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JP2908563B2 - 増強された骨形成特性を有する補綴デバイス - Google Patents

増強された骨形成特性を有する補綴デバイス

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JP2908563B2
JP2908563B2 JP6501663A JP50166393A JP2908563B2 JP 2908563 B2 JP2908563 B2 JP 2908563B2 JP 6501663 A JP6501663 A JP 6501663A JP 50166393 A JP50166393 A JP 50166393A JP 2908563 B2 JP2908563 B2 JP 2908563B2
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protein
amino acid
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residues
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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願の参照 本出願は、1992年２月21日に出願された係属中の米国
特許出願第07/841,646号の一部継続出願である。この一
部継続出願は、以下の米国特許出願の一部継続出願であ
る:1）1992年１月28日に出願された第07/827,052号、こ
れは1988年４月８日に出願された米国特許出願第07/17
9,406号（現在は米国特許第4,968,590号）の分割出願で
ある;2）1990年９月７日に出願された第07/579,865号、
これは米国特許出願第07/179,406号の分割出願である;
3）1990年12月４日に出願された第07/621,849号、1988
年８月15日に出願された米国特許出願第07/232,630号
（現在は放棄）の分割出願であり、後者の出願は第07/1
79,406号の一部継続出願であった;4）1990年12月４日に
出願された第07/621,988号、これは1989年２月23日に出
願された米国特許出願第07/315,342号（現在は米国特許
第5,011,691号）の分割出願であり、第07/232,630号の
一部継続出願である;5）1991年12月20日に出願された第
07/810,560号、これは1991年２月22日に出願された米国
特許出願第07/660,162号（現在は放棄）の継続出願であ
り、この第07/660,162号は1989年10月17日に出願された
第07/422,699号（現在は放棄）の一部継続出願であった
（第07/422,699号は第07/315,342号の一部継続出願であ
った）;6）1990年８月20日に出願された第07/569,920号
（現在は放棄）、これは第07/422,699号および第07/48
3,913号（後者は1989年10月17日に出願された第07/422,
613号（現在は米国特許第4,975,526号）の一部継続出願
および第07/315,342号の一部継続出願である）の一部継
続出願であった;7）1990年10月18日に出願された第07/6
00,024号、これは第07/569,920号の一部継続出願であ
る;8）1990年10月18日に出願された第07/599,543号、こ
れは第07/569,920号の一部継続出願である;9）1990年11
月21日に出願された第07/616,374号、これは第07/422,6
13号の分割出願である；および10）1990年２月22日に出
願された第07/483,913号。
発明の背景 骨格組織の再形成は、骨マトリックス中に天然に存在
する特異的タンパク質因子により調節されると考えられ
ている。骨が損傷を受けると、これらの因子が細胞を刺
激して、損失したまたは損傷を受けた骨の代わりとなる
か、またはそのような骨を修復する、新たな軟骨組織お
よび骨組織を形成する。骨の再形成は、補綴インプラン
トが、股関節部置換におけるように、病んでいる骨の代
わりとなるために結合セメントを用いずに用いられる場
合、特に重要である。これらの場合、補綴物と本来の骨
との間での堅い骨が形成されることが非常に重要であ
り、成功するかどうかは接触面でのインプラントと骨組
織との間の相互作用に依存する。
骨治癒は、１つまたはそれ以上の骨形成タンパク質に
より刺激され得る。この骨形成タンパク質は、軟骨内骨
形成を生じる細胞事象の発達カスケードを誘導し得る。
骨形成を刺激するタンパク質は、文献では、骨形態形成
タンパク質、骨誘導タンパク質、骨形成タンパク質、オ
ステオゲニン（osteogenin）、または骨誘導タンパク質
（osteoinductive proteins）と称されている。
米国特許第4,968,590号（1990年11月６日）は、マト
リックスと関連して哺乳類に移植されたとき哺乳類での
軟骨内骨形成を誘導し得、そして移植マトリックス25mg
あたり少なくとも約25〜50ngの半最大活性を有する、骨
由来の「実質的に純粋な」骨形成タンパク質の精製を開
示している。続いて、このタンパク質の高活性（例え
ば、移植マトリックス1mgあたり骨形成タンパク質0.8〜
1.0ng）が示され、これは米国特許第5,011,691号に開示
されている。この特許はまた、骨形成タンパク質をコー
ドする遺伝子を同定するのに有用なコンセンサスDNA配
列プローブ、およびコンセンサスプローブを用いて同定
された骨形成タンパク質をコードする多数のヒト遺伝子
を開示しており、本明細書中で「OP1」（骨形成タンパ
ク質−１）と称せられる、それ以前には同定されていな
かった遺伝子を含む。このコンセンサスプローブはま
た、国際出願第PCT/US87/01537号において、BMP−２ク
ラスＩおよびクラスII（それぞれ「BMP2」および「BMP
4」）およびBMP3と称される配列に対応するDNA配列を同
定した。これらの配列をコードする骨形成タンパク質
は、それぞれ本明細書中で「CBMP2A」、「CBMP2B」、お
よび「CBMP3」と称される。米国特許第5,011,691号はま
た、骨形成活性に必要とされる共通の「活性領域」を規
定し、マトリックスと関連して哺乳類における軟骨また
は骨の形成を誘導し得る、いくつかの新規な生合成構築
物を記載した。
これらおよび他の研究者らは、軟骨内骨形成のための
骨形成因子の移植の成功には、上記タンパク質と、適用
する位置においてそのタンパク質を維持する適切なキャ
リア材またはマトリックスとが密接に関連していること
が必要とされることを述べている。粉砕した骨の脱塩、
グアニジン抽出、および脱脂後に残った骨コラーゲン粒
子が、この目的のために用いられている。多くの骨誘導
タンパク質は異種間において有用である。しかし、脱塩
し、脱脂し、グアニジン抽出した異種の個体のコラーゲ
ンマトリックスは、典型的にはインビボでの骨誘導を阻
害した。SampathおよびReddi（1983）Proc.Natl.Acad.S
ci.USA，80:6591−6594。しかし、最近Sampathらは、脱
塩しグアニジン抽出した骨粉末を処理して異種のインプ
ラントに有用なマトリックスをつくる方法を記載した。
例えば、米国特許第4,975,526号（1990年12月４日）を
参照のこと。他の有用なマトリックス材としては、例え
ば、コラーゲン；グリコール酸、乳酸、および酪酸のホ
モポリマーまたはコポリマー、それらの誘導体を含む；
およびセラミック（例えばヒドロキシアパタイト、リン
酸三カルシウムおよび他のリン酸カルシウム）が挙げら
れる。これらのマトリックス材の組み合わせもまた有用
であり得る。
整形用インプラントは、従来では骨セメントを用いて
天然骨に付着されていた。より最近では、無セメント補
綴物が用いられており、ここで、天然骨と接触する補綴
物の一部が有孔性の材料でコーティングされている。M.
Spector,J.Arthoroplasty，2(2):163−176（1987）；お
よびCookら、Clin.Orthoped.and Rel.Res.，232:225−2
43（1988）。セメントによらない固定は、骨統合（osse
ointegration）が達成されるとき補綴物の生物学的固定
がより強くなるので好ましい。有孔性コーティングは報
告されているように骨の内方成長（ingrowth）を刺激
し、これにより補綴物の生物学的固定を増強する。しか
し、有孔性コーティング補綴物にはいくつかの問題点が
ある。例えば、デバイスの最初の機械的安定を確実にす
る骨との密接な適合を得るために補綴物の慎重な選択が
必要であり、そして骨内方成長を促進する最初のインプ
ラント−骨接触を確実にするための手術上の精度が要求
される。有孔性コーティングインプラントは、いくつか
の場合では骨の内方成長を生じない。例えば、膝部代替
において用いられる有孔性コーティング脛骨板の場合で
ある。顕著な骨内方成長をもたらし、そして結合部位で
天然骨と強い結合を生じる補綴インプラントは、非常に
価値がある。
歯科用インプラントのような包埋インプラントの固定
に関し、当該分野の現況は充足されていない。典型的に
は、歯科用インプラント固定には、歯槽を埋めるための
骨の歯槽隙への内方成長による補綴物移植のために、ま
ず個体の顎骨中で歯槽を調製する必要がある。この準備
工程は、それだけで完成するまで数カ月を費やし得る。
次いで補綴物を歯槽中の新たな骨に貫通し、新たな骨
を、歯槽中に包埋したインプラントの貫通部分の周囲に
再成長させる。従って、抜歯と補綴物の充填との間の期
間が８カ月にもなり得る。さらに補綴物の骨への装着
は、骨の完全性を損傷し得る。骨統合を改良し、固定の
時間および影響を減少させる補綴歯科用インプラントが
好都合である。
発明の要旨 本発明は、補綴物の移植部位での骨の成長を増強し、
この補綴物と本来の骨との間の結合を形成する方法に関
する。本明細書中で用いられるように、補綴物は、生体
の欠損部を供給する人工部分の付加を意味すると理解さ
れる。本発明の方法は、実質的に純粋な骨形成タンパク
質で骨と接触される補綴物の全体または一部をコーティ
ングすること、またはそうでなければ接触させることを
包含する。この補綴物は、まず骨形成タンパク質でコー
ティングされて、次いで、特定の部位で、個体中に移植
される。ここで、この部位は骨組織および補綴物の表面
が、組織と移植された補綴物との間で骨組織の成長を増
強させるのに充分な時間、非常に接近して維持される部
位である。あるいは、まず、移植の部位が実質的に純粋
な骨形成タンパク質で処理され得、次いで、補綴物が処
理部位で移植され得る。この処理部位は、補綴物の全体
および一部がその部位で骨形成タンパク質と接触され、
そして補綴物、骨形成タンパク質、および本来の骨が、
組織と補綴物との間で骨組織の成長を増強させるのに充
分な時間、互いに非常に接近して維持される部位であ
る。移植された補綴物に結合した骨形成タンパク質は、
補綴物の周囲の骨形成を刺激し、そして補綴物と本来の
骨との間で形成される結合を、このタンパク質の非存在
下での補綴物と骨との間での形成よりも強くする。
本発明の方法の好ましい実施態様では、人工股関節部
代替デバイスのような補綴デバイス（例えば、チタンか
ら生成された金属性デバイス）は、例えば、骨の内方成
長を誘導する骨形成材でまずコーティングされる。この
デバイスが続いて個体に移植されるとき、移植部位の周
囲の骨成長が増強され、インプラントと本来の骨との間
に強い結合の形成がもたらされる。本発明の方法によ
り、生体における補綴物の生物学的固定が増強される。
特に重量を支える補綴物に対して重要である。微小孔表
面構造を規定する補綴物は、骨形成が微小孔内で起こる
ように適切な位置に固着される。金属またはセラミック
の補綴物は、それ自身でこのような構造を規定し得る
か、またはその補綴物がコーティングされて付着性の孔
構造を提供し得る。この目的に有用な材料には、例え
ば、コラーゲン、グリコール酸、乳酸、および酪酸のホ
モポリマー、（それらの誘導体を包含する）；およびセ
ラミック（例えば、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カ
ルシウム、または他のリン酸カルシウム類）が包含され
る。これらの材料の組み合わせは用いられ得る。次い
で、実質的に純粋な骨形成タンパク質を非コーティング
またはコーティング補綴物に結合させる。あるいは、骨
形成タンパク質をコーティング材と混合し得、そして混
合物を補綴物の表面上に付着し得る。
本発明の他の実施態様では、マトリックス材と組み合
わせた骨形成タンパク質は、補綴インプラントを支える
ために調製された開口部に充填される。インプラントの
表面はまた、上記のように骨形成タンパク質でコーティ
ングされ得る。インプラントは、骨の内方成長を可能に
する１つまたはそれ以上のくぼみを規定する形状を有す
る。このくぼみは、好ましくは、インプラントの縦軸に
対して垂直方向である。一般に、インプラントの縦軸
は、インプラントを支えるように処理されている骨の縦
軸と同方向である。新しい骨がくぼみ中に成長し、それ
によってくぼみを埋め、上記のようにインプラントの表
面と統合し、そして本来の骨と組み込まれる。従って、
補綴物は開口部中にさらに堅く固定され得、そしてくぼ
み中に骨が成長することにより、および新たな骨がイン
プラントの表面と骨統合することにより、骨形成タンパ
ク質により刺激される両者により、「ラッチされる（la
tched）」、すなわち適当な位置に保持され得る。
特定の実施態様では、歯科用インプラントは、損失し
た歯の代わりに用いられる。インプラントは、典型的に
は、顎骨中に固定される貫通部分および患者の歯の残部
と組み込むように配置された歯部分を含む。インプラン
トは、骨形成タンパク質で（マトリックスまたはキャリ
アと共に、またはこれらを有さないで）コーティングさ
れ、そしてそれを支持するように調製された顎骨の歯槽
中に貫通されているか、またはネジ止めされている（例
えば、骨を、歯槽隙中に成長させて、この歯槽隙を埋め
るようにしておく）。特に好ましい実施態様では、歯槽
は、隙に骨成長組成物を満たすことにより、インプラン
トを支えるように調製される。この骨成長組成物は、適
切なキャリア材に分散させた骨形成タンパク質から構成
される。骨形成タンパク質とキャリアとの組み合わせ
を、本明細書中では「骨形成デバイス」と称する。骨形
成タンパク質は、最初に骨成長が歯槽を満たすことを必
要とせず、そして補綴物が本来の骨を貫通する（これに
より、本来の骨の完全性を弱め得る）必要がなく、イン
プラントの顎骨への骨統合を促進する。従って、抜歯と
補綴物の充填との間の期間がかなり短くなる。補綴物の
充填は１カ月ほどの短い期間で完成され得ることが理解
される。さらに、骨形成タンパク質が補綴物の骨統合を
促進し得るため、優れた固定材（anchor）が提供され
る。
上記の骨形成タンパク質でコーティングされた骨形成
デバイスもまた本発明の主体である。このデバイスの全
体または一部がタンパク質でコーティングされ得る。一
般に、本来の骨と接触される、デバイスの部分のみがコ
ーティングされる。
本発明の方法およびデバイスにより、補綴物の生物学
的固定が増強される。強い結合が本来の骨と補綴物との
間で形成され、接合部位での機械的強度が改良される。
付着強度が高いことは、骨形成が、より強固で耐久的で
あり、従って、患者に対しより快適で永続的であること
を意味する。
図面の簡単な説明 図は、大腿骨に移植された補綴物の一部の断面図を示
し、本発明の実施態様に従う骨の内方成長のラッチング
作用を例示する。
発明の詳細な説明 本発明は、個体において補綴物の移植部位で補綴デバ
イスと天然骨との間の骨統合を増強する方法に関する。
本発明の方法は、実質的に純粋な骨形成タンパク質と共
に移植部位に補綴物を提供する工程を包含し、ここでこ
の骨形成タンパク質は移植された補綴物の全体または一
部と接触している。このタンパク質は、補綴物および骨
の骨統合を促進し、改良された引っ張り強度を有する強
い結合となる。
本発明に有用である骨形成タンパク質は、実質的に純
粋な骨形成に活性なダイマータンパク質である。本明細
書中で用いられるように、「実質的に純粋な」とは、軟
骨内骨形成活性を有さない他の混入タンパク質を実質的
に含まないことを意味する。このタンパク質は、哺乳類
の骨に由来する天然由来タンパク質であり得るか、また
は組換え生産タンパク質であり得る（生合成構築物を含
む）。天然由来タンパク質は、ラット脱塩骨粉末に比較
して、骨粉末から抽出した脱塩タンパク質の25mgあたり
少なくとも25〜50ngの半最大活性を有することにより特
徴づけられる。
成熟型の未変性天然由来骨形成タンパク質は、SDS−P
AGEにより決定された約30kDaの見かけ分子量を有するグ
リコシル化ダイマーである。還元したとき、この30kDa
タンパク質は、約16kDaおよび18kDaの見かけ分子量を有
する２つのグリコシル化ペプチドサブユニットを生じ
る。還元状態では、このタンパク質は検出可能な骨形成
活性を有さない。非グリコシル化タンパク質（このタン
パク質もまた骨形成活性を有する）は、約27kDaの見か
け分子量を有する。還元したとき、この27kDaタンパク
質は、約14kDaおよび16kDaの分子量を有する２つの非グ
リコシル化ポリペプチドを生じる。組換え生産骨形成タ
ンパク質は、１対のポリペプチド鎖を含む、哺乳類での
軟骨内骨形成を誘導し得るダイマータンパク質の類を示
し、各ポリペプチド鎖は、生合成構築物、すなわちCOP
−５またはCOP−７（配列番号３および４）の配列に十
分に重複したアミノ酸配列を有し、その結果、このポリ
ペプチド鎖対は、ダイマー種を生成するようにジスルフ
ィド結合されたとき、哺乳類において軟骨内骨形成を誘
導し得る。本明細書中で定義されるように、「十分に重
複した」とは、マトリックスに関連して哺乳類に移植し
たダイマータンパク質として軟骨内骨活性を有するタン
パク質の類を示すことは理解される。各サブユニット
は、Ｃ末端のシステインに富む領域中で、OPSの配列（3
35残基から431残基まで、配列番号１）と少なくとも60
％のアミノ酸配列相同性を有する。「相同性」とは、ア
ミノ酸配列が同一であること、またはその配列との同類
アミノ酸置換が生じていること（Dayoffら、Atlas of P
rotein Sequence and Structure；第５巻、第３号、345
〜362頁、（M.O.Dayoff編、Nat'l Biomed.Reseach Fd
n.,Washington,D.C.,1979）により定義される）と、本
明細書中で定義される。有用な配列は、以下のタンパク
質のＣ末端を含む配列である:DPP（ショウジョウバエ由
来）、Vgl（アフリカツメガエル由来）、Vgr−１（マウ
ス由来）、OP1およびOP2タンパク質、CBMP2、CBMP3、お
よびCBMP4タンパク質（米国特許第5,011,691号、および
米国特許第5,266,683号を参照のこと、これら両方の開
示内容は本明細書中に参考として援用されている）、な
らびにBMP5およびBMP6と称されるタンパク質（WO90/113
66、PCT/US90/01630）。これらのタンパク質の多くはま
たWO88/00205、米国特許第5,013,649号、およびWO91/18
098に記載されている。表Ｉに、これら骨形成タンパク
質ファミリーの好ましいメンバーを挙げる。
表Ｉ−骨形成タンパク質配列 hOP1 − ヒトOP1タンパク質をコードするDNA配列（配
列番号１または３）。関連出願では「OP1」、「hOP−
１」、および「OP−１」とも称されている。
OP1 − 一般的に、hOP1遺伝子の一部または全体の発
現により生産された骨形成に活性なタンパク質ファミリ
ーを称する。関連出願では「OPI」および「OP−１」と
も称されている。
hOP1−PP − ヒトOP1タンパク質（プレプロ型）のア
ミノ酸配列（配列番号１の１−431残基）。関連出願で
は「OP1−PP」および「OPP」とも称されている。
OP1−18Ser − 成熟ヒトOP1タンパク質のアミノ酸配
列（配列番号１の293−431残基）。Ｎ末端アミノ酸はセ
リンである。元来COS細胞のSDS−PAGEの18kDaに移動し
たバンドにより同定された。また、種々の宿主細胞にお
けるタンパク質グリコシル化パターンに依存して、SDS
−PAGEで23kDa、19kDa、および17kDaに移動する。関連
出願では「OP1−18」とも称されている。
OPS − 活性領域において保存的な６個のシステイン
骨格を規定するヒトOP1タンパク質種（97アミノ酸、配
列番号１の335−431残基）「Ｓ」は、「ショート（shor
t）」を表す。
OP7 − 活性領域において保存的な７個のシステイン
骨格を規定するヒトOP1タンパク質種（102アミノ酸、配
列番号１の330−431残基）。
OP1−16Ser − Ｎ末端側が切断された成熟ヒトOP1タ
ンパク質種（配列番号１の300−431残基）、Ｎ末端アミ
ノ酸はセリンである；タンパク質は、グリコシル化パタ
ーンに依存してSDS−PAGE上で16kDaまたは15kDaに移動
する。関連出願では「OP−16S」とも称されている。
OP1−16Leu − Ｎ末端側が切断された成熟ヒトOP1タ
ンパク質種（配列番号１の313−431残基）。Ｎ末端アミ
ノ酸はロイシンである；タンパク質は、グリコシル化パ
ターンに依存してSDS−PAGE上で16kDaまたは15kDaに移
動する。関連出願では「OP−16L」とも称されている。
OP1−16Met − Ｎ末端側が切断された成熟ヒトOP1タ
ンパク質種（配列番号１の315−431残基）。Ｎ末端アミ
ノ酸はメチオニンである；タンパク質は、グリコシル化
パターンに依存してSDS−PAGE上で16kDaまたは15kDaに
移動する。関連出願では「OP−16M」とも称されてい
る。
OP1−16Ala − Ｎ末端側が切断された成熟ヒトOP1タ
ンパク質種（配列番号１の316−431残基）。Ｎ末端アミ
ノ酸はアラニンである；タンパク質は、グリコシル化パ
ターンに依存してSDS−PAGE上で16kDaまたは15kDaに移
動する。関連出願では「OP−16A」とも称されている。
OP1−16Val − Ｎ末端側が切断された成熟ヒトOP1タ
ンパク質種（配列番号１の318−431残基）。Ｎ末端アミ
ノ酸はバリンである；タンパク質は、グリコシル化パタ
ーンに依存してSDS−PAGE上で16kDaまたは15kDaに移動
する。関連出願では「OP−16V」とも称されている。
mOP1 − マウスOP1タンパク質をコードするDNA（配列
番号８）。関連出願では「mOP−１」とも称されてい
る。
mOP1−PP − マウスタンパク質のプレプロ型（配列番
号８の１−431残基）。関連出願では「mOP−１−PP」と
も称されている。
mOP1−Ser − 成熟マウスOP1タンパク質種（配列番号
８の292−430残基）。Ｎ末端アミノ酸はセリンである。
関連出願では「mOP1」および「mOP−１」とも称されて
いる。
mOP2 − マウスOP2タンパク質をコードするDNA（配列
番号12）。関連出願では「mOP−２」とも称されてい
る。
mOP2−PP − mOP2タンパク質のプレプロ型（配列番号
12の１−399残基）。関連出願では「mOP−２−PP」とも
称されている。
mOP2−Ala − 成熟マウスOP2タンパク質種（配列番号
12の261−399残基）。Ｎ末端アミノ酸はアラニンであ
る。関連出願では「mOP2」および「mOP−２」とも称さ
れている。
hOP2 − ヒトOP2タンパク質をコードするDNA（配列番
号10）。関連出願では「hOP−２」とも称されている。
hOP2−PP − ヒトOP2タンパク質のプレプロ型（配列
番号10の１−402残基）。関連出願では「hOP−２−PP」
とも称されている。
hOP2−Ala − 生じ得る成熟ヒトOP2タンパク質種；配
列番号10の264−402残基）。関連出願では「hOP−２」
とも称されている。
hOP2−Pro − 生じ得る成熟ヒトOP2タンパク質種（配
列番号10の267−402残基）。Ｎ末端アミノ酸はプロリン
である。関連出願では「hOP−2P」とも称されている。
hOP2−Arg − 生じ得る成熟ヒトOP2タンパク質種（配
列番号10の270−402残基）。Ｎ末端アミノ酸はアルギニ
ンである。関連出願では「hOP−2R」とも称されてい
る。
hOP2−Ser − 生じ得る成熟ヒトOP2タンパク質種（配
列番号10の243−402残基）。Ｎ末端アミノ酸はセリンで
ある。関連出願では「hOP−2S」とも称されている。
Vgr−１−fx − ネズミ「Vgr−１」タンパク質のＣ末
端の102アミノ酸残基（配列番号７）。
CBMP2A − ヒトBMP2Aタンパク質のＣ末端の101アミノ
酸残基（配列番号14の296−396残基）。
CBMP2B − ヒトBMP2Bタンパク質のＣ末端の101アミノ
酸残基（配列番号18）。
BMP3 − 成熟ヒトBMP3（部分配列、配列番号16。Ｃ末
端の102残基に関して米国特許第5,011,691号「CBMP3」
を参照のこと。） BMP5−fx − ヒトBMP5タンパク質のＣ末端の102アミ
ノ酸残基（配列番号20）。
BMP6−fx − ヒトBMP6タンパク質のＣ末端の102アミ
ノ酸残基（配列番号21）。
COP5 − 生合成骨形成96アミノ酸配列（配列番号
３）。
COP7 − 生合成骨形成96アミノ酸配列（配列番号
４）。
DPP−fx − ショウジョウバエ「DPP」タンパク質のＣ
末端の102アミノ酸残基（配列番号５）。
Vgl−fx − アフリカツメガエル「Vgl」タンパク質の
Ｃ末端の102アミノ酸残基（配列番号６）。
表記タンパク質ファミリーのメンバーは、この領域に
保存的な６個または７個のシステイン骨格を共通して有
している（例えば、これらのＣ末端システイン残基の直
線配置は、種々のタンパク質で保存されている）。例え
ば、OPS（この配列は６システイン骨格を規定する）ま
たはOP7（OP1の長型、102個のアミノ酸を含み、そして
この配列は７システイン骨格を規定する）を参照のこ
と。さらに、OP2タンパク質は、この領域内にさらなる
システイン残基を含む。
表記タンパク質ファミリーには、所定のタンパク質の
長型、ならびに種および対立遺伝子変異種および生合成
的変異体（付加および欠失の変異体および変異種を含
む）を包含する。これらは、保存的なＣ末端システイン
骨格を変化し得るが、この変化により、タンパク質が、
マトリックスに関連して哺乳類に移植されたときに哺乳
類において骨形成を誘導し得るコンホメーションを有す
るダイマー種を形成し得る場合に限られる。さらに、本
発明のデバイスに有用な骨形成タンパク質は、種々のグ
リコシル化パターンおよび種々のＮ末端を有する型を含
み得、天然に存在し得るかまたは生合成的に誘導され
得、そして原核または真核の宿主細胞における組換えDN
Aの発現により生産され得る。このタンパク質は、単独
種として活性であるか（例えばホモダイマー）、または
混合種として組み合わされ得る。
本発明の補綴デバイスに有用な上記タンパク質の特に
好ましい実施態様は、システインに富むＣ末端ドメイン
のアミノ酸配列が、OPSのアミノ酸配列と60％より大き
い同一性を有しており、好ましくは65％より大きい同一
性を有する。
別の好ましい局面では、本発明は、本明細書中で「OP
X」と称する一般アミノ酸配列を有するポリペプチド鎖
からなる種を含む骨形成タンパク質を含む。この配列に
より、骨形成OP1タンパク質および骨形成OP2タンパク質
の種々の同定された種の間で相同性が提供され、そして
この配列は、配列番号22のアミノ酸配列により示され
る。
さらに別の好ましい曲面では、本発明は、ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下でOP1またはOP2
の活性領域をコードするDNA配列またはRNA配列にハイブ
リダイズする核酸、およびこれらの核酸によりコードさ
れる骨形成に活性なポリペプチド鎖を含む。本明細書中
で用いられるように、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件とは、40％ホルムアミド、５×SSPE、５
×デンハート溶液、および0.1％SDS中で37℃で一晩ハイ
ブリダイズし、そして0.1X SSPE、0.1％SDS中で50℃で
清浄することと定義される。
本発明は、さらに、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下でOP1またはOP2の「プロ」領域にハイ
ブリダイズする核酸、およびこれらの核酸によりコード
される骨形成に活性なポリペプチド鎖を含む。本明細書
中で用いられるように、「骨形成に活性なポリペプチド
鎖」とは、二量体化されたときに、以下のようなコンホ
メーションを有するタンパク質種を生成するこれらのポ
リペプチド鎖を意味することが理解される。このコンホ
メーションは、このポリペプチド鎖対が、マトリックス
またはキャリアに関連して哺乳類に移植されたときに哺
乳類において軟骨内骨形成を誘導し得るコンホメーショ
ンである。
上記のアミノ酸およびDNAの配列情報、当該分野の技
術レベル、および米国特許第5,011,691号および公開PCT
出願明細書US89/01469（1989年10月19日公開）の開示
（これらの開示内容は本明細書中に参考として援用され
ている）を得ることにより、本発明のデバイスに有用
な、骨形成タンパク質、およびそれらの種々のアナログ
（種および対立遺伝子変異種、および遺伝子工学的に設
計された変異を含む変異種を含む）、ならびに融合タン
パク質、成熟タンパク質の切断型、欠失および付加変異
体、および類似の構築物の少なくとも活性ドメインをコ
ードする種々のDNAが構築され得る。さらに、DNAハイブ
リダイゼーションプローブは、これらのタンパク質のい
ずれのフラグメントからも構築され得、または上記一般
配列からde novoに設計され得る。これらのプローブは
次いで異なるゲノムライブラリーおよびcDNAライブラリ
ーをスクリーニングするのに用いられて、本発明の補綴
デバイスに有用なさらなる骨形成タンパク質を同定し得
る。
このDNAは、周知のDNA操作技法（ゲノムおよびcDNAの
単離、合成したオリゴヌクレオチドからの合成DNAの構
築、およびカセット突然変異誘発法を含む）を用いて、
当業者により作製され得る。15〜100マーのオリゴヌク
レオチドは、DNAシンセサイザーで合成され得、トリス
−ホウ酸−EDTA緩衝液中のポリアクリルアミドゲル電気
泳動（PAGE）により精製され得る。次いで、このDNA
は、ゲルから電気溶出され得る。重複するオリゴマー
は、T4ポリヌクレオチドキナーゼによりホスホリル化さ
れ得、そしてより大きなブロックに連結され得、これを
またPAGEにより精製し得る。
次いで、適切に同定されたクローン由来のDNAが単離
され得、サブクローニングされ得（好ましくは発現ベク
ター中に）、そして配列決定され得る。次いで、目的の
配列を含むプラスミドが、タンパク質発現およびさらな
る特徴付けのために適切な宿主細胞にトランスフェクト
され得る。この宿主は、原核細胞または真核細胞であり
得る。前者の場合でのタンパク質をグリコシル化しない
ことは、上記タンパク質の形態形成活性を喪失させな
い。有用な宿主細胞には、E.coli、Saccharomyces、昆
虫／バキュロウイルス細胞系、ミエローマ細胞、CHO細
胞、および種々の他の哺乳類細胞が包含される。ベクタ
ーは、組換えタンパク質の正確な発現を促進する種々の
配列をさらにコードし得る。この配列は、転写プロモー
ターおよび終止配列、エンハンサー配列、好ましいリボ
ゾーム結合部位配列、好ましいmRNAリーダー配列、タン
パク質分泌のために好ましいシグナル配列などを含む。
目的の遺伝子をコードするDNA配列はまた、阻害可能
性のある配列を除去するかまたは望ましくない二次構造
の形成を最小化するように操作され得る。組換え骨形成
タンパク質はまた、融合タンパク質として発現され得
る。翻訳された後、このタンパク質は細胞自身から精製
され得るか、または培地から回収され得る。すべての生
物学的に活性なタンパク質の型は、ジスルフィド結合に
より結合されるか、またはそうでなければ、個々のサブ
ユニットの発現後に適切な真核細胞内またはインビトロ
で１つまたはそれ以上の種々の組換えポリペプチド鎖を
折り畳み、酸化することにより会合されて生成されるダ
イマー種を包含する。E.coliにおける組換えDNAから発
現した骨形成タンパク質の詳細な説明は、米国特許出願
第422,699号（1989年10月17日に出願）に開示されてお
り、この開示内容は本明細書中に参考として援用されて
いる。多くの種々の哺乳類細胞における組換えDNAから
発現した骨形成タンパク質の詳細な説明は、米国特許出
願第569,920号（1990年８月20日に出願）に開示されて
おり、この開示内容は本明細書中に参考として援用され
ている。
あるいは、骨形成ポリペプチド鎖は、当業者に周知の
従来のペプチド合成法を用いて化学的に合成され得る。
例えば、このタンパク質は、固相ペプチド合成機で、標
準的な操作手順を用いて、完全な形でまたは部分的に合
成され得る。次いで、完成した鎖を脱保護し、HPLC（高
速液体クロマトグラフィー）により精製する。タンパク
質が部分的にしか合成されない場合、その部分を標準法
を用いてペプチド結合して、完全なタンパク質を形成し
得る。一般的に、骨形成タンパク質が作製される方法
は、従来的であり得、本発明の一部を形成するわけでは
ない。
本発明に有用な骨形成タンパク質は、哺乳類の体内に
移植されたとき、軟骨内骨形成の発達カスケード（間葉
細胞の補充および増殖、前駆細胞の分化、軟骨形成、軟
骨の石灰化、血管侵入、骨形成、改造作用（リモデリン
グ）、および骨髄分化を包含する）を誘導するタンパク
質である。本発明の補綴物と接触させる骨形成タンパク
質は、本質的に天然の骨治癒において生じるように、移
植部位で軟骨内骨形成の充分な発達カスケードを誘導し
得る。
本発明の方法と共に用いられ得る補綴物は、当該分野
で周知の型の有孔または無孔の整形外科補綴物であり得
る。このような補綴物は、一般的に金属のような堅い材
料から製造され得る。このような金属としては、例え
ば、ステンレス鋼、チタン、モリブデン、コバルト、ク
ロム、および／またはこれらの金属の合金または酸化物
が挙げられる。このような酸化物は、典型的には、薄く
て安定した付着性の酸化金属表面コーティングを含む。
この補綴物は、骨の浸入が可能なように、好ましくは、
有孔性金属から形成されるかまたは有孔性金属でコーテ
ィングされているが、無孔性材料もまた用いられ得る。
補綴物に用いられる有孔性金属材は、例えば、Spector,
J.Arthroplasty，2(2):163−176（1987）およびCook
ら，Clin.Orthoped.and Rel.Res.，232:225−243（198
8）に記載されており、両文献の教示内容は本明細書中
に参考として援用されている。金属性補綴物は、主要な
骨または関節の代用、および非癒着性の骨折の治療のた
めに用いられ得る。（例えば、本来の骨が疾患または損
傷により破壊されている場合）。
本発明のデバイスおよび方法の好ましい実施態様で
は、補綴物は、上記タンパク質に加えて、骨の内方成長
および固定を増強する材料でコーティングされる。この
目的のために有用な材料は、生体適合性であり、好まし
くはインビボにおいて生体分解性であり非免疫原性であ
る。このような材料としては、例えば、コラーゲン、ヒ
ドロキシアパタイト、グリコール酸、乳酸、および酪酸
のホモポリマーまたはコポリマーおよびそれらの誘導
体、リン酸三カルシウムまたは他のリン酸カルシウム、
酸化金属（例えば、酸化チタン）、および脱塩し、グア
ニジン抽出した骨が挙げられる。
本発明のコーティングされた補綴物は、補綴物の全体
または一部に、上記タンパク質溶液、必要に応じてヒド
ロキシアパタイトまたは他の材料を塗布することにより
調製される。タンパク質は、好都合な方法（例えば、デ
ィッピング、刷毛塗り、液浸、スプレー塗布、または凍
結乾燥）により塗布され得る。ヒドロキシアパタイト
は、好ましくは、プラズマスプレー処理により塗布され
得る。上記タンパク質は、好ましくは、補綴物をタンパ
ク質溶液中に、溶液のタンパク質のインプラントへの結
合または沈降を誘導するのに適切な条件下で浸漬するこ
とにより塗布され得る。インプラントに塗布されるタン
パク質の量は、補綴物が受容者に移植されるときに軟骨
内骨形成を誘導するのに充分な濃度でなければならな
い。一般的に、表面積3.4cm2あたり少なくとも５μｇの
タンパク質の範囲の濃度がこのような目的には十分であ
る。ヒドロキシアパタイトまたは他のキャリア材料が用
いられる場合には、これらの材料は約15μから約60μの
厚さを形成するのに必要とされる量で補綴物に塗布され
る。実施例に示すように、約25μ厚さのヒドロキシアパ
タイト層がインプラント固定の改良に用いられている。
１つの局面では、補綴物は、該補綴物を支えるように
調製された開口部に挿入されるように形成されるデバイ
スを含む。この実施態様では、図に示すように、骨の内
部（10）を、インプラント（12）の挿入のための準備と
してくり抜く。このインプラントは、複数のくぼみ（1
6）を規定する不規則輪郭の表面デザイン（14）を有
し、このためくぼみへの骨の内方成長が可能になる。こ
のくぼみは、好ましくは、インプラントの縦軸（18）に
対して垂直方向にある。開口部に挿入される不規則輪郭
部分は、上記のように骨形成タンパク質でコーティング
され得る。マトリックス材（20）と組み合わされる骨形
成タンパク質を、補綴インプラントと共に開口部に充填
し、それによりインプラントを取り囲む骨形成タンパク
質により刺激されて、上記のように、新たな骨がくぼみ
（16）中に成長し、インプラント（12）の表面および既
に存在する骨（10）と統合する。従って、上記補綴物
は、適切な位置で機械的および生物学的に固定され、骨
に関連するインプラントの軸の動きは、骨組織の剪断を
必要とするようになる。骨の成長および固定を増強する
補綴物のコーティングのためのマトリックス材（20）
は、上記の材料のいずれかであり得る。例えば、コラー
ゲン、ヒドロキシアパタイト、グリコール酸、乳酸、お
よび酪酸のホモポリマーまたはコポリマーおよびそれら
の誘導体、リン酸三カルシウムまたは他のリン酸カルシ
ウム、酸化金属（例えば、酸化チタン）、および脱塩し
グアニジン抽出した骨が挙げられる。本発明の実施態様
で用いられ得る骨形成タンパク質との使用のためのマト
リックス材は、例えば、米国特許第5,011,691号、およ
び米国特許第5,266,683号に記載の材料であり、これら
の教示内容は、これにより本明細書中に参考として援用
される。
図に示される補綴物は、最後に補綴物の一部が骨組織
にはめ込まれるべき場所への、歯科用インプラントおよ
び他のインプラントに特に有用である。開口部（例えば
歯槽）の「骨形成デバイス」（例えばマトリックス材と
組み合わせた骨形成タンパク質）での充填は、このデバ
イスが本来の骨に貫通される必要がなく、補綴物をはめ
込む場所に堅い材料を提供する。さらに、骨形成タンパ
ク質は、歯槽内およびインプラント中および周囲の軟骨
内骨形成を刺激し、よって、補綴物が移植される適切な
表面を提供するために以前必要とされていた歯槽への最
初の低いレベルの骨の内方成長の工程が不要となる。従
って、本発明のデバイスおよび方法を用いると、移植さ
れた補綴物の強い固定が、以前必要とされていた時間の
何分の１かの時間で達成され得、よって、抜歯と補綴物
の充填との間の期間がかなり短くなる。さらに、この処
理は、移植療法の用途を拡大し得、そして、手術工程を
取り除き、抜歯のために損失する骨の量を減少し、イン
プラントをより長い期間挿入でき、そして顎堤吸収によ
り伴われる補綴物の妥協を最小限にすることにより成功
の比率を増大し得る。
本発明は、以下の実施例によりさらに説明され、いか
なる方法によっても限定されないことが意図される。
実施例 実施例１ 金属インプラント固定 長さ18mmおよび直径5.95±0.05mmの円筒状インプラン
トを球状のCo−Cr−Mo粒子から製造し、これは孔サイズ
250〜300μｍおよび孔隙率38〜40％であった。結晶度の
高く、高密度で孔隙率の低いヒドロキシアパタイト（H
A）のコーティングをプラズマスプレー処理により、各
インプラントの長さの半分にまで施した。コーティング
の厚さは25μｍであり、有孔性のコーティング形態を変
化させなかった。
最初の実験では、３つのインプラントを部分的に精製
したウシOP（bOP）調製物で処理した。bOPは、骨皮質
（cortical bone）から抽出し、Sampathら,J.Biol.Che
m.,265:13198−13205（1990）に記載の精製プロトコル
のSephacryl−300 HRステップにより部分的に精製した
天然由来のOPであった。約80μｇのbOPを含む、4Mグア
ニジン−HCl、50mMトリス−HCl、pH7.0を200μｌずつ、
エッペンドルフチューブ中の各インプラントに加えた。
４℃で一晩インキュベートした後、タンパク質を沈殿さ
せ、そしてインプラントを80％エタノールで洗浄した。
インプラントを続いて凍結乾燥した。bOPを含まない２
つのインプラントをコントロールとして与えた。
上記インプラントを骨格が十分に発達した雑種の成犬
（３〜５歳、20〜25kg体重）で大腿骨皮質間モデルを用
いて評価した。動物が１つの大腿骨に５つのインプラン
トが与えられるように、標準的な手術法を用いて行っ
た。３週間で犬を屠殺し、大腿骨を取り出した。
各インプラントが単離されるように、採取した大腿骨
を長軸に対して垂直方向に切断した。各インプラントを
半分に切断し、１つのHAコーティングサンプルおよび１
つの非コーティング押し出し（push out）サンプルを得
た。接触面付着強度を特別に設計された試験固定装置を
用いて測定した。インプラントは、MTS試験機で1.27mm/
分の変位速度で破断した。試験後、標準的な非脱灰組織
学的分析およびマイクロラジオグラフィー分析のため
に、すべてのサンプルを調製した。切片（各インプラン
トに対し４切片）を、組織内方成長の型および質につい
て定性試験し、コンピューター画像分析システムで骨内
方成長の％を定量的に評価した。機械的データおよび定
量組織学的データを表IIに示す。
機械的データおよび組織学的データの両データは、bO
Pがインプラントの骨統合を増強したことを示唆した。H
Aコーティングおよび非コーティングの両インプラント
ともが、未処理コントロールに比較して剪断強度および
骨内方成長の増大を示した。さらに、HAコーティングイ
ンプラントは、非コーティングインプラントに比較して
有意な増強を示すと思われた。組織学的切片では、金属
孔の間に非常に多くの細胞が直接観察された。
最初のインプラント研究で肯定的な結果が得られたの
で、より詳細な研究が促された。27のインプラントを組
換えヒトOP1タンパク質で処理した。OP1タンパク質は、
形質転換CHO細胞により生産された。OP1の組換え生産の
詳細は米国特許出願第841,646号に開示されており、上
記に参考として援用されている。このタンパク質を精製
し、主要種としてOP1−18Ser（配列番号１の293−431残
基）と称されるタンパク質、および約30％はOP1の切断
型（例えば、OP1−16Ser、OP1−16Leu、OP1−16Met、OP
1−16Ala、およびOP1−16Val）を含んだ。このタンパク
質の純度は90％より高かった。インプラントを、５μｇ
の組換えタンパク質を含む200μｌの50％エタノール/0.
01％TFA中に30分間浸漬し、そして処方チューブがロー
ルする間、この溶液をエタノール／ドライアイス浴中で
凍らせた。チューブを続いて凍結乾燥した。また、19の
インプラントを、同一の手順により、OP1タンパク質を
含ませずにエタノール/TFAで処理することにより調製し
た。
試験インプラントでは、OP1は8M尿素、１％Tween 8
0、50mMトリス、pH8.0で処理したインプラントから抽出
され得、HPLCにより分析され得ることがわかった。この
方法により、処方チューブ中のすべてのOP1は、用いら
れた条件下でインプラントに結合したことが示された。
さらに、試験インプラントは、HAで半分がコーティング
されているので、これらの表面のそれぞれへのOP1の結
合を評価するために別のインプラントを得た。最初の結
合試験により、OP1は非コーティング金属よりもHAによ
り容易に結合することが示された。
第二の試験に関し、インプラントは、骨格が十分に発
達した雑種の成犬で上記大腿骨皮質間モデルを用いて評
価した。各動物に対し両側に５つのインプラントを入れ
るように、標準的な無菌手術法を用いた。移植期間は３
週間であった。機械的データおよび定量組織学的データ
を表IIIに示す。３つのHAコーティングおよび非コーテ
ィング形態を評価した：コントロール（未処理）、プレ
コーティングサンプル（OP1を含まない処方）、および
上記のOP1サンプル。
機械的試験の結果は、非コーティングサンプルに比較
してHAコーティングサンプルの付着強度が増強されてい
ることを示した。３週間で、タンパク質を伴うHAコーテ
ィングインプラントで最も強い固定が認められた。
組織学的分析では、非コーティングサンプルに対しす
べてのHAコーティングで、差は有意ではないがより大き
な骨内方成長が示された。骨内方成長％は、タンパク質
が存在するHAコーティングインプラントおよび非コーテ
ィングインプラントが最も大きかった。直線回帰分析に
より、付着強度は孔構造への骨成長量、HAコーティング
の存在、およびタンパク質の存在により推定されること
が示された。
実施例２ チタンは金属補綴物を製造するのにしばしば用いられ
る。これらの補綴物の表面は、酸化チタン層を含む。従
って、酸化チタン自身を、OP−１に対するキャリアとし
て扱われる可能性、および一般に骨形成プロセスとの生
体適合性に対して評価した。酸化チタンおよびOP−１
（配列番号１の293−431残基）の組み合わせを含むイン
プラントのインビボでの生物学的活性を、ラットの皮下
および筋肉アッセイで試験した。インプラントは、30mg
の酸化チタンに処方した０、6.25、12.5、25、または50
μｇのOP−１を含んだ。
インプラントをエタノール/TFA凍結乾燥法の変法によ
り処方した。酸化チタンペレットをすりつぶし、250〜4
20ミクロンの粒子サイズとなるように篩にかけた。これ
らの粒子30mgを、OP−１を全く含まないかまたはOP−１
を種々の濃度で含む、45％エタノール、0.09％トリフル
オロ酢酸50μｌづつと混合した。４℃で３時間後、サン
プルを凍らせ、凍結乾燥し、そしてラットに移植した。
インビボで12日後、インプラントを取り出し、アルカ
リホスファターゼ比活性、カルシウム含量、および組織
学的徴候により骨形成について評価した。この結果によ
り、OP−１は、皮下および筋肉の両インプラント部位で
OP−１の各濃度での骨の形成を誘導することが示され
た。酸化チタンにOP−１を加えなかった場合、骨は形成
されなかった。インプラントのカルシウム含量により定
量される骨の量は、骨のコラーゲンキャリアを用いて得
られる量と類似している。従って、チタンは骨形成タン
パク質に対して有用なキャリアであり、そして骨形成プ
ロセスと生体適合性である。
実施例３ 標準的な歯科用補綴物における本発明の方法の効力
は、以下のモデルおよびプロトコルを用いて評価され得
る。上顎および下顎の切歯および下顎犬歯を、数匹（例
えば３匹）の雄のカニクイザル（Macca fascularis）
（４〜6kg）から、ケタミン麻酔法およびリドケイン局
所浸潤麻酔下で抜歯した。止血を圧迫法で行った。
結果的に得られた歯のない歯槽に、（ａ）コラーゲン
マトリックス（CM）、（ｂ）骨形成タンパク質（例え
ば、上記の実施例１で用いた組換え生産OP1タンパク
質）を含むコラーゲンマトリックス（例えば骨形成デバ
イス）のいずれかを詰めるか、または（ｃ）未処理のま
まとする。チタン製のタッピンネジ式口腔内骨内インプ
ラント（Nobelpharma,Chicago,III）を、ネジの先端を
最小限でとりつけることにより、すべての歯槽中に挿入
した。粘膜性骨膜弁は、その下にある組織から切り離さ
れ、当該医療分野で既知である標準的な手術法を用いて
主な創傷閉鎖を得るのに用いられる。
３週間後、動物をペントバルビタールの致死注入およ
びパラホルムアミド−グルタールアルデヒドでの潅流に
より屠殺した。次いで、顎を解剖し、適当な歯槽を含む
ブロックを切除し、さらに天然の緩衝ホルマリン中に固
定し、ギ酸およびクエン酸ナトリウム中で脱灰し、プラ
スチック中に包埋し、そして塩基性フクシンおよびトル
イジンブルーで染色する。次いで、切片を光学顕微鏡に
より分析する。好ましくは、コンピューター補助組織形
態測定分析が、新たな組織の評価に用いられる（例え
ば、Image1.27およびQuick Capture （Data Translati
on,Inc.Marlboro,MA 07152））。
骨形成デバイスを含む歯槽は、３週間以内で、チタン
インプラントの貫通表面に密接した位置での新たな骨の
形成を誘導することが理解される。対して、コラーゲン
マトリックスのみで処理した歯槽、またはコラーゲンマ
トリックスおよび骨形成タンパク質の両方を含まない歯
槽は、インプラント表面に密接した位置で骨形成を示し
た徴候がみられなかった。
均等物 当業者は、通常的な実験のみを用いて、本明細書中に
記載のかかる事項に対し、多くの均等物があることを確
定することが可能である。このような均等物は、以下の
請求の範囲により包含されることが意図される。
フロントページの続き (72)発明者 オッパーマン，ハーマン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02053，メドウェイ，サマー ヒル ロ ード 25 (72)発明者 オズケイナク，エグニン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01757，ミルフォード，パデュー ドラ イブ 44 (56)参考文献 特開 昭63−125260（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−151461（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−500655（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−502579（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61L 27/00 A61K 37/00

Claims (54)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】実質的に純粋な骨形成タンパク質を含有す
    る、哺乳類の特定の部位での移植における補綴デバイス
    のインビボでの骨統合を促進するために該デバイスの表
    面をコーティングするための試薬であって、該部位で、
    骨組織と該表面とは、該組織と該デバイスとの間で骨組
    織の成長を増強させるのに充分な時間、少なくとも部分
    的に接触されて維持される、試薬： ここで、該骨形成タンパク質は、１対のポリペプチド鎖
    を含むタンパク質であり、該ポリペプチド鎖の一方が、
    配列番号１の335残基から431残基までにより規定される
    アミノ酸配列（OPS）と60％より大きい同一性を有する
    アミノ酸配列を含み、該ポリペプチド鎖対が、ダイマー
    種を生成するようにジスルフィド結合され、哺乳類に移
    植されるときに軟骨内骨形成を誘導し得るコンホメーシ
    ョンを有する。
  2. 【請求項２】実質的に純粋な骨形成タンパク質を含有す
    る、哺乳類の骨格系を修復するために移植前の補綴デバ
    イスの表面をコーティングするための試薬であって、そ
    れにより該デバイスへの骨組織の成長の増強を促進し、
    そして骨と該デバイスとの間の接合部の引っ張り強度を
    改良する、試薬： ここで、該骨形成タンパク質は、骨形成に活性なタンパ
    ク質であって、１対のポリペプチド鎖を含むタンパク質
    であり、該ポリペプチド鎖の一方が、配列番号１の335
    残基から431残基までにより規定されるアミノ酸配列（O
    PS）と60％より大きい同一性を有するアミノ酸配列を含
    み、該ポリペプチド鎖対が、ダイマー種を生成するよう
    にジスルフィド結合され、哺乳類に移植されるときに軟
    骨内骨形成を誘導し得るコンホメーションを有する。
  3. 【請求項３】前記補綴デバイス表面が、ヒドロキシアパ
    タイト、コラーゲン、グリコール酸、乳酸、または酪酸
    のホモポリマーまたはコポリマーおよびそれらの誘導
    体、リン酸三カルシウムまたは他のリン酸カルシウム、
    酸化金属またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求
    項１または２に記載の試薬。
  4. 【請求項４】前記補綴デバイスが、有孔性の金属材料を
    含む、請求項１または２に記載の試薬。
  5. 【請求項５】前記ダイマー種骨形成タンパク質が宿主細
    胞における組換えDNAにより生産され、そしてそこから
    単離される、請求項１または２に記載の試薬。
  6. 【請求項６】前記骨形成タンパク質が、宿主細胞におけ
    る組換えDNAの発現により生産される骨形成活性を有す
    るダイマー種タンパク質であり、以下でさらに特徴づけ
    られる、請求項１または２に記載の試薬： 該タンパク質が、ダイマー種を生成するようにジスルフ
    ィド結合された１対の酸化サブユニットを含み、該サブ
    ユニットの一方が、ストリンジェントなハイブリダイゼ
    ーション条件下で、配列番号１の335残基から431残基ま
    でにより規定されるOPSをコードする核酸にハイブリダ
    イズし得る核酸によりコードされたアミノ酸配列を有
    し、該サブユニットを含むジスルフィド結合ダイマー種
    が、前記デバイスの表面に配置されるとき哺乳類で軟骨
    内骨形成を誘導し得るコンホメーションを有する。
  7. 【請求項７】前記ダイマー種骨形成タンパク質がグリコ
    シル化されていない、請求項５に記載の試薬。
  8. 【請求項８】前記タンパク質の各ポリペプチド鎖が、OP
    Sを含むアミノ酸配列と65％より大きい同一性を有する
    アミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の試薬。
  9. 【請求項９】前記ポリペプチド鎖の一方のアミノ酸配列
    が、配列番号１の335残基から431残基により規定される
    アミノ酸配列（OPS）を含む、請求項８に記載の試薬。
  10. 【請求項１０】前記ポリペプチド鎖のいずれもが、配列
    番号１のの335残基から431残基により規定されるアミノ
    酸配列（OPS）を含む、請求項８に記載の試薬。
  11. 【請求項１１】前記ポリペプチド鎖のいずれもが、配列
    番号１の318残基から431残基のアミノ酸配列（OP1−16V
    al）を含む、請求項10に記載の試薬。
  12. 【請求項１２】骨組織に近接した移植のための有孔また
    は無孔の表面領域を有する堅い補綴デバイスを含む、哺
    乳類の骨の欠損、損傷、または異常を修復するための改
    良補綴デバイスであって、以下を含むデバイス： 該表面への骨組織の成長の増強を促進するのに充分な量
    で、該表面領域に配置された実質的に純粋な骨形成に活
    性な骨形成タンパク質； ここで、該骨形成タンパク質は、骨形成に活性なタンパ
    ク質であって、１対のポリペプチド鎖を含むタンパク質
    であり、該ポリペプチド鎖の一方が、配列番号１の335
    残基から431残基までにより規定されるアミノ酸配列（O
    PS）と60％より大きい同一性を有するアミノ酸配列を含
    み、該ポリペプチド鎖対が、ダイマー種を生成するよう
    にジスルフィド結合され、哺乳類に移植されるときに軟
    骨内骨形成を誘導し得るコンホメーションを有する。
  13. 【請求項１３】前記補綴デバイス表面が、さらにヒドロ
    キシアパタイトを含む、請求項12に記載のデバイス。
  14. 【請求項１４】前記ダイマー種骨形成タンパク質が、宿
    主細胞において組換えDNAにより生産され、そしてそこ
    から単離される、請求項12に記載のデバイス。
  15. 【請求項１５】前記ダイマー種骨形成タンパク質がグリ
    コシル化されていない、請求項14に記載のデバイス。
  16. 【請求項１６】前記ポリペプチド鎖の一方が、配列番号
    １の335残基から431残基までにより規定されるOPSをコ
    ードする核酸にハイブリダイズし得る核酸によりコード
    されたアミノ酸配列を含み、該ポリペプチド鎖を含むジ
    スルフィド結合ダイマー種が、前記デバイスの表面に配
    置されるとき哺乳類において軟骨内骨形成を誘導し得る
    コンホメーションを有する、請求項12に記載のデバイ
    ス。
  17. 【請求項１７】前記タンパク質の各ポリペプチド鎖が、
    配列番号１の335残基から431残基により規定されるアミ
    ノ酸配列（OPS）と65％より大きい同一性を有するアミ
    ノ酸配列を含む、請求項12に記載のデバイス。
  18. 【請求項１８】前記タンパク質のポリペプチド鎖の一方
    が、配列番号１の335残基から431残基により規定される
    アミノ酸配列（OPS）を含む、請求項17に記載のデバイ
    ス。
  19. 【請求項１９】前記ポリペプチド鎖のいずれもが、配列
    番号１の335残基から431残基により規定されるアミノ酸
    配列（OPS）を含む、請求項17に記載のデバイス。
  20. 【請求項２０】前記ポリペプチド鎖のいずれもが、配列
    番号１のの318残基から431残基により規定されるアミノ
    酸配列（OP1−16Val）を含む、請求項19に記載のデバイ
    ス。
  21. 【請求項２１】前記補綴物が、有孔性の金属材料を含
    む、請求項12に記載のデバイス。
  22. 【請求項２２】前記補綴物が、その縦軸に垂直方向で複
    数のくぼみを有する、開口部への挿入のための移植可能
    な不規則輪郭部分を有する、請求項12に記載のデバイ
    ス。
  23. 【請求項２３】歯科用インプラントを含む、請求項22に
    記載のデバイス。
  24. 【請求項２４】骨の開口部中での補綴デバイスのインビ
    ボでの骨統合を促進するための移植可能な不規則輪郭部
    分を有する補綴デバイスを調製する方法であって、以下
    の工程を包含する、方法： ａ）その縦軸に垂直方向で複数のくぼみを有する不規則
    輪郭部分を有する堅い補綴デバイスを提供する工程；お
    よび ｂ）実質的に純粋な骨形成タンパク質を含む骨成長組成
    物で該部分をコーティングする工程であって、該組成物
    は、該くぼみにおける骨成長、該骨と該補綴デバイスと
    の間の骨統合、および該組成物および該骨により誘導さ
    れる新規な骨の骨統合を誘導する、工程； ここで、該骨形成タンパク質は、骨形成に活性なタンパ
    ク質であって、１対のポリペプチド鎖を含むタンパク質
    であり、該ポリペプチド鎖の一方が、配列番号１の335
    残基から431残基までにより規定されるアミノ酸配列（O
    PS）と60％より大きい同一性を有するアミノ酸配列を含
    み、該ポリペプチド鎖対が、ダイマー種を生成するよう
    にジスルフィド結合され、哺乳類に移植されるときに軟
    骨内骨形成を誘導し得るコンホメーションを有する。
  25. 【請求項２５】前記不規則輪郭部分が、有孔性の金属材
    料を含む、請求項24に記載の方法。
  26. 【請求項２６】前記骨形成タンパク質が、前記孔への骨
    の内方成長を増強するために、前記孔内に配置される、
    請求項25に記載の方法。
  27. 【請求項２７】骨の開口部中での補綴物のインビボでの
    骨統合を促進するためのデバイスであって、以下を含む
    デバイス： 該開口部への挿入のための不規則輪郭部分を有する堅い
    補綴デバイスであって、該不規則輪郭部分は、その縦軸
    に垂直方向に複数のくぼみを有する、デバイス；および 実質的に純粋な骨形成タンパク質を含む骨成長組成物で
    あって、該組成物は、該くぼみでの骨の成長、該骨と該
    補綴デバイスとの間の骨統合、および該組成物および該
    骨により誘導される新規な骨の骨統合を誘導する、組成
    物； ここで、該骨形成タンパク質は、骨形成に活性なタンパ
    ク質であって、ダイマー種タンパク質であり、そして１
    対のポリペプチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖の一方
    が、配列番号１の335残基から431残基までにより規定さ
    れるアミノ酸配列（OPS）と60％より大きい同一性を有
    するアミノ酸配列を含み、該ポリペプチド鎖対が、ダイ
    マー種を生成するようにジスルフィド結合され、哺乳類
    に移植されるときに該補綴物の該不規則輪郭部分に関連
    して軟骨内骨形成を誘導し得るコンホメーションを有す
    る。
  28. 【請求項２８】前記不規則輪郭部分が、有孔性の金属材
    料を含む、請求項27に記載のデバイス。
  29. 【請求項２９】前記骨形成タンパク質が、前記孔への骨
    の内方成長を増強する、請求項28に記載のデバイス。
  30. 【請求項３０】前記くぼみが、ヒドロキシアパタイト、
    コラーゲン、グリコール酸、乳酸、または酪酸のホモポ
    リマーまたはコポリマー、リン酸三カルシウムまたは他
    のリン酸カルシウム、酸化金属、脱塩されグアニジン抽
    出された骨、およびそれらの組み合わせからなる群から
    選択される材料を含む、請求項27に記載のデバイス。
  31. 【請求項３１】歯科用インプラントを含む、請求項27に
    記載のデバイス。
  32. 【請求項３２】前記タンパク質が、宿主細胞において組
    換えDNAにより生産され、そしてそこから単離される、
    請求項27に記載のデバイス。
  33. 【請求項３３】前記タンパク質がグリコシル化されてい
    ない、請求項32に記載のデバイス。
  34. 【請求項３４】前記補綴デバイスが、ステンレス鋼、チ
    タン、モリブデン、コバルト、クロム、あるいはこれら
    の金属の合金または酸化物を含む、請求項１または２に
    記載の試薬。
  35. 【請求項３５】前記骨形成タンパク質が、マトリックス
    材と組み合わされる、請求項１または２に記載の試薬。
  36. 【請求項３６】前記マトリックス材が、コラーゲン、ヒ
    ドロキシアパタイト、グリコール酸、乳酸、または酪酸
    のホモポリマーまたはコポリマーおよびその誘導体、リ
    ン酸三カルシウムまたは他のリン酸カルシウム、酸化金
    属、脱塩されグアニジン抽出された骨、およびそれらの
    組み合わせからなる群から選択される、請求項35に記載
    の試薬。
  37. 【請求項３７】前記補綴デバイス表面が、コラーゲン、
    グリコール酸、乳酸、または酪酸のホモポリマーまたは
    コポリマーおよびその誘導体、リン酸三カルシウムまた
    は他のリン酸カルシウム、酸化金属、脱塩されグアニジ
    ン抽出された骨、およびそれらの組み合わせを含む材料
    でコーティングされる、請求項12に記載のデバイス。
  38. 【請求項３８】前記補綴デバイスが、ステンレス鋼、チ
    タン、モリブデン、コバルト、クロム、あるいはこれら
    の金属の合金または酸化物を含む、請求項12に記載のデ
    バイス。
  39. 【請求項３９】前記骨形成タンパク質が、マトリックス
    材と組み合わされる、請求項12に記載のデバイス。
  40. 【請求項４０】前記マトリックス材が、コラーゲン、ヒ
    ドロキシアパタイト、グリコール酸、乳酸、または酪酸
    のホモポリマーまたはコポリマーおよびその誘導体、リ
    ン酸三カルシウムまたは他のリン酸カルシウム、酸化金
    属、脱塩されグアニジン抽出された骨、およびそれらの
    組み合わせからなる群から選択される、請求項39に記載
    のデバイス。
  41. 【請求項４１】前記デバイスが、ステンレス鋼、チタ
    ン、モリブデン、コバルト、クロム、あるいはこれらの
    金属の合金または酸化物を含む、請求項24に記載の方
    法。
  42. 【請求項４２】前記デバイスが、ステンレス鋼、チタ
    ン、モリブデン、コバルト、クロム、あるいはこれらの
    金属の合金または酸化物を含む、請求項27に記載のデバ
    イス。
  43. 【請求項４３】前記ポリペプチド鎖の少なくとも一方
    が、OP2、Vgr−１、CBMP2A、CBMP2B、BMP3、BMP5、BMP
    6、COP5、COP7、DPP、Vgl、およびその変異種を含む、
    請求項１または２に記載の試薬。
  44. 【請求項４４】前記ポリペプチド鎖の一方またはその両
    方が、OP1、OP2、Vgr−１、BMP5、BMP6およびそれらの
    変異種である、請求項１または２に記載の試薬。
  45. 【請求項４５】前記ダイマー種がヘテロダイマーであ
    る、請求項44に記載の試薬。
  46. 【請求項４６】前記骨形成タンパク質が、１つまたはそ
    れ以上のダイマー種のOP2、Vgr−１、CBMP2A、CBMP2B、
    BMP3、BMP5、BMP6、COP5、COP7、DPP、Vgl、およびそれ
    らの変異種との組み合わせで提供される、請求項１また
    は２に記載の試薬。
  47. 【請求項４７】前記ポリペプチド鎖の少なくとも一方
    が、OP2、Vgr−１、CBMP2A、CBMP2B、BMP3、BMP5、BMP
    6、COP5、COP7、DPP、Vgl、およびそれらの変異種を含
    む、請求項12または27に記載のデバイス。
  48. 【請求項４８】前記ポリペプチド鎖の一方またはその両
    方が、OP1、OP2、Vgr−１、BMP5、BMP6およびそれらの
    変異種である、請求項12または27に記載のデバイス。
  49. 【請求項４９】前記ダイマー種がヘテロダイマーであ
    る、請求項48に記載のデバイス。
  50. 【請求項５０】前記骨形成タンパク質が、１つまたはそ
    れ以上のダイマー種のOP2、Vgr−１、CBMP2A、CBMP2B、
    BMP3、BMP5、BMP6、COP5、COP7、DPP、Vgl、およびそれ
    らの変異種との組み合わせで提供される、請求項12また
    は27に記載のデバイス。
  51. 【請求項５１】前記ポリペプチド鎖の少なくとも一方
    が、OP2、Vgr−１、CBMP2A、CBMP2B、BMP3、BMP5、BMP
    6、COP5、COP7、DPP、Vgl、およびそれらの変異種を含
    む、請求項24に記載の方法。
  52. 【請求項５２】前記ポリペプチド鎖の一方またはその両
    方が、OP1、OP2、Vgr−１、BMP5、BMP6およびそれらの
    変異種である、請求項24に記載の方法。
  53. 【請求項５３】前記ダイマー種がヘテロダイマーであ
    る、請求項52に記載の方法。
  54. 【請求項５４】前記骨形成タンパク質が、１つまたはそ
    れ以上のダイマー種のOP2、Vgr−１、CBMP2A、CBMP2B、
    BMP3、BMP5、BMP6、COP5、COP7、DPP、Vgl、およびそれ
    らの変異種との組み合わせで提供される、請求項24に記
    載の方法。
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