JP3115606B2

JP3115606B2 - βＡ４ペプチドに特異的なモノクローナル抗体

Info

Publication number: JP3115606B2
Application number: JP08525208A
Authority: JP
Inventors: ゲルハルトケーニッヒ、; ポールグラハム、
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1995-02-14
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 2000-12-11
Anticipated expiration: 2016-02-14
Also published as: EP1160256B2; EP0809656A1; DK1160256T4; DK1160256T3; US5786180A; PT809656E; CA2212887A1; HK1114105A1; EP1160256A2; MX9706189A; ES2288896T3; DK0809656T3; ATE210681T1; DE69617916D1; EP1160256A3; DE69637150T3; EP1160256B8; US5693753A; PT1160256E; CA2212887C

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明はアルツハイマー病、特に、アミロイド前駆体
蛋白質に由来するβA4ペプチドに特異的なモノクローナ
ル抗体、かかる抗体を産生する細胞、かかるモノクロー
ナル抗体を創製する方法、および診断および治療におい
てかかる抗体を使用する方法に関する。

背景技術アルツハイマー病（AD）は不可逆的な進行性神経変性
脳障害である。数年間にわたって、ADの進行は記憶喪
失、痴呆症、および最終的には死亡に至る。現在、米国
において第４の死亡原因であり、年間ほぼ100,000人の
死亡を占める。典型的には、ADは主として年配の人に影
響し、従って、近代社会の成熟に伴い、近い将来に増大
する健康的関心となることが予測される。該病気の開始
後まもなく、患者は時に関して助力を必要とする。これ
は、我々の社会にとって、重大な心理学的ならびに経済
的問題を示す。現在、ADの診断、予防、治療または治癒
についての証明された手段は存在しない。

神経病理学的には、ADはある種の脳領域における大量
の神経細胞の喪失、ならびにAD患者の脳における蛋白質
性物質の沈着によって特徴付けられている。これらの沈
着は、細胞内神経原線維変化（intracellular neurofib
rillary tangle）および細胞外β−アミロイドプラーク
である。β−アミロイドプラークの主要な蛋白質成分は
βA4ペプチドである。精製されたβ−アミロイドプラー
ク物質の配列解析および質量分析は、βA4ペプチドの最
大長さが43個のアミノ酸であることを示した。しかしな
がら、典型的には、該ペプチドのあるものは40位または
42位のいずれかでも終わり得る（Millerら、1993,Arch.
Biochem.Buiphys.301:41−52）。同様に、Ｎ−末端にお
いて、ある種の不揃いが観察でき、これは主として１、
４または11位で始まる、いくつかの異なる形態のペプチ
ドを導く（Millerら、1993）。

分子クローニングは、βA4ペプチドは「アミロイド前
駆体蛋白質」（APP）と呼ばれるかなり大きい前駆体蛋
白質に由来することを明らかとした（Kangら、1987,Nat
ure 325:733−736）（図１）。図１は、膜貫通（Tm＝膜
領域）蛋白質であるアミロイド前駆体蛋白質（APP）を
示し、ここにＮ−末端は細胞外に位置し、Ｃ−末端は細
胞内（細胞質）に位置することを示している。βA4は膜
に部分的に埋もれている。いくつかの別にスプライシン
グされたイソ型タンパク質（isoform）が記載されてお
り、これは広範囲な翻訳後修飾を受ける（Selkoe、199
4,Ann.Rev.Neurosci.17:489−517）。βA4配列自体は部
分的に細胞外側に位置し、部分的に膜貫通領域中に伸び
ている（図２）。図２（配列番号:3）はβA4配列を説明
し、示してある（丸で囲んだ領域）はそのＣ−末端が膜
貫通領域（Tm、ボックスの領域）中に伸び、Ｎ−末端は
細胞外領域に位置する。アスタリスクは、APP遺伝子に
おける家族性の突然変異の位置を示し；それらはβA4配
列に隣接しているか、あるいはβA4配列の中央部分の中
心にある。APPにおける３つの主要な切断部位（α、β
およびγ）が示される。βA4の切り出しは、従って、該
ペプチドのＮ−末端上にて（β−切断）およびＣ−末端
にて（γ−切断）、１以上のプロテアーゼの蛋白質分解
作用を介して起こると仮定された（図２）（Selkoe、19
94）。APPの分泌の間における主要な事象はα−切断に
おけるものである（βA4「１−42」の16/17位）。この
分泌されるAPP分子（αAPP）はカルボキシル末端にβA4
配列の最初の16個のアミノ酸を含有する。残りの細胞関
連APP断片（いわゆるＣ−末端断片（CTF））はβA4配列
のＣ−末端部分を含有し、APPの細胞質内領域まで伸び
ている。従って、この蛋白質分解切断の結果により断片
が生じ、これはアミロイド性断片に直接的または間接的
に至るようにプロセッシングされ得ない（非アミロイド
性プロセッシング）（Selkoe、1994）。

最近、安定にトランスフェクトされたAPP cDNA構築
体を介して大量のAPPを発現する細胞系が高ピコモルな
いし低ナノモル量のβA4を産生し、培地中に速やかに放
出することが示された（Shojiら、1992,Science 258:12
6−129）。また、全ての初代細胞培養および細胞系が実
質的にβA4を構成要素として放出することも見い出され
た（Busciglioら、1993,PNAS USA 90:2092−2096）。加
えて、健康な対照ならびにアルツハイマー患者は血清お
よびCSF中に低ナノモル量のβA4を含有することが示さ
れた（Seuberら、1992,Nature 359:325−327）。これら
の体液および順化培地中の検出された可溶性βA4の大部
分はβA4「１−40」であり、これはβ−アミロイドプラ
ーク沈着で見い出された総組成を真に反映するものでは
ない。βA4の産生および引き続いての放出は十分であ
り、従って、AD患者の脳におけるβ−アミロイドプラー
クの形成の原因であるという説は、もはや維持すること
ができず；他の因子がβ−アミロイドプラークの沈着に
寄与しているにちがいない。１の簡単な仮説は、βA4の
急性および慢性的な過剰生産がADで観察される増大した
アミロイド負荷を引き起こすというものである。

APP遺伝子のβA4領域におけるおよびその回りの特異
的点突然変異がある種の家族性アルツハイマー病（FA
D）ケースにリンクしているという知見は、APP遺伝子が
「病気遺伝子」であるということを明白に示した（Goat
eら、1991,Nature 349:704−706;Murrellら、1991,Scie
nce 254:97−99;Levyら、1990,Science 248:1124−112
6;Carterら、1992,Nature Genetics 2:255−256）。AD
が特異的年齢の発症を伴って優性的に遺伝される家系で
は、APP遺伝子における点突然変異が必要であり、ADを
引き起こすに十分である。アルツハイマー病のほとんど
大部分は孤発性であって、恐らくは多因子的であるが、
これらの家族性APP突然変異は我々にアミロイド原性（a
myloidogenesis）につき多くを、すなわち、より大きな
前駆体からの小さなβA4ペプチドの生成および引き続い
て起こるβ−アミロイドプラーク中での沈着を教示す
る。

APPコドン670/671における二重突然変異（APPにおけ
るβA4のＮ−末端での「スウェーデン変異体」）は、そ
の突然変位したAPP cDNAで安定にトランスフェクトさ
れた細胞培養で５ないし８倍高いβA4の放出を引き起こ
す（図２）（Citronら、1992;Caiら、1993）。この二重
点突然変位がβ−切断での増大した蛋白質分解のために
APPの増大した代謝回転を導き、これが切り出されたβA
4のより高いレベルを導くことになると考えられる。増
大した量のβA4モノマーは、「スウェーデン突然変異」
によるトランスフェクション実験によって示されるよう
に、これらの家族内におけるβ−アミロイドプラークへ
のβA4の凝集のより速い動力学を説明することができ
る。

もう１つのFAD突然変異は717位でのβA4のＣ−末端に
存在し（「ロンドン変異体」）、組織培養において放出
されたβA4のレベルに影響を与えない（図２）。最近、
この717突然変異は「１−40/142」βA4比を変化させる
ことが示された（Suzukiら、1994,Science 264:1336−1
340）。現在、βA4のＣ−末端の創製がいかにして起こ
るかは明らかではないが、この部分は膜貫通領域に埋も
れているので、「ロンドン突然変異」はAPPからβA4へ
の蛋白質分解に影響を与えると仮定しようとする誘惑に
かられる。恐らくは、この点突然変異はγ−部位におけ
る原因プロテアーゼの切断の忠実度に干渉する。βA4
１−40は、とりわけ、βA4 １−42と比較すると、水溶
液でのその溶解度の劇的な相違を呈する（Burdickら、1
992,JBC 267:546−554）。後者は実質的に水に不溶であ
って、他方、１−40はイン・ビトロで数mg/mlまで水溶
性である。少量のより長い１−42体はイン・ビトロで１
−40の沈殿を劇的に増強し得る。わずかに高い割合のよ
り長い１−42 βA4は、この「ロンドン突然変異」を持
つ患者におけるβA4のβ−アミロイドプラークへの早期
発症の沈着を説明するであろう。また、より短くより可
溶性の１−40種に対する１−42種の割合は独発生ADケー
ス（すなわち、遺伝的傾向が同定されない場合）におけ
る重要な因子の１つであり得る。１−42種に特異的に結
合するモノタローナル抗体は、従って、アミノ酸位42で
終わるβA4の産生および存在が調べるのに有用であり、
ADに存在する異常種の診断的インジケーターとして使用
できる。

40位で終わるβA4を認識する１の抗体、および42位ま
たはそれ以上まで伸びるβA4を認識する１の抗体につい
ての最近の生化学的分析は、より長いβA4の寄与は当該
病気の発症に臨界的であろうことを示した（Sugukiら、
1994）。しかしながら、ススキのモノクローナル抗体は
βA4 １−42、１−43、およびより長いβA4の間を区別
しない。これは、また、もう１つの報告されたモノクロ
ーナル抗体2G9についても当てはまる（Yangら、1994,Ne
uro Report 5:2117−2120）。従って、この交差反応性
を避けるために、42位で終わり他の形態を含まないβA4
に特異的な抗体は、βアミロイドプラークと必ずしも関
連しない典型的な細胞産物である、膜関連Ｃ−末端APP
断片との交差反応性を避けるのに非常に有用であろう。

βA4 １−42を認識する１のモノクローナル抗体は記
載されている（Murphyら、1994,Am.J.Path.144:1082−1
088）。しかしながら、βA4 １−43ペプチドはこれら
の実験で使用されておらず、かくして、このモノクロー
ナル抗体の正確な特異性が１−43ペプチドに応答するで
あろうことは知られていない。競合実験は、40位（「１
−40」）、および44位（「１−44」）で終わるβA4ペプ
チドで、およびさらにこの抗体で行われたに過ぎない。
重要なことには、該抗体は散在するアミロイド（diffus
e amyloid）、線維アミロイド（fibrillar amyloid）、
神経内および神経外の神経原線維変化を染色するが血管
アミロイド（vascular amyloid）を染色しないことが報
告された。

その初期段階におけるアルツハイマー病についてのイ
ン・ビトロ生化学診断テストならびに危険なAD個体につ
いてのスクリーニング手段は利用できない。ADの現在の
診断は、痴呆症および記憶喪失の有意な徴候が示される
まで明確な解答を与え得ない詳細な臨床的評価を要す
る。前記にて言及した研究に鑑み、βA4 １−42はADに
対する前臨床マーカーを表す。かくして、βA4 １−4
2、または他の残基42で終了するもののレベルまたはは
形成を同定すること、およびそれが病気の間にいかに進
行し得るか、およびそれがいかに脳に分布しているかは
ADの進行をモニターし、ならびにADの特異的診断および
可能な治療についての価値ある洞察を提供するであろ
う。

診断テスト、治療剤の調製およびADのモニタリングア
ッセイにとって、現在利用できる抗体の特異性（１−43
と交差反応性；血清アミロイドを染色しないと報告され
ている）とは対照的に、血清アミロイドを染色し、残基
42で終わるβA4ペプチドに特異的であって、従って、当
該分野の診断能力を拡張するモノクローナル抗体、すな
わち、βA4 １−42の遊離Ｃ−末端を認識し、散在する
アミロイド、繊維アミロイド、神経原料線維変化、およ
び血管アミロイドを染色するものを用いることは有用で
あろう。かかる抗体が本出願の主題である。

発明の概要本発明は、βA4ペプチド、特にβA4「１−42」のＣ−
末端に特異的であり、散在するアミロイド、線維アミロ
イド、神経原線維変化、および血管アミロイドを染色す
るモノクローナル抗体を提供する。特に、本発明は、Ｃ
−末端がβA4アミノ酸配列の残基42である全てのβA4ペ
プチドに特異的なモノクローナル抗体を提供する。本発
明は、さらに、同一の結合特異性を有する抗体断片およ
びその構築体とを含む。本発明は、特に、「Mab 369.2
B」として公知のモノクローナル抗体を含み、これは199
5年１月26日に、ブタペスト条約の下、American Type C
ulture Collection（ATCC）に寄託され、寄託番号HB 1
1829が与えられた細胞系「369.2B」によって産生され
る。本発明は、診断、精製および治療用途における本発
明のモノクローナル抗体の使用を含む。

かくして、本発明の１の態様は、42位で終わるβA4に
特異的なモノクローナル抗体を含み、ここに、該抗体は
散在するアミロイド、線維アミロイド、血管アミロイ
ド、および神経原線維変化に結合する。１の特別の具体
例において、本発明は、βA4 １−42ペプチドのＣ末端
アミノ酸に特異的なモノクローナル抗体を提供する。最
も特別の具体例において、本発明は、369.2として同定
され、寄託番号BHB 11829としてAmerican Type Cultur
e Collection（ATCC）に寄託された細胞系によって産生
されるモノクローナル抗体を含む。また、本発明の好ま
しい具体例は、ATCC寄託番号HB 11829によって同定さ
れる細胞を含む。本発明のさらなる具体例において、本
発明のモノクローナル抗体として同一の結合が可能な本
発明のモノクローナル抗体の免疫学的反応性断片が含ま
れる。

また、本発明は、遊離Ｃ−末端残基42を認識するβA4
特異的抗体の産生方法を提供する。また、本発明は、選
択的にモノクローナル抗体の存在を検出することによっ
て、組織試料を本発明のモノクローナル抗体と接触させ
ることによりなる、組織中の、42位で終わるβA4ペプチ
ドの存在を検出する方法を提供する。また、本発明は、
精製すべき試料を本発明のモノクローナル抗体と接触さ
せ、βA4ペプチドを精製すべき試料から分離し、βA4ペ
プチドを単離することよりなる、42位で終わるβA4ペプ
チドの選択的精製法を提供する。さらなる具体例におい
て、本発明は、テストすべき試料を本発明のモノクロー
ナル抗体と接触させ、βA4ペプチドの存在を検出するこ
とよりなる、アルツハイマー病に関連するβA4ペプチド
の検出方法を提供する。

かくして、また、本発明は、本発明のモノクローナル
抗体を投与することによってβA4ペプチドの凝集を防止
する方法を提供する。好ましい具体例において、モノク
ローナル抗体は369.2Bと同一であるか、あるいはそれと
同等な結合特異性を持つ免疫学的活性断片である。かく
して、本発明は、本発明のモノクローナル抗体の免疫学
的反応断片よりなるβA4ペプチドの存在を検出する手段
を提供する。ならびに、本発明のモノクローナル抗体の
免疫学的反応性断片よりなるβA4ペプチドの凝集を防止
する手段を提供する。本発明は、組織または液体試料
（例えば、血液、他の体液、組織切片、バイオプシー組
織等）におけるβA4ペプチドのレベルを検出しモニター
する手段を提供する。好ましい具体例において、検出さ
れ、モニターされ、阻害され、または精製されるべきβ
A4ペプチドは、遊離カルボキシル末端アミノ酸残基がβ
A4ペプチドアミノ酸配列の残基番号42であるβA4ペプチ
ドである。

先行技術または引き続いてのセクションにおける出版
物および特許書類への全ての言及は、引用することによ
って本明細書の一部とみなす。本発明の特に好ましい具
体例は、ある好ましい具体例および請求の範囲のより詳
細な記載から明らかとなるであろう。

図面の簡単な記載本発明は、図面と組み合わせて、以下の詳細な記載を
考慮することによりより完全に理解されるであろう。

図１は、アミロイド前駆体蛋白質（APP）のβA4部
分、細胞膜に対するその位置、およびα、βおよびγ切
断部位を示す模式図である。

図２は、APPのβA4部分、細胞の膜貫通領域に対する
その位置、およびAPPにおける３つの主要な切断部位
（α、βおよびγ）を示す。

図３は、βA4 １−42ペプチドを生成させるために使
用されるクローンpGK003のダイアグラムである。

図4Aは、小麦胚系におけるイン・ビトロで翻訳された
放射性標識のβA4の16％トリス／トリシンゲル上のSD
S−PAGEを示す。

図4Bは、Mab 286.8Aで免疫沈降させた、小麦胚系か
らのイン・ビトロで翻訳された放射性標識のβA4の16％
トリス／トリシンゲル上のSDS−PAGEを示す。

図５は、286.8Aでのイン・ビトロで翻訳されたβA4
（IVT βA4）の免疫沈降性を示すグラフである。

図６は、免疫応答（免疫原性）を生じ、マウスの血清
をスクリーニングするのに使用されるペプチドのダイア
グラムである。

図７は、イン・ビトロで翻訳されたβA4の免疫沈降−
対−抗体濃度；−○− 286.8A、−△−369.2B、−□−
369.6を示すグラフである。

図８は、MAb 369.2によって免疫沈降された種々のβ
A4配列の％を示すグラフである。

図９は、競合アッセイによるMAb 369.2のエピトープ
マッピングを示し、−■−は35−42（OVA）（オボアル
ブミンがカップリングした35−42 βA4ペプチド）であ
り、−□−は１−42 βA4ペプチドであって、−◆−
は、140 βA4ペプチドである。

図10は、MAb 369.2Bの血清アミロイドおよび種々の
形態を持つ他のプラークへの結合を示す写真である。

発明の詳細な記載アルツハイマー病の脳におけるβ−アミロイド沈着
は、主として、Ｎ−ならびにＣ−末端双方の不均一性を
示すβA4ペプチドよりなる。死後脳物質から精製された
β−アミロイドのペプチド配列によって同定された主要
Ｃ−末端は、最大で43残基長であるβA4ペプチドの40位
または42位いずれかで終わる。40位または42位いずれか
で終わる合成βA4ペプチドでのイン・ビトロ実験は、か
なりの物理−化学的相違を示す。従前には、死後組織に
おけるこれらの２種のβA4の分布ならびにイン・ビトロ
におけるそれらの生成は、βA4ペプチドの亜種の間を区
別できるカルボキシル末端に対する抗体の欠如のため突
き止めることができなかった。

最近の証拠は、βA4の放出は実質的に各細胞培養毎に
おける通常の事象であることを示唆する。典型的には、
高ピコモルないし低ナモル濃度のβA4が血清および脳脊
髄液で測定できる（Seubertら、1993）。この知見は驚
くべきものであった。何故ならば、βA4の生成は、βA4
がアルツハイマー病患者の皮質および海馬脳領域におい
てβ−アミロイドプラークとして大量に沈着するので病
理学的事象と推定されていたからである。細胞培養物か
ら放出されたβA4の詳細な配列解析は、主要なものは40
位で終わっていることを明らかとした（Selkoe、199
4）。死後脳から精製されたアミロイドプラークはわず
かに異なる様相を示し；コンコーレッドで染色されるア
ミロイド血管障害（congophilic amyloid angiopathy、
CAA）のアミロイド沈着は血管を囲むβA4凝集体であっ
て、圧倒的にβA4 １−40であり、他方、対照的に、脳
実質に存在し、血管に関連しないアミロイドプラークコ
ア（APC）は（最も普通に残基１、４および11で始ま
る）Ｎ−末端の不揃いを呈し、主として40位または42位
で終わる（GlennerおよびWong、1984,Biochem.Biophys.
Res.Commun.120:885−890;Mastersら、1985,PNAS USA 8
2:4245−4249;Millerら、1993）。特別の場合には、43
位で終わるかさらに延びている長い種類のものも記述さ
れている（Millerら、1993）。疎水性Ｃ−末端の長がイ
ン・ビトロで自己凝集させるペプチドの能力に対して臨
界的であるので（Burdickoら、1992;Jarrettら、1993,B
iochem.32:4693−4697）、２つの区別される病理学的凝
集体APCおよびCAAならびに他の血管β−アミロイドプラ
ークは、２つの種類１−40および１−42の特性を異なっ
たものとすることによって説明できる。また、これは、
老齢のヒトの脳で頻繁に見い出され、ADには関連しない
が、線維状β−アミロイド沈着の前駆体であると提案さ
れているいわゆる「散在するプラーク」に対しても当て
はまる（Selkoe、1994）。βA4の非線維状凝集がこれら
の構造に対して示されている。従って、これらのより長
いβA4ペプチド（すなわち、42位で終わるもの）の組織
特異的生産およびAD患者の脳におけるそれらの病理学的
出現を測定するのに一義的に重要である。最近３つの報
告が公開されており、そこでは、βA4の１−42および１
−40を区別する抗体が記載されている（Suzukiら、199
4;Murphyら、1994:Yangら、1994）。本発明の抗体とは
異なり、Suzukiら、およびYangらによって報告されてい
る抗体は、βA4ペプチドの１−43および１−42のもの双
方と有意な程度で交差反応を生じる。Murphyらの抗体
は、βA4ペプチドの１−43のものとの結合につきテスト
していないが、本発明の抗体と異なる組織結合パターン
を呈し、かくして、本発明の抗体によって認識されるも
のとは異なったまたは改変されたエピトープを認識する
はずである。

βA4ペプチドの29ないし42位は、完全にアミロイド前
駆体蛋白質の推定された膜貫通領域内にあり、性質は疎
水性である（Millerら、1993）。この領域におけるＣ−
末端配列に対する合成ペプチドは、もしそれらが可溶性
βA4に対する良好な免疫応答を誘発するのに使用される
べきならば、水および強力な変性剤中で実質的に不溶性
である異常に安定なβ−構造を形成する34−42配列の能
力を克服するのにちがいない（Halversonら、1990,Bioc
hem.29:2639−2644）。我々は、それらの不溶性の問題
を克服し、また、推定エピトープを担体の近隣から延長
する親水性スペーサーの５残基を設計した。より短いが
主要なβA4である１−40のものとの交差反応の確率を低
下させるために、我々はβA4配列の35−42位に対応する
８残基の最小ペプチドエピトープを選択した。このよう
にした設計した全合成配列を、Ｎ−末端システイン残基
上の遊離スルフヒドリル基によってKLH（キーホールリ
ンペットヘモシアニン）にカップリングさせた。

抗ペプチド抗体の産生におけるスペーサーおよび親水
性残基の首尾よい使用は、コンジュゲーションのために
不溶性ハプテンを溶液にするための親水性構造の使用に
おけるごとくよく記載されている（McMillanら、1983,C
ell 35:859−863;MakelaおよびSeppala、1986,Handbook
of experimental Immunology,第１巻:Immunochemistr
y,Wier,D.M.編、Blackwell Scientific Publication,Ox
ford,3.1−3.13頁）。特異的抗体を産生するにおけるこ
の方法の成功は、少なくとも部分的には、特に疎水性配
列の意味において、遊離の荷電カルボキシル末端の存在
に帰すことができる。というのは、ペプチド抗原上の末
端残基は抗ペプチド抗体のなりの割合を生起させるから
である（Gras−Masseら、1985,Synthetic Peptides in
Biology and Medicine,alitalo,K.ら編、Elsevier,Amst
erdam,105頁）。これは、免疫原として使用される最小
のβA4配列の選択的かつ新規な使用と共に、42位で終わ
るβA4とそうでないものとの間を区別し得る抗体を産生
する確率を最大化したものである。ペプチド競合実験は
抗原決定基を精巧にはマップしかなったが、１−42以外
のβA4配列は結合を阻害するのに有効でなかった。１−
42はイン・ビトロ翻訳されたβA4中の³⁵S−メチオニン
標識と総じて競合しなかったという事実は、分子それ自
体の特定の特性か、あるいは35−42ペプチド免疫原は特
異的スペーサーおよび／または担体の意味において存在
したという事実か、あるいは200−1000倍過剰の未標識
ペプチドがシグナルを消失させるのに十分ではなかった
という事実のいずれかによるためであろう。また、抗原
性活性に対するＮ−末端残基の非特異的効果もよく記載
されている（Benjaminiら、1968,Biochem.7:1261−126
4）。

369.2Bおよび他の抗体がβA4に結合する能力を25−35
が現実には増強するという興味深い知見は、抽出された
ペプチドと全長のβA4配列自体との間の特別の相互作用
のためであろう。残基26−33は水溶液中ではランダムコ
イルとして存在し（Halversonら、1990）、Ｃ−末端を
抗体上の結合部位に対してより接近可能とするように可
溶性のβA4と相互作用できるであろうと信じられてい
る。

369.2Bが特別の例である本発明の高度にに特異的な抗
体は、残基35−42を有する合成βA4ペプチドに対して生
起され、溶液中または固相でより短いβA4のもの１−40
を認識しない。さらに、１−40および１−43は免疫組織
化学的に使用した場合に、共に、抗体を収着し尽くこと
ができなかった。放射性標識したイン・ビトロ翻訳βA4
を用いるハイブリドーマ上清のスクリーニングのための
培地能力スループットでの二次スクリーニング方法を適
用し、一次スクリーニングから集めた抗体が可溶性βA4
を免疫沈降させるそれらの能力につきさらに選択した。
この方法は注目する他の蛋白質／抗体に容易に適合させ
ることができる。得られたMAb 369.2Bは、診断用途お
よび治療のための、イン・サイチュにおける42位で終わ
るβA4ペプチドの役割、死後組織、トランスジェニック
動物、および確立された細胞βA4産生モデルにおけるβ
A4のイン・ビトロ生成を調べるための優れた手段であ
る。

本発明のモノクローナル抗体は、診断テストキットを
確立するために必要な重要な手段でもある。それは、ヒ
ト体液（CSF、血清、尿等）または組織におけるβA4
１−42またはその誘導体（例えば、４−42、および「4
2」カルボキシ末端を持つ他のトランケートされた形
態）の量を測定／定量することを可能とする。また、そ
れを用いて、健康人対照と比較したAD脳における、１−
42または残基42で終わるβA4の分布パターンを研究する
ことができる。この例外的な高活性はかかるテストのた
めの優れた新規な手段となる。ここに開示するモノクロ
ーナル抗体は、アミノ酸42で終わるβA4の存在および／
または産生を測定しおよび／またはそれに影響を与える
ために設計した、トランスフェクトされた細胞培養また
は動物モデル（トランスジェニックマウス）のごとき生
物学的モデル系で使用することもできる。これらのモデ
ル系は、生物学的系におけるβA4のアミノ酸42位で終わ
るβA4の産生の選択的モジュレーターを同定するための
手段となる。本発明の抗体は、βA4ペプチドの凝集を防
止する方法を提供する。すなわち、抗体の特異性は遊離
Ｃ−末端残基との特異的干渉を可能とし、それによりAD
における病理原であり得る凝集に干渉しそれを破壊する
からである。

驚くべくことに、本発明の抗体は、βA4ペプチドの遊
離Ｃ−末端残基42位に特異的でありつつ、それが散在す
るアミロイド、線維アミロイド、神経原線維変化、およ
び血管アミロイドを染色する点で先行技術のものと異な
る。このユニークな結合パターンは、本発明の抗体が先
行技術のそれとは異なるエピトープを認識し、本発明の
抗体によって認識されるβA4ペプチドの組織分布および
反応可能性も異なることを示す。さらに、本発明は、先
行技術の抗体によっては示されなかった、溶液からβA4
ペプチドを沈殿させることができるモノクローナル抗体
を提供する。かくして、本発明は、従前に利用できたも
のよりも良好な診断インジケーターであって区別される
組織分布を有するβA4のユニークなサブセットを認識す
るユニークなモノクローナル抗体、ならびに治療介在用
のユニークな標的を提供する。

かくして、本発明は、Ｃ−末端が残基42で終わるペプ
チドのβA4に特異的な抗体、抗体断片およびその構築体
を提供する。また、本発明は、かかる抗体、結合断片お
よびその構築体の、本発明のモノクローナル抗体の結合
特異性を使用した、診断、分析、治療、および生化学的
精製法における使用、ならびに医薬処方でのそれらの使
用を提供する。

以下の実施例は本発明をさらに説明し、例示によって
示され、限定的なものではない。以下の実施例は前記方
法および組成物ならびにその利点のある態様を説明す
る。

実施例1:βA4ペプチド発現系プラスミドpGK002の調製一般的クローニングおよび分子生物学手法は例えばSa
mbrook,FritschおよびManiatis、1989,Molecular Cloni
ng,第２版.Cold Spring Harbor Lab Pressに見い出され
る。TAG停止コドンを持つAPP配列の2,415kb（キロベー
ス塩基対）を含むBluescript KSクローンに続いてβA4
領域の42番目アミノ酸コドンの後の部位特異的突然変異
誘発によって枠内に入れられたBamH Iサイトを含有する
プラスミドpMT I−26を、1.8kbのXba I/Bgl II断片を切
り出し、末端を満たした後にプラスミドを再連結するこ
とによって修飾した。pGK002と命名した得られた構築体
は、βA4配列の開始コドンを含有する共通配列がBluesc
ript T7プロモーターの直ぐ下流に位置している。

プラスミドpGK003の調製後記するβA4の小麦胚イン・ビトロ翻訳の全てで使用
したプラスミドpGK003（図３）は、突然変異誘発させた
停止/BamH Iを持つ全ヒトβA4配列を含有するpGK002か
らの590bp（塩基対）のNot I/Xho I断片をpSP64ポリＡ
ベクター（Promega Corp.）でサブクローニングするこ
とによって作製した。このプラスミドを調製するにおい
て、pGK002をNot IおよびXho Iとで消化し、得られた59
0bp断片をクレノウで満たし、単離し、Sma Iで線状化し
たpSP64ポリＡと連結した。図３はクローンpGK003のダ
イアグラムである。βA4 １−42のオープンリーディン
グフレームを細菌のSP6プロモーターからイン・ビトロ
で発現させる。APPの３′未翻訳（３′−UT）領域を黒
色で示す。

実施例2:pGK003のイン・ビトロ転写および翻訳プラスミドpGK003をEocR Vで線状化し、完全な消化を
アガロースゲル電気泳動によって確認した。試料をフェ
ノール／クロロホルムで２回抽出し、続いて２回クロロ
ホルム抽出し、エタノールで沈殿させた。得られたペレ
ットを70％エタノールで１回洗浄し、真空下で部分的に
乾燥し、１μg/μｌの濃度でTE中に再懸濁した。

16mM MgCl₂、2mMスペルミジン、40mM DTT、3mM AT
P/CTP/GTP/UTP、800単位/mlのRNAsinリボヌクレアーゼ
阻害剤（Promega Corp.）、５単位/ml酵母無機ピロホス
ファターゼ（Sigma Corp.）、および1800単位/mlのSP6
RNAポリメラーゼ（Promega Corp.）を含有する80mMの
HEPES−KOH（pH7.5）緩衝液中で、30μg/mlの線状化し
た鋳型を用いるイン・ビトロ転写体を調製した。反応混
合物を４時間、37℃に維持した。得られた転写体を、変
性試料を含む1.2％アガロース/TBE/EtBrゲルを通す電気
泳動によって確認した（65℃×10分）。

小麦胚抽出物（Sigma Corp.）を用いて転写体を翻訳
した。略言すると、転写体を加熱し（65℃×10分）、KA
c、RNAsin、およびメチオニンを含まないアミノ酸混合
物を含有する小麦胚抽出物と混合し、³⁵S−標識メチオ
ニン（Amersham）の存在下、25℃で１時間翻訳させた。
4kD（キヨダルトン）βA4蛋白質の翻訳は、16％トリス
／トリシンゲル（Novex）を用いるSDS−PAGEによって
確認した。ゲルを固定し、市販のシステム「Amplify」
（Amersham）を用いて蛋白質をフルオログラフィー的に
可視化した。

分子当たり１個のメチオニン残基を含有するイン・ビ
トロ翻訳βA4への標識の取り込みは、ゲルスライシング
によって測定した。2mmスライスを、37℃にて、1mlの30
％過酸化水素、0.75M NH₄OH中で一晩可溶化した。次
に、10ml容量の「Ready Value」シンチレーションカク
テル（Beckman）を添加し、自動DMPモードのBeckman L
S6000ICシンチレーションカウンターを用いてDPM（１分
当たりの崩壊）を測定した。典型的な反応では〜250ng
のβA4/ml、または〜56nMを生じる。

小麦胚系におけるβA4クローン、pGK003のイン・ビト
ロ転写、続いての翻訳の結果、16％トリス／トリシンSD
Sポリアクリルアミドゲル上のフルオログラフィーによ
って可視化して単一の4kD蛋白質産物が得られた（図4
A）。図4Aは16％トリス／トリシンゲル上のSDS−PAGEの
結果を示す。レーン1:高MWマーカー。レーン2:低MWマー
カー。レーン3:小麦胚系におけるイン・ビトロ翻訳され
たβA4。この4kD産物の同一性は、βA4特異的抗体での
免疫沈殿によって確認した（図4B）。図4Bは16％トリス
／トリシンゲル上のSDS−PAGEの結果を示す。レーン
1:高MWマーカー。レーン2:低MWマーカー。レーン3:MAb
286.8Aで免疫沈降させた小麦胚系からのイン・ビトロ
翻訳βA4。組み合わした網状赤血球溶解物系（TnT）に
おけるこれならびに他のβA4クローンの転写および翻訳
は、放射性標識したβA4と同一収量または純度とはなら
なかった（データは示さず）。これは、短い転写体また
はβA4ペプチドそれ自体の特別の性質によるものであろ
う。

粗製ペプチド１−42に対して生起され、βA4の領域３
−８に対してマップされるモノクローナル抗体286.8Aは
濃度依存的にこの蛋白質を沈殿させることができた（図
５）。図５はイン・ビトロ翻訳βA4（IVT βA4）のこ
の免疫沈降をグラフ化する。増大する量のIVT βA4
を、RIPA緩衝液中の100μｌにおける固定量の286.8A
（7.4μｇ）で免疫沈降させた。

実施例3:免疫原およびスクリーニング用ペプチドの調製標準的なFmoc固相手法によってペプチドを調製した
（例えば、Gras−Masseら、1985参照）。

商業的に入手可能な「Imject」活性化免疫原コンジュ
ゲーションキット（Pierce）を用い、ペプチド＃959、
疎水性DGDGDスペーサーおよびヒトβA4の残基35−42に
結合させたＮ−末端システインを有する14残基の合成ペ
プチド（得られた完全な配列:CDGDGDMVGGVVIA（配列番
号１））をマレイミド−活性化KLH（キーホールリンペ
ットヘモシアニン）担体にカップリングさせた。略言す
れば、2mgのペプチドを200μｌのコンジュゲーション緩
衝液に溶解し、2mgの再構成したマレイミド活性化KLHと
室温で２時間反応させた。ゲル濾過によってコンジュゲ
ートを精製し、実施例４に記載した標準的なプロトコル
を用いるモノクローナル抗体産生用の免疫原として用い
た。

ペプチド＃958、GGGGGスペーサーおよびヒトβA4の残
基35−42に結合させたＮ−末端システインを有する14残
基の合成ペプチド（得られた完全な配列:CGGGGGMVGGVVI
A）（配列番号:2））を、200μｌの6Mグアニジン、0.01
Mリン酸塩pH7.0に2mgのペプチドを溶解し、上記のよう
に2mgの再構成したマレイミド−活性化オボアルブミン
にコンジュゲートさせることによって、オボアルブミン
のカップリングした。精製したコンジュゲート体をモノ
クローナル融合産物のELISA−スクリーニングで使用し
た。このようにしてスクリーニングした抗体はスペーサ
ー、システイン架橋または免疫原性の担体部分よりもむ
しろ「35−42」の決定基に対して特異的であった。

図６は、免疫応答を生じるのに使用されるペプチド
（免疫原）、および、マウスの血清を酵素免疫アッセイ
プレート（EIA）におけるスクリーニングするのに使用
されるペプチドおよび融合物が示されている。βA4配列
35−42はスペーサーおよびＣ−末端システインと共に合
成し、次いで、これを用いてそれをマレイミド架橋を介
して大きな担体分子に共有結合でカップリングさせた。
免疫原性およびスクリーニング用ペプチドにおけるスペ
ーサーおよび担体分子の双方は、βA4配列特異的抗体に
つき選択するために異なるものである。

ELISA（酵素結合イムノソルバントアッセイ） MAbのビオチニル化ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを
用いて、モノクローナル抗体286.8Aをビオチニル化す
る。一級アミンの不存在下で、試薬の全てをまずその自
然発生の加水分解をウオッチングすることによって確認
し;PBS中のNHS−LC−ビオチン（Vector Labs,Burlingam
e,CA）の0.2mg/ml溶液を経時的に260nmでモニターす
る。ほぼ２時間後における1.0のOD260（最初OD260は〜
0.55でそれから上昇）は予測された加水分解を示す。

ビオチニル化反応において、中性のpHでモノクローナ
ル286.8Aに対するビオチンの66:1モル比は、ビオチニル
化した286.8AをELISA様式でテストした場合に、最適結
果を与えることが判明した。0.1mg/mlの濃度のH₂O中のN
HS−LC−ビオチニル0.6mgをPBS中の286.8Aの1ml（2mg）
に添加する（５分内で溶解）。NHSエステルの求核性の
攻撃が25℃で４時間起こり、しかる後に50μｌのH₂O中
の10mgのグリシンを添加して反応を停止させる。次い
で、反応を、PBSに対して平衡化した10mlの架橋デキス
トラン脱塩カラム上に置き、0.5mlのアリコットを収集
する。IgGピークを表す第１のピークをプールし、使用
するまで４℃で保存する。

ELISA手法４℃にて、Corning 25801 96−ウェルELISAプレート
を、典型的には５μg/mlのH₂Oまたは緩衝液中で100μｌ
のモノクローナル4G8または他の捕獲抗体で一晩被覆す
る。次いで、Dynatech Ultrawash plus中で１％トリト
ンＸ−100を含有するPBSでプレートを洗浄する。次い
で、ウェルを、１％トリトンＸ−100および１％ELISAグ
レードのBSAを含有する300μｌ PBS（ブロッキング緩
衝液）で90分間ブロックする。洗浄後、ブロッキング緩
衝液中に希釈した抗原または未知物を三連にてウェルに
添加し、室温で２時間インキュベートする。プレートを
２回洗浄し、400ngのビオチニル化286.8Aまたは他の検
出抗体を添加する。30分後、プレートをより徹底的に洗
浄し（２回洗浄、２分浸漬、２回洗浄）、100μｌの予
め形成させたアビジン−ビオチン−アルカリホスファタ
ーゼ複合体（Vector Labs）を添加する。プレートを洗
浄し（２回洗浄、２分浸漬、２回洗浄、５分浸漬、４回
洗浄）、MUP基質0.06mg/ml １×ジエタノールアミン緩
衝液にて添加する。360nm励起フィルターおよび460nm発
光フィルターを用い、15分後にプレートをMillipore Cy
toflourで読む。

実施例4:モノクローナル抗体の作製 Balb/cマウスをKLHコンジュゲーテッドペプチド＃959
の複数のI.P.接種で免疫化した。標準的なプロトコル
（Wunderlichら、1992,J.Immunol.Methods 147:11）を
用い、免疫化した動物からの脾臓細胞とマウス骨髄腫AG
8とを融合させた。前記した標準ELISA手法を用い、得ら
れたハイブリドーマの上清を、オボアルブミンがカップ
リングされたペプチド＃958に対する免疫反応性につき
スクリーニングした。免疫反応性MAbの発現につき陽性
のハイブリドーマを限界希釈法によって少なくとも２回
クローン化し、MAbイソタイプの分析を行った。プロテ
インＡ−アフィニティークロマトグラフィーを用い、腹
水液から精製されたMAb IgGを調製した。

融合の後、スクリーニングはKLHにコンジュゲートし
たペプチド＃958でのマウスの免疫化を示す、オボアル
ブミンにカップリングしたペプチド＃958での固相ELISA
様式でスクリーニングの結果、６の陽性親シグナルが得
られた（369.1ないし396.6と同定）。両ペプチドはβA4
領域のアミノ酸35−42、異なるＮ−末端スペーサー、お
よび担体蛋白質に共有結合的にカップリングするための
システインを有する（図６）。荷電カルボキシ基および
限定された長さの８個のみのアミノ酸を持つ遊離Ｃ−末
端は、βA4ペプチドからのより長い形態に対して特異的
に向けられた抗体の作製に有利であり；アミノ酸42前で
終わるより短いβA4ペプチドはかくして認識されないで
あろう。

図６は、使用した免疫原（担体−ペプチド）およびス
クリーニングペプチド（担体−スクリーニングペプチ
ド）の構造のダイアグラムである。

６の親シグナルのうち２つが結局はクローン化できな
かった。残りの４つのうち、２つは正常な非免疫対照に
ついて数パーセントしか免疫沈降／シンチレーションシ
グナルを与えなかった；他の２つは（369.6および369.
2）、各々、18％および19％のシグナルを示した。腹水
液からのモノクローナル抗体の生成およびこれらのクロ
ーンの引き続いての免疫精製を行った。表１は、得られ
たデータを、ハイブリドーマ上清および精製された抗体
のIPSAと比較したものである。

表1.ハリブリドーマ細胞系における抗体の比較。

IPSAデータは、ハイブリドーマ上清または精製抗体い
ずれかによって免疫沈降され得るイン・ビトロ翻訳され
たβA4のパーセントを表す。

実施例5:ハイブリドーマスクリーニングのための免疫沈
降／シンチレーションアッセイ固相に付着させた場合よりもむしろ溶液中でβA4ペプ
チドを認識するモノクローナル抗体を開発し、それにつ
きスクリーニングするために、³⁵S−メチオニン標識イ
ン・ビトロ翻訳βA4（IVT βA4）の免疫沈降を測定す
るアッセイを開発した。標準量のイン・ビトロ翻訳βA4
を、イオン強度、pHおよび界面活性剤組成につき最適化
できる溶液中で抗体／抗原複合体を形成させる。免疫複
合体をプロテインＧ（Omnisorb細胞）で沈殿させ、十分
に洗浄した後、結合した放射能を液体シントレーション
カウンターでカウントし、バックグラウンドを差し引
き、沈殿の効率を計算する。この免疫沈降／シンチレー
ションアッセイ（IPSA）は、抗体の迅速な同定および特
徴付けを可能とし、種々のβA4抗体をテストするのに使
用されている。該アッセイは一般にモノクローナルハイ
ブリドーマ上清ならびにポリクローナル抗血清に適用し
て、免疫沈降に使用できる抗体を同定することができ
る。典型的には、18のIPSAを１日で実行できる。従っ
て、これは迅速で情報的な二次ハリブリドーマスクリー
ニング方法である。

略言すれば、ほぼ1.5×10⁵DPMの³⁵S−メチオニン標識
イン・ビトロ翻訳βA4（IVT βA4）を10×免疫沈降緩
衝液（150mM NaCl、10％NP−40、５％デオキシコール
酸、１％SDS、500mMトリス pH8）の10μｌに添加し
た。これに、注目するモノクローナル融合体（我々の表
示＃369）からのモノクローナル細胞上清90μｌを添加
し、４℃で２時間反応させた。非反応性クローンの上清
90μｌを用いてバックグラウンドを測定し；陽性対照は
先に粗製の合成βA4（１−42）標品に対して作製したモ
ノクローナル抗体286.8Aを含有する上清90μｌであっ
た。２時間後、１×免疫沈降緩衝液（RIPA緩衝液、150m
M NaCl、１％NP−40、0.5％デオキシコール酸、0.1％S
DS、50mMトリス pH8）中で平衡化させたOmnisorb細胞
（Calbiochem）の10％溶液、40μｌを添加し、揺らしな
がら４℃でさらに２時間反応させた。4500gで４℃、５
分間の遠心することによって細胞をペレット化し、800
μｌの冷１×免疫沈降緩衝液で３回洗浄した。ペレット
を低量的にシンチレーションバイアルに移し、自動DMP
モードにて、Beckman LS6000シンチレーションカウンタ
ーでカウントした。免疫沈降したβA4のパーセントを計
算した。

５μｇの競合ペプチドを添加した合計容量100μｌの
１×免疫沈降緩衝液中の精製モノクローナル抗体369.2B
の１μｇを用いて、免疫沈降／シンチレーションアッセ
イを行った。インキュベーションおよび沈降は前記した
通りであった。

図７は、MAb369.2、369.6およびMAb286.8Aについての
抗体濃度の関数としての免疫沈降したIVT βA4のパー
セントを示す。このアッセイの条件下で、369.2（およ
びさらなるサブクローン369.2B）は可溶性IVT βA4を
沈降させるにおいて368.8よりもほぼ４倍ほど良好であ
るが、286.8Aの半分以下しか沈殿しない。図７は、イン
・ビトロ翻訳βA4の免疫沈降−抗体濃度（μｇ抗体/100
μｌ RIPA緩衝液）の結果を示し、ここに、である。所与のMAb濃度でのパーセントは実験間および
実験内で数パーセントのポイントが変化したに過ぎなか
った。

モノクローナル特徴付けのためのIPSA ほぼ1.5×10⁵DPMの³⁵S−メチオニン標識イン・ビトロ
翻訳βA4を、合計容量100μｌの１×免疫沈降緩衝液中
で種々の量の精製モノクローナル抗体、369.2Bまたは36
9.6、または286.8Aのいずれかを添加し、前記したごと
くに反応させた。免疫複合体をOmnisorbで沈降させ、洗
浄し、前記したごとくにカウントした。

実施例6:MAb 369.2Bの特徴付け最良の細胞系369.2Bをさらに特徴付けするために、競
合免疫沈降／シンチレーションアッセイ（Competition
IPSA）を行った。この変形において、369.2Bを標識イン
・ビトロ翻訳βA4 １−42と同時に、ほぼ200倍過剰モ
ルの未標識競合体ペプチドに添加した。予測されたごと
く、ヒトβA4領域に対するペプチド、１−40、１−11、
１−28、12−28、ならびに逆ペプチド40−１は、免疫沈
降に対して、³⁵S−メチオニン標識イン・ビトロβA4と
は競合せず、他方、完全な１−42ペプチドは競合した
（図８）。

これらの結果は、固相ELISA様式で確証した：収着さ
れたオボアルブミンがカップリングした。βA4領域35−
42を含有するスクリーニングペプチド、ならびに１−42
ペプチドは競合し、他方、１−40は競合しなかった（図
９）。オボアルブミンがカップリングした35−42と比較
した１−42ペプチドの低下した競合性は、抗原決定基に
関するコンフォメーションおよび／または溶解性ファク
ターによるものか、あるいは恐らくはより単純に、コン
ジュゲーションの特別の化学量論（オボアルブミン、１
−42ペプチドについての4kDと比較して45kDの分子量を
持つ、および担体の１モル当たり５−15の間のどこかの
コンジュゲート可能なマレイミド基を有する担体）によ
るものであろう。

図８はMAb 369.2のエピトープ決定基についての免疫
沈降ペプチド競合／シンチレーションアッセイを示す。
ペプチド競合体（５μｇ）をイン・ビトロ翻訳βA4（〜
1.5×10⁵DPSsまたは〜200pg）と混合し、次いで、２μ
ｇの369.2で免疫沈降させた。ここに、である。所与のMAb濃度でのパーセントは、典型的に
は、実験間および実験内で数パーセントのポイント変化
したに過ぎなかった。

図９は、競合アッセイによるMAb 369.2のエピトープ
マッピングを示す。C369.2（50ngのIgG/100μｌ）を合
成競合体ペプチドと共にまたはそれ無くしてプレインキ
ュベートし（22℃、１時間）、次いで、35−42とカップ
リングさせたしたオボアルブミンを結合した−プレート
（200ng/ウェル）に対してELISAを行った。パーセント
競合を、競合体の不存在下においてMAb結合に対して計
算した。すなわち、ここに、である。塗りつぶした四角は35−42（OVA）ペプチドコ
ンジュゲートであり；塗りつぶしていない四角は１−42
ペプチドであり；塗りつぶした菱形は１−40ペプチドで
ある。

このデータから、我々は、モノクローナル369.2Bは全
長（１−42）βA4ペプチドのＣ−末端に対して特異的で
あると結論する。正確な抗原決定基は精巧にマップされ
ていないが、それは40位を超える残基を明らかに含み、
抗体は短い合成ペプチドに対して作製されたので、決定
基はコンフォメーション的に並置することができるβA4
の他の残基を含むようである。特に、369.2Bは42位で終
わるβA4を認識するにおいて非常に重要な手段である。

ペプチド競合アッセイからの１つのさらなる興味深い
観察は、デカペプチド23−35によるイン・ビトロ翻訳β
A4の増強された免疫沈降性である。この現象は、１の他
のモノクローナル抗体（すなわち、286.8A）ならびに１
のウサギポリクローナル抗血清を用いたアッセイでも観
察されている（データは示さず）。また、我々は、変化
させた量の界面活性剤、特に、MAb286.8AでのIPSAアッ
セイにおけるSDSを用いる他の実験から、界面活性剤の
量が増大するにつれてより多くのβA4が免疫沈降され得
ることを知っている（データは示さず）。興味深いこと
に、SDSは少なくともSDS−PAGEによって示されているご
とく（Burdickら、1992）、βA4凝集体を可溶化させる
のにおいて効果的でないことが示されている。しかしな
がら、何故SDSがβA4の免疫沈降性を増強させるのかに
ついては直ちに明らかとはなっていない。

実施例7:免疫組織化学的実験我々は、369.2Bにつき免疫組織化学実験を行った。β
A4のエピトープ３−８を認識することを我々が示し、ヒ
ト特異的である（データは示さず）モノクローナル抗体
286.8Aと比較して、369.2Bの染色パターン（22mg/ml腹
水精製抗体溶液の1/10,000希釈）は興味深い相違を示し
た。免疫組織化学から得られたデータは、369.2Bがアミ
ロイドプラークコア、散在するアミロイドならびに線維
アミロイド沈着および血管アミロイド沈着を特異的に標
識する優れた抗体（1/10,000希釈にて）であることを示
した（図10）。

図10は、アルツハイマー病を持つ76歳の老婦人の脳か
らのパラフィンに埋封した10μｍ厚の切片における、β
−アミロイドプラーク、血管、およびβA4の脈管周囲の
沈着を示す顕微鏡写真である。組織切片を88％のギ酸
（30分）で予備処理し、次いで、着色原体（chromagen
n）としてニッケル−ジアミノペンジジンと共にアビジ
ン−ビオチン−ペルオキシダーゼキット（Veotor Labor
atories,Burlington,CA）を用いて標識した。モノクロ
ーナル抗体369.2Bはコア、脈管周囲、および散在した
（非アミロイド様）プラークを含む、種々の形態を有す
るプラークを標識する。また、それはアミロイド様血管
のサブセットをも標識する。

また、さらなる実験は、βA4 143ペプチドが染色に
対して競合することができなかったが（1000倍以上の過
剰ペプチド）、βA4 １−42が競合的にシグナルを無く
したことを示した。再度、予測されるごとく、１−40ま
たは40−１は染色に対し競合しなかった。これらの実験
から、我々は、この抗体は免疫組織化学のための優れた
手段であると容易に結論できる。１−40および１−42と
の間の物理−化学的差異を示すイン・ビトロ実験によっ
て示唆されるごとく、これらの２つのβA4はアルハイマ
ー脳において区別されるパターンを示すことが可能であ
る。本発明のモノクローナル抗体にて、我々は、今や、
この問題に向かうことを開始できる。かくして、本発明
のモノクローナル抗体および方法は、ADの診断および治
療において、ユニークなβA4の検出、モニタリング、抽
出、阻害および修飾に適用できる全ての免疫学的および
関連する方法における診断および治療用途で有用であ
る。

表2.競合結合実験および染色の阻害の結果。

＋＋＋は強力な染色を示し、−は染色が検出されなか
たことを示す。

これまでの開示は、本発明のある特別の具体例を強調
するもので、全ての変形またはそれに代わる均等なもの
も添付の請求の範囲に記載した本発明の精神および範囲
内のものであることを理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/50 33/577 Ｂ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献国際公開94／17197（ＷＯ，Ａ１) Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，Ｖｏｌ. 144，Ｎｏ．５（1994）ｐ．1082−88 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 16/18 C12N 5/10 C12P 21/08 G01N 33/50 - 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】369.2Bとして同定され、受託番号ATCC HB
11829としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ATCC）に寄託された細胞系によって産生され
るモノクローナル抗体。
【請求項２】受託番号ATCC HB 11829によって同定さ
れる細胞。
【請求項３】哺乳動物に免疫原を投与する従来のモノク
ローナル抗体の産生方法であって、適切な免疫学的担体
にコンジュゲートしたペプチドCys−Asp−Gly−Asp−Gl
y−Asp−Met−Val−Gly−Gly−Val−Val−Ile−Ala（配
列番号:1）により哺乳動物を免疫することを特徴とす
る、βA4（１−42）ペプチドに特異的に結合するが、β
A4（１−40）ペプチドおよびβA4（１−43）ペプチドに
は結合しないモノクローナル抗体の産生方法。
【請求項４】組織の試料と、モノクローナル抗体369.2B
もしくはその結合性フラグメントとを接触させてカルボ
キシ末端残基42（アラニン）で終わるβA4ペプチドと特
異的に結合させ、特異的に結合したモノクローナル抗体
369.2Bもしくはその結合性フラグメントの存在を検出す
ることを含み、前記モノクローナル抗体が受託番号ATCC
HB 11829で寄託された細胞系により産生されるもの
であることを特徴とする、組織中でカルボキシ末端残基
42（アラニン）で終わるβA4ペプチドの存在を特異的に
検出する方法。
【請求項５】試験すべき試料と、モノクローナル抗体36
9.2Bもしくはその結合性フラグメントとを接触させてカ
ルボキシ末端残基42（アラニン）で終わるβA4ペプチド
と特異的に結合させ、特異的に結合したモノクローナル
抗体369.2Bもしくはその結合性フラグメントの存在を検
出することを含み、前記モノクローナル抗体が受託番号
ATCC HB 11829で寄託された細胞系により産生される
ものであることを特徴とする、散在するアミロイド、線
維アミロイド、神経原線維変化、および血管アミロイド
沈着物中のカルボキシ末端残基42（アラニン）で終わ
る、試料中に存在するβA4ペプチドを特異的に検出する
方法。
【請求項６】モノクローナル抗体369.2Bの活性なβA4ペ
プチド結合性フラグメントを含み、前記モノクローナル
抗体が受託番号ATCC HB 11829で寄託された細胞系に
より産生されるものであることを特徴とする、カルボキ
シ末端残基42（アラニン）で終わるβA4ペプチド種の試
料中の存在を特異的に検出するためのフラグメント含有
組成物。
【請求項７】精製すべき試料と、モノクローナル抗体36
9.2Bもしくはその結合性フラグメントとを接触させてカ
ルボキシ末端残基42（アラニン）で終わるβA4ペプチド
と特異的に結合させ、試料から結合したβA4（１−42）
ペプチドを分離することを含む、カルボキシ末端残基42
（アラニン）で終わるβA4（１−42）ペプチドを選択的
に分離する方法。
【請求項８】モノクローナル抗体369.2Bの活性なβA4ペ
プチド結合性フラグメントを含む、カルボキシ末端残基
42（アラニン）で終わるβA4ペプチドの凝集を防止する
ためのフラグメント含有組成物。