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JP2583440B2 - 酵素活性測定用の基質及びそれを用いる酵素活性測定方法 - Google Patents

酵素活性測定用の基質及びそれを用いる酵素活性測定方法

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JP2583440B2
JP2583440B2 JP63084054A JP8405488A JP2583440B2 JP 2583440 B2 JP2583440 B2 JP 2583440B2 JP 63084054 A JP63084054 A JP 63084054A JP 8405488 A JP8405488 A JP 8405488A JP 2583440 B2 JP2583440 B2 JP 2583440B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、アミド化合物又はその塩及びアミド化合物
又はその塩を基質とする被検液中のペプチダーゼ、γ−
グルタミルトランスペプチダーゼ及びロイシンアミノペ
プチダーゼの新規な活性測定法に関するものである。
［従来の技術］ ペプチダーゼは一般的にはペプチドのアミド結合に作
用してアミノ末端から切断してアミノ酸又はより低級の
ペプチドを遊離させる酵素の総称として古くから知られ
ている。例えばγ−グルタミルトランスペプチダーゼ、
ロイシンアミノペプチダーゼ、アリルアミダーゼ、シス
チルアミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダー
ゼ、アルギニンアミノペプチダーゼ、アラニンアミノペ
プチダーゼ等の酵素が良く知られている。
上記酵素のうち、特にγ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼ（以下、γ−GTPと記す）、及びロイシンアミノ
ペプチダーゼ、アリルアミダーゼ、シスチルアミノペプ
チダーゼ（以下この３つの酵素を総称してロイシンアミ
ノペプチダーゼ〔LAP〕と呼ぶ）は、生体内の組織に広
く分布し、血清中にも存在し、病的条件によって増加す
るため、診断的価値が大きく、かつ臨床検査上重要な酵
素活性測定項目となっている。
γ−GTPは、1950年、Hanesによりその存在が確認され
た酵素であり、γ−グルタミルペプチドを加水分解する
とともに、γ−グルタミル基を他のペプチドやアミノ酸
に転移させる作用をもつ膜結合酵素である。臨床的には
1960年以降、Orlowski、Goldbargらが、合成基質を用い
て本酵素を測定し、さらに肝・胆道疾患や膵癌等で活性
の上昇を報告して注目され始めた。この酵素の診断的な
意義としては、慢性肝炎、肝硬変症、胆道疾患、肝癌、
アルコール性肝障害、心筋梗塞等でその有用性が示さ
れ、診断的価値が大きく、かつ臨床検査上重要な測定項
目となっている。
LAPは、ペプチドのＮ末端を加水分解してロイシン等
のアミノ酸を遊離させる酵素である。生体内の各組織に
γ−GTPと同様に広く分布し、血清中にも存在する。臨
床的には、Goldbargらが、ロイシル−β−ナフチルアミ
ドを用いて本酵素を測定して臨床応用し、一般に用いら
れるようになった。この酵素の診断的な意義としては、
急性肝炎、肝癌、転移性肝癌、肝硬変症、胆道疾患でそ
の有用性が示され、診断的価値が大きく、かつ臨床検査
上重要な測定項目となっている。
従来より、γ−GTP活性の測定法は多数報告されてい
る。それらの大部分は合成基質よりγ−GTPによって生
成するアミン化合物を比色定量するか、或いは、生成す
るアミン化合物を、さらに別の化合物に誘導し、比色定
量することによりγ−GTP活性値を求める方法である。
合成基質としては、γ−Ｌ−グルタミル−ｐ−ニトロア
ニリドが一般的に使用され、γ−GTPにより生成するｐ
−ニトロアニリンの黄色を410nmで比色定量する方法が
挙げられるが、基質溶解性が低く、何らかの可溶化の手
段を講じる必要があった。通常は基質の溶解に希塩酸や
界面活性剤、有機溶媒等を添加することでこの欠点を解
決している〔特開昭52−29799〕。しかし、この場合で
も基質溶解後の基質の安定性が悪く、又界面活性剤の添
加では生ずる気泡のために測定操作上問題があった。
又、近年、この基質の溶解性を向上させるために、修飾
シクロデキストリン〔特開昭60−160896〕や、クラウン
エーテル〔特開昭60−16599〕等を用いた報告もある
が、それらは高価であるため経済的でない。
更に、この方法は、基質と生成するｐ−ニトロアニリ
ンの吸収スペクトルがオーバー・ラップすることから、
ｐ−ニトロアニリンの極大波長で測定することが不能で
あり、吸収スペクトルの肩で測定しなければならないと
いう欠点があった。又、血清中の共存物質であるビリル
ビンや、溶血の影響も免れることが出来なかった。
上記、γ−Ｌ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドの溶
解性向上のために、γ−Ｌ−グルタミル−３−カルボキ
シ−４−ニトロアニリド〔特開昭49−86338〕が開発さ
れ、基質の溶解性は向上したが、共存物質の影響を解消
するには至っていない。
又、生成するｐ−ニトロアニリンをｐ−ジメチルアミ
ノシンナムアルデヒドと縮合させて比色定量する方法も
あるが、発色感度に対する温度の影響が大きく、測定値
の再現性に問題がある。又、生成するｐ−ニトロアニリ
ンをジアゾ化し、ｍ−キシレノールと縮合させて生ずる
色素を比色定量する方法もあるが、操作段階が多く簡便
性に欠けるという問題がある。
近年、γ−Ｌ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ヒ
ドロキシアニリド、γ−Ｌ−グルタミル−3,5−ジブロ
ム−４−ヒドロキシアニリド等の合成基質も開発され、
γ−GTPによって生成するアニリン化合物を、ｐ−キシ
レノール等と酸化縮合させて生成する色素を比色定量す
る方法が開発されたが、強アルカリや、メタ過ヨウ素酸
塩を用いるため操作性に問題がある。
一方、LAP活性の測定法も多数報告されている。それ
らの大部分は、γ−GTPと同様、合成基質よりLAPによっ
て生成するアミン化合物を比色定量するか、或いは、生
成するアミン化合物をさらに別の化合物に誘導し、比色
定量することでLAP活性値を求める方法である。
例えば、合成基質としてＬ−ロイシル−β−ナフチル
アミドを用いる方法があり、LAPによって生成するβ−
ナフチルアミンを亜硝酸ナトリウムでジアゾ化し、Ｎ−
（１−ナフチル）−エチレンジアミンにカップリングさ
せるか、もしくは、ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデ
ヒドを縮合させて生成する色素を比色定量する方法であ
るが、γ−GTPと同様の欠点を有し、かつ生成するβ−
ナフチルアミンの毒性が著しく、発癌性を有する等の欠
点がある。
又、合成基質としてＬ−ロイシル−ｐ−ニトロアニリ
ドを用いる方法があり、LAPによって生成するｐ−ニト
ロアニリンの黄色を比色定量する方法であるが、これも
γ−GTPと同様、基質の溶解性、生成するｐ−ニトロア
ニリンの吸収の肩で比色定量しなければならない点、血
清中共存物質の影響を免れることができない等の欠点が
ある。
［発明が解決しようとする問題点］ 本発明者らは、かかる欠点を有する従来のγ−GTPやL
AP活性測定法を改良すべく鋭意研究した結果、溶解性に
優れた新規合成基質を見い出した。また、合成基質を使
用し、γ−GTPやLAPの作用により生成した物質をまった
く新しい酸素を用いて定量する方法を開発し、ペプチダ
ーゼ活性の優れた測定法として本発明を完成するに至っ
た。
［問題点を解決するための手段］ 即ち、本発明はペプチダーゼの合成基質として有用な 一般式（Ｉ） （式中、R1はγ−Ｌ−グルタミル基、Ｌ−ロイシル基、
Ｌ−アラニル基、シスチル基、Ｌ−プロリル基又はＬ−
アルギニル基を示し、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲ
ン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ
基、置換アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン
酸基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシア
ルキル基又はスルホアルキル基を示す。
但し、R1がγ−Ｌ−グルタミル基である時に、R2並び
にR3が共に水素原子であること及びR2又はR3の一方が水
素原子であって他方が水酸基であることはない。）で表
わされるアミド化合物又はその塩である。
又、本発明は 一般式（II） （式中、R1はγ−Ｌ−グルタミル基、Ｌ−ロイシル基、
Ｌ−アラニル基、シスチル基、Ｌ−プロリル基又はＬ−
アルギニル基を示し、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲ
ン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ
基、置換アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン
酸基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシア
ルキル基又はスルホアルキル基を示す。）で表わされる
アミド化合物又はその塩に被検液に含有されるペプチダ
ーゼを作用させ、遊離する 一般式（III） （式中、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲン原子、低級
アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ
基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、ニトロ
基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基又は
スルホアルキル基を示す。）で表わされるアミノ安息香
酸又はその誘導体に４−アミノ安息香酸水酸化酵素及び
還元型補酵素を作用させ、その時の該還元型補酵素の減
少の吸光度又は溶存酸素量の消費を測定することを特徴
とするペプチダーゼ活性の測定方法である。
又、本発明は 一般式（IV） （式中、R1はγ−Ｌ−グルタミル基を示し、R2及びR3は
各々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級ア
ルコキシ基、アミノ基、置換アミノ基、水酸基、カルボ
キシル基、スルホン酸基、ニトロ基、ヒドロキシアルキ
ル基、カルボキシアルキル基又はスルホアルキル基を示
す。）で表わされるアミド化合物又はその塩に被検液に
含有されるγ−グルタミルトランスペプチダーゼを作用
させ、遊離する 一般式（III） （式中、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲン原子、低級
アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ
基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、ニトロ
基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基又は
スルホアルキル基を示す。）で表わされるアミノ安息香
酸又はその誘導体に４−アミノ安息香酸水酸化酵素及び
還元型補酵素を作用させ、その時の該還元型補酵素の減
少の吸光度又は溶存酸素量の消費を測定することを特徴
とするγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性の測定
方法である。
又、更に、本発明は 一般式（Ｖ） （式中、R1はγ−Ｌ−グルタミル基、Ｌ−ロイシル基、
Ｌ−アラニル基、シスチル基、Ｌ−プロリル基又はＬ−
アルギニル基を示し、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲ
ン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ
基、置換アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン
酸基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシア
ルキル基又はスルホアルキル基を示す。）で表わされる
アミド化合物又はその塩に被検液に含有されるロイシン
アミノペプチダーゼを作用させ、遊離する 一般式（III） （式中、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲン原子、低級
アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ
基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、ニトロ
基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基又は
スルホアルキル基を示す。）で表わされるアミノ安息香
酸又はその誘導体に４−アミノ安息香酸水酸化酵素及び
還元型補酵素を作用させ、その時の該還元型補酵素の減
少の吸光度又は溶存酸素量の消費を測定することを特徴
とするロイシンアミノペプチダーゼ活性の測定方法であ
る。
本発明において、一般式（Ｉ）で表わされるアミド化
合物又はその塩、一般式（II）で表わされるアミド化合
物又はその塩、一般式（IV）で表わされるアミド化合物
又はその塩及び一般式（Ｖ）で表わされるアミド化合物
又はその塩は、常法によって製造することができる。即
ち、Ｌ−グルタミン酸のγ−カルボキシル基や、Ｌ−ロ
イシンのα−カルボキシル基とアニリン誘導体との縮合
反応により得られる。上記の縮合反応に際し、予め反応
に関与してはならない官能基（−NH2、−COOH等）を通
常の保護基で保護するのがよい。
例えば、Ｌ−グルタミン酸のα−アミノ基及びα−カ
ルボキシル基やＬ−ロイシンのα−アミノ基を保護する
のがよい。アミノ基の保護基としては通常ペプチド合成
に用いられる保護基が用いられる。例えば、フタリル、
ｔ−ブチルオキシカルボニル、カルボベンゾキシ、ベン
ジル、ホルミル基等が挙げられる。カルボキシル基の保
護基としては通常ペプチド合成に用いられる保護基が用
いられる。例えば、メチルエステル、エチルエステル、
ｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、ｐ−ニトロベ
ンジルエステル等が挙げられる。
上記の縮合反応は、予め反応に関与してはならない官
能基を保護した後、常法に従って行うことができる。縮
合反応としては、例えば、酸塩化物、アジド、酸無水
物、混合酸無水物、カルボジイミド、活性エステル、イ
ソシアナート、ホスファゾ、亜リン酸エステル法等が挙
げられる。
縮合反応後の保護基の脱離は、常法に従って行うこと
ができる。例えば、アミノ基の保護基であるフタリル
基、ホルミル基の場合はヒドラジン、ｔ−ブチルオキシ
カルボニル基の場合は塩化水素、カルボベンゾキシ、ベ
ンジル基の場合は接触水素還元、カルボキシル基の保護
基であるメチルエステル、エチルエステルの場合はケン
化、ｔ−ブチルエステルの場合は塩化水素、ベンジルエ
ステル、ｐ−ニトロベンジルエステルの場合は接触水素
還元法等が挙げられる。
上記の縮合反応は適当な溶媒中、例えば、ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキ
シド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ベンゼン、ク
ロロホルム等の不活性有機溶媒中で行うことができ、反
応温度、反応時間は、各縮合反応によって決まる。
本発明における一般式（Ｉ）で表わされるアミド化合
物又はその塩、一般式（II）で表わされるアミド化合物
又はその塩、一般式（IV）で表わされるアミド化合物又
はその塩及び一般式（Ｖ）で表わされるアミド化合物又
はその塩は、必要に応じ、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸
との塩、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ
金属との塩を形成することができる。
上記縮合反応に用いるアニリン誘導体としては、例え
ば、４−アミノ安息香酸、４−アミノ−２−クロル安息
香酸、４−アミノサリチル酸、3,4−ジアミノ安息香
酸、４−アミノフタル酸、４−アミノ−２−ヨード安息
香酸、４−アミノ−２−ブロモ安息香酸、４−アミノ−
２−メチル安息香酸、４−アミノ−2,6−ジメチル安息
香酸、４−アミノ−２−ヒドロキシメチル安息香酸等が
挙げられる。
本発明の一般式（Ｉ）で表わされるアミド化合物又は
その塩、一般式（II）で表わされるアミド化合物又はそ
の塩、一般式（IV）で表わされるアミド化合物又はその
塩及び一般式（Ｖ）で表わされるアミド化合物又はその
塩は、上記の製造法で得ることができるが、その一例を
挙げると、γ−Ｌ−グルタミル−３−クロル−４−カル
ボキシアニリドを製造する場合は、４−アミノ−２−ク
ロル安息香酸とN,N−フタリル−Ｌ−グルタミン酸無水
物をジメチルホルムアミド中で反応させ、反応後、ジメ
チルホルムアミドを減圧留去し、メタノール中でヒドラ
ジンを加え保護基であるフタリル基を脱離させると目的
物が得られる。又、Ｌ−ロイシル−４−カルボキシアニ
リドを製造する場合は、４−アミノ安息香酸とｔ−ブチ
ルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシン−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステルを反応させ、酢酸中、2N塩酸を加
え、保護基であるｔ−ブチルオキシカルボニル基を脱離
させると目的物が得られる。
又、本発明は、一般式（II）で表わされるアミド化合
物又はその塩を基質として用いる新規なペプチダーゼ活
性測定方法、一般式（IV）で表わされるアミド化合物又
はその塩を基質として用いる新規なγ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼ（γ−GTP）活性測定方法及び一般式
（Ｖ）で表わされるアミド化合物又はその塩を基質とし
て用いる新規なロイシンアミノペプチダーゼ（LAP）活
性測定方法を提供するものである。
本発明は、被検液に含有されているペプチダーゼに一
般式（II）で表わされるアミド化合物若しくはその塩を
作用せしめ、又は被検液に含有されているγ−グルタミ
ルトランスペプチダーゼ（γ−GTP）に一般式（IV）で
表わされるアミド化合物若しくはその塩を作用せしめ、
或いは被検液に含有されているロイシンアミノペプチダ
ーゼ（LAP）に一般式（Ｖ）で表わされるアミド化合物
若しくはその塩を作用せしめ、これにより遊離する一般
式（III）で表わされるアミノ安息香酸又はその誘導体
を４−アミノ安息香酸水酸化酵素及び還元型補酵素によ
り一原子酸素添加を行い、還元型補酵素の減少の吸光度
又は溶存酸素量の消費を測定する、新規なペプチダーゼ
活性、γ−GTP活性又はLAP活性の測定方法である。又、
この時同時に生成するアミノフェノール、その誘導体、
更に、二酸化炭素を測定することも可能である。
本発明法の反応式を図示すれば次の通りである。
（式中、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲン原子、低級
アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ
基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、ニトロ
基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基又は
スルホアルキル基を示す。） ４−アミノ安息香酸水酸化酵素は、分子間電子供与体
要求性一原子酸素添加酵素であり、下記の反応を触媒す
る酵素である。〔H.Tsuji,T.Ogawa,N.Bando,K.Sasaoka,
Journal of Biological Chemistry,261，（28）,p.1
3203,1986〕。
（式中、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲン原子、低級
アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ
基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、ニトロ
基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基又は
スルホアルキル基を示す。） 該酵素は特に食用栽培キノコ、例えばアガリカス ビ
スポラス（Agaricus bisporus）等から得られる。本発
明を実施する上で、４−アミノ安息香酸水酸化酵素は、
どのような由来（起源）のものでも良く、最終試液中0.
01単位/ml以上存在すれば良いが、好ましくは0.05〜５
単位/mlが良い。
又、該酵素には、必要によりフラビンアデニンジヌク
レオチド（FAD）を加えて用いても良い。FADはその塩で
も良く、用いる濃度は最終試液中、好ましくは0.0001mM
以上である。
FADに代えてFMN、リボフラビン、リボフラビン−4,5
−環状リン酸、フラビンペプチド、リボフラビングルコ
シド、脂溶性リボフラビン誘導体を用いても良い。
４−アミノ安息香酸水酸化酵素の安定化剤として、必
要により、アルブミン等を加えても良い。アルブミンは
いかなる起源から由来したものでも良く、例えば、牛血
清アルブミン（BSA）、ヒト血清アルブミン（HSA）等が
用いられる。
本発明で用いる還元型補酵素は、還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（NADH）又は、還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）であ
る。NADH又はNADPHは、最終試液中0.05mM以上存在すれ
ば良いが、好ましくは0.1〜0.4mMである。NADH又はNADP
Hは、その塩でも良い。
アミノ安息香酸又はその誘導体を還元型補酵素の減少
により測定する方法としては、NAD（Ｐ）Ｈの吸光度の
減少を連続的に単位時間当たりの吸光度変化（ΔA/mi
n）として測定（レートアッセイ法）するか、一定時間
後に測定するか、或いは、一定時間後に反応阻害剤を加
えて、反応をストップさせて測定（エンドポイント法）
することができる。その他、蛍光法、発光法、免疫法、
電極法等が利用される。
溶存酸素の消費を測定する方法としては、酸素電極等
により測定することができる。アミノフェノール又はそ
の誘電体を測定する方法としては、フェノールやナフト
ール等を用いてインドフェノールとし、その吸光度より
測定できる。
反応温度は10〜45℃程度、好ましくは20〜40℃が良
い。pHは、被検液中のペプチダーゼ活性、γ−GTP活性
又はLAP活性が高く、安定なpH範囲にあれば良い。好ま
しくはpH5〜９が良い。測定する被検液（試料）は、生
物化学的な物質なら何れでも良く、特に血清、尿等が利
用される。次に、γ−GTPの活性測定について更に詳し
く説明する。γ−GTPの活性測定は、一般式（IV）で表
わされるアミド化合物又はその塩に被検液中のγ−GTP
を作用せしめ、遊離する一般式（III）で表わされるア
ミノ安息香酸又はその誘導体をNAD（Ｐ）Ｈ及び４−ア
ミノ安息香酸水酸化酵素の存在下で作用させて、その時
起こるNAD（Ｐ）Ｈの減少を吸光度の減少として測定す
るか、或いは、溶存酸素量の消費を測定することにより
行うことができる。γ−GTPの反応に際しては、受容体
としてアミノ酸やペプチド、例えば、グリシルグリシン
の適当量が用いられる。
pHは、6.5〜9.0、好ましくは７〜８である。緩衝液と
しては、リン酸、有機酸、グリシン、グリシルグリシ
ン、トリス、その他生化学の分野で広く用いられている
もので良い。濃度としては、0.01〜0.5M程度で良い。
次に、LAPの活性測定について更に詳しく説明する。L
APの活性測定は、一般式（Ｖ）で表わされるアミド化合
物又はその塩に被検液中のLAPを作用せしめ、遊離する
一般式（III）で表わされるアミノ安息香酸又はその誘
導体を、γ−GTPの場合と同様NAD（Ｐ）Ｈ及び４−アミ
ノ安息香酸水酸化酵素の存在下でNAD（Ｐ）Ｈの減少を
吸光度の減少として測定するか、或いは、溶存酸素量の
消費を測定することにより行うことができる。
pHは、６〜８が良い。緩衝液としては、上記γ−GTP
と同様である。
［作用効果］ ペプチダーゼの合成基質として有用な本発明の一般式
（Ｉ）で表わされるアミド化合物又はその塩は非常に溶
解性に優れ、従来の合成基質のように溶解性を向上させ
るための手段は特別に必要ない。
又、本発明におけるペプチダーゼ，γ−GTP、及びLAP
の新規活性測定方法は、従来法と比較すると、呈色反応
系を使用せず、NAD（Ｐ）Ｈの吸光度変化の減少で見る
ため、化学量論的に、かつ正確にペプチダーゼ、γ−GT
P又はLAPの活性を測定できる。又、還元型補酵素の極大
吸収波長を測定するため、分光光度計の波長精度、スリ
ット巾に由来する影響もない。
更に、NAD（Ｐ）Ｈの吸光度変化をレートアッセイす
るため、血中共存物質、例えば、ビリルビン、溶血等の
影響を受ける事はない。
又、多量検体処理が可能な自動分析装置に適した、簡
単でかつ迅速な活性測定が可能である等の利点を有す
る。
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は
これらによってなんら限定されるものではない。
実施例１ γ−Ｌ−グルタミル−３−クロル−４−カルボキシアニ
リド・カリウム塩（γ−glu−PAClBK）の合成 N,N−フタリル−Ｌ−グルタミン酸無水物7.78g（30mm
ol）及び４−アミノ−２−クロル安息香酸4.63g（27mmo
l）をジメチルホルムアミド（DMF）30mlに溶かし、65℃
で１時間撹拌した。反応後、DMFを減圧下留去し、残渣
にメタノール50mlを加えて溶解し、80％ヒドラジン−水
和物でpH9.0とし、室温で２日間放置した。析出した沈
澱をメタノール洗浄して、1N塩酸75mlに懸濁させ、室温
で約30分撹拌後、沈澱を瀘別し、瀘液を4N水酸化カリウ
ムでpH3.5とした。生成した沈澱を瀘取し、純水、エタ
ノール、エーテルで洗浄後、純水30mlを加えて懸濁さ
せ、2N水酸化カリウムでpH8.0とした。この溶液をアセ
トニトリル１中に撹拌しながら加え、室温で約１時間
撹拌した。生成した白色沈澱を瀘取し、アセトニトリ
ル、エタノール、エーテルで洗浄後、減圧乾燥した。以
上の操作により、γ−Ｌ−グルタミル−３−クロル４−
４−カルボキシアニリド・カリウム塩3.6gを得た（白色
粉末）。
収率:39％、融点:193〜195℃（分解） シリカゲルTLC:Rf＝0.41（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝
4:1:1） IRチャート（KBr法）：第１図に示す通り。
元素分析値:C12H12N2O5ClK・H2O（分子量356.79） 比施光度▲〔α〕22 D▼：＋22.5（Ｃ＝1.0,1N HCl） ▲〔α〕28 D▼：＋5.6（Ｃ＝1.0,H2O）13 C NMR:第１表及び第２図に示す通り。
実施例２ Ｌ−ロイシル−４−カルボキシアニリド（Ｌ−Leu−PAB
A）の合成 ４−アミノ安息香酸5.49g（40mmol）及びトリエチル
アミン9.11g（90mmol）をジメチルホルムアミド（DMF）
80mlに溶かし、これにｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ
−ロイシン−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル1
4.77g（45mmol）をテトラヒドロフラン120mlに溶解した
溶液を−10℃にて約30分間かけて滴下、１時間撹拌し、
その後、室温にて22時間反応させた。反応後、溶媒を減
圧下留去し、残渣に酢酸エチル400mlを加えて溶解し、
１％炭酸水素ナトリウム、水、1N塩酸、飽和食塩水で洗
浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、酢酸エチルを留
去した。2.4N塩酸／酢酸36mlを加えて15〜20℃にて２時
間撹拌した。乾燥エーテル500mlに加えて白色沈澱を生
成させた。沈澱をロ取し、水30mlに溶解し、水酸化ナト
リウム水溶液でpH7とし、不溶物を除去した後、減圧下
濃縮乾固した。得られた白色粉末をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィー（溶離液、クロロホルム：メタノー
ル：酢酸：水＝14:6:0.5:1）により精製して目的物であ
るＬ−ロイシル−４−カルボキシアニリド（Ｌ−Leu−P
ABA）1gを得た（白色粉末）。
収率:10％、融点:213〜215℃（分解） シリカゲルTLC:Rf＝0.42（クロロホルム：メタノール：
酢酸：水＝14:6:1:1） IRチャート（KBr法）：第３図に示す通り。
元素分析値:C13H18N2O3・2H2O（分子量286.30） 13C NMR:第２表及び第４図に示す通り。
実施例３ Ｌ−ロイシル−３−クロル−４−カルボキシアニリド
（Ｌ−Leu−PAClBA）の合成 ４−アミノ−２−クロル安息香酸6.86g（40mmol）を
用いて実施例２と同様にして合成し、Ｌ−ロイシル−３
−クロル−４−カルボキシアニリド（Ｌ−Leu−PAClB
A）1gを得た（白色粉末）。
収率:9％、融点:120℃以上で分解 シリカゲルTLC:Rf＝0.30（クロロホルム：メタノール：
酢酸：水＝14:6:1:1） IRチャート（KBr法）：第５図に示す通り。
元素分析値:C13H17N2O3Cl・3H2O（分子量338.76） 13C NMR:第３表及び第６図に示す通り。
実施例４ γ−Ｌ−グルタミル−３−クロル−４−カルボキシアニ
リド・カリウム塩（γ−glu−PAClBK）を用いるγ−GTP
活性測定 （１）試薬の調製 Ｒ−Ｉ 100mM グリシルグリシン 0.28mM NADH を含む50mMリン酸−カリウム−水酸化カリウム緩衝液
（pH7.0）を100ml調製する。
Ｒ−II 100mM グリシルグリシン 50mM γ−glu−PAClBK 2.5U/ml ４−アミノ安息香酸水酸化酵素 100μＭ FAD 0.1％ BSA を含む50mMリン酸−カリウム−水酸化カリウム緩衝液
（pH7.0）を100ml調製する。
（２）測定操作法 Ｒ−I 400μと血清50μを取り、37℃で５分間加
温し、Ｒ−II 100μを加えて、直ちに37℃で340nmに
おける単位時間あたりの吸光度の減少を測定する。γ−
GTP活性値は下記式により計算される。（試薬ブランク
は血清のかわりに純水を用いる。） ΔA340/minは、１分間当たりの340nmにおける吸光度の
変化量 NADHの分子吸光係数は、6.22×103 得られた結果を、従来のγ−グルタミル−ｐ−ニトロ
アニリド法と比較して第４表に示した。従来法とよく相
関した結果が得られた。
又、γ−GTP高単位の血清を段階希釈して、上記と同
様に行なった結果を第７図に示した。原点を通る直線関
係が得られ、血清γ−GTPが正確に測定されている結果
が示された。
実施例５ γ−Ｌ−グルタミル−４−カルボキシアニリド・カリウ
ム塩（γ−glu−PABK）を用いるγ−GTP活性測定 （１）試薬の調製 Ｒ−Ｉ 実施例４と同様である。
Ｒ−II 実施例４のＲ−IIの50mMγ−glu−PAClBKのか
わりに50mMγ−glu−PABK、2.5U/ml4−アミノ安息香酸
水酸化酵素を1.7U/mlとする。他は同様である。
（２）測定操作法 実施例４と同様である。得られた結果を従来のγ−グ
ルタミル−ｐ−ニトロアニリド法と比較して第５表に示
した。従来法とよく相関した結果が得られた。
又、γ−GTP高単位の血清を段階希釈して、上記と同
様に行った結果を第８図に示した。血清γ−GTPが良好
に測定される結果が得られた。
実施例６ Ｌ−ロイシル−４−カルボキシアニリド（Ｌ−Leu−PAB
A）を用いるLAP活性測定 （１）試薬の調製 Ｒ−Ｉ 0.28mM NADH を含む50mMリン酸−カリウム−水酸化カリウム緩衝液
（pH7.0）を100ml調製する。
Ｒ−II 15mM Ｌ−Leu−PABA 2.0U/ml ４−アミノ安息香酸水酸化酵素 100μＭ FAD 0.1％ BSA を含む50mMリン酸−カリウム−水酸化カリウム緩衝液
（pH7.0）を100ml調製する。
（２）測定操作法 Ｒ−I 400μと血清50μを取り、37℃で３分間加
温し、Ｒ−II 100μを加えて、直ちに37℃で340nmに
おける単位時間あたりの吸光度の減少を測定する。LAP
活性値は下記式により計算される。（試薬ブランクは血
清のかわりに純水を用いる。） ΔA340/minは、１分間当たりの340nmにおける吸光度の
変化量 NADHの分子吸光係数は、6.22×103 LAP高単位の血清を段階希釈して、測定した結果を第
９図に示した。血清LAPが良好に測定される結果が得ら
れた。
実施例７ Ｌ−ロイシル−３−クロル−４−カルボキシアニリド
（Ｌ−Leu−PAClBA）を用いるLAP活性測定 （１）試薬の調製 Ｒ−Ｉ 実施例６と同様である。
Ｒ−II 実施例６のＲ−IIの15mM L−Leu−PABAのかわ
りに15mM L−Leu−PAClBA、2.0U/ml 4−アミノ安息香酸
水酸化酵素を3.5U/mlとする。他は同様である。
（２）測定操作方法 実施例６と同様である。
LAP高単位の血清を段階希釈して、測定した結果を第1
0図に示した。血清LAPが良好に測定される結果が得られ
た。
実施例８ γ−glu−PAClBKを用いる酸素センサーによるγ−GTP活
性測定 （１）試薬の調製 実施例４と同様である。
（２）測定操作法 Ｒ−I:R−II:4:1の割合で混合し、測定液とする。測
定液を37℃になるまで加温し、これを酸素センサーが接
しているセル内に導入し血清を100μ添加する。この
時の酸素濃度の消費を酸素センサー（スタットグルコー
スアナライザーＳ−80:AIC社製）により測定する。
（３）γ−GTP活性値単位換算 単位既知の血清（標準血清）100μを上記測定法と
同様に操作し、その測定値との比で表わす。
γ−GTP高単位の血清を段階希釈して、測定した結果
を第11図に示した。血清γ−GTPが良好に測定される結
果が得られた。
実施例９ Ｌ−Leu−PAClBAを用いる酸素センサーによるLAP活性測
定 （１）試薬の調製 実施例７と同様である。
（２）測定操作法 実施例８と同様である。
（３）LAP活性値単位換算 実施例８と同様である。
LAP高単位の血清を段階希釈して、測定した結果を第1
2図に示した。血清LAPが良好に測定される結果が得られ
た。
【図面の簡単な説明】
第１図はγ−Ｌ−グルタミル−３−クロル−４−カルボ
キシアニリド・カリウム塩のIRスペクトル、第２図はγ
−Ｌ−グルタミル−３−クロル−４−カルボキシアニリ
ド・カリウム塩の13C NMRスペクトル、第３図はＬ−ロ
イシル−４−カルボキシアニリドのIRスペクトル、第４
図はＬ−ロイシル−４−カルボキシアニリドの13C NMR
スペクトル、第５図はＬ−ロイシル−３−クロル−４−
カルボキシアニリドのIRスペクトル、第６図はＬ−ロイ
シル−３−クロル−４−カルボキシアニリドの13C NMR
スペクトル、第７図は実施例４における検量線、第８図
は実施例５における検量線、第９図は実施例６における
検量線、第10図は実施例７における検量線、第11図は実
施例８における検量線、第12図は実施例９における検量
線を示すものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/37 1/48 7823−4Ｂ 1/48 Ａ (56)参考文献 特開 昭54−157691（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−69549（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−158745（ＪＰ，Ａ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式（Ｉ） （式中、R1はγ−Ｌ−グルタミル基、Ｌ−ロイシル基、
    Ｌ−アラニル基、シスチル基、Ｌ−プロリル基又はＬ−
    アルギニル基を示し、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲ
    ン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ
    基、置換アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン
    酸基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシア
    ルキル基又はスルホアルキル基を示す。 但し、R1がγ−Ｌ−グルタミル基である時に、R2並びに
    R3が共に水素原子であること及びR2又はR3の一方が水素
    原子であって他方が水酸基であることはない。）で表わ
    されるアミド化合物又はその塩。
  2. 【請求項２】一般式（II） （式中、R1はγ−Ｌ−グルタミル基、Ｌ−ロイシル基、
    Ｌ−アラニル基、シスチル基、Ｌ−プロリル基又はＬ−
    アルギニル基を示し、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲ
    ン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ
    基、置換アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン
    酸基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシア
    ルキル基又はスルホアルキル基を示す。）で表わされる
    アミド化合物又はその塩に被検液に含有されるペプチダ
    ーゼを作用させ、遊離する 一般式（III） （式中、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲン原子、低級
    アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ
    基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、ニトロ
    基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基又は
    スルホアルキル基を示す。）で表わされるアミノ安息香
    酸又はその誘導体に４−アミノ安息香酸水酸化酵素及び
    還元型補酵素を作用させ、その時の該還元型補酵素の減
    少の吸光度又は溶存酸素量の消費を測定することを特徴
    とするペプチダーゼ活性の測定方法。
  3. 【請求項３】一般式（IV） （式中、R1はγ−Ｌ−グルタミル基を示し、R2及びR3は
    各々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級ア
    ルコキシ基、アミノ基、置換アミノ基、水酸基、カルボ
    キシル基、スルホン酸基、ニトロ基、ヒドロキシアルキ
    ル基、カルボキシアルキル基又はスルホアルキル基を示
    す。）で表わされるアミド化合物又はその塩に被検液に
    含有されるγ−グルタミルトランスペプチダーゼを作用
    させ、遊離する 一般式（III） （式中、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲン原子、低級
    アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ
    基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、ニトロ
    基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基又は
    スルホアルキル基を示す。）で表わされるアミノ安息香
    酸又はその誘導体に４−アミノ安息香酸水酸化酵素及び
    還元型補酵素を作用させ、その時の該還元型補酵素の減
    少の吸光度又は溶存酸素量の消費を測定することを特徴
    とするγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性の測定
    方法。
  4. 【請求項４】一般式（Ｖ） （式中、R1はγ−Ｌ−グルタミル基、Ｌ−ロイシル基、
    Ｌ−アラニル基、シスチル基、Ｌ−プロリル基又はＬ−
    アルギニル基を示し、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲ
    ン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ
    基、置換アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン
    酸基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシア
    ルキル基又はスルホアルキル基を示す。）で表わされる
    アミド化合物又はその塩に被検液に含有されるロイシン
    アミノペプチダーゼを作用させ、遊離する 一般式（III） （式中、R2及びR3は各々水素原子、ハロゲン原子、低級
    アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ
    基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、ニトロ
    基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基又は
    スルホアルキル基を示す。）で表わされるアミノ安息香
    酸又はその誘導体に４−アミノ安息香酸水酸化酵素及び
    還元型補酵素を作用させ、その時の該還元型補酵素の減
    少の吸光度又は溶存酸素量の消費を測定することを特徴
    とするロイシンアミノペプチダーゼ活性の測定方法。
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JPS5569549A (en) * 1978-11-16 1980-05-26 Nitto Boseki Co Ltd Novel substrate for determination of enzyme activity
JPS56158745A (en) * 1980-05-13 1981-12-07 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd L-gamma-glutamyl-3-carboxy-4-aminoanilide derivative and its preparation

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