JP3004414B2 - ボルデテラ属細菌での遺伝子産物の発現のための自己プロモーターの使用 - Google Patents
ボルデテラ属細菌での遺伝子産物の発現のための自己プロモーターの使用Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、各種蛋白質をコードす
る遺伝子のプロモーターを交換し、それらの発現レベル
を変化させることにより、遺伝子産物（特に蛋白質抗
原）の、なかでもボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）
属に属する細菌株での生産を変化させるための新規な方
法に関する。
る遺伝子のプロモーターを交換し、それらの発現レベル
を変化させることにより、遺伝子産物（特に蛋白質抗
原）の、なかでもボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）
属に属する細菌株での生産を変化させるための新規な方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ボルデテラ属の細菌には、百日咳菌
（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、パラ百日咳菌（Ｂ．ｐａ
ｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐ
ｔｉｃａ及びＢ．ａｖｉｕｍの各種が属している。最初
の２種はヒトに対する病原性を有しゝ後の２種は一般に
ヒト以外にその宿主が制限される。百日咳菌とパラ百日
咳菌は非常に激しい初期症状を伴う百日咳の原因とな
る。この病気への感染によって、あるいはこの病気に対
するワクチン、例えば不活性化全菌体ワクチン（ｉｎａ
ｃｔｉｖａｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉ
ｎｅ）の使用によって、各種抗原、典型的には、百日咳
トキシン（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ；ＰＴ）、
繊維状赤血球凝集素（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｈｅａ
ｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＦＨＡ）、凝集原（線毛；ｆ
ｉｍｂｒｉａｅ）及び６９ｋＤａの外膜蛋白質［ｏｕｔ
ｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ；ペルタクチ
ン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）］に対する抗体が誘導され
る。
（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、パラ百日咳菌（Ｂ．ｐａ
ｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐ
ｔｉｃａ及びＢ．ａｖｉｕｍの各種が属している。最初
の２種はヒトに対する病原性を有しゝ後の２種は一般に
ヒト以外にその宿主が制限される。百日咳菌とパラ百日
咳菌は非常に激しい初期症状を伴う百日咳の原因とな
る。この病気への感染によって、あるいはこの病気に対
するワクチン、例えば不活性化全菌体ワクチン（ｉｎａ
ｃｔｉｖａｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉ
ｎｅ）の使用によって、各種抗原、典型的には、百日咳
トキシン（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ；ＰＴ）、
繊維状赤血球凝集素（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｈｅａ
ｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＦＨＡ）、凝集原（線毛；ｆ
ｉｍｂｒｉａｅ）及び６９ｋＤａの外膜蛋白質［ｏｕｔ
ｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ；ペルタクチ
ン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）］に対する抗体が誘導され
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述の各種蛋白質は、
ワクチンの形態が不活性化全菌体ワクチン（生菌体を滅
菌して不活性化してそのまま用いたもの）であるか、特
定の部分を用いるコンポーネントワクチン（ｃｏｍｐｏ
ｎｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ）であるかに拘らず、百日咳
に対する防御のためのワクチンに、個々に、あるいは組
み合わせて用いる免疫原として代表的なものである。従
って、ワクチン用菌株におけるこれらの抗原の効率良い
発現が重要となる。
ワクチンの形態が不活性化全菌体ワクチン（生菌体を滅
菌して不活性化してそのまま用いたもの）であるか、特
定の部分を用いるコンポーネントワクチン（ｃｏｍｐｏ
ｎｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ）であるかに拘らず、百日咳
に対する防御のためのワクチンに、個々に、あるいは組
み合わせて用いる免疫原として代表的なものである。従
って、ワクチン用菌株におけるこれらの抗原の効率良い
発現が重要となる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】ワクチン用抗原の発酵生
産において、モル濃度レベルでペルタクチンに対して約
７倍の、ＰＴに対して約１０倍のＦＨＡの分泌がそれぞ
れ観察された。各抗原における蛋白質の複雑な全体的構
造、あるいは分泌効率が各抗原の収量に影響を及ぼす重
要な因子となっている一方で、各抗原遺伝子固有のプロ
モーターの相対的な強度や制御状態によっても百日咳菌
の各抗原遺伝子の発現レベルが影響を受ける。従って、
百日咳菌の有する自己のプロモーターの各遺伝子間での
相互置換によって特定の抗原の生産量を増加または減少
させることにより、各抗原の生産量の適正化が可能とな
る。このようにして得られた百日咳菌形質転換株は、全
菌体ワクチンに直接使用する免疫原として経済的で好ま
しいものである。更に、自己プロモーター同士の交換
は、特定の抗原の生産速度及び収率を変化させること
で、コンポーネントワクチンの生産のための発酵生産過
程及びそれに続く工程の効率を高める手段を提供するこ
ともできる。他の遺伝子とともに、百日咳トキシンオペ
ロン（ＴＯＸ）、ＦＨＡオペロン及びペルタクチンン遺
伝子（ＰＲＮ）に対しては、ボルデテラ属細菌の毒力制
御遺伝子（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ
ｇｅｎｅ；Ｂｖｇ、以前はＶＩＲとして知られていた
もの）によってポジティブな制御が行われる。後で示す
ように、ＴＯＸ、ＦＨＡ及びＰＲＮの構造遺伝子および
これらのプロモーターのヌクレオチド配列が確定し、対
応する蛋白質のアミノ酸配列が推定された。ＴＯＸオペ
ロンについては、プロモーターにおける対Ｂｖｇ応答部
分が転写開始位置を基準として−１７０ｂｐ位に位置付
けされている。他の遺伝子においては、対応する制御遺
伝子領域は決定されていない。
産において、モル濃度レベルでペルタクチンに対して約
７倍の、ＰＴに対して約１０倍のＦＨＡの分泌がそれぞ
れ観察された。各抗原における蛋白質の複雑な全体的構
造、あるいは分泌効率が各抗原の収量に影響を及ぼす重
要な因子となっている一方で、各抗原遺伝子固有のプロ
モーターの相対的な強度や制御状態によっても百日咳菌
の各抗原遺伝子の発現レベルが影響を受ける。従って、
百日咳菌の有する自己のプロモーターの各遺伝子間での
相互置換によって特定の抗原の生産量を増加または減少
させることにより、各抗原の生産量の適正化が可能とな
る。このようにして得られた百日咳菌形質転換株は、全
菌体ワクチンに直接使用する免疫原として経済的で好ま
しいものである。更に、自己プロモーター同士の交換
は、特定の抗原の生産速度及び収率を変化させること
で、コンポーネントワクチンの生産のための発酵生産過
程及びそれに続く工程の効率を高める手段を提供するこ
ともできる。他の遺伝子とともに、百日咳トキシンオペ
ロン（ＴＯＸ）、ＦＨＡオペロン及びペルタクチンン遺
伝子（ＰＲＮ）に対しては、ボルデテラ属細菌の毒力制
御遺伝子（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ
ｇｅｎｅ；Ｂｖｇ、以前はＶＩＲとして知られていた
もの）によってポジティブな制御が行われる。後で示す
ように、ＴＯＸ、ＦＨＡ及びＰＲＮの構造遺伝子および
これらのプロモーターのヌクレオチド配列が確定し、対
応する蛋白質のアミノ酸配列が推定された。ＴＯＸオペ
ロンについては、プロモーターにおける対Ｂｖｇ応答部
分が転写開始位置を基準として−１７０ｂｐ位に位置付
けされている。他の遺伝子においては、対応する制御遺
伝子領域は決定されていない。
【０００５】本発明により、ある構造遺伝子自身に固有
のプロモーターを、他の構造遺伝子に固有のプロモータ
ーで置換することで、ボルデテラ属の各種における蛋白
質の発現を変化させるための新規な方法が提供される。
この方法により、蛋白質の発現を増加または減少させる
こと、及び同時的生産（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｃｉｔｙｏ
ｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）または非同時的生産（ａｓ
ｙｎｃｈｒｏｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ）が可能となる。本発明において、百日咳遺伝子と
は、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、パラ百日咳
菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂ．ｂｒｏｎ
ｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及びＢ．ａｖｉｕｍ等のボルデテ
ラ属細菌の各種抗原蛋白質の遺伝子をいい、百日咳構造
遺伝子とはこれら遺伝子の有する構造遺伝子をいう。
のプロモーターを、他の構造遺伝子に固有のプロモータ
ーで置換することで、ボルデテラ属の各種における蛋白
質の発現を変化させるための新規な方法が提供される。
この方法により、蛋白質の発現を増加または減少させる
こと、及び同時的生産（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｃｉｔｙｏ
ｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）または非同時的生産（ａｓ
ｙｎｃｈｒｏｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ）が可能となる。本発明において、百日咳遺伝子と
は、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、パラ百日咳
菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂ．ｂｒｏｎ
ｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及びＢ．ａｖｉｕｍ等のボルデテ
ラ属細菌の各種抗原蛋白質の遺伝子をいい、百日咳構造
遺伝子とはこれら遺伝子の有する構造遺伝子をいう。
【０００６】本発明の１つの態様として、ある百日咳遺
伝子に固有の自己プロモーターに、他の百日咳遺伝子に
固有の構造遺伝子をＡＴＧ開始コドンで融合したハイブ
リッド百日咳遺伝子が提供される。
伝子に固有の自己プロモーターに、他の百日咳遺伝子に
固有の構造遺伝子をＡＴＧ開始コドンで融合したハイブ
リッド百日咳遺伝子が提供される。
【０００７】好ましいプロモーターと構造遺伝子の組合
せとして、 ａ．ＴＯＸプロモーターと、ＦＨＡ構造遺伝子もしくは
ＰＲＮ構造遺伝子の組合せ、 ｂ．ＦＨＡプロモーターと、ＴＯＸ構造遺伝子もしくは
ＰＲＮ構造遺伝子の組合せ、及び ｃ．ＰＲＮプロモーターと、ＴＯＸ構造遺伝子もしくは
ＦＨＡ構造遺伝子の組合せが提供される。
せとして、 ａ．ＴＯＸプロモーターと、ＦＨＡ構造遺伝子もしくは
ＰＲＮ構造遺伝子の組合せ、 ｂ．ＦＨＡプロモーターと、ＴＯＸ構造遺伝子もしくは
ＰＲＮ構造遺伝子の組合せ、及び ｃ．ＰＲＮプロモーターと、ＴＯＸ構造遺伝子もしくは
ＦＨＡ構造遺伝子の組合せが提供される。
【０００８】本発明により、更に、ハイブリッド百日咳
遺伝子の１以上により形質転換され、百日咳構造遺伝子
に対応する遺伝子産物の生産能を有するボルデテラ属形
質転換株、特に百日咳菌形質転換株が提供される。この
形質転換株は、同じ宿主を同じ百日咳構造遺伝子をＡＴ
Ｇ開始コドンで該百日咳構造遺伝子に固有のプロモータ
ーに融合した相同遺伝子で形質転換して得た形質転換体
で達成されるのと異なる量で該百日咳構造遺伝子に対応
する遺伝子産物を生産するものである。
遺伝子の１以上により形質転換され、百日咳構造遺伝子
に対応する遺伝子産物の生産能を有するボルデテラ属形
質転換株、特に百日咳菌形質転換株が提供される。この
形質転換株は、同じ宿主を同じ百日咳構造遺伝子をＡＴ
Ｇ開始コドンで該百日咳構造遺伝子に固有のプロモータ
ーに融合した相同遺伝子で形質転換して得た形質転換体
で達成されるのと異なる量で該百日咳構造遺伝子に対応
する遺伝子産物を生産するものである。
【０００９】特定の百日咳菌株の形質転換体が以下に示
され、特に、百日咳菌１２９０−４株、３９０−５９
株、５９０−１１株及び８９０−４９が特定された。更
に、本発明の他の態様として、百日咳菌の非形質転換株
であるＦＨＡオペロンが欠失した３９０−１０１株及び
ＰＲＮ遺伝子が欠失した１０９０−１０８−３株がそれ
ぞれ提供された。
され、特に、百日咳菌１２９０−４株、３９０−５９
株、５９０−１１株及び８９０−４９が特定された。更
に、本発明の他の態様として、百日咳菌の非形質転換株
であるＦＨＡオペロンが欠失した３９０−１０１株及び
ＰＲＮ遺伝子が欠失した１０９０−１０８−３株がそれ
ぞれ提供された。
【００１０】遺伝子産物、すなわち形質転換体により生
産された抗原蛋白質は百日咳菌に対するコンポーネント
ワクチンに有用である。本発明の一態様によれば、培養
において生産される蛋白質の後続する分離工程を容易と
することで、コンポーネントワクンの生産をより経済的
なものとすることができる。更に、本発明の他の態様に
よれば、各抗原蛋白質発現を改善することで、各抗原蛋
白質の分布がより良好なものとなった対百日咳全菌体ワ
クチンの調製が可能となる。
産された抗原蛋白質は百日咳菌に対するコンポーネント
ワクチンに有用である。本発明の一態様によれば、培養
において生産される蛋白質の後続する分離工程を容易と
することで、コンポーネントワクンの生産をより経済的
なものとすることができる。更に、本発明の他の態様に
よれば、各抗原蛋白質発現を改善することで、各抗原蛋
白質の分布がより良好なものとなった対百日咳全菌体ワ
クチンの調製が可能となる。
【００１１】百日咳菌形質転換株からの百日咳抗原蛋白
質の発現のためのここに記載した本発明の技術は、ボル
デテラ属の他の種、例えばパラ百日咳菌、Ｂ．ｂｒｏｎ
ｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及びＢ．ａｖｉｕｍ等においても
用いることができる。また、この技術は、所望の遺伝子
産物をコードする構造遺伝子と他の構造遺伝子に固有の
プロモーターとを組み合わせ、それによって形質転換し
た生体による所望の遺伝子産物の発現を行うためのハイ
ブリッド遺伝子の形成に広く適用できる。
質の発現のためのここに記載した本発明の技術は、ボル
デテラ属の他の種、例えばパラ百日咳菌、Ｂ．ｂｒｏｎ
ｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及びＢ．ａｖｉｕｍ等においても
用いることができる。また、この技術は、所望の遺伝子
産物をコードする構造遺伝子と他の構造遺伝子に固有の
プロモーターとを組み合わせ、それによって形質転換し
た生体による所望の遺伝子産物の発現を行うためのハイ
ブリッド遺伝子の形成に広く適用できる。
【００１２】従って、本発明の他の態様においては、生
体における遺伝子産物の発現方法であって、所望の遺伝
子産物をコードする構造遺伝子が同一菌株由来の他の構
造遺伝子に固有のプロモーターと融合しているハイブリ
ッド遺伝子を形成する過程と、該ハイブリッド遺伝子で
生体を形質転換する過程と、得られた形質転換体を前記
遺伝子産物の発現が行われるように培養する過程とを有
する方法が提供される。
体における遺伝子産物の発現方法であって、所望の遺伝
子産物をコードする構造遺伝子が同一菌株由来の他の構
造遺伝子に固有のプロモーターと融合しているハイブリ
ッド遺伝子を形成する過程と、該ハイブリッド遺伝子で
生体を形質転換する過程と、得られた形質転換体を前記
遺伝子産物の発現が行われるように培養する過程とを有
する方法が提供される。
【００１３】百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）１０
５３６株は、本願出願人の有するワクチン生産菌であ
り、本願発明者により詳細に述べられた全ての操作の出
発菌株として使用された。ＰＴ、ＦＨＡ及びペルタクチ
ンの遺伝子がそれぞれクローニングされ、これらの配列
が決定され（Ｎｉｃｏｓｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８
３，４６３１［１９８６］；Ｌｏｏｓｍｏｒｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７，８３
６５，［１９８９］；Ｒｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．
Ａ．，８６，２６３７，［１９８９］；Ｃｈａｒｌｅｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，３５５４，［１９８
９］）、更にこれらの遺伝子のプロモーター領域及び構
造遺伝子の翻訳開始点が決定された。
５３６株は、本願出願人の有するワクチン生産菌であ
り、本願発明者により詳細に述べられた全ての操作の出
発菌株として使用された。ＰＴ、ＦＨＡ及びペルタクチ
ンの遺伝子がそれぞれクローニングされ、これらの配列
が決定され（Ｎｉｃｏｓｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８
３，４６３１［１９８６］；Ｌｏｏｓｍｏｒｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７，８３
６５，［１９８９］；Ｒｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．
Ａ．，８６，２６３７，［１９８９］；Ｃｈａｒｌｅｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，３５５４，［１９８
９］）、更にこれらの遺伝子のプロモーター領域及び構
造遺伝子の翻訳開始点が決定された。
【００１４】本発明者らは、ともに同一菌株由来の所定
の２つの遺伝子間において、一方の遺伝子に固有のプロ
モーターを他方の遺伝子に固有のプロモーターで置換す
ることによってハイブリッド遺伝子を形成した。これ
は、ＡＴＧ開始コドンで構造遺伝子を所定のプロモータ
ーと融合させることにより達成された。この融合は、百
日咳菌に固有でしかも自己由来のプロモーターと構造遺
伝子を該構造遺伝子に固有のシグナル配列とともに融合
した構造を提供した。その結果得られるハイブリッド遺
伝子は、百日咳菌の染色体の適当な遺伝子座に相同組換
えにより導入された。
の２つの遺伝子間において、一方の遺伝子に固有のプロ
モーターを他方の遺伝子に固有のプロモーターで置換す
ることによってハイブリッド遺伝子を形成した。これ
は、ＡＴＧ開始コドンで構造遺伝子を所定のプロモータ
ーと融合させることにより達成された。この融合は、百
日咳菌に固有でしかも自己由来のプロモーターと構造遺
伝子を該構造遺伝子に固有のシグナル配列とともに融合
した構造を提供した。その結果得られるハイブリッド遺
伝子は、百日咳菌の染色体の適当な遺伝子座に相同組換
えにより導入された。
【００１５】自己プロモーターの使用の例として、以下
の組合せでハイブリッド遺伝子を形成した。 ａ．ＦＨＡプロモーターをＴＯＸオペロンに組み合わせ
たＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子、 ｂ．ＦＨＡプロモーターをＰＲＮ遺伝子に組み合わせた
ＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子、及び ｃ．ＴＯＸプロモーターをＦＨＡ遺伝子に組み合わせた
ＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド遺伝子。この
方法の効果を示すために種々の百日咳菌形質転換株が形
成された。すべての場合において、自己プロモーターは
新たに導入された染色体の本来の位置とは別の位置にお
いて機能した。
の組合せでハイブリッド遺伝子を形成した。 ａ．ＦＨＡプロモーターをＴＯＸオペロンに組み合わせ
たＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子、 ｂ．ＦＨＡプロモーターをＰＲＮ遺伝子に組み合わせた
ＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子、及び ｃ．ＴＯＸプロモーターをＦＨＡ遺伝子に組み合わせた
ＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド遺伝子。この
方法の効果を示すために種々の百日咳菌形質転換株が形
成された。すべての場合において、自己プロモーターは
新たに導入された染色体の本来の位置とは別の位置にお
いて機能した。
【００１６】本発明において、ＦＨＡプロモーター／Ｔ
ＯＸハイブリッド遺伝子をＴＯＸ遺伝子座に挿入するこ
とで百日咳菌３９０−５９株が形成できたことによっ
て、ある構造遺伝子に固有のプロモーターを、他の構造
遺伝子に固有のプロモーターで置換できることが示され
た。この３９０−５９株は、野生型１０５３６株に匹敵
する速度及び収量でＰＴを分泌した（図３Ａに示す菌株
１０５３６における通常の速度と比較して図３Ｂを参
照）。ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子
は次にその菌株固有のＦＨＡ遺伝子座に導入され、２つ
のＴＯＸ遺伝子コピーを有する百日咳菌５９０−１１株
が形成された。この菌株のＰＴ生産の速度および収量
は、２つのＴＯＸ遺伝子からの発現と矛盾するものでは
なかった。すなわち、一方のＦＨＡ遺伝子座に導入され
たＴＯＸはハイブリッドオペロン中のＦＨＡプロモータ
ーの指令によって発現し、他方のＴＯＸは菌株固有のＴ
ＯＸオペロンから発現する（図３Ｃ参照）。これらの実
験は、ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝伝
子を染色体の２つの異なる遺伝子座に組み込ことが可能
であることを示した。
ＯＸハイブリッド遺伝子をＴＯＸ遺伝子座に挿入するこ
とで百日咳菌３９０−５９株が形成できたことによっ
て、ある構造遺伝子に固有のプロモーターを、他の構造
遺伝子に固有のプロモーターで置換できることが示され
た。この３９０−５９株は、野生型１０５３６株に匹敵
する速度及び収量でＰＴを分泌した（図３Ａに示す菌株
１０５３６における通常の速度と比較して図３Ｂを参
照）。ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子
は次にその菌株固有のＦＨＡ遺伝子座に導入され、２つ
のＴＯＸ遺伝子コピーを有する百日咳菌５９０−１１株
が形成された。この菌株のＰＴ生産の速度および収量
は、２つのＴＯＸ遺伝子からの発現と矛盾するものでは
なかった。すなわち、一方のＦＨＡ遺伝子座に導入され
たＴＯＸはハイブリッドオペロン中のＦＨＡプロモータ
ーの指令によって発現し、他方のＴＯＸは菌株固有のＴ
ＯＸオペロンから発現する（図３Ｃ参照）。これらの実
験は、ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝伝
子を染色体の２つの異なる遺伝子座に組み込ことが可能
であることを示した。
【００１７】ＰＴホロトキシンは、それぞれ５種の異な
った遺伝子によってコードされた６種のサブユニットか
らなる蛋白質複合体である。この蛋白質が構造的に複雑
でないと仮定して、ＦＨＡプロモーターによって該蛋白
質の発現量の増加を指令できるかどうかを決定するため
に、ＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子を
有する株（百日咳菌１２９０−４株）が形成された。ペ
ルタクチン蛋白質は大きな前駆体から誘導される単一ポ
リペプチドである。ペルタクチンの収量は、ＦＨＡプロ
モーターの指令による場合に、ファメンター中では３倍
に、更に振とう培養器内では１０倍になった（１０リッ
トルのファーメンターにおける通常のペルタクチン生産
速度を示す図７Ａとともに図７Ｂ参照）。
った遺伝子によってコードされた６種のサブユニットか
らなる蛋白質複合体である。この蛋白質が構造的に複雑
でないと仮定して、ＦＨＡプロモーターによって該蛋白
質の発現量の増加を指令できるかどうかを決定するため
に、ＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子を
有する株（百日咳菌１２９０−４株）が形成された。ペ
ルタクチン蛋白質は大きな前駆体から誘導される単一ポ
リペプチドである。ペルタクチンの収量は、ＦＨＡプロ
モーターの指令による場合に、ファメンター中では３倍
に、更に振とう培養器内では１０倍になった（１０リッ
トルのファーメンターにおける通常のペルタクチン生産
速度を示す図７Ａとともに図７Ｂ参照）。
【００１８】ＦＨＡの過剰生産は精製プロセスにおいて
問題を生じる場合がある。すなわち、ＦＨＡ以外の生産
量の少ない抗原の精製を容易に行いたい場合、過剰のＦ
ＨＡの生産は好ましくない。そのような場合のために、
ＦＨＡの収量を減少させる目的で、ＦＨＡ遺伝子に固有
のプロモーターをＴＯＸに固有のプロモーター（ＴＯＸ
プロモーター）で置換した。得られたＴＯＸプロモータ
ー／ＦＨＡハイブリッド遺伝子はＦＨＡ遺伝子座に導入
され、百日咳菌８９０−４９株が形成された。この操作
によって、ＦＨＡの生産量は大幅に減少し、１／５０〜
１／１００となった（図５Ａに示した通常のＦＨＡ生産
速度及び図５Ｂ参照）。
問題を生じる場合がある。すなわち、ＦＨＡ以外の生産
量の少ない抗原の精製を容易に行いたい場合、過剰のＦ
ＨＡの生産は好ましくない。そのような場合のために、
ＦＨＡの収量を減少させる目的で、ＦＨＡ遺伝子に固有
のプロモーターをＴＯＸに固有のプロモーター（ＴＯＸ
プロモーター）で置換した。得られたＴＯＸプロモータ
ー／ＦＨＡハイブリッド遺伝子はＦＨＡ遺伝子座に導入
され、百日咳菌８９０−４９株が形成された。この操作
によって、ＦＨＡの生産量は大幅に減少し、１／５０〜
１／１００となった（図５Ａに示した通常のＦＨＡ生産
速度及び図５Ｂ参照）。
【００１９】本発明者らは以下の実施例で詳述するよう
に、本発明によってボルデテラ属細菌の有する２種の遺
伝子間でのプロモーターの置換及び置換されたプロモー
ターによる抗原の生産が可能であることが示された。更
に、プロモーターの置換によって、百日咳菌における各
種抗原の収量を選択的に増加もしくは減少させることも
可能であることが示された。ペルタクチンの生産量は増
加し、ＦＨＡの生産量は減少した。抗原の生産速度にお
ける有意な変化は認められなかったが、このプロモータ
ーの置換法は抗原生産の時間経過に伴う推移形態や収量
を変化させることに利用しても良い。この方法により、
所定の菌株での複数種の蛋白質の生産の制御をおこなう
ことで、発酵過程やそれに続く処理操作に好ましい条件
を提供することが可能となる。本発明のプロモーター置
換方法はボルデテラ属の各種におけるいかなる遺伝子の
組合せにおいても使用可能であり、他の生物にも適用可
能である。
に、本発明によってボルデテラ属細菌の有する２種の遺
伝子間でのプロモーターの置換及び置換されたプロモー
ターによる抗原の生産が可能であることが示された。更
に、プロモーターの置換によって、百日咳菌における各
種抗原の収量を選択的に増加もしくは減少させることも
可能であることが示された。ペルタクチンの生産量は増
加し、ＦＨＡの生産量は減少した。抗原の生産速度にお
ける有意な変化は認められなかったが、このプロモータ
ーの置換法は抗原生産の時間経過に伴う推移形態や収量
を変化させることに利用しても良い。この方法により、
所定の菌株での複数種の蛋白質の生産の制御をおこなう
ことで、発酵過程やそれに続く処理操作に好ましい条件
を提供することが可能となる。本発明のプロモーター置
換方法はボルデテラ属の各種におけるいかなる遺伝子の
組合せにおいても使用可能であり、他の生物にも適用可
能である。
【００２０】
【実施例】下記の各実施例における遺伝子操作、発酵生
産、蛋白質生化学的取り扱い及びハイブリドーマ形成技
術等に関する方法において、詳細に記述されていないも
のについては科学文献等に報告された公知の方法に従っ
て行うことができるものであり、下記の各実施例は当業
者にとって良く理解できるものである。百日咳菌におけ
る遺伝子操作法は、ヨーロッパ特許公開第０，３２２，
１１５号（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．０，３２２，１１５）および米
国特許出願第２７５，３７６号（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．２７
５，３７６、本願出願人に譲渡されている）に記載され
ており、本願においても引用されている。
産、蛋白質生化学的取り扱い及びハイブリドーマ形成技
術等に関する方法において、詳細に記述されていないも
のについては科学文献等に報告された公知の方法に従っ
て行うことができるものであり、下記の各実施例は当業
者にとって良く理解できるものである。百日咳菌におけ
る遺伝子操作法は、ヨーロッパ特許公開第０，３２２，
１１５号（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．０，３２２，１１５）および米
国特許出願第２７５，３７６号（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．２７
５，３７６、本願出願人に譲渡されている）に記載され
ており、本願においても引用されている。
【００２１】各オリゴヌクレオチドは、ＡＢＩモデル３
８０Ａ ＤＮＡ合成機により合成し、ポリアクリルアミ
ドゲルを用いた電気泳動法によって精製した。遺伝子操
作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄｅｄｉ
ｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．［１９８９］）の方法に従って行っ
た。制限酵素は、製造者の示す操作法に従って使用し
た。ＴＯＸ遺伝子、ＦＨＡ遺伝子及びＦＲＮ遺伝子は、
百日咳菌１０５３６株のＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ断片を含
むラムダシャロン３５ライブラリー（ｌａｍｂｄａ Ｃ
ｈａｒｏｎ ３５ ｌｉｂｒａｒｙ）からクローニング
した。染色体ＤＮＡの構造は制限酵素地図の作成および
遺伝子の全体あるいは部分的な配列分析によって確認し
た。所定の遺伝子のプロモーターの他の遺伝子の翻訳領
域（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、構造遺伝子）へ
の連結は、合成オリゴヌクレオチド（リンカー）を介し
て行った。プロモーターと構造遺伝子とが正しく融合
（連結）されたかどうかは、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３，［１９７７］）によ
る配列分析によって確認した。
８０Ａ ＤＮＡ合成機により合成し、ポリアクリルアミ
ドゲルを用いた電気泳動法によって精製した。遺伝子操
作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄｅｄｉ
ｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．［１９８９］）の方法に従って行っ
た。制限酵素は、製造者の示す操作法に従って使用し
た。ＴＯＸ遺伝子、ＦＨＡ遺伝子及びＦＲＮ遺伝子は、
百日咳菌１０５３６株のＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ断片を含
むラムダシャロン３５ライブラリー（ｌａｍｂｄａ Ｃ
ｈａｒｏｎ ３５ ｌｉｂｒａｒｙ）からクローニング
した。染色体ＤＮＡの構造は制限酵素地図の作成および
遺伝子の全体あるいは部分的な配列分析によって確認し
た。所定の遺伝子のプロモーターの他の遺伝子の翻訳領
域（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、構造遺伝子）へ
の連結は、合成オリゴヌクレオチド（リンカー）を介し
て行った。プロモーターと構造遺伝子とが正しく融合
（連結）されたかどうかは、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３，［１９７７］）によ
る配列分析によって確認した。
【００２２】百日咳菌における遺伝子の置換操作は、エ
レクトロポレーション法（Ｚｅａｌｅｙ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，１０２５，
［１９９０］）を用いてプラスミドＤＮＡを菌体に導入
することによる相同組換えによって行った。ＴＯＸ欠損
２９−８株、ＦＨＡ欠損３９０−１０１株、及びＰＲＮ
欠揖１０９０−１０８−３株は同様の方法によって形成
した。また、遺伝子は非複製型プラスミドに組み込まれ
て導入され、対立遺伝子の置換は、一次形質転換体のス
トレプトマイシンでの選択により行われた（Ｓｔｉｂｉ
ｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，５０，１３３，［１９
８６］）。染色体ＤＮＡは、Ｙａｃｏｏｂ及びＺｅａｌ
ｅｙの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，
１６３９，［１９８８］）により調製され、Ｇｅｎｅ
Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ（デュポン）を用いたＳａｍｂ
ｒｏｏｋらによるサザーンブロット分析法にかけられ
た。
レクトロポレーション法（Ｚｅａｌｅｙ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，１０２５，
［１９９０］）を用いてプラスミドＤＮＡを菌体に導入
することによる相同組換えによって行った。ＴＯＸ欠損
２９−８株、ＦＨＡ欠損３９０−１０１株、及びＰＲＮ
欠揖１０９０−１０８−３株は同様の方法によって形成
した。また、遺伝子は非複製型プラスミドに組み込まれ
て導入され、対立遺伝子の置換は、一次形質転換体のス
トレプトマイシンでの選択により行われた（Ｓｔｉｂｉ
ｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，５０，１３３，［１９
８６］）。染色体ＤＮＡは、Ｙａｃｏｏｂ及びＺｅａｌ
ｅｙの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，
１６３９，［１９８８］）により調製され、Ｇｅｎｅ
Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ（デュポン）を用いたＳａｍｂ
ｒｏｏｋらによるサザーンブロット分析法にかけられ
た。
【００２３】実施例１ 本実施例は、ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド
オペロンの形成及び百日咳菌１０５３６株への導入を示
す。
オペロンの形成及び百日咳菌１０５３６株への導入を示
す。
【００２４】百日咳菌に固有の百日咳トキシン遺伝子
（ＴＯＸ遺伝子）の非翻訳領域（ｆｌａｋｉｎｇ ｒｅ
ｇｉｏｎ）に挟まれた位置に、ＴＯＸ構造遺伝子とその
発現を指令するＦＨＡプロモーターとを有し、プラスミ
ドｐＵＣをベースとしたプラスミドＳ−３６８０−１０
が構築された。ＦＨＡプロモーターは、対Ｂｖｇ応答部
分を含む約２４０ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｆＩ断片中
にある（ＴＯＸオペロンは１７０ｂｐの対Ｂｖｇ応答領
域を必要とする）。２つの相補的オリゴヌクレオチドを
アニールして、２つの遺伝子領域を連結するための約４
５ｂｐのＨｉｎｆＩ／ＡｖａＩ単位が形成され、プラス
ミドに組み込まれた（図１参照）。この単位は、ＰＴサ
ブユニットＳ１のリーダー配列をコードするＤＮＡ断片
を含む。Ｓ１遺伝子のＡｖａＩ部位から翻訳終止点に続
くＥｃｏＲＩ部位までのＴＯＸオペロンの残りの部分が
ハイブリッドオペロンを完成するために用いられた。Ｔ
ＯＸ遺伝子座に固有の３ｋｂｐのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ
５’側非翻訳領域（図１における５’ＴＯＸ）及び４
ｋｂｐのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ ３’側非翻訳領域（図
１における３’ＴＯＸ）が、ハイブリッドオペロンのＴ
ＯＸ遺伝子座への相同組換えによる導入のために用いら
れた。
（ＴＯＸ遺伝子）の非翻訳領域（ｆｌａｋｉｎｇ ｒｅ
ｇｉｏｎ）に挟まれた位置に、ＴＯＸ構造遺伝子とその
発現を指令するＦＨＡプロモーターとを有し、プラスミ
ドｐＵＣをベースとしたプラスミドＳ−３６８０−１０
が構築された。ＦＨＡプロモーターは、対Ｂｖｇ応答部
分を含む約２４０ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｆＩ断片中
にある（ＴＯＸオペロンは１７０ｂｐの対Ｂｖｇ応答領
域を必要とする）。２つの相補的オリゴヌクレオチドを
アニールして、２つの遺伝子領域を連結するための約４
５ｂｐのＨｉｎｆＩ／ＡｖａＩ単位が形成され、プラス
ミドに組み込まれた（図１参照）。この単位は、ＰＴサ
ブユニットＳ１のリーダー配列をコードするＤＮＡ断片
を含む。Ｓ１遺伝子のＡｖａＩ部位から翻訳終止点に続
くＥｃｏＲＩ部位までのＴＯＸオペロンの残りの部分が
ハイブリッドオペロンを完成するために用いられた。Ｔ
ＯＸ遺伝子座に固有の３ｋｂｐのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ
５’側非翻訳領域（図１における５’ＴＯＸ）及び４
ｋｂｐのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ ３’側非翻訳領域（図
１における３’ＴＯＸ）が、ハイブリッドオペロンのＴ
ＯＸ遺伝子座への相同組換えによる導入のために用いら
れた。
【００２５】ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド
遺伝子を有するプラスミドＳ−３６８０−１０はエレク
トロポレーション法により、百日咳菌１０５３６株から
誘導されたＴＯＸ欠損２９−８株に導入され、その結果
ＰＴの発現がＦＨＡプロモーターによって行われる３９
０−５９株が形成された。この３９０−５９株における
ＰＴの生産速度及び収量は親株（１０５３６株）とほぼ
同じものであった（図３Ａ及び３Ｂ参照）。制限酵素地
図の作成及びサザーンブロット分析によって、ＴＯＸ遺
伝子座の本来の場所に正しくＦＨＡプロモーター／ＴＯ
Ｘハイブリッド遺伝子が導入されたことを確認した（図
８参照）。ＴＯＸ欠損２９−８株は、寄託番号５３９７
３でＡＴＣＣに寄託されており、先に挙げた米国特許出
願第２７５，３７６号に記載されている。
遺伝子を有するプラスミドＳ−３６８０−１０はエレク
トロポレーション法により、百日咳菌１０５３６株から
誘導されたＴＯＸ欠損２９−８株に導入され、その結果
ＰＴの発現がＦＨＡプロモーターによって行われる３９
０−５９株が形成された。この３９０−５９株における
ＰＴの生産速度及び収量は親株（１０５３６株）とほぼ
同じものであった（図３Ａ及び３Ｂ参照）。制限酵素地
図の作成及びサザーンブロット分析によって、ＴＯＸ遺
伝子座の本来の場所に正しくＦＨＡプロモーター／ＴＯ
Ｘハイブリッド遺伝子が導入されたことを確認した（図
８参照）。ＴＯＸ欠損２９−８株は、寄託番号５３９７
３でＡＴＣＣに寄託されており、先に挙げた米国特許出
願第２７５，３７６号に記載されている。
【００２６】実施例２ 本実施例は、ＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド
オペロンの構築及び百日咳菌ＦＨＡ欠損株への導入を示
す。ＦＨＡ遺伝子の非翻訳領域に挟まれた位置に、ＦＨ
Ａプロモーターと該プロモーターにＳ１サブユニットの
リーダー配列をコードするＤＮＡ断片の開始コドンで連
結したＴＯＸ構造遺伝子とを含み、プラスミドｐＢＲ３
２２をベースとしたプラスミドＳ−３７４９−１８を構
築した。この構築は実施例１に従って行った。ＦＨＡオ
ペロンの２．５ｋｂｐのＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ ５’
側非翻訳領域（図２の５’ＦＨＡ）及び１．７ｋｂｐの
ＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ ３’側非翻訳領域（図２の３’
ＦＨＡ）がハイブリッドオペロンのＦＨＡ遺伝子座への
導入に利用された。
オペロンの構築及び百日咳菌ＦＨＡ欠損株への導入を示
す。ＦＨＡ遺伝子の非翻訳領域に挟まれた位置に、ＦＨ
Ａプロモーターと該プロモーターにＳ１サブユニットの
リーダー配列をコードするＤＮＡ断片の開始コドンで連
結したＴＯＸ構造遺伝子とを含み、プラスミドｐＢＲ３
２２をベースとしたプラスミドＳ−３７４９−１８を構
築した。この構築は実施例１に従って行った。ＦＨＡオ
ペロンの２．５ｋｂｐのＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ ５’
側非翻訳領域（図２の５’ＦＨＡ）及び１．７ｋｂｐの
ＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ ３’側非翻訳領域（図２の３’
ＦＨＡ）がハイブリッドオペロンのＦＨＡ遺伝子座への
導入に利用された。
【００２７】プラスミドＳ−３７４９−１８は百日咳菌
ＦＨＡ欠損３９０−１０１株に導入された。この操作に
よって、２つのＴＯＸ遺伝子コピーを有する５９０−１
１株が形成された。この２つのＴＯＸ遺伝子の一方はそ
れ自身に固有のプロモーター（ＴＯＸプロモーター）に
より転写され、他方はＦＨＡプロモーターによって転写
される。５９０−１１株におけるＰＴの全収量は、１０
５３６株における場合の約２倍に達したが、その生産速
度には変化はなかった（図３Ａ及び３Ｂ参照）。ＦＨＡ
欠損３９０−１０１株は１９９１年３月６日にＡＴＣＣ
に寄託されている（寄託番号５５１５７）。
ＦＨＡ欠損３９０−１０１株に導入された。この操作に
よって、２つのＴＯＸ遺伝子コピーを有する５９０−１
１株が形成された。この２つのＴＯＸ遺伝子の一方はそ
れ自身に固有のプロモーター（ＴＯＸプロモーター）に
より転写され、他方はＦＨＡプロモーターによって転写
される。５９０−１１株におけるＰＴの全収量は、１０
５３６株における場合の約２倍に達したが、その生産速
度には変化はなかった（図３Ａ及び３Ｂ参照）。ＦＨＡ
欠損３９０−１０１株は１９９１年３月６日にＡＴＣＣ
に寄託されている（寄託番号５５１５７）。
【００２８】実施例３ 本実施例は、ＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド
遺伝子の構築及び百日咳菌への導入を示す。約５００ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ部位で始まるＴＯＸプロモーター領域を
有し、プラスミドｐＢＲ３２２をベースとしたプラスミ
ドＳ−３８３８−９が構築された。この配列（プロモー
ター領域）は−１７０ｂｐの位置に対Ｂｖｇ応答領域を
含む。ＴＯＸプロモーターを含む４６０ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ／ＮｃｏＩ断片は、−１００ｂｐの位置にあるＮｃｏ
Ｉ／ＳｐｈＩオリゴヌクレオチドを介してＦＨＡ構造遺
伝子と転結された（図４参照）。ＦＨＡ構造遺伝子の残
りの部分（ＳｐｈＩ部位からＥｃｏＲＩ部位まで）を組
み込むことによってＦＨＡ構造遺伝子を完全なものとし
た。ＦＨＡオペロンの２．５ｋｂｐのＢｇｌＩＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ ５’側非翻訳領域（図４の５’ＦＨＡ）及び
１．７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ ３’側非翻訳領
域（図４の３’ＦＨＡ）がハイブリッドオペロンのＦＨ
Ａ遺伝子座への導入に利用された。ＦＨＡ遺伝子座の正
しい位置にＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッドオ
ペロンが導入されたかどうかは、図９に示すように、制
限酵素地図の作成およびサザーンブロット分析によって
確認した。
遺伝子の構築及び百日咳菌への導入を示す。約５００ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ部位で始まるＴＯＸプロモーター領域を
有し、プラスミドｐＢＲ３２２をベースとしたプラスミ
ドＳ−３８３８−９が構築された。この配列（プロモー
ター領域）は−１７０ｂｐの位置に対Ｂｖｇ応答領域を
含む。ＴＯＸプロモーターを含む４６０ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ／ＮｃｏＩ断片は、−１００ｂｐの位置にあるＮｃｏ
Ｉ／ＳｐｈＩオリゴヌクレオチドを介してＦＨＡ構造遺
伝子と転結された（図４参照）。ＦＨＡ構造遺伝子の残
りの部分（ＳｐｈＩ部位からＥｃｏＲＩ部位まで）を組
み込むことによってＦＨＡ構造遺伝子を完全なものとし
た。ＦＨＡオペロンの２．５ｋｂｐのＢｇｌＩＩ／Ｅｃ
ｏＲＩ ５’側非翻訳領域（図４の５’ＦＨＡ）及び
１．７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ ３’側非翻訳領
域（図４の３’ＦＨＡ）がハイブリッドオペロンのＦＨ
Ａ遺伝子座への導入に利用された。ＦＨＡ遺伝子座の正
しい位置にＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッドオ
ペロンが導入されたかどうかは、図９に示すように、制
限酵素地図の作成およびサザーンブロット分析によって
確認した。
【００２９】ＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド
オペロンが染色体に導入された百日咳菌８９０−４９株
は、大幅に低減されたレベルでＦＨＡを生産した（図５
Ａ及び５Ｂ参照）。
オペロンが染色体に導入された百日咳菌８９０−４９株
は、大幅に低減されたレベルでＦＨＡを生産した（図５
Ａ及び５Ｂ参照）。
【００３０】実施例４ 本実施例は、ＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド
遺伝子の構築及び百日咳菌への導入を示す。ＰＲＮ遺伝
子の非翻訳領域に挟まれた位置に、ペルタクチン構造遺
伝子のシグナル配列の開始コドンが融合したＦＨＡプロ
モーターを含み、プラスミドｐＵＣをベースとするプラ
スミドＳ−３９８２−７を構築した。ＦＨＡプロモータ
ーは約２４０ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｆＩ断片に含ま
れている。この断片は、９３ｂｐのＨｉｎｆＩ／Ｎｃｏ
Ｉオリゴヌクレオチドを介してＰＲＮ構造遺伝子と融合
している（図６参照）。ＮｃｏＩ部位で始まるＰＲＮ構
造遺伝子の残りの部分が組み込まれることでハイブリッ
ド遺伝子が完成された。ＰＲＮ遣伝子の１．６ｋｂｐの
Ｓａｕ３ＡＩ／ＥｃｏＲＩ ５’側非翻訳領域（図６の
５’ＰＲＮ）及び８ｋｂｐのＡｐａＩ／Ｓａｕ３ＡＩ
３’側非翻訳領域（図６の３’ＰＲＮ）がハイブリッド
遺伝子のＰＲＮ遺伝子座への導入に利用された。ＦＨＡ
プロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子が百日咳菌Ｐ
ＲＮ欠損１０９０−１０８−３株のＰＲＮ遺伝子座に正
しく導入されたかどうかは、図１０に示すように、制限
酵素地図の作成およびサザーンブロット分析によって確
認した。
遺伝子の構築及び百日咳菌への導入を示す。ＰＲＮ遺伝
子の非翻訳領域に挟まれた位置に、ペルタクチン構造遺
伝子のシグナル配列の開始コドンが融合したＦＨＡプロ
モーターを含み、プラスミドｐＵＣをベースとするプラ
スミドＳ−３９８２−７を構築した。ＦＨＡプロモータ
ーは約２４０ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｆＩ断片に含ま
れている。この断片は、９３ｂｐのＨｉｎｆＩ／Ｎｃｏ
Ｉオリゴヌクレオチドを介してＰＲＮ構造遺伝子と融合
している（図６参照）。ＮｃｏＩ部位で始まるＰＲＮ構
造遺伝子の残りの部分が組み込まれることでハイブリッ
ド遺伝子が完成された。ＰＲＮ遣伝子の１．６ｋｂｐの
Ｓａｕ３ＡＩ／ＥｃｏＲＩ ５’側非翻訳領域（図６の
５’ＰＲＮ）及び８ｋｂｐのＡｐａＩ／Ｓａｕ３ＡＩ
３’側非翻訳領域（図６の３’ＰＲＮ）がハイブリッド
遺伝子のＰＲＮ遺伝子座への導入に利用された。ＦＨＡ
プロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子が百日咳菌Ｐ
ＲＮ欠損１０９０−１０８−３株のＰＲＮ遺伝子座に正
しく導入されたかどうかは、図１０に示すように、制限
酵素地図の作成およびサザーンブロット分析によって確
認した。
【００３１】この操作で得られたＦＨＡプロモーター／
ＰＲＮハイブリッド遺伝子を有する１２９０−４株にお
けるペルタクチン外膜蛋白質の生産量は増加した（図７
Ａ及び７Ｂ参照）。１０９０−１０８−３株及び１２９
０−４株は１９９１年３月６日にＡＴＣＣに寄託された
（前者の寄託番号；５５１５６、後者の寄託番号５５１
５５）。
ＰＲＮハイブリッド遺伝子を有する１２９０−４株にお
けるペルタクチン外膜蛋白質の生産量は増加した（図７
Ａ及び７Ｂ参照）。１０９０−１０８−３株及び１２９
０−４株は１９９１年３月６日にＡＴＣＣに寄託された
（前者の寄託番号；５５１５６、後者の寄託番号５５１
５５）。
【００３２】実施例５ 本実施例は、ハイブリッドオペロンを含む百日咳菌の調
製及びその構造の分析を示す。
製及びその構造の分析を示す。
【００３３】Ｚｅａｌｅｙらの方法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，８，１０２５［１９９０］）を用いて、
コンノートワクチン用百日咳菌１０５３６株（Ｃｏｎｎ
ａｕｇｈｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎ １０５３
６）とプラスミド中の所望の遺伝子の非翻訳領域との間
に起こる相同組換えを利用して、百日咳菌ＴＯＸ欠損２
９−８株、ＦＨＡ欠損３９０−１０１株及びＰＲＮ欠損
１０９０−１０８−３株が形成された。遺伝子の欠損あ
るいは置換に利用された非翻訳領域は実施例１〜４に示
されたとおりである。非翻訳領域に挟まれた領域内に組
込んだテトラサイクリン耐性遺伝子を含む単位が遺伝子
座の構造遺伝子が削除された位置に該構造遺伝子の代り
に挿入された。
ｎｏｌｏｇｙ，８，１０２５［１９９０］）を用いて、
コンノートワクチン用百日咳菌１０５３６株（Ｃｏｎｎ
ａｕｇｈｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎ １０５３
６）とプラスミド中の所望の遺伝子の非翻訳領域との間
に起こる相同組換えを利用して、百日咳菌ＴＯＸ欠損２
９−８株、ＦＨＡ欠損３９０−１０１株及びＰＲＮ欠損
１０９０−１０８−３株が形成された。遺伝子の欠損あ
るいは置換に利用された非翻訳領域は実施例１〜４に示
されたとおりである。非翻訳領域に挟まれた領域内に組
込んだテトラサイクリン耐性遺伝子を含む単位が遺伝子
座の構造遺伝子が削除された位置に該構造遺伝子の代り
に挿入された。
【００３４】続いて行われる欠損株へのハイブリッド遺
伝子の導入の際の対立遺伝子の置換の過程において、こ
の単位はハイブリッド遺伝子と置換された。
伝子の導入の際の対立遺伝子の置換の過程において、こ
の単位はハイブリッド遺伝子と置換された。
【００３５】ハイブリッド遺伝子の所定の位置への導入
が正しく行われたかどうかは、組換え株（形質転換株）
から精製した染色体ＤＮＡを制限酵素で消化し、得られ
た消化物をサザーンブロット分析法によって分析するこ
とで確認した。
が正しく行われたかどうかは、組換え株（形質転換株）
から精製した染色体ＤＮＡを制限酵素で消化し、得られ
た消化物をサザーンブロット分析法によって分析するこ
とで確認した。
【００３６】実施例６ 本実施例は、百日咳菌３９０−５９株のサザーンブロッ
トの調製を示す（図８参照）。
トの調製を示す（図８参照）。
【００３７】野生型（ＷＴ）百日咳菌１０５３６株及び
百日咳菌３９０−５９株から染色体ＤＮＡを単離し、そ
れぞれについて、制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化
した消化物と、制限酵素ＢｇｌＩＩ単独で消化した消化
物とを調製し、これらを展開した。すなわち、図８
（Ｃ）に示すように、レーン１に１０５３６株の染色体
ＤＮＡのＫｐｎＩ／ＳｍａＩ消化物を、レーン２に１０
５３６株の染色体ＤＮＡのＢｇｌＩＩ消化物を、レーン
３に３９０−５９株の染色体ＤＮＡのＫｐｎＩ／Ｓｍａ
Ｉ消化物を、レーン４に３９０−５９株の染色体ＤＮＡ
のＢｇｌＩＩ消化物をそれぞれ展開した。展開されたサ
ンプルをフィルターに転写し、４．７ｋｂｐの全ＴＯＸ
をコードする配列を有するＥｃｏＲＩ断片をプローブと
して分析した。
百日咳菌３９０−５９株から染色体ＤＮＡを単離し、そ
れぞれについて、制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化
した消化物と、制限酵素ＢｇｌＩＩ単独で消化した消化
物とを調製し、これらを展開した。すなわち、図８
（Ｃ）に示すように、レーン１に１０５３６株の染色体
ＤＮＡのＫｐｎＩ／ＳｍａＩ消化物を、レーン２に１０
５３６株の染色体ＤＮＡのＢｇｌＩＩ消化物を、レーン
３に３９０−５９株の染色体ＤＮＡのＫｐｎＩ／Ｓｍａ
Ｉ消化物を、レーン４に３９０−５９株の染色体ＤＮＡ
のＢｇｌＩＩ消化物をそれぞれ展開した。展開されたサ
ンプルをフィルターに転写し、４．７ｋｂｐの全ＴＯＸ
をコードする配列を有するＥｃｏＲＩ断片をプローブと
して分析した。
【００３８】染色体におけるＴＯＸプロモーターのＦＨ
Ａプロモーターでの置換は、図８（Ａ）に矢印で示され
ているＫｐｎＩ部位の消失を起こす（図８（Ｂ）参
照）。なお、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩでの消化によって、
１０５３６株の染色体ＤＮＡからは３．０、１．６及び
１．５ｋｂｐの、また、３９０−５９株の染色体ＤＮＡ
からは４．８及び５．１ｋｂｐのＴＯＸに特異的なハイ
ブリダイゼーションを起こす断片が生じた。
Ａプロモーターでの置換は、図８（Ａ）に矢印で示され
ているＫｐｎＩ部位の消失を起こす（図８（Ｂ）参
照）。なお、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩでの消化によって、
１０５３６株の染色体ＤＮＡからは３．０、１．６及び
１．５ｋｂｐの、また、３９０−５９株の染色体ＤＮＡ
からは４．８及び５．１ｋｂｐのＴＯＸに特異的なハイ
ブリダイゼーションを起こす断片が生じた。
【００３９】実施例７ 本実施例は、百日咳菌８９０−４９株のサザーンブロッ
トを示す（図９）。野生型（ＷＴ）百日咳菌１０５３６
株及び百日咳菌８９０−４９株から染色体ＤＮＡを単離
し、それぞれについて、制限酵素ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩ
Ｉで消化した消化物と、制限酵素ＢａｍＨＩ単独で消化
した消化物とを調製し、これらを展開した。すなわち、
図９（Ｃ）に示すように、レーン１に１０５３６株の染
色体ＤＮＡのＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩ消化物を、レーン２
に１０５３６株の染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物を、
レーン３に８９０−４９株の染色体ＤＮＡのＫｐｎＩ／
ＢｇｌＩＩ消化物を、レーン４に８９０−４９株の染色
体ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物をそれぞれ展開した。展開
されたサンプルをフィルターに転写し、ＦＨＡに特異的
なプローブを用いて分析を行った。
トを示す（図９）。野生型（ＷＴ）百日咳菌１０５３６
株及び百日咳菌８９０−４９株から染色体ＤＮＡを単離
し、それぞれについて、制限酵素ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩ
Ｉで消化した消化物と、制限酵素ＢａｍＨＩ単独で消化
した消化物とを調製し、これらを展開した。すなわち、
図９（Ｃ）に示すように、レーン１に１０５３６株の染
色体ＤＮＡのＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩ消化物を、レーン２
に１０５３６株の染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物を、
レーン３に８９０−４９株の染色体ＤＮＡのＫｐｎＩ／
ＢｇｌＩＩ消化物を、レーン４に８９０−４９株の染色
体ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物をそれぞれ展開した。展開
されたサンプルをフィルターに転写し、ＦＨＡに特異的
なプローブを用いて分析を行った。
【００４０】染色体におけるＦＨＡプロモーターのＴＯ
Ｘプロモーターでの置換は、図９（Ａ）および（Ｂ）に
示されているように、ＫｐｎＩ部位の導入を起こす。な
お、ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩでの消化によって、１０５
３６株の染色体ＤＮＡからは９ｋｂｐの、また、８９０
−４９株の染色体ＤＮＡからは６ｋｂｐのＦＨＡに特異
的なハイブリダイゼーションを起こす断片が生じた。
Ｘプロモーターでの置換は、図９（Ａ）および（Ｂ）に
示されているように、ＫｐｎＩ部位の導入を起こす。な
お、ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩでの消化によって、１０５
３６株の染色体ＤＮＡからは９ｋｂｐの、また、８９０
−４９株の染色体ＤＮＡからは６ｋｂｐのＦＨＡに特異
的なハイブリダイゼーションを起こす断片が生じた。
【００４１】実施例８ 本実施例は、百日咳菌１２９０−４株のサザーンブロッ
トの調製を示す（図１０参照）。
トの調製を示す（図１０参照）。
【００４２】野生型（ＷＴ）百日咳菌１０５３６株及び
百日咳菌１２９０−４株から染色体ＤＮＡを単離し、そ
れぞれについて、制限酵素ＡｐａＩで消化した消化物
と、制限酵素ＳａｌＩで消化した消化物とを調製し、こ
れらを展開した。すなわち、図１０（Ｃ）に示されるよ
うに、レーン１に１０５３６株の染色体ＤＮＡのＡｐａ
Ｉ消化物を、レーン２に１０５３６株の染色体ＤＮＡの
ＳａｌＩ消化物を、レーン３に１２９０−４株の染色体
ＤＮＡのＡｐａＩ消化物を、レーン４に１２９０−４株
の染色体ＤＮＡのＳａｌＩ消化物をそれぞれ展開した。
展開されたサンプルをフィルターに転写し、ＰＲＮに特
異的なプローブを用いて分析を行った。
百日咳菌１２９０−４株から染色体ＤＮＡを単離し、そ
れぞれについて、制限酵素ＡｐａＩで消化した消化物
と、制限酵素ＳａｌＩで消化した消化物とを調製し、こ
れらを展開した。すなわち、図１０（Ｃ）に示されるよ
うに、レーン１に１０５３６株の染色体ＤＮＡのＡｐａ
Ｉ消化物を、レーン２に１０５３６株の染色体ＤＮＡの
ＳａｌＩ消化物を、レーン３に１２９０−４株の染色体
ＤＮＡのＡｐａＩ消化物を、レーン４に１２９０−４株
の染色体ＤＮＡのＳａｌＩ消化物をそれぞれ展開した。
展開されたサンプルをフィルターに転写し、ＰＲＮに特
異的なプローブを用いて分析を行った。
【００４３】染色体におけるＰＲＮプロモーターのＦＨ
Ａプロモーターでの置換は、図１０Ａ）および（Ｂ）に
示されているように、ＡｐａＩ部位の導入を起こす。な
お、ＡｐａＩでの消化によって、１０５３６株の染色体
ＤＮＡからは４．４ｋｂｐの、また、１２９０−４株の
染色体ＤＮＡからは２．５ｋｂｐのＰＲＮに特異的なハ
イブリダイゼーションを起こす断片が生じた。
Ａプロモーターでの置換は、図１０Ａ）および（Ｂ）に
示されているように、ＡｐａＩ部位の導入を起こす。な
お、ＡｐａＩでの消化によって、１０５３６株の染色体
ＤＮＡからは４．４ｋｂｐの、また、１２９０−４株の
染色体ＤＮＡからは２．５ｋｂｐのＰＲＮに特異的なハ
イブリダイゼーションを起こす断片が生じた。
【００４４】実施例９ 本実施例は、各種百日咳菌株の培養と、免疫学的測定法
（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）による各種抗原の定量を示
す。
（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）による各種抗原の定量を示
す。
【００４５】各種百日咳菌株を、０．２％ヘプタキス
（２，６−ｏ−ジメチル）β−シクロデキストリン（Ｉ
ｍａｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆａｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．，４１，１１３８［１９８３］）を含む変法スタ
イナー−ショルテ培地（Ｓｔａｉｎｅｒ−ｓｃｈｏｌｔ
ｅ ｍｅｄｉｕｍ）を用い、１０リットルのｐＨ及び溶
存酸素の制御が行われるＣｈｅｍＡｐファーメンター
で、もしくは１０ｍｌの容量で培養した。培養上清を抗
原の特異性を利用するＥＬＩＳＡ法で分析して、抗原生
産性が試験された。ＰＴはＬｏｏｓｍｏｒｅらの記述
（Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．，５８，３６５
３［１９９０］）に従ってフェツイン補足ＥＬＩＳＡ
（ｆｅｔｕｉｎ−ｃａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡ）によっ
て測定された。ＦＨＡは、腹水から精製したマウスモノ
クローナル抗ＦＨＡ抗体によって補足し、２次標識抗体
としてワサビペルオキシダーゼに結合させたポリクロー
ナルウサギＩｇＧ抗ＦＨＡ抗体を用いるＥＬＩＳＡによ
って分析した。ペルタクチンは、非特異性モルモット過
免疫血清から精製したポリクロナール抗体によって捕獲
し、２次標識抗体としてワサビペルオキシダーゼに結合
させたモルモットＩｇＧ抗ペルタクチン（６９ｋＤａ）
抗体を用いるＥＬＩＳＡによって測定した。野生型１０
５３６株の培養における培養液から精製したＰＴ、ＦＨ
Ａ及びペルタクチン（６９ｋＤａ）の各蛋白質を標準と
して使用した。
（２，６−ｏ−ジメチル）β−シクロデキストリン（Ｉ
ｍａｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆａｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．，４１，１１３８［１９８３］）を含む変法スタ
イナー−ショルテ培地（Ｓｔａｉｎｅｒ−ｓｃｈｏｌｔ
ｅ ｍｅｄｉｕｍ）を用い、１０リットルのｐＨ及び溶
存酸素の制御が行われるＣｈｅｍＡｐファーメンター
で、もしくは１０ｍｌの容量で培養した。培養上清を抗
原の特異性を利用するＥＬＩＳＡ法で分析して、抗原生
産性が試験された。ＰＴはＬｏｏｓｍｏｒｅらの記述
（Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．，５８，３６５
３［１９９０］）に従ってフェツイン補足ＥＬＩＳＡ
（ｆｅｔｕｉｎ−ｃａｐｔｕｒｅ ＥＬＩＳＡ）によっ
て測定された。ＦＨＡは、腹水から精製したマウスモノ
クローナル抗ＦＨＡ抗体によって補足し、２次標識抗体
としてワサビペルオキシダーゼに結合させたポリクロー
ナルウサギＩｇＧ抗ＦＨＡ抗体を用いるＥＬＩＳＡによ
って分析した。ペルタクチンは、非特異性モルモット過
免疫血清から精製したポリクロナール抗体によって捕獲
し、２次標識抗体としてワサビペルオキシダーゼに結合
させたモルモットＩｇＧ抗ペルタクチン（６９ｋＤａ）
抗体を用いるＥＬＩＳＡによって測定した。野生型１０
５３６株の培養における培養液から精製したＰＴ、ＦＨ
Ａ及びペルタクチン（６９ｋＤａ）の各蛋白質を標準と
して使用した。
【００４６】以上の開示内容を総括すると、本発明は、
特にボルデテラ属細菌に対し実用性のある新規な遺伝子
産物発現方法を提供するものである。本発明の範囲にお
いて変更、修正は可能である。
特にボルデテラ属細菌に対し実用性のある新規な遺伝子
産物発現方法を提供するものである。本発明の範囲にお
いて変更、修正は可能である。
【図１】（Ａ）はＦＨＡプロモーターとＴＯＸ構造遺伝
子の連結に用いたＤＮＡ単位の配列を示し、矢印はＳ１
遺伝子のＡＴＧ開始コドンを示す。（Ｂ）は百日咳菌Ｔ
ＯＸ欠損株への導入に利用されたＴＯＸ遺伝子の非翻訳
領域に挟まれたハイブリッドオペロンを有するプラスミ
ドＳ−３６８０−１０の構造を示す図である。
子の連結に用いたＤＮＡ単位の配列を示し、矢印はＳ１
遺伝子のＡＴＧ開始コドンを示す。（Ｂ）は百日咳菌Ｔ
ＯＸ欠損株への導入に利用されたＴＯＸ遺伝子の非翻訳
領域に挟まれたハイブリッドオペロンを有するプラスミ
ドＳ−３６８０−１０の構造を示す図である。
【図２】百日咳菌ＦＨＡ欠損株への導入に利用されたＦ
ＨＡ遺伝子の非翻訳領域に挟まれたＦＨＡプロモーター
／ＴＯＸハイブリッドオペロンを有するプラスミドＳ−
３７４９−１８の構造を示す図である。
ＨＡ遺伝子の非翻訳領域に挟まれたＦＨＡプロモーター
／ＴＯＸハイブリッドオペロンを有するプラスミドＳ−
３７４９−１８の構造を示す図である。
【図３】（Ａ）は百日咳菌１０５３６株におけるＰＴの
生産速度及び発現レベルを示すグラフである。（Ｂ）は
ＴＯＸ遺伝子座にＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリ
ッドオペロンを有する百日咳菌３９０−５９株における
ＰＴの生産速度及び発現レベルを示すグラフである。
（Ｃ）はＦＨＡ遺伝子座にＦＨＡプロモーター／ＴＯＸ
ハイブリッドオペロンを、更にＴＯＸ遺伝子座に固有の
ＴＯＸオペロンを有する百日咳菌５９０−１１株におけ
るＰＴの生産速度及び発現レベルを示すグラフである。
生産速度及び発現レベルを示すグラフである。（Ｂ）は
ＴＯＸ遺伝子座にＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリ
ッドオペロンを有する百日咳菌３９０−５９株における
ＰＴの生産速度及び発現レベルを示すグラフである。
（Ｃ）はＦＨＡ遺伝子座にＦＨＡプロモーター／ＴＯＸ
ハイブリッドオペロンを、更にＴＯＸ遺伝子座に固有の
ＴＯＸオペロンを有する百日咳菌５９０−１１株におけ
るＰＴの生産速度及び発現レベルを示すグラフである。
【図４】（Ａ）はＴＯＸプロモーターとＦＨＡ構造遺伝
子の連結に用いたＤＮＡ単位の配列を示し、矢印はＦＨ
Ａ構造遺伝子のＡＴＧコドンを示す。（Ｂ）は百日咳菌
ＦＨＡ欠損株のＦＨＡ遺伝子座への導入に利用されたＦ
ＨＡ遺伝子の非翻訳領域に挟まれたハイブリッドオペロ
ンを有するプラスミドＳ−３８３８−９の構造を示す図
である。
子の連結に用いたＤＮＡ単位の配列を示し、矢印はＦＨ
Ａ構造遺伝子のＡＴＧコドンを示す。（Ｂ）は百日咳菌
ＦＨＡ欠損株のＦＨＡ遺伝子座への導入に利用されたＦ
ＨＡ遺伝子の非翻訳領域に挟まれたハイブリッドオペロ
ンを有するプラスミドＳ−３８３８−９の構造を示す図
である。
【図５】（Ａ）は百日咳菌１０５３６株におけるＦＨＡ
の生産速度及び発現レベルを示すグラフである。（Ｂ）
はＦＨＡ遺伝子座にＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブ
リッド遺伝子を有する百日咳菌８９０−４９株における
ＦＨＡの生産速度及び発現レベルを示すグラフである。
の生産速度及び発現レベルを示すグラフである。（Ｂ）
はＦＨＡ遺伝子座にＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブ
リッド遺伝子を有する百日咳菌８９０−４９株における
ＦＨＡの生産速度及び発現レベルを示すグラフである。
【図６】（Ａ）はＦＨＡプロモーターとペルタクチン構
造遺伝子の連結に用いたＤＮＡ単位の配列を示し、矢印
はペルタクチン構造遺伝子のＡＴＧコドンを示す。
（Ｂ）は百日咳菌ＰＲＮ欠損株のペルタクチン遺伝子座
への導入に利用されたペルタクチン遺伝子の非翻訳領域
に挟まれたハイブリッド遺伝子を有するプラスミドＳ−
３９８２−７の構造を示す図である。
造遺伝子の連結に用いたＤＮＡ単位の配列を示し、矢印
はペルタクチン構造遺伝子のＡＴＧコドンを示す。
（Ｂ）は百日咳菌ＰＲＮ欠損株のペルタクチン遺伝子座
への導入に利用されたペルタクチン遺伝子の非翻訳領域
に挟まれたハイブリッド遺伝子を有するプラスミドＳ−
３９８２−７の構造を示す図である。
【図７】（Ａ）は百日咳菌１０５３６株におけるペルタ
クチン（６９ｋＤａ）の生産速度及び発現レベルを示す
グラフである。（Ｂ）はＰＲＮ遺伝子座にＦＨＡプロモ
ーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子を有する百日咳菌１
２９０−４株におけるペルタクチンの生産速度及び発現
レベルを示すグラフである。
クチン（６９ｋＤａ）の生産速度及び発現レベルを示す
グラフである。（Ｂ）はＰＲＮ遺伝子座にＦＨＡプロモ
ーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子を有する百日咳菌１
２９０−４株におけるペルタクチンの生産速度及び発現
レベルを示すグラフである。
【図８】（Ａ）は百日咳菌１０５３６株の有する野生型
ＴＯＸオペロン（ＷＴ ＴＯＸ）の制限酵素地図であ
る。（Ｂ）は百日咳菌３９０−５９株のＴＯＸ遺伝子座
に導入されたＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド
オペロンの制限酵素地図である。（Ｃ）は１０５３６株
及び３９０−５９株の染色体ＤＮＡの消化物のサザーン
ブロットの結果を示す図であり、ハイブリッドオペロン
が所定の位置に導入されていることを示す。
ＴＯＸオペロン（ＷＴ ＴＯＸ）の制限酵素地図であ
る。（Ｂ）は百日咳菌３９０−５９株のＴＯＸ遺伝子座
に導入されたＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド
オペロンの制限酵素地図である。（Ｃ）は１０５３６株
及び３９０−５９株の染色体ＤＮＡの消化物のサザーン
ブロットの結果を示す図であり、ハイブリッドオペロン
が所定の位置に導入されていることを示す。
【図９】（Ａ）は百日咳菌１０５３６株の有する野生型
ＦＨＡオペロン（ＷＴ ＦＨＡ）の制限酵素地図であ
る。（Ｂ）は百日咳菌８９０−４９株のＦＨＡ遺伝子座
に導入されたＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド
オペロンの制限酵素地図である。（Ｃ）は１０５３６株
及び８９０−４９株の染色体ＤＮＡの消化物のサザーン
ブロットの結果を示す図であり、ハイブリッドオペロン
が所定の位置に導入されていることを示す。
ＦＨＡオペロン（ＷＴ ＦＨＡ）の制限酵素地図であ
る。（Ｂ）は百日咳菌８９０−４９株のＦＨＡ遺伝子座
に導入されたＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド
オペロンの制限酵素地図である。（Ｃ）は１０５３６株
及び８９０−４９株の染色体ＤＮＡの消化物のサザーン
ブロットの結果を示す図であり、ハイブリッドオペロン
が所定の位置に導入されていることを示す。
【図１０】（Ａ）は百日咳菌１０５３６株の有するＰＲ
Ｎ遺伝子（ＰＲＮ）の制限酵素地図である。（Ｂ）は百
日咳菌１２９０−４株のＰＲＮ遺伝子座に導入されたＦ
ＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子の制限酵
素地図である。（Ｃ）は１０５３６株及び１２９０−４
株の染色体ＤＮＡの消化物のサザーンブロットの結果を
示す図であり、ハイブリッドオペロンが所定の位置に導
入されていることを示す。
Ｎ遺伝子（ＰＲＮ）の制限酵素地図である。（Ｂ）は百
日咳菌１２９０−４株のＰＲＮ遺伝子座に導入されたＦ
ＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子の制限酵
素地図である。（Ｃ）は１０５３６株及び１２９０−４
株の染色体ＤＮＡの消化物のサザーンブロットの結果を
示す図であり、ハイブリッドオペロンが所定の位置に導
入されていることを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/31 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ゲヴィン ズィーレイ カナダ国 エル４ケイ １ジー８ オン タリオ州 コンコード ベイ ヒル ド ライヴ 49 (72)発明者 レザ カイヤーム ヤコブ カナダ国 エル５エイ ２エス１ オン タリオ州 ミスィサウガ オールド フ ィーザント ロード 2354 (72)発明者 マイケル クライン カナダ国 エム５エイ ３エム２ オン タリオ州 ウィロウダール マンロー ブールヴァード 16 (56)参考文献 国際公開90／4641（ＷＯ，Ａ１) 欧州公開336413（ＥＰ，Ａ２) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，166 （1986）Ｐ．194−204 Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，107 （1988）Ｐ．420ａ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，83（1986）Ｐ．4631 〜4635 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，86（1989）Ｐ．2637 〜2641，Ｐ．3554−3558 Ｓｃｉｅｎｃｅ，1989［27］Ｐ．497 −500 Ｇｅｎｅ，1984［29］Ｐ．231〜241
Claims (7)
- 【請求項１】 百日咳菌に固有でかつ自己由来の百日咳
プロモーターにＡＴＧ開始コドンで融合した百日咳構造
遺伝子を有するハイブリッド百日咳遺伝子がゲノムに統
合されており、 該ハイブリッド百日咳遺伝子が、 （ａ）ＦＨＡオペロンのプロモーターとＰＲＮ遺伝子の
ＰＲＮ構造遺伝子を融合したＦＨＡプロモーター／ＰＲ
Ｎハイブリッド遺伝子、 （ｂ）ＦＨＡオペロンのプロモーターとＴＯＸオペロン
のＴＯＸ構造遺伝子を融合したＦＨＡプロモーター／Ｔ
ＯＸハイブリッド遺伝子または （ｃ）ＴＯＸオペロンのプロモーターとＦＨＡオペロン
のＦＨＡ構造遺伝子を融合したＴＯＸプロモーター／Ｆ
ＨＡハイブリッド遺伝子のいずれかの組合せを有するこ
とを特徴とする百日咳菌株。 - 【請求項２】 百日咳菌のＰＲＮ -株をＦＨＡプロモー
ター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子で形質転換したＡＴＣ
Ｃに寄託番号５５１５５で寄託されている百日咳菌１２
９０−４株；百日咳菌のＴＯＸ -株をＦＨＡプロモータ
ー／ＴＯＸハイブリッド遺伝子で形質転換した百日咳菌
３９０−５９株；百日咳菌のＦＨＡ -株をＦＨＡプロモ
ーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子で形質転換した百日
咳菌５９０−１１株；または百日咳菌のＦＨＡ -株をＴ
ＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド遺伝子で形質転
換した百日咳菌８９０−４９株。 - 【請求項３】 制限酵素地図が 【化１】 であるＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子
及びＴＯＸ非翻訳領域を有するプラスミドＳ−３６８０
−１０； 制限酵素地図が 【化２】 であるＦＨＡプロモーター／ＴＯＸハイブリッド遺伝子
及びＦＨＡ非翻訳領域を有するプラスミドＳ−３７４９
−１８； 制限酵素地図が 【化３】 であるＴＯＸプロモーター／ＦＨＡハイブリッド遺伝子
及びＦＨＡ非翻訳領域を有するプラスミドＳ−３８３８
−９；または制限酵素地図が 【化４】 であるＦＨＡプロモーター／ＰＲＮハイブリッド遺伝子
及びＰＲＮ非翻訳領域を有するプラスミドＳ−３９８２
−７。 - 【請求項４】 百日咳菌の形質転換株から遺伝子産物を
発現させる方法において、 イ）百日咳菌に固有でかつ自己由来の百日咳プロモータ
ーと、該プロモーターにＡＴＧ開始コドンで融合した百
日咳構造遺伝子と、を有するハイブリッド百日咳遺伝子
であって、 （ａ）ＦＨＡオペロンのプロモーターとＰＲＮ遺伝子の
ＰＲＮ構造遺伝子を融合したＦＨＡプロモーター／ＰＲ
Ｎハイブリッド遺伝子、 （ｂ）ＦＨＡオペロンのプロモーターとＴＯＸオペロン
のＴＯＸ構造遺伝子を融合したＦＨＡプロモーター／Ｔ
ＯＸハイブリッド遺伝子または （ｃ）ＴＯＸオペロンのプロモーターとＦＨＡオペロン
のＦＨＡ構造遺伝子を融合したＴＯＸプロモーター／Ｆ
ＨＡハイブリッド遺伝子のいずれかの組合せを有するハ
イブリッド百日咳遺伝子で百日咳菌を、該ハイブリッド
百日咳遺伝子を該百日咳菌のゲノムに統合することによ
って形質転換することで、前記百日咳構造遺伝子と該百
日咳構造遺伝子のＡＧＴ開始コドンに融合した該百日咳
構造遺伝子自身に固有のプロモーターとを有する同種遺
伝子を持つ百日咳菌と比較した場合にこれに対して変化
した百日咳抗原の収量を与える形質転換体を得る過程
と、 ロ）前記イ）で得られた形質転換体を培養して、該形質
転換体の遺伝子産物として百日咳抗原を発現させる過程
と、 を有することを特徴とする遺伝子産物を発現させる方
法。 - 【請求項５】 前記遺伝子産物の発現が、前記百日咳菌
が、前記百日咳構造遺伝子と該百日咳構造遺伝のＡＴＧ
開始コドンに融合した該百日咳構造遺伝子自身に固有の
プロモータとを有する同種遺伝子を持つ場合と異る生産
収量で行われる請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 相同組換えによって前記ハイブリッド百
日咳遺伝子を前記百日咳菌の染色体中の遺伝子座に統合
することで該百日咳菌の形質転換を行う請求項４または
５に記載の方法。 - 【請求項７】 前記形質転換体によって発現した百日咳
抗原をワクチン成分として用いるために精製する請求項
４〜６のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB909008746A GB9008746D0 (en) | 1990-04-18 | 1990-04-18 | The use of autologous promoters to express gene products in bordetella |
| GB9008746.1 | 1990-04-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0568556A JPH0568556A (ja) | 1993-03-23 |
| JP3004414B2 true JP3004414B2 (ja) | 2000-01-31 |
Family
ID=10674630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3228212A Expired - Lifetime JP3004414B2 (ja) | 1990-04-18 | 1991-04-18 | ボルデテラ属細菌での遺伝子産物の発現のための自己プロモーターの使用 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0453216B1 (ja) |
| JP (1) | JP3004414B2 (ja) |
| AT (1) | ATE195143T1 (ja) |
| CA (1) | CA2040548C (ja) |
| DE (1) | DE69132342T2 (ja) |
| DK (1) | DK0453216T3 (ja) |
| ES (1) | ES2150414T3 (ja) |
| GB (1) | GB9008746D0 (ja) |
| GR (1) | GR3034693T3 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9115332D0 (en) * | 1991-07-16 | 1991-08-28 | Connaught Lab | Manipulation of gene copy number in bordetella |
| FR2718750B1 (fr) * | 1994-04-19 | 1996-06-14 | Pasteur Institut | Protéines recombinantes de l'hémagglutinine filamenteuse de Bordetella, notamment, B. Pertussis, production et application à la production de protéines étrangères ou de principes actifs vaccinants. |
| US5932714A (en) * | 1995-02-23 | 1999-08-03 | Connaught Laboratories Limited | Expression of gene products from genetically manipulated strains of Bordetella |
| US5998168A (en) * | 1995-06-07 | 1999-12-07 | Connaught Laboratories Limited | Expression of gene products from genetically manipulated strains of bordetella |
| AU2002301780B2 (en) * | 1997-09-19 | 2007-02-08 | Institut Pasteur | Clostridium toxin and method for preparing immunogenic compositions |
| FR2768747B1 (fr) * | 1997-09-19 | 2000-12-01 | Pasteur Institut | Acides nucleiques, cellules recombinantes, et procede de preparation de compositions immunogenes |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8727489D0 (en) * | 1987-11-24 | 1987-12-23 | Connaught Lab | Detoxification of pertussis toxin |
| IT1224254B (it) * | 1988-04-08 | 1990-09-26 | Sclavo Spa | Sistema di regolazione positivo inducibile utile per la produzione di proteine eterologhe |
| US5000952A (en) * | 1988-08-02 | 1991-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford, Jr. University | Polypeptide pertussis toxin vaccine |
| CA1341123C (en) * | 1988-10-27 | 2000-10-17 | David A. Relman | Filamentous hemagglutinin of b. pertussis |
| IT1236971B (it) * | 1989-11-03 | 1993-05-07 | Eniricerche Spa | Regione promotore dei geni codificanti le subunita' piliniche fim2, fm3 e fimx di bordetella pertussis e loro impiego per l'espressione di geni che codificano una proteina di interesse. |
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