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JP2738414B2 - 腫瘍細胞に細胞障害性物質を供給するためのプロドラッグと組合せた抗体−酵素結合体 - Google Patents

腫瘍細胞に細胞障害性物質を供給するためのプロドラッグと組合せた抗体−酵素結合体

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JP2738414B2
JP2738414B2 JP63194308A JP19430888A JP2738414B2 JP 2738414 B2 JP2738414 B2 JP 2738414B2 JP 63194308 A JP63194308 A JP 63194308A JP 19430888 A JP19430888 A JP 19430888A JP 2738414 B2 JP2738414 B2 JP 2738414B2
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prodrug
conjugate
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tumor
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術的分野 本発明は抗体−酵素結合体およびプロドラッグの組合
せ使用により腫瘍細胞障害性物質を供給する新規な方法
に関する。より詳しくは、本発明は腫瘍細胞に結合する
腫瘍特異性抗体−酵素結合体の投与、および腫瘍部位に
おいて抗体結合酵素の存在下に活性細胞障害性薬物に転
化されるプロドラッグの追加投与により腫瘍の部位に細
胞障害性薬物を供給する方法に関する。本発明の方法、
抗体−酵素結合体およびプロドラッグは癌および他の腫
瘍の治療に現在使用される抗体仲介薬物供給系の欠点を
多く克服する。
発明の背景 癌の治療において腫瘍細胞に細胞障害性物質を選択的
に供給するための免疫結合体の使用が知られている。腫
瘍細胞の部位に対する細胞障害性物質の供給は、これら
の物質の全身性投与がしばしば体内の正常細胞および排
除しようとする腫瘍細胞の死を生ずるので非常に望まし
い。従って、現在使用される抗腫瘍薬物供給系によれ
ば、細胞障害性物質を腫瘍特異性抗体に結合させて腫瘍
細胞に結合させ、それにより腫瘍部位に細胞障害性物質
を「供給する」免疫結合体を形成させる。これらの標的
指向系に使用される免疫結合体には抗体−薬物結合体
〔例えば、ボルドウイン（R.W.Baldwin）ほか、「癌治
療に対する単クローン性抗体」、ランセット（Lance
t）、pp603〜05（1986年３月15日）参照〕および抗体−
毒素結合体〔例えば、ソープ（P.E.Thorpe）、「癌療法
における細胞障害性物質の抗体担体：総説」、「モノク
ローナル・アンティボディーズ'84:バイオロジカル・ア
ンド・クロニカル・アプリケーションズ（Monoclonal A
ntibodies '84:Biological And Clinical Application
s）」，ピンチエラ（A.Pinchera）ほか編、pp475〜506
（1985）参照〕が含まれる。
多クローン性抗体および単クローン性抗体の両方がこ
れらの免疫結合体に利用された〔例えば、オーカワ（K.
Ohkawa）ほか、「ヒト血清アルブミンよりマイトマイシ
ンＣと結合したヒトα−フェトプロテインに対する精製
抗体によるヒト卵黄嚢腫瘍細胞系に対する選択的試験管
内および生体内増殖阻止」、カンサー・イムノロジー・
アンド・イムノセラピー（Cancer Immunol.Immunothe
r.）,23、pp81〜86（1986）およびローランド（G.F.Row
land）ほか、「ヒト腫瘍異種移植片におけるビンデシン
−単クローン性抗CEA結合体の薬物局在化および増殖阻
止研究」、カンサー・イムノロジー・アンド・イムノセ
ラピー（Cancer Immunol.Immunother.）,21、pp183〜87
（1986）参照〕。これらの免疫結合体に使用された薬物
にはダウノマイシン〔例えば、ガレゴ（J.Gallego）ほ
か、「抗腫瘍活性を有する４ダウノマイシン−単クロー
ン性抗体791T/36結合体の調製」、インタナショナル・
ジャーナル・オブ・カンサー（Int.J.Cancer）,33、pp7
34〜44（1984）およびアーノン（R.Arnon）ほか、「ダ
ウノマイシンと抗腫瘍抗体との結合体の試験管内および
生体内効力」、イムノロジカル・レビューズ（Immunolo
gical Rev.）,62、pp5〜27（1982）参照〕、メトトレキ
サート〔エンドー（N.Endo〕ほか、「メトトレキサート
と抗MM46単クローン性抗体とのヒト血清アルブミン仲介
結合体の試験管内細胞毒性」、カンサー・リサーチ（Ca
ncer Research）,47、pp1076〜80（1987）〕、マイトマ
イシンＣ〔オーカワ（K.Ohkawa）ほか、前掲〕、および
ビンデシン〔ローランド（G.F.Roland）ほか、前掲〕が
含まれる。抗体−毒素結合体に使用された毒素には細胞
毒素例えばジフテリア毒素および植物毒素例えばリシン
が含まれる〔例えば、ムールテン（F.L.Moolten）ほ
か、「特異性抗腫瘍物質としての強力細胞毒に結合した
抗体」、イムノロジカル・レビューズ（Immunol.Re
v.）,62、pp47〜73（1982）参照〕 治療目的に対する免疫結合体の使用を指向する多くの
研究にもかかわらず、これらの供給法に含まれる若干の
制限が明らかになった〔例えば、エンブレトン（M.J.Em
bleton），「単クローン性抗体による抗癌治療剤の標的
指向」、バイオケミカル・ソサイエティー・トランスア
クションズ（Biochemical Society Transactions）,1
4、pp393〜395〔第615会議（615th Meeting,Belfast）1
986〕参照〕。第１に、細胞の表面上の腫瘍関連抗原の
数および所与抗体分子に結合できる薬物分子の数により
課せられる制約のため、細胞を殺害を行なうために標的
腫瘍細胞に供給されることが必要である多量の薬物がし
ばしば得られることができない。この制約がこれらの結
合体中の一層強力な細胞障害性物質例えば植物毒素の使
用、および非常に高い薬物多重比を有するポリマー結合
抗体−薬物結合体の開発をもたらした〔例えば、ソープ
（P.E.Thorpe），前掲、pp475〜506およびボルドウイン
（R.W.Baldwin）ほか、「単クローン性抗体791T/36−メ
トトレキサート結合体の設計および治療評価」、モノク
ローナル・アンティボディーズ・アンド・カンサー・セ
ラピー（Monoclonal Antibodies and Cancer Therap
y）,pp215〜31、アラン・Ｒ・リス社（Alan R.Liss In
c.），（1985）参照〕。しかし、大薬物装填比または強
力毒素の使用でも、多くの免疫結合体はなお次善的細胞
障害活性を示し、すべての利用可能抗原部位が飽和され
る用量で完全な殺害を行なうことができない。
第２に、免疫結合体の細胞障害活性がしばしば結合体
の抗体成分により仲介された腫瘍細胞中へのその取込み
に依存する〔例えば、ランベルト（J.M.Lambert）ほ
か、「ヒトリンパ系細胞と反応性である精製免疫毒
素」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）,260（No.22）pp12035〜12041（198
5）参照〕。この内在化は薬物が細胞内作用部位を有す
る抗体−薬物結合体を用いるとき、または抗体−毒素結
合体を用いるときに決定的である。しかし大多数の腫瘍
関連抗原、従ってこれらの抗原に結合した抗体−薬物ま
たは抗体−毒素結合体は内在化されない。内在化される
結合体はしばしば細胞のリソソームに輸送され、そこで
薬物または毒素が分解される〔ビテッタ（E.S.Vitett
a）ほか、サイエンス（Science）,238、pp1098〜1104
（1987）参照〕。従って、抗体−薬物または抗体−毒素
結合体が優れた腫瘍結合特性を有することができるけれ
ども、それにもかゝわらず結合体は細胞内のその作用部
位に到達できないために限定された細胞障害利用性を有
することができる。
さらに、腫瘍細胞集団はしばしば抗原発現に関して不
均一である〔例えば、アルビノ（A.P.Albino）ほか、
「同一患者の種々の黒色腫転移由来の細胞系の表面抗原
および糖タンパク質発現の不均一性」、ジャーナル・オ
ブ・エクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）,1
54、pp1764〜78（1981）参照〕。さらに、抗原陽性腫瘍
細胞が抗原陰性後代を生ずることができることが示され
た〔例えば、イエー（M.Yeh）ほか、「単クローン性抗
体により示されたヒト黒色腫抗原の発現に対するクロー
ン変異」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immuno
l.）,126（No.4）,pp.1312〜17（1981）参照〕。従っ
て、腫瘍細胞の任意の集団中に特定免疫結合体が特異的
である抗原を有しない一定数の細胞が存在する。従っ
て、免疫結合体はこれらの細胞に結合してそれらの殺害
を仲介することができない。
これらの欠点のために、現在利用される抗腫瘍薬物ま
たは毒素の供給系は、殊に生体内治療に用いたときに限
定量の達成を有した。
前記免疫結合体に加えて、抗体−酵素結合体が抗体仲
介細胞毒性を増幅させるためにヨウ化物またはアルスフ
ェナミンをそれらの毒性形態に転化する第２非標的指向
酵素と組合せて試験管内で研究された〔例えば、パーカ
ー（C.W.Parker）ほか「ルミノール置換ペプチドおよび
タンパク質の酵素活性化および捕捉。抗腫瘍抗体の細胞
毒性を増幅する可能な手段」、プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA,72（No.1）、pp.338〜42
（1975）およびフィルポット（G.W.Philpott）ほか、
「抗体−グルコースオキシダーゼ結合体、ペルオキシダ
ーゼおよびアルスフェナミンによる腫瘍細胞のアフィニ
ティー細胞毒性」、カンサー・リサーチ（Cancer Resea
rch）,34、pp.2159〜64（1974）参照〕。
これらの試験管内研究によれば、酵素グルコースオキ
シダーゼが抗体に結合され、ヨウ化物またはアルスフェ
ナミンをそれぞれ細胞障害性ヨウ素またはヒ素に転化す
る非標的指向化ペルオキシダーゼ酵素と組合せて使用さ
れる。従って、この方法は抗体でグルコースオキシダー
ゼを腫瘍細胞に標的指向させるだけでなく、また２つの
他の非標的指向化物質が腫瘍部位に存在することを必要
とする。これらの物質の３つすべてが生体内に、腫瘍部
位に同時に存在する可能性は小なく、従ってこの方法は
治療に重要であるとは思われない。
ヤンセン（F.Jansen）ほかに対し1987年１月20日に発
行されたカナダ国特許第1,216,791号には基質からアン
モニウムイオンを遊離できる酵素の抗体に対する結合が
開示されている。次いでアンモニウムイオンが腫瘍部位
を標的した一定免疫毒素の細胞障害性作用を増強すると
いわれる。
最後に、欧州特許出願第84302218.7号には抗体が腫瘍
細胞に対する非代謝性抗原の標的指向に使用される疾患
細胞集団例えば腫瘍を治療する方法が開示されている。
抗原は少くとも一部の腫瘍細胞内に蓄積し、次いでそれ
が溶解して腫瘍部位に形成された汎在フイブロネクチン
捕捉マトリックス中へ抗原を遊離する。発明の方法にお
けるこの時点で、マトリックスに結合した抗原に特異性
でそれに結合するヨウ素含有配位子が投与される。次い
で細胞障害性ヨウ素がその部位に作用して腫瘍細胞を殺
す。多くの他の態様がこの出願に開示され、その１つは
抗体−酵素結合体を腫瘍部位に対する酵素の標的指向に
使用すること、および酵素が細胞障害性物質に転化でき
る非致死基質を添加することを示唆している〔欧州特許
出願、pp.34〜35参照〕。しかし、その出願のどこにも
この態様がいかに実施されるか開示していない。同様
に、ヘルストロム（Hellstrom）ほか、「薬物供給のた
めの抗体」、コントロールド・ドラグ・デリベリー（Co
ntrolled Drug Delivery）（２版）、ロビンソンほか
（Robinson and Lee）編、p.639（1987）、は「腫瘍に
局在化された物質（例えば酵素）による「活性化」まで
非毒性である薬物を他の方法として考えることができ
る」ことを示唆している。
しかし今日まで、こゝに提供される方法がどのように
実施できるかだれも開示または示唆しておらず、また薬
物を標的指向させるこの方法をだれも実際に試みなかっ
た。
発明の概要 本発明は抗体−酵素結合体およびプロドラッグの組合
せ使用により細胞障害性物質を腫瘍細胞に供給する新規
な方法を提供することにより前記問題を処理する。本発
明によれば、貧または非細胞障害性プロドラッグを活性
細胞障害性薬物に転化できる酵素が腫瘍特異性抗体に結
合される。この抗体−酵素結合体が腫瘍をもつ哺乳動物
宿主に投与され、抗体特異性に基いて抗体が特異性であ
る腫瘍抗原を有する腫瘍細胞の表面に結合する。次いで
プロドラッグが宿主に投与され、腫瘍部位で抗体結合酵
素の作用により一層活性な細胞障害性薬物に転化させ
る。
本発明はまた、一連のプロドラッグを単一抗体結合酵
素により活性化させる細胞障害性薬物を腫瘍細胞に供給
する方法を包含する。さらに、一連の異なる免疫結合
体、すなわち種々の酵素を含む腫瘍特異性抗体を本発明
に従って使用し、腫瘍の治療のために多くの種々のプロ
ドラッグをそれらの一層細胞障害性の形態に転化させる
ことができる。あるいは、結合体の抗体成分の特異性が
異なる、すなわち各免疫結合体が腫瘍細胞上の異なる抗
原部位に対する抗体を含む一連の異なる免疫結合体を本
発明に従って用いて、プロドラッグまたは多くのプロド
ラッグを一層活性な細胞障害性形態に転化させることが
できる。
本発明の好ましい態様によれば、酵素、アルカリ性ホ
スファターゼ（「AP」）を含む抗体−酵素結合体が腫瘍
細胞の殺害を行なうために新規プロドラッグ、エトポシ
ド−４′−ホスフェートまたは７−（２′−アミノエチ
ルホスフェート）マイトマイシンあるいはそれらの組合
せとともに使用された。本発明の他の態様によれば、酵
素ペニシリンＶアミダーゼ（「PVA」）を含む抗体−酵
素結合体が腫瘍細胞の殺害を行なうために新規プロドラ
ッグ、Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチル）アド
リアマイシンとともに使用された。本発明のなお他の態
様によれば、腫瘍細胞を殺すための、酵素シトシンデア
ミナーゼ（CD）を含む抗体−酵素結合体のプロドラッ
グ、５−フルオロシトシンと組合せた使用に関する。
本発明の免疫結合体およびプロドラッグは抗腫瘍組成
物例えば本発明の少くとも１種の免疫結合体またはプロ
ドラッグの薬学的に有効な量および薬学的に許容される
担体を含む組成物で使用することができる。さらに、免
疫結合体およびプロドラッグは組合せて哺乳動物を本発
明の組成物の薬学的に有効な量で処置する段階を含む哺
乳動物における腫瘍を治療する方法に使用することがで
きる。
有利には、本発明の方法、免疫結合体、プロドラッ
グ、薬学的組成物および組合せは、細胞障害性薬物を腫
瘍細胞に供給し、高い選択的細胞毒性を可能にし、普通
の抗体指向免疫療法技術に固有の不均一抗原発現、抗原
／抗体内在化および不十分な薬物抗力の問題を回避する
比較的簡単で直接的な方法を提供する。
図面の簡単な説明 第１図は抗体−酵素結合体を結合する腫瘍細胞におい
てプロドラッグを活性化するために用いる方策を示す。
第２図は（Ａ）96.5-AP免疫結合体；（Ｂ）L6-AP免疫
結合体；（Ｃ）AP;（Ｄ）単クローン性抗体96.5;および
（Ｅ）単クローン性抗体L6のSDS−ポリアクリルアミド
ゲル分析（５〜12.5％勾配ゲル、非還元性）を示す。
第３図は本発明のエトポキシドホスフェートおよびエ
トポシドチオホスフェートプロドラッグの調製および加
水分解を示す。
第４図は（Ａ）エトポシド−４′−ホスフェート単独
すなわちAPまたはAP-L6結合体の存在しない；（Ｂ）エ
トポシド単独；（Ｃ）エトポシド−４′−ホスフェート
プロドラッグとAPとの反応の５分後に生じた生成物、お
よび（Ｄ）エトポシド−４′−ホスフェートプロドラッ
グと本発明のL6-AP結合体との反応の５分後に生じた生
成物の高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）（254nmモ
ニター）を示す。
第５図はエトポシド−４′−ホスフェートまたはエト
ポシド−４′−チオホスフェートのアルカリ性ホスファ
ターゼに対する暴露による時間に関するエトポシド遊離
の割合を示す比較図である。
第６図はL6および96.5単クローン性抗体並びに本発明
のL6-APおよび96.5-AP結合体のH3347腫瘍細胞に対する
比較結合を示す。
第７図はL6および1F5単クローン性抗体並びに本発明
のL6-APおよび1F5-AP結合体のH3347腫瘍細胞に対する比
較結合を示す。
第８図はエトポシドまたはエトポシドホスフェートプ
ロドラッグのモル濃度に対する殺された腫瘍細胞の割合
を示す比較図である。グラフは比較的細胞障害性でない
プロドラッグと本発明のL6-AP結合体または96.5-AP結合
体との反応から生ずる高割合の殺害を示す。
第９図は◎：エトポシド、○:EP、□:L6−AP＋EP、ま
たは■:1F5−AP＋EPで処理したH3347腫瘍細胞のDNA中へ
の3H−チミジン取込みのパーセント阻止を示す比較図で
ある。グラフはEP単独で処理したときに認められる活性
を比べて腫瘍細胞をL6-APおよびEPで処理したときに認
められた細胞障害活性の増加を示す。
第10図は非処置または本発明の結合体で処置した腫瘍
中のホスファターゼ活性の分析を示す。第10A図は非処
置マウスと比較した24時間早く本発明のL6-AP結合体で
処置したマウス中の時間に関するH3347腫瘍の全ホスフ
ァターゼ活性を示す。第10B図は非処置あるいはL6-APま
たは1F5-AP前処理マウスのヘマトキシリンおよびエオシ
ンまたはAP基質で染色した腫瘍断面を示す。暗黒色領域
が高いホスファターゼ活性を示す。
第11図は●：非処置あるいは○：エトポキド、■:E
P、□:1F5−AP＋EPまたは▲:L6−AP＋EPで処置したマウ
ス中の時間に関する腫瘍容積を示す比較図である。矢印
は薬物処置の開始を示し、適用できる場合に結合体を18
〜24時間早く投与した。グラフはL6-APおよびEP処置で
認められた顕著な抗腫瘍効果を示す。
第12図は新規プロドラッグ、７−（２′−アミノエチ
ルホスフェート）マイトマイシン（「MOP」）を含む本
発明により用いたマイトマイシン誘導体の化学構造を示
す。
第13図はMOPとアルカリ性ホスファターゼ酵素との反
応を時間に関して示す。反応の経過はHPLCによりMOH、M
OPのマイトマイシンアルコール誘導体、の遊離について
モニターした。
第14図はL6および1F5単クローン性抗体並びに本発明
のL6-APおよび1F5-AP結合体のH2981腫瘍細胞に対する比
較結合を示す。
第15図は▲：エトポシド、■:EP、□:AP＋EP、●:L6
−AP＋EP、または○:1F5−AP＋EPで処理したH2981腫瘍
細胞のDNA中への3H−チミジン取込みのパーセント阻止
を示す比較図である。グラフは腫瘍細胞を本発明のL6-A
P結合体で前処理したときに認められた、EP単独に比べ
た細胞障害活性の増加を示す。
第16図は□：マイトマイシンＣ（MMC）、▲:MOH、■:
MOP、△:MOP＋AP、●:L6−AP＋MOPまたは1F5−AP＋MOP
で処理したH2981腫瘍細胞のDNA中への3H−チミジン組込
みのパーセント阻止を示す比較図である。グラフはMOP
単独で処理したときに認められる活性に比べて腫瘍細胞
を本発明のL6-AP結合体で前処理し次にMOP処理したとき
に認められた細胞障害性活性の増加を示す。
第17図は▲:MMC、□:MOH、■:MOP、●:L6−AP＋MOPま
たは○:1F5−AP＋MOPで処理したCEM細胞のDNA中への3H
−チミジン取込みのパーセント阻止を示す比較図であ
る。このグラフはL6抗原の存在しないCEM細胞で有意な
増大が認められないので第16図に認められた増大された
細胞毒性の特異性を示す。
第18図は●：非処置（対照）、あるいは■:MOH、○:M
OP、▲:1F5−AP＋MOHまたは□:L6−AP＋MOPで処置した
マウス中の時間に関する腫瘍容積を示す比較図である。
矢印は間をあけた薬物処置を示し、適用できる場合に結
合体は各薬物処置より18〜24時間早く投与した。グラフ
はL6−AP＋MOPによる腫瘍の処置で認められた顕著な腫
瘍効果を示す。
第19図は■：非処置（対照）、あるいは□:MOP/EP、
○:1F5−AP＋MOP/EPまたは●:L6−AP＋MOP/EPで処置し
たマウス中の時間に関する腫瘍容積を示す比較図であ
る。矢印は間をあけた薬物処置を示し、適用できる場合
に結合体は各薬物処置より18〜24時間早く投与した。グ
ラフは本発明のL6-AP結合体およびプロドラッグ、MOPお
よびEPの組合せによる腫瘍の処置で認められた顕著な抗
腫瘍効果を示す。
第20図は本発明のアドリアマイシンプロドラッグ
（「APO」）の化学構造およびそのアドリアマイシンか
らの調製を示す。
第21図はAPOと△：遊離ペニシリンＶアミダーゼ酵素
または○および□：本発明のL6-PVA結合体のそれぞれ10
および100μｇ全タンパク質/mlとの反応で遊離されたア
ドレアマイシンの割合を時間に関して示す比較図であ
る。反応の経過はHPLCによりモニターした。
第22図はL6単クローン性抗体並びに本発明のL6-PVAお
よび1F5-PVA結合体のH2981腫瘍細胞に対する比較結合を
示す。
第23図は○：アドレスアマイシン（ADM）、●:APO、
△:L6−PVA＋APOまたは▲:1F5−PVA＋APOで処理したH29
81腫瘍細胞のDNA中への3H−チミジン取込みのパーセン
ト阻止を示す比較図である。グラフはAPO単独で処理し
たときに認められた活性に比べて腫瘍細胞をL6-PVA結合
体で前処理し次いでAPOで処理したときに認められた細
胞障害活性の増加を示す。
第24図はL6および1F5単クローン性抗体並びに本発明
のL6-PVAおよび1F5-PVA結合体のドージ（Daudi）リンパ
腫細胞に対する比較結合を示す。
第25図は●:ADM、○:APO、■:L6−PVA＋APOまたは□:
1F5−PVA＋APOで処理したドージリンパ腫細胞のDNA中へ
の3H−チミジン取込みのパーセント阻止を示す比較図で
ある。グラフはAPO単独で細胞を処理して認められた細
胞障害性効果に比べて腫瘍細胞を1F5−PVA結合体で前処
理し次いでAPO処理したときに認められた細胞障害活性
の増加を示す。
第26図は５−フルオロシトシン（「5-FC」）および５
−フルオロウラシル（「5-FU）の化学構造を示す。5-FC
は本発明の方法により5-FUに転化されるプロドラッグで
ある。
第27図はシトシン（cyto）の●:CD、○:L6-CDまたは
■:1F5-CDとの反応で、あるいは5FCの□:CD、▲:L6-CD
または△:1F5-CDとの反応で形成された生成物の量を時
間に関して示す比較グラフである。基質としてシトシン
を用いて形成された生成物はウラシルであり、基質とし
て5-FCを用いて形成された生成物は5-FUであった。反応
の経過は分光測光でモニターした。
第28図はL6単クローン性抗体並びに本発明のL6-CDお
よび1F5-CD結合体のH2981腫瘍細胞に対する比較結合を
示す。
第29図は●:5-FU、□:5-FC、○:L6−CD＋５−FCまた
は■:1F5−CD＋５−FCで処理したH2981腫瘍細胞のタン
パク質中への3H−ロイシン取込みのパーセント阻止を示
す比較図である。グラフは5-FC単独で処理して認められ
た活性に比べて腫瘍細胞をL6-CD結合体で前処理し次に5
-FC処理したときに認められた細胞障害性活性の増加を
示す。
発明の詳細な説明 本発明は細胞障害性物質を腫瘍細胞に供給する新規な
方法に関し、癌例えば癌腫および黒色腫、並びに他の腫
瘍の治療における腫瘍細胞の高い選択的殺害を与える。
本発明の方法によれば、抗体−酵素結合体が腫瘍をも
つ哺乳動物宿主に投与される。この抗体−酵素結合体
は、親薬物よりも腫瘍細胞に対する細胞障害性の低いプ
ロドラッグを一層活性な親化合物に転化できる酵素に結
合した腫瘍特異性抗体からなる。宿主中に導入されると
腫瘍細胞上に認められる抗原と反応性である結合体の抗
体成分が結合体を腫瘍の部位に向かわせて腫瘍細胞に結
合する。従って抗体が腫瘍の部位に酵素を供給すると考
えることができる。次いで酵素に対する基質であるプロ
ドラッグが宿主に導入され、腫瘍部位で酵素により活性
な細胞障害性薬物に転化される。従って薬物が細胞外で
活性化され、その部位ですべての腫瘍細胞、すなわち結
合体の抗体が特異性であり抗体が結合する特定腫瘍抗原
をもつ細胞並びにその抗原に陰性であるがしかしそれに
もかゝわらず腫痛の部位に存在する細胞、中へ拡散する
ことができる（第１図参照）。従って、本発明の方法は
腫瘍抗原不均一性および普通の免疫結合体薬物供給技術
に関連する抗原／結合体の内在化する必要性の現在の問
題を克服する。
さらに、この方法は薬物が抗体に直接結合する必要が
なく、従って供給できる薬物の量が制限されないので腫
瘍部位における薬物抗力の陳腐な問題を生じない。事実
この方法は、結合体の抗体結合酵素が多くの基質の代謝
回転を行なうことができプロドラッグを活性薬物に反復
転化するので、腫瘍部位に存在する活性薬物分子の数を
増幅する。さらに、この方法は他の組織における遊離と
対照して腫瘍部位に特異的に活性薬物を遊離できる。こ
れは、腫瘍細胞が抗体−酵素結合体でコートされるため
に腫瘍部位における酵素の濃度が他の組織におけるその
濃度より高いためである。
本発明の免疫結合体の抗体成分には腫瘍関連抗原に特
異的に結合する任意の抗体が含まれる。そのような抗体
の例には癌腫、黒色腫、リンパ腫、並びに骨および軟組
織肉腫並びに他の腫瘍上に認められる抗原に特異的に結
合するものが含まれ、しかしそれらに限定されない。細
胞表面に結合して長時間保持されるかまたは非常に徐々
に内在化される抗体が好ましい。これらの抗体は多クロ
ーン性または、好ましくは単クローン性であることがで
き、無傷抗体分子あるいは抗体の活性結合領域を含むフ
ラグメント例えばFabまたはＦ（ab′）２であることが
でき、よく確立された技術を用いて製造することができ
る〔例えば、デウェガー（R.A.DeWeger）ほか、「クロ
ラムブシル−抗体複合体によるマウスリンパ腫および黒
色腫細胞の根絶」、イムノロジカル・レビューズ（Immu
nological Rev.）,62、pp.29〜45（1982）（腫瘍特異性
多クローン性抗体が生成され、結合体に使用される）；
イエー（M.Yeh）ほか、「単クローン性抗体により確認
されたヒト黒色腫の細胞表面抗原」、プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,76、p.2927（1979）；ブ
ラウン（J.P.Brown）ほか、「単クローン性抗体による
ヒト黒色腫関連抗原p97の構造確認」、ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー（J.Immunol.）,127（No.2）、pp.539
〜541（1981）（生成された腫瘍特異性単クローン性抗
体）；およびマーク（J.P.Mach）ほか、「結腸癌映像化
の改良：多クローン性抗CEA抗体および静止フォトスキ
ャンニングから単クローン性FabフラグメントおよびECT
に」、モノクローナル・アンティボディーズ・フォ・カ
ンサー・デテクション・アンド・セラピー（Monoclonal
Antibodies For Cancer Detetion And Therapy），ボ
ルドウィン（Baldwin）ほか編、pp.53〜64、アカデミッ
ク・プレス（Academic Press）（1985）（抗体フラグメ
ントの生成および腫瘍細胞への局在化に対する使用）参
照〕。さらに、単クローン性抗体が使用されれば、抗体
はマウスまたはヒト由来またはキメラ抗体であることが
できる〔例えば、オイ（V.T.Oi）「キメラ抗体」、バイ
オテクニクス（Biotechniques）,4（No.3）、pp.214〜2
21（1986）参照〕。
本発明の免疫結合体の酵素成分にはプロドラッグにそ
れをその一層活性な細胞障害性形態に転化するように作
用することができる任意の酵素が含まれる。本明細書に
用いた「プロドラッグ」という語は親薬物に比べて腫瘍
細胞に対する細胞障害性が低く、一層活性な親形態に酵
素的に活性化または転化されることができる薬学的に活
性な物質の前駆物質または誘導体形態を示す〔例えば、
ウイルマン（D.E.V.Wilman,「癌化学療法におけるプロ
ドラッグ」、バイオケミカル・ソサイエティー・トラン
スアクションズ（Biochemical Society Transaction
s）,14、pp.375〜382〔第615会議（615th Meeting,Belf
ast）1986〕およびステラ（V.J.Stella）ほか、「プロ
ドラッグ：標的指向薬剤供給に対する化学的方法」、デ
ィレクテッド・ドラッグ・デリベリー（Directed Drug
Derivery），ボルチャート（R.Borchardt）ほか編、pp.
247〜267、ヒュマナ・プレス（Humana Press）1985参
照〕。
本発明の方法に有用な酵素にはホスフェート含有プロ
ドラッグの遊離薬物への転化に有用なアルカリ性ホスフ
ァターゼ、サルフェート含有プロドラッグの遊離薬物へ
の転化に有用なアリールスルファターゼ、非毒性５−フ
ルオロシトシンの抗癌薬５−フルオロウラシルへの転化
に有用なシトシンデアミナーゼ、ペプチド含有プロドラ
ッグの遊離薬物への転化に有用なプロテァーゼ例えばセ
ラチアプロテアーゼ、サーモリシン、ズブチリシン、カ
ルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えばカテプ
シンＢおよびＬ）、Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラ
ッグの転化に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダー
ゼ、グリコシル化プロドラッグの遊離薬物の転化に有用
な炭水化物開裂酵素例えばβ−ガラクトシダーゼおよび
ノイラミニダーゼ、β−ラクタムで誘導体化した薬物の
遊離薬物への転化に有用なβ−ラクタマーゼ、並びにペ
ニシリンアミダーゼ例えばそれらのアミン窒素において
フェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基でそれぞ
れ誘導体化した薬物の遊離薬物への転化に有用なペニシ
リンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼが含ま
れ、しかしそれらに限定されない。あるいはまたアブチ
ーム（abzyme）として知られる酵素活性を有する抗体を
本発明のプロドラッグの遊離活性薬物への転化に使用す
ることができる〔例えば、マセイ（R.J.Massey），ネー
チャー（Nature）,328、pp.457〜458（1987）参照〕。
抗体−アブチーム結合体は腫瘍細胞集団に対するアブチ
ームの供給のためにこゝに記載のように調製することが
できる。
同様に、本発明のプロドラッグには前記プロドラッ
グ、例えばホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフ
ェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッ
グ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸変性プロ
ドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含
有プロドラッグ、場合により置換されていることができ
るフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合
により置換されていることができるフェニルアセトアミ
ド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび結合
体の酵素により一層活性な細胞障害性遊離薬物に転化さ
れることができる他の５−フルオロウリジンプロドラッ
グが含まれ、しかしそれらに限定されない。本発明に用
いるプロドラッグに誘導体化できる細胞障害性薬物の例
にはエトポシド（etoposide）、テニポシド（teniposid
e）、アドリアマイシン、ダウノマイシン、カルミノマ
イシン（carminomycin）、アミノプテリン、ダクチノマ
イシン、マイトマイシン、シス−プラチナム（cis-plat
inum）およびシス−プラチナム類似体、ブレオマイシ
ン、エスペラミシン（esperamicin）〔米国特許第4,67
5,187号参照〕、５−フルオロウラシル、メルファラン
並びに他の関連ナイトロジエンマスタードが含まれ、し
かしそれらに限定されない。
本発明の酵素は、よく知られた技術例えばヘテロ二官
能橋かけ剤、SPDP〔３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オン酸Ｎ−スクシンイミジル〕またはSMCC〔４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸ス
クシンイミジル〕の使用により本発明の抗体に共有的に
結合させることができる〔例えば、ソープ（P.E.Thorp
e）ほか、「抗体−毒素結合体の調製および細胞障害
性」、イムノロジカル・レビューズ（Immunological Re
v.）,62、pp.119〜58（1982）；ランベルト（J.M.Lambe
rt）ほか、前掲、p.12038;ローランド（G.F.Rowland）
ほか、前掲、pp.183〜84およびガレゴ（J.Gallego）ほ
か、前掲、pp.737〜38参照〕。あるいは、本発明の酵素
の少くとも機能的に活性な部分に結合した本発明の抗体
の少くとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、よく
知られた組換えDNA技術を用いて構築することができる
〔例えば、ノイバーガー（M.S.Neuberger）ほか、ネー
チャー（Nature）,312、pp.604〜608（1984）参照〕。
これらの融合タンパク質はこゝに記載する抗体−酵素結
合体と実質的に同様に作用する。
本発明の好ましい態様によれば、ヒト癌抗原に特異性
の抗体が酵素、アルカリ性ホスファターゼに結合され、
本発明の方法によりエピポドフィロトキシングルコシド
の４′−ホスフェート誘導体の活性抗癌薬への転化に使
用された。そのような誘導体にはエトポキシド−４′−
ホスフェート、エトポシド−４′−チオホスフェートお
よびテニポシド−４′−ホスフェートが含まれる（これ
らの誘導体の構造には第３図参照：テニポシド誘導体は
示された構造の糖部分上のメチル基の代りに２−チエニ
ル基を有する）。本発明の他の態様はホスフェート部分
がグルコシド上の他のヒドロキシル基に配置されたグル
コシドのホスフェート誘導体を含むことができる。しか
し、より好ましい態様によれば、本発明においてプロド
ラッグとして使用されるホスフェート誘導体はエトポシ
ド−４′−ホスフェートまたはエトポシド−４′−チオ
ホスフェートである。
本発明によって、アルカリ性ホスファターゼAPを、単
クローン性抗体L6、ヒト肺癌細胞上の糖タンパク質抗原
に結合するIgG2a抗体〔ヘルストロム（I.Hellstrom）ほ
か、「多くのヒト癌腫と反応するIgG2a抗体、L6の抗腫
瘍効果」、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA,83、pp.7059〜63（1986）〕、に共有的に結合
させた。生じた免疫結合体は非結合酵素と比べたときに
酵素活性の低下を示さなかった。さらに、L6抗体の結合
活性の大部分が免疫結合体中に保存された。
試験管内細胞毒性検定を用いて我々は、ヒト癌腫細胞
系の細胞をL6-AP免疫結合体で処理し、次いで細胞をエ
トポシドホスフェートプロドラッグに暴露すると、これ
らの癌細胞に対するエトポシド単独の使用に匹敵する細
胞毒性を生じたことを実証した。対照的に、エトポシド
ホスフェート単独はわずかの細胞毒性を示した。
さらに、我々のヌードマウスにおける生体内研究はL6
-AP免疫結合体がL6陽性腫瘍異種移植片に局在化するこ
とを示した。これらの腫瘍の組織学的評価は、標的指向
AP酵素が腫瘍塊全体に分布したことを示した。
さらに、L6-AP免疫結合体は、結合体を皮下L6陽性腫
瘍をもつヌードマウスに投与し、次いでエトポシドホス
フェートプロドラッグで処置した治療実験において強い
生体内抗腫瘍活性を示した。この処置の抗腫瘍効果は若
干の腫瘍の完全な退行を包含し、プロドラッグまたは親
薬物単独による処置の効果より優れていた。
本発明の他の好ましい態様によれば、L6-AP免疫結合
体を新規マイトマイシンホスフェートプロドラッグの活
性マイトマイシン薬物への転化に用いた。エトポシドホ
スフェートプロドラッグの場合のように、結合体のAP酵
素がプロドラッグからホスフェート基を除去し、活性抗
腫瘍物質を遊離する。本発明のマイトマシンホスフェー
トプロドラッグはマイトマイシンＣまたはポリフイロマ
イシンN7-C1-8アルキルホスフェート誘導体またはその
薬学的に許容される塩であることができる。N7は親薬物
のマイトサン（mitosane）の７位に結合した窒素原子を
示す。より好ましい態様によれば、使用される誘導体は
７−（２′−アミノエチルホスフェート）マイトマイシ
ン（「MOP」）である（マイトマイシンＣおよび二ナト
リウム塩形態のMOPの構造には第12図参照;MOPに相当す
るポルフイロマイシン誘導体はマイトマイシンＣのアジ
リジン窒素上にメチル基を有する）。あるいは、MOP化
合物は9a−メトキシ−７−〔〔（ホスホノオキシ）エチ
ル〕アミノ〕マイトサン二ナトリウム塩と称することが
できる。本発明の他の態様はプロドラッグとしてN7−ア
ルキルマイトマイシンホスホロチオアート類の使用を含
むことができる。
試験管内研究は、ヒト肺腫瘍系の細胞をL6-AP免疫結
合体により処理し、次に細胞をMOPに暴露すると、認め
られている抗腫瘍物質のマイトマイシン単独の腫瘍細胞
に対する使用を匹敵する細胞毒性を生じたことを示し
た。マイトマイシンホスフェートプロドラッグ単独の腫
瘍細胞に対する使用はわずかの細胞毒性を生じた。同様
に、L6-AP免疫結合体は、ヒト肺腫瘍をもつヌードマウ
スに結合体を投与し、次いでマイトマイシンホスフェー
トプロドラッグで処置した治療試験において顕著な生体
内抗腫瘍効果を示した。この抗腫瘍効果はプロドラッグ
単独、親薬物単独または非結合性抗体−AP結合体ととも
に与えたプロドラッグの使用で認められたものより大き
かった。
本発明のなお他の態様において、ペニシリンアミダー
ゼ酵素をL6単クローン性抗体に共有的に結合させ、生じ
た免疫結合体を新規アドリアマイシンプロドラッグの活
性抗腫瘍薬アドリアマイシンへの転化に用いた。用いた
特定アミダーゼはフサリウム・オキシスポルム（Fusari
um oxysporum）から分離されたフェノキシアセチルアミ
ド結合を加水分解するペニシリンＶアミダーゼ（「PV
A」）であった。従って、用いた特定のプロドラッグは
Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチル）アドリアマ
イシン（「APO」）であり、それはアミダーゼにより加
水分解されて強力な抗腫瘍物質、アドリアマイシン、を
遊離した。L6-PVA免疫結合体は非結合酵素と比べたとき
に酵素活性の低下を示さず、L6抗体の結合活性の大部分
が結合体中に保存された。
我々の試験管内研究によれば、ヒト肺腫瘍細胞をL6-P
VA結合体で処理し、次いで細胞をAPOプロドラッグに暴
露すると細胞をアドリアマイシン単独で処理して認めら
れたものに匹敵する細胞毒性を生じた。重要なことに
は、APOプロドラッグ単独が腫瘍細胞に対し非常に少な
い細胞毒性を示した。
同様の試験管内研究はまた、PVA酵素を1F5、リンパ腫
細胞に認められる抗原と反応性の単クローン性抗体、に
結合させた1F5-PVA結合体を用いて行なった。ドージリ
ンパ腫細胞を1F5-PVA結合体で処理し、次いで細胞をAPO
に暴露するとアドリアマイシン単独で処理して認められ
たものに匹敵する細胞毒性を生じたが、APO単独による
細胞の処理は非常に小さい細胞毒性を生じた。
新規アドリアマイシンプロドラッグ、Ｎ−（ｐ−ヒド
ロキシフェノキシアセチル）アドリアマイシンの合成お
よび使用がこゝに記載されているけれども、本発明には
実質的に同様に誘導できる他の関連アドリアマイシンプ
ロドラッグの合成および使用が含まれることを理解すべ
きである。例えばプロドラッグ、Ｎ−（ファノキシアセ
チル）アドリアマイシンはまた、そのプロドラッグがこ
ゝに記載したプロトコルを用い、しかし反応物ｐ−ヒド
ロキシフェノキシ酢酸（後記実施例４参照）をフェノキ
シ酢酸にかえることにより合成できるので本発明の範囲
内にある。さらに、本発明のアドリアマイシンプロドラ
ッグにはアドリアマイシンの、例えばフェニル環の異な
る位置で置換した他のＮ−ヒドロキシフェノキシアセチ
ル誘導体、並びにこゝに記載したヒドロキシル基以外の
置換基をフェニル環上に含むＮ−フェノキシアセチル誘
導体が含まれることを理解すべきである。
さらに、この態様は免疫結合体の酵素成分として他の
アミダーゼ、例えばペニシリンＧアミダーゼ、並びに個
々のアミダーゼがプロドラッグを活性抗腫瘍形態に加水
分解できるように相応する誘導体にした他のプロドラッ
グを包含する。例えば、ペニシリンＧアミダーゼを酵素
として用いるとき、プロドラッグがフェニルアセチルア
ミド基を（APOのフェノキシアセチルアミド基とは対照
的に）含むべきであり、これはペニシリンＧアミダーゼ
がこの型のアミド結合を加水分解するからである〔例え
ば、マルゴリン（A.L.Margolin）ほか、ビオシミカ・エ
・ビオフィジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）,61
6、pp.283〜89（1980）参照〕。従って、本発明の他の
プロドラッグにはＮ−（ｐ−ヒドロキシフェニルアセチ
ル）アドリアマイシン、Ｎ−（フェニルアセチル）アド
リアマイシンおよびアドリアマイシンの他の適当に置換
したＮ−フェニルアセチル誘導体が含まれる。
本発明が親薬物のアミン基をフェノキシ酢酸、フェニ
ル酢酸または他の関連酸のカルボキシル基と反応させる
ことにより誘導される任意のプロドラッグを含むことを
理解すべきである。従って、誘導体にでき、こゝに記載
したアドリアマイシンプロドラッグと実質的に同様に作
用するアドリアマイシン以外のアントラシクリン類のプ
ロドラッグは本発明の範囲内に属する。例えば、本発明
に従って製造し、使用できる他のプロドラッグにはアン
トシクリン例えばダウノマイシンおよびカルミノマイシ
ンのヒドロキシフェノキシアセチルアミド誘導体、ヒド
ロキシフェニルアセチルアミド誘導体、フェノキシアセ
チルアミド誘導体およびフェニルアセチルアミド誘導体
が含まれる。他のアミン含有薬物例えばメルファラン、
マイトマイシン、アミノプテリン、ブレオマイシンおよ
びダクチノマイシンもまたこゝに記載のように変性して
本発明のプロドラッグを生成させることができる。
従って、本発明が式ＩおよびII: （式中、 R1がＨであり、R3がOHまたはOCH3であるか、あるいは R1がOHであり、R3がOCH3であり、 R2はＨまたはOHである） （式中、 R1がＨであり、R3がOHまたはOCH3であるか、あるいは R1がOHであり、R3がOCH3であり、 R2はＨまたはOHである） を有する化合物を包含することが明らかである。
本発明のなお他の好ましい態様には酵素、シトシンデ
アミナーゼ（「CD」）のL6単クローン性抗体に対する結
合体が含まれる。そのデアミナーゼ酵素は５−フルオロ
シトシン（「5-FC」）、抗腫瘍活性のない化合物、の強
力な親抗腫瘍薬、５−フルオロウラシル（「5-FU」）へ
の転化を触媒する（第26図参照）。従って、本発明のL6
-CD免疫結合体をプロドラッグ5-FCの5-FUへの転化に用
いると試験管内で腫瘍細胞に対する有意な細胞障害効果
を生じた。
前記本発明の免疫結合体に対して真実であったよう
に、L6-CD結合体は結合に基く酵素または結合活性の有
意な低下を示さなかった。さらに、我々の試験管内研究
は、ヒト肺腫瘍細胞をL6-CD結合体で処理し、次いで細
胞をプロドラッグ5-FCに暴露すると、細胞を強力な抗腫
瘍薬5-FU単独で処理して認められたものに等しい細胞障
害効果を生じたことを示した。これらの腫瘍細胞のプロ
ドラッグ単独による処理は有意でない細胞障害効果を生
じた。
こゝに記載した広範なデータから、本発明の免疫結合
体／プロドラッグの組合せが、細胞障害活性の低下した
プロドラッグが投与されて抗体標的指向酵素の存在に基
きプロドラッグが腫瘍細胞の部位で高細胞障害性状態に
転化される腫瘍細胞を殺す選択的機構を与えることが明
らかである。さらに、この方法により達成される細胞毒
性は、腫瘍部位で遊離された活性薬物が前記のように抗
体−薬物結合体供給系に伴なう物理的制約により妨げら
れないので普通の抗体標的指向技術に比べて増大され
る。従って、本発明の方法が癌および他の腫瘍の治療に
おいて腫瘍細胞に関する選択的細胞毒性を増大する方法
を提供することが明らかである。
本発明の方法の他の態様によれば、若干のプロドラッ
グおよび単に単一の抗体−酵素結合体を用いる組合せ化
学療法の方法が提供される。この態様によれば、すべて
免疫結合体中の同一酵素に対する基質である多数のプロ
ドラッグが使用される。従って、特定の抗体−酵素結合
体が多数のプロドラッグを細胞障害性形態に転化し、腫
瘍部位に高い高腫瘍活性を生ずる。例えば、ヒト肺腫瘍
をもつヌードマウスに本発明のL6-AP免疫結合体を投与
し次いで一緒に与えた新規プロドラッグの組合せ、すな
わちエトポシドホスフェートプロドラッグおよびマイト
マイシンホスフェートプロドラッグで処置した生体内研
究で顕著な抗腫瘍効果が得られた。同様に、エトポシド
ホスフェート、アドリアマイシンホスフェート（米国特
許第4,185,111号参照）および５−フルオロウリジンモ
ノホスフェート〔例えば、ヘィデルバーガー（C.Heidel
berger）ほか、「フッ素化ピリミジンおよびそれらのヌ
クレオシド」、アドバンシス・イン・エンチモロジー・
アンド・リレーテッド・エリアズ・オブ・モレキュラー
・バイオロジ（Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.）,
54、pp.57〜119（1983）参照〕の、抗腫瘍抗体−AP結合
体による処置後の投与が腫瘍の部位に強力な抗腫瘍薬、
すなわちエトポシド、アドリアマイシンおよび５−フル
オロウリジン、の組合せの形成を生ずる。
他の態様によれば、結合体の酵素成分が変化する多く
の異なる免疫結合体が使用される。各免疫結合体はその
それぞれのプロドラッグまたはプロドラッグ類を腫瘍部
位で細胞障害性形態に転化させるために使用できる。例
えば、抗腫瘍抗体をAPに結合させて１結合体を形成する
ことができ、シトシンデアミナーゼに結合させて他の結
合体を形成することができる。次いで両免疫結合体を、
腫瘍をもつ宿主に投与すると抗体特異性により腫瘍部位
で腫瘍抗原に結合する。プロドラッグ、エトポシドホス
フェートおよび５−フルオロシトシンを投与するとエト
ポシドおよび５−フルオロウラシル（ともに強力な抗腫
瘍物質）の形成を腫瘍部位で生ずる。
本発明のなお他の態様には結合体の抗体成分の特異性
が変動する多くの免疫結合体の使用が含まれ、すなわ
ち、それぞれが問題の腫瘍上の異なる抗原に特異的に結
合する抗体を有する多くの免疫結合体が使用される。こ
れらの免疫結合体の酵素成分は同一であることができ、
または異なることができる。この態様は、腫瘍の表面上
の種々の抗原の量が未知であり、十分な酵素を腫瘍部位
に標的指向させることを確実にすることを望む状態にお
いて殊に有用であることができる。腫瘍に対して異なる
抗原特異性をもつ多くの結合体の使用はプロドラッグま
たは一連のプロドラッグの転化に十分な酵素を腫瘍部位
に得る可能性を増大する。さらにこの態様は、正常組織
が同様の腫瘍関連抗原のすべてをもつ可能性が低い〔ヘ
ルストロム（I.Hellstrom）ほか、「黒色腫抗原p97の２
決定基に対する単クローン性抗体の補体依存性細胞毒性
における相乗的な作用」、ジャーナル・オブ・イムノロ
ジー（J.Immunol.）,127（No.1）、pp.157〜160（198
1）参照〕ので腫瘍に対する高度の特異性の達成に重要
である。
本発明はまた癌および他の腫瘍を治療するための薬学
的組成物、組合せおよび方法を包含する。より詳しく
は、本発明は哺乳動物宿主を薬学的に有効な量の抗体−
酵素結合体または結合体類、並びに薬学的に有効な量の
プロドラッグまたはプロドラッグ類で薬学的に許容され
る方法で処置する腫瘍の治療法に使用する本発明の抗体
−酵素結合体およびプロドラッグまたはプロドラッグ類
を含む組合せを包含する。本発明の組合せおよび方法は
ヒト、イヌ、ネコおよびウマを含めて任意の動物の治療
に有用である。
好ましい態様によれば、抗体−酵素結合体がプロドラ
ッグの導入の前に宿主に投与される。結合体およびプロ
ドラッグの投与の間に結合体の抗体が腫瘍部位に標的指
向し、酵素を局在化させる十分な時間を許容すべきであ
る。そのような十分な時間は使用される結合体により12
時間〜１週間の範囲内にあることができる。
本発明の結合体およびプロドラッグは静脈内、腹腔
内、経口、リンパ管内または腫瘍内の直接投与を含み、
それらに限定されない普通の投与方法を用いて投与する
ことができる。静脈内投与が好ましい。
免疫結合体またはプロドラッグを含む本発明の組成物
は液体溶液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、座剤、ポ
リマーマイクロカプセルまたはマイクロベシクル、リポ
ソーム、および注射可能または注入可能溶液を含み、し
かしそれらに限定されない種々の剤形であることができ
る。好ましい形態は投与および治療適用の方法による。
例えば、抗体−酵素結合体の経口投与は、結合体タンパ
ク質が経口的に、例えば錠剤形態で摂取されれば胃中で
分解する傾向であるので有利でないかもしれない。
結合体またはプロドラッグ組成物はまた、好ましくは
普通の薬学的に許容される担体および公知の佐剤例えば
ヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチ
ン、緩衝物質例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、
ソルビン酸カリウムおよび塩または電解質例えば硫酸プ
ロタミンを包含する。
本発明の組成物の投与および用法の最も有効な方法は
疾患の状態および経過、患者の健康、治療に対する応
答、並びに処置医師の判断に依存する。従って、免疫結
合体およびプロドラッグの用量は個々の患者に対し決定
すべきである。
それにもかゝわらず、本発明の抗体−酵素結合体の有
効量は約1.0〜約100mg/m2の範囲内にあることができ
る。本発明のプロドラッグの有効量は使用される個々の
プロドラッグ、誘導される親薬物に依存する。プロドラ
ッグは親薬物より細胞障害性が少ないので、親薬物に認
められる量以上の用量を用いることができる。例えば、
エトポシドプロドラッグの有効量は約75〜500mg/m2の範
囲内にあることができる。マイトマイシンホスフェート
プロドラッグの有効量は約50〜1,000mg/m2の範囲内にあ
ることができる。アドリアマイシンプロドラッグの有効
量は約15〜150mg/m2の範囲内にあることができる。また
５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジン
プロドラッグの有効量は約600〜2,000mg/m2の範囲内に
あることができる。
こゝに記載した本発明が一層十分に理解されるために
次の実施例が示される。これらの実施例は単に例示目的
のためであり、決して本発明の範囲を限定すると解すべ
きでないことを理解すべきである。
実施例１ 次の実施例は本発明の免疫結合体および方法の抗体結
合アルカリ性ホスファターゼによるエトポシドホスフェ
ートプロドラッグのエトポシドへの転化に対する使用並
びに生ずる腫瘍細胞に対する試験管内細胞毒性および本
発明の方法の使用による生体内抗腫瘍効果を示す。
本発明の抗体−アルカリ性ホスファターゼ結合体の調製 この実施例において、酵素、アルカリ性ホスファター
ゼ（AP）に結合した単クローン性抗体L6、96.5または1F
5を含む３免疫結合体を調製して研究した。L6はヒト肺
癌細胞上の糖タンパク質抗原に対し特異性でそれに結合
するIgG2aのサブクラスの単クローン性抗体である〔ヘ
ルストロム（I.Hellstrom）ほか、（1986）前掲参
照〕。96.5はp97（黒色腫関連抗原）に対し特異性であ
る単クローン性IgG2a抗体である〔ブラウン（J.P.Brow
n）ほか、「ヒト黒色腫関連抗原p97の単クローン性抗体
による構造確認」、ジャーナル・オブ・イムノロジー
（J.Immunol.）,127（No.2）、pp.539〜46（1981）参
照〕。IF5は正常および腫瘍Ｂ細胞上のCD-20抗原に特異
性である単クローン性IgG2aの抗体である〔クラーク
（E.A.Clark）ほか、「ヒトＢ細胞活性化におけるBp35
細胞表面ポリペプチドの役割」、プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA,82、pp.1766〜70（1985）
参照〕。L6単クローン性抗体を産生するL6ハイブリドー
マは、1987年１月14日に公表された欧州特許出願第2079
63号の提出に関連してアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ATCC）に受託番号HB8677で寄託され
た。1F5単クローン性抗体を産生する1F5ハイブリドーマ
は1988年２月12日にATCC No.HB9645でATCCに寄託され
た。96.5単クローン性抗体は市販されている。
抗体−酵素結合体はランバート（J.M.Lambert）ほ
か、「ヒトリンパ系細胞と反応性の精製免疫毒素」、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bi
ol.Chem.）,260（No.22）、pp.12035〜12041（1985）に
記載されたものに類似する方法を用いてチオエーテル結
合によりAPを単クローン性抗体L6、96.5または1F5に共
有的に結合させることにより調製した。１実験プロトコ
ルによれば、結合体L6-APおよび96.5-APは次のように調
製された：我々は２−イミノチオラン（0.5Mトリエタノ
ールアミン塩酸塩と10mM-EDTA、pH8.0中50mM）をL6また
は96.5抗体の8.0mg/ml溶液（50mMトリエタノールアミン
塩酸塩および1mM-EDTA中pH8.0）に２−イミノチオラン
の最終濃度が1.3mMであるように加えた。０℃で90分後
に、pH7.2のリン酸塩緩衝食塩水（PBS）を溶離剤として
用いるセファデックス（Sephadex）G-25上のゲル濾過に
より反応を停止させた。抗体と２−イミノチオランとの
反応はスルフヒドリル基を導入し、その数はエルマン
（Ellman）の試薬〔リドレス（P.W.Riddles）ほか、
「エルマンの試薬:5,5′−ジチオビス（２−ニトロ安息
香酸）−再試験」、アナリテイカル・バイオケミストリ
ー（Analytical Biochemistry）、94、pp.75〜81（197
9）参照〕を用いて1.9〜3.5であると測定された。
100mMリン酸塩緩衝液、pH7.0中のアルカリ性ホスファ
ターゼ〔仔ウシ腸、ベーリンガー・マンハイム（Boehri
nger Mannheim）製、10mg/ml〕に４−（Ｎ−マレイミド
メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スルホスクシ
ンイミジル（スルホ−SMCC）〔ピアス・ケミカル社（Pi
erce Chemical Co.）製、ジメチルホルムアミド（DMF）
中20mM〕を、最終スルホ−SMCCの濃度が2.4mMであるよ
うに加えた。30℃で30分後に、修飾された酵素をG-25セ
ファデックス上のゲル濾過により精製し、PBSで溶出さ
せた。
次いで修飾されたAPをチオール化抗体に2:1のモル比
に加えた。APとスルホSMCCとの反応はマレイミド基を酵
素中へ導入し、それが各修飾抗体上のスルフヒドリル基
と反応すると抗体とAPとの間にチオエーテル結合の形成
を生じた。残留未反応チオールをブロックするために反
応時間１時間後にヨードアセトアミド（最終濃度1mM）
をタンパク質溶液に加え、結合体をセフアクリル（Seph
acryl）S-300カラム上でPBSを溶離剤として用いて精製
した。フラクションを280nmでモニターし、各フラクシ
ョン（64,000倍に希釈）のAP活性をｐ−ニトロフェニル
ホスファートを基質として用いてpH9.5で検定した〔チ
イセン（P.Tijssen）、ラボラトリー・テクニクス・イ
ン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイ
オロジー（Laboratory Techniques In Biochemistry an
d Molecular Biology）、pp.366〜67、エルセビーア・
プレス（Elsevier Press）（1985）〕。適当な水準のAP
−抗体比を有する結合体を含むフラクションを５〜12.5
％勾配ゲル上のSDS-PAGEにより決定し（第２図参照）、
次いでプールした。タンパク質濃度は、抗体およびAPの
0.1％溶液がそれぞれ1.4および0.76ODを吸収する280nm
で測定した。ゲル上の結合体の分析はそれらが主に抗体
と酵素との1:1比からなることを示した。ゲルに用いた
変性条件下で、分子量140kdのホモダイマーとして天然
に存在するAPが70kdの単一バンドとして移動する。この
70kdタンパク質バンドはこれらのカラム中のゲル上に観
察され、それはまた酵素のサブユニットの１つが共有的
に結合した抗体−酵素結合体から解離したので高分子量
の結合体バンドを含有した（第２図レーンＡおよびＢ参
照）。S-300セフアクリルカラム上のゲル濾過は結合体
調製物中に遊離酵素が存在しなかったことを示した。
我々はまた本発明のL6-APおよび1F5-AP結合体の調製
に第２の類似の実験プロトコルを用い、抗体をイミノチ
オラン（0.5mM）で修飾して単一遊離チオール基を導入
し、APを４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサ
ン−１−カルボン酸スクシンイミジル（SMCC）〔ピアス
・ケミカル社（Pierce Chemical Co.,Rockford,IL）
製〕でSMCCの最終濃度が0.1mMであるように修飾した。
次いで修飾タンパク質を混合し、生じた結合体をS-300
セフアクリル上のゲル濾過により精製した。次のSDS-PA
GE分析はこれらの結合体調整物が非結合タンパク質およ
び凝集体を含まないことを示した。前記のように、調製
物のタンパク質濃度は、抗体（分子量:160kd）およびAP
（分子量:140kd）の1mg/ml溶液がそれぞれ1.4および0.7
6OD単位を吸収する280nmにおける吸光度により測定し
た。
プロドラッグ、エトポシドホスフェートおよびエトポシ
ドチオホスフェートの調製 本発明の方法の次の段階によれば、各抗体−酵素結合
体を新規エトポシドホスフェートまたはエトポシドチオ
ホスフェートプロドラッグと反応させた。より詳しく
は、用いたプロドラッグはそれぞれ第３図に示される式
を有するエトポシドの４′−リン酸二ナトリウムエステ
ルおよびエトポシドの４′−チオリン酸二ナトリウムエ
ステルであった。
エトポシドホスフェートおよびエトポシドチオホスフ
ェートはエトポシドとそれぞれ塩化ホスホリルまたは塩
化チオホスホリルとを反応させ、それぞれジクロロホス
フェートまたはジクロロチオホスフェート中間体を生成
させることにより合成した。リン酸化反応は適当な無水
有機溶媒、例えばアセトニトリル、中で好ましくは第三
級アミン塩基例えばN,N−ジイソプロピルエチルアミン
の存在下に行なわれる。反応の経過は薄層クロマトグラ
フィー（TLC）によりモニターし、それにより最適反応
時間を生成物の出現または出発物質の消失あるいはその
両方により判断することができる。我々の経験によれ
ば、反応に用いた含リン試薬の性質により約４〜約72時
間要することができる。ジクロロホスフェートまたはジ
クロロチオホスフェート中間体のそれぞれリン酸または
チオリン酸二ナトリウムプロドラッグへの加水分解は水
中の炭酸水素ナトリウムの溶液（20〜50倍過剰）を反応
混合物に直接添加し、混合物を室温でそれぞれ1.5また
は３時間かくはんすることにより行なった。酢酸エチル
および水で分配させ、次いで水−メタノールを用いて水
層の逆相クロマトグラフィーを行なうと、凍結乾燥また
は真空中の水性媒質の蒸発後に所望のプロドラッグが得
られる。
本発明の方法に１プロドラッグとして用いたエトポシ
ドの４′−リン酸二ナトリウム誘導体の調製のより詳し
い説明は次のとおりである： エトポシド〔ブリストル・マイヤーズ社（Bristol-My
ers Co.）製、2.30g、3.91ミリモル）の乾燥アセトニト
リル（210ml）中の磁気かくはん懸濁液を温ためてほゞ
完全な溶液を与え、室温に冷却し、N,N−ジイソプロピ
ルエチルアミン（2.36ml、13.5ミリモル）を加えた。次
いで混合物を０℃に冷却し、塩化ホスホリルPOCl3（666
mg、4.34ミリモル）をシリンジにより30秒にわたって加
えた。混合物を徐々に２〜３時間にわたって室温にな
し、室温で63時間かくはんした。この時間の終りに反応
混合物の炭酸水素ナトリウム（6.0g、71.4ミリモル）の
脱イオンH2O（110ml）中の溶液を加え、混合物を室温で
80分間かくはんし、次いで飽和水性炭酸水素ナトリウム
（20ml）、脱イオンH2O（125ml）および酢酸エチル（35
0ml）で分配させた。有機層をさらに脱イオンH2O（１×
50ml）で抽出し、水層を合せて酢酸エチル（250ml）で
洗浄し、次いで室温で１時間、0.5mmの真空にかけて溶
解溶媒を除去した。次いで水性部分を、メタノール中で
充填しH2Oと平衡させたシリカゲルに結合したオクタデ
シルシラン（C-18）15cmを含む直径4cmのカラムに適用
した。すべての水性部分を適用した後、カラムをH2O（1
75ml）で溶離して無機塩を除き、次いで生成物を水中の
20％メタノールで溶出させた。0.5トルで溶媒を濃縮す
ると純エトポシドホスフェート化合物744mg（36％）が
無色固体として得られた。あるいは、凍結乾燥すると純
化合物が非常に綿毛状の低密度固体として得られる。
他の態様によれば、本発明のエトポシドホスフェート
プロドラッグが次のように調製された： エトポシド（10.50g、17.84ミリモル、P2O5上で80℃/
0.5トルで乾燥）の乾燥アセトニトリル（450ml）中の磁
気かくはん懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（4.20
ml、24.1ミリモル）を加えた。次いでクロロリン酸ジフ
ェニル（2.00ml、9.65ミリモル）をシリンジにより加え
た。混合物をN2下に50℃で２時間かくはんし、その時点
でエトポシドがすべて溶解した。さらにクロロリン酸ジ
フェニル（1.80ml、8.68ミリモル）を加え、反応混合物
を45℃で72時間保持した。さらにアミン塩基（0.75ml、
4.3ミリモル）およびクロロリン酸ジフェニル（0.80m
l、3.86ミリモル）を加えた後、混合物を40〜45℃で27
時間かくはんし、さらにクロロリン酸ジフェニル（0.40
ml）を加え、40〜45℃で22時間維持した。次いでイソプ
ロパノール（20ml）を加え、溶媒を真空で蒸発させ、固
体残留物をCH2Cl2（500ml）に溶解し、H2O（400ml）で
分配させた。水層をさらにCH2Cl2（100ml）で抽出し、
有機抽出物を合せてブライン（250ml）で洗浄し、乾燥
した（Na2SO4／MgSO4）。回転蒸発し、CH2Cl2中の２〜
３％CH3OHを用いるシリカゲル上のフラッシュクロマト
グラフィーによりエトポシド−４′−リン酸ジフェニル
12.5g（85％）が無色固体として得られた。
次に、新開封びん〔アルドリッチ・ケミカル社（Aldr
ich Chemical Co.）製〕の酸化白金（0.198g、0.87ミリ
モル）をエトポシド４′−リン酸ジフェニル（0.79g、
0.962ミリモル）の無水エタノール95ml中の溶液に加え
た。溶液をパー（Parr）装置で45〜50PSIで室温で４時
間水素化した。反応混合物を、エタノールを溶離剤とし
て用いてセライトのパッドに通して濾過した。真空で濃
縮し、P2O5上で真空で14時間乾燥するとエトポシド−
４′−リン酸が白色固体（0.627g、94％）として得られ
た。
FAB MS m/e 669(M+H)+ IR（KBr）3440,2930,1778,1604,1498cm-1 1H NMR（DMSO-d6）δ 6.93（s,1H）,6.46（s,1H）,6.
12（s,2H）,5.94（m,2H）,5.17（bs,1H）,4.86（d,J＝
3.93Hz,1H）,4.64（q,J＝7.5,5.8Hz,1H）,4.51-4.42
（m,2H）,4.20（d,J＝10.7Hz,1H）,4.01（dd,J＝12.1,
5.3Hz,1H）,3.51（s,6H）,3.51-2.75（m,7H）,2.83（m,
1H）,1.16（d,J＝5.1Hz,3H）． 13C NMR（DMSO-d6）δ 174.5,151.2,151.1,147.7,14
6.2,126.1,132.3,128.8,109.8,109.7,107.9,101.5,101.
2,98.5,80.0,74.3,72.7,71.7,67.6,67.2,65.7,55.8,43.
0,37.1,20.2,18.5. 元素分析：計算値（C29H33O16P）:0.85％ H2O:C,50.9
5;H,5.11. 測定値:C,51.42;H,4.97. 次いでエトポシド−４′−リン酸生成物2.90g（4.34
ミリモル）に脱イオンH2O（50ml）および固体炭酸水素
ナトリウム（3.00g、37.7ミリモル）を加えることによ
りエトポシド−４′−リン酸をその二ナトリウム塩に転
化した。混合物を室温で0.5時間かくはんし、その時間
の間にCO2の発生が止んだ。次いでこの混合物を前記態
様に記載したようにC-18カラムに直接適用した。カラム
を初めに脱イオンH2O（300mlで溶離して過剰の塩を除
き、次いで4:1のH2O／CH3OHで溶出させると凍結乾燥後
に純エトポシド−４′−リン酸二ナトリウム塩1.90g（6
1％）が綿毛状の白色固体として得られた。
エトポシドの４′−リン酸またはチオリン酸二ナトリ
ウム誘導体は低細胞障害活性を有するエトポシドの高水
溶性プロドラッグを表わす。しかし、これらの化合物と
アルカリ製ホスファターゼとの反応はホスフェートまた
はチオホスフェート部分を除去し、それぞれ強力な抗癌
薬、エトポシドを残す（第３図参照）。
エトポシド−４′−ホスフェートおよびエトポシド−
４′−チオホスフェートをそれぞれアルカリ性ホスファ
ターゼと反応させた実験は両プロドラッグが酵素に対す
る基質であることを示した。第５図に示されるように、
エトポシドホスフェートはエトポシドチオホスフェート
プロドラッグよりも速やかに酵素によって加水分解され
る。しかし、エトポシドチオホスフェートは一定条件の
もとでその加水分解に対する高い安定性に基く特定の有
用性を有することができる。
抗体−アルカリ性ホスファターゼ結合体とエトポシドホ
スフェートプロドラッグとの反応 本発明の結合体は、結合体および遊離酵素が基質ｐ−
ニトロフェニルホスファート〔チイセン（P.Tijsse
n）、前掲〕またはエトポシドホスフェートに対し等し
い活性を示す事実により証明されるので酵素の抗体に対
する結合に基く酵素活性の明らかな低下を示さなかっ
た。
例えばAP単独または前記のように製造された抗体酵素
結合体L6-AP（最終AP濃度５μg/ml）を、MgCl2（1mM）
およびZnCl2（0.1mM）をpH7.0で含むトリス緩衝液（100
mM）中のエトポシド−４′−ホスフェート（0.1mM）の
溶液に加えた。反応はIBM C-18カラム（３μ、4.5×100
mm）および50％水性メタノールを遊離剤として用いるHP
LCによりモニターした（0.5ml/分、254nmモニター）。
反応の開始の５分以内に、遊離酵素形態またはL6抗体−
酵素結合体の部分として、APがエトポシド−４′−ホス
フェートの少なくとも85％をエトポシドに加水分解した
（第4Cおよび4D図参照）。図が示すように、結合体中の
抗体に対する結合に基くAP酵素活性の低下がなかった。
酵素が存在しないときにホスフェートの加水分解が起こ
らなかった（第4A図参照）。エトポシドホスフェートま
たはエトポシドチオホスフェートの水溶液は室温で少く
とも８時間、および４℃で数日間安定であった。
抗体−アルカリ性ホスファターゼ結合体のH3347腫瘍細
胞に対する結合 第６図はL6-APおよび96.5−AP結合体並びにL6および9
6.5−抗体の転移ヒト結腸癌細胞系H3347〔ジュディ・ア
ンダーソン（Judy Anderson）により提供された、腫瘍
遺伝子）の腫瘍細胞に対し結合する能力の試験を行なっ
た結合体結合検定の結果を示す。
結合検定は次のように行なった：免疫結合体または遊
離抗体は不完全変性ダルベッコ培地〔IMDM、ギブコ（Gi
bco）〕中に系列希釈し、100μｌ分割量を４℃で106細
胞とともに30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、
FITC−ヤギ抗マウス抗体〔タゴ（Tago）製、1:12.5希
釈）50μｌとともに４℃でさらに30分間インキュベート
した。細胞を洗浄し、コールタ・エピックス（Coulter
Epics）−Ｃ螢光細胞アナライザーで分析した。死細胞
をゲートし、各試料の平均対数緑螢光強度を得た。この
数を直尺に変換し、陰性対照（細胞＋FITC−ヤギ抗マウ
ス抗体）と全試験試料との間の比を計算した。
第６図は抗体の結合能力の大部分が結合体中に保存さ
れたこと、すなわち結合が抗体結合能力に影響を与えな
かったことを示す。さらに、同図は抗体の結合の特異
性、すなわち96.5遊離抗体および96.5-AP結合体がとも
にL6抗体およびL6-AP結合体よりも腫瘍細胞に対し非常
に弱く結合したことを示す。この結果は、H3347腫瘍細
胞がヒト腫瘍からでありL6抗体が癌腫抗原に対し特異的
であるが96.5抗体が黒色腫抗原に対し特異的であること
を考慮すると予期することができる。
L6、L6-AP、1F5および1F5-APを用いた同様の結合実験
もまたL6およびL6-APがH3347癌腫細胞系に結合し（10μ
g/ml抗体で飽和）、1F5または1F5-APにより非常にわず
かの結合が認められるかまたは検出可能な結合が認めら
れなかったことを示した（第７図参照）。この結果はま
た結合体の結合の特異性を示し、L6-AP結合体がL6陽性
腫瘍細胞系に結合し、Ｂリンパ腫細胞に対する特異性を
有する1F5-AP結合体が結合を示さなかった。
本発明の結合体／プロドラッグ組合せの試験管内細胞毒
性 次に本発明の結合体／プロドラッグ組合せの細胞障害
性効果がクローン原性細胞毒性検定または3H−チミジン
取込み検定を用いて試験管内で示された。
用いたクローン原性細胞毒性検定はヘルストロム（I.
Hellstrom）ほか、「コロニー阻止および細胞毒性検
定」、イン・ビトロ・メソーズ・イン・セル・メディエ
ーテッド・イムニティ（In Vitro Methods In Cell-Med
iated Immunity）、ブルームほか（Bloom and Glade）
編、pp.409〜14（1971）により記載されたコロニー阻止
検定であった。細胞毒性の検出に用いた細胞は前記H334
7腫瘍細胞であった。L6-APおよび96.5-AP結合体の両方
を、それらのプロドラッグを遊離薬物の転化する能力に
ついて試験した。
簡単に記載すると、H3347細胞（106/ml）をIMDM増殖
培地（抗体濃度を基にして各免疫結合体10μg/mlを含
む）中に懸濁させ、37℃で30分間インキュベートした。
細胞を２回洗浄し、再びIMDM中に懸濁し、培地中の薬物
またはプロドラッグを加えた。37℃でインキュベーショ
ンを15時間続けた。２回洗浄した後、細胞を塗布しコロ
ニーの数（＞８細胞／コロニー）を７〜10日後に計数し
た。
検定の結果は第８図に示される（パーセント阻止は６
試料の平均である）。図に示されるように、エトポシド
（IC50＝0.20μＭ）はエトポシド−４′−ホスフェート
（EP）（IC50＝5.8μＭ）よりも非常に細胞障害性であ
った。プロドラッグ単独は非常に小さい細胞障害活性を
示した。H3347細胞をL6-AP結合体で処理し、次にエトポ
シドホスフェートに暴露するとプロドラッグ単独で認め
られたものに比べて細胞障害活性の非常大きい増加を生
じ、増大した細胞障害活性はエトポシド単独で認められ
た細胞障害活性に匹敵した。細胞の96.5-AP結合体およ
びエトポシドホスフェートによる処理はプロドラッグ単
独で認められたものに比し細胞障害活性の非常に小さい
増加を示した。この結果は前記のようにH3347に結合す
る96.5-AP結合体の量の少ないことに帰着させることが
できる（第６図参照）。結合体は細胞の結合体単独によ
る処理が細胞の死を生じなかったのでそれ自体細胞障害
性ではない。
本発明の結合体の細胞障害効果はまた3H−チミジン取
込み検定を用いて調べた。この検定によれば、10％ウシ
胎仔血清を有するIMDM 0.1ml中の106 H3347細胞の懸濁
液を結合体５μg/mlの存在下に４℃で１時間インキュベ
ートした。細胞を10％ウシ胎仔血清含有培地で２回洗浄
し、再懸濁し（1ml中）、96ウェルミクロタイタープレ
ート中へ塗布した（10,000細胞／ウェル）。次いでIMDM
中の薬物またはプロドラッグを加え、インキュベーショ
ンを37℃で６時間行なった。細胞を２回洗浄し、インキ
ュベーションをさらに12時間続け、次いで3H−チミジン
（1.0μCi/ウェル）で６時間標識した。プレートを−20
℃で凍結して細胞を分離し、細胞をガラス繊維ディスク
上に収集した。フィルターをベックマン（Beckman）380
1シンチレーションカウンター上で計数した。
この検定を用いて我々は腫瘍細胞のDNA中への3H−チ
ミジン取込みの阻止、従ってエトポシドあるいはプロド
ラッグEPのL6-APまたは1F5-AP結合体の不在または存在
下の細胞に対する細胞障害効果を測定した。第９図に示
されるように、エトポシド（IC50＝１μＭ）はEP（100
μＭで35％阻止）より100倍以上も毒性であった。EP暴
露前の1F5-APによる細胞の前処理は細胞毒性の増大を何
ら生じなかった。しかし、細胞障害活性の驚くべき増加
が細胞を初めにL6-APに、次いでEPに暴露したときに認
められた。従って、試験管内細胞毒性の測定に用いた両
検定において、本発明の結合体／プロドラッグの組合せ
の細胞障害効果はエトポシド単独のそれに匹敵し、EP細
胞毒性がH3347細胞の対照結合体、96.5-APおよび1F-5-A
Pのそれぞれによる処理によって同様に増大されなかっ
た事実により示されるように、この効果は抗原特異性で
あった。
マウスの腫瘍異種移植片中の結合体の局在化 次に生体内局在化研究を行ない本発明の結合体が腫瘍
中にいかに速やかにかつどの程度に蓄積するかを見出し
た。この情報は我々の腫瘍療法研究における抗体−酵素
結合体とプロドラッグとの投与の間の時間の適切な間隔
の決定に有用なことを証明するであろう。
初めにBalb/c nu/nuめすマウス（４〜６週令）〔ライ
フ・サイエンス（Life Science,St.Petersburg,Florid
a）から入手〕に、左右の後部側腹に107 H3347腫瘍細胞
を皮下（s.c.）注射した。腫瘍細胞はトリプシン（0.5g
/l）およびEDTA（0.2g/l）で２分間処理することにより
懸濁させた試験管内培養から得た。細胞はIMDMで２回洗
浄し、10％ウシ胎仔血清を有するIMDM中で37℃で１時間
インキュベートした。細胞を洗浄し、PBS中に懸濁し、
注射前に４℃で保持した。こゝに記載した局在化および
療法研究は腫瘍が225mm3の平均大きさに達したときに開
始した。
我々の局在化研究のために、ヨードゲン（iodogen）
法〔フレイカー（P.J.Fraker）ほか、バイオケミカル・
アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョンズ（Biochem.Biophys.Res.Commun.）80、pp.849〜8
57（1978）参照〕を用いてL6およびL6-APを125Iで標識
し、1F5および1F5-APを131Iで標識した。局在化実験の
２日前に動物を0.5％（v/v）ルゴールヨウ素液上に置い
た。各マウスに次の溶液:PBS、pH7.2、0.2ml中のL6-AP
（５μCi）および1F5-AP（2.5μCi）またはPBS 0.2ml中
のL6（５μCi）および1F5（2.5μCi）の組合せ、のいず
れかの100μｇ（各単クローン性抗体基準）をi.p.注射
した。周期的間隔で、マウスを麻酔し、眼窩叢を経て採
血し、剖検した。組織を計量し、次いでガンマカウンタ
ーで計数した。局在化は125I‐L6局在化と131I‐1F5の
それとの比較により、すなわち種々の組織中のカウント
の特異性（125I）と非特異性（131I）との取込みの比の
測定により決定した。腫瘍および肝臓の取込みに対する
結果が表１に要約される。
表に示されるように、非結合L6は24時間内に腫瘍に効
率よく局在し、そこに少くとも48時間保持された。この
期間の間腫瘍中のL6と1F5との比は８〜15の範囲内にあ
ったが肝臓中の比は全く低かった（1.3〜1.4）。L6-AP
に対する腫瘍中の特異的取込みの最大水準は約24時間に
起こり、その時点でL6-APと1F5-APとの比は10.0であっ
た。これらの結果はL6-AP結合体が1F5-APよりはるかに
良好に腫瘍内に局在化したが、しかし非結合L6ほど良好
でなかったことを示す。
次に我々は腫瘍中の天然ホスファターゼ活性の量およ
び本発明の結合体を用いてAPを腫瘍に標的指向させるこ
とによりこの活性を高めることができる程度を測定し
た。L6-AP 100μｇ（L6基準）で24時間処置したマウス
から腫瘍を切除し、次のようにｐ−ニトロフェニルホス
ファートを基質として用いて全ホスファターゼ活性を測
定した：切除細胞を洗浄し、次にNaCl（100mM）およびM
gCl2（5mM）を含むpH9.5のトリス（100mM）中でｐ−ニ
トロフェニルホスファート（1mg/ml）とともに23℃で穏
やかに回転した。反応の経過は410nmで遊離されたｐ−
ニトロフェノールを測定することによりモニターし、結
果を腫瘍重量に対して補正した。L6-AP結合体を受けた
マウスの腫痛が非処置マウスの腫瘍中に認められたホス
ファターゼ活性の水準の10倍程度を示したことが認めら
れた（第10A図参照）。
腫瘍のホスファターゼ活性のより詳細な組織学的分析
を、非処置あるいは24時間早くL6-APまたは1F5-AP300μ
ｇ（抗体基準）で前処置したマウスから得た腫瘍の断面
で行なった。ホスファターゼ活性は免疫組織学により次
のように酵素活性の部位における黒色沈殿を析出したホ
スファターゼ基質を用いて評価した：切除細胞を−28℃
で速やかに凍結し、８μｍ系列断面をライヘルト・ユン
グ（Reichert-Jung）ミクロトームを用いて調製した。
ホスファターゼ活性をベクター・ラボラトリーズ（Vect
or Laboratory,Burlingame CA）のAP基質キットで測定
し、結果をヘマトキシンおよびエオシン（Ｈ−Ｅ、第10
B図参照）で染色した断面と比較した。
第10B図に示されるように、非処置または1F5-APで処
置したマウスの腫瘍中にわずかの酵素活性が検出され
た。しかし、L6-APを受けたマウス中でホスファターゼ
活性が非常に高められ、腫瘍全体に分布したことを知見
できた。顕微鏡評価はL6-AP処置マウス中の腫瘍細胞の
大部分がホスファターゼ活性に対し高陽性に染められた
ことを示した。
本発明の結合体／エトポシドホスフェートプロドラッグ
組合せの生体内抗腫瘍効果 療法実験はs.c.腫瘍約225mm3容積を有したヌードマウ
スで行なった。結合体、L6-APおよび1F5-APをEP処置の1
8〜24時間前に投与（i.p.）した。腫瘍増殖を非処置マ
ウスおよびエトポシドまたはEP単独の最大許容量で処置
したマウス中のそれに比較した。
より詳しくは、両側H3347腫瘍を有する８ヌードマウ
スの群をエトポシド（2:3のDMSO:H2O中のエトポシド1.2
mgを含有する0.2ml）あるいはEP（H2O中のEP 2mgを含有
する0.2ml）単独あるいはL6-AP（PBS中の300μｇ抗体を
含有する0.1ml）または1F5-AP（PBS中の300μｇ抗体を
含有する0.1ml）次いでEP処置、で処置した。各試験に
は非処置マウスの１対照群が包含された。腫瘍容積を腫
瘍移植後種々の日に次式を用いて評価した： 〔（垂直幅２/2）〕×最大長さ これらの試験の結果は第11図に示される。エトポシド
は用いた用量で腫瘍増殖に対し非常に小さい効果を有
し、一層高い用量は十分に許容されなかった。プロドラ
ッグEPは動物に対する毒性が少なく、従って投与できた
高用量がエトポシドそのもので認められたよりも大きい
抗腫瘍効果を生じた。同程度の抗腫瘍活性が対照結合体
1F5-APをEP処置の前に受けたマウスに認められた。しか
し、マウスをL6-AP、次にEPで処置したときに一層顕著
な抗腫瘍効果が認められた。L6-AP単独は腫瘍増殖に効
果を有しなかった（データは示されない）。
各個々の腫瘍の療法に対する応答の概要が表２に示さ
れる。L6-APおよびEPで処置した８マウス中の16腫瘍中
６腫瘍が完全な退行を経験し、他の２つが処置の開始時
より大きさが小さくなった。他の処置プロトコルのいず
れも完全または部分応答が認められなかった。
データは腫瘍移植23日後の各群中の16腫瘍の応答を示
す。
＊応答：進行−腫瘍増殖経続；不変−追加の腫瘍増殖な
し；部分−大きさの減少；完全−見掛け上腫瘍をなくす
る退行。
この実施例は明らかに腫瘍特異性抗体−酵素結合体お
よび、酵素により比較的細胞障害性でない形態から強力
な細胞障害性形態に転化されることができるプロドラッ
グを用いて細胞障害性抗腫瘍薬を腫瘍細胞に供給する本
発明の方法の適用可能性を示す。
実施例２ この実施例は比較的細胞障害性でないマイトマイシン
ホスフェートプロドラッグを活性マイトマイシン薬物に
転化し腫瘍細胞に対して試験管内細胞毒性を生ずる本発
明の免疫結合体および方法の使用を示す。さらに、実施
例１に示したように、次の実施例は生体内腫瘍細胞に対
する細胞障害性抗腫瘍薬の供給に対する本発明の免疫結
合体、プロドラッグおよび方法の適用可能性を示す。
この実施例は実施例１に記載したように調製したL6-A
Pおよび1F5-AP免疫結合体を用いる。本発明のこの態様
によれば、これらの抗体−酵素結合体のそれぞれを新規
マイトマイシンホスフェートプロドラッグと反応させ
た。より詳しくは、用いたプロドラッグはマイトマイシ
ンＣのN7-C1-8アルキルリン酸の二ナトリウム塩であっ
た。この反応の結果遊離された抗腫瘍物質はマイトマイ
シンアルコール誘導体であった。本発明のL6-AP/マイト
マイシンホスフェートプロドラッグ組合せは試験管内で
腫瘍細胞に対する細胞毒性およびマウス中の顕著な生体
内抗腫瘍効果を生じた。
新規マイトマイシンホスフェートプロドラッグの調製 新規マイトマイシンホスフェートプロドラッグ、７−
（２′−アミノエチルホスフェート）マイトマイシン
（以下「MOP」として示す）はマイトマイシンＣ（MMC）
の２−アミノエスルホスフェート誘導体であり、次のよ
うに調製した：リン酸二水素２−アミノエチル（56mg、
0.4ミリモル）の水（0.35ml）およびトリエチルアミン
（0.3ml、２ミリモル）中の溶液をメタノール（6ml）中
のマイトマイシンＡ（以下「MMA」として示す）（140m
g、0.4ミリモル）に加え、反応を室温で一夜進行させ
た。次いで飽和水性炭酸水素ナトリウム1.4mlを加え、
溶液を水と塩化メチレンとの間に分配させた。水相を濃
縮乾燥し、メタノール数部を加えて蒸発させた。残留物
をメタノールに吸収させ、濾過し、２×10cm C-18（逆
相）シリカカラムに適用した。生成物を水で溶出させ、
揮発性物質をすべて蒸発させた。前記のようにメタノー
ルを加えて蒸発させ、残留物をデシケータ中五酸化リン
で高真空下に24時間乾燥した。マイトマイシンホスフェ
ート誘導体MOPが微細青色粉末として得られた（190mg、
97％）。
360MHz ′H-NMR（D2O）δ 1.94（s,3H,CH3）,2.9-3.1
（m,4H）,3.20（s,OCH3）,3.28（s,1H）,3.36（s,1H）,
3.5-3.65（m,4H）,4.1-4.25（m,2H）,4.50-4.57（dd,1
H,10-H）． 従って、MOPはMMAの７−メトキシ基をリン酸２−アミ
ノエチルで置換することにより調製された（第12図参
照）。生成物は炭酸水素ナトリウムによる処理で水溶性
二ナトリウム塩に転化された。
相当する公知マイトマイシンアルコール誘導体、７−
〔（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−9a−メトキシマ
イトサン（以下「MOH」として示す）はイエンガー（B.
S.Iyengar）ほか、「マイトマイシンＣおよび７位に置
換エチルアミンを有するポルフイロマイシン類似体」、
ジャーナル・オブ・メデイシナル・ケミストリー（J.Me
d.Chem.）、26、pp.16〜20（1983）の方法に従ってMMA
（100mg、0.286ミリモル）とエタノールアミン（26mg、
0.429ミリモル）との反応により調製した。生成物は微
細青色粉末として得られた（58mg、54％）。
マイトマイシンホスフェートプロドラッグの反応性およ
び安定性 次いでMOPプロドラッグをそのAPとの反応性について
試験した。MOP（1mM）の100mMトリス、pH7.2緩衝液中の
溶液に室温で仔ウシ腸またはヒト胎盤APを加えた（最終
濃度１μg/ml）。反応の経過はC-18カラム（4.6×150m
m）および次の条件を用いてHPLCによりモニターした：
検出280nm;8分にわたり酢酸塩緩衝液（100mM、pH5.2）
中の30〜95％メタノール、15分後再平衡；流量0.8ml/
分。これらの条件下に、MMCは7.0分で溶出し、MOHは8.5
分で溶出し、MOPは4.0分で溶出した。第13図に示される
ように、MOPプロドラッグ上のリン酸基はAPで速やかに
開裂された。HPLCは相当するアルコールMOHが形成され
たことを確認するのに役立った。用いた反応条件のもと
でMOPの加水分解に対する半減期は約10分であり、反応
は40分以内に完了した。
MOPおよびEPのヒト血清中の安定性は、HPLCを用いて
プロドラッグの消失の速度並びにMOHおよびエトポシド
の形成の速度の両方を測定することにより測定した。従
って、例えばMOPの溶液（100mMトリス、pH7.2中1mM）を
最終薬物濃度が0.1mMであるように新ヒト血清に加え
た。分割量（0.25ml）をメタノール（0.25ml）およびED
TA（100mMで50μｌ）で希釈して血清タンパク質を沈殿
させ、反応を停止させた。試料を遠心分離し、前記のよ
うにHPLCにより分析した。EPの50％加水分解が１時間後
に起こったこと、しかし、MOPの単に25％が４時間後に
加水分解したことが認められた。完全な加水分解は血清
にAPを加えることにより速やかに達成できた。
H2981腫瘍細胞に対する抗体−アルカリ性ホスファター
ゼ結合体の結合 次いで本発明のL6-APおよび1F5-AP抗体−酵素結合体
のH2981腫瘍細胞に結合する能力を測定した。H2981細胞
系は肺の一次ヒト腺癌から確立された〔ヘルストロム
（I.Hellstrom）ほか、「ヒト肺癌に対して生じた単ク
ローン性マウス抗体」、カンサー・リサーチ（Cancer R
es.）、46（No.8）、pp.3917〜23（1986）参照〕。L6抗
体はH2981細胞に強く結合する（10μg/mlで飽和）こと
が知られているが、1F5はこれらの細胞に対し非常にわ
ずかの結合を示す。
結合検定は実施例１に記載したように行なった。FACS
分析はL6およびL6-APが細胞に強く結合したが、1F5およ
び1F5-APに対して非常に弱く結合が示されたことを示し
た（第14図参照）。
H2981腫瘍細胞に対する本発明の結合体／プロドラッグ
組合せの試験管内細胞毒性 本発明の結合体／プロドラッグ組合せの細胞障害効果
が実施例１に記載した3H−チミジン取込み検定により試
験管内で示され；この場合に試験管内細胞毒性に対する
試験にH2981腫瘍細胞を用い、CEM細胞を対照として用い
た。Ｔ細胞全細胞系、CEMはATCCから入手され、L6また
は1F5単クローン性抗体を結合しない。プロドラッグEP
およびMOPのL6-APまたは1F5-AP免疫結合体の不在または
存在下の腫瘍細胞に対する細胞障害効果を分析した。こ
れらの組合せの細胞障害効果はまた各親薬物単独の細胞
障害効果と比較した。
簡単に記載すると、10％ウシ胎仔血清を含むIMDM 0.1
ml中の106 H2981またはCEM細胞の懸濁液を結合体10μg/
mlの存在下に４℃で１時間インキュベートした。細胞を
10％ウシ胎仔血清を含む培地で２回洗浄し、リン酸塩緩
衝食塩水pH7.2（PBS）1ml中に再び懸濁し、96ウェルミ
クロタイタープレートに塗布した（10,000細胞／ウェ
ル）。次いでPBS中のプロドラッグを加え、37℃でイン
キュベーションを１時間（MOPに対し）または５時間（E
Pに対し）行なった。次いで細胞を２回洗浄し、インキ
ュベーションを合計24時間（3H−チミジン1.0μCi/ウェ
ルによる６時間標識を含む）続けた。プレートを−70℃
で凍結して細胞を分離し、融解後細胞をガラス繊維ディ
スク上に収集した。フィルターをベックマン3801シンチ
レーションカウンターで計数し、結合体／プロドラッグ
組合せの細胞障害効果をプロドラッグまたは親薬物単独
による細胞の処理で認められた細胞毒性と比較した。結
果は第15〜17図に示される。
第15図に示されるように、エトポシド（２μＭのI
C50）はEP（30μＭで20％殺害）よりもH2981細胞に対し
有意に一層毒性であった。細胞のプロドラッグ暴露の前
の1F5-APによる前処理は細胞毒性の非常にわずかの増大
を生じた。しかし、細胞障害活性の驚くべき増加が細胞
を初めにL6-APに次いでEPに暴露したときに認められ
た。細胞障害効果はエトポシド単独のそれに匹敵した。
同様の結果がマイトマイシン誘導体を用いて認められ
た。第16図に示されるように、MMCおよびMOHはH2981細
胞に対して等しく細胞障害性であり、約１μＭのIC50値
を有した。ホスフェートプロドラッグMOPはおそらくそ
れが細胞に滲透する能力を欠くために非常に低い細胞障
害性（10μＭで５％細胞殺害）であった。しかし、MOP
の活性は腫瘍細胞を本発明のL6-AP結合体に予め暴露し
たときにMOHおよびMMCに匹敵した。非結合性結合体1F5-
APがプロドラッグの細胞障害活性に有意に影響を与えな
かったので、この増大は抗原特異性であった。L6-APも1
F5-APもCEM細胞に対するMOPの細胞障害効果を驚くほど
増大せず、これらの結合体のこの細胞系に結合しない事
実と矛盾しない（第17図参照）。従って、これらの結果
は試験したプロドラッグのそれぞれのホスフェート基が
薬物を不活性にすることおよび腫瘍細胞の表面に結合し
た抗体−酵素結合体によりプロドラッグ、EPおよびMOP
のフオスフェート基が加水分解されると活性細胞障害性
薬物を生ずることを示す。
本発明の結合体／マイトマイシンプロドラッグ組合せの
生体内抗腫瘍効果 本発明のL6-AP結合体と組合せたMOPの生体内抗腫瘍活
性の調査に先立って、プロドラッグおよびその遊離され
た活性誘導体MOHの相対毒性をBal b/c nu/nuマウスで測
定した。薬物を４日離して２等用量で投与（i.p.）し、
MOHおよびMOPに対しそれぞれ45および90mg薬物/kg体重
のLD50値が得られた。また一層少い用量を長時間にわた
り用いてかなり多量の薬物を投与できることが認められ
た。MOH 40mg/kgおよびMOP 100mg/kgまでの合計量が、
４等用量で25日の期間にわたって投与すれば十分に許容
された。これらの研究は有意に多くのマイトマイシンプ
ロドラッグがその低い毒性のために許容されたことを示
した。
次いで生体内源から得たH2981腫瘍を移植した（s.
c.、右後側腹部）ライフ・サイエンス（Life Sciences,
St.Petersburg,Fla.）から得たヌードBal b/c nu/nuめ
すマウス（６マウス毎処置群）で療法研究を行なった。
試験は腫瘍が約100mm3の容積に達したときに行なった。
L6-APおよび1F5-AP結合体（PBS中の250μｇ抗体を含む
0.1ml）をMOP（H2O中の0.6mgMOPを含む0.2ml）による処
置の18〜24時間前にそれぞれ投与（i.p.）した。腫瘍増
殖は非処置マウスおよび最大許容量のMOP（H2O中の0.6m
gMOPを含む0.2ml）またはMOH（H2O中の0.2mgMOHを含む
0.2ml）で処置したマウス中に認められたものと比較し
た。
第18図に示されるように、MOHおよびMOPはともに生体
内で有意な抗腫瘍活性を有した。750mm3の平均腫瘍容積
に達するまでに要した時間はMOHで処置したマウスで45
日、MOPプロドラッグで処置したマウスで63日、および
対照群で27日であった。前記のようにMOPプロドラッグ
は動物に対する毒性が少なく、従って投与できた高い用
量がMOH誘導体で認められたよりも大きい抗腫瘍効果を
生じた。非結合性結合体1F5-APがMOPの活性を多少増大
したけれども、一層顕著な効果がMOP処置前にL6-APを受
けた群に認められた。図に示されるように、70日で、L6
-AP結合体で前処置（次いでMOP処置）した腫瘍は1F5-AP
結合体で前処置した腫瘍の大きさの約1/3であった。さ
らに、表３に示されるように、移植の63日後までにL6−
AP＋MOP処置マウス中６腫瘍中３つが完全退行を経験
し、残り３腫瘍は処置の着手から大きさの増加がなかっ
た。対照的に1F5−AP＋MOP処置群中の５腫瘍中の３つは
実際に大きさが進行し、５腫瘍中の２つが不変であり、
部分または完全退行がなかった。
これらの試験は明らかに本発明の標的指向酵素/MOP組
合せの生体内における特異性および増大した抗腫瘍効果
を示す。
実施例３ この実施例は本発明の免疫結合体、プロドラッグおよ
び方法の、腫瘍細胞に対する多くの異なる薬物の供給に
対する適用可能性を示す。抗体−アルカリ性ホスファタ
ーゼ結合体L6-APをプロドラッグEPおよびMOPと組合せた
使用が高い生体内抗腫瘍活性を示した。従って、本発明
は腫瘍に対する組合せ化学療法に対する単一の抗体標的
指向酵素とプロドラッグのパネルとの使用を提供する。
プロドラッグ、EPおよびMOP、はそれぞれ実施例１お
よび２に記載したように調製した。
L6-APおよび1F5-AP免疫結合体の調製は実施例１に記
載されている。ヌードマウスにおける生体内研究は実施
例１および２に記載したように行なった。従って、H298
1腫瘍を移植したヌードマウスをMOP/EP（H2O中のEP 1mg
およびMOP 0.3mgを含む0.2ml）で処置する18〜24時間前
にL6-APまたは1F5-AP結合体に前暴露した。腫瘍増殖を
非処置マウスおよびMOP/EP組合せ単独で処置したマウス
中に認められたものと比較した。
第19図に示されるように、MOP/EP組合せ単独およびMO
P/EP組合せプラス1F5-AP処置の抗腫瘍活性はおよそ等し
かった。また表４に示されるように、これらの２群中の
腫瘍のすべて並びに非処置対照マウスの腫瘍はサイズが
成長した。しかし、腫瘍をもつマウスのL6-AP結合体に
よる前処置、次いでMOP/EP組合せは顕著な抗腫瘍応答を
生じた。第19図に示されるように、第70日にL6-APで前
処置（次いで組合せたMOP/EP処置）した腫瘍は1F5-AP結
合体で前処置した腫瘍の大きさの約1/3であった。さら
に、移植63日後までにマウスのL6-AP前処置群中の６腫
瘍中の１つは完全に退行し、６腫瘍中の３つは増殖を停
止し、６腫瘍中の２つのみが大きさで進行した。
従って、これらの生体内研究は腫瘍に対する組合せ療
法に対する本発明の結合体、プロドラッグおよび方法の
適用可能性を示す。
あるいは、本発明の結合体例えばL6-APをプロドラッ
グの他の組合せ、例えばEP、アドリアマイシン−14−ホ
スフェートおよび５−フルオロウリジンモノホスフェー
トとともに用いて腫瘍細胞に多くの異なる細胞障害性物
質を供給することができる。
再び、抗体−酵素結合体L6-APおよびプロドラッグ、
エトポシド−４′−ホスフェートの調製は実施例１に記
載されたとおりである。アドリアマイシン−14−ホスフ
ェートは、1980年１月22日にドセップ（J.B.Ducep）に
対して発行された米国特許第4,185,111号に記載された
ように調製される。５−フルオロウリジンモノホスフェ
ートはロビンス（M.J.Robins）ほか、カナジアン・ジャ
ーナル・オブ・ケミストリー（Can.J.Chem.）、53、pp.
1302〜1306（1975）に記載されたように調製される。
L6-APと上記３プロドラッグとの反応は次のように行
なわれる:AP単独またはL6-AP結合体（最終AP濃度５μg/
ml）を、MgCl2（1mM）およびZnCl2（0.1mM）をpH7.0で
含むトリス緩衝液（100mM）中のエトポシド−４′−ホ
スフェートまたはアドリアマイシン−14−ホスフェート
（0.1mM）の溶液に加える。５−フルオロウリジンプロ
ドラッグに対しては反応条件はリン酸塩緩衝液（100m
M）、pH8.0中の５−フルオロウリジン（３μＭ）の溶液
を必要とする。L6-APと、エトポシドホスフェートまた
は５−フルオロウリジンプロドラッグとの反応は実施例
１に記載したようにモニターする。L6-APとアドリアマ
イシン−14−ホスフェートとの反応はHPLCによりIBM C-
18カラム（３μ、4.5×100mm）および溶離剤として３％
酢酸アンモニウムを含む水中の65％メタノール（0.5ml/
分、495nmでモニター）を用いてモニターする。
抗体−AP結合体と各プロドラッグとの反応はホスフェ
ート部分の加水分解による除去を生じ、遊離薬物を遊離
する〔例えば、マコム（R.B.McComb）ほか、アルカリン
・ホスファターゼ（Alkaline Phosphatase）、プレナム
・プレス（Plenum Press,New York）、（1979）参
照〕。
本発明のL6-AP結合体の存在下の３プロドラッグのそ
れぞれの腫瘍細胞に対する細胞毒性は前記実施例１に記
載したコロニー阻止検定を用いて示すことができる。結
合体によりプロドラッグのそれぞれからホスフェート部
分が除去されるとエトポシド、アドリアマイシンおよび
５−フルオロウリジンが遊離される。３薬物のそれぞれ
が強力な抗腫瘍物質であることが示された〔例えば、オ
ドウヤー（P.J.O'Dwyer）ほか、「エトポシド：活性抗
癌薬の現状」、ニュー・イングランド・ジャーナル・オ
ブ・メデイシン（New England Journal of Medicin
e）、312、pp.692〜700（1985）；エンブレトン（M.J.E
mbleton）ほか、「抗癌物質の抗体標的指向」、モノク
ローナル・アンティボデイズ・フオ・カンサー・デテク
ション・アンド・セラピー（Monoclonal Antibodies Fo
r Cancer Detection And Therapy）、ボルドウインほか
（R.W.Baldwin and V.S.Byers）編、pp.321〜22、アカ
デッミク・プレス（Academic Press）（1985）；米国特
許第4,185,111号、前揚；クルッケほか（S.T.Crooke an
d S.D.Reich）編、アントラシクリンズ：カーレント・
ステータス・アンド・ニュー・デベロープメンツ（Anth
racyclines:Current Status And New Developments）、
アカデミック・プレス（Academic Press,New York）（1
980）：およびハイデルバーガー（C.Heidelberger）ほ
か、「フッ素化ピリミジンおよびそれらのヌクレオシ
ド」、アドバンシス・イン・エンチモロジー・アンド・
リレーテッド・エリアズ・オブ・モノキュラー・バイオ
ロジー（Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.）、54、p
p.57〜119（1983）参照〕。
従って、エトポシド、アドリアマイシンおよび５−フ
ルオロウリジンのプロドラッグは本発明の抗体−アルカ
リ性ホスファターゼ結合体により腫瘍の部位に相当する
公知抗腫瘍物質を遊離させるために一緒にまたは連続的
に用いることができる。例えば、互いに組合せて投与し
た抗腫瘍物質が相乗的に作用できることが示された〔例
えば、モンファルジニ（S.Monfardini）ほか、「癌化学
療法のマニュアル」UICCテクニカル・レポート・シリー
ズ（UICC Technical Report Series）、56（1981）参
照〕。従って本発明のこの態様は腫瘍に対する組合せ化
学療法のための方法を提供する。
実施例４ 次の実施例は比較的細胞障害性でないプロドラッグを
腫瘍細胞に対する細胞毒性を試験内で示す活性抗腫瘍物
質に転化する本発明のなお他の免疫結合体およびプロド
ラッグの使用を示す。この実施例によれば、L6−ペニシ
リンＶアミダーゼ（以下「PVA」として示す）免疫結合
体がアドリアマイシンのＮ−フェノキシアセチル誘導体
の公知抗腫瘍物質アドリアマイシンへの転化に使用され
る。
本発明の抗体−ペニリシンＶアミダーゼ結合体の調製 この実施例において、L6-PVA免疫結合体および1F5-PV
A免疫結合体を調製した。抗体L6および1F5並びにそれら
の源は前に記載した。用いたアミダーゼ酵素は、ロウエ
（D.A.Lowe）ほか、「フサリウム・オキシスポルムによ
るペニシリンＶの６−アミノペニシラン酸への酵素加水
分解」、バイオテクノロジー・レターズ（Biotechnolog
y Letters）、８（３）、pp.151〜56（1986）により開
示された方法に従いフサリウム・オキシスポルムの真菌
培養から分離したペニシリンＶアミダーゼであった。こ
の酵素を分離できるフサリウム・オキシスポルム株はAT
CCに寄託されている。従って、PVAはペニシリンＶをペ
ニシラン酸に転化する入手の容易な酵素である。より詳
しくは、PVAはペニシリンＶのフェノキシアセチルアミ
ド結合を加水分解してペニシラン酸を生ずる。従って、
フェノキシアセトアミドと反応する酵素をフェノキシ酢
酸またはｐ−ヒドロキシフェノキシ酢酸で誘導体にした
公知細胞障害性物質のプロドラッグの開裂に使用するこ
とができる。
本発明のこの態様の抗体−PVA結合体は実施例１のAP
結合体に対して記載したと実質に同様の方法で調製し
た。抗体L6および1F5を記載のようにイミノチオランと
反応させ、各抗体上に導入されたスルフヒドリル基の数
が１〜２の間にあると測定された。
次いでPVA酵素をPBS中に9mg/mlで溶解し、SMCC〔ピア
ス・ケミカル社（Pierce Chemical Co.）製、DMF中100m
M〕を最終濃度が5mMであるように加えた。SMCCによる処
理は酵素上にマレイミド基を導入した。30℃で30分後、
修飾された酵素をG-25PD-10セフアデックス〔ファルマ
シア（Pharmacid,Upsalla,Sweden）製〕上のゲル濾過に
より精製し、PBSで溶出させた。次いで修飾されたPVAを
各チオール化抗体の溶液に3:1のモル比に加えた。各反
応混合物を窒素で飽和し、室温で３時間放置し、４℃で
さらに18時間インキュベートした。この時点で２−アミ
ノエタンチオール（最終濃度1mM）を各溶液に加え、他
の未反応マレイミドをブロックした。
次いで各反応混合物を、50mM-NaClを有する20mMトリ
ス、pH7.2を溶離剤として用いてゲル濾過カラム（G-2
5）に通した。生じた混合物をDEAEセファデックスカラ
ム（2.5×10cm）で精製した。フラクションを280nmでモ
ニターした。各混合物の未反応抗体はカラムに結合せ
ず、結合体および未反応PVAを0.5M-NaClを有する20mMト
リス、pH7.2で溶出させた。PVAおよび結合体を含むフラ
クションを次いでアミコン（Amicon）YM-30限外濾過フ
ィルターを用いて濃縮し、セフアクリルS-300カラム
（2.5×95cm）上でPBSを溶離剤として用いて精製した。
フラクションは280nmでモニターし、SDS-PAGE（４〜12
％勾配ゲル）により測定して純結合体を含むフラクショ
ンをプールした。
新規アドリアマイシンプロドラッグの調製 次いで上記調製抗体−PVA結合体のそれぞれを新規ア
ドリアマイシンプロドラッグと反応させた。より詳しく
は、用いたプロドラッグは、アドリアマイシンが第20図
に示されるようにアミノ糖部位においてｐ−ヒドロキシ
フェノキシ酢酸でアシル化されているＮ−（ｐ−ヒドロ
キシフェノキシアセチル）アドリアマイシン（以下「AP
O」として示す）であった。
このアドリアマイシンプロドラッグは次のように調製
した： テトラヒドロフラン10ml中へｐ−ヒドロキシフェノキ
シ酢酸84mg（0.5ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド57mg（0.5ミリモル）およびジシクロヘキシルカ
ルボジイミド100mg（0.49ミリモル）を入れた。この混
合物を２時間かくはんし、その時間で溶液を濾過し、濾
液をアドリアマイシン塩酸塩200mg（0.35ミリモル）に
加えた。トリエチルアミン0.1mlを反応混合物に加え、
かくはんを４時間続けた。次いで反応混合物をガラスウ
ールに通して濾過し、高真空下に蒸発させて残留物を得
た。生じた混合物をシリカゲル60カラム（2.5×20cm）
上で精製し、95:5のジクロロメタン：メタノールで溶出
させた。フラクションをプールし、再び同様のカラム上
で精製すると純Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチ
ル）アドリアマイシン70mg（0.1ミリモル、30％収率）
が得られた。
FAB MS m/e 694.2125(M+H)+．計算値（C35H36NO14）,
694.2136.360MHz 1H NMR (CDCl3）δ 1.06（d,3H,糖 C
H3）,1.5-2.2（m,6H,糖 Ｈ）,3.0（q,2H）4.0（s,3H,O
CH3）,4.35（s,2H,COCH2O）,4.8-5.0（m,3H）,5.2およ
び5.4（s,1H）,6.6-6.8（dd,4H,フェノキシ ArH）,7.4
-7.9（m,3H,2,3,4−Ｈ）,9.0（s,1H,Ar′OH）,11.61お
よび12.39（s,1H,ArOH）． アドリアマイシンの他のフェノキシアセチルアミド誘
導体を上記と実質的に同様の操作を用いて合成できるこ
とを理解すべきである。例えばＮ−（フェノキシ）アド
リアマイシンを、ｐ−ヒドロキシフェノキシ酢酸の代り
にフェノキシ酢酸0.5ミリモル（76mg）を用いて本節に
記載したように合成することができる。同様に、Ｎ−
（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチル）メルファランま
たはダウノマイシンプロドラッグあるいはＮ−（フェノ
キシアセチル）メルファランまたはダウノマイシンプロ
ドラッグを、メルファラン100mgまたはダウノマイシン2
00mg（0.35ミリモル）を用いてこの合成プロトコルによ
り合成することができる。
抗体−ペニシリンＶアミダーゼ結合体とアドリアマイシ
ンプロドラッグとの反応 抗体−PVA結合体LV-PVAの新規プロドラッグAPOをアド
リアマイシンに転化する能力を次のように測定した:a）
PVA単独（最終濃度50μg/ml）、ｂ）L6-PVA結合体100μ
g/ml（最終PVA濃度25μg/ml）、またはL6-PVA 10μg/ml
（最終PVA濃度2.5μg/ml）をPBS中のAPO（0.1mM）の溶
液に加えた。各反応をHPLCによりフェノミネックス（Ph
enominex）C-18カラム（３μｍ、4.5×100mm）および0.
1％H3PO4を有する水中の20〜60％テトラヒドロフランの
勾配溶離（0.1ml/分、495mmでモニター）を用いてモニ
ターした。これらの条件のもとでアドリアマイシンは8.
9分で溶出し、APOは12.2分で溶出した。結果は第21図に
示される。
図に示されるように、APOのアミド基がアドリアマイ
シンの発生によって示されるようにPVAによって実際に
加水分解された。用いた条件のもとでPVAによるAPOの加
水分解に対する半減期は約20分であった。さらに、反応
開始の40分以内に酵素単独または抗体−PVA結合体がAPO
の少くとも80％のアドリアマイシンへの加水分解を行な
うことができたことが認められた。結合体は10μg/ml
（PVA 2.5μg/ml）でこの水準の加水分解を120分以内に
行なうことができた。最後に、これらの研究から結合体
および遊離酵素がAPOのアドリアマイシンへの加水分解
に類似する能力を示した事実により明らかなように、本
発明の抗体−PVA結合体が抗体に対する酵素の結合に基
く酵素活性の明らかな低下を示さなかったことが明らか
である。
本発明の新規アドリアマイシンプロドラッグの血清安定
性 APOのヒト血清中の安定性を、HPLCを用いてAPOの消失
の速度およびアドリアマイシンの形成の速度を測定する
ことにより測定した。従って、APOの溶液（ジメチルホ
ルムアミド中10mM）を新鮮なヒト血清に最終濃度が0.1m
Mであるように加えた。分割量（50μｌ）をメタノール
（50μｌ）で希釈して血清タンパク質を沈殿させた。次
いでこれらの試料を遠心分離し、すぐ前に記載したよう
にHPLCにより分析した。APOのアドリアマイシンへの加
水分解は２時間以内に起こらなかった。
抗体−PVA結合体のH2981腫瘍細胞に対す結合 本発明のL6-PVAおよび1F5-PVA結合体のH2981腫瘍細胞
に結合する能力を実施例１および２に記載したように測
定した。結合検定の結果は第22図に示される。
FACS分析はL6およびL6-PVA結合体がともに腫瘍細胞に
強く結合し、1F5-PVA結合体が有意量の結合を示さなか
ったことを示した。この結合研究は第１に酵素に対する
結合が本発明の免疫結合体の抗体成分の結合能力に実質
的に影響を与えなかったことを示す。第２に、この検定
はまた結合体の結合の特異性を示し;L6-PVA結合体がL6
陽性H2981腫瘍細胞に結合し、1F5抗体が腫瘍細胞に対す
る特異性を欠くために1F5-PVA結合体が実質的に結合を
示さなかった。
本発明の抗体−PVA結合体／アドリアマイシンプロドラ
ッグ組合せのH2981腫瘍細胞に対する試験管内細胞毒性 本発明の抗体−PVA/アドリアマイシンプロドラッグ組
合せのH2981腫瘍細胞に対する試験管内細胞障害効果
を、実施例１および２に記載した3H−チミジン取込み検
定を用いて測定した。簡単に記載すると、H2981腫瘍細
胞をIMDM中で96ウェルミクロタイタープレート中に置き
（10,000細胞／ウェル）、37℃で18時間付着させた。次
いで抗体−PVA結合体、L6-PVAまたは1F5-PVA、を抗体10
μg/mlの濃度で加え、プレートを４℃で30分間インキュ
ベートした。次いでウェルをIMDMで４回洗浄し、APOをI
MDM中の種々の濃度で加えた。２時間後にウェルを再び
洗浄し、IMDMを加え、細胞を37℃で18時間放置した。そ
の時点で3H−チミジンを加え（１μCi毎ウェル）、６時
間後にプレートを−70℃で凍結し、細胞を分離した。融
解後細胞をガラス繊維ファイバー上に収集した。3H−チ
ミジンをベックマン3801シンチレーションカウンター中
で測定し、APOまたはアドリアマイシン（ADM）単独で処
置した細胞と比較した。
この検定を用いて我々は腫瘍細胞のDNA中への3H−チ
ミジン取込みの阻止、従ってプロドラッグ、APOのL6-PV
Aまたは1F5-PVA結合体による細胞の前処理を有しまたは
有さない細胞に対する細胞障害効果を測定した。これら
の組合せの細胞障害効果を親薬物アドリアマイシン単独
による細胞処理で認められた細胞毒性と比較した。第23
図に示されるように、結合体による処理のない腫瘍細胞
に対して38nMのIC50を有するアドリアマイシンが２μＭ
のIC50を有するAPOより有意に一層毒性であった。これ
はアドリアマイシンアミドがアドリアマイシンよりも毒
性が低いことを示す以前の報告に基いて予期された〔例
えば、レビンほか（Y.Levin and B.A.Sela）、FEBSレタ
ーズ（FEBS Letters）、98、p.119（1979）およびボー
レイン（R.Baurain）ほか、ジャーナル・オブ・メディ
シナル・ケミストリー（J.Med.Chem.）、23、p.1171（1
980）参照〕。
細胞のL6-PVAによる前処理はAPOの細胞毒性をアドリ
アマイシン単独に認められたものに匹敵する水準に20倍
も増大した。細胞の1F5-PVAによる前処理はAPOの毒性に
全く影響を与えなかった。これらの結果はL6-PVA結合体
が比較的細胞障害性のないプロドラッグAPOを加水分解
し、アドリアマイシン単独の使用に匹敵する程度に腫瘍
細胞を殺すことができること、およびこの特定腫瘍細胞
系に有意に結合しない1F5-PVA結合体がそのような細胞
毒性を示さなかった事実により示されるようにこの細胞
毒性が抗原特異性であることを示す。
ドージリンパ腫細胞に対する抗体−PVA結合体の結合 本発明のL6-PVAおよび1F5-PVA結合体の公知ドージ細
胞系に結合する能力もまた測定した。この細胞系は、1F
5抗体が結合するCD-20抗原を発現するATCCに寄託された
（ATCC＃CCL213）パーキット（Burkitt）リンパ腫細胞
系である。結合検定は実施例１に記載したように行なっ
たが、しかし用いた細胞系はドージ細胞であり、結果は
第24図に示される。
この場合に、1F5単クローン性抗体および1F5-PVA結合
体はともにリンパ腫細胞に強く結合した。従って、この
研究はまた結合体の結合能力が結合操作により有意に影
響されなかったことを示す。
さらに、図に示されるように、L6抗体およびL6-PVA結
合体がドージ細胞に対し評価できる結合を示さなかっ
た。これはドージ腫瘍細胞が、L6抗体が反応する抗原を
有しないので予期されたことであった。従って、こゝに
記載した前の結合研究と組合せて、この研究は明らかに
本発明の結合体の結合の特異性を示し、すなわち、L6含
有結合体はL6陽性腫瘍細胞に特異的に結合し、1F5含有
結合体はCD-20陽性腫瘍細胞に特異的に結合する。
本発明の抗体−PVA結合体／アドリアマイシンプロドラ
ッグ組合せのドージ細胞に対する試験管内細胞毒性 次いで我々はAPOプロドラッグと組合せたL6-PVAまた
は1F5-PVA結合体のドージ細胞に対する試験管内細胞障
害効果を試験した。
ドージ細胞が付着しない事実のため3H−チミジン検定
を多少変形して実質的に前記実施例に記載したように行
なった。従って、IMDM中の約250,000ドージ細胞を96ウ
ェルミクロタイタープレートの各ウェルに塗布し、抗体
−酵素結合体を加えた。反応混合物を４℃で30分間イン
キュベートした。非結合抗体−酵素結合体を500×ｇで
５分間遠心分離することにより除去し、上澄みを除去し
た。細胞をIMDM中に再び懸濁し、洗浄操作を３回繰返し
てすべての非結合結合体を除去した。次いでIMDM中のAP
Oを２時間加え、前記のように１回洗浄した。検定の残
余は前記実施例に記載したように行なった。
この検定を用いて我々はドージ細胞のDNA中への3H−
チミジン取込みの阻止、従ってL6-PVAまたは1F5-PVA結
合体による細胞の前処理を有しまたは有しない細胞に対
するAPOプロドラッグの細胞障害効果を測定した。これ
らの組合せの細胞障害効果をアドリアマイシン単独によ
る細胞の処理で認められた細胞毒性と比較した。第25図
に示されるように、結合体による処理のないドージ細胞
に対しアドリアマイシンはAPOより有意に一層毒性であ
った。1F5-PVA結合体による細胞の前処理はAPOプロドラ
ッグの細胞毒性をアドリアマイシン単独で認められたも
のに匹敵する水準に有意に増大し、L6-PVA結合体による
前処理はそのような増大を生じなかった。
これらの結合および細胞毒性研究から得られた結果
が、L6-PVAプラスAPO組合せが増大した細胞障害効果を
示し1F5-PVAプラスAPO組合せが示さなかったH2981腫瘍
細胞を用いたこの実施例の前に記載した研究において得
られた結果の逆であることに注意すべきである。これは
結合体のL6および1F5抗体の異なる特異性から予期さ
れ、明らかに本発明の結合体／プロドラッグ組合せで得
られた細胞障害効果の特異性を示す。
さらに、この研究は試験管内で腫瘍細胞に対する細胞
障害効果の生成に対するAPOと組合せた1F5-PVA結合体の
有用性を示す。従って、この実施例の試験管内細胞毒性
研究は抗体が反応する腫瘍の処置のための腫瘍関連抗原
と反応性の抗体を含む任意の結合体に対する本発明の適
用可能性を示す。
実施例５ この実施例は抗体結合シトシンデアミナーゼ（CD）酵
素によるプロドラッグ５−フルオロシトシン（以下「5-
FC」として示す）の抗腫瘍薬５−フルオロウラシル（以
下「5-FU」として示す）への転化に対する本発明の免疫
結合体および方法の使用に関する（第26図参照）。この
態様の抗体−CD結合体/5-FCプロドラッグ組合せは試験
管内で試験管内で腫瘍細胞に対し有意な細胞障害効果を
示した。
本発明の抗体−シトシンデアミナーゼ結合体の調製 先の実施例に示したL6および1F5単クローン性抗体お
よびシトシンデアミナーゼ酵素を用いてL6-CDおよび1F5
-CD免疫結合体を調製した。CD酵素は種々の微生物から
検出され、分離されたけれども〔例えばウェスト（Wes
t）ほか、ビオシミカ・エ・ビオフィシカ・アクタ（Bio
chem.Biophys.Acta）、719、pp.251〜58（1982）参
照〕、この実施例に用いた特定のCDはイパタ（P.L.Ipat
a）ほか、「パン酵母シトシンデアミナーゼ。若干の酵
素特性並びにヌクレオシドおよびヌクレオチドによるア
ロステリック阻止」、バイオケミストリー（Biochemist
ry）、10、pp.427076（1971）により報告された方法に
類似する方法で圧縮パン酵母から精製した。
簡単に記載すると、酵母細胞〔サッカロミセス・セレ
ビシェ（Saccharomyces cerevisiae）〕（2.0Kg）を酢
酸エチルで原形質分離し、硫酸アンモニウム沈降（50〜
73％）を２回行ない、粗酵素調製物を得た。硫酸アンモ
ニウムペレットを10mMトリス−Cl緩衝液pH8.0に対して
透析し、Ｑ−セファロース（Sepharose）アニオン交換
カラム〔ファルマシア（Pharmacia）製〕に適用し、KCl
勾配（０〜0.3M）で溶出させた。
フラクションを、ニシヤマ（T.Nishiyama）ほか、
「５−フルオロシトシンのシトシンデアミナーゼカプセ
ルと組合せたラットにおける抗腫瘍効果」、カンサー・
リサーチ（Cancer Research）、45、pp.1753〜61（198
5）の操作に従って、PBS中の基質としてシトシン（また
は5-FC）を用いて27℃でCD活性について分析した。従っ
てこの操作に従って、少量の酵素調製物を基質シトシン
（または5-FC）に加え、反応の過程をUV分光測光によ
り、0.1N-HClでクエンチした分割量のウラシル（または
5-FU）の発生に対してモニターした。250/280（シトシ
ンに対し）および255/290（5-FCに対し）の比を形成さ
れたウラシルまたは5-FUの量の測定に用いた。CD活性を
測定するこの操作をCD酵素の精製の各段階並びに下記の
本発明のCD含有結合体の精製の間に用いた。
従って、KCl勾配の活性フラクションをプールし、濃
縮し、G-75セファデックスカラムで精製した。この段階
で、SDS-PAGE（14％、非還元性）はCD活性を含むフラク
ションがMW18kdの主タンパク質並びに20および30kdにお
ける少量のタンパク質からなった。このフラクションの
CD活性は10U/mgタンパク質であった（シトシンを基質と
して使用）。他の調製物は17U/mgタンパク質程度の高い
活性を有する物質を生じた。タンパク質検定はすべてピ
アス（Pierce,Rockford,IL）から入手できるBCAタンパ
ク質検定試薬を用いて行なった。
次いで精製したCDを実施例１のAP結合体に対して記載
したと実質的に同様の方法でL6または1F5単クローン性
抗体に結合させた。粗結合体（ヨードアセトアミド未処
理）をS-200セファロース上のゲル濾過によりPBSを溶離
剤として用いて精製した。フラクションは280nmでモニ
ターし、各フラクションのCDの活性は直前に記載したよ
うに検定した。CD-抗体比の適当な水準を有する結合体
を含むフラクションをプールし、４〜12％非還元性勾配
ゲル上のSDS-PAGEにより分析すると精製L6-CDおよび1F5
-CD結合体調製物が得られた。
抗体−シトシンデアミナーゼ結合体とプロドラッグ5-フ
ルオロシトシンとの反応 本発明のL6-CDおよび1F5-CD結合体のプロドラッグ5-F
Cを5-FUに、または基質シトシンをウラシルに転化する
能力を次のように測定した：遊離CD（最終濃度:5μg/m
l）、L6-CD結合体（最終CD濃度:5μg/ml）または1F5-CD
結合体（最終CD濃度:5μg/ml）を、ａ）シトシンまたは
ｂ）5-FCのPBS中の3mM溶液に27℃で加え、時間にわたっ
て形成された生成物の量を前記実施例節に記載したよう
に分光測光で測定した。結果は第27図に示される。
図に示されるように、5-FUは遊離CD酵素および本発明
の抗体−CD結合体の両方によりプロドラッグ5-FCから生
じた。同図はまた、結合体がCD単独の活性に等しい活性
を示す事実により明らかなように、いずれの結合体の抗
体に対する酵素の結合に基くCD酵素活性の有意な低下の
ないことを示す。遊離酵素および結合体の特異的活性は
約4U/mg酵素であった。
比較のため結合体の反応性を基質として5-FCの代りに
シトシンを用いて試験した。図に示されるように、シト
シンを基質として、結合体はまた遊離CD酵素単独の活性
に実質的に等CD活性を示した。結合体の特異的活性−10
U/mgの結合酵素−はさらにCDの原酵素活性が結合体中に
保存されたことを示した。活性のこの水準は結合体をPB
S中に４℃で貯蔵したときに数週間維持された。
抗体−CD結合体のH2981腫瘍細胞に対する結合 本発明のL6-CDおよび1F5-CD結合体のH2981腫瘍細胞に
結合する能力を実施例１および２に記載したように測定
した。結合検定の結果は第28図に示される。
FACS分析はL6およびL6-CDが腫瘍細胞に強く結合し、1
F5-CD結合体が細胞に対する結合を示さなかったことを
示した。前記前の結合研究のように、この検定は抗体の
酵素に対する結合にもかゝわらずこれらの結合体の結合
活性の保存、並びに結合体の結合の特異性を示す。
本発明の抗体−CD結合体/5-FCプロドラッグ組合せのH29
81腫瘍細胞に対する試験管内細胞毒性 本発明の抗体−CD/5-FCプロドラッグ組合せのH2981腫
瘍細胞に対する試験管内細胞毒性を実施例１および２に
記載した3H−チミジン取込み検定に類似する3H−ロイシ
ン取込み検定を用いて測定した。
この検定によれば、10％（v/v）ウシ胎仔血清を有す
るIMDM 0.1ml中の104 H2981細胞の懸濁液を96ウェルミ
クロタイタープレート中に置き、37℃で一夜付着させ
た。次いでプレートを洗浄し、0.1ml IMDM中のL6-CDま
たは1F5-CD結合体（シトシンを基質として用いて結合酵
素CD活性10U/mgを含む10μｇ全タンパク質/ml）を加え
た。４℃で30分後に、プレートを４回洗浄し、薬物5-FC
または5-FUの種々の濃度を含むロイシン不含RPMI培地0.
15mlをウェルに加えた。細胞を37℃で18時間インキュベ
ートし、次いでロイシン不含RPMI 0.05ml中の3H−ロイ
シン（１μCi/ウェル）で６時間標識した。次いで実施
例１および２に3H−チミジン取込み検定に対して記載し
たように処理した。
この検定を用いて腫瘍細胞のタンパク質中への3H−ロ
イシンの阻止、従ってプロドラッグ5-FCの、L6-CDまた
は1F5-CD結合体による細胞の前処理を有しまたは有しな
い細胞に対する細胞障害効果を測定した。これらの組合
せの細胞障害効果を親薬物5-FU単独による細胞の処理で
認められた細胞毒性と比較した。第29図に示されるよう
に、結合体による処理のない腫瘍細胞に対して5-FCは非
常に小さい細胞障害活性を示し、5-FUは20μＭのIC50で
細胞増殖を阻止した。しかし、L6-CD結合体による細胞
の前処理は5-FCの細胞毒性を5-FU単独で認められたと等
しい水準に増大した。この結果は抗原結合L6-CDが非毒
性プロドラッグ5-FCを5-FUに転化することができる事実
と矛盾しない。非結合性結合体1F5-CDはそのような増大
を示さず、この増大細胞毒性の抗原特異的性質を示し
た。
我々は本発明の多くの態様を提供したけれども、我々
の基本構成を変更し、本発明の方法、免疫結合体および
プロドラッグを用いる他の態様を与えることができるこ
とは明らかである。従って、本発明の範囲が実施例とし
て前に提供した特定態様よりはむしろ特許請求の範囲に
より規定されるべきであることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
第１図は抗体−酵素結合体を結合する腫瘍細胞における
プロドラッグの活性化に用いる方策を示す図、 第２図は、（Ａ）96.5-AP免疫結合体、（Ｂ）L6-AP免疫
結合体、（Ｃ）AP、（Ｄ）単クローン性抗体96.5、
（Ｅ）単クローン性抗体L6のSDS−ポリアクリルアミド
ゲル分析結果を示す写真、 第３図はエトポシドホスフェートおよびエトポシドチオ
ホスフェートプロドラッグの調製および加水分解を示す
図、 第４図は、（Ａ）エトポシド−４′−ホスフェート単
独、（Ｂ）エトポシド単独、（Ｃ）エトポシド−４′−
ホスフェートプロドラッグとAPとの反応５分後の生成
物、（Ｄ）エトポシド−４′−ホスフェートプロドラッ
グとL6-AP結合体との反応５分後の生成物のHPLCを示す
図、 第５図はエトポシド−４′−ホスフェートまたはエトポ
シド−４′−チオホスフェートのアルカリ性ホスファタ
ーゼ暴露による時間に関するエトポシド遊離を示すグラ
フ、 第６図はH3347腫瘍細胞に対する抗体および結合体の結
合を示すグラフ 第７図はアルカリ性ホスファターゼ結合体に対する結合
検定の結果を示すグラフ、 第８図はエトポシドまたはエトポシドホスフェートプロ
ドラッグのモル濃度に対する殺される腫瘍細胞の割合を
示すグラフ、 第９図は薬物濃度とH3347腫瘍細胞のDNA中への3H−チミ
ジン取込み阻止との関係を示すグラフ、 第10図は非処置または結合体処置腫瘍中のホスファター
ゼ活性を示し、第10A図は全ホスファターゼ活性と時間
との関係を示すグラフ、第10B図はＨ−Ｅ染色断面およ
びAP基質キット測定結果を示す写真、 第11図は非処置または処置マウスの腫瘍容積の時間に関
するグラフ、 第12図は本発明に用いるマイトマイシン誘導体の化学構
造を示す図、 第13図はMOPとアルカリ性ホスファターゼ酵素との反応
の時間に関するグラフ、 第14図はL6および1F5単クローン性抗体並びにL6-APおよ
び1F5-AP結合体のH2981腫瘍細胞に対する結合を示すグ
ラフ、 第15図はH2981腫瘍細胞のDNA中への3H−チミジン取込み
の阻止を示すグラフ、 第16図はH2981腫瘍細胞のDNA中への3H−チミジン取込み
の阻止を示すグラフ、 第17図CEM細胞のDNA中への3H−チミジン取込みの阻止を
示すグラフ、 第18図、第19図はそれぞれマウス中の時間に関する腫瘍
容積を示すグラフ、 第20図はアドリアマイシンプロドラッグの化学構造およ
び調製を示す図、 第21図はL6-PVA結合体およびPVA単独によるAPOの代謝を
示すグラフ、 第22図はL6単クローン性抗体並びにL6-PVAおよび1F5-PV
A結合体のH2981腫瘍細胞に対する結合を示すグラフ、 第23図はADM,APOおよびAPO＋PVA結合体によるH2981細胞
の阻止を示すグラフ、 第24図はL6および1F5単クローン性抗体並びにL6-PVAお
よび1F5-PVA結合体のドージリンパ腫細胞に対する結合
を示すグラフ、 第25図はドージリンパ腫細胞のDNA中への3H−チミジン
取込みの阻止を示すグラフ、 第26図は５フルオロシトシン（5-FC）および５−フルオ
ロウラシル（5-FU）の化学構造を示す図、 第27図はシトシンまたは5FCとCD、L6-CDまたは1F5-CDと
の反応の時間に関する生成物量を示すグラフ、 第28図はL6並びにL6-CDおよび1F5-CDのH2981腫瘍細胞に
対する結合を示すグラフ、 第29図はH2981腫瘍細胞のタンパク質中への3H−ロイシ
ン取込みの阻止を示すグラフ、 である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/52 Ａ６１Ｋ 31/52 31/675 31/675 31/70 31/70 39/395 39/395 Ｌ ＡＤＵ ＡＤＵＣ 45/00 ＡＧＢ 45/00 ＡＧＢ Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｂ 9/78 9/78 9/84 9/84 9/86 9/86 // Ａ６１Ｋ 38/46 Ａ６１Ｋ 37/54 (72)発明者 ジョセフ ピー ブラウン アメリカ合衆国 ワシントン州 98109 シアトル ニュートン ストリート 409 (72)発明者 ディヴィッド イー カー アメリカ合衆国 ワシントン州 98199 シアトル トゥエンティエイス アベ ニュー ウェスト 3039 (56)参考文献 特表 平２−504630（ＪＰ，Ａ) 仏国特許公開2584294（ＦＲ，Ａ)

Claims (23)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】相当する親薬物に比べて腫瘍細胞に対する
    細胞障害性が弱い少くとも１種のプロドラッグを含む成
    分、及び該プロドラッグを一層細胞障害性の親薬物に転
    化できる酵素に結合した、該腫瘍細胞の表面上の抗原と
    反応性の抗体を含む少くとも１種の抗体−酵素結合体を
    含む他の成分の二種類の分離した成分からなる癌治療医
    薬組成物であって、該抗体−酵素結合体が、L6−β−ラ
    クタマーゼ、1F5−β−ラクタマーゼ、L6−アルカリホ
    スファターゼ、1F5−アルカリホスファターゼ、L6−ペ
    ニシリンＶアミダーゼ、1F5−ペニシリンＶアミダー
    ゼ、L6−シトシンデアミナーゼおよび1F5−シトシンデ
    アミナーゼからなる群から選択されることを特徴とする
    上記癌治療医薬組成物。
  2. 【請求項２】該親薬物がエトポシド、テニポシド、アド
    リアマイシン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、ア
    ミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、
    シス−プラチンおよびシス−プラチン類似体、ブレオマ
    イシン類、エスペラミシン類、５−フルオロウラシル、
    メルファラン並びに他のナイトロジエンマスタード類か
    らなる群から選ばれる、請求項（１）記載の医薬組成
    物。
  3. 【請求項３】該親薬物がエトポシド、マイトマイシン、
    アドリアマイシン、及び５−フルオロウラシルからなる
    群から選ばれる、請求項（１）記載の医薬組成物。
  4. 【請求項４】該プロドラッグがホスフェート含有プロド
    ラッグ類、β−ラクタム含有プロドラッグ類、及び置換
    フェノキシアセトアミド含有プロドラッグ類からなる群
    から選ばれる、請求項（１）記載の医薬組成物。
  5. 【請求項５】該プロドラッグがエトポシドホスフェート
    類、エトポシドチオホスフェート類、テニポシドホスフ
    ェート類、テニポシドチオホスフェート類、アドリアマ
    イシンホスフェート類およびN7-C1-8アルキルマイトマ
    イシンホスフェート類からなる群から選ばれる、請求項
    （１）記載の医薬組成物。
  6. 【請求項６】該プロドラッグがエトポシド−４′−ホス
    フェート若しくはその薬学的に許容される塩、または７
    −（２′−アミノエチルホスフェート）マイトマイシン
    若しくはその薬学的に許容される塩である、請求項
    （１）記載の医薬組成物。
  7. 【請求項７】該プロドラッグがＮ−（ｐ−ヒドロキシフ
    ェノキシアセチル）アドリアマイシン、Ｎ−（フェノキ
    シアセチル）アドリアマイシン、５−フルオロウリジン
    モノホスフェートおよび５−フルオロシトシンからなる
    群から選ばれる、請求項（１）記載の医薬組成物。
  8. 【請求項８】該抗体−酵素結合体がL6−アルカリホスフ
    ァターゼであり、該プロドラッグがエトポシド−４′−
    ホスフェート、N7-C1-8アルキルマイトマイシンホスフ
    ェートまたはその薬学的に許容される塩である、請求項
    （１）記載の医薬組成物。
  9. 【請求項９】該抗体−酵素結合体がL6−ペニシリンＶア
    ミダーゼであり、該プロドラッグがＮ−（ｐ−ヒドロキ
    シフェノキシアセチル）アドリアマイシン及びＮ−（フ
    ェノキシアセチル）アドリアマイシンからなる群から選
    ばれる、請求項（１）記載の医薬組成物。
  10. 【請求項１０】該抗体−酵素結合体がL6−シトシンデア
    ミナーゼであり、該プロドラッグが５−フルオロシトシ
    ンである、請求項（１）記載の医薬組成物。
  11. 【請求項１１】該腫瘍細胞が癌腫、黒色腫、リンパ腫、
    骨および軟組織肉腫並びに他の腫瘍からなる群から選ば
    れる起源である、請求項（１）記載の医薬組成物。
  12. 【請求項１２】一種以上のプロドラッグを使用し、各プ
    ロドラッグが相当する親薬物に比べて腫瘍細胞に対する
    細胞障害性が弱いことを特徴とする、請求項（１）〜
    （11）のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 【請求項１３】該酵素がアルカリホスファターゼであ
    る、請求項（12）記載の医薬組成物。
  14. 【請求項１４】該プロドラッグがエトポシドホスフェー
    ト類、エトポシドチオホスフェート類、テニポシドホス
    フェート類、テニポシドチオホスフェート類、アドリア
    マイシンホスフェート類、アドリアマイシンのＮ−フェ
    ノキシアセチル誘導体類およびN7-C1-8アルキルマイト
    マイシンホスフェート類からなる群から選ばれる、請求
    項（12）記載の医薬組成物。
  15. 【請求項１５】該プロドラッグの一種が５−フルオロシ
    トシンまたは５−フルオロウリジンモノホスフェートで
    ある、請求項（12）記載の医薬組成物。
  16. 【請求項１６】該プロドラッグがエトポシド−４′−ホ
    スフェート、N7-C1-8アルキルマイトマイシンホスフェ
    ート、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請
    求項（12）記載の医薬組成物。
  17. 【請求項１７】該抗体−酵素結合体がL6−アルカリホス
    ファターゼであり、該プロドラッグがエトポシド−４′
    −ホスフェート、およびN7-C1-8アルキルマイトマイシ
    ンホスフェート、またはそれらの薬学的に許容される塩
    である、請求項（12）記載の医薬組成物。
  18. 【請求項１８】一種以上の酵素−抗体結合体を使用し、
    各結合体の抗体は前記腫瘍細胞の表面上の同一または異
    なる抗原と反応性であり、各結合体の酵素は同一または
    異なり、及び相当する親薬物に比べて腫瘍細胞に対する
    細胞障害性が弱い少くとも１種のプロドラッグを一層細
    胞障害性の親薬物に転化できるものである、請求項
    （１）記載の医薬組成物。
  19. 【請求項１９】該プロドラッグが以下の式で表される化
    合物を含む、請求項（１）記載の医薬組成物。 式中、 R1はＨであり、R3はOHまたはOCH3であるか、または R1はOHであり、R3はOCH3であり、 R2はＨまたはOHである。
  20. 【請求項２０】該プロドラッグがＮ−（ｐ−ヒドロキシ
    フェノキシアセチル）アドリアマイシンまたはＮ−（フ
    ェノキシアセチル）アドリアマイシンである、請求項
    （19）記載の医薬組成物。
  21. 【請求項２１】該抗体−酵素結合体が、少なくとも一種
    の弱い細胞傷害性を有するプロドラッグをより一層細胞
    傷害性の親薬物に転化することができる酵素の少なくと
    も機能的活性部分に結合した、腫瘍関連抗原と反応性で
    ある抗体の抗原結合領域を少なくとも含む融合タンパク
    である、請求項（１）〜（18）のいずれか一項に記載の
    医薬組成物。
  22. 【請求項２２】L6−β−ラクタマーゼ、1F5−β−ラク
    タマーゼ、L6−アルカリホスファターゼ、1F5−アルカ
    リホスファターゼ、L6−ペニシリンＶアミダーゼ、1F5
    −ペニシリンＶアミダーゼ、L6−シトシンデアミナー
    ゼ、または1F5−シトシンデアミナーゼである抗体−酵
    素結合体。
  23. 【請求項２３】該抗体−酵素結合体及び該プロドラッグ
    を混合する工程を含む、請求項（１）〜（21）のいずれ
    か一項に記載の組成物を製造する方法。
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