JP2809537B2 - リステリア属の細菌を同定する方法及び媒質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はリステリア（listeria）
属の種々の細菌を識別及び／又は同定し得る細菌学的同
定方法及び同定用媒質（medium）に関する。更に詳しく
言えば、本発明の主たる要旨はリステリア（listeria）
属の他の非病原性細菌（species)から病原性の単球症
（monocytogenes)細菌の識別に関する。

【０００２】

【従来の技術及び問題点】リステリア（listeria）属は
今日７種の細菌を含有してなり、そのうち単球症リステ
リア（Listeria monocytogenes）のみがヒトに対して病
原性である。微生物は、食品によって生起される汚染に
続いてヒトの重大な発症の原因となる。リステリア（li
steria）の２種の細菌：非病原性のリステリア・イノキ
ュア（Listeria innocua）及び病原性の単球症リステリ
ア（Listeria monocytogenes）が食料主としてミルク及
び乳製品から主に単離される。

【０００３】これら２種の細菌は共通する種々の生化学
的特性を有し、それ故これら細菌同志の間で識別するの
が困難である。現在使用されている識別試験は次の如く
である。

【０００４】１）β−溶血反応試験：この試験は赤血球
の溶解を生起する物質（リステリオリシン）の細菌によ
る産生に関連するβ−溶血反応活性の測定に基づく。こ
の試験は羊又は馬の血液寒天について行なうが、応答反
応は個々に非関連であることが多い。それ故この試験は
きわめて信頼性がなく、主として出合う２種の細菌を識
別し得るが即ちリステリア・イノキュア（Listeria inn
ocua）（陰性反応）から単球症リステリア（Listeria m
onocytogenes）（陽性反応）を識別し得るが、病原性細
菌に対しては特異的でない。

【０００５】２）ＣＡＭＰ試験：この試験は前記したβ
−溶血反応試験と組合せて行なう。この試験は５％の洗
浄済み羊の赤血球を含有するトリプチカーゼ（tryptica
se）大豆寒天について行なう。黄色ブドウ球菌（S.aure
us）のβ−溶血菌株を、試験すべきリステリア（lister
ia）菌株の培養物により形成された画線に垂直な画線中
に接種する。２個の帯域に接触しているブドウ球菌によ
る溶血反応の増大は陽性反応を示している。実際上ＣＡ
ＭＰ試験は実施するのが困難な技術でありしかも溶血反
応と同様に、常にきわめて信頼性がある訳ではない。

【０００６】それ故本発明の主目的はリステリア（list
eria）属の単球症細菌を識別する方法に在り、該方法は
特に選択的で、鋭敏でしかも相対的にきわめて主観的で
ない。

【０００７】第２に、本発明の目的はリステリア（list
eria）属の種々の細菌を同定する完全な媒質系に在る。

【０００８】１４２回の酵素試験（ペプチダーゼ、オキ
シダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ等）、８２回
の発酵試験及び２７８回の細菌生長検査用平板培養（au
xanogram）試験よりなる５００回以上の種々の生化学試
験を使用して、リステリア属の７種の細菌を検査した後
に、本発明者は、病原性の細菌、単球症リステリア(L.
monocyto genes)を除いては全てのリステリア細菌はグリ
シンアミノペプチダーゼ酵素活性を有するという重要な
発見に到達した。

【０００９】

【問題点を解決するための手段、作用及び効果】この発
見から本発明はそれ故、発色性（chromogenic)又は螢光
発光性（fluorigenic)でありしかもグリシンアミノペプ
チダーゼ酵素の存在下に加水分解され得るグリシンアミ
ノペプチダーゼ基質を含有してなる同定用媒質に対し
て、分析すべき試料を培養反応下に接触させることから
なる、リステリア属の細菌を細菌学的分析する特に選択
的な方法を提供する。

【００１０】尚同じ発見から本発明は、発色性又は螢光
性でありしかも単球症リステリア(L. monocytogenes)細
菌を含有し得る分析すべき試料と接触させて又は該試料
の存在下に加水分解され得るグリシンアミノペプチダー
ゼ基質を含有してなる、例えば脱水形で包装した、リス
テリア属の細菌の細菌学的同定用媒質を提供する。

【００１１】単球症（monocytogenes)以外のリステリア
細菌を特徴付ける目的のため、かゝる同定用媒質はまた
分析すべき試料中に存在する細菌種を特徴付け得る１種
又はそれ以上の転化基質を含有することもできる。これ
らの転化基質は次の基質から選ぶのが好ましい： （イ）細菌発酵性の基質、即ち炭水化物（Ｄ−キシロー
ス、リボース、ラムノース、タガトース、α−メチル−
Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、マンニ
トール等）、 （ロ）細菌還元性の基質例えば硝酸塩、好ましくは硝酸
カリウム、 （ハ）酵素加水分解性の基質例えばα−マンノシダーゼ
基質。

【００１２】発色性又は螢光性の基質とは、その分子が
少なくとも１種の特異酵素の存在下では加水分解され得
るか又は２つの部分に切断され得る、即ち非発色性又は
非螢光性の不活性部分と、直接的に又は間接的に即ち指
示薬と呼ばれる追加の化学化合物の作用により肉眼で又
は紫外線の下で見える色を発現し得る発色性又は螢光性
の部分とに切断され得る何れかの標識（マーカー）を意
味すると解される。

【００１３】即ち、発色性又は螢光性の基質は加水分解
されて生成物を生成し得る基質から選択でき：該基質は
直接的に螢光性であり、即ちグリシン−７−アミド−４
−メチルクマリン、グリシン−７−アミド−４−トリフ
ルオロメチルクマリンであり、該基質は直接的に発色性
であり即ちグリシン−４−ニトロアニリドであり、該基
質は間接的に発色性であり即ちグリシン−２−ナフチル
アミド及びグリシン−４−メトキシ−２−ナフチルアミ
ドであり、これにファーストブルーＢＢ型のジアゾニウ
ム塩及びパラ−ジメチルアミノシンナムアルデヒドから
選んだ指示薬を添加する。

【００１４】かくして着色された錯体が陽性反応の存在
下で得られる。当然前記の基質は例としてのみ与えられ
ており、本発明を限定するものではない。

【００１５】同定用媒質に添加されるグリシンアミノペ
プチダーゼ基質の濃度は０．０１ｍＭ〜１０ｍＭで変化
するのが好ましい。

【００１６】本発明の同定用媒質はトリスホスフェート
緩衝剤及びペプトン培地から選んだ緩衝剤系を含有して
なる。同定用媒質のｐＨ値を６〜９に調節させ得る。

【００１７】本発明の同定用媒質の特定の処方による
と、同定用媒質は好ましくは０〜１０ｇの含量の塩化ナ
トリウムを含有する。媒質はこれの１ｌ当り好ましくは
０〜１００ｍｇの量でグリシンアミノペプチダーゼの少
なくとも１種の賦活剤を含有することもでき、該賦活剤
はＭｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｎ²⁺等の２価カチオンから選ばれ
るのが好ましい。この特定の処方によると、同定用媒質
は、好ましくは媒質１ｌ当り３０ｍｇの量でＭｎＣｌ₂
又はＭｎＳＯ₄ の溶液を含有できる。

【００１８】本発明の媒質の製造、本法の実施及び利点
を次の実施例により例示する。

【００１９】実施例１ 本発明の媒質の製造 媒質の好ましい組成は次の如くである： グリシン−２−ナフチルアミド ０．６５ｇ トリズマ塩基（trizma base) ６．０６ｇ ＮａＣｌ ５．００ｇ 蒸留水 １ｌ ＨＣｌ ｐＨ８にする必
要量 この組成物を２４時間３７℃で通気乾燥することにより
微量滴定板のたまり部（well）中で脱水した。蒸発すべ
き媒質の容量は１個のたまり部当り１００μｌであっ
た。かくして製造した媒質はそれらを使用するまで＋４
℃で暗所で脱水剤の作用下に貯蔵した。

【００２０】実施例２ 本発明の方法の実施 以下の実施は例として与えてある。多数の変更を受け得
ることは明らかである。

【００２１】羊血コロンビア寒天（Columbia agar)（５
％）上で単離体を用いて、研究すべきリステリア（list
eria）菌株の懸濁物を無菌蒸留水中に製造した。この懸
濁物をマクファーランドスケール（Mcfarland scale)の
Ｎｏ．４ポイントに調節した。この懸濁物１００μｌ
を、実施例１により記載した脱水済み組成物を含有する
微量滴定板のたまり部に導入した。３７℃で４時間反応
させた後に、１滴のファーストブルーＢＢ試薬を反応媒
質に添加して遊離２−ナフチルアミンの存在を測定し
た。橙色の発現は陽性反応を示した。

【００２２】実施例３ ２種のリステリア（listeria）細菌、単球症
リステリア(L. monocytogenes)とリステリア・イノキュ
ア(L. innocua)とを識別するのに本発明の媒質の使用 実施例２の方法の実施を次の菌株の識別に応用した： ４１個の L.monocytogenes菌株 ３３個の L.innocua菌株 得られた結果は陽性菌株の個数として表わして次の如く
であった：L.monocytogenes ：０／４１ 即ち０％L.innocua ：３３／３３ 即ち１００％ 本実施例は、何らの混同も生じない観察から得られる本
発明媒質の特異性及びその信頼性を証明するものであ
る。

【００２３】実施例４ リステリア属の細菌を同定する
のに他の検出媒質と組合せて本発明媒質の使用 提案される可能性を説明するための目的で、本発明の媒
質と組合せて選択した検出用媒質は次の媒質である： Ｄ−キシロースを発酵する細菌の検出用媒質 リボースを発酵する細菌の検出用媒質 α−メチル−Ｄ−マンノシドを発酵する細菌の検出用媒
質 硝酸塩を還元する細菌の検出用媒質。

【００２４】検出用媒質の各々の組成は次の如くであ
る： （イ）本発明の媒質即ちＡ、実施例１の組成物 （ロ）発酵性の炭水化物を含有してなる媒質即ちＢ 蒸留水 １０００ｍｌ 炭水化物：Ｄ−キシロース、リボース、α−メチル−Ｄ−マンノシド １０ｇ バクト−ペプトン（Difco) ５ｇ フェノールレッド ６０ｍｇ ｐＨ ８．５に調節 （ハ）硝酸塩を含有してなる媒質即ちＣ 蒸留水 １０００ｍｌ 硝酸カリウム １ｇ バクト−ペプトン（Difco) １０ｇ ｐＨ ７．０に調節 種々の組成物を、０．２２μのフィルター上でのろ過に
より消毒し、１個のたまり部当り１００μｌの量で前記
したグリシンアミノペプチダーゼ試験と並んで微量滴定
板のたまり部に分散させた。反応媒質を次いで２４時間
３７℃で通風乾燥により脱水した。

【００２５】かくして製造した一連の試験用媒質をそれ
らを使用するまで＋４℃で暗所で脱水剤の作用下に貯蔵
した。

【００２６】次の如く分布した１０４個のリステリア
（listeria）菌株を研究した： ４１個の単球症リステリア（L.monocytogenes) ３３個の無害性リステリア（L.innocua) ８個のリステリア イバノビ（L.ivanovii） ３個のリステリア ウェルシメリ（L.welshimeri） １４個のリステリア シーリゲリ（L.seeligeri) ３個のリステリア グレイ（L.grayi) ２個のリステリア ムレイ（L.murrayi) これらの種々の菌株を次の要領で試験した：羊血コロン
ビア寒天（５％）上に単離した各々の菌株については、
細菌の懸濁物を無菌蒸留水中に製造した。

【００２７】この懸濁物をマクファーランドスケールの
Ｎｏ．４ポイントに調節した。

【００２８】前記した５種類の媒質に対応するたまり部
に１００μｌの懸濁物を分散させた。

【００２９】３７℃で４時間反応させた後に、種々の反
応物を次の要領で解釈した： 媒質Ａ：（実施例３参照） 媒質Ｂ： 黄色の着色：陽性反応 赤色の着色：陰性反応 媒質Ｃ：ＢＩＯ ＭＥＲＩＥＵＸ社により市販されしか
も酢酸中の溶液としてそれぞれスルファニル酸及びＮ，
Ｎ−ジメチル−１−ナフチルアミンよりなる試薬ＮＩＴ
１及びＮＩＴ２の各々１滴を添加した後、 赤色の着色：陽性反応 着色なし：陰性反応 得られた結果は次の如くであった： −：陽性反応の０％ ＋：陽性反応の１００％ この表は、リステリア（listeria）属を構成する７種の
菌株が５種の選択した媒質の少なくとも１種によって全
て２種ずつ分離されることを示している。

【００３０】同定用媒質を組合せることによって、リス
テリア属の細菌が属する種類が何であろうとも何れかの
リステリア菌株を簡単に且つ正確に同定することができ
る。

Claims (20)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１種の細菌種の代謝と関連す
   る少なくとも１種の酵素の存在下で加水分解され得る発
   色性基質又は螢光発生基質を含有してなる同定用媒質に
   対して、分析すべき試料を接触させる細菌学的分析方法
   において、リステリア（listeria）属の細菌を含有し得
   る試料中の単球症（monocytogenes)菌を識別するのに、
   グリシンアミノペプチダーゼ基質を同定用媒質に添加す
   ることを特徴とする、リステリア属の細菌を同定する方
   法。
2. 【請求項２】 グリシンアミノペプチダーゼ基質の濃度
   は０．０１ｍＭ〜１０ｍＭである請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 緩衝剤系を基質に導入してｐＨ値を６〜
   ９に調節する請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 少なくとも１種のグリシンアミノペプチ
   ダーゼ賦活剤を同定用媒質に添加する請求項１〜３の何
   れかに記載の方法。
5. 【請求項５】 賦活剤はＭｎ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺及びＣａ⁺⁺より
   なる群から選んだ２価のカチオンである請求項４記載の
   方法。
6. 【請求項６】 少なくとも１種の細菌種の代謝と関連す
   る少なくとも１種の酵素の存在下で加水分解され得る発
   色性基質又は螢光発生基質を含有してなる細菌学的同定
   用の媒質において、リステリア（listeria）属の細菌を
   含有できしかも同定用媒質と接触させた分析すべき試料
   中の単球症（monocytogenes)菌を識別するのに、同定用
   媒質はグリシンアミノペプチダーゼ基質を含有してなる
   ことを特徴とする、リステリア属の細菌を同定する媒
   質。
7. 【請求項７】 基質は直接的に螢光発生性であり次の化
   合物：グリシン−７−アミド−４−メチルクマリン及び
   グリシン−７−アミド−４−トリフルオロメチルクマリ
   ンから選ばれる請求項６記載の媒質。
8. 【請求項８】 基質は直接的に発色性であり、特にグリ
   シン−４−ニトロアニリドである請求項６記載の媒質。
9. 【請求項９】 基質は指示薬を添加することにより間接
   的に発色性であり、次の化合物：グリシン−２−ナフチ
   ルアミド、グリシン−４−メトキシ−２−ナフチルアミ
   ドから選ばれる請求項６記載の媒質。
10. 【請求項１０】 指示薬は“ファーストブルーＢＢ”の
    如きジアゾニウム塩又はパラ−ジメチルアミノシンナム
    アルデヒドである請求項９記載の媒質。
11. 【請求項１１】 ｐＨ値を６〜９に維持するため緩衝剤
    系を含有してなる請求項６〜１０の何れかに記載の媒
    質。
12. 【請求項１２】 基質のモル濃度は０．０１ｍＭ〜１０
    ｍＭである請求項６〜１１の何れかに記載の媒質。
13. 【請求項１３】 塩化ナトリウムに加えて、少なくとも
    １種のグリシンアミノペプチダーゼ賦活剤を含有してな
    る請求項６〜１２の何れかに記載の媒質。
14. 【請求項１４】 賦活剤はＭｎ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺及びＣａ⁺⁺よ
    りなる群から選んだ２価のカチオンである請求項１３記
    載の媒質。
15. 【請求項１５】 賦活剤の量は０〜１００ｍｇ／ｌであ
    る請求項１４記載の媒質。
16. 【請求項１６】 媒質を脱水する請求項６〜１５の何れ
    かに記載の媒質。
17. 【請求項１７】 更に、少なくとも１種の発酵基質及び
    ／又は１種の還元性基質及び／又は１種の酵素基質を含
    有してなり、その化学的転化によって分析すべき試料中
    に存在するリステリア（listeria）属細菌を特徴付け得
    る請求項６記載の媒質。
18. 【請求項１８】 発酵基質はＤ−キシロース、リボー
    ス、α−メチル−マンノシド、ラムノース、タガトー
    ス、α−メチル−Ｄ−グルコシド及びマンニトールより
    なる群から選ばれる請求項１７記載の媒質。
19. 【請求項１９】 還元性基質は硝酸塩類から選ばれ、好
    ましくは硝酸カリウムである請求項１７記載の媒質。
20. 【請求項２０】 合成酵素基質はα−マンノシダーゼ基
    質である請求項１７記載の媒質。