JP3096722B2 - ポリメラーゼ・チェーン・リアクション用プライマーの作製法およびそれを用いるｄｎａの増幅法 - Google Patents
ポリメラーゼ・チェーン・リアクション用プライマーの作製法およびそれを用いるｄｎａの増幅法Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生体外ポリメラーゼ・チェーン・リアクショ
ン（PCR）に用いうる新しいプライマーの作製法および
そのプライマーを利用するDNAの増幅法に関する。
ン（PCR）に用いうる新しいプライマーの作製法および
そのプライマーを利用するDNAの増幅法に関する。
分子生物学の進歩の歴史に関して、いくつかの基本技
術の確立が大きく貢献している。例えば、クローニング
技術、塩基配列決定の技術、ブロッティング法などがこ
れに当たる。近年報告され、応用が開始されたPCR法
（R.Saiki et al,1985 Science 230:1350、K.B.Mullis
and F.A.Faloona 1987 Methods Enzymol.155:335−35
0）も、一つの基本技術として定着しつつある。本技術
の特徴は、化学的に合成された１組の単鎖DNA（プライ
マー）に夾まれたDNAを選択的に試験管内で増幅すると
ころにある。また、本技術は、鋳型DNA、NTP、プライマ
ーおよび耐熱性DNAポリメラーゼから構成される反応液
を自動化されたブロックヒーター（サーマルサイクラ
ー）内に保持し、DNAのアニーリング、ポリメラーゼに
よる新規DNA鎖の合成、デアニーリングのサイクルを繰
り返させることにより、ごく微量の鋳型から目的とする
DNA鎖を増幅することを可能にした。本技術を応用する
ことにより、既知のDNA鎖の特異的な領域が簡便に得ら
れるとともに染色体遺伝子内に於ける遺伝子の欠損、た
とえば筋ジストロフィー関連遺伝子の欠損等、を容易に
検出できるようになった（J.S.Chamberlain 1988 Nucl.
Acids Res.16:11141−11156）。しかしながらこれら一
連の技術は、塩基配列が全く未知な遺伝子の解析への応
用がきわめて限られたものであった。最近、以上の欠点
を克服し染色体遺伝子の解析を行う方法として逆方向の
PCR法が報告された（T.Triglia et al 1988 Nucl.Acids
Res.16:8186）。これは、適当な制限酵素で切断したク
ロモゾームの遺伝子断片を、リガーゼを用いてたくさん
の小型環状DNAとしたのち、既知の遺伝子（例えば特定
のcDNA）の両端に当たる部分のDNAを従来と逆向き（外
向き）にPCR反応が進むように合成して、反応に供する
という方法である。この方法によって、既知の遺伝子
（例えば特定のcDNA）をコードする染色体遺伝子に隣接
するDNAの塩基配列が増幅され、その機能、例えば、プ
ロモーター、ターミネーターなどcDNAとしてとらえられ
ない遺伝子の構造や機能の解析が不可能ではなくなっ
た。しかし本技術は、いくつかの欠点を有していた。第
一にプライマーの化学合成が不可欠である。第二にプラ
イマーを化学合成する上で、その設計にあたり、塩基配
列が解明されていなければならない。第三にcDNAコード
領域に隣接した配列を決定しようとするとき、介在配列
やcDNAからは、予測できない塩基配列に関しては、本法
の応用は、不可能である。このように、最新の応用技術
をもってしても、遺伝子の解析に関するPCR法の応用に
あたって限界があった。
術の確立が大きく貢献している。例えば、クローニング
技術、塩基配列決定の技術、ブロッティング法などがこ
れに当たる。近年報告され、応用が開始されたPCR法
（R.Saiki et al,1985 Science 230:1350、K.B.Mullis
and F.A.Faloona 1987 Methods Enzymol.155:335−35
0）も、一つの基本技術として定着しつつある。本技術
の特徴は、化学的に合成された１組の単鎖DNA（プライ
マー）に夾まれたDNAを選択的に試験管内で増幅すると
ころにある。また、本技術は、鋳型DNA、NTP、プライマ
ーおよび耐熱性DNAポリメラーゼから構成される反応液
を自動化されたブロックヒーター（サーマルサイクラ
ー）内に保持し、DNAのアニーリング、ポリメラーゼに
よる新規DNA鎖の合成、デアニーリングのサイクルを繰
り返させることにより、ごく微量の鋳型から目的とする
DNA鎖を増幅することを可能にした。本技術を応用する
ことにより、既知のDNA鎖の特異的な領域が簡便に得ら
れるとともに染色体遺伝子内に於ける遺伝子の欠損、た
とえば筋ジストロフィー関連遺伝子の欠損等、を容易に
検出できるようになった（J.S.Chamberlain 1988 Nucl.
Acids Res.16:11141−11156）。しかしながらこれら一
連の技術は、塩基配列が全く未知な遺伝子の解析への応
用がきわめて限られたものであった。最近、以上の欠点
を克服し染色体遺伝子の解析を行う方法として逆方向の
PCR法が報告された（T.Triglia et al 1988 Nucl.Acids
Res.16:8186）。これは、適当な制限酵素で切断したク
ロモゾームの遺伝子断片を、リガーゼを用いてたくさん
の小型環状DNAとしたのち、既知の遺伝子（例えば特定
のcDNA）の両端に当たる部分のDNAを従来と逆向き（外
向き）にPCR反応が進むように合成して、反応に供する
という方法である。この方法によって、既知の遺伝子
（例えば特定のcDNA）をコードする染色体遺伝子に隣接
するDNAの塩基配列が増幅され、その機能、例えば、プ
ロモーター、ターミネーターなどcDNAとしてとらえられ
ない遺伝子の構造や機能の解析が不可能ではなくなっ
た。しかし本技術は、いくつかの欠点を有していた。第
一にプライマーの化学合成が不可欠である。第二にプラ
イマーを化学合成する上で、その設計にあたり、塩基配
列が解明されていなければならない。第三にcDNAコード
領域に隣接した配列を決定しようとするとき、介在配列
やcDNAからは、予測できない塩基配列に関しては、本法
の応用は、不可能である。このように、最新の応用技術
をもってしても、遺伝子の解析に関するPCR法の応用に
あたって限界があった。
〔課題を解決するための手段〕 本発明者らは鋭意研究を進めた結果、PCRに用いうる
全く新たなプライマーを作製することに成功した。それ
は手持ちのDNA鎖（例えばcDNA）を特殊な酵素で５′末
端側から消化して適当な長さの断片を作製し、これをプ
ライマーとすることができるもので、DNAを化学的に合
成するものではない。つぎに、cDNAをクローニングした
プラスミドをそのまま鋳型として、上記のプライマーを
利用して、PCR法を実施した。その結果、プラスミド
が、そのまま、非常に高い効率で増幅されることが判っ
た。この発見は、反応液中において、目的とするcDNAを
クローニングしたプラスミドだけを、最近の菌体内に導
入する事なしに増幅、純化し、形質転換の効率を飛躍的
に高めることを可能にするという新たな技術の発明につ
ながった。
全く新たなプライマーを作製することに成功した。それ
は手持ちのDNA鎖（例えばcDNA）を特殊な酵素で５′末
端側から消化して適当な長さの断片を作製し、これをプ
ライマーとすることができるもので、DNAを化学的に合
成するものではない。つぎに、cDNAをクローニングした
プラスミドをそのまま鋳型として、上記のプライマーを
利用して、PCR法を実施した。その結果、プラスミド
が、そのまま、非常に高い効率で増幅されることが判っ
た。この発見は、反応液中において、目的とするcDNAを
クローニングしたプラスミドだけを、最近の菌体内に導
入する事なしに増幅、純化し、形質転換の効率を飛躍的
に高めることを可能にするという新たな技術の発明につ
ながった。
つぎに、本プライマーを染色体遺伝子の増幅に応用し
た。真核細胞の染色体由来のDNAを制限酵素で切断した
後、リガーゼでセルフライゲートすることにより環状DN
Aを作製した。この環状DNAを鋳型にして、前述したプラ
イマーを用いてPCR反応を実施した。その結果、驚くべ
き事に、手持ちDNA鎖の断片からなるプライマーに隣接
した両側の染色体遺伝子で、切断に使用した制限酵素の
認識部位に夾まれた部分だけが増幅され、それ以外の遺
伝子は、全く増幅されなかった。このことにより、本発
明がその特異性と簡便さにおいてcDNAを用いた染色体上
のコード遺伝子および関連した制御遺伝子の解析にきわ
めて有効であることを明らかにして発明を確立するに至
った。
た。真核細胞の染色体由来のDNAを制限酵素で切断した
後、リガーゼでセルフライゲートすることにより環状DN
Aを作製した。この環状DNAを鋳型にして、前述したプラ
イマーを用いてPCR反応を実施した。その結果、驚くべ
き事に、手持ちDNA鎖の断片からなるプライマーに隣接
した両側の染色体遺伝子で、切断に使用した制限酵素の
認識部位に夾まれた部分だけが増幅され、それ以外の遺
伝子は、全く増幅されなかった。このことにより、本発
明がその特異性と簡便さにおいてcDNAを用いた染色体上
のコード遺伝子および関連した制御遺伝子の解析にきわ
めて有効であることを明らかにして発明を確立するに至
った。
本発明は、二重鎖DNAの断片にエキソヌクレアーゼを
作用させるポリメラーゼ・チェーン・リアクション用プ
ライマーの作製法、ポリメラーゼ・チェーン・リアクシ
ョンにより生体外でDNAを増幅させる方法において、二
重鎖DNAの断片にエキソヌクレアーゼを作用させて得ら
れる断片をプライマーとして用いるDNAの増幅方法、お
よび二重鎖DNA断片に５′末端から３′末端の方向にモ
ノヌクレオチドを遊離する形式で二重鎖DNAの一方の鎖
を消化するエキソヌクレアーゼを作用させて得られる断
片をプライマーとして、かつ染色体遺伝子を制限酵素に
より切断し、生成す断片をセルフライゲーションして得
られた環状DNAを鋳型として、逆方向のポリメラーゼ・
チェーン・リアクションを行うことを特徴とする染色体
遺伝子の増幅に関する。
作用させるポリメラーゼ・チェーン・リアクション用プ
ライマーの作製法、ポリメラーゼ・チェーン・リアクシ
ョンにより生体外でDNAを増幅させる方法において、二
重鎖DNAの断片にエキソヌクレアーゼを作用させて得ら
れる断片をプライマーとして用いるDNAの増幅方法、お
よび二重鎖DNA断片に５′末端から３′末端の方向にモ
ノヌクレオチドを遊離する形式で二重鎖DNAの一方の鎖
を消化するエキソヌクレアーゼを作用させて得られる断
片をプライマーとして、かつ染色体遺伝子を制限酵素に
より切断し、生成す断片をセルフライゲーションして得
られた環状DNAを鋳型として、逆方向のポリメラーゼ・
チェーン・リアクションを行うことを特徴とする染色体
遺伝子の増幅に関する。
本発明はPCR法、逆PCR法を応用して未知の遺伝子のク
ローニング、その解析を進める上できわめて有効な手段
を提供するものである。本発明に於て使用するプライマ
ーは、二重鎖DNAを酵素消化して得られる。今日応用さ
れているPCR法では、プライマーは化学的に合成されな
ければならない。そのため、応用範囲は、塩基配列が既
知な断片に限られてきたうえ、高価なDNA合成装置やそ
の試薬を使用しなければならなかったが、本発明によっ
て、その必要性はなくなった。本発明によれば、例え
ば、cDNAを逆転写酵素で合成後、煩雑な塩基配列の決定
を待つ事なく、そのcDNAそのものを出発材料としてプラ
イマーを作製し、すぐに関連した遺伝子の解析のためPC
R法による遺伝子増幅を実施できる。もちろん、cDNAに
限らず、あらゆるDNA断片が本法によるプライマーの作
成の出発材料となり得る。本法におけるプライマーはヌ
クレアーゼを使用して二重鎖DNAの一方の鎖を大部分ま
たは完全に消化し除去することによって得られる。その
ヌクレアーゼとしては、二重鎖DNAの断片を、いずれか
一方向からのみ消化するエキソヌクレアーゼを用いるの
が好ましい。逆PCR法に利用する場合、その消化の形式
が５′末端から進むヌクレアーゼが用いられる。この目
的には、たとえば、バクテリオファージλ由来エキソヌ
クレアーゼ（J.W.Little et al,1967 J.B.C.242;672−6
78）が適当である。プライマー断片の長さは、10塩基か
ら400塩基を越える長さまで可能で、それぞれの場合に
於て、サーマルサイクラーの温度、時間の条件を調整す
ることが必要である。本法により初めて可能になった10
0塩基以上のプライマーを使用する場合、従来より高温
でアニーリングすることができる。このことにより短い
合成DNAプライマーに比較して、アニーリング温度の選
択幅が広がり、はるかに特異性の高いPCR反応が迅速に
そして容易に実施できる。また、プライマー作製時のエ
キソヌクレアーゼ反応を調節して、二重鎖DNAのオーバ
ーラップをのこした断片をプライマーとすることによ
り、鋳型環状DNAを増幅して得られるDNA鎖は、その鋳型
のすべての塩基配列を有する直鎖DNAとなる。このこと
は、切断して得た染色体遺伝子などの中で、必要なDNA
断片を、サブクローニングする事なく選択的に増幅させ
ることが可能であることを意味し、遺伝子解析上、きわ
めて有用な方法論であることが明らかである。
ローニング、その解析を進める上できわめて有効な手段
を提供するものである。本発明に於て使用するプライマ
ーは、二重鎖DNAを酵素消化して得られる。今日応用さ
れているPCR法では、プライマーは化学的に合成されな
ければならない。そのため、応用範囲は、塩基配列が既
知な断片に限られてきたうえ、高価なDNA合成装置やそ
の試薬を使用しなければならなかったが、本発明によっ
て、その必要性はなくなった。本発明によれば、例え
ば、cDNAを逆転写酵素で合成後、煩雑な塩基配列の決定
を待つ事なく、そのcDNAそのものを出発材料としてプラ
イマーを作製し、すぐに関連した遺伝子の解析のためPC
R法による遺伝子増幅を実施できる。もちろん、cDNAに
限らず、あらゆるDNA断片が本法によるプライマーの作
成の出発材料となり得る。本法におけるプライマーはヌ
クレアーゼを使用して二重鎖DNAの一方の鎖を大部分ま
たは完全に消化し除去することによって得られる。その
ヌクレアーゼとしては、二重鎖DNAの断片を、いずれか
一方向からのみ消化するエキソヌクレアーゼを用いるの
が好ましい。逆PCR法に利用する場合、その消化の形式
が５′末端から進むヌクレアーゼが用いられる。この目
的には、たとえば、バクテリオファージλ由来エキソヌ
クレアーゼ（J.W.Little et al,1967 J.B.C.242;672−6
78）が適当である。プライマー断片の長さは、10塩基か
ら400塩基を越える長さまで可能で、それぞれの場合に
於て、サーマルサイクラーの温度、時間の条件を調整す
ることが必要である。本法により初めて可能になった10
0塩基以上のプライマーを使用する場合、従来より高温
でアニーリングすることができる。このことにより短い
合成DNAプライマーに比較して、アニーリング温度の選
択幅が広がり、はるかに特異性の高いPCR反応が迅速に
そして容易に実施できる。また、プライマー作製時のエ
キソヌクレアーゼ反応を調節して、二重鎖DNAのオーバ
ーラップをのこした断片をプライマーとすることによ
り、鋳型環状DNAを増幅して得られるDNA鎖は、その鋳型
のすべての塩基配列を有する直鎖DNAとなる。このこと
は、切断して得た染色体遺伝子などの中で、必要なDNA
断片を、サブクローニングする事なく選択的に増幅させ
ることが可能であることを意味し、遺伝子解析上、きわ
めて有用な方法論であることが明らかである。
〔実施例１〕 λエキソヌクレアーゼ処理によってプライマーDNAを
作製した。イネ種子貯蔵蛋白質である10kDaプロラミン
のcDNAをすでに報告した方法（T.Masumura et al 1989
Plant Mol.Bicology 12:123−130）で得た。そのcDNAを
クローン化したプラスミドplRP10は、図１に示すような
構造を持つ。本プラスミドを大腸菌に導入したのち大量
培養した。1lの培養液中の菌体よりアルカリ溶菌法を用
いて、プラスミドDNAを回収し、セシウムクロライド／
エチジウムブロマイド中で超遠心することにより精製し
約1mgのplRP10プラスミドDNAを得た。そのうちの50μｇ
を反応緩衝液（33mM Tris−acetate,pH7.9,10mM Magnes
ium−acetate,0.5mM DTT,66mM potassium acetate,0.01
％BSA）中で制限酵素Hinc II、Sma I各50単位を用い
て、37℃、２時間反応した。反応物を３％アガロースゲ
ル上で電気泳動し、400および200bpの長さに相当するDN
A断片のバンドをゲルから抽出したうえエタノール沈殿
して回収した。得られたDNA断片のうち、400bpの断片２
μｇを67mM Glycine−KOH,pH9.4,2.5mM MgCl2,50μg/ml
BSAからなる緩衝液中で８単位のλエキソヌクレアーゼ
存在下、37℃、15分間反応した。反応後、フェノール／
クロロホルム抽出したうえでエタノール沈澱により１本
鎖DNAとしてプライマーDNAを得た。
作製した。イネ種子貯蔵蛋白質である10kDaプロラミン
のcDNAをすでに報告した方法（T.Masumura et al 1989
Plant Mol.Bicology 12:123−130）で得た。そのcDNAを
クローン化したプラスミドplRP10は、図１に示すような
構造を持つ。本プラスミドを大腸菌に導入したのち大量
培養した。1lの培養液中の菌体よりアルカリ溶菌法を用
いて、プラスミドDNAを回収し、セシウムクロライド／
エチジウムブロマイド中で超遠心することにより精製し
約1mgのplRP10プラスミドDNAを得た。そのうちの50μｇ
を反応緩衝液（33mM Tris−acetate,pH7.9,10mM Magnes
ium−acetate,0.5mM DTT,66mM potassium acetate,0.01
％BSA）中で制限酵素Hinc II、Sma I各50単位を用い
て、37℃、２時間反応した。反応物を３％アガロースゲ
ル上で電気泳動し、400および200bpの長さに相当するDN
A断片のバンドをゲルから抽出したうえエタノール沈殿
して回収した。得られたDNA断片のうち、400bpの断片２
μｇを67mM Glycine−KOH,pH9.4,2.5mM MgCl2,50μg/ml
BSAからなる緩衝液中で８単位のλエキソヌクレアーゼ
存在下、37℃、15分間反応した。反応後、フェノール／
クロロホルム抽出したうえでエタノール沈澱により１本
鎖DNAとしてプライマーDNAを得た。
〔実施例２〕 イネゲノムDNAを制限酵素で切断したうえセルフライ
ゲートすることにより環状DNAとしこれを逆PCR法により
増幅した。イネDNAは常法通り（Molecular Cloning,269
−294,Cold Spring Harbor）調製した。その10μｇを高
塩濃度反応液（50mM Tris−Cl,pH7.5,10mM MgCl2,1mM D
TT,100mM NaCl）中で12単位の制限酵素EcoR Iとともに3
7℃、２時間反応し、完全に切断した。反応液をフェノ
ール／クロロホルム抽出したのちエタノール沈澱し、DN
A断片を回収した。このDNAを宝ライゲーションキットを
用いてセルフライゲートし環状化したのちフェノール／
クロロホルム抽出、エタノール沈澱し鋳型用環状ゲノム
DNAを得た。一方、plRP10を制限酵素Rsa I消化して280b
pの断片を調製し、この断片から実施例１記載と同様に
してプライマーを作製した。上記の環状ゲノムDNA2ngを
鋳型として反応溶液（10mM Tris−Cl、pH8.3,1.5mM MgC
l2,0.01％（w/v）gelatine,200uMdNTPs,0.5U Ampli Taq
DNA polymerase）に加え、さらに、上記で作製したプ
ライマーを200ng添加して、反応を開始した。反応は、
熱変性（94℃、１分）、アニーリング（60℃、２分）、
ポリメラーゼ反応（72℃、２分間）の連続反応を１サイ
クルとして35サイクル繰り返した。最後に７分間72℃の
反応を延長した。以上の反応は、シータス社サーマルサ
イクラーを使用して、自動的に行った。
ゲートすることにより環状DNAとしこれを逆PCR法により
増幅した。イネDNAは常法通り（Molecular Cloning,269
−294,Cold Spring Harbor）調製した。その10μｇを高
塩濃度反応液（50mM Tris−Cl,pH7.5,10mM MgCl2,1mM D
TT,100mM NaCl）中で12単位の制限酵素EcoR Iとともに3
7℃、２時間反応し、完全に切断した。反応液をフェノ
ール／クロロホルム抽出したのちエタノール沈澱し、DN
A断片を回収した。このDNAを宝ライゲーションキットを
用いてセルフライゲートし環状化したのちフェノール／
クロロホルム抽出、エタノール沈澱し鋳型用環状ゲノム
DNAを得た。一方、plRP10を制限酵素Rsa I消化して280b
pの断片を調製し、この断片から実施例１記載と同様に
してプライマーを作製した。上記の環状ゲノムDNA2ngを
鋳型として反応溶液（10mM Tris−Cl、pH8.3,1.5mM MgC
l2,0.01％（w/v）gelatine,200uMdNTPs,0.5U Ampli Taq
DNA polymerase）に加え、さらに、上記で作製したプ
ライマーを200ng添加して、反応を開始した。反応は、
熱変性（94℃、１分）、アニーリング（60℃、２分）、
ポリメラーゼ反応（72℃、２分間）の連続反応を１サイ
クルとして35サイクル繰り返した。最後に７分間72℃の
反応を延長した。以上の反応は、シータス社サーマルサ
イクラーを使用して、自動的に行った。
反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール
沈澱の後、得られたDNAを制限酵素Rsa Iで消化しアガロ
ース電気泳動に供した。その結果、プライマーの作製に
あたって出発材料として用いた280bpのcDNA断片に相当
するバンドが認められた。また本DNAを制限酵素EcoR I
で消化すると約4000bpの断片のみが検出された。また、
このようにして増幅されたDNAは、プロラミンcDNAをプ
ローブとしたサザンブロットにおいて、プローブと反応
した。これらのことから、本実験の結果、イネ10kDaプ
ロラミンのcDNAに相当する部分とその上下流域でEcoR I
認識部位にはさまれたゲノムDNAが特異的に増幅された
ことが認識された。
沈澱の後、得られたDNAを制限酵素Rsa Iで消化しアガロ
ース電気泳動に供した。その結果、プライマーの作製に
あたって出発材料として用いた280bpのcDNA断片に相当
するバンドが認められた。また本DNAを制限酵素EcoR I
で消化すると約4000bpの断片のみが検出された。また、
このようにして増幅されたDNAは、プロラミンcDNAをプ
ローブとしたサザンブロットにおいて、プローブと反応
した。これらのことから、本実験の結果、イネ10kDaプ
ロラミンのcDNAに相当する部分とその上下流域でEcoR I
認識部位にはさまれたゲノムDNAが特異的に増幅された
ことが認識された。
本発明によれば、二重鎖DNAを酵素で消化して得られ
るプライマーを用いてプラスミドDNA、cDNA、クロモゾ
ームDNAのようなDNAを、その塩基配列が不明であって
も、生体外で容易に増幅し、純化することができる。
るプライマーを用いてプラスミドDNA、cDNA、クロモゾ
ームDNAのようなDNAを、その塩基配列が不明であって
も、生体外で容易に増幅し、純化することができる。
第１図は実施例で用いたプラスミドplRP10の制限酵素地
図である。
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．86［23］（1989 −Ｄｅｃ）ｐ．9208−9212 Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，Ｖ ｏｌ．16［16］（1988）ｐ．8186 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】５′末端から３′末端の方向にモノヌクレ
オチドを遊離する形式で二重鎖DNAの一方の鎖を消化す
るエキソヌクレアーゼを二重鎖DNAの断片に作用させる
ことを特徴とするポリメラーゼ・チェーン・リアクショ
ン用プライマーの作製法。 - 【請求項２】エキソヌクレアーゼがバクテリオファージ
λに由来するエキソヌクレアーゼである請求項１記載の
作製法。 - 【請求項３】ポリメラーゼ・チェーン・リアクションに
より生体外でDNAを増幅させる方法において、二重鎖DNA
の断片に、５′末端から３′末端の方向にモノヌクレオ
チドを遊離する形式で二重鎖DNAの一方の鎖を消化する
エキソヌクレアーゼを作用させて得られる断片をプライ
マーとして用いることを特徴とするDNAの増幅方法。 - 【請求項４】エキソヌクレアーゼがバクテリオファージ
λに由来するエキソヌクレアーゼである請求項３記載の
方法。 - 【請求項５】二重鎖DNA断片に５′末端から３′末端の
方向にモノヌクレオチドを遊離する形式で二重鎖DNAの
一方の鎖を消化するエキソヌクレアーゼを作用させて得
られる断片をプライマーとして、かつ染色体遺伝子を制
限酵素により切断し、生成する断片をセルフライゲーシ
ョンして得られた環状DNAを鋳型として、逆方向のポリ
メラーゼ・チェーン・リアクションを行うことを特徴と
する染色体遺伝子の増幅方法。 - 【請求項６】エキソヌクレアーゼがバクテリオファージ
λ由来のエキソヌクレアーゼである請求項５記載の方
法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02009302A JP3096722B2 (ja) | 1990-01-17 | 1990-01-17 | ポリメラーゼ・チェーン・リアクション用プライマーの作製法およびそれを用いるｄｎａの増幅法 |
| CA 2034161 CA2034161A1 (en) | 1990-01-17 | 1991-01-15 | Method of preparing primers for polymerase chain reaction and dna amplification using said primers |
| EP91300326A EP0438292B1 (en) | 1990-01-17 | 1991-01-17 | Method of preparing primers for polymerase chain reaction and DNA amplification using said primers |
| DE1991622629 DE69122629T2 (de) | 1990-01-17 | 1991-01-17 | Verfahren zur Vorbereitung von Primern für die Polymerase-Kettenreaktion und DNS-Verstärkung durch Verwendung dieser Primer |
| ES91300326T ES2094194T3 (es) | 1990-01-17 | 1991-01-17 | Procedimiento para preparar cebadores para la reaccion en cadena de la polimerasa y amplificacion de adn usando dichos cebadores. |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| ES (1) | ES2094194T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0523920U (ja) * | 1991-09-17 | 1993-03-30 | 光命 益子 | 傘の収納袋 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2131630A1 (en) * | 1992-03-10 | 1993-09-30 | Yury E. Khudyakov | Exchangeable template reaction |
| US5580759A (en) * | 1994-02-03 | 1996-12-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Construction of recombinant DNA by exonuclease recession |
| US6740506B2 (en) | 1995-12-07 | 2004-05-25 | Diversa Corporation | End selection in directed evolution |
| AU4039400A (en) * | 1999-03-26 | 2000-10-16 | Diversa Corporation | Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution |
| GB0514935D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods for sequencing a polynucleotide template |
| GB0514910D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
| WO2007091077A1 (en) | 2006-02-08 | 2007-08-16 | Solexa Limited | Method for sequencing a polynucleotide template |
| US7754429B2 (en) | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
| WO2009032167A1 (en) * | 2007-08-29 | 2009-03-12 | Illumina Cambridge | Method for sequencing a polynucleotide template |
| US12060554B2 (en) | 2008-03-10 | 2024-08-13 | Illumina, Inc. | Method for selecting and amplifying polynucleotides |
| LT2669387T (lt) | 2009-08-25 | 2016-10-25 | Illumina, Inc. | Polinukleotidų atrankos ir padauginimo būdai |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK171161B1 (da) * | 1985-03-28 | 1996-07-08 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve |
-
1990
- 1990-01-17 JP JP02009302A patent/JP3096722B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-01-15 CA CA 2034161 patent/CA2034161A1/en not_active Abandoned
- 1991-01-17 DE DE1991622629 patent/DE69122629T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-17 ES ES91300326T patent/ES2094194T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-17 EP EP91300326A patent/EP0438292B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１６［１６］（１９８８）ｐ．８１８６ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．８６［２３］（１９８９−Ｄｅｃ）ｐ．９２０８−９２１２ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0523920U (ja) * | 1991-09-17 | 1993-03-30 | 光命 益子 | 傘の収納袋 |
Also Published As
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|---|---|
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| ES2094194T3 (es) | 1997-01-16 |
| CA2034161A1 (en) | 1991-07-18 |
| JPH03247282A (ja) | 1991-11-05 |
| EP0438292A2 (en) | 1991-07-24 |
| DE69122629T2 (de) | 1997-02-20 |
| EP0438292A3 (en) | 1991-09-18 |
| DE69122629D1 (de) | 1996-11-21 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |