性ペプチドを用いたブーストを含む。本発明の異種プライムブーストレジメンはまた、例えば、プラスミドＤＮＡを用いたプライミング及びｍＲＮＡベクターを用いたブーストならびにプラスミドＤＮＡを用いたプライミング及び免疫原性ペプチドを用いたブーストを含むことができる。
用語「特異的に結合する」は、本明細書中で使用されるように、インビトロ又はインビボでリガンドを認識及び結合する一方で、周囲の環境中の他の分子を実質的に認識又は結合しないポリペプチド又はポリペプチド複合体の能力を指す。一部の実施形態では、特異的結合は、少なくとも約１×１０６Ｍ又はそれ以下の平衡解離定数により特徴付けられ得る（例、より小さい平衡解離定数は、より緊密な結合を意味する）。二つの分子が特異的に結合するか否かを決定するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、及び同様のものを含む。
用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書中で使用されるように、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用した、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度における変化の検出により、リアルタイム生物特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。さらなる記載については、米国特許第６，２５８，５６２号の実施例１及びＪｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９；Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０－６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８を参照のこと。
本明細書中で使用されるように、用語「異種核酸配列」及び「導入遺伝子」は、互換的に使用され、本明細書中に開示されるｃｅＤＮＡベクターにより組み入れられて、送達及び発現され得る目的の核酸（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外）を指す。一部の実施形態によると、用語「異種核酸」は、それが接触する細胞又は対象において存在しない、それにより発現される、又はそれから由来する核酸（又は導入遺伝子）を指すことを意味する。
本明細書中で使用されるように、用語「発現カセット」及び「転写カセット」は、互換的に使用され、導入遺伝子の転写に向けるのに十分な一つ又は複数のプロモーターあるいは他の調節配列に動作可能に連結されているが、しかし、カプシドコード配列、他のベクター配列、又は逆位末端反復領域を含まない導入遺伝子を含む核酸の直線的なストレッチを指す。発現カセットは、一つ又は複数のシス作用配列（例、プロモーター、エンハンサー、又はリプレッサー）、一つ又は複数のイントロン、及び一つ又は複数の転写後調節エレメントを追加的に含んでもよい。
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書中で互換的に使用され、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。このように、この用語は、一本鎖、二本鎖、又は多鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー、又は他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む。「オリゴヌクレオチド」は、一般的に、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドの間のポリヌクレオチドを指す。しかし、本開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに対する上限はない。オリゴヌクレオチドはまた、「オリゴマー」又は「オリゴ」として公知であり、遺伝子から単離されてもよく、又は当技術分野において公知の方法により化学的に合成されてもよい。用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、記載されている実施形態に適用可能な場合、一本鎖ポリヌクレオチド（例えばセンス又はアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
用語ＤＮＡ及びＤＮＡ分子は、本明細書中では互換的に使用され、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ－ＤＮＡ二本鎖、予め縮合されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、又はこれらの基の誘導体及び組み合わせの形態であり得るＤＮＡを指すことを意味する。ＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形状ＤＮＡ、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの形態であってもよい。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、及びそれらの組み合わせの形態であってもよい。好ましい実施形態によると、プライミングワクチンのＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形状ＤＮＡ、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを含む。核酸は、公知のヌクレオチド類似体又は修飾された骨格残基もしくは連結を含む核酸を含み、それらは合成的であり、天然であり、及び非天然であり、ならびに参照核酸と類似の結合特性を有する。そのような類似体及び／又は修飾残基の例は、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（モルホリノ）、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有する天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列、ならびに明示的に示された配列を暗黙的に包含する。
「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）又はリボース（ＲＮＡ）、塩基、及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、リン酸基を通じて一緒に連結される。
「塩基」はプリン及びピリミジンを含み、それらは天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然類似体、ならびにプリン及びピリミジンの合成誘導体をさらに含み、それらは、限定されないが、新たな反応性基、例えばアミン、アルコール、チオール、カルボン酸塩、及びハロゲン化アルキルなどを配置する修飾を含む。
本明細書中で使用される用語「核酸構築物」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子を指し、それは、天然遺伝子から単離される、又はそうでなければ自然において存在しないであろう、もしくは合成的である様式において核酸のセグメントを含むように修飾される。用語「核酸構築物」は、核酸構築物が、本開示のコード配列の発現のために要求される制御配列を含む場合、用語「発現カセット」と同義である。「発現カセット」は、プロモーターに動作可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。
「ハイブリッド可能」又は「相補的」又は「実質的に相補的」により、それは、核酸（例、ＲＮＡ）が、それが非共有結合的に結合し、即ち、ワトソン・クリック塩基対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を形成し、温度及び溶液イオン強度の適したインビトロ及び／又はインビボ条件下で、配列特異的で、反平行な様式（即ち、核酸は相補的核酸に特異的に結合する）において別の核酸に「アニールする」、又は「ハイブリダイズする」ことを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当技術分野において公知であるように、標準的なワトソン・クリック塩基対形成は、チミジン（Ｔ）とのアデニン（Ａ）対形成、ウラシル（Ｕ）とのアデニン（Ａ）対形成、及びシトシン（Ｃ）とのグアニン（Ｇ）対形成を含む。また、当技術分野においては、二つのＲＮＡ分子（例、ｄｓＲＮＡ）の間でのハイブリダイゼーションについて、グアニン（Ｇ）がウラシル（Ｕ）と塩基対形成することが公知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対形成は、ｍＲＮＡ中のコドンとのｔＲＮＡアンチコドン塩基対形成の文脈において、遺伝子コードの縮重（即ち、冗長性）について部分的に関与している。本開示の文脈において、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二本鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に対して、及びその逆も相補的と考えられる。そのようなものとして、Ｇ／Ｕ塩基対が、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二本鎖）の所与のヌクレオチド位置で作製されることができる場合、その位置は、非相補的であると考えられず、しかし、代わりに相補的であると考えられる。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書中で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、それは、コード及び非コードアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。
特定の抗原又は免疫原性ペプチドを「コードする」ＤＮＡ配列は、特定のＲＮＡ及び／又はタンパク質に転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしてもよく、又はＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡ；また、「非コード」ＲＮＡ又は「ｎｃＲＮＡ」と呼ばれる）をコードしてもよい。
本明細書中で使用されるように、用語「末端反復」又は「ＴＲ」は、少なくとも一つの最小限の要求される複製の起点、及びパリンドロームヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端反復又は合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」）（また、ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）として言及される）及び末端分解部位（「ＴＲＳ」）は、一緒に、「最小限の要求される複製の起点」を構成し、このように、ＴＲは、少なくとも一つのＲＢＳ及び少なくとも一つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内の互いの逆相補体であるＴＲは、典型的には、各々、「逆位末端反復」又は「ＩＴＲ」として言及される。ウイルスの文脈では、ＩＴＲは複製、ウイルスパッケージング、組込み、及びプロウイルスレスキューを媒介する。予想外に見出されたように、それらの全長にわたって逆相補体ではないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を実施することができ、このように、用語「ＩＴＲ」は、本明細書中では、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することが可能であるｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すために使用される。複雑なｃｅＤＮＡベクター配置中では、二つを上回るＩＴＲ又は非対称ＩＴＲ対が存在し得ることが当業者により理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ ＩＴＲであることができる、又はＡＡＶ ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ ＩＴＲから由来することができる。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルス科から由来し得るが、それは、パルボウイルス及びディペンドウイルス（例、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）を包含し、又はＳＶ４０複製起点としての役割を果たすＳＶ４０ヘアピンは、ＩＴＲとして使用されることができ、それは、切断、置換、欠失、挿入、及び／又は付加によりさらに修飾されることができる。パルボウイルス科ウイルスは、二つの亜科からなる：パルボウイルス亜科は、脊椎動物に感染し、及びデンソウイルス亜科は、無脊椎動物に感染する。ディペンドパルボウイルスは、限定されないが、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、及びウシ種を含む脊椎動物宿主において複製することが可能であるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルス科を含む。本明細書中での便宜のために、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対する５’（その上流）に位置付けられるＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」として言及され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットの３’（その下流）に位置付けられるＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」として言及される。
「野生型ＩＴＲ」又は「ＷＴ－ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性及びＲｅｐニッキング能力を保持するＡＡＶ又は他のディペンドウイルス中の天然ＩＴＲ配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ－ＩＴＲの核酸配列は、遺伝子コードの縮重又はドリフトに起因して、標準天然配列からわずかに変動し得るが、従って、本明細書中での使用のために包含されるＷＴ－ＩＴＲ配列は、産生プロセス中に起こる天然の変化（例、複製エラー）の結果として、ＷＴ－ＩＴＲ配列を含む。
本明細書中で使用されるように、用語「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ」又は「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ対」は、それらの全長にわたって逆相補配列を有する野生型ＩＴＲの両方である、単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内のＷＴ－ＩＴＲの対を指す。例えば、ＩＴＲは、変化が、配列の特性及び全体的な三次元構造に影響を及ぼさない限り、それが、標準天然配列から逸脱する一つ又は複数のヌクレオチドを有する場合でさえ、野生型配列であると考えることができる。一部の態様によると、逸脱ヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。一つの非限定的な例として、（例、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）基準配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、また、それらの３Ｄ構造が幾何学的空間において同じ形状であるように、他のＷＴ－ＩＴＲに対して対称な三次元空間構成を有する配列。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、３Ｄ空間中に同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、それが適したＲｅｐタンパク質と対合する動作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥ又はＲＢＥ’）及び末端分解部位（ｔｒｓ）を有することを決定することにより、ＷＴとして機能的に確認することができる。場合により、許容条件下での導入遺伝子発現を含む、他の機能をテストすることができる。
本明細書中で使用されるように、「修飾ＩＴＲ」又は「ｍｏｄ－ＩＴＲ又は「変異体ＩＴＲ」の語句は、本明細書中で互換的に使用され、同じ血清型からのＷＴ－ＩＴＲと比較して、少なくとも一つ又は複数のヌクレオチドにおいて変異を有するＩＴＲを指す。変異は、ＩＴＲ中のＡ、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、Ｂ’領域の一部又はそれ以上に従った変化をもたらし得る、同じ血清型のＷＴ－ＩＴＲの３Ｄ空間構成と比較して、三次元空間構成（即ち、幾何学的空間におけるその３Ｄ構造）において変化をもたらし得る。
本明細書中で使用されるように、用語「非対称ＩＴＲ」はまた、「非対称ＩＴＲ対」として言及され、それらの全長にわたって逆相補体ではない単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。一つの非限定的な例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの３Ｄ構造が幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して、対称な三次元空間構成を有さない。異なって述べると、非対称ＩＴＲ対は、異なる全体的な幾何学的構造を有し、即ち、それらは、３Ｄ空間においてそれらのＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループの異なる構成を有する（例、一つのＩＴＲは、同族ＩＴＲと比較して、短いＣ－Ｃ’アーム及び／又は短いＢ－Ｂ’アームを有し得る）。二つのＩＴＲ間の配列における違いは、一つ又は複数のヌクレオチド付加、欠失、切断、又は点変異に起因し得る。一部の実施形態によると、非対称ＩＴＲ対の一つのＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列であってもよく、他のＩＴＲは、本明細書中で定義される修飾ＩＴＲ（例、非野生型又は合成的ＩＴＲ配列）であってもよい。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のＩＴＲのいずれも、野生型ＡＡＶ配列ではなく、二つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（即ち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾ＩＴＲである。一部の実施形態によると、非対称ＩＴＲ対の一つのｍｏｄ－ＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームを有することができ、他のＩＴＲは、それらが、同族非対称ｍｏｄ－ＩＴＲと比較して、異なる三次元空間構成を有するように、異なる修飾（例、単一のアーム、又は短いＢ－Ｂ’アームなど）を有することができる。
本明細書中で使用されるように、用語「対称ＩＴＲ」は、野生型ディペンドウイルスＩＴＲ配列に対して変異又は修飾され、それらの全長にわたって逆相補体である、単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。ＩＴＲのいずれも野生型ＩＴＲ ＡＡＶ２配列ではなく（即ち、それらは修飾ＩＴＲであり、また、変異ＩＴＲとして言及される）、ヌクレオチド付加、欠失、置換、切断、又は点変異に起因して、野生型ＩＴＲとの配列における違いを有し得る。本明細書中での便宜のために、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対する５’（その上流）に位置付けられるＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」として言及され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットの３’（その下流）に位置付けられるＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」として言及される。
本明細書中で使用されるように、用語「実質的に対称な修飾ＩＴＲ」又は「実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対」は、それらの全長にわたって逆相補配列を有する両方である単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内の修飾ＩＴＲの対を指す。例えば、修飾ＩＴＲは、変化が特性及び全体的な形状に影響を及ぼさない限り、それが、逆相補配列から逸脱する一部のヌクレオチド配列を有する場合でさえ、実質的に対称と考えられ得る。一つの非限定的な例として、（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）基準配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する、及びまた、それらの３Ｄ構造が幾何学的空間において同じ形状であるように、それらの同族修飾ＩＴＲに対して、対称な三次元空間構成を有する配列。異なって述べると、実質的に対称な修飾ＩＴＲ対は、３Ｄ空間において組織化された同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する。一部の実施形態によると、ｍｏｄ－ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補ヌクレオチド配列を有し得るが、しかし、依然として、同じ対称な三次元空間構成を有してもよく、すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な３Ｄ形状をもたらす変異を有する。例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ対における一つのＩＴＲ（例、５’ＩＴＲ）は、一つの血清型からであってもよく、他のＩＴＲ（例、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型からであってもよいが、しかし、両方が、同じ対応する変異を有する（例、５’ＩＴＲがＣ領域中に欠失を有する場合、異なる血清型からの同族修飾３’ＩＴＲは、Ｃ’領域中の対応する位置に欠失を有する）ことができ、修飾ＩＴＲ対は、同じ対称な三次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾ＩＴＲ対中の各ＩＴＲは、異なる血清型（例、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２）、例えばＡＡＶ２及びＡＡＶ６の組み合わせなどからであってもよく、一部のＩＴＲに従った修飾は、異なる血清型からの同族ＩＴＲ中の対応する位置において反映される。一部の実施形態によると、実質的に対称な修飾ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の違いが特性又は全体的な形状に影響を及ぼさず、それらが３Ｄ空間において実質的に同じ形状を有する限り、修飾ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）の対を指す。非限定的な例として、当技術分野において周知の標準的手段、例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、又はデフォルト設定でのＢＬＡＳＴＮなどにより決定される、基準ｍｏｄ－ＩＴＲに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、また、それらの３Ｄ構造が幾何学的空間において同じ形状であるように対称的な三次元空間構成を有するｍｏｄ－ＩＴＲ。実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対は、３Ｄ空間において同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有し、例えば、実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対における修飾ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、次に同族ｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、また、その同族ｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間において同じ形状の残りのＡ及びＢ－Ｂ’ループの同様の３Ｄ構造を有する。
本明細書中で使用されるように、「内部リボソーム進入部位」（ＩＲＥＳ）は、ｍＲＮＡ配列の中央における翻訳の開始を可能にするヌクレオチド配列（＞５００ヌクレオチド）を指すことを意味する（Ｋｉｒｎ，ＪＩＴ．ｅｔ ａｌ．，２０１１．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（４）：８５５６；その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる）。ＩＲＥＳ配列の使用は、ＩＲＥＳの前及び後の遺伝子の共発現を確実にするが、ＩＲＥＳに従った配列は、ＩＲＥＳ配列に先行する配列よりも低いレベルで転写及び翻訳され得る。
本明細書中で使用されるように、「２Ａペプチド」は、ウイルス、例えば口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ブタテシオウイルス－１（Ｐ２Ａ）、ゾセアアシグナウイルス（Ｔ２Ａ）、又はウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）などから由来する小さな自己切断ペプチドを指すことを意味する。２Ａ命名は、２ＡペプチドのＯ末端におけるグリシル－プロリル結合でリボソームスキップに導くピコルナウイルスポリタンパク質の領域を具体的に指す（Ｋｉｍ，Ｊ．ＩＴ．ｅｔ ａｌ．２０１１．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（４）；その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる）。このスキップによって、２Ａペプチドとそのすぐ下流のペプチドの間での切断がもたらされる。
用語「隣接」は、別の核酸配列に対する一つの核酸配列の相対位置を指す。一般的に、配列ＡＢＣ中では、ＢはＡ及びＣにより隣接されている。同じことが、配列ＡｘＢｘＣについてあてはまる。このように、隣接配列は、隣接配列に先行する又は続くが、しかし、隣接配列と連続する、又は直ぐに隣接する必要はない。一部の実施形態によると、用語「隣接」は、直線二本鎖ｃｅＤＮＡベクターの各末端での末端反復を指す。
本明細書中で使用されるように、用語「ｃｅＤＮＡゲノム」は、少なくとも一つの逆位末端反復領域をさらに組み入れる発現カセットを指す。ｃｅＤＮＡゲノムは、一つ又は複数のスペーサー領域をさらに含み得る。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二本鎖ポリヌクレオチドとしてプラスミド又はウイルスゲノム中に組み入れられる。
本明細書中で使用されるように、用語「ｃｅＤＮＡスペーサー領域」は、ｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡゲノム中の機能的エレメントを分離する介在配列を指す。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、最適な機能性のために、二つの機能的エレメントを所望の距離で保つ。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、例えばプラスミド又はバキュロウイルス内のｃｅＤＮＡゲノムの遺伝的安定性を提供する、又は加える。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、クローニング部位及び同様のもののための便利な場所を提供することにより、ｃｅＤＮＡゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含むオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」、又は公知のタンパク質（例、転写因子）結合部位を有さないよう設計された非オープンリーディングフレーム配列は、例えば、末端分解部位と上流転写調節エレメントの間に６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒなどを挿入するなど、シス作用因子を分離するために、ｃｅＤＮＡゲノム中に位置付けられ得る。同様に、スペーサーは、ポリアデニル化シグナル配列と３’末端分解部位の間に組み入れられ得る。
本明細書中で使用されるように、用語「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合エレメント、「ＲＢＥ」、及び「ＲＢＳ」は、互換的に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例、ＡＡＶ Ｒｅｐ ７８又はＡＡＶ Ｒｅｐ ６８）についての結合部位を指し、それは、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み入れる配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実施することを可能にする。ＲＢＳ配列及びその逆相補体は一緒に、単一のＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は当技術分野において公知であり、例えば、ＡＡＶ２中で特定されたＲＢＳ配列である５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’を含む。任意の公知のＲＢＳ配列が、本開示の実施形態において使用され得るが、他の公知のＡＡＶ ＲＢＳ配列及び他の天然の公知の又は合成のＲＢＳ配列を含む。理論により拘束されることを伴わないが、Ｒｅｐタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二本鎖核酸配列ＧＣＴＣに結合し、このように、二つの公知のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、二本鎖オリゴヌクレオチド、５’－（ＧＣＧＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）－３’に直接的に結合し、その上で安定的に組み立てられると考えられる。また、可溶性凝集立体構造（即ち、未定義数の相互関連Ｒｅｐタンパク質）は、Ｒｅｐ結合部位を含むオリゴヌクレオチドを解離し、それに結合する。各Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基及びホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するのに対し、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非又は低配列特異的であり、タンパク質－ＤＮＡ複合体を安定化させる。
本明細書中で使用されるように、用語「末端分解部位」及び「ＴＲＳ」は、本明細書中では互換的に使用され、Ｒｅｐが、５’チミジンとチロシン－ホスホジエステル結合を形成し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡ ｐｏｌデルタ又はＤＮＡ ｐｏｌイプシロンを介したＤＮＡ伸長のための基質としての役割を果たす３’ＯＨを生成する領域を指す。あるいは、Ｒｅｐ－チミジン複合体は、同調ライゲーション反応において関与してもよい。一部の実施形態によると、ＴＲＳは、非塩基対チミジンを最小限だけ包含する。一部の実施形態によると、ＴＲＳのニッキング効率は、ＲＢＳからの同じ分子内の距離により少なくとも部分的に制御され得る。アクセプター基質が相補的ＩＴＲである場合、次に、結果として得られる産物は分子内二本鎖である。ＴＲＳ配列は、当技術分野において公知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されるヘキサヌクレオチド配列である５’－ＧＧＴＴＧＡ－３’を含む。任意の公知のＴＲＳ配列が、本開示の実施形態において使用され得るが、他の公知のＡＡＶ ＴＲＳ配列ならびに他の天然の公知の又は合成のＴＲＳ配列、例えばＡＧＴＴ、ＧＧＴＴＧＧ、ＡＧＴＴＧＧ、ＡＧＴＴＧＡなど、ならびに他のモチーフ、例えばＲＲＴＴＲＲなどを含む。
本明細書中で使用されるように、用語「ｃｅＤＮＡ」は、非ウイルス性遺伝子移入、合成、又は他の方法のためのカプシド不含閉端直線二本鎖（ｄｓ）二本鎖ＤＮＡを指す。ｃｅＤＮＡの詳細な記載は、２０１７年３月３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２０８２８の国際出願において記載されており、その内容全体が、参照により本明細書中に明示的に組み入れられる。細胞ベースの方法を使用した様々な逆位末端反復（ＩＴＲ）配列及び配置を含むｃｅＤＮＡの産生のための特定の方法が、２０１８年９月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６、及び２０１８年１２月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の実施例１において記載されており、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。様々なＩＴＲ配列及び配置を含む合成ｃｅＤＮＡベクターの産生のための特定の方法が、例えば、２０１９年１月１８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／１４１２２において記載されており、その内容全体が、参照により本明細書中に組み入れられる。本明細書中で使用されるように、用語「ｃｅＤＮＡベクター」及び「ｃｅＤＮＡ」は、互換的に使用され、少なくとも一つの末端パリンドロームを含む閉端ＤＮＡベクターを指す。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡは、二つの共有結合的に閉じた末端を含む。
本明細書中で使用されるように、用語「ｃｅＤＮＡプラスミド」は、分子間二本鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むプラスミドを指す。
本明細書中で使用されるように、用語「ｃｅＤＮＡ－バクミド」は、プラスミドとして大腸菌中で増殖することが可能であり、そのためバキュロウイルスのためのシャトルベクターとして作用することができる分子間二本鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含む感染性バキュロウイルスゲノムを指す。
本明細書中で使用されるように、用語「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス」は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二本鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指す。
本明細書中で使用されるように、用語「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス感染昆虫細胞」及び「ｃｅＤＮＡ－ＢＩＩＣ」は、互換的に使用され、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスで感染された無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例、Ｓｆ９細胞）を含む）を指す。
本明細書中で使用されるように、用語「閉端ＤＮＡベクター」は、少なくとも一つの共有結合的な閉端を伴うカプシド不含ＤＮＡベクターを指し、ベクターの少なくとも一部は分子内二本鎖構造を有する。
本明細書中で定義されるように、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用することができるタンパク質を指す。レポーターは、一般的に、測定可能なシグナル、例えば蛍光、色、又は発光などを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞又は生物体におけるその存在を容易に観察するタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定の波長の光で励起された場合に細胞を蛍光化し、ルシフェラーゼによって、細胞が、光を産生する反応を触媒し、酵素、例えばβ－ガラクトシダーゼなどは、基質を着色産物に変換する。実験的又は診断的な目的のために有用な、例示的なレポーターポリペプチドは、限定されないが、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及び他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ならびに当技術分野において周知の他を含む。
本明細書中で使用されるように、用語「エフェクタータンパク質」は、例えば、レポーターポリペプチドとして、又はより適切には、細胞を殺すポリペプチドとして、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指し、例えば、細胞を、選ばれた薬剤での、又はそれを欠く殺傷に対して感受性にする毒素、又は薬剤である。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを直接的に標的化する又は損傷する任意のタンパク質又はペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質は、限定されないが、宿主細胞ＤＮＡ配列（ゲノム又は染色体外エレメント上であるかにかかわらず）を標的化する制限エンドヌクレアーゼ、細胞生存のために必要なポリペプチド標的を分解するプロテアーゼ、ＤＮＡジャイレース阻害剤、及びリボヌクレアーゼ型毒素を含むことができる。一部の実施形態によると、本明細書中に記載される合成的生物学的回路により制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成的生物学的回路における因子として関与し、それにより、生物学的回路系の応答性の範囲及び複雑さを拡張することができる。
転写調節因子は、導入遺伝子（例、本明細書中に記載される抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸）の転写を活性化又は抑制する転写アクチベーター及びリプレッサーを指す。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベーターは、典型的には、転写プロモーターの近くに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接的に開始させる。リプレッサーは転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨げる。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、ならびに細胞及び環境条件に依存的に、アクチベーター又はリプレッサーのいずれかとしての役割を果たし得る。転写調節因子クラスの非限定的な例は、限定されないが、ホメオドメインタンパク質、ジンクフィンガータンパク質、ウィングドヘリックス（フォークヘッド）タンパク質、及びロイシンジッパータンパク質を含む。
本明細書中で使用されるように、「リプレッサータンパク質」又は「インデューサータンパク質」は、調節配列エレメントに結合し、調節配列エレメントに動作的に連結された配列の転写をそれぞれ抑制又は活性化するタンパク質である。本明細書中に記載される好ましいリプレッサー及びインデューサータンパク質は、少なくとも一つの投入剤又は環境投入の存在又は非存在に対して感受性である。本明細書中に記載される好ましいタンパク質は、例えば、分離可能なＤＮＡ結合及び投入剤結合又は応答エレメントもしくはドメインを含む、モジュール式の形態である。
本明細書中で使用されるように、「担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、賦形剤、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド、及び同様のものを含む。医薬的に活性な物質のためのそのような培地及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である。補助的な活性成分をまた、組成物中に組み入れることができる。語句「医薬的に許容可能な」は、宿主に投与された場合に、毒性、アレルギー性、又は類似の有害な反応を産生しない分子実体及び組成物を指す。
本明細書中で使用されるように、「投入薬剤応答性ドメイン」は、連結されたＤＮＡ結合融合ドメインを、その状態又は投入の存在に応答性にする様式において、状態又は投入薬剤に結合する、又はそうでなければそれに応答する転写因子のドメインである。一部の実施形態によると、状態又は投入の存在は、転写因子の転写調節活性を修飾する、投入剤応答ドメインにおける、又はそれが融合されるタンパク質における立体構造変化をもたらす。
用語「インビボ」は、生物、例えば多細胞動物などにおいて、又はその内で生じるアッセイ又はプロセスを指す。本明細書中に記載される態様の一部によると、方法又は使用は、単細胞生物、例えば細菌などが使用される場合に、「インビボ」で生じると言うことができる。用語「エクスビボ」は、特に、多細胞動物又は植物の身体の外側にあるインタクトな膜を伴う生きた細胞、例えば、とりわけ、外植片、初代細胞及び細胞株を含む培養細胞、形質転換細胞株、ならびに血液細胞を含む抽出された組織又は細胞を使用して実施される方法及び使用を指す。用語「インビトロ」は、インタクトな膜を伴う細胞、例えば細胞抽出物などの存在を要求しないアッセイ及び方法を指し、非細胞系、例えば細胞を含まない培地など、又は細胞系、例えば細胞抽出物などにおけるプログラム可能な合成生物学的回路の導入を指すことができる。
用語「プロモーター」は、本明細書中で使用されるように、タンパク質又はＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であることができる、核酸配列の転写を駆動することにより、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモーターは、構成的、誘導的、抑制的、組織特異的、又はそれらの任意の組み合わせであることができる。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始及び速度が制御される核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、調節タンパク質及び分子、例えばＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などが結合することができる遺伝子エレメントを含むことができる。本明細書中に記載される態様の一部の実施形態によると、プロモーターは、プロモーター自体の発現を調節する転写因子の発現を駆動することができる。プロモーター配列内には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出される。真核プロモーターは、しばしば、しかし、必ずしもそうではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含む。誘導性プロモーターを含む、様々なプロモーターを使用して、本明細書中に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の発現を駆動させてもよい。プロモーター配列は、転写開始部位によりその３’末端で境界付けられてもよく、上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基又はエレメントを含み得る。一部の実施形態によると、本開示のプロモーターは肝臓特異的プロモーターである。
本明細書中で使用されるように、用語「エンハンサー」は、核酸配列の転写活性化を増加させるために、一つ又は複数のタンパク質（例、アクチベータータンパク質、又は転写因子）に結合するシス作用調節配列（例、１０～１，５００塩基対）を指す。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流又は遺伝子開始部位の下流に、１，０００，０００塩基対まで位置付けられ得る。エンハンサーは、イントロン領域内、又は無関係な遺伝子のエクソン領域中に位置付けられ得る。
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する又は転写を駆動すると言うことができる。語句「動作可能に連結された」、「動作的に位置付けられた」、「動作的に連結された」、「制御下」、及び「転写制御下」は、プロモーターが、それが、その配列の転写開始及び／又は発現を制御するように調節する核酸配列に関して、正しい機能的位置及び／又は配向にあることを示す。「逆方向プロモーター」は、本明細書中で使用されるように、核酸配列が逆方向にあるプロモーターを指し、コード鎖であったものが、今は非コード鎖であり、その逆もまた同様である。逆方向プロモーター配列は、スイッチの状態を調節するために様々な実施形態において使用されることができる。また、様々な実施形態では、プロモーターは、エンハンサーと併せて使用することができる。
プロモーターは、所与の遺伝子又は配列のコードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置付けられる５’非コード配列を単離することにより得ることができるように、遺伝子又は配列と自然に関連付けられるプロモーターであることができる。そのようなプロモーターは、「内因性」として言及することができる。同様に、一部の実施形態によると、エンハンサーは、核酸配列と自然に関連付けられ、その配列の下流又は上流のいずれかに位置付けられるエンハンサーであることができる。
一部の実施形態では、コード核酸セグメントは、「組換えプロモーター」又は「異種プロモーター」の制御下に位置付けられ、それらの両方が、その天然環境において動作可能に連結されるコード核酸配列と通常関連付けられないプロモーターを指す。組換え又は異種エンハンサーは、その天然環境において所与の核酸配列に通常関連付けられないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターもしくはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサー；任意の他の原核細胞、ウイルス細胞、もしくは真核細胞から単離されたプロモーターもしくはエンハンサー；及び「天然」ではない、即ち、異なる転写調節領域の異なるエレメントを含む合成プロモーターもしくはエンハンサー、及び／又は当技術分野において公知である遺伝子操作の方法を通じて発現を改変させる変異を含むことができる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書中に開示される合成生物学的回路及びモジュールとの関連において、ＰＣＲを含む組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を使用して産生されることができる（例、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照のこと。各々が、参照により本明細書中に組み入れられる）。さらに、非核小器官、例えばミトコンドリア、クロロプラスト、及び同様のもの内の配列の転写及び／又は発現を方向付ける制御配列も用いることができることが企図される。
本明細書中に記載されるように、「誘導性プロモーター」は、インデューサー又は誘導薬剤の存在における、それにより影響される、又はそれにより接触される場合、転写活性を開始又は増強することにより特徴付けられるものである。「インデューサー」又は「誘導薬剤」は、本明細書中に定義されるように、内因性の、又は誘導性プロモーターから転写活性を誘導する際に活性であるような方法において投与される通常外因性の化合物もしくはタンパク質であることができる。一部の実施形態では、インデューサー又は誘導薬剤、即ち、化学物質、化合物、又はタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写又は発現の結果であることができ（即ち、インデューサーは、別の構成要素又はモジュールにより発現されるインデューサータンパク質であることができる）、それは、それ自体がコントロール又は誘導性プロモーター下にあることができる。一部の実施形態によると、誘導性プロモーターは、特定の薬剤、例えばリプレッサーなどの非存在において誘導される。誘導性プロモーターの例は、限定されないが、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳類ウイルス（例、アデノウイルス後期プロモーター；及びマウス乳房腫瘍ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））、ならびに他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーター及び同様のものを含む。
用語「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」は、本明細書中で互換的に使用され、転写及び翻訳制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、及び同様のものなどを指し、非コード配列（例、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）又はコード配列（例、部位特異的修飾ポリペプチド、又はＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供及び／又は調節し、ならびに／あるいはコードされるポリペプチドの翻訳を調節する。
本明細書中で使用される用語「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」は、ペプチド又はタンパク質に翻訳され得るいくつかのヌクレオチドトリプレットの配列を指すことを意味する。オープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン、即ち、アミノ酸メチオニン（ＡＴＧ）を通常コードする三つの後続のヌクレオチドの組み合わせをその５’末端で、及び、３つのヌクレオチドの倍数である長さを通常示す後続の領域を含む。ＯＲＦは、好ましくは、終止コドン（例、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）により終結される。典型的には、これはオープンリーディングフレームの唯一の終止コドンである。このように、本開示の文脈におけるオープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン（例、ＡＴＧ）で開始し、好ましくは停止コドン（例、ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）で終結する、３により割られ得る多数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。オープンリーディングフレームが単離されてもよく、又はそれは、より長い核酸配列中に、例えば、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡベクター中に組み入れられてもよい。
「動作可能に連結された」は、そのように記載された構成要素が、それらが意図された様式において機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えば、プロモーターは、プロモーターがその転写又は発現に影響を及ぼす場合、コード配列に動作可能に連結される。「発現カセット」は、ｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の転写に向けるのに十分なプロモーター又は他の調節配列に動作可能に連結されたＤＮＡ配列を含む。適切なプロモーターは、例えば、組織特異的プロモーターを含む。プロモーターはまた、ＡＡＶ起源であることができる。
本明細書中で使用される用語「対象」は、本開示によるｃｅＤＮＡベクターを用いた、予防的治療を含む治療が提供されるヒト又は動物を指す。本明細書中で使用されるように、用語「対象」はヒト及び他の動物を含む。典型的には、対象はヒトである。例えば、対象は、成人、十代、小児（２歳～１４歳）、乳児（２歳まで出産）、又は新生児（２ヶ月まで）であってもよい。特定の態様では、対象は、４ヶ月齢まで、又は６ヶ月齢までである。一部の態様によると、成人は約６５歳又はそれ以上、あるいは約６０歳又はそれ以上の年輩である。一部の態様によると、対象は、妊娠女性又は妊娠することを意図する女性である。他の態様では、対象は、ヒト、例えば、非ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー、ゴリラ、又はマカクなどではない。特定の態様では、対象は、ペット、例えばイヌ又はネコなどであってもよい。
本明細書中で使用されるように、用語「宿主細胞」は、本開示の核酸構築物又はｃｅＤＮＡ発現ベクターを用いた形質転換、トランスフェクション、形質導入、及び同様のものを受けやすい任意の細胞型を含む。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、ＣＤ３４＋細胞）、誘導多能性幹細胞、又は多数の不死化細胞株（例、ＨｅｐＧ２細胞）のいずれかであり得る。あるいは、宿主細胞は、組織、器官又は生物におけるインサイツ又はインビボ細胞であることができる。
用語「外因性」は、その天然供給源以外の細胞中に存在する物質を指す。本明細書中で使用される用語「外因性」は、ヒトの手を含むプロセスにより、生物学的な系、例えば、通常は見出されず、核酸又はポリペプチドをそのような細胞又は生物中に導入することが望まれる細胞又は生物などの中に導入された核酸（例、ポリペプチドをコードする核酸）又はポリペプチドを指すことができる。あるいは、「外因性」は、ヒトの手を含むプロセスにより、生物学的な系、例えば、比較的少量で見出される細胞又は生物などの中に導入された、及び、細胞又は生物中の核酸又はポリペプチドの量を増加させる、例えば、異所性の発現又はレベルを作製することが望まれる核酸又はポリペプチドを指すことができる。対照的に、用語「内因性」は、生物学的システム又は細胞に天然である物質を指す。
用語「配列同一性」は、二つのヌクレオチド配列間の関連性を指す。本開示の目的のために、二つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，上記）のＮｅｅｄｌｅプログラム、好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降において実装されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、上記）を使用して決定される。使用されるオプションのパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳージョン）置換マトリックスである。「最も長い同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力が、同一性パーセントとして使用され、以下のように算出される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）。アライメントの長さは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。
本明細書中で使用される用語「相同性」又は「相同の」は、配列を整列させ、必要な場合にギャップを導入して最大配列同一性パーセントを達成した後、標的染色体上の対応する配列中のヌクレオチド残基と同一であるヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。ヌクレオチド配列相同性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用して、当技術分野におけるスキル内にある様々な方法において達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適したパラメータを決定することができる。一部の実施形態によると、例えば、相同アームの核酸配列（例、ＤＮＡ配列）は、配列が、宿主細胞の対応する天然又は未編集の核酸配列（例、ゲノム配列）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上同一である場合に、「相同の」と考えられる。
用語「異種」は、本明細書中で使用されるように、天然核酸又はタンパク質においてそれぞれ見出されないヌクレオチド配列又はポリペプチド配列を意味する。異種核酸配列は、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成するために、天然核酸配列（又はそのバリアント）に（例、遺伝子操作により）連結されてもよい。異種核酸配列は、バリアントポリペプチドに連結されて（例、遺伝子操作により）、融合バリアントポリペプチドをコードする核酸配列を生成してもよい。あるいは、用語「異種」は、細胞又は対象において天然には存在しない核酸配列を指してもよい。
「ベクター」又は「発現ベクター」は、レプリコン、例えばプラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、又はコスミドなどであり、別のＤＮＡセグメント、即ち、「挿入物」が、細胞中で付着セグメントの複製をもたらすように付着され得る。ベクターは、宿主細胞への送達のために、又は異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であることができる。本明細書中で使用されるように、ベクターは、ウイルスもしくは非ウイルスの起源及び／又は最終形態であり得るが、しかし、本開示の目的のために、「ベクター」は一般的に、その用語が本明細書中で使用されるように、ｃｅＤＮＡベクターを指す。用語「ベクター」は、適当な制御エレメントと関連付けられる場合に複製が可能であり、遺伝子配列を細胞に移入することができる任意の遺伝子エレメントを包含する。一部の実施形態によると、ベクターは、発現ベクター又は組み換えベクターであることができる。
本明細書中で使用されるように、用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からＲＮＡ又はポリペプチドの発現を方向付けるベクターを指す。発現された配列は、しばしば、細胞に対して異種であるが、しかし、必ずしもそうではない。発現ベクターは、追加のエレメントを含んでもよく、例えば、発現ベクターは、二つの複製系を有してもよく、このように、二つの生物において、例えば、発現のためのヒト細胞において、及びクローニング及び増幅のための原核宿主において維持されることを可能にする。用語「発現」は、ＲＮＡ及びタンパク質を産生すること、ならびに適する場合、タンパク質を分泌することにおいて含まれる細胞プロセスを指し、適用可能な場合、限定されないが、例えば、転写、転写物プロセシング、翻訳及びタンパク質フォールディング、修飾及びプロセシングを含む。「発現産物」は、遺伝子から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳により得られたポリペプチドを含む。用語「遺伝子」は、適した調節配列に作動可能に連結された場合に、インビトロ又はインビボでＲＮＡに転写される（ＤＮＡ）核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域に先行する及び続く領域、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列又は「リーダー」配列及び３’ＵＴＲ配列又は「トレイラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでもよい、又は含まなくてもよい。
「組換えベクター」により、インビボで発現することが可能である異種核酸配列、又は「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。本明細書中に記載されるベクターは、一部の実施形態によると、他の適切な組成物及び治療と組み合わせることができることを理解すべきである。一部の実施形態によると、ベクターはエピソーム性である。適切なエピソームベクターの使用は、対象における目的のヌクレオチドを、高コピー数の染色体外ＤＮＡ中に維持し、それにより、染色体組込みの潜在的な効果を排除する手段を提供する。
本明細書中で使用されるように、用語「投与」、「投与すること」及びそれらのバリアントは、対象中に組成物又は薬剤（例、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡ）を導入することを指し、一つ又は複数の組成物又は薬剤の同時の及び連続的な導入を含む。「投与」は、例えば、治療方法、薬物動態方法、診断方法、研究方法、プラセボ方法、及び実験方法を指すことができる。「投与」はまた、インビトロ治療及びエクスビボ治療を包含する。対象中への組成物又は薬剤の導入は、経口、肺内、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、直腸内、リンパ内、腫瘍内、又は局所的を含む、任意の適切な経路による。投与は自己投与及び別による投与を含む。投与は、任意の適切な経路により行うことができる。適切な投与の経路によって、組成物又は薬剤がその意図される機能を実施することが可能になる。例えば、適切な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物又は薬剤を対象の静脈中に導入することにより投与される。
本明細書中で使用されるように、組成物の投与に「後続する」組成物の投与は、時間間隔が、第一及び第二の組成物が同一である、又は異なっているかにかかわらず、第一の組成物の投与及び第二の組成物の投与の間に経過したことを示す。
本明細書中で使用される用語「感染」は、病原体の宿主への初期侵入；及び病原体が宿主の細胞又は組織中に又はその上に確立されている状態を指す；そのような状態は、必ずしも疾患を構成又はそれに導かない。
本明細書中で使用されるように、用語「生物学的サンプル」は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、炭水化物、及びタンパク質を含む、対象から単離された生物学的起源の任意の種類の材料を指す。用語「生物学的サンプル」は、対象から単離された組織、細胞、及び生物学的流体を含む。生物学的サンプルは、例えば、限定されないが、全血液、血漿、血清、精液、唾液、涙液、尿、糞便材料、汗、口腔、皮膚、脳脊髄液、骨髄、胆汁、毛髪、筋肉生検、器官組織、又は当業者により公知の生物学的起源の他の材料を含む。生物学的サンプルは、診断もしくは研究のために対象から得ることができ、又はコントロールとして、もしくは基礎研究のために健康な対象から得ることができる。本明細書中で使用される用語「用量」は、一度に対象に摂取される又は投与される物質（例、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡ）の量を指す。
用語「用量」は、本明細書中で使用されるように、治療目的（例、処置）を達成するための物質（例、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡ）の投与を指す。
語句「第二の薬剤との組み合わせにおける第一の薬剤」における用語「組み合わせ」は、第一の薬剤及び第二の薬剤の同時投与、それは、例えば、同じ医薬的に許容可能な担体中に溶解もしくは混合され得る、又は第一の薬剤、それに続く第二の薬剤の投与、又は第二の薬剤、それに続く第一の薬剤の投与を含む。本開示は、従って、併用治療処置の方法及び併用医薬組成物を含む。
語句「併用治療処置」における用語「併用」は、第二の薬剤の存在において薬剤を投与することを含む。併用治療処置方法は、第一、第二、第三、又は追加の薬剤が同時投与される方法を含む。併用治療処置方法はまた、第一又は追加の薬剤が第二又は追加の薬剤の存在において投与される方法を含み、それにおいて、第二又は追加の薬剤は、例えば、以前に投与されていてもよい。併用治療処置方法は、異なるアクターにより段階的に実行されてもよい。例えば、一つのアクターが対象に第一の薬剤を投与してもよく、第二のアクターが対象に第二の薬剤を投与してもよく、投与工程は、第一の薬剤（及び追加の薬剤）が、投与後に第二の薬剤（及び追加の薬剤）の存在下にある限り、同時に、又はほぼ同時に、又は離れた時間に実行されてもよい。アクター及び対象は、同じ実体（例、ヒト）であってもよい。
用語「組み合わせ治療」は、本明細書中で使用されるように、二つ以上の治療物質、例えば、本明細書中に記載されるように、抗原、又は免疫原性タンパク質、及び別の薬物の投与を指す。他の薬物は、本明細書中に記載される抗原、又は免疫原性タンパク質の投与と同時に、その前に、又はその後に投与されてもよい。
本明細書中で使用されるように、語句「核酸治療用」、「治療用核酸」、及び「ＴＮＡ」は、互換的に使用され、疾患又は障害を治療するための治療用薬剤の活性成分として核酸を使用する治療剤の任意のモダリティを指す。本明細書中で使用されるように、これらの語句は、ＲＮＡベースの治療薬及びＤＮＡベースの治療薬を指す。ＲＮＡベースの治療薬の非限定的な例は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ＤＮＡベースの治療薬の非限定的な例は、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例、レンチウイルス又はＡＡＶゲノム）又は非ウイルス合成ＤＮＡベクター、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ドギーボーン（商標）ＤＮＡベクター、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、又はダンベル形状ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）を含む。一部の実施形態によると、治療用核酸はｃｅＤＮＡである。
本明細書中で使用されるように、用語「治療効果」は、治療の結果を指し、その結果は、望ましく、かつ有益であると判断される。治療効果は、直接的又は間接的に、疾患徴候の停止、低下、又は排除を含むことができる。治療効果はまた、直接的又は間接的に、疾患徴候の進行の停止低下又は排除を含むことができる。
本明細書中に記載される任意の治療薬剤については、治療有効量は、予備的なインビトロ試験及び／又は動物モデルから最初に決定され得る。治療有効用量はまた、ヒトデータから決定されてもよい。適用用量は、投与された化合物の相対的なバイオアベイラビリティ及び効力に基づいて調整され得る。上に記載される方法及び他の周知の方法に基づいて最大の有効性を達成するために用量を調整することは、通常の当業者の能力内である。参照により本明細書中に組み入れられるＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（２００１）の第１章において見出され得る、治療有効性を決定するための一般的な原則を以下に要約する。
薬物動態原理は、最小限の許容可能な有害効果を伴う所望の程度の治療有効性を得るために、投与レジメンを修正するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度が測定され、治療ウィンドウに関連し得る状況では、投与量変更のための追加のガイダンスを得ることができる。
本明細書中で使用されるように、「ウイルス感染」は、対象の身体中のウイルスの侵入及び増殖を指すことを意味する。
本明細書中で使用される用語「治療」は、（ｉ）従来のワクチンにおけるような感染又は再感染の防止、（ｉｉ）症状の低下又は排除、及び（ｉｉｉ）問題の病原体の実質的又は完全な排除のいずれかを指すことを意味する。治療は、予防的（感染前）又は治療的（感染後）にもたらされ得る。治療することはさらに、（ａ）障害の重症度を低下させること；（ｂ）治療されている障害に特徴的な症状の悪化を限定すること；（ｃ）以前に障害を有していた患者における障害の再発を限定すること；及び（ｄ）以前は障害について無症状であった患者における症状の再発を限定することの一つ又は複数を達成することを指し得る。
有益な又は望ましい臨床結果、例えば薬理学的及び／又は生理学的効果などは、限定されないが、疾患、障害、又は症状に罹りやすいであろうが、しかし、まだ疾患の症状を経験していない、あるいは示していない対象において疾患、障害、又は症状が生じることを防止すること（予防的治療）、疾患、障害、又は症状の緩和、疾患、障害、又は症状の程度の減少、疾患、障害、又は症状の安定化（即ち、悪化していない）、疾患、障害、又は症状の拡大を防止すること、疾患、障害、又は症状の進行を遅延させること又は遅らせること、疾患、障害、又は症状の寛解又は緩和、及びそれらの組み合わせ、ならびに治療を受けていない場合の予測生存期間と比較して生存期間を延長させることを含む。
本明細書中で使用される用語「ワクチン接種される」は、ワクチンを用いて治療されることを指すことを意味する。
本明細書中で使用される用語「ワクチン接種」は、ワクチンを用いた治療を指すことを意味する。
本明細書中で使用される用語「ワクチン」は、脊椎動物に投与されることが可能であり、免疫を誘導する、ならびに／あるいは感染を防止する及び／又は寛解させる、ならびに／あるいは感染の少なくとも一つの症状を低下させる、ならびに／あるいは製剤の別の用量の効力を増強させるのに十分な防御免疫応答を誘導する形態である製剤を指すことを意味する。典型的には、ワクチンは、本開示の組成物が懸濁又は溶解される従来の生理食塩水又は緩衝水溶液媒質を含む。この形態では、本開示の組成物は、ウイルス感染を防止、寛解、又はそうでなければ治療するために便利に使用することができる。宿主中への導入時に、ワクチンは、限定されないが、抗体及び／又はサイトカインの産生、ならびに／あるいは細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞、及び／又は他の細胞応答の活性化を含む免疫応答を誘発することができる。
本明細書中で使用される用語「ワクチン治療」は、腫瘍又は感染性微生物を破壊するために免疫系を刺激するために物質又は物質の群を使用する治療の一種を指すことを意味する。
「治療を必要とする」ものは、疾患もしくは障害、感染、又は癌を既に有する哺乳類、例えばヒトなどを含む。
本明細書中で使用されるように、用語「増加させる」、「増強させる」、「上昇させる」（及び同様の用語）は、一般的に、自然条件、予想条件、又は平均と比べて、あるいはコントロール条件と比べて、直接的又は間接的のいずれかで、濃度、レベル、機能、活性、又は挙動を増加させる行為を指す。
本明細書中で使用されるように、用語「抑制させる」、「減少させる」、「干渉する」、「阻害する」、及び／又は「低下させる」（及び類似の用語）は、一般的に、自然条件、予想条件、又は平均と比べて、あるいはコントロール条件と比べて、直接的又は間接的のいずれかで、濃度、レベル、機能、活性、又は挙動を低下させる行為を指す。
本明細書中で使用されるように、「コントロール」は、参照標準を指すことを意味する。一部の実施形態によると、コントロールは、健康な患者から得られた陰性コントロールサンプルである。他の実施形態では、コントロールは、疾患もしくは障害、感染、又は癌と診断された患者から得られた陽性コントロールサンプルである。さらに他の実施形態では、コントロールは、過去のコントロールもしくは標準的な参照値又は値の範囲（以前にテストされたコントロールサンプル、又はベースライン値もしくは正常値を表すサンプルの群など）である。テストサンプルとコントロールの間の差は、増加又は逆に減少であることができる。差は、定性的差又は定量的差、例えば、統計的に有意な差であることができる。一部の実施例によると、差は、コントロールと比べて、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、又は５００％を超える増加又は減少である。
本明細書中で使用されるように、用語「含んでいる」又は「含む」は、方法又は組成物に必須であるが、しかし、必須であるか否かにかかわらず、特定されていないエレメントの含有に開放的である、組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素への参照において使用される。
本明細書中で使用されるように、用語「本質的になる」は、所与の実施形態のために要求される要素を指す。この用語によって、その実施形態の基本的及び新規又は機能的特徴に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を可能にする。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
用語「からなる」は、実施形態のその記載において列挙されていない任意のエレメントを除く、本明細書中に記載される組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素を指す。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が他を明確に指示しない限り、複数の参照を含む。このように、例えば、「方法」への言及は、本明細書中に記載される種類の、及び／又は本開示等を読み取る際に当業者に明らかになるであろう、一つ又は複数の方法、及び／又は工程を含む。同様に、用語「又は」は、文脈が他に明確に示さない限り、「及び」を含むことが意図される。本明細書中に記載されるものと同様の又は等価の方法及び材料を、本開示の実践又はテストにおいて使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。略語「ｅ．ｇ．」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａから由来し、非限定的な例を示すために本明細書中で使用される。このように、略語「ｅ．ｇ．」は、用語「例えば」と同義である。
操作例における以外、又は他に示される場合、本明細書中で使用される成分又は反応条件の量を表現する全ての数が、全ての場合において用語「約」により修飾されるとして理解されるべきである。パーセンテージへの関連において使用される場合での用語「約」は、±１％を意味することができる。本開示は、以下の実施例によりさらに詳細に説明されるが、しかし、本開示の範囲は、それに限定されるべきではない。
本明細書中に開示される代替的なエレメント又は本開示の実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各群メンバーは、個別に、又は本明細書中に見出される群もしくは他のエレメントの他のメンバーとの任意の組み合わせにおいて参照及び請求されることができる。群の一つ又は複数のメンバーは、利便性及び／又は特許性の理由のために、群中に含まれることができる、又はそれから削除されることができる。任意のそのような包含又は削除が生じる場合、本明細書は、本明細書中で、改変された群を含み、このように、添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュ群の書面による記載を満たすとみなされる。
他の用語は、本開示の様々な態様の記載内で本明細書中に定義される。
本開示の実施形態の記載は、網羅的であること、又は開示される正確な形態に本開示を限定することを意図しない。本開示の特定の実施形態、及びそれについての実施例が、例証の目的のために本明細書中に記載される一方で、様々な等価の改変が、関連技術分野における当業者が認識するであろうように、本開示の範囲内で可能である。例えば、方法の工程又は機能が、所与の順序において提示される一方で、代替的な実施形態が、異なる順序において機能を実施し得る、又は機能が実質的に同時に実施され得る。本明細書中に提供される本開示の教示は、適する場合、他の手順又は方法に適用することができる。本明細書中に記載される様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本開示の態様は、必要な場合、本開示のなおさらなる実施形態を提供するために、上の参考文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いるように改変することができる。さらに、生物学的な機能的等価性の考慮に起因して、一部の変化を、生物学的又は化学的作用に種類又は量において影響を及ぼすことなく、タンパク質構造において作製することができる。これらの及び他の変化は、詳細な記載に照らして本開示に対して作製することができる。全てのそのような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
前述の実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態における要素について組み合わせられる、又は置換されることができる。さらに、本開示の特定の実施形態に関連付けられる利点が、これらの実施形態の文脈において記載されてきた一方で、他の実施形態はまた、そのような利点を示してもよく、全ての実施形態が、本開示の範囲内に入るために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
本明細書中に記載される技術は、以下の実施例によりさらに例証されており、それは、さらに限定しているとして決して解釈されるべきではない。本開示は、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、そのようなものとして変動し得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される用語法は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、特許請求の範囲によりもっぱら定義される本開示の範囲を限定することを意図しない。
ＩＩ．免疫系の細胞
免疫系を含む、多数の細胞相互作用がある。これらの相互作用は、各細胞が、それらのシグナルの時間分布及び空間分布に基づいて指示を受けるように、両方の方向においてシグナルを発する特定の受容体－リガンド対を通じて生じる。
マウスモデルは、免疫調節経路を発見する際に高度に有用であるが、しかし、これらの経路の臨床的有用性は、近交系マウス系統から非近交系ヒト集団に常に翻訳されるわけではない。なぜなら、非近交系ヒト集団は、変動する程度まで、個々の免疫調節経路に頼る個体を有し得るためである。
免疫系の細胞は、リンパ球、単球／マクロファージ、樹状細胞、密接に関連するランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マスト細胞、好塩基球、及び細胞の骨髄系統の他のメンバーを含む。また、一連の特殊上皮細胞及び間質細胞は、しばしば、免疫系の細胞における成長及び／又は遺伝子活性化を調節する重要な因子を分泌することにより、免疫が生じる解剖学的環境を提供し、それはまた、応答の誘導期及びエフェクター期において直接的な役割を果たす。（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９），ａｔ ｐ．１０２）。
免疫系の細胞は、末梢組織化組織、例えば脾臓、リンパ節、腸のパイエル板、及び扁桃などにおいて見出される。リンパ球はまた、中枢リンパ器官、胸腺、及び骨髄において見出され、そこでは、それらは、成熟免疫系の無数の応答を媒介するためにそれらに備える発生工程を受ける。リンパ球及びマクロファージの実質的な部分が、血液及びリンパ中に見出される細胞の再循環プールを含み、それらが必要とされる部位に免疫担当細胞を送達し、局所的に生成される免疫が一般化されることを可能にする手段を提供する。（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９），ａｔ ｐ．１０２）。
用語「リンパ球」は、全身のリンパ組織中で形成される小さな白血球細胞を指し、及び正常な成人において、疾患に対して身体を防御する際に大きな役割を果たす循環血液中の白血球の総数の約２２～２８％を構成する。個々のリンパ球は、それらが、それらの遺伝物質の組み換えを通じて（例、Ｔ細胞受容体及びＢ細胞受容体を作製するために）、構造的に関連する抗原の限定されたセットに応答するようにコミットしているという点で特殊化されている。このコミットメントは、免疫系と所与の抗原との最初の接触前に存在し、リンパ球の表面膜上の抗原上の決定基（エピトープ）について特異的な受容体の存在により表現される。各リンパ球は、受容体の固有の集団を持ち、それらの全てが同一の組み合わせ部位を有する。リンパ球の一つのセット、又はクローンは、その受容体の結合領域の構造において別のクローンとは異なり、このように、それが認識することができるエピトープにおいて異なる。リンパ球は、それらの受容体の特異性だけでなく、しかし、また、それらの機能において互いに異なる。（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９），ａｔ ｐ．１０２）。
二つの広いクラスのリンパ球が認識されている：抗体分泌細胞の前駆体であるＢリンパ球（Ｂ細胞）、及びＴリンパ球（Ｔ細胞）。
Ｂリンパ球
Ｂリンパ球は、骨髄の造血細胞から由来する。成熟Ｂ細胞は、その細胞表面により認識されるエピトープを発現する抗原で活性化されることができる。活性化プロセスは、直接的、抗原による膜Ｉｇ分子の架橋に依存的であり得る（架橋依存的Ｂ細胞活性化）、又は間接的、ヘルパーＴ細胞との相互作用を介し得るが、同族ヘルプとして言及されるプロセス中である。多くの生理学的状況では、受容体架橋刺激及び同族は、相乗作用して、より激しいＢ細胞応答をもたらすのに役立つ（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
架橋依存的Ｂ細胞活性化は、抗原が、細胞表面受容体の結合部位に相補的なエピトープの複数のコピーを発現することを要求する。なぜなら、各Ｂ細胞が、同一の可変領域を伴うＩｇ分子を発現するためである。そのような要件は、反復エピトープ、例えば微生物又はウイルスエンベロープタンパク質のカプセル多糖類などを伴う他の抗原により満たされる。架橋依存的Ｂ細胞活性化は、これらの微生物に対して開始される主要な防御的免疫応答である（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
同族は、Ｂ細胞が、受容体を架橋することができない抗原に対する応答を開始することを可能にすることを助け、同時に、それらが、弱い架橋事象により刺激された場合にＢ細胞を不活性化からレスキューする共刺激シグナルを提供する。同族の助けは、Ｂ細胞の膜免疫グロブリン（Ｉｇ）による抗原の結合、抗原のエンドサイトーシス、及び細胞のエンドソーム／リソソーム区画内のペプチド中へのその断片化に依存的である。結果として得られたペプチドの一部は、クラスＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子として公知の細胞表面タンパク質の特殊化されたセットの溝中に装填される。結果として得られたクラスＩＩ／ペプチド複合体は、細胞表面上に発現され、ＣＤ４＋Ｔ細胞として命名されるＴ細胞のセットの抗原特異的受容体についてのリガンドとして作用する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞のクラスＩＩ／ペプチド複合体について特異的なそれらの表面上に受容体を担持する。Ｂ細胞活性化は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を通じたＴ細胞の結合に依存するだけでなく、しかし、この相互作用によって、また、Ｔ細胞上の活性化リガンド（ＣＤ４０リガンド）が、Ｂ細胞上のその受容体（ＣＤ４０）に結合することが可能になり、Ｂ細胞活性化をシグナル伝達する。また、Ｔヘルパー細胞は、Ｂ細胞上のサイトカイン受容体に結合することにより、刺激されたＢ細胞の成長及び分化を調節するいくつかのサイトカインを分泌する（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，“Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
抗体産生のための同族補助の間に、ＣＤ４０リガンドは、活性化ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞上で一過性に発現され、それは、抗原特異的Ｂ細胞上のＣＤ４０に結合し、それにより、第二の共刺激シグナルを形質導入する。後者のシグナルは、抗原に遭遇した生殖細胞中心Ｂ細胞のアポトーシスを防止することにより、Ｂ細胞の成長及び分化のために、ならびにメモリーＢ細胞の生成のために不可欠である。Ｂ細胞及びＴ細胞の両方におけるＣＤ４０リガンドの過剰発現が、ヒトＳＬＥ患者における病原性自己抗体産生において関与する（Ｄｅｓａｉ－Ｍｅｈｔａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，“Ｈｙｐｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４０ ｌｉｇａｎｄ ｂｙ Ｂ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｕｐｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌ．９７（９），２０６３－２０７３，（１９９６））。
Ｔリンパ球
造血組織中の前駆体から由来するＴリンパ球は、胸腺において分化を受け、次に末梢リンパ組織に及びリンパ球の再循環プールに播種される。Ｔリンパ球又はＴ細胞は、広範な免疫機能を媒介する。これらは、Ｂ細胞が抗体産生細胞に発生するのを助ける能力、単球／マクロファージの微生物殺菌作用を増加させる能力、特定の種類の免疫応答の阻害、標的細胞の直接殺傷、及び炎症応答の動員を含む。これらの効果は、特定の細胞表面分子のＴ細胞発現及びサイトカインの分泌に依存する（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
Ｔ細胞は、抗原認識のそれらの機構においてＢ細胞とは異なる。免疫グロブリンは、Ｂ細胞の受容体であり、可溶性分子上の又は粒子表面上の個々のエピトープに結合する。Ｂ細胞受容体は、天然分子の表面上に発現されるエピトープを見る。抗体及びＢ細胞受容体は、細胞外液中の微生物に結合し、微生物に対して防御するように進化した一方で、Ｔ細胞は、他の細胞の表面上の抗原を認識し、これらの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の挙動と相互作用し、それを改変させることにより、それらの機能を媒介する。末梢リンパ器官において、Ｔ細胞を活性化することができる三つの主な種類のＡＰＣがある：樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞。これらのうちの最も強力なものは、樹状細胞であり、その唯一の機能は、Ｔ細胞に外来抗原を提示することである。未成熟樹状細胞は、皮膚、腸、及び気道を含む全身の組織において位置付けられる。それらが、これらの部位で、侵入する微生物に遭遇すると、それらは、病原体及びそれらの産物をエンドサイトーシスし、それらを、リンパを介して局所リンパ節又は腸関連リンパ器官に運ぶ。病原体との遭遇によって、樹状細胞が、抗原捕捉細胞から、Ｔ細胞を活性化することができるＡＰＣに成熟するように誘導する。ＡＰＣは、Ｔ細胞を活性化してエフェクター細胞になる役割を有する三つの種類のタンパク質分子をそれらの表面上に呈する：（１）Ｔ細胞受容体に外来抗原を提示するＭＨＣタンパク質；（２）Ｔ細胞表面上の相補的受容体に結合する共刺激性タンパク質；及び（３）Ｔ細胞が、活性化されるのに十分な期間にわたりＡＰＣに結合することを可能にする細胞－細胞接着分子（“Ｃｈａｐｔｅｒ ２４：Ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，（２００２））。
Ｔ細胞は、それらが発現する細胞表面受容体に基づいて、二つの別個のクラスに細分化される。Ｔ細胞の大部分が、α鎖及びβ鎖からなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。Ｔ細胞の小さな群は、γ鎖及びδ鎖で作製された受容体を発現する。α／β Ｔ細胞の間に、二つのサブ系統がある：コア受容体分子ＣＤ４を発現するもの（ＣＤ４＋Ｔ細胞）及びＣＤ８を発現するもの（ＣＤ８＋Ｔ細胞）。これらの細胞は、それらが抗原をどのように認識するか、ならびにそれらのエフェクター及び調節機能において異なる。
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫系の主要な調節性細胞である。それらの調節機能は、それらの細胞表面分子、例えばＴ細胞が活性化された場合に発現が誘導されるＣＤ４０リガンドなどの発現、及び活性化された場合にそれらが分泌する幅広いサイトカインの両方に依存する。
Ｔ細胞はまた、重要なエフェクター機能を媒介し、その一部は、それらが分泌するサイトカインのパターンにより決定される。サイトカインは、標的細胞に直接的に毒性があり得る、及び強力な炎症機構を動員し得る。
また、Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＴＬにより認識される抗原を発現する標的細胞を効率的に溶解することが可能な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に発生することができる（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、クラスＩＩ又はクラスＩのＭＨＣタンパク質の特殊溝に結合された抗原のタンパク質分解により由来するペプチドからなる複合体を認識する。ＣＤ４＋Ｔ細胞はペプチド／クラスＩＩ複合体のみを認識する一方で、ＣＤ８＋Ｔ細胞はペプチド／クラスＩ複合体を認識する（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
ＴＣＲのリガンド（即ち、ペプチド／ＭＨＣタンパク質複合体）は、ＡＰＣ内に作製される。一般的に、クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、ＡＰＣによりエンドサイトーシスプロセスを通じて取り込まれたタンパク質から由来するペプチドに結合する。これらのペプチド担持クラスＩＩ分子は次に、細胞の表面上に発現され、ここで、それらは、発現された細胞表面複合体を認識することが可能なＴＣＲを伴うＣＤ４＋Ｔ細胞により結合されるために利用可能である。このように、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞外供給源から由来する抗原と反応するように特殊化される（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
対照的に、クラスＩ ＭＨＣ分子は、主に、内部合成タンパク質、例えばウイルスタンパク質などから由来するペプチドが装填される。これらのペプチドは、プロテオソームによるタンパク質分解により細胞質タンパク質から産生され、粗面小胞体中に転座される。そのようなペプチドは、一般的に９アミノ酸長で構成され、クラスＩ ＭＨＣ分子中に結合し、細胞表面に運ばれ、ここで、それらは、適した受容体を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されることができる。これによって、Ｔ細胞系、特にＣＤ８＋Ｔ細胞、生物の残りの細胞（例、ウイルス抗原）又は変異抗原（例えば活性癌遺伝子産物など）のものとは異なる、あるいはそれらよりもずっと多い量で産生されるタンパク質を発現する細胞を検出する能力が与えられるが、それらのインタクトな形態におけるこれらのタンパク質が、細胞表面上で発現されず、分泌されない場合もある（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
Ｔ細胞はまた、ヘルパーＴ細胞；細胞免疫を誘導する際に含まれるＴ細胞；サプレッサーＴ細胞；及び細胞傷害性Ｔ細胞としてのそれらの機能に基づいて分類されることができる。
ヘルパーＴ細胞
ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞を刺激して、タンパク質及び他のＴ細胞依存的抗原に対する抗体応答を作るＴ細胞である。Ｔ細胞依存的抗原は、個々のエピトープが、一回のみ又は限定された回数で出現する免疫原であって、それらが、Ｂ細胞の膜免疫グロブリン（Ｉｇ）を架橋できないようにする、又は非効率的に架橋するようにする。Ｂ細胞は、それらの膜Ｉｇを通じて抗原に結合し、複合体はエンドサイトーシスを受ける。エンドソーム区画及びリソソーム区画内で、抗原はタンパク質分解酵素によりペプチドに断片化され、生成されたペプチドの一つ又は複数が、クラスＩＩ ＭＨＣ分子中に充填され、それは、この小胞区画を通じて移動する。結果として得られたペプチド／クラスＩＩ ＭＨＣ複合体を次に、Ｂ細胞表面膜にエクスポートする。ペプチド／クラスＩＩ分子複合体について特異的な受容体を伴うＴ細胞は、Ｂ細胞表面上のこの複合体を認識する。（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９））。
Ｂ細胞活性化は、そのＴＣＲを通じたＴ細胞の結合、及びＢ細胞上でのＣＤ４０とのＴ細胞ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の相互作用の両方に依存する。Ｔ細胞は、ＣＤ４０Ｌを構成的に発現しない。むしろ、ＣＤ４０Ｌ発現は、Ｔ細胞のＴＣＲ及びＣＤ８０又はＣＤ８６により認識される同族抗原の両方を発現するＡＰＣとの相互作用の結果として誘導される。ＣＤ８０／ＣＤ８６は一般的に、活性化Ｂ細胞により発現されるが、しかし、休止中のＢ細胞により発現されず、活性化Ｂ細胞及びＴ細胞を含むヘルパー相互作用によって、効率的な抗体産生に導くことができるようにする。多くの場合では、しかし、Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌの初期誘導は、ＣＤ８０／８６を構成的に発現するＡＰＣ、例えば樹状細胞などの表面上の抗原のそれらの認識に依存的である。そのような活性化ヘルパーＴ細胞は次に、Ｂ細胞と効率的に相互作用し、Ｂ細胞を助けることができる。Ｂ細胞上の膜Ｉｇの架橋は、非効率的であっても、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用と相乗作用して、激しいＢ細胞活性化をもたらし得る。発現されるＩｇクラスの増殖、Ｉｇ分泌、及びクラススイッチングを含むＢ細胞応答におけるその後の事象は、Ｔ細胞由来サイトカインの作用に依存する、又はそれにより増強される、のいずれかである（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、サイトカインＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６及びＩＬ－１０を主に分泌する細胞（ＴＨ２細胞）に、又はＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、及びリンホトキシンを主に産生する細胞（ＴＨ１細胞）に分化する傾向がある。ＴＨ２細胞は、Ｂ細胞が抗体産生細胞に発生するのを助ける際に非常に有効であるのに対し、ＴＨ１細胞は、単球及びマクロファージの微生物殺菌活性の増強、及び結果として細胞内小胞区画において微生物を溶解する際での増加した効率を含む、細胞免疫応答の効果的なインデューサーである。ＴＨ２細胞の表現型を伴うＣＤ４＋Ｔ細胞（即ち、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６及びＩＬ－１０）は効率的なヘルパー細胞であるが、ＴＨ１細胞はまた、ヘルパーとなる能力を有する（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，“Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
細胞免疫誘導におけるＴ細胞関与
Ｔ細胞はまた、細胞内微生物を破壊する単球及びマクロファージの能力を増強するように作用し得る。特に、ヘルパーＴ細胞により産生されるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）は、単核食細胞が細胞内細菌及び寄生虫を破壊するいくつかの機構を増強し、一酸化窒素の生成及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）産生の誘導を含む。ＴＨ１細胞は、微生物殺菌作用を増強する際に有効である。なぜなら、それらは、ＩＦＮ－γを産生するためである。対照的に、ＴＨ２細胞により産生される主要なサイトカインの二つ、ＩＬ－４及びＩＬ－１０は、これらの活性を遮断する（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞
免疫恒常性は、免疫応答の開始と下方制御の間での制御されたバランスにより維持される。アポトーシス及びＴ細胞アネルギー（Ｔ細胞が、抗原遭遇後に本質的に機能的に不活化される寛容機構（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．，“Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｅｒｇｙ”，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２１：３０５－３３４（２００３））の両方の機構が、免疫応答の下方調節に寄与する。第三の機構が、サプレッサー細胞又は調節性ＣＤ４＋ Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞による活性化Ｔ細胞の能動的抑制により提供される（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｓｅｌｆ－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４３５：５９８－６０４（２００５）において概説されている）。ＩＬ－２受容体アルファ（ＩＬ－２Ｒα）鎖（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）を構成的に発現するＣＤ４＋Ｔｒｅｇは、アネルギー性及び抑制性である天然Ｔ細胞サブセットである（Ｔａａｍｓ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ ａｎｅｒｇｉｃ／ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ：ａ ｈｉｇｈｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｐｒｏｎｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．３１：１１２２－１１３１（２００１））。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの枯渇は、マウスにおける全身自己免疫疾患をもたらす。さらに、これらのＴｒｅｇの移行は、自己免疫疾患の発生を防止する。ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇは、それらのマウスの対応物と同様に、胸腺において生成され、細胞－細胞接触依存的機構を通じてレスポンダーＴ細胞の増殖を抑制する能力、ＩＬ－２を産生することができないこと、及びインビトロでのアネルギー性表現型により特徴付けられる。ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＣＤ２５発現のレベルに従って、抑制性（ＣＤ２５ｈｉｇｈ）細胞及び非抑制性（ＣＤ２５ｌｏｗ）細胞に分割することができる。転写因子のフォークヘッドファミリーのメンバーであるＦＯＸＰ３は、マウス及びヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇにおいて発現されることが示されており、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ発生を制御するマスター遺伝子であるように見える（Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ａｎｄ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７７：８３３８－８３４７，（２００６））。
細胞傷害性Ｔリンパ球
標的細胞内で産生されたタンパク質からのペプチドを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞は、それらが、標的細胞の溶解に導くことにおいて細胞傷害性特性を有する。ＣＴＬ誘導性溶解の機構は、標的細胞の膜中に挿入され、その細胞の溶解を促進することができる分子であるパーフォリンのＣＴＬによる産生を含む。パーフォリン媒介性溶解は、活性化ＣＴＬにより産生される一連の酵素であるグランザイムにより増強される。多くの活性ＣＴＬはまた、それらの表面上に大量のｆａｓリガンドを発現する。ＣＴＬの表面上のｆａｓリガンドと、標的細胞の表面上のｆａｓとの相互作用は、標的細胞におけるアポトーシスを開始し、これらの細胞の死に導く。ＣＴＬ媒介性溶解は、ウイルス感染細胞の破壊のための主要な機構であるように見える。
リンパ球活性化
用語「活性化」又は「リンパ球活性化」は、ＲＮＡ、タンパク質及びＤＮＡの合成ならびにリンホカインの産生をもたらす特定の抗原、非特異的マイトジェン、又は同種細胞によるリンパ球の刺激を指し；その後に様々なエフェクター細胞及びメモリー細胞の増殖及び分化が続く。Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、クラスＩ又はクラスＩＩのＭＨＣ分子の溝において結合されたペプチドであるその同族リガンドとの相互作用に依存的である。受容体会合により動かされる分子事象は複雑である。最も早期の工程の中で、いくつかのシグナル伝達経路を制御する基質のセットのチロシンリン酸化に導くチロシンキナーゼの活性化であるように見える。これらは、ＴＣＲをｒａｓ経路に連結するアダプタータンパク質のセット、ホスホリパーゼＣγ１を含み、そのチロシンリン酸化は、その触媒活性を増加させ、イノシトールリン脂質代謝経路を会合し、細胞内遊離カルシウム濃度の上昇及びタンパク質キナーゼＣの活性化、ならびに細胞成長及び分化を制御する一連の他の酵素に導く。Ｔ細胞の完全な応答性は、受容体会合に加えて、補助的な細胞送達共刺激活性、例えば、ＡＰＣ上のＣＤ８０及び／又はＣＤ８６ によるＴ細胞上のＣＤ２８の会合を要求する。
Ｔメモリー細胞
適応免疫応答を通じた病原体の認識及び根絶後、Ｔ細胞の大多数（９０～９５％）がアポトーシスを受け、残りの細胞がメモリーＴ細胞のプール、指定されたセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、及び常在メモリーＴ細胞（ＴＲＭ）を形成する（Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ．，“Ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，７，２６９ｒｖ１，（２０１５））。ＣＤ４５ＲＡは、ナイーブＴ細胞、ならびにＣＤ４及びＣＤ８の両方におけるエフェクター細胞上で発現される。抗原経験後、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯの発現を得て、ＣＤ４５ＲＡの発現を失う。このように、ＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ４５ＲＯのいずれかを使用して、ナイーブ集団をメモリー集団から一般的に区別する。ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌは、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞を区別するために使用することができる二つの他のマーカーである。ナイーブ細胞及びセントラルメモリー細胞は、二次リンパ器官に移動するためにＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌを発現する。このように、ナイーブＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋であり、セントラルメモリーＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋であり、エフェクターメモリーＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－ＣＤ６２Ｌ－である。
標準Ｔ細胞と比較して、これらのメモリーＴ細胞は、別個の表現型、例えば特定の表面マーカーの発現、異なるサイトカインプロファイルの迅速な産生、直接エフェクター細胞機能の能力、及び固有のホーミング分布パターンなどを伴って長寿命である。メモリーＴ細胞は、攻撃者の再感染を排除し、それにより、免疫系のバランスを迅速に回復させるために、それらのそれぞれの抗原への再曝露時に急速な反応を示す。増加するエビデンスによって、自己免疫メモリーＴ細胞が自己免疫疾患を治療又は治癒する大半の試みを妨げることが実証されている（Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ．，“Ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７，２６９ｒｖ１，（２０１５））。
ＩＩＩ．ＤＮＡベクターからのペプチドの発現
本明細書中で提供するのは、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導する方法であって、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ＤＮＡを含むプライミングワクチンを対象に投与すること、それにおいて、ＤＮＡが第一のペプチドをコードし；及び（ｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）、又は（ｉｉ）第二のペプチドを含むブースティングワクチンを対象に投与すること、それにおいて、ＲＮＡが第二のペプチドをコードし、それにより、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導すること、を含む。
また、提供されるのは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ＤＮＡを含むプライミングワクチンであって、ＤＮＡが第一のペプチドをコードするプライミングワクチン；及び（ｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）、又は（ｉｉ）第二のペプチドを含むブースティングワクチンであって、ＲＮＡが第二のペプチドをコードするブースティングワクチンを含むワクチンレジメンである。
一部の実施形態によると、プライミングワクチンは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形状ＤＮＡ、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの形態におけるＤＮＡを含む。一部の実施形態によると、プライミングワクチンは、プラスミドの形態におけるＤＮＡを含む。一部の実施形態によると、プライミングワクチンは、ｃｅＤＮＡの形態におけるＤＮＡを含む。
一部の実施形態では、プライミングワクチンは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形状ＤＮＡ、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの形態におけるＤＮＡを含み、ブースティングワクチンはＲＮＡ（例、ｍＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態によると、プライミングワクチンは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形状ＤＮＡ、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの形態におけるＤＮＡを含み、ブースティングワクチンはペプチドを含む。
ＤＮＡプラスミド
一部の実施形態によると、プライミングワクチンは、免疫応答が望まれる選択された抗原をコードする核酸配列を含むＤＮＡプラスミドの形態におけるＤＮＡを含む。プラスミドでは、選択された抗原は、哺乳類細胞又は脊椎動物細胞におけるその発現を指示する調節配列の制御下にある。
プラスミド自体の構成要素は、当技術分野において公知である。
本発明において有用な非ウイルスプラスミドベクターは、選択された抗原、例えば、本明細書中に記載される抗原をコードするＤＮＡ配列を含む単離及び精製されたＤＮＡ配列を含む。ＤＮＡ分子は、外因性又は異種の核酸配列をコードするように設計された、ウイルス又は非ウイルス、例えば、細菌種から由来してもよい。そのようなプラスミド又はベクターは、ウイルス又はファージからの配列を含み得る。様々な非ウイルスベクターが当技術分野において公知であり、限定されないが、プラスミド、細菌ベクター、バクテリオファージベクター、「ネイキッド」ＤＮＡ、及びカチオン性脂質又はポリマーと凝縮されたＤＮＡを含み得る。
細菌ベクターの例は、限定されないが、とりわけ、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、サルモネラ、赤癬菌、大腸菌、及びリステリアから由来する配列を含む。適切なプラスミドベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫ３７、ｐＫＣ１０１、ｐＡＣ１０５、ｐＶＡ５１、ｐＫＨ４７、ｐＵＢ１１０、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、Ｃｏｌ Ｅｌ、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３１３、ｐＭＬ２１、ＲＳＦ２１２４、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ｐＢＡＤ１８、及びｐＢＲ３２８を含む。
適切な誘導性エシェリキア・コリ発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｇｅｎｅ，６９：３０１－３１５）、アラビノース発現ベクター（例、ｐＢＡＤ１８、Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：４１２１－４１３０）、及びｐＥＴＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８５：６０－８９）を含む。
所望の哺乳類又は脊椎動物宿主における抗原の発現を駆動するプロモーター及び他の調節配列は、同様に、その目的のために有用であることが公知であるプロモーターの広範なリストから選択され得る。様々なそのようなプロモーターが以下に開示される。例示的なプロモーターは、限定されないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー（例、米国特許第５，１６８，０６２号及び第５，３８５，８３９号において記載される、ならびにＳＣＭＶプロモーターエンハンサーを含む。
核酸配列、分子、又はベクター中での包含のための追加の調節配列は、限定されないが、エンハンサー配列、ポリアデニル化配列、スプライスドナー配列及びスプライスアクセプター配列、翻訳されるポリペプチドのそれぞれ開始及び終了時に位置付けられる転写開始及び終結のための部位、転写領域中での翻訳のためのリボソーム結合部位、エピトープタグ、核局在化配列、ＩＲＥＳエレメント、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ－Ｈｏｇｎｅｓｓ「ＴＡＴＡ」エレメント、制限酵素切断部位、選択マーカー及び同様のものを含む。エンハンサー配列は、例えば、ＳＶ４０ ＤＮＡの７２ｂｐタンデム反復又はレトロウイルスの長末端反復もしくはＬＴＲなどを含み、転写効率を増加させるために用いられる。
ＤＮＡプラスミドにおいて有用なこれらの他の構成要素、例えば、複製起源、ポリアデニル化配列（例、ＢＧＨポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ）、薬物耐性マーカー（例、カナマイシン耐性）、及び同様のものを含む、がまた、当技術分野において周知の配列の中から選択され得る。
プロモーター及び他の共通ベクターエレメントの選択は従来的であり、多くのそのような配列が、本発明において有用なプラスミドを設計するために利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）、及び、それにおいて引用されている参考文献、例えば、３．１８～３．２６及び１６．１７～１６．２７頁、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。プラスミドの全ての構成要素が、当業者により、当技術分野における公知の材料の中から容易に選択され、医薬品業界から入手可能であり得る。
本明細書中に記載されるプライミングワクチンにおいて使用され得る適切なＤＮＡプラスミド構築物の例が、以下の特許公開において詳細に示されており、それらは、国際特許公開第Ｗ０９８／１７７９９、Ｗ０９９／４３８３９、及びＷ０９８／１７７９９；ならびに米国特許第５，５９３，９７２号；第５，８１７，６３７号；第５，８３０，８７６号；及び第５，８９１，５０５号であり、参照によりそれらの全体において本明細書中に組み入れられる。
ｃｅＤＮＡベクター
一部の実施形態によると、本明細書中に記載される技術は、一般的に、一つ又は複数の非ウイルスＤＮＡベクター、例えば、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡベクターからの細胞における抗原の発現及び／又は産生に向けられる。抗原の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、「一般的に、ｃｅＤＮＡベクター」と称されるセクションにおいて本明細書中に記載されている。以前に考察したように、従来のＡＡＶベクター、及びさらにレンチウイルスベクターを上回るｃｅＤＮＡベクターの明確な利点は、ペプチド（例、抗原）をコードする一つ又は複数の核酸配列についてのサイズ制約がないことである。当業者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、多数のペプチド抗原を使用して、一度、本明細書中に提供される教示を備えれば、ほぼ無限の様々なｃｅＤＮＡベクターを産生することができることを理解するであろう。
一部の実施形態では、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、一対のＩＴＲ（例、本明細書中に記載される対称又は非対称）を含み、本明細書中に記載されるＩＴＲ対、抗原、又は免疫原性ペプチドをコードする核酸の間にあり、プロモーター配列又は調節配列に動作的に連結されている。従来のＡＡＶベクター、及びさらにレンチウイルスベクターを上回る抗原、又は免疫原性ペプチドの発現のためのｃｅＤＮＡベクターの明確な利点は、所望の抗原、又は免疫原性ペプチドをコードする核酸配列についてのサイズ制約がないことである。
理解されるであろうように、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡベクター技術は、任意のレベルの複雑さに適応されることができる、又はモジュラー様式において使用されることができ、ここで、ｃｅＤＮＡベクターの異なる構成要素の発現は、独立した様式において制御されることができる。以下の実施形態は、本明細書中で具体的に企図され、望ましいように当業者により適応されることができる。
一部の態様によると、本開示は、抗原をコードする一つ又は複数の核酸配列を含む一つ又は複数のｃｅＤＮＡベクターを提供する。一部の実施形態によると、一つ又は複数の核酸配列は、例えば、細菌、ウイルス、真菌、及び寄生虫感染因子を含む、様々な病原体からの一つ又は複数のペプチド（例、抗原）をコードする。一部の実施形態によると、一つ又は複数の核酸配列は、癌又は癌関連抗原である一つ又は複数のペプチド（例、抗原）をコードする。一部の実施形態によると、抗原又は免疫原性ペプチドは腫瘍抗原である。一部の実施形態によると、一つ又は複数の核酸配列は、自己免疫状態、例えば関節リウマチ（ＲＡ）又は多発性硬化症（ＭＳ）などに関連付けられる一つ又は複数のペプチド（例、抗原）をコードする。一部の実施形態によると、抗原は、自己免疫障害もしくは状態、感染因子により誘発される自己免疫疾患などに、又は感染性疾患もしくは病原体に関連する抗原である。
癌又は腫瘍関連抗原
一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡは、癌又は腫瘍関連抗原をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡは、癌抗原ペプチドデータベースから選択される一つ又は複数の抗原をコードする核酸配列を含み、ｃａｐｅｄ．ｉｃｐ．ｕｃｌ．ａｃ．ｂｅ／ａｂｏｕｔで公的に利用可能である。このデータベースは、特定された各抗原についての、ペプチド配列及びタンパク質配列中のその位置を含む。
一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡは、以下の表１中に示される抗原の一つ又は複数から選択される腫瘍関連抗原をコードする核酸配列を含む。
Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データセットの最近の分析によって、腫瘍のゲノム環境が腫瘍免疫と関連し、Ｔ細胞応答を駆動する際でのネオアンチゲン負荷を暗示しており（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ｍａｙ；２４（５）：７４３－５０，２０１４）、免疫浸潤に関連付けられる体細胞変異を特定している（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３ Ｓｅｐ １５；１９（１８）：４９５１－６０，２０１３）。Ｒｏｏｎｅｙら（２０１５年１月１５日；１６０（１－２）：４８－６１）は、ネオアンチゲン及びウイルスが細胞溶解活性を駆動する可能性が高いことを示唆し、腫瘍が免疫攻撃に抵抗することを可能にする公知の新規変異を明らかにしている。
一部の実施形態では、抗原は、対象において癌細胞から特定されたネオアンチゲンである。一部の実施形態では、ネオアンチゲンは共有ネオアンチゲンである。ネオアンチゲンを特定する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第１０，０５５，５４０号において記載されており、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。ネオアンチゲン性ポリペプチド及び共有ネオアンチゲン性ポリペプチドが、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３３４５２、米国公開第２０１８００５５９２２号、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｈａｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６ Ａｕｇ；４１：９８－１０３）、Ｇｕｂｉｎ，ＭＭ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ．２０１４ Ｎｏｖ ２７；５１５（７５２８）：５７７－８１）、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５ Ａｐｒ ３；３４８（６２３０）：６９－７４）、Ｏｔｔ ＰＡ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１７ Ｊｕｌ １３；５４７（７６６２）：２１７－２２１において記載されており、それらの全てが、参照によりそれらの全体において本明細書中に組み入れられる。
したがって、一部の実施形態では、抗原はネオアンチゲンポリペプチドである。一部の実施形態では、この抗原は、Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＴＳＮＡｄｂ ｖ１．０）において示されており；ｂｉｏｐｈａｒｍ．ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｔｓｎａｄｂで入手可能であり、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６（２０１８）２７６－２８２において記載されているネオアンチゲンポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原は、米国特許第１０，０５５，５４０号において示されるネオアンチゲンポリペプチドであって、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
自己免疫疾患抗原
一部の実施形態によると、抗原は自己免疫疾患に関連付けられる。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡは、以下の表２中のものから選択される一つ又は複数の抗原をコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態によると、自己免疫疾患は感染因子により誘発される。一部の実施形態によると、本開示は、感染因子に関連付けられる、又はそれにより誘発される自己免疫疾患又は障害を治療するための一つ又は複数のペプチド（例、抗原）をコードする核酸配列を含む、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡを提供する。感染因子に関連付けられる、又はそれにより誘発される例示的な自己免疫疾患又は障害を表３中に提供する。
感染性疾患
一部の実施形態によると、本開示は、感染性疾患を治療するための一つ又は複数のペプチド（例、抗原）をコードする核酸配列を含む、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡを提供する。一部の実施形態によると、抗原は、病原体又は感染因子の抗原（ここで、病原体及び感染因子は、本明細書中で互換的に使用される）、例えば、ウイルス病原体、細菌病原体、真菌病原体、又は寄生虫病原体である。
一部の実施形態によると、抗原はウイルス抗原である。一部の実施形態によると、本開示は、一つ又は複数のウイルス抗原をコードする核酸配列を含む、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡを提供する。
ウイルス感染は、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、エプスタインバールウイルス、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、水痘・帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞性ウイルス、パピローマウイルス、狂犬病ウイルス、及び風疹ウイルスを含む。他のウイルス標的は、パラミクソウイルス科（例、ニューモウイルス、モルビリウイルス、メタニューモウイルス、レスピロウイルス又はルブラウイルス）、アデノウイルス科（例、アデノウイルス）、アレナウイルス科（例、アレナウイルス、例えばリンパ球性絨毛髄膜炎ウイルスなど）、アルテリウイルス科（例、ブタ呼吸器・生殖症候群ウイルス又はウマ動脈炎ウイルス）、ブニヤウイルス科（例、フレボウイルス又はハンタウイルス）、カリシウイルス科（例、ノーウォークウイルス）、コロナウイルス科（例、コロナウイルス又はトロウイルス）、フィロウイルス科（例、エボラ様ウイルス）、フラビウイルス科（例、ヘパシウイルス又はフラビウイルス）、ヘルペスウイルス科（例、単純ウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、又はリンホクリプトウイルス）、オルトミクソウイルス科（例、インフルエンザウイルス又はトゴトウイルス）、パルボウイルス科（例、パルボウイルス）、ピコルナウイルス科（例、エンテロウイルス又は肝ウイルス）、ポックスウイルス科（例、オルトポックスウイルス、アビポックスウイルス、又はレポリポックスウイルス）、レトロウイルス科（例、レンチウイルス又はスプーマウイルス）、レオウイルス科（例、ロタウイルス）、ラブドウイルス科（例、リッサウイルス、ノビラブドウイルス、又はベジクロウイルス）、及びトガウイルス科（例、アルファウイルス又はルビウイルス）。これらのウイルスの具体的な例は、ヒト呼吸器コロナウイルス、インフルエンザウイルスＡ～Ｃ、肝炎ウイルスＡ～Ｇ、及び単純ヘルペスウイルス１～９を含む。
例示的なウイルス病原体を以下の表４中に示す。
一部の実施形態によると、本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９を治療するための一つ又は複数のペプチド（例、抗原）をコードする核酸配列を含む、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡを提供する。一部の実施形態によると、核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする。
スパイクタンパク質は、細胞表面タンパク質へのコロナウイルスの結合を促進するＳ１サブユニットを含む。したがって、スパイクタンパク質のＳ１サブユニットは、どの細胞がコロナウイルスにより感染されるかを制御する。スパイクタンパク質はまた、Ｓ２サブユニットを含み、それは、ウイルス及び細胞膜融合を促進する膜貫通サブユニットである。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１の完全なゲノムが、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＭＮ９０８９４７．３として示されている。野生型スパイク糖タンパク質（Ｓ）のアミノ酸配列を、配列番号＿＿として以下に示す：
一部の実施形態によると、ペプチドは、安定化された前融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（２Ｐ））である。
一部の実施形態によると、ペプチドは細菌抗原である。一部の実施形態によると、本開示は、一つ又は複数の細菌抗原をコードする核酸配列を含む、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡを提供する。
細菌感染症は、限定されないが、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノレア、レジオネラ、ビブリオ・コレラエ、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミデス、シュードモナス・エルギノーサ、コリネバクテリウム・ジフテリア、クロストリジウム属、腸内毒素原性エシェリキア・コリ、バチルス・アントラシス、リケッチア、バルトネラ・ヘンセラ、バルトネラ・キンタナ、コクシエラ・ブルネッティ、クラミジア、マイコバクテリウム・レプラエ、サルモネラ；シゲラ；エルシニア・エンテロコリチカ；エルシニア・シュードツベルクローシス；レジオネラ・ニューモフィラ；マイコバクテリウム・ツベルクローシス；リステリア・モノサイトゲネス；マイコプラズマ属；シュードモナス・フルオレセンス；ビブリオ・コレラエ；ヘモフィルス・インフルエンザエ；バチルス・アントラシス；梅毒トレポネーマ；レプトスピラ；ボレリア；コリネバクテリウム・ジフテリア；フランシセラ；ブルセラ・メリテンシス；カンピロバクター・ジェジュニ；エンテロバクター；プロテウス・ミラビリス；プロテウス；及びクレブシエラ・ニューモニエを含む。
例示的な細菌感染を以下の表５中に示す。
一部の実施形態によると、抗原は真菌抗原又は免疫原性ペプチドである。一部の実施形態によると、本開示は、一つ又は複数の真菌抗原をコードする核酸配列を含む、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡを提供する。
例示的な真菌感染を以下の表６中に示す。
一部の実施形態によると、ペプチドは寄生虫抗原である。一部の実施形態によると、本開示は、一つ又は複数の真菌抗原をコードする核酸配列を含む、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡを提供する。
例示的な寄生虫感染症を以下の表７中に示す。
他の疾患及び障害は、本開示のｃｅＤＮＡベクターによる治療のために企図される。例は、限定されないが、心血管疾患及び免疫疾患を含む。
例えば、抗原の公知の及び／又は公的に利用可能なタンパク質配列を取り、ｃＤＮＡ配列を逆操作して、そのようなタンパク質をコードすることは、当業者の能力の十分に範囲内である。
ＩＶ．抗原の産生における使用のためのｃｅＤＮＡベクター
本開示の実施形態は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ＤＮＡを含むプライミングワクチンを含む方法及び組成物に基づいており、それにおいて、ＤＮＡは、ペプチドを発現することができる閉端直線二本鎖（ｃｅＤＮＡ）ベクターである。本明細書中に記載されるように、ペプチド（例、抗原）は、例えば、細菌、ウイルス、真菌及び寄生虫感染因子、又は癌もしくは癌関連抗原、又は同様のものを含む、様々な病原体から選択されてもよい。さらに他の標的は、自己免疫状態、例えば関節リウマチ（ＲＡ）又は多発性硬化症（ＭＳ）などを含み得る。
一部の実施形態によると、導入遺伝子は、抗原をコードする核酸配列である。ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、分子、例えば発現カセットなどの少なくとも一部分にわたって二本鎖、例えば自己相補的である（例、ｃｅＤＮＡは二本鎖円形分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合的に閉じた末端を有し、このように、エクソヌクレアーゼ消化（例、エクソヌクレアーゼＩ又はエクソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して、例えば、３７℃で１時間にわたって耐性である。
一般的に、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’～３’方向において、第一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的の核酸配列（例えば、本明細書中に記載される発現カセット）、及び第二のＡＡＶ ＩＴＲを含む。以下のいずれかから選択されるＩＴＲ配列：（ｉ）少なくとも一つのＷＴ ＩＴＲ及び少なくとも一つの修飾ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例、非対称修飾ＩＴＲ）；（ｉｉ）二つの修飾ＩＴＲ、ここで、ｍｏｄ－ＩＴＲ対が、互いに対して異なる三次元空間構成を有する（例、非対称修飾ＩＴＲ）、又は（ｉｉｉ）対称な、もしくは実質的に対称なＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、ここで、各ＷＴ－ＩＴＲが、同じ三次元空間構成を有する、又は（ｉｖ）対称な、もしくは実質的に対称な修飾ＩＴＲ対、ここで、各ｍｏｄ－ＩＴＲは、同じ三次元空間構成を有する。
本明細書中で包含されるのは、送達システム、例えば、限定されないが、リポソームナノ粒子送達システムなどをさらに含み得るペプチド（例、抗原）の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む方法及び組成物である。使用のために包含される非限定的な例示的なリポソームナノ粒子系が、本明細書中に開示される。一部の態様によると、本開示は、ｃｅＤＮＡ及びイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、本プロセスにより得られたｃｅＤＮＡベクターで作製され、充填された脂質ナノ粒子製剤は、２０１８年９月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２において開示されており、それは本明細書中に組み入れられる。
本明細書中に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間により課されるパッケージング制約を有さない。ｃｅＤＮＡベクターは、封入ＡＡＶゲノムとは対照的に、原核生物産生プラスミドＤＮＡベクターの生存可能な真核生物産生代替物を表す。これによって、制御エレメント、例えば、本明細書中に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子などの挿入が可能になる。
参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる国際公開第ＷＯ／２０１９／０５１２５５号の図１Ａ～１Ｅは、ペプチド（例、抗原）の発現のための非限定的な例示的なｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡプラスミドの対応する配列の概略図を示す。ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、カプシド不含であり、この順序において：第一のＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第二のＩＴＲをコードするプラスミドから得ることができる。発現カセットは、導入遺伝子の発現を可能にする及び／又は制御する一つ又は複数の調節配列を含んでもよく、例えば、ここで、発現カセットは、この順序において：エンハンサー／プロモーター、ＯＲＦレポーター（導入遺伝子）、転写後調節エレメント（例、ＷＰＲＥ）、ならびにポリアデニル化及び終結シグナル（例、ＢＧＨポリＡ）の一つ又は複数を含むことができる。
発現カセットはまた、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）及び／又は２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントは、限定されないが、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節可能エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーを含む。一部の実施形態によると、ＩＴＲは、導入遺伝子のためのプロモーターとして作用することができる。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは、ペプチド（例、抗原）の発現を制御及び調節するための導入遺伝子の発現を調節するための追加的な構成要素、例えば、調節スイッチを含み、また、望ましい場合には、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするためのキルスイッチである調節スイッチを含むことができる。
発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド超、１０，０００ヌクレオチド超もしくは２０，０００ヌクレオチド超、又は３０，０００ヌクレオチド超、又は４０，０００ヌクレオチド超もしくは５０，０００ヌクレオチド超、又は約４０００～１０，０００ヌクレオチドもしくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの間の任意の範囲、又は５０，０００ヌクレオチド超を含むことができる。一部の実施形態によると、発現カセットは、５００～５０，０００ヌクレオチドの長さの範囲中にある導入遺伝子を含むことができる。一部の実施形態によると、発現カセットは、５００～７５，０００ヌクレオチドの長さの範囲中にある導入遺伝子を含むことができる。一部の実施形態によると、発現カセットは、５００～１０，０００ヌクレオチドの長さの範囲中にある導入遺伝子を含むことができる。一部の実施形態によると、発現カセットは、１０００～１０，０００ヌクレオチドの長さの範囲中にある導入遺伝子を含むことができる。一部の実施形態によると、発現カセットは、５００～５，０００ヌクレオチドの長さの範囲中にある導入遺伝子を含むことができる。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド形成ＡＡＶベクターのサイズ限定を有さず、このように、大サイズ発現カセットの送達を可能にして、効率的な導入遺伝子発現を提供する。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは原核生物特異的メチル化を欠いている。
本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの発現カセット、発現構築物中に提供される配列は、標的宿主細胞についてコドン最適化されることができる。本明細書中で使用されるように、用語「コドン最適化された」又は「コドン最適化」は、天然配列（例、原核生物配列）の少なくとも一つ、二つ以上、又は有意な数のコドンを、その脊椎動物の遺伝子においてより高頻度に又は最も高頻度に使用されるコドンで置換することにより、目的の脊椎動物、例えば、マウス又はヒトの細胞における増強発現のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種が、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを示す。典型的には、コドン最適化によって、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列は改変されない。最適化されたコドンは、例えば、Ａｐｔａｇｅｎ’ｓ ＧＥＮＥ ＦＯＲＧＥ（登録商標）コドン最適化及びカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２１９０ Ｆｏｘ Ｍｉｌｌ Ｒｄ．Ｓｕｉｔｅ ３００，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．２０１７１）又は別の公的に入手可能なデータベースを使用して決定することができる。一部の実施形態によると、核酸は、ヒト発現のために最適化される。
本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためにｃｅＤＮＡベクターにより発現される導入遺伝子は、抗原をコードする。プラスミドベースの発現ベクターとは異なるｃｅＤＮＡベクターの多くの構造的特徴がある。ｃｅＤＮＡベクターは、以下の特徴の一つ又は複数を持ち得る：元の（即ち、挿入されていない）細菌ＤＮＡの欠如、原核生物複製起点の欠如、自己含有であること、即ち、それらは、二つのＩＴＲ以外の配列を要求せず、Ｒｅｐ結合部位及び末端分解部位（ＲＢＳ及びＴＲＳ）を含むこと、ＩＴＲ間の外因性配列、ヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、及び哺乳類宿主により異常とみなされる細菌型ＤＮＡメチル化又は実際に任意の他のメチル化の非存在。一般的に、本ベクターは、任意の原核生物ＤＮＡを含まないことが好ましいが、しかし、一部の原核生物ＤＮＡは、プロモーター領域又はエンハンサー領域における非限定的な例として、外因性配列として挿入され得ることが企図される。ｃｅＤＮＡベクターをプラスミド発現ベクターから区別する別の重要な特徴は、ｃｅＤＮＡベクターが、閉端を有する一本鎖直鎖ＤＮＡである一方で、プラスミドが常に二本鎖ＤＮＡであることである。
本明細書中に提供される方法により産生されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、制限酵素消化アッセイにより決定されるように、非連続構造ではなく、直線状及び連続構造を有する（例、国際公開第ＷＯ／２０１９／０５１２５５号の図４Ｄを参照のこと。参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる）。直線構造及び連続構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃からより安定しており、ならびに組換えられて、変異誘発を起こす可能性が低いと考えられる。このように、直線構造及び連続構造におけるｃｅＤＮＡベクターが好ましい実施形態である。連続的で直線状の一本鎖分子内二本鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列を伴わずに、共有結合的に結合された末端を有することができる。これらのｃｅＤＮＡベクターは、プラスミド（本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なり、それは、細菌起源の環状二本鎖核酸分子である。プラスミドの相補鎖は、変性後に分離されて二つの核酸分子を産生し得るのに対し、対照的に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有する一方で、単一のＤＮＡ分子であり、従って、変性した場合でさえ、単一の分子のままである。一部の実施形態によると、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核型のＤＮＡ塩基メチル化を伴うことなく産生されることができる。従って、ｃｅＤＮＡベクター及びｃｅＤＮＡプラスミドは、構造（特に、直線状対円形）の点で、また、これらの異なる物体（以下を参照）を産生及び精製するために使用される方法の観点で、また、ｃｅＤＮＡ－プラスミドについての原核生物型及びｃｅＤＮＡベクターについての真核生物型であるそれらのＤＮＡメチル化の観点で異なっている。
プラスミドベースの発現ベクターからのペプチド（例、抗原）の発現のためにｃｅＤＮＡベクターを使用することにはいくつかの違いがあり、そのような違いは、限定されないが、以下を含む：１）プラスミドは細菌ＤＮＡ配列を含み、原核生物特異的メチル化、例えば、６－メチルアデノシン及び５－メチルシトシンメチル化に供されるのに対し、カプシド不含ＡＡＶベクター配列は真核生物起源であり、原核生物特異的メチル化を受けない；結果的に、カプシド不含ＡＡＶベクターは、プラスミドと比較して、炎症応答及び免疫応答を誘導する可能性が低い；２）環状プラスミドは、細胞中への導入時に核に送達されず、細胞ヌクレアーゼによる分解を迂回するために過負荷を要求する一方で、ｃｅＤＮＡベクターはウイルスシスエレメントを含み、即ち、ＩＴＲ、それらは、ヌクレアーゼに対する耐性を付与し、標的化されて核に送達されるように設計することができる。
逆位末端反復（ＩＴＲ）
本明細書中に開示されるように、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、二つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた導入遺伝子又は核酸配列を含み、ここで、ＩＴＲ配列は、これらの用語が本明細書中に定義されるように、非対称ＩＴＲ対又は対称な、もしくは実質的に対称なＩＴＲ対であることができる。本明細書中に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、以下のいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含むことができる：（ｉ）少なくとも一つのＷＴ ＩＴＲ及び少なくとも一つの修飾ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例、非対称修飾ＩＴＲ）；（ｉｉ）二つの修飾ＩＴＲ、ここで、ｍｏｄ－ＩＴＲ対が、互いに対して異なる三次元空間構成を有する（例、非対称修飾ＩＴＲ）、又は（ｉｉｉ）対称な、もしくは実質的に対称なＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、ここで、各ＷＴ－ＩＴＲは、同じ三次元空間構成を有し、又は（ｉｖ）対称な、もしくは実質的に対称な修飾ＩＴＲ対、ここで、各ｍｏｄ－ＩＴＲは、同じ三次元空間構成を有し、ここで、本開示の方法は、送達システム、例えば、限定されないが、リポソームナノ粒子送達システムなどをさらに含み得る。
一部の実施形態によると、ＩＴＲ配列は、パルボウイルス科のウイルスからであることができ、それは二つの亜科を含む：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科、及び昆虫に感染するデンソウイルス亜科。パルボウイルス亜科（パルボウイルスとして言及される）は、ディペンドウイルス属を含み、そのメンバーは、大半の条件下で、生産的感染のためにヘルパーウイルス、例えばアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどとの共感染を要求する。ディペンドウイルス属は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、それは、通常、ヒト（例、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５、及び６）又は霊長類（例、血清型１及び４）に感染し、ならびに他の温血動物（例、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）に感染する関連ウイルスを含む。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーは、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｈａｐｔｅｒ ６９ ｉｎ ＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ（３ｄ Ｅｄ．１９９６）において一般的に記載されている。
本明細書中で及び本明細書中の実施例において例示されるＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＷＴ－ＩＴＲである一方で、当業者は、上述のように、任意の公知のパルボウイルス、例えば、ディペンドウイルス、例えばＡＡＶ（例、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ １１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノム。例、ＮＣＢＩ：ＮＣ ００２０７７；ＮＣ ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ ００６２６０；ＮＣ ００６２６１）からのＩＴＲ、キメラＩＴＲ、又は任意の合成的ＡＡＶからのＩＴＲを使用することができる。一部の実施形態によると、ＡＡＶは、温血動物、例えば、鳥類（ＡＡＡＶ）、ウシ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルスに感染することができる。一部の実施形態によると、ＩＴＲは、Ｂ１９パルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ ０００８８３）、マウスからの微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ ００１５１０）；ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ ００１７０１）；ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ ００６１４８）からである。一部の実施形態によると、５’ＷＴ－ＩＴＲは、一つの血清型から、３’ＷＴ－ＩＴＲは、異なる血清型からであることができ、本明細書中で考察されるとおりである。
当業者は、ＩＴＲ配列が、典型的にはＴ字形状又はＹ字形状のヘアピン構造である二本鎖のホリデイジャンクションの共通構造を有することを認識しており（例、国際公開第ＷＯ／２０１９／０５１２５５号の図２Ａ及び図３Ａを参照のこと。参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる）、ここで、各ＷＴ－ＩＴＲは、より大きなパリンドロームアーム（Ａ－Ａ’）中に埋め込まれた二つのパリンドロームアーム又はループ（Ｂ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’）、及び一本鎖Ｄ配列（ここで、これらのパリンドローム配列の順序は、ＩＴＲのフリップ又はフロップ方向を定義する）により形成される。例えば、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１－ＡＡＶ６）からのＩＴＲの構造分析及び配列比較を参照のこと。Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６－４３９；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５；３６４－３７９；Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９；２６１；８－１４において記載されている。当業者は、本明細書中に提供される例示的なＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に基づいて、ｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡプラスミドにおける使用のために、任意のＡＡＶ血清型からＷＴ－ＩＴＲ配列を容易に決定することができる。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６－４３９において記載される異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ６、ならびにトリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）及びウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ））からのＩＴＲの配列比較を参照のこと；それらは、他の血清型：ＡＡＶ－１（８４％）、ＡＡＶ－３（８６％）、ＡＡＶ－４（７９％）、ＡＡＶ－５（５８％）、ＡＡＶ－６（左ＩＴＲ）（１００％）、及びＡＡＶ－６（右ＩＴＲ）（８２％）からの左ＩＴＲに対するＡＡＶ２の左ＩＴＲの同一性％を示す。
対称ＩＴＲ対
一部の実施形態によると、本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向において、第一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、目的の核酸配列（例えば、本明細書中に記載される発現カセット）及び第二のＡＡＶ ＩＴＲを含み、ここで、第一のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに関して対称である、又は実質的に対称である－すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、対称的な三次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含むことができ、それらの構造は、幾何学的空間において同じ形状である、又は３Ｄ空間において同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する。そのような実施形態では、対称なＩＴＲ対、又は実質的に対称なＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾ＩＴＲ（例、ｍｏｄ－ＩＴＲ）であることができる。ｍｏｄ－ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの一つ又は複数の修飾を有し、互いの逆相補（逆方向）である同じ配列を有することができる。代替的な実施形態では、修飾ＩＴＲ対は、本明細書中で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾ＩＴＲ対は、異なる配列を有するが、しかし、対応する又は同じ対称三次元形状を有することができる。
（ｉ）野生型ＩＴＲ
一部の実施形態によると、対称なＩＴＲ、又は実質的に対称なＩＴＲは、本明細書中に記載される野生型（ＷＴ－ＩＴＲ）である。すなわち、両方のＩＴＲは野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型からのＷＴ－ＩＴＲでなくてもよい。すなわち、一部の実施形態によると、一つのＷＴ－ＩＴＲは一つのＡＡＶ血清型からであることができ、他のＷＴ－ＩＴＲは異なるＡＡＶ血清型からであることができる。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書中で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、一つ又は複数の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる一方で、対称な三次元空間構成を依然として保持する。
したがって、本明細書中に開示されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、二つの隣接する野生型逆位末端反復（ＷＴ－ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた導入遺伝子又は核酸配列を含み、それらは、互いの逆相補体（逆位）である、又は代替的に、互いに対して実質的に対称である－すなわち、ＷＴ－ＩＴＲ対は、対称な三次元空間構成を有する。一部の実施形態によると、野生型ＩＴＲ配列（例、ＡＡＶ ＷＴ－ＩＴＲ）は、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；例、ＡＡＶ２、配列番号＿＿についての５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’）及び機能的末端分解部位（ＴＲＳ；例、５’－ＡＧＴＴ－３’、配列番号＿＿）を含む。
一部の態様によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、二つのＷＴ逆位末端反復配列（ＷＴ－ＩＴＲ）（例、ＡＡＶ ＷＴ－ＩＴＲ）の間に動作的に位置付けられた核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから入手可能である。すなわち、両方のＩＴＲは野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型からのＷＴ－ＩＴＲでなくてもよい。すなわち、一部の実施形態によると、一つのＷＴ－ＩＴＲは一つのＡＡＶ血清型からであることができ、他のＷＴ－ＩＴＲは異なるＡＡＶ血清型からであることができる。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書中で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、一つ又は複数の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる一方で、対称な三次元空間構成を依然として保持する。一部の実施形態によると、５’ＷＴ－ＩＴＲは、一つのＡＡＶ血清型からであり、３’ＷＴ－ＩＴＲは、同じ又は異なるＡＡＶ血清型からである。一部の実施形態によると、５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ－ＩＴＲは、互いの鏡像であり、すなわち、それらは対称である。一部の実施形態によると、５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ－ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型からである。
ＷＴ ＩＴＲは周知である。一部の実施形態によると、二つのＩＴＲは、同じＡＡＶ２血清型からである。特定の実施形態では、他の血清型からのＷＴを使用することができる。相同である多数の血清型があり、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８である。一部の実施形態によると、密接に相同なＩＴＲ（例、類似のループ構造を伴うＩＴＲ）を使用することができる。別の実施形態では、より多様であるＡＡＶ ＷＴ ＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ２及びＡＡＶ５を使用することができ、さらに別の実施形態では、実質的にＷＴであるＩＴＲを使用することができる－すなわち、それはＷＴの基礎ループ構造を有するが、しかし、特性を改変させない、又はそれに影響を及ぼさない一部の保存的ヌクレオチド変化を有する。同じウイルス血清型からのＷＴ－ＩＴＲを使用する場合、一つ又は複数の調節配列をさらに使用してもよい。特定の実施形態では、調節配列は、ｃｅＤＮＡの活性、例えば、コードされた抗原、又は免疫原性ペプチドの発現の調節を可能にする調節スイッチである。
一部の実施形態によると、本明細書中に記載される技術の一態様は、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターに関し、それにおいて、このｃｅＤＮＡベクターは、二つの野生型逆末端反復配列（ＷＴ－ＩＴＲ）の間に動作可能に位置付けられた、例えば、ＨＣ及び／又はＬＣをコードする少なくとも一つの核酸配列を含み、それにおいて、ＷＴ－ＩＴＲが、同じ血清型、異なる血清型からである、又は互いに関して実質的に対称である（即ち、対称的な三次元空間構成を有し、それらの構造が幾何学的空間中で同じ形状である、又は３Ｄ空間中で同じＡ、Ｃ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’ループを有するようにする）ことができる。一部の実施形態によると、対称ＷＴ－ＩＴＲは、機能的末端分解部位及びＲｅｐ結合部位を含む。一部の実施形態によると、核酸配列は導入遺伝子をコードし、それにおいて、ベクターはウイルスカプシド中にない。
一部の実施形態によると、ＷＴ－ＩＴＲは同じであるが、しかし、互いの逆相補である。例えば、５’ＩＴＲ中の配列ＡＡＣＧは、対応する部位での３’ＩＴＲ中のＣＧＴＴ（即ち、逆相補）であってもよい。一部の実施例によると、５’ＷＴ－ＩＴＲセンス鎖は、ＡＴＣＧＡＴＣＧの配列を含み、対応する３’ＷＴ－ＩＴＲセンス鎖は、ＣＧＡＴＣＧＡＴ（即ち、ＡＴＣＧＡＴＣＧの逆相補）を含む。一部の実施形態によると、ＷＴ－ＩＴＲ ｃｅＤＮＡは、末端分解部位及び複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）（時折、複製タンパク質結合部位として言及される）、例えば、Ｒｅｐ結合部位をさらに含む。
ＷＴ－ＩＴＲを含むペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための例示的なＷＴ－ＩＴＲ配列を、本明細書中の表８において示し、それは、ＷＴ－ＩＴＲの対（５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ－ＩＴＲ）を示す。
例示的な例として、本開示は、調節スイッチを伴う又は伴わない、導入遺伝子（例、核酸配列）に動作可能に連結されたプロモーターを含むペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを提供し、ここで、ｃｅＤＮＡはカプシドタンパク質を欠いており、（ａ）ＷＴ－ＩＴＲをコードするｃｅＤＮＡプラスミドから産生され（例、国際公開第ＷＯ／２０１９／０５１２５５号の図１Ｆ～１Ｇを参照のこと。参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる）、ここで、各ＷＴ－ＩＴＲは、そのヘアピン二次配置において同数の分子内二本鎖塩基対を有する（好ましくは、これらの参照配列と比較して、この配置における任意のＡＡＡ又はＴＴＴ末端ループの欠失を除外する）、及び（ｂ）実施例１における天然ゲル及び変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるｃｅＤＮＡの特定のためのアッセイを使用して、ｃｅＤＮＡとして特定される。
一部の実施形態によると、隣接するＷＴ－ＩＴＲは、互いに実質的に対称である。この実施形態では、５’ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶの一つの血清型、３’ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶの異なる血清型からであることができ、ＷＴ－ＩＴＲは同一の逆相補体ではないようにする。例えば、５’ＷＴ－ＩＴＲはＡＡＶ２から、３’ＷＴ－ＩＴＲは異なる血清型（例、ＡＡＶ１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２）からであることができる。一部の実施形態によると、ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、又は昆虫ＡＡＶのいずれかから選択される二つの異なるパルボウイルスから選択することができる。一部の実施形態によると、ＷＴ ＩＴＲのそのような組み合わせは、ＡＡＶ２及びＡＡＶ６からのＷＴ－ＩＴＲの組み合わせである。一部の実施形態によると、実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、一つが他のＩＴＲに対して反転している場合、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一であり、少なくとも ９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．９９．５％及びそれらの間における全ての点であり、同じ対称な三次元空間構成を有する。一部の実施形態によると、ＷＴ－ＩＴＲ対は実質的に対称である。なぜなら、それらは対称的な三次元空間構成を有し、例えば、Ａ、Ｃ－Ｃ’、Ｂ－Ｂ’、及びＤアームの同じ３Ｄ構成を有する。一部の実施形態によると、実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ対は、他に対して反転しており、互いに少なくとも９５％同一であり、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．９９．５％及びそれらの間における全ての点であり、一つのＷＴ－ＩＴＲは、５´－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３´（配列番号６０）のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）及び末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する。一部の実施形態によると、実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ対は、互いに対して反転しており、互いに少なくとも９５％同一であり、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．．９９．５％及びそれらの間における全ての点であり、一つのＷＴ－ＩＴＲは、５´－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３´（配列番号＿＿）のＲｅｐ 結合部位（ＲＢＳ）及び末端分解部位（ｔｒｓ）、ならびに、また、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変回文配列を保持する。相同性は、当技術分野において周知の標準的な手段、例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、デフォルト設定でのＢＬＡＳＴＮなどにより決定することができる。
一部の実施形態によると、ＩＴＲの構造的エレメントは、ＩＴＲと、大きなＲｅｐタンパク質（例、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８）との機能的相互作用において含まれる任意の構造的エレメントであることができる。特定の実施形態では、構造的エレメントは、ＩＴＲと、大きなＲｅｐタンパク質との相互作用に対する選択性を提供し、即ち、Ｒｅｐタンパク質がＩＴＲと機能的に相互作用することを少なくとも部分的に決定する。他の実施形態では、構造的エレメントは、Ｒｅｐタンパク質がＩＴＲに結合される場合、大きなＲｅｐタンパク質と物理的に相互作用する。各構造的エレメントは、例えば、ＩＴＲの二次構造、ＩＴＲの核酸配列、二つ以上のエレメント間の間隔、又は上のいずれかの組み合わせであることができる。一部の実施形態によると、構造的エレメントは、Ａ及びＡ’アーム、Ｂ及びＢ’アーム、Ｃ及びＣ’アーム、Ｄアーム、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＥ）及びＲＢＥ’（即ち、相補的ＲＢＥ配列）、ならびに末端分解能部位（ｔｒｓ）からなる群から選択される。
例としてのみ、表８は、ＷＴ－ＩＴＲの例示的な組み合わせを示す。
表８：同じ血清型もしくは異なる血清型、又は異なるパルボウイルスからのＷＴ－ＩＴＲの例示的な組み合わせ。示される順序は、ＩＴＲ位置を示しておらず、例えば、「ＡＡＶ１、ＡＡＶ２」は、ｃｅＤＮＡが、５’位置においてＷＴ－ＡＡＶ１ ＩＴＲ、及び３’位置においてＷＴ－ＡＡＶ２ ＩＴＲ、又はその逆、５’位置においてＷＴ－ＡＡＶ２ ＩＴＲ、及び３’位置においてＷＴ－ＡＡＶ１ ＩＴＲを含むことができることを実証する。略語：ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型３（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、又はＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）；ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノム（例、ＮＣＢＩ：ＮＣ ００２０７７；ＮＣ ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ ００６２６０；ＮＣ ００６２６１）、温血動物（トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）、ウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、及びヒツジＡＡＶ）からのＩＴＲ、Ｂ１９パルボウイルスからのＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ ０００８８３）、マウスからの微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ ００１５１０）；ガチョウ：ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ ００１７０１）；ヘビ：ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ ００６１４８）。
例としてのみ、表９は、一部の異なるＡＡＶ血清型からの例示的なＷＴ－ＩＴＲの配列を示す。
一部の実施形態によると、ＷＴ－ＩＴＲ配列の核酸配列は、（例、１、２、３、４、もしくは５、又はそれ以上のヌクレオチド、あるいはその任意の範囲を修飾することにより）修飾することができ、それにより、修飾は、相補的ヌクレオチドについての置換、例えば、ＣについてのＧ、及びその逆、ＡについてのＴ、及びその逆である。
本開示の特定の実施形態では、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、以下のいずれかから選択される核酸配列からなるＷＴ－ＩＴＲを有さない：配列番号１、２、５～１４。本開示の代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、以下のいずれかから選択される核酸配列を含むＷＴ－ＩＴＲを有し：配列番号１、２、５～１４、次に、隣接するＩＴＲがまた、ＷＴであり、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、本明細書中に及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６において開示されるように、調節スイッチを含む（例、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表１１を参照のこと。参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる）。一部の実施形態によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書中に開示される調節スイッチ、及び以下からなる群のいずれかから選択される核酸配列を有する選択されたＷＴ－ＩＴＲを含む：配列番号１、２、５～１４。
本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、動作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、及びＲＢＥ´部分を保持するＷＴ－ＩＴＲ構造を含むことができる。図２Ａ及び図２Ｂは、例示的な目的のために野生型ＩＴＲを使用して、ｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造部分内のｔｒｓ部位の動作のための一つの可能な機構を示す。一部の実施形態によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；ＡＡＶ２についての５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号＿＿））及び末端分解部位（ＴＲＳ；５’－ＡＧＴＴ（配列番号＿＿））を含む一つ又は複数の機能的ＷＴ－ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態によると、少なくとも一つのＷＴ－ＩＴＲは機能的である。代替的な実施形態では、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターが、互いに実質的に対称である二つのＷＴ－ＩＴＲを含む場合、少なくとも一つのＷＴ－ＩＴＲは機能的であり、少なくとも一つのＷＴ－ＩＴＲは非機能的である。
非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターについての一般的な修飾ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）
本明細書中で考察されるように、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対称ＩＴＲ対又は非対称ＩＴＲ対を含むことができる。両方の実例では、ＩＴＲの一つ又は両方は、修飾ＩＴＲであることができ、違いは、第一の実例（即ち、対称ｍｏｄ－ＩＴＲ）では、ｍｏｄ－ＩＴＲが、同じ三次元空間構成を有する（即ち、同じＡ－Ａ’、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’アーム配置を有する）ことであるのに対し、第二の実例（即ち、非対称ｍｏｄ－ＩＴＲ）では、ｍｏｄ－ＩＴＲは、異なる三次元空間構成を有する（即ち、Ａ－Ａ’、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’アームの異なる配置を有する）ことである。
一部の実施形態によると、修飾ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ配列（例、ＡＡＶ ＩＴＲ）と比較して、欠失、挿入、及び／又は置換により修飾されるＩＴＲである。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクター中のＩＴＲの少なくとも一つは、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；例、ＡＡＶ２についての５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’）及び機能的末端分解部位（ＴＲＳ；例、５’－ＡＧＴＴ－３’）を含む。一部の実施形態によると、ＩＴＲの少なくとも一つは、非機能的ＩＴＲである。一部の実施形態によると、異なる又は修飾されたＩＴＲは、各々、異なる血清型からの野生型ＩＴＲではない。
ＩＴＲにおける特定の改変及び変異は、本明細書中に詳細に記載されているが、しかし、ＩＴＲ、「改変」、又は「変異」、又は「修飾」の文脈において、それは、ヌクレオチドが野生型配列、参照配列、又は元のＩＴＲ配列に対して挿入、欠失、及び／又は置換されたことを示す。改変又は変異ＩＴＲは、操作されたＩＴＲであることができる。本明細書中で使用されるように、「操作された」は、人の手により操作された態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも一つの態様、例えば、その配列が、それが自然界において存在する態様とは異なるように人の手により操作された場合に、操作されると考えられる。
一部の実施形態によると、ｍｏｄ－ＩＴＲは合成的であってもよい。一部の実施形態によると、合成的ＩＴＲは、二つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づく。別の実施形態では、合成的ＩＴＲは、ＡＡＶベースの配列を含まない。さらに別の実施形態では、合成的ＩＴＲは、上に記載されるＩＴＲ構造を保存するが、ＡＡＶ供給源配列の一部のみを有する、又は全く有さない。一部の態様によると、合成的ＩＴＲは、特定の血清型の野生型ＲｅｐもしくはＲｅｐと優先的に相互作用し得る、又は一部の例によると、野生型Ｒｅｐにより認識されず、変異Ｒｅｐによってのみ認識される。
当業者は、公知の手段により、他の血清型における対応する配列を決定することができる。例えば、変化がＡ領域、Ａ’領域、Ｂ領域、Ｂ’領域、Ｃ領域、Ｃ’領域、又はＤ領域にあるか否かを決定し、別の血清型における対応する領域を決定する。ＢＬＡＳＴ（登録商標）（基本ローカルアライメント検索ツール）又は他の相同アライメントプログラムをデフォルトの状態で使用して、対応する配列を決定することができる。本開示はさらに、異なるＡＡＶ血清型の組み合わせからのｍｏｄ－ＩＴＲを含む、集団及び複数のｃｅＤＮＡベクターを提供する。すなわち、一つのｍｏｄ－ＩＴＲは一つのＡＡＶ血清型からであることができ、他のｍｏｄ－ＩＴＲは異なる血清型からであることができる。理論により拘束されることを望まないが、一部の実施形態によると、一つのＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列からであることができる、又はそれに基づくことができ、ｃｅＤＮＡベクターの他のＩＴＲは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、又はＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）の任意の一つ又は複数のＩＴＲ配列からであることができる、又はそれに基づくことができる。
任意のパルボウイルスＩＴＲを、ＩＴＲとして、又は修飾のためのベースＩＴＲとして使用することができる。好ましくは、パルボウイルスはディペンドウイルスである。より好ましくは、ＡＡＶ。選ばれる血清型は、血清型の組織指向性に基づくことができる。ＡＡＶ２は広範な組織指向性を有し、ＡＡＶ１は、神経筋及び骨格筋を優先的に標的化し、ＡＡＶ５は、神経、網膜色素上皮、及び光受容体を優先的に標的化する。ＡＡＶ６は、骨格筋及び肺を優先的に標的化する。ＡＡＶ８は、肝臓、骨格筋、心臓、及び膵臓組織を優先的に標的化する。ＡＡＶ９は、肝臓、骨格、及び肺組織を優先的に標的化する。一部の実施形態によると、修飾ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲに基づく。
より具体的には、特定の大きなＲｅｐタンパク質と機能的に相互作用する構造的エレメントの能力は、構造的エレメントを修飾することにより改変させることができる。例えば、構造的エレメントの核酸配列は、ＩＴＲの野生型配列と比較して修飾されることができる。一部の実施形態によると、ＩＴＲの構造的エレメント（例、Ａアーム、Ａ’アーム、Ｂアーム、Ｂ’アーム、Ｃアーム、Ｃ’アーム、Ｄアーム、ＲＢＥ、ＲＢＥ’、及びｔｒｓ）は、除去され、異なるパルボウイルスからの野生型構造的エレメントと置換されることができる。例えば、置換構造は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、又は昆虫ＡＡＶからであることができる。例えば、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲであることができ、Ａ又はＡ’アーム又はＲＢＥは、ＡＡＶ５からの構造的エレメントで置換されることができる。別の例では、ＩＴＲは、ＡＡＶ５ ＩＴＲであることができ、Ｃ又はＣ’アーム、ＲＢＥ、及びｔｒは、ＡＡＶ２からの構造的エレメントで置換されることができる。別の例では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ Ｂ及びＢ’アームで置換されたＢ及びＢ’アームを伴うＡＡＶ５ ＩＴＲであることができる。
一例としてのみ、表１０は、修飾ＩＴＲの領域中での少なくとも一つのヌクレオチドの例示的な修飾（例、欠失、挿入、及び／又は置換）を示し、ここで、Ｘは、対応する野生型ＩＴＲに対する、そのセクションにおける少なくとも一つの核酸の修飾（例、欠失、挿入、及び／又は置換）を示している。一部の実施形態によると、Ｃ及び／又はＣ’及び／又はＢ及び／又はＢ’の領域のいずれかにおける少なくとも一つのヌクレオチドの任意の修飾（例、欠失、挿入及び／又は置換）は、少なくとも一つの末端ループにおいて三つの連続Ｔヌクレオチド（即ち、ＴＴＴ）を保持する。例えば、修飾が、単一アームＩＴＲ（例、単一Ｃ－Ｃ’アーム、又は単一Ｂ－Ｂ’アーム）、又は修飾Ｃ－Ｂ’アームもしくはＣ’－Ｂアーム、又は少なくとも一つの切断アーム（例、切断Ｃ－Ｃ’アーム及び／又は切断Ｂ－Ｂ’アーム）を伴う２アームＩＴＲ、少なくとも単一アーム、又は２アームＩＴＲ（ここで、一つのアームが切断されることができる）のアームの少なくとも一つのいずれかをもたらす場合、三つの連続Ｔヌクレオチド（即ち、ＴＴＴ）を少なくとも一つの末端ループ中に保持する。一部の実施形態によると、切断Ｃ－Ｃ’アーム及び／又は切断Ｂ－Ｂ’アームは、末端ループ中に三つの連続Ｔヌクレオチド（即ち、ＴＴＴ）を有する。
一部の実施形態によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターにおける使用のためのｍｏｄ－ＩＴＲは、本明細書中に開示されるような非対称ＩＴＲ対、又は対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対を含み、表１０中に示される修飾の組み合わせのいずれか一つ、ならびに、また、Ａ’とＣの間、Ｃ’とＣ’の間、Ｃ’とＢの間、ＢとＢ’の間、及びＢ’とＡの間から選択される領域のいずれかの一つ又は複数における少なくとも一つのヌクレオチドの修飾を含むことができる。一部の実施形態によると、ＣもしくはＣ’又はＢもしくはＢ’領域中での少なくとも一つのヌクレオチドの任意の修飾（例、欠失、挿入及び／又は置換）は、ステムループの末端ループを依然として保持する。一部の実施形態によると、ＣとＣ’及び／又はＢとＢ’の間での少なくとも一つのヌクレオチド（例、欠失、挿入及び／又は置換）の任意の修飾は、少なくとも一つの末端ループ中に三つの連続Ｔヌクレオチド（即ち、ＴＴＴ）を保持する。代替的な実施形態では、ＣとＣ’及び／又はＢとＢ’の間での少なくとも一つのヌクレオチド（例、欠失、挿入及び／又は置換）の任意の修飾は、少なくとも一つの末端ループ中に三つの連続Ａヌクレオチド（即ち、ＡＡＡ）を保持する。一部の実施形態によると、本発明中での使用のための修飾ＩＴＲは、表１０中に示される修飾の組み合わせのいずれか一つ、及び、また、以下から選択される領域のいずれか一つ又は複数における少なくとも一つのヌクレオチドの修飾（例、欠失、挿入及び／又は置換）を含むことができる：Ａ’、Ａ及び／又はＤ。例えば、一部の実施形態によると、本明細書中での使用のための修飾ＩＴＲは、表１０中に示される修飾の組み合わせのいずれか一つ、及び、また、Ａ領域中の少なくとも一つのヌクレオチドの修飾（例、欠失、挿入及び／又は置換）を含むことができる。一部の実施形態によると、本明細書中での使用のための修飾ＩＴＲは、表１０中に示される修飾の組み合わせのいずれか一つ、及び、また、Ａ’領域中の少なくとも一つのヌクレオチドの修飾（例、欠失、挿入及び／又は置換）を含むことができる。一部の実施形態によると、本明細書中での使用のための修飾ＩＴＲは、表１０中に示される修飾の組み合わせのいずれか一つ、ならびに、また、Ａ及び／又はＡ’領域中の少なくとも一つのヌクレオチドの修飾（例、欠失、挿入及び／又は置換）を含むことができる。一部の実施形態によると、本明細書中での使用のための修飾ＩＴＲは、表１０中に示される修飾の組み合わせのいずれか一つ、及び、また、Ｄ領域中の少なくとも一つのヌクレオチドの修飾（例、欠失、挿入及び／又は置換）を含むことができる。
一部の実施形態によると、構造的エレメントのヌクレオチド配列は、修飾された構造的エレメントを産生するように（例、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、又はそれらの任意の範囲を修飾することにより）修飾されることができる。一部の実施形態によると、ＩＴＲに対する特定の修飾が、本明細書中で例示されている（例、配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、もしくは１６５～１８７、又は２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図７Ａ～７Ｂ中に示されている（例、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２における配列番号９７～９８、１０１～１０３、１０５～１０８、１１１～１１２、１１７～１３４、５４５～５４）。一部の実施形態によると、ＩＴＲは修飾されることができる（例、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０又はそれ以上のヌクレオチドあるいはその中の任意の範囲を修飾することによる）。他の実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６もしくは１６５～１８７の修飾ＩＴＲの一つ、又は配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６もしくは１６５～１８７のＡ－Ａ’アームならびにＣ－Ｃ’アーム及びＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有セクション、又は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表２～９中に示され（即ち、配列番号１１０～１１２、１１５～１９０、２００～４６８）、それは、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる、と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有することができる。
一部の実施形態によると、修飾ＩＴＲは、例えば、特定のアームの全て、例えば、Ａ－Ａ’アームの全てもしくは一部、又はＢ－Ｂ’アームの全てもしくは一部、又はＣ－Ｃ’アームの全てもしくは一部の除去もしくは欠失、あるいは代替的に、ステム（例、単一アーム）をキャッピングする最終ループが依然として存在している限り、ループのステムを形成する１、２、３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の塩基対の除去を含むことができる（例、２０１８年１２月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図７Ａ中のＩＴＲ－２１を参照のこと）。一部の実施形態によると、修飾ＩＴＲは、Ｂ－Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の塩基対の除去を含むことができる。一部の実施形態によると、修飾ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の塩基対の除去を含むことができる（例、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図３Ｂ中のＩＴＲ－１、又は図７Ａ中のＩＴＲ－４５を参照のこと）。一部の実施形態によると、修飾ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の塩基対の除去及びＢ－Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上の塩基対の除去を含むことができる。塩基対の除去の任意の組み合わせが想定され、例えば、６塩基対をＣ－Ｃ’アームにおいて、及び２塩基対をＢ－Ｂ’アームにおいて除去することができる。例証的な例として、図３Ｂは、Ｃ部分及びＣ’部分の各々から欠失された少なくとも７塩基対、Ｃ領域とＣ’領域の間のループ中のヌクレオチドの置換、Ｂ領域及びＢ’領域の各々からの少なくとも一つの塩基対欠失、修飾ＩＴＲが二つのアームを含み、ここで、少なくとも一つのアーム（例、Ｃ－Ｃ’）が切断されているようにする、例示的な修飾ＩＴＲを示す。一部の実施形態によると、修飾ＩＴＲはまた、Ｂ領域及びＢ’領域の各々からの少なくとも一つの塩基対欠失を含み、Ｂ－Ｂ’アームがまた、ＷＴ ＩＴＲに対して切断されるようにする。
一部の実施形態によると、修飾ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１～５０（例、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）の間のヌクレオチド欠失を有することができる。一部の実施形態によると、修飾ＩＴＲは、全長ＷＴ ＩＴＲ配列に対して１～３０の間のヌクレオチド欠失を有することができる。一部の実施形態によると、修飾ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して２～２０の間のヌクレオチド欠失を有する。
一部の実施形態によると、修飾ＩＴＲは、ＤＮＡ複製（例、Ｒｅｐタンパク質によるＲＢＥへの結合、又は末端分解部位でのニッキング）に干渉しないように、Ａ又はＡ’領域のＲＢＥ含有部分において任意のヌクレオチド欠失を含まない。一部の実施形態によると、本明細書中での使用のために包含される修飾ＩＴＲは、本明細書中に記載されるＢ領域、Ｂ’領域、Ｃ領域、及び／又はＣ領域中に一つ又は複数の欠失を有する。
一部の実施形態によると、対称ＩＴＲ対又は非対称ＩＴＲ対を含むペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書中で開示される調節スイッチ、及び以下からなる群のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する、選択された少なくとも一つの修飾ＩＴＲを含む：配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６又は１６５～１８７。
別の実施形態では、構造的エレメントの構造は修飾することができる。例えば、構造的エレメントは、ステムの高さ及び／又はループ中のヌクレオチド数における変化である。例えば、ステムの高さは、約２、３、４、５、６、７、８、もしくは９ヌクレオチド又はそれ以上、あるいはその中の任意の範囲であることができる。一部の実施形態によると、ステムの高さは、約５ヌクレオチド～約９ヌクレオチドであることができ、Ｒｅｐと機能的に相互作用する。別の実施形態では、ステムの高さは、約７ヌクレオチドであることができ、Ｒｅｐと機能的に相互作用する。別の例では、ループは、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド又はそれ以上、あるいはそれらの任意の範囲を有することができる。
別の実施形態では、ＲＢＥ又は伸長ＲＢＥ内のＧＡＧＹ結合部位又はＧＡＧＹ関連結合部位の数を増加又は減少させることができる。一部の例によると、ＲＢＥ又は伸長ＲＢＥは、１、２、３、４、５、もしくは６つ又はそれ以上のＧＡＧＹ結合部位又はその任意の範囲を含むことができる。各ＧＡＧＹ結合部位は独立して、配列がＲｅｐタンパク質に結合するのに十分である限り、正確なＧＡＧＹ配列又はＧＡＧＹと類似した配列であることができる。
別の実施形態では、二つのエレメント（例えば、限定されないが、ＲＢＥ及びヘアピンなど）の間の間隔は、大きなＲｅｐタンパク質との機能的相互作用を改変させるために改変（例、増加又は減少）させることができる。例えば、間隔は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド又はそれ以上、あるいはその中の任意の範囲であることができる。
本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書中に開示される野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ構造に関して修飾されるが、しかし、依然として動作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、及びＲＢＥ´部分を保持するＩＴＲ構造を含むことができる。図２Ａ及び図２Ｂは、抗原、又は免疫原性ペプチドの発現のためのｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造部分内のｔｒｓ部位の動作のための一つの可能な機構を示す。一部の実施形態によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’、ＡＡＶ２）及び末端分解部位（ＴＲＳ；５’－ＡＧＴＴ）を含む一つ又は複数の機能的ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態によると、少なくとも一つのＩＴＲ（ｗｔ又は修飾ＩＴＲ）は機能的である。代替的な実施形態では、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターが、互いに異なる、又は非対称である二つの修飾ＩＴＲを含む場合、少なくとも一つの修飾ＩＴＲは機能的であり、少なくとも一つの修飾ＩＴＲは非機能的である。
一部の実施形態によると、本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの修飾ＩＴＲ（例、左又は右ＩＴＲ）は、ループアーム、切断アーム、又はスペーサー内に修飾を有する。ループアーム、切断アーム、又はスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表２（即ち、配列番号１３５～１９０、２００～２３３）；表３（例、配列番号２３４～２６３）；表４（例、配列番号２６４～２９３）；表５（例、本明細書中の配列番号２９４～３１８）；表６（例、配列番号３１９～４６８；及び表７～９（例、配列番号１０１～１１０、１１１～１１２、１１５～１３４）又は表１０Ａもしくは１０Ｂ（例、配列番号９、１００、４６９～４８３、４８４～４９９）中に列挙されている。
一部の実施形態によると、非対称ＩＴＲ対、又は対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対を含むペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための修飾ＩＴＲは、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０Ａ～１０Ｂ中に示されるもののいずれか又は組み合わせから選択される。
上のクラスの各々において非対称ＩＴＲ対、又は対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対を含むペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための追加の例示的な修飾ＩＴＲが、表１１Ａ及び１１Ｂ中に提供されている。表１１Ａ中の右修飾ＩＴＲの予測二次構造が、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図７Ａ中に、及び表１１Ｂ中の左修飾ＩＴＲの予測二次構造が、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図７Ｂ中に示されており、それは、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
表１１Ａ及び表１１Ｂは、例示的な右及び左修飾ＩＴＲの配列番号を列挙する。
一部の実施形態によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’～３’方向において、第一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的の核酸配列（例、本明細書中に記載される発現カセット）、及び第二のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第一のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに関して非対称であり、即ち、それらは、互いに異なる３Ｄ空間配置を有する。例示的な実施形態として、第一のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであることができ、第二のＩＴＲは、変異もしくは修飾ＩＴＲであることができ、又はその逆であることができ、ここで、第一のＩＴＲは、変異もしくは修飾ＩＴＲであることができ、第二のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであることができる。一部の実施形態によると、第一のＩＴＲ及び第二のＩＴＲは両方とも、ｍｏｄ－ＩＴＲであるが、しかし、異なる配列を有する、又は異なる修飾を有し、このように、同じ修飾ＩＴＲではなく、異なる３Ｄ空間配置を有する。言い換えると、非対称ＩＴＲを伴うｃｅＤＮＡベクターは、ＷＴ－ＩＴＲに対する一部のＩＴＲに従った任意の変化が、他のＩＴＲにおいて反映されないＩＴＲを含む；又は代替的に、非対称ＩＴＲが、修飾された非対称ＩＴＲ対を有し、互いに関して異なる配列及び異なる三次元形状を有することができる。ペプチド（例、抗原）の発現のための、及びｃｅＤＮＡプラスミドを生成するための使用のためのｃｅＤＮＡベクター中の例示的な非対称ＩＴＲを、表１１Ａ及び１１Ｂ中に示す。
代替的な実施形態では、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、二つの対称的なｍｏｄ－ＩＴＲを含む、すなわち、両方のＩＴＲは、同じ配列を有するが、しかし、互いの逆相補体（反転）である。一部の実施形態によると、対称的なｍｏｄ－ＩＴＲ対は、同じＡＡＶ血清型からの野生型ＩＴＲ配列に対する欠失、挿入、又は置換の少なくとも一つ又は任意の組み合わせを含む。対称ＩＴＲにおける付加、欠失、又は置換は、同一であるが、しかし、互いに逆相補的である。例えば、５’ＩＴＲのＣ領域中での３つのヌクレオチドの挿入は、３’ＩＴＲのＣ’領域中の対応するセクションにおける三つの逆相補体ヌクレオチドの挿入において反映されるであろう。単に例証の目的のみのために、付加が５’ＩＴＲ中のＡＡＣＧである場合、付加は、対応する部位での３’ＩＴＲ中のＣＧＴＴである。例えば、５’ＩＴＲ センス鎖がＡＴＣＧＡＴＣＧであり、ＧとＡの間でのＡＡＣＧの付加を伴い、配列ＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧをもたらす。対応する３’ＩＴＲセンス鎖は、配列ＣＧＡＴＣＧＴＴＣＧＡＴ（ＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧの逆相補体）をもたらすために、ＴとＣの間にＣＧＴＴ（即ち、ＡＡＣＧの逆相補体）の付加を伴うＣＧＡＴＣＧＡＴ（ＡＴＣＧＡＴＣＧの逆相補体）である。
代替的な実施形態では、修飾ＩＴＲ対は、本明細書中に定義されるように実質的に対称である－すなわち、修飾ＩＴＲ対は、異なる配列を有するが、しかし、対応する又は同じ対称三次元形状を有することができる。例えば、一つの修飾ＩＴＲは、一つの血清型からであることができ、他の修飾ＩＴＲは、異なる血清型からであることができるが、しかし、それらは、同じ領域中に同じ変異（例、ヌクレオチド挿入、欠失、又は置換）を有する。言い換えると、例示の目的のみのために、５’ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＡＡＶ２からであり、Ｃ領域中に欠失を有することができ、３’ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＡＡＶ５からであり、Ｃ’領域中に対応する欠失を有することができるが、ただし、５’ｍｏｄ－ＩＴＲ及び３’ｍｏｄ－ＩＴＲが、同じ又は対称な三次元空間構成を有し、それらは、修飾ＩＴＲ対として本明細書中での使用のために包含される。
一部の実施形態によると、実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対は、３Ｄ空間中に同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有し、例えば、実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対中の修飾ＩＴＲが、Ｃ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、次に、同族ｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、また、その同族ｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間中に同じ形状において残りのＡ及びＢ－Ｂ’ループの同様の３Ｄ構造を有する。一例としてのみ、実質的に対称なＩＴＲは、対称な空間構成を有することができ、それらの構造が、幾何学的空間において同じ形状であるようにする。これは、例えば、Ｇ－Ｃ対が、例えば、Ｃ－Ｇ対に、又はその逆に修飾される場合に、あるいはＡ－Ｔ対が、Ｔ－Ａ対に、又はその逆に修飾される場合に生じ得る。従って、ＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧとしての修飾５’ＩＴＲ、及びＣＧＡＴＣＧＴＴＣＧＡＴ（即ち、ＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧの逆相補体）としての修飾３’ＩＴＲの上の例示的な例を使用すると、これらの修飾ＩＴＲは、例えば、５’ＩＴＲがＡＴＣＧＡＡＣＣＡＴＣＧの配列を有した場合には、依然として対称でありうるが、ここで、付加におけるＧがＣに修飾され、実質的に対称な３’ＩＴＲが、ａへの付加においてＴの対応する修飾を伴わないＣＧＡＴＣＧＴＴＣＧＡＴの配列を有する。一部の実施形態によると、そのような修飾ＩＴＲ対は、修飾ＩＴＲ対が対称立体化学を有するため、実質的に対称である。
表１２は、抗原、又は免疫原性ペプチドの発現のためのｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための例示的な、対称な修飾ＩＴＲ対（即ち、左修飾ＩＴＲ及び対称右修飾ＩＴＲ）を示す。配列の太字（赤色）部分は、部分的なＩＴＲ配列（即ち、Ａ－Ａ’、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループの配列）を特定し、また、図３１Ａ～４６Ｂ中に示されている。これらの例示的な修飾ＩＴＲは、ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’のＲＢＥ、ＡＣＴＧＡＧＧＣのスペーサー、スペーサー相補体、及びＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＧＣのＲＢＥ’（即ち、ＲＢＥに対する相補体）を含むことができる。
一部の実施形態によると、非対称ＩＴＲ対を含むペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書中の表１１Ａ～１１Ｂのいずれか一つもしくは複数において示されるＩＴＲ配列もしくはＩＴＲ部分配列、又は２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図７Ａ～７Ｂ中に示される配列、それは、その全体において本明細書中に組み入れられる、又は２０１８年９月７日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０Ａ～１０Ｂにおいて開示されている配列、それは、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる、の中の修飾のいずれかに対応する修飾を伴うＩＴＲを含むことができる。
例示的なｃｅＤＮＡベクター
上に記載されるように、本開示は、上に記載される非対称ＩＴＲ対、対称ＩＴＲ対、又は実質的に対称なＩＴＲ対のいずれか一つを含むペプチド（例、抗原）をコードする組換えｃｅＤＮＡ発現ベクター及びｃｅＤＮＡベクターに関する。特定の実施形態では、本開示は、隣接するＩＴＲ配列及び導入遺伝子を有するペプチド（例、抗原）の発現のための組換えｃｅＤＮＡベクターに関し、ここで、ＩＴＲ配列は、本明細書中で定義されるように、互いに対して非対称、対称、又は実質的に対称であり、ｃｅＤＮＡは、隣接するＩＴＲの間に位置付けられる目的の核酸配列（例、導入遺伝子の核酸を含む発現カセット）をさらに含み、それにおいて、当該核酸分子はウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている。
ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡ発現ベクターは、本明細書中に記載される核酸配列を含む組換えＤＮＡ手順に便利に供されることができる任意のｃｅＤＮＡベクターであってもよく、ただし、少なくとも一つのＩＴＲが改変される。本開示のペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターが導入される宿主細胞と適合性がある。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは直線状であってもよい。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、染色体外実体として存在してもよい。特定の実施形態では、本開示のｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞のゲノム中へのドナー配列の組込みを可能にするエレメントを含んでもよい。本明細書中で使用されるように、「導入遺伝子」、「核酸配列」、及び「異種核酸配列」は同義であり、本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）をコードする。
ここで、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる国際公開番号ＷＯ／２０１９／０５１２５５の図１Ａ～１Ｇを参照すると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを作製する際に有用な二つの非限定的なプラスミドの機能的な構成要素の概略図が示されている。図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、１Ｆは、抗原、又は免疫原性ペプチドの発現のためのｃｅＤＮＡベクターの構築物又はｃｅＤＮＡプラスミドの対応する配列を示す。ｃｅＤＮＡベクターはカプシド不含であり、第一のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセット、及び第二のＩＴＲをこの順序においてコードするプラスミドから得られることができ、ここで、第一のＩＴＲ配列及び第二のＩＴＲ配列は、本明細書中で定義されるように、互いに非対称、対称、又は実質的に対称である。ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターはカプシド不含であり、第一のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子（タンパク質又は核酸）、及び第二のＩＴＲをこの順序においてコードするプラスミドから得られることができ、ここで、第一のＩＴＲ配列及び第二のＩＴＲ配列は、本明細書中で定義されるように、互いに対して非対称、対称、又は実質的に対称である。一部の実施形態によると、発現可能な導入遺伝子カセットは、必要に応じて、エンハンサー／プロモーター、一つ又は複数の相同アーム、ドナー配列、転写後調節エレメント（例、ＷＰＲＥ、例、配列番号６７））、ならびにポリアデニル化及び終結シグナル（例、ＢＧＨポリＡ、例、配列番号６８）を含む。
参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる国際公開番号ＷＯ／２０１９／０５１２５５の図５は、実施例において記載される方法を使用して複数のプラスミド構築物からのｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルである。ｃｅＤＮＡは、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる国際公開番号ＷＯ／２０１９／０５１２５５の図４Ａに関して考察されているように、ゲル中の特徴的なバンドパターンにより確認される。
調節エレメント
本明細書中に定義される非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含む、本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、シス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含むことができる。シス調節エレメントは、限定されないが、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節可能エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーを含む。
一部の実施形態によると、様々なシス調節エレメントの配列が、２０２１年３月２４日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２３８９１において開示されるもののいずれかから選択することができ、その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
実施形態では、第二の核酸配列は、調節配列、及びヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子調節配列は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列に動作可能に連結される。特定の実施形態では、調節配列は、宿主細胞におけるヌクレアーゼの発現を制御するために適切である。特定の実施形態では、調節配列は適切なプロモーター配列を含み、プロモーター配列、例えば本開示のヌクレアーゼをコードする核酸配列などに動作可能に連結された遺伝子の転写を方向付けることができる。特定の実施形態では、第二の核酸配列は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列の５’末端に連結されたイントロン配列を含む。特定の実施形態では、エンハンサー配列が、プロモーターの有効性を増加させるためにプロモーターの上流に提供される。特定の実施形態では、調節配列は、エンハンサー及びプロモーターを含み、それにおいて、第二の核酸配列は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列の上流にイントロン配列を含み、それにおいて、イントロンは、一つ又は複数のヌクレアーゼ切断部位を含み、及び、それにおいて、プロモーターは、ヌクレアーゼをコードする核酸配列に動作可能に連結される。
適切なプロモーターは、ウイルスから由来し得るが、従って、ウイルスプロモーターとして言及され得る、又はそれらは、原核生物もしくは真核生物を含む任意の生物から由来し得る。適切なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）による発現を駆動することができる。例示的なプロモーターは、限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ即時型プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例、配列番号 ８０）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７－５００（２００２））、増強Ｕ６プロモーター（例、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）（例、配列番号８１又は配列番号１５５）、ＣＡＧプロモーター、ヒトアルファ１－アンチチプシン（ＨＡＡＴ）プロモーター（例、配列番号８２）、及び同様のものを含む。特定の実施形態では、これらのプロモーターは、一つ又は複数のヌクレアーゼ切断部位を含むように、それらの下流イントロン含有末端で改変される。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位を含むＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来性である。
一部の実施形態では、プロモーターはまた、ヒト遺伝子、例えばヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、又はヒトメタロチオネインなどからのプロモーターであってもよい。
一部の実施形態によると、プロモーターは組織特異的プロモーターである。さらなる実施形態によると、組織特異的プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。一部の実施形態では、抗原、又は免疫原性タンパク質は、肝臓に対して標的化される、及び／又は肝臓特異的プロモーターにより肝臓において産生される。
当技術分野において公知の任意の肝臓特異的プロモーターが、本開示中での使用のために企図される。一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、限定されないが、ヒトアルファ１－アンチチプシン（ＨＡＡＴ）、天然又は合成から選択される。一部の実施形態では、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を介した、肝細胞へのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の内因性ＡｐｏＥ特異的標的化を使用して達成することができる。
本開示に従った使用のための適切なプロモーターの非限定的な例は、限定されないが、以下のいずれかを含む：ＣＡＧプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＩＥ２プロモーター及びラットＥＦ１－αプロモーター、ｍＥＦ１プロモーター、又は１Ｅ１プロモーター断片。
一部の実施形態によると、プロモーターは、２０２１年３月２４日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２３８９１において開示されている任意のプロモーター配列から選択することができ、その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
ポリアデニル化配列：
ポリアデニル化配列をコードする配列は、ｃｅＤＮＡベクターから発現されるｍＲＮＡを安定化させ、核輸送及び翻訳を助けるためのペプチド（例、抗原）の発現のために、ｃｅＤＮＡベクター中に含まれることができる。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターはポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０又はそれ以上のアデニンジヌクレオチドを含む。一部の実施形態によると、ポリアデニル化配列は、約４３のヌクレオチド、約４０～５０のヌクレオチド、約４０～５５のヌクレオチド、約４５～５０のヌクレオチド、約３５～５０のヌクレオチド、又はその間の任意の範囲を含む。
発現カセットは、当技術分野において公知の任意のポリアデニル化配列又はそのバリエーションを含むことができる。一部の発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含むことができる。一部の実施形態によると、ＵＳＥ配列は、ＳＶ４０ｐＡ又は異種ポリＡシグナルとの組み合わせにおいて使用することができる。ポリＡ配列は、抗原、又は免疫原性ペプチドをコードする導入遺伝子の３’に位置付けられる。
一部の実施形態によると、ポリアデニル化配列は、２０２１年３月２４日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２３８９１において開示されている任意のポリアデニル化配列から選択することができ、その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるための転写後エレメントを含むことができる。一部の実施形態によると、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後プロセシングエレメント、例えば単純ヘルペスウイルス、又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントなどを使用することができる。
一部の実施形態によると、転写後調節エレメントは、２０２１年３月２４日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２３８９１において開示されている任意の転写後調節エレメント配列から選択することができ、その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
一部の実施形態によると、抗原、又は免疫原性タンパク質をコードする一つ又は複数の核酸配列はまた、分泌配列をコードすることができ、タンパク質はゴルジ装置及び小胞体に向けられ、それがＥＲを通過し、細胞から出る際に、シャペロン分子により正しい立体構造に折り畳まれるようになる。例示的な分泌配列は、限定されないが、ＶＨ－０２及びＶＫ－Ａ２６）ならびにＩｇＫシグナル配列、ならびにタグ付きタンパク質を細胞質から外に分泌することを可能にするＧｌｕｃ分泌シグナル、タグ付きタンパク質をゴルジ体に向けるＴＭＤ－ＳＴ分泌配列を含む。
一部の実施形態によると、分泌配列は、２０２１年３月２４日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２３８９１において開示されている任意の分泌配列から選択することができ、その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
核局在化配列
一部の実施形態によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、一つ又は複数の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のＮＬＳを含む。一部の実施形態によると、一つ又は複数のＮＬＳは、アミノ末端で又はその近くで、カルボキシ末端で又はその近くで、あるいはこれらの組み合わせ（例、アミノ末端での一つ又は複数のＮＬＳ及び／又はカルボキシ末端での一つ又は複数のＮＬＳ）に位置付けられる。二つ以上のＮＬＳが存在する場合、各々を他から独立して選択することができ、単一のＮＬＳが、二つ以上のコピーにおいて、及び／又は一部のもしくはより多くのコピーに従って存在する一つもしくは複数の他のＮＬＳとの組み合わせにおいて存在するようにする。
一部の実施形態によると、ＮＬＳは、２０２１年３月２４日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２３８９１において開示されている任意のＮＬＳから選択することができ、その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
Ｖ．ｃｅＤＮＡベクターの産生の方法
一般的な産生
本明細書中に定義される非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含むペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの産生のための特定の方法は、２０１８年９月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６のセクションＩＶにおいて記載されており、それは、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。一部の実施形態によると、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書中に記載されるように、昆虫細胞を使用して産生されることができる。代替的な実施形態では、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、２０１９年１月１８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２において開示されるように、無細胞方法において合成的に、及び一部の実施形態に従って産生することができ、それは、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
本明細書中に記載されるように、一部の実施形態によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、以下の工程を含むプロセスにより得ることができる：ａ）ウイルスカプシドコード配列を欠くポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例、ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、及び／又はｃｅＤＮＡバキュロウイルス）を保有する宿主細胞（例、昆虫細胞）の集団を、Ｒｅｐタンパク質の存在下で、宿主細胞内でｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するのに有効な条件下で、及び十分な時間にわたりインキュベートすること（宿主細胞はウイルスカプシドコード配列を含まない）；ならびにｂ）宿主細胞からｃｅＤＮＡベクターを回収し、単離すること。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾ＩＴＲを伴うベクターポリヌクレオチドの複製を誘導し、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生させる。しかし、ウイルス粒子（例、ＡＡＶビリオン）は発現されない。このように、サイズ制限、例えばＡＡＶ又は他のウイルスベースのベクターにおいて自然に課されるものなどはない。
宿主細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターの存在は、ｃｅＤＮＡベクター上に単一の認識部位を有する制限酵素を用いて、宿主細胞から単離されたＤＮＡを消化し、非変性ゲル上で消化されたＤＮＡ材料を分析して、線形及び非連続ＤＮＡと比較して、線形及び連続ＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することにより確認することができる。
さらに別の態様では、本開示は、例えば、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ６９８７９において記載されているように、非ウイルスＤＮＡベクターの産生において、ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノム中に安定的に組込んだ宿主細胞株の使用を提供する。好ましくは、Ｒｅｐは、約３のＭＯＩで宿主細胞に加えられる。宿主細胞株が哺乳類細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である場合、細胞株は、安定的に組込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有することができ、第二のベクター、例えばヘルペスウイルスなどを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞中に導入し、Ｒｅｐ及びヘルパーウイルスの存在におけるｃｅＤＮＡの除去及び増幅を可能にすることができる。
一部の実施形態によると、本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現のためにｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は、昆虫細胞であり、バキュロウイルスは、例えば、実施例１において記載されるように、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びｃｅＤＮＡについての非ウイルスＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートの両方を送達するために使用される。一部の実施形態によると、宿主細胞は、Ｒｅｐタンパク質を発現するように操作される。
ｃｅＤＮＡベクターを次に回収し、宿主細胞から単離する。細胞から、本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡベクターを回収及び収集する時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するように選択及び最適化することができる。例えば、回収時間は、細胞生存率、細胞形態、細胞成長などの観点において選択することができる。一部の実施形態によると、細胞は、バキュロウイルス感染後に十分な時間成長及び回収されて、ｃｅＤＮＡベクターを産生するが、しかし、大半の細胞が、バキュロウイルス毒性に起因して死に始める前である。ＤＮＡベクターは、プラスミド精製キット、例えばＱｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅプラスミドキットなどを使用して単離することができる。プラスミド単離用に開発された他の方法がまた、ＤＮＡベクターについて適応されることができる。一般的に、任意の核酸精製方法を採用することができる。
ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のために当業者に公知の任意の手段により精製することができる。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターはＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターはエクソソーム又は微粒子として精製される。
ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの存在は、ＤＮＡベクター上に単一の認識部位を有する制限酵素を用いて、細胞から単離されたベクターＤＮＡを消化し、ゲル電気泳動を使用して消化及び未消化ＤＮＡ材料の両方を分析して、線形及び非連続ＤＮＡと比較して、線形及び連続ＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することにより確認することができる。
一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡは、無細胞環境において合成的に産生される。
ｃｅＤＮＡプラスミド
ｃｅＤＮＡプラスミドは、本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの後の産生のために使用されるプラスミドである。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡプラスミドは、転写の方向において動作的に連結された構成要素として少なくとも以下を提供するために、公知の技術を使用して構築されることができる：（１）修飾５’ＩＴＲ配列；（２）シス調節エレメント、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサー及び同様のものを含む発現カセット；ならびに（３）修飾３’ＩＴＲ配列、ここで、３’ＩＴＲ配列は、５’ＩＴＲ配列に対して対称である。一部の実施形態によると、ＩＴＲにより隣接される発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、ＡＡＶゲノムのｒｅｐコード領域及びｃａｐコード領域を置換する。
一部の態様によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、第一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、導入遺伝子を含む発現カセット、及び変異又は修飾ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序においてコードする、本明細書中で「ｃｅＤＮＡプラスミド」として言及されるプラスミドから得られ、それにおいて、当該ｃｅＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いている。代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第一（又は５’）の修飾又は変異ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第二（又は３’）の修飾ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序においてコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、それにおいて、５’及び３’ＩＴＲは、互いに対して対称である。代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡプラスミドは、第一（又は５’）の修飾又は変異ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第二（又は３’）の変異又は修飾ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序においてコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、それにおいて、５’及び３’の修飾ＩＴＲは、同じ修飾を有する（即ち、それらは、互いに対して逆相補的又は対称である）。
さらなる実施形態では、ｃｅＤＮＡプラスミド系は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている（即ち、それは、ＡＡＶカプシド遺伝子を欠いているが、しかし、また、他のウイルスのカプシド遺伝子を欠いている）。また、特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡプラスミドはまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、ｃｅＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶ２についての機能的ＡＡＶ ｃａｐ及びＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子ＧＧ－３’）、それに加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列を欠いている。
本開示のｃｅＤＮＡプラスミドは、当技術分野において周知の任意のＡＡＶ血清型のゲノムの天然核酸配列を使用して生成することができる。一部の実施形態では、ｃｅＤＮＡプラスミド骨格は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ １１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノムから由来する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ ００２０７７；ＮＣ ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ ００６２６０；ＮＣ ００６２６１；Ｋｏｔｉｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｈｅ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒにより維持されるＵＲＬで入手可能）（アドレスｏｅｓｙｓ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｄｅ／ｖｉｒｕｓｅｓ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｍｋｃｈａｐｔｅｒ．ａｓｐ？ｖｉｒＩＤ＝４２．０４．で）（注意－ＵＲＬ又はデータベースへの参照は、本出願の有効な出願日の時点でのＵＲＬ又はデータベースの内容を指す）。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡプラスミド骨格は、ＡＡＶ２ゲノムから由来する。別の特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡプラスミド骨格は、これらのＡＡＶゲノムの一つから由来するその５’及び３’ＩＴＲを含むように遺伝子操作された合成的骨格である。
ｃｅＤＮＡプラスミドは、場合により、ｃｅＤＮＡベクター産生細胞株の確立における使用のための選択可能又は選択マーカーを含むことができる。一部の実施形態によると、選択マーカーは、３’ＩＴＲ配列の下流（即ち、３’）に挿入されることができる。別の実施形態では、選択マーカーは、５’ＩＴＲ配列の上流（即ち、５’）に挿入されることができる。適した選択マーカーは、例えば、薬物耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、例えば、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、カナマイシン、ジェネテシン、及び同様のものであり得る。好ましい実施形態では、薬物選択マーカーは、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子である。
ペプチド（例、抗原）の発現のための例示的なｃｅＤＮＡ（例、ｒＡＡＶ０）ベクターは、ｒＡＡＶプラスミドから産生される。ｒＡＡＶベクターの産生のための方法は、（ａ）上に記載されるｒＡＡＶプラスミドを伴う宿主細胞に提供すること、それにおいて、宿主細胞及びプラスミドの両方が、カプシドタンパク質コード遺伝子を欠いており、（ｂ）ｃｅＤＮＡ ゲノムの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、ならびに（ｃ）細胞を回収し、当該細胞から産生されたＡＡＶゲノムを単離することを含むことができる。
ｃｅＤＮＡプラスミドからｃｅＤＮＡベクターを作製する例示的な方法
ペプチド（例、抗原）の発現のためのカプシド不含ｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法がまた、本明細書中に提供され、注目すべきは、インビボ実験のための十分なベクターを提供するために十分に高い収率を伴う方法である。
一部の実施形態によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの産生のための方法は、（１）発現カセット及び二つの対称的なＩＴＲ配列を含む核酸構築物を宿主細胞（例、Ｓｆ９細胞）中に導入すること、（２）場合により、例えば、プラスミド上に存在する選択マーカーを使用することによりクローン細胞株を確立すること、（３）Ｒｅｐコード遺伝子を（当該遺伝子を運ぶバキュロウイルスを用いたトランスフェクション又は感染のいずれかにより）当該昆虫細胞中に導入すること、及び（４）細胞を回収し、ｃｅＤＮＡベクターを精製することを含む。ｃｅＤＮＡベクターの産生のための上に記載される発現カセット及び二つのＩＴＲ配列を含む核酸構築物は、以下に記載されるように、ｃｅＤＮＡプラスミド、又はｃｅＤＮＡプラスミドを用いて生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスの形態であることができる。核酸構築物は、トランスフェクション、ウイルス形質導入、安定的組込み、又は当技術分野において公知の他の方法により宿主細胞中に導入することができる。
細胞株
ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの産生における使用のための宿主細胞株は、スポドプテラ・フルギペルダ、例えばＳｆ９ Ｓｆ２１などから由来する昆虫細胞株、又はトリコプルシア・ニ細胞、あるいは他の無脊椎動物、脊椎動物、又は哺乳類細胞を含む他の真核生物細胞株を含むことができる。当業者に公知の他の細胞株をまた、使用することができ、例えばＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１１８０、単球、ならびに成熟細胞及び未成熟樹状細胞などである。宿主細胞株を、高収率のｃｅＤＮＡベクター産生のためのｃｅＤＮＡプラスミドの安定的な発現のためにトランスフェクトすることができる。
ＣｅＤＮＡ－プラスミドは、当技術分野において公知の試薬（例、リポソーム、リン酸カルシウム）又は物理的手段（例、エレクトロポレーション）を使用した一過性トランスフェクションによりＳｆ９細胞中に導入することができる。あるいは、ｃｅＤＮＡ－プラスミドをそれらのゲノム中に安定的に組込んだ安定なＳｆ９細胞株を確立することができる。そのような安定的な細胞株は、上に記載されるように、選択マーカーをｃｅＤＮＡプラスミド中に組み入れることにより確立することができる。細胞株をトランスフェクトするために使用されるｃｅＤＮＡプラスミドが、選択マーカー、例えば抗生物質などを含む場合、ｃｅＤＮＡプラスミドでトランスフェクトされ、ｃｅＤＮＡプラスミドＤＮＡをそれらのゲノム中に組込まれた細胞は、細胞成長培地への抗生物質の添加により選択することができる。細胞の耐性クローンを次に、単一細胞希釈又はコロニー移入技術により単離し、増殖させることができる。
ｃｅＤＮＡベクターの単離及び精製
ｃｅＤＮＡベクターを得る及び単離するためのプロセスの例が、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる国際公開番号ＷＯ／２０１９／０５１２５５の図４Ａ～４Ｅ号において記載されている。本明細書中に記載されるプライムブースト組成物及び方法においてプライミングワクチンとして使用されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を発現する産生細胞から得ることができ、さらにｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、又はｃｅＤＮＡバキュロウイルスで形質転換される。ｃｅＤＮＡベクターの産生のために有用なプラスミドは、ペプチド（例、抗原）をコードするプラスミド、あるいは一つ又は複数のＲＥＰタンパク質をコードするプラスミドを含む。
一部の態様によると、ポリヌクレオチドは、プラスミド（Ｒｅｐプラスミド）、バクミド（Ｒｅｐ－バクミド）、又はバキュロウイルス（Ｒｅｐ－バキュロウイルス）中の産生細胞に送達されるＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ ７８又は６８）をコードする。Ｒｅｐプラスミド、Ｒｅｐ－バクミド、及びＲｅｐ－バキュロウイルスは、上に記載される方法により生成することができる。
本明細書中に記載されるプライムブースト組成物及び方法においてプライミングワクチンとして使用されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを産生するための方法が本明細書中に記載されている。本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用される発現構築物は、プラスミド（例、ｃｅＤＮＡプラスミド）、バクミド（例、ｃｅＤＮＡ－バクミド）、及び／又はバキュロウイルス（例、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）であり得る。一例としてのみ、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス及びＲｅｐ－バキュロウイルスを用いて同時感染された細胞から生成することができる。Ｒｅｐ－バキュロウイルスから産生されたＲｅｐタンパク質は、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを複製して、ｃｅＤＮＡベクターを生成することができる。あるいは、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐプラスミド、Ｒｅｐ－バクミド、又はＲｅｐ－バキュロウイルス中で送達されるＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８／５２）をコードする配列を含む構築物を用いて安定的にトランスフェクトされた細胞から生成されることができる。ＣｅＤＮＡ－バキュロウイルスは、細胞に一過性にトランスフェクトされ、Ｒｅｐタンパク質により複製され、ｃｅＤＮＡベクターを産生することができる。
バクミド（例、ｃｅＤＮＡバクミド）は、許容昆虫細胞、例えばＳｆ９，Ｓｆ２１Ｔｎｉ（トリコプルシア・ニ）細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞などの中にトランスフェクトされ、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを生成することができ、それは、対称ＩＴＲ及び発現カセットを含む配列を含む組換えバキュロウイルスである。ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを昆虫細胞中に再び感染させて、次世代の組換えバキュロウイルスを得ることができる。場合により、工程を一回又は複数回繰り返して、組換えバキュロウイルスをより大量に産生することができる。
細胞から、本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現のためにｃｅＤＮＡベクターを回収及び収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するように選択及び最適化することができる。例えば、回収時間は、細胞生存率、細胞形態、細胞成長などの観点において選択することができる。通常、細胞は、ｃｅＤＮＡベクター（例、ｃｅＤＮＡベクター）を産生するためにバキュロウイルス感染後の十分な時間後に、しかし、ウイルス毒性のために細胞の大部分が死に始める前に回収することができる。ｃｅＤＮＡベクターは、プラスミド精製キット、例えばＱｉａｇｅｎ ＥＮＤＯ－ＦＲＥＥ ＰＬＡＳＭＩＤ（登録商標）キットなどを使用して、Ｓｆ９細胞から単離することができる。プラスミド単離のために開発された他の方法をまた、ｃｅＤＮＡベクターについて適応させることができる。一般的に、任意の当技術分野において公知の核酸精製方法、ならびに市販のＤＮＡ抽出キットを採用することができる。
あるいは、精製は、細胞ペレットをアルカリ溶解プロセスに供し、結果として得られた溶解物を遠心分離し、クロマトグラフィー分離を実施することにより実施することができる。一つの非限定的な例として、プロセスは、核酸を保持するイオン交換カラム（例、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ Ｑ（登録商標））上に上清を充填し、次に（例、１．２Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いて）溶出し、ゲル濾過カラム（例、６つの高速流ＧＥ）上でさらなるクロマトグラフィー精製を実施することにより実施することができる。カプシド不含ＡＡＶベクターを次に、例えば、沈殿により回収する。
一部の実施形態によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、エクソソーム、又は微粒子の形態において精製されることができる。多くの細胞型が、可溶性タンパク質だけでなく、しかし、また、膜微小胞シェディングを介して複雑なタンパク質／核酸カーゴを放出することが当技術分野において公知である（Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００９；ＥＰ １０３０６２２６．１）。そのような小胞は、微小胞（また、マイクロ粒子として言及される）及びエクソソーム（また、ナノ小胞として言及される）を含み、それらの両方が、タンパク質及びＲＮＡをカーゴとして含む。小胞は、細胞膜の直接的な出芽から生成され、エクソソームは、多胞性エンドソームと細胞膜との融合時に細胞外環境中に放出される。このように、ｃｅＤＮＡベクター含有マイクロ小胞及び／又はエクソソームは、ｃｅＤＮＡプラスミドで形質導入された細胞、又はｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスから単離されることができる。
微小胞は、培養培地を、２０，０００×ｇで濾過又は超遠心分離に、１００，０００×ｇでエクソソームに供することにより単離することができる。超遠心分離の最適な持続時間は、実験的に決定することができ、小胞が単離される特定の細胞型に依存する。好ましくは、培養培地は、最初に低速遠心分離（例、２０００×ｇで５～２０分間）により除去され、例えば、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、英国ワットフォード）を使用してスピン濃度に供される。微小胞及びエクソソームは、微小胞及びエクソソーム上に存在する特異的表面抗原を認識する特異的抗体を使用することにより、ＦＡＣＳ又はＭＡＣＳを介してさらに精製することができる。他の微小胞及びエクソソーム精製方法は、限定されないが、免疫沈降、親和性クロマトグラフィー、濾過、及び特定の抗体又はアプタマーでコーティングされた磁気ビーズを含む。精製時に、小胞は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄される。微小胞又はエクソソームを使用してｃｅＤＮＡ含有小胞を送達することの一つの利点は、これらの小胞が、それぞれの細胞型上の特定の受容体により認識されるそれらの膜タンパク質上に含まれることにより、様々な細胞型に標的化されることができることである。（また、ＥＰ １０３０６２２６を参照のこと）
本明細書中の本開示の別の態様は、ｃｅＤＮＡ構築物をそれら自体のゲノム中に安定的に組込んだ宿主細胞株からｃｅＤＮＡベクターを精製する方法に関する。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターはＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターはエクソソーム又は微粒子として精製される。
国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の図５は、複数のｃｅＤＮＡ－プラスミド構築物からのｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルを示す。
ＶＩ．投与
異種プライムブースト免疫化のための方法
複数用量の免疫化は、治療のために又は疾患予防のために、しばしば、単一用量の免疫化よりも効果的であることが報告されている。ワクチン接種後に多数の抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を生成することは、様々な動物及びヒトの疾患に対するワクチン設計の望ましい目標であると一般的に考えられている。なぜなら、この数は宿主の免疫化及び防御と強く相関するためである。これらの多数の細胞を生成するための一つのアプローチは、プライムブースト免疫化を使用することであり、それは、一次記憶形成後の抗原特異的免疫細胞の再刺激に頼る。そのようなプロセスでは、最初に対象に投与される「プライミング」組成物、及びその後に一回又は複数回投与される「ブースト」組成物がある。
本開示はさらに、組成物の一つの複数回投与（プライミングワクチン）、それに続く他の組成物の複数回投与（ブースト）を企図する。一実施形態では、プライミング組成物は、ブースト組成物の投与の前に少なくとも一回又は複数回、対象に投与される。その後、ブースト組成物は、その後、対象に少なくとも一回又は複数回投与される。ワクチンによる免疫応答のブーストは、感染時に病原体に対する防御を媒介するために要求されるより多くのエフェクター細胞の生成をもたらすと広く考えられている。
本開示の態様によると、本明細書中に記載される方法は、異種プライムブースト免疫化、又は二つの異なるモダリティもしくはプラットフォームを使用した抗原もしくは免疫原性ペプチドの投与を用いる。実施形態によると、そのようなアプローチは、有利には、対象において改善された免疫応答を惹起させる。一部の実施形態によると、記載される異種プライムブースト免疫化からもたらされる改善された免疫応答は、改善された記憶応答を含み、それらは、限定されないが、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のより高い大きさ、免疫系により認識されるＴ細胞エピトープの広がり、及びＴ細胞の多官能性における増加を含む。一部の実施形態によると、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のより高い大きさは、単一用量投与に対して、又は相同プライムブーストレジメンに対して、少なくとも２０％又は少なくとも２５％又は少なくとも３０％又は少なくとも５０％又は少なくとも７５％又は少なくとも１００％又は少なくとも１５０％又は少なくとも２００％又は少なくとも２５０％又は少なくとも３００％の増加であり得る。一部の実施形態によると、本明細書中に記載される異種プライムブースト戦略は、ｃｅＤＮＡプラットフォームがプライミングワクチンとして使用される、免疫応答の相乗的増強をもたらすことができる。さらなる実施形態によると、免疫応答の相乗的増強は、増加した数の抗原特異的Ｔ細胞、免疫記憶応答の長さ、及び免疫記憶応答の大きさにおいて見られる。
一部の実施形態によると、本開示は、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導する方法を提供し、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ＤＮＡを含むプライミングワクチンを対象に投与すること、それにおいて、ＤＮＡは第一のペプチドをコードする；及び（ｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）、又は（ｉｉ）第二のペプチドを含むブースティングワクチンを対象に投与することを含み、それにおいて、ＲＮＡは第二のペプチドをコードする；それにより、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導することを含む。また、提供されるのは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ＤＮＡを含むプライミングワクチンであって、ＤＮＡが第一のペプチドをコードするプライミングワクチン；及び（ｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）、又は（ｉｉ）第二のペプチドを含むブースティングワクチンであって、ＲＮＡが第二のペプチドをコードするブースティングワクチンを含むワクチンレジメンである。一部の実施形態によると、第一及び第二のペプチドは、細菌、ウイルス、真菌、又は寄生虫の感染因子から由来する。一部の実施形態によると、第一及び第二のペプチドは、同じ病原性生物からである。一部の実施形態によると、第一及び第二のペプチドは、プライミングワクチン及びブースティングワクチンにおいて同じである。一部の実施形態によると、第一及び第二のペプチドのエピトープの少なくとも一つは、プライミングワクチン及びブースティングワクチンにおいて異なっている。
本明細書中に開示される一部の実施形態は、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導するための方法に関し、方法は、第一のペプチドをコードするｃｅＤＮＡベクターを含むプライミングワクチンの少なくとも一用量を対象に投与すること；及び、その後に、ブースティングワクチンの少なくとも一用量を対象に投与することを含み、ブースティングワクチンは、ｃｅＤＮＡベクターを含まない。
本明細書中に開示される一部の実施形態は、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導するための方法に関し、方法は、第一のペプチドをコードするｃｅＤＮＡベクターを含むプライミングワクチンの少なくとも一用量を対象に投与すること；及び、その後に、ブースティングワクチンの少なくとも一用量を対象に投与することを含み、ブースティングワクチンは、第二のペプチドを含む。
本明細書中に開示される一部の実施形態は、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導するための方法に関し、方法は、第一のペプチドをコードするｃｅＤＮＡベクターを含むプライミングワクチンの少なくとも一用量を対象に投与すること；及び、その後に、ブースティングワクチンの少なくとも一用量を対象に投与することを含み、ブースティングワクチンは、第二のペプチドをコードするリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。
本明細書中に開示される一部の実施形態は、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導するための方法に関し、方法は、第一のペプチドをコードするｃｅＤＮＡベクターを含むプライミングワクチンの少なくとも一用量を対象に投与すること；及び、その後に、ブースティングワクチンの少なくとも一用量を対象に投与することを含み、ブースティングワクチンは、第二のペプチドをコードするｃｅＤＮＡベクターを含む。
本明細書中に開示される一部の実施形態は、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導するための方法に関し、方法は、第一のペプチドをコードするリボ核酸（ＲＮＡ）を含むプライミングワクチンの少なくとも一用量を対象に投与すること；及び、その後に、ブースティングワクチンの少なくとも一用量を対象に投与することを含み、ブースティングワクチンは、第二のペプチドをコードするｃｅＤＮＡベクターを含む。
本明細書中に開示される一部の実施形態は、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導するための方法に関し、方法は、第一のペプチドを含むプライミングワクチンの少なくとも一用量を対象に投与すること；及び、その後に、ブースティングワクチンの少なくとも一用量を対象に投与することを含み、ブースティングワクチンは、第二のペプチドをコードするｃｅＤＮＡベクターを含む。
一部の実施形態では、第一のペプチド及び第二のペプチドは、互いに同一である。一部の実施形態では、第一のペプチド及び第二のペプチドのアミノ酸配列は、互いに相同である。一部の実施形態では、第一のペプチドのアミノ酸配列は、第二のペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を示す。一部の実施形態では、第一及び第二の免疫原性ペプチドは、少なくとも一つの交差反応性抗原決定基を含む。一部の実施形態では、第一及び第二の免疫原性ペプチド又は抗原は、対象において実質的に同じ免疫応答を誘導する。
一部の実施形態では、プライミング組成物は、対象中に単一用量において投与される。一部の実施形態では、プライミング組成物は、対象中に複数用量において投与される。一部の実施形態では、ブースト組成物は、対象中に単一用量において投与される。一部の実施形態では、ブースト組成物は、対象中に複数用量において投与される。
一部の実施形態では、プライミング組成物及び／又はブースト組成物は、対象に、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも１０の連続投与量、又はその間の任意の数の投与量にわたり投与される。一部の実施形態では、プライミング組成物及び／又はブースト組成物は、対象に、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、又は少なくとも２０の連続投与量、又はその間の任意の数の投与量にわたり投与される。
本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象に、約１週間、又は２、３、４、５、６、７、もしくは８、又は１～２もしくは２～４もしくは３～４週間の間隔で投与される。本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象中に、約４週間の間隔で投与される。本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象中に、約６週間の間隔で投与される。本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象中に、約８週間の間隔で投与される。本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象中に、約１０週間の間隔で投与される。
本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象中に、約２８日の間隔で投与される。本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象中に、約３５日の間隔で投与される。本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象中に、約４２日の間隔で投与される。本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象中に、約４９日の間隔で投与される。本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象中に、約５６日の間隔で投与される。本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象中に、約６３日の間隔で投与される。本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象中に、約７０日又はそれ以上の間隔で投与される。本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、プライミング組成物及びブースト組成物の少なくとも一用量は、対象中に、２８日～５６日の間の間隔で投与される。
当業者は、任意の特定の対象について、特定の投与レジメンが、個々のニーズ、及び組成物の投与を施行又は監督する人の専門的判断に従って経時的に調整されることができることをさらに理解するであろう。例えば、用量は、投与された組成物の臨床効果、例えば毒性効果及び／又は臨床検査値などに基づいて調整され得る。投薬レジメンは、最適な所望の効果を提供するように調整することができる。例えば、上で考察するように、単一用量を投与することができる、いくつかの分割用量を経時的に投与することができる、又は用量を、治療状況の緊急性により示されるように比例的に低下又は増加させることができる。本明細書中に開示される組成物の投与のための適した投与量及びレジメンを決定することは、関連技術分野において周知であり、一度、本明細書中に開示される教示が提供されると、当業者により包含されることが理解されるであろう。
このように、当業者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、用量及び投与レジメンが、治療技術分野において周知の方法に従って調整されることを理解するであろう。すなわち、最大耐用量を容易に確立することができ、検出可能な治療的利益を対象に提供する有効量をまた、決定することができ、検出可能な治療的利益を患者に提供するために各薬剤を投与するための時間的要件も同様であり得る。したがって、特定の用量及び投与レジメンが本明細書中に例示される一方で、これらの実施例は、本開示を実践する際に患者に提供されることができる用量及び投与レジメンを決して限定しない。
本明細書中に開示されるプライミング組成物及びブースト組成物の投与は、組成物の作用の部位への送達を可能にする任意の方法により行われ得る。これらの方法は、経口経路、十二指腸内経路、非経口注射（静脈内、皮下、筋肉内、血管内、又は注入を含む）、局所投与、及び直腸投与を含む。注入は、滴下、連続注入、注入ポンプ、計量ポンプ、デポ製剤、又は任意の他の適切な手段により投与することができる。一部の実施形態では、プライミング組成物の少なくとも一用量が、対象に筋肉内投与される。一部の実施形態では、ブースト組成物の少なくとも一用量が、対象に筋肉内投与される。
本明細書中に開示される一部の実施形態では、本開示の方法は、一つ又は複数のその後のブースト投与をさらに含む。一部の実施形態では、本開示の方法は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも１０の連続的なブースト投与、又はその間の任意の数の投与をさらに含む。一部の実施形態では、その後のブースト投与は、経時的に、徐々に増加する投与量において実施される。一部の実施形態では、その後のブースト投与は、経時的に、徐々に減少する投与量において実施される。
ＶＩＩ．医薬組成物
別の態様では、医薬組成物が提供される。医薬組成物は、本明細書中に記載されるプライムブースト組成物及び方法においてプライミングワクチンとして使用されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクター、ならびに医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む。
本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象の細胞、組織、又は器官へのインビボ送達のために対象への投与のために適切な医薬組成物中に組み入れられることができる。典型的には、医薬組成物は、本明細書中に開示されるｃｅＤＮＡベクター及び医薬的に許容可能な担体を含む。
本明細書中に開示される医薬製剤は、直接的に投与され得る液体、例えば、水溶液、及び投与前に希釈剤を加えることにより溶液に再構成され得る凍結乾燥粉末を含む。特定の実施形態では、本明細書中に開示されるｃｅＤＮＡベクターを含む製剤は、少なくとも一つの追加の治療薬剤を伴って又は伴わずに、適した賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。凍結乾燥は、市販の凍結乾燥剤（例、ＶｉｒＴｉｓ Ｌａｂ Ｓｃａｌｅ凍結乾燥剤）上の一般的な凍結乾燥サイクルを使用して実施することができる。
治療目的のための医薬組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で無菌であり、安定的でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、又は高ｃｅＤＮＡベクター濃度に対して適切な他の順序付けられた構造として製剤化されることができる。滅菌注射用溶液は、要求に応じて、上に列挙された成分の一つ又は組み合わせを伴う、適した緩衝液中に、要求される量のｃｅＤＮＡベクター化合物を組み入れて、それに続く濾過滅菌により調製することができる。
特定の実施形態では、非経口投与用の製剤は、凍結乾燥形態において又は溶液中で保存されることができる。特定の実施形態では、非経口製剤は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアル中に配置される。
一部の態様によると、本明細書中に提供される方法は、本明細書中に記載されるプライムブースト組成物及び方法においてプライミングワクチンとして使用されるペプチド（例、抗原）の発現のために一つ又は複数のｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に送達することを含む。また、本明細書中で提供されるのは、そのような方法により産生される細胞、及びそのような細胞を含む、又はそれから産生される生物（例えば動物、植物、又は真菌など）である。核酸の送達の方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、及びＤＮＡの薬剤増強取り込みを含むことができる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号；及び第４，８９７，３５５号）において記載されており、ならびにリポフェクション試薬（例、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））が市販されている。送達は、細胞（例、インビトロ又はエクスビボ投与）又は標的組織（例、インビボ投与）に対してであり得る。
様々な技術及び方法が、核酸を細胞に送達するために、当技術分野において公知である。例えば、ペプチド（例、抗原）の発現のための核酸、例えばｃｅＤＮＡなどは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、又はコアシェルナノ粒子中に製剤化することができる。典型的には、ＬＮＰは、核酸（例、ｃｅＤＮＡ）分子、一つ又は複数のイオン化可能もしくはカチオン性脂質（又はその塩）、一つ又は複数の非イオン性もしくは中性脂質（例、リン脂質）、凝集を防止する分子（例、ＰＥＧ又はＰＥＧ脂質コンジュゲート）、及び、場合により、ステロール（例、コレステロール）で構成される。
核酸、例えばｃｅＤＮＡなどをペプチド（例、抗原）の発現のために細胞に送達するための別の方法は、核酸を、細胞により内在化されるリガンドとコンジュゲートすることによる。例えば、リガンドは、細胞表面上の受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して内在化することができる。リガンドは、核酸中のヌクレオチドに共有結合的に連結させることができる。核酸を細胞中に送達するための例示的なコンジュゲートは、例えば、ＷＯ２０１５／００６７４０、ＷＯ２０１４／０２５８０５、ＷＯ２０１２／０３７２５４、ＷＯ２００９／０８２６０６、ＷＯ２００９／０７３８０９、ＷＯ２００９／０１８３３２、ＷＯ２００６／１１２８７２、ＷＯ２００４／０９０１０８、ＷＯ２００４／０９１５１５、及びＷＯ２０１７／１７７３２６において記載されている。
ペプチド（例、抗原）の発現のための核酸、例えばｃｅＤＮＡベクターなどがまた、トランスフェクションにより細胞に送達されることができる。有用なトランスフェクション方法は、限定されないが、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクション、又はリン酸カルシウム沈殿を含む。トランスフェクション試薬は、当技術分野において周知であり、以下に限定されないが、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｒｏ－Ｊｅｃｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）タンパク質送達試薬（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ、スイス、バーゼル）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン）、ＴＦＸ－１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ－２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ－５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ヘラクレス）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）、ＤＣ－ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、コロラド州ラファイエット）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、及びＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含む。核酸、例えばｃｅＤＮＡなどはまた、当業者に公知のマイクロ流体方法を介して細胞に送達されることができる。
本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接的に投与することができる。投与は、限定されないが、注射、注入、局所適用、及びエレクトロポレーションを含む、血液又は組織細胞と最終的に接触するように分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによる。そのような核酸を投与する適切な方法が利用可能であり、当業者に周知であり、二つ以上の経路を、特定の組成物を投与するために使用することができるが、特定の経路は、しばしば、別の経路よりも即時かつより効果的な反応を提供することができる。
本開示によるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを、対象における細胞又は標的器官への送達のためにリポソームに加えることができる。リポソームは、少なくとも一つの脂質二重層を持つ小胞である。リポソームは、典型的には、医薬品開発の文脈において薬物／治療送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置して、薬物又は医薬品有効成分（ＡＰＩ）を送達することにより機能する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリン基を有する化合物で構成されるが、しかし、これらの組成物はまた、他の脂質を含み得る。例示的なリポソーム及びリポソーム製剤は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基含有化合物を含み、２０１８年９月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号において、及び２０１８年１２月６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号において開示されており、例えば、「医薬製剤」と題するセクションを参照のこと。
当技術分野において公知の様々な送達方法又はその改変を使用して、インビトロ又はインビボでｃｅＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、一部の実施形態によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、機械的、電気的、超音波的、流体力学的な、又はレーザーベースのエネルギーにより細胞膜中で一過性浸透を作製することにより送達され、標的化細胞中へのＤＮＡ進入が促進されるようにする。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、サイズ制限されたチャネルを通して細胞を圧迫することにより、又は当技術分野において公知の他の手段により、細胞膜を一過性に破壊することにより送達されることができる。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクター単独は、肺、肝臓、腎臓、胆嚢、前立腺、副腎、心臓、腸、胃、皮膚、胸腺、心筋、又は骨格筋から選択される任意の一つ又は複数の組織のいずれか一つの中にネイキッドＤＮＡとして直接的に注射される。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子銃により送達される。カプシド不含ＡＡＶベクターでコーティングされた金又はタングステン球状粒子（直径１～３μｍ）は、加圧ガスにより高速にまで加速されて標的組織細胞中に浸透することができる。
一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは、脂質送達系、例えば、本明細書中に記載されるリポソームを用いて製剤化される。一部の実施形態によると、そのような組成物は、当業者により望ましい任意の経路により投与される。組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介して、頬側投与を介して、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、及び関節内、又はそれらの組み合わせを含む、異なる経路により対象に投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的慣行に従って、適切に許容可能な製剤として投与されてもよい。獣医は、特定の動物について最も適している投与レジメン及び投与の経路を容易に決定し得る。組成物は、従来のシリンジ、無針注射装置、「微小弾丸爆撃遺伝子銃」、又は他の物理的方法、例えばエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、流体力学的方法、もしくは超音波などにより投与されてもよい。
一部の場合によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、流体力学的注射により送達され、それは、肢全体における内臓及び骨格筋中への任意の水溶性化合物及び粒子の直接的な細胞内送達のための単純かつ高度に効率的な方法である。
一部の実施形態によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、内部器官又は腫瘍の細胞中へのＤＮＡ粒子の細胞内送達を促進するために膜中にナノスコピック細孔を作製することにより超音波により送達され、そのため、プラスミドＤＮＡのサイズ及び濃度は、システムの効率において大きな役割を有する。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは、磁場を使用して核酸を含む粒子を標的細胞中に濃縮することにより、磁気感染により送達される。
一部の実施形態によると、化学物質送達システムを、例えば、ナノマー複合体を使用することにより使用されることができ、それは、カチオン性リポソーム／ミセル又はカチオン性ポリマーに属するポリカチオン性ナノマー粒子による負に荷電した核酸の圧縮を含む。送達方法のために使用されるカチオン性脂質は、限定されないが、一価カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、グアニジン含有化合物、コレステロール誘導体化合物、カチオン性ポリマー（例、ポリ（エチレンイミン）、ポリ－Ｌ－リジン、プロタミン、他のカチオン性ポリマー）、及び脂質－ポリマーハイブリッドを含む。
エクソソーム
一部の実施形態によると、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、エクソソーム中にパッケージングされることにより送達される。エクソソームは、多胞体と細胞膜との融合後に細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二重層からなり、それらは、エクソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含み、表面上に親細胞からの膜タンパク質を示す。エクソソームは、上皮細胞、Ｂ及びＴリンパ球、肥満細胞（ＭＣ）ならびに樹状細胞（ＤＣ）を含む様々な細胞型により産生される。一部の実施形態によると、１０ｎｍ～１μｍの間、２０ｎｍ～５００ｎｍの間、３０ｎｍ～２５０ｎｍの間、５０ｎｍ～１００ｎｍの間の直径を伴うエクソソームが、使用のために想定される。エクソソームは、それらのドナー細胞を使用して、又はそれらの中に特定の核酸を導入することにより、標的細胞への送達のために単離され得る。当技術分野において公知の様々なアプローチを使用して、本開示のカプシド不含ＡＡＶベクターを含むエクソソームを産生することができる。
微粒子／ナノ粒子
一部の実施形態によると、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子により送達される。一般的に、脂質ナノ粒子は、イオン化可能なアミノ脂質（例、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ホスファチジルコリン（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びコート脂質（ポリエチレングリコール－ジミリストールグリセロール、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含み、例えば、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ５（３）：４９８－５０７により開示されるとおりである。
一部の実施形態によると、脂質ナノ粒子は、約１０～約１０００ｎｍの間の平均直径を有する。一部の実施形態によると、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満である直径を有する。一部の実施形態によると、脂質ナノ粒子は、約１０～約３００ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態によると、脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満である直径を有する。一部の実施形態によると、脂質ナノ粒子は、約２５～約２００ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子調製物（例、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物）は、平均サイズ（例、直径）が約７０ｎｍ～約２００ｎｍであり、より典型的には、平均サイズが約１００ｎｍ又はそれ以下であるサイズ分布を有する。
当技術分野において公知の様々な脂質ナノ粒子を使用して、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、脂質ナノ粒子を使用した様々な送達方法が、米国特許第９，４０４，１２７号、第９，００６，４１７号、及び第９，５１８，２７２号において記載されている。
コンジュゲート
一部の実施形態によると、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、細胞取り込みを増加させる薬剤にコンジュゲート（例、共有結合的に結合）される。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を横切った核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物（例、コレステロール、トコフェロールなど）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（例、ペネトラチン、ＴＡＴ、Ｓｙｎ１Ｂなど）、及びポリアミン（例、スペルミン）にコンジュゲートすることができる。細胞取り込みを増加させる薬剤のさらなる例は、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ（２０１３）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４（７）；７９１－８０９において開示されている。
一部の実施形態によると、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ポリマー（例、ポリマー分子）又は葉酸分子（例、葉酸分子）にコンジュゲートされる。一般的に、ポリマーにコンジュゲートされた核酸の送達は、例えば、ＷＯ２０００／３４３４３及びＷＯ２００８／０２２３０９において記載されるように、当技術分野において公知である。一部の実施形態によると、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，９８７，３７７号により記載されるように、ポリ（アミド）ポリマーにコンジュゲートされる。一部の実施形態によると、本開示により記載される核酸は、米国特許第８，５０７，４５５号において記載される葉酸分子にコンジュゲートされる。
一部の実施形態によると、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号において記載されるように、糖にコンジュゲートされる。
ナノカプセル
あるいは、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターのナノカプセル製剤を使用することができる。ナノカプセルは一般的に、安定かつ再現可能な方法において物質を封入することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）が、インビボで分解されることができるポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
リポソーム
本開示によるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを、対象における細胞又は標的器官への送達のためにリポソームに加えることができる。リポソームは、少なくとも一つの脂質二重層を持つ小胞である。リポソームは、典型的には、医薬品開発の文脈において薬物／治療送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置して、薬物又は医薬品有効成分（ＡＰＩ）を送達することにより機能する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリン基を有する化合物で構成されるが、しかし、これらの組成物はまた、他の脂質を含み得る。
リポソームの形成及び使用は、当業者に一般的に公知である。リポソームは、改善された血清安定性及び循環半減期を伴って開発されている（米国特許第５，７４１，５１６号を参照のこと）。さらに、潜在的な薬剤担体としてのリポソーム及びリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号；第５，５５２，１５７号；第５，５６５，２１３号；第５，７３８，８６８号、及び第５，７９５，５８７号）。
例示的なリポソーム及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物
本開示に従ったペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、細胞、例えば、導入遺伝子の発現を必要とする細胞に送達するためにリポソームに加えることができる。リポソームは、少なくとも一つの脂質二重層を持つ小胞である。リポソームは、典型的には、医薬品開発の文脈において薬物／治療送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置して、薬物又は医薬品有効成分（ＡＰＩ）を送達することにより機能する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリン基を有する化合物で構成されるが、しかし、これらの組成物はまた、他の脂質を含み得る。
ｃｅＤＮＡベクターを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、２０１８年９月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２、及び２０１８年１２月６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２において開示されており、それらは、それらの全体において本明細書中に組み入れられ、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの方法及び組成物における使用について想定される。
一部の態様によると、本開示は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基（いわゆる、ＰＥＧ化化合物）を伴う一つ又は複数の化合物を含むリポソーム製剤を提供し、それは、化合物の免疫原性／抗原性を低下させ、それに親水性及び疎水性を提供し、投薬頻度を低下させることができる。又はリポソーム製剤は、追加の成分としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを単に含む。そのような態様では、ＰＥＧ又はＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ～約５，０００Ｄａであることができる。
一部の態様によると、本開示は、数時間から数週間にわたる徐放又は制御放出プロファイルを伴うＡＰＩを送達するリポソーム製剤を提供する。一部の関連する態様によると、リポソーム製剤は、脂質二重層により結合される水性チャンバーを含み得る。他の関連する態様では、リポソーム製剤は、数時間から数週間にわたってＡＰＩを放出する、上昇温度で物理的転移を受ける成分を伴うＡＰＩをカプセル化する。
一部の態様によると、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリン及び本明細書中に開示される一つ又は複数の脂質を含む。一部の態様によると、リポソーム製剤はオプティソームを含む。
一部の態様によると、本開示は、以下から選択される一つ又は複数の脂質を含むリポソーム製剤を提供する：Ｎ－（カルボニルメトキシポリエチレングリコール ２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）コンジュゲート脂質、ＨＳＰＣ（水素化大豆ホスファチジルコリン）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＤＳＰＥ（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）；ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）；ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）；ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）；ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）；ＳＭ（スフィンゴミエリン）；ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）；ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＥ（ジオレオリ－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）。コレステリル硫酸塩（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオリ－ｓｎ－グリセロ－ホスファチジルコリン）、又はそれらの組み合わせ。
一部の態様によると、本開示は、５６：３８：５のモル比でリン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様によると、リポソーム製剤の全体的な脂質含量は、２～１６ｍｇ／ｍＬである。一部の態様によると、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含む脂質、エタノールアミン官能基を含む脂質、及びＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様によると、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含む脂質、エタノールアミン官能基を含む脂質、及びＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比において含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様によると、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含む脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様によると、本開示は、ホスファチジルコリン官能基及びコレステロールを含む脂質を含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様によると、ＰＥＧ化脂質はＰＥＧ－２０００－ＤＳＰＥである。一部の態様によると、本開示は、ＤＰＰＧ、大豆ＰＣ、ＭＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質コンジュゲート、及びコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
一部の態様によると、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含む一つ又は複数の脂質及びエタノールアミン官能基を含む一つ又は複数の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様によると、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含む脂質、エタノールアミン官能基を含む脂質、及びステロール、例えば、コレステロールの一つ又は複数を含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様によると、リポソーム製剤はＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ；及びＤＯＰＥを含む。
一部の態様によると、本開示は、一つ又は複数の医薬賦形剤、例えば、スクロース及び／又はグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
一部の態様によると、本開示は、構造において単層又は多層のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。一部の態様によると、本開示は、多小胞粒子及び／又は発泡体ベースの粒子を含むリポソーム製剤を提供する。一部の態様によると、本開示は、共通ナノ粒子に対する相対サイズにおいてより大きく、サイズにおいて約１５０～２５０ｎｍであるリポソーム製剤を提供する。一部の態様によると、リポソーム製剤は凍結乾燥粉末である。
一部の態様によると、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱い塩基を加えることにより、本明細書中に開示又は記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製及び装填されるリポソーム製剤を提供する。この添加によって、リポソームの外側のｐＨが約７．３まで増加し、ＡＰＩがリポソーム中に駆動される。一部の態様によると、本開示は、リポソーム内部で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合では、リポソームの内側はｐＨ４～６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、高分子又は非高分子の高荷電アニオン及びリポソーム内捕捉剤、例えば、ポリリン酸又はオクタ硫酸スクロースが利用される。
一部の態様によると、本開示は、ｃｅＤＮＡ及びイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、２０１８年９月７日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２において開示されるプロセスにより得られたｃｅＤＮＡで作製及び装填された脂質ナノ粒子製剤が、本明細書中に組み入れられる。これは、エタノール脂質と水性ｃｅＤＮＡを低ｐＨで高エネルギー混合することにより達成することができ、それは、イオン化可能な脂質をプロトン化し、ｃｅＤＮＡ／脂質の会合及び粒子の核形成のために好ましいエネルギーを提供する。粒子は、水性希釈及び有機溶媒の除去を通じてさらに安定化させることができる。粒子は所望のレベルに濃縮することができる。
一般的に、脂質ナノ粒子は、約１０：１～６０：１の総脂質対ｃｅＤＮＡ（質量又は重量）比率で調製される。一部の実施形態によると、脂質対ｃｅＤＮＡ比率（質量／質量比率；ｗ／ｗ比率）は、約１：１～約６０：１、約１：１～約５５：１、約１：１～約５０：１、約１：１～約４５：１、約１：１～約４０：１、約１：１～約３５：１、約１：１～約３０：１、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、約６：１～約９：１；約３０：１～約６０：１の範囲中とすることができる。一部の実施形態によると、脂質粒子（例、脂質ナノ粒子）は、約６０：１のｃｅＤＮＡ（質量又は重量）対総脂質で調製される。一部の実施形態によると、脂質粒子は、約１０：１～３０：１の総脂質対ｃｅＤＮＡ（質量又は重量）比率で調製される。一部の実施形態によると、脂質対ｃｅＤＮＡ比率（質量／質量比率；ｗ／ｗ比率）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、又は約６：１～約９：１の範囲中とすることができる。脂質及びｃｅＤＮＡの量は、所望のＮ／Ｐ比率、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより高いＮ／Ｐ比率を提供するように調整することができる。一般的に、脂質粒子製剤の全体的な脂質含量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であることができる。
イオン化可能な脂質は、典型的には、核酸カーゴ、例えば、ｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮し、膜の会合及び融合性を駆動するために用いられる。一般的に、イオン化可能な脂質は、酸性条件下で、例えば、ｐＨ６．５又はそれ以下で正に荷電される又はプロトン化される少なくとも一つのアミノ基を含む脂質である。イオン化可能な脂質はまた、本明細書中ではカチオン性脂質として言及される。
例示的なイオン化可能な脂質が、国際ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１５／０９５３４０、ＷＯ２０１５／１９９９５２、ＷＯ２０１８／０１１６３３、ＷＯ２０１７／０４９２４５、ＷＯ２０１５／０６１４６７、ＷＯ２０１２／０４０１８４、ＷＯ２０１２／０００１０４、ＷＯ２０１５／０７４０８５、ＷＯ２０１６／０８１０２９、ＷＯ２０１７／００４１４３、ＷＯ２０１７／０７５５３１、ＷＯ２０１７／１１７５２８、ＷＯ２０１１／０２２４６０、ＷＯ２０１３／１４８５４１、ＷＯ２０１３／１１６１２６、ＷＯ２０１１／１５３１２０、ＷＯ２０１２／０４４６３８、ＷＯ２０１２／０５４３６５、ＷＯ２０１１／０９０９６５、ＷＯ２０１３／０１６０５８、ＷＯ２０１２／１６２２１０、ＷＯ２００８／０４２９７３、ＷＯ２０１０／１２９７０９、ＷＯ２０１０／１４４７４０、ＷＯ２０１２／０９９７５５、ＷＯ２０１３／０４９３２８、ＷＯ２０１３／０８６３２２、ＷＯ２０１３／０８６３７３、ＷＯ２０１１／０７１８６０、ＷＯ２００９／１３２１３１、ＷＯ２０１０／０４８５３６、ＷＯ２０１０／０８８５３７、ＷＯ２０１０／０５４４０１、ＷＯ２０１０／０５４４０６、ＷＯ２０１０／０５４４０５、ＷＯ２０１０／０５４３８４、ＷＯ２０１２／０１６１８４、ＷＯ２００９／０８６５５８、ＷＯ２０１０／０４２８７７、ＷＯ２０１１／０００１０６、ＷＯ２０１１／０００１０７、ＷＯ２００５／１２０１５２、ＷＯ２０１１／１４１７０５、ＷＯ２０１３／１２６８０３、ＷＯ２００６／００７７１２、ＷＯ２０１１／０３８１６０、ＷＯ２００５／１２１３４８、ＷＯ２０１１／０６６６５１、ＷＯ２００９／１２７０６０、ＷＯ２０１１／１４１７０４、ＷＯ２００６／０６９７８２、ＷＯ２０１２／０３１０４３、ＷＯ２０１３／００６８２５、ＷＯ２０１３／０３３５６３、ＷＯ２０１３／０８９１５１、ＷＯ２０１７／０９９８２３、ＷＯ２０１５／０９５３４６、及びＷＯ２０１３／０８６３５４、ならびに米国特許公開ＵＳ２０１６／０３１１７５９、ＵＳ２０１５／０３７６１１５、ＵＳ２０１６／０１５１２８４、ＵＳ２０１７／０２１０６９７、ＵＳ２０１５／０１４００７０、ＵＳ２０１３／０１７８５４１、ＵＳ２０１３／０３０３５８７、ＵＳ２０１５／０１４１６７８、ＵＳ２０１５／０２３９９２６、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、ＵＳ２０１７／０１１９９０４、ＵＳ２０１２／０１４９８９４、ＵＳ２０１５／００５７３７３、ＵＳ２０１３／００９０３７２、ＵＳ２０１３／０２７４５２３、ＵＳ２０１３／０２７４５０４、ＵＳ２０１３／０２７４５０４、ＵＳ２００９／００２３６７３、ＵＳ２０１２／０１２８７６０、ＵＳ２０１０／０３２４１２０、ＵＳ２０１４／０２００２５７、ＵＳ２０１５／０２０３４４６、ＵＳ２０１８／０００５３６３、ＵＳ２０１４／０３０８３０４、ＵＳ２０１３／０３３８２１０、ＵＳ２０１２／０１０１１４８、ＵＳ２０１２／００２７７９６、ＵＳ２０１２／００５８１４４、ＵＳ２０１３／０３２３２６９、ＵＳ２０１１／０１１７１２５、ＵＳ２０１１／０２５６１７５、ＵＳ２０１２／０２０２８７１、ＵＳ２０１１／００７６３３５、ＵＳ２００６／００８３７８０、ＵＳ２０１３／０１２３３３８、ＵＳ２０１５／００６４２４２、ＵＳ２００６／００５１４０５、ＵＳ２０１３／００６５９３９、ＵＳ２００６／０００８９１０、ＵＳ２００３／００２２６４９、ＵＳ２０１０／０１３０５８８、ＵＳ２０１３／０１１６３０７、ＵＳ２０１０／００６２９６７、ＵＳ２０１３／０２０２６８４、ＵＳ２０１４／０１４１０７０、ＵＳ２０１４／０２５５４７２、ＵＳ２０１４／００３９０３２、ＵＳ２０１８／００２８６６４、ＵＳ２０１６／０３１７４５８、及びＵＳ２０１３／０１９５９２０において記載されており、それらの全ての内容が、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
一部の実施形態によると、イオン化可能な脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である。
脂質ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９－８５３３において記載されており、その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。一部の他の実施形態によると、イオン化可能な脂質は、以下の構造の任意の一つを有する。
一部の実施形態によると、イオン化可能な脂質は、ＷＯ２０１５／０７４０８５において記載される脂質ＡＴＸ－００２であり、その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
一部の実施形態によると、イオン化可能な脂質は、ＷＯ２０１２／０４０１８４において記載されるように、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（化合物３２）であり、その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
一部の実施形態によると、イオン化可能な脂質は、ＷＯ２０１５／１９９９５２において記載される化合物６又は化合物２２であり、その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
限定されないが、イオン化可能な脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の２０～９０％（ｍｏｌ）を含むことができる。例えば、イオン化可能な脂質モル含量は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）、又は４０～５０％（ｍｏｌ）であり得る。一部の実施形態によると、イオン化可能な脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の約５０モル％～約９０モル％を含む。
一部の態様によると、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質をさらに含むことができ。非イオン性脂質は、両親媒性脂質、中性脂質、及びアニオン性脂質を含む。したがって、非カチオン性脂質は、中性非荷電脂質、双性イオン性脂質、又はアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的には、融合性を増強するために用いられる。
本明細書中に開示される方法及び組成物における使用について想定される例示的な非カチオン性脂質が、２０１８年９月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２、及び２０１８年１２月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２において記載されており、それは、その全体において本明細書中に組み入れられる。例示的な非カチオン性脂質は、国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０９９８２３及び米国特許出願公開ＵＳ２０１８／００２８６６４において記載されており、それらの両方の内容が、参照によりそれらの全体において本明細書中に組み入れられる。
非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を含むことができる。例えば、非カチオン性脂質含量は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の５～２０％（ｍｏｌ）又は１０～１５％（ｍｏｌ）である。様々な実施形態では、イオン化可能な脂質と中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。
一部の実施形態によると、脂質ナノ粒子は任意のリン脂質を含まない。一部の態様によると、脂質ナノ粒子は、膜の完全性を提供するために、成分、例えばステロールなどをさらに含むことができる。
脂質ナノ粒子中で使用することができる一つの例示的なステロールは、コレステロール及びその誘導体である。例示的なコレステロール誘導体が、国際出願ＷＯ２００９／１２７０６０及び米国特許公開ＵＳ２０１０／０１３０５８８において記載されており、それらの両方の内容が、参照によりそれらの全体において本明細書中に組み入れられる。
膜の完全性を提供する成分、例えばステロールなどは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～５０％（ｍｏｌ）を含むことができる。一部の実施形態によると、そのような成分は、脂質ナノ粒子の総脂質含量の２０～５０％（ｍｏｌ）３０～４０％（ｍｏｌ）である。
一部の態様によると、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコンジュゲートされた脂質分子をさらに含むことができる。一般的に、これらは、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、及び／又は立体安定化を提供するために使用される。例示的なコンジュゲート脂質は、限定されないが、ＰＥＧ脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）脂質コンジュゲート、ポリアミド脂質コンジュゲート（例えばＡＴＴＡ脂質コンジュゲートなど）、カチオン性ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物を含む。一部の実施形態によると、コンジュゲート脂質分子は、ＰＥＧ脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）コンジュゲート脂質である。例示的なＰＥＧ脂質コンジュゲートは、限定されないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（例えばｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（例えば４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はそれらの混合物を含む。追加の例示的なＰＥＧ脂質コンジュゲートは、例えば、ＵＳ５，８８５，６１３、ＵＳ６，２８７，５９１、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００５／０１７５６８２、ＵＳ２００８／００２００５８、ＵＳ２０１１／０１１７１２５、ＵＳ２０１０／０１３０５８８、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、及びＵＳ２０１７／０１１９９０４において記載されており、それらの全ての内容が、参照によりそれらの全体において本明細書中に組み入れられる。
一部の実施形態によると、ＰＥＧ脂質は、ＵＳ２０１８／００２８６６４において定義される化合物であり、その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。一部の実施形態によると、ＰＥＧ脂質は、ＵＳ２０１５０３７６１１５において又はＵＳ２０１６／０３７６２２４において開示されており、その両方の内容が、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル〕カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］の一つ又は複数であり得る。一部の実施例によると、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］からなる群から選択され得る。
ＰＥＧ以外の分子とコンジュゲートされた脂質をまた、ＰＥＧ脂質の代わりに使用することができる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）脂質コンジュゲート、ポリアミド脂質コンジュゲート（例えばＡＴＴＡ脂質コンジュゲートなど）、及びカチオン性ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲートを、ＰＥＧ脂質の代わりに、又はそれに加えて使用することができる。例示的なコンジュゲート脂質、即ち、ＰＥＧ脂質、（ＰＯＺ）脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ脂質コンジュゲート及びカチオン性ポリマー脂質が、国際特許出願公開ＷＯ１９９６／０１０３９２、ＷＯ１９９８／０５１２７８、ＷＯ２００２／０８７５４１、ＷＯ２００５／０２６３７２、ＷＯ２００８／１４７４３８、ＷＯ２００９／０８６５５８、ＷＯ２０１２／０００１０４、ＷＯ２０１７／１１７５２８、ＷＯ２０１７／０９９８２３、ＷＯ２０１５／１９９９５２、ＷＯ２０１７／００４１４３、ＷＯ２０１５／０９５３４６、ＷＯ２０１２／０００１０４、ＷＯ２０１２／０００１０４、及びＷＯ２０１０／００６２８２、米国特許出願公開ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００５／０１７５６８２、ＵＳ２００８／００２００５８、ＵＳ２０１１／０１１７１２５、ＵＳ２０１３／０３０３５８７、ＵＳ２０１８／００２８６６４、ＵＳ２０１５／０３７６１１５、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、ＵＳ２０１６／０３１７４５８、ＵＳ２０１３／０３０３５８７、ＵＳ２０１３／０３０３５８７、及びＵＳ２０１１０１２３４５３、ならびに米国特許ＵＳ５，８８５，６１３、ＵＳ６，２８７，５９１、ＵＳ６，３２０，０１７、及びＵＳ６，５８６，５５９において記載されており、それらの全ての内容が、参照によりそれらの全体において本明細書中に組み入れられる。
イオン化可能な脂質、ステロール、非カチオン性脂質、ＰＥＧ化脂質、及び場合により組織特異的標的化リガンドを含むＬＮＰ。
本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの一部の実施形態によると、本明細書中に提供される脂質ナノ粒子は、本明細書中に記載される少なくとも一つのイオン化可能な脂質、少なくとも一つのステロール、少なくとも一つの非カチオン性脂質、及び少なくとも一つのＰＥＧ化脂質を含む。本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの一実施形態では、本明細書中に提供される脂質ナノ粒子は、本明細書中に記載される少なくとも一つのイオン化可能な脂質、少なくとも一つのステロール、少なくとも一つの非カチオン性脂質、及び少なくとも一つのＰＥＧ化脂質から本質的になる。本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの一実施形態では、本明細書中に提供される脂質ナノ粒子は、本明細書中に記載される少なくとも一つのイオン化可能な脂質、少なくとも一つのステロール、少なくとも一つの非カチオン性脂質、及び少なくとも一つのＰＥＧ化脂質からなる。本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの一実施形態では、イオン化可能な脂質：ステロール：非カチオン性脂質：ＰＥＧ化脂質のモル比は、約４８（±５）：１０（±３）：４１（±５）：２（±２）、例えば、約４７．５：１０．０：４０．７：１．８又は約４７．５：１０．０：４０．７：３．０である。
本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの一部の実施形態によると、本明細書中に提供される脂質ナノ粒子は、本明細書中に記載される少なくとも一つのイオン化可能な脂質、少なくとも一つのステロール、少なくとも一つの非カチオン性脂質、少なくとも一つのＰＥＧ化脂質、及び組織特異的標的化リガンドを含む。本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの一実施形態では、組織特異的標的化リガンドはＧａｌＮＡｃである。本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの一実施形態では、本明細書中に提供される脂質ナノ粒子は、本明細書中に記載される少なくとも一つのイオン化可能な脂質、少なくとも一つのステロール、少なくとも一つの非カチオン性脂質、少なくとも一つのＰＥＧ化脂質、及び組織特異的標的化リガンドから本質的になる。本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの一実施形態では、本明細書中に提供される脂質ナノ粒子は、本明細書中に記載される少なくとも一つのイオン化可能な脂質、少なくとも一つのステロール、少なくとも一つの非カチオン性脂質、少なくとも一つのＰＥＧ化脂質、及び組織特異的標的化リガンドからなる。本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの一実施形態では、組織特異的標的化リガンドは、ＰＥＧ化脂質複合体を形成するためにＰＥＧ化脂質とコンジュゲートされる。本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは、一、二、三、又は四分岐ＧａｌＮＡｃ－ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００である。本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ化脂質コンジュゲートは四分岐ＧａｌＮＡｃ－ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００である。本明細書中の態様又は実施形態のいずれかの一実施形態では、イオン化可能な脂質：ステロール：非カチオン性脂質：ＰＥＧ化脂質：ＰＥＧ化脂質コンジュゲートの比率は、約４８（±５）：１０（±３）：４１（±５）：２（±２）：１．５（±１）、例えば、４７．５：１０．０：４０．２：１．８：０．５又は４７．５：１０．０：３９．５：２．５：０．５である。
組み合わせ
一部の実施形態によると、プライムブースト組成物のいずれかは、一つ又は複数の追加的な治療薬剤、例えば、抗癌治療薬、自己免疫治療薬、感染性疾患治療薬との組み合わせにおいて投与される。一部の実施形態によると、薬剤は、本明細書中に記載される第二の抗原又は免疫原性ペプチドである。
一部の実施形態では、ｃｅＤＮＡ及び追加の薬剤の効果は相乗的である。用語「相乗的」又は「相乗」は、二つ以上の薬剤の組み合わせの相加的効果を、それらの個々の効果と比較して意味する。一部の実施形態では、相乗的活性は、第一の薬剤が検出可能なレベルの出力Ｘを産生し、第二の薬剤が検出可能なレベルの出力Ｘを産生し、ならびに第一及び第二の薬剤が一緒に、相加的レベルを上回る出力Ｘを産生する場合に存在する。
一部のヒト腫瘍は、患者の免疫系により排除され得る。例えば、免疫「チェックポイント」分子に標的化されたモノクローナル抗体の投与は、完全応答及び腫瘍寛解に導き得る。そのような抗体の作用の様式は、腫瘍が抗腫瘍免疫応答からの防御として利用している免疫調節分子の阻害を通じている。これらの「チェックポイント」分子を（例、アンタゴニスト性抗体を用いて）阻害することにより、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させ、腫瘍細胞を破壊することが可能になり得る。例えば、一例として、限定されないが、ＣＴＬＡ－４又はＰＤ－１に標的化されたモノクローナル抗体の投与は、完全応答及び腫瘍寛解に導き得る。そのような抗体の作用の様式は、腫瘍が抗腫瘍免疫応答からの防御として利用しているＣＴＬＡ－４又はＰＤ－１の阻害を通じている。これらの「チェックポイント」分子を（例、アンタゴニスト性抗体を用いて）阻害することにより、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させ、腫瘍細胞を破壊することが可能になり得る。
このように、本明細書中に提供される一つ又は複数の腫瘍関連抗原をコードする核酸配列を含むｃｅＤＮＡベクターは、免疫「チェックポイント」分子に標的化された一つ又は複数の遮断抗体との組み合わせにおいて使用することができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書中に提供される組成物は、分子、例えばＣＴＬＡ－４又はＰＤ－１などに標的化された一つ又は複数の遮断抗体との組み合わせにおいて使用することができる。
一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡ組成物はアジュバントと投与される。アジュバントは、以下に限定されないが、フロイントアジュバント、ＧＭ－ＣＳＦ、モンタニド（例、モンタニドＩＭＳ １３１２、モンタニドＩＳＡ ２０６、モンタニドＩＳＡ ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ－５１）、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ（登録商標）、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラジェリンもしくはフラジェリン由来のＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標））、レシキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、インターロイキン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、インターフェロンαもしくはβ、又はそれらのペグ化誘導体、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、モノホスホリル脂質Ａ、油中水型及び水中油型エマルジョン、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）ベクターシステム、ポリ（ラクチドコグリコリド）［ＰＬＧ］ベース及びデキストラン微粒子、タラクトフェリンＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＡｑｕｉｌａのＱＳ２１スティミュロン、結核菌抽出物及び合成細菌細胞壁模倣物、Ｒｉｂｉ’ｓ Ｄｅｔｏｘ、Ｑｕｉｌ、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロミド、テムシロリムス、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＶＥＧＦトラップ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、及び抗ＣＴＬＡ４抗体を含む。ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドを使用して、ワクチン設定においてアジュバントの効果を増強することができる。
一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターの核酸配列は、アジュバントをコードする配列をさらに含む。
また、本明細書中に提供されるのは、本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現のための、脂質ナノ粒子封入昆虫細胞により産生された、又は合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター、及び医薬的に許容可能な担体もしくは賦形剤を含む医薬組成物である。
一部の態様によると、本開示は、一つ又は複数の医薬賦形剤をさらに含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。一部の実施形態によると、脂質ナノ粒子製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、及び／又はグリシンをさらに含む。
ｃｅＤＮＡベクターは、粒子の脂質部分と複合体化される、又は脂質ナノ粒子の脂質位置において封入されることができる。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡは、脂質ナノ粒子の脂質位置において完全に封入されることができ、それにより、それを、例えば、水溶液中のヌクレアーゼによる分解から保護する。一部の実施形態によると、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃での少なくとも約２０、３０、４５、又は６０分間にわたるヌクレアーゼへの脂質ナノ粒子の曝露後に実質的に分解されない。一部の実施形態によると、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃での少なくとも約３０、４５、もしくは６０分間、又は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間にわたる血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象に対して、例えば、哺乳類、例えばヒトなどに対して実質的に非毒性である。一部の態様によると、脂質ナノ粒子製剤は凍結乾燥粉末である。
一部の実施形態によると、脂質ナノ粒子は、少なくとも一つの脂質二重層を持つ固体コア粒子である。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、非二重層構造、即ち、非層（即ち、非二重層）形態を有する。限定されないが、非二重層形態は、例えば、三次元チューブ、ロッド、立方対称性などを含むことができる。例えば、脂質ナノ粒子の形態（層状対非層状）は、例えば、ＵＳ２０１０／０１３０５８８号において記載されるようなＣｒｙｏ－ＴＥＭ分析を使用して容易に評価及び特徴付けることができ、その内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
一部のさらなる実施形態によると、非層状形態を有する脂質ナノ粒子は、高電子密度である。一部の態様によると、本開示は、構造において単層又は多層のいずれかである脂質ナノ粒子を提供する。一部の態様によると、本開示は、多小胞粒子及び／又は発泡体ベースの粒子を含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。
脂質成分の組成及び濃度を制御することにより、脂質複合体が脂質粒子から交換する速度、及び次に、脂質ナノ粒子が融合性になる速度を制御することができる。また、例えば、ｐＨ、温度、又はイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質ナノ粒子が融合性になる速度を変動させる及び／又は制御することができる。脂質ナノ粒子が融合性になる速度を制御するために使用されることができる他の方法は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。また、脂質複合体の組成及び濃度を制御することにより、脂質粒子サイズを制御することができることが明らかであろう。製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６（２０ ｌ ０）を参照のこと、それらの両方が、参照によりそれらの全体において組み入れられる）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約７である。カチオン性脂質／イオン化可能脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用して脂質ナノ粒子中で決定することができる。
ＶＩＩＩ．治療の方法
本明細書中に開示されるワクチンレジメンの免疫学的有効量を投与することを含む、それを必要とする対象において免疫応答を誘導するための方法が本明細書中に提供される。一部の実施形態では、本明細書中に開示されるワクチンレジメンの免疫学的有効量を投与することを含む、それを必要とする対象において病原性生物に対する免疫応答を誘導するための方法が本明細書中に提供される。
一部の実施形態は、それを必要とする対象において第一及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導するための、本明細書中に開示される構築物又は組成物の使用を提供する。一部の実施形態は、ワクチンレジメンにおける本明細書中に開示される構築物又は組成物の使用を提供する。一部の実施形態は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導する薬物の製造における、本明細書中に開示される構築物又は組成物の使用を提供する。
本明細書中で提供するのは、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導する方法であって、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ＤＮＡを含むプライミングワクチンを対象に投与すること、それにおいて、ＤＮＡが第一のペプチドをコードし；及び（ｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）、又は（ｉｉ）第二のペプチドを含むブースティングワクチンを対象に投与すること、それにおいて、ＲＮＡが第二のペプチドをコードし、それにより、対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導すること、を含む。
ワクチンレジメンであって、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ＤＮＡを含むプライミングワクチンを含み、それにおいて、ＤＮＡが第一のペプチドをコードし；及び（ｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）、又は（ｉｉ）第二のペプチドを含むブースティングワクチンであって、それにおいて、ＲＮＡが第二のペプチドをコードする、がまた提供される。
本明細書中に記載される抗体、又は抗原結合断片についての標的（即ち、抗原）は、例えば、細菌、ウイルス、真菌、及び寄生虫感染因子を含む、様々な病原体から選択されてもよい。適切な標的は、癌もしくは癌関連抗原又は同様のものをさらに含み得る。さらに他の標的は、自己免疫状態、例えば関節リウマチ（ＲＡ）又は多発性硬化症（ＭＳ）などを含み得る。
本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物についての標的は、例えば、細菌、ウイルス、真菌、及び寄生虫感染因子を含む、様々な病原体から選択され得る。適切な標的は、癌もしくは癌関連抗原又は同様のものをさらに含み得る。さらに他の標的は、自己免疫状態、例えば関節リウマチ（ＲＡ）又は多発性硬化症（ＭＳ）などを含み得る。
ウイルス標的の例は、オルトミクソウイルス科からのインフルエンザウイルスを含み、それは以下を含む：インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、及びインフルエンザＣ。Ａ型ウイルスは、最も病毒性のあるヒト病原体である。パンデミックと関連付けられてきたインフルエンザＡの血清型は、１９１８年にスペイン風邪、２００９年にブタ風邪を起こしたＨ１Ｎ１；１９５７年にアジア風邪を起こしたＨ２Ｎ２；１９６８年に香港風邪を起こしたＨ３Ｎ２；２００４年にトリ風邪を起こしたＨ５Ｎ１；Ｈ７Ｎ７；Ｈ１Ｎ２；Ｈ９Ｎ２；Ｈ７Ｎ２；Ｈ７Ｎ３；及びＨ１０Ｎ７を含む。
インフルエンザＡに対する、広範に中和する抗体が記載されている。本明細書中で使用されるように、「広範に中和する抗体」は、複数のサブタイプからの複数の株を中和することができる中和抗体を指す。例えば、ＣＲ６２６１［Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｃｒｕｃｅｌｌ］が、１９１８年「スペイン風邪」（ＳＣ１９１８／Ｈ１）を含む広範なインフルエンザウイルスに、及び２００４年にベトナムにおいてニワトリからヒトにジャンプしたＨ５Ｎ１クラスの鳥インフルエンザのウイルス（Ｖｉｅｔ０４／Ｈ５）に結合するモノクローナル抗体として記載されている。ＣＲ６２６１は、インフルエンザウイルスの表面上の優性タンパク質であるヘマグルチニンの膜近位ステムにおける高度に保存されたらせん領域を認識する。この抗体は、参照により本明細書中に組み入れられるＷＯ２０１０／１３０６３６において記載されている。別の中和抗体Ｆ１０［ＸＯＭＡ Ｌｔｄ］は、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１に対して有用であるとして記載されている。［Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．２００９，１６（３）：２６５－７３）］。インフルエンザに対する他の抗体、例えば、Ｆａｂ２８及びＦａｂ４９が選択されてもよい。例えば、参照により組み入れられる、ＷＯ２０１０／１４０１１４及びＷＯ２００９／１１５９７２を参照のこと。さらに他の抗体、例えばＷＯ２０１０／０１０４６６、米国公開特許公開ＵＳ／２０１１／０７６２６５、及びＷＯ２００８／１５６７６３において記載されるものなどが、容易に選択され得る。
他の標的病原性ウイルスは、アレナウイルス（フニンウイルス、マチュポウイルス、ラッサウイルスを含む）、フィロウイルス（マールブルグウイルス、エボラウイルスを含む）、ハンタウイルス、ピコルナウイルス科（ライノウイルス、エコーウイルスを含む）、コロナウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ＲＳウイルス、トガウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルスＢ１９、パラインフルエンザ、アデノウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス科からの天然痘（天然痘）及びワクシニア（牛痘）、ならびに水痘帯状疱疹（仮性狂犬病）を含む。
ウイルス性出血熱は、アレナウイルス科（ラッサ熱）（この科はまた、リンパ性脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）と関連付けられる）、フィロウイルス（エボラウイルス）、及びハンタウイルス（ピュアマラ）により起こされる。ピコルナウイルス（ライノウイルスの亜科）のメンバーは、ヒトにおける一般的な風邪と関連付けられる。コロナウイルス科は、多数の非ヒトウイルス、例えば感染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸管コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）などを含む。ヒト呼吸器コロナウイルスは、推定的には、一般的な風邪、非Ａ型、非Ｂ型、又は非Ｃ型肝炎、及び重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）と関連付けられてきた。パラミクソウイルス科は、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（ムンプスウイルス）、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（鶏）、牛疫、麻疹及びイヌジステンパーを含むモルビリウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含むニューモウイルスを含む。パルボウイルス科は、ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス、及びブタパルボウイルスを含む。アデノウイルス科は、呼吸器疾患を起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を含む。
細菌病原体に対する中和抗体構築物がまた、本開示における使用のために選択され得る。一実施形態では、中和抗体構築物は、細菌自体に対して向けられる。別の実施形態では、中和抗体構築物は、細菌により産生される毒素に対して向けられる。空中浮遊細菌病原体の例は、例えば、ナイセリア・メニンギティディス（髄膜炎）、クレブシエラ・ニューモニア（肺炎）、シュードモナス・エルギノーサ（肺炎）、シュードモナス・シュードマレイ（肺炎）、シュードモナス・マレイ（肺炎）、アシネトバクター（肺炎）、モラクセラ・カタラーリス、モラクセラ・ラクナータ、アルカリゲネス、カルジオバクテリア、ヘモフィルス・インフルエンザエ（インフルエンザ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ、ボルデテラ・パータシス（百日咳）、フランシセラ・ツラレンシス（肺炎／発熱）、レジオネラ・ニューモニア（レジオネラ症）、クラミジア・シタッシ（肺炎）、クラミジア・ニューモニアエ（肺炎）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（結核（ＴＢ））、マイコバクテリウム・カンサシ（ＴＢ）、マイコバクテリウム・アビウム（肺炎）、ノカルジア・アステロイデス（肺炎）、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、スタフィロコッカス・アウレウス（肺炎）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（猩紅熱）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（肺炎）、コリネバクテリウム・ジフテリア（ジフテリア）、マイコプラズマ・ニューモニエ（肺炎）を含む。
炭疽の原因物質は、バチルス・アンスラシスにより産生される毒素である。保護剤（ＰＡ）に対する中和抗体、トキソイドを形成する三つのペプチドの一つが記載されている。他の二つのポリペプチドは、致死因子（ＬＦ）及び浮腫因子（ＥＦ）からなる。抗ＰＡ中和抗体は、炭疽に対する受動的免疫化において有効であるとして記載されている。例えば、米国特許第７，４４２，３７３号；Ｒ．Ｓａｗａｄａ－Ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｅ Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００４；２：５．（オンライン、２００４年５月１２日）を参照のこと。さらに他の抗炭疽毒素中和抗体が記載されており、及び／又は生成され得る。同様に、他の細菌及び／又は細菌毒素に対する中和抗体を使用して、本明細書中に記載されるＡＡＶ送達抗病原体構築物を生成してもよい。
他の感染性疾患は、例えば、アスペルギルス種、アブシディア・コリンビフェラ、リゾプス・ストロニファー、ムコール・プルボース、クリプトコックス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラツム、ブラストミセス・デルマティティジス、コクシジオイデス・イミティス、ペニシリウム種、マイクロポリスポラ・ファエニ、サーモアクチノミセス・ブルガリス、アルテルナリア・アルテルナータ、クラドスポリウム種、ヘルミントスポリウム、及びスタキボトリス属を含む、空中浮遊真菌により起こされ得る。
また、受動免疫化を使用して、直接接触により伝達され得る真菌感染症（例、水虫）、白癬、又はウイルス、細菌、寄生虫、真菌、及び他の病原体を防止してもよい。また、家庭のペット、ウシ及び他の家畜、ならびに他の動物に影響を及ぼす様々な状態。例えば、イヌでは、イヌ副鼻腔アスペルギル症による上気道の感染は、有意な疾患を起こす。ネコでは、鼻を起源とする上気道疾患又はネコ呼吸器疾患複合体は、未処置のままにすると罹患及び死亡を起こす。ウシは、感染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ又は赤鼻と一般的に呼ばれる）による感染に易発性であり、ウシの急性伝染性ウイルス疾患である。また、ウシは、軽度から重度の呼吸器疾患を起こし、他の疾患に対する耐性を損ない得るウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）に易発性である。さらに他の病原体及び疾患が、当業者には明らかであろう。例えば、抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）中和抗体の生成を記載する、米国特許第５，８１１，５２４号を参照のこと。本明細書中に記載される技術は、他の病原体に適用可能である。そのような抗体は、インタクトで、又はその配列（足場）を修飾して、人工又は組換え中和抗体構築物を生成してもよい。そのような方法が記載されている〔例、ＷＯ２０１０／１３０３６；ＷＯ２００９／１１５９７２；ＷＯ２０１０／１４０１１４を参照のこと〕。
本明細書中に記載される抗新生物免疫グロブリンは、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）、例えばＨＥＲ２などを標的化しうる。例えば、トラスツズマブは、細胞ベースのアッセイにおいてヒト上皮成長因子受容体タンパク質の細胞外ドメインに高親和性（Ｋｄ＝５ｎＭ）を伴って選択的に結合する、組換えＩｇＧ１カッパ、ヒト化モノクローナル抗体である。市販の産物が、ＣＨＯ細胞培養において産生される。例えば、ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０００７２を参照のこと。トラスツズマブ軽鎖１及び２ならびに重鎖１及び２のアミノ酸配列、ならびにトラスツズマブのＸ線構造の試験から得られた配列は、アクセッション番号ＤＢ０００７２でこのデータベース上に提供され、それらの配列は、参照により本明細書中に組み入れられる。また、２１２－Ｐｂ－ＴＣＭＣ－トラスツズマブ［Ａｒｅｖａ Ｍｅｄ、メリーランド州ベセスダ］を参照のこと。目的の別の抗体は、例えば、ペルツズマブ、ヒト上皮成長因子受容体２タンパク質（ＨＥＲ２）の細胞外二量体化ドメイン（サブドメインＩＩ）を標的化する組換えヒト化モノクローナル抗体を含む。それは、それぞれ４４８残基及び２１４残基を有する二つの重鎖及び二つの軽鎖からなる。ＦＤＡは２０１２年６月８日に承認した。その重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、例えば、アクセッション番号ＤＢ０６３６６で、このデータベース上のｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０６３６６（同義語は、２Ｃ４、ＭＯＡＢ ２Ｃ４、モノクローナル抗体２Ｃ４、及びｒｈｕＭＡｂ－２Ｃ４を含む）において提供される。ＨＥＲ２に加えて、他のＨＥＲ標的を選択してもよい。
例えば、ＭＭ－１２１／ＳＡＲ２５６２１２は、ＨＥＲ３受容体を標的化する完全ヒトモノクローナル抗体であり［Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ’ｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｂｉｏｌｏｇｙ］、それは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、及び卵巣癌の治療において有用であることが報告されている。ＳＡＲ２５６２１２は、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）受容体を標的化する、研究中の完全ヒトモノクローナル抗体である［Ｓａｎｏｆｉ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ］。別の抗Ｈｅｒ３／ＥＧＦＲ抗体は、ＲＧ７５９７［Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ］であり、頭頸部癌において有用であるとして記載されている。別の抗体であるマルゲツキシマブ（又はＭＧＡＨ２２）、ＨＥＲ［ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ］を標的化する次世代Ｆｃ最適化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）がまた、利用され得る。
あるいは、他のヒト上皮細胞表面マーカー及び／又は他の腫瘍受容体もしくは抗原を標的化してもよい。他の細胞表面マーカー標的の例は、例えば、５Ｔ４、ＣＡ－１２５、ＣＥＡ（例、ラベツズマブにより標的化）、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例、リツキシマブにより標的化）、ＣＤ２２（例、エプラツズマブ又はベルツズマブにより標的化）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１（また、インテグリンαｖβ３）、ＣＤ１３３（例、神経膠芽腫細胞）、ＣＴＬＡ－４（例、神経芽腫の治療において使用されるイピリムマブ）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）受容体２（ＣＸＣＲ２）（脳中の異なる領域において発現される；例、抗ＣＸＣＲ２（細胞外）抗体＃ＡＣＲ－０１２（Ａｌｏｍｅｎｅ Ｌａｂｓ））；ＥｐＣＡＭ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）［例、ＷＯ２０１２０２０００６ Ａ２、脳腫瘍を参照のこと］、葉酸受容体アルファ（例、小児脳上衣脳腫瘍、頭頸部癌）、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ１）（抗ＦＧＦＲ１抗体を用いた癌の治療については、ＷＯ２０１２１２５１２４Ａ１を参照のこと）、ＦＧＦＲ２（例、ＷＯ２０１３０７６１８６Ａ及びＷＯ２０１１１４３３１８Ａ２において記載されている抗体を参照のこと）、ＦＧＦＲ３（例、米国特許第８，１８７，６０１号及びＷＯ２０１０１１１３６７Ａ１において記載されている抗体を参照のこと）、ＦＧＦＲ４（例、ＷＯ２０１２１３８９７５Ａ１において記載される抗ＦＧＦＲ４抗体を参照のこと）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（例、ＷＯ２０１０１１９９９１Ａ３における抗体を参照のこと）、インテグリンα５β１、ＩＧＦ－１受容体、ガングリオロシドＧＤ２（例、ＷＯ２０１１１６０１１９Ａ２において記載される抗体を参照のこと）、ガングリオシドＧＤ３、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）（とりわけ、神経膠腫に関連付けられ、抗体グレムバツムマブ（ＣＲ０１１）の標的、ムチン、ＭＵＣ１、ホスファチジルセリン（例、バビツキシマブにより標的化、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ］、前立腺癌腫細胞、ＰＤ－Ｌ１（例、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８）、完全ヒトｇＧ４、例、転移性黒色腫］、血小板由来成長因子受容体、アルファ（ＰＤＧＦＲα）又はＣＤ１４０、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、テネイシンＣ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）－Ａ（例、ベバシズマブによる標的化）及びＶＥＧＦＲ２（例、ラムシルマブによる標的化）を含む。
他の抗体及びそれらの標的は、例えば、ＡＰＮ３０１（ｈｕ１４．１９－ＩＬ２）、モノクローナル抗体［小児における悪性黒色腫及び神経芽細胞腫、Ａｐｅｉｒｏｎ Ｂｉｏｌｇｉｃｓ、オーストリア、ウイーン］を含む。また、例えば、モノクローナル抗体８Ｈ９を参照のこと。それは、転移性脳癌を含む固形腫瘍の治療のために有用であるとして記載されている。モノクローナル抗体８Ｈ９は、Ｂ７Ｈ３抗原についての特異性を伴うマウスＩｇＧ１抗体である［Ｕｎｉｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ］。このマウス抗体は、ヒト化することができる。Ｂ７－Ｈ３及び／又はＢ７－Ｈ４抗原を標的化するさらに他の免疫グロブリン構築物が本明細書中で使用され得る。別の抗体は、Ｓ５８（抗ＧＤ２、神経芽細胞腫）である。ＣＯＴＡＲＡ［Ｐｅｒｒｅｇｒｉｎｃｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ］は、再発性膠芽腫の治療について記載されるモノクローナル抗体である。他の抗体は、例えば、アバスチン、フィクラツズマブ、ｍｅｄｉ－５７５、及びオララツマブを含む。さらに他の免疫グロブリン構築物又はモノクローナル抗体が、本明細書中での使用のために選択され得る。例えば、Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，２０１３ Ｒｅｐｏｒｔ，ｐｐ．１－８７、ＰｈＲＭＡ’ｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ＆Ｐｕｂｌｉｃ Ａｆｆａｉｒｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ．（２０２）８３５－３４６０の刊行物を参照のこと。それは、参照により本明細書中に組み入れられる。
例えば、免疫原は、様々なウイルス科から選択されてもよい。免疫応答が望ましいであろうウイルス科の例は、一般的な風邪の症例の約５０％について関与している、ライノウイルス属を含むピコルナウイルス科；ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、及びヒトエンテロウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルスなどを含むエンテロウイルス属；ならびに主に非ヒト動物において口蹄疫について関与しているアプトウイルス属を含む。ウイルスのピコルナウイルス科内では、標的抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、及びＶＰＧを含む。別のウイルス科はカルシウイルス科を含み、それは、ウイルスのノーウォーク群を包含し、それは、流行性胃腸炎の重要な原因物質である。ヒト及び非ヒト動物における免疫応答を誘導するために抗原を標的化する際での使用のために望ましいさらに別のウイルス科は、トガウイルス科であり、それは、アルファウイルス属を含み、それは、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、及びベネズエラ、東部＆西部ウマ脳炎、ならびにルベラウイルスを含むルビウイルスを含む。フラビウイルス科は、デング熱ウイルス、黄色熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、及びマダニ媒介性脳炎ウイルスを含む。他の標的抗原は、Ｃ型肝炎又はコロナウイルス科から生成され得るが、それは、多数の非ヒトウイルス、例えば感染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸内コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）、ならびに一般的な風邪及び／又は非Ａ、Ｂ、もしくはＣ型肝炎を起こし得るヒト呼吸器コロナウイルスなどを含む。コロナウイルス科内では、標的抗原は、Ｅ１（また、Ｍ又はマトリクスタンパク質と呼ばれる）、Ｅ２（また、Ｓ又はスパイクタンパク質と呼ばれる）、Ｅ３（また、ＨＥ又はヘマグルチン－エルテロースと呼ばれる）糖タンパク質（全てのコロナウイルスにおいて存在するわけではない）、又はＮ（ヌクレオカプシド）を含む。さらに他の抗原は、ラブドウイルス科に対して標的化され得るが、それは、ベシキュロウイルス属（例、水疱性口炎ウイルス）、及び一般的なリッサウイルス（例、狂犬病）を含む。
ラブドウイルス科内で、適切な抗原は、Ｇタンパク質又はＮタンパク質から由来し得る。フィロウイルス科は、出血熱ウイルス、例えばマールブルクウイルス及びエボラウイルスなどを含み、適切な抗原の供給源であり得る。パラミクソウイルス科は、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（ムンプスウイルス）、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（鶏）、牛疫、麻疹及びイヌジステンパーを含むモルビリウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルスを含むニューモウイルスを含む。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科内で分類され、適切な抗原の供給源（例、ＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）である。ブニヤウイルスは、ブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス（リフトバレー熱）、ハンタウイルス（プレマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハギン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス（ナイロビヒツジ病）、及び様々な未割り当てのブニヤウイルスを含む。アリーナウイルス科は、ＬＣＭ及びラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルス科は、レオウイルス属、ロタウイルス（それは、小児において急性胃腸炎を起こす）、オルビウイルス、及びカルチウイルス（コロラドダニ熱、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）を含む。
レトロウイルス科はオンコリビリナル（ｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）亜科を含み、それは、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ、レンチウイルス（それは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス、及びスプマビリナル（ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｌ）を含む）などのヒト及び獣医疾患を包含する。レンチウイルスの間で、多くの適切な抗原が記載されており、標的として容易に選択されることができる。適切なＨＩＶ抗原及びＳＩＶ抗原の例は、限定されないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、及びＲｅｖタンパク質、ならびにその様々な断片を含む。例えば、Ｅｎｖタンパク質の適切な断片は、そのサブユニット、例えばｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１、又はそれらのより小さな断片など、例えば、少なくとも約８アミノ酸長、のいずれかを含み得る。同様に、ｔａｔタンパク質の断片が選択されてもよい。米国特許第５，８９１，９９４号及び第６，１９３，９８１号を参照のこと。また、Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（５）：２４６２－２４６７（Ｍａｒｃｈ ２００１）、及びＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９－７４（６ Ａｐｒ．２００１）において記載されるＨＩＶタンパク質及びＳＩＶタンパク質を参照のこと。別の例では、ＨＩＶ及び／又はＳＩＶ免疫原性タンパク質又はペプチドを使用して、融合タンパク質又は他の免疫原性分子を形成してもよい。例えば、２００１年８月２日に公開されたＷＯ０１／５４７１９、及び１９９９年４月８日に公開されたＷＯ９９／１６８８４において記載されるＨＩＶ－１ Ｔａｔ及び／又はＮｅｆ融合タンパク質ならびに免疫化レジメンを参照のこと。本発明は、本明細書中に記載されるＨＩＶ及び／又はＳＩＶ免疫原性タンパク質又はペプチドに限定されない。また、これらのタンパク質に対する様々な修飾が記載されている、又は当業者により容易に作製されることができ得る。例えば、米国特許第５，９７２，５９６号において記載されている修飾ｇａｇタンパク質を参照のこと。
パポバウイルス科は、亜科ポリオーマウイルス（ＢＫＵウイルス及びＪＣＵウイルス）及び亜科パピローマウイルス（癌又はパピローマの悪性進行に関連付けられる）を含む。アデノウイルス科は、呼吸器疾患及び／又は腸炎を起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を含む。パルボウイルス科は、ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス、及びブタパルボウイルスを含む。ヘルペスウイルス科は、単純ウイルス属（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、水痘ウイルス属（仮性狂犬病、水痘帯状疱疹）を含むアルファヘルペスウイルス亜科、サイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）を含むベータヘルペスウイルス亜科、及びリンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルス、及びラジノウイルスを含むガンマヘルペスウイルス亜科を含む。ポックスウイルス科はコードポックスウイルス亜科を含み、それは、オルトポックスウイルス属（痘瘡（天然痘）及びワクシニア（牛痘））、パラポックスウイルス属、アビポックスウイルス属、カプリポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属、スイポックスウイルス属、及びエントモポックスウイルス亜科を含む。ヘパドナウイルス科はＢ型肝炎ウイルスを含む。抗原の適切な供給源であり得る一つの未分類ウイルスは、デルタ型肝炎ウイルスである。さらに他のウイルス供給源は、トリ感染性滑液包疾患ウイルスならびにブタ呼吸器及び生殖症候群ウイルスを含み得る。アルファウイルス科は、ウマ動脈炎ウイルス及び様々な脳炎ウイルスを含む。
抗体についての他の病原性標的は、例えば、ヒト及び非ヒト脊椎動物に感染する細菌、真菌、寄生微生物もしくは多細胞寄生虫を含み得る、又は癌細胞もしくは腫瘍細胞からである。細菌性病原体の例は、肺炎球菌；ブドウ球菌；及び連鎖球菌を含む病原性グラム陽性球菌を含む。病原性グラム陰性球菌は、髄膜炎菌；淋菌を含む。病原性腸内グラム陰性桿菌は、腸内細菌科；シュードモナス属；アシネトバクテリア属及びエイケネラ属；類鼻疽；サルモネラ属；シゲラ属；ヘモフィルス属；モラクセラ属；Ｈ．デュクレイ（軟性下疳を起こす）；ブルセラ属；フランシセラ・ツラレンシス（野兎病を起こす）；エルシニア属（パスツレラ属）；ストレプトバチルス・モニリフォルミス及びスピリルム属を含む；グラム陽性桿菌は、リステリア・モノサイトゲネス；エリジペロスリックス・ルジオパシエ；コリネバクテリウム・ジフテリア（ジフテリア）；コレラ；Ｂ．アントラシス（炭疽菌）；鼠径リンパ肉芽腫症（鼠径肉芽腫）；及びバルトネラ症を含む。病原性嫌気性細菌により起こされる疾患は、破傷風；ボツリヌス症；他のクロストリジウム；結核；ハンセン病；及び他のマイコバクテリアを含む。病原性スピロヘータ性疾患は、梅毒；トレポネーマ症：フランベジア、ピンタ、及び地方病性梅毒；ならびにレプトスピラ症を含む。より高い病原体細菌及び病原性真菌により起こされる他の感染症は、放線菌症；ノカルジア症；クリプトコッカス症；ブラストミセス症；ヒストプラズマ症及びコクシジオイデス症；カンジダ症、アスペルギルス症、及びムコール症；スポロトリクム症；パラコクシジオイデス症、ペトリエリジウム症、トルロプシス、菌腫及びクロモミコーシス；ならびに皮膚糸状菌症を含む。リケッチア感染症は、チフス熱、ロッキー山紅斑熱、Ｑ熱、及びリケッチア痘症を含む。マイコプラズマ感染及びクラミジア感染の例は、以下を含む：マイコプラズマ肺炎；鼠径リンパ肉芽腫；オウム病；及び周産期クラミジア感染症。病原性真核生物は、病原性原生動物及び蠕虫を含み、ならびに、それにより産生される感染症は、アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症；ニューモシスチス・カリニ；トリカンス（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）；トキソプラズマ・ゴンディ；バベシア症；ジアルジア症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫；吸虫類又は吸虫；及び条虫（サナダムシ）感染症を含む。
それにより産生されるこれらの生物及び／又は毒素の多くは、生物学的攻撃における使用の潜在能を有する薬剤として、疾病管理センター［（ＣＤＣ）、保健福祉省、米国］により特定されている。例えば これらの生物学的薬剤の一部は、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌム及びその毒素（ボツリヌス中毒）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、及びウイルス性出血熱（フィロウイルス（例、エボラ、マールブルグ）、及びアレナウイルス［例、ラッサ、マチュポ］）（それらの全てが、現在カテゴリーＡの病原体として分類されている）；コクシエラ・ブルネッティ（Ｑ熱）；バークホルデリア・マレイ（ブルセラ症）、バークホルデリア・シュードマレイ（鼻疽）、偽鼻疽菌（類鼻疽）、トウゴマ及びその毒素（リシン毒素）、クロストリジウム・パーフリンジェンス及びその毒素（イプシロン毒素）、スタフィロコッカス種及びそれらの毒素（エンテロトキシンＢ）、クラミジア・シッタシ（オウム病）、水の安全に対する脅威（例、ビブリオ・コレラエ、クリプトスポリジウム・パルバムなど）、発疹チフス（発疹チフスリケッチア）、及びウイルス性脳炎（アルファウイルス、例、ベネズエラウマ脳炎；東部ウマ脳炎；西部ウマ脳炎）；それらの全てが、現在カテゴリーＢ病原体として分類されている；ならびに、ニパンウイルス及びハンタウイルス（それらは、現在カテゴリーＣ病原体として分類されている）を含む。また、そのように分類されるか、又は異なって分類される他の生物は、将来において、そのような目的のために特定及び／又は使用され得る。本明細書中に記載されるウイルスベクター及び他の構築物は、これらの生物、ウイルス、それらの毒素又は他の副産物からの抗原を標的化するのに有用であり、それらによって、これらの生物学的薬剤を用いて感染又は他の有害反応が防止及び／又は治療されるであろうことが容易に理解されよう。
ｃｅＤＮＡベクターを投与される対象は、ウイルス感染、例えば、インフルエンザ感染を有する、又は感染を発生しやすいであろう。感染症を発生しやすい対象、又は（例、コロナウイルス又はインフルエンザウイルスの）感染に罹る上昇リスクがあり得る対象は、自己免疫疾患のために損なわれた免疫系を伴う対象、免疫抑制治療を受けている対象（例えば、臓器移植後）、ヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）又は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に罹患している対象、白血球を枯渇又は破壊する貧血の形態を伴う対象、放射線又は化学療法を受けている対象、あるいは炎症性障害に罹患している対象を含む。加えて、非常に若い（例、５歳又はそれより若い）あるいは高齢（例、６５歳又はそれより高齢）の対象は、増加リスクにある。さらに、対象は、疾患の大流行に近いこと、例えば、対象が人口密集都市に住んでいる、又は確認された、もしくは疑われるウイルス感染を有する対象の近くにいる、あるいは職業の選択、例えば、病院職員、製薬研究者、感染地域への旅行者、又は頻繁な飛行機搭乗者に起因して、ウイルス感染に罹るリスクがあり得る。
本開示はまた、本明細書中に記載される抗原又は免疫原性ペプチドの発現のためのｃｅＤＮＡベクターを、疾患又は障害、例えば、ウイルス感染のリスクがある対象に予防的に投与して、そのような感染を防止することを包含する。「防止する」又は「防止している」は、本明細書中に記載される抗原の発現用ｃｅＤＮＡベクター又は免疫原性ペプチドを対象に投与して、対象の身体における疾患又は感染症（例、ウイルス感染症）の発現を阻害することを意味し、それについて、本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）の発現用ｃｅＤＮＡベクターは、有効又は治療有効量又は用量で対象に投与される場合に有効である。
一部の実施形態では、対象におけるウイルス感染の徴候又は症状は、例えば、ウイルス力価アッセイ（例、胚性ニワトリ卵におけるコロナウイルス増殖又はコロナウイルススパイクタンパク質アッセイ）により決定される、対象の身体におけるウイルスの生存又は増殖である。ウイルス感染の他の徴候及び症状が、本明細書中で考察される。
上に記述されるように、一部の実施形態によると、対象は非ヒト動物であってもよく、本明細書中で考察される抗体及び抗原結合断片は、非ヒト動物（例、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、及び同様のもの）において疾患を治療及び／又は防止するために、獣医学的状況において使用されてもよい。
本開示は、本明細書中に記載されるワクチンレジメンの治療有効量を対象に投与することにより、それを必要とする対象において、ウイルス感染（例、コロナウイルス感染）を治療又は防止するための、あるいは、ウイルス感染に続発する徴候又は症状である、ウイルス感染の少なくとも一つの徴候又は症状、例えば発熱又は熱っぽい感じ／悪寒；咳；喉の痛み；鼻水又は鼻づまり；くしゃみ；筋肉又は身体の痛み；頭痛；疲労（倦怠感）；嘔吐；下痢；呼吸器感染症；胸部不快感；息切れ；気管支炎；及び／又は肺炎などの退縮又は排除を誘導する、あるいはその進行を阻害するための方法を提供する。
サイトカイン分泌細胞を検出するためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
フィルター免疫プラークアッセイは、他では酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）と呼ばれ、個々の抗体分泌Ｂ細胞を検出及び定量化するために最初に開発された。この技術は元々、従来のプラーク形成細胞アッセイに対する迅速で多用途の代替物を提供する。最近の修飾によって、一秒当たりわずか１００の分子の特定のタンパク質を産生する細胞を検出することができるように、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの感度が改善されている。これらのアッセイは、タンパク質分泌細胞を直に取り囲む環境中の所与のタンパク質（例えばサイトカインなど）の比較的高い濃度を利用する。これらの細胞産物は、高親和性抗体を使用して捕捉及び検出される。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、同じサイトカイン分子上の異なるエピトープに対して向けられた二つの高親和性サイトカイン特異的抗体：二つのモノクローナル抗体、又は一つのモノクローナル抗体及び一つの多価抗血清の組み合わせのいずれかを利用する。ＥＬＩＳｐｏｔは、単一の細胞により分泌されるサイトカインを検出する比色反応に基づいてスポットを生成する。スポットは、元のサイトカイン産生細胞の「足跡」を表す。スポット（即ち、スポット形成細胞又はＳＦＣ）は永久的であり、視覚的、顕微鏡的、又は電子的に定量化することができる。
一部の実施形態によると、本開示に対するＥＬＩＳｐｏｔアッセイの性能によって、ガンマインターフェロンの産生により測定される、本明細書中に開示されるプライム／ブーストワクチンレジメンへの応答において誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞の数が測定される。
細胞媒介性免疫応答の検出
テスト抗原に対する細胞媒介性免疫応答は、最も適した細胞ベースのアッセイを使用して分析することができ、それらは、５１Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイ（Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ Ａ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ Ｄ，Ｓｈｅｖａｃｈ Ｅ，Ｓｔｒｏｂｅｒ Ｗ，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、可溶性ＭＨＣクラスＩテトラマー染色、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ、及び細胞内サイトカイン分析を含む。
エクスビボ治療
一部の実施形態によると、細胞は対象から除去され、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターがその中に導入され、細胞は次に、対象中に戻して置き換えられる。エクスビボでの治療のために対象から細胞を除去し、それに続く、対象中に戻して導入する方法は、当技術分野において公知である（例、米国特許第５，３９９，３４６号において記載されている；その開示は、その全体において本明細書中に組み入れられる）。あるいは、ｃｅＤＮＡベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、又は任意の他の適切な供給源からの細胞中に導入され、細胞は、それを必要とする対象に投与される。
本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためにｃｅＤＮＡベクターで形質導入された細胞は、好ましくは、医薬担体との組み合わせにおける「治療有効量」において対象に投与される。当業者は、治療効果は、なんらかの利益が対象に提供される限り、完全又は治癒的である必要はないことを理解するであろう。
一部の実施形態によると、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで細胞中で産生される、本明細書中に記載される抗体及びその抗原結合断片をコードすることができる。例えば、本明細書中に記載される治療の方法における本明細書中に記載されるｃｅＤＮＡベクターの使用とは対照的に、一部の実施形態によると、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを培養細胞に導入してもよく、発現されたペプチド（例、抗原）を、一定期間後に、例えば、抗体及び融合タンパク質の産生のために細胞から単離してもよい。一部の実施形態によると、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む培養細胞は、抗体又は融合タンパク質の商業的生産のために使用することができ、例えば、抗体又は融合タンパク質の小規模又は大規模バイオ製造のための細胞供給源としての役割を果たす。代替的な実施形態では、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、宿主非ヒト対象において細胞中に導入され、小規模産生を含む、抗体又は融合タンパク質のインビボ産生のために、ならびに市販の大規模ペプチド（例、抗原）産生のために導入される。
本明細書中に開示される抗原及び免疫原性ペプチドの発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、獣医学的適用及び医学的適用の両方において使用することができる。上に記載されるエクスビボ遺伝子送達方法のための適切な対象は、トリ（例、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、及びキジ）及び哺乳類（例、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、及びウサギ類）の両方を含み、哺乳類が好ましい。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は、新生児、乳児、若年者、及び成人を含む。
用量範囲
本明細書中に提供されるのは、本明細書中に記載されるペプチド（例、抗原）をコードするｃｅＤＮＡベクターを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む治療の方法である。
インビボ及び／又はインビトロアッセイを場合により用いて、使用のための最適な投与量範囲を特定するのに役立ち得る。製剤において用いられる正確な用量はまた、投与の経路、及び状態の重篤度に依存し、ならびに当業者の判断、及び各対象の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデルテストシステムから由来する用量応答曲線から外挿することができる。
本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞にトランスフェクトし、過度の有害効果を伴わずに、十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供するのに十分な量において投与される。従来の医薬的に許容可能な投与の経路は、限定されないが、「投与」のセクションにおいて上に記載されるもの、例えば選択された器官への直接送達（例、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内及び気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、及び他の非経口の投与の経路などを含む。投与の経路を、望ましい場合、組み合わせることができる。
特定の「治療効果」を達成するために要求される、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの量の用量は、いくつかの要因に基づいて変動し得るが、限定されないが、核酸投与の経路、治療効果を達成するために要求される遺伝子又はＲＮＡ発現のレベル、治療されている特定の疾患又は障害、及び遺伝子、ＲＮＡ 産物、又は結果として得られる発現タンパク質の安定性を含む。当業者は、前述の因子、ならびに当技術分野において周知である他の因子に基づいて、特定の疾患又は障害を有する患者を治療するためのｃｅＤＮＡベクター用量範囲を容易に決定することができる。
ウイルス感染を治療又は防止するための、本明細書中に記載される抗原及び免疫原性ペプチドの発現のためのｃｅＤＮＡベクターの有効用量又は治療有効用量は、本明細書中に記載される抗原又は免疫原性ペプチドの発現のためのｃｅＤＮＡベクター、治療対象における感染の一つ又は複数の徴候及び／又は症状を緩和するために十分である抗原及び免疫原性ペプチドの量を指し、そのような徴候及び／又は症状の退縮又は排除を誘導することによる、あるいはそのような徴候及び／又は症状の進行を阻害することによる。用量の量は、投与される対象の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与の経路、及び同様のものに依存して変動し得る。本開示の実施形態では、例えば、成人ヒト対象におけるウイルス感染を治療又は防止するための、本開示の抗体又はその抗原結合性断片の有効用量又は治療有効用量は、約０．０１～約２００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１５０ｍｇ／ｋｇまでである。本開示の一実施形態では、投与量は、約１０．８又は１１グラム（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１グラム）までである。
投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返し投与することができ、例えば、いくつかの用量を毎日投与することができる、又は用量を、治療状況の緊急性により示されるように比例的に低下させることができる。当業者は、オリゴヌクレオチドが細胞又は対象に投与されるか否かにかかわらず、対象のオリゴヌクレオチドの適した用量及び投与のスケジュールを容易に決定することができるであろう。
臨床使用のための「治療有効用量」は、臨床治験を通して決定することができ、特定の適用に依存する比較的広範囲中に収まる（例、神経系細胞は非常に少量を要求する一方で、全身注射は大量を要求する）。例えば、ヒト対象の骨格筋又は心筋中への直接的なインビボ注射については、治療有効用量は、約１μｇ～１００ｇ程度のｃｅＤＮＡベクターである。エクソソーム又は微粒子を使用してｃｅＤＮＡベクターを送達する場合、次に、治療有効用量を実験的に決定することができるが、しかし、１μｇ～約１００ｇのベクターを送達することが予想される。さらに、治療有効用量は、対象に対して効果を有するために十分な量の導入遺伝子を発現するｃｅＤＮＡベクターの量であり、疾患の一部又は複数の症状による低下をもたらすが、しかし、有意なオフターゲット又は有意な有害副作用をもたらさない。一部の実施形態によると、「治療有効量」は、所与の疾患症状の低下における統計的に有意な、測定可能な変化を産生させるのに十分である発現ペプチド（例、抗原）の量である。そのような有効量は、臨床治験ならびに所与のｃｅＤＮＡベクター組成物についての動物試験において測ることができる。
インビトロトランスフェクションについては、細胞（ｌｘ１０６細胞）に送達される本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のための有効量のｃｅＤＮＡベクターは、０．１～１００μｇ程度のｃｅＤＮＡベクター、好ましくは１～２０μｇ、より好ましくは１～１５μｇ又は８～１０μｇである。より大きなｃｅＤＮＡベクターは、より高い用量を要求する。エクソソーム又は微粒子が使用される場合、有効なインビトロ用量を実験的に決定することができるが、しかし、一般的に同量のｃｅＤＮＡベクターを送達することが意図されるであろう。
治療は、単一用量又は複数用量の投与を含み得る。一部の実施形態によると、二つ以上の用量を対象に投与することができ；実際に、複数の用量を、必要に応じて投与することができる。なぜなら、ｃｅＤＮＡベクターが、ウイルスカプシドの非存在に起因して、抗カプシド宿主免疫応答を誘発しないためである。そのようなものとして、当業者は、適した用量数を容易に決定することができる。一部の実施形態によると、用量は、プライム用量投与レジメンにおいて投与される。
任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、本開示により記載されるようなｃｅＤＮＡベクターの投与により誘発される典型的な抗ウイルス免疫応答の欠如（即ち、カプシド成分の非存在）によって、ペプチド（例、抗原）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを、複数の機会に宿主に投与することが可能になる。一部の実施形態によると、核酸が対象に送達される機会の数は、２～１０回（例、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回）の範囲中である。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に５回を上回って送達される。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に３回を上回って送達される。一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に２回を上回って送達される。
単位投与形態
一部の実施形態によると、本明細書中に開示されるペプチド（例、抗原）の発現のためのプライムワクチン組成物を含む、又はペプチド（例、抗原）の発現のためのブーストワクチン組成物を含む医薬組成物は、便利に単位投薬形態で提示することができる。単位投与形態は、典型的には、医薬組成物の一つ又は複数の特定の投与の経路に対して適応される。
一部の実施形態によると、単位投与形態は、静脈内投与、筋肉内投与、又は皮下投与のために適応される。一部の実施形態によると、単位投与形態は、吸入による投与のために適応される。一部の実施形態によると、単位投与形態は、気化器による投与のために適応される。一部の実施形態によると、単位投与形態は、ネブライザーによる投与のために適応される。一部の実施形態によると、単位投与形態は、エアロゾライザーによる投与のために適応される。一部の実施形態によると、単位投与形態は、経口投与のために、頬側投与のために、又は舌下投与のために適応される。
目的の分子を産生するための方法
本開示の組成物及び方法は、本明細書中に開示される目的の遺伝子（ＧＯＩ）のオープンリーディングフレームにおいてコードされる、目的の分子、例えば、例、ポリペプチドなどを産生（例、発現）するために使用することができる。このように、本出願は、目的の分子、例えば、ポリペプチドなどを産生するための組成物及び方法をさらに提供する。
したがって、一部の実施形態は、対象において目的のポリペプチドを産生するための方法に関し、態様及び実施形態のいずれか一つによる本明細書中に記載されるプライムワクチン組成物及びブーストワクチン組成物を対象に投与することを含む。
本明細書中に開示される方法及び組成物は、例えば、水産、農業、動物飼育において使用されるものを含む対象と、ならびに／又はワクチン、医薬品、工業産物、化学物質、及び同様のものの製造において使用されるポリペプチドの産生を含む、治療的及び医薬的適用のために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書中に開示される組成物及び方法は、アルファウイルスの自然宿主、例えばげっ歯類、マウス、魚類、鳥類、及びより大きな哺乳類、例えばヒト、ウマ、ブタ、サル、類人猿など、ならびに無脊椎動物などである対象と使用することができる。一部の実施形態では、対象は脊椎動物種及び無脊椎動物種である。任意の動物種を一般的に使用することができ、例えば、哺乳類種、例えばヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ロバ、ハムスター、又はバッファローなどであることができる。一部の実施形態では、対象は、トリ種、甲殻類種、又は魚種である。
上述の幅広い対象を形質転換又はトランスフェクトするための技術は、当技術分野において公知であり、技術文献及び科学文献において記載されている。
ＩＸ．キット
本発明は、疾患又は状態、例えば、病原性生物により起こされるものを治療するための免疫原性、予防的、又は治療的レジメンの迅速な投与のための医薬キットを提供する。キットは、対象において免疫応答を誘導するための方法における使用のために設計されており、方法は、第一の免疫原性ペプチド又は抗原をコードするｃｅＤＮＡベクターを含むプライミング組成物の少なくとも一つの用量を対象に投与すること；及び、その後、ブースト組成物の少なくとも一つの用量を対象に投与することを含み、それにおいて、ブースト組成物は、第二の免疫原性ペプチド又は抗原をコードするｍＲＮＡを含む。
キットは、抗原をコードするｃｅＤＮＡを含む少なくとも一つの免疫原性組成物及び抗原をコードするＲＮＡ分子を含む少なくとも一つの免疫原性組成物を含む。キットは、抗原をコードするｃｅＤＮＡを含む少なくとも一つの免疫原性組成物及び抗原をコードするアミノ酸配列を含む少なくとも一つの免疫原性組成物を含む。キットは、各々の複数回投与のための構成要素ベクターの各々の複数の予め包装された用量を含んでもよい。キットの構成要素は、バイアル中に含まれてもよい。
本発明は、感染性病原性生物により起こされる疾患又は状態を治療するための免疫原性、予防、又は治療レジメンの素早い投与のための医薬キットを提供する。キットは、本明細書中に記載される方法のいずれかにおける使用のために設計される。
キットは、抗原をコードするｃｅＤＮＡベクターを含む少なくとも一つの免疫原性組成物及び抗原をコードするＲＮＡ分子を含む少なくとも一つの免疫原性組成物を含む。キットは、各々の複数回投与のための構成要素ベクターの各々の複数の予め包装された用量を含んでもよい。キットの構成要素は、バイアル中に含まれてもよい。
キットはまた、本明細書中に記載されるプライム／ブースト方法において免疫原性組成物を使用するための説明書を含む。それはまた、構成要素の免疫原性に関連するアッセイを実施するための説明書を含み得る。キットはまた、賦形剤、希釈剤、アジュバント、シリンジ、免疫原性組成物を投与する他の適した手段、又は除染もしくは他の廃棄の説明書を含み得る。
本発明のベクターは、当業者に公知の技術と併せて、本明細書中に提供される技術及び配列を使用して生成される。そのような技術は、ｃＤＮＡの従来のクローニング技術、例えばテキストにおいて記載されるものなど、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を提供する任意の適切な方法を含む。
全ての特許及び他の刊行物は、本出願全体を通して引用される、文献参照、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属中の特許出願を含めて、例えば、本明細書中に記載される技術との関連において使用され得るそのような刊行物において記載される方法論を記載及び開示する目的のために、参照により本明細書中に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日前に、それらの開示のみのために提供される。この点に関する何事も、本発明者らが、先行開示により、又は任意の他の理由のために、そのような開示に先立つ資格を有さないという承認として解釈されるべきではない。これらの文書の内容に関する日付又は表明に関する全ての記述が、申請者に入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確性に関する任意の承認を構成しない。
以下の実施例は、例証として提供され、限定ではない。ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書中に記載される野生型ＩＴＲ又は修飾ＩＴＲのいずれかから構築することができ、以下の例示的な方法を使用して、そのようなｃｅＤＮＡベクターを構築し及びその活性を評価することができることが当業者により理解されるであろう。本方法は、特定のｃｅＤＮＡベクターで例証される一方で、それらは、記載に従って任意のｃｅＤＮＡベクターに適用可能である。
実施例１：昆虫細胞ベースの方法を使用したｃｅＤＮＡベクターの構築
ポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用したｃｅＤＮＡベクターの産生が、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の実施例１において記載されており、それは、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。例えば、本開示のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスであり得る。理論に限定されることなく、許容宿主細胞では、例えば、Ｒｅｐの存在において、二つの対称ＩＴＲ及び発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ＩＴＲの少なくとも一つが野生型ＩＴＲ配列に対して修飾されており、複製してｃｅＤＮＡベクターを産生する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、二つの工程を受ける：第一に、Ｒｅｐタンパク質を介してテンプレート骨格（例、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスゲノムなど）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、及び第二に、切除されたｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介性複製。
実施例２：二本鎖ＤＮＡ分子からの切除を介した合成的ｃｅＤＮＡ産生
ｃｅＤＮＡベクターの合成的産生は、２０１９年１月１８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の実施例２～６において記載されており、それは、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。二本鎖ＤＮＡ分子の切除を含む合成的方法を使用して、ｃｅＤＮＡベクターを産生する一つの例示的な方法。簡単には、ｃｅＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物を使用して生成することができ、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図７Ａ～８Ｅを参照のこと。一部の実施形態によると、二本鎖ＤＮＡ構築物はｃｅＤＮＡプラスミドであり、例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２における図６を参照のこと）。
一部の実施形態によると、ｃｅＤＮＡベクターを作製するための構築物は、本明細書中に記載される調節スイッチを含む。
例証の目的のために、実施例２は、この方法を使用して生成された例示的な閉端ＤＮＡベクターとしてｃｅＤＮＡベクターを産生することを記載する。しかし、ｃｅＤＮＡベクターが本実施例において例示されており、ＩＴＲ及び発現カセット（例、核酸配列）を含む二本鎖ポリヌクレオチドの切除、それに続く本明細書中に記載される遊離３’末端及び５’末端のライゲーションにより、閉端ＤＮＡベクターを生成するためのインビトロ合成産生方法を例証している一方で、当業者は、上に例証されるように、任意の所望の閉端ＤＮＡベクターが、限定されないが、ドギーボーンＤＮＡ、ダンベルＤＮＡ及び同様のものを含めて、生成されるように二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド分子を修飾することができることを知っている。
方法は、（ｉ）発現カセットをコードする配列を二本鎖ＤＮＡ構築物から切除すること、及び（ｉｉ）ＩＴＲの一つ又は複数でヘアピン構造を形成すること、及び（ｉｉｉ）例えば、遊離５’末端及び３’末端を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによるライゲーションにより結合することを含む。
二本鎖ＤＮＡ構築物は、５’から３’の順序において、第一の制限エンドヌクレアーゼ部位；上流ＩＴＲ；発現カセット；下流ＩＴＲ；及び第二の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。二本鎖ＤＮＡ構築物を次に、一つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼと接触させて、制限エンドヌクレアーゼ部位の両方に二本鎖切断を生成する。一つのエンドヌクレアーゼは、両方の部位を標的化することができる、又は各部位は、制限部位がｃｅＤＮＡベクターテンプレート中に存在しない限り、異なるエンドヌクレアーゼにより標的化することができる。これによって、制限エンドヌクレアーゼ部位間の配列が、二本鎖ＤＮＡ構築物の残り部分から切除される（ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図９を参照のこと）。ライゲーション時に、閉端ＤＮＡベクターが形成される。
本方法において使用されるＩＴＲの一つ又は両方は、野生型ＩＴＲであってもよい。修飾ＩＴＲがまた使用されてもよく、ここで、修飾は、Ｂ及びＢ’アームならびに／あるいはＣ及びＣ’アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの一つ又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を含むことができ（例、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図６～８及び１０図１１Ｂを参照のこと）、二つ又はそれ以上のヘアピンループ（例、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図６～８図１１Ｂを参照のこと）又は単一のヘアピンループ（例、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図１０Ａ～１０Ｂ図１１Ｂを参照のこと）を有し得る。ヘアピンループ修飾ＩＴＲは、既存のオリゴの遺伝子修飾により、あるいはデノボ生物学的及び／又は化学的合成により生成することができる。
非限定的な例では、ＩＴＲ－６左及び右（配列番号１１１及び１１２）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＢ－Ｂ’アーム及びＣ－Ｃ’アームにおいて４０のヌクレオチド欠失を含む。修飾ＩＴＲにおいて残っているヌクレオチドは、単一のヘアピン構造を形成すると予測される。構造をアンフォールドするギブス自由エネルギーは約－５４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。ＩＴＲに対する他の修飾がまた、作製されてもよく、機能的Ｒｅｐ結合部位又はＴｒｓ部位の任意の欠失を含む。
実施例３：オリゴヌクレオチド構築を介したｃｅＤＮＡ産生
様々なオリゴヌクレオチドの組み立てを含む合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の実施例３において提供されており、ここで、ｃｅＤＮＡベクターは、５’オリゴヌクレオチド及び３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることにより産生される。ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図１１Ｂは、５’ＩＴＲオリゴヌクレオチド及び３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする例示的な方法を示す。
本明細書中に開示されるように、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、ＷＴ－ＩＴＲ、又は修飾ＩＴＲを含むことができる。（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図６Ａ、６Ｂ、７Ａ、及び７Ｂを参照のこと。それは、その全体において本明細書中に組み入れられる）。例示的なＩＴＲオリゴヌクレオチドは、限定されないが、配列番号１３４～１４５を含む（例、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２における表７を参照のこと）。修飾ＩＴＲは、Ｂ及びＢ’アームならびに／あるいはＣ及びＣ’アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの一つ又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を含むことができる。無細胞合成において使用される、本明細書中に記載されるＷＴ－ＩＴＲ又はｍｏｄ－ＩＴＲを含むＩＴＲオリゴヌクレオチドは、遺伝子修飾あるいは生物学的及び／又は化学的合成により生成されることができる。本明細書中で考察されるように、実施例２及び３におけるＩＴＲオリゴヌクレオチドは、本明細書中で考察されるように、対称又は非対称配置においてＷＴ－ＩＴＲ、又は修飾ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）を含むことができる。
実施例４：一本鎖ＤＮＡ分子を介したｃｅＤＮＡ産生
合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、その全体において参照により本明細書中に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の実施例４において提供されており、センス発現カセット配列に隣接し、アンチセンス発現カセットに隣接する二つのアンチセンスＩＴＲに共有結合的に付着されている二つのセンスＩＴＲを含む一本鎖直鎖ＤＮＡを使用し、その一本鎖直鎖ＤＮＡの末端が次にライゲーションされて、閉端一本鎖分子を形成する。一つの非限定的な例は、一本鎖ＤＮＡ分子を合成及び／又は産生すること、分子の部分をアニーリングさせて、二次構造の一つ又は複数の塩基対領域を有する単一の直鎖ＤＮＡ分子を形成すること、ならびに、次に、遊離５’末端及び３’末端を互いにライゲーションさせて、閉鎖一本鎖分子を形成することを含む。
ｃｅＤＮＡベクターの産生のための例示的な一本鎖ＤＮＡ分子は、５’から３’に以下を含む。
センス第一ＩＴＲ；
センス発現カセット配列；
センス第二ＩＴＲ；
アンチセンス第二ＩＴＲ；
アンチセンス発現カセット配列；及び
アンチセンス第一ＩＴＲ
実施例４の例示的な方法における使用のための一本鎖ＤＮＡ分子は、本明細書中に記載される任意のＤＮＡ合成方法論、例えば、インビトロＤＮＡ合成により形成されることができる、又はヌクレアーゼでＤＮＡ構築物（例、プラスミド）を切断し、結果として得られたｄｓＤＮＡ断片を溶融して、ｓｓＤＮＡ断片を提供することにより提供されることができる。
アニーリングは、センス配列対及びアンチセンス配列対の算出された融解温度を下回って温度を下げることにより達成することができる。融解温度は、特定のヌクレオチド塩基含量及び使用されている溶液の特性、例えば、塩濃度に依存的である。任意の所与の配列及び溶液の組み合わせについての融解温度は、当業者により容易に算出される。
アニーリングされた分子の遊離５’末端及び３’末端は、互いにライゲーションされることができる、又はヘアピン分子にライゲーションされて、ｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。適切な例示的なライゲーション方法論及びヘアピン分子を、実施例２及び３において記載する。
実施例５：雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬＮＰ：ＤＮＡ又はＬＮＰ：ｍＲＮＡ製剤の筋肉内投与後の抗スパイク抗体応答を評価するための試験
試験の目的は、プライムブーストレジメンにおけるＬＮＰ：ＤＮＡ又はＬＮＰ：ｍＲＮＡ製剤の筋肉内（ＩＭ）注射後の抗スパイクタンパク質抗体応答を評価することであった。試験デザイン及び詳細は、以下に示されるように行われた。
試験デザイン
表１３は、試験のデザインを示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２前融合安定化全長スパイクタンパク質抗原を、ＬＮＰ：ｃｅＤＮＡ又はＬＮＰ：ｍＲＮＡ Ｃ９イオン化可能な脂質ベースの製剤のいずれかとしてＩＭ注射により送達した。ブーストは、０日目のプライミング用量と同じ薬剤を用いるか、又は混合した（例、ｃｅＤＮＡ（プライム）－ｃｅＤＮＡ（ブースト）、ｃｅＤＮＡ（プライム）－ｍＲＮＡ（ブースト）、ｍＲＮＡ（プライム）－ｍＲＮＡ（ブースト）、又はｍＲＮＡ（プライム）－ｃｅＤＮＡ（ブースト））。
テストシステム
テストシステムは以下のとおりであった。
種：ハツカネズミ
系統：Ｂａｌｂ／ｃマウス
雌の数：７５匹、加えて３匹の予備
週齢：到着時に６週齢
供給源：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
収容：動物は、処置室において接触床を伴う透明なポリカーボネートケージ中に群で収容された。
食物及び水：動物に、Ｍｏｕｓｅ Ｄｉｅｔ ５０５８、及び１Ｎ ＨＣｌで標的ｐＨ２．５～３．０に酸性化された濾過水道水を自由に提供した。
テスト材料
化合物のクラス：組換えＤＮＡベクター：ｃｅＤＮＡ＆ｍＲＮＡ。
用量製剤：被験物質を濃縮ストック中で供給した。被験物質濃度を受け入れ時に記録した。
ストックを室温まで加温し、必要に応じて、使用前に直ちに、提供されるＰＢＳで希釈した。調製された材料は、投薬が直ちに実施されなかった場合、約４℃で保存された。
テスト材料の投与：テスト（又はコントロール）材料＃１は、２８日目に全ての１～１５群について動物１匹当たり３０μＬで投薬された。
テスト（又はコントロール）材料＃２は、１～５群については２８日目、６～１０群については５６日目、及び１１～１５群については８４日目に動物１匹当たり３０μＬで投薬された。
動物に、左腓腹筋中への筋肉内投与により投薬した。動物を、投薬手順のために、効果があるまで、吸入イソフルランで麻酔した。
残留材料：全ての残留の開封済み在庫は、今後の投薬のために保持され、冷蔵された。希釈された用量材料を、用量投与の完了後に廃棄した。
生存中の観察及び測定
ケージサイド観察（動物の健康確認）：ケージサイドの動物健康確認を少なくとも一日一回実施し、一般的な健康、死亡率、及び瀕死を確認した。
臨床観察：臨床観察が、各投薬後０＆２８、５６又は８４日目：６０～１２０分に、及び作業日の終了時（３～６時間後）に、及び０＆２８日目のテスト材料投薬後の１＆２９日目：２２～２６時間に実施された。２８、５６、又は８４日目にテスト材料投与を受けた動物のみが、投薬後の臨床観察を要求した。特別な注意が、注射の部位として、左後肢に払われた。
体重：全ての動物についての体重（残りの動物について適用可能である場合）が、０、１、２、３、７、１４、２１、２８、２９、３０、３１、３５、４２、４９、５６、５７、５８、５９、５７、５８、５９、６３、７０、７７、８４、８５、８６、８７、９１、９８及び１０５日目に記録される。追加の体重を、要求に応じて記録した。
麻酔及び回復：動物は、テスト施設のＳＯＰに従って、麻酔下、回復中、及び可動になるまで継続的にモニタリングされた。
血液収集
１～１５群における動物は、以下の表１４において示されるように、テスト材料投薬後の投薬０＆２８、５６又は７７日目；４～６時間に収集された血清についての中間血液を有した。１～５群における動物は、２１日目に収集された血清について中間血液を有した。６～１０群における動物は、２１＆４９日目に収集された血清について中間血液を有した。１１～１５群における動物は、２１、４９＆７７日目に収集された血清について中間血液を有した。
全ての動物は、血清採取のために全血液を有した。
血清用の全血液を、眼窩又は尾部収集により収集した。全血液を、凝固活性化管を伴う血清分離器中に収集し、施設ＳＯＰに従って血清の一つの（１）アリコートに処理した。
全てのサンプルを、ドライアイス上で出荷するまで、名目上は－７０℃で保存した。
各収集後、動物は、０．５～１．０ｍＬの乳化リンゲルを皮下で受けた。
血清用の全血液を、伏在静脈により収集した。全血液を、凝固活性化管を伴う血清分離器中に収集し、血清の一つのアリコートに処理した。
全てのサンプルを、ドライアイス上で出荷するまで、名目上は－７０℃で保存した。
麻酔の回復：適用可能な場合、動物を、麻酔下で、回復中に、及び可動になるまで連続的にモニタリングした。
末端手順及び収集
末端血液：全ての動物について、瀉血からの全血液を、凝固活性化管を伴う血清分離器中に収集し、施設ＳＯＰに従って血清の四つの（４）アリコートに処理した。
全てのサンプルを、ドライアイス上で出荷するまで、名目上は－７０℃で保存した。
末端組織：第１～１５群については、脾臓を回収し、秤量した。脾臓を、テスト施設プロトコルに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ解離キットを使用して脾細胞に処理した。処理後、脾臓を計数し、ペレット化し、１ｍＬ当たり１，０００万個の細胞で再懸濁した。収率及び解離細胞生存率を記録した。６，０００万個までの細胞（≦６アリコート）を、細胞培養凍結培地（Ｇｉｂｃｏ ＃１２６４８０１０）中の懸濁液として、１ｍＬ当たり１，０００万個の細胞で凍結した。任意の追加の細胞を廃棄した。
細胞は、ドライアイス上で出荷されるまで、名目上は－７０℃で保存した。
安楽死：動物を４９、７７、又は１０５日目に安楽死させた。動物をＣＯ２窒息により安楽死させ、その後に開胸術及び瀉血が続いた。
結果
前述の実施例は、ＬＮＰ：ｃｅＤＮＡ又はＬＮＰ：ｍＲＮＡテスト製剤により誘発される免疫応答を特徴付けるために、モデル抗原として、前融合安定化全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を使用した免疫原性プライムブーストレジメンを記載する。この抗原は、プライミング薬剤としてＬＮＰ：ｃｅＤＮＡを含むプライムブーストの組み合わせの普遍性を実証するための原理の証明として選ばれた。
上に記載されるように、動物を０日目に免疫化し、標準的なＳｐｉｋｅＶａｘスケジュールである２８日目、５６日目又は８４日目にブーストした。ブースター用量は、プライミング用量と同じ薬剤を用いた、又は異なっていた。例えば、ｃｅＤＮＡ（プライム）－ｃｅＤＮＡ（ブースト）、ｃｅＤＮＡ（プライム）－ｍＲＮＡ（ブースト）、ｍＲＮＡ（プライム）－ｍＲＮＡ（ブースト）、又はｍＲＮＡ（プライム）－ｃｅＤＮＡ（ブースト）。
図１は、試験の４９日目に決定されたスパイクタンパク質抗体力価を示す。ｍＲＮＡ構築物が、スパイクタンパク質抗体力価の比較のためのベンチマークとして使用された。図１中に示されるように、処置後４９日目に、一用量のｃｅＤＮＡは、一用量のｍＲＮＡと類似のスパイク結合力価を産生した。図２は、試験の７７日目に決定されたスパイクタンパク質抗体力価を示す。ｍＲＮＡ構築物が、スパイクタンパク質抗体力価の比較のためのベンチマークとして使用された。図２中に示されるように、処置後７７日目（０日目のプライム、５６日目のブースト）に、一用量のｃｅＤＮＡは、一用量のｍＲＮＡと類似のスパイク結合力価を産生した。図３は、試験の１０５日目に決定されたスパイクタンパク質抗体力価を示す。ｍＲＮＡ構築物が、スパイクタンパク質抗体力価の比較のためのベンチマークとして使用された。図３中に示されるように、処置後１０５日目に（０日目のプライム、５６日目のブースト；０日目のプライム、８４日目のブースト）、一用量のｃｅＤＮＡは、一用量のｍＲＮＡと類似のスパイク結合力価を産生した。図１～３中の結果は、ｃｅＤＮＡをプライムとして使用した異種プライムブースト戦略が、マウスにおいてより高い抗体力価の産生を効率的に誘導することができ得ることを示した。
図４は、アッセイ７７日目（０日目のプライム、５６日目のブースト）での、ＩＦＮγ＋、ＩＦＮγ＋及びＣＤ１０７＋、ＩＦＮγ＋及びＴＮＦα＋又はＩＬ４＋であった集団におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを描写するグラフである。図４は、ｃｅＤＮＡプライム－ｍＲＮＡブースト用量レジメンが、プライムとしてｃｅＤＮＡを、ブーストとしてｍＲＮＡを用いない相同プライム－ブースト戦略又は異種プライム－ブースト戦略よりも、ＩＦＮγ又はＩＦＮγ及びＴＮＦα又はＩＦＮγを産生し、Ｓ１ ペプチドプールへの応答において細胞溶解機能（細胞溶解性脱顆粒についてのマーカーとしてＣＤ１０７＋を使用）を呈する、有利により多くのＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導したことを実証する。この結果についての一つの論理的根拠は、プライムブーストならびに８週間の間隔を混合することが、この応答において役割を果たしていることであり得る。サイトカインＩＬ４の発現は、アレルギー応答の特徴であり、ウイルス応答において不適当である。図４中に示されるように、ＩＬ４レベルは低かった。
要約すると、実施例５におけるデータは、ｃｅＤＮＡワクチンプラットフォームが、コードされたモデル抗原に対する免疫応答の両方を誘発及び増強するための異種プライム／ブーストレジメンにおいて成功裏に組み合わせられることができ、改善されたワクチン戦略のデザインのための重要な候補であることを示す。
実施例６：雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬＮＰ：ＤＮＡ製剤の筋肉内投与後の抗スパイク抗体応答を評価する試験。
ｃｅＤＮＡベクターを、上の実施例１において記載される方法に従って産生した。
本試験の目的は、ＬＮＰ：ｃｅＤＮＡ製剤の筋肉内（ＩＭ）注射後の抗スパイクタンパク質抗体応答を評価することであった。試験デザイン及び詳細は、以下に示されるように行われた。
試験デザイン
表１８は、試験のデザインを示す。表１８中に示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原をコードする核酸を含むｃｅＤＮＡを、３０μｌ／動物の用量容積中で３μｇの用量レベルで、マウス（ｎ＝５）の６群（２～７群）において投薬した。第１群はコントロールとしての役割を果たした。投薬を、０日目及び２８日目に筋肉内（ＩＭ）注射により実施した。４９日目は、試験の終末時間点であった。
テストシステム
テストシステムは以下のとおりであった
種：ハツカネズミ
系統：Ｂａｌｂ／ｃマウス
雌の数：３５匹、加えて３匹の予備
週齢：到着時に６週齢
供給源：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
収容：動物は、処置室において接触床を伴う透明なポリカーボネートケージ中に群で収容された。
食物及び水：動物に、Ｍｏｕｓｅ Ｄｉｅｔ ５０５８、及び１Ｎ ＨＣｌで標的ｐＨ２．５～３．０に酸性化された濾過水道水を自由に提供した。
テスト材料
化合物のクラス：組換えＤＮＡベクター：ｃｅＤＮＡ
用量製剤：被験物質を濃縮ストック中で供給した。被験物質濃度を受け入れ時に記録した。
ストックを室温まで加温し、必要に応じて、使用前に直ちに、提供されるＰＢＳで希釈した。調製された材料は、投薬が直ちに実施されなかった場合、約４℃で保存された。
テスト材料の投与：被験物質及びコントロール物質は、０及び２８日目に、全ての１～７群について動物１匹当たり３０μＬで投薬された。投薬は、左腓腹筋中への筋肉内投与により実施された。動物を、投薬手順のために、施設ＳＯＰＳに従って、効果があるまで、吸入イソフルランで麻酔した。
残留材料：全ての残留の開封済み在庫は、今後の投薬のために保持され、冷蔵された。希釈された用量材料を、用量投与の完了後に廃棄した。
生存中の観察及び測定
ケージサイド観察（動物の健康確認）：ケージサイドの動物健康確認を少なくとも一日一回実施し、一般的な健康、死亡率、及び瀕死を確認した。
臨床観察：臨床観察が、各投薬後０＆２８日目：６０～１２０分に、及び作業日の終了時（３～６時間後）に、及び０＆２８日目のテスト材料投薬後の１＆２９日目：２２～２６時間に実施された。
体重：全ての動物についての体重（残りの動物について適用可能である場合）を、０、１、２、３、７、１４、２１、２８、２９、３０、３１、３５、４２及び４９日目に記録した。追加の体重を、要求に応じて記録した。
麻酔及び回復：動物は、テスト施設のＳＯＰに従って、麻酔下、回復中、及び可動になるまで継続的にモニタリングされた。
血液収集
１～７群における全ての動物が、以下の表１９及び表２０において示されるように、テスト材料投薬後の０日目；４～６時間に収集された血清についての中間血液を有した。
１～８群における動物は、２１日目に収集された血清について中間血液を有した。
血清用の全血液を、伏在静脈により収集した。全血液を、凝固活性化管を伴う血清分離器中に収集し、施設ＳＯＰに従って血清の一つの（１）アリコートに処理した。
全てのサンプルを、ドライアイス上で出荷するまで、名目上は－７０℃で保存した。
各収集後、動物は、０．５～１．０ｍＬの乳化リンゲルを皮下で受けた。
血清用の全血液を、伏在静脈により収集した。全血液を、凝固活性化管を伴う血清分離器中に収集し、血清の一つの（１）アリコート（０＆２８日目）又は二つの（２）アリコート（２１日目）に処理した。全てのサンプルを、ドライアイス上で出荷するまで、名目上は－７０℃で保存した。
麻酔の回復：適用可能な場合、動物を、麻酔下で、回復中に、及び可動になるまで連続的にモニタリングした。
組織収集
全ての動物について、瀉血からの全血液を、凝固活性化管を伴う血清分離器中に収集し、施設ＳＯＰに従って血清の四つの（４）アリコートに処理した。全てのサンプルを、ドライアイス上で出荷するまで、名目上は－７０℃で保存した。
末端組織：１～７群については、脾臓を回収し、秤量した。脾臓を、テスト施設プロトコルに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ解離キットを使用して脾細胞に処理した。処理後、脾臓を計数し、ペレット化し、再懸濁した。収率及び解離細胞生存率を記録した。６，０００万個までの細胞（≦６アリコート）を、細胞培養凍結培地（Ｇｉｂｃｏ ＃１２６４８０１０）中の懸濁液として、１ｍＬ当たり１，０００万個までの細胞で凍結した細胞は、ドライアイス上で出荷されるまで、名目上は－７０℃で保存された。
結果
図５は、試験の２１日目及び４９日目に決定されたスパイクタンパク質抗体力価を示す。ｃｅＤＮＡ製剤を含む様々なイオン化可能脂質（ＬＮＰ１－６）をテストして、特定の脂質が、製剤中の他よりも好ましいか否かを決定した。図５中に示されるように、特定の製剤は、テストされた他のＬＮＰ製剤（例、ＤＯＰＥ非カチオン性脂質、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００との組み合わせにおけるＣ７イオン化可能脂質）よりも免疫原性であり、一部の脂質がｃｅＤＮＡワクチン製剤中の他よりも好まれ得ることを示している。
実施例７：ＤＮＡプライミングワクチンの投与による対象のワクチン接種
この実施例では、マウスに、ＣＯＶＩＤスパイクタンパク質をコードするｃｅＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はプラスミドプライミングワクチンを投与し、ｍＲＮＡワクチンの投与が続いた。ｃｅＤＮＡベクターが、上の実施例１において記載される方法に従って産生された。ＤＮＡプラスミド及びｍＲＮＡは、本明細書中に記載されるように、及び当技術分野において公知のルーチン的な方法を使用して産生された。
図６は、ＣＯＶＩＤスパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｃｅＤＮＡ、又はプラスミドを用いた免疫化後の８週間のマウス脾臓細胞懸濁液中のＩＦＮγ＋抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを描写するグラフである。マウスを、ＣＯＶＩＤスパイクタンパク質をコードする３μｇのｍＲＮＡ、ｃｅＤＮＡ、又はプラスミドのプライミング用量で免疫化した（各々がＬＮＰ中で製剤化されている）。八週間後、脾臓を除去し、単細胞懸濁液中に処理した。細胞をスパイクタンパク質エピトープのライブラリーで刺激し、ワクチン誘導性免疫応答の大きさを測った。細胞をメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のマーカーについて染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ８＋集団内では、ワクチン誘導性メモリーＴエフェクター細胞（ＣＤ６２Ｌｌｏ ＣＤ４４ｈｉ ＣＣＲ７ｌｏ ＣＤ１２７ｈｉ）の統計的に有意に大きな割合が、ｍＲＮＡ又はプラスミドよりもｃｅＤＮＡへの応答においてある。これらのデータは、ｃｅＤＮＡワクチン接種が、他のモダリティよりも大きなメモリーＴ細胞集団を誘導することを示唆する。
図７は、ｃｅＤＮＡ－ｃｅＤＮＡ、ｍＲＮＡ－ｍＲＮＡ、又はｃｅＤＮＡ－ｍＲＮＡレジメンで初回刺激され、ブーストされたマウスにおけるＩＦＮγ＋抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを描写するグラフである。スパイクタンパク質反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を、４、６、又は８週間のいずれかの間隔で初回刺激及びブーストされたマウスからのフローサイトメトリー（上に記載するとおり）により調べた。測定値を、各々のそれぞれのブースト後の３週間に取った。ワクチンレジメン及び用量間隔の全てによって、免疫応答を惹起させた一方で、ワクチン誘導性ＣＤ８＋Ｔ細胞の最も大きな集団が、第一用量と第二用量の間に８週間を伴うｃｅＤＮＡ－ｍＲＮＡレジメンにおいて見られた。このデータは、抗原発現の動態が、メモリーＴ細胞生成に影響を及ぼすことを示唆する。
図８は、０．３μｇ ｍＲＮＡ－３μｇ ｍＲＮＡ、１μｇ ｍＲＮＡ－３μｇ ｍＲＮＡ、３μｇ ｍＲＮＡ－３μｇ ｍＲＮＡ、３μｇ ｃｅＤＮＡ－３μｇ ｍＲＮＡ、及び１０μｇ ｃｅＤＮＡ－３μｇ ｍＲＮＡの異種プライムブーストレジメン後のＩＦＮγ＋抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを描写するグラフである。プライムブーストレジメン及び測定は、上に記載されるように行われた。ｍＲＮＡを滴定することにより抗原曝露のプライミング用量を調節することによって、全体的な応答が減る一方で、ｃｅＤＮＡのプライミング用量を増加させることは影響を有さず、飽和であったことを示唆している。このデータは、ｃｅＤＮＡ－ｍＲＮＡ異種プライムブースト増強ＣＤ８＋Ｔ細胞効果が、ｍＲＮＡと比較してｃｅＤＮＡからの発現動態に関連し、低いプライミング用量及びそれに続くより高いブースター用量から生じ得る効果に関連しないことを示唆する。
様々な他のアッセイを実施して、スパイクタンパク質抗体力価の決定を含む、免疫応答を決定することができる。
参考文献
本明細書及び本明細書中の実施例において引用される、限定されないが、特許及び特許出願を含む、全ての刊行物及び参考文献が、各個々の刊行物又は参考文献が、完全に示されるとして参照により本明細書中に組み入れられることが具体的かつ個別に示されているかのように、それらの全体において参照により組み入れられる。本出願が優先権を主張する任意の特許出願はまた、刊行物及び参考文献について上に記載される様式において参照により本明細書中に組み入れられる。

Claims (111)

  1. 対象において第一のペプチド及び第二のペプチドに対する免疫応答を誘導する方法であって、
    デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むプライミングワクチンを前記対象に投与することであって、前記ＤＮＡが第一のペプチドをコードする、投与すること；ならびに
    （ｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）であって、前記第二のペプチドをコードする、ＲＮＡ、又は
    （ｉｉ）第二のペプチド、を含むブースティングワクチンを前記対象に投与することを含み、
    それにより、前記対象において前記第一のペプチド及び前記第二のペプチドに対する前記免疫応答を誘導することを含む、方法。
  2. 前記プライミングワクチンが、前記第一のペプチドをコードするＤＮＡを含み、前記ブースティングワクチンが、前記第二のペプチドをコードするＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記プライミングワクチンが、前記第一のペプチドをコードするＤＮＡを含み、前記ブースティングワクチンが、前記第二のペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＤＮＡが、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形状ＤＮＡ、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記第一及び前記第二のペプチドが、細菌、ウイルス、真菌、又は寄生虫の感染因子から由来する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記第一及び前記第二のペプチドが、同じ病原性生物から由来する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記第一及び前記第二のペプチドが、前記プライミングワクチン及び前記ブースティングワクチンにおいて同じである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第一及び前記第二のペプチドのエピトープの少なくとも一つが、前記プライミングワクチン及び前記ブースティングワクチンにおいて異なる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ＤＮＡが、隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）の間に少なくとも一つの核酸配列を含むカプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含み、前記少なくとも一つの核酸配列が前記ペプチドをコードする、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記第一及び／又は前記第二のペプチドが、腫瘍関連抗原である、あるいは自己免疫状態に関連付けられる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記第一及び／又は前記第二のペプチドが、表１～８中に示されるペプチドからなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ＤＮＡが、前記少なくとも一つの核酸配列に連結されたプロモーター配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、少なくとも一つのポリＡ配列を含む、請求項４～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、５’ＵＴＲ及び／又はイントロン配列を含む、請求項４～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ｃｅＤＮＡベクターが３’ＵＴＲ配列を含む、請求項４～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記ｃｅＤＮＡベクターがエンハンサー配列を含む、請求項４～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記隣接するＩＴＲの少なくとも一つが、機能的末端分解部位及びＲｅｐ結合部位を含む、請求項９～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）からなる群から選択されるウイルスから由来する、請求項９～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記隣接するＩＴＲが、互いに関して対称又は非対称である、請求項９～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記隣接するＩＴＲが対称又は実質的に対称である、請求項９～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記隣接するＩＴＲが非対称である、請求項９～１９のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記隣接するＩＴＲの一つが野生型である、又は前記隣接するＩＴＲの両方が野生型ＩＴＲである、請求項９～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記隣接するＩＴＲが、異なるウイルス血清型からである、請求項９～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記隣接するＩＴＲが、表８中に示されるウイルス血清型の対からなる群から選択される、請求項９～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、表９中に示される配列からなる群から選択される配列を含む、請求項９～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記隣接するＩＴＲの少なくとも一つが、前記ＩＴＲの全体的な三次元構造に影響を及ぼす欠失、付加、又は置換により野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列から改変される、請求項９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２からなる群から選択されるＡＡＶ血清型から由来する、請求項９～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が合成的である、請求項９～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記隣接するＩＴＲの一つが、野生型ＩＴＲではない、又は前記ＩＴＲの両方が、野生型ＩＴＲではない、請求項９～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、及びＤ’から選択されるＩＴＲ領域の少なくとも一つにおける欠失、挿入、及び／又は置換により修飾される、請求項９～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記欠失、挿入、及び／又は置換が、前記Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、又はＣ’領域により形成されるステム－ループ構造の全て又は一部の欠失をもたらす、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、前記Ｂ及びＢ’領域により形成されるステム－ループ構造の全て又は一部の欠失をもたらす欠失、挿入、及び／又は置換により修飾される、請求項９～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、前記Ｃ及びＣ’領域により形成されるステム－ループ構造の全て又は一部の欠失をもたらす欠失、挿入、及び／又は置換により修飾される、請求項９～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、前記Ｂ及びＢ’領域により形成されるステム－ループ構造の一部ならびに／あるいは前記Ｃ及びＣ’領域により形成されるステム－ループ構造の一部の前記欠失をもたらす欠失、挿入、及び／又は置換により修飾される、請求項９～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、野生型ＩＴＲにおいて、前記Ｂ及びＢ’領域により形成される第一のステム－ループ構造ならびに前記Ｃ及びＣ’領域により形成される第二のステム－ループ構造を含むであろう前記領域中に単一のステム－ループ構造を含む、請求項９～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、野生型ＩＴＲにおいて、前記Ｂ及びＢ’領域により形成される第一のステム－ループ構造ならびに前記Ｃ及びＣ’領域により形成される第二のステム－ループ構造を含むであろう前記領域中に単一のステム及び二つのループを含む、請求項９～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、野生型ＩＴＲにおいて、前記Ｂ及びＢ’領域により形成される第一のステム－ループ構造ならびに前記Ｃ及びＣ’領域により形成される第二のステム－ループ構造を含むであろう前記領域中に単一のステム及び単一のループを含む、請求項９～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 両方の隣接するＩＴＲが、前記ＩＴＲが互いに対して反転された場合に全体的な三次元対称性をもたらす様式において改変される、請求項９～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ＤＮＡが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で送達される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ＲＮＡがＬＮＰ中で送達される、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ＲＮＡが、少なくとも一つのヌクレオチド類似体を含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記免疫応答が抗体応答である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記免疫応答がＴ細胞応答である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記免疫応答がメモリー（ＣＤ８＋）Ｔ細胞応答である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記方法が、前記ブースティングワクチンを、前記プライミングワクチンを投与した後の少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１４週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約１～２週間、少なくとも約２～３週間、少なくとも約３～４週間、少なくとも約４～５週間、少なくとも約５～６週間、少なくとも約６～７週間、少なくとも約７～８週間、少なくとも約８～９週間、少なくとも約９～１０週間、少なくとも約１０～１１週間、少なくとも約１１～１２週間、少なくとも約１２～１３週間、少なくとも１３～１４週間、少なくとも約１４～１５週間、又は少なくとも約１５～１６週間に投与することを含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記方法が、前記プライミングワクチンを投与した後の約８週間に前記ブースティングワクチンを投与することを含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記プライミングワクチンの前記投与と前記ブースティングワクチンの前記投与の間での間隔が、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約２６日、少なくとも約２７日、少なくとも約２８日、少なくとも約２９日、少なくとも約３０日、少なくとも約３１日、少なくとも約３２日、少なくとも約３３日、少なくとも約３４日、少なくとも約３５日、少なくとも約３６日、少なくとも約３７日、少なくとも約３８日、少なくとも約３９日、少なくとも約４０日、少なくとも約４１日、少なくとも約４２日、少なくとも約４３日、少なくとも約４４日、少なくとも約４５日、少なくとも約４６日、少なくとも約４７日、少なくとも約４８日、少なくとも約４９日、少なくとも約５０日、少なくとも約５１日、少なくとも約５２日、少なくとも約５３日、少なくとも約５４日、少なくとも約５５日、少なくとも約５６日、少なくとも約５７日、少なくとも約５８日、少なくとも約５９日、少なくとも約６０日、少なくとも約６１日、少なくとも約６２日、少なくとも約６３日、少なくとも約６４日、少なくとも約６５日、少なくとも約６６日、少なくとも約６７日、少なくとも約６８日、少なくとも約６９日、少なくとも約７０日、少なくとも約７１日、少なくとも約７２日、少なくとも約７３日、少なくとも約７４日、少なくとも約７５日、少なくとも約７６日、少なくとも約７７日、少なくとも約７８日、少なくとも約７９日、少なくとも約８０日、少なくとも約８１日、少なくとも約８２日、少なくとも約８３日、少なくとも約８４日、少なくとも約８５日、少なくとも約８６日、少なくとも約８７日、少なくとも約８８日、少なくとも約８９日、少なくとも約９０日、少なくとも約９１日、少なくとも約９２日、少なくとも約９３日、少なくとも約９４日、少なくとも約９５日、少なくとも約９６日、少なくとも約９７日、少なくとも約９８日、少なくとも約９９日、少なくとも約１００日、少なくとも約１０１日、少なくとも約１０２日、少なくとも約１０３日、少なくとも約１０４日、少なくとも約１０５日、少なくとも約１０６日、少なくとも約１０７日、少なくとも約１０８日、少なくとも約１０９日、少なくとも約１１０日、少なくとも約１１１日、又は少なくとも約１１２日である、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記プライミングワクチンの前記投与と前記ブースティングワクチンの前記投与の間の前記間隔が約６４日である、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記方法が、前記ブースティングワクチンの二つ以上の用量を前記対象に投与することを含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記方法が、ブースティングワクチンの各用量を、以前のワクチンを投与した後の少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１４週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約１～２週間、少なくとも約２～３週間、少なくとも約３～４週間、少なくとも約４～５週間、少なくとも約５～６週間、少なくとも約６～７週間、少なくとも約７～８週間、少なくとも約８～９週間、少なくとも約９～１０週間、少なくとも約１０～１１週間、少なくとも約１１～１２週間、少なくとも約１２～１３週間、少なくとも１３～１４週間、少なくとも約１４～１５週間、又は少なくとも約１５～１６週間に投与することを含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. ブースティングワクチンの前記各用量の投与と前記以前のワクチンの投与の間での間隔が、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約２６日、少なくとも約２７日、少なくとも約２８日、少なくとも約２９日、少なくとも約３０日、少なくとも約３１日、少なくとも約３２日、少なくとも約３３日、少なくとも約３４日、少なくとも約３５日、少なくとも約３６日、少なくとも約３７日、少なくとも約３８日、少なくとも約３９日、少なくとも約４０日、少なくとも約４１日、少なくとも約４２日、少なくとも約４３日、少なくとも約４４日、少なくとも約４５日、少なくとも約４６日、少なくとも約４７日、少なくとも約４８日、少なくとも約４９日、少なくとも約５０日、少なくとも約５１日、少なくとも約５２日、少なくとも約５３日、少なくとも約５４日、少なくとも約５５日、少なくとも約５６日、少なくとも約５７日、少なくとも約５８日、少なくとも約５９日、少なくとも約６０日、少なくとも約６１日、少なくとも約６２日、少なくとも約６３日、少なくとも約６４日、少なくとも約６５日、少なくとも約６６日、少なくとも約６７日、少なくとも約６８日、少なくとも約６９日、少なくとも約７０日、少なくとも約７１日、少なくとも約７２日、少なくとも約７３日、少なくとも約７４日、少なくとも約７５日、少なくとも約７６日、少なくとも約７７日、少なくとも約７８日、少なくとも約７９日、少なくとも約８０日、少なくとも約８１日、少なくとも約８２日、少なくとも約８３日、少なくとも約８４日、少なくとも約８５日、少なくとも約８６日、少なくとも約８７日、少なくとも約８８日、少なくとも約８９日、少なくとも約９０日、少なくとも約９１日、少なくとも約９２日、少なくとも約９３日、少なくとも約９４日、少なくとも約９５日、少なくとも約９６日、少なくとも約９７日、少なくとも約９８日、少なくとも約９９日、少なくとも約１００日、少なくとも約１０１日、少なくとも約１０２日、少なくとも約１０３日、少なくとも約１０４日、少なくとも約１０５日、少なくとも約１０６日、少なくとも約１０７日、少なくとも約１０８日、少なくとも約１０９日、少なくとも約１１０日、少なくとも約１１１日、又は少なくとも約１１２日である、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記対象が、細菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、又は真菌感染を有する、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記対象が癌を有する、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記対象が自己免疫疾患又は障害を有する、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記プライミングワクチン又は前記ブースティングワクチンの一つ又は複数が、医薬的に許容可能な担体を含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記プライミングワクチン及び前記ブースティングワクチンの組成物の少なくとも一つがアジュバントをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記プライミングワクチン及び前記ブースティングワクチンの少なくとも一つが、筋肉内、腹腔内、頬側、吸入、鼻腔内、くも膜下腔内、静脈内、皮下、皮内、及び腫瘍内からなる群から選択される経路により投与される、又は組織の間質腔に投与される、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むプライミングワクチンを含む、ワクチンレジメンであって、前記ＤＮＡが第一のペプチドをコードし、（ｉ）第二のペプチドをコードするリボ核酸（ＲＮＡ）、又は（ｉｉ）第二のペプチドを含むブースティングワクチンが続く、ワクチンレジメン。
  60. 前記プライミングワクチンが、免疫学的有効量の前記第一のペプチドをコードするＤＮＡの量を含み、前記ブースティングワクチンが、免疫学的有効量の前記第二のペプチドをコードするＲＮＡの量を含む、請求項５９に記載のワクチンレジメン。
  61. 前記プライミングワクチンが、免疫学的有効量の前記第一のペプチドをコードするＤＮＡの量を含み、前記ブースティングワクチンが、免疫学的有効量の前記第二のペプチドを含む、請求項５９に記載のワクチンレジメン。
  62. 前記ＤＮＡが、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖共有結合閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直線二本鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ドギーボーン（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形状ＤＮＡ、最低限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを含む、請求項５９～６１のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  63. 前記第一のペプチド及び前記第二のペプチドが、細菌感染因子、ウイルス感染因子、真菌感染因子、又は寄生虫感染因子から由来する、請求項５９～６２のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  64. 前記第一のペプチド及び前記第二のペプチドが、同じ病原性生物から由来する、請求項５９～６３のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  65. 前記第一のペプチド及び前記第二のペプチドが、前記プライミングワクチン及び前記ブースティングワクチンにおいて同じである、請求項５９～６４のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  66. 前記第一のペプチド及び前記第二のペプチドのエピトープの少なくとも一つが、前記プライミングワクチン及び前記ブースティングワクチンにおいて異なる、請求項５９～６４のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  67. 前記ＤＮＡが、隣接する逆位末端（ＩＴＲ）の間に少なくとも一つの核酸配列を含むカプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含み、前記少なくとも一つの核酸配列が、前記第一のペプチドをコードする、請求項５９～６６のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  68. 前記第一及び／又は前記第二のペプチドが、腫瘍関連抗原である、あるいは自己免疫状態に関連付けられる、請求項５９～６２又は６５～６７のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  69. 前記第一及び／又は前記第二のペプチドが、表１～８中に示されるペプチドからなる群から選択される、請求項５９～６８のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  70. 前記ＤＮＡが、前記少なくとも一つの核酸配列に連結されたプロモーター配列を含む、請求項５９～６９のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  71. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、少なくとも一つのポリＡ配列を含む、請求項６２～７０のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  72. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、５’ＵＴＲ及び／又はイントロン配列を含む、請求項６２～７１のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  73. 前記ｃｅＤＮＡベクターが３’ＵＴＲ配列を含む、請求項６２～７２のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  74. 前記ｃｅＤＮＡベクターがエンハンサー配列を含む、請求項６２～７３のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  75. 前記隣接するＩＴＲの少なくとも一つが、機能的末端分解部位及びＲｅｐ結合部位を含む、請求項６７～７４のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  76. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスから由来する、請求項６７～７５のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  77. 前記隣接するＩＴＲが、互いに関して対称又は非対称である、請求項６７～７６のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  78. 前記隣接するＩＴＲが対称又は実質的に対称である、請求項６７～７７のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  79. 前記隣接するＩＴＲが非対称である、請求項６７～７７のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  80. 前記隣接するＩＴＲの一つが野生型である、又は前記ＩＴＲの両方が野生型ＩＴＲである、請求項６７～７９のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  81. 前記隣接するＩＴＲが、異なるウイルス血清型から由来する、請求項６７～８０のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  82. 前記隣接するＩＴＲが、表８中に示されるウイルス血清型からなる群から選択される、請求項６７～８１のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  83. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、表９中に示される配列からなる群から選択される配列を含む、請求項６７～８２のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  84. 前記隣接するＩＴＲの少なくとも一つが、前記ＩＴＲの全体的な三次元構造に影響を及ぼす欠失、付加、又は置換により野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列から改変される、請求項６７～８３のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  85. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２からなる群から選択されるＡＡＶ血清型から由来する、請求項６７～８４のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  86. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が合成的である、請求項６７～８５のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  87. 前記隣接するＩＴＲの一つが野生型ＩＴＲではない、又は前記隣接するＩＴＲの両方が野生型ＩＴＲではない、請求項６７～８６のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  88. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、及びＤ’から選択される前記ＩＴＲ領域の少なくとも一つにおける欠失、挿入、及び／又は置換により修飾される、請求項６７～８７のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  89. 前記欠失、挿入、及び／又は置換が、前記Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、又はＣ’領域により形成されるステム－ループ構造の全て又は一部の欠失をもたらす、請求項８８に記載のワクチンレジメン。
  90. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、前記Ｂ及びＢ’領域により形成されるステム－ループ構造の全て又は一部の欠失をもたらす欠失、挿入、及び／又は置換により修飾される、請求項６７～８９のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  91. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、前記Ｃ及びＣ’領域により形成されるステム－ループ構造の全て又は一部の欠失をもたらす欠失、挿入、及び／又は置換により修飾される、請求項６７～９０のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  92. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、前記Ｂ及びＢ’領域により形成されるステム－ループ構造の一部ならびに／あるいは前記Ｃ及びＣ’領域により形成されるステム－ループ構造の一部の前記欠失をもたらす欠失、挿入、及び／又は置換により修飾される、請求項６７～９１のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  93. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、野生型ＩＴＲにおいて、前記Ｂ及びＢ’領域により形成される第一のステム－ループ構造ならびに前記Ｃ及びＣ’領域により形成される第二のステム－ループ構造を含むであろう前記領域中に単一のステム－ループ構造を含む、請求項６７～９２のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  94. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、野生型ＩＴＲにおいて、前記Ｂ及びＢ’領域により形成される第一のステム－ループ構造ならびに前記Ｃ及びＣ’領域により形成される第二のステム－ループ構造を含むであろう前記領域中に単一のステム及び二つのループを含む、請求項６７～９３のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  95. 前記隣接するＩＴＲの一つ又は両方が、野生型ＩＴＲにおいて、前記Ｂ及びＢ’領域により形成される第一のステム－ループ構造ならびに前記Ｃ及びＣ’領域により形成される第二のステム－ループ構造を含むであろう前記領域中に単一のステム及び単一のループを含む、請求項６７～９４のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  96. 両方の隣接するＩＴＲが、前記ＩＴＲが互いに対して反転された場合に全体的な三次元対称性をもたらす様式において改変される、請求項６７～９５のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  97. 請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法を実施すること又は請求項５９～９６のいずれか一項に記載のワクチンレジメンを対象に投与することを含む、細菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、又は真菌感染を伴う前記対象を治療する方法。
  98. 請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法を実施すること又は請求項５９～９６のいずれか一項に記載のワクチンレジメンを対象に投与することを含む、癌を伴う前記対象を治療する方法。
  99. 請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法を実施すること又は請求項５９～９６のいずれか一項に記載のワクチンレジメンを対象に投与することを含む、自己免疫疾患又は障害を伴う前記対象を治療する方法。
  100. 請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法を実施すること又は請求項５９～９６のいずれか一項に記載のワクチンレジメンを対象に投与することを含む、前記対象において細菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、又は真菌感染を防止する方法。
  101. 請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法を実施すること又は請求項５９～９６のいずれか一項に記載のワクチンレジメンを対象に投与することを含む、前記対象において癌を防止する方法。
  102. 請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法を実施すること又は請求項５９～９６のいずれか一項に記載のワクチンレジメンを対象に投与することを含む、前記対象において自己免疫疾患を防止する方法。
  103. 前記方法が、前記ブースティングワクチンの二つ以上の用量を前記対象に投与することを含む、請求項９７～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記方法が、前記プライミングワクチンを投与した後の約８週間に前記ブースティングワクチンを投与することを含む、請求項９７～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記対象に一つ又は複数の追加の治療薬剤を投与することをさらに含む、請求項９７～１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記プライミングワクチン及び前記ブースティングワクチンが、各々、医薬組成物中で製剤化される、請求項５９～９６のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  107. 前記プライミングワクチン及び前記ブースティングワクチンの一つ又は両方が、一つ又は複数の追加の治療薬剤をさらに含む、請求項１０６に記載のワクチンレジメン。
  108. 前記プライミングワクチン及び前記ブースティングワクチンの一つ又は両方が、脂質をさらに含む、請求項５９～９６又は１０６～１０７のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  109. 前記脂質が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項１０８に記載のワクチンレジメン。
  110. 前記プライミングワクチン及び前記ブースティングワクチンの一つ又は両方が、凍結乾燥される、請求項１０６～１０９のいずれか一項に記載のワクチンレジメン。
  111. 請求項５９～９６又は１０６～１１０のいずれか一項に記載のワクチンレジメン及び使用のための説明書を含む、キット。
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