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JP3080402B2 - ヒト網膜芽細胞腫遺伝子生成物燐酸化の細胞サイクルに依存した制御 - Google Patents

ヒト網膜芽細胞腫遺伝子生成物燐酸化の細胞サイクルに依存した制御

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JP3080402B2
JP3080402B2 JP03501784A JP50178491A JP3080402B2 JP 3080402 B2 JP3080402 B2 JP 3080402B2 JP 03501784 A JP03501784 A JP 03501784A JP 50178491 A JP50178491 A JP 50178491A JP 3080402 B2 JP3080402 B2 JP 3080402B2
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カイ フン，ユエン
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は細胞増殖の分野に関するものである。さら
に、本発明は癌および増殖細胞性疾患の防止と治療に関
するものである。
発明の背景 成長因子を奪われると、活発に増殖している細胞が細
胞サイクルのG0段階で拘束されてしまう。逆に、適切な
成長因子を与えられると、休止細胞の増殖が誘発され
る。休止細胞を成長刺激因子に接触させると、多くの特
殊な遺伝子およびその生成物の表現の量的および質的変
化がもたらされる。例えば、休止している細胞を、血小
板を取り去った成長因子（PDGF）（ワール等、分子細胞
生物学9:2934（1989）；マイセンヘルダー等、細胞、5
7:1109（1989））に、あるいは表皮成長因子（ワール
等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1568（1989）；マルゴ
リス等、細胞57:1101（1989））に接触させると、その
レセプターのチロシン・キナーゼが活性化され、それが
直接、フォスフォリパーゼＣを燐酸化する場合がある。
このことが、次に、細胞内カルシウム・イオンの増大、
フォスフォイノシチーゼの加水分解、蛋白質燐酸化の変
調、および新しいmRNA合成の誘発（デューエル、細胞生
化学年報3:443（1987）参照）などのその他の生化学反
応をもたらす場合がある。こうした転写的に活性化され
た遺伝子の一部は原腫瘍遺伝子であるので、細胞増殖の
コントロールに関する研究は増殖反応の最初の数時間に
表現が活性化される類似の遺伝子の分離と特徴付けに重
点が置かれてきている（コクラン等、サイエンス226:10
80（1984）、トンプソン等、ネイチャー319:374（198
6）、サウおよびナタンズ、Proc.Natl.Acd.（米国）84:
1182（1987）；ライター、Proc.Natl.Acod.Sci.（米
国）85:1487（1988）参照）。特に休止状態で表現され
た多数の遺伝子も分離されている（シュナイダー等、細
胞14,787（1988）；シモンズおよびエリクソン、分子細
胞生物学9,1372（1989））。細胞が成長刺激に接触させ
られると、これらの遺伝子の表現は抑制される。したが
って、特定の遺伝子のダウン（活性低下）制御も、細胞
増殖への障害の除去による分裂誘発性反応には重要な意
味を持つ場合もある。
ヒト網膜芽細胞腫遺伝子Rb1は両方の対立遺伝子の不
活性化が腫瘍形成にとって基本的な条件であると考えら
れるタイプの遺伝子の原形である。Rb1の分離によっ
て、網膜芽細胞腫おけるその遺伝子のロスおよび骨肉腫
など臨床的に関連性のある腫瘍の分子レベルでの確認が
可能になっている（フレンド等、ネイチャー323,643（1
986）；フアング等、サイエンス、236:1657（1987）；
リー等、サイエンス235:1394（1987））。さらに、Rb1
cDNAプローブおよびその遺伝子生成物に対する抗体
（Rb）を使用しての分析は小細胞肺悪性腫瘍（ハーバー
等、サイエンス241,353（1988）；横田等、腫瘍遺伝子
3,471（1988））および乳房腫瘍（タン等、サイエンス2
42,263（1988））など、成人における多数の腫瘍におけ
るRb1の喪失を明らかにしている、Rb1の腫瘍成長におけ
るRb1の重要な機能は、RbがアデノウイルスE1A（ホワイ
ト等、ネイチャー334,124（1988））、シミアン・ウイ
ルス（SV40）大Ｔ抗原（デカプリオ等、細胞54,275（19
88））およびヒト乳頭腫ウイルス・タイプ16（ダイソン
等サイエンス234,934（1989））の形質転換蛋白質と物
理的な関係を形成するという事実によっても裏づけられ
ている。
図面の簡単な説明 図1AはSDS−PAGEによるRbのRb1−ABとの免疫沈降反応
を示している。
図1BはフローサイトメリーによるRbの定常状態の分析
を説明している。
図1Cはパルス・チェイス実験におけるRb劣化のSDS−P
AGE分析を示している。
図２は種々の成長条件下での細胞内のRbの燐酸化を説
明している。
図３は種々の薬品による反応の違いを見るために処理
されたHL−60A細胞におけるRb燐酸化を説明している。
図４はRb蛋白質における11の潜在的燐酸化箇所（下線
の箇所）を示している。
図５は燐酸化されたRb蛋白と燐酸化形態下にあるRb蛋
白を区別する抗体の能力を説明している。レーン１で、
Rb蛋白は抗体OS3と免疫沈降反応を行っている。レーン
２では、Rb蛋白は抗体OS1と免疫沈降反応を行ってい
る。
発明の要約 RB1の不活性化は腫瘍形成と関係している。本発明の
目的は、細胞増殖を制限するRbの機能を利用することで
ある。
本発明のもうひとつの目的は増殖中の細胞へのRbの燐
酸化を抑制できる化合物の投与を内容とする、Rb蛋白を
含んでいる細胞中の細胞増殖を抑制する方法を提供する
ことである。
本発明のさらにもうひとつの目的は、該化合物がレチ
ノン酸、ジメチル・スルホキサイド、酪酸、およびTGF
−Ｂで構成されるグループから選ばれるところの、Rb蛋
白を含む細胞の細胞増殖を抑制する方法を提供すること
である。
本発明の別の目的は、Rbの燐酸化を抑制できる化合物
の増殖中の細胞への投与を内容とする、Rb蛋白を含む細
胞における細胞増殖を防ぐための方法を提供することで
ある。
本発明のさらに別の目的は、レチノン酸、ジメチル・
スルホキサイド、酪酸およびTGF−Ｂで構成されるグル
ープから選択される化合物をRb蛋白を含んでいる細胞へ
の投与を内容とする細胞増殖を防ぐ方法を提供すること
にある。
細胞成長に積極的な作用を及ぼす遺伝子の表現の成長
因子に誘発された活性化は細胞増殖のコントロールにお
いて重要であるように思われる。しかしながら、細胞成
長に抑制的に働く遺伝子の表現のダウン調節も成長制御
において重要な役割を果しているようである。Rb1の不
活性化が腫瘍発展と相関関係を持っているという事実
は、この遺伝子が細胞増殖のコントロールに関与するこ
とを示唆している。我々はG0およびG1段階で細胞内に新
たに合成されるRbはそれ程燐酸化されておらず、新たに
合成されたRbはG1/S境界にある、およびＳ段階における
細胞内でのみ、複数の箇所で燐酸化されることを実証し
た。我々の観察は、Rbの燐酸化過程形態がその活性形態
であり、この形態のRbがDNA合成の開始前にひとつ、あ
るいは複数の重要な箇所での燐酸化により不活性化され
るという解釈と一致している。SV40大Ｔ抗原はRbの燐酸
化過程形態にだけ結合することができ、そして、おそら
くはそれを不活性化することができる（ラドロウ等、細
胞56,57（1989））。このように、燐酸化によるRbの不
活性化は細胞がG1/S境界を通過するためにどうしても必
要な事象である可能性がある。細胞増殖のコントロール
は、したがって、Rb不活性化のレベルでだけおこなわれ
るのかもしれない。燐酸化Rb種の豊富さにおける観察さ
れた差がキナーゼ活性によるものか、ホスホターゼ活性
によるものか、あるいは両方によるものなのかは、今の
ところ不明である。
発明の詳細な説明 例 １ 種々の成長条件下にある細胞内のRbの表現の制御につ
いて調べられた。
Rbの最も親水的な領域を示すペプチドが合成され、ポ
リクローナルおよびモノクローナル抗体を作成するため
にうさぎおよびBalc/cねずみを免疫化するために使用さ
れた。Rbに対する抗体を作成するために、Rb1c DNAシ
ーケンスから得られた蛋白シーケンスに従って合成され
たペプチドが、若いニュージーランド・ウサギを免疫す
るために用いられた。Rb−１−AB16の場合、使用された
ペプチド（P4）はCEEIYLKNKDLDARLFLDHDK（アミノ酸322
〜341）であった。Rb−１−AB20の場合、使用されたペ
プチド（P5）はCEGSNPPKPLKKLRFDIEGSDEAD（アミノ酸86
4〜886）であった。Rb−１−AB Alの場合、使用された
ペプチドは（P2）CRMQKQKMNDSMDTSNKEEK（アミノ酸910
〜928）であった。図1AはRbのRb−１−AB20との免疫沈
降反応を説明している。VM−CUB−３（4x106細胞）の活
発に増殖中の無作為集団を、５％透析ウシ胎仔血清（FC
S）を含んだダルベッコの修正イーグルス培地（DMEM）
に、メチオニンなし（レーン１および２）、または燐酸
なし（レーン３）で、１時間培養し、次に、1mlのDMEM
＋［35S］−メチオニン（1000Ci/mmol）を300uCi含んだ
（レーン１および２）、または、［32P］正燐酸塩（285
Ci/mg）を300uCi含んだ（レーン３）５％透析ウシ胎仔
血清（FCS）に37℃の温度で２時間ラベルした。次に細
胞を燐酸塩緩衝食塩水（PBS）で２度洗い、そして、0.5
mlのEBC（40mMトリスHcl［pH1 8.0］）、120mM NaCl、
0.5％NP−40、アプロチニン、ペスタチンおよびリュー
ペプチンがそれぞれ2ug/ml、および弗化フェニルメチル
スルフォニル100ug/mlを使って、０℃の温度下で１時
間、蛋白質を抽出した。細胞溶解物は、４℃の温度下
で、15,000rpmの回転速度で、10分間遠心分離を行っ
た。その上澄液をRb1−AB20抗血清５−10ul（レーン１
およびレーン３）、または、４℃の温度下で100ugのペ
プチドP5を使って２時間予備培養したRb1−AB20（レー
ン２）を使って培養した。免疫複合体を蛋白Ａ−アガロ
ーゼ（カルバイオケム社製）で集めて、EBCで５回洗浄
した。サンプル・バッファー（62.5mMトリス塩酸（pH6.
8）、５％Ｂ−メルカプトエタノール、2.3％SDS、10％
グリセロール、および0.001％ブロモフェノール・ブル
ー）内で90℃の温度下、１分間加熱することによって、
免疫沈降蛋白を溶出し、SDS−PAGEで分離した。このゲ
ルを固定し、Ｘ線フィルムに露出した。
図1Bはフロー・サイトメトリーによる定常状態レベル
のRbの分析を示している。指数関数的に増殖しているHL
−60細胞（2x106）を４℃の温度で0.1mlのPBS中に浮遊
させ、−80℃まで冷却されたメタノール0.9mlを加え
て、固定した。固定した細胞を４℃の温度下で、120ul
のPBS−NGS（50％PBS、50％正常ヤギ血清、0.002％トリ
トンＸ−100および10ulのRb1−AB20）内で再び浮遊させ
た。この懸濁液を37℃の温度下で1.5時間定期的に撹拌
しながら培養し、この懸濁液を氷上で２分間冷やし、次
に、150ulのPBSを加えた。この細胞を４℃の温度下で、
30分間、定期的に撹拌しながら培養した。二次染色のた
めに、これらの細胞を195ulのPBS−NGSと5ulのFITC−GA
R（ウサギIgGに対するフルオレセイン・イソチアネート
接合ヤギ抗体）内で再び浮遊させた。この懸濁液を37℃
の温度下で１時間培養し、次に、氷上で２分間冷やし、
そして、150ulのPBS−NGSを加えた。この洗浄ステップ
を１度繰り返し、次に、これらの細胞を37℃の温度下
で、30分間、ＲナーゼＡ（5ug/ml）で処理した。そし
て、最後にヨウ化プロピジウム（5ug/ul）で染色し、フ
ロー・サイトメトリーによって分析した。フロー・サイ
トメトリーはアルゴン・イオン・レーザー・フロー・サ
イトメトリー（プロフィール・モデル、クールター・エ
レクトロニクス社）を使って行われた。励起は488umで
あった。Rb濃度を測定するために、525nm帯域パス・フ
ィルターでマスクした光電子倍増管で緑色発光を集め、
赤色蛍光は610nm長パス・フィルターでマスクした光電
子倍増管で集めた。サンプル流速が10ul/分の条件下
で、イベント（2x104）が集められた。ユニバリエート
・ヒストグラムは細胞状RbあるいはDNA含有量（水平
軸）の関数としての細胞の相対数の分布（垂直軸）を示
している。Rb含有量対DNA含有量の比は点密度プロット
として示してある。このプロットに細胞サイクル段階が
示されている。図1Cはパルス・チェイス実験によるRb劣
化の測定を説明している。SW613細胞は、上に述べたよ
うに、300uCiの［35S］−メチオニン（1000ci/mmol）で
90分間パルス・ラベルし、RPMI1640＋10％FCS内で22時
間チェイスした。このチェイス期間中、２時間間隔で上
に述べたようなSDS−PAGEにより、Rb蛋白の複製サンプ
ルが抽出、免疫沈降、分離された。
例 ２ 種々の成長条件の下での細胞内のRbの燐酸化抑制が図
２に説明されている。活発に増殖しているVM−CUB−３
の無作為の群を、RPMI1640培地内で、血清不在の条件下
で４日間成長させた。この４日間の間に、細胞は300uCi
の［35S］−メチオニン（1000Ci/mmol）でラベルされ
た。０（図2A、レーン１）、24（図2A、レーン２）、48
（図2A、レーン３）、72（図2A、レーン４）、および96
（図2A、レーン７）時間後にRb蛋白が抽出、免疫沈降さ
れ、サンプルは上記のように分析された。
例 ３ 血清枯渇状態下で２日間休止状態にされた613細胞
を、培地を10％ウシ胎仔血清を補給することによって、
成長するように刺激を与えた。その細胞に血清を与えた
後、（マッチャー等が、Exp.Cell Res.117:95（197
8））で述べているような3Hl−チミジン摂取で）測定し
た。各時点で、細胞の複製培養株を例1Aで述べたように
［35S］−メチオニンでラベルした。多重燐酸化開始の
タイミングをより正確に分析するために、血清枯渇で同
調された細胞を、アヒジコリン（5ng/ml）で24時間処理
して、G1/S境界で拘束した（図2C、レーン13）。24時間
の処理後、これらの細胞を、アヒジコリンの存在下で、
300uCiの［35S］−メチオニン（1000Ci/mmol）で２時間
ラベルし、例1Aで述べたように分析した。結果を図2Cに
示す（レーン１、G0段階；レーン２、抗血Rb1−AB20が
４℃の温度下で２時間、100ugのペプチドP5で予備培養
されていることを除けば、レーン１と同じ；レーン３お
よび４、初期G1段階；レーン５、末期Ｇ、初期Ｓ段階；
レーン６−10、Ｓ段階；レーン11および12、G2＋Ｍ段
階、レーン13、G1/S境界；レーン14、Rb1−AB−20は100
ugのペプチドP5で２時間、４℃の温度下で予備培養され
たことを除いてレーン13と同じ）。
例 ４ 図３は種々の薬品で末端が分化するように処理された
HL−60AのRb燐酸化を説明している。（Ａ）RPMI1640、1
0％FCS内で指数関数的に増殖しているHL−60Aの無作為
群を5x10-6RA（０）、あるいは1.25％DMSOを使って（イ
ェン等、Exp.Cell Res.168,247（1987））、それぞれ異
なった時間処理した。細胞数はゼロ時間および24時間間
隔でカウントされた。その結果を図3Aに示す。未処理の
コントロール・サンプルをＸで、RAで処理したサンプル
はｏで、そしてDSMOサンプルを＋で示す。
例 ５ 例３からのHL−60A細胞の複製培養株を300Uciの
［35S］−メチオニン（1000Ci/mmol）でラベルし、例1A
で述べたのと同じ方法で分析した。これらの細胞を5x10
-6M RA（レーン１〜６）、1.25％DMSO（レーン７〜
９）、あるいは4x10-3M RA（レーン10）で処理した。細
胞の代謝ラベリングは時間０（レーン１）、12時間（レ
ーン２）、24時間（レーン３）、48時間（レーン４）、
72時間（レーン５）、96時間（レーン６）、12時間（レ
ーン７）、24時間（レーン８）、96時間（レーン９）、
および96時間（レーン10）である。矢印は上の薬品で96
時間処理した細胞で再現可能に出現した約98KDのRbの種
を示している。
（ｃ）G0およびG1段階でのHL−60を活発に増殖細胞群
から遠心溶出の方法を使って分離した。遠心溶出は40ml
チェンバーを含んでいるJE−６ローターを備えたベック
マンJ21−Ｃ遠心溶出で行われた。チェンバーには109個
の細胞が入れられた。ローター速度は2000rpmに維持さ
れ、流速は最初の11.5ml/分から、最後の29ml/分に12段
階刻みに増大された。G0およびG1細胞は14.3ml/分で収
集され、その大きさを顕微鏡で観察した。集められたサ
ンプルの複製培養株を5x10-6M RAの存在（Ｘ）および不
在（０）の条件下で、RPMI1640＋10％FCS内で成長させ
た。ラドロウ等が細胞56:57（1989）で描いているよう
に［3H］−チミジン摂取量で測定した。
例 ６ コリンズ等がInt.J.Cancer25:213（1980）で述べてい
るようにNBTの摂取量で細胞を差別化するために、例５
で各時点で少量のサンプルを採取した。その結果を図3D
に示す。NBT陽性細胞はカウントされた細胞の総数のパ
ーセント（Ｘ）、RA処理細胞（Ｏ）、そしてコントロー
ルで表現された。Rb表現を分析するために、上に述べた
実験で得たG0およびG1HL−60A細胞の複製細胞を用い
た。回収された細胞を時間０の時点でRAで処理し、ほぼ
0,4,8および18時間目にRb分析を行った。その結果を図3
Eに示す。細胞は収集後、2 1/2時間目（レーン１）、6
1/2時間目（レーン２）、10 1/2時間目（レーン３）、
そして20 1/2時間目（レーン４）に回収された。初期お
よび後期G1細胞の分離は不可能であるから、一部の細胞
はラベリングの期間中にG1/S境界を越えてしまった。
見かけの分子量が105から115Kdである複数の形態のRb
が、［35S］−メチオニンでラベルしたヒト水痘腫瘍細
胞系統からの免疫沈降反応で検出され、次いで、SDS−
ポリアクリルアミド・ゲル・電気泳動（SDS PAGE）が行
われた（図1A、レーン１）。対応するRbペプチドを使っ
て、抗体を予め吸収させてある場合、そうした蛋白質は
沈降されなかった（図1A、レーン２）。［32P］正燐酸
塩を使っての代謝ラベリングは、見かけ分子量が高いRb
ポリペプチドがより重度に燐酸化されることを示した
（図1A、レーン３）。免疫沈降を行う前にポテト酸ホス
ファターゼで燐酸蛋白を処理すると、これらのRb種が消
失した。これらの抗体を使って細胞の免疫組織化学的染
色を行った結果、すでに述べられており（リー等、ネイ
チャー329,642（1987）；バーリー等、腫瘍形成遺伝子
4,721（1989））、また、SV大Ｔ抗原に見出される核変
位信号を思わせるアミノ酸VRSPKKK（アミノ・ボイド残
余609〜615）の連鎖の存在からも予測されるように、Rb
の核局在化を明らかにした。（アミノ酸残余の略号は以
下の通りである。A,Ala;C,Cys;D,Asp;E,Glu;F,Phe;G,Gl
y;H,His;I,Ile;K,Lys;L,Leu;M,Met;N,Asn;P,Pro;Q,Gli
n,R,Arg;S,Ser;T,Thr;V,Val;W,Trp;そしてY,Tyr） 例 ７ Rbの合成と分解は細胞サイクルに依存した方法で調節
することができる。細胞サイクルの関数としてのRbの定
常状態の量を測定した。ウサギ・ポリクローナル抗体Rb
1−AB20,Rb1 AB16、およびRb1−AB−AlはRbの種々の燐
酸化形態を検出するので、細胞内のRbの総量が測定され
た。指数関数的に増殖している野生タイプのHL−60細胞
を固定し、Rb1−AB20と免疫グロブリンＧ（IgG）に対す
る二次フルオレセイン接合ウサギ抗体で染色した。次
に、これらの細胞をリボニュクリアーゼＡ（Ｒナーゼ
Ａ）で処理し、DNAの定量のためにヨウ化プロピジウム
で染色した。これらの細胞を488nmで照射すると、フル
オレセインの発光は緑色であり、ヨウ化プロピジウムは
赤色であるので、発光強度を同時に測定し、そしてこれ
を手掛かりに、RbおよびDNAの含有量をフロー・サイト
メトリーにより判定した（図1B）。細胞１つあたりのRb
の含有量は、それらの細胞が細胞サイクルのG1,Sおよび
G2＋Ｍ段階を通じて成長するにつれて増大した。G2＋Ｍ
段階の細胞はG1段階に入った細胞と比較して約二倍の量
のRbを含んでいる。したがって、増殖中の細胞のRb含有
量は常にG0およびG1の閾値あるいはそれ以上のレベルに
保たれる。Rb合成の速度がその分解の速度を上回れば、
こうしたことが予想されるであろう。Rb1−AB Alを使っ
て実験を行っても、これらの結果が再現された。
Rb代謝回転のダイナミックスを確認するために、Rbの
合成および分解が免疫沈降によって調べられた。ヒト乳
房腫瘍細胞SW613を、［35S］−メチオニンで90分間パル
ス・ラベルされ、ラベルされたRbの分解速度を観察した
（図1C）。種々の形態のRbの強度の密度計測走査の結
果、Rbの半減期が最低10時間であることがわかった。Rb
の半減期特性についての同様の観察が他の人々によって
も行われている（ホワイト等、ネイチャー334,124（198
8）;Xu等、腫瘍形成遺伝子4,807（1989））。SW613およ
びVM−CUB−３における細胞サイクルの関数としてのRb
の合成を図２に示す。血清を引き上げてから2,3日後、
指数関数的に成長していた細胞が増殖をやめた。次の５
日間に細胞数は一定であり、DNA合成は起こらなかっ
た。血清あるいは血清とEGF＋インシュリン、およびト
ランスファリンだけを加えてこれらの細胞を増殖段階に
入れると、それらの細胞は同調的に細胞サイクルを通過
した。一定の間隔で［35S］−メチオニンでパルス・ラ
ベルし、Rbを分析のために免疫沈降した。こうした条件
下で、休止状態（図2A、レーン１〜５、図2B、レーン
１）と、増殖段階（図2B、レーン３〜13）の両方で、Rb
が合成されることが確認された。Rbが安定しており、絶
えず合成されているという事実は細胞の量が増大するに
つれて蛋白質が定常的に蓄積されていくことが観察され
たこととも一致している。
Rb含有量を下方調製する能力が細胞にないことは、そ
れがこの蛋白質の作用を調製する他の手段を有している
のに違いないことを示した。休止状態では、これらの細
胞は唯一の種；燐酸化の程度が低いRbを有しており、見
かけの分子量は105KD（図2A、レーン３〜５、図2B、レ
ーン１）であった。血清を再導入すると、細胞サイクル
を通過中の同調化された細胞は、依然として、初期G1段
階の燐酸化の程度が低い形態のRbだけを示した。しかし
ながら、G1/S境界およびＳ段階にある細胞（図2B、レー
ン５〜10）は多様に燐酸化され、新しく合成されたRbを
つくりだす能力を取り戻した。継続的なDNA合成は、細
胞が多様に燐酸化されたRbをつくりだす上で必要ではな
い。最大24時間もアフィジコリンでG1/S境界で拘束され
た細胞は、多様に燐酸化された状態で、Rbをつくりだ
し、新たに合成されたRbを保持する能力を十分に持って
いた（図2B、レーン13）。G2＋Ｍ段階で、燐酸化過程形
態のRbが再び優勢になった（図2B、レーン11および1
3）。しかしながら、３−（１−アニリノエチリデン）
−５−ベンジルピロリジン−2,4−ジオン（WAKOケミカ
ルU.S.A.社）でＭ段階で拘束された細胞は依然として、
複数の形態のRbを示した。DNA合成開始の直前にRbが重
度に燐酸化されたという事実は、Rb燐酸化の状態と細胞
増殖のコントロールとの間に一定の相関関係がある可能
性を示唆している。血清枯渇により引き起こされる異常
な成長条件が燐酸化特性に及ぼす影響は、末端分化が誘
発された細胞におけるRbの燐酸化特性と対比された。HL
−60細胞は、種々の薬品による処理によって、いくつか
のことなった配列に沿って分化するように誘発すること
ができる。レチノン酸（RA）あるいはジメチル・スルフ
ォキサイド（DMSO）での処理は骨髄細胞分化を誘発し、
一方、1,25−ジヒドロキシビタミンD3および12−０−テ
トラデカノイル・フォルボル−13−13アセテート（TP
A）は単球分化を誘発する。誘発プロセスは通常、２細
胞サイクルに対応する時間で起きる（イェン等、白血病
Res.10,619（1986））。最初の細胞サイクルで、誘発因
子に露出された細胞は前駆状態を形成する。この段階で
の細胞は、成長拘束あるいは分化のいずれの状態も示し
ておらず、そしてそれらの細胞はいくらでも増殖でき
る。
我々はこの前駆状態を形成している変異体HL−60細胞
株（HL−60A）を分離した。HL−60Aを単一細胞サイクル
の間誘発因子に露出すると、細胞拘束および分化の開始
が引き起こされる。細胞増殖のコントロールとRbの燐酸
化の状態の間の関係を、活発に増殖しているHL−60A細
胞の無作為の群をRAで処理することにより判定した。細
胞の数はRAによる処理の最初の24時間以内に倍化した
（図3A）。細胞数での一層の増加が観察されなかったの
で、その後の増殖の抑制は起きなかった。処理後12時間
程度の早い時期に、Rb燐酸化のダウン調整が観察された
（図3B、レーン２および７）。RAあるいはDMSOで処理し
て24時間後、実質的にほとんどすべての新たに合成され
たRbは燐酸化の程度が低かった（レーン３および８）。
しかしながら、これらのデータだけでは、Rb燐酸化特
性における変化が成長拘束の原因なのか結果なのかを判
断するすることはできない。RAによる処理がすべての細
胞におけるRb燐酸化の程度を直接抑制でき、それによっ
て成長拘束をもたらすということはあり得る。また、Rb
の燐酸化のダウン調整は、細胞サイクルの特定の時点、
例えば、G0およびG1段階でだけ起きるのかもしれない。
したがって、後のケースにおけるRb燐酸化の抑制は、細
胞がG0およびG1の段階で成長拘束され、そして、RA処理
後の燐酸化過程形態のRbの観察された蓄積は、細胞が制
約時点に徐々に近づいていることを示しているかもしれ
ないという事実の反映であろう。この問題を検討するた
めに、我々は以下のような実験を行った。我々は先ず、
遠心溶出でHL−60A細胞の同調G0/G1群を分離した。分離
後、細胞を２つの部分に分け、そのひとつをRAで処理し
た。免疫沈降反応でRb燐酸化特性を分析し、［3H］−チ
ミジン摂取量によって燐酸化を測定するために、規則正
しい間隔で、細胞サンプルを採取した。同調化されたHL
−60A細胞は、成長拘束の開始前に１細胞区間だけ、RA
の存在下で成長することができた（図3C）。このサイク
ル中、新たに合成されたRbは、それらの細胞がＳ段階に
入ると、未処理細胞の場合とは違った方法で燐酸化され
た（図3E、レーン１〜４）。処理から30分後、RAで処理
された細胞は成長拘束状態となり、また、多様に燐酸化
されたRbをつくりだす能力を喪失した（図3E、レーン
５）。ニトロブルー・テトラゾリウム（NBT）染色で測
定すると、かなりの割合の細胞が分化された（図3D）。
このことから、我々はRA処理が間接的に蛋白質の燐酸化
を制御すると判断している。むしろ、新たに合成された
Rbの燐酸化の抑制はRAに誘発される成長拘束の結果であ
る。この結論は、TPA,DMSOあるいはナトリウム・ブチレ
ート（BA）などの化合物によるHL−60A細胞の処理は、
これらの化合物がそれぞれ異なった細胞標的に影響を及
ぼすという事実にも拘らず、Rb燐酸化の似たような抑制
過程（図3B、レーン７〜10）をもたらしたという観察に
よっても裏付けられている。RA,BAあるいはDMSOのいず
れかによる処理の96時間後、これらの細胞は98KDの燐酸
化の程度の低いRb蛋白を示した。ノーザン・ブロット分
析は通常のサイズのMRBAの存在を明らかにしたので、こ
の先端を切られたRbの発生源は内部ATGでの蛋白翻訳の
開始に原因を求めることができるであろう。この種のRb
は種々の薬品誘発因子で処理された細胞で観察されるの
で、その出現は、細胞の分化より成長拘束状態に関連づ
けられるかもしれない。
網膜芽細胞腫蛋白質の燐酸化はその活性のコントロー
ルにおいて中心的な役割を演じている。Rbを燐酸化でき
るRbキナーゼを部分的に精製すると、サイクリンＢと複
合したCDC2キナーゼが作成される。このCDC2/サイクリ
ンＢ複合体がイン・ビトロでRb蛋白を燐酸化する。イン
・ビトロでこの酵素が利用できる燐酸化個所のほとんど
はイン・ビボでも使われる。
ＹがK,RあるいはＨであり得るモチーフ:S/TPXYを含む
Rb蛋白における燐酸化個所はCDC2キナーゼによって識別
される。Rb蛋白においては、そうした燐酸化の可能性の
ある場所が11個所ある（図４、下線部）。それらの一部
はその活性の制御では重要な役割を果たしており、例え
ば、これらの重要な個所が燐酸化されると、Rb蛋白が不
活性化されるであろう。
燐酸化形態のRb蛋白（不活性形態）と燐酸化過程（活
性）形態のRb蛋白を区別する方法は、少なくとも２つあ
る。ひとつの方法は免疫沈降による方法で、この場合、
組織培養内の細胞は、［35S］−メチオニンか、あるい
は32Pのいずれかでラベルされる。次にRb蛋白が抽出さ
れ、Rb蛋白に対する抗体を使って沈降される。重度に燐
酸化された形態のRbより分子量が低い（105キロ・ドル
トン）燐酸化過程形態のRbはゲル電気泳動法によって識
別できる。燐酸化過程形態のRb蛋白を識別できるもうひ
とつの方法は、組織部分あるいは培養細胞を免疫組織化
学的染色を用いる方法によるものである。燐酸化個所を
含む、燐酸化過程形態の低いペプチドに対する抗体は、
燐酸化過程形態の個所を含むRb蛋白だけを識別する場合
もある。そうした抗体のひとつである0S3はアミノ酸248
〜262までの個所にCDC2キナーゼに対して燐酸化される
可能性のあるRbペプチドの領域であるペプチドGSPRTPRR
GQNRSARに対してだけ作用を発揮する（図４）。このペ
プチドに対する抗体は図５、レーン１に示すように、0S
3により免疫沈降されたRb蛋白の分子量が105kd程度であ
る、燐酸化過程形態のRb蛋白だけを検出する。それとは
対照的に、Rb蛋白の燐酸化個所を有していない別の部分
に向けられた抗体0S1は、図５、レーン２に示されてい
るように、燐酸化過程形態の低い個所と、重度に燐酸化
されたRb蛋白の両方を検出する。いくつかの燐酸化個
所、例えば、すぐ上に触れた個所は無作為では燐酸化さ
れず、このことはこの個所の燐酸化が行われないことが
常に燐酸化過程形態のRb蛋白（活性形態のRb蛋白）と関
係していることを示唆している。この個所、および／あ
るいはその他の同様の個所に対する抗体は、免疫沈降、
あるいは未培養組織部分の免疫組織化学的染色のいずれ
かの方法で燐酸化された形態のRb蛋白と燐酸化過程形態
のRb蛋白を識別する。これらの燐酸化個所に向けて、あ
るいはその近くに投与された抗体は特に免疫組織化学的
染色に関する研究などに有益であろう。これらの個所を
図４に示す。この個所固有抗体を得るためにこれらの個
所を含む15あるいはそれ以上のアミノ酸のオリゴペプチ
ドを使用した。
成長拘束および分化のための多数の治療用試薬、例え
ば、インターフェロン（アルファ、ベータ、ガンマ）、
腫瘍壊死因子、および腫瘍成長因子βは白血病細胞およ
び固形腫瘍などの多数の異なった種類の細胞タイプの分
化と成長拘束を引き起こすことができる。これらの薬品
のひとつの共通の作用はRb蛋白燐酸化のダウン調整であ
る。Rb遺伝子を種々のタイプの腫瘍細胞に導入すると、
それらの細胞の成長が、しばしば、単一の細胞サイクル
での、ひとつの、あるいは少数の細胞サイクルの間にダ
ウン調節された。このデータはその反増殖作用がRb蛋白
の内在的な作用であることを示唆している。このトラン
スフェクションは基本的には過剰な量の活性形態のRb蛋
白の産出に導いたが、この蛋白は細胞によっては脱燐酸
化されず、こうした活性蛋白の存在は細胞が成長するの
を防ぐのに十分であった。治療薬の多くはRb蛋白燐酸化
のダウン調節をもたらし、そのことで、Rb蛋白を活性化
した。
与えられた処方箋に基く薬品治療の有効性は、Rb蛋白
の燐酸化状態を観察することで評価することができる。
この評価は、特定の薬品がRb遺伝子を含んでいる細胞内
の異常細胞増殖を抑制する上で有効であるかどうかをす
ばやく判定するための手段の提供において特に有効であ
る。薬品治療中および後に腫瘍細胞標本を採取し、それ
から、Rb蛋白の燐酸化の程度を判定する。与えられた薬
品が、それだけで投与された時、あるいは他の薬品と組
み合わせて投与した時にRb蛋白の燐酸化をダウン調節し
たかどうかは、多数の方法で判定することができる。腫
瘍細胞は生体組織検査するか、あるいは患者から取り出
して、イン・ビトロでひとつの薬品、あるいはその薬品
とその他の薬品との組み合わせで処理することができ
る。Rb燐酸化がダウン制御されたかどうかを評価するす
るために、処理後のいろいろな時点で、Rb蛋白の燐酸化
を免疫沈降および／あるいは免疫組織化学染色の方法で
測定する。燐酸化がイン・ビトロでダウン制御されてい
なかったら、その処理は細胞成長拘束をもたらすとは思
われない。一方、その薬品がイン・ビトロでRb蛋白の燐
酸化を効果的に抑制するのであれば、その措置がその患
者において成功を収める可能性が高いことを示してい
る。
また、その患者の措置中に、その薬品による治療の有
効性、あるいは、Rb蛋白の燐酸化の抑制が誘発されたか
どうかを評価するために、腫瘍サンプルを生体組織検査
し、特定の燐酸化個所に対する抗体をつかって、培養を
行わずに、免疫組織化学的染色を行うことができる。
薬品治療の有効性のアッセイの終点は、対象となる薬
品が重要な個所でのRb蛋白の燐酸化を抑制することがで
きるかどうかについての判定である。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−20266（ＪＰ，Ａ) Ｃｅｌｌ（1989）Ｖｏｌ．58，Ｎｏ. ６，ｐ．1085−1095，ｐ．1097−1105 Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．（1986) Ｖｏｌ．162，ｐ．326−334 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ. （1988）Ｖｏｌ．８，ｐ．3088−3093 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/24 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】薬品をRb蛋白を含んでいる異常増殖中の細
    胞で、該Rb蛋白の燐酸化が可能な時間培養すること、そ
    して該Rb蛋白の程度の低い燐酸化の程度を測定すること
    で構成される細胞異常増殖を抑制する薬品を確認する方
    法。
  2. 【請求項２】培養時間が12時間である請求項１に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】Rb蛋白を含んでいる異常増殖中の細胞で、
    該Rb蛋白の燐酸化が可能な時間薬品を培養すること、お
    よび該Rb蛋白の軽度の燐酸化の程度を測定することで構
    成されRb蛋白を含む異常増殖中の細胞がその薬品に反応
    して成長拘束の状態になるかどうかを判定する方法。
  4. 【請求項４】以下のａ）〜ｄ）の工程を含む細胞増殖性
    疾患の治療に対する薬剤の有効性を判定する方法。 ａ） 薬剤治療前の個々のヒト由来のRb蛋白を含む細胞
    の標本の一部をイン・ビトロで該薬剤で処理する工程。 ｂ） 工程ａ）で処理された部分の細胞標本のRb蛋白の
    燐酸化のレベルを測定する工程。 ｃ） 細胞標本の未処理部分のRb蛋白の燐酸化のレベル
    を測定する工程。及び ｄ） 工程ｂ）の細胞標本のRb蛋白の燐酸化のレベルと
    工程ｃ）の細胞標本のRb蛋白の燐酸化のレベルとを比較
    する工程。 ここにおいて、Rb蛋白の燐酸化を阻害する薬剤は、細胞
    増殖性疾患の治療に有効であると判定される。
  5. 【請求項５】Rb蛋白の燐酸化の測定の方法が免疫沈降に
    よって行われる請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】Rb蛋白の燐酸化の測定の方法が免疫組織化
    学的染色によって行われる請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】燐酸化過程のRb蛋白が、Rb蛋白と該蛋白の
    燐酸化箇所に対して固有の作用を発揮する抗体によって
    測定される請求項４に記載の方法。
  8. 【請求項８】Rb蛋白をRb蛋白と結合する抗体で沈降さ
    せ、そのRb蛋白にゲル電気泳動を行い、分子量標準と比
    較することにより、Rb蛋白燐酸化の程度を判定する請求
    項４に記載の方法。
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