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JP2025512531A - 近接エフェクターポリペプチドを同定する方法およびその使用法 - Google Patents

近接エフェクターポリペプチドを同定する方法およびその使用法 Download PDF

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JP2025512531A
JP2025512531A JP2024560829A JP2024560829A JP2025512531A JP 2025512531 A JP2025512531 A JP 2025512531A JP 2024560829 A JP2024560829 A JP 2024560829A JP 2024560829 A JP2024560829 A JP 2024560829A JP 2025512531 A JP2025512531 A JP 2025512531A
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Abstract

本明細書では、近接エフェクターポリペプチドを同定する方法が開示され、その方法は、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを複数の細胞に形質導入する工程であって、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーは複数のＯＲＦをコードし、ＯＲＦのそれぞれは、標的ポリペプチドに直接的または間接的に結合するか、または結合するように誘導することができる標的化部分と融合されている、工程；標的化部分が標的ポリペプチドと相互作用するための条件下で、複数の形質導入細胞内でＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの複数のＯＲＦを発現させる工程；および存在量を測定することにより複数のＯＲＦのいずれかが近接エフェクターポリペプチドであるかどうかを決定する工程を含んでなり、ＯＲＦは、ＯＲＦが対照と比較して標的ポリペプチドの存在量が増加もしくは減少させているか、または対照と比較して複数の形質導入細胞で枯渇もしくは増加している場合に、近接エフェクターポリペプチドをコードしている。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年４月１４日に出願された米国仮出願第６３／３３１，０７８号の利益を主張するものであり、その内容は全体が参照により本明細書の一部とされる。
配列表の組み込み
２０２３年４月１３日に作成されたコンピューター可読形式の配列表「2223-P67134PC00_Sequence_Listing」（３７，１８６バイト）が参照により本明細書の一部とされる。
分野
本開示は、例えば標的化タンパク質分解および安定化のための近接エフェクター、特に、近接エフェクターポリペプチドを同定する方法およびそれらの近接因子をスクリーニングで使用する方法および例えば標的化タンパク質分解または安定化のための方法に関する。
背景
標的化タンパク質分解（ＴＰＤ）は、創薬における最も有望な技術革新の一つとして浮上してきた(Burslem and Crews, 2020)。ＴＰＤの考え方は、単に標的を阻害または活性化するのではなく、標的タンパク質の分解を選択的に誘導するというものある。ＴＰＤは、ＰＲＯｔｅｏｌｙｓｉｓ－ＴＡｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒａｓ（ＰＲＯＴＡＣｓ）または「分子糊」として知られるヘテロ二機能性分子によってもたらされ得る。ＰＲＯＴＡＣは２つの共有結合したタンパク質結合部分からなり、一方は標的タンパク質に結合し、もう一方はＥ３ユビキチンリガーゼに結合し、標的タンパク質をリガーゼに近接させる。これにより標的タンパク質はユビキチン化され、その後、プロテアソーム依存性の分解が起こる。分子糊も同様の働きをするが、Ｅ３リガーゼと標的タンパク質の両方に直接接触し、非天然のタンパク質／タンパク質相互作用を誘導し、標的の分解をもたらす。
ＰＲＯＴＡＣと分子糊の概念は、多くの（全てではないが）Ｅ３リガーゼの乱雑性を利用したものであり、その基質特異性は、基質固有の特徴よりも、基質との物理的近接性によってほぼ決定される。ＴＰＤには、従来の低分子阻害剤に優るいくつかの利点があり、一分子が複数のタンパク質分子を分解できるので薬物の効力が高まることが含まれる。さらに、それらは酵素的に活性なドメインだけでなく、タンパク質のあらゆる創薬可能なドメインを標的とすることができるため、低分子の標的空間が拡大される。
ＰＲＯＴＡＣおよび分子糊の高い治療可能性にもかかわらず、その開発における大きな障壁は、既知のＥ３リガーゼがほんの一握りしかこのアプローチに用いられていないことである。実際に、最近の糊およびＰＲＯＴＡＣは２つのＥ３（すなわち、Ｅ３リガーゼ）、すなわち、サリドマイド標的セレブロン（ＣＲＢＮ）と腫瘍抑制因子ＶＨＬしか利用していない。この２つのＥ３を利用した化合物は、非常に予測しにくい様式で、いくつかの標的タンパク質には作用するが他には作用しないため、かなり難しい。より強固で予測可能な働きができる新規タンパク質を同定することは、新規分解剤の開発におけるこの障害を取り除き、多くの治療領域における創薬を促進するであろう。
多くのグループがＰＲＯＴＡＣおよび分子糊の開発に適したＥ３リガーゼの特性決定を積極的に試みているが、ほとんどのアプローチは、ヒトゲノム中の６００を超えるユビキチンリガーゼの全領域ではなく、これまでによく特性決定されている限られた数のＥ３に依存している(Burslem and Crews, 2020)。さらに、Ｅ３のアノテーションは分子機能ではなく、特徴的なタンパク質ドメイン（例えば、ＲＩＮＧ ｆｉｎｇｅｒ、Ｆ－ｂｏｘ）に基づいているため、これは過小評価である可能性がある。例えば、キナーゼ、Ｇタンパク質、および代謝酵素もＥ３および他のユビキチン修飾複合体の基質アダプターとして機能することがある。Ｅ３として機能的に働く他の多くの予期しないタンパク質が存在し、標的化タンパク質分解のツールキットを拡大する可能性がある。
また、他のタンパク質品質管理経路を利用できる可能性もある。タンパク質のターンオーバーは、選択的なマクロオートファジー、マイトファジー、シャペロンを介したオートファジー、一般的なプロテアーゼ、さらには細胞外分泌など、他の複数のメカニズムによって制御されている。それらの特異性は、基質タンパク質の運命を決定する受容体によって部分的に調節されており、標的化タンパク質分解のための潜在的な経路となっている。しかしながら、これらの経路は依然として完全には解明されていない。
より広義には、誘導近接性に基づく治療法はタンパク質分解だけに限定されない。実際、生物学の多くは、動的に組み合わされるタンパク質／タンパク質相互作用によって駆動されており、植物ホルモンのような多くの天然化合物は、特定のタンパク質／タンパク質相互作用を誘導することによって機能する(Gerry and Schreiber, 2020)。従って、タンパク質／タンパク質相互作用を再配線する化合物は、次世代治療薬において大きな可能性を持つ。実際、いくつかの概念実証研究では、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢＴＡＣ）によるタンパク質の安定化、ホスファターゼ（ＰｈｏＲＣ）によるタンパク質の脱リン酸化、およびＡＵＴＡＣによるオートファジー誘導化合物を誘導する可能性が示されている(Henning et al., 2021; Takahashi et al., 2019; Yamazoe et al., 2020)。
しかしながら、誘導近接薬物を開発する上で大きな障害となっているものの一つが、「タンパク質ペア問題」である。ある標的の機能を調節したい場合、６００を超えるＥ３リガーゼ、５００を超えるキナーゼ、１００を超える脱ユビキチン化酵素、および有益な機能的結果をもたらすかもしれない何千もの他のタンパク質が存在することを考えれば、どのように理想的なエフェクタータンパク質を同定すればよいのだろうか。
概要
本明細書では、近接依存的に標的タンパク質の分解または安定化を促進するようなポリペプチド近接エフェクターが同定される。
本開示の一つの態様は、近接エフェクターポリペプチドを同定する方法であって、
ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを複数の細胞に形質導入する工程であって、前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーは複数のＯＲＦをコードし、前記ＯＲＦのそれぞれは、標的ポリペプチドに直接的または間接的に結合するか、または結合するように誘導することができる標的化部分と融合されている、工程；
前記標的化部分が前記標的ポリペプチドと相互作用するための条件下で、前記複数の形質導入細胞内で前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの複数のＯＲＦを発現させる工程；および
対照と比較して前記複数のＯＲＦのいずれかを発現する細胞における前記標的ポリペプチドの存在量、場合により、全存在量、細胞表面存在量もしくは細胞内存在量を測定すること、および／または対照と比較して前記複数の形質導入細胞において前記複数のＯＲＦのいずれかが枯渇もしくは増加しているかどうかを検出することによって、前記複数のＯＲＦのいずれかが近接エフェクターポリペプチドであるかどうかを決定する工程
を含み、
前記複数の形質導入細胞は、前記標的ポリペプチドを組換え発現し、かつ場合により、第１の蛍光ポリペプチドを発現し、前記標的ポリペプチドは、第２の蛍光ポリペプチド、内因性タンパク質、または第２の蛍光ポリペプチドエピトープタグ、抗生物質耐性タンパク質および／もしくは負の選択マーカーと融合された融合ポリペプチドであり；
ＯＲＦは、ＯＲＦが対照と比較して前記標的ポリペプチドの存在量を増加もしくは減少させているか、または対照と比較して前記複数の形質導入細胞で枯渇もしくは増加している場合に、近接エフェクターポリペプチドをコードしている方法を含む。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドの存在量を測定することは、ｉ）対照に比べて前記複数の細胞で発現した標的ポリペプチドが減少しているどうかもしくは増加しているかどうか（例えば、全存在量もしくは細胞内画分中）を決定すること、またはｉｉ）前記複数のＯＲＦのいずれかが対照と比較して標的ポリペプチドの細胞表面レベルを増加させたかどうかを決定することを含んでなる、
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドが対照と比較して減少している場合に、近接エフェクターポリペプチドは、標的ポリペプチドの分解剤であり、または標的ポリペプチドが対照と比較して増加していた場合に、近接エフェクターポリペプチドは、標的ポリペプチドの安定化剤である。いくつかの実施形態では、近接エフェクターポリペプチドは、対照と比較して、複数の形質導入細胞で枯渇もしくは減少していた場合に、致死ポリペプチドであり、または複数の形質導入細胞で増加していた場合に、増殖誘導ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、近接エフェクターが対照と比較して標的ポリペプチドの細胞表面レベルを増加させる場合に、近接エフェクターポリペプチドは、タンパク質輸送ポリペプチドである、
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、第２の蛍光ポリペプチドであるか、または第２の蛍光ポリペプチドと融合され、決定することは、選択された第２の蛍光ポリペプチド：第１の蛍光ポリペプチド比を有する前記複数の細胞の画分を単離すること、および画分中の複数のＯＲＦの１以上のシークエンシングを行うことを含み；標的ポリペプチドがエピトープタグと融合されている場合、決定することは、エピトープタグ結合タンパク質、場合により、抗体を用いて、標的ポリペプチドの存在量を測定することを含んでなり；標的ポリペプチドが内因性標的である場合、決定することは、標的ポリペプチド結合タンパク質、場合により、抗体を用いて、標的ポリペプチドの存在量、場合により、全存在量、細胞表面存在量もしくは細胞内存在量を測定することを含んでなり；標的ポリペプチドが抗生物質選択タンパク質と融合されている場合、決定することは、抗生物質処理に生き残った前記複数の細胞の画分を単離すること、および画分中のＯＲＦの１以上のシークエンシングを行うことを含んでなり；または標的ポリペプチドが負の選択マーカー、場合により、チミジンキナーゼと融合されている場合、決定することは、負の選択処理に生き残った前記複数の細胞の画分を単離すること、および画分中のＯＲＦの１以上のシークエンシングを行うことを含んでなる。
いくつかの実施形態では、前記複数の細胞は細胞株であり、前記方法は、標的ポリペプチド、および場合により、第１の蛍光ポリペプチドをコードする核酸を導入することによって細胞株を作製することをさらに含んでなり、場合により、標的ポリペプチドと第１の蛍光ポリペプチドは、その間にＩＲＥＳまたは切断部位を含んでなる構築物内にある。いくつかの実施形態では、第２の蛍光ポリペプチドと第１の蛍光ポリペプチドの比は、フローサイトメトリーを含んでなる方法を用いて決定される。いくつかの実施形態では、第１または第２の蛍光ポリペプチドは、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ＢＦＰおよび／またはＧＦＰである。いくつかの実施形態では、第１の蛍光ポリペプチドがＧＦＰであって、第２の蛍光ポリペプチドがＢＦＰであるか、または第１の蛍光ポリペプチドがＢＦＰであって、第２の蛍光ポリペプチドがＧＦＰである。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、抗生物質耐性タンパク質または負の選択マーカーと融合されている。いくつかの実施形態では、負の選択マーカーは、チミジンキナーゼ、変異型デオキシシトジン(deoxycytodine)キナーゼまたはチミジル酸キナーゼである。いくつかの実施形態では、負の選択マーカーはチミジンキナーゼであり、前記方法は、標的化部分が標的ポリペプチドと相互作用するための条件下で、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの複数のＯＲＦを発現させる工程中に、前記複数の細胞をガンシクロビルで処理することを含んでなり、ガンシクロビルに曝された際の細胞の生存が、標的ポリペプチドのレベルが減少していることを示す。
いくつかの実施形態では、抗生物質処理に生き残った細胞で同定されたＯＲＦが近接エフェクターポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗生物耐性タンパク質は、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ブラストサイジンデアミナーゼ、またはハイグロマイシンキナーゼである。いくつかの実施形態では、前記方法は、標的化部分が標的ポリペプチドと相互作用するための条件下で、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの複数のＯＲＦを発現させる工程中に、前記複数の細胞をピューロマイシンで処理することを含んでなる。
いくつかの実施形態では、決定することは、前記複数の形質導入細胞の増殖を測定することを含んでなり、対照と比較して細胞増殖を増加または減少させる、前記複数の形質導入細胞の細胞において同定されたＯＲＦが近接エフェクターポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記複数の細胞は、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーのカバー率として＞３００倍、＞４００倍または＞５００倍を維持するように形質導入される。
いくつかの実施形態では、前記方法は、同定された近接エフェクターポリペプチドを個々の近接エフェクターアッセイで検定すること、場合により、近接エフェクターポリペプチドが安定化剤または分解剤として同定されている場合には、安定化剤または分解剤として同定されている推定近接エフェクターポリペプチドを、標的ポリペプチドを発現する検定細胞内で発現させること、および検定細胞中の標的ポリペプチドのレベルが減少または増加しているかどうかを決定することをさらに含んでなる。
いくつかの実施形態では、近接エフェクターポリペプチドは、複数の近接エフェクターポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、致死ポリペプチドまたは増殖誘導ポリペプチドである近接エフェクターポリペプチドを同定するためのものであり、決定することが、ＯＲＦが複数の形質導入細胞の少なくとも１つの細胞の死滅をひき起こしたかどうかもしくは増殖を誘導したかどうか、および／または対照と比較して複数の形質導入細胞において枯渇もしくは増加しているかどうかを決定することを含んでなり、近接エフェクターポリペプチドが複数の形質導入細胞の少なくとも１つの細胞において死滅を引き起こし、および／もしくはそれが複数の形質導入細胞において枯渇している場合に、近接エフェクターポリペプチドは致死ポリペプチドであり、近接エフェクターポリペプチドが複数の形質導入細胞において少なくとも１つの細胞で増殖を誘導し、および／もしくは対照と比較して増加している場合には、推定近接エフェクターポリペプチドは増殖誘導ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、決定することが、前記複数の細胞で枯渇しているＯＲＦを同定することを含んでなり、場合により、生き残った複数の形質導入細胞中の複数のＯＲＦのシークエンシングを行うこと、およびＯＲＦｅｏｍｅライブラリー中の複数のＯＲＦの参照を比較してＯＲＦが存在するまたは存在しないと決定することを含んでなる。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、発癌性ポリペプチド、アポトーシスの調節因子、オートファジーの調節因子、またはマイトファジーの調節因子である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＲＡＳポリペプチド、場合により、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、タンパク質輸送ポリペプチドである近接エフェクターポリペプチドを同定するためのものであり、決定することが、標的ポリペプチドの細胞表面レベルを測定することを含んでなり、近接エフェクターポリペプチドは、それが標的ポリペプチドの細胞表面レベルを増加させる場合に、タンパク質輸送ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩポリペプチドである。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、場合により表２に示される、変異型細胞表面ポリペプチド、好ましくは、ＣＦＴＲΔ５０８である。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＥＧＦＰ－ＡＢ１、Ｒｌｕｃ、ＦＵＳ Ｓ５２５Ｌ、ＮＲＡＳ、ＤＮＡＪＡ３、ＢＲＡＦ、ＬＡＭＰ１、ＴＤＰ４３ Ｑ３１１Ｋ、ＣＤ６３、Ｈ２Ｂ、ＥＧＦＲ、ＤＮＡＪＢ１１、ＷＤＲ５、ＲＡＳ、ＭＹＣ、またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１、ＥＷＳＲ１、ＳＭＡＲＣＡ２／４、またはＰＡＲＰ１、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１、ＪＡＫ、ＦＵＳ、ＴＤＰ４３、ａ－シヌクレイン、アミロイドβ前駆体タンパク質、ＨＴＴ、プリオンタンパク質、ｐ５３、ＰＴＥＮ、ＣＦＴＲ変異体、および／またはジストロフィン変異体を含んでなる。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、標的ポリペプチドに結合するナノボディ、リガンド、相互作用ペプチドまたは抗体である。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ナノボディである。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＡＢＩ１、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ、変異型ＦＲＢ、ＧＩＤ１、ＧＡＩ、および／またはＰＹＲ１から選択される相互作用ペプチド（または相補的相互作用ペプチド）である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、標的化部分と相互作用する相互作用ペプチドを含んでなる融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ＡＢＩ１、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ、変異株、ＦＲＢ、ＧＩＤ１、ＧＡＩ、ＰＹＬ１、Ａｌｆａタグおよび／またはＰＹＲ１を含んでなる。
いくつかの実施形態では、方法は、化学誘導剤の使用を含んでなる。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドがＡＢＩ１を含んでなる場合、標的化部分は、ＰＹＲ１またはＰＹＬ１を含んでなり、化学誘導剤は、マンジプロパミドまたはアブシジン酸である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドがＰＹＲ１を含んでなる場合、標的化部分は、ＡＢＩ１を含んでなり、化学誘導剤は、マンジプロパミドまたはアブシジン酸である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドがＡＢＩ１を含んでなる場合、標的化部分は、ＰＹＬ１を含んでなり、化学誘導剤は、アブシジン酸である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドがＦＫＢＰを含んでなる場合、標的化部分は、ＦＲＢを含んでなり、化学誘導剤は、ラパマイシンである。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドがＦＲＢを含んでなる場合、標的化部分は、ＦＫＢＰを含んでなり、化学誘導剤は、ラパマイシンである。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドがＦＫＢＰを含んでなる場合、標的化部分は、変異型ＦＲＢを含んでなり、化学誘導剤は、ラパログ、場合により、ＡＰ２１９６７である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドが変異型ＦＲＢを含んでなる場合、標的化部分は、ＦＫＢＰを含んでなり、化学誘導剤は、ラパログ、場合により、ＡＰ２１９６７である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドがＧＩＤ１を含んでなる場合、標的化部分は、ＧＡＩを含んでなり、化学誘導剤は、ジベレリン酸である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、変異型ＧＡＩを含んでなり、標的化部分は、ＧＩＤ１を含んでなり、化学誘導剤はジベレリン酸である。
いくつかの実施形態では、前記方法は、同定された少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドに対するリガンド、場合により、低分子結合剤を同定するためのスクリーニングアッセイを実施することをさらに含んでなる。
本開示の別の態様は、少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドのリガンド、場合により、低分子結合剤を同定するためのスクリーニングアッセイであって、
少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドを低分子ライブラリーと、場合により、ハイスループットスクリーニングアッセイで接触させる工程であって、前記近接エフェクターポリペプチドは表４、５、６または７から選択される、工程；
前記組換え近接エフェクターポリペプチドと前記低分子ライブラリーの１以上の低分子との間で結合が起こったかどうかを評価する工程
を含んでなり、
前記少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドに結合した１以上の分子は、前記少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドのリガンド、場合により、低分子結合剤であり；
好ましくは、前記近接エフェクターポリペプチドは、ＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、もしくはＲＮＦ１２６から選択されるか、またはＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１、ＵＢＥ２ＢもしくはＫＬＨＬ４０から選択される、
スクリーニングアッセイを含む。
いくつかの実施形態では、前記アッセイは、標的ポリペプチドを前記低分子ライブラリーと接触させること、および標的ポリペプチドと低分子ライブラリーの１以上の低分子との間に結合が起こったかどうかを決定することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、評価工程は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、サーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）、Ｘ線結晶学、ＤＮＡコードライブラリー（ＤＥＬ）スクリーン、アフィニティー選択－質量分析（ＡＳ－ＭＳ）、または共有結合フラグメントスクリーンを用いて実施される。
いくつかの実施形態では、前記アッセイは、組換え近接エフェクターと標的ポリペプチドが低分子結合剤の存在下で相互作用するかどうかを決定することによって、組換え近接エフェクターポリペプチドの低分子結合剤が分子糊であるかどうかを同定することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、決定工程はルシフェラーゼ相補性、酵母ツーハイブリッドアッセイ、アルファスクリーン、酵母接合に基づく相互作用アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動顕微鏡法（ＦＲＥＴ）、または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）を用いて実施され、低分子結合剤は、組換え近接エフェクターポリペプチドおよび標的ポリペプチドと同時に相互作用するか、または相互作用することができる場合は、分子糊である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドは、本明細書に記載の方法を用いて同定されたものである。
本開示の別の側面は、ヘテロ二機能性分子を作製する方法であって、
エフェクターポリペプチドのリガンド、場合により、低分子結合剤と標的ポリペプチドのリガンド、場合により、低分子結合剤を、本明細書に記載の方法を用いて同定する工程、および
前記エフェクターポリペプチドの低分子結合剤と前記標的ポリペプチドの低分子結合剤を、場合により、リンカーを介して結合する工程
を含んでなる方法を含む。
いくつかの実施形態では、前記方法は、エフェクターポリペプチドと標的ポリペプチドがヘテロ二機能性分子の存在下で相互作用するかどうかを評価することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、評価工程は、ルシフェラーゼ相補性、酵母ツーハイブリッドアッセイ、アルファスクリーン、酵母接合に基づく相互作用アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動顕微鏡（ＦＲＥＴ）、または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）を用いて実施される。
本開示の別の態様は、少なくとも１つの細胞において標的ポリペプチドを調節するためのプロセスであって、前記少なくとも１つの細胞において表４、５、６または７に示される近接エフェクターポリペプチドを発現させることを含んでなり、少なくとも１つの近接エフェクターポリペプチドは標的化部分と融合され、好ましくは、近接エフェクターポリペプチドは、ＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、もしくはＲＮＦ１２６から選択されるか、またはＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１、ＵＢＥ２ＢもしくはＫＬＨＬ４０から選択されるプロセスを含む。
いくつかの実施形態では、近接エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの分解剤である。いくつかの実施形態では、近接エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの安定化剤である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分解剤ポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ａ、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１および／またはＫＬＨＤＣ２から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分解剤は、ＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、ＺＥＲ１および／またはＲＮＦ１２６から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分解剤ポリペプチドは、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１および／またはＵＢＥ２Ｂから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの安定化剤ポリペプチドは、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４１、ＤＤＩ１、および／またはＰＲＰＳ２から選択され、好ましくは、ＫＬＨＬ４０である。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、癌遺伝子ポリペプチド、発癌性融合ポリペプチド、合成致死標的、免疫学的／癌免疫学的標的、優性機能獲得型疾患変異体、腫瘍抑制因子、または不安定疾患変異体である。いくつかの実施形態では、癌遺伝子ポリペプチドまたは発癌性融合ポリペプチドは、ＲＡＳ、ＭＹＣ、またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１であるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、合成致死標的は、ＥＷＳＲ１、ＳＭＡＲＣＡ２／４、またはＰＡＲＰ１である。いくつかの実施形態では、免疫学的／癌免疫学的標的は、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１またはＪＡＫである。いくつかの実施形態では、優性機能獲得型疾患変異体は、ＦＵＳ、ＴＤＰ４３、ａ－シヌクレイン、アミロイドβ前駆体タンパク質、ＨＴＴ、またはプリオンタンパク質である。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制因子は、ｐ５３またはＰＴＥＮである。いくつかの実施形態では、不安定疾患変異体は、ＣＦＴＲ突然変異またはジストロフィン変異体である。
いくつかの実施形態では、近接エフェクターは、ＫＬＨＬ４０またはＫＬＨＬ４１であり、標的ポリペプチドは、筋ジストロフィーの安定性喪失型変異体である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＢＣＲ－ＡＢＬである。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ナノボディ、リガンド、相互作用ペプチドまたは抗体である。
本開示の別の態様は、表４、５、６または７から選択される近接エフェクターポリペプチド、および標的ポリペプチドに結合する標的化部分を含んでなる融合ポリペプチドを含み、好ましくは、近接エフェクターポリペプチドは、ＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、もしくはＲＮＦ１２６から選択されるか、またはＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１、ＵＢＥ２ＢもしくはＫＬＨＬ４０から選択される。いくつかの実施形態では、近接エフェクターポリペプチドは、ＺＥＲ１ ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＵＢＥ２ＢまたはＫＬＨＬ４０から選択される。いくつかの実施形態では、近接エフェクターポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ａ、ＺＥＲ１、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４０融合、ＫＬＨＬ６融合、またはＰＲＮＰ融合から選択される。いくつかの実施形態では、エフェクターポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｂ、ＺＥＲ１ ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４１、ＤＤＩ１、またはＰＲＰＳ２である。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、分解剤である近接エフェクターポリペプチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、近接エフェクターポリペプチドは、ＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、ＺＥＲ１またはＲＮＦ１２６から選択される。いくつかの実施形態では、近接エフェクターポリペプチドは、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１、またはＵＢＥ２Ｂから選択される。いくつかの実施形態では、近接エフェクターポリペプチドは、安定化剤、好ましくは、ＫＬＨＬ４０である。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、標的ポリペプチドに結合するナノボディ、リガンド、相互作用ペプチドまたは抗体である。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ナノボディ、場合により、ｖｈｈＧＦＰまたはαタグナノボディである。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、癌遺伝子ポリペプチド、発癌性融合ポリペプチド、合成致死標的、免疫学的／癌免疫学的標的、優性機能獲得型疾患変異体、腫瘍抑制因子、または不安定疾患変異体から選択される。いくつかの実施形態では、癌遺伝子ポリペプチドまたは発癌性融合ポリペプチドは、ＲＡＳ、ＭＹＣ、またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１である。いくつかの実施形態では、合成致死標的は、ＥＷＳＲ１、ＳＭＡＲＣＡ２／４、またはＰＡＲＰ１である。いくつかの実施形態では、免疫学的／癌免疫学的標的は、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１またはＪＡＫである。いくつかの実施形態では、優性機能獲得型疾患変異体は、ＦＵＳ、ＴＤＰ４３、ａ－シヌクレイン、アミロイドβ前駆体タンパク質、ＨＴＴ、またはプリオンタンパク質である。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制因子は、ｐ５３またはＰＴＥＮである。いくつかの実施形態では、不安定疾患変異体は、ＣＦＴＲ変異体またはジストロフィン変異体である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＥＧＦＰ－ＡＢ１、ＡＢＩ１、Ｒｌｕｃ、ＦＵＳ Ｓ５２５Ｌ、ＮＲＡＳ、ＤＮＡＪＡ３、ＢＲＡＦ、ＬＡＭＰ１、ＴＤＰ４３、Ｑ３１１Ｋ、ＣＤ６３、Ｈ２Ｂ、ＥＧＦＲ、ＤＮＡＪＢ１１またはＷＤＲ５から選択される。
本開示の別の態様は、薬剤の作製において使用するための本明細書に記載の融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、近接エフェクターＫＬＨＬ４０またはＫＬＨＬ４１を含んでなり、標的ポリペプチドは安定性喪失型変異体であり、薬剤は筋ジストロフィーを治療するためのものである。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドはＢＣＲ－Ａｂｌである。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の任意の融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。本開示の別の態様は、本明細書に記載の任意の核酸を含んでなるベクターを含む。
以下、本開示の実施形態を図面に関して説明する。
図１Ａは、本明細書に記載の方法の概略図である。 図１Ｂは、本明細書に記載の方法の概略図である。 図２は、本明細書に記載の分解および安定化スクリーンの結果を示す画像である。 図３Ａは、プリオンタンパク質（ＰＲＮＰ）およびＦＣＧＲ３Ｂの構造を示す概略図である。 図３Ｂは、組換えおよび融合ＰＲＮＰポリペプチドおよびＦＣＧＲ３Ｂポリペプチドの構造の概略図ならびに各ポリペプチドの相対ＧＦＰ強度を示すグラフを示す。 図３Ｃは、組換えＦＣＧＲ３Ｂポリペプチドのアミノ酸配列を示す概略図および各ポリペプチドの相対ＧＤＰ強度を示すグラフである。配列番号６～２４を示す。 図４Ａは、トランスで分解を示す融合ポリペプチドの概略図および各ポリペプチドの相対蛍光強度を示すグラフである。 図４Ｂは、シスで分解を示す融合ポリペプチドの概略図および各ポリペプチドの相対蛍光強度を示すグラフである。 図５Ａは、ウミシイタケ(Renilla)の野生型ＵＢＥ２ＢおよびＣｙｓ８８のアラニンへの変異を含んでなる変異型ＵＢＥ２Ｂの相対ＧＦＰ強度を示すグラフである。 図５Ｂは、ＵＢＥ２Ｂの構造の概略図ならびにウミシイタケの野生型ＵＢＥ２ＢおよびＵＢＥ２Ｂの変異体の相対ＧＦＰ強度を示すグラフである。 図５Ｃは、推定エフェクターポリペプチドＥＧＦＰの蛍光強度中央値を示すグラフである。 図６Ａは、ｖｈｈＧＦＰを有するまたは有さないＥＧＦＰおよびウミシイタケルシフェラーゼ、ＫＬＨＬ４０、ＤＤＩ１、およびＰＲＰＳ２を含む分解アッセイの結果を示すグラフである。 図６Ｂは、ＤＤＩ１ポリペプチドおよび組換えＤＤＩ１ポリペプチドの構造の一連の概略図ならびに各ポリペプチドの相対ＧＦＰ強度を示すグラフである。 図６Ｃは、ＰＲＳ２および変異型ＰＲＰＳ２の相対ＧＦＰ強度を示すグラフである。 図６Ｄは、ＫＬＨＬ４０ポリペプチドおよび組換えＫＬＨＬ４０ポリペプチドの構造の一連の概略図ならびに各ポリペプチドの相対ＧＦＰ強度を示すグラフである。 図６Ｅは、ＫＬＨＬ４０およびＫＬＨＬ６のそれぞれに由来するドメインを含んでなるＫＬＨＬ４０ポリペプチドおよびＫＬＨＬ６ポリペプチドおよび組換えポリペプチドの構造の一連の概略図ならびに各ポリペプチドの相対ＧＦＰ強度を示すグラフである。 図６Ｆは、いくつかのポリペプチドのアミノ酸配列を示す画像である。配列番号２５～３９を示す。 図７は、Ｃ末端ｖｈｈＧＦＰまたはＮ末端ｖｈｈＧＦＰのいずれかのタグを有するいくつかのポリペプチドの活性を測定するアッセイの結果を示す画像である。 図８は、推定エフェクターポリペプチドを種々の標的ポリペプチドの分解剤または安定化剤ポリペプチドとして同定するためのスクリーニングの結果を示す画像である。 図９は、不安定な変異体およびＧＦＰを含んでなる標的融合ポリペプチドの構造の概略図、ｖｈｈＧＦＰと融合された推定エフェクターポリペプチドの構造の概略図および各標的ポリペプチドに対する各エフェクターの活性を示す画像である。 図１０Ａは、エフェクターポリペプチドの活性を測定するアッセイの結果を示す画像である。 図１０Ｂは、エフェクターポリペプチドのウエスタンブロット定量を示すグラフである。 図１０Ｃは、エフェクターポリペプチドの活性を測定するアッセイの結果を示す画像である。 図１１Ａは、本明細書に記載の分解および安定化スクリーンで使用されるｖｈｈＧＦＰ融合ポリペプチドの構造の概略図である。 図１１Ｂは、本明細書に記載の分解および安定化スクリーンの結果を示す画像である。 図１２Ａは、本明細書に記載の安定化スクリーンで使用されるＧＮＭＴ Ｈ１７６Ｎ－ＧＦＰ融合ポリペプチドおよびｖｈｈＧＦＰ融合ポリペプチドの構造の概略図である。 図１２Ｂは、本明細書に記載の安定化スクリーンの結果を示す画像である。 図１３Ａは、脱ユビキチン化酵素機能、特に、ＵＳＰ１３の必要条件を示す本明細書に記載の安定化アッセイの結果を示すグラフである。 図１３Ｂは、脱ユビキチン化酵素機能、特に、ＵＳＰ３８の必要条件を示す本明細書に記載の安定化アッセイの結果を示すグラフである。 図１３Ｃは、脱ユビキチン化酵素機能、特に、ＵＳＰ３９の必要条件を示す本明細書に記載の安定化アッセイの結果を示すグラフである。 図１３Ｄは、脱ユビキチン化酵素機能、特に、ＯＴＵＢ１の必要条件を示す本明細書に記載の安定化アッセイの結果を示すグラフである。 図１４Ａは、ドキシサイクリンの存在下または非存在下での本明細書に記載のエフェクターポリペプチドについてのウエスタンブロット結果の概略図、画像、およびバンド強度のグラフ表示を示すグラフを示す。 図１４Ｂは、ドキシサイクリンの存在下または非存在下での本明細書に記載のエフェクターの相対増殖を経時的に示す一連の折れ線グラフである。 図１５Ａは、ＡＲＡＦ、本明細書に記載のエフェクター、およびＨｓｐ９０のウエスタンブロッティング結果の概略図および画像である。 図１５Ｂは、ドキシサイクリンの存在下または非存在下での本明細書に記載のエフェクターポリペプチドについてのウエスタンブロット結果の概略図、画像、およびバンド強度のグラフ表示を示すグラフを示す。
詳細な説明
特に断りのない限り、本開示に関して使用される科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解している意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。例えば、「細胞」という用語は、単一細胞ならびに複数の細胞または細胞集団も含む。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して、ならびにそれらの技術に関連して利用される命名法は、当技術分野において周知かつ慣用されるものである（例えば、Green and Sambrook, 2012を参照）。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、内容が別段のことを明示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「化合物」を含む組成物は、２つ以上の化合物の混合物を含む。また、「または」という用語は、内容が別段のことを明示しない限り、一般に「および／または」を含む意味で使用されることに留意されたい。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１以上の要素のリストに関して「少なくとも１つ」という語句は、要素のリスト内のいずれか１以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列挙されるありとあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、要素のリスト内の要素のいずれの組合せも除外するものではない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、具体的に特定された要素に関連するものであれ無関係なものであれ、場合により存在し得ることを許容する。
本出願および特許請求の範囲において使用される場合、「からなる」という語およびその派生語は、示された特徴、要素、構成要素、群、整数、および／または工程の存在を特定し、また、示されていない他の特徴、要素、構成要素、群、整数、および／または工程の存在を除外する、クローズエンドの用語であることを意図している。
本明細書で使用される場合、「約」、「実質的に」および「およそ」という用語は、最終結果が大きく変化しないような、修飾されたその用語の合理的な偏差量を意味する。これらの程度の用語は、この偏差が、それが修飾する語の意味を否定しない限り、修飾された語の少なくとも±５％または少なくとも±１０％の偏差を含むと解釈されるべきである。
特定の節に記載された定義および実施形態は、当業者に理解されるように、それらが適切な本明細書に記載された他の実施形態にも適用されることが意図される。
本明細書における端点による数値範囲の記載は、その範囲内に包含される全ての数値および端数を含む（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５が含まれる）。また、全ての数値およびその端数は、「約」という用語によって修飾されると仮定されていることも理解されたい。本明細書に記載されている範囲については、例えば、その間の０．１刻みなどの下位範囲も企図される。例えば、範囲が８０％～約９０％の場合、８０．１％～約９０％、８０％～約８９．９％、８０．１％～約８９．９％なども企図される。
「細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、単一の細胞または複数の細胞を指す。
本開示の範囲を理解する上で、「含んでなる(comprising)」およびその派生語（例えば、「comprises」および「comprises」）、「有する(having)」（およびhavingの任意の形態、例えば、「have」および「has」）、「含む(including)」（およびincludingの任意の形態、例えば、「include」および「includes」）または「含有する(containing)」（およびcontainingの任意の形態、例えば、「contain」および「contains」）という用語は、本明細書で使用される場合、記載された特徴、要素、構成要素、群、整数、および／または工程の存在を特定するオープンエンドの用語であることを意図しているが、記載されていない他の特徴、要素、構成要素、群、整数、および／または工程の存在を除外するものではない。上記のことはまた、「含む(including)」、「有する(having)」という用語およびそれらの派生語など、同様の意味を有する語にも当てはまる。
特定の節に記載された定義および実施形態は、当業者に理解されるように、それらが適切な本明細書に記載された他の実施形態にも適用されることが意図される。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係なく、２つ以上の天然または非天然アミノ酸残基の鎖を指す。単一のポリペプチド鎖であるタンパク質およびマルチサブユニットタンパク質（例えば、２つ以上のポリペプチドから構成される）が含まれる。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化および他のキメラ抗体、または完全ヒト抗体、ならびにその結合フラグメント、例えばナノボディを含むことが意図される。抗体は組換え源由来であってもよく、および／またはトランスジェニック動物で産生されたものであってもよい。また、生化学的技術を用いて産生可能な抗体、またはライブラリーから単離可能な抗体も含まれる。
本明細書で使用する場合、「推定近接エフェクターポリペプチド」または「推定エフェクターポリペプチド」という用語は、標的ポリペプチドを分解または安定化する能力、標的ポリペプチドを含む細胞において細胞死を引き起こす能力、または細胞表面ポリペプチドの膜局在を促進する能力について、例えば本明細書に記載のアッセイまたは方法においてスクリーニングされるポリペプチドを意味する。例えば、細胞内で発現されたＯＲＦｅｏｍｅライブラリーのＯＲＦは、推定近接エフェクターポリペプチドである。
本明細書で使用する場合、「近接エフェクターポリペプチド」または「エフェクターポリペプチド」という用語は、標的ポリペプチドに近接した際に生物学的効果を誘導することができるポリペプチド、例えば、標的ポリペプチドを分解または安定化するポリペプチド、標的ポリペプチドを含む細胞において細胞死を引き起こすことができるポリペプチド、または細胞表面ポリペプチドの膜局在を促進することができるポリペプチドを意味する。
「エフェクター」という用語は、推定近接エフェクターポリペプチドまたは近接エフェクターポリペプチドまたはその両方を指して使用することができる。
「蛍光ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載のペプチド、抗体または他の化合物に付着させる、または導入することができ、直接的または間接的に、検出可能な蛍光シグナルを生成し得る蛍光ポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「標的ポリペプチド」という用語は、例えば、近接エフェクターであるかどうか、例えば、標的ポリペプチドを分解もしくは安定化するかどうかを決定するためには、例えば本明細書に記載のアッセイもしくは方法においてスクリーニングされる推定近接エフェクターポリペプチドとの、または例えば、標的ポリペプチドが分解または安定化される場合には、分解剤ポリペプチドまたは安定化剤ポリペプチドとの近接誘導相互作用において標的化される目的のポリペプチドを意味する。標的ポリペプチドは、例えばエフェクターポリペプチドと融合された標的化部分、例えば標的ポリペプチドに結合する分解剤ポリペプチドまたは安定化剤ポリペプチドを用いて、別のポリペプチドと近接させることができる。標的ポリペプチドは、ＡＢＩ１、例えばＥＧＦＰ－ＡＢＩ１などのペプチド相互作用タグを含んでなる融合ポリペプチド中にあってもよい。標的ポリペプチドは、マルチサブユニットタンパク質であってもよい。標的ポリペプチドは、哺乳動物、好ましくはヒトを含む任意の種であり得る。標的ポリペプチドは、内因性ポリペプチドでも組換え発現ポリペプチドであってもよい。
本明細書で使用される場合、「分解剤ポリペプチド（ｄｅｇｒａｄｅｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」（単に「分解剤」と呼ばれることもある）という用語は、細胞内で標的ポリペプチドに近接すると、標的ポリペプチドを、対照と比較して、例えば少なくとも１０％分解する、または分解をもたらすポリペプチドを意味する。分解剤ポリペプチドは、例えば、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＨｉＢｉＴ／ＬｇＢｉｔ、またはＧＦＰ１１／ＧＦＰ１－１０システムを用いて直接または間接的に標的ポリペプチドに結合する分解剤ポリペプチドと融合された標的化部分を用いて標的ポリペプチドに近接させることができる。分解剤ポリペプチドは、標的ポリペプチドの半減期を短縮し、および／または細胞内の標的ポリペプチドのレベルを減少させることができる。文脈によって、分解剤ポリペプチドまたは分解剤という場合、分解剤ポリペプチドをコードする核酸配列を指すこともある。
本明細書で使用される場合、「安定化剤ポリペプチド（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」（または単に「安定化剤」と呼ばれることもある）という用語は、細胞内で標的ポリペプチドに近接すると、標的ポリペプチドを安定化させる、または安定化をもたらすポリペプチドを意味する。安定化剤ポリペプチドは、例えば、標的ポリペプチドに結合する安定化剤ポリペプチドと融合された標的化部分を用いて、標的ポリペプチドに近接させることができる。安定化剤ポリペプチドは、例えば、対照と比較した場合に、標的ポリペプチドの半減期を延長し、および／または細胞内の標的ポリペプチドのレベルを増加させることができる。文脈によって、安定化剤ポリペプチドまたは安定化剤という場合、分解剤ポリペプチドをコードする核酸配列を指すこともある。
本明細書で使用する場合、「致死ポリペプチド（ｌｅｔｈａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」には、標的ポリペプチドに近接させると細胞死を引き起こすポリペプチドが含まれる。
本明細書で使用する場合、「タンパク質輸送ポリペプチド」という用語には、変異型細胞表面ポリペプチドを含む細胞表面ポリペプチドの膜局在を促進するポリペプチドが含まれる。
本明細書で使用する場合、「標的化部分」という用語には、標的ポリペプチドに結合するポリペプチド、例えば、抗体、抗体結合フラグメント、ナノボディ、リガンドまたは場合により融合ポリペプチドの相互作用ペプチドが含まれる。標的化部分は、エフェクター、例えば、分解剤または安定化剤ポリペプチドと融合させることができる。標的化部分は、いくつかの場合、例えば、標的化部分が抗体、場合により、ナノボディなどの結合タンパク質である場合、推定近接エフェクターポリペプチドまたは近接エフェクターポリペプチドを構成的に近接させ得る。標的化部分は、いくつかの場合、例えば、別の分子、例えばアブシジン酸などの化学誘導剤（例えば、相互作用ＡＢＩ１およびＰＹＬ１ドメインを含んでなるタンパク質の相互作用をもたらす）の存在下での化学的二量体化を介した誘導時にのみ、標的ポリペプチドに結合する。このような化学的誘導剤およびそれらが化学的二量体化を誘導するドメインは本明細書に記載され、例えば、Ziegler et al., Mandipropamid as a chemical inducer of proximity for in vivo applications. Nat Chem Biol 18, 64-69 (2022)に記載されており、これは参照により本明細書の一部とされる。標的化部分は、結合親和性アッセイにおいて、場合によりＳＰＲにより、１０ｅ－４Ｍより低いｋｄで標的ポリペプチドに結合する任意の分子であり得る。
「相互作用ペプチド」は、本明細書で使用する場合、例えば、別の相互作用ペプチド（相補的相互作用ペプチドと呼ばれることもある）と特異的に相互作用する、または相互作用もしくは二量体化するように誘導することができるペプチドを含み得る。相互作用ペプチド（および相補的相互作用ペプチド）の例としては、限定されるものではないが、化学誘導剤の存在下で互いに結合するＡＢＩ１およびＰＹＬ１、ＡＢＩ１およびＰＹＲ、ＧＩＤ１およびＧＡＩまたはＦＫＢＰおよびＦＲＢが挙げられる。相互作用ペプチドの例は、相補的相互作用ペプチドの例でもあると理解されたい。
本明細書で使用する場合、「負の選択マーカー」には、選択時に宿主生物の増殖を排除または阻害する選択マーカーが含まれる。負の選択マーカーの例は、ガンシクロビルの存在下でのチミジンキナーゼ、または２－ブロモビニルデオキシウリジンもしくはＬ－デオキシチミジンの存在下での改変デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ＊）である。
本明細書で使用する場合、「合成致死標的（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｅｔｈａｌ ｔａｒｇｅｔ）」という用語には、阻害または活性化されると特定の条件下でのみ細胞死を引き起こすポリペプチドが含まれる。例えば、ＳＭＡＲＣＡ２は、ＳＭＡＲＣＡ４変異腫瘍に存在する場合、合成致死標的である。
本開示の一態様は、表４から選択される１つまたは少なくとも１つの近接エフェクターポリペプチドおよび１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドに結合する１つまたは少なくとも１つの標的化部分を含んでなる融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの近接エフェクターポリペプチドは、表５または表６または表７から選択される。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの近接エフェクターポリペプチドは、図１２Ｂのものから選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの近接エフェクターポリペプチドは、図１１Ｂのものから選択される。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの近接エフェクターポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ａ、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ４０（場合により、ＫＬＨＬ４０フラグメント）、ＫＬＨＬ４０融合物、ＺＥＲ１またはＰＲＮＰ融合物から選択される。
一実施形態では、ＫＬＨＬ４０は、ＫＬＨＬ４０フラグメント、例えば、表４に挙げられているフラグメントである。
いくつかの実施形態では、１つまたはなくとも１つの近接エフェクターポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｂ、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４０融合物、またはＫＬＨＬ６から選択される。実施例で示されるように、同定された近接エフェクターの多くは、既知の近接分解剤ＣＲＢＮおよびＶＨＬよりも大きな活性を有していた。
よって、一実施形態では、１つまたは少なくとも１つの近接エフェクターポリペプチドは、ＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、またはＲＮＦ１２６から選択される。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つのエフェクターポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｂ、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４１、ＤＤＩ１、またはＰＲＰＳ２から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの標的化部分は、少なくとも１つの標的ポリペプチドに結合するナノボディ、リガンド、相互作用ペプチドまたは抗体である。標的化部分は、内因性標的ポリペプチドと直接または間接的に結合することができる。標的化部分はまた、内因性標的ポリペプチドと融合されているタグまたは相互作用ペプチドに結合することもできる。いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの標的化部分は、ナノボディ、場合により、ｖｈｈＧＦＰまたはエピトープタグ結合タンパク質、例えば、ＡＬＦＡタグ、ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグまたはＶ５タグに対する結合タンパク質（抗体またはナノボディ）である。標的化部分が相互作用ペプチドであるかまたはそれを含んでなる場合、エフェクターもまた、標的化部分相互作用ペプチドと相補的な相互作用ペプチドを含んでなり得る。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドは、発癌性ポリペプチド、発癌性融合タンパク質、合成致死標的、免疫学的／癌免疫学的標的、優性機能獲得型疾患変異体、腫瘍抑制因子タンパク質、または不安定疾患変異体から選択される。
いくつかの実施形態では、発癌性ポリペプチドまたは発癌性融合タンパク質は、ＲＡＳ、ＭＹＣ、またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１である。
いくつかの実施形態では、合成致死標的は、ＥＷＳＲ１、ＳＭＡＲＣＡ２／４、またはＰＡＲＰ１である。いくつかの実施形態では、合成致死標的は、ＳＭＡＲＣＡ４変異体の存在下でＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ２変異体の存在下でＳＭＡＲＣＡ４、ＢＲＣＡ１／２欠損細胞でのＰＡＲＰ１、および／またはＭＴＡＰが喪失した細胞でのＰＲＭＴ５である。
免疫学的／癌免疫学的標的には、例えば、Ｔ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷に関与するタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫学的／癌免疫学的標的は、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１またはＪＡＫである。
いくつかの実施形態では、優性機能獲得型疾患変異体は、ＦＵＳ、ＴＤＰ４３、ａ－シヌクレイン、アミロイドβ前駆体タンパク質、ＨＴＴ、またはプリオンタンパク質機能獲得型疾患変異体である。いくつかの実施形態では、優性機能獲得型疾患変異体は、表１から選択される。優性機能獲得型疾患変異体には、疾患表現型を引き起こす機能獲得（すなわち、毒性）をもたらす変異を有するタンパク質が含まれる。
Figure 2025512531000002
Figure 2025512531000003
いくつかの実施形態では、腫瘍抑制因子タンパク質は、ｐ５３またはＰＴＥＮである。
不安定疾患変異体には、疾患表現型を引き起こすタンパク質のミスフォールディングおよび／または分解をもたらすタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、不安定疾患変異体は、ＣＦＴＲ変異体またはジストロフィン変異体である。いくつかの実施形態では、不安定疾患変異体は、ＣＦＴＲΔ５０８、ＡＣＴＢ Ｅ３６４Ｋ、ＡＬＤＯＡ Ｅ２０６Ｋ、ＡＭＨＲ２ Ｒ５４Ｃ、ＡＭＰＤ３ Ａ３２０Ｖ、ＣＢＳ Ｌ４５６Ｐ、ＧＮＭＴ Ｈ１７６Ｎ、ＰＩＫＬＲ Ｆ１３２Ｌ、ＳＣＡＲＢ Ｈ３６３Ｎ、またはＴＰＭＴ Ａ８０Ｐである。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドは、ＥＧＦＰ－ＡＢＩ１、Ｒｌｕｃ、ＦＵＳ Ｓ５２５Ｌ、ＮＲＡＳ、ＤＮＡＪＡ３、ＢＲＡＦ、ＬＡＭＰ１、ＴＤＰ４３ Ｑ３１１Ｋ、ＣＤ６３、Ｈ２Ｂ、ＥＧＦＲ、ＤＮＡＪＢ１１またはＷＤＲ５から選択される。
いくつかの実施形態では、その少なくとも１つの標的ポリペプチドは、ヒトポリペプチドである。
融合ポリペプチドは、本明細書に記載の任意の群（ｇｒｏｕｐ）または任意の群の亜群（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）から選択される近接エフェクターを含んでなり得、本明細書に記載の任意の標的化部分または標的化部分群と組み合わせることができる。
融合ポリペプチドは、１つのもしくは少なくとも１つの標的ポリペプチドに結合する１つのもしくは少なくとも１つの標的化部分のＣ末端および／または１つのもしくは少なくとも１つの標的ポリペプチドに結合する１つのもしくは少なくとも１つの標的化部分のＮ末端に表４、５、６または７から選択される１つのもしく少なくとも１つの近接エフェクターポリペプチドを含んでなり得る。例えば、ＰＲＲ２０Ａ、ＭＹＬＩＰ、ＫＬＨＬ２２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＦＢＸＬ１５、ＴＲＩＭ３９、ＮＨＬＲＣ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ、ＫＬＨＬ６、ＤＣＡＦ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＲＮＦ１６６、ＲＴＬ８Ｃ、ＳＰＯＰ、ＬＹ６Ｄ、ＡＳＢ６、またはＰＲＮＰは、１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドに結合する１つまたは少なくとも１つの標的化部分のＣ末端にあり得る。
近接エフェクターへの言及には、その活性フラグメントへの言及を含む。例えば、本明細書で示されるように、ＢＴＢドメインを含む種々のＫＬＨＬ４０フラグメントが安定化エフェクターとして働く。ＢＴＢドメインが欠失しているＫＬＨＬ４０フラグメントは、分解エフェクターとして働く。ＫＬＨＬ４０という場合には、全タンパク質、例えば、アクセッション番号Ｑ２ＴＢＡ０に示される配列、またはその活性フラグメントを指し得る。例えば、ＫＬＨＬ４０融合物という場合には、ＫＬＨＬ４０のＢＴＢドメインがＫＬＨＬ６のＢＴＢドメインと入れ替わったＫＬＨＬ４０を指す。融合ポリペプチドに含まれ得るエフェクター融合は、本明細書の例えば表４、５、６および７、ならびに実施例に記載されている。このような融合物という場合には、例えば、これらの表に記載される部分を含む。
融合ポリペプチドは、１つまたは少なくとも１つのエフェクターと１つまたは少なくとも１つの標的部分、例えばナノボディを連結するリンカーを含んでなり得る。種々のリンカーが使用可能である。短鎖および長鎖リンカーが種々のエフェクターとともに評価された。リンカー長は、エフェクター標的化部分融合ポリペプチドを標的ポリペプチドとともに発現させるアッセイでは、エフェクターの有効性に影響を及ぼさなかった。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の任意の融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。
本開示の別の態様は、方法、プロセス、アッセイ、キットでまたは本明細書に別途記載されるような使用のための、場合により、ＥＧＦＰ－ＡＢ１、Ｒｌｕｃ、ＦＵＳ、場合により、ＦＵＳ Ｓ５２５Ｌ、ＮＲＡＳ、ＤＮＡＪＡ３、ＢＲＡＦ、ＬＡＭＰ１、ＴＤＰ４３、場合により、ＴＤＰ４３ Ｑ３１１Ｋ、ＣＤ６３、Ｈ２Ｂ、ＥＧＦＲ、ＤＮＡＪＢ１１、ＷＤＲ５、ＲＡＳ、ＭＹＣ、またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１、ＥＷＳＲ１、ＳＭＡＲＣＡ２／４、またはＰＡＲＰ１、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１、ＪＡＫ、ａ－シヌクレイン、アミロイドβ前駆体タンパク質、ＨＴＴ、プリオンタンパク質、ｐ５３、ＰＴＥＮ、ＣＦＴＲ変異体、またはジストロフィン変異体を含んでなるまたはから選択される１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチド；第１の蛍光ポリペプチド、および場合によりその間（例えば、標的ポリペプチドと蛍光タンパク質の間）にＩＲＥＳまたは切断部位をコードする核酸を含む。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の１以上の成分を含んでなるキットである。一実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法において使用するためのものである。一実施形態では、キットは、本明細書に記載の核酸のいずれかを含んでなる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の融合ポリペプチドのいずれかを含んでなる。一実施形態では、キットは、本明細書に記載の細胞株を含んでなる。核酸は、本明細書に記載のベクターを含むベクターを含んでなり得る。キットは、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合ポリペプチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、キットは、例えば、核酸または融合ポリペプチドを含んでなるバイアルまたはその他のハウジングをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、キットは、説明書のセット、または本明細書に記載のアッセイを実施するための１以上の試薬をさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つの標的ポリペプチドに結合する標的化部分と融合された少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドを含んでなる本明細書に記載の任意のライブラリー、場合により、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを含んでなる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的ポリペプチドは、第２の蛍光ポリペプチドに融合される。
いくつかの実施形態では、第１の蛍光ポリペプチドは、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ＢＦＰまたはＧＦＰである。
いくつかの実施形態では、第２の蛍光ポリペプチドは、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ＢＦＰまたはＧＦＰであり、第１および第２の蛍光ポリペプチドにより発せられる蛍光シグナルは、フローサイトメトリーを用いて識別可能である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのエフェクターポリペプチドは、複数のエフェクターポリペプチドである。
融合ポリペプチドは、薬剤を作製するために使用することができる。本明細書で述べられるように、ＫＬＨＬ４０を含んでなる融合物は、筋ジストロフィーに見られる不安定な変異体を標的とするために特に有用であり得る。また、白血病に関与する融合タンパク質であるＢＣＲ－Ａｂｌは、本明細書に記載のエフェクターにより標的とされ得ることが本明細書で示された。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の任意の核酸を含んでなるベクターである。
さらなる態様は、本明細書に記載の核酸を含んでなるか、または融合タンパク質を発現する組換え細胞を含む。
融合ポリペプチド、核酸、ベクター、キット、使用および細胞は、本明細書に記載の１以上の方法、プロセス、またはアッセイで使用することができる。
本明細書では、近接スクリーニングを実施するための偏りのないアプローチが提供される。実証されたように、採用された方法は、標的ポリペプチドを分解または安定化し得る多数の近接エフェクターを同定した。このような方法は、安定化剤および／または分解剤に加え、他のエフェクターを同定するために使用することができる。
一態様は、近接エフェクターポリペプチドを同定する方法を含み、その方法は、
ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを複数の細胞に形質導入する工程であって、前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーは複数のＯＲＦをコードし、前記ＯＲＦのそれぞれは、標的ポリペプチドに直接的または間接的に結合するか、または結合するように誘導することができる標的化部分と融合されている、工程；
前記標的化部分が前記標的ポリペプチドと相互作用するための条件下で、前記複数の形質導入細胞内で前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの複数のＯＲＦを発現させる工程；および
対照と比較して前記複数のＯＲＦのいずれかを発現する細胞における前記標的ポリペプチドの存在量、場合により、全存在量、細胞表面存在量もしくは細胞内存在量を測定すること、および／または対照と比較して前記複数の形質導入細胞において前記複数のＯＲＦのいずれかが枯渇もしくは増加しているかどうかを検出することによって、前記複数のＯＲＦのいずれかが近接エフェクターポリペプチドであるかどうかを決定する工程
を含み、
前記複数の形質導入細胞は、前記標的ポリペプチドを組換え発現し、かつ場合により、第１の蛍光ポリペプチドを発現し、前記標的ポリペプチドは、第２の蛍光ポリペプチド、内因性タンパク質、または第２の蛍光ポリペプチドエピトープタグ、抗生物質耐性タンパク質および／もしくは負の選択マーカーと融合された融合ポリペプチドであり；
ＯＲＦは、ＯＲＦが対照と比較して前記標的ポリペプチドの存在量を増加もしくは減少させているか、または対照と比較して前記複数の形質導入細胞で枯渇もしくは増加している場合に、近接エフェクターポリペプチドをコードしている。
第１の蛍光ポリペプチドは、内部正規化として働くことができ、スクリーニングの感度を高めることができる。いくつかの実施形態では、複数の細胞は、第１の蛍光ポリペプチドを発現する。
特に、これらの方法は、安定化剤および分解剤を同定するために使用することができる。
従って、本開示の別の態様は、１つまたは少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドを標的ポリペプチドの分解剤または安定化剤として同定する方法を含み、その方法は、
ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを複数の細胞に形質導入する工程、
前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの１つまたは少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドを発現させる工程であって、前記少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドは、少なくとも１つの標的ポリペプチドに結合する標的化部分と融合されている、工程、および
前記少なくとも１つの細胞中の前記少なくとも１つの標的ポリペプチドのレベルが対照に比べて減少または増加しているかどうかを決定する工程
を含んでなり、
前記複数の細胞はそれぞれ、第１の蛍光ポリペプチドおよび第２の蛍光ポリペプチドと融合された前記少なくとも１つの標的ポリペプチドを組換え発現するか、または前記標的ポリペプチドは、抗生物質耐性タンパク質または負の選択マーカーと融合され、
前記標的ポリペプチドのレベルが減少する場合には、前記少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドは、前記標的ポリペプチドの分解剤であり、前記標的ポリペプチドのレベルが増加する場合には、前記少なくとも１つのエフェクターポリペプチドは、前記標的ポリペプチドの安定化剤である。
標的ポリペプチドの存在量またはレベルを測定することは、標的ポリペプチドが対照に比べて減少もしくは増加しているかどうか、または標的ポリペプチドの細胞表面レベルが対照に比べて増加もしくは減少しているかどうか、または特定の細胞内画分または標的オルガネラのオルガネラレベルが対照に比べて増加もしくは減少しているかどうかを決定することを含んでなり得る。使用するセンサーおよびタグと同定される近接エフェクターのタイプの組合せに応じて、ポリペプチドレベルを評価するために様々な方法を使用することができる。例えば、実施例で示されるように、蛍光タグの場合、所望の画分の蛍光レベルを測定し、非選別細胞と比較することができる。
あるいは、いくつかの実施形態では、決定することは、標的ポリペプチドに特異的な抗体を用いて前記１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドのレベルをモニタリングすることを含んでなり得る。例えば、蛍光タグが使用されない場合、蛍光標識抗体または免疫磁性ビーズなどのタグ付き結合タンパク質を用いるイムノアフィニティ技術によって、細胞表面標的ポリペプチドなどの標的ポリペプチドを直接または間接的に検出し、ＦＡＣＳまたは磁気分離によって分離することができる。
増加または減少は、例えば、少なくとも１０パーセントであり得、または例えば、「減少した」とは、対照に比べて、例えばｐ＜０．０５での統計的に有意な減少をさし、または例えば「増加した」とは、対照に比べて、例えばｐ＜０．０５での統計的に有意な増加を指す。
対照は、例えば、蛍光を用いる場合には非選別細胞、または抗生物質耐性もしくは負の選択を用いる場合には非処理細胞であり得る。
別の実施形態では、標的化部分は、標的ポリペプチドに結合するナノボディ、リガンドまたは抗体である。いくつかの実施形態では、標的化部分は、１０ｅ－４より低い、例えば、１０ｅ－５または１０ｅ－６のｋｄで少なくとも１つの標的ポリペプチドに結合する任意の分子である。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＨａｌｏＴａｇ（商標）（ハロアルカンデハロゲナーゼ）である。例えば、ＨａｌｏＴａｇ（商標）は、少なくとも１つの標的ポリペプチドが既知のリガンドを有し、このようなリガンドのクロロアルカン誘導体が合成される場合に、標的化部分として使用可能である。例えば、標的ポリペプチドがＢＲＤ４である場合、リガンドは、ＢＲＤ４に結合するＪＱ１－クロロアルカンであり得、エフェクターポリペプチドはＨａｌｏＴａｇと融合される。この例では、ＢＲＤ４レベルは、蛍光団に結合されたＢＲＤ４特異的抗体を用いる蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で追跡することができる。あるいは、ＢＲＤ４は多くの細胞株において必須遺伝子であるので、リードアウトとして細胞生存率を使用することができ、ＢＲＤ４の分解が細胞死により同定される場合は、リードアウトとして細胞生存率を使用する。いくつかの実施形態では、対照には、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーまたは少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドが形質導入されていない、少なくとも１つの標的ポリペプチドを発現する細胞（例えば、細胞株）が含まれる。いくつかの実施形態では、対照は、エフェクターを発現しない細胞である。いくつかの実施形態では、対照は、標的化部分に結合された不活性推定エフェクター（例えば、ルシフェラーゼ）を発現する細胞である。いくつかの実施形態では、例えば、抗体、ナノボディまたはその他の標的化部分を含んでなる融合タンパク質などの遺伝子構築物は、ＡＡＶ、アデノウイルス、ヘルペスウイルスベクターなどのウイルスベクターを介して、またはリポソームもしくは脂質ナノ粒子を用いて送達することができる。
いくつかの実施形態では、この方法は、第２の蛍光ポリペプチドであるか、もしくは２の蛍光ポリペプチドと融合された、および／またはエピトープタグ、抗生物質耐性タンパク質および／もしくは負の選択マーカーと融合された標的ポリペプチドを発現する細胞株を作製することをさらに含んでなる。標的ポリペプチドはまた、非標識または非タグ付きポリペプチド（例えば、組換え発現される内因性ポリペプチド）であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞株は、第１の蛍光ポリペプチドをさらに含んでなる。細胞株は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｈａｐ１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＭｉａＰａＣａ細胞、Ａ５４９細胞、ＴＨＰ－１細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、またはＫ５６２細胞を用いて生産することができる。一実施形態では、細胞株は、本明細書に開示される細胞株である。いくつかの実施形態では、細胞株を作製することは、標的ポリペプチドをコードする核酸、場合により、本明細書に開示される核酸または本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸のいずれかを細胞に導入すること、安定に形質導入された細胞を選択すること、およびクローン細胞株を生産することを含んでなる。この方法は、標的ポリペプチドが所望のレベルで発現されるクローンを選択することを含み得る。この方法は、実施例に記載される工程を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、標的ポリペプチドおよび場合により第１の蛍光ポリペプチドをコードし、場合により、標的ポリペプチドは、第２の蛍光ポリペプチドまたは抗生物質耐性タンパク質または負の選択マーカーと融合されている。いくつかの実施形態では、核酸は、ＥＧＦＰ－ＡＢ１、Ｒｌｕｃ、ＦＵＳ Ｓ５２５Ｌ、ＮＲＡＳ、ＤＮＡＪＡ３、ＢＲＡＦ、ＬＡＭＰ１、ＴＤＰ４３ Ｑ３１１Ｋ、ＣＤ６３、Ｈ２Ｂ、ＥＧＦＲ、ＤＮＡＪＢ１１、ＷＤＲ５、ＲＡＳ、ＭＹＣ、またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１、ＥＷＳＲ１、ＳＭＡＲＣＡ２／４、またはＰＡＲＰ１、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１、ＪＡＫ、ＦＵＳ、ＴＤＰ４３、ａ－シヌクレイン、アミロイドβ前駆体タンパク質、ＨＴＴ、プリオンタンパク質、ｐ５３、ＰＴＥＮ、ＣＦＴＲ変異体、またはジストロフィン変異体から選択される標的ポリペプチド；第１の蛍光ポリペプチド、およびＩＲＥＳをコードする。いくつかの実施形態では、細胞株は、２９３Ｔ細胞株であり、場合により、ＡＢＩ１－ＧＦＰ融合物を発現する。他の実施形態では、いずれの細胞株も使用可能である。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドレベルの減少または増加は、フローサイトメトリーを用いて、第２の蛍光ポリペプチドと第１の蛍光ポリペプチドの比を算出することによって決定される。いくつかの実施形態では、蛍光ポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の蛍光タンパク質、例えば、公開データベースfpbase.orgに開示されているものである。いくつかの実施形態では、第１または第２の蛍光ポリペプチドは、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ＢＦＰ、ＧＦＰ、またはその任意の変異体（例えば、ＥＧＦＰ）である。一実施形態では、第１の蛍光ポリペプチドはＧＦＰであり、第２の蛍光ポリペプチドはＢＦＰである。
抗生物質耐性ポリペプチドまたは負の選択マーカーと融合された標的ポリペプチドを含む方法、プロセス、スクリーニングアッセイなどでは、近接エフェクターは、分解剤または安定化剤または他のエフェクターであり得る。例えば、生存細胞を単離した後、抗生物質または負の選択薬で処理した複数の形質導入細胞を、各ＯＲＦ（例えば、推定近接エフェクター）の存在量に関して評価することができる。対照（例えば、非選択細胞）と比較して複数の形質導入細胞で枯渇しているＯＲＦは、それらのＯＲＦが分解剤エフェクターであることを示し、対照と比較して複数の形質導入細胞で富化されているＯＲＦは、それらのＯＲＦが安定化剤であることを示す。
従って、いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、抗生物質耐性タンパク質または負の選択マーカーと融合されている。いくつかの実施形態では、対照と比較した標的ポリペプチドのレベルの減少または増加は、対照と比較して複数の形質導入細胞の生存細胞における各ＯＲＦの相対存在量を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性タンパク質は、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼであり、この方法は、複数の形質導入細胞にピューロマイシンを添加することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、ピューロマイシンに曝された際の複数の形質導入細胞の細胞の生存は、標的ポリペプチドのレベルが対照と比較して増加していたことを示し、および／またはピューロマイシンに曝された際の複数の形質導入細胞の細胞の死滅は、標的ポリペプチドのレベルが対照と比較して減少していたことを示し得る。いくつかの実施形態では、ピューロマイシンに曝された際の対照と比較した複数の形質導入細胞の細胞増殖の増加は、標的ポリペプチドのレベルが対照と比較して増加していた（例えば、エフェクターは安定化剤である）ことを示し、ピューロマイシンに曝された際の対照と比較した複数の形質導入細胞のより低い程度の細胞増殖は、標的ポリペプチドのレベルが対照と比較して減少していた（例えば、エフェクターは分解剤である）ことを示す。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ブラストサイジンデアミナーゼ、またはハイグロマイシンキナーゼなど、他の抗生物質耐性タンパク質も使用可能である。使用される抗生物質は、それぞれ例えば、ネオマイシン、ブラストサイジンまたはハイグロマイシンとなろう。
使用される負の選択マーカーに応じて、細胞の増殖、増殖の欠如、または死滅は、対照と比較した増加または減少の指標となり得る。いくつかの実施形態では、負の選択マーカーは、チミジンキナーゼであり、この方法は、複数の形質導入細胞にガンシクロビルを添加することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、ガンシクロビルに曝された際の複数の細胞の細胞の生存は、標的ポリペプチドのレベルが対照と比較して減少していることを示し、ガンシクロビルに曝された際の複数の形質導入細胞の細胞死は、標的ポリペプチドのレベルが対照と比較して増加していることを示す。いくつかの実施形態では、ガンシクロビルに曝された際の複数の細胞の、対照と比較した細胞増殖の増加は、標的ポリペプチドのレベルが対照と比較して減少していることを示し、ガンシクロビルに曝された際の対照と比較した複数の形質導入細胞のより低い程度の細胞増殖は、標的ポリペプチドのレベルが対照と比較して増加していたことを示す。
いくつかの実施形態では、決定することは、複数の形質導入細胞の増殖を評価することを含んでなり、複数の形質導入細胞の細胞において同定された、対照と比較して細胞増殖を増加または減少させるＯＲＦは、近接エフェクターポリペプチドである。増殖は、選択前（例えば、対照）と比較して、選択後の複数の形質導入細胞における各ＯＲＦの相対存在量を測定することによって評価することができる。増殖を促進するＯＲＦは富化され、増殖を阻害するＯＲＦは枯渇されることになる。
いくつかの実施形態では、複数の細胞は、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーのカバー率として＞平均約３００、＞４００または＞平均約５００倍を維持するように形質導入される。
いくつかの実施形態では、対照には、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーも少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドも形質導入されてない、少なくとも１つの標的ポリペプチドを発現する細胞（例えば、細胞株）が含まれる。
いくつかの実施形態では、この方法、プロセスまたはスクリーニングアッセイは、標的ポリペプチドを発現する少なくとも１つの細胞において、上述の方法で安定化剤または分解剤として同定されたエフェクターポリペプチドのうち少なくとも１つを発現させる工程であって、場合により、標的ポリペプチドは融合ポリペプチド内にあり、少なくとも１つのエフェクターポリペプチドは標的化部分と融合されている工程、および少なくとも１つの細胞における標的ポリペプチドのレベルが対照に比べて減少または増加しているかどうかを決定する工程をさらに含んでなる。例えば、これらの追加工程は、上述の方法、プロセスおよびスクリーニングアッセイで標的ポリペプチドの分解剤または安定化剤として同定されたエフェクターポリペプチドが標的ポリペプチドを分解または安定化することを確認するために使用することができる。いくつかの実施形態では、対照は、エフェクターポリペプチドが形質導入されていない、例えば化学的二量体化によって誘導されてない、選別されていない、および／または選択（例えば、抗生物質または負の選択）を受けていない、標的ポリペプチドを発現する細胞または複数の細胞である。
いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ＯＲＦｅｏｍｅ由来のレンチウイルスプールライブラリーである。多くの異なる種類のライブラリーが当技術分野で周知であり、本開示の方法およびプロセスで使用することができる。本開示で使用され得るライブラリーの例としては、ウイルスまたは細菌タンパク質、タンパク質ドメインライブラリー（ヒトタンパク質または他のプロテオーム）の合成ライブラリー、フラグメントライブラリー（ヒトタンパク質または他のプロテオーム由来）または例えば遺伝子フラグメントと融合させるためにスプライスアクセプター配列を有するゲノムにランダムに近接誘導タグを挿入するための挿入突然変異誘発の使用が挙げられる。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、推定近接エフェクターまたは近接エフェクターポリペプチドを、キメラ二量体化を介して標的ポリペプチドと近接させ、この方法は、化学誘導剤を投与することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、エフェクターポリペプチドは標的化部分と融合され、標的化部分はナノボディである。一本鎖抗体などの他の親和性結合剤も使用可能である。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＡＢＩ１を含んでなる融合ポリペプチド内にある。いくつかの実施形態では、推定エフェクターポリペプチドまたはエフェクターポリペプチドは、標的化部分と融合された融合ポリペプチドであり、標的化部分はＰＹＬ１である。例えば、ＰＹＬ１は、アブシジン酸の存在下でＡＢＩ１に結合し得る。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＡＢＩ１を含んでなる融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＰＹＬ１であり、この方法は、化学誘導剤としてアブシジン酸を投与することを含んでなる。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＦＫＢＰを含んでなる融合ポリペプチド内にあり、推定エフェクターポリペプチドまたはエフェクターポリペプチドは、標的化部分と融合された融合ポリペプチドであり、標的化部分はＦＲＢであり、例えば、ＦＫＢＰとＦＲＢはラパマイシンの存在下で結合する。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＦＫＢＰを含んでなる融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＦＲＢであり、この方法は、化学誘導剤としてラパマイシンを投与することを含んでなる。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＦＲＢを含んでなる融合ポリペプチド内にあり、推定エフェクターポリペプチドまたはエフェクターポリペプチドは、標的化部分と融合された融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＦＫＲＢであり、例えば、ＦＫＢＰとＦＲＢはラパマイシンの存在下で結合する。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＦＲＢを含んでなる融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＦＫＢＰであり、その方法は、化学誘導剤としてラパマイシンを投与することを含んでなる。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＦＫＢＰを含んでなる融合ポリペプチド内にあり、推定エフェクターポリペプチドまたはエフェクターポリペプチドは、標的化部分と融合された融合ポリペプチドであり、標的化部分は変異型ＦＲＢであり、例えば、ＦＫＢＰと変異型ＦＲＢは、ＡＰ２１９６７などのラパログの存在下で結合する。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＦＫＢＰを含んでなる融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＦＲＢであり、この方法は、化学誘導剤としてＡＰ２１９６７を投与することを含んでなる。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、変異型ＦＲＢを含んでなる融合ポリペプチド内にあり、推定エフェクターポリペプチドまたはエフェクターポリペプチドは、標的化部分と融合された融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＦＫＢＰであり、例えば、ＦＫＢＰと変異型ＦＲＢは、ＡＰ２１９６７などのラパログの存在下で結合する。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＦＲＢを含んでなる融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＦＫＢＰであり、この方法は、化学誘導剤としてＡＰ２１９６７を投与することを含んでなる。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＧＩＤ１を含んでなる融合ポリペプチド内にあり、推定エフェクターポリペプチドまたはエフェクターポリペプチドは、標的化部分と融合された融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＧＡＩであり、例えば、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｗａｒｆ １（ＧＩＤ１）とＧＡ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（ＧＡＩ）は、ジベレリン酸の存在下で結合する。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＧＩＤ１を含んでなる融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＧＡＩであり、この方法は、化学誘導剤としてジベレリン酸を投与することを含んでなる。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＧＡＩを含んでなる融合ポリペプチド内にあり、推定エフェクターポリペプチドまたはエフェクターポリペプチドは、標的化部分と融合された融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＧＩＤ１であり、例えば、ＧＩＤ１とＧＡＩはジベレリン酸の存在下で結合する。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＧＡＩを含んでなる融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＧＩＤ１であり、この方法は、化学誘導剤としてジベレリン酸を投与することを含んでなる。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＡＢＩ１を含んでなる融合ポリペプチド内にあり、推定エフェクターポリペプチドまたはエフェクターポリペプチドは、標的化部分と融合された融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＰＹＲ１であり、例えば、ＡＢＩ１とＰＹＲ１はマンジプロパミドの存在下で結合する。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＡＢＩ１を含んでなる融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＰＹＲ１であり、この方法は、化学誘導剤としてマンジプロパミドを投与することを含んでなる。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＰＹＲ１を含んでなる融合ポリペプチド内にあり、推定エフェクターポリペプチドまたはエフェクターポリペプチドは、標的化部分と融合された融合ポリペプチドであり、標的化部分はＡＢＩ１であり、例えば、ＡＢＩ１とＰＹＲ１はマンジプロパミドの存在下で結合する。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＰＹＲ１を含んでなる融合ポリペプチド内にあり、標的化部分はＡＢＩ１であり、この方法は、化学誘導剤としてマンジプロパミドを投与することを含んでなる。
また、別の態様では、少なくとも１つの細胞において標的ポリペプチドを調節するためのプロセスが提供され、その方法は、表４、５、または７に示される近接エフェクターポリペプチドを少なくとも１つの細胞で発現させることを含んでなり、少なくとも１つの近接エフェクターポリペプチドは標的化部分と融合されている。このプロセスは、標的化分解または標的化安定化のためのものであり得る。
例えば、いくつかの実施形態では、このプロセスは、少なくとも１つの細胞における少なくとも１つの標的ポリペプチドの標的化分解のためのものであり、その方法は、少なくとも１つの細胞において表４に示される少なくとも１つの分解剤を発現させることを含んでなり、少なくとも１つの分解剤ポリペプチドは、標的化部分と融合されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分解剤は、表５、６または７に示される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの分解剤は、図１１Ｂに示される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的ポリペプチドは、癌遺伝子ポリペプチドまたは発癌性融合タンパク質、場合により、ＲＡＳ、ＭＹＣ、および／またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１であり、分解剤ポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ａ、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＰＲＲ２０ＡまたはＫＬＨＤＣ２から選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的ポリペプチドは、合成致死標的、場合により、ＳＭＡＲＣＡ４変異株の存在下のＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ２変異体の存在下のＳＭＡＲＣＡ４、ＢＲＣＡ１／２欠損細胞でのＰＡＲＰ１、および／またはＭＴＡＰが喪失した細胞でのＰＲＭＴ５であり、分解剤ポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ａ、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＰＲＲ２０ＡまたはＫＬＨＤＣ２から選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的ポリペプチドは、免疫学的／癌免疫学的標的、場合により、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１またはＪＡＫであり、分解剤ポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ａ、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＰＲＲ２０ＡまたはＫＬＨＤＣ２から選択される。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドは、優性機能獲得型疾患変異体、場合により、ＦＵＳ、ＴＤＰ４３、ａ－シヌクレイン、アミロイドβ前駆体タンパク質、ＨＴＴ、またはプリオンタンパク質機能獲得型疾患変異体、場合により表１から選択されるものであり、分解剤ポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ａ、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＰＲＲ２０ＡまたはＫＬＨＤＣ２から選択される。
本開示の別の態様は、少なくとも１つの細胞における少なくとも１つの標的ポリペプチドの標的化安定化のためのプロセスを含み、その方法は、１つまたは少なくとも１つの細胞において表４に示される少なくとも１つの安定化剤を発現させることを含んでなり、１つまたは少なくとも１つの分解剤ポリペプチドは標的化部分と融合されている。いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの安定化剤は、表５、６または７に示される。いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの安定化剤は、図１１Ｂに示される。いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの安定化剤は、図１２Ｂに示される。
表５、６もしく７の、または図面もしくは実施例に記載の他のいずれのエフェクターの部分的組合せも企図される。
いくつかの実施形態では、近接エフェクターポリペプチドは、ＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、もしくはＲＮＦ１２６から選択されるか、またはＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１、ＵＢＥ２ＢもしくはＫＬＨＬ４０から選択される。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドは、腫瘍抑制因子タンパク質であり、場合により表３から選択され、場合によりｐ５３またはＰＴＥＮであり、安定化剤ポリペプチドは、ＦＢＸＬ８、ＦＢＸＯ２、ＣＤＣＡ３、ＳＫＰ１、ＡＳＢ９、ＥＬＯＢ、ＫＬＨＬ４０、ＺＦＰ１６１、ＫＣＴＤ１７、ＺＢＴＢ１８、ＺＢＴＢ７Ｂ、ＫＣＴＤ５、ＺＢＴＢ２０、ＺＢＴＢ４３、ＫＥＡＰ１、ＺＢＴＢ１０、ＵＣＨＬ１、ＯＴＵＢ１、ＵＳＰ３９、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ１４もしくはＵＳＰ１３、ＫＬＨＬ４１、ＤＤＩ１、および／またはＰＲＰＳ２から選択される。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドは、腫瘍抑制因子タンパク質であり、場合により表３から選択され、場合によりｐ５３またはＰＴＥＮであり、安定化剤ポリペプチドは、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４１、ＤＤＩ１、ＰＲＰＳ２、ＵＣＨＬ１、ＯＴＵＢ１またはＵＳＰ１３から選択される。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドは、不安定疾患変異体、場合により、ＣＦＴＲΔ５０８、ＡＣＴＢ Ｅ３６４Ｋ、ＡＬＤＯＡ Ｅ２０６Ｋ、ＡＭＨＲ２ Ｒ５４Ｃ、ＡＭＰＤ３ Ａ３２０Ｖ、ＣＢＳ Ｌ４５６Ｐ、ＧＮＭＴ Ｈ１７６Ｎ、ＰＩＫＬＲ Ｆ１３２Ｌ、ＳＣＡＲＢ Ｈ３６３Ｎ、またはＴＰＭＴ Ａ８０Ｐであり、安定化剤ポリペプチドは、ＦＢＸＬ８、ＦＢＸＯ２、ＣＤＣＡ３、ＳＫＰ１、ＡＳＢ９、ＥＬＯＢ、ＫＬＨＬ４０、ＺＦＰ１６１、ＫＣＴＤ１７、ＺＢＴＢ１８、ＺＢＴＢ７Ｂ、ＫＣＴＤ５、ＺＢＴＢ２０、ＺＢＴＢ４３、ＫＥＡＰ１、ＺＢＴＢ１０、ＵＣＨＬ１、ＯＴＵＢ１、ＵＳＰ３９、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ１４、ＵＳＰ１３、ＫＬＨＬ４１、ＤＤＩ１、および／またはＰＲＰＳ２から選択される。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドは、不安定疾患変異体、場合により、ＣＦＴＲΔ５０８、ＡＣＴＢ Ｅ３６４Ｋ、ＡＬＤＯＡ Ｅ２０６Ｋ、ＡＭＨＲ２ Ｒ５４Ｃ、ＡＭＰＤ３ Ａ３２０Ｖ、ＣＢＳ Ｌ４５６Ｐ、ＧＮＭＴ Ｈ１７６Ｎ、ＰＩＫＬＲ Ｆ１３２Ｌ、ＳＣＡＲＢ Ｈ３６３Ｎ、またはＴＰＭＴ Ａ８０Ｐであり、安定化剤ポリペプチドは、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４１、ＤＤＩ１、ＰＲＰＳ２、ＵＣＨＬ１、ＯＴＵＢ１またはＵＳＰ１３から選択される。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドおよびエフェクターポリペプチドは、実施例および図面、例えば、図８に開示されているものである。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドおよびエフェクターポリペプチドは、実施例および図面、例えば、図８に示される組合せで使用される。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、実施例および図面、例えば、図８でそれらを分解することが示されたエフェクターポリペプチドと組み合わせられる／併用される。他の実施形態では、標的ポリペプチドは、実施例および図面、例えば、図８でそれらを安定化することが示されたエフェクターポリペプチドと組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの分解剤ポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ａ、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、および／またはＫＬＨＤＣ２から選択される。ＵＢＥ２Ｂが強力な分解剤であることは、それがＥ２結合酵素であることから特に予想外であった。Ｅ２結合酵素はこれまで標的化ポリペプチド分解に使用されたことはなく、機能するにはＥ３リガーゼを必要とするとしばしば思われていた。実施例に示された結果は、ＵＢＥ２ＢはＥ３がなくても機能し、近接依存的に標的を直接ユビキチン化できることを示唆している。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの分解剤ポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｂである。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの分解剤ポリペプチドは、シグナルペプチド、可溶性ドメイン、およびＦＣＧＲ３Ｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５０１５－１）のＣ末端残基１９４～２２３を含んでなるＧＰＩアンカーポリペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの分解剤ポリペプチドは、ＰＲＮＰ融合ポリペプチドであり、ＰＲＮＰ融合ポリペプチドは、ＰＲＮＰシグナルペプチド、ＰＲＮＰ可溶性ドメイン、およびＦＣＧＲ３Ｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５０１５－１）のＣ末端残基１９４～２２３を含んでなる。いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの分解剤ポリペプチドは、シグナルペプチド、分泌経路に沿って進み得るようにする可溶性ドメイン、およびＦＣＧＲ３Ｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５０１５－１）のＣ末端残基１９４～２２３を含んでなるＥＲ内在性可溶性ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの分解剤ポリペプチドは、ＬＹ６ＤまたはＬＹＰＤ３である。本明細書では、ＬＹ６ＤおよびＬＹＰＤ３のＣ末端残基も分解剤であることが示され、分解を誘導するためにポリペプチド、場合により、ＧＰＩアンカータンパク質に付加することができる。
いくつかの実施形態では、分解剤ポリペプチドは、ＬＹ６ＤのＣ末端残基、例えば、残基ＡＡＰＴＲＴＡＬＡＨＳＡＬＳＬＧＬＡＬＳＬＬＡＶＩＬＡＰＳＬ（配列番号４０）であるか、またはそれを含んでなる。
いくつかの実施形態では、１または少なくとも１つの分解剤ポリペプチドは、シグナルペプチド、可溶性ドメイン、およびＬＹ６ＤのＣ末端残基を含んでなるＧＰＩアンカーポリペプチドである。いくつかの実施形態では、分解剤ポリペプチドは、ＧＰＩアンカーポリペプチドおよびＡＡＰＴＲＴＡＬＡＨＳＡＬＳＬＧＬＡＬＳＬＬＡＶＩＬＡＰＳＬ（配列番号４０）を含んでなる。
いくつかの実施形態では、分解剤ポリペプチドは、ＬＹＰＤ３のＣ末端残基、例えば、残基ＶＡＰＴＡＧＬＡＡＬＬＬＡＶＡＡＧＶＬＬ（配列番号４１）であるか、またはそれを含んでなる。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの分解剤ポリペプチドは、シグナルペプチド、可溶性ドメイン、およびＬＹＰＤ３のＣ末端残基を含んでなるＧＰＩアンカーポリペプチドである。いくつかの実施形態では、分解剤ポリペプチドは、ＧＰＩアンカーポリペプチドおよびＶＡＰＴＡＧＬＡＡＬＬＬＡＶＡＡＧＶＬＬ（配列番号４１）を含んでなる。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの安定化剤ポリペプチドは、ＦＢＸＬ８、ＦＢＸＯ２、ＣＤＣＡ３、ＳＫＰ１、ＡＳＢ９、ＥＬＯＢ、ＫＬＨＬ４０、ＺＦＰ１６１、ＫＣＴＤ１７、ＺＢＴＢ１８、ＺＢＴＢ７Ｂ、ＫＣＴＤ５、ＺＢＴＢ２０、ＺＢＴＢ４３、ＫＥＡＰ１、ＺＢＴＢ１０、ＫＬＨＬ４１、ＤＤＩ１、および／またはＰＲＰＳ２から選択される。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの安定化剤ポリペプチドは、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４１、ＤＤＩ１、および／またはＰＲＰＳ２から選択される。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの安定化剤ポリペプチドは、ＫＬＨＬ４０またはＫＬＨＬ４１である。ＫＬＨＬ４０およびＫＬＨＬ４１は、タンパク質分解にカノニカルに関連するタンパク質群（ＢＴＢ－ＢＡＣＫ－Ｋｅｌｃｈファミリー）に属しているため、特に予想外の安定化剤である。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドは、癌遺伝子ポリペプチド、発癌性融合ポリペプチド、合成致死標的、免疫学的／癌免疫学的標的、優性機能獲得型疾患変異体、腫瘍抑制因子、および／または不安定疾患変異体である。
いくつかの実施形態では、癌遺伝子／腫瘍抑制因子ポリペプチドまたは発癌性融合ポリペプチドは、ＲＡＳ、ＭＹＣ、またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１である。いくつかの実施形態では、癌遺伝子／腫瘍抑制因子ポリペプチドまたは発癌性融合ポリペプチドは、表３に示されている。
いくつかの実施形態では、合成致死標的は、ＥＷＳＲ１、ＳＭＡＲＣＡ２／４、ＰＡＲＰ１、ＷＲＮ、ＡＲＩＤ１Ａ／１Ｂ、ＭＴＡＰ、ＰＫＭＹＴ１、ＣＩＰ２Ａ、ＡＰＥＸ２、ＰＯＬＱ、ＳＫＰ２、またはＡＴＲである。
いくつかの実施形態では、免疫学的／癌免疫学的標的は、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１ ＪＡＫ、またはＰＴＰＮ２である。
いくつかの実施形態では、優性機能獲得型疾患変異体は、ＦＵＳ、ＴＤＰ４３、ａ－シヌクレイン、アミロイドβ前駆体タンパク質、ＨＴＴ、またはプリオンタンパク質である。
いくつかの実施形態では、腫瘍抑制因子は、ｐ５３またはＰＴＥＮである。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制因子ポリペプチドは、表３に示される。
いくつかの実施形態では、不安定疾患変異体は、変異型ＣＦＴＲまたはジストロフィン変異体である。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、１つまたは少なくとも１つの安定化剤または分解剤ポリペプチドと融合されている。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、標的ポリペプチドに結合するナノボディ、リガンドまたは抗体である。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトポリペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの細胞は、ヒト細胞である。
本開示の別の態様は、少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドを致死ポリペプチドとして同定する方法を含み、その方法は、
ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを複数の細胞に形質導入する工程、
前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドを発現させる工程であって、前記１つまたは少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドは、前記１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドに結合する標的化部分と融合されている工程、および
前記１つまたは少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドが前記複数の形質導入細胞の細胞死を引き起こしたかどうかを決定する工程
を含んでなり、
前記推定エフェクターポリペプチドは、細胞死を引き起こす場合、致死ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドが細胞死を引き起こしたかどうかを決定することは、１以上の推定エフェクターポリペプチドがスクリーニングアッセイ中に複数の形質導入細胞から消失するのを同定することを含んでなる。いくつかの実施形態では、１以上の推定エフェクターポリペプチドがスクリーニングアッセイ中に複数の形質導入細胞から消失するのを同定することは、生き残った細胞において１つまたは少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドをコードするＤＮＡのシークエンシングを行うこと、およびＯＲＦｅｏｍｅライブラリー中に存在するエフェクター遺伝子を、推定エフェクターポリペプチドが存在するかしないかを決定するためのスクリーニングの後に細胞に存在するエフェクター遺伝子と比較することを含んでなる。いくつかの実施形態では、１以上の推定エフェクターポリペプチドが複数の形質導入細胞から経時的に消失するのを同定することは、生き残った細胞において１つまたは少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドにマッピングされたＤＮＡバーコードのシークエンシングを行うこと、およびＯＲＦｅｏｍｅライブラリー中に存在するエフェクター遺伝子を、推定エフェクターポリペプチドが存在するかしないかを決定するためのスクリーニングの後に細胞に存在するエフェクター遺伝子と比較することを含んでなる。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、細胞の生存または死に関与する可能性のある任意のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、発癌性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ＲＡＳポリペプチド、場合により、ＫＲＡＳである。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、アポトーシスの調節因子である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、オートファジーの調節因子である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、マイトファジーの調節因子である。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、当技術分野で周知の他の必須の細胞プロセスの調節因子である。
本開示の別の態様は、少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドをタンパク質輸送ポリペプチドとして同定する方法を含み、その方法は、
ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを複数の細胞に形質導入する工程、
前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドを発現させる工程であって、前記１つまたは少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドは、前記１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドに結合する標的化部分と融合されている工程、および
前記１つまたは少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドが前記１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドの細胞表面局在を増加させるかどうかを決定すること
を含んでなり、
前記推定エフェクターポリペプチドは、前記１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドの細胞表面局在を増加させる場合、タンパク質輸送ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、任意の細胞表面ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、細胞表面ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩポリペプチドである。いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、変異型細胞表面ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、変異型細胞表面ポリペプチドは、表２に示される。いくつかの実施形態では、変異型細胞表面ポリペプチドは、ＣＦＴＲΔ５０８である。
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いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの推定エフェクターポリペプチドが１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドの細胞表面局在を増加させるかどうかは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）およびタンパク質輸送ポリペプチドとして同定された推定エフェクターポリペプチドのシークエンシングを用いて決定される。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳは、１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドの細胞外エピトープに結合する抗体を用いて実施される。いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの標的ポリペプチドは、ＦＬＡＧタグと融合されている。
本開示の別の態様は、筋ジストロフィーを治療する方法を含み、その方法は、対象に標的ポリペプチドに結合する標的化部分と融合されたＫＬＨＬ４０またはＫＬＨＬ４１を投与することを含んでなる。ＫＬＨＬ４０およびＫＬＨＬ４１は、骨格筋に特異的であり、従って、それらは例えば筋ジストロフィーにおいて安定性喪失型変異体の標的化に特に有用となる。いくつかの実施形態では、標的化部分は、標的ポリペプチドに結合するナノボディ、リガンドまたは抗体であり、標的ポリペプチドは、ＮＥＢ、ＲＹＲ１、ＤＭＤ、ＳＧＣＡ、ＳＧＣＢ、ＳＧＣＧ、ＳＧＣＤ、ＤＡＧ１、ＬＡＭＡ２、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ６Ａ３、ＦＬＭＮＣ、ＭＹＨ７、ＭＹＨ２、ＤＥＳ、ＭＹＯＴ、ＴＴＮ、ＡＣＴＡ１、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４１、ＫＢＴＢＤ１３、ＴＮＰＯ３、ＬＭＮＡ、ＥＭＤ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＮＥ２、ＣＡＶ３、ＢＩＮ１、ＤＮＭ２、ＭＴＭ１、ＳＴＩＭ１、ＳＴＡＣ３、ＣＡＣＮＡ１５、ＳＰＥＧ、ＣＡＰＮ３、ＤＹＳＦ、ＢＩＮ１、ＡＮＯ５、ＳＩＬ１、ＤＮＡＪＢ６、ＢＡＧ３、ＨＳＰＢ５、ＴＲＩＭ３２、ＬＡＭＰ２、ＶＭＡ２１、ＥＰＧ５、ＳＱＳＴＭ１、ＴＲＩＭ６３におけるものなどの安定性喪失型変異体である。
いくつかの実施形態では、標的ポリペプチドは、ヒトポリペプチドである。いくつかの実施形態では、１つまたは少なくとも１つの細胞は、ヒト細胞である。
また、本明細書では、方法、プロセス、スクリーニングアッセイ、融合ポリペプチド、細胞、核酸、キットまたは本明細書に記載の他の製品のいずれの使用も企図される。
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本明細書に記載のエフェクターはまた、ＰＲＯＴＡＣ、分子糊およびその他のヘテロ二機能性分子などの低分子結合剤を同定するためのスクリーニングを行うために使用することもできる。
従って、別の態様は、少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドのリガンド、場合により、低分子結合剤を同定するためのスクリーニングアッセイを含み、そのスクリーニングアッセイは、
前記１つまたは少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドを低分子ライブラリーと、場合により、ハイスループットスクリーニングアッセイで接触させる工程であって、前記近接エフェクターポリペプチドは表４、５、６または７から選択される、工程；
前記組換え近接エフェクターポリペプチドと前記低分子ライブラリーの１以上の低分子の間に結合が起こったかどうかを評価する工程
を含んでなり、
前記１つまたは少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドに結合した１以上の分子は、前記１つまたは少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドの低分子結合剤である。
リガンドとは、本明細書で使用する場合、低分子、例えば、約１０００Ｄａ以下の分子量を有する分子を含む、任意の化合物または物質の組成物を意味する。
いくつかの実施形態では、リガンド、場合により、低分子結合剤は、ＰＲＯＴＡＣである。いくつかの実施形態では、リガンド、場合により、低分子結合剤は、分子糊である。
いくつかの実施形態では、この方法は、製品、場合により、治療用製品を作製することをさらに含んでなる。
本明細書に記載のエフェクターおよび融合ポリペプチドの群または亜群はいずれも使用可能である。組換えポリペプチドは、細菌、哺乳動物、または昆虫系を含む様々な発現系を用いて作製することができる。それらは、精製を容易にするために分泌されるようにシグナルペプチドと融合させることができる。
実施例６に記載のものを含む本明細書に記載の方法はいずれも使用可能である。
方法、プロセスおよび／またはスクリーニングアッセイは、組み合わせ可能である。例えば、本明細書に記載されるような近接エフェクターポリペプチドを同定する方法が実施可能である。エフェクターは、低分子結合剤を同定するために、選択し、本明細書に記載のスクリーニングアッセイを行うことができる。また、別の態様では、ヘテロ二機能性分子を作製する方法が提供され、その方法は、近接エフェクターポリペプチドの低分子結合剤などのリガンドと標的ポリペプチドの低分子結合剤などのリガンドをリンカー、場合により、本明細書に記載のリンカーを介して結合させることを含んでなる。
同定されたリガンドは、製品、場合により、治療用製品の調製のために使用することができる。いくつかの実施形態では、この方法は、製品、場合により、治療用製品を作製することをさらに含んでなる。
さらに、特定の節に記載されている定義および実施形態は、当業者によって理解されるように、それらが適切である本明細書に記載された他の実施形態にも当てはまることが意図される。例えば、後述において、本開示の異なる態様をより詳細に定義する。このように定義された各態様は、別段のことが明示されない限り、任意の他の１または複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示されたいずれの特徴も、好ましいまたは有利であると示された他のいずれの１または複数の特徴とも組み合わせることができる。
以上の開示は、一般的に本出願を説明するものである。より完全な理解は、以下の具体例を参照することによって得ることができる。これらの実施例は、単に説明のために記載され、本出願の範囲を限定することを意図していない。状況が示唆し得るまたは好都合とする場合には、形態の変更および等価物の置換が企図される。本明細書では特定の用語が使用されているが、このような用語は説明の意味で意図され、限定を目的とするものではない。
以下の非限定的な実施例は、本開示を例示するものである。
実施例１
材料および方法
細胞株
スクリーニングのために使用したＡＢＩ１－ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＴａｇＢＦＰレポーター細胞株を含むＨｅＬａ Ｋｙｏｔｏ細胞および全てのＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭで維持した。細胞は、加湿インキュベーターにて、３７℃、５％ＣＯ２で維持し、慣例によりマイコプラズマ汚染に関して検査した。
レンチウイルスの生産
プールしたＯＲＦｅｏｍｅを含むレンチウイルス粒子は、ｐＬＸ３０１－［ＯＲＦ］－ＰＹＬ１またはｐＬＸ３０１－［ＯＲＦ］－ｖｈｈＧＦＰ、ｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２６０）およびｐＶＳＶ－Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃８４５４）を８：８：１の割合で２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることにより生産した。トランスフェクションは、リポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１６６８０１９）を用いて、製造者のプロトコールに従って１５ｃｍディッシュで行った。トランスフェクション２４時間後に培地を交換した。トランスフェクション７２時間後に、上清を濾過し（０．４５μＭ）、プールして回収した。リポフェクタミン２０００試薬を用いて６ウェルプレートでトランスフェクションを行い、個々の安定した細胞株を樹立する際の小規模のウイルス生産も同様のプロトコールに従った。
細胞株の作製
ＡＢＩ１－ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＴａｇＢＦＰ（ブラストサイジン、６μｇ／ｍＬ）を発現するＡＢＩ１－ＥＧＦＰレポーター株のクローン株を作製した。単一細胞を選別し、拡大培養し、高いＥＧＦＰおよびＴａｇＢＦＰ発現を示すクローンをその後の実験のために選択した。ドキシサイクリン誘導性のＥＧＦＰタグ付きタンパク質を発現する２９３Ｔ細胞を作製するために、エントリークローンをｈＯＲＦｅｏｍｅコレクションから選び取り、Ｇａｔｅｗａｙ適合性ｐＳＴＶ６－ＴｅｔＯ－ｃｃｄＢ－ＥＧＦＰレンチウイルスプラスミドにサブクローニングした。２９３Ｔ細胞を８μｇ／ｍＬポリブレン存在下で感染させ、感染２４時間後に２μｇ／ｍＬピューロマイシンで選択した。ＥＧＦＰ細胞株は１μｇ／ｍＬドキシサイクリンで誘導し、最高のＧＦＰ集団を選別した（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｍｅｌｏｄｙ）。
プラスミドクローニング
ｇａｔｅｗａｙクローニング技術を用い、不安定な変異型標的をｐｃＤＮＡ３．１－ｃｃｄＢ－ＧＳｌｉｎｋｅｒ－ＥＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＤｓＲｅｄデスティネーションベクターにクローニングした。
分解アッセイのために、エフェクターをｐｃＤＮＡ３．１－ｃｃｄＢ－ＧＳｌｉｎｋｅｒ－ｖｈｈＧＦＰ－ＳＶ４０－ＴａｇＢＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１－ｃｃｄＢ－ＧＳｌｉｎｋｅｒ－ｖｈｈＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１－ｖｈｈＧＦＰ－ｃｃｄＢおよびｐｃＤＮＡ３．１－ｃｃｄＢ－ＧＳｌｉｎｋｅｒ－ＰＹＬ１デスティネーションベクターにクローニングした。
ＷＤＲ５内因性タンパク質発現のために、エフェクターコード配列をｐｃＤＮＡ３．４－ｃｃｄＢ－Ｍｂ（Ｓ４）ＷＤＲ５－ＨＡベクターにクローニングし、高い親和性でＷＤＲ５を認識するＣ末端モノボディを有する各タンパク質の発現を可能とした(Gupta et al., 2018)。
ＫＲａｓ外因性のタンパク質の発現のために、ＫＲａｓをｐｃＤＮＡ３．１－３ｘＦＬＡＧ－ｃｃｄＢデスティネーションベクターにクローニングした。エフェクターコード配列をｐｃＤＮＡ３．４－ｃｃｄＢ－ｉＤａｂ－ＫＲａｓ－ＨＡベクターおよびｐｃＤＮＡ３．１－ｃｃｄＢ－ｉＤａｂ－ＬＭＯ２－ＨＡベクターにクローニングし、それぞれＫＲａｓまたは別のタンパク質を認識するＣ末端モノボディを有する各タンパク質の発現を可能とした(Tanaka et al., 2007および2011)。エフェクターはまた、ｐｃＤＮＡ３．４－ｃｃｄＢ－ＤＡＲＰｉｎＫ１９－ＨＡベクターおよびｐｃＤＮＡ３．１－ｃｃｄＢ－ＤＡＲＰｉｎＫ１９ｍｕｔａｔｅｄ－ＨＡベクターにクローニングし、それぞれＫＲａｓと選択的に結合するＣ末端モノボディまたは相互作用を喪失した変異型モノボディを有する各タンパク質の発現を可能とした（Bery et al., 2019）。
点突然変異（ＵＢＥ２Ｂ、ＦＣＧＲ３ＢおよびＰＲＰＳ２変異）の作製には、Ｑｕｉｃｋ－ｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発を用い、標準点なＰＣＲ実施を用いた。
プールされたＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの作製
ヒトＯＲＦｅｏｍｅコレクション（ｖ８．１）からのエントリークローンをそれぞれ～３８４のＯＲＦを含む４０の標準化サブプールに回収し、レンチウイルスＧａｔｅｗａｙ適合性デスティネーションベクターｐＬＸ３０１－ＤＥＳＴ－ＰＹＬ１またはｐＬＸ３０１－ＤＥＳＴ－ｖｈｈＧＦＰにクローニングした。ＬＲ反応は、１５０ｎｇの各エントリーＯＲＦサブプールを用いて２反復でセットアップし、合計５μｌの反応容量で１μｌのＧａｔｅｗａｙ ＬＲクロナーゼＩＩと合わせ、ＴＥバッファー中、室温で一晩インキュベートした。次の２日間、４μｌのＴＥに１μｌのＬＲ酵素を加え、各反応物に１５０ｎｇのデスティネーションベクターを加えた。サブプールを化学的にコンピテントなＳｔｂｌ３大腸菌(E. coli)に形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／μｌ）を含有するＬＢ寒天プレートに播種し、３０℃で一晩置いた。カバー率が２００倍を超えるようにコロニーを数え、氷上のＳＯＣに回収し、ペレットとし、乾燥ペレットの重量に基づいて複数のカラムでマキシプレップを行った。
プールされた活性化スクリーニング
Ｃ末端にＰＹＬ１またはｖｈｈＧＦＰタグが付けられたＯＲＦｅｏｍｅライブラリーをレチウイルス粒子にパッケージングした。ＡＢＩ１－ＧＦＰを安定に共発現するクローンＧＦＰレポーター細胞株に低い多重感染度（ＭＯＩ）で形質導入し、ピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）選択後におよそ３０％の細胞が生存した。同じ条件下で未導入の細胞は完全に排除された。ライブラリーの５００倍を超えるカバー率を維持するのに十分な細胞を形質導入した。ＯＲＦｅｏｍｅ－ＰＹＬ１ライブラリーでは、細胞を１００μＭアブシジン酸（ＡＢＡ、Ｓｉｇｍａ）で４８時間処理することにより動員を誘導した。これと並行して、対照の細胞バッチは総容量が同じＤＭＳＯで処理した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、解離バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ炭酸水素ナトリウム、０．１％グルコース）で処理し、フローバッファー（５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７、１％ＢＳＡ、ＰＢＳ）に再懸濁させた。各ライブラリーについて、高ＧＦＰ集団（上位１０％）と低ＧＦＰ集団（下位１０％）を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｍｅｌｏｄｙ（Ｓｔａｇｌｊａｒ ｌａｂ、ＣＣＢＲ）を用いて選別し（２反復）、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、それらのゲノムＤＮＡを直接抽出した。
ＯＲＦｅｏｍｅシークエンシング
ネステッドＰＣＲは、選別された集団から精製した全てのゲノムＤＮＡ、または選別されていない集団から少なくとも５μｇのゲノムＤＮＡを用いて行った。標的ＯＲＦｅｏｍｅ領域は、Ｔ７プロモーターを標的とするプライマー（配列番号１：ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧ）およびＰＹＬ１を標的とするプライマー（配列番号２：ＡＴＴＣＡＴＣＴＴＧＣＧＴＴＧＧＴＧＣＴＣＣ）またはｖｈｈＧＦＰを標的とするプライマー（配列番号３：ＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＧＡＣ）を用いてゲノムＤＮＡから増幅した。この反応の生成物をサンプルごとにプールし、Ｇａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位の外側を標的とするプライマー（配列番号４：ＣＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧおよび配列番号５：ＣＣＧＣＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣ）により、さらに１０サイクルでさらに増幅した。次に、アンプリコンを１％アガロースゲル上で分離し、プライマーダイマーを除く目に見えるＰＣＲ産物をゲル精製した。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ １Ｘ ｄｓＤＮＡ ＨＳキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｑ３３２３２）を用いてＤＮＡを定量した後、サンプルあたり５０ｎｇをＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐ， （Ｍ） Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、２００１８７０５）を用いて６サイクルの増幅で処理した。各精製最終ライブラリー２μｌをＡｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ ＨＳ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、５０６７－５５８４）で実行した。ライブラリーはＱｕａｎｔ－ｉＴ １Ｘ ｄｓＤＮＡ ＨＳキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｑ３３２３２）を用いて定量し、サイズ調整後に等モル比でプールした。最終プールはＮＥＢＮｅｘｔ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｅ７６３０Ｌ）を用いて定量し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでペアエンドシークエンシングを行った。
プールされた活性化スクリーニングからのシークエンシングデータの解析
ＳＴＡＲａｌｉｇｎｅｒ ｖ２．７．８ａを用いてＯＲＦｅｏｍｅ参照配列のインデックスを作成した。ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーからのリードをＳＴＡＲ ａｌｉｇｎｅｒで、最大３ミスマッチを許容してアラインした。分解剤と安定化剤を同定するために、ｅｄｇｅＲパッケージ(Robinson et al., 2010)を用いて、選別サンプルと無選別細胞のカウントの変化を比較することにより、各ＯＲＦについてｌｏｇ２倍率変化、ｐ値、および偽発見率（ＦＤＲ）を計算した。
個々のエフェクターに関する分解アッセイ
個々のエフェクターを用いた分解アッセイは、４８ウェル細胞培養形式で、ＡＢＩ１－ＧＦＰを安定に共発現しているクローンＧＦＰレポーター細胞株に、三重ＦＬＡＧタグ付きＤｓＲｅｄを発現するトランスフェクション対照プラスミド１５ｎｇと、ｖｈｈＧＦＰまたはＰＹＬ１と融合したエフェクター２００ｎｇを、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて一過性にトランスフェクトすることにより行った。不安定変異体の安定化実験のために、２９３ＴにｖｈｈＧＦＰと融合した１００ｎｇのエフェクターとＧＦＰと融合した１００ｎｇの標的を共トランスフェクトした。エフェクター－ＰＹＬ１構築物では、細胞を１００μＭアブシジン酸（ＡＢＡ、Ｓｉｇｍａ）で４８時間処理することにより動員を誘導した。これと並行して、対照の細胞バッチは、総容量が同じＤＭＳＯで処理した。トランスフェクション４８時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、解離バッファーで処理し、フローバッファーに再懸濁させた。細胞をマイクロ遠心機にて１０００ｒｐｍで５分間回転沈降させた。細胞ペレットをフローバッファーに再懸濁させ、ＢＤ ＬＳＲ ＦｏｒｔｅｓｓａまたはＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を用いて解析した。
ウエスタンブロット
ＨｅＬａ細胞（２４ウェルプレート）を、Ｍｂ（Ｓ４）ＷＤＲ５モノボディと融合したエフェクター０．８μｇでトランスフェクトした。ＨｅＬａ細胞（１２ウェルプレート）を、０．４μｇの３ｘＦＬＡＧ－ＫＲａｓおよびｉＤａｂまたはＤＡＲＰｉｎ Ｋ－ＲＡＳナノボディと融合したエフェクター０．４μｇでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、細胞を採取し、５０μＬのＣＫＳ溶解バッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ ｐＨ７．９、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３００ｍＭ スクロース、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％トリトンＸ－１００、ベンゾナーゼおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で溶解させた。４℃にて１６０００ｇで５分間の遠心分離の後、細胞溶解液を、ゲル電気泳動ならびに一次抗体として抗ＷＤＲ５（Ｄ９Ｅ１Ｉ）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃１３１０５）、抗ＨＳＰ９０ａ／ｂ（Ｆ－８）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および抗ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ Ｈ３６６３）を用いるウエスタンブロットによって解析した。ヤギＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃７０７４Ｓ）または抗マウス（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃７０７６Ｓ）を二次抗体として使用した。
阻害剤処理
細胞を１μＭ ＭＬＮ４９２４（Ｃｈｅｍｉｔｅｃｋ）で２４時間、１００ｎＭボルテゾミブ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で６時間、２０μＭシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）で６時間、２．５μＭ ＣＢ－５０８３（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）で６時間または０．０１％ ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）で６もしくは２４時間処理した。
結果
機能的プロテオミクススクリーニングを用いて、近接依存的に他のタンパク質を高効率で分解または安定化するヒトタンパク質のコレクションを同定した。これらのタンパク質は、ヘテロ二機能性分子（例えば、ＰＲＯＴＡＣ）または分子糊を用いて、標的化タンパク質分解（ＴＰＤ）または標的化タンパク質安定化などの誘導近接治療薬に利用できる可能性がある。同定されたタンパク質は、誘導された複合体の形状に対する感受性ならびに細胞内の複数の標的およびコンパートメントにわたる効力を含む、そのような開発にとって魅力的なものとなる特徴を持っている。
タンパク質安定性エフェクターのＯＲＦｅｏｍｅワイドな誘導近接スクリーニング
プロテオームスケールで近接依存性エフェクターを発見するための偏りのないアプローチが開発された。このアプローチでは、標的タンパク質とエフェクタータンパク質を、それらの相互作用の誘導を可能とするタグとともに細胞内で共発現させる。原理実証として、近接依存的にＧＦＰ融合タンパク質を分解または安定化するタンパク質が同定された。ＡＢＩ１－ＧＦＰ融合物に続いて、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）とＢＦＰを発現する安定な２９３Ｔ細胞株（図１）を作製した。次に、この細胞株を、ＧＦＰに結合するナノボディであるｖｈｈＧＦＰ(Caussinus et al., 2012; Saerens et al., 2005)、またはアブシジン酸（ＡＢＡ）の存在下でＡＢＩ１に結合するドメインであるＰＹＬ１(Liang et al., 2011)のいずれかに融合した１８，９３７のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現するＯＲＦｅｏｍｅ由来のレンチウイルスプールライブラリーで形質転換した。このデザインにより、ＯＲＦｅｏｍｅの各タンパク質は、構成的に（ｖｈｈＧＦＰ）、または化学的二量体化（ＰＹＬ１）によって、ＧＦＰ－ＡＢＩ１に近接させることができた。ＧＦＰ／ＢＦＰ比が低いまたは高い細胞を選別し、次いでＯＲＦシークエンシングを行うと、それぞれＧＦＰ－ＡＢＩ１を分解または安定化するタンパク質が同定された（図１Ｂ）。意外にも、ユビキチン化、オートファジー、またはリソソーム分解の調節因子ではないタンパク質が多く存在し、プロテオームには、タンパク質安定性の近接依存的調節因子の、これまで明らかにされていなかった蓄えがあることが示唆された。ＧＦＰ－ＡＢＩ１を分解または安定化するものとして同定されたエフェクタータンパク質は表４に含まれる。
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スクリーンヒットの検証
スクリーニングから選択されたヒットを、まず、元のＡＢＩ１－ＧＦＰ細胞株にｖｈｈＧＦＰ融合物として個別にトランスフェクションし、レポーターの安定性への影響を評価することによって検証した。ほとんどの分解スクリーンヒットはレポーターを強固に分解したが、安定化スクリーンで検定した２つのヒット（ＤＤＩ１とＰＲＰＳ２）はいずれもＧＦＰシグナルを増加させた（図２）。次に、タンパク質の恒常性経路のいくつかの阻害剤の、エフェクター機能に対する影響を評価した。プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブで細胞を処理すると、ほとんどの分解エフェクターが阻害され、それらがプロテアソーム機能に依存していることと一致していた（図２）。対照的に、シクロヘキシミドで翻訳を阻害すると、検定したヒットの分解作用が全体的に増加した（図２）。次に、タンパク質分解のより特異的な側面を標的とする２つの化合物であるネディレーション阻害剤ＭＬＮ４９２４とＶＣＰ／ｐ９７阻害剤ＣＢ－５０８３（ＲＥＦ）を検定した。ｃｕｌｌｉｎ－ＲＩＮＧ型Ｅ３リガーゼ（ＣＲＬ）の機能に特異的に干渉するＭＬＮ４９２４は、いくつかのＣＲＬアダプター分解剤を阻害したが、他の分解剤にはほとんど影響を与えなかった（図２）。興味深いことに、全てのＣＲＬがＭＬＮ４９２４処理によって等しく影響を受けるわけではなかった。例えば、ＦＢＸＬ１４は、関連するＦ－ｂｏｘタンパク質ＦＢＸＬ１２およびＦＢＸＬ１５よりも、ＭＬＮ４９２４による影響が少なかった。ＣＢ－５０８３はまた、いくつかのエフェクターの分解活性に干渉したが、他のエフェクターの分解活性には干渉しなかった（図２）。ＣＢ－５０８３は、レポーターを分解するＥ３リガーゼの能力には概して影響を与えなかったが、ＣＲＢＮの機能は阻害した。ＣＢ－５０８３は、オートファジーの３つの中心的な調節因子であるＬＣ３Ａ、ＧＡＢＡＲＡＰおよびＧＡＢＡＲＡＰＬ２の活性を阻害した。
予想外の分解剤
スクリーンヒットにはＥ３リガーゼが豊富にあったが、予想外の因子および完全には同定されていないタンパク質も含まれていた。例えば、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＬＹ６ＤおよびＬＹＰＤ３など、いくつかのＧＰＩアンカータンパク質が同定され、強力な分解剤であることが確認された（図３Ａ）。対照的に、ＧＰＩアンカータンパク質として十分に特性評価がなされているプリオンタンパク質（ＰＲＮＰ）は、個々に検定したところ、スクリーンヒットもＡＢＩ１－ＧＦＰ分解も見られなかった（図３Ａ）。この違いの分子決定因子を同定するために、ＦＣＧＲ３Ｂ（ＣＤ１６ｂとしても知られる）とＰＲＮＰに着目した。両タンパク質ともシグナルペプチドに続いて折りたたまれたドメインとＧＰＩアンカーシグナルを有し、ＧＰＩアンカーシグナルは親水性リンカー、切断部位、および疎水性テールからなる（図３Ｂ）。シグナル配列とＧＰＩアンカーシグナルはそのままにして、ＰＲＮＰとＦＣＧＲ３Ｂの折りたたみドメインを、まずＴａｇＲＦＰに置き換えた。これらの構築物は非修飾タンパク質と同じ挙動を示し、折りたたみドメインはＧＦＰ－ＡＢＩ１の分解に関与しないことが示唆された（図３Ｂ）。対照的に、次に、ＦＣＧＲ３ＢとＰＲＮＰのＣ末端疎水性テールを入れ替えると、それらの活性が逆転し、ＰＲＮＰテールを有するＦＣＧＲ３Ｂはレポーターを分解しなかったが、ＦＣＧＲ３Ｂテールを有するＰＲＮＰは分解した（図３Ｂ）。従って、Ｃ末端の疎水性テールが、分解アッセイにおけるＰＲＮＰとＦＣＧＲ３Ｂの違いの原因である。
欠失構築物を用いたＦＣＧＲ３Ｂの分解促進領域をさらに定義した。ω切断部位の直後の５つのアミノ酸欠失は、ＦＣＧＲ３Ｂの活性を消失させた（図３Ｃ）。疎水性テールのＣ末端は欠失に対してより耐性があり、最後の１０個のアミノ酸の欠失は活性に顕著な影響を与えなかった。しかしながら、アミノ酸２１９～２２３の欠失またはａａ２２１～２２５をアラニンで置換すると、ＦＣＧＲ３Ｂのレポーター分解能は著しく低下し、疎水性テールの中央残基が機能的に重要であることが示唆された。最後に、Ｃ末端テールの切断とプロセシングを防ぐことが機能に関連するどうかを調べた。推定された切断部位のすぐ隣にあるＳｅｒ２０１を変異させると、活性が消失した（図３Ａ）。これらの結果を合わせると、ＦＣＧＲ３Ｂが細胞質ＧＦＰ－ＡＢＩ１レポーターを分解する能力には、ＧＰＩアンカーの適切なプロセシングと疎水性テールの中央コアが必要であることが示される。
デグロンモチーフを介したトランスでの分解
スクリーニングにおいて、いくつかの未同定のタンパク質が強力な分解剤として同定された。これらの１つが、未同定のプロリンリッチタンパク質ＰＲＲ２０Ａである。ＰＲＲ２０Ａには（ＡｌｐｈａＦｏｌｄ２で予測されたように）球状ドメインがないことから、デグロン配列を介してＥ３リガーゼまたは他の因子を動員することによって機能するのではないかと考えられた。この仮説は、もう１つのｖｈｈＧＦＰスクリーンヒットが、Ｅ３リガーゼアダプターＦＢＸＯ２１と結合するデグロンを含むタンパク質であるＥＩＤ１(Watanabe et al., 2015; Zhang et al., 2015)であったという所見によって裏付けられた。デグロンは、安定なタンパク質と融合させるとそれらの安定なタンパク質の分解をシスで分解を誘導することができるが、Ｅ３リガーゼなどの「カノニカルな」分解剤はそうではない。そこで、ＥＩＤ１とＰＲＲ２０Ａ（またはそのフラグメント）が、トランスでもシスでも分解を誘導できるかどうかを調べた。トランス分解には、ＡＢＩ１－ＧＦＰレポーターを標的とするｖｈｈＧＦＰ融合物（図４Ａ）を用いた。シス分解には、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の制御下でＤｓＲｅｄも発現するベクター中のＧＦＰにＰＲＲ２０ＡおよびＥＩＤ１のフラグメントを融合させたものを用いた。この場合、ＧＦＰ融合物とＤｓＲｅｄ対照の蛍光比が安定性レポーターとして機能する（図４Ｂ）。予想通りに、ＦＢＸＯ２１デグロンを含むＥＩＤ１のＣ末端にＧＦＰを融合すると、ＧＦＰの蛍光は低くなったが、ＥＩＤ１のＮ末端をＧＦＰと融合すると安定であった（図４Ｂ）。ＧＦＰに融合した全長ＰＲＲ２０Ａも不安定であった。ＰＲＲ２０Ａの複数のオーバーラップフラグメントを用い、Ｃ末端残基１８９～２２１がＧＦＰ融合に低い安定性を与える領域として同定された（図４Ｂ）。注目すべきことに、このフラグメントはｖｈｈＧＦＰと融合した場合にもＧＦＰ－ＡＢＩ１を分解することができ、同じ領域がシスおよびトランス両方の分解活性を保持することを示している（図４Ａ）。より一般的には、これらの結果は、誘導近接スクリーンが複数のメカニズムを介して働く分解剤を同定できることを示している。
ＵＢＥ２Ｂは極めて強力な分解剤である
同定された最も強力な分解剤の１つは、Ｅ２結合酵素ＵＢＥ２Ｂであった。ＵＢＥ２ＢはｖｈｈＧＦＰ融合スクリーンとＰＹＬ１融合スクリーンの両方でヒットした（図２）。Ｅ２酵素はこれまで標的化タンパク質分解に利用されたことがなかったために、ＵＢＥ２Ｂは特に興味深いエフェクターであった。ＵＢＥ２Ｂのさらなる特性評価を行うために、その触媒活性が分解に必要であるかどうかを調べた。ＵＢＥ２Ｂの活性部位はＣｙｓ８８を含み、これはユビキチンが基質またはＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼに移行する前に、トランスチオレーション反応によってユビキチンと一過性に結合する(Stewart et al., 2016)。Ｃｙｓ８８をアラニンに変異させると（ＵＢＥ２Ｂ Ｃ８８Ａ）活性が完全に消失したことから、ＵＢＥ２Ｂによる近接誘導分解にはトランスチオレーションが必要であることが示された（図５Ａ）。
標的のユビキチン化においてＥ２は常にＥ３リガーゼと直列で機能するため、次にＵＢＥ２Ｂが近接依存的な分解を促進するためにＥ３パートナーを必要とするかどうかを検討した。ＵＢＥ２Ｂは、タンパク質の反対側にある２つの界面を介してＥ３リガーゼＲＡＤ１８と相互作用する。ＲＡＤ１８ ＲＩＮＧ ｆｉｎｇｅｒと相互作用する界面の破壊的変異（Ｎ６５Ｒ、Ｔ９９Ｒ）、ＲＡＤ１８のＲ６ＢＤドメインと接触する界面の破壊的変異（Ｓ２５Ｒ、Ｖ３９Ｑ）、またはこれら４つの変異を全て組み合わせたものを導入した。全ての変異体は分解アッセイで依然として活性があり、ＵＢＥ２Ｂが近接依存的に標的を分解する能力には、意外にもＥ３の結合は必要でないことが示された（図５Ｂ）。
Ｅ２結合酵素が一般に強力な分解剤であるかどうかを調べるために、３８のヒトＥ２のうち３０の活性を分解アッセイで測定した（図５Ｃ）。このアッセイで高い活性を示したＥ２はわずかであった。ＵＢＥ２Ｂは、配列が９５％同一であるそのパラログＵＢＥ２Ａとともに、最も強力な分解剤であった（図５Ｃ）。さらに、関連するＥ２であるＵＢＥ２Ｄ１およびＵＢＥ２Ｄ４もアッセイにおいて高い活性であった。注目すべきことに、ＵＢＥ２Ｄ４は、Ｅ３非依存的にｉｎ ｖｉｔｒｏで基質タンパク質をユビキチン化することもできる(David et al., 2010)。これらの結果は、保存性の高い折りたたみにもかかわらず、Ｅ２ファミリーメンバー間には固有の機能的差異があることを示している。より一般的には、これらの結果は、いくつかの（全てではない）Ｅ２が標的化タンパク質分解に利用できることを示唆している。
近接依存性安定化剤の同定
いくつかの安定化剤もスクリーニングで発見された。例えば、脱ユビキチン化酵素ＯＴＵＢ１がＰＹＬ１／ＡＢＩ１近接スクリーンでヒットした。ＯＴＵＢ１は脱ユビキチン化酵素標的化キメラ（ＤＵＢＴＡＣ）のエフェクターとして使用されており(Henning et al., 2021)、このスクリーニングが関連の近接依存性エフェクターを同定したことを示す。ｖｈｈＧＦＰスクリーンにおける顕著なヒットは、ユビキチン依存性プロテアーゼＤＤＩ１(Yip et al., 2020)とピロホスホキナーゼＰＲＰＳ２であった。さらに、大規模スクリーニングを最適化し、ｖｈｈＧＦＰとの複数のＥ３リガーゼ融合物を検定していると、推定ユビキチンリガーゼＫＬＨＬ４０はレポーターを分解せず、むしろ安定化させることに気づいた（図２Ａ）。そこで、ＤＤＩ１、ＰＲＰＳ２およびＫＬＨＬ４０が推定安定化エフェクターとして着目された。
これらのタンパク質が、タンパク質の恒常性に対する間接的な影響によってレポーターを安定化させるのか、またはレポーターへの近接性を必要とするのかをまず調べた。ｖｈｈＧＦＰタグを除去すると分解アッセイでの活性が消失し、これらのタンパク質は非特異的にタンパク質分解に影響を与えないことが示された（図６Ａ）。これらのタンパク質の活性に必要な領域を同定するために、欠失構築物および変異構築物を調べた。ＤＤＩ１はＮ末端のユビキチン様ドメインとＣ末端のレトロウイルス様アスパラギン酸プロテアーゼドメインを含んでいる（図６Ｂ）。意外にも、ＤＤＩ１の複数のフラグメントがレポーターを安定化することができ、その活性が単一の領域に限定されないことを示している（図６Ｂ）。ＰＲＰＳ２については、その酵素活性が安定化に必要であるかどうかを調べるために、触媒部位に変異を有する構築物を調べた。変異型ＰＲＰＳ２は野生型構築物と同様にレポーターを安定化した。このことは、ＰＲＰＳ２が非触媒的に安定化剤として機能している可能性が高いことを示している（図６Ｃ）。
ＫＬＨＬ４０は大きなＢＴＢ－ＢＡＣＫ－Ｋｅｌｃｈドメインファミリーに属し、欠失構築物はＢＴＢドメインが近接依存的にレポーターを安定化するのに十分かつ必要であることを示した（図６Ｄ）。さらに、ＫＬＨＬ４０のＢＴＢドメインを、近縁のファミリーメンバーであるＫＬＨＬ６（強固な分解剤である）由来の同じドメインと入れ替えると、ＫＬＨＬ４０は分解剤に、ＫＬＨＬ６は安定化剤になった（図６Ｅ）。多くのＢＴＢ－ＢＡＣＫ－Ｋｅｌｃｈドメインタンパク質では、ＢＴＢドメインはＣＵＬ３と相互作用し、それらがＣＵＬ３－ＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼ（ＣＲＬ）複合体の基質アダプターとして機能することを可能とする。しかしながら、ＫＬＨＬ４０では、Ｃｕｌ３と相互作用するモチーフは保存されておらず（図６Ｆ）、それがＣＲＬ複合体の一部として機能していないことが示唆される。興味深いことに、マウスでＫＬＨＬ４０を欠損させると、筋中間フィラメントタンパク質のネブリンとＬＭＯＤ３が不安定化する(Garg et al., 2014; Ravenscroft et al., 2013)。この知見とこれらの結果を合わせると、ＫＬＨＬ４０の内因性機能はタンパク質の安定化にあり、この活性は誘導近接によって非生理的基質に再標的化できることが強く示唆される。
タグの位置に対するエフェクターの感受性
スクリーニングで同定されたエフェクターが特定の形状に限定されているかどうかを調べるために、３８のエフェクターにＮ末端またはＣ末端ｖｈｈＧＦＰタグを付け、元のレポーター細胞株でそれらの活性をアッセイした。いくつかのエフェクター（ＫＬＨＬ２２など）はＣ末端融合物としてのみ機能したが、他のエフェクター（ＵＢＥ２Ｂ、ＦＢＸＬ１２およびＦＢＸＬ１４など）はタグの位置に関係なく等しく強力であった（図７）。同様に、ＤＤＩ１とＫＬＨＬ４０は、Ｃ末端融合物とＮ末端融合物の両方でレポーターを安定化したた。
異なる基質に対するエフェクターの特異性
上位のエフェクターが元のレポーター構築物に特異的であるのか、または複数の異なるＧＦＰタグ付きタンパク質でも同様に効率的であるのかについても検討した。この目的のため、異なる細胞コンパートメントに局在する多様なＧＦＰタグ付きタンパク質を発現する１１の安定細胞株を作製し、ｖｈｈＧＦＰ融合物としてのＹＹエフェクターの活性をアッセイした。これらのエフェクターは著しく異なるパターンを示し、複数の標的に対して極めて強力なものもあれば、限られた数の標的だけに作用するものもあった（図８）。図８（下のバー）は、このアッセイにおいて、ＧＥＴ４からＫＬＨＬ４０までの親表示の右側のエフェクターが安定化剤子であり、ＲＮＦ１６６からＴＭＥＭ２０４までの親表示の左側のエフェクターが分解剤であることを示している。これらの結果から、このスクリーニングがレポーターのＧＦＰ部分を標的とするエフェクターだけを明らかにしたのではないことが確認される。興味深いことに、ＣＲＢＮはほとんど全ての標的（ＧＦＰ－ＦＵＳとＧＦＰ－ＮＲＡＳを除く）の強力な分解剤であったが、ＶＨＬは元のＧＦＰ－ＡＢＩ１レポーター以外には極めて限られた効果しか示さなかった。注目すべきことに、各標的は、同じコンパートメントに局在していた構築物（例えばＧＦＰ－ＡＢＩ１とＧＦＰ－ＲＬｕｃ）を含め、機能したエフェクターのユニークな相補物を同定した。これらの結果は、タンパク質が分解剤と安定化剤に対して著しく異なる「選好性」を持つことを示しており、分解剤のツールボックスを拡大することが、次世代のＰＲＯＴＡＣと分子糊の開発に極めて有益であることを示唆している。しかしながら、様々な標的を持つエフェクターもある（例えば、ＵＢＥ２Ｂは様々な標的ポリペプチドの分解剤である）。ＵＢＥ２Ｂなどの強固なエフェクターは、様々な標的ポリペプチドを持つエフェクターとして働くと予想するのが妥当である。
ＫＬＨＬ４０、ＰＲＰＳ２、およびＤＤＩ１は、検定した標的のほとんど全てに対して安定化効果を示すことが認められた（図８）。そこで、これらのエフェクターが、病原性変異によって本質的に不安定なタンパク質を安定化できるかどうかを調べた。異なる細胞コンパートメントを代表する５つの異なる不安定変異体を選択し、それらをＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＤｓＲｅｄと融合した。Ｐ２Ａモチーフは翻訳中のリボソームスキップを誘導し、タンパク質の安定性の内部対照としてのＤｓＲｅｄの使用を容易にする。３つのエフェクターは全て、ウミシイタケルシフェラーゼよりも効率よく変異体を安定化させた（図９）。従って、これらのエフェクターは、標的化タンパク質の安定化に利用できる新規なクラスの近接依存性安定化剤である。
新規エフェクターによる非ＧＦＰタグ付きタンパク質および内因性タンパク質の標的化
これまでは、実験は全て、ＧＦＰタグ付きタンパク質を用いて行われたため、スクリーニングはＧＦＰ部分と融合されたタンパク質ではなくＧＦＰ部分を標的とするエフェクターを同定していた可能性が残されていた。そこで、エフェクターが別の手段で標的に到達した場合でも機能するかどうかを調べた。そのために、これまでに開発された２つのＲＡＳ結合剤、すなわち、細胞内シングルドメイン抗体（ｉＤａｂ）と設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）（これらはいずれもＫＲＡＳと高い親和性で結合する）を用いた(Bery et al., 2019, 2020; Tanaka and Rabbitts, 2003)。内因性Ｒａｓの検出が困難なため、３ｘＦＬＡＧ－Ｖ５タグ付きＫＲＡＳを、結合剤と融合したエフェクターで共トランスフェクトした。結合剤と融合したウミシイタケルシフェラーゼはＫＲＡＳレベルに影響を及ぼさなかったが、ほとんどの分解エフェクターはｉＤａｂおよびＤＡＲＰｉｎ融合物としてＫＲＡＳを下方調節した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。注目すべきことに、ＫＬＨＬ４０はＫＲＡＳを安定化させ、これはＧＦＰタグ付きタンパク質での機能と一致している。これらの結果から、エフェクターが単にＧＦＰを標的とするのではなく、誘導近接のための複数の異なる方法に適合することが確認された。
最後に、エフェクターが内因性タンパク質を標的とすることができるかどうかを調べるために、いくつかのエフェクターをクロマチン調節因子ＷＤＲ５と結合するモノボディと融合した(Gupta et al., 2018)。ＵＢＥ２Ｂ、ＦＢＸＬ１２、およびＫＢＴＢＤ７は、内因性ＷＤＲ５のレベルを効果的に減少させ、これらのエフェクターが天然タンパク質も標的とすることができることを示す（図１０Ｃ）。
要約すると、治療目的の標的化タンパク質分解および安定化アプローチに利用できるエフェクタータンパク質のコレクションが同定された。これらの結果は、これらのエフェクター（例えば、ＵＢＥ２Ｂ）が、既存のＴＰＤエフェクターよりも強力で、形状に対する感受性が低いことを示しており、より高い汎用性提供することを示唆している。新たに同定されたエフェクターの多くはＥ３リガーゼではなく、ＴＰＤはこのクラスのタンパク質以外にも拡大できる可能性が示唆される。
Ｅ３リガーゼの系統的解析
多くの分解剤と安定化剤がカノニカルなＥ３リガーゼであったため、Ｅ３リガーゼの大規模パネルを、それらをｖｈｈＧＦＰ融合物として元のＧＦＰ－ＡＢＩ１細胞株に個々のトランスフェクトし、レポーターの安定性に対するそれらの効果を評価することによって調べることにした（図１１Ａ）。
現在、標的タンパク質分解（ＴＰＤ）で利用されている２つの主要なＥ３リガーゼ、すなわち、サリドマイド標的であるセレブロン（ＣＲＢＮ）と腫瘍抑制因子ＶＨＬは強固な分解剤であると思われ（図１１Ｂ）、上位２０の分解剤に入った。他のＣｕｌｌｉｎ－ＲＩＮＧユビキチンリガーゼ（ＣＲＬ）アダプタータンパク質もＧＦＰ分解を強く誘導した（図１１Ｂ）。ＣＩＳＨおよびＳＯＣＳ５などのいくつかのＳＯＣＳ－ｂｏｘドメインタンパク質に加え、分解剤ヒットには、因子Ｆ－ｂｏｘドメインタンパク質であるＦＢＸＬ１５、ＦＢＸＯ３、ＦＢＸＯ４０、ＦＢＸＯ１１、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣおよびＦＢＸＬ１４が含まれた。その他の顕著なＣＲＬアダプター型分解剤には、ＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメインタンパク質であるＧＭＣＬ１、ＫＢＴＢＤ７、ＫＬＨＬ１２、ＧＡＮ、ＫＢＴＢＤ２、ＲＨＯＢＴＢ１およびＫＬＨＬ６が含まれた。逆に、Ｆ－ｂｏｘドメインタンパク質であるＦＢＸＬ８、ＦＢＸＯ２、ＣＤＣＡ３またはＳＫＰ１のトランスフェクションにより、強固なＧＦＰの安定化がもたらされた。同様に、ＳＯＣＳ－ｂｏｘドメインタンパク質であるＡＳＢ９およびＥＬＯＢ、ＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメインタンパク質の一部、例えばＫＬＨＬ４０、ＺＦＰ１６１、ＫＣＴＤ１７、ＺＢＴＢ１８、ＺＢＴＢ７Ｂ、ＫＣＴＤ５、ＺＢＴＢ２０、ＺＢＴＢ４３、ＫＥＡＰ１、ＺＢＴＢ１０およびＫＬＨＬ４１でもＧＦＰの安定化が見られた。
検定した１３７のＥ３のうち、ＴＲＩＭ３１、ＲＣＨＹ１およびＲＮＦ１６６を含む２４のエフェクターがＧＦＰ強度を少なくとも半分（相対ＧＦＰ強度＜０．５）に減少させた（図１Ｂ）。対照的に、検定した９種類のＨＥＣＴ（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ Ｅ６ＡＰ Ｃ－Ｔｅｒｍｉｎｕｓ）型Ｅ３にＧＦＰ分解を誘導したものはなかった。ＨＥＣＴファミリーＥ３リガーゼは、天然基質がない場合、しばしば自己阻害されることから、誘導された近接状況での活性の欠如が説明できるかもしれない。
ＤＵＢの系統的解析
Ｅ３リガーゼに加えて、脱ユビキチン化酵素の、標的タンパク質の安定性に対する影響も系統的に解析した。強力なＤＵＢを同定するために、ＧＦＰと融合した不安定疾患変異体ＧＮＭＴ Ｈ１７６Ｎに対してそれらを検定した。ｖｈｈＧＦＰ融合物としての４７のＤＵＢをＧＮＭＴ Ｈ１７６Ｎ－ＧＦＰ構築物を個々に共トランスフェクトし、融合タンパク質の安定性に対するそれらの影響を評価した（図１２Ａ）。これらのＤＵＢは、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ）、卵巣腫瘍プロテアーゼ（ＯＴＵ）、マチャド・ジョセフィンドメイン（ＭＪＤ）プロテアーゼ、亜鉛依存性金属酵素（ＪＡＭＭ）およびＳＵＭＯプロテアーゼを含む、全ての主要なファミリーを代表していた。興味深いことに、いくつかの異なるＤＵＢファミリーにわたる強固な安定化剤が見つかった（図１２Ｂ）。ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼＵＳＰ１３、ＵＳＰ３９、ＵＳＰ３８およびＵＳＰ１４は、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼＵＣＨＬ１および卵巣腫瘍プロテアーゼＯＴＵＢ１とともに、変異型構築物を安定化する上で特に強力であった。
近接依存性安定化剤の同定
次に、安定化にＤＵＢ触媒活性が必要かどうかを調べた。（ＵＳＰ１３Ｃ３４５Ａ）の触媒システインを不活性化すると、ＵＳＰ１３の安定化効果は低下し、一方、ＵＳＰ１３の２つのユビキチン結合ドメインを破壊すると（ＵＳＰ１３Ｍ６６４Ｅ／Ｍ７３９Ｅ）、ＧＮＭＴＨ１７６Ｎに対する活性が消失した（図１３Ａ）。ＵＳＰ３８１５の触媒的に活性を失った変異体（ＵＳＰ３８Ｃ４５４Ｓ／Ｈ８５７Ａ／Ｄ９１８Ｎ）も同様にアッセイで不活性であった（図１３Ｂ）。従って、これら２つのＤＵＢは触媒活性とユビキチン結合を必要とする機構を介して機能していると思われる。対照的に、ＵＳＰ３９はｉｎ ｖｉｔｒｏで脱ユビキン化酵素活性を持たない偽酵素である。さらに、そのユビキチン結合ドメインを変異させても（ＵＳＰ３９Ｃ１３６Ａ／Ｃ１３９Ａ）、活性には影響がなく（図１３Ｃ）、ＵＳＰ３９はこの場合には別の方法で機能していることが示唆される。同様に、ＯＴＵＢ１の触媒活性も無視できるものであった（図１３Ｄ）。しかしながら、ＯＴＵＢ１には、Ｅ２の活性を化学量論的に阻害できることから、さらなる非触媒的機能も有する。Ｅ２との結合と阻害が欠損した三重変異構築物をアッセイしたところ、Ｋ４８結合ユビキチン鎖の結合も欠損していることが予測された。この変異体はＧＮＭＴＨ１７６Ｎを安定化できなかったことから（図１３Ｆ）、この場合には、ＯＴＵＢ１はＥ２阻害機能またはＫ４８結合ユビキチン鎖への結合能を介して作用していることが強く示唆された。
図１３Ａ～Ｄは、脱ユビキン化酵素機能の必要条件を示している。例えば、触媒システインＣ９１は、ＯＴＵＢ１を介した標的タンパク質の安定化には必要ではなく、これは非常に予想外であった。ＵＳＰ１３（図１３Ａ）、ＵＳＰ３８（図１３Ｂ）、ＵＳＰ３９（図１３Ｃ）、およびＯＴＵＢ１（図１３Ｄ）の変異体をｖｈｈＧＦＰと融合し、ＧＮＭＴＨ１７６Ｎ－ＥＧＦＰを用いた安定化アッセイで検定した。統計的有意性は、ダネットの多重比較補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡで計算した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
多様なアフィニティタグを介したエフェクターの動員
最近、包括的な研究によって９１の多様なＰＲＯＴＡＣに対するキナーゼの感受性に顕著な違いがあることが明らかになった。ＡＲＡＦおよびＩＫＢＫＥなどのいくつかのキナーゼは、ＶＨＬまたはＣＲＢＮに関与するどの化合物によっても分解されなかった。これら２つのキナーゼには１３－ａａのＡＬＦＡタグが付けられ、選択されたエフェクターにはＮｂＡＬＦＡナノボディタグが付けられた。化学的プロテオミクスアプローチと一致して、ＶＨＬ－ＮｂＡＬＦＡはこのアッセイでどちらのキナーゼも分解できないことが認められた（図１５Ａ）。対照的に、多くの新規エフェクターは、はるかに効率的であった。例えば、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２およびＧＰＩアンカータンパク質ＦＣＧＲ３ＢはＡＲＡＦのレベルを強力に減少させたが、ＫＬＨＬ４０はレベルを増加させた（図１５Ａ）。
Ｎｂ（ＡＬＦＡ）－Ｍｙｃと融合した示されたエフェクターを、ＡＬＦＡ－３ｘＦＬＡＧ－ＡＲＡＦとともに２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、次いでＡＲＡＦ（抗ＦＬＡＧ）、エフェクター（抗Ｍｙｃ）、およびＨｓｐ９０についてウエスタンブロッティングを行った（図１５Ａ）。ＷＤＲ５標的化モノボディＭｂ（ＷＤＲ５）を融合したドキシサイクリン誘導性エフェクターを発現する安定ＨＣＴ１１６細胞株を、ドキシサイクリンで処理するか、または処理せずにおいた（図１５Ｂ）。内因性ＷＤＲ５レベルとエフェクター発現をウエスタンブロッティングによって評価した（図１５Ｂの上）。ドキシサイクリン誘導後のＷＤＲ５レベルの定量（図１５Ｂの下）。統計学的有意性は、多重仮説のための偽発見率補正を加えた対応のないｔ検定で計算した。これは、上位のエフェクターが分解されにくい細胞標的（ＡＲＡＦなど）または内因性タンパク質（ＷＤＲ５など）を分解できるというさらなる証拠を提供する。
新規なエフェクターによる内因性タンパク質の標的化
最後に、２つの内因性タンパク質、ＷＤＲ５とＢＣＲ－ＡＢＬに対するエフェクターの効力を評価した。選択されたエフェクターは、Ｃ末端で特異的ＷＤＲ５およびＢＣＲ－ＡＢＬモノボディに融合した誘導性レンチウイルスベクターにクローニングし、安定なＨＣＴ１１６細胞（ＷＤＲ５用）およびＫ５６２細胞（ＢＣＲ－ＡＢＬ用）を作製した。ＶＨＬは内因性ＷＤＲ５を分解できず、ＣＲＢＮはわずかな効果しかなかったが、いくつかの新規なエフェクターはドキシサイクリン依存的にＷＤＲ５を強固に分解した（図１５Ｂ）。 特にＦＢＸＬ１２とＦＢＸＬ１５は、この場合にも非常に効率的であった。Ｋ５６２細胞でＢＣＲ－ＡＢＬを用いた結果も同様であった：ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１５、ＫＢＴＢＤ７、ＫＬＨＤＣ２、およびＫＬＨＬ６はＢＣＲ－ＡＢＬを非常に強力に分解したが、ＣＲＢＮとＶＨＬは有意な効果を示さなかった（図１４Ａ）。
ＢＣＲ－ＡＢＬはＫ５６２細胞に必須のタンパク質であるため、次に細胞増殖に対する分解剤融合物の効果を評価した。モノボディ単独ではＢＣＲ－ＡＢＬ１０１の機能を阻害するが、不活性対照であるＲＬｕｃと融合すると、Ｋ５６２細胞の増殖は部分的に阻害されるだけであった（図１４Ｂ）。しかしながら、モノボディを新規エフェクターと融合すると、細胞は完全に増殖を止めるか、または増殖が著しく遅くなった（図１４Ｂ）。対照的に、ＣＲＢＮは増殖にそれ以上の影響を与えなかった（図１４Ｂ）。従って、偏りのないＯＲＦｅｏｍｅスクリーンで同定された多くのエフェクターは、慢性骨髄性白血病の特徴的な発癌性融合物であるＢＣＲ－ＡＢＬの機能の分解および阻害において有意に優れている。
図１４Ａ～Ｂは、複数の動員戦略と治療に関連する標的を用いた新規なエフェクターのベンチマーキングの結果を示している。特に図１４Ａ～Ｂは、内因性ＢＣＲ－ＡＢＬを分解し、細胞増殖を阻害する上位エフェクターの効力を示している。ＢＣＲ－ＡＢＬのＳＨ２ドメインに結合するモノボディと融合したドキシサイクリン誘導性エフェクターを発現する安定なＫ－５６２細胞株を、ドキシサイクリンで処理するか、または処理せずにおいた（図１４Ａ）。内因性ＢＣＲ－ＡＢＬレベルとエフェクターの発現はウエスタンブロッティングによって評価した（図１４Ａの上）。図１４Ａの下は、ドキシサイクリン誘導後のＢＣＲ－ＡＢＬレベルの定量を示す。統計学的有意性は、多重仮説のための偽発見率補正を加えた対応のないｔ検定で計算した。図１４Ｂは、示されたエフェクター融合構築物をドキシサイクリンで誘導した後のＫ５６２細胞の増殖を示す。モノボディ自体が細胞増殖に影響を及ぼす（ＲＬｕｃ－ｖｈｈＧＦＰに関する左上のグラフのスケールを右上のグラフと比較（図１４Ｂ））。
実施例２：
生存率スクリーニングアッセイ
まず、目的の標的ポリペプチド（ＫＲＡＳなど）にＧＦＰまたはＡＢＩ１（または他のタグ）を付けて、細胞内でそのタンパク質の唯一の供給源とする。これは、内在性遺伝子座にタグを付けるか、またはタグ付きバージョンを異所的に発現させ、内在性コピーをノックアウトすることにより達成される。次に、標的ポリペプチドまたは標的ポリペプチドと融合したタグ（例えば、ｖｈｈＧＦＰ、ＰＹＬ１または他の抗体）と結合する標的部位と融合した、コレクション、例えばライブラリー（例えば、ＯＲＦｅｏｍｅ）に含まれる推定エフェクターポリペプチドをスクリーニングする。その後、経時的にコレクションから消失する推定エフェクターポリペプチドを同定する。スクリーニングアッセイ中に消失する推定エフェクターの同定は、例えば、生存した細胞に存在する推定エフェクターポリペプチドをコードするＤＮＡのシークエンシングを行い、元のコレクションに存在するエフェクター遺伝子とスクリーニング後に存在するエフェクター遺伝子とを比較することによって、どの推定エフェクターポリペプチドがそのような細胞に存在するか、または存在しないかを決定することによって行われる。これは、推定エフェクターポリペプチドと標的ポリペプチドとの相互作用が細胞にとって致死的であることを示す。これらの因子には、標的を分解するエフェクターポリペプチドだけでなく、他の手段で標的の機能を阻害する他のエフェクターポリペプチドも含まれる可能性がある。
あるいは、この方法は標的ポリペプチドにタグを付加することなく実施することもでき、推定エフェクターポリペプチドは標的ポリペプチドと結合するナノボディまたは他の標的化部分と融合することができ、スクリーニングはタグ付けされていない内因性標的ポリペプチドに対して実施される。
実施例３：
タンパク質輸送スクリーニングアッセイ
まず、細胞表面タンパク質（ＣＦＴＲデルタ５０８など）にＧＦＰ、ＡＢＩ１またはその他のタグをつける。次に、コレクション、例えばライブラリーに含まれる推定エフェクターポリペプチドを、標的ポリペプチド（細胞表面タンパク質）の細胞表面局在を増加させる推定エフェクターポリペプチドについてスクリーニングする。これは、タンパク質の細胞外エピトープに対する抗体を用いるか、またはタンパク質の細胞外部分に別のエピトープ（ＦＬＡＧタグなど）を付加することによって、ＦＡＣＳで行うことができる。ＦＡＣＳ選別の後に高い表面発現のクローンのシークエンシングを行えば、輸送を促進する推定エフェクターポリペプチドが同定される。
あるいは、この方法は標的ポリペプチドにタグを付加することなく実施することができ、推定エフェクターポリペプチドは標的ポリペプチドに結合するナノボディまたは他の標的化部分と融合することができ、スクリーニングはタグ付けされていない内因性標的ポリペプチドに対して実施される。
実施例４：
間接的近接相互作用スクリーニング
エフェクターは、ｖｈｈＧＦＰまたはＰＹＬ１などの近接誘導タンパク質に直接融合する必要はない。例えば、標的と相互作用する二次因子との相互作用を促進する小タグと融合することができる。そのような例としては、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＨｉＢｉＴ／ＬｇＢｉｔ、またはＧＦＰ１１／ＧＦＰ１－１０が挙げられる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒは、それぞれＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇペプチドと共有結合を形成するタンパク質である。ＬｇＢｉｔおよびＧＦＰ１－１０はＮａｎｏｌｕｃルシフェラーゼおよびＧＦＰのフラグメントであり、それぞれＨｉＢｉＴおよびＧＦＰ１１ペプチドに高い親和性で結合する。エフェクターは、ＰＹＬ１または標的との相互作用を誘導する別の部分と融合したＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを発現する細胞において、ＳｐｙＴａｇと融合することっで標的に接近させることができる。従って、エフェクターは二次因子（この場合はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＰＹＬ１融合物）の助けで標的と相互作用するように誘導される。
別のリードアウト（蛍光タンパク質融合ではない）
蛍光タンパク質に加えて、標的を小エピトープタグ（ＦＬＡＧ、Ｖ５、Ｍｙｃ、ＡＬＦＡまたはＨＡなど）と融合し、エピトープタグ抗体でその存在量を検出することもできる。 あるいは、全くタグ付けされていない（内因性の）標的を、フローサイトメーターを用いて標的に対する抗体で検出することもできる。これらの場合、ナノボディ、ＳｃＦｖフラグメント、モノボディ、アフィボディまたはエピトープタグもしくは標的そのものに対する類似のアフィニティー試薬を用いて、エフェクターを標的に接近させる。
抗生物質選択スクリーニングについては、標的を抗生物質耐性マーカー（例えば、ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼもしくはブラストサイジンデアミナーゼ）または負の選択マーカー（例えば、チミジンキナーゼもしくはデオキシシチジンキナーゼＤＣＫ＊）と融合する。第１の場合、標的のレベルを増加させるエフェクターは、抗生物質耐性マーカーのレベルを増加させる。これらの細胞は、その後、抗生物質に対する耐性が高くなり、安定化エフェクターの発見を助長する。第２の場合では、標的レベルを減少させるエフェクターは、負の選択マーカーのレベルも減少させる。チミジンキナーゼを発現する細胞はガンシクロビルに感受性があるが、変異型デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ＊）を発現する細胞は２－ブロモビニルデオキシウリジン（ＢＶｄＵ）に感受性がある。これらの化合物で細胞集団を処理すると、標的を分解するエフェクターが選択される。
実施例５：
強固なエフェクター
実施例１および２に記載された方法によって、多くの強固な分解剤および安定剤が同定された。例えば、ＣＲＢＮまたはＶＨＬと比較して同等または増加した活性を有する以下の群が同定された：
ＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、ＲＮＦ１２６。ＺＥＲ１も、ＣＲＢＮまたはＶＨＬと比較して高い活性を有した。
Figure 2025512531000053
Figure 2025512531000054
実施例６：
エフェクタータンパク質およびその標的に対する低分子リガンド／結合剤の発見
エフェクターまたは標的に対する結合剤を同定するには複数の選択肢がある。ほとんどの場合、まず、組換えエフェクターおよび／または標的タンパク質を精製し、次に、化学的スクリーニングを行う。
作用機序（例えば、阻害または活性化）を考慮せずに低分子結合剤を同定するには、いくつかのスクリーニング法を用いることができる。これらの方法は通常、結合相互作用またはリガンドに結合した際のタンパク質特性の変化を測定することに着目する。これらの技術には以下のようなものがある。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：ＳＰＲは、標的タンパク質と相互作用する低分子の結合親和性および動態を、それらの作用機序に関する情報を必要とすることなく、無標識で測定する。
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法：ＮＭＲは、低分子に結合した際のタンパク質のスペクトルの変化を検出することができ、それらの作用機序を知る必要なく結合剤を同定することができる。
示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）またはサーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）：標的タンパク質の低分子結合時の熱安定性をモニターすることで、機能的効果に関する予備知識がなくても結合剤を同定することができる。
等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）：ＩＴＣは、低分子とそれらの標的タンパク質の間の相互作用時に発生または吸収される熱を測定し、作用機序を特定することなく、結合親和性と化学量論データを提供する。
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）：ＭＳＴは、蛍光標識した標的タンパク質が低分子と結合する際の温度勾配における動きの変化を検出し、作用様式を考慮することなく相互作用に関する情報を提供する。
バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）：この無標識光学技術は、固定化された標的タンパク質に低分子が結合することによって生じる干渉パターンの変化を、作用機序に関する情報の必要なく測定する。
Ｘ線結晶学：この方法は、タンパク質－低分子複合体の三次元構造を決定することができ、作用機序に関係なく、分子間相互作用および結合様式に関する洞察を提供する。
ＤＮＡコード化ライブラリー（ＤＥＬ）スクリーン：ライブラリー内の各低分子にユニークなＤＮＡバーコードを共有結合させる革新的なスクリーニング法である。これにより、膨大な化合物ライブラリーの並行スクリーニングが可能となり、結合した分子のＤＮＡバーコードを増幅してシークエンシングを行うことにより、結合剤を同定することができる。
アフィニティー選択－質量分析（ＡＳ－ＭＳ）：この技術は、標的タンパク質を化合物ライブラリーとともにインキュベートし、その後アフィニティー精製を行い、タンパク質と結合した低分子を単離することを含む。次に、結合した分子は質量分析を用いて同定される。ＡＳ－ＭＳは、作用機序に関する予備知識がなくても結合剤を検出することができる。
共有結合フラグメントスクリーン：標的タンパク質と共有結合を形成する低分子の同定に焦点を当てた、フラグメントベースのスクリーニングの特殊な形態。このアプローチは、機能的効果よりも共有結合相互作用を主に検出するため、作用機序に関係なく結合剤を同定することができる。
これらの技術は、リガンド結合時の結合事象またはタンパク質特性の変化を検出することに着目し、機能的効果に関する予備知識がなくても結合剤を同定することができる。潜在的な結合剤を同定した後、活性化または阻害などの作用機序の特性評価を行うために、さらにアッセイを行うことができる。
エフェクターにも標的にもリガンドがない場合、それを見つけるために２つの別のスクリーニングを行う。その後に、同定された結合剤を様々なリンカーで連結し、標的とエフェクター間の相互作用を誘導する能力について、これらのヘテロ二官能性分子の特性評価を行うための医薬品化学的努力が続くことになる。
例えば、ルシフェラーゼ相補性（各タンパク質がルシフェラーゼの半分を持ち、相互作用が発光をもららす）、レポーター遺伝子を用いた酵母ツーハイブリッドアッセイ、アルファスクリーン（近接に基づく発光／蛍光アッセイ）、酵母交配に基づく相互作用アッセイ（ＳｙｎＡｇ）、ＦＲＥＴまたはＴＲ－ＦＲＥＴなど、分子糊のｄｅ ｎｏｖｏ発見のためのいくつかのアプローチを使用することができる。
実施例７
材料および方法
材料および方法は、実施例１に記載のとおり、または本明細書に記載のとおりである。
細胞株
スクリーニングに使用されるＥＧＦＰ－ＡＢＩ１－ＩＲＥＳ－ＴａｇＢＦＰレポーター細胞株を含め、ＨｅＬａ Ｋｙｏｔｏ、ＨＣＴ１１６、および全ての２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で維持した。Ｋ５６２細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ中で培養した。２９３Ｔ、Ｋ５６２、およびＨＣＴ１１６ Ｔｅｔ誘導性細胞株は、１０％Ｔｅｔシステムにより承認されたＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ａ４７３６３－０１）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加した各通常培地で維持した。細胞は、加湿インキュベーターにて、３７℃、５％ＣＯ２で維持し、慣例によりマイコプラズマ汚染に関して検査した。
プラスミド
不安定変異型標的は、Ｇａｔｅｗａｙクローニング技術を用い、ｐｃＤＮＡ３．１－［ＯＲＦ］－ＧＳｌｉｎｋｅｒ－ＥＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ＤｓＲｅｄデスティネーションベクターにクローニングした。ｖｈｈＧＦＰおよびＰＹＬ１分解アッセイについては、エントリークローンをｈＯＲＦｅｏｍｅコレクションから選び取り、ｐｃＤＮＡ３．１－［ＯＲＦ］－ＧＳｌｉｎｋｅｒ－ｖｈｈＧＦＰ－ＳＶ４０－ＴａｇＢＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１－［ＯＲＦ］－ＧＳｌｉｎｋｅｒ－ｖｈｈＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１－ｖｈｈＧＦＰ－ＯＲＦおよびｐｃＤＮＡ３．１－［ＯＲＦ］－ＧＳｌｉｎｋｅｒ－ＰＹＬ１デスティネーションベクターにサブクローニングした。ＷＤＲ５内因性タンパク質分解については、エフェクターコード配列を、ｐＳＴＶ６－ＴｅｔＯ－［ＯＲＦ］－Ｍｂ（Ｓ４）ＷＤＲ５－ＨＡレンチウイルスプラスミドにクローニングし、高い親和性でＷＤＲ５を認識する末端モノボディＭｂ（Ｓ４）を有する各タンパク質の発現を可能とした。ＢＣＲ－ＡＢＬ内因性タンパク質分解については、エフェクターコード配列を、ｐＳＴＶ６－ＴｅｔＯ－［ＯＲＦ］－ＡＳ２５－ＨＡレンチウイルスベクターにクローニングし、Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ２（ＳＨ２）－キナーゼドメイン相互作用界面に向けられたＣ末端高親和性モノボディＡＳ２５を有する各タンパク質の発現を可能とした。ＡＬＦＡタグ付きＡＲＡＦまたはＩＫＢＫＥを作製するために、それらのオープンリーディングフレームをＧａｔｅｗａｙ適合性ｐｃＤＮＡ３．４－ＡＬＦＡ－３ｘＦＬＡＧ－ＯＲＦベクターおよびｐｃＤＮＡ３．４－［ＯＲＦ］－３ｘＦＬＡＧ－ＡＬＦＡベクターにそれぞれクローニングした。ＡＬＦＡナノボディ融合エフェクターは、各エフェクター遺伝子をＧａｔｅｗａｙ適合性ｐｃＤＮＡ３．４－［ＯＲＦ］－ＮｂＡＬＦＡ－Ｍｙｃプラスミドにサブクローニングすることによって作製した。
異所性Ｋ－Ｒａｓ発現については、ＫＲＡＳ ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１－３ｘＦＬＡＧ－ＯＲＦデスティネーションベクターにクローニングした。エフェクターコード配列をｐｃＤＮＡ３．４－［ＯＲＦ］－Ｒａｓ ｉＤａｂ－ＨＡベクターおよびｐｃＤＮＡ３．１－［ＯＲＦ］－ＬＭＯ２ ｉＤａｂ－ＨＡベクターにクローニングし、Ｋ－Ｒａｓまたは対照タンパク質（ＬＭＯ２）をそれぞれ認識するＣ末端モノボディを有する各タンパク質の発現を可能とした。
点突然変異体は部位特異的突然変異誘発により作製し、欠失構築物はＰＣＲにより作製した。
安定細胞株の作製
ＥＧＦＰ－ＡＢＩ１－ＩＲＥＳ－ＴａｇＢＦＰを発現するモノクローナル２９３Ｔ細胞株は、レンチウイルス感染およびブラストサイジン（６μｇ／ｍｌ）選択の後にＦＡＣＳにより単細胞を選別することによって作製した。高いＥＧＦＰおよびＴａｇＢＦＰ発現を示すクローンを次の検定のために選択した。誘導性ドキシサイクリン誘導性細胞株を作製するために、エフェクターをＧａｔｅｗａｙ適合性ｐＳＴＶ６－ＴｅｔＯ－［ＯＲＦ］－ＥＧＦＰ、ｐＳＴＶ６－ＴｅｔＯ－［ＯＲＦ］－ＡＳ２５－ＨＡまたはｐＳＴＶ６－ＴｅｔＯ－［ＯＲＦ］－Ｍｂ（Ｓ４） ＷＤＲ５－ＨＡレンチウイルスプラスミドにサブクローニングした。２９３ＴおよびＨＣＴ１１６細胞は、８μｇ／ｍＬポリブレンの存在下で感染させ、感染２４時間後に３μｇ／ｍｌピューロマイシンで選択した。Ｋ５６２細胞は、８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下、３０００ｒｐｍで９０分間回転沈降させることで感染させ、感染２４時間後に３μｇ／ｍｌピューロマイシンで選択した。
融合タンパク質を伴う高いＥＧＦＰ発現の存在量を高めるために、ｐＳＴＶ６－ＴｅｔＯ－［ＯＲＦ］－ＥＧＦＰレンチウイルスを感染させた高密度を、１μｇ／ｍｌドキシサイクリンで誘導し、高ＥＧＦＰ集団を選別した。
プールされた活性化スクリーニングからのシークエンシングデータの解析
ＳＴＡＲ ａｌｉｇｎｅｒ ｖ２．７．８ａを用いてＯＲＦｅｏｍｅ参照配列のインデックスを作成した。ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーからのリードをＳＴＡＲ ａｌｉｇｎｅｒで、最大３ミスマッチを許容してアラインした。分解剤と安定化剤エフェクターを同定するために、ｅｄｇｅＲパッケージを用いて、選別サンプルと無選別細胞のカウントの変化を比較することにより、各ＯＲＦについてｌｏｇ２倍率変化、ｐ値、および偽発見率（ＦＤＲ）を計算した。分解スクリーンでは、５％偽発見率をカットオフとし、下位１０％と無選別細胞の間の正規化リードカウントの変化４倍を用いた。安定化スクリーンでは、１％ＦＤＲをカットオフとし、正規化リードカウントの変化４倍を用いた。
Ｋ－Ｒａｓ分解アッセイ
ＨｅＬａ細胞を１２ウェルプレートに播種し（１００，０００細胞／ウェル）、２４時間後に２００ｎｇの３ｘＦＬＡＧ－ＫＲＡＳおよび４００ｎｇのＲａｓ ｉＤａｂまたはＬＭＯ２ ｉＤａｂ融合エフェクターでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に細胞を採取し、ウエスタンブロット解析を行った。
内因性タンパク質分解アッセイ
Ｋ５６２およびＨＣＴ１１６安定細胞株を１２ウェルプレートに播種した（１×１０６細胞／ウェル）。Ｋ５６２細胞は、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンまたは１％ＤＭＳＯとともに４８時間インキュベートした。ＨＣＴ１１６細胞は、細胞を馴化させるために２４時間インキュベートした後、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンまたは１％ＤＭＳＯでさらに２４時間処理した。その後、細胞を採取し、ウエスタンブロット解析を行った。
ＡＬＦＡタグキナーゼ分解アッセイ
ＡＬＦＡタグキナーゼ分解アッセイは、１２ウェル細胞培養形式（１００，０００細胞／ウェル）で実施した。２４時間後、２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の説明書に従って用い、１μｇのｐｃＤＮＡ３．４－ＡＬＦＡ－３ｘＦＬＡＧ－ＴＥＶ－ＡＲＡＦまたはｐｃＤＮＡ３．４－ＩＫＢＫＥ－３ｘＦＬＡＧ－ＡＬＦＡで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション１６時間後に細胞を採取し、ウエスタンブロット解析を行った。
ウエスタンブロット
細胞をＣＳＫ溶解バッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ ｐＨ７．９、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３００ｍＭ スクロース、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％トリトンＸ－１００、ベンゾナーゼ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で溶解させた。ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＷＤＲ５、ＡＲＡＦおよびＩＫＢＫＥ分解アッセイについては、細胞をＮＰ４０溶解バッファー（５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で溶解させた。４℃で１６，０００ｇ、５分の遠心分離の後、同量の各細胞溶解液を、ゲル電気泳動および一次抗体として抗ＷＤＲ５抗体（Ｄ９Ｅ１Ｉ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃１３１０５）、抗ＨＳＰ９０抗体（Ｆ－８；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＨＡ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｈ６９０８）、抗ｃ－ＡＢＬ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃２８６２Ｔ）、抗ＭＹＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃６２６８０２）、および抗ＦＬＡＧ（ＤＳＨＢ ＃１２Ｃ６ｃ）を用いるウエスタンブロットを用いて解析した。ヤギＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃７０７４Ｓ）または抗マウスＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃７０７６Ｓ）を二次抗体として使用した。ｖｈｈＧＦＰ融合タンパク質の検出にはＭｏｎｏＲａｂＴＭ ＨＲＰウサギ抗ラクダ科ＶＨＨ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＃Ａ０１８６１）を用いた。化学発光シグナルは、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて生成し、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍｉ４．２（ＦｒｏｇｇａＢｉｏ）で検出した。
安定Ｋ５６２細胞株の増殖アッセイ
増殖アッセイは、９６ウェル培養形式（１，０００細胞／ウェル）で実施した。細胞を１μｇ／ｍｌドキシサイクリンまたは１％ＤＭＳＯの存在下で示された時間増殖させた。ドキシサイクリンまたはＤＭＳＯは７２時間後に新たに加えた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の説明書に従って用いて細胞生存率を測定した。発光強度は、マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて測定した。
免疫蛍光
ＨｅＬａ Ｋｙｏｔｏ細胞を不透明黒色、透明底の９６ウェルプレートに４，５００～５，０００細胞／ウェルで播種した。翌日、ＸｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ９（Ｒｏｃｈｅ）を用い、製造者の説明書に従って細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した後、室温で１５分間、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定後、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、０．１％トリトンＸ－１００／１×ＰＢＳで透過処理を施し、その後、室温で３０分間、ブロッキングバッファー（０．１％トリトンＸ－１００／１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）でブロッキングした。ブロッキングの後、固定細胞を、ブロッキングバッファーで希釈したＭｏｎｏＲａｂＴＭ ｉＦｌｕｏｒ ６４７ウサギ抗ラクダ科ＶＨＨ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ａ０１９９４）およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２とともに室温で１時間インキュベートした。最後に、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、Ｐｈｅｎｉｘハイコンテント顕微鏡（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて６３倍で画像を得た。
結果
近接依存性安定化剤の特性評価
次に、ＤＵＢ触媒活性が安定化に必要かどうかを調べた。（ＵＳＰ１３Ｃ３４５Ａ）の触媒システインを不活性化すると、ＵＳＰ１３の安定化効果が減少し、一方、ＵＳＰ１３の２つのユビキチン結合ドメインを破壊すると（ＵＳＰ１３Ｍ６６４Ｅ／Ｍ７３９Ｅ）、ＧＮＭＴＨ１７６Ｎに対する活性が消失した（図１３Ａ）。ＵＳＰ３８１５の触媒的に活性を失った変異体（ＵＳＰ３８Ｃ４５４Ｓ／Ｈ８５７Ａ／Ｄ９１８Ｎ）も同様にアッセイで不活性であった（図１３Ｂ）。従って、これら２つのＤＵＢは触媒活性とユビキチン結合を必要とする機構で機能していると思われる。対照的に、ＵＳＰ３９はｉｎ ｖｉｔｒｏでは脱ユビキチン化酵素活性を持たない偽酵素である。さらに、そのユビキチン結合ドメインを変異させても（ＵＳＰ３９Ｃ１３６Ａ／Ｃ１３９Ａ）、活性には影響がなく（図１３Ｃ）、ＵＳＰ３９はこの場合には別の方法で機能していることが示唆される。同様に、ＯＴＵＢ１触媒活性も同様に無視できるものであった（図１３Ｄ）。しかしながら、ＯＴＵＢ１はまた、Ｅ２の活性を化学量論的に阻害することができるため、さらなる非触媒的機能も有する。Ｅ２結合と阻害が欠損した三重変異構築物をアッセイしたところ、Ｋ４８結合ユビキチン鎖の結合も欠損していることが予測された。この変異体はＧＮＭＴＨ１７６Ｎを安定化できなかったことから（図１３Ｆ）、ここでは、ＯＴＵＢ１はＥ２阻害機能またはＫ４８結合ユビキチン鎖への結合能を介して作用していることが強く示唆された。
図１３Ａ～Ｄは、脱ユビキン化酵素機能の必要条件を示している。例えば、触媒システインＣ９１は、ＯＴＵＢ１を介した標的タンパク質の安定化には必要ではなく、これは非常に予想外であった。ＵＳＰ１３（図１３Ａ）、ＵＳＰ３８（図１３Ｂ）、ＵＳＰ３９（図１３Ｃ）、およびＯＴＵＢ１（図１３Ｄ）の変異体をｖｈｈＧＦＰと融合し、ＧＮＭＴＨ１７６Ｎ－ＥＧＦＰを用いた安定化アッセイで検定した。統計的有意性は、ダネットの多重比較補正を用いた一元配置ＡＮＯＶＡで計算した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
多様なアフィニティタグを介したエフェクターの動員
最近、包括的な研究によって９１の多様なＰＲＯＴＡＣに対するキナーゼの感受性に顕著な違いがあることが明らかになった。ＡＲＡＦおよびＩＫＢＫＥなどのいくつかのキナーゼは、ＶＨＬまたはＣＲＢＮに関与するどの化合物によっても分解されなかった。これら２つのキナーゼには１３－ａａのＡＬＦＡタグが付けられ、選択されたエフェクターにはＮｂＡＬＦＡナノボディタグが付けられた。化学的プロテオミクスアプローチと一致して、ＶＨＬ－ＮｂＡＬＦＡはこのアッセイでどちらのキナーゼも分解できないことが認められた（図１５Ａ）。対照的に、多くの新規エフェクターははるかに効率的であった。例えば、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２およびＧＰＩアンカータンパク質ＦＣＧＲ３ＢはＡＲＡＦのレベルを強力に減少させたが、ＫＬＨＬ４０はレベルを増加させた（図１５Ａ）。
Ｎｂ（ＡＬＦＡ）－Ｍｙｃと融合した示されたエフェクターを、ＡＬＦＡ－３ｘＦＬＡＧ－ＡＲＡＦとともに２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、次いでＡＲＡＦ（抗ＦＬＡＧ）、エフェクター（抗Ｍｙｃ）、およびＨｓｐ９０についてウエスタンブロッティングを行った（図１５Ａ）。ＷＤＲ５標的化モノボディＭｂ（ＷＤＲ５）を融合したドキシサイクリン誘導性エフェクターを発現する安定ＨＣＴ１１６細胞株を、ドキシサイクリンで処理するか、または処理せずにおいた（図１５Ｂ）。内因性ＷＤＲ５レベルとエフェクター発現をウエスタンブロッティングによって評価した（図１５Ｂの上）。ドキシサイクリン誘導後のＷＤＲ５レベルの定量（図１５Ｂの下）。統計学的有意性は、多重仮説のための偽発見率補正を加えた対応のないｔ検定で計算した。これは、上位のエフェクターが分解されにくい細胞標的（ＡＲＡＦなど）または内因性タンパク質（ＷＤＲ５など）を分解できるというさらなる証拠を提供する。
新規なエフェクターによる内因性タンパク質の標的化
最後に、２つの内因性タンパク質、ＷＤＲ５とＢＣＲ－ＡＢＬに対するエフェクターの効力を評価した。選択されたエフェクターは、Ｃ末端で特異的ＷＤＲ５およびＢＣＲ－ＡＢＬモノボディに融合した誘導性レンチウイルスベクターにクローニングし、安定なＨＣＴ１１６細胞（ＷＤＲ５用）およびＫ５６２細胞（ＢＣＲ－ＡＢＬ用）を作製した。ＶＨＬは内因性ＷＤＲ５を分解できず、ＣＲＢＮはわずかな効果しかなかったが、いくつかの新規なエフェクターはドキシサイクリン依存的にＷＤＲ５を強固に分解した（図１５Ｂ）。 特にＦＢＸＬ１２とＦＢＸＬ１５は、この場合にも非常に効率的であった。Ｋ５６２細胞でＢＣＲ－ＡＢＬを用いた結果も同様であった：ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１５、ＫＢＴＢＤ７、ＫＬＨＤＣ２、およびＫＬＨＬ６はＢＣＲ－ＡＢＬを非常に強力に分解したが、ＣＲＢＮとＶＨＬは有意な効果を示さなかった（図１４Ａ）。
ＢＣＲ－ＡＢＬはＫ５６２細胞に必須のタンパク質であるため、次に細胞増殖に対する分解剤融合物の効果を評価した。モノボディ単独ではＢＣＲ－ＡＢＬ１０１の機能を阻害するが、不活性対照であるＲＬｕｃと融合すると、Ｋ５６２細胞の増殖は部分的に阻害されるだけであった（図１４Ｂ）。しかしながら、モノボディを新規エフェクターと融合すると、細胞は完全に増殖を止めるか、または増殖が著しく遅くなった（図１４Ｂ）。対照的に、ＣＲＢＮは増殖にそれ以上の影響を与えなかった（図１４Ｂ）。従って、偏りのないＯＲＦｅｏｍｅスクリーンで同定された多くのエフェクターは、慢性骨髄性白血病の特徴的な発癌性融合物であるＢＣＲ－ＡＢＬの機能の分解および阻害において有意に優れている。
図１４Ａ～Ｂは、複数の動員戦略と治療に関連する標的を用いた新規なエフェクターのベンチマーキングの結果を示している。特に図１４Ａ～Ｂは、内因性ＢＣＲ－ＡＢＬを分解し、細胞増殖を阻害する上位エフェクターの効力を示している。ＢＣＲ－ＡＢＬのＳＨ２ドメインに結合するモノボディと融合したドキシサイクリン誘導性エフェクターを発現する安定なＫ－５６２細胞株を、ドキシサイクリンで処理するか、または処理せずにおいた（図１４Ａ）。内因性ＢＣＲ－ＡＢＬレベルとエフェクターの発現はウエスタンブロッティングによって評価した（図１４Ａの上）。図１４Ａの下は、ドキシサイクリン誘導後のＢＣＲ－ＡＢＬレベルの定量を示す。統計学的有意性は、多重仮説のための偽発見率補正を加えた対応のないｔ検定で計算した。図１４Ｂは、示されたエフェクター融合構築物をドキシサイクリンで誘導した後のＫ５６２細胞の増殖を示す。モノボディ自体が細胞増殖に影響を及ぼす（ＲＬｕｃ－ｖｈｈＧＦＰに関する左上のグラフのスケールを右上のグラフと比較（図１４Ｂ））。
Figure 2025512531000055
現在好ましい実施例と考えられるものを参照して本出願を説明してきたが、本出願は開示された実施例に限定されるものではないと理解されるべきである。さらには、本出願は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる様々な変更および同等の配置を包含することを意図している。
全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個の刊行物、特許、または特許出願が、参照によりその全体が本明細書の一部とされることが具体的かつ個々に示されている場合と同じ程度に、参照によりその全体が本明細書の一部とされる。具体的には、例えば、表中または他所で提供されるアクセッション番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含む、本明細書で提供される各アクセッション番号に関連する配列は、参照によりその全体が本明細書の一部とされる。
特許請求の範囲は、好ましい実施形態および実施例によって限定されるべきではなく、全体として本明細書と整合する最も広い解釈が与えられるべきである。
Figure 2025512531000056
Figure 2025512531000057

Claims (103)

  1. 近接エフェクターポリペプチドを同定する方法であって、
    ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを複数の細胞に形質導入する工程であって、前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーは複数のＯＲＦをコードし、前記ＯＲＦのそれぞれは、標的ポリペプチドに直接的または間接的に結合するか、または結合するように誘導することができる標的化部分と融合されている、工程；
    前記標的化部分が前記標的ポリペプチドと相互作用するための条件下で、前記複数の形質導入細胞内で前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの複数のＯＲＦを発現させる工程；および
    対照と比較して前記複数のＯＲＦのいずれかを発現する細胞における前記標的ポリペプチドの存在量、場合により、全存在量、細胞表面存在量もしくは細胞内存在量を測定すること、および／または対照と比較して前記複数の形質導入細胞において前記複数のＯＲＦのいずれかが枯渇もしくは増加しているかどうかを検出することによって、前記複数のＯＲＦのいずれかが近接エフェクターポリペプチドであるかどうかを決定する工程
    を含み、
    前記複数の形質導入細胞は、前記標的ポリペプチドを組換え発現し、かつ場合により、第１の蛍光ポリペプチドを発現し、前記標的ポリペプチドは、第２の蛍光ポリペプチド、内因性タンパク質、または第２の蛍光ポリペプチドエピトープタグ、抗生物質耐性タンパク質および／もしくは負の選択マーカーと融合された融合ポリペプチドであり；
    ＯＲＦは、ＯＲＦが対照と比較して前記標的ポリペプチドの存在量を増加もしくは減少させているか、または対照と比較して前記複数の形質導入細胞で枯渇もしくは増加している場合に、近接エフェクターポリペプチドをコードしている、
    方法。
  2. 前記標的ポリペプチドの存在量を測定することが、ｉ）対照に比べて前記複数の形質導入細胞で発現した標的ポリペプチドが減少しているかどうかもしくは増加しているかどうかを決定すること、またはｉｉ）前記複数のＯＲＦのいずれかが対照と比較して標的ポリペプチドの細胞表面レベルを増加させたかどうかを決定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記標的ポリペプチドが対照と比較して減少している場合に、前記近接エフェクターポリペプチドは、前記標的ポリペプチドの分解剤であり、または前記標的ポリペプチドが対照と比較して増加していた場合に、前記近接エフェクターポリペプチドは、前記標的ポリペプチドの安定化剤であり、
    前記近接エフェクターポリペプチドは、対照と比較して、前記複数の形質導入細胞で枯渇もしくは減少していた場合に、致死ポリペプチドであり、または前記複数の形質導入細胞で増加していた場合に、増殖誘導ポリペプチドであり；あるいは
    前記近接エフェクターが対照と比較して標的ポリペプチドの細胞表面レベルを増加させる場合に、前記近接エフェクターポリペプチドは、タンパク質輸送ポリペプチドである、
    請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記標的ポリペプチドが第２の蛍光ポリペプチドであるか、または第２の蛍光ポリペプチドと融合されている場合、決定することは、選択された第２の蛍光ポリペプチド：第１の蛍光ポリペプチド比を有する前記複数の形質導入細胞の画分を単離すること、および前記画分中の複数のＯＲＦの１以上のＯＲＦシークエンシングを行うことを含み；
    前記標的ポリペプチドがエピトープタグと融合されている場合、決定することは、エピトープタグ結合タンパク質、場合により、抗体を用いて、前記標的ポリペプチドの存在量を測定することを含んでなり；
    前記標的ポリペプチドが内因性標的である場合、決定することは、標的ポリペプチド結合タンパク質、場合により、抗体を用いて、前記標的ポリペプチドの存在量を測定することを含んでなり；
    前記標的ポリペプチドが前記抗生物質選択タンパク質と融合されている場合、決定することは、抗生物質処理に生き残った前記複数の形質導入細胞の画分を単離すること、および前記画分中のＯＲＦの１以上のＯＲＦシークエンシングを行うことを含んでなり；または
    前記標的ポリペプチドが負の選択マーカー、場合により、チミジンキナーゼと融合されている場合、決定することは、負の選択処理に生き残った前記複数の形質導入細胞の画分を単離すること、および前記画分中のＯＲＦの１以上のＯＲＦシークエンシングを行うことを含んでなる、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記複数の細胞が細胞株であり、前記方法が、前記標的ポリペプチド、および場合により、第１の蛍光ポリペプチドをコードする核酸を導入することによって細胞株を作製することをさらに含んでなり、場合により、標的ポリペプチドと第１の蛍光ポリペプチドは、その間にＩＲＥＳまたは切断部位を含んでなる構築物内にある、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 第２の蛍光ポリペプチドと第１の蛍光ポリペプチドの比が、フローサイトメトリーを含んでなる方法を用いて決定される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 第１または第２の蛍光ポリペプチドがＲＦＰ、ＹＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ＢＦＰおよび／またはＧＦＰである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 第１の蛍光ポリペプチドがＧＦＰであって、第２の蛍光ポリペプチドがＢＦＰであるか、または第１の蛍光ポリペプチドがＢＦＰであって、第２の蛍光ポリペプチドがＧＦＰである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記標的ポリペプチドが前記抗生物質耐性タンパク質または前記負の選択マーカーと融合されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  10. 抗生物質処理に生き残った細胞で同定されたＯＲＦがエフェクターである、請求項１～４または９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 決定することが、前記複数の形質導入細胞の増殖を測定することを含んでなり、対照と比較して細胞増殖を増加または減少させた前記複数の形質導入細胞の一細胞で同定されたＯＲＦが近接エフェクターポリペプチドである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記抗生物質耐性タンパク質がピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである、請求項１～４または９～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記標的化部分が前記標的ポリペプチドと相互作用するための条件下で、前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの複数のＯＲＦを発現させる工程中に、前記複数の形質導入細胞をピューロマイシンで処理することを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記負の選択マーカーがチミジンキナーゼ、変異型デオキシシトジンキナーゼまたはチミジル酸キナーゼである、請求項１～４、９または１１のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記負の選択マーカーがチミジンキナーゼであり、前記方法が、前記標的化部分が前記標的ポリペプチドと相互作用するための条件下で、前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの複数のＯＲＦを発現させる工程中に、前記複数の形質導入細胞をガンシクロビルで処理することを含んでなり、ガンシクロビルに曝された際の細胞の生存が、前記標的ポリペプチドのレベルが減少していることを示す、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記複数の細胞がＯＲＦｅｏｍｅライブラリーのカバー率として＞平均約３００倍、＞４００倍または＞平均約５００倍を維持するように形質導入される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 同定された近接エフェクターポリペプチドを個々の近接エフェクターアッセイで検定すること、場合により、前記近接エフェクターポリペプチドが安定化剤または分解剤として同定されている場合には、安定化剤または分解剤として同定されている推定近接エフェクターポリペプチドを、前記標的ポリペプチドを発現する検定細胞内で発現させること、および前記検定細胞中の前記標的ポリペプチドのレベルが減少または増加しているかどうかを決定することをさらに含んでなる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記近接エフェクターポリペプチドが複数の近接エフェクターポリペプチドである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  19. 致死ポリペプチドまたは増殖誘導ポリペプチドである近接エフェクターポリペプチドを同定するための方法であって、決定することが、前記ＯＲＦが前記複数の形質導入細胞の少なくとも１つの細胞の死滅をひき起こしたかどうかもしくは増殖を誘導したかどうか、および／または対照と比較して前記複数の形質導入細胞において枯渇もしくは増加しているかどうかを決定することを含んでなり、前記近接エフェクターポリペプチドが前記複数の形質導入細胞の少なくとも１つの細胞において死滅を引き起こし、および／もしくはそれが前記複数の形質導入細胞において枯渇している場合に、前記近接エフェクターポリペプチドは致死ポリペプチドであり、前記近接エフェクターポリペプチドが前記複数の形質導入細胞において少なくとも１つの細胞で増殖を誘導し、および／もしくは対照と比較して増加している場合には、前記推定近接エフェクターポリペプチドは増殖誘導ポリペプチドである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  20. 決定することが、前記複数の形質入細胞で枯渇しているＯＲＦを同定することを含んでなり、場合により、生き残った複数の形質導入細胞中の複数のＯＲＦのシークエンシングを行うこと、および前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリー中の複数のＯＲＦの参照を比較してＯＲＦが存在するまたは存在しないと決定することを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記標的ポリペプチドが発癌性ポリペプチド、アポトーシスの調節因子、オートファジーの調節因子、またはマイトファジーの調節因子である、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 前記標的ポリペプチドがＲＡＳポリペプチド、ＭＹＣ、またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記標的ポリペプチドがＲＡＳポリペプチド、場合により、ＫＲＡＳである、請求項２２に記載の方法。
  24. タンパク質輸送ポリペプチドである近接エフェクターポリペプチドを同定するための方法であって、決定することが、前記標的ポリペプチドの細胞表面レベルを測定することを含んでなり、前記近接エフェクターポリペプチドは、それが前記標的ポリペプチドの細胞表面レベルを増加させる場合に、タンパク質輸送ポリペプチドである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記標的ポリペプチドがＭＨＣクラスＩポリペプチドである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記標的ポリペプチドが、場合により表２に示される、変異型細胞表面ポリペプチドである、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記変異型細胞表面ポリペプチドがＣＦＴＲΔ５０８である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記標的ポリペプチドがＥＧＦＰ－ＡＢ１、Ｒｌｕｃ、ＦＵＳ Ｓ５２５Ｌ、ＮＲＡＳ、ＤＮＡＪＡ３、ＢＲＡＦ、ＬＡＭＰ１、ＴＤＰ４３ Ｑ３１１Ｋ、ＣＤ６３、Ｈ２Ｂ、ＥＧＦＲ、ＤＮＡＪＢ１１、ＷＤＲ５、ＲＡＳ、ＭＹＣ、またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１、ＥＷＳＲ１、ＳＭＡＲＣＡ２／４、またはＰＡＲＰ１、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１、ＪＡＫ、ＦＵＳ、ＴＤＰ４３、ａ－シヌクレイン、アミロイドβ前駆体タンパク質、ＨＴＴ、プリオンタンパク質、ｐ５３、ＰＴＥＮ、ＣＦＴＲ変異体、および／またはジストロフィン変異体を含んでなる、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記標的化部分が前記標的ポリペプチドに結合するナノボディ、リガンド、相互作用ペプチドまたは抗体である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 標的化部分がナノボディである、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記標的化部分が、ＡＢＩ１、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ、変異型ＦＲＢ、ＧＩＤ１、ＧＡＩ、および／またはＰＹＲ１から選択される相互作用ペプチドである、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記標的ポリペプチドが、前記標的化部分と相互作用する相互作用ペプチドを含んでなる融合ポリペプチドである、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記融合ポリペプチドがＡＢＩ１、ＦＫＢＰ、ＦＲＢ、変異型ＦＲＢ、ＧＩＤ１、ＧＡＩ、ＰＹＬ１、ＡＬＦＡタグおよび／またはＰＹＲ１を含んでなる、請求項３２に記載の方法。
  34. 化学誘導剤の使用を含んでなる、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記標的ポリペプチドがＡＢＩ１を含んでなり、前記標的化部分がＰＹＲ１またはＰＹＬ１を含んでなり、前記化学誘導剤がマンジプロパミドまたはアブシジン酸である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記標的ポリペプチドがＰＹＲ１を含んでなり、前記標的化部分がＡＢＩ１を含んでなり、前記化学誘導剤がマンジプロパミドまたはアブシジン酸である、請求項３４に記載の方法。
  37. 前記標的ポリペプチドがＡＢＩ１を含んでなり、前記標的化部分がＰＹＬ１を含んでなり、化学誘導剤がアブシジン酸である、請求項３４に記載の方法。
  38. 前記標的ポリペプチドがＦＫＢＰを含んでなり、前記標的化部分がＦＲＢを含んでなり、前記化学誘導剤がラパマイシンである、請求項３４に記載の方法。
  39. 前記標的ポリペプチドがＦＲＢを含んでなり、前記標的化部分がＦＫＢＰを含んでなり、前記化学誘導剤がラパマイシンである、請求項３４に記載の方法。
  40. 前記標的ポリペプチドがＦＫＢＰを含んでなり、前記標的化部分が変異型ＦＲＢを含んでなり、前記化学誘導剤がラパログ、場合により、ＡＰ２１９６７である、請求項３４に記載の方法。
  41. 前記標的ポリペプチドが変異型ＦＲＢを含んでなり、前記標的化部分がＦＫＢＰを含んでなり、前記化学誘導剤がラパログ、場合により、ＡＰ２１９６７である、請求項３４に記載の方法。
  42. 前記標的ポリペプチドがＧＩＤ１を含んでなり、標的化部分がＧＡＩを含んでなり、前記化学誘導剤がジベレリン酸である、請求項３４に記載の方法。
  43. 前記標的ポリペプチドが変異型ＧＡＩを含んでなり、前記標的化部分がＧＩＤ１を含んでなり、前記化学誘導剤がジベレリン酸である、請求項３４に記載の方法。
  44. 同定された少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドに対するリガンド、場合により、低分子結合剤を同定するためのスクリーニングアッセイを実施することをさらに含んでなる、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドのリガンド、場合により、低分子結合剤を同定するためのスクリーニングアッセイであって、
    少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドを低分子ライブラリーと、場合により、ハイスループットスクリーニングアッセイで接触させる工程であって、前記近接エフェクターポリペプチドは表４、５、６または７から選択される、工程；
    前記組換え近接エフェクターポリペプチドと前記低分子ライブラリーの１以上の低分子との間で結合が起こったかどうかを評価する工程
    を含んでなり、
    前記少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドに結合した１以上の分子は、前記少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドのリガンド、場合により、低分子結合剤であり；
    好ましくは、前記近接エフェクターポリペプチドは、ＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、もしくはＲＮＦ１２６から選択されるか、またはＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１、ＵＢＥ２ＢもしくはＫＬＨＬ４０から選択される、
    スクリーニングアッセイ。
  46. 標的ポリペプチドを前記低分子ライブラリーと接触させること、および前記標的ポリペプチドと前記低分子ライブラリーの１以上の低分子との間に結合が起こったかどうかを決定することをさらに含んでなる、請求項４５に記載のスクリーニングアッセイ。
  47. 前記評価工程が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、サーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）、Ｘ線結晶学、ＤＮＡコード化ライブラリー（ＤＥＬ）スクリーン、アフィニティー選択－質量分析（ＡＳ－ＭＳ）、または共有結合フラグメントスクリーンを用いて実施される、請求項４５または４６に記載のスクリーニングアッセイ。
  48. 前記組換え近接エフェクターと前記標的ポリペプチドが前記低分子結合剤の存在下で相互作用するかどうかを決定することによって、前記組換え近接エフェクターポリペプチドの低分子結合剤が分子糊であるかどうかを同定することをさらに含んでなる、請求項４５に記載のスクリーニングアッセイ。
  49. 決定工程がルシフェラーゼ相補性、酵母ツーハイブリッドアッセイ、アルファスクリーン、酵母接合に基づく相互作用アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動顕微鏡法（ＦＲＥＴ）、または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）を用いて実施され、前記低分子結合剤は、前記組換え近接エフェクターポリペプチドおよび前記標的ポリペプチドと同時に相互作用するか、または相互作用することができる場合は、分子糊である、請求項４８に記載のスクリーニングアッセイ。
  50. 前記少なくとも１つの組換え近接エフェクターポリペプチドが請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法を用いて同定され、および／または前記方法が、リガンド、場合により、低分子結合剤を有する製品、場合により、治療用製品を作製することを含んでなる、請求項４５～４９のいずれか一項に記載のスクリーニングアッセイ。
  51. ヘテロ二機能性分子を作製する方法であって、
    エフェクターポリペプチドのリガンド、場合により、低分子結合剤と標的ポリペプチドの低分子結合剤を、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法を用いて同定する工程、および
    前記エフェクターポリペプチドのリガンド、場合により、低分子結合剤と前記標的ポリペプチドの低分子結合剤を、場合により、リンカーを介して結合する工程
    を含んでなる、方法。
  52. 前記エフェクターポリペプチドと前記標的ポリペプチドが前記ヘテロ二機能性分子の存在下で相互作用するかどうかを評価することをさらに含んでなる、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記評価工程が、ルシフェラーゼ相補性、酵母ツーハイブリッドアッセイ、アルファスクリーン、酵母接合に基づく相互作用アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動顕微鏡（ＦＲＥＴ）、または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）を用いて実施される、請求項５２に記載の方法。
  54. 少なくとも１つの細胞において標的ポリペプチドを調節するためのプロセスであって、前記少なくとも１つの細胞において表４、５、６または７に示される近接エフェクターポリペプチドを発現させることを含んでなり、前記少なくとも１つの近接エフェクターポリペプチドは標的化部分と融合され、好ましくは、前記近接エフェクターポリペプチドは、ＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、もしくはＲＮＦ１２６から選択されるか、またはＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１、ＵＢＥ２ＢもしくはＫＬＨＬ４０から選択される、プロセス。
  55. 前記近接エフェクターポリペプチドが少なくとも１つの分解剤である、請求項５４に記載のプロセス。
  56. 前記近接エフェクターポリペプチドが少なくとも１つの安定化剤である、請求項５４に記載のプロセス。
  57. 前記少なくとも１つの分解剤ポリペプチドがＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ａ、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１および／またはＫＬＨＤＣ２から選択される、請求項４４５５に記載のプロセス。
  58. 前記少なくとも１つの分解剤がＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、ＺＥＲ１および／またはＲＮＦ１２６から選択される、請求項５５に記載のプロセス。
  59. 前記少なくとも１つの分解剤ポリペプチドが、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１および／またはＵＢＥ２Ｂから選択される、請求項５５に記載のプロセス。
  60. 前記少なくとも１つの安定化剤ポリペプチドがＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４１、ＤＤＩ１、および／またはＰＲＰＳ２から選択される、請求項４５６に記載のプロセス。
  61. 前記少なくとも１つの安定化剤ポリペプチドがＫＬＨＬ４０である、請求項５６または６０に記載のプロセス。
  62. 前記標的ポリペプチドが癌遺伝子ポリペプチド、発癌性融合ポリペプチド、合成致死標的、免疫学的／癌免疫学的標的、優性機能獲得型疾患変異体、腫瘍抑制因子、または不安定疾患変異体である、請求項５４～６１のいずれか一項に記載のプロセス。
  63. 前記癌遺伝子ポリペプチドまたは発癌性融合ポリペプチドがＲＡＳ、ＭＹＣ、またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１であるか、またはそれを含んでなる、請求項６２に記載のプロセス。
  64. 前記合成致死標的がＥＷＳＲ１、ＳＭＡＲＣＡ２／４、またはＰＡＲＰ１である、請求項６２に記載のプロセス。
  65. 前記免疫学的／癌免疫学的標的がＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１またはＪＡＫである、請求項６２に記載のプロセス。
  66. 前記優性機能獲得型疾患変異体がＦＵＳ、ＴＤＰ４３、ａ－シヌクレイン、アミロイドβ前駆体タンパク質、ＨＴＴ、またはプリオンタンパク質である、請求項６２に記載のプロセス。
  67. 前記腫瘍抑制因子がｐ５３またはＰＴＥＮである、請求項６２に記載のプロセス。
  68. 前記不安定疾患変異体がＣＦＴＲ変異またはジストロフィン変異体である、請求項６２に記載のプロセス。
  69. 前記近接エフェクターがＫＬＨＬ４０またはＫＬＨＬ４１であり、標的ポリペプチドが筋ジストロフィーの安定性喪失変異体である、請求項６２に記載のプロセス。
  70. 前記標的ポリペプチドがＢＣＲ－ＡＢＬである、請求項６２に記載のプロセス。
  71. 前記標的化部分がナノボディ、リガンド、相互作用ペプチドまたは抗体である、請求項５４～７０のいずれか一項に記載のプロセス。
  72. 表４、５、６または７から選択される近接エフェクターポリペプチド、および標的ポリペプチドに結合する標的化部分を含んでなり、好ましくは、前記近接エフェクターポリペプチドは、ＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、もしくはＲＮＦ１２６から選択されるか、またはＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１、ＵＢＥ２ＢもしくはＫＬＨＬ４０から選択される、融合ポリペプチド。
  73. 前記エフェクターポリペプチドがＺＥＲ１ ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＵＢＥ２ＢまたはＫＬＨＬ４０から選択される、請求項７２に記載の融合ポリペプチド。
  74. 前記近接エフェクターポリペプチドがＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ａ、ＺＥＲ１、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ６融合物のＫＬＨＬ４０：ＢＴＢドメイン、またはＦＣＧＲ３Ｂ融合物のＰＲＮＰ：残基１９４～２２３から選択される、請求項７２に記載の融合ポリペプチド。
  75. 前記エフェクターポリペプチドがＵＢＥ２Ｂ、ＺＥＲ１ ＫＬＨＬ４０、ＫＬＨＬ４１、ＤＤＩ１、またはＰＲＰＳ２である、請求項７２に記載の融合ポリペプチド。
  76. 前記融合ポリペプチドが、分解剤である近接エフェクターポリペプチドを含んでなる、請求項７２に記載の融合ポリペプチド。
  77. 前記近接エフェクターポリペプチドがＧＭＣＬ１、ＦＢＸＬ１５、ＰＪＡ１、ＲＮＦ１１５、ＤＺＩＰ３、ＲＮＦ１２５、ＦＢＸＯ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１８３、ＲＣＨＹ１、ＫＢＴＢＤ７、ＴＲＩＭ３１、ＣＩＳＨ、ＳＯＣＳ５、ＴＲＩＭ３９、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＦＢＸＯ４０、ＫＬＨＬ６、ＦＢＸＯ１１、ＧＡＮ、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＷ５、ＲＮＦ１１１、ＦＢＸＬ１２、ＢＴＲＣ、ＺＥＲ１またはＲＮＦ１２６から選択される、請求項７６に記載の融合ポリペプチド。
  78. 前記近接エフェクターポリペプチドがＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＫＬＨＤＣ２、ＫＬＨＬ６、ＫＢＴＢＤ７、ＺＥＲ１、またはＵＢＥ２Ｂから選択される、請求項７２に記載の融合ポリペプチド。
  79. 前記近接エフェクターポリペプチドが安定化剤である、請求項７２に記載の融合ポリペプチド。
  80. 前記安定化剤がＫＬＨＬ４０である、請求項７９に記載の融合ポリペプチド。
  81. 前記標的化部分が、前記標的ポリペプチドに結合するナノボディ、リガンド、相互作用ペプチドまたは抗体である、請求項７２～８０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  82. 前記標的化部分がナノボディ、場合により、ｖｈｈＧＦＰまたはＡＬＦＡタグナノボディである、請求項７２～８１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  83. 前記標的ポリペプチドが癌遺伝子ポリペプチド、発癌性融合ポリペプチド、合成致死標的、免疫学的／癌免疫学的標的、優性機能獲得型疾患変異体、腫瘍抑制因子、または不安定疾患変異体から選択される、請求項７２～８２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  84. 前記癌遺伝子ポリペプチドまたは発癌性融合ポリペプチドがＲＡＳ、ＭＹＣ、またはＥＷＳＲ－ＦＬＩ１である、請求項８３に記載の融合ポリペプチド。
  85. 前記合成致死標的がＥＷＳＲ１、ＳＭＡＲＣＡ２／４、またはＰＡＲＰ１である、請求項８３に記載の融合ポリペプチド。
  86. 前記免疫学的／癌免疫学的標的がＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１またはＪＡＫである、請求項６３に記載の融合ポリペプチド。
  87. 前記優性機能獲得型疾患変異体がＦＵＳ、ＴＤＰ４３、ａ－シヌクレイン、アミロイドβ前駆体タンパク質、ＨＴＴ、またはプリオンタンパク質である、請求項８３に記載の融合ポリペプチド。
  88. 前記腫瘍抑制因子がｐ５３またはＰＴＥＮである、請求項８３に記載の融合ポリペプチド。
  89. 前記不安定疾患変異体がＣＦＴＲ変異体またはジストロフィン変異体である、請求項８３に記載の融合ポリペプチド。
  90. 前記標的ポリペプチドがＥＧＦＰ－ＡＢ１、ＡＢＩ１、Ｒｌｕｃ、ＦＵＳ Ｓ５２５Ｌ、ＮＲＡＳ、ＤＮＡＪＡ３、ＢＲＡＦ、ＬＡＭＰ１、ＴＤＰ４３、Ｑ３１１Ｋ、ＣＤ６３、Ｈ２Ｂ、ＥＧＦＲ、ＤＮＡＪＢ１１またはＷＤＲ５から選択される、請求項７２～８２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  91. 薬剤の作製における使用のための、請求項７２～９０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  92. 前記近接エフェクターがＫＬＨＬ４０またはＫＬＨＬ４１であり、前記標的ポリペプチドが安定性喪失型変異体であり、前記薬剤が筋ジストロフィーを治療するためのものである、請求項９１の使用のための融合ポリペプチド。
  93. 前記標的ポリペプチドがＢＣＲ－Ａｂｌである、請求項９１の使用のための融合ポリペプチド。
  94. 請求項７２～９３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。
  95. 請求項９４に記載の核酸を含んでなるベクター。
  96. 近接エフェクターポリペプチドを同定する方法であって、
    ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを複数の細胞に形質導入する工程であって、前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーは複数のＯＲＦをコードし、前記ＯＲＦのそれぞれは、標的ポリペプチドに結合するナノボディ、および場合により、相互作用ペプチドと融合されている、工程；
    前記ナノボディ、および場合により、前記相互作用ペプチドが前記標的ポリペプチドと相互作用するための条件下で、前記複数の形質導入細胞内で前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの複数のＯＲＦを発現させる工程；および
    対照と比較して前記複数のＯＲＦのいずれかを発現する細胞における標的ポリペプチドの存在量を測定することによって、前記複数のＯＲＦのいずれかが近接エフェクターポリペプチドであるかどうかを決定する工程
    を含んでなり、
    前記複数の形質導入細胞は、蛍光ポリペプチド、場合により、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を組換え発現し、かつ前記標的ポリペプチドを発現し、前記標的ポリペプチドは、別の蛍光ポリペプチド、場合により、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または別の蛍光ポリペプチド、場合により、ＧＦＰと融合された、場合により、相補的相互作用ポリペプチドと融合された内因性タンパク質であり；ＯＲＦが対照と比較して前記標的ポリペプチドの存在量を増加または減少させる場合に、前記ＯＲＦは近接エフェクターポリペプチドをコードする、方法。
  97. 前記ＯＲＦが、標的ポリペプチドに結合するナノボディおよび相互作用ペプチドと融合されている、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記標的ポリペプチドが蛍光ポリペプチド、場合により、ＧＦＰである、請求項９６または９７に記載の方法。
  99. 近接エフェクターポリペプチドを同定する方法であって、
    ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを複数の細胞に形質導入する工程であって、前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーは複数のＯＲＦをコードし、前記ＯＲＦのそれぞれは、標的ポリペプチドに結合する相互作用ペプチドと融合されている、工程；
    前記相互作用ペプチドが前記標的ポリペプチドと相互作用するための条件下で、前記複数の形質導入細胞内で前記ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの複数のＯＲＦを発現させる工程；および
    対照と比較して前記複数のＯＲＦのいずれかを発現する細胞における標的ポリペプチドの存在量を測定することによって、前記複数のＯＲＦのいずれかが近接エフェクターポリペプチドであるかどうかを決定する工程
    を含んでなり、
    前記複数の形質導入細胞は、蛍光ポリペプチド、場合により、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を組換え発現し、かつ前記標的ポリペプチドを発現し、前記標的ポリペプチドは、別の蛍光ポリペプチド、場合により、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または別の蛍光ポリペプチド、場合により、ＧＦＰと融合された、相補的相互作用ポリペプチドと融合された内因性タンパク質であり；ＯＲＦが対照と比較して標的ポリペプチドの存在量を増加または現象させる場合に、前記ＯＲＦは近接エフェクターポリペプチドをコードする、方法。
  100. 前記相互作用ペプチドが前記標的ポリペプチドと相互作用するための条件は、化学誘導剤の存在下である、請求項９６～９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記相互作用ペプチドがＰＹＬ１であって、前記相補的相互作用ペプチドがＡＢＩであるか、または前記相互作用ペプチドがＡＢＩであって、前記相補的相互作用ペプチドがＰＹＬ１である、請求項９６～９９のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記化学誘導剤がアブシジン酸である、請求項１０１に記載の方法。
  103. 請求項９９～１０２のいずれか一項に記載の方法を実施すること、および請求項９６～１０２のいずれか一項に記載の方法からの比較結果と請求項９９～１０２のいずれか一項に記載の方法の結果を比較すること、および両方法で近接エフェクターポリペプチドであるとして同定されたＯＲＦを同定することをさらに含んでなる、請求項９６～９８のいずれか一項に記載の方法。
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