JP3313358B2 - 核酸の合成方法 - Google Patents
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Description
技術分野 本発明は、核酸の増幅方法として有用な、特定の塩基
配列で構成される核酸を合成する方法に関する。 背景技術 核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、遺伝的な
特徴を直接的に分析することが可能である。そのため、
遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には非常に有力な手
段である。また遺伝子そのものを検出対象とするため
に、例えば培養のような時間と手間のかかる操作を省略
できる場合もある。 とはいえ試料中に存在する目的の遺伝子量が少ない場
合の検出は一般に容易ではなく、標的遺伝子そのもの
を、あるいは検出シグナル等を増幅することが必要とな
る。標的遺伝子を増幅する方法の一つとして PCR(Polym
erase ChainReaction)法が知られている(Science,230,1
350-1354,1985)。PCR 法は、in vitroにおける核酸の増
幅技術として現在最も一般的な方法である。その指数的
な増幅効果に基づく高い感度により優れた検出方法とし
て定着した。また、増幅生成物をDNA として回収できる
ことから、遺伝子クローニングや構造決定などの遺伝子
工学的手法を支える重要なツールとして幅広く応用され
ている。しかしPCR 法においては、実施のために特別な
温度調節装置が必要なこと；増幅反応が指数的に進むこ
とから定量性に問題があること；試料や反応液が外部か
らの汚染を受け、誤って混入した核酸が鋳型として機能
してしまうコンタミネーションの影響を受け易いこと等
の問題点が指摘されている。 ゲノム情報の蓄積に伴って、１塩基多型(SNPs; singl
e nucleotide polymorphism)の解析が注目されている。
プライマーの塩基配列にSNPs を含むように設計するこ
とによってPCR を利用したSNPs の検出が可能である。
すなわち、反応生成物の有無によってプライマーに相補
的な塩基配列の有無を知ることができる。しかしPCR に
おいては、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった
場合には、その生成物が以降の反応の鋳型として機能し
て誤った結果を与える原因となる。現実には、プライマ
ーの末端における１塩基の相違のみでは、PCR を厳密に
制御することは難しいといわれている。したがって、PC
R をSNPs の検出に利用するには特異性の改善が必要と
されている。 一方リガーゼに基づく核酸合成方法も実用化されてい
る。LCR 法 (Ligase Chain Reaction, Laffler TG; Car
rino JJ; Marshall RL; Ann. Biol. Clin. (Paris), 19
93, 51:9, 821-6) は、検出対象となる配列上において
隣接する２つのプローブをハイブリダイズさせ、リガー
ゼによって両者を連結する反応が基本原理になってい
る。標的塩基配列が存在しない場合には２つのプローブ
を連結することはできないので、連結生成物の存在は標
的塩基配列の指標となる。LCR 法も合成した相補鎖と鋳
型との分離に温度制御が必要となることから、PCR 法と
同じ問題点を伴っている。LCR については、隣接するプ
ローブの間にギャップを設け、これをDNA ポリメラーゼ
で充填する工程を加え特異性を改善する方法も報告され
ている。しかし、この改良方法によって期待できるのは
特異性のみであり、温度制御を要求する点については依
然として課題を残している。しかも、必要な酵素が増え
るため、コストを犠牲にしているといえる。 検出対象配列を鋳型として相補的な配列を持つDNAを
増幅する方法には、SDA法(Strand DispIacement Amplif
ication) [Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,392-396;1992]
[Nucleic Acid.Res.,20,1691-1696;1992]と呼ばれる方
法も知られている。SDA法は、ある塩基配列の3'側に相
補的なプライマーを合成起点として相補鎖合成を行うと
きに、5'側に２本鎖の領域が有るとその鎖を置換しなが
ら相補鎖の合成を行う特殊なDNAポリメラーゼを利用す
る方法である。なお以下本明細書において単に5'側、あ
るいは3'側と表現するときには、いずれも鋳型となって
いる方の鎖における方向を意味している。5'側の２本鎖
部分が新たに合成された相補鎖によって置換(displacem
ent)されることからSDA法と呼ばれている。SDA法では、
プライマーとしてアニールさせた配列に予め制限酵素認
識配列を挿入しておくことによって、PCR法においては
必須となっている温度変化工程の省略を実現できる。す
なわち、制限酵素によってもたらされるニックが相補鎖
合成の起点となる3'-OH基を与え、そこから鎖置換合成
を行うことによって先に合成された相補鎖が１本鎖とし
て遊離して次の相補鎖合成の鋳型として再利用される。
このようにSDA法はPCR法で必須となっていた複雑な温度
制御を不要とした。 しかし、SDA法では鎖置換型のDNAポリメラーゼに加
え、必ずニックをもたらす制限酵素を組み合わせる必要
がある。必要な酵素が増えるということは、コストアッ
プの要因である。また、用いる制限酵素によって２本鎖
の切断ではなくニックの導入（すなわち一方の鎖だけの
切断）を行うために、一方の鎖には酵素消化に耐性を持
つように合成の際の基質としてαチオdNTPのようなdNTP
誘導体を利用しなければならない。このため、SDAによ
る増幅産物は天然の核酸とは異なった構造となり、制限
酵素による切断や、増幅産物の遺伝子クローニングへの
応用といった利用は制限される。またこの点においても
コストアップの要因を伴っているといえる。加えて、未
知の配列にSDA法を応用するときには、合成される領域
の中にニック導入のための制限酵素認識配列と同じ塩基
配列が存在する可能性を否定できない。このようなケー
スでは完全な相補鎖の合成が妨げられる必要がある。 複雑な温度制御を不要とする核酸の増幅方法として、
NASBA(NucIeic AcidSequence-based Amplification、TM
A/Transcription Mediated Amplification 法とも呼ば
れる)が公知である。NASBA は、標的RNA を鋳型としてT
7 プロモーターを付加したプローブでDNA ポリメラーゼ
によるDNA 合成を行い、これを更に第２のプローブで２
本鎖とし、生成する２本鎖DNA を鋳型としてT7 RNA ポ
リメラーゼによる転写を行わせて多量の RNA を増幅す
る反応系である(Nature,350,91-92,1991)。NASBA は２
本鎖DNA を完成するまでにいくつかの加熱変性工程を要
求するが、以降のT7 RNA ポリメラーゼによる転写反応
は等温で進行する。しかし、逆転写酵素、RNaseH、DNA
ポリメラーゼ、そしてT7 RNA ポリメラーゼといった複
数の酵素の組み合わせが必須となることから、SDA と同
様にコストの面では不利である。また複数の酵素反応を
行わせるための条件設定が複雑なので、一般的な分析方
法として普及させることが難しい。このように公知の核
酸増幅反応においては、複雑な温度制御の問題点、ある
いは複数の酵素が必要となることといった課題が残され
ている。 更に、これらの公知の核酸合成反応について、特異性
やコストを犠牲にすることなく核酸の合成効率を更に向
上させる試みについては、ほとんど報告が無い。たとえ
ば、RCA(Rolling-circle amplification)と呼ばれる方
法では、標的塩基配列の存在下でパドロックプローブ(p
adlock probe)に相補的な塩基配列が連続した１本鎖の
DNA を継続して合成できることが示された(Paul M.Liza
rdi etal,Nature Genetics 19, 225-232, July,1998)。
RCA では、１本のオリゴヌクレオチドの5'末端と3'末端
がLCRにおける隣接プローブを構成する特殊な構造のパ
ドロックプローブが利用される。そして鎖置換型の相補
鎖合成反応を触媒するポリメラーゼを組み合わせること
により、標的塩基配列の存在下でライゲーションされ環
化したパドロックプローブを鋳型とする連続的な相補鎖
合成反応がトリガーされる。同じ塩基配列からなる領域
が繰り返し連続した構造を持った１本鎖核酸が生成され
る。この１本鎖核酸に対して更にプライマーをアニール
させてその相補鎖の合成を行って、高度な増幅を実現し
ている。しかし、複数の酵素が必要な点は依然として残
された課題である。また、相補鎖合成のトリガーは、２
つの隣接領域の連結反応に依存しており、その特異性は
原理的にLCR と同じレベルである。 3'-OH の供給という課題に対しては、3'末端に同一鎖
上の塩基配列に相補的な配列を持たせ、末端でヘアピン
ループを形成させる方法が公知である(Gene71,29-40,19
88)。このようなヘアピンループからは、自身を鋳型と
した相補鎖合成が行われ、相補的な塩基配列で構成され
た１本鎖の核酸を生成する。たとえばPCT/FR95/00891
では、相補的な塩基配列を連結した末端部分で同一鎖上
にアニールする構造を実現している。しかしこの方法で
は、末端が相補鎖との塩基対結合(base pairing)を解消
して改めて同一鎖上で塩基対結合を構成するステップが
必須である。このステップは塩基対結合を伴う相補的な
塩基配列同士の末端における微妙な平衡状態に依存して
進むとされている。すなわち、相補鎖との塩基対結合
と、同一鎖上での塩基対結合との間で維持される平衡状
態を利用し、同一鎖上の塩基配列とアニールしたものの
みが相補鎖合成の起点となる。したがって、高度な反応
効率を達成するためには、厳密な反応条件の設定が求め
られるものと考えられる。更にこの先行技術において
は、プライマー自身がループ構造を作っている。そのた
めプライマーダイマーがいったん生成すると、標的塩基
配列の有無にかかわらず自動的に増幅反応が開始され非
特異的な合成産物を形成してしまう。これは重大な問題
点といえる。更に、プライマーダイマーの生成とそれに
伴う非特異的な合成反応によるプライマーの消費が、目
的とする反応の増幅効率の低下につながる。 その他に、DNA ポリメラーゼに対して鋳型とならない
領域を利用して同一鎖にアニールする3'末端構造を実現
した報告(EP713922)がある。この報告も末端部分におけ
る動的平衡を利用している点、あるいはプライマーダイ
マー形成にともなう非特異的な合成反応の可能性におい
ては先の PCT/FR95/00891 と同様の問題点を持つ。更
に、DNA ポリメラーゼの鋳型とならない特殊な領域をプ
ライマーとして用意しなければならない。 また前記NASBA の原理を応用した各種のシグナル増幅
反応においては、２本鎖のプロモーター領域を供給する
ためにしばしば末端でヘアピン状の構造を伴ったオリゴ
ヌクレオチドが利用される (特開平 5-211873)。しかし
これらは、相補鎖合成の 3'-OH の連続的な供給を可能
とするものではない。更に特表平 10-510161(WO96/1707
9)においては、RNA ポリメラーゼによって転写されるDN
A 鋳型を得ることを目的として同一鎖上に3' 末端をア
ニールさせたヘアピンループ構造が利用されている。こ
の方法では、RNA への転写と、RNA からDNA への逆転写
を利用して鋳型の増幅が行われる。しかし、この方法も
複数の酵素を組み合わせなければ反応系を構成できな
い。 発明の開示 本発明の課題は、新規な原理に基づく核酸の合成方法
を提供することである。より具体的には、低コストで効
率的に配列に依存した核酸の合成を実現することができ
る方法を提供することである。すなわち、単一の酵素を
用い、しかも等温反応条件の下でも核酸の合成と増幅を
達成することができる方法の提供が、本発明の課題であ
る。更に本発明は、公知の核酸合成反応原理では達成す
ることが困難な高い特異性を実現することができる核酸
の合成方法、並びにこの合成方法を応用した核酸の増幅
方法の提供を課題とする。 本発明者らは、まず鎖置換型の相補鎖合成を触媒する
ポリメラーゼの利用が、複雑な温度制御に依存しない核
酸合成に有用であることに着目した。このようなDNA ポ
リメラーゼは、SDA やRCA でも利用された酵素である。
しかし、たとえこのような酵素を用いたとしても、公知
のプライマーに基づく手法では、たとえばSDAのように
合成起点となる3'-OHを供給するために常に他の酵素反
応が要求される。 そこで本発明者らは、公知のアプローチとはまったく
異なる角度から3'-OH の供給について検討した。その結
果、特殊な構造を持ったオリゴヌクレオチドを利用する
ことによって、付加的な酵素反応に頼らずとも3'-OH の
供給が可能となることを見出し本発明を完成した。すな
わち本発明は、以下の核酸の合成方法、更にはこの核酸
合成方法を応用した核酸の増幅方法、ならびにこれらの
方法を可能とする新規なオリゴヌクレオチドに関する。 〔１〕 以下の工程を含む１本鎖上に相補的な塩基配列
が交互に連結された核酸の合成方法。 ａ)同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる
領域Ｆ１を3'末端に備え、この領域Ｆ１がＦ１ｃにアニ
ールすることによって、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃ
を含むループを形成することができる核酸を与える工程 ｂ)Ｆ１ｃにアニールしたＦ１の3'末端を合成起点とし
て相補鎖合成を行う工程 ｃ)領域Ｆ２ｃに相補的な配列からなるＦ２を3'末端に
含むオリゴヌクレオチドをアニールさせ、これを合成起
点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ
による相補鎖合成を行って、工程ｂ）で合成された相補
鎖を置換する工程 ｄ）工程ｃ）で置換され塩基対結合が可能となった相補
鎖における任意の領域に相補的な配列を3' 末端に含む
ポリヌクレオチドをアニールさせ、その3' 末端を合成
起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラー
ゼによる相補鎖合成を行って、工程ｃ）で合成された相
補鎖を置換する工程 〔２〕 工程ｄ）において、合成起点が領域Ｒ１ｃにア
ニールすることができる同一鎖上の3'末端に存在する領
域Ｒ１であり、Ｒ１がＲ１ｃにアニールすることによっ
て塩基対結合が可能な領域Ｒ２ｃを含むループが形成さ
れる〔１〕に記載の方法。 〔３〕 少なくとも以下の２つの領域Ｘ２およびＸ１ｃ
とで構成され、Ｘ２の5' 側にＸ１ｃが連結されたオリ
ゴヌクレオチド。 Ｘ２：特定の塩基配列を持つ核酸の任意の領域Ｘ２ｃに
相補的な塩基配列を持つ領域 Ｘ１ｃ:特定の塩基配列を持つ核酸における領域Ｘ２ｃ
の5'側に位置する領域Ｘ１ｃと実質的に同じ塩基配列を
持つ領域 〔４〕 工程ａ）における核酸が、以下の工程によって
提供される第２の核酸である〔１〕に記載の方法。 i) 領域Ｘ２が領域Ｆ２であり、領域Ｘ１ｃが領域Ｆ１
ｃである〔３〕に記載のオリゴヌクレオチドの領域Ｆ２
を鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃにアニールさせる工程、 ii)オリゴヌクレオチドのＦ２を合成起点とし、鋳型に
相補的な塩基配列を持つ第１の核酸を合成する工程 iii)工程 ii)で合成された第１の核酸の任意の領域を塩
基対結合が可能な状態とする工程、 iv)工程iii)における第１の核酸の塩基対結合を可能と
した領域に相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
をアニールさせ、それを合成起点として第２の核酸を合
成し、その3' 末端のＦ１を塩基対結合が可能な状態と
する工程 〔５〕 工程 iii)の塩基対結合を可能とする領域がＲ
２ｃであり、かつ工程 iv)におけるオリゴヌクレオチド
が、領域Ｘ２ｃが領域Ｒ２ｃであり、領域Ｘ１ｃが領域
Ｒ１ｃである〔３〕に記載のオリゴヌクレオチドである
〔４〕に記載の方法。 〔６〕 工程iii)およびiv)における塩基対結合が可能
な状態とする工程を、鋳型におけるＦ２ｃの更に3'側に
アニールするアウタープライマー、および第１の核酸に
おける工程iv)で合成起点とした領域の更に3'側にアニ
ールするアウタープライマーを合成起点とする鎖置換相
補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる鎖置換相補
鎖合成によって行う〔４〕または〔５〕に記載の方法。 〔７〕 反応に用いる各オリゴヌクレオチドと鋳型にお
けるその相補領域との融解温度が、同じストリンジェン
シーの下で次の関係にある〔６〕に記載の方法。 (アウ
タープライマー／鋳型における3'側の領域)≦(Ｆ２ｃ／
Ｆ２およびＲ２ｃ／Ｒ２) ≦ (Ｆ１ｃ／Ｆ１およびＲ１
ｃ／Ｒ１) 〔８〕 鋳型となる核酸がRNA であり、工程 ii)におけ
る相補鎖合成を逆転写酵素活性を持つ酵素で行う〔４〕
〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
配列で構成される核酸を合成する方法に関する。 背景技術 核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、遺伝的な
特徴を直接的に分析することが可能である。そのため、
遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には非常に有力な手
段である。また遺伝子そのものを検出対象とするため
に、例えば培養のような時間と手間のかかる操作を省略
できる場合もある。 とはいえ試料中に存在する目的の遺伝子量が少ない場
合の検出は一般に容易ではなく、標的遺伝子そのもの
を、あるいは検出シグナル等を増幅することが必要とな
る。標的遺伝子を増幅する方法の一つとして PCR(Polym
erase ChainReaction)法が知られている(Science,230,1
350-1354,1985)。PCR 法は、in vitroにおける核酸の増
幅技術として現在最も一般的な方法である。その指数的
な増幅効果に基づく高い感度により優れた検出方法とし
て定着した。また、増幅生成物をDNA として回収できる
ことから、遺伝子クローニングや構造決定などの遺伝子
工学的手法を支える重要なツールとして幅広く応用され
ている。しかしPCR 法においては、実施のために特別な
温度調節装置が必要なこと；増幅反応が指数的に進むこ
とから定量性に問題があること；試料や反応液が外部か
らの汚染を受け、誤って混入した核酸が鋳型として機能
してしまうコンタミネーションの影響を受け易いこと等
の問題点が指摘されている。 ゲノム情報の蓄積に伴って、１塩基多型(SNPs; singl
e nucleotide polymorphism)の解析が注目されている。
プライマーの塩基配列にSNPs を含むように設計するこ
とによってPCR を利用したSNPs の検出が可能である。
すなわち、反応生成物の有無によってプライマーに相補
的な塩基配列の有無を知ることができる。しかしPCR に
おいては、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった
場合には、その生成物が以降の反応の鋳型として機能し
て誤った結果を与える原因となる。現実には、プライマ
ーの末端における１塩基の相違のみでは、PCR を厳密に
制御することは難しいといわれている。したがって、PC
R をSNPs の検出に利用するには特異性の改善が必要と
されている。 一方リガーゼに基づく核酸合成方法も実用化されてい
る。LCR 法 (Ligase Chain Reaction, Laffler TG; Car
rino JJ; Marshall RL; Ann. Biol. Clin. (Paris), 19
93, 51:9, 821-6) は、検出対象となる配列上において
隣接する２つのプローブをハイブリダイズさせ、リガー
ゼによって両者を連結する反応が基本原理になってい
る。標的塩基配列が存在しない場合には２つのプローブ
を連結することはできないので、連結生成物の存在は標
的塩基配列の指標となる。LCR 法も合成した相補鎖と鋳
型との分離に温度制御が必要となることから、PCR 法と
同じ問題点を伴っている。LCR については、隣接するプ
ローブの間にギャップを設け、これをDNA ポリメラーゼ
で充填する工程を加え特異性を改善する方法も報告され
ている。しかし、この改良方法によって期待できるのは
特異性のみであり、温度制御を要求する点については依
然として課題を残している。しかも、必要な酵素が増え
るため、コストを犠牲にしているといえる。 検出対象配列を鋳型として相補的な配列を持つDNAを
増幅する方法には、SDA法(Strand DispIacement Amplif
ication) [Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,392-396;1992]
[Nucleic Acid.Res.,20,1691-1696;1992]と呼ばれる方
法も知られている。SDA法は、ある塩基配列の3'側に相
補的なプライマーを合成起点として相補鎖合成を行うと
きに、5'側に２本鎖の領域が有るとその鎖を置換しなが
ら相補鎖の合成を行う特殊なDNAポリメラーゼを利用す
る方法である。なお以下本明細書において単に5'側、あ
るいは3'側と表現するときには、いずれも鋳型となって
いる方の鎖における方向を意味している。5'側の２本鎖
部分が新たに合成された相補鎖によって置換(displacem
ent)されることからSDA法と呼ばれている。SDA法では、
プライマーとしてアニールさせた配列に予め制限酵素認
識配列を挿入しておくことによって、PCR法においては
必須となっている温度変化工程の省略を実現できる。す
なわち、制限酵素によってもたらされるニックが相補鎖
合成の起点となる3'-OH基を与え、そこから鎖置換合成
を行うことによって先に合成された相補鎖が１本鎖とし
て遊離して次の相補鎖合成の鋳型として再利用される。
このようにSDA法はPCR法で必須となっていた複雑な温度
制御を不要とした。 しかし、SDA法では鎖置換型のDNAポリメラーゼに加
え、必ずニックをもたらす制限酵素を組み合わせる必要
がある。必要な酵素が増えるということは、コストアッ
プの要因である。また、用いる制限酵素によって２本鎖
の切断ではなくニックの導入（すなわち一方の鎖だけの
切断）を行うために、一方の鎖には酵素消化に耐性を持
つように合成の際の基質としてαチオdNTPのようなdNTP
誘導体を利用しなければならない。このため、SDAによ
る増幅産物は天然の核酸とは異なった構造となり、制限
酵素による切断や、増幅産物の遺伝子クローニングへの
応用といった利用は制限される。またこの点においても
コストアップの要因を伴っているといえる。加えて、未
知の配列にSDA法を応用するときには、合成される領域
の中にニック導入のための制限酵素認識配列と同じ塩基
配列が存在する可能性を否定できない。このようなケー
スでは完全な相補鎖の合成が妨げられる必要がある。 複雑な温度制御を不要とする核酸の増幅方法として、
NASBA(NucIeic AcidSequence-based Amplification、TM
A/Transcription Mediated Amplification 法とも呼ば
れる)が公知である。NASBA は、標的RNA を鋳型としてT
7 プロモーターを付加したプローブでDNA ポリメラーゼ
によるDNA 合成を行い、これを更に第２のプローブで２
本鎖とし、生成する２本鎖DNA を鋳型としてT7 RNA ポ
リメラーゼによる転写を行わせて多量の RNA を増幅す
る反応系である(Nature,350,91-92,1991)。NASBA は２
本鎖DNA を完成するまでにいくつかの加熱変性工程を要
求するが、以降のT7 RNA ポリメラーゼによる転写反応
は等温で進行する。しかし、逆転写酵素、RNaseH、DNA
ポリメラーゼ、そしてT7 RNA ポリメラーゼといった複
数の酵素の組み合わせが必須となることから、SDA と同
様にコストの面では不利である。また複数の酵素反応を
行わせるための条件設定が複雑なので、一般的な分析方
法として普及させることが難しい。このように公知の核
酸増幅反応においては、複雑な温度制御の問題点、ある
いは複数の酵素が必要となることといった課題が残され
ている。 更に、これらの公知の核酸合成反応について、特異性
やコストを犠牲にすることなく核酸の合成効率を更に向
上させる試みについては、ほとんど報告が無い。たとえ
ば、RCA(Rolling-circle amplification)と呼ばれる方
法では、標的塩基配列の存在下でパドロックプローブ(p
adlock probe)に相補的な塩基配列が連続した１本鎖の
DNA を継続して合成できることが示された(Paul M.Liza
rdi etal,Nature Genetics 19, 225-232, July,1998)。
RCA では、１本のオリゴヌクレオチドの5'末端と3'末端
がLCRにおける隣接プローブを構成する特殊な構造のパ
ドロックプローブが利用される。そして鎖置換型の相補
鎖合成反応を触媒するポリメラーゼを組み合わせること
により、標的塩基配列の存在下でライゲーションされ環
化したパドロックプローブを鋳型とする連続的な相補鎖
合成反応がトリガーされる。同じ塩基配列からなる領域
が繰り返し連続した構造を持った１本鎖核酸が生成され
る。この１本鎖核酸に対して更にプライマーをアニール
させてその相補鎖の合成を行って、高度な増幅を実現し
ている。しかし、複数の酵素が必要な点は依然として残
された課題である。また、相補鎖合成のトリガーは、２
つの隣接領域の連結反応に依存しており、その特異性は
原理的にLCR と同じレベルである。 3'-OH の供給という課題に対しては、3'末端に同一鎖
上の塩基配列に相補的な配列を持たせ、末端でヘアピン
ループを形成させる方法が公知である(Gene71,29-40,19
88)。このようなヘアピンループからは、自身を鋳型と
した相補鎖合成が行われ、相補的な塩基配列で構成され
た１本鎖の核酸を生成する。たとえばPCT/FR95/00891
では、相補的な塩基配列を連結した末端部分で同一鎖上
にアニールする構造を実現している。しかしこの方法で
は、末端が相補鎖との塩基対結合(base pairing)を解消
して改めて同一鎖上で塩基対結合を構成するステップが
必須である。このステップは塩基対結合を伴う相補的な
塩基配列同士の末端における微妙な平衡状態に依存して
進むとされている。すなわち、相補鎖との塩基対結合
と、同一鎖上での塩基対結合との間で維持される平衡状
態を利用し、同一鎖上の塩基配列とアニールしたものの
みが相補鎖合成の起点となる。したがって、高度な反応
効率を達成するためには、厳密な反応条件の設定が求め
られるものと考えられる。更にこの先行技術において
は、プライマー自身がループ構造を作っている。そのた
めプライマーダイマーがいったん生成すると、標的塩基
配列の有無にかかわらず自動的に増幅反応が開始され非
特異的な合成産物を形成してしまう。これは重大な問題
点といえる。更に、プライマーダイマーの生成とそれに
伴う非特異的な合成反応によるプライマーの消費が、目
的とする反応の増幅効率の低下につながる。 その他に、DNA ポリメラーゼに対して鋳型とならない
領域を利用して同一鎖にアニールする3'末端構造を実現
した報告(EP713922)がある。この報告も末端部分におけ
る動的平衡を利用している点、あるいはプライマーダイ
マー形成にともなう非特異的な合成反応の可能性におい
ては先の PCT/FR95/00891 と同様の問題点を持つ。更
に、DNA ポリメラーゼの鋳型とならない特殊な領域をプ
ライマーとして用意しなければならない。 また前記NASBA の原理を応用した各種のシグナル増幅
反応においては、２本鎖のプロモーター領域を供給する
ためにしばしば末端でヘアピン状の構造を伴ったオリゴ
ヌクレオチドが利用される (特開平 5-211873)。しかし
これらは、相補鎖合成の 3'-OH の連続的な供給を可能
とするものではない。更に特表平 10-510161(WO96/1707
9)においては、RNA ポリメラーゼによって転写されるDN
A 鋳型を得ることを目的として同一鎖上に3' 末端をア
ニールさせたヘアピンループ構造が利用されている。こ
の方法では、RNA への転写と、RNA からDNA への逆転写
を利用して鋳型の増幅が行われる。しかし、この方法も
複数の酵素を組み合わせなければ反応系を構成できな
い。 発明の開示 本発明の課題は、新規な原理に基づく核酸の合成方法
を提供することである。より具体的には、低コストで効
率的に配列に依存した核酸の合成を実現することができ
る方法を提供することである。すなわち、単一の酵素を
用い、しかも等温反応条件の下でも核酸の合成と増幅を
達成することができる方法の提供が、本発明の課題であ
る。更に本発明は、公知の核酸合成反応原理では達成す
ることが困難な高い特異性を実現することができる核酸
の合成方法、並びにこの合成方法を応用した核酸の増幅
方法の提供を課題とする。 本発明者らは、まず鎖置換型の相補鎖合成を触媒する
ポリメラーゼの利用が、複雑な温度制御に依存しない核
酸合成に有用であることに着目した。このようなDNA ポ
リメラーゼは、SDA やRCA でも利用された酵素である。
しかし、たとえこのような酵素を用いたとしても、公知
のプライマーに基づく手法では、たとえばSDAのように
合成起点となる3'-OHを供給するために常に他の酵素反
応が要求される。 そこで本発明者らは、公知のアプローチとはまったく
異なる角度から3'-OH の供給について検討した。その結
果、特殊な構造を持ったオリゴヌクレオチドを利用する
ことによって、付加的な酵素反応に頼らずとも3'-OH の
供給が可能となることを見出し本発明を完成した。すな
わち本発明は、以下の核酸の合成方法、更にはこの核酸
合成方法を応用した核酸の増幅方法、ならびにこれらの
方法を可能とする新規なオリゴヌクレオチドに関する。 〔１〕 以下の工程を含む１本鎖上に相補的な塩基配列
が交互に連結された核酸の合成方法。 ａ)同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる
領域Ｆ１を3'末端に備え、この領域Ｆ１がＦ１ｃにアニ
ールすることによって、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃ
を含むループを形成することができる核酸を与える工程 ｂ)Ｆ１ｃにアニールしたＦ１の3'末端を合成起点とし
て相補鎖合成を行う工程 ｃ)領域Ｆ２ｃに相補的な配列からなるＦ２を3'末端に
含むオリゴヌクレオチドをアニールさせ、これを合成起
点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ
による相補鎖合成を行って、工程ｂ）で合成された相補
鎖を置換する工程 ｄ）工程ｃ）で置換され塩基対結合が可能となった相補
鎖における任意の領域に相補的な配列を3' 末端に含む
ポリヌクレオチドをアニールさせ、その3' 末端を合成
起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラー
ゼによる相補鎖合成を行って、工程ｃ）で合成された相
補鎖を置換する工程 〔２〕 工程ｄ）において、合成起点が領域Ｒ１ｃにア
ニールすることができる同一鎖上の3'末端に存在する領
域Ｒ１であり、Ｒ１がＲ１ｃにアニールすることによっ
て塩基対結合が可能な領域Ｒ２ｃを含むループが形成さ
れる〔１〕に記載の方法。 〔３〕 少なくとも以下の２つの領域Ｘ２およびＸ１ｃ
とで構成され、Ｘ２の5' 側にＸ１ｃが連結されたオリ
ゴヌクレオチド。 Ｘ２：特定の塩基配列を持つ核酸の任意の領域Ｘ２ｃに
相補的な塩基配列を持つ領域 Ｘ１ｃ:特定の塩基配列を持つ核酸における領域Ｘ２ｃ
の5'側に位置する領域Ｘ１ｃと実質的に同じ塩基配列を
持つ領域 〔４〕 工程ａ）における核酸が、以下の工程によって
提供される第２の核酸である〔１〕に記載の方法。 i) 領域Ｘ２が領域Ｆ２であり、領域Ｘ１ｃが領域Ｆ１
ｃである〔３〕に記載のオリゴヌクレオチドの領域Ｆ２
を鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃにアニールさせる工程、 ii)オリゴヌクレオチドのＦ２を合成起点とし、鋳型に
相補的な塩基配列を持つ第１の核酸を合成する工程 iii)工程 ii)で合成された第１の核酸の任意の領域を塩
基対結合が可能な状態とする工程、 iv)工程iii)における第１の核酸の塩基対結合を可能と
した領域に相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
をアニールさせ、それを合成起点として第２の核酸を合
成し、その3' 末端のＦ１を塩基対結合が可能な状態と
する工程 〔５〕 工程 iii)の塩基対結合を可能とする領域がＲ
２ｃであり、かつ工程 iv)におけるオリゴヌクレオチド
が、領域Ｘ２ｃが領域Ｒ２ｃであり、領域Ｘ１ｃが領域
Ｒ１ｃである〔３〕に記載のオリゴヌクレオチドである
〔４〕に記載の方法。 〔６〕 工程iii)およびiv)における塩基対結合が可能
な状態とする工程を、鋳型におけるＦ２ｃの更に3'側に
アニールするアウタープライマー、および第１の核酸に
おける工程iv)で合成起点とした領域の更に3'側にアニ
ールするアウタープライマーを合成起点とする鎖置換相
補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる鎖置換相補
鎖合成によって行う〔４〕または〔５〕に記載の方法。 〔７〕 反応に用いる各オリゴヌクレオチドと鋳型にお
けるその相補領域との融解温度が、同じストリンジェン
シーの下で次の関係にある〔６〕に記載の方法。 (アウ
タープライマー／鋳型における3'側の領域)≦(Ｆ２ｃ／
Ｆ２およびＲ２ｃ／Ｒ２) ≦ (Ｆ１ｃ／Ｆ１およびＲ１
ｃ／Ｒ１) 〔８〕 鋳型となる核酸がRNA であり、工程 ii)におけ
る相補鎖合成を逆転写酵素活性を持つ酵素で行う〔４〕
〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕 次の工程を繰り返すことによる１本鎖上に相補
的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法。 Ａ)3'末端と5'末端において、それぞれ末端領域に相補
的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互い
に相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の間に塩
基対結合が可能となるループが形成される鋳型を提供す
る工程 Ｂ)同一鎖にアニールさせた前記鋳型の3'末端を合成起
点として相補鎖合成を行う工程、 Ｃ）前記ループのうち3' 末端側に位置するループ内に
相補的な塩基配列を3' 末端に含むオリゴヌクレオチド
を、ループ部分にアニールさせ、これを合成起点として
鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相
補鎖合成を行って、工程Ｂ）で合成された相補鎖を置換
してその3'末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、
および Ｄ）工程Ｃ）において3'末端を塩基対結合が可能な状態
とした鎖を工程Ａ）における新たな鋳型とする工程 〔１０〕 工程Ｃ)におけるオリゴヌクレオチド
が、その5'側末端に工程Ｂ)において合成起点となった
3' 末端に相補的な塩基配列を備えたものである
的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法。 Ａ)3'末端と5'末端において、それぞれ末端領域に相補
的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互い
に相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の間に塩
基対結合が可能となるループが形成される鋳型を提供す
る工程 Ｂ)同一鎖にアニールさせた前記鋳型の3'末端を合成起
点として相補鎖合成を行う工程、 Ｃ）前記ループのうち3' 末端側に位置するループ内に
相補的な塩基配列を3' 末端に含むオリゴヌクレオチド
を、ループ部分にアニールさせ、これを合成起点として
鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相
補鎖合成を行って、工程Ｂ）で合成された相補鎖を置換
してその3'末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、
および Ｄ）工程Ｃ）において3'末端を塩基対結合が可能な状態
とした鎖を工程Ａ）における新たな鋳型とする工程 〔１０〕 工程Ｃ)におけるオリゴヌクレオチド
が、その5'側末端に工程Ｂ)において合成起点となった
3' 末端に相補的な塩基配列を備えたものである
〔９〕
に記載の増幅方法。 〔１１〕 更に工程Ｃ）におけるオリゴヌクレオチ
ドを合成起点として合成された相補鎖を工程Ａ）におけ
る鋳型とする工程を含む〔１０〕に記載の増幅方法。 〔１２〕 工程Ａ）における鋳型が〔５〕に記載の
方法によって合成されたものである
に記載の増幅方法。 〔１１〕 更に工程Ｃ）におけるオリゴヌクレオチ
ドを合成起点として合成された相補鎖を工程Ａ）におけ
る鋳型とする工程を含む〔１０〕に記載の増幅方法。 〔１２〕 工程Ａ）における鋳型が〔５〕に記載の
方法によって合成されたものである
〔９〕に記載の増幅
方法。 〔１３〕 融解温度調整剤の存在下で鎖置換相補鎖
合成反応を行う〔１〕または
方法。 〔１３〕 融解温度調整剤の存在下で鎖置換相補鎖
合成反応を行う〔１〕または
〔９〕に記載の方法。 〔１４〕 融解温度調整剤がベタインである〔１
３〕に記載の方法。 〔１５〕 反応液中に 0.2〜3.0Mのベタインを存在
させる〔１４〕に記載の方法。 〔１６〕
３〕に記載の方法。 〔１５〕 反応液中に 0.2〜3.0Mのベタインを存在
させる〔１４〕に記載の方法。 〔１６〕
〔９〕〜〔１５〕に記載のいずれかの増
幅方法を行い、増幅反応生成物が生じたかどうかを観察
することにより試料中の標的塩基配列を検出する方法。 〔１７〕 増幅反応生成物に、ループに相補的な塩
基配列を含むプローブを加え、両者のハイブリダイズを
観察する〔１６〕に記載の方法。 〔１８〕 プローブが粒子標識されており、ハイブ
リダイズによって生じる凝集反応を観察する〔１７〕に
記載の方法。 〔１９〕 核酸の検出剤存在下で
幅方法を行い、増幅反応生成物が生じたかどうかを観察
することにより試料中の標的塩基配列を検出する方法。 〔１７〕 増幅反応生成物に、ループに相補的な塩
基配列を含むプローブを加え、両者のハイブリダイズを
観察する〔１６〕に記載の方法。 〔１８〕 プローブが粒子標識されており、ハイブ
リダイズによって生じる凝集反応を観察する〔１７〕に
記載の方法。 〔１９〕 核酸の検出剤存在下で
〔９〕〜〔１５〕
に記載のいずれかの増幅方法を行い、検出剤のシグナル
変化に基づいて増幅反応生成物が生じたかどうかを観察
する〔１６〕に記載の方法。 〔２０〕 〔１６〕に記載の検出方法によって標的
塩基配列の変異を検出する方法であって、増幅対象であ
る塩基配列における変異が、増幅方法を構成するいずれ
かの相補鎖合成を妨げるものである方法。 〔２１〕 以下の要素を含む、１本鎖上に相補的な
塩基配列が交互に連結された核酸の合成用キット。 i)鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃをＸ２ｃとし、Ｆ２ｃの
5'側に位置するＦ１ｃをＸ１ｃとする〔３〕に記載のオ
リゴヌクレオチド ii)i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成さ
れた相補鎖における任意の領域に相補的な塩基配列を含
むオリゴヌクレオチド iii)鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃの3' 側に位置する領
域Ｆ３ｃに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド iv)鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNA ポリメラ
ーゼ、および v)要素 iv)の基質となるヌクレオチド 〔２２〕 ii)のオリゴヌクレオチドが、i)のオリ
ゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖にお
ける任意の領域Ｒ２ｃをＸ２ｃとし、Ｒ２ｃの5'に位置
するＲ１ｃをＸ１ｃとする〔３〕に記載のオリゴヌクレ
オチドである〔２１〕 に記載のキット。 〔２３〕 更に付加的に以下の要素を含む、〔２
２〕に記載のキット。 vi) i)のオリゴヌクレオチドを合成起点として合成され
た相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃの3' 側に位置する
領域Ｒ３ｃに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチ
ド。 〔２４〕 〔２１〕〜〔２３〕に記載のいずれかの
キットに、更に付加的に核酸合成反応の生成物を検出す
るための検出剤を含む、標的塩基配列の検出用キット。 本発明において合成の目的としている１本鎖上に相補
的な塩基配列が交互に連結された核酸とは、１本鎖上に
互いに相補的な塩基配列を隣り合せに連結した核酸を意
味する。更に本発明においては、相補的な塩基配列の間
にループを形成するための塩基配列を含まなければなら
ない。本発明においては、この配列をループ形成配列と
呼ぶ。そして本発明によって合成される核酸は、実質的
に前記ループ形成配列によって連結された互いに相補的
な塩基配列で構成される。なお一般的には、それが部分
的に塩基対結合を伴っているかどうかにかかわらず、塩
基対結合を解離させたときに２つ以上の分子に分離しな
いものを１本鎖と呼ぶ。相補的な塩基配列は、同一鎖上
で塩基対結合を形成することができる。本発明による１
本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結した核酸を、同
一鎖上で塩基対結合させることによって得ることができ
る分子内塩基対結合生成物は、見かけ上２本鎖を構成す
る領域と、塩基対結合を伴わないループ部分を与える。 すなわち、本発明における１本鎖上に相補的な塩基配
列が交互に連結した核酸とは、同一鎖上でアニールする
ことが可能な相補的な塩基配列を含み、そのアニール生
成物は折れ曲がったヒンジ部分に塩基対結合を伴わない
ループを構成する１本鎖核酸と定義することもできる。
そして塩基対結合を伴わないループには、相補的な塩基
配列を持つヌクレオチドがアニールすることができる。
ループ形成配列は任意の塩基配列であることができる。
置換のための相補鎖合成を開始することができるように
塩基対結合が可能であり、望ましくは特異的なアニーリ
ングを達成するために他の領域に存在する塩基配列から
識別可能な配列を備える。たとえば望ましい態様におい
ては、鋳型となる核酸に由来し同一鎖上でアニールする
領域（すなわちＦ１ｃやＲ１ｃ）の更に3'側に位置する
領域Ｆ２ｃ（あるいはＲ２ｃ）と実質的に同じ塩基配列
を含む。 本発明において、実質的に同じ塩基配列とは、次のよ
うに定義される。すなわち、ある配列を鋳型として合成
された相補鎖が、目的の塩基配列に対してアニールし相
補鎖合成の起点を与えるとき、このある配列は目的の塩
基配列に対して実質的に同一である。たとえばＦ２に対
して実質的に同一な塩基配列とは、Ｆ２とまったく同一
な塩基配列に加えて、Ｆ２にアニールして相補鎖合成の
起点となりうる塩基配列を与える鋳型として機能する塩
基配列を含む。本発明における用語「アニール」は、核
酸がワトソン−クリックの法則に基づく塩基対結合によ
って２本鎖構造を形成することを意味する。したがっ
て、塩基対結合を構成する核酸鎖が１本鎖であっても、
分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、
アニールである。本発明において、アニールとハイブリ
ダイズは、核酸が塩基対結合により２本鎖構造を構成す
る点で同義である。 本発明による核酸を構成する相補的な塩基配列の数
は、少なくとも１組である。本発明の望ましい態様によ
れば、その整数倍となることもある。そしてこの場合、
理論的には本発明における前記核酸を構成する相補的な
塩基配列のペアの数に上限はない。本発明の合成生成物
である核酸が複数組の相補的な塩基配列で構成されると
き、この核酸は同じ塩基配列の繰り返しからなる。 本発明によって合成される１本鎖上に相補的な塩基配
列が交互に連結した核酸は、必ずしも天然の核酸と同じ
構造を取る必要はない。核酸重合化酵素の作用によって
核酸を合成するときに基質としてヌクレオチド誘導体を
利用すれば、核酸の誘導体の合成が可能なことは公知で
ある。このようなヌクレオチド誘導体には、ラジオアイ
ソトープで標識したヌクレオチドや、ビオチンやジゴキ
シンのような結合性リガンドで標識したヌクレオチド誘
導体などが用いられる。これらのヌクレオチド誘導体を
用いることにより、生成物である核酸誘導体の標識が達
成される。あるいは、蛍光性のヌクレオチドを基質とし
て用いることによって、生成物である核酸を蛍光性の誘
導体とすることができる。更にこの生成物は、DNA であ
ることもできるし、RNA とすることもできる。いずれを
生成するかは、プライマーの構造、重合のための基質の
種類、そして核酸の重合を行う重合化試薬との組み合わ
せによって決定される。 上記の構造を持った核酸の合成は、鎖置換活性を持っ
たDNA ポリメラーゼと、3'末端に同一鎖上の一部Ｆ１ｃ
にアニールすることができる領域Ｆ１を備え、この領域
Ｆ１が同一鎖上のＦ１ｃにアニールすることによって、
塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成する
ことができる核酸によって開始することができる。ヘア
ピンループを形成させて自身を鋳型(template)とする相
補鎖合成反応の報告は多いが、本発明においてはヘアピ
ンループ部分に塩基対結合を可能とする領域を備えてお
り、この領域を相補鎖合成に利用している点において新
規である。この領域を合成起点とすることにより、先に
自身を鋳型として合成された相補鎖が置換される。そし
て置換された鎖の3'側に存在する領域Ｒ１ｃ（任意の領
域）が塩基対結合可能な状態となる。このＲ１ｃに相補
的な塩基配列を持つ領域がアニールして相補鎖合成を行
われ、結果としてＦ１からＲ１ｃにいたる塩基配列とそ
の相補鎖とがループ形成配列を介して交互に結合した核
酸（２分子）が生成する。本発明において、たとえば前
記Ｒ１ｃのように任意に選択される領域は、その領域に
相補的な塩基配列を持つポリヌクレオチドをアニールす
ることができ、そしてそのポリヌクレオチドを合成起点
として合成される相補鎖が本発明に必要な機能を備えて
いる限り、任意の領域から選択することができる。 更に本発明では、核酸という用語を用いる。本発明に
おいて核酸とは、一般的にはDNAとRNAの双方を含む。し
かしながら、構成ヌクレオチドが人工的な誘導体に置換
されているものや、あるいは天然のDNAやRNAが修飾され
たものであっても、相補鎖合成のための鋳型として機能
する限り、本発明の核酸に含まれる。本発明の核酸は、
一般に生物学的な試料に含まれる。生物学的試料とは、
動物、植物、あるいは微生物の組織、細胞、培養物、排
泄物あるいはそれらの排出物を示すことができる。本発
明の生物学的試料には、ウイルスやマイコプラズマのよ
うな細胞内寄生体のゲノムDNA、あるいはRNAが含まれ
る。また本発明の核酸は、前記生物学的試料に含まれる
核酸から誘導されたものであってもよい。たとえば、mR
NAをもとに合成されたcDNAや、生物学的試料に由来する
核酸をもとに増幅された核酸は、本発明における核酸の
代表的なものである。 本発明の特徴となっている、3'末端に同一鎖上の一部
Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を備え、こ
の領域Ｆ１が同一鎖上のＦ１ｃにアニールすることによ
って、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形
成することができる核酸は、様々な方法によって得るこ
とができる。もっとも望ましい態様においては、次の構
造を持ったオリゴヌクレオチドを利用した相補鎖合成反
応に基づいてその構造を与えることができる。 すなわち本発明において有用なオリゴヌクレオチドと
は、少なくとも以下の２つの領域Ｘ２およびＸ１ｃとで
構成され、Ｘ２の5'側にＸ１ｃが連結されたオリゴヌク
レオチドからなる。 Ｘ２：特定の塩基配列を持つ核酸の領域Ｘ２ｃに相補的
な塩基配列を持つ領域 Ｘ１ｃ:特定の塩基配列を持つ核酸における領域Ｘ２ｃ
の5'側に位置する領域Ｘ１ｃと実質的に同じ塩基配列を
持つ領域 ここで、本発明のオリゴヌクレオチドの構造を決定す
る特定の塩基配列を持つ核酸とは、本発明のオリゴヌク
レオチドをプライマーとして利用するときに、その鋳型
となる核酸を意味する。本発明の合成方法に基づいて核
酸の検出を行う場合には、特定の塩基配列を持つ核酸と
は、検出対象、あるいは検出対象から誘導された核酸で
ある。特定の塩基配列を持つ核酸は、少なくともその一
部の塩基配列が明らかとなっている、あるいは推測が可
能な状態にある核酸を意味する。塩基配列を明らかにす
べき部分とは、前記領域Ｘ２ｃおよびその5'側に位置す
る領域Ｘ１ｃである。この２つの領域は、連続する場
合、そして離れて存在する場合とを想定することができ
る。両者の相対的な位置関係により、生成物である核酸
が自己アニールしたときに形成されるループ部分の状態
が決定される。また、生成物である核酸が分子間のアニ
ールではなく自己アニールを優先的に行うためには、両
者の距離が不必要に離れないほうが望ましい。したがっ
て、両者の位置関係は、通常0-500 塩基分の距離を介し
て連続するようにするのが望ましい。ただし、後に述べ
る自己アニールによるループの形成において、両者があ
まりにも接近している場合には望ましい状態のループの
形成を行うには不利となるケースも予想される。ループ
においては、新たなオリゴヌクレオチドのアニールと、
それを合成起点とする鎖置換を伴う相補鎖合成反応がス
ムーズに開始できる構造が求められる。したがってより
望ましくは、領域Ｘ２ｃおよびその5'側に位置する領域
Ｘ１ｃとの距離が、０〜１００塩基、さらに望ましくは
１０〜７０塩基となるように設計する。なおこの数値は
Ｘ１ｃとＸ２を含まない長さを示している。ループ部分
を構成する塩基数は、更にＸ２に相当する領域を加えた
長さとなる。 なお本発明に基づくオリゴヌクレオチドを構成する塩
基配列の特徴付けのために用いられる同一、あるいは相
補的という用語は、いずれも完全に同一、あるいは完全
に相補的であることを意味しない。すなわち、ある配列
と同一とは、ある配列に対してアニールすることができ
る塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができ
る。他方、相補的とは、ストリンジェントな条件下でア
ニールすることができ、相補鎖合成の起点となる3'末端
を提供することができる配列を意味する。 上記特定の塩基配列を持つ核酸に対して本発明による
オリゴヌクレオチドを構成する領域Ｘ２およびＸ１ｃ
は、通常は重複することなく連続して配置される。ある
いはもしも両者の塩基配列に共通の部分があるのであれ
ば、部分的に両者を重ねて配置することもできる。Ｘ２
はプライマーとして機能する必要があることから、常に
3'末端となるようにしなければならない。一方Ｘ１ｃ
は、後に述べるように、これを鋳型として合成された相
補鎖の3'末端にプライマーとしての機能を与える必要が
あることから、5'末端に配置する。このオリゴヌクレオ
チドを合成起点として得られる相補鎖は、次のステップ
においては逆向きからの相補鎖合成の鋳型となり、最終
的には本発明によるオリゴヌクレオチド部分も鋳型とし
て相補鎖に写し取られる。写し取られることによって生
じる3'末端は塩基配列Ｘ１を備えており、同一鎖上のＸ
１ｃにアニールするとともに、ループを形成する。 本発明においてオリゴヌクレオチドとは、相補的な塩
基対結合を形成できること、そしてその3'末端において
相補鎖合成の起点となる-OH 基を与えること、の２つの
条件を満たすものを意味する。したがって、そのバック
ボーンは必ずしもホスホジエステル結合によるものに限
定されない。たとえばＰではなくＳをバックボーンとし
たホスホチオエート体やペプチド結合に基づくペプチド
核酸からなるものであることもできる。また、塩基は、
相補的な塩基対結合を可能とするものであれば良い。天
然の状態では、一般にはACTGおよびＵの５種類となる
が、たとえばブロモデオキシウリジン(bromodeoxyuridi
ne)といった類似体であることもできる。本発明に用い
るオリゴヌクレオチドは、合成の起点となるのみなら
ず、相補鎖合成の鋳型としても機能するものであること
が望ましい。なお、本発明においてはオリゴヌクレオチ
ドを含む用語としてポリヌクレオチドを用いる。用語ポ
リヌクレオチドは、その鎖長を制限しない場合に用い、
オリゴヌクレオチドは比較的短い鎖長のヌクレオチド重
合体を意味する用語として用いられる。 本発明によるオリゴヌクレオチドは、以下に述べる各
種の核酸合成反応において、与えられた環境の下で必要
な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うこ
とができる程度の鎖長を持つ。具体的には、5-200 塩
基、より望ましくは10-50 塩基対とする。配列依存的な
核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識する
プライマーの鎖長が、最低５塩基前後であることから、
アニールする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。
加えて、塩基配列としての特異性を期待するためには、
確率的に10 塩基以上の長さを利用するのが望ましい。
一方、あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製
することが困難となることから、前記のような鎖長が望
ましい範囲として例示される。なお、ここで例示した鎖
長はあくまでも相補鎖とアニールする部分の鎖長であ
る。後に述べるように、本発明によるオリゴヌクレオチ
ドは最終的には少なくとも２つの領域に個別にアニール
することができる。したがって、ここに例示する鎖長
は、オリゴヌクレオチドを構成する各領域の鎖長と理解
するべきである。 更に、本発明によるオリゴヌクレオチドは、公知の標
識物質によって標識することができる。標識物質として
は、ジゴキシンやビオチンのような結合性リガンド、酵
素、蛍光物質や発光物質、あるいは放射性同位元素など
を示すことができる。あるいは、オリゴヌクレオチドを
構成する塩基を蛍光性のアナログに置換する技術(WO95/
05391,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,6644-6648,1994)も
公知である。 この他本発明によるオリゴヌクレオチドは、それ自身
を固相に結合させておくこともできる。あるいは、オリ
ゴヌクレオチドの任意の部分にビオチンのような結合性
のリガンドで標識しておき、これを固相化アビジンのよ
うな結合パートナーによって間接的に固相化することも
できる。固相化オリゴヌクレオチドを合成開始点とする
場合には、核酸の合成反応生成物が固相に捕捉されるこ
とから、分離が容易となる。分離された生成物に対し
て、核酸特異的な指示薬や、あるいは更に標識プローブ
をハイブリダイズさせることによって、検出を行うこと
もできる。あるいは、任意の制限酵素で消化することに
よって、目的とする核酸の断片を回収することもでき
る。 本発明において用いられる鋳型という用語は、相補鎖
合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な
塩基配列を持つ相補鎖は、鋳型に対応する鎖としての意
味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過
ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び
鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳
型になることができる。 本発明に有用なオリゴヌクレオチドは前記２つの領域
のみならず、更に付加的な領域を含むことができる。Ｘ
２とＸ１ｃとがそれぞれ3'末端と5'末端に配置される一
方、両者の間に任意の配列を介在させることが可能であ
る。それは、たとえば制限酵素認識配列、RNA ポリメラ
ーゼが認識するプロモーター、あるいはリボザイムをコ
ードするDNA 等であることができる。制限酵素認識配列
とすることにより、本発明の合成産物である１本鎖上に
相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を同じ長さを
持った２本鎖核酸に切りそろえることができるようにな
る。RNA ポリメラーゼが認識するプロモーター配列を配
置すれば、本発明の合成生成物を鋳型として更にRNA へ
の転写が行われる。このときに、更にリボザイムをコー
ドするDNA を配置すれば、転写生成物を自身で切断する
系が実現する。なお、これらの付随的な塩基配列はいず
れも２本鎖となった場合に機能するものである。したが
って、本発明による１本鎖の核酸がループを形成してい
るときには、これらの配列は機能しない。核酸の伸長が
進み、ループを含まない状態で相補的な塩基配列を持つ
鎖とアニールした状態になったときにはじめて機能す
る。 本発明に基づくオリゴヌクレオチドに対して、合成さ
れた領域の転写を可能とする方向でプロモーターを組み
合わせた場合、同じ塩基配列を繰り返す本発明に基づく
反応生成物は、高度に効率的な転写系を実現する。これ
を適当な発現系と組み合わせることによって、タンパク
質への翻訳も可能である。すなわち、細菌や動物細胞内
で、あるいはin vitro での転写とタンパク質への翻訳
に利用することができる。 上記のような構造の本発明によるオリゴヌクレオチド
は、化学的に合成することができる。あるいは天然の核
酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配
列で構成されるように改変する、あるいは連結すること
も可能である。 本発明による核酸の合成方法において有用な上記オリ
ゴヌクレオチドを利用し、鎖置換活性を持ったDNA ポリ
メラーゼと組み合わせて合成を行う反応について、基本
的な原理を図５−６を参考にしながら以下に説明する。
上記オリゴヌクレオチド（図５におけるＦＡ）は、まず
Ｘ２（Ｆ２に相当）が鋳型となる核酸にアニールし相補
鎖合成の起点となる。図５においてはＦＡを起点として
合成された相補鎖がアウタープライマー（Ｆ３）からの
相補鎖合成（後述）によって置換され、１本鎖（図５−
Ａ）となっている。得られた相補鎖に対して更に相補鎖
合成を行うと、このとき図５−Ａの相補鎖として合成さ
れる核酸の3'末端部分は、本発明によるオリゴヌクレオ
チドに相補的な塩基配列を持つ。つまり、本発明のオリ
ゴヌクレオチドは、その5'末端部分に領域Ｘ１ｃ（Ｆ１
ｃに相当）と同じ配列を持つことから、このとき合成さ
れる核酸の3' 末端部分はその相補配列Ｘ１ (Ｆ１)を持
つことになる。図５は、Ｒ１を起点として合成された相
補鎖がアウタープライマーＲ３を起点とする相補鎖合成
によって置換される様子を示している。置換によって3'
末端部分が塩基対結合が可能な状態となると、3'末端
のＸ１ (Ｆ１)は、同一鎖上のＸ１ｃ（Ｆ１ｃ）にアニ
ールし、自己を鋳型とした伸長反応が進む (図５−
Ｂ)。そしてその3' 側に位置するＸ２ｃ（Ｆ２ｃ）を塩
基対結合を伴わないループとして残す。このループには
本発明によるオリゴヌクレオチドのＸ２（Ｆ２）がアニ
ールし、これを合成起点とする相補鎖合成が行われる
(図５−Ｂ)。このとき、先に合成された自身を鋳型とす
る相補鎖合成反応の生成物が、鎖置換反応によって置換
され塩基対結合が可能な状態となる。 本発明によるオリゴヌクレオチドを１種類、そしてこ
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相
補鎖を鋳型として核酸合成を行うことが可能な任意のリ
バースプライマーを用いた基本的な構成によって、図６
に示すような複数の核酸合成生成物を得ることができ
る。図６からわかるとおり、(D)が本発明において合成
の目的となっている１本鎖上に相補的な塩基配列が交互
に連結された核酸である。他方の生成物(E)は、加熱変
性などの処理によって１本鎖とすれば再び(D)を生成す
るための鋳型となる。また２本鎖状態にある核酸である
生成物(D)は、もしも加熱変性などによって１本鎖にさ
れた場合、もとの２本鎖とはならずに高い確率で同一鎖
内部でのアニールが起きる。なぜならば、同じ融解温度
(Tm)を持つ相補配列ならば、分子間(intermolecular)反
応よりも分子内(intramolecular)反応のほうがはるかに
優先的に進むためである。同一鎖上でアニールした生成
物(D)に由来する１本鎖は、それぞれが同一鎖内でアニ
ールして(B)の状態に戻るので、更にそれぞれが１分子
づつの(D)と(E)を与える。これらの工程を繰り返すこと
によって、１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結さ
れた核酸を次々に合成していくことが可能である。１サ
イクルで生成される鋳型と生成物が指数的に増てえいく
ので、たいへん効率的な反応となる。 ところで図５−(A)の状態を実現するためには、はじ
めに合成された相補鎖を少なくともリバースプライマー
がアニールする部分において塩基対結合が可能な状態に
しなければならない。このステップは任意の方法によっ
て達成することができる。すなわち、最初の鋳型に対し
て本発明のオリゴヌクレオチドがアニールする領域Ｆ２
ｃよりも更に鋳型上で3' 側の領域Ｆ３ｃにアニールす
るアウタープライマー（Ｆ３）を別に用意する。このア
ウタープライマーを合成起点として鎖置換型の相補鎖合
成を触媒するポリメラーゼによって相補鎖合成を行え
ば、本発明の前記Ｆ２ｃを合成開始点として合成された
相補鎖は置換され、やがてＲ１がアニールすべき領域Ｒ
１ｃを塩基対結合が可能な状態とする(図５)。鎖置換反
応を利用することによって、ここまでの反応を等温条件
下で進行させることができる。 アウタープライマーを利用する場合には、Ｆ２ｃから
の合成よりも後にアウタープライマー（Ｆ３）からの合
成が開始される必要がある。最も単純な方法はインナー
プライマーの温度をアウタープライマーの濃度よりも高
くすることである。具体的には、通常２〜５０倍、望ま
しくは４〜１０倍の濃度差でプライマーを用いることに
より、期待どおりの反応を行わせることができる。また
アウタープライマーの融解温度(Tm)をインナープライマ
ーのＸ１（Ｆ１やＲ１に相当）領域のTmより低くなるよ
うに設定することによって合成のタイミングをコントロ
ールすることもできる。すなわち、(アウタープライマ
ーＦ３：Ｆ３ｃ) ≦ (Ｆ２ｃ／Ｆ２) ≦ (Ｆ１ｃ／Ｆ
１)、あるいは（アウタープライマー／鋳型における3'
側の領域）≦（Ｘ２ｃ：Ｘ２）≦（Ｘ１ｃ：Ｘ１）であ
る。なおここで（Ｆ２ｃ／Ｆ２）≦（Ｆ１ｃ／Ｆ１）と
したのは、Ｆ２がループ部分にアニールするよりも先に
Ｆ１ｃ／Ｆ１間のアニールを行わせるためである。Ｆ１
ｃ／Ｆ１間のアニールは分子内の反応なので優先的に進
む可能性が高い。しかしより望ましい反応条件を与える
ためにTmを考慮することには意義がある。同様の条件
は、リバースプライマーの設計においても考慮すべきで
あることは言うまでもない。このような関係とすること
により、確率的に理想的な反応条件を達成することがで
きる。融解温度(Tm)は、他の条件が一定であればアニー
ルする相補鎖の長さと塩基対結合を構成する塩基の組み
合わせによって理論的に算出することができる。したが
って当業者は、本明細書の開示に基づいて望ましい条件
を容易に導くことができる。 更にアウタープライマーのアニールのタイミングを調
整するために、コンティギュアス スタッキング(conti
guous stacking)と呼ばれる現象を応用することもでき
る。コンティギュアス スタッキングとは、単独ではア
ニールすることができないオリゴヌクレオチドが２本鎖
部分に隣接することによってアニールが可能となる現象
である(Chiara Borghesi-Nicoletti et.al. Bio Techni
ques 12, 474-477(1992)。つまり、アウタープライマー
をＦ２ｃ（Ｘ２ｃ）に隣接させ、単独ではアニールでき
ないように設計しておくのである。こうすれば、Ｆ２ｃ
(Ｘ２ｃ)がアニールしたときに初めてアウタープライマ
ーのアニールが可能となるので、必然的にＦ２ｃ（Ｘ２
ｃ）のアニールが優先されることになる。この原理に基
づいて、一連の反応にプライマーとして必要なオリゴヌ
クレオチドの塩基配列を設定した例が実施例に記載され
ている。なお、この工程は加温による変性や、DNAヘリ
カーゼによって達成することもできる。 Ｆ２ｃ（Ｘ２ｃ）を持つ鋳型核酸がRNA の場合には、
異なる方法により図５−(A)の状態を実現することもで
きる。たとえば、このRNA 鎖を分解してしまえば、Ｒ１
は塩基対結合が可能な状態となる。すなわち、Ｆ２をRN
A のＦ２ｃにアニールさせ、逆転写酵素によってDNA と
して相補鎖合成を行う。次いで鋳型となったRNAをアル
カリ変性やDNA/RNA２本鎖のRNAに作用するリボヌクレア
ーゼによる酵素処理によって分解すれば、Ｆ２から合成
したDNA は１本鎖となる。DNA/RNA２本鎖のRNA を選択
的に分解する酵素には、RNaseH や、一部の逆転写酵素
が備えているリボヌクレアーゼ活性を利用することがで
きる。こうして塩基対結合を可能としたＲ１ｃにリバー
スプライマーをアニールさせることができる。したがっ
てＲ１ｃを塩基結合可能な状態とするためのアウタープ
ライマーが不要となる。 あるいは逆転写酵素が備えている鎖置換活性を利用し
て、先に述べたアウタープライマーによる鎖置換を行う
こともできる。この場合は逆転写酵素のみで反応系を構
成することができる。すなわち、RNA を鋳型として、そ
のＦ２ｃにアニールするＦ２からの相補鎖合成、更にそ
の3'側に位置するＦ３ｃにアニールするアウタープライ
マーＦ３を合成起点とする相補鎖合成と置換とが、逆転
写酵素で可能となる。逆転写酵素がDNA を鋳型とする相
補鎖合成反応を行うものであれば、置換された相補鎖を
鋳型としてそのＲ１ｃにアニールするＲ１を合成起点と
する相補鎖合成、そして3'側に位置するＲ３ｃにアニー
ルするＲ３を合成起点とする相補鎖合成と置換反応をも
含めてすべての相補鎖合成反応が逆転写酵素によって進
行する。あるいは、与えられた反応条件の下で逆転写酵
素にDNA/DNA 鎖の置換活性が期待できないときには、先
に述べた鎖置換活性を持ったDNA ポリメラーゼを組み合
わせて用いても良い。以上のように、RNA を鋳型として
第１の１本鎖核酸を得るという態様は、本発明における
望ましい態様を構成する。逆に、鎖置換活性を有し、逆
転写酵素活性を併せ持つBca DNA ポリメラーゼのような
DNA ポリメラーゼを利用しても、同様にRNA からの第１
の１本鎖核酸の合成のみならず、以降のDNA を鋳型とす
る反応も同一の酵素によって行うことができる。 さて、以上のような反応系は前記リバースプライマー
として特定の構造を持つものを利用することによって、
本発明に固有の様々なバリエーションをもたらす。もっ
とも効果的なバリエーションについて以下に述べる。す
なわち、本発明のもっとも有利な態様においては、前記
リバースプライマーとして、〔５〕に述べたような構成
からなるオリゴヌクレオチドを用いるのである。〔５〕
のオリゴヌクレオチドとは、すなわちＦ２をプライマー
として合成される相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃをＸ
２ｃとし、Ｒ１ｃをＸ１ｃとするオリゴヌクレオチドで
ある。このようなリバースプライマーの利用により、ル
ープの形成とこのループ部分からの相補鎖合成と置換と
いう一連の反応が、センス鎖とアンチセンス鎖（フォー
ワード側とリバース側）の両方で起きるようになる。そ
の結果、本発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が交
互に連結された核酸の合成方法の合成効率が飛躍的に向
上すると共に、一連の反応を等温で実施可能とするもの
である。以下に、この態様をまとめた図１−図３に基づ
き、具体的に説明する。 以下の態様においては、本発明に基づくオリゴヌクレ
オチドとして２種類を用意する。これを説明のためにＦ
ＡとＲＡと名づける。ＦＡとＲＡを構成する領域は、以
下のとおりである。 Ｘ２ Ｘ１ｃ ＦＡ Ｆ２ Ｆ１ｃ ＲＡ Ｒ２ Ｒ１ｃ ここで、Ｆ２は鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃに相補的
な塩基配列である。またＲ２はＦ２をプライマーとして
合成される相補鎖に含まれる任意の領域Ｒ２ｃに相補的
な塩基配列である。Ｆ１ｃとＲ１ｃはそれぞれ、Ｆ２ｃ
およびＲ２ｃのそれぞれ下流に位置する任意の塩基配列
である。ここでＦ２−Ｒ２間の距離は任意であって良
い。相補鎖合成を行うDNA ポリメラーゼの合成能力にも
依存するが、好適な条件では1kbp 程度の長さであって
も十分に合成が可能である。より具体的には、Bst DNA
ポリメラーゼを用いた場合、F2/R2c 間で 800bp、望ま
しくは 500bp以下の長さであれば確実に合成される。温
度サイクルを伴うPCR では、温度変化ストレスによる酵
素活性の低下が長い塩基配列の合成効率を下げるとされ
ている。本発明における望ましい態様では、核酸増幅工
程における温度サイクルが不要となるので、長い塩基配
列であっても合成、ならびに増幅を確実に達成すること
ができる。 まず鋳型となる核酸に対してＦＡのＦ２をアニールさ
せ、これを合成起点として相補鎖合成を行う。以下、図
１の(4)にいたるまでは先に説明した本発明の基本的な
態様(図５) と同様の反応工程となっている。図１の(2)
でＦ３としてアニールしている配列は、先に説明したア
ウタープライマーである。このプライマーを合成起点と
して鎖置換型の相補鎖合成を行うDNA ポリメラーゼで行
うことにより、ＦＡから合成した相補鎖は置換され、塩
基対結合が可能な状態となる。 (4)でＲ２ｃが塩基対結合が可能な状態となったとこ
ろで、リバースプライマーとしてのＲＡがＲ２ｃ／Ｒ２
の組み合わせでアニールする。これを合成起点とする相
補鎖合成は、ＦＡの5'側末端であるＦ１ｃに至る部分ま
で行われる。この相補鎖合成反応に続いて、やはり置換
用のアウタープライマーＲ３がアニールし、鎖置換を伴
って相補鎖合成を行うことにより、ＲＡを合成起点とし
て合成された相補鎖が置換される。このとき置換される
相補鎖は、ＲＡを5'側に持ちＦＡに相補的な配列が3'末
端に位置する。 さて、こうして置換された１本鎖核酸の3'側には、同
一鎖上のＦ１ｃに相補的な配列Ｆ１が存在する。Ｆ１
は、同一分子内に並ぶＦ１ｃに速やかにアニールし、相
補鎖合成が始まる。3'末端（Ｆ１）が同一鎖上のＦ１ｃ
にアニールするときに、Ｆ２ｃを含むループが形成され
ている。このループ部分は塩基対結合が可能な状態で維
持されていることは、図２-(7)からも明らかである。Ｆ
２ｃに相補的な塩基配列を持つ本発明のオリゴヌクレオ
チドＦＡは、このループ部分にアニールして相補鎖合成
の起点となる(7)。ループ部分からの相補鎖合成は、先
に開始したＦ１からの相補鎖合成の反応生成物を置換し
ながら進む。その結果、自身を鋳型として合成された相
補鎖は、再び3'末端において塩基対結合が可能な状態と
なる。この3'末端は、同一鎖上のＲ１ｃにアニールしう
る領域Ｒ１を3'末端に備えており、やはり同一分子内の
速やかな反応により両者は優先的にアニールする。こう
して、先に説明したＦＡを鋳型として合成された3'末端
からの反応と同様の反応が、この領域でも進行する。結
果として、本発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が
交互に連結された核酸は次々と相補鎖合成と置換とを継
続し、その3' 末端Ｒ１を起点とする伸長を続けること
になる。3'末端Ｒ１の同一鎖へのアニールによって形成
されるループには常にＲ２ｃが含まれることから、以降
の反応で3'末端のループ部分にアニールするのは常にＲ
２を備えたオリゴヌクレオチド（すなわちＲＡ）とな
る。 一方、自分自身を鋳型として伸長を継続する１本鎖の
核酸に対して、そのループ部分にアニールするオリゴヌ
クレオチドを合成起点として相補鎖合成される核酸に注
目すると、ここでも本発明による１本鎖上に相補的な塩
基配列が交互に連結された核酸の合成が進行している。
すなわち、ループ部分からの相補鎖合成は、たとえば図
２−(7)においては、ＲＡに達した時点で完了する。そ
して、この核酸の合成によって置換された核酸が相補鎖
合成を開始（図３−(8)）すると、やがてその反応はか
つて合成起点であったループ部分に達して再び置換が始
まる。こうしてループ部分から合成を開始した核酸も置
換され、その結果同一鎖上にアニールすることができる
3' 末端Ｒ１を得る（図３−(10)）。この3' 末端Ｒ１は
同一鎖のＲ１ｃにアニールして相補鎖合成を開始する。
さて、この反応のＦとＲを読みかえれば、図２−(7)で
起きている反応と同じである。したがって図３−(10)に
示す構造は、自身の伸長と新たな核酸の生成を継続する
新しい核酸として機能することができる。 なお図３−(10)に示す核酸から開始する核酸の合成反
応は、ここまで述べてきたものとは逆に常に3' 末端Ｆ
１を合成起点とする伸長となる。すなわち本発明におい
ては、１つの核酸の伸長に伴って、これとは別に伸長を
開始する新たな核酸を供給しつづける反応が進行する。
更に鎖が伸長するのに従い、末端のみならず、同一鎖上
に複数のループ形成配列がもたらされる。これらのルー
プ形成配列は、鎖置換合成反応により塩基対形成可能な
状態となると、オリゴヌクレオチドがアニールし、新た
な核酸の生成反応の基点となる。末端のみならず鎖の途
中からの合成反応も組み合わされることにより、さらに
効率のよい増幅反応が達成されるのである。以上のよう
にリバースプライマーとして本発明に基づくオリゴヌク
レオチドＲＡを組み合わせることによって、伸長とそれ
に伴う新たな核酸の生成が起きる。更に本発明において
は、この新たに生成した核酸自身が伸長し、それに付随
する更に新たな核酸の生成をもたらす。一連の反応は、
理論的には永久に継続し、きわめて効率的な核酸の増幅
を達成することができる。しかも本発明の反応は、等温
条件のもとで行うことができる。 このとき蓄積する反応生成物は、Ｆ１−Ｒ１間の塩基
配列とその相補配列が交互に連結された構造を持つ。た
だし繰り返し単位となっている配列の両端には、Ｆ２−
Ｆ１ (Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ)、またはＲ２−Ｒ１（Ｒ２ｃ−
Ｒ１ｃ）の塩基配列で構成される領域が連続している。
たとえば図３−(9)では、5'側から（Ｒ２−Ｆ２ｃ）−
（Ｆ１−Ｒ２ｃ）−（Ｒ１−Ｆ１ｃ）−（Ｆ２−Ｒ２
ｃ）という順序で連結された状態となる。これは、本発
明に基づく増幅反応が、オリゴヌクレオチドを合成起点
としてＦ２（またはＲ２）から開始し、続いて自身の3'
末端を合成起点とするＦ１（またはＲ１）からの相補
鎖合成反応によって伸長するという原理のもとに進行し
ているためである。 さて、ここでは最も望ましい態様としてループ部分に
アニールするオリゴヌクレオチドに本発明によるオリゴ
ヌクレオチドＦＡ、およびＲＡを用いた。しかし本発明
による核酸の増幅反応は、これらの限られた構造を持っ
たオリゴヌクレオチドのみならず、ループからの相補鎖
合成を開始できるオリゴヌクレオチドを利用しさえすれ
ば実施することができる。つまり、伸長を続ける3'末端
はループからの相補鎖合成によって置換されさえすれ
ば、再びループ部分を与える。ループ部分から開始する
相補鎖合成は、常に１本鎖上に相補的な塩基配列が交互
に連結された核酸を鋳型としていることから、本発明で
目的としている核酸の合成が可能なことは自明である。
ただし、ここで合成される核酸は、置換後にループを形
成して相補鎖合成は行うものの、以降のループを形成す
るための3'末端を持たないため、新たな鋳型としては機
能できなくなる。したがって、ＦＡ、あるいはＲＡによ
って合成を開始した核酸と違って指数的な増幅は期待で
きない。このような理由から、ＦＡやＲＡのような構造
を持ったオリゴヌクレオチドは、本発明に基づく高度に
効率的な核酸の合成に有用なのである。 一連の反応は、鋳型となる１本鎖の核酸に対して、以
下の成分を加え、ＦＡおよびＲＡを構成する塩基配列が
相補的な塩基配列に対して安定な塩基対結合を形成する
ことができ、かつ酵素活性を維持しうる温度でインキュ
ベートするだけで進行する。 ・４種類のオリゴヌクレオチド： ＦＡ、 ＲＡ、 アウタープライマーＦ３、 およびアウタープライマーＲ３、 ・鎖置換型の相補鎖合成を行うDNA ポリメラーゼ、 ・DNA ポリメラーゼの基質となるヌクレオチド したがって、PCR のような温度サイクルは必要無い。
なおここでいう安定な塩基対結合とは、反応系に存在す
るオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が相補鎖合成の
起点を与えうる状態を意味する。安定な塩基対結合をも
たらす望ましい条件は、たとえば融解温度(Tm)以下に設
定することである。一般に融解温度(Tm)は、互いに相補
的な塩基配列を持つ核酸の 50%が塩基対結合した状態と
なる温度とされている。融解温度(Tm)以下に設定するこ
とは本発明の必須の条件ではないが、高度な合成効率を
達成するためには考慮すべき反応条件の一つである。鋳
型とすべき核酸が２本鎖である場合には、少なくともオ
リゴヌクレオチドがアニールする領域を塩基対結合が可
能な状態とする必要がある。そのためには一般に加熱変
性が行われるが、これは反応開始前の前処理として１度
だけ行えば良い。 この反応は、酵素反応に好適なpH を与える緩衝剤、
酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、
酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度(Tm)の調整
剤等の共存下で行う。緩衝剤としては、Tris-HCl 等の
中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられ
る。pH は使用するDNA ポリメラーゼに応じて調整す
る。塩類としては KCl、NaCl、あるいは(NH4)2SO4等
が、酵素の活性維持と核酸の融解温度(Tm)調整のために
適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アル
ブミンや糖類が利用される。更に融解温度(Tm)の調整剤
には、ジメチルスルホキシド(DMSO)やホルムアミドが一
般に利用される。融解温度(Tm)の調整剤を利用すること
によって、前記オリゴヌクレオチドのアニールを限られ
た温度条件の下で調整することができる。更にベタイン
(N,N,N,-trimethylglycine)やテトラアルキルアンモニ
ウム塩は、そのisostabilize 作用によって鎖置換効率
の向上にも有効である。ベタインは、反応液中 0.2〜3.
0Ｍ、好ましくは 0.5〜1.5 M 程度の添加により、本発
明の核酸増幅反応の促進作用を期待できる。これらの融
解温度の調整剤は、融解温度を下げる方向に作用するの
で、塩濃度や反応温度等のその他の反応条件を考慮し
て、適切なストリンジェンシーと反応性を与える条件を
経験的に設定する。 本発明においては、一連の反応が常に複数の領域の位
置関係を維持した状態でなければ進行しないことが重要
な特徴である。この特徴によって、非特異的な相補鎖合
成に伴う非特異的な合成反応が効果的に防止できるので
ある。すなわち、たとえ何らかの非特異的な反応が起き
たとしても、その生成物が以降の増幅工程に対して出発
材料となる可能性を低く押さえることにつながるのであ
る。またより多くの領域によって反応の進行が制御され
ているということは、類似した塩基配列の厳密な識別を
可能とする検出系を自由に構成できる可能性をもたら
す。 この特徴を遺伝子変異の検出に利用することができ
る。本発明におけるアウタープライマーを用いる態様に
おいては、このアウタープライマー２種、本発明のオリ
ゴヌクレオチドからなるプライマー２種の合計４種のプ
ライマーが用いられている。すなわち４種のオリゴヌク
レオチドに含まれる６領域が設計通りに働かなければ本
発明の合成反応は進行しない。特に、相補鎖合成の起点
となる各オリゴヌクレオチドの3'末端、および相補配列
が合成起点となるＸ１ｃ領域の5'末端の配列は重要であ
る。そこで、この重要な配列を検出すべき変異に対応す
るように設計すれば、本発明による合成反応生成物を観
察することによって、塩基の欠失や挿入といった変異の
有無、あるいはSNPs のような遺伝子多型を総合的に分
析することができる。より具体的には、変異や多型が予
想される塩基が、相補鎖合成の起点となるオリゴヌクレ
オチドの3'末端付近（相補鎖が起点となる場合には5'末
端付近）に相当するように設計するのである。相補鎖の
合成起点となる3'末端や、その付近にミスマッチが存在
すると核酸の相補鎖合成反応は著しく阻害される。本発
明においては、反応初期の生成物における末端構造が繰
り返し反応を行わなければ高度な増幅反応に結びつかな
い。したがって、たとえ誤った合成が行われたとして
も、増幅反応を構成する相補鎖合成がいずれかの段階で
常に妨げられるのでミスマッチを含んだままでは高度な
増幅は起きない。結果的にミスマッチが増幅反応を効果
的に抑制し、最終的には正確な結果をもたらすことにな
る。つまり本発明に基づく核酸の増幅反応は、より完成
度の高い塩基配列のチェック機構を備えていると言うこ
とができる。これらの特徴は、たとえば単純に２つの領
域で増幅反応を行っているPCR 法などでは期待しにくい
利点である。 更に本発明に用いるオリゴヌクレオチドを特徴付ける
領域Ｘ１ｃは、相補配列が合成されてはじめて合成起点
となり、この相補配列が、新たに合成された同一鎖内の
配列Ｘ１にアニールすることにより、自己を鋳型とする
合成反応が進行する。このため、たとえ先行技術でしば
しば重要な問題となるいわゆるプライマータイマーを生
成しても、本オリゴヌクレオチドはループを形成しな
い。したがって、プライマーダイマーに起因する非特異
的な増幅は原理的に生じ得ず、反応の特異性向上に貢献
している。 更に本発明によれば、Ｆ３（図１-(2)）やＲ３（図２
-(5)）で示したアウタープライマーを組み合わせること
によって、上記の一連の反応を等温条件下で行うことが
できる。すなわち本発明は、前記
に記載のいずれかの増幅方法を行い、検出剤のシグナル
変化に基づいて増幅反応生成物が生じたかどうかを観察
する〔１６〕に記載の方法。 〔２０〕 〔１６〕に記載の検出方法によって標的
塩基配列の変異を検出する方法であって、増幅対象であ
る塩基配列における変異が、増幅方法を構成するいずれ
かの相補鎖合成を妨げるものである方法。 〔２１〕 以下の要素を含む、１本鎖上に相補的な
塩基配列が交互に連結された核酸の合成用キット。 i)鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃをＸ２ｃとし、Ｆ２ｃの
5'側に位置するＦ１ｃをＸ１ｃとする〔３〕に記載のオ
リゴヌクレオチド ii)i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成さ
れた相補鎖における任意の領域に相補的な塩基配列を含
むオリゴヌクレオチド iii)鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃの3' 側に位置する領
域Ｆ３ｃに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド iv)鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNA ポリメラ
ーゼ、および v)要素 iv)の基質となるヌクレオチド 〔２２〕 ii)のオリゴヌクレオチドが、i)のオリ
ゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖にお
ける任意の領域Ｒ２ｃをＸ２ｃとし、Ｒ２ｃの5'に位置
するＲ１ｃをＸ１ｃとする〔３〕に記載のオリゴヌクレ
オチドである〔２１〕 に記載のキット。 〔２３〕 更に付加的に以下の要素を含む、〔２
２〕に記載のキット。 vi) i)のオリゴヌクレオチドを合成起点として合成され
た相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃの3' 側に位置する
領域Ｒ３ｃに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチ
ド。 〔２４〕 〔２１〕〜〔２３〕に記載のいずれかの
キットに、更に付加的に核酸合成反応の生成物を検出す
るための検出剤を含む、標的塩基配列の検出用キット。 本発明において合成の目的としている１本鎖上に相補
的な塩基配列が交互に連結された核酸とは、１本鎖上に
互いに相補的な塩基配列を隣り合せに連結した核酸を意
味する。更に本発明においては、相補的な塩基配列の間
にループを形成するための塩基配列を含まなければなら
ない。本発明においては、この配列をループ形成配列と
呼ぶ。そして本発明によって合成される核酸は、実質的
に前記ループ形成配列によって連結された互いに相補的
な塩基配列で構成される。なお一般的には、それが部分
的に塩基対結合を伴っているかどうかにかかわらず、塩
基対結合を解離させたときに２つ以上の分子に分離しな
いものを１本鎖と呼ぶ。相補的な塩基配列は、同一鎖上
で塩基対結合を形成することができる。本発明による１
本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結した核酸を、同
一鎖上で塩基対結合させることによって得ることができ
る分子内塩基対結合生成物は、見かけ上２本鎖を構成す
る領域と、塩基対結合を伴わないループ部分を与える。 すなわち、本発明における１本鎖上に相補的な塩基配
列が交互に連結した核酸とは、同一鎖上でアニールする
ことが可能な相補的な塩基配列を含み、そのアニール生
成物は折れ曲がったヒンジ部分に塩基対結合を伴わない
ループを構成する１本鎖核酸と定義することもできる。
そして塩基対結合を伴わないループには、相補的な塩基
配列を持つヌクレオチドがアニールすることができる。
ループ形成配列は任意の塩基配列であることができる。
置換のための相補鎖合成を開始することができるように
塩基対結合が可能であり、望ましくは特異的なアニーリ
ングを達成するために他の領域に存在する塩基配列から
識別可能な配列を備える。たとえば望ましい態様におい
ては、鋳型となる核酸に由来し同一鎖上でアニールする
領域（すなわちＦ１ｃやＲ１ｃ）の更に3'側に位置する
領域Ｆ２ｃ（あるいはＲ２ｃ）と実質的に同じ塩基配列
を含む。 本発明において、実質的に同じ塩基配列とは、次のよ
うに定義される。すなわち、ある配列を鋳型として合成
された相補鎖が、目的の塩基配列に対してアニールし相
補鎖合成の起点を与えるとき、このある配列は目的の塩
基配列に対して実質的に同一である。たとえばＦ２に対
して実質的に同一な塩基配列とは、Ｆ２とまったく同一
な塩基配列に加えて、Ｆ２にアニールして相補鎖合成の
起点となりうる塩基配列を与える鋳型として機能する塩
基配列を含む。本発明における用語「アニール」は、核
酸がワトソン−クリックの法則に基づく塩基対結合によ
って２本鎖構造を形成することを意味する。したがっ
て、塩基対結合を構成する核酸鎖が１本鎖であっても、
分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、
アニールである。本発明において、アニールとハイブリ
ダイズは、核酸が塩基対結合により２本鎖構造を構成す
る点で同義である。 本発明による核酸を構成する相補的な塩基配列の数
は、少なくとも１組である。本発明の望ましい態様によ
れば、その整数倍となることもある。そしてこの場合、
理論的には本発明における前記核酸を構成する相補的な
塩基配列のペアの数に上限はない。本発明の合成生成物
である核酸が複数組の相補的な塩基配列で構成されると
き、この核酸は同じ塩基配列の繰り返しからなる。 本発明によって合成される１本鎖上に相補的な塩基配
列が交互に連結した核酸は、必ずしも天然の核酸と同じ
構造を取る必要はない。核酸重合化酵素の作用によって
核酸を合成するときに基質としてヌクレオチド誘導体を
利用すれば、核酸の誘導体の合成が可能なことは公知で
ある。このようなヌクレオチド誘導体には、ラジオアイ
ソトープで標識したヌクレオチドや、ビオチンやジゴキ
シンのような結合性リガンドで標識したヌクレオチド誘
導体などが用いられる。これらのヌクレオチド誘導体を
用いることにより、生成物である核酸誘導体の標識が達
成される。あるいは、蛍光性のヌクレオチドを基質とし
て用いることによって、生成物である核酸を蛍光性の誘
導体とすることができる。更にこの生成物は、DNA であ
ることもできるし、RNA とすることもできる。いずれを
生成するかは、プライマーの構造、重合のための基質の
種類、そして核酸の重合を行う重合化試薬との組み合わ
せによって決定される。 上記の構造を持った核酸の合成は、鎖置換活性を持っ
たDNA ポリメラーゼと、3'末端に同一鎖上の一部Ｆ１ｃ
にアニールすることができる領域Ｆ１を備え、この領域
Ｆ１が同一鎖上のＦ１ｃにアニールすることによって、
塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成する
ことができる核酸によって開始することができる。ヘア
ピンループを形成させて自身を鋳型(template)とする相
補鎖合成反応の報告は多いが、本発明においてはヘアピ
ンループ部分に塩基対結合を可能とする領域を備えてお
り、この領域を相補鎖合成に利用している点において新
規である。この領域を合成起点とすることにより、先に
自身を鋳型として合成された相補鎖が置換される。そし
て置換された鎖の3'側に存在する領域Ｒ１ｃ（任意の領
域）が塩基対結合可能な状態となる。このＲ１ｃに相補
的な塩基配列を持つ領域がアニールして相補鎖合成を行
われ、結果としてＦ１からＲ１ｃにいたる塩基配列とそ
の相補鎖とがループ形成配列を介して交互に結合した核
酸（２分子）が生成する。本発明において、たとえば前
記Ｒ１ｃのように任意に選択される領域は、その領域に
相補的な塩基配列を持つポリヌクレオチドをアニールす
ることができ、そしてそのポリヌクレオチドを合成起点
として合成される相補鎖が本発明に必要な機能を備えて
いる限り、任意の領域から選択することができる。 更に本発明では、核酸という用語を用いる。本発明に
おいて核酸とは、一般的にはDNAとRNAの双方を含む。し
かしながら、構成ヌクレオチドが人工的な誘導体に置換
されているものや、あるいは天然のDNAやRNAが修飾され
たものであっても、相補鎖合成のための鋳型として機能
する限り、本発明の核酸に含まれる。本発明の核酸は、
一般に生物学的な試料に含まれる。生物学的試料とは、
動物、植物、あるいは微生物の組織、細胞、培養物、排
泄物あるいはそれらの排出物を示すことができる。本発
明の生物学的試料には、ウイルスやマイコプラズマのよ
うな細胞内寄生体のゲノムDNA、あるいはRNAが含まれ
る。また本発明の核酸は、前記生物学的試料に含まれる
核酸から誘導されたものであってもよい。たとえば、mR
NAをもとに合成されたcDNAや、生物学的試料に由来する
核酸をもとに増幅された核酸は、本発明における核酸の
代表的なものである。 本発明の特徴となっている、3'末端に同一鎖上の一部
Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を備え、こ
の領域Ｆ１が同一鎖上のＦ１ｃにアニールすることによ
って、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形
成することができる核酸は、様々な方法によって得るこ
とができる。もっとも望ましい態様においては、次の構
造を持ったオリゴヌクレオチドを利用した相補鎖合成反
応に基づいてその構造を与えることができる。 すなわち本発明において有用なオリゴヌクレオチドと
は、少なくとも以下の２つの領域Ｘ２およびＸ１ｃとで
構成され、Ｘ２の5'側にＸ１ｃが連結されたオリゴヌク
レオチドからなる。 Ｘ２：特定の塩基配列を持つ核酸の領域Ｘ２ｃに相補的
な塩基配列を持つ領域 Ｘ１ｃ:特定の塩基配列を持つ核酸における領域Ｘ２ｃ
の5'側に位置する領域Ｘ１ｃと実質的に同じ塩基配列を
持つ領域 ここで、本発明のオリゴヌクレオチドの構造を決定す
る特定の塩基配列を持つ核酸とは、本発明のオリゴヌク
レオチドをプライマーとして利用するときに、その鋳型
となる核酸を意味する。本発明の合成方法に基づいて核
酸の検出を行う場合には、特定の塩基配列を持つ核酸と
は、検出対象、あるいは検出対象から誘導された核酸で
ある。特定の塩基配列を持つ核酸は、少なくともその一
部の塩基配列が明らかとなっている、あるいは推測が可
能な状態にある核酸を意味する。塩基配列を明らかにす
べき部分とは、前記領域Ｘ２ｃおよびその5'側に位置す
る領域Ｘ１ｃである。この２つの領域は、連続する場
合、そして離れて存在する場合とを想定することができ
る。両者の相対的な位置関係により、生成物である核酸
が自己アニールしたときに形成されるループ部分の状態
が決定される。また、生成物である核酸が分子間のアニ
ールではなく自己アニールを優先的に行うためには、両
者の距離が不必要に離れないほうが望ましい。したがっ
て、両者の位置関係は、通常0-500 塩基分の距離を介し
て連続するようにするのが望ましい。ただし、後に述べ
る自己アニールによるループの形成において、両者があ
まりにも接近している場合には望ましい状態のループの
形成を行うには不利となるケースも予想される。ループ
においては、新たなオリゴヌクレオチドのアニールと、
それを合成起点とする鎖置換を伴う相補鎖合成反応がス
ムーズに開始できる構造が求められる。したがってより
望ましくは、領域Ｘ２ｃおよびその5'側に位置する領域
Ｘ１ｃとの距離が、０〜１００塩基、さらに望ましくは
１０〜７０塩基となるように設計する。なおこの数値は
Ｘ１ｃとＸ２を含まない長さを示している。ループ部分
を構成する塩基数は、更にＸ２に相当する領域を加えた
長さとなる。 なお本発明に基づくオリゴヌクレオチドを構成する塩
基配列の特徴付けのために用いられる同一、あるいは相
補的という用語は、いずれも完全に同一、あるいは完全
に相補的であることを意味しない。すなわち、ある配列
と同一とは、ある配列に対してアニールすることができ
る塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができ
る。他方、相補的とは、ストリンジェントな条件下でア
ニールすることができ、相補鎖合成の起点となる3'末端
を提供することができる配列を意味する。 上記特定の塩基配列を持つ核酸に対して本発明による
オリゴヌクレオチドを構成する領域Ｘ２およびＸ１ｃ
は、通常は重複することなく連続して配置される。ある
いはもしも両者の塩基配列に共通の部分があるのであれ
ば、部分的に両者を重ねて配置することもできる。Ｘ２
はプライマーとして機能する必要があることから、常に
3'末端となるようにしなければならない。一方Ｘ１ｃ
は、後に述べるように、これを鋳型として合成された相
補鎖の3'末端にプライマーとしての機能を与える必要が
あることから、5'末端に配置する。このオリゴヌクレオ
チドを合成起点として得られる相補鎖は、次のステップ
においては逆向きからの相補鎖合成の鋳型となり、最終
的には本発明によるオリゴヌクレオチド部分も鋳型とし
て相補鎖に写し取られる。写し取られることによって生
じる3'末端は塩基配列Ｘ１を備えており、同一鎖上のＸ
１ｃにアニールするとともに、ループを形成する。 本発明においてオリゴヌクレオチドとは、相補的な塩
基対結合を形成できること、そしてその3'末端において
相補鎖合成の起点となる-OH 基を与えること、の２つの
条件を満たすものを意味する。したがって、そのバック
ボーンは必ずしもホスホジエステル結合によるものに限
定されない。たとえばＰではなくＳをバックボーンとし
たホスホチオエート体やペプチド結合に基づくペプチド
核酸からなるものであることもできる。また、塩基は、
相補的な塩基対結合を可能とするものであれば良い。天
然の状態では、一般にはACTGおよびＵの５種類となる
が、たとえばブロモデオキシウリジン(bromodeoxyuridi
ne)といった類似体であることもできる。本発明に用い
るオリゴヌクレオチドは、合成の起点となるのみなら
ず、相補鎖合成の鋳型としても機能するものであること
が望ましい。なお、本発明においてはオリゴヌクレオチ
ドを含む用語としてポリヌクレオチドを用いる。用語ポ
リヌクレオチドは、その鎖長を制限しない場合に用い、
オリゴヌクレオチドは比較的短い鎖長のヌクレオチド重
合体を意味する用語として用いられる。 本発明によるオリゴヌクレオチドは、以下に述べる各
種の核酸合成反応において、与えられた環境の下で必要
な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うこ
とができる程度の鎖長を持つ。具体的には、5-200 塩
基、より望ましくは10-50 塩基対とする。配列依存的な
核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識する
プライマーの鎖長が、最低５塩基前後であることから、
アニールする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。
加えて、塩基配列としての特異性を期待するためには、
確率的に10 塩基以上の長さを利用するのが望ましい。
一方、あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製
することが困難となることから、前記のような鎖長が望
ましい範囲として例示される。なお、ここで例示した鎖
長はあくまでも相補鎖とアニールする部分の鎖長であ
る。後に述べるように、本発明によるオリゴヌクレオチ
ドは最終的には少なくとも２つの領域に個別にアニール
することができる。したがって、ここに例示する鎖長
は、オリゴヌクレオチドを構成する各領域の鎖長と理解
するべきである。 更に、本発明によるオリゴヌクレオチドは、公知の標
識物質によって標識することができる。標識物質として
は、ジゴキシンやビオチンのような結合性リガンド、酵
素、蛍光物質や発光物質、あるいは放射性同位元素など
を示すことができる。あるいは、オリゴヌクレオチドを
構成する塩基を蛍光性のアナログに置換する技術(WO95/
05391,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,6644-6648,1994)も
公知である。 この他本発明によるオリゴヌクレオチドは、それ自身
を固相に結合させておくこともできる。あるいは、オリ
ゴヌクレオチドの任意の部分にビオチンのような結合性
のリガンドで標識しておき、これを固相化アビジンのよ
うな結合パートナーによって間接的に固相化することも
できる。固相化オリゴヌクレオチドを合成開始点とする
場合には、核酸の合成反応生成物が固相に捕捉されるこ
とから、分離が容易となる。分離された生成物に対し
て、核酸特異的な指示薬や、あるいは更に標識プローブ
をハイブリダイズさせることによって、検出を行うこと
もできる。あるいは、任意の制限酵素で消化することに
よって、目的とする核酸の断片を回収することもでき
る。 本発明において用いられる鋳型という用語は、相補鎖
合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な
塩基配列を持つ相補鎖は、鋳型に対応する鎖としての意
味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過
ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び
鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳
型になることができる。 本発明に有用なオリゴヌクレオチドは前記２つの領域
のみならず、更に付加的な領域を含むことができる。Ｘ
２とＸ１ｃとがそれぞれ3'末端と5'末端に配置される一
方、両者の間に任意の配列を介在させることが可能であ
る。それは、たとえば制限酵素認識配列、RNA ポリメラ
ーゼが認識するプロモーター、あるいはリボザイムをコ
ードするDNA 等であることができる。制限酵素認識配列
とすることにより、本発明の合成産物である１本鎖上に
相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を同じ長さを
持った２本鎖核酸に切りそろえることができるようにな
る。RNA ポリメラーゼが認識するプロモーター配列を配
置すれば、本発明の合成生成物を鋳型として更にRNA へ
の転写が行われる。このときに、更にリボザイムをコー
ドするDNA を配置すれば、転写生成物を自身で切断する
系が実現する。なお、これらの付随的な塩基配列はいず
れも２本鎖となった場合に機能するものである。したが
って、本発明による１本鎖の核酸がループを形成してい
るときには、これらの配列は機能しない。核酸の伸長が
進み、ループを含まない状態で相補的な塩基配列を持つ
鎖とアニールした状態になったときにはじめて機能す
る。 本発明に基づくオリゴヌクレオチドに対して、合成さ
れた領域の転写を可能とする方向でプロモーターを組み
合わせた場合、同じ塩基配列を繰り返す本発明に基づく
反応生成物は、高度に効率的な転写系を実現する。これ
を適当な発現系と組み合わせることによって、タンパク
質への翻訳も可能である。すなわち、細菌や動物細胞内
で、あるいはin vitro での転写とタンパク質への翻訳
に利用することができる。 上記のような構造の本発明によるオリゴヌクレオチド
は、化学的に合成することができる。あるいは天然の核
酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配
列で構成されるように改変する、あるいは連結すること
も可能である。 本発明による核酸の合成方法において有用な上記オリ
ゴヌクレオチドを利用し、鎖置換活性を持ったDNA ポリ
メラーゼと組み合わせて合成を行う反応について、基本
的な原理を図５−６を参考にしながら以下に説明する。
上記オリゴヌクレオチド（図５におけるＦＡ）は、まず
Ｘ２（Ｆ２に相当）が鋳型となる核酸にアニールし相補
鎖合成の起点となる。図５においてはＦＡを起点として
合成された相補鎖がアウタープライマー（Ｆ３）からの
相補鎖合成（後述）によって置換され、１本鎖（図５−
Ａ）となっている。得られた相補鎖に対して更に相補鎖
合成を行うと、このとき図５−Ａの相補鎖として合成さ
れる核酸の3'末端部分は、本発明によるオリゴヌクレオ
チドに相補的な塩基配列を持つ。つまり、本発明のオリ
ゴヌクレオチドは、その5'末端部分に領域Ｘ１ｃ（Ｆ１
ｃに相当）と同じ配列を持つことから、このとき合成さ
れる核酸の3' 末端部分はその相補配列Ｘ１ (Ｆ１)を持
つことになる。図５は、Ｒ１を起点として合成された相
補鎖がアウタープライマーＲ３を起点とする相補鎖合成
によって置換される様子を示している。置換によって3'
末端部分が塩基対結合が可能な状態となると、3'末端
のＸ１ (Ｆ１)は、同一鎖上のＸ１ｃ（Ｆ１ｃ）にアニ
ールし、自己を鋳型とした伸長反応が進む (図５−
Ｂ)。そしてその3' 側に位置するＸ２ｃ（Ｆ２ｃ）を塩
基対結合を伴わないループとして残す。このループには
本発明によるオリゴヌクレオチドのＸ２（Ｆ２）がアニ
ールし、これを合成起点とする相補鎖合成が行われる
(図５−Ｂ)。このとき、先に合成された自身を鋳型とす
る相補鎖合成反応の生成物が、鎖置換反応によって置換
され塩基対結合が可能な状態となる。 本発明によるオリゴヌクレオチドを１種類、そしてこ
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相
補鎖を鋳型として核酸合成を行うことが可能な任意のリ
バースプライマーを用いた基本的な構成によって、図６
に示すような複数の核酸合成生成物を得ることができ
る。図６からわかるとおり、(D)が本発明において合成
の目的となっている１本鎖上に相補的な塩基配列が交互
に連結された核酸である。他方の生成物(E)は、加熱変
性などの処理によって１本鎖とすれば再び(D)を生成す
るための鋳型となる。また２本鎖状態にある核酸である
生成物(D)は、もしも加熱変性などによって１本鎖にさ
れた場合、もとの２本鎖とはならずに高い確率で同一鎖
内部でのアニールが起きる。なぜならば、同じ融解温度
(Tm)を持つ相補配列ならば、分子間(intermolecular)反
応よりも分子内(intramolecular)反応のほうがはるかに
優先的に進むためである。同一鎖上でアニールした生成
物(D)に由来する１本鎖は、それぞれが同一鎖内でアニ
ールして(B)の状態に戻るので、更にそれぞれが１分子
づつの(D)と(E)を与える。これらの工程を繰り返すこと
によって、１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結さ
れた核酸を次々に合成していくことが可能である。１サ
イクルで生成される鋳型と生成物が指数的に増てえいく
ので、たいへん効率的な反応となる。 ところで図５−(A)の状態を実現するためには、はじ
めに合成された相補鎖を少なくともリバースプライマー
がアニールする部分において塩基対結合が可能な状態に
しなければならない。このステップは任意の方法によっ
て達成することができる。すなわち、最初の鋳型に対し
て本発明のオリゴヌクレオチドがアニールする領域Ｆ２
ｃよりも更に鋳型上で3' 側の領域Ｆ３ｃにアニールす
るアウタープライマー（Ｆ３）を別に用意する。このア
ウタープライマーを合成起点として鎖置換型の相補鎖合
成を触媒するポリメラーゼによって相補鎖合成を行え
ば、本発明の前記Ｆ２ｃを合成開始点として合成された
相補鎖は置換され、やがてＲ１がアニールすべき領域Ｒ
１ｃを塩基対結合が可能な状態とする(図５)。鎖置換反
応を利用することによって、ここまでの反応を等温条件
下で進行させることができる。 アウタープライマーを利用する場合には、Ｆ２ｃから
の合成よりも後にアウタープライマー（Ｆ３）からの合
成が開始される必要がある。最も単純な方法はインナー
プライマーの温度をアウタープライマーの濃度よりも高
くすることである。具体的には、通常２〜５０倍、望ま
しくは４〜１０倍の濃度差でプライマーを用いることに
より、期待どおりの反応を行わせることができる。また
アウタープライマーの融解温度(Tm)をインナープライマ
ーのＸ１（Ｆ１やＲ１に相当）領域のTmより低くなるよ
うに設定することによって合成のタイミングをコントロ
ールすることもできる。すなわち、(アウタープライマ
ーＦ３：Ｆ３ｃ) ≦ (Ｆ２ｃ／Ｆ２) ≦ (Ｆ１ｃ／Ｆ
１)、あるいは（アウタープライマー／鋳型における3'
側の領域）≦（Ｘ２ｃ：Ｘ２）≦（Ｘ１ｃ：Ｘ１）であ
る。なおここで（Ｆ２ｃ／Ｆ２）≦（Ｆ１ｃ／Ｆ１）と
したのは、Ｆ２がループ部分にアニールするよりも先に
Ｆ１ｃ／Ｆ１間のアニールを行わせるためである。Ｆ１
ｃ／Ｆ１間のアニールは分子内の反応なので優先的に進
む可能性が高い。しかしより望ましい反応条件を与える
ためにTmを考慮することには意義がある。同様の条件
は、リバースプライマーの設計においても考慮すべきで
あることは言うまでもない。このような関係とすること
により、確率的に理想的な反応条件を達成することがで
きる。融解温度(Tm)は、他の条件が一定であればアニー
ルする相補鎖の長さと塩基対結合を構成する塩基の組み
合わせによって理論的に算出することができる。したが
って当業者は、本明細書の開示に基づいて望ましい条件
を容易に導くことができる。 更にアウタープライマーのアニールのタイミングを調
整するために、コンティギュアス スタッキング(conti
guous stacking)と呼ばれる現象を応用することもでき
る。コンティギュアス スタッキングとは、単独ではア
ニールすることができないオリゴヌクレオチドが２本鎖
部分に隣接することによってアニールが可能となる現象
である(Chiara Borghesi-Nicoletti et.al. Bio Techni
ques 12, 474-477(1992)。つまり、アウタープライマー
をＦ２ｃ（Ｘ２ｃ）に隣接させ、単独ではアニールでき
ないように設計しておくのである。こうすれば、Ｆ２ｃ
(Ｘ２ｃ)がアニールしたときに初めてアウタープライマ
ーのアニールが可能となるので、必然的にＦ２ｃ（Ｘ２
ｃ）のアニールが優先されることになる。この原理に基
づいて、一連の反応にプライマーとして必要なオリゴヌ
クレオチドの塩基配列を設定した例が実施例に記載され
ている。なお、この工程は加温による変性や、DNAヘリ
カーゼによって達成することもできる。 Ｆ２ｃ（Ｘ２ｃ）を持つ鋳型核酸がRNA の場合には、
異なる方法により図５−(A)の状態を実現することもで
きる。たとえば、このRNA 鎖を分解してしまえば、Ｒ１
は塩基対結合が可能な状態となる。すなわち、Ｆ２をRN
A のＦ２ｃにアニールさせ、逆転写酵素によってDNA と
して相補鎖合成を行う。次いで鋳型となったRNAをアル
カリ変性やDNA/RNA２本鎖のRNAに作用するリボヌクレア
ーゼによる酵素処理によって分解すれば、Ｆ２から合成
したDNA は１本鎖となる。DNA/RNA２本鎖のRNA を選択
的に分解する酵素には、RNaseH や、一部の逆転写酵素
が備えているリボヌクレアーゼ活性を利用することがで
きる。こうして塩基対結合を可能としたＲ１ｃにリバー
スプライマーをアニールさせることができる。したがっ
てＲ１ｃを塩基結合可能な状態とするためのアウタープ
ライマーが不要となる。 あるいは逆転写酵素が備えている鎖置換活性を利用し
て、先に述べたアウタープライマーによる鎖置換を行う
こともできる。この場合は逆転写酵素のみで反応系を構
成することができる。すなわち、RNA を鋳型として、そ
のＦ２ｃにアニールするＦ２からの相補鎖合成、更にそ
の3'側に位置するＦ３ｃにアニールするアウタープライ
マーＦ３を合成起点とする相補鎖合成と置換とが、逆転
写酵素で可能となる。逆転写酵素がDNA を鋳型とする相
補鎖合成反応を行うものであれば、置換された相補鎖を
鋳型としてそのＲ１ｃにアニールするＲ１を合成起点と
する相補鎖合成、そして3'側に位置するＲ３ｃにアニー
ルするＲ３を合成起点とする相補鎖合成と置換反応をも
含めてすべての相補鎖合成反応が逆転写酵素によって進
行する。あるいは、与えられた反応条件の下で逆転写酵
素にDNA/DNA 鎖の置換活性が期待できないときには、先
に述べた鎖置換活性を持ったDNA ポリメラーゼを組み合
わせて用いても良い。以上のように、RNA を鋳型として
第１の１本鎖核酸を得るという態様は、本発明における
望ましい態様を構成する。逆に、鎖置換活性を有し、逆
転写酵素活性を併せ持つBca DNA ポリメラーゼのような
DNA ポリメラーゼを利用しても、同様にRNA からの第１
の１本鎖核酸の合成のみならず、以降のDNA を鋳型とす
る反応も同一の酵素によって行うことができる。 さて、以上のような反応系は前記リバースプライマー
として特定の構造を持つものを利用することによって、
本発明に固有の様々なバリエーションをもたらす。もっ
とも効果的なバリエーションについて以下に述べる。す
なわち、本発明のもっとも有利な態様においては、前記
リバースプライマーとして、〔５〕に述べたような構成
からなるオリゴヌクレオチドを用いるのである。〔５〕
のオリゴヌクレオチドとは、すなわちＦ２をプライマー
として合成される相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃをＸ
２ｃとし、Ｒ１ｃをＸ１ｃとするオリゴヌクレオチドで
ある。このようなリバースプライマーの利用により、ル
ープの形成とこのループ部分からの相補鎖合成と置換と
いう一連の反応が、センス鎖とアンチセンス鎖（フォー
ワード側とリバース側）の両方で起きるようになる。そ
の結果、本発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が交
互に連結された核酸の合成方法の合成効率が飛躍的に向
上すると共に、一連の反応を等温で実施可能とするもの
である。以下に、この態様をまとめた図１−図３に基づ
き、具体的に説明する。 以下の態様においては、本発明に基づくオリゴヌクレ
オチドとして２種類を用意する。これを説明のためにＦ
ＡとＲＡと名づける。ＦＡとＲＡを構成する領域は、以
下のとおりである。 Ｘ２ Ｘ１ｃ ＦＡ Ｆ２ Ｆ１ｃ ＲＡ Ｒ２ Ｒ１ｃ ここで、Ｆ２は鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃに相補的
な塩基配列である。またＲ２はＦ２をプライマーとして
合成される相補鎖に含まれる任意の領域Ｒ２ｃに相補的
な塩基配列である。Ｆ１ｃとＲ１ｃはそれぞれ、Ｆ２ｃ
およびＲ２ｃのそれぞれ下流に位置する任意の塩基配列
である。ここでＦ２−Ｒ２間の距離は任意であって良
い。相補鎖合成を行うDNA ポリメラーゼの合成能力にも
依存するが、好適な条件では1kbp 程度の長さであって
も十分に合成が可能である。より具体的には、Bst DNA
ポリメラーゼを用いた場合、F2/R2c 間で 800bp、望ま
しくは 500bp以下の長さであれば確実に合成される。温
度サイクルを伴うPCR では、温度変化ストレスによる酵
素活性の低下が長い塩基配列の合成効率を下げるとされ
ている。本発明における望ましい態様では、核酸増幅工
程における温度サイクルが不要となるので、長い塩基配
列であっても合成、ならびに増幅を確実に達成すること
ができる。 まず鋳型となる核酸に対してＦＡのＦ２をアニールさ
せ、これを合成起点として相補鎖合成を行う。以下、図
１の(4)にいたるまでは先に説明した本発明の基本的な
態様(図５) と同様の反応工程となっている。図１の(2)
でＦ３としてアニールしている配列は、先に説明したア
ウタープライマーである。このプライマーを合成起点と
して鎖置換型の相補鎖合成を行うDNA ポリメラーゼで行
うことにより、ＦＡから合成した相補鎖は置換され、塩
基対結合が可能な状態となる。 (4)でＲ２ｃが塩基対結合が可能な状態となったとこ
ろで、リバースプライマーとしてのＲＡがＲ２ｃ／Ｒ２
の組み合わせでアニールする。これを合成起点とする相
補鎖合成は、ＦＡの5'側末端であるＦ１ｃに至る部分ま
で行われる。この相補鎖合成反応に続いて、やはり置換
用のアウタープライマーＲ３がアニールし、鎖置換を伴
って相補鎖合成を行うことにより、ＲＡを合成起点とし
て合成された相補鎖が置換される。このとき置換される
相補鎖は、ＲＡを5'側に持ちＦＡに相補的な配列が3'末
端に位置する。 さて、こうして置換された１本鎖核酸の3'側には、同
一鎖上のＦ１ｃに相補的な配列Ｆ１が存在する。Ｆ１
は、同一分子内に並ぶＦ１ｃに速やかにアニールし、相
補鎖合成が始まる。3'末端（Ｆ１）が同一鎖上のＦ１ｃ
にアニールするときに、Ｆ２ｃを含むループが形成され
ている。このループ部分は塩基対結合が可能な状態で維
持されていることは、図２-(7)からも明らかである。Ｆ
２ｃに相補的な塩基配列を持つ本発明のオリゴヌクレオ
チドＦＡは、このループ部分にアニールして相補鎖合成
の起点となる(7)。ループ部分からの相補鎖合成は、先
に開始したＦ１からの相補鎖合成の反応生成物を置換し
ながら進む。その結果、自身を鋳型として合成された相
補鎖は、再び3'末端において塩基対結合が可能な状態と
なる。この3'末端は、同一鎖上のＲ１ｃにアニールしう
る領域Ｒ１を3'末端に備えており、やはり同一分子内の
速やかな反応により両者は優先的にアニールする。こう
して、先に説明したＦＡを鋳型として合成された3'末端
からの反応と同様の反応が、この領域でも進行する。結
果として、本発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が
交互に連結された核酸は次々と相補鎖合成と置換とを継
続し、その3' 末端Ｒ１を起点とする伸長を続けること
になる。3'末端Ｒ１の同一鎖へのアニールによって形成
されるループには常にＲ２ｃが含まれることから、以降
の反応で3'末端のループ部分にアニールするのは常にＲ
２を備えたオリゴヌクレオチド（すなわちＲＡ）とな
る。 一方、自分自身を鋳型として伸長を継続する１本鎖の
核酸に対して、そのループ部分にアニールするオリゴヌ
クレオチドを合成起点として相補鎖合成される核酸に注
目すると、ここでも本発明による１本鎖上に相補的な塩
基配列が交互に連結された核酸の合成が進行している。
すなわち、ループ部分からの相補鎖合成は、たとえば図
２−(7)においては、ＲＡに達した時点で完了する。そ
して、この核酸の合成によって置換された核酸が相補鎖
合成を開始（図３−(8)）すると、やがてその反応はか
つて合成起点であったループ部分に達して再び置換が始
まる。こうしてループ部分から合成を開始した核酸も置
換され、その結果同一鎖上にアニールすることができる
3' 末端Ｒ１を得る（図３−(10)）。この3' 末端Ｒ１は
同一鎖のＲ１ｃにアニールして相補鎖合成を開始する。
さて、この反応のＦとＲを読みかえれば、図２−(7)で
起きている反応と同じである。したがって図３−(10)に
示す構造は、自身の伸長と新たな核酸の生成を継続する
新しい核酸として機能することができる。 なお図３−(10)に示す核酸から開始する核酸の合成反
応は、ここまで述べてきたものとは逆に常に3' 末端Ｆ
１を合成起点とする伸長となる。すなわち本発明におい
ては、１つの核酸の伸長に伴って、これとは別に伸長を
開始する新たな核酸を供給しつづける反応が進行する。
更に鎖が伸長するのに従い、末端のみならず、同一鎖上
に複数のループ形成配列がもたらされる。これらのルー
プ形成配列は、鎖置換合成反応により塩基対形成可能な
状態となると、オリゴヌクレオチドがアニールし、新た
な核酸の生成反応の基点となる。末端のみならず鎖の途
中からの合成反応も組み合わされることにより、さらに
効率のよい増幅反応が達成されるのである。以上のよう
にリバースプライマーとして本発明に基づくオリゴヌク
レオチドＲＡを組み合わせることによって、伸長とそれ
に伴う新たな核酸の生成が起きる。更に本発明において
は、この新たに生成した核酸自身が伸長し、それに付随
する更に新たな核酸の生成をもたらす。一連の反応は、
理論的には永久に継続し、きわめて効率的な核酸の増幅
を達成することができる。しかも本発明の反応は、等温
条件のもとで行うことができる。 このとき蓄積する反応生成物は、Ｆ１−Ｒ１間の塩基
配列とその相補配列が交互に連結された構造を持つ。た
だし繰り返し単位となっている配列の両端には、Ｆ２−
Ｆ１ (Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ)、またはＲ２−Ｒ１（Ｒ２ｃ−
Ｒ１ｃ）の塩基配列で構成される領域が連続している。
たとえば図３−(9)では、5'側から（Ｒ２−Ｆ２ｃ）−
（Ｆ１−Ｒ２ｃ）−（Ｒ１−Ｆ１ｃ）−（Ｆ２−Ｒ２
ｃ）という順序で連結された状態となる。これは、本発
明に基づく増幅反応が、オリゴヌクレオチドを合成起点
としてＦ２（またはＲ２）から開始し、続いて自身の3'
末端を合成起点とするＦ１（またはＲ１）からの相補
鎖合成反応によって伸長するという原理のもとに進行し
ているためである。 さて、ここでは最も望ましい態様としてループ部分に
アニールするオリゴヌクレオチドに本発明によるオリゴ
ヌクレオチドＦＡ、およびＲＡを用いた。しかし本発明
による核酸の増幅反応は、これらの限られた構造を持っ
たオリゴヌクレオチドのみならず、ループからの相補鎖
合成を開始できるオリゴヌクレオチドを利用しさえすれ
ば実施することができる。つまり、伸長を続ける3'末端
はループからの相補鎖合成によって置換されさえすれ
ば、再びループ部分を与える。ループ部分から開始する
相補鎖合成は、常に１本鎖上に相補的な塩基配列が交互
に連結された核酸を鋳型としていることから、本発明で
目的としている核酸の合成が可能なことは自明である。
ただし、ここで合成される核酸は、置換後にループを形
成して相補鎖合成は行うものの、以降のループを形成す
るための3'末端を持たないため、新たな鋳型としては機
能できなくなる。したがって、ＦＡ、あるいはＲＡによ
って合成を開始した核酸と違って指数的な増幅は期待で
きない。このような理由から、ＦＡやＲＡのような構造
を持ったオリゴヌクレオチドは、本発明に基づく高度に
効率的な核酸の合成に有用なのである。 一連の反応は、鋳型となる１本鎖の核酸に対して、以
下の成分を加え、ＦＡおよびＲＡを構成する塩基配列が
相補的な塩基配列に対して安定な塩基対結合を形成する
ことができ、かつ酵素活性を維持しうる温度でインキュ
ベートするだけで進行する。 ・４種類のオリゴヌクレオチド： ＦＡ、 ＲＡ、 アウタープライマーＦ３、 およびアウタープライマーＲ３、 ・鎖置換型の相補鎖合成を行うDNA ポリメラーゼ、 ・DNA ポリメラーゼの基質となるヌクレオチド したがって、PCR のような温度サイクルは必要無い。
なおここでいう安定な塩基対結合とは、反応系に存在す
るオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が相補鎖合成の
起点を与えうる状態を意味する。安定な塩基対結合をも
たらす望ましい条件は、たとえば融解温度(Tm)以下に設
定することである。一般に融解温度(Tm)は、互いに相補
的な塩基配列を持つ核酸の 50%が塩基対結合した状態と
なる温度とされている。融解温度(Tm)以下に設定するこ
とは本発明の必須の条件ではないが、高度な合成効率を
達成するためには考慮すべき反応条件の一つである。鋳
型とすべき核酸が２本鎖である場合には、少なくともオ
リゴヌクレオチドがアニールする領域を塩基対結合が可
能な状態とする必要がある。そのためには一般に加熱変
性が行われるが、これは反応開始前の前処理として１度
だけ行えば良い。 この反応は、酵素反応に好適なpH を与える緩衝剤、
酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、
酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度(Tm)の調整
剤等の共存下で行う。緩衝剤としては、Tris-HCl 等の
中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられ
る。pH は使用するDNA ポリメラーゼに応じて調整す
る。塩類としては KCl、NaCl、あるいは(NH4)2SO4等
が、酵素の活性維持と核酸の融解温度(Tm)調整のために
適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アル
ブミンや糖類が利用される。更に融解温度(Tm)の調整剤
には、ジメチルスルホキシド(DMSO)やホルムアミドが一
般に利用される。融解温度(Tm)の調整剤を利用すること
によって、前記オリゴヌクレオチドのアニールを限られ
た温度条件の下で調整することができる。更にベタイン
(N,N,N,-trimethylglycine)やテトラアルキルアンモニ
ウム塩は、そのisostabilize 作用によって鎖置換効率
の向上にも有効である。ベタインは、反応液中 0.2〜3.
0Ｍ、好ましくは 0.5〜1.5 M 程度の添加により、本発
明の核酸増幅反応の促進作用を期待できる。これらの融
解温度の調整剤は、融解温度を下げる方向に作用するの
で、塩濃度や反応温度等のその他の反応条件を考慮し
て、適切なストリンジェンシーと反応性を与える条件を
経験的に設定する。 本発明においては、一連の反応が常に複数の領域の位
置関係を維持した状態でなければ進行しないことが重要
な特徴である。この特徴によって、非特異的な相補鎖合
成に伴う非特異的な合成反応が効果的に防止できるので
ある。すなわち、たとえ何らかの非特異的な反応が起き
たとしても、その生成物が以降の増幅工程に対して出発
材料となる可能性を低く押さえることにつながるのであ
る。またより多くの領域によって反応の進行が制御され
ているということは、類似した塩基配列の厳密な識別を
可能とする検出系を自由に構成できる可能性をもたら
す。 この特徴を遺伝子変異の検出に利用することができ
る。本発明におけるアウタープライマーを用いる態様に
おいては、このアウタープライマー２種、本発明のオリ
ゴヌクレオチドからなるプライマー２種の合計４種のプ
ライマーが用いられている。すなわち４種のオリゴヌク
レオチドに含まれる６領域が設計通りに働かなければ本
発明の合成反応は進行しない。特に、相補鎖合成の起点
となる各オリゴヌクレオチドの3'末端、および相補配列
が合成起点となるＸ１ｃ領域の5'末端の配列は重要であ
る。そこで、この重要な配列を検出すべき変異に対応す
るように設計すれば、本発明による合成反応生成物を観
察することによって、塩基の欠失や挿入といった変異の
有無、あるいはSNPs のような遺伝子多型を総合的に分
析することができる。より具体的には、変異や多型が予
想される塩基が、相補鎖合成の起点となるオリゴヌクレ
オチドの3'末端付近（相補鎖が起点となる場合には5'末
端付近）に相当するように設計するのである。相補鎖の
合成起点となる3'末端や、その付近にミスマッチが存在
すると核酸の相補鎖合成反応は著しく阻害される。本発
明においては、反応初期の生成物における末端構造が繰
り返し反応を行わなければ高度な増幅反応に結びつかな
い。したがって、たとえ誤った合成が行われたとして
も、増幅反応を構成する相補鎖合成がいずれかの段階で
常に妨げられるのでミスマッチを含んだままでは高度な
増幅は起きない。結果的にミスマッチが増幅反応を効果
的に抑制し、最終的には正確な結果をもたらすことにな
る。つまり本発明に基づく核酸の増幅反応は、より完成
度の高い塩基配列のチェック機構を備えていると言うこ
とができる。これらの特徴は、たとえば単純に２つの領
域で増幅反応を行っているPCR 法などでは期待しにくい
利点である。 更に本発明に用いるオリゴヌクレオチドを特徴付ける
領域Ｘ１ｃは、相補配列が合成されてはじめて合成起点
となり、この相補配列が、新たに合成された同一鎖内の
配列Ｘ１にアニールすることにより、自己を鋳型とする
合成反応が進行する。このため、たとえ先行技術でしば
しば重要な問題となるいわゆるプライマータイマーを生
成しても、本オリゴヌクレオチドはループを形成しな
い。したがって、プライマーダイマーに起因する非特異
的な増幅は原理的に生じ得ず、反応の特異性向上に貢献
している。 更に本発明によれば、Ｆ３（図１-(2)）やＲ３（図２
-(5)）で示したアウタープライマーを組み合わせること
によって、上記の一連の反応を等温条件下で行うことが
できる。すなわち本発明は、前記
〔９〕に示した工程を
含む１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核
酸を増幅する方法を提供するものである。この方法で
は、Ｆ２ｃ／Ｆ２間、Ｒ２ｃ／Ｒ２間、Ｆ１ｃ／Ｆ１
間、そしてＲ１ｃ／Ｒ１間で安定なアニールが起きる温
度条件が選択され、そして望ましくはＦ３ｃ／Ｆ３間、
ならびにＲ３ｃ／Ｒ３間は、それぞれＦ２ｃ／Ｆ２間、
ならびにＲ２ｃ／Ｒ２間のアニールに助けられるコンテ
ィギュアス スタッキング現象によってアニールするよ
うに設定される。 本発明においては核酸の合成(synthesis)と増幅(ampl
ification)という用語を用いる。本発明における核酸の
合成とは、合成起点となったオリゴヌクレオチドからの
核酸の伸長を意味する。合成に加えて、更に他の核酸の
生成と、この生成された核酸の伸長反応とが連続して起
きるとき、一連の反応を総合して増幅という。 さて、3'末端に同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールする
ことができる領域Ｆ１を備え、この領域Ｆ１が同一鎖上
のＦ１ｃにアニールすることによって、塩基対結合が可
能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる１
本鎖核酸は、本発明の重要な構成要素である。このよう
な１本鎖核酸は、次のような原理に基づいて供給するこ
ともできる。すなわち、予め次のような構造を持ったプ
ライマーに基づいて相補鎖合成を進めるのである。 5'- ［プライマー内に位置する領域Ｘ１ｃにアニールす
る領域Ｘ１］−［塩基対結合が可能な状態にあるループ
形成配列］−［領域Ｘ１ｃ］−［鋳型に相補的な配列を
持つ領域］-3' 鋳型に相補的な配列を持つ領域には、Ｆ１に相補的な
塩基配列（プライマーＦＡ）およびＲ１ｃに相補的な塩
基配列（プライマーＲＡ）の２種類を用意する。なお、
このとき合成すべき核酸を構成する塩基配列は、領域Ｆ
１から領域Ｒ１ｃにいたる塩基配列と、この塩基配列に
相補的な塩基配列を持つ領域Ｒ１から領域Ｆ１ｃにいた
る塩基配列とを含むものである。一方、プライマー内部
でアニールすることができるＸ１ｃとＸ１は、任意の配
列とすることができる。ただしプライマーＦＡとＲＡの
間では、領域X１ｃ／X１の配列を異なるものとするのが
望ましい。 まず鋳型核酸の領域Ｆ１から前記プライマーＦＡによ
る相補鎖合成を行う。次いで合成された相補鎖の領域Ｒ
１ｃを塩基対結合が可能な状態とし、ここに一方のプラ
イマーをアニールさせて相補鎖合成の起点とする。この
とき合成される相補鎖の3'末端は、最初に合成された鎖
の5'末端部分を構成するプライマーＦＡに相補的な塩基
配列を持つので、3'末端には領域 X1 を持ち、これが同
一鎖上の領域 X１ｃにアニールするとともにループを形
成する。こうして、前記本発明による特徴的な3'末端構
造が提供され、以降の反応は最も望ましい態様として示
した先の反応系そのものとなる。なおこのときループ部
分にアニールするオリゴヌクレオチドは、3'末端にルー
プ内に存在する領域X２ｃに相補的な領域X２を持ち、5'
側には領域 X１を持つものとする。先の反応系ではプラ
イマーＦＡとＲＡを使って鋳型核酸に相補的な鎖を合成
することによって核酸の 3'末端にループ構造をもたら
した。この方法は、短いプライマーで効果的に本発明に
特徴的な末端構造を提供する。一方、本態様において
は、プライマーとしてはじめからループを構成する塩基
配列全体を提供しており、より長いプライマーの合成が
必要となる。 リバースプライマーに制限酵素認識領域を含む塩基配
列を利用すれば、本発明による異なった態様を構成する
ことができる。図６に基づき、リバースプライマーが制
限酵素認識配列を含む場合について具体的に説明する。
図６−(D)が完成したところで、リバースプライマー内
の制限酵素認識部位に対応する制限酵素によりニックが
生じる。このニックを合成起点として鎖置換型の相補鎖
合成反応が開始する。リバースプライマーは(D)を構成
する２本鎖核酸の両端に位置しているので、相補鎖合成
反応も両端から開始することになる。基本的には先行技
術として記載したSDA 法の原理に基づくが、鋳型となる
塩基配列が本発明によって相補的な塩基配列を交互に連
結した構造となっているので、本発明に特有の核酸合成
系が構成されるのである。なお、ニックを入れるリバー
スプライマーの相補鎖となる部分には制限酵素による２
本鎖の切断が生じないようにヌクレアーゼ耐性となるよ
うにdNTP 誘導体が取りこまれるように設計しなければ
ならない。 リバースプライマーにRNA ポリメラーゼのプロモータ
ーを挿入しておくこともできる。この場合もSDA 法を応
用した先の態様と同様に、図６−(D)の両端からこのプ
ロモーターを認識するRNA ポリメラーゼにより転写が行
われる。 本発明によって合成された核酸は、１本鎖とは言え相
補的な塩基配列から構成されるため、その大部分が塩基
対結合を形成している。この特徴を利用して、合成生成
物の検出が可能である。エチジウムブロマイド、SYBR G
reen 1、あるいはPico Green のような２本鎖特異イン
ターカレーターである蛍光色素の存在下で本発明による
核酸の合成方法を実施すれば、生成物の増加に伴って蛍
光強度の増大が観察される。これをモニターすれば、閉
鎖系でリアルタイムな合成反応の追跡が可能である。こ
の種の検出系はPCR 法への応用も考えられているが、プ
ライマーダイマー等によるシグナルの発生と区別がつか
ないことから問題が多いとされている。しかし本発明に
応用した場合には、非特異的な塩基対結合が増加する可
能性が非常に低いことから、高い感度と少ないノイズが
同時に期待できる。２本鎖特異インターカレーターと同
様に、均一系の検出系を実現する方法として、蛍光エネ
ルギー転移の利用が可能である。 本発明による核酸の合成方法を支えているのは、鎖置
換型の相補鎖合成反応を触媒するDNA ポリメラーゼであ
る。上記反応中には、必ずしも鎖置換型のポリメラーゼ
を要しない反応ステップも含まれてはいる。しかし、構
成試薬の単純化、そして経済性の点で、１種類のDNA ポ
リメラーゼを利用するのが有利である。この種のDNA ポ
リメラーゼには、以下のようなものが知られている。ま
た、これらの酵素の各種変異体についても、それが配列
依存型の相補鎖合成活性と鎖置換活性を有する限り、本
発明に利用することができる。ここで言う変異体とは、
酵素の必要とする触媒活性をもたらす構造のみを取り出
したもの、あるいはアミノ酸の変異等によって触媒活
性、安定性、あるいは耐熱性を改変したもの等を示すこ
とができる。 Bst DNA ポリメラーゼ Bca(exo-)DNA ポリメラーゼ DNA ポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント Vent DNA ポリメラーゼ Vent(Exo-)DNA ポリメラーゼ（Vent DNA ポリメラーゼ
からエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの） DeepVent DNA ポリメラーゼ DeepVent(Exo-)DNA ポリメラーゼ（DeepVent DNA ポリ
メラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの） Φ29ファージDNA ポリメラーゼ MS-2ファージDNA ポリメラーゼ Z-Taq DNA ポリメラーゼ（宝酒造） KOD DNA ポリメラーゼ（東洋紡績） これらの酵素の中でもBst DNA ポリメラーゼやBca(ex
o-)DNA ポリメラーゼは、ある程度の耐熱性を持ち、触
媒活性も高いことから特に望ましい酵素である。本発明
の反応は、望ましい態様においては等温で実施すること
ができるが、融解温度(Tm)の調整などのために必ずしも
酵素の安定性にふさわしい温度条件を利用できるとは限
らない。したがって、酵素が耐熱性であることは望まし
い条件の一つである。また、等温反応が可能とは言え、
最初の鋳型となる核酸の提供のためにも加熱変性は行わ
れる可能性があり、その点においても耐熱性酵素の利用
はアッセイプロトコールの選択の幅を広げる。 Vent(Exo-)DNAポリメラーゼは、鎖置換活性と共に高
度な耐熱性を備えた酵素である。ところでDNAポリメラ
ーゼによる鎖置換を伴う相補鎖合成反応は、１本鎖結合
タンパク質(single strand binding protein)の添加に
よって促進されることが知られている(Paul M.Lizardi
et al, Nature Genetics 19, 225-232, July,1998)。こ
の作用を本発明に応用し、１本鎖結合タンパク質を添加
することによって相補鎖合成の促進効果を期待すること
ができる。たとえばVent(Exo-)DNAポリメラーゼに対し
ては、１本鎖結合タンパク質としてT4 gene 32が有効で
ある。 なお3'-5'エクソヌクレアーゼ活性を持たないDNA ポ
リメラーゼには、相補鎖合成が鋳型の5'末端に達した部
分で停止せず、１塩基突出させた状態まで合成を進める
現象が知られている。本発明では、相補鎖合成が末端に
至ったときの3'末端の配列が次の相補鎖合成の開始につ
ながるため、このような現象は望ましくない。しかし、
DNA ポリメラーゼによる3'末端への塩基の付加は、高い
確率でＡとなる。したがって、dATP が誤って１塩基付
加しても問題とならないように、3'末端からの合成がA
で開始するように配列を選択すれば良い。また、相補鎖
合成時に3'末端がたとえ突出してしまっても、これを消
化してblunt end とする3'→5'エクソヌクレアーゼ活性
を利用することもできる。たとえば、天然型のVent DNA
ポリメラーゼはこの活性を持つことから、Vent(Exo-)DN
A ポリメラーゼと混合して利用することにより、この問
題を回避することができる。 本発明による核酸の合成方法、あるいは増幅方法に必
要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキ
ットとして供給することができる。具体的には、本発明
のために、相補鎖合成のプライマーとして、あるいは置
換用のアウタープライマーとして必要な各種のオリゴヌ
クレオチド、相補鎖合成の基質となるdNTP、鎖置換型の
相補鎖合成を行うDNA ポリメラーゼ、酵素反応に好適な
条件を与える緩衝液、更に必要に応じて合成反応生成物
の検出のために必要な試薬類で構成されるキットが提供
される。特に、本発明の望ましい態様においては、反応
途中で試薬の添加が不要なことから、１回の反応に必要
な試薬を反応容器に分注した状態で供給することによ
り、サンプルの添加のみで反応を開始できる状態とする
ことができる。発光シグナルや蛍光シグナルを利用し
て、反応生成物の検出を反応容器のままで行えるような
システムとすれば、反応後の容器の開封を全面的に廃止
することができる。これは、コンタミネーションの防止
上、たいへん望ましいことである。 さて、本発明によって合成される、１本鎖上に相補的
な塩基配列が交互に連結された核酸には、たとえば次の
ような有用性がある。第一には、相補的な塩基配列を１
分子内に備えた特殊な構造に伴う利点の活用である。こ
の特徴により、検出が容易となることが期待される。す
なわち、相補的な塩基配列との塩基対結合に伴って、シ
グナルを増減する核酸の検出系が公知である。たとえば
先に述べたような２本鎖特異インターカレーターを検出
剤として利用する方法などを組み合わせれば、本発明の
合成生成物の特徴を生かした検出系を実現することがで
きる。このような検出系において本発明の合成反応生成
物を一度熱変性して元の温度に戻すと、分子内のアニー
ルが優先的に起きるため速やかに相補的配列の間で塩基
対結合を構成する。一方、もしも非特異的反応生成物が
存在していても、それは分子内に相補的配列を持ってい
ないので熱変性により２分子以上に分離してしまい、す
ぐにはもとの二本鎖には戻れない。こうして、検出前に
加熱変性工程を追加することによって、非特異反応に伴
うノイズを軽減することができる。熱に対して耐性を持
たないDNA ポリメラーゼを使用しているときには、加熱
変性工程は反応停止の意味も持ち、反応時間の制御の点
で有利である。 第二の特徴は、塩基対結合が可能な状態にあるループ
を常に形成することである。塩基対結合が可能な状態に
あるループの構造を、図４に示した。図４からわかるよ
うに、ループはプライマーのアニールが可能な塩基配列
Ｆ２ｃ（Ｘ２ｃ）と、Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ（Ｘ１ｃ）の間に
介在する塩基配列とで構成される。Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ間
（普遍的に示せばＸ２ｃ−Ｘ１ｃ間）の配列は、鋳型に
由来する塩基配列である。したがってこの領域に対して
相補的な塩基配列を持つプローブをハイブリダイズさせ
れば、鋳型特異的な検出を行うことができる。しかも、
この領域は常に塩基対結合が可能な状態にあることか
ら、ハイブリダイズに先だって加熱変性する必要がな
い。なお本発明の増幅反応生成物におけるループを構成
する塩基配列は、任意の長さとすることができる。した
がって、プローブのハイブリダイズを目的とする場合に
は、プライマーがアニールすべき領域とプローブがハイ
ブリダイズすべき領域を別々にして両者の競合を避ける
ことにより理想的な反応条件を構成することができる。 本発明の望ましい態様によれば、１本の核酸鎖上に塩
基対結合が可能な多数のループがもたらされる。このこ
とは、核酸１分子に多数のプローブがハイブリダイズ可
能なことを意味しており、感度の高い検出を可能とす
る。また感度のみならず、たとえば凝集反応のような特
殊な反応原理に基づく核酸の検出方法を可能とするもの
でもある。たとえばポリスチレンラテックスのような微
粒子に固定したプローブを本発明による反応生成物に加
えると、プローブとのハイブリダイゼーションに伴って
ラテックス粒子の凝集が観察される。凝集の強度を光学
的に測定すれば、高感度に、しかも定量的な観察が可能
である。あるいは、凝集反応を肉眼的に観察することも
できるので、光学的な測定装置を使わない反応系を構成
することもできる。 更に、１核酸分子当たり多くの標識を結合できる本発
明の反応生成物は、クロマトグラフィックな検出をも可
能とする。イムノアッセイの分野では、肉眼的に検出可
能な標識を利用したクロマト媒体を用いた分析方法（イ
ムノクロマトグラフィー法）が実用化されている。この
方法は、クロマト媒体に固定した抗体と標識抗体でアナ
ライトをサンドイッチし、未反応の標識成分を洗い去る
原理に基づいている。本発明の反応生成物は、この原理
を核酸の分析にも応用可能とする。すなわち、ループ部
分に対する標識プローブを用意し、これをクロマト媒体
に固定化した捕捉用プローブでトラップすることによっ
てクロマト媒体中での分析が行われる。捕捉用プローブ
には、ループ部分に対する相補配列を利用することがで
きる。本発明の反応生成物は、多数のループ部分を伴っ
ていることから、多数の標識プローブを結合し、肉眼的
に認識可能なシグナルをもたらす。 ループとして常に塩基対結合が可能な領域を与える本
発明による反応生成物は、この他にもさまざまな検出系
を可能とする。たとえば、このループ部分に対するプロ
ーブを固定した表面プラズモン共鳴を利用した検出系が
可能である。また、ループ部分に対するプローブを２本
鎖特異的なインターカレーターで標識しておけば、より
高感度な蛍光分析を行うことができる。あるいは、本発
明によって合成される核酸が 3'側と 5'側の両方に塩基
対結合が可能なループを形成することを積極的に利用す
ることもできる。たとえば、一方のループを正常型と異
常型で共通の塩基配列となる部分とし、他方のループに
両者の違いが生じる領域となるように設計しておくので
ある。共通部分に対するプローブで遺伝子の存在を確認
し、他方の領域で異常の有無を確認するといった特徴的
な分析系を構成することができる。本発明による核酸の
合成反応は、等温で進めることも可能なことから、一般
的な蛍光光度計によってリアルタイムな分析が可能とな
ることも特筆すべき利点である。これまでにも同一鎖上
にアニールする核酸の構造は公知である。しかし本発明
によって得ることができる１本鎖上に相補的な塩基配列
が交互に連結された核酸は、他のオリゴヌクレオチドが
塩基対結合することができる多数のループ部分を含む点
において新規である。 一方、本発明による反応生成物によって与えられる多
数のループ部分そのものをプローブとして利用すること
も可能である。たとえば、DNAチップにおいては、限ら
れたエリアに高密度にプローブを集積する必要がある。
しかし現在の技術では、一定の面積に固定することがで
きるオリゴヌクレオチドの数は制限される。そこで本発
明の反応生成物を利用すれば、アニールが可能な多数の
プローブを高密度に固定化することができる。すなわ
ち、本発明による反応生成物をプローブとしてDNA チッ
プ上に固定すればよい。反応生成物は、増幅後に公知の
手法によって固定することもできるし、あるいは固定化
したオリゴヌクレオチドを本発明の増幅反応におけるオ
リゴヌクレオチドとして利用することにより結果的に固
定化された反応生成物とすることもできる。このように
して固定化されたプローブを用いれば、限られたエリア
中に多くの試料DNA ハイブリダイズすることができ、結
果的に高いシグナルを期待することができる。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の望ましい態様の反応原理の一部(1)-
(4)を示す模式図である。 図２は、本発明の望ましい態様の反応原理の一部(5)-
(7)を示す模式図である。 図３は、本発明の望ましい態様の反応原理の一部(8)-
(10)を示す模式図である。 図４は、本発明による１本鎖核酸が形成するループの
構造を示す模式図である。 図５は、本発明による基礎的な態様の一部(A)-(B)を
示す模式図である。 図６は、本発明による基礎的な態様の一部(C)-(D)を
示す模式図である。 図７は、M13mp18 の標的塩基配列における、オリゴヌ
クレオチドを構成する各塩基配列の位置関係を示す図で
ある。 図８は、M13mp18 を鋳型として本発明による１本鎖核
酸の合成方法によって得られた生成物のアガロース電気
泳動の結果を示す写真である。 レーン１：XIV size marker レーン２： 1 fmol M13mp18 dsDNA レーン３：targetなし 図９は、実施例１によって得られた本発明による核酸
合成反応の生成物を制限酵素で消化しアガロース電気泳
動した結果を示す写真である。 レーン１：XIV size marker レーン２：精製物の BamHI 消化物 レーン３：精製物の PvuII 消化物 レーン４：生成物の HindIII 消化物 図１０は、M13mp18 を鋳型として、ベタイン添加によ
る本発明の１本鎖核酸の合成方法によって得られた生成
物のアガロース電気泳動の結果を示す写真である。０、
0.5、１、２は反応液中に添加したベタイン濃度(M)を表
す。また、Ｎは陰性対照を、-21 は鋳型DNA の濃度10
-21mol を表す。 図１１は、HBV 由来の標的塩基配列における、オリゴ
ヌクレオチドを構成する各塩基配列の位置関係を示す図
である。 図１２は、M13mp18 組みこまれた HBV-M13mp18 を鋳
型として本発明による１本鎖核酸の合成方法によって得
られた生成物のアガロース電気泳動の結果を示す写真で
ある。 レーン１：XIV size marker レーン２： 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA レーン３：target なし 図１３は、本発明による１本鎖核酸の合成方法によっ
て得られた生成物のアルカリ変性ゲル電気泳動の結果を
示す写真である。 レーン１：ラムダファージのHindIII 消化断片 レーン２：実施例１の反応生成物 レーン３：実施例３の反応生成物 図１４は、ターゲットであるM13mp18 の濃度を変えて
ときに、本発明による１本鎖核酸の合成方法によって得
られた生成物のアガロース電気泳動の結果を示す写真で
ある。上は反応時間１時間、下は反応時間３時間の結果
である。 レーン１：M13mp18 dsDNA 1x10-15mol/tube レーン２：M13mp18 dsDNA 1x10-16mol/tube レーン３：M13mp18 dsDNA 1x10-17mol/tube レーン４：M13mp18 dsDNA 1x10-18mol/tube レーン５：M13mp18 dsDNA 1x10-19mol/tube レーン６：M13mp18 dsDNA 1x10-20mol/tube レーン７：M13mp18 dsDNA 1x10-21mol/tube レーン８：M13mp18 dsDNA 1x10-22mol/tube レーン９：target なし レーン１０：XIV size marker 図１５は、変異の位置、および標的塩基配列(target)
に対する各領域の位置関係を表す図である。下線で示し
たグアニンが、変異型ではアデニンに置換されている。 図１６は、本発明の増幅反応による生成物のアガロー
ス電気泳動の結果を示す写真である。 M: 100bp ladder (New England Biolabs) N: 鋳型なし（精製水） WT: 野生型鋳型M13mp18 1 fmol MT: 変異型鋳型M13mp18FM 1 fmol 図１７は、標的mRNA をコードする塩基配列におけ
る、オリゴヌクレオチドを構成する各塩基配列の位置関
係を示す図である。 図１８は、mRNA をターゲットとして本発明による１
本鎖核酸の合成方法によって得られた生成物のアガロー
ス電気泳動の結果を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態 実施例１ M13mp18 内の領域の増幅 M13mp18 を鋳型として、本発明による１本鎖上に相補
的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法を試み
た。実験に使用したプライマーは、M13FA、M13RA、M13F
3、そしてM13R3 の４種類である。M13F3 とM13R3 は、
それぞれM13FA とM13RA を合成起点として得られた第１
の核酸を置換するためのアウタープライマーである。ア
ウタープライマーはM13FA（あるいはM13RA）よりも後か
ら相補鎖合成の起点となるべきプライマーなので、M13F
A（あるいはM13RA）と隣接する領域にコンティギュアス
スタッキング現象を利用してアニールするように設計
した。また、M13FA（あるいはM13RA）のアニールが優先
的に起こるようにこれらのプライマー濃度を高く設定し
た。 各プライマーを構成する塩基配列は配列表に示したと
おりである。プライマーの構造的な特徴を以下にまとめ
た。また標的塩基配列(target)に対する各領域の位置関
係を図７に示した。 このようなプライマーによって、M13mp18 の領域Flc
からR1c にいたる領域とその相補的な塩基配列とが、F2
c を含むループ形成配列を挟んで１本鎖上に交互に連結
した核酸が合成される。これらのプライマーによる本発
明による核酸の合成方法のための反応液組成を以下に示
す。 反応液組成（２５μL中） 20mM Tris-HCl pH8.8 10mM KCl 10mM (NH4)2SO4 6mM MgSO4 0.1% Triton X-100 5% ジメチルスルホキシド(DMSO) 0.4mM dNTP プライマー： 800nM M13FA／配列番号：１ 800nM M13RA／配列番号：２ 200nM M13F3／配列番号：３ 200nM M13R3／配列番号：４ ターゲット：M13mp18 dsDNA ／配列番号：５ 反応：上記反応液を９５℃で５分間加熱し、ターゲッ
トを変性させて１本鎖とした。反応液を氷水上に移し、
Bst DNA ポリメラーゼ(NEW ENGLAND BioLabs)を４U 添
加し、６５℃で１時間反応させた。反応後、８０℃１０
分間で反応を停止し再び氷水上に移した。 反応の確認：上記反応液の５μL に１μL のloading
buffer を添加し、２％アガロースゲル（0.5% TBE）を
使って、１時間、80mV で電気泳動した。分子サイズマ
ーカーとして、XIV(100bp ladder, Boehringer Mannhei
m製)を使用した。泳動後のゲルをSYBR Green I (Molecu
lar Probes,Inc.)で染色して核酸を確認した。結果は図
８に示すとおりである。各レーンは次のサンプルに対応
している。 1. XIV size marker 2. 1fmol M13mp18 dsDNA 3. target なし レーン３では未反応のプライマーが染色されている以
外にバンドは認識されなかった。レーン２はターゲット
が存在する場合、低サイズのバンドのラダーと高サイズ
でのスメアな染色、およびゲル内でほとんど泳動されて
いないバンドとして生成物が確認された。低サイズのバ
ンドのうち、290bp、450bp付近のバンドは、それぞれ本
発明の合成反応により予想される産物である、配列番
号：１１および配列番号：１２が２本鎖となったもの
（図２−(7)および図２−(10)が２本鎖となったものに
相当）および配列番号：１３（図３−(9)にある長い１
本鎖に相当）とサイズが一致することから、反応が予想
されるとおりに進行していることが確認された。高サイ
ズのスメアなパターン、および泳動されていないバンド
は、本反応が基本的に連続的な反応であることから、反
応産物が一定のサイズにはならないこと、そして部分的
な１本鎖、あるいは２本鎖の複合体を形成した複雑な構
造をともなっているため、結果としてこのような泳動結
果を与えるものと考えられた。 実施例２ 反応産物の制限酵素消化確認 実施例１で得られた本発明による１本鎖上に相補的な
塩基配列が交互に連結された核酸の構造を明らかにする
ことを目的として、制限酵素による消化を行った。制限
酵素を使った消化によって理論どおりの断片を生じる一
方、実施例１で観察された高サイズのスメアなパターン
や泳動されないバンドが消滅すれば、これらがいずれも
本発明によって合成された１本鎖上に相補的な塩基配列
を交互に連結した核酸であることが推定できる。 実施例１の反応液を８本分（200μL）プールし、フェノ
ール処理後、エタノール沈でんを行って精製した。この
沈でんを回収して200μL のTE 緩衝液で再溶解し、その
10μL を制限酵素BamHI、PvuII、およびHindIII でそれ
ぞれ３７℃２時間消化した。消化物を2%アガロースゲル
（0.5% TBE）を使って、１時間、80mV で電気泳動し
た。分子サイズマーカーとして、SUPER LADDER-LOW(100
bp ladder)(GensuraLaboratories,Inc.製) を使用し
た。泳動後のゲルを SYBR Green I (MolecularProbes,I
nc.)で染色して核酸を確認した。結果は図９に示すとお
りである。各レーンは次のサンプルに対応している。 1. XIV size marker 2. 精製物のBamHI 消化物 3. 精製物のPvuII 消化物 4. 精製物のHindIII 消化物 ここで比較的鎖長の短い増幅生成物を構成している塩
基配列は、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番
号：１５、および配列番号：１６等と推定される。これ
らの塩基配列から、推測される各制限酵素消化断片のサ
イズは表１のとおりである。表中のL は、ループ（１本
鎖）を含む断片なので泳動位置が未確定であることを示
す。 未消化でのバンドのほとんどが消化後には推定される
サイズのバンドへ変化したことから、目的の反応産物が
増幅されていることが確認された。また非特異的産物は
ほとんどないことも示された。 実施例３ ベタイン添加による増幅反応の促進 増幅反応液中へのベタイン(betaine:N,N,N,-trimethy
lglycine、SIGMA)添加による、核酸の増幅反応に対する
効果を調べる実験を行った。実施例１と同様に、M13mp1
8 を鋳型とし、本発明による１本鎖上に相対的な塩基配
列が交互に連結された核酸の合成方法を、種々の濃度の
ベタイン存在下で行った。実験に使用したプライマー
は、実施例１で使用したものと同じである。鋳型DNA 量
は、10-21 mol(M13mp18)で、陰性対照として水を用い
た。添加するベタインは、0、0.5、1、2Mの濃度になる
ように反応液に加えた。反応液組成を以下に示す。 反応液組成（２５μL 中） 20mM Tris-HCl pH8.8 4mM MgSO4 0.4mM dNTPs 10mM KCl 10mM (NH4)2SO4 0.1% TritonX-100 プライマー： 800nM M13FA／配列番号：１ 800nM M13RA／配列番号：２ 200nM M13F3／配列番号：３ 200nM M13R3／配列番号：４ ターゲット：M13mp18 dsDNA ／配列番号：５ 使用したポリメラーゼ、反応条件、反応後の電気泳動
条件は、実施例１に記載したものと同じである。 結果を図１０に示す。ベタイン濃度0.5、1.0M 存在下
での反応では、増幅産物量が増大した。また2.0M まで
増やすと逆に増幅産物は確認されなかった。これによ
り、適度のベタイン存在で、増幅反応が促進されること
が示された。ベタイン濃度2M の場合に、増幅産物が低
下したことは、Tm が低下しすぎたのが原因と考えられ
た。 実施例４ HBV 遺伝子配列の増幅 HBV 遺伝子の部分配列を組み込んだM13mp18 dsDNA を
鋳型として、本発明による核酸の合成方法を試みた。実
験に使用したプライマーは、HB65FA（配列番号：６）、
HB65RA（配列番号：７）、HBF3（配列番号：８）、そし
て HBR3（配列番号：９）の４種類である。HBF3 とHBR3
は、それぞれHB65FA とHB65RA を合成起点として得ら
れた第１の核酸を置換するためのアウタープライマーで
ある。アウタープライマーはHB65FA(あるいはHB65RA)よ
りも後から相補鎖合成の起点となるべきプライマーなの
で、HB65FA（あるいはHB65RA）と隣接する領域にコンテ
ィギュアス スタッキング現象を利用してアニールする
ように設計した。また、HB65FA（あるいはHB65RA）のア
ニールが優先的に起こるようにこれらのプライマー濃度
を高く設定した。M13mp18 に組みこまれたHBV に由来す
る本実施例のターゲット配列(430bp)を配列１０に示し
た。 各プライマーを構成する塩基配列は配列表に示したと
おりである。プライマーの構造的な特徴を以下にまとめ
た。また標的塩基配列(target)に対する各領域の位置関
係を図１１に示した。 このようなプライマーによって、HBV 遺伝子の部分配列
を組み込んだM13mp18(HBV-M13mp18)の領域F1c からR1c
にいたる領域とその相補的な塩基配列とが、F2c を含む
ループ形成配列を挟んで１本鎖上で交互に連結した核酸
が合成される。上記プライマーを用いる他は実施例１と
同じ条件で反応させ、その反応液をアガロース電気泳動
により分析した。結果は図１２に示すとおりである。各
レーンは次のサンプルに対応している。 1. XIV size marker 2. 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA 3. target なし 実施例１と同様に、target が存在するときにのみ、
低サイズのバンドのラダーと高サイズでのスメアな染
色、およびゲル内でほとんど泳動されていないバンドと
して生成物が確認された（レーン２）。低サイズのバン
ドのうち、310bp、および480bp 付近のバンドはそれぞ
れ、本反応により予想される産物である。配列番号：１
７および配列番号：１８の２本鎖とサイズが一致するこ
とから、反応が予想されるとおりに進行していることが
確認された。高サイズのスメアなパターン、および泳動
されていないバンドは、実施例１の結果で述べたよう
に、本発明に特徴的な合成生成物の構造が原因となって
いるものと推定された。この実験により、増幅する配列
(target)が異なっても本発明を実施可能であることが確
認された。 実施例５ 合成反応生成物のサイズの確認 本発明に基づいて合成された核酸の構造を確認するた
めに、その長さをアルカリ変性条件下での電気泳動によ
って分析した。実施例１と実施例４のターゲット存在下
での反応液の５μL に、それぞれ１μL のalkaline loa
ding buffer を添加し、0.7％アガロースゲル(50mM NaO
H, 1mM EDTA)を使って、14時間、50mAで電気泳動した。
分子サイズマーカーとして、ラムダファージのHindIII
消化断片を使用した。泳動後のゲルを 1M Tris pH 8 で
中和後、SYBR Green I (MolecularProbes,Inc.)で染色
して核酸を確認した。結果は図１３に示す。各レーンは
以下のサンプルに対応している。 1. ラムダファージのHindIII 消化断片 2. 実施例１の反応生成物 3. 実施例４の反応生成物 反応生成物をアルカリ変性条件で泳動すると１本鎖状
態でのサイズ確認が可能である。実施例１(レーン２)、
実施例４(レーン３)ともに主な生成物は２kbase内であ
ることが確認された。また、本発明による生成物はこの
分析によって確認できる範囲で少なくとも６kbase 以上
にまで伸びていることが判明した。加えて、実施例１や
実施例４の未変性条件下で泳動されなかったバンドは、
変性状態では個々の１本鎖に分離されサイズが小さくな
ることが改めて確認された。 実施例６ M-13mp13 内の領域の増幅における、ターゲ
ット濃度依存的増幅の確認 本発明による核酸の合成方法に及ぼす、ターゲットの
濃度変化の影響を観察した。ターゲットであるM13mp18
dsDNA を０〜1 fmol とし、反応時間を１時間および３
時間とする他は、実施例１と同じ条件で本発明による核
酸の合成方法を実施した。実施例１と同様に、２％アガ
ロースゲル(0.5% TBE)で電気泳動し、SYBR GreenI(Mole
cular Probes,Inc.)染色により核酸を確認した。分子サ
イズマーカーとして、XIV(100bp ladder, Boehringer M
annheim)を使用した。結果は図１４（上：反応時間１時
間、下：反応時間３時間）に示した。各レーンは、次の
サンプルに対応する。 1. M13mp18 dsDNA 1x10-15mol/tube 2. M13mp18 dsDNA 1x10-16mol/tube 3. M13mp18 dsDNA 1x10-17mol/tube 4. M13mp18 dsDNA 1x10-18mol/tube 5. M13mp18 dsDNA 1x10-19mol/tube 6. M13mp18 dsDNA 1x10-20mol/tube 7. M13mp18 dsDNA 1x10-21mol/tube 8. M13mp18 dsDNA 1x10-22mol/tube 9. target なし 10. XIV size marker 泳動像の下部に見られる各レーンに共通のバンドは未
反応のプライマーが染色されたものである。反応時間に
かかわらず、ターゲットが存在しないときは全く増幅産
物は観察されない。ターゲット存在下でのみ、ターゲッ
トの濃度依存的に増幅産物の染色パターンが得られた。
また、反応時間を長くすることにより、より低濃度まで
増幅産物が確認できた。 実施例７ 点変異（ポイントミューテーション）の検出 （１）M13mp18FM（変異型）の作製 ターゲットDNA として、M13mp18（野生型）、およびM
13mp18FM（変異型）を用いた。変異型であるM13mp18FM
の作製は、LA PCRTM in vitro Mutagenesis Kit（宝酒
造）を使用し、１塩基置換を導入した。その後、シーク
エンシングにより配列を確認した。F1領域での配列を以
下に示す。 （２）プライマーのデザイン 使用するプライマーは、FA プライマーの F1c 領域の
5'末端に野生型、変異型で配列の異なる塩基となるよう
にした。変異の位置、および標的塩基配列(target)に対
する各領域の位置関係を図１５に示す。 （３）増幅反応 Ｍ13mp18（野生型）、およびM13mp18FM（変異型）を
鋳型にして、以下に示すそれぞれに特異的なプライマー
の組み合わせで鋳型特異的な増幅反応が起きるかどうか
実験を行った。 野生型増幅用プライマーセット： FAd4, RAd4, F3, R3 変異型増幅用プライマーセット： FAMd4, RAd4, F3, R
3 各プライマーの塩基配列は以下の通りである。 （４）Ｍ13mp18の点突然変異の検出 反応液の組成は以下のとおりである。 上記反応液にターゲットM13mp18、またはM13mp18FM 1
fmol(2μl)を添加し、９５℃で５分間加熱し、ターゲ
ットを変性させて１本鎖とした。反応液を氷水上に移
し、Bst DNA ポリメラーゼ(NEW ENGLAND BioLabs)を1μ
L(8U)添加し、６８℃または68.5℃で１時間反応させ
た。反応後、８０℃１０分間で反応を停止し再び氷水上
に移した。 図１６で示すように、FAプライマーとして野生型用の
FAd4 を用いたときは、野生型の鋳型存在のみ効果的に
増幅が観察された。一方、FA プライマーとして変異型
用の FAMd4 を用いたときは、野生型の鋳型存在のみ効
果的に増幅が観察された。 以上の結果から、本発明の増幅反応を利用することに
より、点変異を効率的に検出できることが示された。 実施例８ ｍRNA をターゲットとした増幅反応 ターゲットとなる核酸を mRNA として、本発明による
核酸の合成方法を試みた。ターゲットとなるmRNAは、前
立腺特異抗原(Prostate specific antigen;PSA)を発現
した細胞である前立腺癌細胞株 LNCaP cell(ATCC No.CR
L-1740)と、非発現細胞である慢性骨髄性白血病細胞株K
562 cell(ATCC No.CCL-243)を、1:106〜100:106で混合
し、Qiagen社（ドイツ）のRNeasy Mini kitを用いて全R
NAを抽出した。実験に使用したプライマーは、PSAFA、P
SARA、PSAF3、そしてPSAR3 の４種類である。PSAF3 とP
SAR3 は、それぞれPSAFA とPSARA を合成起点として得
られた第一の核酸を置換するためのアウタープライマー
である。また、PSAFA(あるいは PSARA)のアニールが優
先的に起こるようにこれらのプライマー濃度を高く設定
した。各プライマーを構成する塩基配列は以下のとおり
である。 プライマー： プライマーの構造的な特徴を以下にまとめた。また、標
的の mRNA をコードするDNA塩基配列に対する各プライ
マーの位置関係、および制限酵素Sau3AＩの認識部位を
図１７に示した。 本発明による核酸の合成方法のための反応液組成を以
下に示す。 反応液組成（２５μＬ中） 20mM Tris-HCl pH8.8 4mM MgSO4 0.4mM dNTPs 10mM KCl 10mM(NH4)2SO4 0.1% TritonX-100 0.8M betaine 5mM DTT 1600nM PSAFA & PSARA プライマー 200nM PSAF3 & PSAR3 プライマー 8U Bst DNA ポリメラーゼ 100U ReverTra Ace(TOYOBO, 日本) 5μg 全RNA 全ての成分は氷上で混合した。本実験においては mRN
A（１本鎖）を targetとしているので、加熱変性によっ
て１本鎖とする工程は不要である。反応は、65℃で45
分間行い、85℃、５分で、反応を停止させた。反応終了
後、5μＬの反応液を 2%アガロースを使って電気泳動
し、SYBR Green Iで検出した。 結果を図１８に示す。各レーンは、以下のサンプルに
対応している。 Bst DNAポリメラーゼ、ReverTra Aceのいずれか一方が
ないと、増幅産物が得られなかった (レーン１〜４)。
両方の酵素存在下では、LNCaP由来のＲＮＡが存在する
と、増幅産物が検出された (レーン５〜７)。100 万個
のＫ562 細胞に１個の LNCaP からの抽出ＲＮＡでも検
出可能であった (レーン６)。増幅産物は、ターゲット
内部の配列にある制限酵素部位Sau3AＩで消化したとこ
ろ、予想される大きさの断片に消化された (レーン８，
９)。 以上の結果から、本発明による核酸の合成方法におい
て、ターゲットとしてRNA を用いた場合でも、目的の反
応産物が得られることが確認された。 産業上の利用の可能性 本発明による新規なオリゴヌクレオチドとそれを用い
た核酸の合成方法により、複雑な温度制御の不要な１本
鎖上に交互に相補的な塩基配列が連結した核酸の合成方
法が提供される。本発明に基づくオリゴヌクレオチドを
プライマーとして合成される相補鎖は、常にその3'末端
が自身を鋳型とする新たな相補鎖合成の合成起点とな
る。このとき、新たなプライマーのアニールをもたらす
ループの形成を伴い、この部分からの相補鎖合成によっ
て先に合成された自身を鋳型とする相補鎖合成反応の生
成物は再び置換され塩基対結合が可能な状態となる。こ
のようにして得ることができる自身を鋳型として合成さ
れた核酸は、たとえばSDA のような公知の核酸合成方法
との組み合わせによって、それらの核酸合成効率の向上
に貢献する。 更に本発明の望ましい態様によれば、単に公知の核酸
合成方法の効率向上を達成するのみならず、複雑な温度
制御を必要としない、しかも高度な増幅効率を期待で
き、更には高い特異性を達成できる新規な核酸の合成方
法が提供される。すなわち、本発明に基づくオリゴヌク
レオチドを鋳型鎖とその相補鎖に対して適用することに
よって、１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結され
た核酸が連続して合成されるようになる。この反応は、
原理的には合成に必要な出発材料が枯渇するまで続き、
その間にループ部分から合成を開始した新たな核酸を生
成し続ける。こうして、ループにアニールしたオリゴヌ
クレオチドからの伸長が、長い１本鎖核酸（すなわち、
複数組の相補的な塩基配列が連結したもの）の伸長のた
めの3'-OH を供給する鎖置換を行う。一方、長い１本鎖
の3'-OH は自身を鋳型とする相補鎖合成反応を行うこと
によって自身の伸長を達成すると同時に、ループから合
成開始した新たな相補鎖の置換を行う。このような増幅
反応工程が、高い特異性を維持しながら等温条件下で進
行する。 本発明におけるオリゴヌクレオチドは、２つの連続し
た領域が設計どおりに配置されているときにはじめて本
発明による核酸合成反応のためのプライマーとして機能
する。このことが、特異性の維持に大きく貢献する。た
とえばPCR では、２つのプライマーの意図した位置関係
とは無関係に、非特異的なミスアニールにより、非特異
的増幅反応が開始してしまうことと比べれば、本発明で
は高い特異性が期待できることは容易に説明できる。こ
の特徴を利用してSNPs を高い感度で精確に検出するこ
とができる。 本発明の特徴は、このような反応がごく単純な試薬構
成で容易に達成できることにある。たとえば本発明によ
るオリゴヌクレオチドは、特殊な構造を持つとは言えそ
れは塩基配列の選択の問題であって、物質としては単な
るオリゴヌクレオチドである。また、望ましい態様にお
いては、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNA ポリ
メラーゼのみで反応を進めることができる。更に、RNA
を鋳型として本発明を実施する場合には、Bca DNA ポリ
メラーゼのような逆転写酵素活性と鎖置換型のDNA ポリ
メラーゼ活性を併せ持つDNA ポリメラーゼを利用するこ
とによって、全ての酵素反応を単一の酵素によって行う
ことができる。このようなシンプルな酵素反応で高度な
核酸の増幅反応を実現する反応原理はこれまでに知られ
ていない。あるいは、SDA 等の公知の核酸合成反応に適
用するとしても、本発明との組み合わせによって新たな
酵素が必要となるようなことはなく、単に本発明に基づ
くオリゴヌクレオチドを組み合わせるだけで各種反応系
への適応が可能である。したがて、本発明による核酸合
成方法は、コストの点においても有利といえる。 以上述べたように、本発明の核酸の合成方法とそのた
めのオリゴヌクレオチドは、操作性（温度制御不要）、
合成効率の向上、経済性、そして高い特異性という、複
数の困難な課題を同時に解決する新たな原理を提供す
る。
含む１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核
酸を増幅する方法を提供するものである。この方法で
は、Ｆ２ｃ／Ｆ２間、Ｒ２ｃ／Ｒ２間、Ｆ１ｃ／Ｆ１
間、そしてＲ１ｃ／Ｒ１間で安定なアニールが起きる温
度条件が選択され、そして望ましくはＦ３ｃ／Ｆ３間、
ならびにＲ３ｃ／Ｒ３間は、それぞれＦ２ｃ／Ｆ２間、
ならびにＲ２ｃ／Ｒ２間のアニールに助けられるコンテ
ィギュアス スタッキング現象によってアニールするよ
うに設定される。 本発明においては核酸の合成(synthesis)と増幅(ampl
ification)という用語を用いる。本発明における核酸の
合成とは、合成起点となったオリゴヌクレオチドからの
核酸の伸長を意味する。合成に加えて、更に他の核酸の
生成と、この生成された核酸の伸長反応とが連続して起
きるとき、一連の反応を総合して増幅という。 さて、3'末端に同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールする
ことができる領域Ｆ１を備え、この領域Ｆ１が同一鎖上
のＦ１ｃにアニールすることによって、塩基対結合が可
能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる１
本鎖核酸は、本発明の重要な構成要素である。このよう
な１本鎖核酸は、次のような原理に基づいて供給するこ
ともできる。すなわち、予め次のような構造を持ったプ
ライマーに基づいて相補鎖合成を進めるのである。 5'- ［プライマー内に位置する領域Ｘ１ｃにアニールす
る領域Ｘ１］−［塩基対結合が可能な状態にあるループ
形成配列］−［領域Ｘ１ｃ］−［鋳型に相補的な配列を
持つ領域］-3' 鋳型に相補的な配列を持つ領域には、Ｆ１に相補的な
塩基配列（プライマーＦＡ）およびＲ１ｃに相補的な塩
基配列（プライマーＲＡ）の２種類を用意する。なお、
このとき合成すべき核酸を構成する塩基配列は、領域Ｆ
１から領域Ｒ１ｃにいたる塩基配列と、この塩基配列に
相補的な塩基配列を持つ領域Ｒ１から領域Ｆ１ｃにいた
る塩基配列とを含むものである。一方、プライマー内部
でアニールすることができるＸ１ｃとＸ１は、任意の配
列とすることができる。ただしプライマーＦＡとＲＡの
間では、領域X１ｃ／X１の配列を異なるものとするのが
望ましい。 まず鋳型核酸の領域Ｆ１から前記プライマーＦＡによ
る相補鎖合成を行う。次いで合成された相補鎖の領域Ｒ
１ｃを塩基対結合が可能な状態とし、ここに一方のプラ
イマーをアニールさせて相補鎖合成の起点とする。この
とき合成される相補鎖の3'末端は、最初に合成された鎖
の5'末端部分を構成するプライマーＦＡに相補的な塩基
配列を持つので、3'末端には領域 X1 を持ち、これが同
一鎖上の領域 X１ｃにアニールするとともにループを形
成する。こうして、前記本発明による特徴的な3'末端構
造が提供され、以降の反応は最も望ましい態様として示
した先の反応系そのものとなる。なおこのときループ部
分にアニールするオリゴヌクレオチドは、3'末端にルー
プ内に存在する領域X２ｃに相補的な領域X２を持ち、5'
側には領域 X１を持つものとする。先の反応系ではプラ
イマーＦＡとＲＡを使って鋳型核酸に相補的な鎖を合成
することによって核酸の 3'末端にループ構造をもたら
した。この方法は、短いプライマーで効果的に本発明に
特徴的な末端構造を提供する。一方、本態様において
は、プライマーとしてはじめからループを構成する塩基
配列全体を提供しており、より長いプライマーの合成が
必要となる。 リバースプライマーに制限酵素認識領域を含む塩基配
列を利用すれば、本発明による異なった態様を構成する
ことができる。図６に基づき、リバースプライマーが制
限酵素認識配列を含む場合について具体的に説明する。
図６−(D)が完成したところで、リバースプライマー内
の制限酵素認識部位に対応する制限酵素によりニックが
生じる。このニックを合成起点として鎖置換型の相補鎖
合成反応が開始する。リバースプライマーは(D)を構成
する２本鎖核酸の両端に位置しているので、相補鎖合成
反応も両端から開始することになる。基本的には先行技
術として記載したSDA 法の原理に基づくが、鋳型となる
塩基配列が本発明によって相補的な塩基配列を交互に連
結した構造となっているので、本発明に特有の核酸合成
系が構成されるのである。なお、ニックを入れるリバー
スプライマーの相補鎖となる部分には制限酵素による２
本鎖の切断が生じないようにヌクレアーゼ耐性となるよ
うにdNTP 誘導体が取りこまれるように設計しなければ
ならない。 リバースプライマーにRNA ポリメラーゼのプロモータ
ーを挿入しておくこともできる。この場合もSDA 法を応
用した先の態様と同様に、図６−(D)の両端からこのプ
ロモーターを認識するRNA ポリメラーゼにより転写が行
われる。 本発明によって合成された核酸は、１本鎖とは言え相
補的な塩基配列から構成されるため、その大部分が塩基
対結合を形成している。この特徴を利用して、合成生成
物の検出が可能である。エチジウムブロマイド、SYBR G
reen 1、あるいはPico Green のような２本鎖特異イン
ターカレーターである蛍光色素の存在下で本発明による
核酸の合成方法を実施すれば、生成物の増加に伴って蛍
光強度の増大が観察される。これをモニターすれば、閉
鎖系でリアルタイムな合成反応の追跡が可能である。こ
の種の検出系はPCR 法への応用も考えられているが、プ
ライマーダイマー等によるシグナルの発生と区別がつか
ないことから問題が多いとされている。しかし本発明に
応用した場合には、非特異的な塩基対結合が増加する可
能性が非常に低いことから、高い感度と少ないノイズが
同時に期待できる。２本鎖特異インターカレーターと同
様に、均一系の検出系を実現する方法として、蛍光エネ
ルギー転移の利用が可能である。 本発明による核酸の合成方法を支えているのは、鎖置
換型の相補鎖合成反応を触媒するDNA ポリメラーゼであ
る。上記反応中には、必ずしも鎖置換型のポリメラーゼ
を要しない反応ステップも含まれてはいる。しかし、構
成試薬の単純化、そして経済性の点で、１種類のDNA ポ
リメラーゼを利用するのが有利である。この種のDNA ポ
リメラーゼには、以下のようなものが知られている。ま
た、これらの酵素の各種変異体についても、それが配列
依存型の相補鎖合成活性と鎖置換活性を有する限り、本
発明に利用することができる。ここで言う変異体とは、
酵素の必要とする触媒活性をもたらす構造のみを取り出
したもの、あるいはアミノ酸の変異等によって触媒活
性、安定性、あるいは耐熱性を改変したもの等を示すこ
とができる。 Bst DNA ポリメラーゼ Bca(exo-)DNA ポリメラーゼ DNA ポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント Vent DNA ポリメラーゼ Vent(Exo-)DNA ポリメラーゼ（Vent DNA ポリメラーゼ
からエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの） DeepVent DNA ポリメラーゼ DeepVent(Exo-)DNA ポリメラーゼ（DeepVent DNA ポリ
メラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの） Φ29ファージDNA ポリメラーゼ MS-2ファージDNA ポリメラーゼ Z-Taq DNA ポリメラーゼ（宝酒造） KOD DNA ポリメラーゼ（東洋紡績） これらの酵素の中でもBst DNA ポリメラーゼやBca(ex
o-)DNA ポリメラーゼは、ある程度の耐熱性を持ち、触
媒活性も高いことから特に望ましい酵素である。本発明
の反応は、望ましい態様においては等温で実施すること
ができるが、融解温度(Tm)の調整などのために必ずしも
酵素の安定性にふさわしい温度条件を利用できるとは限
らない。したがって、酵素が耐熱性であることは望まし
い条件の一つである。また、等温反応が可能とは言え、
最初の鋳型となる核酸の提供のためにも加熱変性は行わ
れる可能性があり、その点においても耐熱性酵素の利用
はアッセイプロトコールの選択の幅を広げる。 Vent(Exo-)DNAポリメラーゼは、鎖置換活性と共に高
度な耐熱性を備えた酵素である。ところでDNAポリメラ
ーゼによる鎖置換を伴う相補鎖合成反応は、１本鎖結合
タンパク質(single strand binding protein)の添加に
よって促進されることが知られている(Paul M.Lizardi
et al, Nature Genetics 19, 225-232, July,1998)。こ
の作用を本発明に応用し、１本鎖結合タンパク質を添加
することによって相補鎖合成の促進効果を期待すること
ができる。たとえばVent(Exo-)DNAポリメラーゼに対し
ては、１本鎖結合タンパク質としてT4 gene 32が有効で
ある。 なお3'-5'エクソヌクレアーゼ活性を持たないDNA ポ
リメラーゼには、相補鎖合成が鋳型の5'末端に達した部
分で停止せず、１塩基突出させた状態まで合成を進める
現象が知られている。本発明では、相補鎖合成が末端に
至ったときの3'末端の配列が次の相補鎖合成の開始につ
ながるため、このような現象は望ましくない。しかし、
DNA ポリメラーゼによる3'末端への塩基の付加は、高い
確率でＡとなる。したがって、dATP が誤って１塩基付
加しても問題とならないように、3'末端からの合成がA
で開始するように配列を選択すれば良い。また、相補鎖
合成時に3'末端がたとえ突出してしまっても、これを消
化してblunt end とする3'→5'エクソヌクレアーゼ活性
を利用することもできる。たとえば、天然型のVent DNA
ポリメラーゼはこの活性を持つことから、Vent(Exo-)DN
A ポリメラーゼと混合して利用することにより、この問
題を回避することができる。 本発明による核酸の合成方法、あるいは増幅方法に必
要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキ
ットとして供給することができる。具体的には、本発明
のために、相補鎖合成のプライマーとして、あるいは置
換用のアウタープライマーとして必要な各種のオリゴヌ
クレオチド、相補鎖合成の基質となるdNTP、鎖置換型の
相補鎖合成を行うDNA ポリメラーゼ、酵素反応に好適な
条件を与える緩衝液、更に必要に応じて合成反応生成物
の検出のために必要な試薬類で構成されるキットが提供
される。特に、本発明の望ましい態様においては、反応
途中で試薬の添加が不要なことから、１回の反応に必要
な試薬を反応容器に分注した状態で供給することによ
り、サンプルの添加のみで反応を開始できる状態とする
ことができる。発光シグナルや蛍光シグナルを利用し
て、反応生成物の検出を反応容器のままで行えるような
システムとすれば、反応後の容器の開封を全面的に廃止
することができる。これは、コンタミネーションの防止
上、たいへん望ましいことである。 さて、本発明によって合成される、１本鎖上に相補的
な塩基配列が交互に連結された核酸には、たとえば次の
ような有用性がある。第一には、相補的な塩基配列を１
分子内に備えた特殊な構造に伴う利点の活用である。こ
の特徴により、検出が容易となることが期待される。す
なわち、相補的な塩基配列との塩基対結合に伴って、シ
グナルを増減する核酸の検出系が公知である。たとえば
先に述べたような２本鎖特異インターカレーターを検出
剤として利用する方法などを組み合わせれば、本発明の
合成生成物の特徴を生かした検出系を実現することがで
きる。このような検出系において本発明の合成反応生成
物を一度熱変性して元の温度に戻すと、分子内のアニー
ルが優先的に起きるため速やかに相補的配列の間で塩基
対結合を構成する。一方、もしも非特異的反応生成物が
存在していても、それは分子内に相補的配列を持ってい
ないので熱変性により２分子以上に分離してしまい、す
ぐにはもとの二本鎖には戻れない。こうして、検出前に
加熱変性工程を追加することによって、非特異反応に伴
うノイズを軽減することができる。熱に対して耐性を持
たないDNA ポリメラーゼを使用しているときには、加熱
変性工程は反応停止の意味も持ち、反応時間の制御の点
で有利である。 第二の特徴は、塩基対結合が可能な状態にあるループ
を常に形成することである。塩基対結合が可能な状態に
あるループの構造を、図４に示した。図４からわかるよ
うに、ループはプライマーのアニールが可能な塩基配列
Ｆ２ｃ（Ｘ２ｃ）と、Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ（Ｘ１ｃ）の間に
介在する塩基配列とで構成される。Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ間
（普遍的に示せばＸ２ｃ−Ｘ１ｃ間）の配列は、鋳型に
由来する塩基配列である。したがってこの領域に対して
相補的な塩基配列を持つプローブをハイブリダイズさせ
れば、鋳型特異的な検出を行うことができる。しかも、
この領域は常に塩基対結合が可能な状態にあることか
ら、ハイブリダイズに先だって加熱変性する必要がな
い。なお本発明の増幅反応生成物におけるループを構成
する塩基配列は、任意の長さとすることができる。した
がって、プローブのハイブリダイズを目的とする場合に
は、プライマーがアニールすべき領域とプローブがハイ
ブリダイズすべき領域を別々にして両者の競合を避ける
ことにより理想的な反応条件を構成することができる。 本発明の望ましい態様によれば、１本の核酸鎖上に塩
基対結合が可能な多数のループがもたらされる。このこ
とは、核酸１分子に多数のプローブがハイブリダイズ可
能なことを意味しており、感度の高い検出を可能とす
る。また感度のみならず、たとえば凝集反応のような特
殊な反応原理に基づく核酸の検出方法を可能とするもの
でもある。たとえばポリスチレンラテックスのような微
粒子に固定したプローブを本発明による反応生成物に加
えると、プローブとのハイブリダイゼーションに伴って
ラテックス粒子の凝集が観察される。凝集の強度を光学
的に測定すれば、高感度に、しかも定量的な観察が可能
である。あるいは、凝集反応を肉眼的に観察することも
できるので、光学的な測定装置を使わない反応系を構成
することもできる。 更に、１核酸分子当たり多くの標識を結合できる本発
明の反応生成物は、クロマトグラフィックな検出をも可
能とする。イムノアッセイの分野では、肉眼的に検出可
能な標識を利用したクロマト媒体を用いた分析方法（イ
ムノクロマトグラフィー法）が実用化されている。この
方法は、クロマト媒体に固定した抗体と標識抗体でアナ
ライトをサンドイッチし、未反応の標識成分を洗い去る
原理に基づいている。本発明の反応生成物は、この原理
を核酸の分析にも応用可能とする。すなわち、ループ部
分に対する標識プローブを用意し、これをクロマト媒体
に固定化した捕捉用プローブでトラップすることによっ
てクロマト媒体中での分析が行われる。捕捉用プローブ
には、ループ部分に対する相補配列を利用することがで
きる。本発明の反応生成物は、多数のループ部分を伴っ
ていることから、多数の標識プローブを結合し、肉眼的
に認識可能なシグナルをもたらす。 ループとして常に塩基対結合が可能な領域を与える本
発明による反応生成物は、この他にもさまざまな検出系
を可能とする。たとえば、このループ部分に対するプロ
ーブを固定した表面プラズモン共鳴を利用した検出系が
可能である。また、ループ部分に対するプローブを２本
鎖特異的なインターカレーターで標識しておけば、より
高感度な蛍光分析を行うことができる。あるいは、本発
明によって合成される核酸が 3'側と 5'側の両方に塩基
対結合が可能なループを形成することを積極的に利用す
ることもできる。たとえば、一方のループを正常型と異
常型で共通の塩基配列となる部分とし、他方のループに
両者の違いが生じる領域となるように設計しておくので
ある。共通部分に対するプローブで遺伝子の存在を確認
し、他方の領域で異常の有無を確認するといった特徴的
な分析系を構成することができる。本発明による核酸の
合成反応は、等温で進めることも可能なことから、一般
的な蛍光光度計によってリアルタイムな分析が可能とな
ることも特筆すべき利点である。これまでにも同一鎖上
にアニールする核酸の構造は公知である。しかし本発明
によって得ることができる１本鎖上に相補的な塩基配列
が交互に連結された核酸は、他のオリゴヌクレオチドが
塩基対結合することができる多数のループ部分を含む点
において新規である。 一方、本発明による反応生成物によって与えられる多
数のループ部分そのものをプローブとして利用すること
も可能である。たとえば、DNAチップにおいては、限ら
れたエリアに高密度にプローブを集積する必要がある。
しかし現在の技術では、一定の面積に固定することがで
きるオリゴヌクレオチドの数は制限される。そこで本発
明の反応生成物を利用すれば、アニールが可能な多数の
プローブを高密度に固定化することができる。すなわ
ち、本発明による反応生成物をプローブとしてDNA チッ
プ上に固定すればよい。反応生成物は、増幅後に公知の
手法によって固定することもできるし、あるいは固定化
したオリゴヌクレオチドを本発明の増幅反応におけるオ
リゴヌクレオチドとして利用することにより結果的に固
定化された反応生成物とすることもできる。このように
して固定化されたプローブを用いれば、限られたエリア
中に多くの試料DNA ハイブリダイズすることができ、結
果的に高いシグナルを期待することができる。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の望ましい態様の反応原理の一部(1)-
(4)を示す模式図である。 図２は、本発明の望ましい態様の反応原理の一部(5)-
(7)を示す模式図である。 図３は、本発明の望ましい態様の反応原理の一部(8)-
(10)を示す模式図である。 図４は、本発明による１本鎖核酸が形成するループの
構造を示す模式図である。 図５は、本発明による基礎的な態様の一部(A)-(B)を
示す模式図である。 図６は、本発明による基礎的な態様の一部(C)-(D)を
示す模式図である。 図７は、M13mp18 の標的塩基配列における、オリゴヌ
クレオチドを構成する各塩基配列の位置関係を示す図で
ある。 図８は、M13mp18 を鋳型として本発明による１本鎖核
酸の合成方法によって得られた生成物のアガロース電気
泳動の結果を示す写真である。 レーン１：XIV size marker レーン２： 1 fmol M13mp18 dsDNA レーン３：targetなし 図９は、実施例１によって得られた本発明による核酸
合成反応の生成物を制限酵素で消化しアガロース電気泳
動した結果を示す写真である。 レーン１：XIV size marker レーン２：精製物の BamHI 消化物 レーン３：精製物の PvuII 消化物 レーン４：生成物の HindIII 消化物 図１０は、M13mp18 を鋳型として、ベタイン添加によ
る本発明の１本鎖核酸の合成方法によって得られた生成
物のアガロース電気泳動の結果を示す写真である。０、
0.5、１、２は反応液中に添加したベタイン濃度(M)を表
す。また、Ｎは陰性対照を、-21 は鋳型DNA の濃度10
-21mol を表す。 図１１は、HBV 由来の標的塩基配列における、オリゴ
ヌクレオチドを構成する各塩基配列の位置関係を示す図
である。 図１２は、M13mp18 組みこまれた HBV-M13mp18 を鋳
型として本発明による１本鎖核酸の合成方法によって得
られた生成物のアガロース電気泳動の結果を示す写真で
ある。 レーン１：XIV size marker レーン２： 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA レーン３：target なし 図１３は、本発明による１本鎖核酸の合成方法によっ
て得られた生成物のアルカリ変性ゲル電気泳動の結果を
示す写真である。 レーン１：ラムダファージのHindIII 消化断片 レーン２：実施例１の反応生成物 レーン３：実施例３の反応生成物 図１４は、ターゲットであるM13mp18 の濃度を変えて
ときに、本発明による１本鎖核酸の合成方法によって得
られた生成物のアガロース電気泳動の結果を示す写真で
ある。上は反応時間１時間、下は反応時間３時間の結果
である。 レーン１：M13mp18 dsDNA 1x10-15mol/tube レーン２：M13mp18 dsDNA 1x10-16mol/tube レーン３：M13mp18 dsDNA 1x10-17mol/tube レーン４：M13mp18 dsDNA 1x10-18mol/tube レーン５：M13mp18 dsDNA 1x10-19mol/tube レーン６：M13mp18 dsDNA 1x10-20mol/tube レーン７：M13mp18 dsDNA 1x10-21mol/tube レーン８：M13mp18 dsDNA 1x10-22mol/tube レーン９：target なし レーン１０：XIV size marker 図１５は、変異の位置、および標的塩基配列(target)
に対する各領域の位置関係を表す図である。下線で示し
たグアニンが、変異型ではアデニンに置換されている。 図１６は、本発明の増幅反応による生成物のアガロー
ス電気泳動の結果を示す写真である。 M: 100bp ladder (New England Biolabs) N: 鋳型なし（精製水） WT: 野生型鋳型M13mp18 1 fmol MT: 変異型鋳型M13mp18FM 1 fmol 図１７は、標的mRNA をコードする塩基配列におけ
る、オリゴヌクレオチドを構成する各塩基配列の位置関
係を示す図である。 図１８は、mRNA をターゲットとして本発明による１
本鎖核酸の合成方法によって得られた生成物のアガロー
ス電気泳動の結果を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態 実施例１ M13mp18 内の領域の増幅 M13mp18 を鋳型として、本発明による１本鎖上に相補
的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法を試み
た。実験に使用したプライマーは、M13FA、M13RA、M13F
3、そしてM13R3 の４種類である。M13F3 とM13R3 は、
それぞれM13FA とM13RA を合成起点として得られた第１
の核酸を置換するためのアウタープライマーである。ア
ウタープライマーはM13FA（あるいはM13RA）よりも後か
ら相補鎖合成の起点となるべきプライマーなので、M13F
A（あるいはM13RA）と隣接する領域にコンティギュアス
スタッキング現象を利用してアニールするように設計
した。また、M13FA（あるいはM13RA）のアニールが優先
的に起こるようにこれらのプライマー濃度を高く設定し
た。 各プライマーを構成する塩基配列は配列表に示したと
おりである。プライマーの構造的な特徴を以下にまとめ
た。また標的塩基配列(target)に対する各領域の位置関
係を図７に示した。 このようなプライマーによって、M13mp18 の領域Flc
からR1c にいたる領域とその相補的な塩基配列とが、F2
c を含むループ形成配列を挟んで１本鎖上に交互に連結
した核酸が合成される。これらのプライマーによる本発
明による核酸の合成方法のための反応液組成を以下に示
す。 反応液組成（２５μL中） 20mM Tris-HCl pH8.8 10mM KCl 10mM (NH4)2SO4 6mM MgSO4 0.1% Triton X-100 5% ジメチルスルホキシド(DMSO) 0.4mM dNTP プライマー： 800nM M13FA／配列番号：１ 800nM M13RA／配列番号：２ 200nM M13F3／配列番号：３ 200nM M13R3／配列番号：４ ターゲット：M13mp18 dsDNA ／配列番号：５ 反応：上記反応液を９５℃で５分間加熱し、ターゲッ
トを変性させて１本鎖とした。反応液を氷水上に移し、
Bst DNA ポリメラーゼ(NEW ENGLAND BioLabs)を４U 添
加し、６５℃で１時間反応させた。反応後、８０℃１０
分間で反応を停止し再び氷水上に移した。 反応の確認：上記反応液の５μL に１μL のloading
buffer を添加し、２％アガロースゲル（0.5% TBE）を
使って、１時間、80mV で電気泳動した。分子サイズマ
ーカーとして、XIV(100bp ladder, Boehringer Mannhei
m製)を使用した。泳動後のゲルをSYBR Green I (Molecu
lar Probes,Inc.)で染色して核酸を確認した。結果は図
８に示すとおりである。各レーンは次のサンプルに対応
している。 1. XIV size marker 2. 1fmol M13mp18 dsDNA 3. target なし レーン３では未反応のプライマーが染色されている以
外にバンドは認識されなかった。レーン２はターゲット
が存在する場合、低サイズのバンドのラダーと高サイズ
でのスメアな染色、およびゲル内でほとんど泳動されて
いないバンドとして生成物が確認された。低サイズのバ
ンドのうち、290bp、450bp付近のバンドは、それぞれ本
発明の合成反応により予想される産物である、配列番
号：１１および配列番号：１２が２本鎖となったもの
（図２−(7)および図２−(10)が２本鎖となったものに
相当）および配列番号：１３（図３−(9)にある長い１
本鎖に相当）とサイズが一致することから、反応が予想
されるとおりに進行していることが確認された。高サイ
ズのスメアなパターン、および泳動されていないバンド
は、本反応が基本的に連続的な反応であることから、反
応産物が一定のサイズにはならないこと、そして部分的
な１本鎖、あるいは２本鎖の複合体を形成した複雑な構
造をともなっているため、結果としてこのような泳動結
果を与えるものと考えられた。 実施例２ 反応産物の制限酵素消化確認 実施例１で得られた本発明による１本鎖上に相補的な
塩基配列が交互に連結された核酸の構造を明らかにする
ことを目的として、制限酵素による消化を行った。制限
酵素を使った消化によって理論どおりの断片を生じる一
方、実施例１で観察された高サイズのスメアなパターン
や泳動されないバンドが消滅すれば、これらがいずれも
本発明によって合成された１本鎖上に相補的な塩基配列
を交互に連結した核酸であることが推定できる。 実施例１の反応液を８本分（200μL）プールし、フェノ
ール処理後、エタノール沈でんを行って精製した。この
沈でんを回収して200μL のTE 緩衝液で再溶解し、その
10μL を制限酵素BamHI、PvuII、およびHindIII でそれ
ぞれ３７℃２時間消化した。消化物を2%アガロースゲル
（0.5% TBE）を使って、１時間、80mV で電気泳動し
た。分子サイズマーカーとして、SUPER LADDER-LOW(100
bp ladder)(GensuraLaboratories,Inc.製) を使用し
た。泳動後のゲルを SYBR Green I (MolecularProbes,I
nc.)で染色して核酸を確認した。結果は図９に示すとお
りである。各レーンは次のサンプルに対応している。 1. XIV size marker 2. 精製物のBamHI 消化物 3. 精製物のPvuII 消化物 4. 精製物のHindIII 消化物 ここで比較的鎖長の短い増幅生成物を構成している塩
基配列は、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番
号：１５、および配列番号：１６等と推定される。これ
らの塩基配列から、推測される各制限酵素消化断片のサ
イズは表１のとおりである。表中のL は、ループ（１本
鎖）を含む断片なので泳動位置が未確定であることを示
す。 未消化でのバンドのほとんどが消化後には推定される
サイズのバンドへ変化したことから、目的の反応産物が
増幅されていることが確認された。また非特異的産物は
ほとんどないことも示された。 実施例３ ベタイン添加による増幅反応の促進 増幅反応液中へのベタイン(betaine:N,N,N,-trimethy
lglycine、SIGMA)添加による、核酸の増幅反応に対する
効果を調べる実験を行った。実施例１と同様に、M13mp1
8 を鋳型とし、本発明による１本鎖上に相対的な塩基配
列が交互に連結された核酸の合成方法を、種々の濃度の
ベタイン存在下で行った。実験に使用したプライマー
は、実施例１で使用したものと同じである。鋳型DNA 量
は、10-21 mol(M13mp18)で、陰性対照として水を用い
た。添加するベタインは、0、0.5、1、2Mの濃度になる
ように反応液に加えた。反応液組成を以下に示す。 反応液組成（２５μL 中） 20mM Tris-HCl pH8.8 4mM MgSO4 0.4mM dNTPs 10mM KCl 10mM (NH4)2SO4 0.1% TritonX-100 プライマー： 800nM M13FA／配列番号：１ 800nM M13RA／配列番号：２ 200nM M13F3／配列番号：３ 200nM M13R3／配列番号：４ ターゲット：M13mp18 dsDNA ／配列番号：５ 使用したポリメラーゼ、反応条件、反応後の電気泳動
条件は、実施例１に記載したものと同じである。 結果を図１０に示す。ベタイン濃度0.5、1.0M 存在下
での反応では、増幅産物量が増大した。また2.0M まで
増やすと逆に増幅産物は確認されなかった。これによ
り、適度のベタイン存在で、増幅反応が促進されること
が示された。ベタイン濃度2M の場合に、増幅産物が低
下したことは、Tm が低下しすぎたのが原因と考えられ
た。 実施例４ HBV 遺伝子配列の増幅 HBV 遺伝子の部分配列を組み込んだM13mp18 dsDNA を
鋳型として、本発明による核酸の合成方法を試みた。実
験に使用したプライマーは、HB65FA（配列番号：６）、
HB65RA（配列番号：７）、HBF3（配列番号：８）、そし
て HBR3（配列番号：９）の４種類である。HBF3 とHBR3
は、それぞれHB65FA とHB65RA を合成起点として得ら
れた第１の核酸を置換するためのアウタープライマーで
ある。アウタープライマーはHB65FA(あるいはHB65RA)よ
りも後から相補鎖合成の起点となるべきプライマーなの
で、HB65FA（あるいはHB65RA）と隣接する領域にコンテ
ィギュアス スタッキング現象を利用してアニールする
ように設計した。また、HB65FA（あるいはHB65RA）のア
ニールが優先的に起こるようにこれらのプライマー濃度
を高く設定した。M13mp18 に組みこまれたHBV に由来す
る本実施例のターゲット配列(430bp)を配列１０に示し
た。 各プライマーを構成する塩基配列は配列表に示したと
おりである。プライマーの構造的な特徴を以下にまとめ
た。また標的塩基配列(target)に対する各領域の位置関
係を図１１に示した。 このようなプライマーによって、HBV 遺伝子の部分配列
を組み込んだM13mp18(HBV-M13mp18)の領域F1c からR1c
にいたる領域とその相補的な塩基配列とが、F2c を含む
ループ形成配列を挟んで１本鎖上で交互に連結した核酸
が合成される。上記プライマーを用いる他は実施例１と
同じ条件で反応させ、その反応液をアガロース電気泳動
により分析した。結果は図１２に示すとおりである。各
レーンは次のサンプルに対応している。 1. XIV size marker 2. 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA 3. target なし 実施例１と同様に、target が存在するときにのみ、
低サイズのバンドのラダーと高サイズでのスメアな染
色、およびゲル内でほとんど泳動されていないバンドと
して生成物が確認された（レーン２）。低サイズのバン
ドのうち、310bp、および480bp 付近のバンドはそれぞ
れ、本反応により予想される産物である。配列番号：１
７および配列番号：１８の２本鎖とサイズが一致するこ
とから、反応が予想されるとおりに進行していることが
確認された。高サイズのスメアなパターン、および泳動
されていないバンドは、実施例１の結果で述べたよう
に、本発明に特徴的な合成生成物の構造が原因となって
いるものと推定された。この実験により、増幅する配列
(target)が異なっても本発明を実施可能であることが確
認された。 実施例５ 合成反応生成物のサイズの確認 本発明に基づいて合成された核酸の構造を確認するた
めに、その長さをアルカリ変性条件下での電気泳動によ
って分析した。実施例１と実施例４のターゲット存在下
での反応液の５μL に、それぞれ１μL のalkaline loa
ding buffer を添加し、0.7％アガロースゲル(50mM NaO
H, 1mM EDTA)を使って、14時間、50mAで電気泳動した。
分子サイズマーカーとして、ラムダファージのHindIII
消化断片を使用した。泳動後のゲルを 1M Tris pH 8 で
中和後、SYBR Green I (MolecularProbes,Inc.)で染色
して核酸を確認した。結果は図１３に示す。各レーンは
以下のサンプルに対応している。 1. ラムダファージのHindIII 消化断片 2. 実施例１の反応生成物 3. 実施例４の反応生成物 反応生成物をアルカリ変性条件で泳動すると１本鎖状
態でのサイズ確認が可能である。実施例１(レーン２)、
実施例４(レーン３)ともに主な生成物は２kbase内であ
ることが確認された。また、本発明による生成物はこの
分析によって確認できる範囲で少なくとも６kbase 以上
にまで伸びていることが判明した。加えて、実施例１や
実施例４の未変性条件下で泳動されなかったバンドは、
変性状態では個々の１本鎖に分離されサイズが小さくな
ることが改めて確認された。 実施例６ M-13mp13 内の領域の増幅における、ターゲ
ット濃度依存的増幅の確認 本発明による核酸の合成方法に及ぼす、ターゲットの
濃度変化の影響を観察した。ターゲットであるM13mp18
dsDNA を０〜1 fmol とし、反応時間を１時間および３
時間とする他は、実施例１と同じ条件で本発明による核
酸の合成方法を実施した。実施例１と同様に、２％アガ
ロースゲル(0.5% TBE)で電気泳動し、SYBR GreenI(Mole
cular Probes,Inc.)染色により核酸を確認した。分子サ
イズマーカーとして、XIV(100bp ladder, Boehringer M
annheim)を使用した。結果は図１４（上：反応時間１時
間、下：反応時間３時間）に示した。各レーンは、次の
サンプルに対応する。 1. M13mp18 dsDNA 1x10-15mol/tube 2. M13mp18 dsDNA 1x10-16mol/tube 3. M13mp18 dsDNA 1x10-17mol/tube 4. M13mp18 dsDNA 1x10-18mol/tube 5. M13mp18 dsDNA 1x10-19mol/tube 6. M13mp18 dsDNA 1x10-20mol/tube 7. M13mp18 dsDNA 1x10-21mol/tube 8. M13mp18 dsDNA 1x10-22mol/tube 9. target なし 10. XIV size marker 泳動像の下部に見られる各レーンに共通のバンドは未
反応のプライマーが染色されたものである。反応時間に
かかわらず、ターゲットが存在しないときは全く増幅産
物は観察されない。ターゲット存在下でのみ、ターゲッ
トの濃度依存的に増幅産物の染色パターンが得られた。
また、反応時間を長くすることにより、より低濃度まで
増幅産物が確認できた。 実施例７ 点変異（ポイントミューテーション）の検出 （１）M13mp18FM（変異型）の作製 ターゲットDNA として、M13mp18（野生型）、およびM
13mp18FM（変異型）を用いた。変異型であるM13mp18FM
の作製は、LA PCRTM in vitro Mutagenesis Kit（宝酒
造）を使用し、１塩基置換を導入した。その後、シーク
エンシングにより配列を確認した。F1領域での配列を以
下に示す。 （２）プライマーのデザイン 使用するプライマーは、FA プライマーの F1c 領域の
5'末端に野生型、変異型で配列の異なる塩基となるよう
にした。変異の位置、および標的塩基配列(target)に対
する各領域の位置関係を図１５に示す。 （３）増幅反応 Ｍ13mp18（野生型）、およびM13mp18FM（変異型）を
鋳型にして、以下に示すそれぞれに特異的なプライマー
の組み合わせで鋳型特異的な増幅反応が起きるかどうか
実験を行った。 野生型増幅用プライマーセット： FAd4, RAd4, F3, R3 変異型増幅用プライマーセット： FAMd4, RAd4, F3, R
3 各プライマーの塩基配列は以下の通りである。 （４）Ｍ13mp18の点突然変異の検出 反応液の組成は以下のとおりである。 上記反応液にターゲットM13mp18、またはM13mp18FM 1
fmol(2μl)を添加し、９５℃で５分間加熱し、ターゲ
ットを変性させて１本鎖とした。反応液を氷水上に移
し、Bst DNA ポリメラーゼ(NEW ENGLAND BioLabs)を1μ
L(8U)添加し、６８℃または68.5℃で１時間反応させ
た。反応後、８０℃１０分間で反応を停止し再び氷水上
に移した。 図１６で示すように、FAプライマーとして野生型用の
FAd4 を用いたときは、野生型の鋳型存在のみ効果的に
増幅が観察された。一方、FA プライマーとして変異型
用の FAMd4 を用いたときは、野生型の鋳型存在のみ効
果的に増幅が観察された。 以上の結果から、本発明の増幅反応を利用することに
より、点変異を効率的に検出できることが示された。 実施例８ ｍRNA をターゲットとした増幅反応 ターゲットとなる核酸を mRNA として、本発明による
核酸の合成方法を試みた。ターゲットとなるmRNAは、前
立腺特異抗原(Prostate specific antigen;PSA)を発現
した細胞である前立腺癌細胞株 LNCaP cell(ATCC No.CR
L-1740)と、非発現細胞である慢性骨髄性白血病細胞株K
562 cell(ATCC No.CCL-243)を、1:106〜100:106で混合
し、Qiagen社（ドイツ）のRNeasy Mini kitを用いて全R
NAを抽出した。実験に使用したプライマーは、PSAFA、P
SARA、PSAF3、そしてPSAR3 の４種類である。PSAF3 とP
SAR3 は、それぞれPSAFA とPSARA を合成起点として得
られた第一の核酸を置換するためのアウタープライマー
である。また、PSAFA(あるいは PSARA)のアニールが優
先的に起こるようにこれらのプライマー濃度を高く設定
した。各プライマーを構成する塩基配列は以下のとおり
である。 プライマー： プライマーの構造的な特徴を以下にまとめた。また、標
的の mRNA をコードするDNA塩基配列に対する各プライ
マーの位置関係、および制限酵素Sau3AＩの認識部位を
図１７に示した。 本発明による核酸の合成方法のための反応液組成を以
下に示す。 反応液組成（２５μＬ中） 20mM Tris-HCl pH8.8 4mM MgSO4 0.4mM dNTPs 10mM KCl 10mM(NH4)2SO4 0.1% TritonX-100 0.8M betaine 5mM DTT 1600nM PSAFA & PSARA プライマー 200nM PSAF3 & PSAR3 プライマー 8U Bst DNA ポリメラーゼ 100U ReverTra Ace(TOYOBO, 日本) 5μg 全RNA 全ての成分は氷上で混合した。本実験においては mRN
A（１本鎖）を targetとしているので、加熱変性によっ
て１本鎖とする工程は不要である。反応は、65℃で45
分間行い、85℃、５分で、反応を停止させた。反応終了
後、5μＬの反応液を 2%アガロースを使って電気泳動
し、SYBR Green Iで検出した。 結果を図１８に示す。各レーンは、以下のサンプルに
対応している。 Bst DNAポリメラーゼ、ReverTra Aceのいずれか一方が
ないと、増幅産物が得られなかった (レーン１〜４)。
両方の酵素存在下では、LNCaP由来のＲＮＡが存在する
と、増幅産物が検出された (レーン５〜７)。100 万個
のＫ562 細胞に１個の LNCaP からの抽出ＲＮＡでも検
出可能であった (レーン６)。増幅産物は、ターゲット
内部の配列にある制限酵素部位Sau3AＩで消化したとこ
ろ、予想される大きさの断片に消化された (レーン８，
９)。 以上の結果から、本発明による核酸の合成方法におい
て、ターゲットとしてRNA を用いた場合でも、目的の反
応産物が得られることが確認された。 産業上の利用の可能性 本発明による新規なオリゴヌクレオチドとそれを用い
た核酸の合成方法により、複雑な温度制御の不要な１本
鎖上に交互に相補的な塩基配列が連結した核酸の合成方
法が提供される。本発明に基づくオリゴヌクレオチドを
プライマーとして合成される相補鎖は、常にその3'末端
が自身を鋳型とする新たな相補鎖合成の合成起点とな
る。このとき、新たなプライマーのアニールをもたらす
ループの形成を伴い、この部分からの相補鎖合成によっ
て先に合成された自身を鋳型とする相補鎖合成反応の生
成物は再び置換され塩基対結合が可能な状態となる。こ
のようにして得ることができる自身を鋳型として合成さ
れた核酸は、たとえばSDA のような公知の核酸合成方法
との組み合わせによって、それらの核酸合成効率の向上
に貢献する。 更に本発明の望ましい態様によれば、単に公知の核酸
合成方法の効率向上を達成するのみならず、複雑な温度
制御を必要としない、しかも高度な増幅効率を期待で
き、更には高い特異性を達成できる新規な核酸の合成方
法が提供される。すなわち、本発明に基づくオリゴヌク
レオチドを鋳型鎖とその相補鎖に対して適用することに
よって、１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結され
た核酸が連続して合成されるようになる。この反応は、
原理的には合成に必要な出発材料が枯渇するまで続き、
その間にループ部分から合成を開始した新たな核酸を生
成し続ける。こうして、ループにアニールしたオリゴヌ
クレオチドからの伸長が、長い１本鎖核酸（すなわち、
複数組の相補的な塩基配列が連結したもの）の伸長のた
めの3'-OH を供給する鎖置換を行う。一方、長い１本鎖
の3'-OH は自身を鋳型とする相補鎖合成反応を行うこと
によって自身の伸長を達成すると同時に、ループから合
成開始した新たな相補鎖の置換を行う。このような増幅
反応工程が、高い特異性を維持しながら等温条件下で進
行する。 本発明におけるオリゴヌクレオチドは、２つの連続し
た領域が設計どおりに配置されているときにはじめて本
発明による核酸合成反応のためのプライマーとして機能
する。このことが、特異性の維持に大きく貢献する。た
とえばPCR では、２つのプライマーの意図した位置関係
とは無関係に、非特異的なミスアニールにより、非特異
的増幅反応が開始してしまうことと比べれば、本発明で
は高い特異性が期待できることは容易に説明できる。こ
の特徴を利用してSNPs を高い感度で精確に検出するこ
とができる。 本発明の特徴は、このような反応がごく単純な試薬構
成で容易に達成できることにある。たとえば本発明によ
るオリゴヌクレオチドは、特殊な構造を持つとは言えそ
れは塩基配列の選択の問題であって、物質としては単な
るオリゴヌクレオチドである。また、望ましい態様にお
いては、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNA ポリ
メラーゼのみで反応を進めることができる。更に、RNA
を鋳型として本発明を実施する場合には、Bca DNA ポリ
メラーゼのような逆転写酵素活性と鎖置換型のDNA ポリ
メラーゼ活性を併せ持つDNA ポリメラーゼを利用するこ
とによって、全ての酵素反応を単一の酵素によって行う
ことができる。このようなシンプルな酵素反応で高度な
核酸の増幅反応を実現する反応原理はこれまでに知られ
ていない。あるいは、SDA 等の公知の核酸合成反応に適
用するとしても、本発明との組み合わせによって新たな
酵素が必要となるようなことはなく、単に本発明に基づ
くオリゴヌクレオチドを組み合わせるだけで各種反応系
への適応が可能である。したがて、本発明による核酸合
成方法は、コストの点においても有利といえる。 以上述べたように、本発明の核酸の合成方法とそのた
めのオリゴヌクレオチドは、操作性（温度制御不要）、
合成効率の向上、経済性、そして高い特異性という、複
数の困難な課題を同時に解決する新たな原理を提供す
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】 次の工程を繰り返すことによる１本鎖上
に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方
法。 Ａ）3'末端と5'末端において、それぞれ末端領域に相補
的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互い
に相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の間に塩
基対結合が可能となるループが形成される鋳型を提供す
る工程 Ｂ）同一鎖にアニールさせた前記鋳型の3'末端を合成起
点として相補鎖合成を行う工程、 Ｃ）前記ループのうち3'末端側に位置するループ内に相
補的な塩基配列を3'末端に含むオリゴヌクレオチドを、
ループ部分にアニールさせ、これを合成起点として鎖置
換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖
合成を行って、工程Ｂ）で合成された相補鎖を置換して
その3'末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、およ
び Ｄ）工程Ｃ）において3'末端を塩基対結合が可能な状態
とした鎖を工程Ａ）における新たな鋳型とする工程 - 【請求項２】 工程Ｃ）におけるオリゴヌクレオチド
が、その5'側末端に工程Ｂ）において合成起点となった
3'末端に相補的な塩基配列を備えたものである請求項１
に記載の増幅方法。 - 【請求項３】 更に工程Ｃ）におけるオリゴヌクレオチ
ドを合成起点として合成された相補鎖を工程Ａ）におけ
る鋳型とする工程を含む請求項２に記載の増幅方法。 - 【請求項４】 融解温度調整剤の存在下で鎖置換相補鎖
合成反応を行う請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 融解温度調整剤がベタインである請求項
４に記載の方法。 - 【請求項６】 反応液中に0.2〜3.0Mのベタインを存在
させる請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 請求項１〜６に記載のいずれかの増幅方
法を行い、増幅反応生成物が生じたかどうかを観察する
ことにより試料中の標的塩基配列を検出する方法。 - 【請求項８】 増幅反応生成物に、ループに相補的な塩
基配列を含むプローブを加え、両者のハイブリダイズを
観察する請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 プローブが粒子標識されており、ハイブ
リダイズによって生じる凝集反応を観察する請求項８に
記載の方法。 - 【請求項１０】 核酸の検出剤存在下で請求項１〜６に
記載のいずれかの増幅方法を行い、検出剤のシグナル変
化に基づいて増幅反応生成物が生じたかどうかを観察す
る請求項７に記載の方法。 - 【請求項１１】 請求項７に記載の検出方法によって標
的塩基配列の変異を検出する方法であって、増幅対象で
ある塩基配列における変異が、増幅方法を構成するいず
れかの相補鎖合成を妨げるものである方法。
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Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007018257A1 (ja) | 2005-08-10 | 2007-02-15 | Hamamatsu Foundation For Science And Technology Promotion | 大腸癌マーカー検出方法 |
| JP3897805B2 (ja) * | 2003-12-25 | 2007-03-28 | 独立行政法人理化学研究所 | 核酸の増幅法およびこれを利用した変異核酸の検出法 |
| JP2007189984A (ja) * | 2006-01-20 | 2007-08-02 | Toshiba Corp | ハイブリダイゼーションによる核酸の検出方法およびアッセイキット |
| EP1956098A1 (en) | 2007-02-09 | 2008-08-13 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Method of detecting gene mutation |
| EP1988178A2 (en) | 2007-04-26 | 2008-11-05 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleotide primer set and nucleotide probe for detecting genotype of serum amyloid A1(SAA1) |
| US7488581B2 (en) | 2006-03-20 | 2009-02-10 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Method for detecting a target nucleic acid sequence |
| JP2010004855A (ja) * | 2008-06-30 | 2010-01-14 | Q P Corp | オリゴヌクレオチド及びこれをプライマーとして用いたバチルス・コアグランスの検出法 |
| US7728119B2 (en) | 2007-03-28 | 2010-06-01 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleotide primer set and nucleotide probe for detecting genotype of methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) |
| US7803579B2 (en) | 2002-10-29 | 2010-09-28 | Riken | Process for amplifying nucleic acid |
| US7919611B2 (en) | 2007-03-28 | 2011-04-05 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleotide primer set and nucleotide probe for detecting genotype of N-acetyltransferase-2 (NAT2) |
| WO2012029993A1 (en) | 2010-09-02 | 2012-03-08 | Riken | Method of detecting type ii diabetes |
| WO2013035875A1 (ja) * | 2011-09-08 | 2013-03-14 | 独立行政法人理化学研究所 | プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法 |
| WO2013065574A1 (ja) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | 栄研化学株式会社 | 標的核酸の検出法 |
| WO2013129542A1 (ja) | 2012-02-29 | 2013-09-06 | 独立行政法人理化学研究所 | Ｈｌａ－ａ＊３１：０１アレルの検出方法 |
| JP2016189715A (ja) * | 2015-03-31 | 2016-11-10 | 株式会社カネカ | クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を検出するためのプライマー及び方法 |
| WO2018235886A1 (ja) | 2017-06-23 | 2018-12-27 | 栄研化学株式会社 | 核酸検出方法、核酸検出用プライマー及び核酸検出用キット |
Families Citing this family (388)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994003624A1 (en) | 1992-08-04 | 1994-02-17 | Auerbach Jeffrey I | Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules |
| US6261808B1 (en) | 1992-08-04 | 2001-07-17 | Replicon, Inc. | Amplification of nucleic acid molecules via circular replicons |
| US7256020B2 (en) * | 1996-11-29 | 2007-08-14 | Third Wave Technologies, Inc. | Methods and compositions for detecting target sequences |
| US8445664B2 (en) | 1998-06-24 | 2013-05-21 | Enzo Diagnostics, Inc. | Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
| US6743605B1 (en) * | 1998-06-24 | 2004-06-01 | Enzo Life Sciences, Inc. | Linear amplification of specific nucleic acid sequences |
| EP1020534B2 (en) * | 1998-11-09 | 2011-01-05 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Process for synthesizing nucleic acid |
| NZ517121A (en) | 1999-09-13 | 2004-05-28 | Nugen Technologies Inc | Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences |
| US6692918B2 (en) | 1999-09-13 | 2004-02-17 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences |
| ATE317023T1 (de) * | 1999-11-08 | 2006-02-15 | Eiken Chemical | Methode zum nachweis von variationen oder polymorphismen |
| JP4721603B2 (ja) * | 1999-11-08 | 2011-07-13 | 栄研化学株式会社 | 変異および／または多型の検出方法 |
| WO2001077317A1 (en) * | 2000-04-07 | 2001-10-18 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Method of amplifying nucleic acid by using double-stranded nucleic acid as template |
| US7846733B2 (en) | 2000-06-26 | 2010-12-07 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification |
| DE60141087D1 (de) | 2000-06-26 | 2010-03-04 | Nugen Technologies Inc | Methoden und zusammensetzungen zur auf transkription basierenden vervielfältigung von nukleinsäuren |
| US7374913B2 (en) * | 2000-09-19 | 2008-05-20 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Method for synthesizing polynucleotides |
| US20060141452A1 (en) * | 2000-10-27 | 2006-06-29 | Kentaro Nagamine | Method For Synthesizing Single-Stranded Nucleic Acid |
| JP2002171999A (ja) * | 2000-12-08 | 2002-06-18 | Olympus Optical Co Ltd | 核酸増幅反応測定方法及び装置 |
| JP2002171997A (ja) * | 2000-12-08 | 2002-06-18 | Olympus Optical Co Ltd | 核酸増幅反応測定方法及び装置 |
| JP2002171998A (ja) * | 2000-12-08 | 2002-06-18 | Olympus Optical Co Ltd | 核酸増幅反応測定方法及び装置 |
| AU2002228974A1 (en) | 2000-12-13 | 2002-06-24 | Nugen Technologies, Inc | Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof |
| JP2002186481A (ja) * | 2000-12-18 | 2002-07-02 | Eiken Chem Co Ltd | 光学的特性の測定による核酸増幅産物の検出方法 |
| US20050118578A1 (en) * | 2001-02-06 | 2005-06-02 | Takara Bio Inc. | Amplified nucleic acids and immobilized products thereof |
| CA2439074A1 (en) | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for amplification of rna sequences |
| NZ523167A (en) * | 2001-03-09 | 2006-08-31 | Nugen Technologies Inc | Methods, compositions and kits for amplifying RNA sequences of interest which employ an RNA/DNA composite primer |
| JP2002272475A (ja) * | 2001-03-22 | 2002-09-24 | Eiken Chem Co Ltd | 蛍光偏光法による核酸増幅産物の検出方法 |
| JPWO2002090538A1 (ja) * | 2001-05-08 | 2004-08-26 | 栄研化学株式会社 | 核酸を合成する方法 |
| US8137911B2 (en) | 2001-05-22 | 2012-03-20 | Cellscript, Inc. | Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences |
| WO2004059289A2 (en) | 2001-05-22 | 2004-07-15 | Epicentre Technologies | Target-dependent transcription using deletion mutants of n4 rna polymerase |
| JP2002345499A (ja) * | 2001-05-29 | 2002-12-03 | Eiken Chem Co Ltd | 核酸配列を検出する方法及びその方法に使用するキット |
| CA2450397A1 (en) * | 2001-06-12 | 2002-12-19 | Takara Bio Inc. | Method of stabilizing reagent for amplifying or detecting nucleic acid and storage method |
| JP2005052002A (ja) * | 2001-07-06 | 2005-03-03 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | 非環状核酸断片の増幅方法 |
| TWI257426B (en) | 2001-08-20 | 2006-07-01 | Takara Bio Inc | Nucleic acid amplification methods |
| WO2003044177A2 (en) * | 2001-11-19 | 2003-05-30 | Parallele Bioscience, Inc. | Multiplex pcr |
| US20110151438A9 (en) | 2001-11-19 | 2011-06-23 | Affymetrix, Inc. | Methods of Analysis of Methylation |
| AU2003211947A1 (en) | 2002-02-20 | 2003-09-09 | Sysmex Corporation | PRIMERS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION IN DETECTING HOUSEKEEPING GENE mRNA AND TEST METHOD USING THESE PRIMERS |
| EP1510587B1 (en) | 2002-05-21 | 2011-07-13 | Sysmex Corporation | Nucleic acid amplification primers for detecting cytokeratins and examination method with the use of the primers |
| GB0218215D0 (en) * | 2002-08-06 | 2002-09-11 | Tepnel Medical Ltd | Amplification of nucleic acids |
| WO2004016755A2 (en) * | 2002-08-16 | 2004-02-26 | Geneohm Sciences | Amplification of target nucleotide sequence without polymerase chain reaction |
| US20050118616A1 (en) * | 2002-08-16 | 2005-06-02 | Kawashima Tadashi R. | Amplification of target nucleotide sequence without polymerase chain reaction |
| JP4560285B2 (ja) * | 2002-10-02 | 2010-10-13 | 栄研化学株式会社 | 核酸沈澱剤を利用した核酸増幅産物のハイブリダイゼーションアッセイ |
| JP2004154088A (ja) * | 2002-11-08 | 2004-06-03 | Sysmex Corp | Ｃｅａ検出のための核酸増幅用プライマーおよび該プライマーを用いた検査方法 |
| EP1585824A4 (en) | 2002-11-21 | 2008-01-02 | Epict Technologies | PREPARATION AND USE OF SINGLE-STRONG TRANSCRIPTION SUBSTRATES FOR SYNTHESIS OF TARGET SEQUENCES ACCORDING TO TRANSCRIPTION PRODUCTS |
| US7851150B2 (en) * | 2002-12-18 | 2010-12-14 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of small nucleic acids |
| US8206904B2 (en) | 2002-12-18 | 2012-06-26 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acids |
| JP4280519B2 (ja) | 2003-03-07 | 2009-06-17 | アークレイ株式会社 | Ｄｎａ増幅法およびそのためのキット |
| WO2004092418A2 (en) | 2003-04-14 | 2004-10-28 | Nugen Technologies, Inc. | Global amplification using a randomly primed composite primer |
| WO2005031005A2 (en) | 2003-05-19 | 2005-04-07 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, methods and kits for determining the presence of trichomonas vaginalis in a test sample |
| CN1813064B (zh) * | 2003-06-27 | 2011-11-02 | 荣研化学株式会社 | 检测sars冠状病毒的方法 |
| EP1508809B1 (en) * | 2003-08-20 | 2007-02-28 | Sysmex Corporation | Sample analyzer and nucleic acid detector |
| US20050042145A1 (en) | 2003-08-22 | 2005-02-24 | Sysmex Corporation | Container for analyzer, detection container, reaction container and packing container for storing detection container |
| WO2005056790A1 (ja) | 2003-12-10 | 2005-06-23 | Takara Bio Inc. | 核酸の増幅方法 |
| JP4542345B2 (ja) * | 2004-01-15 | 2010-09-15 | シスメックス株式会社 | 分析装置 |
| JP4505230B2 (ja) * | 2004-01-20 | 2010-07-21 | シスメックス株式会社 | 分析装置 |
| JP4632670B2 (ja) * | 2004-01-21 | 2011-02-16 | シスメックス株式会社 | 濁度検出用光学装置及びそれを用いた濁度検出装置 |
| JP4320266B2 (ja) * | 2004-01-22 | 2009-08-26 | シスメックス株式会社 | 分注装置およびそれを備えた分析装置 |
| US20050164375A1 (en) * | 2004-01-23 | 2005-07-28 | Sysmex Corporation | Nucleic acid detection apparatus |
| WO2005087951A2 (en) | 2004-03-05 | 2005-09-22 | Gen-Probe Incorporated | Reagents, methods and kits for use in deactivating nucleic acids |
| JPWO2005093059A1 (ja) * | 2004-03-25 | 2008-02-14 | サッポロビール株式会社 | 酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌検出・識別のためのプライマー及びプライマーセット並びにそれらを用いた検出・識別方法 |
| JP5009787B2 (ja) | 2004-05-07 | 2012-08-22 | ザ・ヘンリー・エム・ジャクソン・ファンデイション・フォー・ジ・アドヴァンスメント・オヴ・ミリタリー・メディシン、インコーポレイテッド | Ｅｒｇ遺伝子を単独でまたは前立腺癌中で過剰発現もしくは過少発現される他の遺伝子と組み合わせて用いる、前立腺癌を診断または治療する方法 |
| JP4791966B2 (ja) | 2004-08-31 | 2011-10-12 | 栄研化学株式会社 | 核酸解析方法 |
| JP2008000002A (ja) * | 2004-09-30 | 2008-01-10 | Sysmex Corp | リブロース２リン酸カルボキシラーゼスモールチェーン１Ａ（ＲＢＣＳ−１Ａ）遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマ、及び内部標準として該遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを用いた検査方法。 |
| JP5019431B2 (ja) * | 2004-10-19 | 2012-09-05 | 学校法人日本大学 | インフルエンザ菌の検出方法、インフルエンザ菌検出用プライマーセット及びインフルエンザ菌検出用キット |
| JP4786548B2 (ja) | 2004-11-01 | 2011-10-05 | 栄研化学株式会社 | Ｈ５型トリインフルエンザウイルスの検出方法 |
| JP5160725B2 (ja) * | 2004-11-02 | 2013-03-13 | シスメックス株式会社 | チップラックおよびチップ組立品 |
| US20080305142A1 (en) * | 2004-12-11 | 2008-12-11 | Cytogenix, Inc. | Cell Free Biosynthesis of High-Quality Nucleic Acid and Uses Thereof |
| US7964413B2 (en) | 2005-03-10 | 2011-06-21 | Gen-Probe Incorporated | Method for continuous mode processing of multiple reaction receptacles in a real-time amplification assay |
| EP1909108B1 (en) | 2005-03-10 | 2019-05-29 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods to perform assays for detecting or quantifiying analytes |
| FR2885140B1 (fr) | 2005-04-29 | 2010-12-31 | Millipore Corp | Procede de detection et de caracterisation de microorgarnismes sur une membrane. |
| NZ599522A (en) | 2005-05-09 | 2013-11-29 | Theranos Inc | Point-of-care fluidic systems and uses thereof |
| WO2006123423A1 (ja) * | 2005-05-20 | 2006-11-23 | Sapporo Breweries Limited | フザリウム属菌検出用プライマー |
| JP4733456B2 (ja) * | 2005-07-26 | 2011-07-27 | シスメックス株式会社 | 前処理の外部精度管理方法、核酸検出処理の外部精度管理方法、検量線作成処理の外部精度管理方法、前処理の外部精度管理コンピュータ、核酸検出処理の外部精度管理コンピュータ、検量線作成処理の外部精度管理コンピュータ、前処理装置、及び核酸検出装置 |
| JP2007043997A (ja) * | 2005-08-11 | 2007-02-22 | Tosoh Corp | 新規な標的核酸の増幅キット |
| JP4926966B2 (ja) | 2005-08-18 | 2012-05-09 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカーＭｓｘ１／２ |
| CA2621146A1 (en) * | 2005-09-06 | 2007-03-15 | Gen-Probe Incorporated | Methods, compositions and kits for isothermal amplification of nucleic acids |
| US7939258B2 (en) * | 2005-09-07 | 2011-05-10 | Nugen Technologies, Inc. | Nucleic acid amplification procedure using RNA and DNA composite primers |
| US8831887B2 (en) * | 2005-10-12 | 2014-09-09 | The Research Foundation For The State University Of New York | Absolute PCR quantification |
| US7910719B2 (en) * | 2005-12-08 | 2011-03-22 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Method of detecting human papilloma virus by using nucleic acid amplification method and nucleic acid chain-immobilized carrier |
| WO2007083766A1 (ja) * | 2006-01-20 | 2007-07-26 | Olympus Corporation | 分子内プローブによる核酸配列の検出方法 |
| JP4580875B2 (ja) | 2006-01-20 | 2010-11-17 | 株式会社東芝 | 核酸検出法のためのプライマーの設計方法 |
| JP4881623B2 (ja) | 2006-01-27 | 2012-02-22 | シスメックス株式会社 | Ｃｅａ核酸増幅用プライマー、プライマーセット、及びがんの診断支援方法 |
| US8741230B2 (en) | 2006-03-24 | 2014-06-03 | Theranos, Inc. | Systems and methods of sample processing and fluid control in a fluidic system |
| US11287421B2 (en) | 2006-03-24 | 2022-03-29 | Labrador Diagnostics Llc | Systems and methods of sample processing and fluid control in a fluidic system |
| CA2649250A1 (en) | 2006-04-11 | 2007-10-25 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | Dopaminergic neuron progenitor cell marker 187a5 |
| WO2007123265A1 (ja) * | 2006-04-19 | 2007-11-01 | Nihon University | 各有莢膜型インフルエンザ菌の検出方法、検出用プライマーセット、 及び検出用キット |
| EP2021506B1 (en) * | 2006-04-28 | 2016-03-16 | Igor Kutyavin | Use of products of pcr amplification carrying elements of secondary structure to improve pcr-based nucleic acid detection |
| ES2700606T3 (es) | 2006-04-28 | 2019-02-18 | Igor Kutyavin | Uso de trifosfatos de desoxinucleósidos modificados en sus bases para mejorar la detección de ácidos nucleicos |
| CN101490278A (zh) | 2006-05-16 | 2009-07-22 | 麒麟麦酒株式会社 | 用于检测德克醇母或酒香酵母的引物组 |
| US11001881B2 (en) | 2006-08-24 | 2021-05-11 | California Institute Of Technology | Methods for detecting analytes |
| AU2007258455B2 (en) | 2006-06-06 | 2013-05-02 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
| JP4918409B2 (ja) | 2006-07-26 | 2012-04-18 | 西川ゴム工業株式会社 | 核酸配列の増幅方法 |
| US8048626B2 (en) | 2006-07-28 | 2011-11-01 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| US11525156B2 (en) | 2006-07-28 | 2022-12-13 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| US9045522B2 (en) | 2006-07-31 | 2015-06-02 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| WO2008016562A2 (en) * | 2006-07-31 | 2008-02-07 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| EP2520935A3 (en) | 2006-08-09 | 2013-02-13 | Homestead Clinical Corporation | Organ-specific proteins and methods of their use |
| US11560588B2 (en) | 2006-08-24 | 2023-01-24 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| US7939299B2 (en) | 2006-08-31 | 2011-05-10 | Toyo Seikan Kaisha, Ltd. | Nucleic acid amplification method |
| US8445238B2 (en) * | 2006-10-04 | 2013-05-21 | Third Wave Technologies, Inc. | Snap-back primers and detectable hairpin structures |
| WO2008044358A1 (fr) * | 2006-10-05 | 2008-04-17 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Ensemble d'amorces destiné à la détection d'une levure saccharomyces |
| US8338109B2 (en) | 2006-11-02 | 2012-12-25 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Predicting cancer outcome |
| JP2008136386A (ja) * | 2006-11-30 | 2008-06-19 | Sapporo Breweries Ltd | ホップ潜在ウイルスの検出方法、検出用プライマーセット及び検出用キット |
| JP2008136389A (ja) | 2006-11-30 | 2008-06-19 | Sapporo Breweries Ltd | アップルモザイクウイルスの検出方法、検出用プライマーセット及び検出用キット |
| JP2008194028A (ja) | 2007-01-15 | 2008-08-28 | Sysmex Corp | 胃がんのリンパ節転移判定方法 |
| US20080182312A1 (en) * | 2007-01-17 | 2008-07-31 | Todd Denison Pack | Stable reagents and kits useful in loop-mediated isothermal amplification (LAMP) |
| JP2008212009A (ja) | 2007-02-28 | 2008-09-18 | Sysmex Corp | Ｄｎａメチル化検出用試料の調製方法 |
| US20100086931A1 (en) | 2007-03-05 | 2010-04-08 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for assaying action of antitumor agent using decrease in gene expression level as index |
| WO2008111464A1 (ja) | 2007-03-05 | 2008-09-18 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | スプライシング異常を指標とする抗ガン剤の作用検定方法 |
| CA2622649C (en) | 2007-03-09 | 2018-04-24 | Riken | Nucleic acid amplification method using primer exhibiting exciton effect |
| US8153064B2 (en) | 2007-03-22 | 2012-04-10 | Doebler Ii Robert W | Systems and devices for isothermal biochemical reactions and/or analysis |
| TWI402348B (zh) | 2007-05-28 | 2013-07-21 | Univ Ehime | 用於偵測瘧原蟲之引子 |
| EP2384432B1 (en) | 2007-06-21 | 2016-12-28 | Gen-Probe Incorporated | Instrument and receptacles for performing processes |
| JP2009000044A (ja) * | 2007-06-21 | 2009-01-08 | Hitachi High-Technologies Corp | 核酸増幅法 |
| JP4551917B2 (ja) * | 2007-07-18 | 2010-09-29 | 株式会社東芝 | ヒトチトクロームｐ４５０（ｃｙｐ）２ｄ６遺伝子変異の検出方法 |
| US8143006B2 (en) * | 2007-08-03 | 2012-03-27 | Igor Kutyavin | Accelerated cascade amplification (ACA) of nucleic acids comprising strand and sequence specific DNA nicking |
| CN104297506B (zh) | 2007-10-02 | 2017-05-03 | 赛拉诺斯股份有限公司 | 模块化现场护理装置及其应用 |
| EP2210941A4 (en) | 2007-10-25 | 2010-11-03 | Riken | ISOTHERMIC AMPLIFICATION PROCEDURE AND DNA POLYMERASE USED THEREOF |
| EP2058406A3 (en) * | 2007-11-06 | 2009-10-28 | Fujifilm Corporation | RNA detection method |
| EP2232259B1 (en) | 2008-01-09 | 2016-10-12 | Keck Graduate Institute | System, apparatus and method for material preparation and/or handling |
| US8034568B2 (en) * | 2008-02-12 | 2011-10-11 | Nugen Technologies, Inc. | Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions |
| US20090215050A1 (en) * | 2008-02-22 | 2009-08-27 | Robert Delmar Jenison | Systems and methods for point-of-care amplification and detection of polynucleotides |
| US7846666B2 (en) | 2008-03-21 | 2010-12-07 | Nugen Technologies, Inc. | Methods of RNA amplification in the presence of DNA |
| JPWO2009119331A1 (ja) * | 2008-03-28 | 2011-07-21 | シスメックス株式会社 | サイトケラチン７のｍＲＮＡの検出用プライマを含む試薬 |
| EP2479287B1 (en) | 2008-05-13 | 2014-07-23 | Gen-Probe Incorporated | Inactivatable target capture oligomers for use in the selective hybridization and capture of target nucleic acid sequences |
| US9074261B2 (en) | 2008-05-28 | 2015-07-07 | Kao Corporation | Method of detecting heat-resistant fungus |
| WO2009143603A1 (en) | 2008-05-28 | 2009-12-03 | Genomedx Biosciences, Inc. | Systems and methods for expression-based discrimination of distinct clinical disease states in prostate cancer |
| US20110076689A1 (en) * | 2008-05-29 | 2011-03-31 | Sysmex Corporation | PRIMER FOR DETECTING TYROSINASE mRNA |
| CN103451285B (zh) | 2008-05-29 | 2015-05-06 | 花王株式会社 | 宛氏拟青霉的检测方法 |
| US10407731B2 (en) | 2008-05-30 | 2019-09-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Biomarker panels for predicting prostate cancer outcomes |
| US20110171649A1 (en) * | 2008-09-10 | 2011-07-14 | Igor Kutyavin | Detection of nucleic acids by oligonucleotide probes cleaved in presence of endonuclease v |
| ES2403756T3 (es) | 2008-10-24 | 2013-05-21 | Epicentre Technologies Corporation | Composiciones de extremo del transposón y métodos para modificar ácidos nucleicos |
| US9080211B2 (en) * | 2008-10-24 | 2015-07-14 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
| US9495515B1 (en) | 2009-12-09 | 2016-11-15 | Veracyte, Inc. | Algorithms for disease diagnostics |
| US10236078B2 (en) | 2008-11-17 | 2019-03-19 | Veracyte, Inc. | Methods for processing or analyzing a sample of thyroid tissue |
| EP2371951A4 (en) | 2008-11-27 | 2012-07-18 | Riken | NOVEL MutS PROTEIN AND ITS USE FOR THE DETERMINATION OF MUTATIONS |
| SG171899A1 (en) | 2008-12-25 | 2011-07-28 | Universal Bio Research Co Ltd | Method for pretreating specimen and method for assaying biological substance |
| WO2010088273A1 (en) * | 2009-01-27 | 2010-08-05 | Qiagen Gaithersburg | Thermophilic helicase dependent amplification technology with endpoint homogenous fluorescent detection |
| US8368882B2 (en) | 2009-01-30 | 2013-02-05 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods for detecting a signal and applying thermal energy to a signal transmission element |
| US8409805B2 (en) * | 2009-02-13 | 2013-04-02 | Asuragen, Inc. | Method of amplification of GC-rich DNA templates |
| US9074258B2 (en) | 2009-03-04 | 2015-07-07 | Genomedx Biosciences Inc. | Compositions and methods for classifying thyroid nodule disease |
| BRPI1013410B1 (pt) | 2009-03-24 | 2020-10-06 | Asuragen, Inc. | Método de analisar se uma sequência de interrupção está presente em pelo menos uma região rica em cgg compreendida por pelo menos um molde em uma amostra |
| EP3360978A3 (en) | 2009-05-07 | 2018-09-26 | Veracyte, Inc. | Methods for diagnosis of thyroid conditions |
| WO2010151705A2 (en) | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Claremont Biosolutions Llc | Capture and elution of bio-analytes via beads that are used to disrupt specimens |
| EP2272980A1 (en) * | 2009-07-09 | 2011-01-12 | Bioesplora SRL | Molecular probes for target nucleic acid detection and quantification |
| EP2272978B1 (en) | 2009-07-10 | 2012-04-18 | Biotrin International Limited | Highly sensitive rapid isothermal method for the detection of point mutations and SNPs |
| EP2455470A4 (en) | 2009-07-17 | 2013-02-27 | Toyo Seikan Kaisha Ltd | PROCESS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION |
| EP2287335A1 (en) | 2009-08-05 | 2011-02-23 | DiaSorin S.p.A. | Highly sensitive rapid isothermal method for the detection of methylation patterns |
| WO2011022427A1 (en) * | 2009-08-18 | 2011-02-24 | Archemix Corp. | Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics |
| US8598327B2 (en) | 2009-08-18 | 2013-12-03 | Baxter International Inc. | Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics |
| CA2770888C (en) | 2009-08-31 | 2020-04-14 | Gen-Probe Incorporated | Dengue virus assay |
| US9914963B2 (en) | 2009-09-28 | 2018-03-13 | Igor Kutyavin | Methods and compositions for detection of nucleic acids based on stabilized oligonucleotide probe complexes |
| US10446272B2 (en) | 2009-12-09 | 2019-10-15 | Veracyte, Inc. | Methods and compositions for classification of samples |
| CA2787327C (en) | 2010-01-22 | 2015-09-15 | Damon Kittredge Getman | Probes for detecting the presence of trichomonas vaginalis in a sample |
| JP2012000031A (ja) | 2010-06-15 | 2012-01-05 | Sysmex Corp | 肺がんのリンパ節転移の検査方法、肺がんのリンパ節転移判定装置およびコンピュータプログラム |
| WO2012003289A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Gen-Probe Incorporated | Method and apparatus for identifying analyte-containing samples using single-read determination of analyte and process control signals |
| AU2011317073B2 (en) | 2010-10-22 | 2016-04-07 | T2 Biosystems, Inc. | NMR systems and methods for the rapid detection of analytes |
| US8563298B2 (en) | 2010-10-22 | 2013-10-22 | T2 Biosystems, Inc. | NMR systems and methods for the rapid detection of analytes |
| WO2012061283A1 (en) | 2010-11-04 | 2012-05-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Rapid molecular assays for specific detection and quantitation of loa loa microfilaremia |
| US20130267443A1 (en) | 2010-11-19 | 2013-10-10 | The Regents Of The University Of Michigan | ncRNA AND USES THEREOF |
| TWI435935B (zh) * | 2010-12-06 | 2014-05-01 | Univ Nat Cheng Kung | 快速檢測標靶核酸片段之套組及方法 |
| JP6126381B2 (ja) | 2010-12-10 | 2017-05-10 | 国立大学法人東京工業大学 | 標的核酸の検出方法及びキット |
| BR112013018656B1 (pt) | 2011-01-21 | 2021-03-02 | Labrador Diagnostics Llc | método para detectar a presença ou concentração de um analito numa amostra de fluido contido num recipiente, e, método de medição da concentração de analito numa amostra de fluido |
| JP6088487B2 (ja) | 2011-04-15 | 2017-03-01 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ | 走査リアルタイムマイクロ流体熱サイクラーと同期熱サイクリング及び走査光学検出の方法 |
| JP5704543B2 (ja) | 2011-06-29 | 2015-04-22 | 株式会社ダナフォーム | 生体試料の前処理方法、ｒｎａの検出方法及び前処理キット |
| GB201112140D0 (en) | 2011-07-14 | 2011-08-31 | Dna Electronics | Nucleic acid amplification |
| US20140170735A1 (en) | 2011-09-25 | 2014-06-19 | Elizabeth A. Holmes | Systems and methods for multi-analysis |
| US8840838B2 (en) | 2011-09-25 | 2014-09-23 | Theranos, Inc. | Centrifuge configurations |
| US9268915B2 (en) | 2011-09-25 | 2016-02-23 | Theranos, Inc. | Systems and methods for diagnosis or treatment |
| US9664702B2 (en) | 2011-09-25 | 2017-05-30 | Theranos, Inc. | Fluid handling apparatus and configurations |
| US9619627B2 (en) | 2011-09-25 | 2017-04-11 | Theranos, Inc. | Systems and methods for collecting and transmitting assay results |
| US8435738B2 (en) | 2011-09-25 | 2013-05-07 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-analysis |
| US8380541B1 (en) | 2011-09-25 | 2013-02-19 | Theranos, Inc. | Systems and methods for collecting and transmitting assay results |
| US9632102B2 (en) | 2011-09-25 | 2017-04-25 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-purpose analysis |
| US8475739B2 (en) | 2011-09-25 | 2013-07-02 | Theranos, Inc. | Systems and methods for fluid handling |
| AU2012312169B2 (en) | 2011-09-21 | 2016-01-14 | Gen-Probe Incorporated | Methods for amplifying nucleic acid using tag-mediated displacement |
| US9250229B2 (en) | 2011-09-25 | 2016-02-02 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-analysis |
| MX344792B (es) | 2011-09-25 | 2017-01-06 | Theranos Inc | Sistemas y métodos para múltiples análisis. |
| US10012664B2 (en) | 2011-09-25 | 2018-07-03 | Theranos Ip Company, Llc | Systems and methods for fluid and component handling |
| US9810704B2 (en) | 2013-02-18 | 2017-11-07 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-analysis |
| US20140295415A1 (en) * | 2011-11-04 | 2014-10-02 | Diagnostics For All, Inc. | Low cost, disposable molecular diagnostic devices |
| EP2791359B1 (en) | 2011-12-13 | 2020-01-15 | Decipher Biosciences, Inc. | Cancer diagnostics using non-coding transcripts |
| ES2705849T3 (es) | 2012-03-29 | 2019-03-26 | Becton Dickinson Co | Acidos nucleicos para la amplificación de ácidos nucleicos |
| CA2869717C (en) | 2012-04-13 | 2022-09-06 | Becton, Dickinson And Company | Reflex testing of samples using residual materials from a prior test |
| JP6519851B2 (ja) | 2012-07-06 | 2019-05-29 | 京都府公立大学法人 | 眼細胞の分化マーカーおよび分化制御 |
| US20140038182A1 (en) | 2012-07-17 | 2014-02-06 | Dna Logix, Inc. | Cooperative primers, probes, and applications thereof |
| ES2759023T3 (es) | 2012-07-20 | 2020-05-07 | Asuragen Inc | Genotipificación completa de FMR1 |
| AU2013202793B2 (en) | 2012-07-31 | 2014-09-18 | Gen-Probe Incorporated | System, method and apparatus for automated incubation |
| ES2945036T3 (es) | 2012-08-16 | 2023-06-28 | Veracyte Sd Inc | Pronóstico del cáncer de próstata mediante biomarcadores |
| MX2015002919A (es) | 2012-09-11 | 2015-08-14 | Theranos Inc | Sistemas y metodos de manejo de informacion que utilizan una firma biologica. |
| WO2014085687A1 (en) | 2012-11-28 | 2014-06-05 | Abwiz Bio, Inc. | Preparation of gene-specific templates for the use in single primer amplification |
| JP6200281B2 (ja) | 2012-11-29 | 2017-09-20 | シスメックス株式会社 | 甲状腺腫瘍の性状の判別を補助する方法およびその方法に用いるマーカーセット |
| MX354033B (es) | 2013-02-18 | 2018-02-09 | Theranos Ip Co Llc | Sistemas y métodos para recolectar y transmitir resultados de ensayos. |
| US9623409B2 (en) | 2013-03-11 | 2017-04-18 | Cue Inc. | Cartridges, kits, and methods for enhanced mixing for detection and quantification of analytes |
| US10545161B2 (en) | 2013-03-11 | 2020-01-28 | Cue Health Inc. | Systems and methods for detection and quantification of analytes |
| IL290168B2 (en) | 2013-03-11 | 2023-03-01 | Cue Health Inc | Systems and methods for the detection and measurement of analytes |
| AU2013202778A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Gen-Probe Incorporated | Systems, methods, and apparatuses for performing automated reagent-based assays |
| AU2013202788B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-10-01 | Gen-Probe Incorporated | Indexing signal detection module |
| EP2971083B1 (en) | 2013-03-15 | 2018-05-02 | Becton, Dickinson and Company | Detection of neisseria gonorrhoeaes |
| ES2908751T3 (es) | 2013-03-15 | 2022-05-03 | Labrador Diagnostics Llc | Amplificación de ácidos nucleicos |
| US9677981B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-06-13 | 3M Innovative Properties Company | Sample concentrator and method of use |
| US11976329B2 (en) | 2013-03-15 | 2024-05-07 | Veracyte, Inc. | Methods and systems for detecting usual interstitial pneumonia |
| EP3587592A1 (en) | 2013-03-15 | 2020-01-01 | Theranos IP Company, LLC | Nucleic acid amplification |
| PL2970922T3 (pl) | 2013-03-15 | 2018-06-29 | Theranos, Inc. | Termostabilna ligaza łącząca tępe końce i sposoby jej wykorzystania |
| CN111366434A (zh) | 2013-03-15 | 2020-07-03 | 赛拉诺斯知识产权有限责任公司 | 用于使样品中的细胞破裂的自动化测定装置 |
| US10450595B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-10-22 | Theranos Ip Company, Llc | Nucleic acid amplification |
| AU2014233150A1 (en) | 2013-03-15 | 2015-09-17 | Theranos Ip Company, Llc | Nucleic acid amplification |
| JP6286419B2 (ja) | 2013-03-26 | 2018-02-28 | 株式会社ニッポンジーン | 遺伝子多型の識別に用いるプライマーとプローブのセットおよびその利用 |
| JP5951545B2 (ja) | 2013-03-29 | 2016-07-13 | シスメックス株式会社 | 検体分析装置、検体分析方法、及びコンピュータプログラム |
| US20160138013A1 (en) | 2013-05-30 | 2016-05-19 | The Regents Of The University Of California | Substantially unbiased amplification of genomes |
| CN103276083B (zh) * | 2013-05-30 | 2014-11-19 | 首都医科大学附属北京友谊医院 | 肺炎支原体检测试剂盒 |
| US10392670B2 (en) | 2013-07-25 | 2019-08-27 | Dch Molecular Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for detecting bacterial contamination |
| EP3029140A4 (en) | 2013-07-30 | 2017-06-28 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Corneal endothelial cell marker |
| WO2015019247A1 (en) * | 2013-08-09 | 2015-02-12 | Genebio Systems, Inc. | Dna amplification via scissor-like structures (dasl) |
| CN107435067B (zh) | 2013-08-09 | 2021-07-09 | 卢米耐克斯公司 | 用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针 |
| SG11201601611WA (en) | 2013-09-06 | 2016-04-28 | Theranos Inc | Systems and methods for detecting infectious diseases |
| JP6118223B2 (ja) | 2013-09-27 | 2017-04-19 | シスメックス株式会社 | 液体吸引装置、検体分析装置、およびチップ収容容器 |
| JP6339787B2 (ja) * | 2013-10-09 | 2018-06-06 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸の分析方法 |
| WO2015058008A2 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-23 | California Institute Of Technology | Enhanced nucleic acid identification and detection |
| EP3063272A2 (en) | 2013-10-30 | 2016-09-07 | Green Life Biotech, LLC | Pathogenesis quantification systems and treatment methods for citrus greening blight |
| JP2015087329A (ja) | 2013-10-31 | 2015-05-07 | シスメックス株式会社 | 吸引部の位置調整方法及び検体処理装置 |
| CN107002117B (zh) | 2013-12-05 | 2021-12-10 | 生捷科技控股公司 | 核酸测序方法 |
| EP3077430A4 (en) | 2013-12-05 | 2017-08-16 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Modified surfaces |
| WO2015085275A2 (en) | 2013-12-05 | 2015-06-11 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Fabrication of patterned arrays |
| US11286519B2 (en) | 2013-12-11 | 2022-03-29 | Accuragen Holdings Limited | Methods and compositions for enrichment of amplification products |
| US11859246B2 (en) | 2013-12-11 | 2024-01-02 | Accuragen Holdings Limited | Methods and compositions for enrichment of amplification products |
| WO2015089333A1 (en) | 2013-12-11 | 2015-06-18 | Accuragen, Inc. | Compositions and methods for detecting rare sequence variants |
| WO2017062863A1 (en) | 2015-10-09 | 2017-04-13 | Accuragen Holdings Limited | Methods and compositions for enrichment of amplification products |
| EP3094753B1 (en) | 2014-01-15 | 2019-10-16 | Abbott Laboratories | Covered sequence conversion dna and detection methods |
| CN103789436B (zh) * | 2014-01-30 | 2015-09-30 | 思博奥科生物信息科技（北京）有限公司 | 一种基于人工修饰引物的定量突变检测系统 |
| US11060139B2 (en) | 2014-03-28 | 2021-07-13 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods for sequencing nucleic acids |
| CN106471131B (zh) | 2014-03-31 | 2025-08-05 | 达纳福股份有限公司 | 荧光性标记单链核酸及其用途 |
| USD745423S1 (en) | 2014-05-12 | 2015-12-15 | Cue Inc. | Automated analyzer test cartridge and sample collection device for analyte detection |
| WO2015183837A1 (en) | 2014-05-27 | 2015-12-03 | Brian Haynes | Compositions, methods, and uses related to ntrk2-tert fusions |
| WO2015183836A1 (en) | 2014-05-27 | 2015-12-03 | Brian Haynes | Compositions, methods, and uses related to ntrk2-tert fusions |
| US10093918B2 (en) | 2014-06-04 | 2018-10-09 | Lucigen Corporation | Sample collection and analysis devices |
| US10017759B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-07-10 | Illumina, Inc. | Library preparation of tagged nucleic acid |
| US12297505B2 (en) | 2014-07-14 | 2025-05-13 | Veracyte, Inc. | Algorithms for disease diagnostics |
| CN106661600B (zh) | 2014-07-16 | 2021-04-06 | 唐恩生物科技股份有限公司 | 用于扩增核酸样品的等温方法 |
| US9982291B2 (en) | 2014-08-11 | 2018-05-29 | Luminex Corporation | Probes for improved melt discrimination and multiplexing in nucleic acid assays |
| ES2759339T3 (es) | 2014-10-14 | 2020-05-08 | Abbott Lab | Conversión de secuencia y ADN amplificador de señal que tiene ácidos nucleicos bloqueados y métodos de detección que usan los mismos |
| JP6491458B2 (ja) | 2014-10-31 | 2019-03-27 | シスメックス株式会社 | 核酸増幅方法 |
| EP3215260B1 (en) | 2014-11-03 | 2020-01-15 | Tangen Biosciences Inc. | Apparatus and method for cell, spore, or virus capture and disruption |
| JP7356788B2 (ja) | 2014-11-05 | 2023-10-05 | ベラサイト インコーポレイテッド | 機械学習および高次元転写データを使用して経気管支生検における特発性肺線維症を診断するシステムおよび方法 |
| CN107109495B (zh) | 2014-11-11 | 2021-12-24 | 伊鲁米那股份有限公司 | 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增 |
| ES2791280T3 (es) | 2014-12-24 | 2020-11-03 | Abbott Lab | Método de detección, composición y kit basados en reacciones en cascada de ADN amplificador de señal con extensión de la diana |
| US11326213B2 (en) | 2015-01-21 | 2022-05-10 | T2 Biosystems, Inc. | NMR methods and systems for the rapid detection of tick-borne pathogens |
| US10724091B1 (en) | 2015-02-10 | 2020-07-28 | National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc | Endpoint detection of amplified nucleic acids |
| US9708647B2 (en) | 2015-03-23 | 2017-07-18 | Insilixa, Inc. | Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays |
| WO2016168755A1 (en) | 2015-04-17 | 2016-10-20 | Distributed Bio, Inc. | Method for mass humanization of non-human antibodies |
| ES2961374T3 (es) | 2015-04-24 | 2024-03-11 | Atila Biosystems Incorporated | Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada |
| DK4166678T3 (da) | 2015-04-24 | 2024-08-12 | Becton Dickinson Co | Multiplex-detektion af vulvovaginal candiasis, trichomoniasis og bakteriel vaginosis |
| JP6822974B2 (ja) | 2015-05-29 | 2021-01-27 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | シトラコン酸無水物によって微生物を不活性化する方法 |
| US10260090B2 (en) | 2015-07-16 | 2019-04-16 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Accelerated isothermal amplification of DNA |
| BR122020004273B1 (pt) | 2015-07-17 | 2022-11-29 | Cue Health Inc | Cartucho de análise de amostras |
| CA2992616C (en) | 2015-07-23 | 2023-01-03 | Asuragen, Inc. | Methods, compositions, kits, and uses for analysis of nucleic acids comprising repeating a/t-rich segments |
| US9499861B1 (en) | 2015-09-10 | 2016-11-22 | Insilixa, Inc. | Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification |
| US12163184B2 (en) | 2015-12-03 | 2024-12-10 | Accuragen Holdings Limited | Methods and compositions for forming ligation products |
| CA3011991A1 (en) | 2016-01-21 | 2017-07-27 | T2 Biosystems, Inc. | Rapid antimicrobial susceptibility testing using high-sensitivity direct detection methods |
| EP3416658B1 (en) | 2016-02-15 | 2023-03-22 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Human functional corneal endothelial cell and application thereof |
| WO2017155858A1 (en) | 2016-03-07 | 2017-09-14 | Insilixa, Inc. | Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension |
| US10859579B2 (en) | 2016-03-31 | 2020-12-08 | William Beaumont Hospital | Methods for detecting, diagnosing and treating ulcerative interstitial cystitis |
| AU2017250205A1 (en) | 2016-04-14 | 2018-11-22 | T2 Biosystems, Inc. | Methods and systems for amplification in complex samples |
| CN109477137B (zh) | 2016-05-11 | 2023-05-30 | 伊鲁米那股份有限公司 | 使用argonaute系统的多核苷酸富集和扩增 |
| CN109511265B (zh) | 2016-05-16 | 2023-07-14 | 安可济控股有限公司 | 通过链鉴定改进测序的方法 |
| JPWO2017212904A1 (ja) * | 2016-06-06 | 2019-04-11 | 国立大学法人 宮崎大学 | 複数のプライマーセットを組み合わせたｌａｍｐ法を用いたアフリカ豚コレラウイルスの迅速検出法 |
| WO2018035170A1 (en) | 2016-08-15 | 2018-02-22 | Accuragen Holdings Limited | Compositions and methods for detecting rare sequence variants |
| WO2018039490A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | Genomedx Biosciences, Inc. | Use of genomic signatures to predict responsiveness of patients with prostate cancer to post-operative radiation therapy |
| CA3029274A1 (en) | 2016-09-15 | 2018-03-22 | Sophie Laurenson | Devices and methods for sample analysis |
| US10724089B2 (en) | 2016-10-06 | 2020-07-28 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Spatial molecular analysis of tissue |
| EP4095263A1 (en) | 2017-01-06 | 2022-11-30 | Editas Medicine, Inc. | Methods of assessing nuclease cleavage |
| US11208697B2 (en) | 2017-01-20 | 2021-12-28 | Decipher Biosciences, Inc. | Molecular subtyping, prognosis, and treatment of bladder cancer |
| WO2018140540A1 (en) | 2017-01-25 | 2018-08-02 | Cue Health Inc. | Systems and methods for enhanced detection and quantification of analytes |
| AU2018230784A1 (en) | 2017-03-09 | 2019-10-10 | Decipher Biosciences, Inc. | Subtyping prostate cancer to predict response to hormone therapy |
| JP6924600B2 (ja) | 2017-04-10 | 2021-08-25 | シスメックス株式会社 | 測定方法、測定装置、プログラム、演算式の取得方法および定性判定結果の表示方法 |
| US11366116B1 (en) | 2017-04-12 | 2022-06-21 | National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc | Real time autonomous surveillance of pathogens |
| CN110809495A (zh) | 2017-04-26 | 2020-02-18 | 伯克利之光生命科技公司 | 使用具有优化电润湿表面的微流体装置的生物处理系统和方法 |
| EP4124862A1 (fr) | 2017-05-05 | 2023-02-01 | bioMérieux | Procédé de détection d'une réponse cellulaire immune |
| EP3622087A4 (en) | 2017-05-12 | 2021-06-16 | Decipher Biosciences, Inc. | GENETIC SIGNATURES FOR PREDICTING PROSTATE CANCER METASTASIS AND IDENTIFYING TUMOR VIRULENCE |
| US10914729B2 (en) | 2017-05-22 | 2021-02-09 | The Trustees Of Princeton University | Methods for detecting protein binding sequences and tagging nucleic acids |
| US11217329B1 (en) | 2017-06-23 | 2022-01-04 | Veracyte, Inc. | Methods and systems for determining biological sample integrity |
| WO2019073049A1 (en) | 2017-10-12 | 2019-04-18 | Danmarks Tekniske Universitet | ISOTHERMIC AMPLIFICATION IN SOLID PHASE |
| AR113802A1 (es) | 2017-10-27 | 2020-06-10 | Juno Diagnostics Inc | Dispositivos, sistemas y métodos para la biopsia líquida de un volumen ultra bajo |
| US10724017B1 (en) | 2017-12-06 | 2020-07-28 | Cepheid | Inhibition of DNA polymerases by uracil-DNA glycosylase-cleavable oligonucleotide ligands |
| US10689629B1 (en) | 2017-12-06 | 2020-06-23 | Cepheid | Inhibition of nucleic acid polymerases by endonuclease V-cleavable circular oligonucleotide ligands |
| US10724083B1 (en) | 2017-12-06 | 2020-07-28 | Cepheid | Inhibition of nucleic acid polymerases by endonuclease V-cleavable oligonucleotide ligands |
| EP3724322A1 (en) | 2017-12-14 | 2020-10-21 | Medicinal Genomics Corporation | Methods and kits for classifying cannabinoid production in cannabis plants |
| ES2978313T3 (es) | 2018-02-05 | 2024-09-10 | Syngenta Crop Protection Ag | Procedimientos para detectar hongos en hierba de césped con un ensayo LAMP que comprende conjuntos de cebadores novedosos |
| JP7176682B2 (ja) | 2018-02-22 | 2022-11-22 | 佐藤製薬株式会社 | 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法 |
| US11203782B2 (en) | 2018-03-29 | 2021-12-21 | Accuragen Holdings Limited | Compositions and methods comprising asymmetric barcoding |
| FR3080185A1 (fr) | 2018-04-16 | 2019-10-18 | Biomerieux | Evaluation du risque de complication chez un patient suspecte d'avoir une infection ayant un score sofa inferieur a deux |
| EP3789504A4 (en) | 2018-04-20 | 2021-12-29 | Epigeneron, Inc. | Method for detecting difference in reference sequence in target nucleic acid region |
| CN112601823A (zh) | 2018-06-12 | 2021-04-02 | 安可济控股有限公司 | 用于形成连接产物的方法和组合物 |
| FR3085689A1 (fr) | 2018-09-12 | 2020-03-13 | Biomerieux | Procede pour determiner in vitro ou ex vivo le statut immunitaire d'un individu |
| EP3814532A1 (fr) | 2018-06-29 | 2021-05-05 | bioMérieux | Procédé pour déterminer in vitro ou ex vivo le statut immunitaire d'un individu |
| EP3841223A1 (en) | 2018-08-08 | 2021-06-30 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium |
| WO2020068983A1 (en) | 2018-09-25 | 2020-04-02 | Co-Diagnostics, Inc. | Allele-specific design of cooperative primers for improved nucleic acid variant genotyping |
| US20220033879A1 (en) | 2018-11-28 | 2022-02-03 | Keygene N.V. | Targeted enrichment by endonuclease protection |
| JP7499767B2 (ja) | 2018-12-07 | 2024-06-14 | エレメント バイオサイエンシーズ，インク． | フローセルデバイスおよびその使用 |
| WO2020148610A1 (en) | 2019-01-15 | 2020-07-23 | 3M Innovative Properties Company | Loop-mediated isothermal amplification primers for shiga toxin producing e. coli (stec) detection |
| AU2020225760A1 (en) | 2019-02-21 | 2021-08-19 | Keygene N.V. | Genotyping of polyploids |
| EP3937780A4 (en) | 2019-03-14 | 2022-12-07 | InSilixa, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR TIME RESOLVED FLUORESCENCE-BASED DETECTION |
| EP3708678A1 (en) | 2019-03-15 | 2020-09-16 | Adisseo France S.A.S. | Process for identifying a stress state in a subject |
| US20220162591A1 (en) | 2019-03-27 | 2022-05-26 | Juno Diagnostics, Inc. | Optimized ultra-low volume liquid biopsy methods, systems, and devices |
| CN113646007B (zh) | 2019-03-29 | 2024-08-23 | 希森美康株式会社 | 新人工核酸、其制造方法及用途 |
| AR120629A1 (es) | 2019-07-23 | 2022-03-02 | Laboratorio Pablo Cassara S R L | Kit de diagnóstico de fundamento molecular para la detección de secuencias nucleotídicas, y métodos para detectar agentes infecciosos usando dicho kit |
| JP2021019581A (ja) * | 2019-07-25 | 2021-02-18 | 株式会社リコー | 標準核酸試料調製用鋳型核酸分子 |
| CA3147077A1 (en) | 2019-08-05 | 2021-02-11 | David Ruff | Method and apparatus for single-cell analysis for determining a cell trajectory |
| JP7742830B2 (ja) | 2019-08-23 | 2025-09-22 | ジェン－プローブ・インコーポレーテッド | Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍを検出するための組成物、方法、およびキット |
| FR3101358A1 (fr) | 2019-09-27 | 2021-04-02 | Bioaster | Procédé pour déterminer le risque de survenue d’une infection associée aux soins chez un patient |
| EP4038202A1 (fr) | 2019-10-01 | 2022-08-10 | Biomérieux | Procédé pour déterminer la capacité d'un individu à répondre à un stimulus |
| FR3101423A1 (fr) | 2019-10-01 | 2021-04-02 | bioMérieux | Procédé pour déterminer la capacité d’un individu à répondre à un stimulus |
| SG10201910254YA (en) * | 2019-11-04 | 2021-06-29 | Denka Company Ltd | Nucleic Acid Detection Method Using Lamp And Probe Detection |
| US20230257813A1 (en) * | 2019-11-15 | 2023-08-17 | Public University Corporation Yokohama City University | Sensitive Detection Method for Undifferentiated Marker Genes |
| WO2021116371A1 (en) | 2019-12-12 | 2021-06-17 | Keygene N.V. | Semi-solid state nucleic acid manipulation |
| CA3161280A1 (en) | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Rene Cornelis Josephus Hogers | Next-generation sequencing library preparation using covalently closed nucleic acid molecule ends |
| FR3107282B1 (fr) | 2020-02-14 | 2025-01-03 | Enalees | Trousses et procédés pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’échantillons complexes |
| CN115103919A (zh) | 2020-02-17 | 2022-09-23 | 3M创新有限公司 | 用于副溶血弧菌检测的环介导的等温扩增引物及其用途 |
| WO2021172370A1 (ja) | 2020-02-27 | 2021-09-02 | 栄研化学株式会社 | 一本鎖ｒｎａウイルスを検出する方法 |
| CN115176036A (zh) | 2020-03-05 | 2022-10-11 | 荣研化学株式会社 | 冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测方法 |
| EP3878971B1 (fr) | 2020-03-10 | 2024-12-04 | Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives | Procédé pour détecter et éventuellement quantifier un analyte avec un oligonucléotide à double structure tige-boucle |
| FR3108124B1 (fr) | 2020-03-10 | 2025-02-28 | Commissariat Energie Atomique | Procédé pour détecter et éventuellement quantifier un analyte avec un oligonucléotide à double structure tige-boucle et ledit oligonucléotide |
| WO2021183921A1 (en) | 2020-03-12 | 2021-09-16 | New England Biolabs, Inc. | A rapid diagnostic test for lamp |
| US11345970B2 (en) | 2020-03-12 | 2022-05-31 | New England Biolabs, Inc. | Rapid diagnostic test for LAMP |
| US11732315B2 (en) | 2020-03-12 | 2023-08-22 | New England Biolabs, Inc. | Rapid diagnostic test for lamp |
| US10968493B1 (en) | 2020-03-12 | 2021-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Rapid diagnostic test using colorimetric LAMP |
| MX2022011362A (es) | 2020-03-13 | 2023-02-22 | Uh Oh Labs Inc | Cebador en bucle y metodo de bucle-de-bucle para detectar acido nucleico objetivo. |
| CA3172238A1 (en) | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Dalia Dhingra | Single cell workflow for whole genome amplification |
| US11149320B1 (en) | 2020-03-31 | 2021-10-19 | Diasorin S.P.A. | Assays for the detection of SARS-CoV-2 |
| CA3175648A1 (en) | 2020-04-30 | 2021-11-04 | Alcino Orfeu De Leao E Flores | Method and portable device for detection of nucleic sequences in suspected coronavirus samples |
| CA3177886A1 (en) | 2020-05-05 | 2021-11-11 | Miron TOKARSKI | Diagnostic primers, kits and methods for viral detection |
| US20240052436A1 (en) | 2020-06-12 | 2024-02-15 | Sherlock Biosciences | Crispr-based sars-cov-2 detection |
| FR3112209A1 (fr) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Procédé pour déterminer le risque de complication chez un patient |
| FR3112210A1 (fr) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Procédé pour déterminer le risque de survenue d’une infection associée aux soins chez un patient |
| FR3112211A1 (fr) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Procédé pour déterminer le risque de survenue d’une infection associée aux soins chez un patient |
| FR3112207A1 (fr) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Procédé pour déterminer le risque de survenue d’une infection associée aux soins chez un patient |
| FR3112208A1 (fr) | 2020-07-06 | 2022-01-07 | bioMérieux | Procédé pour déterminer le risque de survenue d’une infection associée aux soins chez un patient |
| US11898197B2 (en) | 2020-07-30 | 2024-02-13 | Wainamics, Inc. | System and self-metering cartridges for point of care bioassays |
| US11904314B2 (en) | 2020-07-30 | 2024-02-20 | Wainamics, Inc. | System and self-metering cartridges for point of care bioassays |
| US12428674B2 (en) | 2020-07-30 | 2025-09-30 | Wainamics, Inc. | System and self-metering cartridges for point of care bioassays |
| EP4110945A2 (en) | 2020-08-21 | 2023-01-04 | New England Biolabs, Inc. | A rapid diagnostic test for lamp |
| US12110542B2 (en) | 2020-09-10 | 2024-10-08 | University Of Connecticut | Isothermal amplification |
| WO2022065413A1 (ja) | 2020-09-25 | 2022-03-31 | 株式会社理研ジェネシス | 新規人工核酸、その製造方法及び用途 |
| JP2023543602A (ja) | 2020-10-06 | 2023-10-17 | キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ | 標的化された配列付加 |
| US20230374588A1 (en) | 2020-10-08 | 2023-11-23 | National Center For Global Health And Medicine | One or more kinds of hla gene primers |
| EP3992300A1 (en) | 2020-10-30 | 2022-05-04 | Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO | Sample pre-treatment for isothermal amplification |
| CN116964226A (zh) | 2020-11-05 | 2023-10-27 | 贝克顿迪金森公司 | 副溶血弧菌的快速鉴定和分型 |
| WO2022095921A1 (en) | 2020-11-05 | 2022-05-12 | Becton, Dickinson And Company | Multiplex detection and typing of vibrio cholerae |
| AU2021373166A1 (en) | 2020-11-05 | 2023-05-11 | Becton, Dickinson And Company | Multiplex detection of bacterial respiratory pathogens |
| WO2022101259A1 (en) | 2020-11-10 | 2022-05-19 | MultiplexDX, s.r.o. | Loop mediated isothermal nucleic acid amplification (lamp) using lna-modified primers and a metal-based colorimetric method for detecting an amplification product |
| WO2022106795A1 (fr) | 2020-11-20 | 2022-05-27 | bioMérieux | Procédé de classification d'un individu |
| WO2022112316A1 (en) | 2020-11-24 | 2022-06-02 | Keygene N.V. | Targeted enrichment using nanopore selective sequencing |
| US20240093288A1 (en) | 2020-11-25 | 2024-03-21 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Ribosomal profiling in single cells |
| JP6972291B1 (ja) | 2020-12-24 | 2021-11-24 | 栄研化学株式会社 | 核酸増幅方法、核酸増幅方法用プライマーセット、プローブ、及びキット |
| US12390808B2 (en) | 2021-01-12 | 2025-08-19 | Definitive Biotechnologies Llc | Device and method for detecting nucleic acids in biological samples |
| US20240392394A1 (en) | 2021-01-25 | 2024-11-28 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences |
| US11788129B2 (en) | 2021-02-23 | 2023-10-17 | Industrial Technology Research Institute | Nucleic acid detection kit and nucleic acid detection method |
| US20240167020A1 (en) | 2021-03-09 | 2024-05-23 | Illumina, Inc. | Analyzing expression of protein-coding variants in cells |
| WO2022192186A1 (en) | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Illumina, Inc. | Genomic library preparation and targeted epigenetic assays using cas-grna ribonucleoproteins |
| WO2022203748A1 (en) | 2021-03-23 | 2022-09-29 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for variant-resistant detection of target viral sequences |
| WO2022226870A1 (zh) * | 2021-04-29 | 2022-11-03 | 中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院 | 恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用 |
| FR3125065A1 (fr) | 2021-07-08 | 2023-01-13 | bioMérieux | Procédé et kit de détection d’un virus respiratoire réplicatif |
| CN118339310A (zh) | 2021-08-02 | 2024-07-12 | 生命科技股份有限公司 | 用于检测核酸序列负荷的组合物、试剂盒和方法 |
| EP4381094B1 (en) | 2021-08-03 | 2025-07-02 | Wageningen Universiteit | Argonaute-based nucleic acid detection system |
| AU2022328378A1 (en) | 2021-08-11 | 2024-01-18 | Illumina, Inc. | Detection of analytes using targeted epigenetic assays, proximity-induced tagmentation, strand invasion, restriction, or ligation |
| FR3126983A1 (fr) | 2021-09-15 | 2023-03-17 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Oligonucléotide à double structure tige-boucle et utilisation dans la détection d’analytes d’intérêt |
| CN118414438A (zh) | 2021-10-20 | 2024-07-30 | 生命科技公司 | 使用内部定量标准物定量核酸序列的组合物、试剂盒和方法 |
| WO2023081221A1 (en) | 2021-11-02 | 2023-05-11 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for reducing master mix contamination |
| KR20230078548A (ko) | 2021-11-24 | 2023-06-02 | 주식회사 위즈바이오솔루션 | 루프-매개 등온 증폭 방법에서 다중 검출을 위한 형광 표지 물질 프라이머 셋트 및 이를 이용한 분자 진단 방법 |
| JP2025500496A (ja) | 2021-12-24 | 2025-01-09 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | Ｌａｍｐ増幅産物の改良された検出 |
| JPWO2023127857A1 (ja) | 2021-12-27 | 2023-07-06 | ||
| FR3131315B1 (fr) | 2021-12-27 | 2025-08-29 | Commissariat Energie Atomique | Oligonucléotide linéaire et utilisation dans la détection d’analytes d’intérêt |
| WO2024005458A1 (ko) | 2022-06-27 | 2024-01-04 | 주식회사 씨젠 | 베타-하이드록시산을 이용한 타겟 핵산의 증폭 방법 |
| CN119698486A (zh) | 2022-06-29 | 2025-03-25 | 阿克托姆有限责任公司 | 检测单细胞中的生物分子 |
| FR3139579A1 (fr) | 2022-09-09 | 2024-03-15 | bioMérieux | Procédé de détection in vitro ou ex vivo d’un statut immunodéprimé chez un sujet |
| WO2024054925A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-14 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences |
| EP4622974A1 (en) | 2022-11-22 | 2025-10-01 | bioMérieux | New nucleic acid binding compounds and uses |
| WO2024121354A1 (en) | 2022-12-08 | 2024-06-13 | Keygene N.V. | Duplex sequencing with covalently closed dna ends |
| WO2024133893A1 (en) | 2022-12-22 | 2024-06-27 | Keygene N.V. | Nucleotide sequencing data compression |
| FR3144165A1 (fr) | 2022-12-27 | 2024-06-28 | Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives | Méthode pour contrôler la qualité d’une amplification lamp et kit utilisé a cet effet |
| WO2024148013A1 (en) | 2023-01-02 | 2024-07-11 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral sequences |
| US20240254568A1 (en) | 2023-01-27 | 2024-08-01 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for detecting sti pathogen sequences |
| WO2024170798A1 (fr) | 2023-02-17 | 2024-08-22 | Naos Institute Of Life Science | Procede de selection d'un compose ecobiologique apte a augmenter le seuil de tolerance de la peau |
| WO2024209000A1 (en) | 2023-04-04 | 2024-10-10 | Keygene N.V. | Linkers for duplex sequencing |
| WO2024218190A1 (en) | 2023-04-18 | 2024-10-24 | Uniqure Biopharma B.V. | Generation of adeno-associated virus capsid libraries for insect cells |
| WO2025009968A1 (en) | 2023-07-03 | 2025-01-09 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Methods for specific quantitation of the inducible hiv reservoir |
| EP4488391A1 (en) | 2023-07-04 | 2025-01-08 | Nederlandse Organisatie voor toegepast-natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO | Methods and means for detection of legionella |
| JP2025023671A (ja) | 2023-08-04 | 2025-02-17 | シスメックス株式会社 | Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、試薬組成物及び核酸増幅方法 |
| WO2025111147A1 (en) | 2023-11-21 | 2025-05-30 | Abbott Laboratories | Two-dimensional matrix droplet array |
| WO2025141105A1 (en) | 2023-12-27 | 2025-07-03 | bioMérieux | Specific probes for the detection of nucleic acids, methods and uses |
| WO2025172242A1 (en) | 2024-02-13 | 2025-08-21 | bioMérieux | Method of assessing the risk of death of a patient |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996001327A1 (fr) * | 1994-07-04 | 1996-01-18 | Labimap S.A. | Methode d'amplification de sequences d'acides nucleiques |
| WO1996031622A1 (en) * | 1995-04-07 | 1996-10-10 | Oxford Gene Technology Limited | Detecting dna sequence variations |
| WO1997004131A1 (en) * | 1995-07-21 | 1997-02-06 | Forsyth Dental Infirmary For Children | Single primer amplification of polynucleotide hairpins |
| JPH09168400A (ja) * | 1995-12-20 | 1997-06-30 | Sekisui Chem Co Ltd | 核酸の定量方法 |
| JPH10510158A (ja) * | 1994-12-09 | 1998-10-06 | ガメラ・バイオサイエンス・コーポレイション | 磁気サイクル反応を行うための装置 |
| JP2000037194A (ja) * | 1998-06-24 | 2000-02-08 | Enzo Diagnostics Inc | 核酸を増幅するため、核酸配列のための終結後標識プロセス、および減少した熱力学安定性を有する核酸を生成するための新規の方法 |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6197563B1 (en) | 1985-03-28 | 2001-03-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US5104791A (en) | 1988-02-09 | 1992-04-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Particle counting nucleic acid hybridization assays |
| JP2650159B2 (ja) | 1988-02-24 | 1997-09-03 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | 核酸増幅方法 |
| DE4010465A1 (de) | 1990-03-31 | 1991-10-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen vervielfaeltigung von nukleinsaeuretemplates und zur bestimmung von nukleinsaeuren |
| US5595891A (en) | 1990-07-19 | 1997-01-21 | Behringwerke Ag | Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification |
| US5455166A (en) * | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| US5525462A (en) | 1991-05-02 | 1996-06-11 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Nucleic acid sequence amplification method, detection method, and reagent kit therefor |
| US5714323A (en) * | 1991-08-30 | 1998-02-03 | The University Of Medecine And Dentistry Of New Jersey | Over expression of single-stranded molecules |
| US5474796A (en) * | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
| EP0549107B1 (en) * | 1991-10-11 | 1997-12-29 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification and phosphorothioate-containing oligonucleotides as primers in nucleic acid amplification |
| US5612199A (en) | 1991-10-11 | 1997-03-18 | Behringwerke Ag | Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification |
| US5270184A (en) | 1991-11-19 | 1993-12-14 | Becton, Dickinson And Company | Nucleic acid target generation |
| JPH08503843A (ja) | 1992-04-27 | 1996-04-30 | リサーチ コーポレーション テクノロジーズ インコーポレーテッド | ウレアプラズマウレアリチカムの検出用オリゴヌクレオチド及び核酸 |
| CA2167838C (en) | 1993-07-23 | 1999-11-23 | Thomas B. Ryder | Methods for enhancing nucleic acid amplification |
| FR2708288B1 (fr) * | 1993-07-26 | 1995-09-01 | Bio Merieux | Procédé d'amplification d'acides nucléiques par transcription utilisant le déplacement, réactifs et nécessaire pour la mise en Óoeuvre de ce procédé. |
| CA2145750A1 (en) | 1993-08-18 | 1995-02-23 | Michael J. Conrad | Applications of fluorescent n-nucleosides and fluorescent structural analogs of n-nucleosides |
| US5547861A (en) * | 1994-04-18 | 1996-08-20 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acid amplification |
| US5648211A (en) | 1994-04-18 | 1997-07-15 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification using thermophilic enzymes |
| FR2726277B1 (fr) * | 1994-10-28 | 1996-12-27 | Bio Merieux | Oligonucleotide utilisable comme amorce dans une methode d'amplification basee sur une replication avec deplacement de brin |
| US5665545A (en) | 1994-11-28 | 1997-09-09 | Akzo Nobel N.V. | Terminal repeat amplification method |
| US6270962B1 (en) | 1995-01-30 | 2001-08-07 | The Regents Of The University Of California | Methods for the elimination of DNA sequencing artifacts |
| US5674683A (en) | 1995-03-21 | 1997-10-07 | Research Corporation Technologies, Inc. | Stem-loop and circular oligonucleotides and method of using |
| AT402203B (de) | 1995-06-13 | 1997-03-25 | Himmler Gottfried Dipl Ing Dr | Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren |
| US5888731A (en) * | 1995-08-30 | 1999-03-30 | Visible Genetics Inc. | Method for identification of mutations using ligation of multiple oligonucleotide probes |
| US5866331A (en) | 1995-10-20 | 1999-02-02 | University Of Massachusetts | Single molecule detection by in situ hybridization |
| US5972618A (en) * | 1997-08-28 | 1999-10-26 | Bloch; Will | Detection of mutations in nucleic acids by chemical cleavage |
| US7067117B1 (en) | 1997-09-11 | 2006-06-27 | Cambridge University Technical Services, Ltd. | Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response |
| US6794133B1 (en) | 1997-12-11 | 2004-09-21 | The General Hospital Corporation | Broad range PCR amplification techniques |
| JP3115270B2 (ja) * | 1997-12-19 | 2000-12-04 | コナミ株式会社 | ゲームシステムおよびゲーム用プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体 |
| GB9812768D0 (en) | 1998-06-13 | 1998-08-12 | Zeneca Ltd | Methods |
| EP1020534B2 (en) * | 1998-11-09 | 2011-01-05 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Process for synthesizing nucleic acid |
| WO2001077317A1 (en) | 2000-04-07 | 2001-10-18 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Method of amplifying nucleic acid by using double-stranded nucleic acid as template |
| CA2504234C (en) | 2002-10-29 | 2011-09-13 | Riken | Process for amplifying nucleic acids |
-
1999
- 1999-11-08 EP EP99954435A patent/EP1020534B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-08 DE DE69940623T patent/DE69940623D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-08 DE DE69937223T patent/DE69937223T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-08 ES ES07014809T patent/ES2320814T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-08 US US09/530,061 patent/US6410278B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-08 ES ES09000525T patent/ES2369818T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-08 EP EP09000525A patent/EP2045337B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-08 WO PCT/JP1999/006213 patent/WO2000028082A1/ja active IP Right Grant
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- 1999-11-08 EP EP10011291A patent/EP2287338B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-04-14 MY MYPI20001598A patent/MY117621A/en unknown
- 2000-04-14 MY MYPI20032673A patent/MY137889A/en unknown
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-
2002
- 2002-04-24 US US10/132,561 patent/US6974670B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-02-19 US US10/782,040 patent/US7494790B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-04-23 JP JP2007113523A patent/JP4139424B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-12-09 US US12/331,196 patent/US9909168B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2016
- 2016-12-28 US US15/392,758 patent/US20170107568A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996001327A1 (fr) * | 1994-07-04 | 1996-01-18 | Labimap S.A. | Methode d'amplification de sequences d'acides nucleiques |
| JPH10510158A (ja) * | 1994-12-09 | 1998-10-06 | ガメラ・バイオサイエンス・コーポレイション | 磁気サイクル反応を行うための装置 |
| WO1996031622A1 (en) * | 1995-04-07 | 1996-10-10 | Oxford Gene Technology Limited | Detecting dna sequence variations |
| JPH11503019A (ja) * | 1995-04-07 | 1999-03-23 | オックスフォード・ジーン・テクノロジー・リミテッド | Ｄｎａ配列変異の検出 |
| WO1997004131A1 (en) * | 1995-07-21 | 1997-02-06 | Forsyth Dental Infirmary For Children | Single primer amplification of polynucleotide hairpins |
| JPH09168400A (ja) * | 1995-12-20 | 1997-06-30 | Sekisui Chem Co Ltd | 核酸の定量方法 |
| JP2000037194A (ja) * | 1998-06-24 | 2000-02-08 | Enzo Diagnostics Inc | 核酸を増幅するため、核酸配列のための終結後標識プロセス、および減少した熱力学安定性を有する核酸を生成するための新規の方法 |
Non-Patent Citations (14)
| Title |
|---|
| JPN3010000776, ＳＣＯＴＴ Ｗ．ＭＯＲＲＩＣＡＬ, "ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＮＡＰ−ＢＡＣＫ ＤＮＡ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ ＢＹ ＴＨＥ ＵＶＳＸ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＳＥ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＰＨＡＧＥ Ｔ４", ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ, 19910301, Ｖ．２６６ Ｎ．２１, Ｐ．１４０３１−１４０３８ * |
| JPN3010000777, "甲第１号証の抄訳" * |
| JPN3010000778, ＧＥＯＲＧＥ Ａ．ＲＩＣＣＡ, ＰＮＡＳ, 198202, Ｖ．７９, Ｐ．７２４−７２８ * |
| JPN3010000779, ＡＲＴＨＵＲ ＫＯＲＮＢＥＲＧ, ＤＮＡ ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ＳＥＣＯＮＤ ＥＤＩＴＩＯＮ, 1992, Ｐ．７００−７０３，７１３−７１６, US, Ｗ．Ｈ．ＦＲＥＥＭＡＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ * |
| JPN3010000780, "甲第２号証の抄訳" * |
| JPN3010000781, "ＷＯ１９９６−００１３２７の翻訳" * |
| JPN3010000782, "ＷＯ１９９７−００４１３１の抄訳" * |
| JPN3010000783, 中山広樹, "バイオ実験イラストレイテッド", 細胞工学別冊 目で見る実験ノートシリーズ, 19980601, 第２版, Ｐ．２５−２６，１６３−１６５，１６９, 株式会社秀潤社 * |
| JPN3010000784, ＴＳＵＧＵＮＯＲＩ ＮＯＴＯＭＩ, "ＬＯＯＰ−ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＩＳＯＴＨＥＲＭＡＬ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＮＡ", ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ, 2000, Ｖ．２８，Ｎ．１２，ｅ６３, Ｐ．５ * |
| JPN3010000785, "甲第１０号証の抄訳" * |
| JPN3010000786, "平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の原告による第４準備書面" * |
| JPN3010000787, "平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の原告による第５準備書面" * |
| JPN3010000788, "平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の原告による第７準備書面" * |
| JPN3010000789, "平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の原告による技術説明資料" * |
Cited By (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7803579B2 (en) | 2002-10-29 | 2010-09-28 | Riken | Process for amplifying nucleic acid |
| JP3897805B2 (ja) * | 2003-12-25 | 2007-03-28 | 独立行政法人理化学研究所 | 核酸の増幅法およびこれを利用した変異核酸の検出法 |
| US8206902B2 (en) | 2003-12-25 | 2012-06-26 | Riken | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same |
| WO2007018257A1 (ja) | 2005-08-10 | 2007-02-15 | Hamamatsu Foundation For Science And Technology Promotion | 大腸癌マーカー検出方法 |
| JP2007189984A (ja) * | 2006-01-20 | 2007-08-02 | Toshiba Corp | ハイブリダイゼーションによる核酸の検出方法およびアッセイキット |
| US7919252B2 (en) | 2006-03-20 | 2011-04-05 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Method for detecting a target nucleic acid sequence |
| US7488581B2 (en) | 2006-03-20 | 2009-02-10 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Method for detecting a target nucleic acid sequence |
| EP1956098A1 (en) | 2007-02-09 | 2008-08-13 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Method of detecting gene mutation |
| US7728119B2 (en) | 2007-03-28 | 2010-06-01 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleotide primer set and nucleotide probe for detecting genotype of methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) |
| US7919611B2 (en) | 2007-03-28 | 2011-04-05 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleotide primer set and nucleotide probe for detecting genotype of N-acetyltransferase-2 (NAT2) |
| EP1988178A2 (en) | 2007-04-26 | 2008-11-05 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleotide primer set and nucleotide probe for detecting genotype of serum amyloid A1(SAA1) |
| JP2010004855A (ja) * | 2008-06-30 | 2010-01-14 | Q P Corp | オリゴヌクレオチド及びこれをプライマーとして用いたバチルス・コアグランスの検出法 |
| WO2012029993A1 (en) | 2010-09-02 | 2012-03-08 | Riken | Method of detecting type ii diabetes |
| JP5299981B1 (ja) * | 2011-09-08 | 2013-09-25 | 独立行政法人理化学研究所 | プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法 |
| WO2013035875A1 (ja) * | 2011-09-08 | 2013-03-14 | 独立行政法人理化学研究所 | プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法 |
| US9586987B2 (en) | 2011-09-08 | 2017-03-07 | Kabushiki Kaisha Dnaform | Primer set for isothermal amplication of a target nucleic acid sequence |
| WO2013065574A1 (ja) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | 栄研化学株式会社 | 標的核酸の検出法 |
| KR20140091562A (ko) | 2011-10-31 | 2014-07-21 | 에이껜 가가꾸 가부시끼가이샤 | 표적 핵산의 검출법 |
| US10876160B2 (en) | 2011-10-31 | 2020-12-29 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Method for detecting target nucleic acid |
| WO2013129542A1 (ja) | 2012-02-29 | 2013-09-06 | 独立行政法人理化学研究所 | Ｈｌａ－ａ＊３１：０１アレルの検出方法 |
| JP2016189715A (ja) * | 2015-03-31 | 2016-11-10 | 株式会社カネカ | クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を検出するためのプライマー及び方法 |
| WO2018235886A1 (ja) | 2017-06-23 | 2018-12-27 | 栄研化学株式会社 | 核酸検出方法、核酸検出用プライマー及び核酸検出用キット |
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