JP2995216B2 - Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体を検出するための合成抗原 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体を検出するための合成抗原Info
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- C12N2770/24011—Flaviviridae
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Description
【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）に関する系統的な試験の実
行はこのウイルスを血液供給物から排除する手段になっ
ている。それでもなお、かなりの数の輸注後肝炎（PT
H）の症例が起きている。これらの症例は一般に非Ａ非
Ｂ型肝炎（NANBH）ウイルスに帰することができ、その
診断は通常、他のウイルスマーカーの排除によって行わ
れる。
行はこのウイルスを血液供給物から排除する手段になっ
ている。それでもなお、かなりの数の輸注後肝炎（PT
H）の症例が起きている。これらの症例は一般に非Ａ非
Ｂ型肝炎（NANBH）ウイルスに帰することができ、その
診断は通常、他のウイルスマーカーの排除によって行わ
れる。
これらの症例の大部分に寄与する病原物質が最近クロ
ーン化され（Choo,Q−Ｌら,Science（1988）244:359−3
62）、第１世代抗体試験が開発された（Kuo,G.ら,Scien
ce（1989）244:362−364）。この物質はプラス鎖RNAウ
イルスであると同定され、そのゲノムの配列が部分的に
決定されている。複数の研究によって、このウイルス
（以下、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）と呼ぶ）がフラビウ
イルス類およびペスチウイルス（pestivirus）類に関連
し得ることが示唆されている。チンパンジーから単離さ
れたあるHCVのゲノムの一部（HCVCDC/CHI）がEPO 88310
922.5に開示されている。この文書に開示されているコ
ード化配列は、推定上の構造タンパク質の遺伝暗号を指
定するウイルスゲノムの５′−末端から始まる配列を含
んでいない。しかし最近、HCVゲノムのこの領域から導
かれた配列が公表された（Okamoto,H.ら,Japan J.Exp.M
ed.60:167−177,1990）。この日本のクローンHC−J1が
コード化しているアミノ酸配列とHCVCDC/CHI配列を、そ
の２つの配列が重なっている領域で結合させることによ
って、図１に記載の混合配列を作成した。具体的には、
上記の２配列をグリシン451でつないだ。欠失や挿入を
保持する変種HCV株が存在する可能性は極めて高いの
で、このHCVアミノ酸配列について用いた番号付与系が
絶対的なものであるとは考えていないことは強調される
べきである。このHCVゲノムの５′末端に対応する配列
が最近EPO 90302866.0にも開示されている。
ーン化され（Choo,Q−Ｌら,Science（1988）244:359−3
62）、第１世代抗体試験が開発された（Kuo,G.ら,Scien
ce（1989）244:362−364）。この物質はプラス鎖RNAウ
イルスであると同定され、そのゲノムの配列が部分的に
決定されている。複数の研究によって、このウイルス
（以下、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）と呼ぶ）がフラビウ
イルス類およびペスチウイルス（pestivirus）類に関連
し得ることが示唆されている。チンパンジーから単離さ
れたあるHCVのゲノムの一部（HCVCDC/CHI）がEPO 88310
922.5に開示されている。この文書に開示されているコ
ード化配列は、推定上の構造タンパク質の遺伝暗号を指
定するウイルスゲノムの５′−末端から始まる配列を含
んでいない。しかし最近、HCVゲノムのこの領域から導
かれた配列が公表された（Okamoto,H.ら,Japan J.Exp.M
ed.60:167−177,1990）。この日本のクローンHC−J1が
コード化しているアミノ酸配列とHCVCDC/CHI配列を、そ
の２つの配列が重なっている領域で結合させることによ
って、図１に記載の混合配列を作成した。具体的には、
上記の２配列をグリシン451でつないだ。欠失や挿入を
保持する変種HCV株が存在する可能性は極めて高いの
で、このHCVアミノ酸配列について用いた番号付与系が
絶対的なものであるとは考えていないことは強調される
べきである。このHCVゲノムの５′末端に対応する配列
が最近EPO 90302866.0にも開示されている。
HCVの潜在的保有者（キャリアー）を検出するために
は、極めて多量のウイルスタンパク質を入手する方法が
必要である。HCVの場合、このウイルスを培養する方法
は現在のところ知られておらず、このことがウイルス抗
原の供給源としてのウイルス感染培養の使用を妨げてい
る。現在の第１世代抗体試験はHCVゲノムがコード化し
ている363アミノ酸の配列を含有する融合タンパク質を
利用している。このタンパク質に対する抗体が慢性NANB
H患者の75〜85％中で検出され得ることがわかった。対
照的に、この疾患の急性相にある患者のわずか約15％が
この融合タンパク質を認識する抗体を保有するに過ぎな
かった（Kuo,G.ら,Science（1989）244:362−364）。し
かし適当な確証的試験がないことが、これらの統計の立
証を困難にしている。このHCVゲノムとフラビウイルス
類ゲノムとの見掛け上の類似性は、診断的価値を有する
可能性の高いエピトープの位置の予測を可能にする。こ
のHCVゲノムのある分析は、連続的な長い読み取り枠の
存在を明らかにしている。ウイルスRNAはおそらく長い
ポリタンパク質に翻訳され、次いでこのポリタンパク質
が細胞プロテアーゼおよび／またはウイルスプロテアー
ゼによって切断されるのであろう。例えばデングウイル
スの類似性から、このウイルス構造タンパク質群はこの
ウイルスポリタンパク質のアミノ末端の第３番から導か
れると思われる。このポリタンパク質が切断される正確
な部位は、現時点では推測することしかできない。それ
でもこれらの構造タンパク質群は、診断的目的にとっ
て、抗体の検出および抗体の誘導（生じた抗体は次いで
ウイルス抗原の検出に利用できる）の両方に関して有用
であろうエピトープを含有する可能性が高い。さらに、
非構造タンパク質はウイルス粒子の構造成分としては発
見されないけれども、非構造タンパク質のドメインも診
断的価値を有するエピトープを含有すると期待される。
は、極めて多量のウイルスタンパク質を入手する方法が
必要である。HCVの場合、このウイルスを培養する方法
は現在のところ知られておらず、このことがウイルス抗
原の供給源としてのウイルス感染培養の使用を妨げてい
る。現在の第１世代抗体試験はHCVゲノムがコード化し
ている363アミノ酸の配列を含有する融合タンパク質を
利用している。このタンパク質に対する抗体が慢性NANB
H患者の75〜85％中で検出され得ることがわかった。対
照的に、この疾患の急性相にある患者のわずか約15％が
この融合タンパク質を認識する抗体を保有するに過ぎな
かった（Kuo,G.ら,Science（1989）244:362−364）。し
かし適当な確証的試験がないことが、これらの統計の立
証を困難にしている。このHCVゲノムとフラビウイルス
類ゲノムとの見掛け上の類似性は、診断的価値を有する
可能性の高いエピトープの位置の予測を可能にする。こ
のHCVゲノムのある分析は、連続的な長い読み取り枠の
存在を明らかにしている。ウイルスRNAはおそらく長い
ポリタンパク質に翻訳され、次いでこのポリタンパク質
が細胞プロテアーゼおよび／またはウイルスプロテアー
ゼによって切断されるのであろう。例えばデングウイル
スの類似性から、このウイルス構造タンパク質群はこの
ウイルスポリタンパク質のアミノ末端の第３番から導か
れると思われる。このポリタンパク質が切断される正確
な部位は、現時点では推測することしかできない。それ
でもこれらの構造タンパク質群は、診断的目的にとっ
て、抗体の検出および抗体の誘導（生じた抗体は次いで
ウイルス抗原の検出に利用できる）の両方に関して有用
であろうエピトープを含有する可能性が高い。さらに、
非構造タンパク質はウイルス粒子の構造成分としては発
見されないけれども、非構造タンパク質のドメインも診
断的価値を有するエピトープを含有すると期待される。
図面の簡単な説明 図１ 混成HCVHC−J1/CDC/CHIのアミノ酸配列を表
す。
す。
図２ ELISA検定における個々のペプチドおよび種々
の混合物に対する抗体の結合を表す。
の混合物に対する抗体の結合を表す。
特定の態様の説明 RNAウイルスはしばしば高い自然突然変異率を示すこ
とが知られており、したがってたとえ同じ個体由来であ
ったとしても、２つのHCV単離物が完全に同一であるこ
とはないであろうと予想されるべきである。本開示のた
めに、あるウイルスがHCVHC−J1/CDC/CHI混成配列に対
して核酸レベルで60％以上、アミノ酸レベルで70％以上
の全体的相同性を示すならば、そのウイルスをHCVと同
一もしくは等価と見なす。
とが知られており、したがってたとえ同じ個体由来であ
ったとしても、２つのHCV単離物が完全に同一であるこ
とはないであろうと予想されるべきである。本開示のた
めに、あるウイルスがHCVHC−J1/CDC/CHI混成配列に対
して核酸レベルで60％以上、アミノ酸レベルで70％以上
の全体的相同性を示すならば、そのウイルスをHCVと同
一もしくは等価と見なす。
HCVがコード化しているタンパク質を免疫学的に模倣
するペプチドについて記述する。種−種間の配列変化を
適応させるために、保存的および非保存的アミノ酸置換
を行い得る。これらは一般に特定の配列の35％未満を占
めるであろう。ペプチドが高度に多形性のHCVポリペプ
チドの一領域に対応する場合には、異なるウイルス株の
異なるエピトープをより良く模倣するように１または複
数のアミノ酸を変化させることが望ましいであろう。
するペプチドについて記述する。種−種間の配列変化を
適応させるために、保存的および非保存的アミノ酸置換
を行い得る。これらは一般に特定の配列の35％未満を占
めるであろう。ペプチドが高度に多形性のHCVポリペプ
チドの一領域に対応する場合には、異なるウイルス株の
異なるエピトープをより良く模倣するように１または複
数のアミノ酸を変化させることが望ましいであろう。
重要なペプチドは、HCVゲノムがコード化している配
列内に含まれるアミノ酸のうち、少なくとも５アミノ
酸、時には６アミノ酸、時には８アミノ酸、時には12ア
ミノ酸、通常は約50アミノ酸より少なく、より通常は約
35アミノ酸より少なく、好ましくは約25アミノ酸より少
ない該アミノ酸を含有するであろう。それぞれの場合に
おいてペプチドは、それより大きいペプチドの感受性を
本質的に総て維持しつつも、できる限り小さいことが好
ましいであろう。ある場合には、２以上のペプチドを結
合させて１つのペプチド構造にすることが望ましいこと
もあり得る。
列内に含まれるアミノ酸のうち、少なくとも５アミノ
酸、時には６アミノ酸、時には８アミノ酸、時には12ア
ミノ酸、通常は約50アミノ酸より少なく、より通常は約
35アミノ酸より少なく、好ましくは約25アミノ酸より少
ない該アミノ酸を含有するであろう。それぞれの場合に
おいてペプチドは、それより大きいペプチドの感受性を
本質的に総て維持しつつも、できる限り小さいことが好
ましいであろう。ある場合には、２以上のペプチドを結
合させて１つのペプチド構造にすることが望ましいこと
もあり得る。
記載のペプチドは、それがHCVの少なくとも１株と免
疫学的に競合し得る限り、なんらかの特定のHCV配列と
同一である必要がないことは理解されるべきである。し
たがって挿入、欠失、および同類あるいは非同類アミノ
酸置換が本ペプチドの使用にあたってある種の利点を提
供するかも知れない場合には、本ペプチドにそのような
変異を導入してもよい。
疫学的に競合し得る限り、なんらかの特定のHCV配列と
同一である必要がないことは理解されるべきである。し
たがって挿入、欠失、および同類あるいは非同類アミノ
酸置換が本ペプチドの使用にあたってある種の利点を提
供するかも知れない場合には、本ペプチドにそのような
変異を導入してもよい。
同類であると見なされる置換は、置換アミノ酸の化学
的性質が元のアミノ酸の化学的性質と類似している置換
である。同類であると見なされ得るアミノ酸の組み合わ
せは、Gly,Ala;Asp,Glu;Asn,Gln;Val,Ile,Leu;Ser,Thr;
Lys,Arg;およびPhe,Tyrである。
的性質が元のアミノ酸の化学的性質と類似している置換
である。同類であると見なされ得るアミノ酸の組み合わ
せは、Gly,Ala;Asp,Glu;Asn,Gln;Val,Ile,Leu;Ser,Thr;
Lys,Arg;およびPhe,Tyrである。
さらに、“リンカーアーム（連結鎖）”（これによっ
て本ペプチドを担体に便利に結合できる）を作成するた
めに、追加アミノ酸もしくは化学基をアミノ末端または
カルボキシル末端に付加することができる。このリンカ
ーアームは少なくとも１アミノ酸であり、60アミノ酸程
度でもよいが、最も頻繁には１〜10アミノ酸であろう。
固相または担体に対する結合の性質が共有結合的である
必要はない。
て本ペプチドを担体に便利に結合できる）を作成するた
めに、追加アミノ酸もしくは化学基をアミノ末端または
カルボキシル末端に付加することができる。このリンカ
ーアームは少なくとも１アミノ酸であり、60アミノ酸程
度でもよいが、最も頻繁には１〜10アミノ酸であろう。
固相または担体に対する結合の性質が共有結合的である
必要はない。
システイン、リジン、チロシン、グルタミン酸または
アスパラギン酸などの天然アミノ酸をアミノ末端か、あ
るいはカルボキシル末端に付加することによって、固相
または担体にカップリング（結合）させるための官能基
を提供することができる。しかし、望ましい化学的特性
または物理的特性を本ペプチドに与えるであろう他の化
学基（例えばビオチンおよびチオグリコール酸など）を
末端に付加することができる。また本ペプチドの末端
を、例えばＮ−末端アセチル化あるいは末端カルボキシ
アミド化などによって修飾することもできる。重要なペ
プチドを図１に記載の混成アミノ酸配列と関連させて記
述する。アミノ酸配列を、世界的に容認されている従来
の３文字コードで表す。記載のアミノ酸配列に加えて、
他の基を以下のように定義する:Yは例えばNH2、１また
は複数のＮ−末端アミノ酸、あるいはカップリングを容
易にするために付加された他の部分を表す。Ｙそのもの
を、例えばアセチル化などによって修飾することができ
る。Ｚは結合、アミノ酸（単数または複数）、あるいは
連結に使用し得る化学基（単数または複数）を表す。Ｘ
はOH、NH2、あるいはこれら２つの基のいずれかを含有
する結合を表すものとする。
アスパラギン酸などの天然アミノ酸をアミノ末端か、あ
るいはカルボキシル末端に付加することによって、固相
または担体にカップリング（結合）させるための官能基
を提供することができる。しかし、望ましい化学的特性
または物理的特性を本ペプチドに与えるであろう他の化
学基（例えばビオチンおよびチオグリコール酸など）を
末端に付加することができる。また本ペプチドの末端
を、例えばＮ−末端アセチル化あるいは末端カルボキシ
アミド化などによって修飾することもできる。重要なペ
プチドを図１に記載の混成アミノ酸配列と関連させて記
述する。アミノ酸配列を、世界的に容認されている従来
の３文字コードで表す。記載のアミノ酸配列に加えて、
他の基を以下のように定義する:Yは例えばNH2、１また
は複数のＮ−末端アミノ酸、あるいはカップリングを容
易にするために付加された他の部分を表す。Ｙそのもの
を、例えばアセチル化などによって修飾することができ
る。Ｚは結合、アミノ酸（単数または複数）、あるいは
連結に使用し得る化学基（単数または複数）を表す。Ｘ
はOH、NH2、あるいはこれら２つの基のいずれかを含有
する結合を表すものとする。
ペプチドＩはアミノ酸１〜20に対応し、次のアミノ酸
配列を有する： ペプチドIIはアミノ酸７〜26に対応し、アミノ酸配
列： を有する。
配列を有する： ペプチドIIはアミノ酸７〜26に対応し、アミノ酸配
列： を有する。
オリゴペプチドII A: は特に重要である。
ペプチドIIIはアミノ酸13〜32に対応し、配列： を有する。
ペプチドIVはアミノ酸37〜56に対応し、配列： を有する。
ペプチドＶはアミノ酸49〜68に対応し、配列： を有する。
ペプチドVIはアミノ酸61〜80に対応し、次の配列： を有する。
ペプチドVIIはアミノ酸73〜92に対応し、配列： を有する。
ペプチドVIIIはアミノ酸1688〜1707に対応し、配列： を有する。
ペプチドIXはアミノ酸1694〜1713に対応し、配列： を有する。
ペプチドＸはアミノ酸1706〜1725に対応し、配列： を有する。
ペプチドXIはアミノ酸1712〜1731に対応し、配列： を有する。
ペプチドXIIはアミノ酸1718〜1737に対応し、配列： を有する。
ペプチドXIIIはアミノ酸1724〜1743に対応し、配列： を有する。
ペプチドXIVはアミノ酸1730〜1749に対応し、配列： を有する。
ペプチドXVはアミノ酸2263〜2282に対応し、配列： を有する。
ペプチドXVIはアミノ酸2275〜2294に対応し、配列： を有する。
ペプチドXVIIはアミノ酸2287〜2306に対応し、配列： を有する。
ペプチドXVIIIはアミノ酸2299〜2318に対応し、配
列： を有する。
列： を有する。
ペプチドXIXはアミノ酸2311〜2330に対応し、配列： を有する。
これらのペプチドを環化させたり、２つのペプチドを
カップリングさせるために末端アミノ基をアシル化する
ためのシステインまたはチオグリコール酸のメルカプト
基の使用は特に重要である。この環化もしくはカップリ
ングが１結合を通して起こってもよいし、あるいはチオ
ール特異的試薬を用いて分子橋を形成させることによっ
てこれを達成することもできる。
カップリングさせるために末端アミノ基をアシル化する
ためのシステインまたはチオグリコール酸のメルカプト
基の使用は特に重要である。この環化もしくはカップリ
ングが１結合を通して起こってもよいし、あるいはチオ
ール特異的試薬を用いて分子橋を形成させることによっ
てこれを達成することもできる。
抗体を生じさせるため、あるいは固相に対するこれら
のペプチドの吸着を促進するために、本ペプチドを可溶
性担体に結合することができる。この担体の性質は、50
00以上の分子量を有し、ヒト血清中の抗体によって認識
されないような性質であるべきである。一般に担体はタ
ンパク質であろう。担体としてよく用いられるタンパク
質はキーホールリムペットヘモシアニン、ウシγ−グロ
ブリン、ウシ血清アルブミン、およびポリ−Ｌ−リジン
である。
のペプチドの吸着を促進するために、本ペプチドを可溶
性担体に結合することができる。この担体の性質は、50
00以上の分子量を有し、ヒト血清中の抗体によって認識
されないような性質であるべきである。一般に担体はタ
ンパク質であろう。担体としてよく用いられるタンパク
質はキーホールリムペットヘモシアニン、ウシγ−グロ
ブリン、ウシ血清アルブミン、およびポリ−Ｌ−リジン
である。
ペプチドを担体にカップリングさせるための技術は種
々詳しく記述されている。この連結はペプチドのＮ−末
端、Ｃ−末端あるいは内部部位で起こり得る。カップリ
ングのためにペプチドを誘導体化することもできる。広
範囲にわたる種々のカップリング法に関する詳細な記述
は、例えばVan Regenmortel,M.H.V.,Briand,J.P.Mulle
r,S.およびPlau,S.,“Laboratory Techniques in Bio
chemistry and Moleular Biology",第19巻，“Syntheti
c Polypeptides as Antigens",Elsevier Press,アムス
テルダム，ニューヨーク，オクスフォード,1988に記載
されている。
々詳しく記述されている。この連結はペプチドのＮ−末
端、Ｃ−末端あるいは内部部位で起こり得る。カップリ
ングのためにペプチドを誘導体化することもできる。広
範囲にわたる種々のカップリング法に関する詳細な記述
は、例えばVan Regenmortel,M.H.V.,Briand,J.P.Mulle
r,S.およびPlau,S.,“Laboratory Techniques in Bio
chemistry and Moleular Biology",第19巻，“Syntheti
c Polypeptides as Antigens",Elsevier Press,アムス
テルダム，ニューヨーク，オクスフォード,1988に記載
されている。
リジンのα−アミノ基とε−アミノ基の両方をペプチ
ドの成長点として使用するオルゴリジン核上で、本ペプ
チド類を直接合成することもできる。この核を構成する
リジンの数は３または７が好ましい。さらに、ホモ二量
体またはヘテロ二量体の形成を促進するために、この錯
体のＣ−末端もしくはその付近にシステインが含まれて
いてもよい。この技術の使用はＢ型肝炎抗原（Tam,J.P.
およびLu,Y−A,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1989）86:908
4−9088）および他の種々の抗原（“Synthetic Peptide
s,Approaches to Biological Problems",Tam,J.P.およ
びKaiser,E.T.編,Alan R.Liss Inc.,ニューヨーク,1989
中のTam,J.P.,“Multiple Antigen Peptide System:A N
ovel Design for Synthetic Peptide Vaccine and Immu
noassay"を参照のこと）に関して詳細に記述されてい
る。
ドの成長点として使用するオルゴリジン核上で、本ペプ
チド類を直接合成することもできる。この核を構成する
リジンの数は３または７が好ましい。さらに、ホモ二量
体またはヘテロ二量体の形成を促進するために、この錯
体のＣ−末端もしくはその付近にシステインが含まれて
いてもよい。この技術の使用はＢ型肝炎抗原（Tam,J.P.
およびLu,Y−A,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1989）86:908
4−9088）および他の種々の抗原（“Synthetic Peptide
s,Approaches to Biological Problems",Tam,J.P.およ
びKaiser,E.T.編,Alan R.Liss Inc.,ニューヨーク,1989
中のTam,J.P.,“Multiple Antigen Peptide System:A N
ovel Design for Synthetic Peptide Vaccine and Immu
noassay"を参照のこと）に関して詳細に記述されてい
る。
意図される使用に依存して、本ペプチドをラベル（標
識）することもできるし、ラベルしなくてもよい。使用
できるラベルはいかなる種類でもよく、例えば酵素的ラ
ベル、化学的ラベル、蛍光ラベル、ルミネセンスラベ
ル、あるいは放射活性ラベルであり得る。さらに、例え
ば微量滴定プレート、ナイロン膜、ガラスまたプラスチ
ックビーズおよびクロマトグラフィー支持体（例：セル
ロース、シリカ、あるいはアガロース）などの表面また
は固相に結合させるために、ペプチドを修飾することが
できる。ペプチドを固体支持体または表面に結合または
付着させ得る方法は、当業者にはよく知られている。
識）することもできるし、ラベルしなくてもよい。使用
できるラベルはいかなる種類でもよく、例えば酵素的ラ
ベル、化学的ラベル、蛍光ラベル、ルミネセンスラベ
ル、あるいは放射活性ラベルであり得る。さらに、例え
ば微量滴定プレート、ナイロン膜、ガラスまたプラスチ
ックビーズおよびクロマトグラフィー支持体（例：セル
ロース、シリカ、あるいはアガロース）などの表面また
は固相に結合させるために、ペプチドを修飾することが
できる。ペプチドを固体支持体または表面に結合または
付着させ得る方法は、当業者にはよく知られている。
Ｃ型肝炎ウイルスに特異的な抗体を検出するためにペ
プチドの混合物を使用することは特に重要である。特に
有利と思われるペプチドの混合物を次に記載する。
プチドの混合物を使用することは特に重要である。特に
有利と思われるペプチドの混合物を次に記載する。
A.II、III、Ｖ、IX、およびXVIII B.I、II、Ｖ、IX、XI、XVIおよびXVIII C.II、III、IV、Ｖ、VIII、XI、XVIおよびXVIII D.II、IXおよびXVIII E.II、III、IVおよびＶ F.VIII、IX、XI、XIIIおよびXIV G.XV、XVI、XVII、XVIIIおよびXIX これらのペプチドを認識する抗体は、種々の方法で検
出することができる。好ましい検出法は酵素結合イミノ
ソルベント検定法（ELISA）であり、この方法ではペプ
チドまたはペプチド混合物を固体支持体に結合させる。
これはほとんどの場合微量滴定プレートであろうが、原
理的にはいかなる種類の不溶固相であってもよい。試験
すべき血清または他の体液の適当な希釈液（単数または
複数）を、ペプチドを結合させる固相と接触させる。結
合反応を起こすのに必要な時間インキュベーションを実
行する。次いで、結合していない成分を固相の洗浄によ
って除去する。免疫複合体の検出を、ヒト免疫グロブリ
ンに特異的に結合する抗体であって、無色もしくはほぼ
無色の基質または補基質を高度に着色した生成物か、も
しくは色素原と共に有色の錯体を形成し得る生成物に変
換し得る酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ
性ホスファターゼ、あるいはβ−ガラクトシダーゼが好
ましいがこれらに限定されない）でラベルされている抗
体を用いて達成する。別法として、適切な基質（単数ま
たは複数）の存在下で光を放出する酵素を検出系に使用
することもできる。生成した生成物の量を肉眼で、分光
光度測定法によって、電気化学的に、あるいは発光測定
法によって検出し、これを同様に処理した対照と比較す
る。また、放射活性標識抗体を検出系に使用することも
でき、この場合には免疫複合体の量をシンチレーション
計数器またはガンマ計数器で定量する。
出することができる。好ましい検出法は酵素結合イミノ
ソルベント検定法（ELISA）であり、この方法ではペプ
チドまたはペプチド混合物を固体支持体に結合させる。
これはほとんどの場合微量滴定プレートであろうが、原
理的にはいかなる種類の不溶固相であってもよい。試験
すべき血清または他の体液の適当な希釈液（単数または
複数）を、ペプチドを結合させる固相と接触させる。結
合反応を起こすのに必要な時間インキュベーションを実
行する。次いで、結合していない成分を固相の洗浄によ
って除去する。免疫複合体の検出を、ヒト免疫グロブリ
ンに特異的に結合する抗体であって、無色もしくはほぼ
無色の基質または補基質を高度に着色した生成物か、も
しくは色素原と共に有色の錯体を形成し得る生成物に変
換し得る酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ
性ホスファターゼ、あるいはβ−ガラクトシダーゼが好
ましいがこれらに限定されない）でラベルされている抗
体を用いて達成する。別法として、適切な基質（単数ま
たは複数）の存在下で光を放出する酵素を検出系に使用
することもできる。生成した生成物の量を肉眼で、分光
光度測定法によって、電気化学的に、あるいは発光測定
法によって検出し、これを同様に処理した対照と比較す
る。また、放射活性標識抗体を検出系に使用することも
でき、この場合には免疫複合体の量をシンチレーション
計数器またはガンマ計数器で定量する。
使用できる他の検出系には、スタフィロコッカス・ア
ウレウス・コーワン（Cowan）株Ｉ由来のプロテイン
Ａ、スタフィロコッカス種（株26RP66）由来のプロテイ
ンＧの使用に基づく系、あるいは高親和性ビオチン−ア
ビジンまたはストレプタビジン（streptavidin）結合反
応を利用する系が含まれる。
ウレウス・コーワン（Cowan）株Ｉ由来のプロテイン
Ａ、スタフィロコッカス種（株26RP66）由来のプロテイ
ンＧの使用に基づく系、あるいは高親和性ビオチン−ア
ビジンまたはストレプタビジン（streptavidin）結合反
応を利用する系が含まれる。
血清中または他の体液中に存在する抗体を競争検定法
で検出するために、担体に結合したペプチドに対して生
じた抗体を、標識ペプチドと組み合わせて用いることも
できる。この場合、担体に結合したペプチドに対して生
じた抗体を固体支持体（これは例えばプラスチックビー
ズまたはプラスチックチューブであり得る）に結合させ
る。次に標識ペプチドを試験すべき体液の適当な希釈液
と混合し、次いでこの混合物を固体支持体に結合させた
抗体と接触させる。適当なインキューベーション期間の
後、固体支持体を洗浄し、標識ペプチドの量を定量す
る。固体支持体に結合するラベル量の減少は、元の試料
中に抗体が存在することを示す。同じように、ペプチド
を固体支持体に結合させることもできる。次いでペプチ
ド量が制限的である条件下で、標識抗体を試料中に存在
する抗体と競争させる。上記の例と同様に、測定される
信号の減少は被験試料中に抗体が存在することを示す。
で検出するために、担体に結合したペプチドに対して生
じた抗体を、標識ペプチドと組み合わせて用いることも
できる。この場合、担体に結合したペプチドに対して生
じた抗体を固体支持体（これは例えばプラスチックビー
ズまたはプラスチックチューブであり得る）に結合させ
る。次に標識ペプチドを試験すべき体液の適当な希釈液
と混合し、次いでこの混合物を固体支持体に結合させた
抗体と接触させる。適当なインキューベーション期間の
後、固体支持体を洗浄し、標識ペプチドの量を定量す
る。固体支持体に結合するラベル量の減少は、元の試料
中に抗体が存在することを示す。同じように、ペプチド
を固体支持体に結合させることもできる。次いでペプチ
ド量が制限的である条件下で、標識抗体を試料中に存在
する抗体と競争させる。上記の例と同様に、測定される
信号の減少は被験試料中に抗体が存在することを示す。
もう１つの好ましい抗体検出法は、均一免疫検定法で
ある。このような検定法の設計には多くの変法が考えら
れる。例えば、均一酵素免疫検定法に関する数多くの考
え得る配置とそれらを実行する方法がTijssen,P.,“Pra
ctice and Theory of Enzyme Immunoassays",Elsevier
Press,アムステルダム，オクスフォード，ニューヨー
ク,1985に記載されている。使用できる検出法には、酵
素チャネリング、生物発光、アロステリック活性化およ
びアロステリック阻害に基づく系が含まれる。リポソー
ムに封入した酵素または補酵素を用いる方法も使用でき
る（例えば、Pinnaduwage,P.およびHuang,L.,Clin.Che
m.（1988）34/2:268−272、およびUllman,E.F.ら,Clin.
Chem.（1987）33/9:1579−1584を参照のこと）。
ある。このような検定法の設計には多くの変法が考えら
れる。例えば、均一酵素免疫検定法に関する数多くの考
え得る配置とそれらを実行する方法がTijssen,P.,“Pra
ctice and Theory of Enzyme Immunoassays",Elsevier
Press,アムステルダム，オクスフォード，ニューヨー
ク,1985に記載されている。使用できる検出法には、酵
素チャネリング、生物発光、アロステリック活性化およ
びアロステリック阻害に基づく系が含まれる。リポソー
ムに封入した酵素または補酵素を用いる方法も使用でき
る（例えば、Pinnaduwage,P.およびHuang,L.,Clin.Che
m.（1988）34/2:268−272、およびUllman,E.F.ら,Clin.
Chem.（1987）33/9:1579−1584を参照のこと）。
ペプチドの合成は溶液中でも、あるいは固体支持体上
でも達成できる。合成法は一般に、ｔ−ブチルオキシカ
ルボニルまたは９−フルオレニルメトキシ−カルボニル
で保護された活性化アミノ酸を使用する。この合成を実
行するための操作、側鎖保護の種類、および切断法は、
例えばStewartおよびYoung,“Solid Phase Peptide Syn
thesis",第２版,Pierce Chemical Company,1984、およ
びAthertonおよびSheppard,“Solid Phase Peptide Syn
thesis",IRL Press,1989に詳細に記述されている。
でも達成できる。合成法は一般に、ｔ−ブチルオキシカ
ルボニルまたは９−フルオレニルメトキシ−カルボニル
で保護された活性化アミノ酸を使用する。この合成を実
行するための操作、側鎖保護の種類、および切断法は、
例えばStewartおよびYoung,“Solid Phase Peptide Syn
thesis",第２版,Pierce Chemical Company,1984、およ
びAthertonおよびSheppard,“Solid Phase Peptide Syn
thesis",IRL Press,1989に詳細に記述されている。
実施例 I.ペプチド合成 記述するペプチドをすべて、エチレンジアミンで官能
化しそれに酸不安定リンカー４−（α−Fmoc−アミノ−
２′,4′−ジメトキシベンジル）フェノキシ酢酸をカッ
プリングさせたペプシンＫポリアミド−キーゼルグアー
樹脂（Pepsyn K polyamide−Keselguhr resin:Millige
n,Novato,カリフォルニア）上で合成した（Rink,tetrah
edron Lett.（1987）28:3787）。ｔ−ブチルに基づく側
鎖保護およびFmocα−アミノ保護を用いた。2,2,5,7,8
−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル部分を用いて
アルギニンのグアニジノ基を保護した。ヒスチジンのイ
ミダゾール基をｔ−Bocかトリチル基で保護し、システ
インのスルフヒドリル基をトリチル基で保護した。ジイ
ソプロピルカルボジイミド媒介ヒドロキシベンゾトリア
ゾールエステル形成を用いたアルギニンの場合を除い
て、形成させたＯ−ペンタフルオロフェニルエステル類
を用いてカップリングを実行した。ペプチドＩを除いて
すべてのペプチドを酢酸無水物でＮ−アセチル化した。
すべての合成をミリゲン9050ペプシンセサイザー（Mill
igen 9050 PepSynthesizer:Novato,カリフォルニア）で
連続フロー法を用いて行った。補集剤（スカベンジャ
ー）の存在下でトリフルオロ酢酸で切断し、ジエチルエ
ーテルで抽出した後、すべてのペプチドをC18−逆相ク
ロマトグラフィーで分析した。
化しそれに酸不安定リンカー４−（α−Fmoc−アミノ−
２′,4′−ジメトキシベンジル）フェノキシ酢酸をカッ
プリングさせたペプシンＫポリアミド−キーゼルグアー
樹脂（Pepsyn K polyamide−Keselguhr resin:Millige
n,Novato,カリフォルニア）上で合成した（Rink,tetrah
edron Lett.（1987）28:3787）。ｔ−ブチルに基づく側
鎖保護およびFmocα−アミノ保護を用いた。2,2,5,7,8
−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル部分を用いて
アルギニンのグアニジノ基を保護した。ヒスチジンのイ
ミダゾール基をｔ−Bocかトリチル基で保護し、システ
インのスルフヒドリル基をトリチル基で保護した。ジイ
ソプロピルカルボジイミド媒介ヒドロキシベンゾトリア
ゾールエステル形成を用いたアルギニンの場合を除い
て、形成させたＯ−ペンタフルオロフェニルエステル類
を用いてカップリングを実行した。ペプチドＩを除いて
すべてのペプチドを酢酸無水物でＮ−アセチル化した。
すべての合成をミリゲン9050ペプシンセサイザー（Mill
igen 9050 PepSynthesizer:Novato,カリフォルニア）で
連続フロー法を用いて行った。補集剤（スカベンジャ
ー）の存在下でトリフルオロ酢酸で切断し、ジエチルエ
ーテルで抽出した後、すべてのペプチドをC18−逆相ク
ロマトグラフィーで分析した。
II.C型肝炎ウイルスに対する抗体の検出 A.ナイロン膜に結合させたペプチドの使用 ペプチドを適切な緩衝液に溶解することにより濃保存
液を調製し、これをリン酸緩衝化食塩水（PBS）または
炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）でさらに希釈すること
によって作業溶液を調製した。これらのペプチドをナイ
ロン膜（Pall,ポーツマス，イギリス）上に線状にの
せ、その後その膜をカゼインで処理することにより占有
されていない結合部位を遮断した。次いでこの膜をペプ
チド線の方向に対して直角な小片に切断した。次に各小
片を１対100に希釈した血清試料（HCV感染個体から得た
もの）と共にインキュベートした。酵素アルカリ性ホス
ファターゼに結合したヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体と
共にこの小片をインキュベートすることによって抗体結
合を検出した。結合していない複合体を洗浄によって除
去した後、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホ
スフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムを含有す
る基質溶液を加えた。
液を調製し、これをリン酸緩衝化食塩水（PBS）または
炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）でさらに希釈すること
によって作業溶液を調製した。これらのペプチドをナイ
ロン膜（Pall,ポーツマス，イギリス）上に線状にの
せ、その後その膜をカゼインで処理することにより占有
されていない結合部位を遮断した。次いでこの膜をペプ
チド線の方向に対して直角な小片に切断した。次に各小
片を１対100に希釈した血清試料（HCV感染個体から得た
もの）と共にインキュベートした。酵素アルカリ性ホス
ファターゼに結合したヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体と
共にこの小片をインキュベートすることによって抗体結
合を検出した。結合していない複合体を洗浄によって除
去した後、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホ
スフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムを含有す
る基質溶液を加えた。
陽性反応は、特異的に認識されるペプチドの位置に対
応する着色した線として目視できる。36種類の異なる血
清の反応様式を表１に記載する。表１に記載の結果をさ
らに表２に要約する。
応する着色した線として目視できる。36種類の異なる血
清の反応様式を表１に記載する。表１に記載の結果をさ
らに表２に要約する。
B.酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）における
ペプチドの使用 ペプチド保存液を炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）で
希釈し、これを用いて２μg/mlのペプチド濃度で微量滴
定プレートをコートした。ペプチドII、III、Ｖ、IXお
よびXVIIIからなる混合物も用いてプレートをコートし
た。コーティングの後、プレートをカゼインで遮断し
た。15種のHCV抗体陽性血清と７人の非感染血液供給者
から得た対照血清を１対20に希釈し、ペプチド被覆プレ
ートのウェル中でインキュベートした。このプレートを
酵素西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒト
免疫グロブリン抗体と共にインキュベートすることによ
って抗体結合を検出した。結合していない複合体を洗浄
によって除去した後、H2O2および3,3′,5,5′−テトラ
メチルベンジジンを含有する溶液を加えた。適当な時間
経過後、硫酸の添加によって反応を停止させた。陽性反
応は黄色を呈し、これを従来の微量滴定プレートリーダ
ー（読み取り機）を用いて定量した。これらの測定の結
果を表３に記載する。ペプチド自体の物理的または化学
的特性に原因を帰することができる非特異的結合につい
て補正するために、各ペプチドについて個別に区分値
（カットオフ値）を決定した。この区分吸光度を（陰性
試料の平均光度密度＋0.200）として計算した。この区
分値より高い吸光度値を与える試料を陽性と見なす。15
種の陽性血清試料についての結果をさらに表４に要約す
る。
ペプチドの使用 ペプチド保存液を炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）で
希釈し、これを用いて２μg/mlのペプチド濃度で微量滴
定プレートをコートした。ペプチドII、III、Ｖ、IXお
よびXVIIIからなる混合物も用いてプレートをコートし
た。コーティングの後、プレートをカゼインで遮断し
た。15種のHCV抗体陽性血清と７人の非感染血液供給者
から得た対照血清を１対20に希釈し、ペプチド被覆プレ
ートのウェル中でインキュベートした。このプレートを
酵素西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒト
免疫グロブリン抗体と共にインキュベートすることによ
って抗体結合を検出した。結合していない複合体を洗浄
によって除去した後、H2O2および3,3′,5,5′−テトラ
メチルベンジジンを含有する溶液を加えた。適当な時間
経過後、硫酸の添加によって反応を停止させた。陽性反
応は黄色を呈し、これを従来の微量滴定プレートリーダ
ー（読み取り機）を用いて定量した。これらの測定の結
果を表３に記載する。ペプチド自体の物理的または化学
的特性に原因を帰することができる非特異的結合につい
て補正するために、各ペプチドについて個別に区分値
（カットオフ値）を決定した。この区分吸光度を（陰性
試料の平均光度密度＋0.200）として計算した。この区
分値より高い吸光度値を与える試料を陽性と見なす。15
種の陽性血清試料についての結果をさらに表４に要約す
る。
本ペプチド類のいくつかがHCV感染個体から得た血清
の大部分によって認識されることは明白であるが、すべ
ての血清によって認識される単一のペプチドがないこと
も明らかである。対照的に、ペプチド混合物は15種総て
の血清によって認識され、この15種の血清のうち６種に
ついては、得られる光学密度が個々のペプチドのいずれ
かに関して得られる光学密度に等しいか、もしくはそれ
以上であった。これらの結果は、抗HCV抗体を検出する
ためにペプチドの混合物を用いることの利点を明示する
ものである。
の大部分によって認識されることは明白であるが、すべ
ての血清によって認識される単一のペプチドがないこと
も明らかである。対照的に、ペプチド混合物は15種総て
の血清によって認識され、この15種の血清のうち６種に
ついては、得られる光学密度が個々のペプチドのいずれ
かに関して得られる光学密度に等しいか、もしくはそれ
以上であった。これらの結果は、抗HCV抗体を検出する
ためにペプチドの混合物を用いることの利点を明示する
ものである。
C.ELISAにおける様々な個々のペプチドおよびペプチド
混合物に対するHCV感染患者から得た血清中の抗体の結
合 ５種のペプチドを個別に用いて、またこれらのペプチ
ドを７種の異なる組み合わせで用いて、微量滴定プレー
トをコートした。次いで、抗体検出に個々のペプチドを
用いる場合と比較して混合物を用いることの相対的な利
点を評価するために、これらのプレートを15種のHCV抗
体陽性血清の希釈液と共にインキュベートした。使用し
た混合物および得られた結果を図２に示す。
混合物に対するHCV感染患者から得た血清中の抗体の結
合 ５種のペプチドを個別に用いて、またこれらのペプチ
ドを７種の異なる組み合わせで用いて、微量滴定プレー
トをコートした。次いで、抗体検出に個々のペプチドを
用いる場合と比較して混合物を用いることの相対的な利
点を評価するために、これらのプレートを15種のHCV抗
体陽性血清の希釈液と共にインキュベートした。使用し
た混合物および得られた結果を図２に示す。
一般に混合物の機能は個々のペプチドより優れてい
た。このことは混合物12（ペプチドＩ、III、Ｖ、IXお
よびXVIII）に関して特に顕著であり、この混合物12は
試験した12種の血清すべてによって認識された。これら
の結果は、HCVに対する抗体を検出するための診断的試
験においてペプチドの混合物を用いることの利点を強調
するものである。
た。このことは混合物12（ペプチドＩ、III、Ｖ、IXお
よびXVIII）に関して特に顕著であり、この混合物12は
試験した12種の血清すべてによって認識された。これら
の結果は、HCVに対する抗体を検出するための診断的試
験においてペプチドの混合物を用いることの利点を強調
するものである。
D.抗HCV抗体を検出するためのELISA検定におけるペプチ
ド混合物の使用 ペプチドII、III、Ｖ、IXおよびXVIIIの混合物を調製
し、これを用いて、個々のペプチドを試験するために用
いた方法と同じ方法に従って微量滴定プレートをコート
した。臨床的に診断されたが分類されていない慢性非Ａ
非Ｂ型肝炎患者から得た合計49種の血清、ならびに健康
な献血者から得た49種の血清を試験した。西洋ワサビペ
ルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗
体を用いて抗体結合の検出を行った。得られた光学密度
値を表５に記載する。これらの結果は、このペプチド混
合物が健康な供給者から得た血清中の抗体によっては認
識されない（49中０が反応性）が、慢性NANBHの患者か
ら得た血清の大部分（49中41、あるいは84％）によって
認識されることを示している。これらの結果は、記載の
ペプチドがHCV感染を診断するための混合物として効果
的に使用できることを立証している。
ド混合物の使用 ペプチドII、III、Ｖ、IXおよびXVIIIの混合物を調製
し、これを用いて、個々のペプチドを試験するために用
いた方法と同じ方法に従って微量滴定プレートをコート
した。臨床的に診断されたが分類されていない慢性非Ａ
非Ｂ型肝炎患者から得た合計49種の血清、ならびに健康
な献血者から得た49種の血清を試験した。西洋ワサビペ
ルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗
体を用いて抗体結合の検出を行った。得られた光学密度
値を表５に記載する。これらの結果は、このペプチド混
合物が健康な供給者から得た血清中の抗体によっては認
識されない（49中０が反応性）が、慢性NANBHの患者か
ら得た血清の大部分（49中41、あるいは84％）によって
認識されることを示している。これらの結果は、記載の
ペプチドがHCV感染を診断するための混合物として効果
的に使用できることを立証している。
E.ELISA検定におけるペプチド混合物およびナイロン膜
に結合させた個々のペプチドを用いる、急性NANB感染患
者から得た血清中の抗HCV抗体の検出、および市販キッ
トとの比較 上述のように、ペプチドをナイロン膜に適用するか、
あるいは混合して微量滴定プレートのコーティングに用
いた。このペプチド混合物はペプチドII、III、Ｖ、IX
およびXVIIIからなる。次に、21人の急性非Ａ非Ｂ肝炎
患者から得た血清をＣ型肝炎ウイルスに対する抗体の存
在について試験した。また市販のキット（Ortho,Emeryv
ille,CA,USA）を用いてこれらと同じ血清を評価した。
に結合させた個々のペプチドを用いる、急性NANB感染患
者から得た血清中の抗HCV抗体の検出、および市販キッ
トとの比較 上述のように、ペプチドをナイロン膜に適用するか、
あるいは混合して微量滴定プレートのコーティングに用
いた。このペプチド混合物はペプチドII、III、Ｖ、IX
およびXVIIIからなる。次に、21人の急性非Ａ非Ｂ肝炎
患者から得た血清をＣ型肝炎ウイルスに対する抗体の存
在について試験した。また市販のキット（Ortho,Emeryv
ille,CA,USA）を用いてこれらと同じ血清を評価した。
この比較研究の結果を表６に記載する。本ペプチドに
基づくELISAと市販のキットとの比較が可能なように、
両試験の結果を、各試料について得られた光学密度測定
値をその区分値で割ることによって計算した信号対雑音
比（S/N）としても表す。1.0以上の信号対雑音比を陽性
反応を表すものと解釈する。市販のキットについては製
造者の指示に従って区分値を計算した。本ペプチドに基
づくELISAについての区分値を、（５種の陰性試料の平
均光学密度＋0.200）として計算した。
基づくELISAと市販のキットとの比較が可能なように、
両試験の結果を、各試料について得られた光学密度測定
値をその区分値で割ることによって計算した信号対雑音
比（S/N）としても表す。1.0以上の信号対雑音比を陽性
反応を表すものと解釈する。市販のキットについては製
造者の指示に従って区分値を計算した。本ペプチドに基
づくELISAについての区分値を、（５種の陰性試料の平
均光学密度＋0.200）として計算した。
ナイロン結合ペプチドの抗体認識を評価するために用
いた尺度は表１に記載のものと同じとした。試験した29
試料のうち25試料（86％）が本ペプチドに基づくELISA
において陽性であり、１または複数のナイロン結合ペプ
チドを認識した。対照的に、29血清のうち、わずか14血
清が市販のELISAで陽性を記録したに過ぎなかった。こ
れらの結果は、抗HIV抗体を検出するためにペプチド混
合物を用いることの利点を明示すると共に、HCVポリペ
プチドの異なる領域から誘導されたアミノ酸配列が混合
物中に含まれる必要性を明示するものである。
いた尺度は表１に記載のものと同じとした。試験した29
試料のうち25試料（86％）が本ペプチドに基づくELISA
において陽性であり、１または複数のナイロン結合ペプ
チドを認識した。対照的に、29血清のうち、わずか14血
清が市販のELISAで陽性を記録したに過ぎなかった。こ
れらの結果は、抗HIV抗体を検出するためにペプチド混
合物を用いることの利点を明示すると共に、HCVポリペ
プチドの異なる領域から誘導されたアミノ酸配列が混合
物中に含まれる必要性を明示するものである。
フロントページの続き (72)発明者 ポレット，デルク ベルギー国ベー―2110ウェイネヘム、ス トケレイストラート50番 (72)発明者 マールテンス，ヘールト ベルギー国ベー―8310ブルッヘ、ジルフ ェルスパレンストラート64番 (72)発明者 ファン・ヘオフェルスウェイン，フーゴ ベルギー国ベー―9270ラールネ、コルマ ンストラート62番 (56)参考文献 欧州公開388232（ＥＰ，Ａ１) ・「Ｊａｐ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．」 60（４）Ｐ．223〜233（1990) ・Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，1990，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ 28ｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ，Ｏｓａｋａ，25〜27，Ｐ．211 〜214（1990)
Claims (14)
- 【請求項１】（ａ）以下のアミノ酸配列からなる群： ［式中、ＹはＨ、ビオチンまたはチオグリコール酸であ
り、そしてＹは例えばＮ末端アシル化などによって修飾
されていてもよく、 Ｚは結合、ビオチンまたはチオグリコール酸であり、 ＸはNH2、OHまたはこれら２つの基のいずれかを含有す
る結合である］ から選択される少なくとも１つのペプチドを含有するペ
プチド組成物。 - 【請求項２】ペプチド組成物が、以下のアミノ酸配列か
らなる群： ［式中、ＹはＨ、ビオチンまたはチオグリコール酸であ
り、そしてＹは例えばＮ末端アシル化などによって修飾
されていてもよく、 Ｚは結合、ビオチンまたはチオグリコール酸であり、 ＸはNH2、OHまたはこれら２つの基のいずれかを含有す
る結合である］ から選択される少なくとも１つのペプチドを更に含有す
る請求項１に記載のペプチド組成物。 - 【請求項３】ペプチドが担体に結合している請求項１〜
２のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項４】ペプチド（II）、ペプチド（III）、ペプ
チド（Ｖ）、ペプチド（IX）およびペプチド（XVIII）
からなる請求項１に記載のペプチド組成物。 - 【請求項５】ペプチド（Ｉ）、ペプチド（II）、ペプチ
ド（Ｖ）、ペプチド（IX）、ペプチド（XI）、ペプチド
（XVI）およびペプチド（XVIII）からなる請求項１に記
載のペプチド組成物。 - 【請求項６】ペプチド（II）、ペプチド（III）、ペプ
チド（IV）、ペプチド（Ｖ）、ペプチド（VIII）、ペプ
チド（XI）、ペプチド（XVI）およびペプチド（XVIII）
からなる請求項１に記載のペプチド組成物。 - 【請求項７】ペプチド（II）、ペプチド（IX）およびペ
プチド（XVIII）からなる請求項１に記載のペプチド組
成物。 - 【請求項８】ペプチド（II）、ペプチド（III）、ペプ
チド（IV）およびペプチド（Ｖ）からなる請求項１に記
載のペプチド組成物。 - 【請求項９】ペプチド（VIII）、ペプチド（IX）、ペプ
チド（XI）、ペプチド（XIII）およびペプチド（XIV）
からなる請求項２に記載のペプチド組成物。 - 【請求項１０】ペプチド（XV）、ペプチド（XVI）、ペ
プチド（XVII）、ペプチド（XVIII）およびペプチド（X
IX）からなる請求項１に記載のペプチド組成物。 - 【請求項１１】血清または血漿などの生物学的液体中の
Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体を検出する方法であっ
て、診断を受けるべき人の体液を請求項１〜10までのい
ずれかに記載のペプチド組成物と接触させ、該抗体と１
または複数の抗原との間に形成される免疫学的複合体を
検出することを特徴とする方法。 - 【請求項１２】免疫学的複合体の検出が、抗ヒト免疫グ
ロブリン抗体またはスタフィロコッカルＡプロテインま
たはストレプトコッカルＧプロテインまたはアビジンま
たはストレプトアビジンから選択される標識試薬と該免
疫学的複合体を反応させ、該複合体と該試薬の間で複合
体形成した試薬を検出することによって達成されること
を特徴とする請求項11に記載の方法。 - 【請求項１３】請求項１〜10までのいずれかに記載のペ
プチド組成物および生成する免疫学的複合体を検出する
ための手段からなる、生物学的液体中の抗Ｃ型肝炎ウイ
ルス抗体の検出用キット。 - 【請求項１４】免疫学的複合体を検出するための手段が
１または複数の抗ヒト免疫グロブリンまたはプロテイン
ＡまたはプロテインＧまたはアビジンまたはストレプト
アビジンと、検出される免疫学的複合体中に含まれる抗
HCV抗体間に形成される複合体を検出するための手段か
らなることを特徴とする請求項13に記載のキット。
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