JP3107225B2 - Ｐａｃａｐに対する抗体およびその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はPACAPに結合特異性を有する点で有用かつ新
規な抗体に関する。更に詳しくは、抗原抗体反応に基づ
くPACAPの測定法の開発、あるいはPACAPが関与する疾患
の診断、治療に有用な抗体に関する。

脳の視床下部、下垂体から分泌されるホルモンには種
々のものが知られている。甲状腺刺激ホルモン放出ホル
モン（Thyrotropin releasing hormone）や黄体形成ホ
ルモン放出ホルモン（Leutenizing hormone releasing
hormone）、ソマトスタチン（Somatostatin）、副腎皮
質刺激ホルモン（Adrenocorticotropic hormone）、成
長ホルモン（Growth hormone）、プロラクチン（Prolac
tin）などがその例で、これらの作用については詳細な
研究がなされている。最近、これら以外の新しい視床下
部由来の生理活性物質が、アデニレート サイクラーゼ
アクティヴィティ（adenylate cyclase activity）を
指標にして探索され、その結果、ヒツジ視床下部より、
これまでには報告されていない、38個のアミノ酸残基か
らなるペプタイドが発見された。このペプタイドはPACA
P38NH₂と命名され、下記の構造を有する。

His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg
Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala
Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys
−NH₂ また、ヒツジ、ヒト両者のPACAP38NH₂の成熟部分のア
ミノ酸配列は同一、前駆体においてはアミノ酸の置換が
あることがヒツジPACAP38NH₂のcDNAの特許出願（特願平
１−155791号、同１−284771号）、およびヒトPACAP38N
H₂のcDNAの部分構造の特許出願（特願平１−259924号）
から明らかにされている。PACAP38NH₂のcDNAの配列中に
示される連続した塩基性アミノ酸の位置から、前駆体か
ら切り出されるペプチドとしてPACAP38NH₂の他にもPACA
P27NH₂が存在すると推測される。

事実、その後の研究から、羊視床下部よりPACAP38NH₂
以外にもPACAP27NH₂が単離された。構造を以下に示す。

PACAP27NH₂ 以下、PACAP38NH₂とPACAP27NH₂とを総称してPACAPと
表わす。

PACAP27NH₂を含むPACAP38NH₂のＮ端部の28アミノ酸残
基は脳腸管ペプタイドとして有名なバソアクティブ・イ
ンテスティナル・ポリペプチド（VIP:vasoactive inter
sinal polypeptide）と68％の相同性を示す。しかしな
がら、PACAPのアデニレートサイクラーゼ活性化能は、V
IPのそれを少なくとも1000倍を上まわると報告されてい
る。

このように、PACAPの作用はVIPと異なることが予想さ
れ、その生理的役割、病態との関連に深い関心が寄せら
れている。

上述したように、PACAPに対する関心が高まっている
にもかかわらず、これまで、PACAPの視床下部以外の存
在部位、血漿レベル等、基本的な生理的情報はほとんど
得られておらず、病態との関連も不明である。この主た
る原因として、これまでPACAPを特異的に認識するモノ
クローナル抗体が作製されておらず、さらにPACAPを特
異的かつ高感度に測定する免疫学的測定法が開発されて
いないことが挙げられる。これらの免疫学的手法は、PA
CAPの研究、特に代謝経路、分泌機構、リセプターシス
テム、病態との関連等に関する研究を総合的に行う上で
最も有効な手段の一つと考えられ、該手法の確立が各界
から切望されていた。

また、これまで、PACAPのような低分子ペプタイドの
測定には、通常１種類の抗体を用いる競合法のラジオイ
ムノアッセイ（RIA）あるいは、エンザイムイムノアッ
セイ（EIA、酵素免疫測定法）が開発され、用いられて
きた。一方、２種類の抗体を用いるサンドイッチ法によ
る免疫測定法は、競合法と比較し、（１）２種類の抗体
を用いるため、測定形の特異性が向上し、（２）被測定
物質に対し、大過剰の抗体を用いるため被特異的妨害因
子の影響を受けにくい等の利点を有している。しかしな
がら、これまで、PACAPのような、ジスルフィド結合を
有さない低分子量のペプタイドがサンドイッチ法により
高感度に測定されるかどうか、全く不明であった。即
ち、PACAPのようなジスルフィド結合を有さない低分子
の場合、２組の抗体の結合部位が互いに立体障害等、影
響を及ぼす程近傍であり、高感度なサンドイッチ法を設
定することが困難である可能性が考えられた。

発明の要旨 本発明者等は、PACAPに結合し、PACAPの部分ペプタイ
ドおよびVIPに対し異なる反応特異性を有するポリクロ
ーナルおよびモノクローナル抗体を作製し、該抗体を用
いてPACAPを高感度にかつ特異的に検出し、かつPACAP38
NH₂とPACAP27NH₂とを分別定量し得る免疫測定法を開発
した。

すなわち、本発明はPACAP、PACAP部分ペプタイド、PA
CAP前駆体、あるいはVIPに結合性を有するモノクローナ
ル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞、および該抗体を用いた競合法あるいはサンドイ
ッチ法によるPACAPの免疫測定法に関する。

図面の簡単な説明 第１図はマウス抗血清中のPACAP38NH₂に対する抗体価
を測定したグラフである。

第２図は家兎抗血清中のPACAP（11−27）NH₂に対する
抗体価を測定したグラフである。

第３図は本発明抗体を用いた競合法−酵素免疫測定法
によるPACAP38ならびに関連ペプタイドの測定結果を示
したグラフであり、本発明抗体の認識部位が明らかにさ
れたグラフである。

第４図、第５図および第６図は本発明抗体を用いたサ
ンドイッチ法−酵素免疫測定法によるPACAP38NH₂の検出
結果を示したグラフである。

第７図は本発明のサンドイッチ法−酵素免疫測定法に
おけるPACAPならびに関連ペプタイドの反応性をみたグ
ラフである。

第８、９、10および11図は本サンドイッチ法−酵素免
疫測定法におけるPACAP27NH₂ならびに関連ペプタイドの
反応性をみたグラフである。

第12図はPACAP38NH₂に対する抗PACAP抗体の中和能を
培養細胞を用いて調べた結果を示している。

第13図はヒト・プレプロ−PACAP cDNAを含有する発現
フラスミドで形質転換した大腸菌の生産物のイムノブロ
ット分析を示す図である。

好ましい実施態様 PACAPの部分ペプタイドとしては、PACAPの部分配列を
有するものであればどのようなペプタイドでもかまわな
いが、例えば、PACAPのＮ端部分に相当するペプタイ
ド、例えば、以下の配列を有するPACAP（１−13） あるいは、PACAPのＮ端部分から中央部分に相当するペ
プタイド、例えば PACAP（４−27） あるいは、PACAP38NH₂のＣ端部分から中央部分に相当す
るペプタイド、例えば、以下の配列を有するPACAP（14
−38） あるいは、PACAP38NH₂のＣ端部分に相当するペプタイ
ド、例えば、以下の配列を有するPACAP（31−38） あるいはPACAP27の中央部分からＣ端部分に相当するペ
プタイド、例えば、以下の配列を有するPACAP（11−2
7） 等が挙げられる。これらのペプタイドのうち、PACAP（3
1−38）およびPACAP（11−27）のＣ末端はアミド体であ
ることが好ましく、他のペプタイドのＣ末端は、アミド
体でも、遊離カルボン酸体でもかまわない。アミド体に
ついてはPACAP（31−38）NH₂のようにNH₂を付けて表わ
しており、また遊離カルボン酸体については何も付けな
いか、PACAP（31−38）OHのようにOHを付けて表わして
いる。

PACAP前駆体の例としては次の式で表わされるアミノ
酸もしくはその一部のアミノ酸からなるヒトPACAPの前
駆体が含まれる： 本発明者等はPACAPに対するモノクローナル抗体およ
びポリクローナル抗体を作製すべく種々研究の結果、大
きくは５つのクラスに分類される抗体を確立した。

クラスＩに分類される抗体は、PACAPのＮ端部分を認
識する、即ち、PACAP38NH₂、PACAP27NH₂、PACAP（１−1
3）、PACAP（４−27）と反応し、且つPACAP（14−38）N
H₂PACAP（31−38）NH₂とは反応しない。

クラスIIに分類される抗体は、PACAPのＮ端部分から
中央部分に至る領域と認識する、即ち、PACAP38、PACAP
27NH₂、PACAP（４−27）と反応し、且つPACAP（１−1
3）、PACAP（14−38）NH₂、PACAP（31−38）NH₂とは反
応しない。

クラスIIIに分類される抗体は、PACAP38NH₂のＣ端部
分から中央部分に至る領域と認識する、即ち、PACAP38N
H₂、PACAP（14−38）NH₂と反応し、且つPACAP27NH₂、PA
CAP（１−13）、PACAP（４−27）、PACAP（31−38）NH₂
とは反応しない。

クラスIVに分類される抗体は、PACAP38NH₂のＣ端部分
を認識する、即ち、PACAP38NH₂、PACAP（14−38）NH₂、
PACAP（31−38）NH₂と反応し、且つPACAP27NH₂、PACAP
（４−27）、PACAP（１−13）とは反応しない。

クラスＶに分類される抗体は、PACAP27NH₂のＣ端部分
を認識する、即ち、PACAP（11−27）NH₂に対する抗体で
ある。

クラスＩに属する抗体は、さらに、I aおよびI bに分
類される。即ち、I aは、VIPと0.5％以下の交差反応性
しか示さず、I bは、VIPと0.5％以上の交差反応性を示
す。

クラスIIの抗体の多くはVIPと0.5％以下の交差反応性
しか示さず、クラスIII、クラスIVおよびクラスＶの抗
体の多くは、VIPと0.01％以下の交差反応性しか示さな
い。

これらの抗体は、通常の組織染色あるいは競合法の免
疫測定法に用いることができる。さらに、本発明者ら
は、優れた免疫測定法を開発すべく種々研究の結果、こ
れらのモノクローナル抗体、あるいはポリクローナル抗
体２種類を組み合わせるサンドイッチ法による免疫測定
法を開発した。

本発明のサンドイッチ法によるPACAPの免疫測定法に
おいては、１次反応（固相用抗体と被検物質との反応）
および２次反応（標識化抗体と被検物質との反応）に用
いられる抗体は、それぞれポリクローナル抗体またはモ
ノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、その
一方がPACAP38NH₂のＮ端部分（クラスＩ）、Ｎ端部分か
ら中央部分に至る領域（クラスII）、Ｃ端部分から中央
部分に至る領域（クラスIII）、あるいはＣ端部分（ク
ラスIV）を認識する抗体であって、他方が、その抗体が
認識する領域以外を認識する抗体が用いられる。即ち、
本発明者らは、本発明のサンドイッチ法による免疫測定
法において、クラスＩとクラスIII、クラスIIとクラスI
V、クラスＩとクラスIVの抗体の組み合わせ、即ち、１
次配列上隣接しない抗体と組みあわせるサンドイッチ法
においてPACAP38NH₂が高感度に検出されることを見い出
した。さらに、本発明者らは、クラスＩとクラスII、ク
ラスIIとクラスIII、クラスIIIとクラスIVの抗体の組み
あわせ、即ち、互いに１次配列上隣接する抗体を組みあ
わせるサンドイッチ法においても、PACAP38NH₂が検出さ
れ、特に、クラスIIとクラスIIIの抗体を組みあわせる
サンドイッチ法において、PACAP38NH₂が高感度に検出さ
れることを見い出した。さらに、該サンドイッチ法によ
る免疫測定法は、PACAP38NH₂に特異的であり、例えば、
クラスIIに属するモノクローナル抗体の１種であるPA−
6NaおよびクラスIIIに属するモノクローナル抗体の１種
であるPA−2Caを用いるサンドイッチ法による免疫測定
法においては、VIPおよびPACAP38NH₂と相同性を有する
他のペプタイド、たとえば以下の配列を有する生長ホル
モン放出ホルモン（GRF） や以下の配列を有する代表的消化管ホルモンであるセク
レチン に対する交差反応性はいずれも0.001％以下であること
が見い出された。

本発明のサンドイッチ法によるPACAP27NH₂の免疫測定
法においては、１次反応および２次反応に用いられる抗
体は、それぞれポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体であってもよいが、好ましくは、その一方がPACA
P27NH₂のＮ端部分（クラスＩ）、Ｎ端部分から中央部分
に至る領域（クラスII）、あるいはＣ端部分（クラス
Ｖ）を認識する抗体であって、他方が、その抗体が認識
する領域以外を認識する抗体が用いられる。本発明のサ
ンドイッチ法による免疫測定法においても、PACAP27NH₂
をVIP,GRFあるいはセクレチンとの交差反応なく（交差
反応性0.001％以下）検出し得る。

さらにクラスＩおよびIIのいずれかと、クラスIIおよ
びクラスIVのいずれかと組み合わせるサンドイッチ法に
よる免疫測定法はPACAP38NH₂に特異的で、PACAP27NH₂と
は交差反応せず、一方、クラスＩあるいはIIのいずれか
とクラスＶとを組み合わせるサンドイッチ法によるPACA
P27NH₂の免疫測定法はPACAP38NH₂とそれぞれ重量比では
0.22〜3.6％、モル比では0.31〜５％の交差反応性しか
示さないことから、これらの測定法を用いることによ
り、PACAP38NH₂とPACAP27NH₂とを分別定量することが可
能である。

本発明のポリクローナル抗体の調製は一般に免疫抗原
のPACAPまたはPACAPの部分ペプタイドとキャリアー蛋白
との複合体をつくり、このものを動物に接種して免疫を
行い、該免疫動物から抗PACAPまたはPACAPの部分ペプタ
イド抗体含有物を採取、抗体の分離精製を行うことによ
る。

本発明のモノクローナル抗体の調製に当っては、上記
免疫動物から抗体価の高い個体を選び、最終免疫２〜５
日後に脾臓あるいはリンパ節を採取、それらに含まれる
抗体産生細胞を骨髄主細胞と融合させ、安定的に力価の
高い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、モノクロ
ーナルなハイブリドーマを得ることによる。

免疫抗原としては、天然精製標品、合成標品等いずれ
も使用でき、PACAPおよびそれらの一部分が用いられ
る。また免疫抗原として、PACAPの構造を含む化合物、
あるいはPACAPの一部分の構造を含む化合物が用いられ
る場合もある。

本発明に記載されている種々のペプチドは、ペプチド
合成の公知の常套手段で製造しうるものであり、固相合
成法、液相合成法のいずれによってもよい。ペプチド合
成の方法としては、例えば以下の報告に記載された方法
がある。B.Merrifield［ジャーナル オブ アメリカン
ケミカル ソサイェティ（J.Am.Chem.Soc.），85.214
9（1963）］,M.Bodanszky及びM.A.Ondetti［ペプチド
シンセーシス（Peptide Synthesis）,Interscience Pub
lishers,New York,1966年］,Schroder及びLubke［ザ
ペプチド（The Peptide）,Academic Press,New York,19
65年］、泉屋信夫他［ペプチド合成の基礎と実験、丸善
（株）、1985年］矢島治明及び榊原俊平［生化学実験講
座１、タンパク質の化学IV,205,1977年］等。

例えば固相法によりPACAP38NH₂あるいはPACAP38NH₂の
部分ペプチドを合成する場合には、不溶性樹脂として当
該技術分野で知られたもの、例えばクロロメチル樹脂、
４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、４−オキシメチ
ルフェニルアセタミドメチル樹脂等これら何れかの樹脂
を用い、PACAP38NH₂あるいはPACAP38NH₂の部分ペプチド
のＣ末端側から保護アミノ酸を常法に従って順次縮合す
る。次いでフッ化水素処理で全保護基を除去して、高速
液体クロマトグラフィー等のそれ自体公知の方法による
精製後、目的とするPACAP38NH₂あるいはPACAP38NH₂の部
分ペプチドを得ることが出来る。

例えば、Ｎ−保護アミノ酸としては、α−アミノ基を
Boc基で保護し、セリンおよびスレオニンの水酸基はBzl
基で、グルタミン酸、アスパラギン酸のω−カルボン酸
はOBzl基、リジンのε−アミノ基はCl−Ｚ基で、チロシ
ンの水酸基はBr−Ｚ基でアルギニンのグアニド基はTos
基で、ヒスチジンのイミダゾール基はTos基で保護する
方法で製造することが出来る。

本発明明細書においてアミノ酸等を略号で表示する場
合、IUPAC−IUB Commision on Biochemical Nomenclatu
reによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づ
くものであり、その例を下記する。アミノ酸に関し光学
異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を
示すものとする。

PAM :フェニルアセタミドメチル BHA :ベンツヒドリルアミン Boc :t−ブチルオキシカルボニル Cl−Z:2−クロロ−ベンジルオキシカルボニル Br−Z:2−ブロモ−ベンジルオキシカルボニル Bzl :ベンジル OBzl :ベンジルエステル Tos :p−トルエンスルホニル HOBt :1−ベンゾトリアゾール DCC :N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド Gly :グリシン Ala :アラニン Val :バリン Leu :ロイシン Ile :イソロイシン Ser :セリン Thr :スレオニン Cys :システイン Met :メチオニン Glu :グルタミン酸 Asp :アスパラギン酸 Lys :リジン Arg :アルギニン His :ヒスチジン Phe :フェニルアラニン Tyr :チロシン Trp :トリプトファン Pro :プロリン Asn :アスパラギン Gln :グルタミン 哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャ
リアー蛋白との蛋白複合体に関し、キャリアー蛋白の種
類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリア
ーにカプリングさせて免疫したハプテンに対して抗体が
効率よく出来れば、どの様なものをどの様な比率でカプ
リングさせてもよいが、例えば、牛血清アルブミンや牛
サイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン
１に対し0.1〜20、好ましくは１〜５の割合でカプルさ
せる方法が用いられる。

またハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の
縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデビトや
カルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール
基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が
好都合に用いられる。

縮合生成物は温血動物に対して投与により抗体産生が
可能な部位にそれ自体あるいは抗体、希釈剤とともに投
与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全
フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバン
トを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ず
つ、計３〜10回程度行われる。

用いられる温血動物としては、たとえばサル、ウサ
ギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤ
ギ、ニワトリがあげられる。

抗体は上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水
（好ましくは血液）などから採取される。抗血清中の抗
PACAP抗体価の測定は、例えば後記の標識化PACAPと抗血
清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を
測定することによりなされる。抗体の分離精製は免疫グ
ロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿
法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、DE
AE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原抗体
結合物あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなど
の活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させ
て抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。

このようにして作製された抗体は、IgGを主たる成分
とし、IgM、IgA等、他の免疫グロブリンも含む。

一方、上記のポリクローナル抗体の調製法と同様に免
疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認めら
れた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリ
ンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄
腫細胞と融合させることにより、抗PACAP抗体産生ハイ
ブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の
方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法〔ネイチ
ャー（Nature）、256、495（1975）〕に従い実施でき
る。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（PE
G）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましく
はPEGが用いられる。

骨髄腫細胞としてはたとえばNS−１、P3U1、SP2/0な
どがあげられるが、特にP3U1が好ましく用いられる。用
いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との
好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PEG（好ましくは
PEG1000〜PEG6000）が10〜80％程度の濃度で添加され、
20〜40℃、好ましくは30〜37℃で１〜10分間インキュベ
ートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。

抗PACAP抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングに
は種々の方法が使用できるが、たとえばPACAPあるいはP
ACAP部分ペプタイドを吸着させた固相（例、マイクロプ
レート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に西洋
ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で標識した抗免疫グロ
ブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場
合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）または
プロテインＡを加え、固相に結合した抗PACAPモノクロ
ーナル抗体を検出するEIA法、抗免疫グロブリン抗体ま
たはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培
養上清を添加し、HRPで標識したPACAPを加え、固相に結
合した抗PACAPモノクローナル抗体を検出するEIA法など
があげられる。抗PACAPモノクローナル抗体の選別、育
種は通常HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジン）を添加して、10〜20％牛胎児血清を含む動物細胞
用培地（例、RPMI1640）で行われる。ハイブリドーマ培
養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗PACAP抗体価の
測定と同様にして測定できる。

抗PACAPモノクローナル抗体の分離精製は上記のポリ
クローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分
離精製法に従って行われる。

PACAPの一部領域と反応する抗PACAPポリクローナル抗
体は、その一部領域に相当するペプチドをハプテンとし
て免疫し上記の方法で調製することもできるが、PACAP
をハプテンとして用いて調製された抗PACAPポリクロー
ナル抗体から、その一部領域に相当するペプチドを結合
したカラムによるアフィニティクロマトグラフィを用い
て調製することもできる。

また、PACAPの一部領域と反応する抗PACAP抗体を産生
するハイブリドーマおよび、PACAPとは反応するがその
一部領域とは反応しない抗PACAPモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマの選別はたとえばその一部領域
に相当するペプチドとハイブリドーマが産生する抗体と
の結合性を測定することにより行うことができる。

上記で得られた抗PACAPモノクローナルおよびポリク
ローナル抗体を用いて、PACAPの測定ないし組織染色等
を行ない得る。これらの目的には、抗体分子そのものを
用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ab′）_２、Fa
b′、あるいはFab画分を用いてもよい。

PACAPの測定法には通常、以下に述べる競合法が用い
られるが、前述した理由によりサンドイッチ法を用いる
のが好ましい。

競合法においては、本発明で得られた抗PACAP抗体
と、被検液および標識化PACAPとを競合的に反応させた
のち、抗体に結合した標識化PACAPの割合を測定するこ
とにより、被検液中のPACAPを定量する。

該PACAPの標識剤あるいは後記の抗体の標識剤として
は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが
挙げられる。放射性同位元素としては、例えば¹²⁵I,¹³¹
I,³H,¹⁴Cなどが、上記酵素としては、安定で比活性の大
きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β
−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオ
キシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質として
は、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネ
ートなどが、発光物質としては、ルミノール、ルミノー
ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙
げられる。さらに、抗体あるいはPACAPと標識剤との結
合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。

上記の標識剤の活性の測定に当っては、抗体に結合し
た標識化PACAPと遊離の標識化PACAPとを分離（以後B/F
分離と略す）する必要があるが、標識剤として酵素を用
いた場合には、このための試薬に不溶化した抗PACAP抗
体に対する抗体あるいは不溶化したプロテインＡ等の活
性吸着剤が有利に用いられる。例えば、抗IgG抗体（抗P
ACAP抗体に対する抗体に相当）を固相として用い、これ
と反応性のある上記抗体を介して標識化PACAPを固相に
ある抗IgG抗体に結合させ、該固相上の標識剤を測定す
ることによって行なうことができる。標識剤として酵素
を用いた場合には、不溶化担体上の酵素活性の測定には
通常の比色法あるいは蛍光法が用いられる。標識剤にラ
ジオアイソトープ等を用いた場合には、B/F分離に上記
の試薬以外にも不溶化しない抗PACAP抗体に対する抗
体、硫酸ナトリウム、デキストラン炭末、ポリエチレン
グリコール等の試薬が用いられる。いずれの方法におい
ても上清中あるいは沈降物中の標識剤の活性を測定す
る。

上記の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、
また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するの
に用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体とし
ては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不
溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリ
コン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。

競合法においては、抗PACAP抗体、被検液、標識化PAC
AP、およびB/F分離用試薬は、どのような順序に反応さ
せることも可能であり、また全部あるいは一部を同時に
反応させてもよいが、少なくとも標識化PACAPは、被検
液と抗PACAP抗体との反応と同時に、あるいは反応後に
遅れて反応系に加えられることが好ましい。

ただし硫酸ナトリウム、デキストラン炭末、ポリエチ
レングリコール等のB/F分離試薬は主として反応系の最
後に用いられる。

一方、サンドイッチ法においては不溶化した抗PACAP
抗体に被検液を接触（反応）させ（１次反応）、さらに
標識化抗PACAP抗体を反応させ（２次反応）たのち、不
溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液
中のPACAP量を定量することができる。１次反応と２次
反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なって
もよい、標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに
準じることができる。

２次反応に用いられる抗PACAP抗体としては、１次反
応に用いられる抗PACAP抗体とはPACAPの該抗体と結合す
る部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。

即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体はそ
れぞれポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で
あってもよいが、例えば、１次反応で用いられる抗体
が、PACAP38NH₂のＣ端部を認識する（クラスIV）場合、
２次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、
即ち、Ｎ端部（クラスＩ）、Ｎ端部から中央部分に至る
領域（クラスII）、あるいはＣ端部から中央部分に至る
領域（クラスIII）を認識する抗体が用いられる。

サンドイッチ法による免疫測定法においては、固相用
抗体および標識用抗体いずれもいかなるクラス、サブク
ラスのものでもよく、また、抗体活性が保持されている
なら、それらからFc′あるはFc領域を除去したＦ（a
b′）_２画分、Fab′画分あるいは、Fab画分でもよい。

サンドイッチ法による免疫測定法において、モノクロ
ーナル抗体を用いる場合、固相用抗体あるいは標識用抗
体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はな
く、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体
の混合物を用いてもよい。また、本発明で得られた抗体
を用いる免疫測定法は、PACAPが関与する疾患の診断お
よび予後管理に使用し得る。

被検試料としては、血漿、血清、尿、脳脊髄液、腹
水、胸水、羊水等の体液や、痰、便などが使用し得る。
これらの試料は、そのまま、あるいは各種緩衝液で希釈
あるいは抽出後濃縮し、イムノアッセイの試料とし得
る。試料の希釈あるいは抽出に用いられる溶媒としては
どのような緩衝液あるいは有機溶媒を用いてもよいが、
好ましくはイムノアッセイ用緩衝液、水、生理食塩水、
酢酸緩衝液、アセトン、クロロホルム−メタノールある
いは、界面活性剤を含むこれらの溶液が用いられ、抽出
後、加熱処理される場合もある。また、濃縮は、試料を
直接減圧下、あるいは常圧、窒素気流下濃縮してもよい
し、また試料をイオン交換あるは逆相クロマトグラフィ
ー用担体あるいは抗PACAP抗体結合担体に添加したの
ち、適当な溶出液で溶出後、減圧下あるいは常圧、窒素
気流下濃縮しても良い。逆相クロマトグラフィー用担体
としてはC2、C8、C18あるいはフェニルカートリッジが
用いられるが、濃縮用担体として特に好ましくは、抗PA
CAP抗体結合担体が用いられる。濃縮物はイムノアッセ
イ用緩衝液に溶解後、イムノアッセイの試料とする。

さらに、本発明で得られた抗PACAP抗体はPACAPの免疫
組織染色法等にも用いる事ができる。その方法は、例え
ば標識化抗PACAP抗体を用いる直接法、抗PACAP抗体およ
び抗PACAP抗体に対する抗体の標識化されたものを用い
る間接法等に準ずることができる。

また、さらに本発明で得られた抗PACAP抗体のうちPAC
APのアデニレートサイクラーゼ活性化能を中和し得る抗
体は、PACAPの特異的中和抗体として使用し得る。

抗PACAP抗体の中からPACAPの作用を特異的に抑制する
抗体をスクリーニングする方法としては、PACAPの薬理
作用を検出するいかなる方法を用いることも可能であ
り、例えば、下垂体の初代培養や褐色細胞腫細胞株PC12
hを含む各種細胞培養系において、PACAPのアデニレート
サイクラーゼ活性化能を標識とする生体外の測定系、あ
るいは、PACAPの実験動物の血圧降下活性を指標とする
生体内の測定系などが挙げられる。

得られたPACAPの作用を特異的に抑制する抗体はIgG、
IgA、IgMいかなるクラスのものでもよく、またそれらか
らFc′あるいはFc領域を除去したFab′あるいはFab画分
あるはその重合体でもよい。また、PACAPの作用を特異
的に抑制し得るモノクローナル抗体の可変遺伝子部と、
ヒトイムノグロブリン定常遺伝子部とを融合させ、組み
換え体として発現させたキメラ抗体を用いることもでき
る。

なお、後述の実施例８で得られたハイブリドーマ細胞
は平成２年２月27日から財団法人発酵研究所（IFO）
に、そして平成２年３月16日から通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所（FRI）に以下の受託番号で寄託
されている。

ハイブリドーマ細胞 IFO FERM−BP（FRI） PA−1N 50225
2811 PA−3N 50226
2812 PA−5N 50227 2813 PA−6N 50228 2814 PA−2C 50229 2815 PA−1C 50230 2816 なお以下の実施例では、各ハイブリドーマ細胞から得
られる抗体については細胞名の後にａを付けた形で表し
ている。

参考例１ PACAP38NH₂の合成 市販のｐ−メチルBHA樹脂（アプライド バイオシス
テムズ社製）1.04g（0.5m mole）を用い、ペプチド合成
機（アプライド バイオシステムズ社製モデル430A）を
使用し、合成した。

最初のアミノ酸、Boc−Lys（Cl−Ｚ）をHOBt/DCCで活
性化し、樹脂に縮合した後、樹脂上のBoc基を50％トリ
フルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離
させ、このアミノ基に、Boc−Asn,Boc−Lys（Cl−Ｚ）,
Boc−Val,Boc−Arg（Tos）,Boc−Gln,Boc−Tyr（Br−
Ｚ）,Boc−Gly,Boc−Leu−,Boc−Ala,Boc−Met,Boc−Se
r（Bzl）,Boc−Asp（OBzl）,Boc−Thr（Bzl）,Boc−Ph
e,Boc−Ile,Boc−His（Tos）をPACAP38のアミノ酸配列
通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合した。さらにDCCまた
は、HOBt/DCCで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮
合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化
し、保護PACAP38NH₂樹脂2.42gを得た。

この保護PACAP38NH₂樹脂0.51gをｐ−クレゾール0.6g
共存下無水フッ化水素5mlで０℃、60分間処理した後、
フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル5mlで
２回洗浄した後、残渣を50％−酢酸水6mlで抽出した。
不溶物を濾去し、50％−酢酸水5mlで洗浄した。濾液、
洗液を合し、２〜3mlに減圧濃縮し、セファデックスLH
−20（２×90cm）のカラムに付し、50％−酢酸で溶出し
た。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、0.1％ト
リフルオロ酢酸水100mlに溶解し、YMC−ODS AM120 Ｓ
−50樹脂カラム（1.6×7cm）に付し、0.1％トリフルオ
ロ酢酸水と50％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢
酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。

主要画分を合し、凍結乾燥し、60mgの白色粉末を得
た。これを0.05M−酢酸アンモニア水20mlに溶解し、CM
−セルロファインの樹脂カラム（１×6cm）に付し、0.0
5Mから1.0M−酢酸アンモニア水の直線型濃度勾配で溶出
した。主要画分を合し、再度YMC−ODSカラム（2.6×7c
m）に付し、０〜40％までのアセトニトリル水溶液（0.1
％トリフルオロ酢酸含有）の直線型濃度勾配溶出を行
い、アセトニトリル28〜30％の区分を集め凍結乾燥し、
白色粉末21.6mgを得た。

アミノ酸分析値 Asp 2.90（３）,Thr 0.84（１）,Ser 2.10（３）,Glu
2.21（２）,Gly 2.00（２）,Ala 3.29（３）,Val 3.19
（３）,Met 1.01（１）,Ile 0.87（１）,Leu 2.09
（２）,Tyr 3.94（４）,Phe 0.92（１）,Lys 7.18
（７）,His 0.96（１）,Arg 4.19（４） 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺4530 HPLC溶出時間 19.6分 カラム条件 カラム:YMC−ODS（AM−301,S−5 120A） 溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） B液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセトニ
トリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（50分）流
速:1.0ml/分 参考例２ PACAP27NH₂の合成 市販のｐ−メチルBHA樹脂（アプライド バイオシス
テムズ社製）1.04g（0.5m mole）を用い、ペプチド合成
機（アプライド バイオシステムズ社製モデル430A）を
使用し、合成した。

最初のアミノ酸、Boc−LeuをHOBt/DCCで活性化し、樹
脂に縮合した後、樹脂上のBoc基を50％トリフルオロ酢
酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させ、この
アミノ基に、Boc−Lys（Cl−Ｚ）,Boc−Val,Boc−Arg
（Tos）,Boc−Gln,Boc−Tyr（Br−Ｚ）,Boc−Gly,Boc−
Leu,Boc−Ala,Boc−Met,Boc−Ser（Bzl）,Boc−Asp（OB
zl）,Boc−Thr（Bzl）,Boc−Phe,Boc−Ile,Boc−His（T
os）をPACAP27NH₂のアミノ酸配列通り順にHOBt/DCCで活
性化し縮合した。さらにDCCまたは、HOBt/DCCで活性化
した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応の
アミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護PACAP27NH₂樹
脂2.31gを得た。

この保護PACAP27NH₂樹脂0.79gをｐ−クレゾール1.2g
共存下無水フッ化水素10mlで０℃、60分間処理した後、
フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル5mlで
２回洗浄した後、残渣を50％−酢酸水5mlで抽出した。
不溶物を濾去し、50％−酢酸水5mlで洗浄した。濾液、
洗液を合し、２〜3mlに減圧濃縮し、セファデックスLH
−20（２×75cm）のカラムに付し、50％−酢酸で溶出し
た。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、0.1％ト
リフルオロ酢酸水100mlに溶解し、YMC−ODS AM120 Ｓ
−50樹脂カラム（2.6×7cm）に付し、0.1％トリフルオ
ロ酢酸水と50％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢
酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分
を合し、再度YMC−ODSカラム（2.6×7cm）に付し、15〜
35％までのアセトニトリル水溶液（0.1％トリフルオロ
酢酸含有）の直線型濃度勾配溶出を行い、アセトニトリ
ル30〜32％の区分を集め凍結乾燥した。これを0.05M−
酢酸アンモニア水20mlに溶解し、CM−セルロファインの
樹脂カラム（１×6cm）に付し、水から0.33M−酢酸アン
モニア水の直線型濃度勾配で溶出した。主要画分（0.18
〜0.22M）を合して凍結乾燥し、白色粉末20mgを得た。

アミノ酸分析値 Asp 1.96（２）,Thr 0.94（１）,Ser 2.57（３）,Glu
1.07（１）,Gly 0.95（１）,Ala 3.00（３）,Val 1.96
（２）,Met 0.88（１）,Ile 0.88（１）,Leu 1.93
（２）,Tyr 2.87（３）,Phe 0.90（１）,Lys 2.91
（３）,His 0.94（１）,Arg 2.17（２） 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺3146.7 HPLC溶出時間 21.2分 カラム条件 カラム:YMC−ODS（AM−301,S−5 120A） 溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） B液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセトニ
トリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（50分） 流速 :1.0ml/分 参考例３ PACAP27OH（His Ser Asp Gly Ile Phe Thr A
sp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln Met Ala Val Lys
Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu−OH）の合成 市販のBoc−Leu−OCH₂−PAM樹脂（アプライド バイ
オシステムズ社製）0.60g（0.5m mole）を用い、ペプチ
ド合成機（アプライド バイオシステムズ社製モデル43
0A）を使用し、合成した。

樹脂上のBoc基を50％トリフルオロ酢酸／塩化メチレ
ンで処理し、アミノ基を遊離させた後、このアミノ基
に、各2m moleのBoc−Val,Boc−Lys（Cl−Ｚ）,Boc−Ar
g（Tos）,Boc−Gln,Boc−Tyr（Br−Ｚ）,Boc−Gly,Boc
−Leu,Boc−Ala,Boc−Met,Boc−Ser（Bzl）,Boc−Asp
（OBzl）,Boc−Thr（Bzl）,Boc−Phe,Boc−Ile,Boc−Hi
s（Tos）をPACAP27のアミノ酸配列通り順にHOBt/DCCで
活性化し縮合した。さらにDCCまたは、HOBt/DCCで活性
化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応
のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護PACAP27−O
CH₂−PAM樹脂1.25gを得た。

この保護PACAP27−OCH₂−PAM樹脂0.65gをｐ−クレゾ
ール1.0g共存下無水フッ化水素6mlで０℃、60分間処理
した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテ
ル5mlで２回洗浄した後、残渣を50％−酢酸水5mlで抽出
した。不溶物を濾去し、50％−酢酸水5mlで洗浄した。
濾液、洗液を合し、２〜3mlに減圧濃縮し、セファデッ
クスLH−20（２×75cm）のカラムに付し、50％−酢酸で
溶出した。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、0.
1％トリフルオロ酢酸水100mlに溶解し、YMC−ODS AM12
0 Ｓ−50樹脂カラム（2.6×7cm）に付し、0.1％トリフ
ルオロ酢酸水と50％アセトニトリル（0.1％トリフルオ
ロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要
画分を合して凍結乾燥し、白色粉末90mgを得た。再度YM
C−ODSカラム（2.6×7cm）に付し、15〜40％までのアセ
トニトリル水溶液（0.1％トリフルオロ酢酸含有）の直
線型濃度勾配溶出を行い、アセトニトリル25〜28％の区
分を集め凍結乾燥した。これを0.05M−酢酸アンモニア
水20mlに溶解し、CM−セルロファインの樹脂カラム（１
×6cm）に付し、0.05Mから0.33M−酢酸アンモニア水の
直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合して凍結乾燥
し、白色粉末20mgを得た。

アミノ酸分析値 Asp 2.03（２）,Thr 0.96（１）,Ser 2.66（３）,Glu
1.08（１）,Gly 1.01（１）,Ala 3.05（３）,Val 1.98
（２）,Met 0.94（１）,Ile 0.94（１）,Leu 2.00
（２）,Tyr 2.96（３）,Phe 0.95（１）,Lys 2.99
（３）,His 1.03（１）,Arg 2.25（２） 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺3147.9 HPLC溶出時間 18.69分 カラム条件 カラム:YMC−ODS（AM−301,S−5 120A） （4.6×100） 溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） Ｂ液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセト
ニトリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（25分） 流速 :1.0ml/分 実施例１−１ PACAP（14−38）NH₂の合成 市販のｐ−メチルBHA樹脂（アプライド バイオシス
テムズ社製）1.04g（0.5m mole）を用い、ペプチド合成
機（アプライド バイオシステムズ社製モデル430A）を
使用し、合成した。

最初のアミノ酸、Boc−Lys（CL−Ｚ）をHOBt/DCCで活
性化し、樹脂に縮合した後、樹脂上のBoc基を50％トリ
フルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離
させ、このアミノ基に、Boc−Asn,Boc−Lys（Cl−Ｚ）,
Boc−Val,Boc−Arg（Tos）,Boc−Gln,Boc−Tyr（Br−
Ｚ）,Boc−Gly,Boc−Leu,Boc−Ala,Boc−MetをPACAP（1
4−38）NH₂のアミノ酸配列通り順にHOBt/DCCで活性化し
縮合した。さらにDCCまたは、HOBt/DCCで活性化した同
じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ
基は無水酢酸でアセチル化し、保護PACAP（14−38）NH₂
樹脂2.00gを得た。この保護PACAP（14−38）NH₂樹脂0.4
8gをｐ−クレゾール0.48g共存下無水フッ化水素5mlで０
℃、60分間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣
をエチルエーテル5mlで２回洗浄した後、残渣を50％−
酢酸水5mlで抽出した。不溶物を濾去し、50％−酢酸水5
mlで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜3mlに減圧濃縮
し、セファデックスLH−20（２×75cm）のカラムに付
し、50％−酢酸で溶出した。主要画分を集め減圧留去の
後、残留物を、0.1％トリフルオロ酢酸水100mlに溶解
し、YMC−ODS AM120 Ｓ−50樹脂カラム（2.6×7cm）
に付し、0.1％トリフルオロ酢酸水と30％アセトニトリ
ル（0.1％トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度
勾配で溶出した。主要画分を合して凍結乾燥し、白色粉
末20.2mgを得た。

アミノ酸分析値 Asp 1.01（１）,Glu 2.01（２）,Gly 1.00（１）,Ala
3.01（３）,Val 2.85（３）,Met 0.86（１）,Leu 2.08
（２）,Tyr 1.98（２）,Lys 6.37（７）,Arg 3.24
（３） 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺3003.6 HPLC溶出時間 13.1分 カラム条件 カラム:YMC−ODS（AM−301,S−5 120A） 溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） B液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセトニ
トリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（25分） 流速 :1.0ml/分 実施例１−２ PACAP（１−13）OHの合成 市販のBoc−Tyr（Br−Ｚ）−OCH₂−PAM樹脂（アプラ
イド バイオシステムズ社製）0.87g（0.5m mole）を用
い、ペプチド合成機（アプライド バイオシステムズ社
製モデル430A）を使用し、合成した。

樹脂上のBoc基を50％トリフルオロ酢酸／塩化メチレ
ンで処理し、アミノ基を遊離させた後、このアミノ基
に、Boc−Arg（Tos）,Boc−Tyr（Br−Ｚ）,Boc−Gly,Bo
c−Ser（Bzl）,Boc−Asp（OBzl）,Boc−Thr（Bzl）,Boc
−Phe,Boc−Ile,Boc−His（Tos）をPACAP（１−13）の
アミノ酸配列通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合した。さ
らにDCCまたは、HOBt/DCCで活性化した同じアミノ酸誘
導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸
でアセチル化し、保護PACAP（１−13）OH₂−PAM樹脂1.8
6gを得た。

この樹脂0.70gをｐ−クレゾール0.81gを共存下無水フ
ッ化水素10mlで０℃、60分間処理した後、フッ化水素を
減圧留去し、残渣をエチルエーテル5mlで２回洗浄した
後、残渣を50％−酢酸水5mlで抽出した。不溶物を濾去
し、50％−酢酸水5mlで洗浄した。濾液、洗液を合し、
２〜3mlに減圧濃縮し、セファデックスLH−20（２×75c
m）のカラムに付し、50％−酢酸で溶出した。主要画分
を集め減圧留去の後、残留物を、0.1％トリフルオロ酢
酸水100mlに溶解し、YMC−ODS AM120 Ｓ−50樹脂カラ
ム（2.6×7cm）に付し、0.1％トリフルオロ酢酸水と33
％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸含有）の間
での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合し、再度
同じカラム条件で精製、主要画分を集め凍結乾燥し、白
色粉末38mgを得た。

アミノ酸分析値 Asp 2.00（２）,Thr 0.93（１）,Ser 2.43（３）,Glu
1.05（１）,Gly 1.00（１）,Tyr 1.82（２）,Phe 1.02
（１）,His 1.13（１）,Arg 1.12（１） 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺1547.5 HPLC溶出時間 12.3分 カラム条件 カラム:YMC−ODS（AM−301,S−5 120A） 溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） Ｂ液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセト
ニトリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（25分） 流速 :1.0ml/分 実施例１−３ PACAP（４−27）OHの合成 市販のBoc−Leu−OCH₂−PAM樹脂（アプライド バイ
オシステムズ社製）0.60g（0.5m mole）を用い、ペプチ
ド合成機（アプライド バイオシステムズ社製モデル43
0A）を使用し、合成した。

樹脂上のBoc基を50％トリフルオロ酢酸／塩化メチレ
ンで処理し、アミノ基を遊離させた後、このアミノ基
に、Boc−Lys（Cl−Ｚ）,Boc−Val,Boc−Arg（Tos）,Bo
c−Gln,Boc−Tyr（Br−Ｚ）,Boc−Gly,Boc−Leu,Boc−A
la,Boc−Met,Boc−Ser（Bzl）,Boc−Asp（OBzl）,Boc−
Thr（Bzl）,Boo−Phe,Boc−Ile,をPACAP（４−27）のア
ミノ酸配列通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合した。さら
にDCCまたは、HOBt/DCCで活性化した同じアミノ酸誘導
体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸で
アセチル化し、保護PACAP（４−27）OCH₂−PAM樹脂1.08
gを得た。

この保護PACAP（４−27）OCH₂−PAM樹脂0.29gをｐ−
クレゾール0.49g共存下無水フッ化水素5mlで０℃、60分
間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチル
エーテル5mlで２回洗浄した後、残渣を50％−酢酸水5ml
で抽出した。不溶物を濾去し、50％−酢酸水5mlで洗浄
した。濾液、洗液を合し、２〜3mlに減圧濃縮し、セフ
ァデックスLH−20（２×75cm）のカラムに付し、50％−
酢酸で溶出した。主要画分を集め減圧留去の後、残留物
を、0.1％トリフルオロ酢酸水100mlに溶解し、YMC−ODS
AM120 Ｓ−50樹脂カラム（2.6×7cm）に付し、15％
アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸含有）と50％
アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸含有）の間で
の直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合して凍結乾
燥し、白色粉末33mgを得た。これを0.05M−酢酸アンモ
ニア水20mlに溶解し、CM−セルロファインの樹脂カラム
（１×6cm）に付し、水から0.03M−酢酸アンモニア水の
直線型濃度勾配で溶出した。主要画分（0.18〜0.22M）
を合して凍結乾燥し、白色粉末33mgを得た。

アミノ酸分析値 Asp 1.02（１）,Thr 0.98（１）,Ser 1.78（２）,Glu
1.07（１）,Gly 1.02（１）,Ala 3.04（３）,Val 1.89
（２）,Met 0.81（１）,Ile 0.89（１）,Leu 2.00
（２）,Tyr 2.91（３）,Phe 0.90（１）,Lys 2.89
（３）,Arg 2.20（２） 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺2808.5 HPLC溶出時間 14.5分 カラム条件 カラム:YMC−ODS（AM−301,S−5 120A） 溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） Ｂ液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセト
ニトリル） を用いＡ液からＢ液の直線型濃度勾配溶出（35分） 流速 :1.0ml/分 実施例１−４ PACAP（31−38）NH₂の合成 市販のｐ−メチルBHA樹脂（アプライド バイオシス
テムズ社製）0.98g（0.5m mole）を用い、ペプチド合成
機（アプライド バイオシステムズ社製モデル430A）を
使用し、合成した。

最初のアミノ酸、Boc−Lys（Cl−Ｚ）をHOBt/DCCで活
性化し、樹脂に縮合した後、樹脂上のBoc基を50％トリ
フルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離
させ、このアミノ基に、Boc−Asn,Boc−Lys（Cl−Ｚ）,
Boc−Val,Boc−Arg（Tos）,Boc−Gln,Boc−Tyr（Br−
Ｚ）をPACAP（31−38）NH₂のアミノ酸配列通り順にHOBt
/DCCで活性化し縮合した。さらにDCCまたは、HOBt/DCC
で活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、
未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護PACA
P（31−38）NH₂樹脂2.00gを得た。

この保護PACAP（31−38）NH₂樹脂0.43gをｐ−クレゾ
ール0.6g共存下無水フッ化水素5mlで０℃、60分間処理
した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテ
ル5mlで２回洗浄した後、残渣を50％−酢酸水5mlで抽出
した。不溶物を濾去し、50％−酢酸水5mlで洗浄した。
濾液、洗液を合し、２〜3mlに減圧濃縮し、セファデッ
クスLH−20（２×75cm）のカラムに付し、50％−酢酸で
溶出した。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、0.
1％トリフルオロ酢酸水100mlに溶解し、YMC−ODS AM12
0 Ｓ−50樹脂カラム（2.6×7cm）に付し、0.1％トリフ
ルオロ酢酸水と33％アセトニトリル（0.1％トリフルオ
ロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要
画分を合して凍結乾燥し、白色粉末45mgを得た。

アミノ酸分析値 Asp 1.02（１）,Glu 1.05（１）,Val 1.00（１）,Tyr
0.90（１）,Lys 2.98（３）,Arg 1.12（１） 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺1062.7 HPLC溶出時間 11.6分 カラム条件 カラム:YMC−ODS（AM−301,S−5 120A） 溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） Ｂ液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル） を用いＡ液からA:B（4:1）混合液へ直線型濃度勾配溶出
（20分） 流速 :1.0ml/分 実施例１−５ 〔Cys¹⁰〕PACAP（11−27）NH₂の合成 市販のｐ−メチルBHA樹脂（アプライド バイオシス
テムズ社製）0.66g（0.5m mol）を用い、ペプチド合成
機（アプライド バイオシステムズ社製モデル430A）を
使用し、合成した。

最初のアミノ酸、Boc−LeuをHOBt/DCCで活性化し、樹
脂に縮合した後、樹脂上のBoc基を50％トリフルオロ酢
酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させ、この
アミノ基に、Boc−Val,Boc−Ala,Boc−Tyr（Br−Ｚ）,B
oc−Lys（Cl−Ｚ）,Boc−Met,Boc−Gln,Boc−Arg（To
s）,Boc−Ser（Bzl）,Boc−Cys（MeBzl）を目的ペプチ
ドのアミノ酸配列通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合し
た。さらにDCCまたは、HOBt/DCCで活性化した同じアミ
ノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無
水酢酸でアセチル化し、保護〔Cys¹⁰〕PACAP（11−27）
NH₂樹脂1.20gを得た。

この保護樹脂0.60gをｐ−クレゾール1.0g共存下無水
フッ化水素10mlで０℃、60分間処理した後、フッ化水素
を減圧留去し、残渣をエチルエーテル5mlで２回洗浄し
た後、残渣を50％−酢酸水5mlで抽出した。不溶物を濾
去し、50％−酢酸水5mlで洗浄した。濾液、洗液を合
し、２〜3mlに減圧濃縮し、セファデックスLH−20（２
×75cm）のカラムに付し、50％−酢酸で溶出した。主要
画分を集め減圧留去の後、残留物を、0.1％トリフルオ
ロ酢酸水100mlに溶解し、YMC−ODS AM120 Ｓ−50樹脂
カラム（2.6×7cm）に付し、0.1％トリフルオロ酢酸水
と50％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸含有）
の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合して
凍結乾燥し、白色粉末70mgを得た。アミノ酸分析値 Ser 0.92（１）,Glu 1.07（１）,Ala 2.00（２）,Val
1.96（２）,Met 0.88（１）,Leu 1.93（２）,Tyr 1.87
（２）,Lys 2.91（３）,Arg 2.17（２） 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺2127.9 HPLC溶出時間 20.8分 カラム条件 カラム:YMC−ODS（AM−301,S−5 120A） 溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） Ｂ液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセト
ニトリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（50分） 流速 :1.0ml/分 実施例２−１ PACAP38NH₂を含む免疫原の作製 上記参考例１で得られたPACAP38NH₂と牛チログロブリ
ン（BTG）との複合体を作製し、免疫原とした。

即ち、PACAP38NH₂2.8mgとBTG8.4mgとを1mlの0.1Mリン
酸緩衝液、pH6.9に溶解させ、最終濃度、0.04％のグル
タルアルデヒドを加え、室温で２時間反応させた。反応
後、生理食塩水に対し、４℃で２日間透析した。

実施例２−２ PACAP（11−27）NH₂を含む免疫原の作製 上記実施例１−５で得られた〔Cys¹⁰〕PACAP（11−2
7）NH₂とBTGとの複合体を作製し免疫原とした。即ち、B
TG 20mgを、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.9）1.4mlに溶解さ
せ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）サクシニミド
（GMBS）2.2mg（８μmol）を含むDMF溶液100μｌと混合
し、室温で40分反応させた。反応後、セファデックスＧ
−25カラムで分画したのち、マレイミド基の導入された
BTG12mgと〔Cys¹⁰〕PACAP（11−27）NH₂3.0mgとを混合
し、４℃で３日間反応させた。反応後、生理食塩水に対
し、４℃で２日間透析した。

実施例３−１ PACAP38NH₂−BTG複合体の免疫 ６〜８週令のBALB/C雌マウスに上記実施例２−１記載
の免疫原PACAP38NH₂−BTG複合体80μg/匹を完全フロイ
ントアジュバントとともに皮下免疫した。以後４週間お
きに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントとと
もに２〜３回追加免疫した。

実施例３−２ PACAP（11−27）NH₂−BTG複合体の免疫 雄性家兎に、上記実施例２−２記載のPACAP（11−2
7）NH₂−BTG複合体400μg/羽を完全フロイントアジュバ
ントとともに皮下免疫した。以後４週間おきに同量の免
疫原を不完全フロイントアジュバントとともに６回追加
免疫した。

実施例４−１ 西洋ワサビパーオキシダーゼ（HRP）標
識化PACAP38NH₂の作製 上記参考例１で得られたPACAP38NH₂とHRPとを架橋
し、酵素免疫測定法（EIA）の標識体とした。

即ち、PACAP38NH₂180n molを500μの0.1Mリン酸緩
衝液、pH6.8に溶解させ、GMBS 450n molを含むDMF溶液5
0μと混合し、室温で30分反応させた。反応後、セフ
ァデックスＧ−15カラムで分画を行ないマレイミド基の
導入されたポリペプチド100n molを得た。

一方、HRP7.9mg（200n mol）を0.15M食塩を含む0.02M
リン酸緩衝液、pH6.8、0.95mlに溶解させ、SPDP〔Ｎ−
スクシニミジル−３−（２−ピリミジルジチオ）プロピ
オネート〕1.54mg（4.9μ mol）を含むDMF溶液50μと
混合したのち室温40分間反応させた。反応後、ジチオス
レイトール8.2mg（53μ mol）を含む0.1M酢酸緩衝液、p
H4.5、0.33mlを加え、室温20分反応させたのち、セファ
デックスＧ−25カラムで分画を行ない、SH基の導入され
た酵素6mg（100n mol）を得た。

次に、マレイミド基導入PACAP38NH₂100n molとSH基導
入HRP 100n molとを混合し、４℃、16時間反応させた。
反応後ウルトロゲルAcA44（LKB−ファルマシア社製）カ
ラムで分画し、HRP標識化PACAP38を得た。

実施例４−２ HRP標識化PACAP（11−27）NH₂の作製 HRP8mg（200n mol）を950μｌの0.1Mリン酸緩衝液、p
H6.8に溶解させ、GMBS1.4mg（５μ mol）を含むDMF溶液
50μと混合し、室温で40分間反応させたのち、セファ
デックスＧ−25カラムで分画した。このようにして作製
した、マレイミド基の導入されたHRP 3.3mg（78n mol）
と実施例１−５で作製された〔Cys¹⁰〕PACAP（11−27）
NH₂0.65mg（310nmol）とを混合し、４℃で１日反応させ
た。反応後ウルトロゲルAcA44（LKB−ファルマシア社
製）カラムで分画し、HRP標識化〔Cys¹⁰〕PACAP（11−2
7）NH₂を得た。

実施例５−１ マウス抗血清中の抗体価の測定 マウス抗血清中の抗体価を以下の方法により測定し
た。抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレー
トを作製するため、まず抗マウスイムノグロブリン抗体
（IgG画分、カッペル社製）を100μg/ml含む0.1M炭酸緩
衝液、pH9.6溶液を96ウェルマイクロプレートに100μ
ずつ分注し、４℃で24時間放置した。次に、プレートを
PBSで洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐ
ため25％ブロックエース（雪印乳業社製）を含むPBSを3
00μずつ分注し、少なくとも４℃で24時間処理した。

上記、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプ
レートの各ウエルにバッファーＥ［10％ブロックエー
ス、2mg/ml牛血清アルブミン（BSA）、0.4M NaCl、2mM
EDTAおよび0.1％ NaN₃を含む0.02Mリン酸緩衝液、pH
7.0］50μおよびバッファーＥで希釈したマウス抗PAC
AP38NH₂抗血清50μを加え４℃で16時間反応させた。
次に、該プレートをPBSで洗浄したのち、上記実施例４
−１で作製したHRP標識化PACAP38NH₂［2mg/ml BSA、0.
15M NaClを含む0.02Mリン酸緩衝液、pH7.0（バッファ
ーＨ）で200倍希釈］100μを加え、室温で６時間反応
させた。反応後PBSで洗浄したのち、固相上の酵素活性
を測定するため0.2％オルソフェニレンジアミン、0.02
％過酸化水素を含む0.1Mクエン酸緩衝液、pH5.5を100μ
ずつ分注し、室温で10分間反応させた。４規定硫酸10
0μを加え、反応を停止させたのち、492nmの吸収をプ
レートリーダー（MTP−32、コロナ社製）で測定した。

結果を第１図に示す。免疫した８匹のマウスのうち４
匹に抗PACAP38抗体価の上昇が認められた。

実施例５−２ 家兎抗血清中の抗体価の測定 家兎抗血清中の抗体価を同様の方法により測定した。
抗ウサギイムノグロブリン抗体（IgG画分、カッペル社
製）結合マイクロプレートを、上記実施例５−１記載の
方法により作製した。該プレートに、バッファーE 50μ
およびバッファーＥで希釈した家兎抗PACAP（11−2
7）NH₂抗血清50μを加え４℃で16時間反応させた。次
に、該プレートをPBSで洗浄したのち、上記実施例４−
２で作製したHRP標識化PACAP（11−27）NH₂（バッファ
ーＨで200倍希釈）100μを加え、室温で６時間反応さ
せた。反応後PBSで洗浄したのち、固相上の酵素活性
を、TMBマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム
（KIRKEGAARD ＆ PERRY LAB,INC.フナコシ薬品（株）取
扱い）を用いて測定した。吸光度（450nm）の測定には
プレートリーダー（MTP−32、コロナ社製）を用いた。
結果を第２図に示す。免疫した総ての家兎に高い抗体価
が検出された。

実施例６ 細胞融合 比較的高い抗体価を示したマウスNo.5に対して200μ
ｇの免疫原を生理食塩水0.25mlに溶解させたものを静脈
内に接種することにより最終免疫を行なった。最終免疫
４日後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメッシュ
で圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エッセンシャ
ルメデイウム（MEM）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得
た。細胞融合に用いる細胞として、BALB/Cマウス由来ミ
エローマ細胞P3−×63.Ag8.U1（P3U1）を用いた〔カレ
ント トピックス イン マイクロバイオロジー アン
ド イムノロジー、81、１（1978）〕。細胞融合は、原
法〔ネイチャー、256、495（1957）〕に準じて行なっ
た。即ち、脾臓細胞およびP3U1をそれぞれ血清を含有し
ないMEMで３度洗浄し、脾臓細胞とP3U1数の比率を5:1に
なるよう混合して、800回転で15分間遠心を行なって細
胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈澱を軽く
ほぐし、45％ポリエチレングリコール（PEG）6000（コ
ッホライト社製）を0.3ml加え、37℃温水槽中で７分間
静置して融合を行なった。融合後細胞に毎分2mlの割合
でMEMを添加し、合計12mlのMEMを加えた後600回転15分
間遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物を10％牛胎
児血清を含有するGITメデイウム（和光純薬）（GIT−10
FCS）にP3U1が1ml当り２×10⁶個になるように浮遊し、2
4穴マルチデイシュ（リンブロ社製）に１ウェル1mlずつ
120ウェルに播種した。播種後、細胞を37℃で５％炭酸
ガスフラン器中培養した。24時間後HAT（ヒポキサンチ
ン１×10^-4M、アミノプテリン４×10^-7M、チミジン1.6
×10^-3M）を含んだGIT−10FCS培地（HAT培地）を１ウェ
ル当り1mlずつ添加することにより、HAT選択培養を開始
した。HAT選択培養は、培養開始３、６、９日後に旧液
を1ml捨てたあと、1mlのHAT培地を添加することにより
継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後９〜14
日で認められ、培養液が黄変したとき（約１×10⁶セル/
ml）、上清を採取し、抗体価を測定した。

実施例７ ハイブリドーマのスクリーニング 抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレート
にバッファーE50μとハイブリドーマ培養上清50μ
とを加え、室温で６時間反応させた。プレートをPBSで
洗浄したのち、上記４で作製したHRP標識化PACAP38NH₂
〔バッファーＨで200倍に希釈〕100μを加え、４℃で
16時間反応させた。次に、プレートをPBSで洗浄したの
ち、固相上の酵素活性を上記実施例５−１記載の方法に
より測定した。

このようにして、ハイブリドーマの増殖が認められた
全120ウェルの上清を調べたところ、18ウェルに抗体価
が認められた。

実施例８ クローニング 抗体活性が陽性を示したウェルのうち、No.44、No.4
9、No.97、No.113の各ハイブリドーマを限界希釈法によ
るクローニングに付した。即ち、ハイブリドーマが1.5
個/mlになるようRPMI1640−20FCSに浮遊させ、96穴マイ
クロプレート（ヌンク社製）に１ウェル当り0.2mlずつ
分注した。分注する際、フィーダー細胞としてBALB/Cマ
ウスの胸腺細胞をウェル当り５×10⁵個になるように加
えた。約１週間後には細胞の増殖が認められるようにな
り、上清中の抗体価を上記実施例５記載のEIA法により
調べたところ、No.44のハイブリドーマでは30クローン
中28クローンが、No.49のハイブリドーマでは50クロー
ン中47クローンが、No.97のハイブリドーマでは50クロ
ーン中49クローンが、No.113のハイブリドーマでは50ク
ローン中48クローンが抗体を産生していた。

これらのクローンのうち、No.44−２より得られたク
ローンPA−6Nおよびその産生するモノクローナル抗体PA
−6Na、No.49−３より得られたクローンPA−1Nおよびそ
の産生するモノクローナル抗体PA−1Na、No.97−２より
得られたクローンPA−2Cおよびその産生するモノクロー
ナル抗体PA−2Ca、No.113−５より得られたクローンPA
−5Nおよびその産生するモノクローナル抗体PA−5Naに
注目し、以下の実験を実施した。

また、同様にして、免疫中の他のマウスの脾臓細胞を
用いて細胞融合実験を実施し、No.28−12より得られた
クローンPA−1Cおよびその産生するモノクローナル抗体
PA−1CaおよびNo.10−３より得られたクローンPA−3Nお
よびその産生するモノクローナル抗体PA−3NAにも注目
し、以下の実験を実施した。

実施例９ 大量のモノクローナル抗体の調製 ミネラルオイル0.5mlを腹腔内投与されたマウス、あ
るいは未処置マウス（BALB/C）に上記ハイブリドーマ１
〜３×10³セル／匹を腹腔内注射したのち、６〜20日後
に抗体含有腹水を採取した。

実施例10 モノクローナル抗体の精製 上記実施例９調製腹水よりプロテイン−Ａカラム、あ
るいはジエチルアミノエチル（DEAE）−セルロースカラ
ムによりモノクローナル抗体を精製した。

即ちPA−1Nの腹水6mlを等量の結合緩衝液（3.5M NaC
l、0.05％NaN₃を含む1.5Mグリシン、pH9.0）で希釈した
のち、あらかじめ結合緩衝液で平衡化したプロテイン−
Ａ−セファロース（ファルマシア製）カラムに供し、特
異抗体を溶離緩衝液（0.05％NaN₃を含む0.1Mクエン酸緩
衝液、pH3.0）で溶出した。以上の操作により、28mgの
特異抗体を得た。

同様にして、PA−5Nの腹水5mlより23mgの特異抗体
を、PA−6Nの腹水7.5mlより13mgの特異抗体を、また、P
A−1Cの腹水14mlより、45mgの特異抗体を得た。

一方、PA−3Nの腹水20mlに最終濃度45％の飽和硫安溶
液を加え塩析後、遠心分離（20,000g、30分）し、沈殿
画分を0.15MのNaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液、pH8（BB
S）に対し透析し、さらに、0.01MのNaClを含む0.01Mリ
ン酸緩衝液に対し透析した。該抗体画分をDEAEセルロー
スカラム（2.5×10cm、ワットマン社製DE−52）に供
し、NaCl濃度の直線勾配（0.01M−0.35M）100mlで溶出
した。以上の操作により特異抗体136mgを得た。

同様にして、PA−2Cの腹水7.5mlから特異抗体57mgを
得た。

実施例11 モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの
決定 上記調製PACAP38NH₂を５μg/mlを含む0.1M炭酸緩衝
液、pH9.6溶液を96ウェルマイクロプレートに100μず
つ分注し、４℃で24時間放置した。上記実施例５−１で
述べた方法に従って、ウェルの余剰の結合部位をブロッ
クエースでふさぎPACAP38NH₂結合プレートを作製した。
次に該プレートに、PA−1N、PA−3N、PA−5N、PA−6N、
PA−2CおよびPA−1Cの培養上清100μを加え、室温で
３時間反応させたのち、アイソタイプタイピングキット
（Mouse−Typer^TM Sub−Isotyping Kitバイオラッド社
製）を用いるエンザイム−リンクトイムノソーベントア
ッセイ（ELISA）によってクラス、サブクラスを調べ
た。その結果PA−1Na、PA−6Na、PA−2Ca、およびPA−1
CaはIgG1、κ、PA−5NaはIgG2a、κ、PA−3NaはIgG2b、
κであった。

実施例12 Ｆ（ab′）_２画分の調製 上記実施例10記載のPA−6Naをコロジオンバッグ（エ
ムエス機器社製）で8mg/500μにまで濃縮したのち、
0.1M NaClを含む0.1M酢酸緩衝液に対し透析した。該抗
体溶液にペプシン（シグマ社、２回結晶）0.4mgを加
え、37℃、16時間反応させたのち、0.1Mリン酸緩衝液、
pH6.8で平衡化したスーパーロース12カラムを用いるFPL
C（ファルマシア社製）でＦ（ab′）_２画分を精製し
た。

同様の手法により、上記実施例10記載のPA−1Ca 8.9m
gに0.445mgのペプシンを加え、Ｆ（ab′）_２画分を調製
した。

実施例13 HRP標識化抗PACAPモノクローナル抗体の作製 （１）PA−6Na Ｆ（ab′）_２−HRP 上記実施例12記載PA−6Na Ｆ（ab′）_２画分2.2mg
（22nmol）/ml、1mlにGMBS、260nmolを含むDMF50μｌを
加え、室温で40分反応させた。反応液をセファテックス
Ｇ−25カラム（１×30cm、溶離液、0.1Mリン酸緩衝液、
pH6.7）で分離し、得られたマレイミド基の導入された
Ｆ（ab′）_２画分1.5mgと、上記実施例４−１記載の方
法により調製されたSH基の導入されたHRP5.5mgとを混合
し、コロジオンバッグで約0.3mlにまで濃縮したのち、
４℃で16時間放置した。反応液を溶離液に0.1Mリン酸緩
衝液、pH6.5を用いるウルトロゲルAcA34カラム（10mmφ
×40mm）に供し、Ｆ（ab′）_２−HRP複合体画分を精製
した。280nmと403nmの吸光度から、Ｆ（ab′）₂1分子あ
たり2.4ヶのHRPが導入されたことが確認された。

（２）PA−1Ca Ｆ（ab′）_２−HRP 同様の方法により、上記実施例12に記載PA−1CaF（a
b′）_２画分2.9mgを用いて、Ｆ（ab′）_２−HRP複合体
を作製した。

（３）PA−2Ca IgG−HRP 上記実施例10記載のPA−2Ca精製画分6.4mg（43n mol
に15倍molのGMBSを加え、マレイミド基を導入後同様の
方法により、SH基を導入されたHRPと反応させ、IgG1分
子あたり、2.4ヶのHRPが導入された標識体を作製した。

実施例14 競合法−EIA （１）PA−1Naを用いる競合法−EIA 上記実施例５記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結
合マイクロプレートに、バッファーＨで50倍に希釈した
PA−1N培養上清50μ、およびPACAPあるいはPACAP部分
ペプタイド、即ち、PACAP38NH₂、PACAP27NH₂、PACAP
（４−27）、PACAP（１−13）、PACAP（14−38）NH₂、P
ACAP（31−38）NH₂、あるいはVIPのバッファーＨ溶液50
μを加え、室温で２時間反応させたのち、上記実施例
４−１記載HRP標識化PACAP38NH₂（バッファーＨで100倍
希釈）を50μ加え、４℃で16時間反応させた。反応
後、PBSで洗浄したのち固相上の酵素活性を上記実施例
５記載の方法により測定した。結果を第３図（ａ）に示
す。

図中、−○−がPACAP38NH₂を、−●−がPACAP27NH
₂を、−▲−がPACAP（４−27）OHを、−■−がPACAP
（１−13）OHを、−△−がPACAP（14−38）NH₂を、−□
−がPACAP（31−38）NH₂を、また−×−がVIPの標準曲
線を示す。

第３図（ａ）の結果から、PA−1NaがPACAP38NH₂、PAC
AP27NH₂、PACAP（１−13）OH、PACAP（４−27）OHと反
応し、PACAP（14−38）NH₂、PACAP（31−38）NH₂と反応
せず、また、VIPとも反応しない（交差反応性0.1％以
下、対PACAP38NH₂）ことから、PACAP38NH₂のＮ端部分を
認識する、クラスI aの抗体であることが分った。

（２）PA−5Naを用いる競合法−EIA 上記実施例14−（１）記載の方法により、PA−5Naを
用いる（PA−5Nの培養上清70倍希釈）競合法−EIAを実
施した。結果を第３図（ｃ）に示す。この結果から、PA
−5Naが、PACAP38NH₂、PACAP27NH₂、PACAP（１−13）O
H、PACAP（４−27）OHと反応し、PACAP（14−38）NH₂、
PACAP（31−38）NH₂と反応せず、また、VIPとも反応し
ない（交差反応性0.1％以下）ことから、PACAP38NH₂の
Ｎ端部分を認識するクラスI aの抗体であることが分っ
た。

なお、PA−1NaとPA−5Naとは、PACAP（１−13）OHと
の交差反応性（対PACAP38NH₂）において異っており、該
交差反応性は前者が後者の10倍以上強い。

（３）PA−3Naを用いる競合法−EIA 上記実施例14−（１）記載の方法により、（PA−3Nの
培養上清50倍希釈）PA−3Naを用いる競合法−EIAを実施
した。結果を第３図（ｂ）に示す。この結果から、PA−
3NaがPACAP38NH₂、PACAP27NH₂、PACAP（１−13）OH、PA
CAP（４−27）OHと反応し、PACAP（14−38）NH₂、PACAP
（31−38）NH₂と反応せず、一方、VIPとは１％の交差反
応性を示す（対PACAP38NH₂）ことから、PACAP38NH₂のＮ
端部分を認識するクラスI bの抗体であることが分っ
た。

（４）PA−6Naを用いる競合法−EIA 上記実施例14−（１）記載の方法により、（PA−6Nの
培養上清40倍希釈）PA−6Naを用いる競合法−EIAを実施
した。結果を第３図（ｄ）に示す。この結果から、PA−
6NaがPACAP38NH₂、PACAP27NH₂、PACAP（４−27）OHと反
応し、PACAP（１−13）OH、PACAP（14−38）NH₂、PACAP
（31−38）NH₂と反応せず、また、VIPとも反応しない
（交差反応性0.1％以下、対PACAP38NH₂）ことから、PAC
AP38NH₂のＮ端部分から中央部分に至る領域を認識する
クラスIIの抗体であることが分った。

（５）PA−2Caを用いる競合法−EIA 上記実施例14−（１）記載の方法により、（PA−2Cの
培養上清340倍希釈）PA−2Caを用いる競合法−EIAを実
施した。結果を第３図（ｅ）に示す。この結果から、PA
−2CaがPACAP38NH₂、PACAP（14−38）NH₂と反応し、PAC
AP27NH₂、PACAP（４−27）OH、PACAP（１−13）OH、PAC
AP（31−38）NH₂と反応せず、また、VIPとも反応しない
（交差反応性0.1％以下、対PACAP38NH₂）ことから、PAC
AP38NH₂のＣ端部分から中央部分に至る領域を認識する
クラスIIIの抗体であることが分った。

（６）PA−1CAを用いる競合法−EIA 上記実施例14−（１）記載の方法により、（PA−1Cの
培養上清35倍希釈）PA−1CAを用いる競合法−EIAを実施
した。結果を第３図（ｆ）に示す。この結果から、PA−
1CAがPACAP38NH₂、PACAP（14−38）NH₂、PACAP（31−3
8）NH₂と反応し、PACAP27NH₂、PACAP（４−27）OH、PAC
AP（１−13）OHと反応せず、また、VIPとも反応しない
（交差反応性0.1％以下、対PACAP38NH₂）ことから、PAC
AP38NH₂のＣ端部分を認識するクラスIVの抗体であるこ
とが分った。

以上、PA−1Na、PA−5Na、PA−3Na、PA−6Na、PA−2C
aおよびPA−1Caを用いる競合法−EIAにより、それぞれ
少なくとも400、100、200、200、20および200pg./ウェ
ルのPACAP38NH₂を検出する（B/Bo＝80％を与えるPACAP
濃度）ことが可能であった。

実施例15 サンドイッチ法−EIA （１）PA−6Na Ｆ（ab′）_２−HRPを用いるサンドイッ
チ法−EIA 上記実施例10記載の精製したモノクローナル抗体PA−
1Na、PA−3Na、PA−5Na、PA−6Na、PA−2CaあるいはPA
−1Ca15μg/mlを含む0.1M炭酸緩衝液、pH9.6溶液を96ウ
ェルマイクロプレートに100μずつ分注し、４℃で24
時間放置した。ウェルの余剰の結合部位をPBSで４倍希
釈したブロックエース300μを加え不活化した。

以上のように調製したプレートに、バッファーＥで希
釈したPACAP38NH₂標準液100μを加え、４℃で24時間
反応させた。PBSで洗浄したのち、上記実施例13−
（１）で作製したHRP標識化PA−6Na Ｆ（ab′）_２（バ
ッファーＣで100倍希釈）100μを加え、４℃で24時間
反応させた。PBSで洗浄したのち、上記実施例５記載の
方法により固相上の酵素活性を測定した。結果を第４図
に示す。

PA−6Na（クラスII）Ｆ（ab′）_２−HRPを用いるサン
ドイッチ法−EIAにおいては、固相用抗体としてPA−2Ca
（クラスIII）を用いた場合が最も高感度であり、少な
くとも0.4pg/ウェルのPACAP38NH₂を検出することが可能
であった。また、固相用抗体としてPA−1Ca（クラスI
V）を用いた場合2pg/ウェルの、また、PA−5NA（クラス
I a）を用いた場合40pg/ウェルのPACAP38NH₂が検出され
た。

以上の結果から、クラスIIの抗体であるPA−6Naを標
識体として用いた場合、他のいずれのクラス（１次配列
上隣接するクラスも含む）の抗体を固相用抗体としても
サンドイッチ法−EIAが設定されること、とりわけ、ク
ラスIIIの抗体であるPA−2Caを固相用抗体とするサンド
イッチ法−EIAが高感度であることが分った。

（２）PA−1Ca Ｆ（ab′）２−HRPを用いるサンドイッ
チ法−EIA 上記（１）記載の各種抗体を感作したマイクロプレー
トと上記実施例13−（２）記載のHRP標識化PA−1Ca Ｆ
（ab′）_２とを用いるサンドイッチ法−EIAを上記
（１）記載の方法により実施した。結果を第５図に示
す。

PA−1CA（クラスIV）Ｆ（ab′）_２−HRPを用いるサン
ドイッチ法−EIAにおいては、固相用抗体としてPA−3Na
（クラスI b）を用いた場合が最も高感度であり、少な
くとも1pg/ウェルのPACAP38NH₂を検出することが可能で
あった。また、固相用抗体として、PA−1Na（クラスI
a）、PA−5Na（クラスI a）、PA−6Na（クラスII）を用
いた場合、少なくとも2pg/ウェルのPACAP38NH₂が検出さ
れた。さらに、１次配列上隣接するクラスIIIの抗体を
固相用抗体としても少なくとも8pgのPACAP38NH₂が検出
された。

以上の結果から、クラスIVの抗体であるPA−1Caを標
識体として用いた場合、他のいずれのクラス（１次配列
上隣接するクラスも含む）の抗体を固相用抗体としても
サンドイッチ法−EIAが設定されること、とりわけ、ク
ラスI bの抗体であるPA−3Naを固相用抗体とするサンド
イッチ法−EIAが高感度であることが分った。

（３）PA−2Ca IgG−HRPを用いるサンドイッチ法−EIA 上記（１）記載の各種抗体を感作したマイクロプレー
トと上記実施例13−（３）記載のHRP標識化PA−2Ca Ig
Gとを用いるサンドイッチ法−EIAを上記（１）記載の方
法により実施した。結果を第６図に示す。

PA−2Ca（クラスIII）IgG−HRPを用いるサンドイッチ
法−EIAにおいては、固相用抗体としてPA−3Na（クラス
I b）を用いた場合が最も高感度であり、少なくとも2pg
/ウェルのPACAP38NH₂を検出することが可能であった。
また、固相用抗体として、PA−1Na、PA−5NaおよびPA−
6Naを用いた場合には、4pg/ウェルの、またPA−1Caを用
いた場合には80pg/ウェルのPACAP38NH₂が検出された。

以上の結果から、クラスIIIの抗体であるPA−2Caを標
識体として用いた場合、他のいずれのクラス（１次配列
上隣接するクラスも含む）の抗体を固相用抗体としても
サンドイッチ法−EIAが設定されること、とりわけ、ク
ラスI bの抗体であるPA−3Naを固相用抗体とするサンド
イッチ法−EIAが高感度であることが分った。

実施例16 サンドイッチ法−EIAの特異性 上記実施例15−（１）記載の、PA−2Caを固相用抗体
とし、PA−6Na Ｆ（ab′）_２−HRPを標識用抗体とする
サンドイッチ法−EIAにおいて、PACAP38NH₂、VIP、GR
F、およびセクレチンに対する反応性を検討した。結果
を第７図に示す。

図中、−○−が、PACAP38NH₂を、−●−がPACAP27NH₂
の、−▲−がVIPの、−△−がGRFの、また−■−がセク
レチンの濃度依存曲線を示す。

該測定法においては、PACAP27NH₂、VIP、GRF、および
セクレチンに対する交差反応性はいずれも0.001％であ
り、該測定法がPACAP38NH₂に特異的であることが分っ
た。

実施例17 家兎PACAP（11−27）NH₂抗体の精製 家兎PACAP（11−27）NH₂を精製するためのアフィニテ
ィ固相を作製した。すなわち、〔Cys¹⁰〕PACAP（11−2
7）NH₂4.5mgを20mlの0.5M食塩を含む0.1M炭酸水素ナト
リウムに溶解させ、3gのCNBr活性化セファロース4Bと室
温３時間反応させた。次に、未反応の活性基を0.1Mトリ
ス−塩酸緩衝液、pH8で処理したのち、PBSに分散させ、
カラムに充填した。

高い抗体活性が認められた家兎PACAP（11−27）NH₂抗
血清1C 8ml,2C 8mLおよび3C 16ml（第２図参照）を混合
し、PBS 32mlを加えたのち、さらに52mlの飽和硫安を徐
々に撹拌したのち、12,000×ｇで20分間遠心し、沈殿を
0.15M食塩を含むホウ酸緩衝液、pH8（以下BBSと略す）2
5mlに溶解させたのちBBSに対し４℃、２日間透析した。
透析後、上記カラムに付し、BBSで十分に洗浄したのち
特異抗体を0.5M食塩を含む0.1M酢酸緩衝液、pH4.5で溶
出し、さらに0.1M食塩を含む0.05Mグリシン−塩酸緩衝
液、pH2.0で溶出した。その結果pH4.5およびpH2で溶出
された画分にそれぞれ特異抗体5.4mgおよび6.7mgが得ら
れた。

実施例18 抗PACAP（11−27）NH₂Fab′−HRPの作製 上記実施例17記載の抗PACAP（11−27）NH₂抗体より、
石川らの方法〔ジャーナル オブ アプライド バイオ
ケミストリー（J.Appl.Biochem.）,6:56−63（1984）〕
に従ってFab′−ペルオキシダーゼ標識体を作製した。

即ち、0.1M酢酸緩衝液、pH4.5に溶解した特異抗体5.6
mgにペプシン（シグマ社、２回結晶）160μｇを加え、3
7℃、20時間反応させたのち、0.1M酢酸緩衝液、pH5で平
衡化したスーパーロース12カラムを用いるFPLC（ファル
マシア社製）でＦ（ab′）_２画分2.2mgを得た。該画分
に、最終20mMのβ−メルカプトエチルアミンを加え、37
℃で90分放置したのち、反応液を5mM EDTAを含む0.1Mリ
ン酸緩衝液、pH6.0で平衡化したセファデックスＧ−25
カラムで分離し、Fab′画分を得た。

一方、上記実施例４−２記載の方法に従って調製した
マレイミド化HRP 6mgと、上記抗PACAP（11−27）NH₂Fa
b′画分全量とを混合し、４℃で２日間反応させたの
ち、0.1Mリン酸緩衝液、PH6.5で平衡化したウルトロゲ
ルAcA44カラムで分画し、HRP標識化抗PACAP（11−27）N
H₂Fab′を精製した。

実施例19 PACAP27NH₂測定用サンドイッチ−EIA （１）上記実施例15記載のPA−1Naを固定したマイクロ
プレートに、バッファーＥで希釈したPACAP27NH₂、PACA
P（１−27）OH、PACAP38NH₂標準液100μを加え、４℃
で24時間反応させた。PBSで洗浄したのち、上記実施例1
8記載HPR標識化抗PACAP（11−27）NH₂Fab′（バッファ
ーＣで400倍希釈）を加え、４℃で24時間反応させた。P
BSで洗浄したのち、上記実施例５−２記載の方法により
固相上の酵素活性を測定した。結果を第８図に示す。

図中、−●−がPACAP27NH₂を、−▲−がPACAP（１−2
7）OHを、−■−がPACAP38NH₂を、−○−がVIPの標準曲
線を示す。第８図の結果から、この測定法により、0.2p
g/wellのPACAP27NH₂を、PACAP（１−27）OHと11.5％
の、またPACAP38NH₂と重量比では0.97％、モル比では1.
3％の交差反応性で検出し得ることがわかった。

（２）上記実施例15記載のPA−3Naを固定したマイクロ
プレートと、上記実施例18記載HRP標識化PACAP（11−2
7）NH₂Fab′とを用いて、上記記載の方法によりサンド
イッチ法−EIAを実施した。結果を第９図に示す。この
測定法により、0.2pg/wellのPACAP27NH₂を、PACAP（１
−27）OHと11％の、またPACAP38NH₂と重量比で0.22％、
モル比で0.31％の交差反応性で検出し得ることがわかっ
た。

（３）上記実施例15記載のPA−5Naを固定したマイクロ
プレートと、上記実施例18記載HRP標識化PACAP（１−2
7）NH₂Fab′とを用いて、上記記載の方法によりサンド
イッチ法−EIAを実施した。結果を第10図に示す。この
測定法により、0.2pg/wellのPACAP27NH₂を、PACAP（１
−27）OHと4.1％の、またPACAP38NH₂と重量比で0.40
％、モル比で0.56％の交差反応性で検出し得ることがわ
かった。

（４）上記実施例15記載のPA−6Naを固定したマイクロ
プレートと、上記実施例18記載HRP標識化PACAP（11−2
7）NH₂Fab′とを用いて、上記記載の方法によりサンド
イッチ法−EIAを実施した。結果を第11図に示す。この
測定法により、0.8pg/wellのPACAP27NH₂を、PACAP（１
−27）OHと5.4％の、またPACAP38NH₂と重量比で3.6％、
モル比で5.00％の交差反応性で検出し得ることがわかっ
た。

なお、いずれの測定法もVIPと0.001％以下の交差反応
性しか示さなかった。

以上の結果から、これらの測定法を用いることによ
り、PACAP27NH₂を、PACAP38NH₂と重量比で0.22〜3.6
％、モル比で0.31〜5.0％の交差反応性で検出し得るこ
とから、これらの測定法と、上記実施例16記載の測定法
とを組み合わせることにより、PACAP27NH₂とPACAP38NH₂
とを分別定量することが可能である。

実施例20 抗PACAP抗体の中和活性能の検討 ラット副腎褐色細胞腫株PC−12h（大阪大学、蛋白研
究所、畠中博士より供与）をコラーゲン処理した48ウェ
ルマルチウェルプレート（住友ベークライト社製）上
に、５×10⁴セル／ウェルの割合で播き、10％のFCSを含
むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で７〜10日間
培養した。該プレートの培地を0.05％のBSAを含むハン
クス液（HBSS:Hanks′ balanced salt solution）に変
換し、30分間培養したのち、抗PACAP抗体（最終濃度
２、20あるいは200nM）とあらかじめ４℃で１時間反応
させたPACAP38NH₂（最終濃度2nM）を加えた。さらに２
時間培養したのち、培養上清中のcAMP濃度をcAMP測定キ
ット（アマシャム社製）で測定した。結果を第12図に示
す。図中、−○−がPA−1Naを、−△−がPA−3Naを、−
□−がPA−5Naを、−■−がPA−6Naを、−▲−がPA−2C
aを、−●−がPA−1Caを表わす。この結果から、これら
６種類のモノクローナル抗PACAP抗体のうち、４種類はP
ACAP38NH₂に対して中和能を有しており、その強さは、P
A−2Ca（クラスIIIの抗体）＞PA−1Na（クラス1aの抗
体）＞PA−5Na（クラス1aの抗体）＞PA−3Na（クラス1b
の抗体）の順であることがわかった。

本発明のPACAPの一次配列上連続した部位を認識する
種々のモノクローナル抗体を用いることにより、PACAP
の免疫化学的な性質が明らかにされた。また、これらの
抗体を用いることにより、PACAPあるいはその関連ペプ
タイドに対し特異性の異なる種々の競合法あるいはサン
ドイッチ法による測定系を設定することが可能であり、
とりわけ、種々のサンドイッチ法を組み合わせることに
より、PACAP38NH₂とPACAP27NH₂とを高感度に分別定量す
ることが可能となった。

実施例21 ヒトPACAP前駆体に対する抗PACAPモノクロー
ナル抗体の反応性に関する検討 ヒトPACAP前駆体遺伝子を組み込んだプラスミドpTS40
1を持つ大腸菌を10mlのM9培地（0.1％ NZアミン,0.4％
グルコース,Ampicillinを50μg/mlおよびChloramphen
icolを25μg/ml含む）で37℃下に培養し、600nmにおけ
る吸光度が0.7まで菌体増殖した時、終濃度0.4mMとなる
ようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
を添加してさらに３時間培養を続けた後、5000g10分間
の遠心で集菌した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド添加直前の菌体をコントロールとして集菌
した。

菌体に1mlのLaemmliのSDS含有sample bufferを加え、
100℃で５分間沸騰させ、16％のポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行った。Western blotting法により、ニト
ロセルロースフィルターへ蛋白を電気的に移し、抗PACA
Pマウスモノクローナル抗体（PA−1Na,−1Caおよび−2C
a）をそれぞれ反応させた後、二次抗体（抗マウスIgG−
パーオキシダーゼ,CAPPEL社製）を反応させた。和光純
薬PODイムノステインセットにより目的とする蛋白のバ
ンドを発色、固定した。抗PACAPマウスモノクローナル
抗体PA−1NaおよびPA−2Caと反応するバンドは分子量約
18,000ダルトン付近に確認された。このバンドはヒトPA
CAPをコードするcDNAから予想されるヒトPACAP前駆体の
分子量とほぼ一致しており、抗PACAPマウスモノクロー
ナル抗体PA−1NaおよびPA−2CaがヒトPACAP前駆体と反
応することが明らかとなった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２８１２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２８１３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２８１４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２８１５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２８１６ 前置審査 (56)参考文献 特開 平３−123798（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−22987（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．166, Ｎｏ．１（1990．Ｊａｎ．）ｐ．81−89 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．164, Ｎｏ．１（1989）ｐ．567−574 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 16/18 C12P 21/08 G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記〔式４〕、〔式５〕、〔式６〕もしく
   は〔式７〕で表わされるPACAPの部分ペプチドの少なく
   とも１種類に特異的に結合する、 PA−1N（FERM BP−2811）により製造されるPA−1Naで
   標示されるモノクローナル抗体、 PA−5N（FERM BP−2813）により製造されるPA−5Naで
   標示されるモノクローナル抗体、 PA−6N（FERM BP−2814）により製造されるPA−6Naで
   標示されるモノクローナル抗体、 PA−2C（FERM BP−2815）により製造されるPA−2Caで
   標示されるモノクローナル抗体、または PA−1C（FERM BP−2816）により製造されるPA−1Caで
   標示されるモノクローナル抗体。 〔式４〕PACAP（４−27） 〔式５〕PACAP（１−13） 〔式６〕PACAP（14−38）NH₂ 〔式７〕PACAP（31−38）NH₂
2. 【請求項２】ハイブリドーマ細胞が PA−1N（FERM BP−2811）、 PA−5N（FERM BP−2813）、 PA−6N（FERM BP−2814）、 PA−2C（FERM BP−2815）、または PA−1C（FERM BP−2816）である請求項１記載のモノク
   ローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
3. 【請求項３】担体上に不溶化したPACAPに対する第１抗
   体に被検液を接触させた後、PACAPに対する標識化され
   た第２抗体を接触させ、不溶化担体上の標識剤の活性を
   測定することを特徴とする、被検液中のPACAPまたはPAC
   AP部分ペプチドの定量法において、第１および第２抗体
   の一方がPA−1Na（FERM BP−2811）、PA−3Na（FERM
   BP−2812）、PA−5Na（FERM BP−2813）、PA−6Na（FE
   RM BP−2814）、PA−2Ca（FERM BP−2815）のいずれ
   か、あるいはそれらの複合物であり、他方がPA−1Ca（F
   ERM BP−2816）であるPACAPまたはPACAP部分ペプチド
   の定量法。
4. 【請求項４】担体上に不溶化したPACAPに対する第１抗
   体に被検液を接触させた後、PACAPに対する標識化され
   た第２抗体を接触させ、不溶化担体上の標識剤の活性を
   測定することを特徴とする、被検液中のPACAPまたはPAC
   AP部分ペプチドの定量法において、第１および第２抗体
   の一方がPA−1Na（FERM BP−2811）、PA−3Na（FERM
   BP−2812）、PA−5Na（FERM BP−2813）、PA−6Na（FE
   RM BP−2814）のいずれか、あるいはそれらの複合物で
   あり、他方がPA−2Ca（FERM BP−2815）であるPACAPま
   たはPACAP部分ペプチドの定量法。
5. 【請求項５】担体上に不溶化したPACAPに対する第１抗
   体に被検液を接触させた後、PACAPに対する標識化され
   た第２抗体を接触させ、不溶化担体上の標識剤の活性を
   測定することを特徴とする、被検液中のPACAPまたはPAC
   AP部分ペプチドの定量法において、第１および第２抗体
   の一方がPA−5Na（FERM BP−2813）であり、他方がPA
   −6Na（FERM BP−2814）であるPACAPまたはPACAP部分
   ペプチドの定量法。
6. 【請求項６】担体上に不溶化したPACAPに対する第１抗
   体に被検液を接触させた後、PACAPに対する標識化され
   た第２抗体を接触させ、不溶化担体上の標識剤の活性を
   測定することを特徴とする、被検液中のPACAPまたはPAC
   AP部分ペプチドの定量法において、第１および第２抗体
   の一方がPA−1Na（FERM BP−2811）、PA−3Na（FERM
   BP−2812）、PA−5Na（FERM BP−2813）、PA−6Na（FE
   RM BP−2814）のいずれか、あるいはそれらの複合物で
   あり、他方が 〔式９〕： で表されるPACAP27のＣ−端ペプチドまたはPACAP（11−
   27）に特異的に結合するポリクローナル抗体あるいはモ
   ノクローナル抗体であるPACAPまたはPACAP部分ペプチド
   の定量法。
7. 【請求項７】担体上に不溶化したPACAPに対する第１抗
   体に被検液を接触させた後、PACAPに対する標識化され
   た第２抗体を接触させ、不溶化担体上の標識剤の活性を
   測定することを特徴とする、被検液中のPACAPまたはPAC
   AP部分ペプチドの定量法において、担体上に不溶化した
   第１抗体がPA−2Ca（FERM BP−2815）であり、第２抗
   体がPA−6Na（FERM BP−2814）であるPACAPまたはPACA
   P部分ペプチドの定量法。