JP3320716B2 - 初期プロモーターを用いた組換えバキュロウイルスベクター - Google Patents
初期プロモーターを用いた組換えバキュロウイルスベクターInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えバキュロウイルスもしくは安定形質
転換された虫細胞系を生成するのに有用な組換えDNAベ
クターに関する。
転換された虫細胞系を生成するのに有用な組換えDNAベ
クターに関する。
バキュロウイルス発現ベクター（BEVs）は、基礎研究
及び、ヒト臨床適用のための蛋白質合成並びに生物医薬
品に応用できる、外来遺伝子の発現にとって非常に重要
なものである（W.Doerfler著、Curr.Top.Microbiol.Imm
uno.,131:51 68（1968）;V.A.Luckow及びM.D.Summers
著、Bio/Technology,6:47 55（1989a）;L.K.Miller著、
Annual Review of Microbiol.,42:177 199（1988）;M.
D.Summers著、Curr.Communications in Molecular Biol
ogy,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.
Y.（1988））。BEVsは、プロモータの後に、選択された
外来遺伝子を非必須ウイルス遺伝子ポリヘドリン（以
下、polyhedrinという場合がある）に代えて挿入したコ
ード配列を有する、組換え虫ベクターである（Smith及
びSummersに付与された米国特許第4,745,051号参照）。
及び、ヒト臨床適用のための蛋白質合成並びに生物医薬
品に応用できる、外来遺伝子の発現にとって非常に重要
なものである（W.Doerfler著、Curr.Top.Microbiol.Imm
uno.,131:51 68（1968）;V.A.Luckow及びM.D.Summers
著、Bio/Technology,6:47 55（1989a）;L.K.Miller著、
Annual Review of Microbiol.,42:177 199（1988）;M.
D.Summers著、Curr.Communications in Molecular Biol
ogy,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.
Y.（1988））。BEVsは、プロモータの後に、選択された
外来遺伝子を非必須ウイルス遺伝子ポリヘドリン（以
下、polyhedrinという場合がある）に代えて挿入したコ
ード配列を有する、組換え虫ベクターである（Smith及
びSummersに付与された米国特許第4,745,051号参照）。
バキュロウイルス遺伝子は、４期の異なるウイルス複
製サイクルのうち１期以降のサイクル中に、一時的に調
整されながら、次々に発現する（P.D.Friesen及びL.K.M
iller著、Curr.Top.Microbiol.Immunol.,131:31 49（19
86）;L.A.Cuarino著、CRCPress.（1989）［in pres
s］）。したがって、発現の過程で、異なるバキュロウ
イルス遺伝子は、ウイルス感染期に応じて、前初期（以
下、immediate−early期という場合がある）（α）、後
初期（以下、delayed−early期という場合がある）
（β）、後期（以下、late期という場合がある）
（γ）、最後期（以下、very late期という場合があ
る）（δ）に分類し得る。
製サイクルのうち１期以降のサイクル中に、一時的に調
整されながら、次々に発現する（P.D.Friesen及びL.K.M
iller著、Curr.Top.Microbiol.Immunol.,131:31 49（19
86）;L.A.Cuarino著、CRCPress.（1989）［in pres
s］）。したがって、発現の過程で、異なるバキュロウ
イルス遺伝子は、ウイルス感染期に応じて、前初期（以
下、immediate−early期という場合がある）（α）、後
初期（以下、delayed−early期という場合がある）
（β）、後期（以下、late期という場合がある）
（γ）、最後期（以下、very late期という場合があ
る）（δ）に分類し得る。
これらの遺伝子の発現は、カスケード機構を有する思
われる転写調整の結果、次々に起こる。こうして、imme
diate−early期遺伝子は、他ウイルスの影響を受けず
に、感染後速やかに発現し、１以上の遺伝子生成物がde
layed−early期遺伝子の転写を誘発する。delayed−ear
ly期遺伝子生成物のうちいくつかが、交互にlate期遺伝
子の転写を誘発し、最終的に、very late期遺伝子が、
それ以前に発現された１期以上の遺伝子生成物の制御下
で発現する。このカスケード調整を行う物質としては、
Autographa californica核polyhidrosisウイルス（AcMN
PV）のimmediate−early期遺伝子である。IE1が比較的
よく定義されている。IE1は、他ウイルスの影響を受け
ずに発現し、late期遺伝子同様に（L.A.Guarino及びM.
D.Summers著、Virol.162:444 451（1988））、39K遺伝
子を含むdelayed−early期のいくつかの遺伝子の転写を
誘発する物質をコードする（L.A.Cuarino及びM.D.Summe
rs著、J.Virol.,57:563 571（986a）;J.Virol.,61:2091
2099（1987））。しかしながら、immediate−early期
遺伝子は、他ウイルスに依存せずに発現すると考えられ
ている。
われる転写調整の結果、次々に起こる。こうして、imme
diate−early期遺伝子は、他ウイルスの影響を受けず
に、感染後速やかに発現し、１以上の遺伝子生成物がde
layed−early期遺伝子の転写を誘発する。delayed−ear
ly期遺伝子生成物のうちいくつかが、交互にlate期遺伝
子の転写を誘発し、最終的に、very late期遺伝子が、
それ以前に発現された１期以上の遺伝子生成物の制御下
で発現する。このカスケード調整を行う物質としては、
Autographa californica核polyhidrosisウイルス（AcMN
PV）のimmediate−early期遺伝子である。IE1が比較的
よく定義されている。IE1は、他ウイルスの影響を受け
ずに発現し、late期遺伝子同様に（L.A.Guarino及びM.
D.Summers著、Virol.162:444 451（1988））、39K遺伝
子を含むdelayed−early期のいくつかの遺伝子の転写を
誘発する物質をコードする（L.A.Cuarino及びM.D.Summe
rs著、J.Virol.,57:563 571（986a）;J.Virol.,61:2091
2099（1987））。しかしながら、immediate−early期
遺伝子は、他ウイルスに依存せずに発現すると考えられ
ている。
polynedrin遺伝子は、very late期遺伝子に分類され
る。したがって、polyhedrinプロモータからの転写に
は、それ以前の、未知の、多数の他ウイルス及び細胞遺
伝子生成物の発現が必要であると思われる。このため、
Smith及びSummersによる典型的なBEV系（米国特許第4,7
45,051号）のような従来のBEVsは、外来遺伝子を、他の
ウイルスゲノムの遺伝子発現の結果としてのみ、また、
ウイルス感染が十分に進行した後にのみ、発現する。さ
らに、このベクターは、オクルージョン陽性となった後
代を生成できないため、生きた虫における発現には不適
である。
る。したがって、polyhedrinプロモータからの転写に
は、それ以前の、未知の、多数の他ウイルス及び細胞遺
伝子生成物の発現が必要であると思われる。このため、
Smith及びSummersによる典型的なBEV系（米国特許第4,7
45,051号）のような従来のBEVsは、外来遺伝子を、他の
ウイルスゲノムの遺伝子発現の結果としてのみ、また、
ウイルス感染が十分に進行した後にのみ、発現する。さ
らに、このベクターは、オクルージョン陽性となった後
代を生成できないため、生きた虫における発現には不適
である。
他のウイルスベノムの遺伝子発現の結果としての外来
遺伝子の発現を、従来の典型的なBEV系へ応用するに
は、少なくとも２点の理由から明らかな限界がある。第
一に、本質的に完全な組換えウイルスに感染すると、こ
れによって宿主細胞が最終的には殺されてしまい、その
ため、宿主細胞の外来蛋白質合成の“工場”としての役
割が失われてしまう。したがって、感染のvery late期
において組換えバキュロウイルスに感染した虫細胞内で
のみ発現できる、バキュロウイルスの“very late期”
プロモータ（polyhedrin及びp10遺伝子）の制御下で
は、外来遺伝子が発現しにくい。これは、これらの宿主
細胞感染後４ないし５日で死に、上記ベクターによる発
現は一時的なものとなってしまうことを示している。こ
のように、従来のBEV系は細胞系での一過性遺伝子発現
に限定される。
遺伝子の発現を、従来の典型的なBEV系へ応用するに
は、少なくとも２点の理由から明らかな限界がある。第
一に、本質的に完全な組換えウイルスに感染すると、こ
れによって宿主細胞が最終的には殺されてしまい、その
ため、宿主細胞の外来蛋白質合成の“工場”としての役
割が失われてしまう。したがって、感染のvery late期
において組換えバキュロウイルスに感染した虫細胞内で
のみ発現できる、バキュロウイルスの“very late期”
プロモータ（polyhedrin及びp10遺伝子）の制御下で
は、外来遺伝子が発現しにくい。これは、これらの宿主
細胞感染後４ないし５日で死に、上記ベクターによる発
現は一時的なものとなってしまうことを示している。こ
のように、従来のBEV系は細胞系での一過性遺伝子発現
に限定される。
第二の限界は、宿主細胞へのバキュロウイルス感染の
進行の結果、該細胞の新規合成蛋白質を処理する能力が
低下することである（D.Summers著、Mol.Cell.Biol.,9:
214 223（1989））。感染細胞は、感染後一日経過後で
さえも、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータの場合
に見られるように、もはや外来糖蛋白質を効果的に処理
することができなくなる。したがって、polyhedrinプロ
モータからの遺伝子発現は、宿主細胞の新規合成蛋白質
処理能が有意に低下した時点で起こる。
進行の結果、該細胞の新規合成蛋白質を処理する能力が
低下することである（D.Summers著、Mol.Cell.Biol.,9:
214 223（1989））。感染細胞は、感染後一日経過後で
さえも、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータの場合
に見られるように、もはや外来糖蛋白質を効果的に処理
することができなくなる。したがって、polyhedrinプロ
モータからの遺伝子発現は、宿主細胞の新規合成蛋白質
処理能が有意に低下した時点で起こる。
このように、細胞が糖蛋白質生成物を有効に処理でき
る能力を維持したまま、すなわち、継続的かつ永久的
に、外来遺伝子生成物を発現する系の必要性が非常に高
くなっている。以下に記載するのはこのような系であ
り、バキュロウイルス初期プロモータを用いた遺伝子発
現のための改良された新規のベクターである。
る能力を維持したまま、すなわち、継続的かつ永久的
に、外来遺伝子生成物を発現する系の必要性が非常に高
くなっている。以下に記載するのはこのような系であ
り、バキュロウイルス初期プロモータを用いた遺伝子発
現のための改良された新規のベクターである。
本発明に記載された、新規改良プラスミドベクター
は、形質転換された虫細胞もしくは組換えバキュロウイ
ルスに適用し得る。本ベクターは非感染虫細胞だけでな
く感染虫細胞のimmediate−early期中、及び自然体での
虫類内での外来遺伝子を発現する。このように、本プラ
スミドベクターは、オクルージョン陽性化した後代を生
成し得る組換えウイルス内での発現も可能にするため、
生きた虫内での発現に適している。本新規プラスミドベ
クターは、環境による不活性化に対しウイルスを安定さ
せるのに必要な、機能的polyhedrin遺伝子を保持してい
る。
は、形質転換された虫細胞もしくは組換えバキュロウイ
ルスに適用し得る。本ベクターは非感染虫細胞だけでな
く感染虫細胞のimmediate−early期中、及び自然体での
虫類内での外来遺伝子を発現する。このように、本プラ
スミドベクターは、オクルージョン陽性化した後代を生
成し得る組換えウイルス内での発現も可能にするため、
生きた虫内での発現に適している。本新規プラスミドベ
クターは、環境による不活性化に対しウイルスを安定さ
せるのに必要な、機能的polyhedrin遺伝子を保持してい
る。
これにより、組換えウイルスを、オクルージョン陽性
化後代を生成するために上記プラスミドベクターととも
に生成することも可能になる。これらの後代はin vivo
の系において非常に感染しやすい。これは、オクルージ
ョン陰性後代のみを生成する他の組換えバキュロウイル
スと異なる点である。こうして、新規ベクターは、外来
遺伝子をin vivoの系で、感染の早い段階で発現させる
ことができる。このような性質は、殺虫剤等の外来遺伝
子生成物を虫の体内で発現させる際に、特に重要であ
る。加えて、これらの特徴から、特にベストコントロー
ルのための環境適用等には、本ベクターの使用が理想的
である。
化後代を生成するために上記プラスミドベクターととも
に生成することも可能になる。これらの後代はin vivo
の系において非常に感染しやすい。これは、オクルージ
ョン陰性後代のみを生成する他の組換えバキュロウイル
スと異なる点である。こうして、新規ベクターは、外来
遺伝子をin vivoの系で、感染の早い段階で発現させる
ことができる。このような性質は、殺虫剤等の外来遺伝
子生成物を虫の体内で発現させる際に、特に重要であ
る。加えて、これらの特徴から、特にベストコントロー
ルのための環境適用等には、本ベクターの使用が理想的
である。
本発明は、有効な殺虫剤を、環境に効果的に散布する
のに、直接的に有益である。本発明の新しい点のひとつ
は、初期バキュロウイルスの遺伝子発現を、殺虫剤の効
果的な散布に適用する点である。虫は、late期バキュロ
ウイルスプロモータによって、ウイルスに感染し、３な
いし５日で死に至る。この間、虫は作物を食べ続ける。
３ないし５日という短期間だけ、ウイルスに感染した虫
は、作物を荒らし、農民を憂慮させる。こうして、初期
バキュロウイルス遺伝子由来のプロモータによって直接
制御される殺虫剤を使用することで、虫を殺し、もしく
は少なくとも作物を食べ続けることができない状態にで
きる。虫は、ウイルス感染後数時間内に、死ぬかもしく
はそれ以上作物摂取ができない状態となる。
のに、直接的に有益である。本発明の新しい点のひとつ
は、初期バキュロウイルスの遺伝子発現を、殺虫剤の効
果的な散布に適用する点である。虫は、late期バキュロ
ウイルスプロモータによって、ウイルスに感染し、３な
いし５日で死に至る。この間、虫は作物を食べ続ける。
３ないし５日という短期間だけ、ウイルスに感染した虫
は、作物を荒らし、農民を憂慮させる。こうして、初期
バキュロウイルス遺伝子由来のプロモータによって直接
制御される殺虫剤を使用することで、虫を殺し、もしく
は少なくとも作物を食べ続けることができない状態にで
きる。虫は、ウイルス感染後数時間内に、死ぬかもしく
はそれ以上作物摂取ができない状態となる。
さらに、バキュロウイルス発現ベクター系の宿主は、
感染細胞であるため、所望の外来遺伝子を生成する間は
安全であるという利点がある。
感染細胞であるため、所望の外来遺伝子を生成する間は
安全であるという利点がある。
一般に、本発明は、所望の外来遺伝子を継続的かつ永
久的に発現する転換非感染虫細胞クローンもしくは、所
望の外来遺伝子を一時的に発現する組換えバキュロウイ
ルスの双方を生成する能力を有するベクターを開示して
いる。後者の生成物は、本特異的なベクターを用いる特
異的な方法に依存して、個々に産生される。したがっ
て、本新規特異ベクターは、（１）所望遺伝子を継続的
かつ永久的に発現する形質転換虫細胞（非感染）、ある
いは、（２）所望遺伝子を感染のimmediate−early期
に、虫細胞内又は虫そのものの体ないで発現する組換え
バキュロウイルスを生成するために使用されるものであ
る。
久的に発現する転換非感染虫細胞クローンもしくは、所
望の外来遺伝子を一時的に発現する組換えバキュロウイ
ルスの双方を生成する能力を有するベクターを開示して
いる。後者の生成物は、本特異的なベクターを用いる特
異的な方法に依存して、個々に産生される。したがっ
て、本新規特異ベクターは、（１）所望遺伝子を継続的
かつ永久的に発現する形質転換虫細胞（非感染）、ある
いは、（２）所望遺伝子を感染のimmediate−early期
に、虫細胞内又は虫そのものの体ないで発現する組換え
バキュロウイルスを生成するために使用されるものであ
る。
所望遺伝子を形質転換非感染虫細胞に挿入することに
より、安定形質転換された細胞クローンが産生され、こ
こで、所望遺伝子のDNAがコードされ、虫宿主細胞のゲ
ノム内で安定状態で蓄積して、所望遺伝子の継続的かつ
永久的発現をうながす。継続的に発現された生成物は、
その後、細胞集合体の一部より、精製する。したがっ
て、安定形質転換虫細胞は、所望の遺伝子を継続的に発
現する工場となる。“安定形質転換虫細胞”及び、“宿
主虫細胞のゲノム内での安定蓄積”並びに“形質転換虫
細胞”という表現は、すべて同じく、外来DNAの宿主細
胞ゲノム内への安定蓄積、及びそれに続く本所望遺伝子
の継続的かつ永久的発現を表現するものである。
より、安定形質転換された細胞クローンが産生され、こ
こで、所望遺伝子のDNAがコードされ、虫宿主細胞のゲ
ノム内で安定状態で蓄積して、所望遺伝子の継続的かつ
永久的発現をうながす。継続的に発現された生成物は、
その後、細胞集合体の一部より、精製する。したがっ
て、安定形質転換虫細胞は、所望の遺伝子を継続的に発
現する工場となる。“安定形質転換虫細胞”及び、“宿
主虫細胞のゲノム内での安定蓄積”並びに“形質転換虫
細胞”という表現は、すべて同じく、外来DNAの宿主細
胞ゲノム内への安定蓄積、及びそれに続く本所望遺伝子
の継続的かつ永久的発現を表現するものである。
継続的かつ永久的に所望の遺伝子を発現する、形質転
換虫細胞クローン（非感染）を産生するプラスミドベク
ターの最適な実施例として、左から右方向に、以下の化
合物が含まれる。
換虫細胞クローン（非感染）を産生するプラスミドベク
ターの最適な実施例として、左から右方向に、以下の化
合物が含まれる。
1. 選択可能マーカー遺伝子をコードするDNA領域（例
えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のDNAコード）。本
選択的マーカー遺伝子は、エレメント２の第１のプロモ
ータ領域をコードするDNA領域及びその上流部に位置す
る； 2. バキュロウイルスimmediate−early期遺伝子（例え
ばIEN）由来の第１のプロモータ領域を有するDNA領域。
本プロモータ前方のマーカー遺伝子の発現を行うよう位
置する； 3. 他のバキュロウイルスimmediate−early期遺伝子
（例えばIE1）由来の第２のプロモータを有するDNA領
域。所望の遺伝子の発現を行うように適当な間隔で位置
する； 4. 所望の蛋白質をコードする、cDNAあるいはゲノムDN
A配列を挿入し得るクローニング抑制部位を有するDNA領
域。本クローニング抑制部位は、エレメント５の第２の
プロモータ領域の第１ヌクレオチド部位及びその下流部
に位置するマルチクローニングカセット配列を有する； 5. 所望の遺伝子をコードするcDNAあるいはゲノム領
域。クローニング抑制部位の第２のプロモータ内に位置
し、これにより、第２のプロモータ領域が、所望遺伝子
の発現を行う。
えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のDNAコード）。本
選択的マーカー遺伝子は、エレメント２の第１のプロモ
ータ領域をコードするDNA領域及びその上流部に位置す
る； 2. バキュロウイルスimmediate−early期遺伝子（例え
ばIEN）由来の第１のプロモータ領域を有するDNA領域。
本プロモータ前方のマーカー遺伝子の発現を行うよう位
置する； 3. 他のバキュロウイルスimmediate−early期遺伝子
（例えばIE1）由来の第２のプロモータを有するDNA領
域。所望の遺伝子の発現を行うように適当な間隔で位置
する； 4. 所望の蛋白質をコードする、cDNAあるいはゲノムDN
A配列を挿入し得るクローニング抑制部位を有するDNA領
域。本クローニング抑制部位は、エレメント５の第２の
プロモータ領域の第１ヌクレオチド部位及びその下流部
に位置するマルチクローニングカセット配列を有する； 5. 所望の遺伝子をコードするcDNAあるいはゲノム領
域。クローニング抑制部位の第２のプロモータ内に位置
し、これにより、第２のプロモータ領域が、所望遺伝子
の発現を行う。
このように、本発明は、さらに、上述のバキュロウイ
ルス転写ベクターを含む形質転換虫細胞クローンを包含
する。
ルス転写ベクターを含む形質転換虫細胞クローンを包含
する。
所望の遺伝子を、感染のimmediate−early期に、虫細
胞あるいは虫本体の内部で発現する組換えバキュロウイ
ルス（感染）を産生する新規プラスミドベクターの最適
な実施例として、左から右方向に、以下の構成を有す
る。
胞あるいは虫本体の内部で発現する組換えバキュロウイ
ルス（感染）を産生する新規プラスミドベクターの最適
な実施例として、左から右方向に、以下の構成を有す
る。
1. polyhedrin遺伝子の５′末端側部位をコードする、
バキュロウイルスのウイルスDNA配列（本末端側配列
は、バキュロウイルスのpolyhedrin遺伝子内での、pIET
Vの効果的な相同組換えに必須である）； 2. 選択可能なマーカー遺伝子をコードするDNA領域
（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするDN
A）。本選択可能マーカー遺伝子は、エレメント３の第
１のプロモータ領域をコードするDNA領域部位及びその
上流部に位置する； 3. バキュロウイルスimmediate−early期遺伝子（例え
ばIEN）由来第１のプロモータ領域を有するDNA領域。マ
ーカー遺伝子を発現するように上記プロモータ上流部に
位置する； 4. 他のバキュロウイルスimmediate−early期遺伝子
（例えば、IE1）由来第２のプロモータ領域を有するDNA
領域。所望の遺伝子を発現するように適当な間隔で位置
する； 5. 所望の蛋白質をコードする。cDNAあるいはゲノムDN
A配列を挿入し得るクローニング抑制部位を有するDNA領
域。本クローニング制限部位は、エレメント６のpolyhe
drin遺伝子をコードするDNA領域の上流部かつエレメン
トＢの第２プロモータ領域の第１ヌクレオチドの下流部
に位置するマルチクローニングカセット配列を有する； 6. 所望の遺伝子をコードするcDNAあるいはゲノム領
域。クローニング制限部位の第２のプロモータ内に位置
し、これにより、第２のプロモータ領域が、所望遺伝子
の発現を行う； 7. polyhedrinプロモータを有するpolyhedrin遺伝子を
コードするDNA領域； 8. polyhedrin遺伝子の３′末端側部位をコードする、
バキュロウイルスのウイルスDNA配列（本末端側配列
は、バキュロウイルスのpolyhedrin遺伝子内での、pIET
Vの効果的な相同組換えに必須である）。
バキュロウイルスのウイルスDNA配列（本末端側配列
は、バキュロウイルスのpolyhedrin遺伝子内での、pIET
Vの効果的な相同組換えに必須である）； 2. 選択可能なマーカー遺伝子をコードするDNA領域
（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするDN
A）。本選択可能マーカー遺伝子は、エレメント３の第
１のプロモータ領域をコードするDNA領域部位及びその
上流部に位置する； 3. バキュロウイルスimmediate−early期遺伝子（例え
ばIEN）由来第１のプロモータ領域を有するDNA領域。マ
ーカー遺伝子を発現するように上記プロモータ上流部に
位置する； 4. 他のバキュロウイルスimmediate−early期遺伝子
（例えば、IE1）由来第２のプロモータ領域を有するDNA
領域。所望の遺伝子を発現するように適当な間隔で位置
する； 5. 所望の蛋白質をコードする。cDNAあるいはゲノムDN
A配列を挿入し得るクローニング抑制部位を有するDNA領
域。本クローニング制限部位は、エレメント６のpolyhe
drin遺伝子をコードするDNA領域の上流部かつエレメン
トＢの第２プロモータ領域の第１ヌクレオチドの下流部
に位置するマルチクローニングカセット配列を有する； 6. 所望の遺伝子をコードするcDNAあるいはゲノム領
域。クローニング制限部位の第２のプロモータ内に位置
し、これにより、第２のプロモータ領域が、所望遺伝子
の発現を行う； 7. polyhedrinプロモータを有するpolyhedrin遺伝子を
コードするDNA領域； 8. polyhedrin遺伝子の３′末端側部位をコードする、
バキュロウイルスのウイルスDNA配列（本末端側配列
は、バキュロウイルスのpolyhedrin遺伝子内での、pIET
Vの効果的な相同組換えに必須である）。
このように、本発明は、さらに、上述のバキュロウイ
ルス転写ベクターを含む形質転換虫細胞クローンを包含
する。
ルス転写ベクターを含む形質転換虫細胞クローンを包含
する。
本発明の他の好適な実施例は、所望の末端生成物を上
述のプラスミドベクター（安定な形質転換虫細胞クロー
ンもしくは組換えバキュロウイルス）から製造する方法
である。
述のプラスミドベクター（安定な形質転換虫細胞クロー
ンもしくは組換えバキュロウイルス）から製造する方法
である。
これらプラスミドベクターは、所望の形質転換細胞ク
ローンもしくは組換えウイルスを、迅速かつ容易に認識
するためのマーカー遺伝子を含有する。マーカー遺伝子
は、当該技術により既知である多数の異なるマーカー遺
伝子のうちの一つから選択可能であるが、β−ガラクト
シダーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフ
ェラーゼ、もしくはβ−グルクロンニダーゼから選択す
ることがより望ましい。こうして、所望の形質転換細胞
クローンもしくは組換えウイルスを、マーカー遺伝子
（すなわちβ−ガラクトシダーゼ）の生成により識別す
ることができる。
ローンもしくは組換えウイルスを、迅速かつ容易に認識
するためのマーカー遺伝子を含有する。マーカー遺伝子
は、当該技術により既知である多数の異なるマーカー遺
伝子のうちの一つから選択可能であるが、β−ガラクト
シダーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフ
ェラーゼ、もしくはβ−グルクロンニダーゼから選択す
ることがより望ましい。こうして、所望の形質転換細胞
クローンもしくは組換えウイルスを、マーカー遺伝子
（すなわちβ−ガラクトシダーゼ）の生成により識別す
ることができる。
また、さらに別の好適例は、本プラスミドベクター
の、２種のバキュロウイルス初期プロモータによって、
宿主虫細胞内で遺伝子発現させる際への適用である。初
期バキュロウイルスプロモータであれば、本系に有効で
あるが、IEN、IE0及びIE1が本発明に好適である。本発
明は、immediate−early期IEN遺伝子由来初期プロモー
タ領域を用いて、形質転換虫細胞もしくは組換えウイル
スの識別を促進するために使用される、β−ガラクトシ
ダーゼ等のマーカー遺伝子を発現させることが望まし
い。IENは、マーカー遺伝子を、その配列方向で発現さ
せ、また一方では初期プロモータ領域、最適にはimmedi
ate−early期遺伝子IE1の配列方向で発現させる。２種
のバキュロウイルスプロモータが反対方向に位置するた
め、２種の初期バキュロウイルスプロモータを異種のも
のにする必要はない。
の、２種のバキュロウイルス初期プロモータによって、
宿主虫細胞内で遺伝子発現させる際への適用である。初
期バキュロウイルスプロモータであれば、本系に有効で
あるが、IEN、IE0及びIE1が本発明に好適である。本発
明は、immediate−early期IEN遺伝子由来初期プロモー
タ領域を用いて、形質転換虫細胞もしくは組換えウイル
スの識別を促進するために使用される、β−ガラクトシ
ダーゼ等のマーカー遺伝子を発現させることが望まし
い。IENは、マーカー遺伝子を、その配列方向で発現さ
せ、また一方では初期プロモータ領域、最適にはimmedi
ate−early期遺伝子IE1の配列方向で発現させる。２種
のバキュロウイルスプロモータが反対方向に位置するた
め、２種の初期バキュロウイルスプロモータを異種のも
のにする必要はない。
より好適な実施例としては、所望の外来遺伝子の挿入
を適切な方向で促進させるマルチクローニングカセット
の次にIE1プロモータ領域が続くことが望ましい。この
マルチクローニングカセットの配列は、IE1プロモータ
の下流部に位置される。典型的なカセットの配列単位に
は、８ないし11種の酵素によって制限される部位が含ま
れる（例えば、Hinc II、EcoR I、Xho I、Sma I、Pst
1、Sac II、Nhe I、Nco I、Not I、BstB I）。マルチク
ローニング部位配列単位は数種の企業から入手可能であ
り（Promega,New England Biolads等）、またはDNA合成
装置を用いてそれぞれの実験室で合成することも可能で
ある。いずれの方法も日常的に用いられており、また、
これらマルチクローニングカセット単位の使用について
も、当該技術分野において既知のものである。
を適切な方向で促進させるマルチクローニングカセット
の次にIE1プロモータ領域が続くことが望ましい。この
マルチクローニングカセットの配列は、IE1プロモータ
の下流部に位置される。典型的なカセットの配列単位に
は、８ないし11種の酵素によって制限される部位が含ま
れる（例えば、Hinc II、EcoR I、Xho I、Sma I、Pst
1、Sac II、Nhe I、Nco I、Not I、BstB I）。マルチク
ローニング部位配列単位は数種の企業から入手可能であ
り（Promega,New England Biolads等）、またはDNA合成
装置を用いてそれぞれの実験室で合成することも可能で
ある。いずれの方法も日常的に用いられており、また、
これらマルチクローニングカセット単位の使用について
も、当該技術分野において既知のものである。
本発明のさらに他の実施例として、上述のimmediate
−early期遺伝子をdelayed−early期のバキュロウイル
ス遺伝子プロモータ領域と組み合わせて用いる方法があ
る。immediate−early期遺伝子と異なり、delayed−ear
ly期遺伝子はその他のウイルス遺伝子もしくはimmediat
e−early期遺伝子等の遺伝子生成物の存在下でのみ機能
する。immediate−early期遺伝子は、39Kもしくはバキ
ュロウイルスゲノムのHind III Kフラグメント上のdela
yed−early期遺伝子プロモータの一つのような、数種の
delayed−early期遺伝子プロモータ領域すべてと組み合
わせることが可能である。より好適には、39Kプロモー
タ領域と、非相同遺伝子を結合させ、その発現をIE1の
存在下で、さらに制御することが望ましい。
−early期遺伝子をdelayed−early期のバキュロウイル
ス遺伝子プロモータ領域と組み合わせて用いる方法があ
る。immediate−early期遺伝子と異なり、delayed−ear
ly期遺伝子はその他のウイルス遺伝子もしくはimmediat
e−early期遺伝子等の遺伝子生成物の存在下でのみ機能
する。immediate−early期遺伝子は、39Kもしくはバキ
ュロウイルスゲノムのHind III Kフラグメント上のdela
yed−early期遺伝子プロモータの一つのような、数種の
delayed−early期遺伝子プロモータ領域すべてと組み合
わせることが可能である。より好適には、39Kプロモー
タ領域と、非相同遺伝子を結合させ、その発現をIE1の
存在下で、さらに制御することが望ましい。
加えて、immediate−early期遺伝子をdelayed−early
期遺伝子プロモータ領域と組み合わせて使用する際は、
直接delayed−early期遺伝子プロモータ領域とcis結合
している増強配列の存在により、非相同遺伝子の発現が
増強される。これら増強配列（hr1、hr2、hr3、hr4及び
hr5）は、delayed−early期遺伝子の発現が、immediate
−early期遺伝子もしくはその生成物が制限されている
場所で増強することを特徴とする。好適な実施例として
は、hr5増強配列は直接（cis結合で）delayed−early期
遺伝子プロモータ領域である39Kと結合して、クローン
化された非相同DNAの発現を増強する。
期遺伝子プロモータ領域と組み合わせて使用する際は、
直接delayed−early期遺伝子プロモータ領域とcis結合
している増強配列の存在により、非相同遺伝子の発現が
増強される。これら増強配列（hr1、hr2、hr3、hr4及び
hr5）は、delayed−early期遺伝子の発現が、immediate
−early期遺伝子もしくはその生成物が制限されている
場所で増強することを特徴とする。好適な実施例として
は、hr5増強配列は直接（cis結合で）delayed−early期
遺伝子プロモータ領域である39Kと結合して、クローン
化された非相同DNAの発現を増強する。
さらに上記組成に加えて、特異プラスミドベクター
は、真核細胞もしくは前核細胞のソース由来の所望の蛋
白質をコードするcDNAもしくはゲノムNDA配列を有するD
NA領域を包含する。この配列は、当該技術で周知であ
り、American Type Culture Collection（ATCC,Rockvil
le,Maryland）から入手可能な多種の異なった遺伝子を
コードする。例として、いかにATCCより入手可能なクロ
ーン化遺伝子またはプローブの簡単なリストを挙げる：
表皮成長因子受容体、β−グルクロニダーゼ、Ｙ−mos
M1 Maloney sarcomaウイルス、組織系プラスミノゲーン
アクチベータ、アルギノサクシネート合成酵素、インス
リン（Ａ及びＢ鎖）、プロラクチン、インターロイキン
１及び２、コロニー誘発因子、腫瘍壊死因子、β−ヘモ
グロブリン、インターフェロン、leutinizingホルモ
ン、β−ヘキソースアミニダーゼ、凝固因子VIIIC、ト
ランスフェリン、エステラーゼＤ、アデノシンデアミナ
ーゼ等。
は、真核細胞もしくは前核細胞のソース由来の所望の蛋
白質をコードするcDNAもしくはゲノムNDA配列を有するD
NA領域を包含する。この配列は、当該技術で周知であ
り、American Type Culture Collection（ATCC,Rockvil
le,Maryland）から入手可能な多種の異なった遺伝子を
コードする。例として、いかにATCCより入手可能なクロ
ーン化遺伝子またはプローブの簡単なリストを挙げる：
表皮成長因子受容体、β−グルクロニダーゼ、Ｙ−mos
M1 Maloney sarcomaウイルス、組織系プラスミノゲーン
アクチベータ、アルギノサクシネート合成酵素、インス
リン（Ａ及びＢ鎖）、プロラクチン、インターロイキン
１及び２、コロニー誘発因子、腫瘍壊死因子、β−ヘモ
グロブリン、インターフェロン、leutinizingホルモ
ン、β−ヘキソースアミニダーゼ、凝固因子VIIIC、ト
ランスフェリン、エステラーゼＤ、アデノシンデアミナ
ーゼ等。
また、本発明のプラスミドベクターの別の好適な実施
例としては、組換えウイルスによってオクルージョン陽
性後代を生成し得る、完全なpolyhedrin遺伝子及びプロ
モータの使用もまた好適である。これらプラスミドベク
ターとともに生成される組換えウイルスは、合成polyhe
drinが、オクルージョン陽性後代を産生するため、好適
である。上記組換えウイルスはin vivo系で非常に高い
感染能を有し、また、環境の不活性化にも耐性を有す
る。この能力は他の組換えバキュロウイルスにはみられ
ないものであり、宿主細胞を感染させ、感染初期の段階
で、外来遺伝子を虫の体内で発現させる。虫体内におい
て、上記特性は、殺虫剤を含む外来遺伝子生成物の発現
には必須である。加えて、これらの特性は、環境的な適
用、特にベストコントロールへの適用に理想的な本ベク
ターを産生する。
例としては、組換えウイルスによってオクルージョン陽
性後代を生成し得る、完全なpolyhedrin遺伝子及びプロ
モータの使用もまた好適である。これらプラスミドベク
ターとともに生成される組換えウイルスは、合成polyhe
drinが、オクルージョン陽性後代を産生するため、好適
である。上記組換えウイルスはin vivo系で非常に高い
感染能を有し、また、環境の不活性化にも耐性を有す
る。この能力は他の組換えバキュロウイルスにはみられ
ないものであり、宿主細胞を感染させ、感染初期の段階
で、外来遺伝子を虫の体内で発現させる。虫体内におい
て、上記特性は、殺虫剤を含む外来遺伝子生成物の発現
には必須である。加えて、これらの特性は、環境的な適
用、特にベストコントロールへの適用に理想的な本ベク
ターを産生する。
本cDNA配列はさらに、５′末端側切断翻訳領域及び翻
訳開始部位を有する所望の蛋白質をコードするヌクレオ
チド配列を包含する。本発明によれば、アミノ酸及びヌ
クレオチド数は、用いられる適当な変換因子と相互変換
可能に使用する。
訳開始部位を有する所望の蛋白質をコードするヌクレオ
チド配列を包含する。本発明によれば、アミノ酸及びヌ
クレオチド数は、用いられる適当な変換因子と相互変換
可能に使用する。
多数の組換えDNAベクター生成物間の（５′から３′
方向への）適切な配列位置は、所望の蛋白質をコードす
る各々の特異DNAに応じて決定され、その情報によっ
て、所望の蛋白質の、より至適な発現及び生成が行われ
る。
方向への）適切な配列位置は、所望の蛋白質をコードす
る各々の特異DNAに応じて決定され、その情報によっ
て、所望の蛋白質の、より至適な発現及び生成が行われ
る。
初期遺伝子プロモータ領域をバキュロウイルス由来の
ものとする一実施例を挙げる。バキュロウイルスはAuto
grapha californica MNPV,Trichoplusia ni MNPV,Rachi
plusia ou MNPV Orgyiapsuedosugata MPV,Bombyx mori
NPV,Heliothis zea NPV,Spodoptera exigua NPVあるい
はGalleria mellonella NPVを含む虫細胞のウイルスの
中のひとつから選択可能である。
ものとする一実施例を挙げる。バキュロウイルスはAuto
grapha californica MNPV,Trichoplusia ni MNPV,Rachi
plusia ou MNPV Orgyiapsuedosugata MPV,Bombyx mori
NPV,Heliothis zea NPV,Spodoptera exigua NPVあるい
はGalleria mellonella NPVを含む虫細胞のウイルスの
中のひとつから選択可能である。
最適な実施例としては、初期遺伝子プロモータ領域を
Autographa californica MNPVのバキュロウイルスDNA由
来のものとするのが望ましい。上記初期遺伝子プロモー
タ領域はSpodopotera frugiperdeの細胞内で発現し得
る。バキュロウイルスから単離される初期遺伝子プロモ
ータ領域は、本ウイルスのimmediate−early期遺伝子で
あり、非相同遺伝子の継続的発現に、他のウイルス遺伝
子あるいは遺伝子生成物を必要としない。プロモータ領
域由来のimmediate−early期遺伝子は、IE1もしくはIEN
が望ましい。遺伝子プロモータ領域をバキュロウイルス
IE1のimmediate−early期遺伝子から単離すると好適で
ある。
Autographa californica MNPVのバキュロウイルスDNA由
来のものとするのが望ましい。上記初期遺伝子プロモー
タ領域はSpodopotera frugiperdeの細胞内で発現し得
る。バキュロウイルスから単離される初期遺伝子プロモ
ータ領域は、本ウイルスのimmediate−early期遺伝子で
あり、非相同遺伝子の継続的発現に、他のウイルス遺伝
子あるいは遺伝子生成物を必要としない。プロモータ領
域由来のimmediate−early期遺伝子は、IE1もしくはIEN
が望ましい。遺伝子プロモータ領域をバキュロウイルス
IE1のimmediate−early期遺伝子から単離すると好適で
ある。
本発明の方法を上述のように適用すると、安定に形質
変換された虫細胞クローンを誘発することができる。し
たがって、これら形質変換された虫細胞クローンは、上
述のバキュロウイルス転移ベクターを包含するようにな
る。本発明には、形質転換された虫細胞クローンには、
Lepidopteran転移中細胞クローンを使用するのが最も望
ましい。形質転換された細胞クローンは、Spodoptera f
rugiperda,Bombyx mori,Heliothis virescens,Heliothi
s zea,Mamestra brassicas,Estigmens acreaもしくは、
Trichoplusia niを含むLepidopteran虫細胞由来のもの
ならどんなものでもよい。
変換された虫細胞クローンを誘発することができる。し
たがって、これら形質変換された虫細胞クローンは、上
述のバキュロウイルス転移ベクターを包含するようにな
る。本発明には、形質転換された虫細胞クローンには、
Lepidopteran転移中細胞クローンを使用するのが最も望
ましい。形質転換された細胞クローンは、Spodoptera f
rugiperda,Bombyx mori,Heliothis virescens,Heliothi
s zea,Mamestra brassicas,Estigmens acreaもしくは、
Trichoplusia niを含むLepidopteran虫細胞由来のもの
ならどんなものでもよい。
最適実施例において、安定に形質転換されたSpodopte
ra FruglperdaのSf9細胞系が確立されて、あらゆる初期
遺伝子プロモータあるいは、100パッセージ以上成長し
た初期遺伝子プロモータを組み合わせ、その制御下で相
同DNAを発現する。本実施例において、用いられるSf9細
胞は、log期まで成長した細胞である。このように安定
形質転換された細胞系である非相同DNA生成物は、これ
らの細胞の細胞機能が、ウイルスの初期遺伝子配列によ
って全く変化しないため、細胞系により翻訳後修飾及び
／またはコードされる。
ra FruglperdaのSf9細胞系が確立されて、あらゆる初期
遺伝子プロモータあるいは、100パッセージ以上成長し
た初期遺伝子プロモータを組み合わせ、その制御下で相
同DNAを発現する。本実施例において、用いられるSf9細
胞は、log期まで成長した細胞である。このように安定
形質転換された細胞系である非相同DNA生成物は、これ
らの細胞の細胞機能が、ウイルスの初期遺伝子配列によ
って全く変化しないため、細胞系により翻訳後修飾及び
／またはコードされる。
図面の説明 図１は、組換えプラスミドpIENeo、p39E-Neo、p39+Ne
o、pIE139Neo、p510Neo、pIE1FB、pIE1NFB、p39FB、pIE
1tPAの構成を概略的に示している。
o、pIE139Neo、p510Neo、pIE1FB、pIE1NFB、p39FB、pIE
1tPAの構成を概略的に示している。
図２は、前初期転移ベクター（pIETV）を示す線図で
ある。pIETVは、AcNPV DNAのEcoR Iフラグメントから
構成されている。（）は構成中に破壊される部位を示
す。矢印は図示の遺伝子の転写方向を示す。矢印の先端
はポリアデニル化部位を示す。斜線を付したブロックは
多重クローニング配列（図面の下側の配列）を示す。
ある。pIETVは、AcNPV DNAのEcoR Iフラグメントから
構成されている。（）は構成中に破壊される部位を示
す。矢印は図示の遺伝子の転写方向を示す。矢印の先端
はポリアデニル化部位を示す。斜線を付したブロックは
多重クローニング配列（図面の下側の配列）を示す。
図３は前初期転移ベクタープラスミドDNA（pIETV）を
使用して昆虫細胞形質転換クローンまたは組換えバキュ
ロウィルスを産生する２種類の異なる方法を示す図であ
る。
使用して昆虫細胞形質転換クローンまたは組換えバキュ
ロウィルスを産生する２種類の異なる方法を示す図であ
る。
発明を実施するための最良の形態 ここで、バキュロウィルス初期遺伝子にはバキュロウ
ィルス前初期遺伝子とバキュロウィルス後初期遺伝子と
を含むものとする。前初期遺伝子は非感染細胞で発現す
るウィルス遺伝子からなり、遺伝子IE1およびIENを含
む。後初期遺伝子は、IE1およびIENのような前初期遺伝
子産物によってtransで活性化されるウィルス遺伝子で
ある。AcMNPV 39K遺伝子はAcMNPVのHind III−ｋフラ
グメントの４つの後初期転写物であり、後初期遺伝子の
一例として挙げられる。前初期遺伝子産物の制御下での
後初期遺伝子からの転写は、hr1、hr2、hr3、hr4、hr5
のようなcis結合エンハンサーの存在下で促進される。
ィルス前初期遺伝子とバキュロウィルス後初期遺伝子と
を含むものとする。前初期遺伝子は非感染細胞で発現す
るウィルス遺伝子からなり、遺伝子IE1およびIENを含
む。後初期遺伝子は、IE1およびIENのような前初期遺伝
子産物によってtransで活性化されるウィルス遺伝子で
ある。AcMNPV 39K遺伝子はAcMNPVのHind III−ｋフラ
グメントの４つの後初期転写物であり、後初期遺伝子の
一例として挙げられる。前初期遺伝子産物の制御下での
後初期遺伝子からの転写は、hr1、hr2、hr3、hr4、hr5
のようなcis結合エンハンサーの存在下で促進される。
ここで、異種遺伝子・異種DNAには、ウィルス由来の
遺伝子・DNAを含む原核遺伝子・DNA、真核遺伝子・DNA
を含むDNAの外因性の原因を含むものとする。
遺伝子・DNAを含む原核遺伝子・DNA、真核遺伝子・DNA
を含むDNAの外因性の原因を含むものとする。
以下に示す例は、本願発明者らが本発明による様々な
態様を実施する上で好ましい方法であると考えている実
験室技術である。しかしながら、本願に記載の内容に鑑
みて、本発明の構成および実施に関する様々な修正およ
び変更が可能であることは当業者らによって容易に理解
でき、これらは本発明の趣旨および範囲内にある。
態様を実施する上で好ましい方法であると考えている実
験室技術である。しかしながら、本願に記載の内容に鑑
みて、本発明の構成および実施に関する様々な修正およ
び変更が可能であることは当業者らによって容易に理解
でき、これらは本発明の趣旨および範囲内にある。
プラスミド寄託 バキュロウイルス前初期プロモータIE1を含む好まし
いプラスミドであるpIE1を1989年７月６日にAmerican
Type Culture Collection,（Rockville,Maryland）に
寄託し、受入れ番号40630を受理している。後初期プロ
モータ39Kおよび転写エンハンサーエレメントを含む好
ましいプラスミドであるp39E+を1989年７月６日にAmeri
can Type Culture Collection,（Rockville,Marylan
d）に寄託し、受入れ番号40629を受理している。AcMNPV
のHind III−ｋフラグメントの４つの後初期転写物を含
む好ましいプラスミドであるpHind III Kを1989年７月
６日にAmerican Type Culture Collection,（Rockvi
lle,Maryland）に寄託し、受入れ番号40628を受理して
いる。
いプラスミドであるpIE1を1989年７月６日にAmerican
Type Culture Collection,（Rockville,Maryland）に
寄託し、受入れ番号40630を受理している。後初期プロ
モータ39Kおよび転写エンハンサーエレメントを含む好
ましいプラスミドであるp39E+を1989年７月６日にAmeri
can Type Culture Collection,（Rockville,Marylan
d）に寄託し、受入れ番号40629を受理している。AcMNPV
のHind III−ｋフラグメントの４つの後初期転写物を含
む好ましいプラスミドであるpHind III Kを1989年７月
６日にAmerican Type Culture Collection,（Rockvi
lle,Maryland）に寄託し、受入れ番号40628を受理して
いる。
実験 開始材料および方法 本発明の好ましい実施例によれば、ネオマイシン耐性
遺伝子（Neo−Ｒ）を使用するが、これはP.J.Southern
およびP.Berg,J.Mol.Appl.Gen.、1:327−341（1982）に
記載の方法に基づいて得たものである。しかしながら、
本記載内容から得るところのある当業者は、他の遺伝子
も適宜使用可能であることを理解できよう。特に、少な
くともJ.C.LiおよびE.Kaminskas,PNAS、81:5694−5698
（1981）に記載の方法に基づいて得られるハイグロマイ
シンＢ耐性遺伝子（Hygro−Ｒ）およびメトトレキセー
ト耐性遺伝子（Metho−Ｒ）は有効利用できるものと思
われる。
遺伝子（Neo−Ｒ）を使用するが、これはP.J.Southern
およびP.Berg,J.Mol.Appl.Gen.、1:327−341（1982）に
記載の方法に基づいて得たものである。しかしながら、
本記載内容から得るところのある当業者は、他の遺伝子
も適宜使用可能であることを理解できよう。特に、少な
くともJ.C.LiおよびE.Kaminskas,PNAS、81:5694−5698
（1981）に記載の方法に基づいて得られるハイグロマイ
シンＢ耐性遺伝子（Hygro−Ｒ）およびメトトレキセー
ト耐性遺伝子（Metho−Ｒ）は有効利用できるものと思
われる。
ウィルスDNA G.E.SmithおよびM.D.Summers,Virology、89:517−520
（1978）、G.E.SmithおよびM.D.Summers,J.Virol.、39:
125−137（1981）に記載の方法に基づいて、本例でウィ
ルスDNA生成源として使用したバキュロウィルスであるA
utographa californica核多角体病ウィルス（AcMNPV）
を単離した。
（1978）、G.E.SmithおよびM.D.Summers,J.Virol.、39:
125−137（1981）に記載の方法に基づいて、本例でウィ
ルスDNA生成源として使用したバキュロウィルスであるA
utographa californica核多角体病ウィルス（AcMNPV）
を単離した。
本発明の好ましい実施例によれば、AcMNPVやE2の特定
の菌株を使用することもできる。しかしながら、本記載
内容から得るところのある当業者は、他のバキュロウィ
ルスや他のバキュロウィルス菌株を使用してウィルスDN
Aを得ることも可能であることを理解できよう。特に、
少なくとも密接に関連した自然発生菌株であるTrichopl
usia ni MNPV、Rachiplusia ou MNPV、Galleria m
ellonella MNPVや、G.E.SmithおよびM.D.Summers,J.Vi
rol.、33:311−319（1980）において単離され特徴付け
られたAcMNPVのM3、R9、SI、S3菌株のような溶菌斑精製
菌株などは有効利用できるものと思われる。上述の菌株
および他の菌株については、G.E.SmithおよびM.D.Summe
rs,J.Virol.、89:517−527（1978）に記載されている。
の菌株を使用することもできる。しかしながら、本記載
内容から得るところのある当業者は、他のバキュロウィ
ルスや他のバキュロウィルス菌株を使用してウィルスDN
Aを得ることも可能であることを理解できよう。特に、
少なくとも密接に関連した自然発生菌株であるTrichopl
usia ni MNPV、Rachiplusia ou MNPV、Galleria m
ellonella MNPVや、G.E.SmithおよびM.D.Summers,J.Vi
rol.、33:311−319（1980）において単離され特徴付け
られたAcMNPVのM3、R9、SI、S3菌株のような溶菌斑精製
菌株などは有効利用できるものと思われる。上述の菌株
および他の菌株については、G.E.SmithおよびM.D.Summe
rs,J.Virol.、89:517−527（1978）に記載されている。
酵素 これらの構成に使用した制限酵素および他の酵素は、
Bethesda Research Laboratories（Bethesda,Marylan
d）、Promega（Medison,Wisconsin）、New England B
iolabs,Inc.（Beverly,Massachusetts）のいずれかから
入手した。
Bethesda Research Laboratories（Bethesda,Marylan
d）、Promega（Medison,Wisconsin）、New England B
iolabs,Inc.（Beverly,Massachusetts）のいずれかから
入手した。
β−ガラクトシダーゼDNA 本例で使用したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子から成る
DNAフラグメントは、Dr.Max D.Summers,Dept.of Ento
mology,Texas Ａ＆Ｍ University,College station,
Texas 77843から入手したプラスミドpDP500から単離し
たものである。（V.A.LuckowおよびM.D.Summers,Viro
l.,167:56−71（1988b）参照。）β−ガラクトシダーゼ
遺伝子から成るDNAフラグメントを含むプラスミドは、A
merican Type culture Collection（Rockville,Mary
land）から入手できる。
DNAフラグメントは、Dr.Max D.Summers,Dept.of Ento
mology,Texas Ａ＆Ｍ University,College station,
Texas 77843から入手したプラスミドpDP500から単離し
たものである。（V.A.LuckowおよびM.D.Summers,Viro
l.,167:56−71（1988b）参照。）β−ガラクトシダーゼ
遺伝子から成るDNAフラグメントを含むプラスミドは、A
merican Type culture Collection（Rockville,Mary
land）から入手できる。
tPA DNA 本例で使用したヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
遺伝子から成るDNAフラグメントは、Dr.Max D.Summer
s,Dept.of Entomology,Texas Ａ＆Ｍ University,Co
llege station,Texas 77843から入手したプラスミドp
VL327から単離したものである。（V.A.LuckowおよびM.
D.Summers,Virol.,167:56−71（1988b）参照。）ヒト組
織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子から成るDNAフラ
グメントを含むプラスミドは、American Type Cultur
e Collection,（Rockville,Maryland）から入手でき
る。
遺伝子から成るDNAフラグメントは、Dr.Max D.Summer
s,Dept.of Entomology,Texas Ａ＆Ｍ University,Co
llege station,Texas 77843から入手したプラスミドp
VL327から単離したものである。（V.A.LuckowおよびM.
D.Summers,Virol.,167:56−71（1988b）参照。）ヒト組
織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子から成るDNAフラ
グメントを含むプラスミドは、American Type Cultur
e Collection,（Rockville,Maryland）から入手でき
る。
昆虫細胞系 鱗翅目昆虫細胞系IPLB−SfZI−AEは、10年以上前にア
キアワヨトウガSpodoptera frugiperda（J.L.Vaughn
他、In Vitro,13:213−217（1977））から樹立され
た。
キアワヨトウガSpodoptera frugiperda（J.L.Vaughn
他、In Vitro,13:213−217（1977））から樹立され
た。
Spodoptera frugiperda Sf9細胞系は、American T
ype Culture Collection,（Rockville,Maryland）の
受入れ番号ATCC CRL 1711である。M.D.Summersおよび
G.E.Smith,A Manual of Methods for Baculovirus
Vectors and Insect Cell Culture Procedures,
Texas Agricultural Experiment Station Bulletin
No.1555,Texas Ａ＆Ｍ University（1987）を参照
のこと。本記載内容から得るところのある当業者は、Sf
9細胞系の他のクローン誘導体も有効利用できることを
理解できよう。
ype Culture Collection,（Rockville,Maryland）の
受入れ番号ATCC CRL 1711である。M.D.Summersおよび
G.E.Smith,A Manual of Methods for Baculovirus
Vectors and Insect Cell Culture Procedures,
Texas Agricultural Experiment Station Bulletin
No.1555,Texas Ａ＆Ｍ University（1987）を参照
のこと。本記載内容から得るところのある当業者は、Sf
9細胞系の他のクローン誘導体も有効利用できることを
理解できよう。
細胞培地 本例で使用したTNMFH培地は、M.D.SummersおよびG.E.
Smith,A Manual of Methods for Baculovirus Ve
ctors and Insect Cell Culture Procedures,Texa
s Agricultural Experiment Station Bulletin N
o.1555,Texas Ａ＆Ｍ University（1987）に記載の方
法に基づいて調製した。（W.F.Hink,Nature（London）,
226:466−467（1970）も参照のこと。）TNMFH培地を添
加するために使用したウシ胎児血清はHazelton Resear
ch Products,Inc.（Lenexa,Kansas）から入手できる。
Smith,A Manual of Methods for Baculovirus Ve
ctors and Insect Cell Culture Procedures,Texa
s Agricultural Experiment Station Bulletin N
o.1555,Texas Ａ＆Ｍ University（1987）に記載の方
法に基づいて調製した。（W.F.Hink,Nature（London）,
226:466−467（1970）も参照のこと。）TNMFH培地を添
加するために使用したウシ胎児血清はHazelton Resear
ch Products,Inc.（Lenexa,Kansas）から入手できる。
抗生物質 本例で使用したネオマイシン抗生物質G418はGIBCO（G
rand Island,New York）から入手した。ハイグロマイ
シンＢ抗生物質およびメトトレキセート抗生物質は、Si
gma Chemical Company（St.Louis,Missouri）から販
売されている。
rand Island,New York）から入手した。ハイグロマイ
シンＢ抗生物質およびメトトレキセート抗生物質は、Si
gma Chemical Company（St.Louis,Missouri）から販
売されている。
方法 すべてのプラスミドは、United States Dept.of H
EW,National Institute of Health（NIH）Guideline
s for Recombinant DNA Researchに記載のように調
製し、T.Maniatis、E.F.FritschおよびJ.Sambrook,Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring
Harbor Laboratory（1982）に記載の標準的な組換え
DNA技術を使用して構成精製した。これらの文献は以下
の標準的な方法の実施手順についての記載を含む。すな
わち、E.coliプラスミドを使用したクローニング手順、
E.coli細胞の形質転換、プラスミドDNA精製、DNAのフェ
ノール抽出、DNAのエタノール沈殿、寒天ゲル電気泳
動、寒天ゲルからのDNAフラグメント精製、制限エンド
ヌクレアーゼ反応および他のDNA修飾酵素反応である。
EW,National Institute of Health（NIH）Guideline
s for Recombinant DNA Researchに記載のように調
製し、T.Maniatis、E.F.FritschおよびJ.Sambrook,Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring
Harbor Laboratory（1982）に記載の標準的な組換え
DNA技術を使用して構成精製した。これらの文献は以下
の標準的な方法の実施手順についての記載を含む。すな
わち、E.coliプラスミドを使用したクローニング手順、
E.coli細胞の形質転換、プラスミドDNA精製、DNAのフェ
ノール抽出、DNAのエタノール沈殿、寒天ゲル電気泳
動、寒天ゲルからのDNAフラグメント精製、制限エンド
ヌクレアーゼ反応および他のDNA修飾酵素反応である。
本例に基づいて使用したpAc510およびpAc360−β−ガ
ラクトシダーゼを含む特定プラスミドの同時導入および
調製という昆虫細胞培養の標準的な方法は、M.D.Summer
sおよびG.E.Smith,A Manual of Methods for Bacu
lovirus Vectors and Insect Cell Culture Proc
edures,Texas Agricultural Experiment Station B
ulletin No.1555,Texas Ａ＆Ｍ University（1987）
に記載されている。この文献はAcMNPV転移ベクターへの
遺伝子クローニング、プラスミドDNA単離、AcMNPVゲノ
ムへの遺伝子転移、ウィルスDNA精製、組換えタンパク
質の放射能標識、昆虫細胞培地の調製などについての標
準的な方法も開示している。
ラクトシダーゼを含む特定プラスミドの同時導入および
調製という昆虫細胞培養の標準的な方法は、M.D.Summer
sおよびG.E.Smith,A Manual of Methods for Bacu
lovirus Vectors and Insect Cell Culture Proc
edures,Texas Agricultural Experiment Station B
ulletin No.1555,Texas Ａ＆Ｍ University（1987）
に記載されている。この文献はAcMNPV転移ベクターへの
遺伝子クローニング、プラスミドDNA単離、AcMNPVゲノ
ムへの遺伝子転移、ウィルスDNA精製、組換えタンパク
質の放射能標識、昆虫細胞培地の調製などについての標
準的な方法も開示している。
ウィルスおよび細胞の培養手順は、L.E.Volkmanおよ
びM.D.Summers,J.Virol,19:820−832（1975）や、L.E.V
olkman、M.D.SummersおよびC.H.Hsieh,J.Virol,19:820
−832（1976）に記載されている。成長速度はS.frugipe
rdaと1.5％アガロース・オーバーレイとを使用してVolk
man他、同上に記載されているように判定した。
びM.D.Summers,J.Virol,19:820−832（1975）や、L.E.V
olkman、M.D.SummersおよびC.H.Hsieh,J.Virol,19:820
−832（1976）に記載されている。成長速度はS.frugipe
rdaと1.5％アガロース・オーバーレイとを使用してVolk
man他、同上に記載されているように判定した。
生化学的分析 T.Maniatis、E.F.FritschおよびJ.Sambrook,Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Har
bor Laboratory（1982）に記載の標準的な方法によっ
て、Sf9細胞（継代26;以下「P26」と呼ぶ）またはクロ
ーン誘導体（IE1FB1,P21;IE1FB2,P21;IE1FB4,P20;IE1FB
5,P20;IE1FB7,P19）から全細胞性DNAを抽出した。Sf9細
胞またはクローン誘導体（B.HirtによってJ.Mol.Bjol.,
26:365−369（1967）に記載されたようなIE1FB1,P17;IE
1FB2,P16およびP49;IE1FB4,P21;IE1FB7,P15）からHirt
ライゼートを調製した。E.M.Southern,J.Mol.Biol.,98:
503−517（1975）記載の方法によってプラスミド配列の
存在下でDNA標本を分析した。A.P.FeinbergおよびB.Vog
elstein,Analyt.Biochem.,132:6−13（1983）に記載の
ランダムプライマー法によって、サザン分析に使用した
プローブを［α-32p］dATP（New England Nuclear,Bo
ston,Massachusetts;800 Ci/mmol）で標識した。J.G.
W.FlemingおよびM.D.Summers,J.Virol.,57:552−562（1
986）に記載されているようにサザンブロットをハイブ
リッド形成し、高緊張状態で洗浄した。J.M.Chirgwin
他、Biochemistry,18:5294−5299（1979）の方法によっ
て全細胞RNAを抽出し、R.F.WeaverおよびC.Weissman,Nu
cleic Acid Res.,7:1175−1193（1979）に記載の方法
に基づいてS1ヌクレアーゼ保護分析を行った。S1マッピ
ング用プローブには、ポリヌクレオチドキナーゼによっ
て５′末端標識したゲル精製制限フラグメントを使用し
た。全細胞性タンパク質をデタージェント抽出し、S.W.
Kessler,J.Immunol.,115:1617−1624（1975）に記載の
放射性免疫沈降法、U.K.Laemmli,Nature,227:680−685
（1970）に記載のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）、H.Towbin,T.Staehl
inおよびJ.Gordon,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76:4350
−4354（1979）に記載され、この以前にD.L.Jarvisおよ
びM.D.Summers,Mol.Cell.Biol.,9:214−223（1989）に
記載されたSDS−PAGEとウエスタンブロッティングを両
方用いる方法のいずれかによって分析した。M.S.Blake
他,Anal.Biochem.,36:175−179（1984）に記載されたア
ルカリ性ホスファダーゼによるウエスタンブロットで免
疫複合体を検出した。I.ZamnおよびA.Fowler,in:The L
actose Operon,p.27,Cold Spring Harbor Press,Co
ld Spring Harbor,New York（1970）記載の修飾方法
を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性を検定した。β−
ガラクトシダーゼ活性単位を100万セル/420nm/時の吸光
度の変化の形で表１および表２に示す。１×106細胞／
時からの抽出物を保温した後の１活性単位は1.0吸光度
単位増加量に相当する。
r Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Har
bor Laboratory（1982）に記載の標準的な方法によっ
て、Sf9細胞（継代26;以下「P26」と呼ぶ）またはクロ
ーン誘導体（IE1FB1,P21;IE1FB2,P21;IE1FB4,P20;IE1FB
5,P20;IE1FB7,P19）から全細胞性DNAを抽出した。Sf9細
胞またはクローン誘導体（B.HirtによってJ.Mol.Bjol.,
26:365−369（1967）に記載されたようなIE1FB1,P17;IE
1FB2,P16およびP49;IE1FB4,P21;IE1FB7,P15）からHirt
ライゼートを調製した。E.M.Southern,J.Mol.Biol.,98:
503−517（1975）記載の方法によってプラスミド配列の
存在下でDNA標本を分析した。A.P.FeinbergおよびB.Vog
elstein,Analyt.Biochem.,132:6−13（1983）に記載の
ランダムプライマー法によって、サザン分析に使用した
プローブを［α-32p］dATP（New England Nuclear,Bo
ston,Massachusetts;800 Ci/mmol）で標識した。J.G.
W.FlemingおよびM.D.Summers,J.Virol.,57:552−562（1
986）に記載されているようにサザンブロットをハイブ
リッド形成し、高緊張状態で洗浄した。J.M.Chirgwin
他、Biochemistry,18:5294−5299（1979）の方法によっ
て全細胞RNAを抽出し、R.F.WeaverおよびC.Weissman,Nu
cleic Acid Res.,7:1175−1193（1979）に記載の方法
に基づいてS1ヌクレアーゼ保護分析を行った。S1マッピ
ング用プローブには、ポリヌクレオチドキナーゼによっ
て５′末端標識したゲル精製制限フラグメントを使用し
た。全細胞性タンパク質をデタージェント抽出し、S.W.
Kessler,J.Immunol.,115:1617−1624（1975）に記載の
放射性免疫沈降法、U.K.Laemmli,Nature,227:680−685
（1970）に記載のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）、H.Towbin,T.Staehl
inおよびJ.Gordon,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76:4350
−4354（1979）に記載され、この以前にD.L.Jarvisおよ
びM.D.Summers,Mol.Cell.Biol.,9:214−223（1989）に
記載されたSDS−PAGEとウエスタンブロッティングを両
方用いる方法のいずれかによって分析した。M.S.Blake
他,Anal.Biochem.,36:175−179（1984）に記載されたア
ルカリ性ホスファダーゼによるウエスタンブロットで免
疫複合体を検出した。I.ZamnおよびA.Fowler,in:The L
actose Operon,p.27,Cold Spring Harbor Press,Co
ld Spring Harbor,New York（1970）記載の修飾方法
を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性を検定した。β−
ガラクトシダーゼ活性単位を100万セル/420nm/時の吸光
度の変化の形で表１および表２に示す。１×106細胞／
時からの抽出物を保温した後の１活性単位は1.0吸光度
単位増加量に相当する。
免疫蛍光法 間接免疫蛍光法を使用してSf9細胞やこの細胞のクロ
ーン変異株の抗原を可視化した。カバーグラス上の細胞
を異なる時間で成長させ、PHEM緩衝液（60mM PIPES,25
mM HEPES,10mM EGTA,2mM MgCl2,pH6.9;REF）で洗浄
した。さらに、ホルムアルデヒド（PHEM中２％w/v;パラ
ホルムアルデヒドから新たに調製）を加えて室温で20分
かけて固定した。この細胞をPHEMで洗浄し、PHEM中の0.
1％Triton−Ｘ−100によって室温でさらに20分処理し、
ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（DPBS）で洗浄した。２
％ヤギ正常血清含有DPBSで希釈した一次抗体（例えばマ
ウス抗β−ガラクトシダーゼ;Promega;Madison,Wiscons
in）を固定可溶化した細胞に加え、加湿器内にて室温で
さらに30分保温した。この細胞をDPBSで洗浄し、二次抗
体（例えばヤギ抗マウスIgG−FITC;Organon Teknika
Corporation;West Chester,Pennsylvania）を加えて上
述した条件下で保温した。最後に、DPBSおよび水で細胞
を洗浄し、Olympus Vanox Model AHBT顕微鏡（オリ
ンパス光学工業；東京、日本）を使用して蛍光検鏡およ
び写真撮影を行った。
ーン変異株の抗原を可視化した。カバーグラス上の細胞
を異なる時間で成長させ、PHEM緩衝液（60mM PIPES,25
mM HEPES,10mM EGTA,2mM MgCl2,pH6.9;REF）で洗浄
した。さらに、ホルムアルデヒド（PHEM中２％w/v;パラ
ホルムアルデヒドから新たに調製）を加えて室温で20分
かけて固定した。この細胞をPHEMで洗浄し、PHEM中の0.
1％Triton−Ｘ−100によって室温でさらに20分処理し、
ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（DPBS）で洗浄した。２
％ヤギ正常血清含有DPBSで希釈した一次抗体（例えばマ
ウス抗β−ガラクトシダーゼ;Promega;Madison,Wiscons
in）を固定可溶化した細胞に加え、加湿器内にて室温で
さらに30分保温した。この細胞をDPBSで洗浄し、二次抗
体（例えばヤギ抗マウスIgG−FITC;Organon Teknika
Corporation;West Chester,Pennsylvania）を加えて上
述した条件下で保温した。最後に、DPBSおよび水で細胞
を洗浄し、Olympus Vanox Model AHBT顕微鏡（オリ
ンパス光学工業；東京、日本）を使用して蛍光検鏡およ
び写真撮影を行った。
例Ｉ 組換えプラスミドの構成 本例で使用したすべての構成物を図１に示す。プラス
ミドpIE1Neoは、IE1プロモータ（L.A.GuarinoおよびM.
D.Summers,J.Virol.,57:563−571（1986a）;J.Virol.,6
1:2091−2099（1987））のすぐ下流にネオマイシン耐性
遺伝子Neo−Ｒ（P.J.SouthernおよびP.Berg,J.Mol.App
l.Gen.,1:327−341（1982））を含む。このプラスミド
はNeo−Ｒをコード化する修復Bgl II−BamH Iフラグメ
ントをIE1の翻訳開始部位の上流のHinc部位39塩基対に
挿入することによって構成した。
ミドpIE1Neoは、IE1プロモータ（L.A.GuarinoおよびM.
D.Summers,J.Virol.,57:563−571（1986a）;J.Virol.,6
1:2091−2099（1987））のすぐ下流にネオマイシン耐性
遺伝子Neo−Ｒ（P.J.SouthernおよびP.Berg,J.Mol.App
l.Gen.,1:327−341（1982））を含む。このプラスミド
はNeo−Ｒをコード化する修復Bgl II−BamH Iフラグメ
ントをIE1の翻訳開始部位の上流のHinc部位39塩基対に
挿入することによって構成した。
プラスミドp39E+Neoは、39K（L.A.GuarinoおよびM.D.
Summers,J.Virol.,57:563−571（1986a）プロモータ
と、このプロモータ上流に位置するエンハンサーエレメ
ントhr5（L.A.GuarinoおよびM.D.Summers.J.Virol.,60:
215−223（1986b）;L.A.Guarino他,J.Virol.,60:24−22
9（1986）、39K遺伝子の５′AUG下流７塩基対のフレー
ムに挿入したNeo−Ｒ遺伝子とを含む。このプラスミド
は、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで修復
した後BstB Iで消化し、BamH IでCAT配列を欠失し、Bgl
II（修復;BstB IおよびBamH I部位でNeo−Ｒをコード
化するBamH Iフラグメント）することによりp39CATQ"
（L.A.GuarinoおよびM.D.Summers,J.Virol.,57:563−47
1（1986a）から誘導した。本発明の好ましい実施例によ
れば、AcMNPV転写エンハンサーエレメントhr5を使用す
ることもできる。しかしながら、本記載内容から得ると
ころのある当業者は、バキュロウィルス前初期遺伝子や
遺伝子プロモータと他の転写エンハンサーエレメントと
を組み合わせてもよいことは理解できよう。特に、少な
くともL.A.Guarino、M.A.GonzalezおよびM.D.Summers,
J.Virol.,60:224−229（1986）に記載・特徴付けられて
いるAcMNPV転写エンハンサーエレメントhr1、hr2、hr
3、hr4は有効利用できる。
Summers,J.Virol.,57:563−571（1986a）プロモータ
と、このプロモータ上流に位置するエンハンサーエレメ
ントhr5（L.A.GuarinoおよびM.D.Summers.J.Virol.,60:
215−223（1986b）;L.A.Guarino他,J.Virol.,60:24−22
9（1986）、39K遺伝子の５′AUG下流７塩基対のフレー
ムに挿入したNeo−Ｒ遺伝子とを含む。このプラスミド
は、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで修復
した後BstB Iで消化し、BamH IでCAT配列を欠失し、Bgl
II（修復;BstB IおよびBamH I部位でNeo−Ｒをコード
化するBamH Iフラグメント）することによりp39CATQ"
（L.A.GuarinoおよびM.D.Summers,J.Virol.,57:563−47
1（1986a）から誘導した。本発明の好ましい実施例によ
れば、AcMNPV転写エンハンサーエレメントhr5を使用す
ることもできる。しかしながら、本記載内容から得ると
ころのある当業者は、バキュロウィルス前初期遺伝子や
遺伝子プロモータと他の転写エンハンサーエレメントと
を組み合わせてもよいことは理解できよう。特に、少な
くともL.A.Guarino、M.A.GonzalezおよびM.D.Summers,
J.Virol.,60:224−229（1986）に記載・特徴付けられて
いるAcMNPV転写エンハンサーエレメントhr1、hr2、hr
3、hr4は有効利用できる。
プラスミドp39E-Neoは、プラスミドp39E+Neoと同様に
構成した。しかしながら、p39E-Neoはhr5（または他
の）エンハンサーを欠いており、Hind III消化およびp3
9E+Neoの再リガーゼによって構成する。
構成した。しかしながら、p39E-Neoはhr5（または他
の）エンハンサーを欠いており、Hind III消化およびp3
9E+Neoの再リガーゼによって構成する。
プラスミドpIE139Neoは、Neo−Ｒをコード化するBgl
II−BamH IフラグメントでBamH Iを置換することによっ
てp39CAT/IE−１（L.A.GuarinoおよびM.D.Summers,J.Vi
rol.,57:563−571（1986a））から誘導した。
II−BamH IフラグメントでBamH Iを置換することによっ
てp39CAT/IE−１（L.A.GuarinoおよびM.D.Summers,J.Vi
rol.,57:563−571（1986a））から誘導した。
プラスミドp510Neoは、M.D.SummersおよびG.E.Smith,
A Manual of Methods for Baculovirus Vectors
and Insect Cell Culture Procedures,Texas Ag
ricultural Experiment Station Bulletin No.155
5,Texas Ａ＆Ｍ University（1987）に記載された後
期転写ベクターであるpAc510の固有のBamH I部位でNeo
−Ｒをコード化するBgl II−BamH Iフラグメントを挿入
することによって構成した。
A Manual of Methods for Baculovirus Vectors
and Insect Cell Culture Procedures,Texas Ag
ricultural Experiment Station Bulletin No.155
5,Texas Ａ＆Ｍ University（1987）に記載された後
期転写ベクターであるpAc510の固有のBamH I部位でNeo
−Ｒをコード化するBgl II−BamH Iフラグメントを挿入
することによって構成した。
プラスミドpIE1FBは、pAcIE1のEco47III部位にBgl II
リンカーを添加し、続いてpDP500（D.Panicali、A,Grza
leckiおよびC.Huang,Gene,47:193−199（1986））から
得た、機能的E.coliβ−ガラクトシダーゼをその部位で
コード化するBgl IIフラグメントを挿入することによっ
て構成した。これによってβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
はIE1翻訳開始部位下流36塩基対部位のフレームに位置
決めされ、IE1の最初の12個のアミノ酸とβ−ガラクト
シダーゼフラグメントとを融合する。
リンカーを添加し、続いてpDP500（D.Panicali、A,Grza
leckiおよびC.Huang,Gene,47:193−199（1986））から
得た、機能的E.coliβ−ガラクトシダーゼをその部位で
コード化するBgl IIフラグメントを挿入することによっ
て構成した。これによってβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
はIE1翻訳開始部位下流36塩基対部位のフレームに位置
決めされ、IE1の最初の12個のアミノ酸とβ−ガラクト
シダーゼフラグメントとを融合する。
プラスミドpIE1NFBは、β−ガラクトシダーゼをコー
ド化するBgl IIフラグメントをHinc IIのIE1翻訳開始部
位上流39塩基対に挿入した以外はpIE1FBの構成と同様の
方法で構成した。このため、このプラスミドは非融合β
−ガラクトシダーゼ遺伝子産物をコード化する。
ド化するBgl IIフラグメントをHinc IIのIE1翻訳開始部
位上流39塩基対に挿入した以外はpIE1FBの構成と同様の
方法で構成した。このため、このプラスミドは非融合β
−ガラクトシダーゼ遺伝子産物をコード化する。
プラスミドp39E+FBは、Neo−Ｒコード配列のβ−ガラ
クトシダーゼコード配列を適所に有するようにしたこと
以外はp39E+Neoと同様に構成した。
クトシダーゼコード配列を適所に有するようにしたこと
以外はp39E+Neoと同様に構成した。
プラスミドpIE1tPAは、組織プラスミノーゲン活性化
因子（tPA）をコード化するBamH Iフラグメントをβ−
ガラクトシダーゼの代わりにIE1翻訳開始部位下流36塩
基対に挿入した以外はpIE1FBと同様に構成し、IE1コー
ド配列からみてフレーム外にくるようにしている。この
ため、このプラスミドは非融合tPA遺伝子産物をコード
化する。
因子（tPA）をコード化するBamH Iフラグメントをβ−
ガラクトシダーゼの代わりにIE1翻訳開始部位下流36塩
基対に挿入した以外はpIE1FBと同様に構成し、IE1コー
ド配列からみてフレーム外にくるようにしている。この
ため、このプラスミドは非融合tPA遺伝子産物をコード
化する。
さらに、本記載内容から得るところのある当業者は、
他の異種遺伝子や他のバキュロウィルス初期プロモータ
を使用して他のプラスミドを調製することも可能である
ことを理解できよう。
他の異種遺伝子や他のバキュロウィルス初期プロモータ
を使用して他のプラスミドを調製することも可能である
ことを理解できよう。
例II 安定形質転換昆虫細胞クローンの構成 本発明による安定形質転換昆虫細胞クローンを構成す
るために、鱗翅目昆虫細胞系からのクローン誘導体すな
わちSf9を使用して上述した新規な遺伝子構成を１つ以
上含む安定した遺伝子変異型を産生した。Sf9細胞を35m
m培養皿に約１×106の密度で播種し、最低１時間放置し
て付着させた。培地を除去し、M.D.SummersおよびG.E.S
mith,A Manual of Methods for Baculovirus Vec
tors and Insect Cell Culture Procedures,Texas
Agricultural Experiment Station Bulletin No.
1555,Texas Ａ＆Ｍ University（1987）に記載の方法
を使用して、目的のタンパク質（例えばβ−ガラクトシ
ダーゼ）をコード化する異種DNAを含む２μｇプラスミ
ドと１μｇ pIE1Neo DNAとの混合物で細胞を同時に導
入した。
るために、鱗翅目昆虫細胞系からのクローン誘導体すな
わちSf9を使用して上述した新規な遺伝子構成を１つ以
上含む安定した遺伝子変異型を産生した。Sf9細胞を35m
m培養皿に約１×106の密度で播種し、最低１時間放置し
て付着させた。培地を除去し、M.D.SummersおよびG.E.S
mith,A Manual of Methods for Baculovirus Vec
tors and Insect Cell Culture Procedures,Texas
Agricultural Experiment Station Bulletin No.
1555,Texas Ａ＆Ｍ University（1987）に記載の方法
を使用して、目的のタンパク質（例えばβ−ガラクトシ
ダーゼ）をコード化する異種DNAを含む２μｇプラスミ
ドと１μｇ pIE1Neo DNAとの混合物で細胞を同時に導
入した。
導入後、細胞を28℃で２時間保温し、洗浄し、10％ウ
シ胎児血清（Hazelton Research Products,Inc.Lenex
a,Kansas）および抗生物質（完全TNMFH）を補充したTNM
FH培地（M.D.SummersおよびG.E.Smith,（1987）、同上;
W.F.Hink,Nature（London）,226:466−467（1970））に
添加した。細胞を28℃でさらに22時間保温し、各培養皿
について低細胞密度で継代培養し、60mm培養皿で多数の
疎播種を行った。60mm培養皿の各々には約５×104個の
細胞を播種した。これらを28℃でさらに24時間保温し、
各皿の培地を1mg/mlネオマイシン抗生物質G418（GIBCO;
Grand Island,New York）を含む新鮮な完全TNMFHと交
換した。培養物を28℃で１週間保温して培地を交換した
後、この培養物を28℃でさらに１週間保温した。培地を
G418を含まない完全TNMFHと交換し、裸眼でもコロニー
をはっきりと認めることができるようになるまで培養物
を28℃で保温した。この時、各コロニーを取り出し、分
析用に十分な数の細胞が得られるまで各々増幅した。一
度増幅してしまうと、問題のクローンは28℃の完全TNMF
H中で着生培養物または懸濁培養物として定期的に成長
した。
シ胎児血清（Hazelton Research Products,Inc.Lenex
a,Kansas）および抗生物質（完全TNMFH）を補充したTNM
FH培地（M.D.SummersおよびG.E.Smith,（1987）、同上;
W.F.Hink,Nature（London）,226:466−467（1970））に
添加した。細胞を28℃でさらに22時間保温し、各培養皿
について低細胞密度で継代培養し、60mm培養皿で多数の
疎播種を行った。60mm培養皿の各々には約５×104個の
細胞を播種した。これらを28℃でさらに24時間保温し、
各皿の培地を1mg/mlネオマイシン抗生物質G418（GIBCO;
Grand Island,New York）を含む新鮮な完全TNMFHと交
換した。培養物を28℃で１週間保温して培地を交換した
後、この培養物を28℃でさらに１週間保温した。培地を
G418を含まない完全TNMFHと交換し、裸眼でもコロニー
をはっきりと認めることができるようになるまで培養物
を28℃で保温した。この時、各コロニーを取り出し、分
析用に十分な数の細胞が得られるまで各々増幅した。一
度増幅してしまうと、問題のクローンは28℃の完全TNMF
H中で着生培養物または懸濁培養物として定期的に成長
した。
例III 異種遺伝子の連続的発現に使用するプロモータの評価 AcMNPV前初期および後初期プロモータの一例としてIE
1および39Kプロモータを挙げておく。しかしながら、本
記載内容から得るところのある当業者は、他のバキュロ
ウィルス前初期プロモータでも有効利用できることを理
解できよう。これらのウィルスプロモータの安定形質転
換Sf9細胞で抗生物質耐性Neo−Ｒ遺伝子の連続的な発現
を促進する能力を確認した。
1および39Kプロモータを挙げておく。しかしながら、本
記載内容から得るところのある当業者は、他のバキュロ
ウィルス前初期プロモータでも有効利用できることを理
解できよう。これらのウィルスプロモータの安定形質転
換Sf9細胞で抗生物質耐性Neo−Ｒ遺伝子の連続的な発現
を促進する能力を確認した。
例Ｉで構成した様々なプラスミド（すなわちpIENeo、
p39E-Neo、p39+Neo、pIE139Neo、p510Neo、pIE1FB、pIE
1NFB、p39+FB、pIE1tPASf9）で細胞培養物を同時に導入
して洗浄し、28℃で24時間保温した。これらの細胞培養
物を継代培養し、同数の細胞を播種した24枚のプレート
（直径60mm）にした。各培養物からの12プレートでは新
鮮なTNMFHに細胞を播種し、残りの12プレートでは1mg/m
l抗生物質G418を含有する新鮮なTNMFHに細胞を播種し
た。各皿に最初に播種する細胞の数を決めるために、M.
D.SummersおよびG.E.Smith,A.Manual of Methods fo
r Baculovirus Vectors and Insect Cell Cultur
e Procedures,Texas Agricultural Experiment Sta
tion Bulletin No.1555,Texas Ａ＆Ｍ University
（1987）に記載されているような標準的なトリパンブル
ー排除染色法を使用して開始細胞懸濁物の３倍標本の生
菌数を測定した。続いて３倍プレートを制御処理細胞と
G418処理細胞について各々２日間隔と４日間隔で測定し
た。
p39E-Neo、p39+Neo、pIE139Neo、p510Neo、pIE1FB、pIE
1NFB、p39+FB、pIE1tPASf9）で細胞培養物を同時に導入
して洗浄し、28℃で24時間保温した。これらの細胞培養
物を継代培養し、同数の細胞を播種した24枚のプレート
（直径60mm）にした。各培養物からの12プレートでは新
鮮なTNMFHに細胞を播種し、残りの12プレートでは1mg/m
l抗生物質G418を含有する新鮮なTNMFHに細胞を播種し
た。各皿に最初に播種する細胞の数を決めるために、M.
D.SummersおよびG.E.Smith,A.Manual of Methods fo
r Baculovirus Vectors and Insect Cell Cultur
e Procedures,Texas Agricultural Experiment Sta
tion Bulletin No.1555,Texas Ａ＆Ｍ University
（1987）に記載されているような標準的なトリパンブル
ー排除染色法を使用して開始細胞懸濁物の３倍標本の生
菌数を測定した。続いて３倍プレートを制御処理細胞と
G418処理細胞について各々２日間隔と４日間隔で測定し
た。
導入に使用したプラスミドに関係なく、すべての細胞
は抗生物質G418なしでもほぼ同等の成長曲線をたどっ
た。さらに、これらの成長曲線は導入していない正常な
Sf9細胞に典型的な曲線であった。このようなことか
ら、研究期間全体にわたって重大な毒性を示したプラス
ミドはないことが分かった。抗生物質G418を添加した場
合には、p510Neoを使用して導入した細胞は生存できな
かった。この結果は、Neo−Ｒ遺伝子を極めて後期の多
角体プロモータから発現するためには、その前にこの細
胞内には欠如している他の多数のウイルス遺伝子を発現
させておく必要があるという考え（L.K.Miller,Annual
Review of Microbiol.,42:177−199（1988））と一
致する。一方、pIE1NeoまたはP39+NeoにPIE1を加えたも
のを使用してSf9細胞を導入すると、多数のG418耐性細
胞が得られた。この結果から、IEプロモータまたは39K
プロモータのいずれかを使用してSf9細胞中にNeo−Ｒ遺
伝子産物を連続的に発現させることができるということ
が分かる。これらのプロモータおよび他のバキュロウィ
ルス初期プロモータを使用して、例えばβ−ガラクトシ
ダーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ヒトインタ
ーロイキン−２、ヒトβ−インターフェロンなどの異種
遺伝子産物も同様に発現できるということに注意された
い。また、ネオマイシンに対する耐性をコード化する遺
伝子に加えてハイグロマイシンＢやメトトレキセートに
対する耐性をコード化するような他の抗生物質耐性遺伝
子も有効利用できることに注意されたい。
は抗生物質G418なしでもほぼ同等の成長曲線をたどっ
た。さらに、これらの成長曲線は導入していない正常な
Sf9細胞に典型的な曲線であった。このようなことか
ら、研究期間全体にわたって重大な毒性を示したプラス
ミドはないことが分かった。抗生物質G418を添加した場
合には、p510Neoを使用して導入した細胞は生存できな
かった。この結果は、Neo−Ｒ遺伝子を極めて後期の多
角体プロモータから発現するためには、その前にこの細
胞内には欠如している他の多数のウイルス遺伝子を発現
させておく必要があるという考え（L.K.Miller,Annual
Review of Microbiol.,42:177−199（1988））と一
致する。一方、pIE1NeoまたはP39+NeoにPIE1を加えたも
のを使用してSf9細胞を導入すると、多数のG418耐性細
胞が得られた。この結果から、IEプロモータまたは39K
プロモータのいずれかを使用してSf9細胞中にNeo−Ｒ遺
伝子産物を連続的に発現させることができるということ
が分かる。これらのプロモータおよび他のバキュロウィ
ルス初期プロモータを使用して、例えばβ−ガラクトシ
ダーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ヒトインタ
ーロイキン−２、ヒトβ−インターフェロンなどの異種
遺伝子産物も同様に発現できるということに注意された
い。また、ネオマイシンに対する耐性をコード化する遺
伝子に加えてハイグロマイシンＢやメトトレキセートに
対する耐性をコード化するような他の抗生物質耐性遺伝
子も有効利用できることに注意されたい。
さらに、上述の結果から、IE1遺伝子産物および代表
的な転写エンハンサーエレメントhr5（L.A.Guarinoおよ
びM.D.Summers,J.Virol.,60:215−223（1986b）;L.A.Gu
arino、M.A.GonzalezおよびM.D.Summers,J.Virol.,60:2
24−229（1986））が39Kプロモータからの連続的な遺伝
子発現におよぼす影響も確認した。IE1が欠如したp39E-
Neoを使用した導入によって得られたG418耐性細胞の数
は最も少なかった。IE1の存在するp39E-NeoまたはIE1が
欠如したp39E+Neoを使用して導入を行うと、得られるG4
18耐性細胞の数は多くなる。最大数が得られたのは、IE
1およびhr5の両方が存在している場合であった。この結
果は、39Kプロモータからの発現はIE1遺伝子産物によっ
てtransで活性化され、hr5によってcisで活性化される
という以前に確認されている一時的発現アッセイ（L.A.
GuarinoおよびM.D.Summers,J.Virol.,57:563−571（198
6a）;J.Virol.,60:215−223（1986b））の結果と一致す
る。おもしろいことに、IE1プロモータだけを使用した
場合とIE1とhr5との両方を含む39Kプロモータを使用し
た場合とではほぼ同数の耐性細胞を得ることができた。
これらの観察結果に基くと、IE1プロモータのみであっ
てもIE1とAcMNPV転写エンハンサーエレメントhr5との両
方を含む39Kプロモータであっても、異種遺伝子を連続
的に発現させ得る安定形質転換Sf9細胞変異型の産生用
プロモータとして等しく有効利用できる。さらに、hr5
の他にAcMNPV転写エンハンサーエレメントhr1、hr2、hr
3、hr4も有効利用できることに注意されたい。
的な転写エンハンサーエレメントhr5（L.A.Guarinoおよ
びM.D.Summers,J.Virol.,60:215−223（1986b）;L.A.Gu
arino、M.A.GonzalezおよびM.D.Summers,J.Virol.,60:2
24−229（1986））が39Kプロモータからの連続的な遺伝
子発現におよぼす影響も確認した。IE1が欠如したp39E-
Neoを使用した導入によって得られたG418耐性細胞の数
は最も少なかった。IE1の存在するp39E-NeoまたはIE1が
欠如したp39E+Neoを使用して導入を行うと、得られるG4
18耐性細胞の数は多くなる。最大数が得られたのは、IE
1およびhr5の両方が存在している場合であった。この結
果は、39Kプロモータからの発現はIE1遺伝子産物によっ
てtransで活性化され、hr5によってcisで活性化される
という以前に確認されている一時的発現アッセイ（L.A.
GuarinoおよびM.D.Summers,J.Virol.,57:563−571（198
6a）;J.Virol.,60:215−223（1986b））の結果と一致す
る。おもしろいことに、IE1プロモータだけを使用した
場合とIE1とhr5との両方を含む39Kプロモータを使用し
た場合とではほぼ同数の耐性細胞を得ることができた。
これらの観察結果に基くと、IE1プロモータのみであっ
てもIE1とAcMNPV転写エンハンサーエレメントhr5との両
方を含む39Kプロモータであっても、異種遺伝子を連続
的に発現させ得る安定形質転換Sf9細胞変異型の産生用
プロモータとして等しく有効利用できる。さらに、hr5
の他にAcMNPV転写エンハンサーエレメントhr1、hr2、hr
3、hr4も有効利用できることに注意されたい。
例IV バキュロウィルス遺伝子初期プロモータからE.coliβ−
ガラクトシダーゼを発現する安定形質転換Sf9細胞の構
成 E.Coliβ−ガラクトシダーゼを連続的に発現する安定
形質転換変異型を産出するために、例Ｉのプラスミドを
使用して以下のようにSf9細胞を同時に導入した。すな
わち、pIE1FBとpIE1Neo、pIE1NFBとpIE1Neo、またはp39
E+FBとpIE1とpIE1Neoを使用したのである。導入後、G41
8耐性細胞を選択し、例Ｉ乃至IIIにおいて上述したよう
にコロニーを単離した。十分に単離されたコロニーを取
り出して増幅した。個々のクローンからの細胞質抽出物
を調製し、β−ガラクトシダーゼ活性検定を行った（表
１）。β−ガラクトシダーゼ活性は、IE1FBまたはIE1NF
Bを使用して導入後に単離したクローンの1/2を越え、p3
9E+FBを使用して導入後に単離したクローンの1/3より大
きい値が検出された。IE1FB2を使用した場合のクローン
の活性が最も大きく、Ac360−β−ガラクトシダーゼま
たはVL720βガラクトシダーゼに24時間感染させたSf9細
胞に一過的に発現した場合の約５〜15％であった。Ac36
0−β−ガラクトシダーゼやVL720β−ガラクトシダーゼ
は組換えバキュロウィルスであり、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子は多角体プロモータによって一過的に発現する
（Ac360−β−ガラクトシダーゼに関するM.D.Summersお
よびG.E.Smith,A Manual of Methods for Baculov
irus Vectors and Insect Cell Culture Procedu
res,Texas Agricultural Exporiment Station Bull
etin No.1555,Texas Ａ＆Ｍ University（1987）
や、V.A.LuckowおよびM.D.Summers,Virol.,167:56−71
（1988b）などを参照のこと）。さらに分析すること
で、正のIE1FBクローンの3/4は培養中に最低29継代まで
β−ガラクトシダーゼを連続して発現する（表２）とい
うことも分かった。表２において示すように、クローン
IE1FB2は55継代以上も連続してβ−ガラクトシダーゼを
発現した。IE1FB5クローンはβ−ガラクトシダーゼ発現
能を喪失しており、約20継代後に組込プラスミドDNA配
列が欠損した。これらの結果から、一般にIE1FB細胞は
約55継代後よりも３〜４継代後の方が多くのβ−ガラク
トシダーゼを発現するということが分かった。しかしな
がら、発現レベルは継代数30付近で安定し、外来遺伝子
の連続的な発現は安定形質転換細胞系において達成でき
るということも証明できた。
ガラクトシダーゼを発現する安定形質転換Sf9細胞の構
成 E.Coliβ−ガラクトシダーゼを連続的に発現する安定
形質転換変異型を産出するために、例Ｉのプラスミドを
使用して以下のようにSf9細胞を同時に導入した。すな
わち、pIE1FBとpIE1Neo、pIE1NFBとpIE1Neo、またはp39
E+FBとpIE1とpIE1Neoを使用したのである。導入後、G41
8耐性細胞を選択し、例Ｉ乃至IIIにおいて上述したよう
にコロニーを単離した。十分に単離されたコロニーを取
り出して増幅した。個々のクローンからの細胞質抽出物
を調製し、β−ガラクトシダーゼ活性検定を行った（表
１）。β−ガラクトシダーゼ活性は、IE1FBまたはIE1NF
Bを使用して導入後に単離したクローンの1/2を越え、p3
9E+FBを使用して導入後に単離したクローンの1/3より大
きい値が検出された。IE1FB2を使用した場合のクローン
の活性が最も大きく、Ac360−β−ガラクトシダーゼま
たはVL720βガラクトシダーゼに24時間感染させたSf9細
胞に一過的に発現した場合の約５〜15％であった。Ac36
0−β−ガラクトシダーゼやVL720β−ガラクトシダーゼ
は組換えバキュロウィルスであり、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子は多角体プロモータによって一過的に発現する
（Ac360−β−ガラクトシダーゼに関するM.D.Summersお
よびG.E.Smith,A Manual of Methods for Baculov
irus Vectors and Insect Cell Culture Procedu
res,Texas Agricultural Exporiment Station Bull
etin No.1555,Texas Ａ＆Ｍ University（1987）
や、V.A.LuckowおよびM.D.Summers,Virol.,167:56−71
（1988b）などを参照のこと）。さらに分析すること
で、正のIE1FBクローンの3/4は培養中に最低29継代まで
β−ガラクトシダーゼを連続して発現する（表２）とい
うことも分かった。表２において示すように、クローン
IE1FB2は55継代以上も連続してβ−ガラクトシダーゼを
発現した。IE1FB5クローンはβ−ガラクトシダーゼ発現
能を喪失しており、約20継代後に組込プラスミドDNA配
列が欠損した。これらの結果から、一般にIE1FB細胞は
約55継代後よりも３〜４継代後の方が多くのβ−ガラク
トシダーゼを発現するということが分かった。しかしな
がら、発現レベルは継代数30付近で安定し、外来遺伝子
の連続的な発現は安定形質転換細胞系において達成でき
るということも証明できた。
形質転換したSf9細胞クローン中におけるβ−ガラク
トシダーゼ関連ポリペプチドの存在を立証するために、
この細胞をパルス標識し、デタージェント抽出し、SDS
−PAGEによって免疫沈降を分析した。以下に述べるpIE1
FB形質転換クローン２、４、７の各々は特に見かけ上の
分子量約120,000の免疫反応性ポリペプチドを含んでい
た。このポリペプチドは偽感染またはAcMNPV感染Sf9細
胞やIE1FB形質転換クローン１、５（クローン５は初期
段階では正であったが継代に伴って反転した（表２）こ
とに注意）には検出されなかった。Ac360−β−ガラク
トシダーゼによって発現した同様の組換え産物を使用し
てこのポリペプチドを同時移動し、この時に多角体の最
初の11個のアミノ酸をβ−ガラクトシダーゼに対応する
フレームで融合（M.D.SummersおよびG.E.Smith,A Manu
al of Methods for Baculovirus Vectors and I
nsect Cell Culture Procedures,Texas Agricultur
al Experiment Station Bulletin No.1555,Texas
Ａ＆Ｍ University（1987））した。このように、ここ
に記載の手順で産生したポリペプチドは特定の免疫活
性、分子量、酵素活性を基準にすると信頼できるIE1−
β−ガラクトシダーゼ融合産物となった。
トシダーゼ関連ポリペプチドの存在を立証するために、
この細胞をパルス標識し、デタージェント抽出し、SDS
−PAGEによって免疫沈降を分析した。以下に述べるpIE1
FB形質転換クローン２、４、７の各々は特に見かけ上の
分子量約120,000の免疫反応性ポリペプチドを含んでい
た。このポリペプチドは偽感染またはAcMNPV感染Sf9細
胞やIE1FB形質転換クローン１、５（クローン５は初期
段階では正であったが継代に伴って反転した（表２）こ
とに注意）には検出されなかった。Ac360−β−ガラク
トシダーゼによって発現した同様の組換え産物を使用し
てこのポリペプチドを同時移動し、この時に多角体の最
初の11個のアミノ酸をβ−ガラクトシダーゼに対応する
フレームで融合（M.D.SummersおよびG.E.Smith,A Manu
al of Methods for Baculovirus Vectors and I
nsect Cell Culture Procedures,Texas Agricultur
al Experiment Station Bulletin No.1555,Texas
Ａ＆Ｍ University（1987））した。このように、ここ
に記載の手順で産生したポリペプチドは特定の免疫活
性、分子量、酵素活性を基準にすると信頼できるIE1−
β−ガラクトシダーゼ融合産物となった。
標識期間４時間で異なるSf9細胞形質転換株によって
合成したβ−ガラクトシダーゼの相対量を比較したとこ
ろ、IE1FB2クローンが最も多量のβ−ガラクトシダーゼ
を産生するということが示された。平均的にみて、IE1
融合構成（IE1FB）は非融合IE1（IE1NFB）構成よりも多
量のβ−ガラクトシダーゼを発現した。また、39K構成
（39FB）の発現量はIE1構成の場合の発現量よりも少な
かった。他の安定形質転換細胞に比べ、一過的BEV系でA
c360−β−ガラクトシダーゼに感染したSf9細胞におい
て有意に多くのβ−ガラクトシダーゼが標識された。し
たがって、４時間の標識期間では感染細胞中で合成され
るβ−ガラクトシダーゼの割合はもっと多くなる。不思
議なことに、４時間の標識期間では継代レベルの高い
（P41）IE1FB2細胞の方が継代レベルの低い（P8）同じ
細胞よりも多くの放射性標識β−ガラクトシダーゼを産
生した。
合成したβ−ガラクトシダーゼの相対量を比較したとこ
ろ、IE1FB2クローンが最も多量のβ−ガラクトシダーゼ
を産生するということが示された。平均的にみて、IE1
融合構成（IE1FB）は非融合IE1（IE1NFB）構成よりも多
量のβ−ガラクトシダーゼを発現した。また、39K構成
（39FB）の発現量はIE1構成の場合の発現量よりも少な
かった。他の安定形質転換細胞に比べ、一過的BEV系でA
c360−β−ガラクトシダーゼに感染したSf9細胞におい
て有意に多くのβ−ガラクトシダーゼが標識された。し
たがって、４時間の標識期間では感染細胞中で合成され
るβ−ガラクトシダーゼの割合はもっと多くなる。不思
議なことに、４時間の標識期間では継代レベルの高い
（P41）IE1FB2細胞の方が継代レベルの低い（P8）同じ
細胞よりも多くの放射性標識β−ガラクトシダーゼを産
生した。
免疫蛍光検鏡を実施してIE1FB2細胞におけるβ−ガラ
クトシダーゼの細胞内分布を調べた。正常Sf9細胞は染
色されず、Sf9細胞に感染したVL720−β−ガラクトシダ
ーゼは強い細胞質蛍光を呈した。反応はそれほど大きく
はないが、IE1FB2でも同様の蛍光分布が観察された。位
相検鏡によってIE1FB2細胞の全体的な形態はSf9細胞の
形態と極めて類似しているということが証明された。
クトシダーゼの細胞内分布を調べた。正常Sf9細胞は染
色されず、Sf9細胞に感染したVL720−β−ガラクトシダ
ーゼは強い細胞質蛍光を呈した。反応はそれほど大きく
はないが、IE1FB2でも同様の蛍光分布が観察された。位
相検鏡によってIE1FB2細胞の全体的な形態はSf9細胞の
形態と極めて類似しているということが証明された。
ウェスタンブロッティング分析を行い、24時間、48時
間、72時間の成長段階で各クローンに蓄積したβ−ガラ
クトシダーゼの総量を調べた。この結果から、感染から
同じ時間経過後における安定形質転換細胞には一過的BE
V感染細胞にくらべてかなり少量のβ−ガラクトシダー
ゼしか存在しない（どの場合も感染細胞抽出物の10分の
１しかローディングできなかったことに注意）というこ
とが分かった。いろいろな継代レベルでIE1FB2によって
産生されるβ−ガラクトシダーゼの量と、一過性BEV360
−β−ガラクトシダーゼ感染細胞からの抽出物を連続希
釈したものとを比較した。IE1FB2クローンで産生される
β−ガラクトシダーゼの量はpIE1FB DNAを使用して導
入したSf9細胞で産生される量よりも多かったが、Ac360
−β−ガラクトシダーゼ一過的BEV系に感染したSf9細胞
で感染後20〜24時間のあいだに産生される量は極めて少
なかった。各細胞型について４時間にわたって標識した
β−ガラクトシダーゼの相対量は、β−ガラクトシダー
ゼバンドを除去し、ゲル切片を可溶化し、放射能を測定
することによって判定した。成長開始から48時間後、IE
1FB2細胞は、一過的BEV系の360−β−ガラクトシダーゼ
に48時間感染させたSf9細胞に総β−ガラクトシダーゼ
関連タンパク質の約0.1〜0.5％を含有していた。P23か
らP55の範囲の様々な継代レベルにあるIE1FB2にこれに
近い量のβ−ガラクトシダーゼが検出された。最後に、
免疫沈降およびウェスタンブロッティングの両方の結果
から、一過的BEV感染細胞抽出物のβ−ガラクトシダー
ゼ関連ポリペプチド含有量は、β−ガラクトシダーゼ産
物をそのまま使用した場合よりは少ないが、それでもか
なり多いということが証明された。このように、一過的
BEV感染細胞は本発明による安定形質転換細胞よりもか
なり多量のβ−ガラクトシダーゼを産生し、一過的BEV
系由来の産生物は、感染後比較的速い時期（24時間）で
も比較的多量のおそらく分解産物と思われるものによっ
て汚染されている。
間、72時間の成長段階で各クローンに蓄積したβ−ガラ
クトシダーゼの総量を調べた。この結果から、感染から
同じ時間経過後における安定形質転換細胞には一過的BE
V感染細胞にくらべてかなり少量のβ−ガラクトシダー
ゼしか存在しない（どの場合も感染細胞抽出物の10分の
１しかローディングできなかったことに注意）というこ
とが分かった。いろいろな継代レベルでIE1FB2によって
産生されるβ−ガラクトシダーゼの量と、一過性BEV360
−β−ガラクトシダーゼ感染細胞からの抽出物を連続希
釈したものとを比較した。IE1FB2クローンで産生される
β−ガラクトシダーゼの量はpIE1FB DNAを使用して導
入したSf9細胞で産生される量よりも多かったが、Ac360
−β−ガラクトシダーゼ一過的BEV系に感染したSf9細胞
で感染後20〜24時間のあいだに産生される量は極めて少
なかった。各細胞型について４時間にわたって標識した
β−ガラクトシダーゼの相対量は、β−ガラクトシダー
ゼバンドを除去し、ゲル切片を可溶化し、放射能を測定
することによって判定した。成長開始から48時間後、IE
1FB2細胞は、一過的BEV系の360−β−ガラクトシダーゼ
に48時間感染させたSf9細胞に総β−ガラクトシダーゼ
関連タンパク質の約0.1〜0.5％を含有していた。P23か
らP55の範囲の様々な継代レベルにあるIE1FB2にこれに
近い量のβ−ガラクトシダーゼが検出された。最後に、
免疫沈降およびウェスタンブロッティングの両方の結果
から、一過的BEV感染細胞抽出物のβ−ガラクトシダー
ゼ関連ポリペプチド含有量は、β−ガラクトシダーゼ産
物をそのまま使用した場合よりは少ないが、それでもか
なり多いということが証明された。このように、一過的
BEV感染細胞は本発明による安定形質転換細胞よりもか
なり多量のβ−ガラクトシダーゼを産生し、一過的BEV
系由来の産生物は、感染後比較的速い時期（24時間）で
も比較的多量のおそらく分解産物と思われるものによっ
て汚染されている。
遺伝子分析 IE1−β−ガラクトシダーゼ構成で形質転換したSf9細
胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現物の遺伝子分析を
実施し、外来遺伝子（ここではβ−ガラクトシダーゼ）
をコード化する異種DNA配列は宿主細胞染色体に安定し
て組込まれることを証明した。Sf9細胞または様々なIE1
FBクローンから全細胞DNAを抽出し、EcoR Iで消化し
た。ゲル電気泳動、ニトロセルロースフィルタへの送
出、例Ｉ乃至IIIにおいて上述したような放射性標識pIE
1FBプローブによるフィルタのハイブリッド化によって
消化を行った。IE1FBクローン２、４、７から単離したD
NAにはプラスミド特異配列が検出されたが、Sf9細胞やI
E1FBクローン１、５中には検出されなかった。pIE1FB特
異配列のコピー数は、IE1FBクローン４、７に比べてIE1
FB2からのDNAの方がかなり多く、プラスミド特異DNAに
含まれる量にほぼ等しかったが、IE1FB2よりはかなり少
なかった。このように、プラスミド特異DNAの相対量は
クローンによって発現するβ−ガラクトシダーゼ活性の
相対レベルに対応していた。
胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現物の遺伝子分析を
実施し、外来遺伝子（ここではβ−ガラクトシダーゼ）
をコード化する異種DNA配列は宿主細胞染色体に安定し
て組込まれることを証明した。Sf9細胞または様々なIE1
FBクローンから全細胞DNAを抽出し、EcoR Iで消化し
た。ゲル電気泳動、ニトロセルロースフィルタへの送
出、例Ｉ乃至IIIにおいて上述したような放射性標識pIE
1FBプローブによるフィルタのハイブリッド化によって
消化を行った。IE1FBクローン２、４、７から単離したD
NAにはプラスミド特異配列が検出されたが、Sf9細胞やI
E1FBクローン１、５中には検出されなかった。pIE1FB特
異配列のコピー数は、IE1FBクローン４、７に比べてIE1
FB2からのDNAの方がかなり多く、プラスミド特異DNAに
含まれる量にほぼ等しかったが、IE1FB2よりはかなり少
なかった。このように、プラスミド特異DNAの相対量は
クローンによって発現するβ−ガラクトシダーゼ活性の
相対レベルに対応していた。
上述の結果を見ると、P19より前のいくつかの点でpIE
1FB関連配列が欠如することによってIE1FB2（P4では正
であったがP29では負；表２）でもβ−ガラクトシダー
ゼ活性が失われることが分かる。反対に、IE1FB2DNAはP
55でも依然として多量のpIE1FB関連配列を含んでおり、
これらの配列はこのクローン内では安定に維持されると
いうことが示された。全細胞DNAのサザンブロットを見
ると、pIE1FBはIE1FBクローン２、４、７に組込まれる
ことが分かる。IE1FB7におけるプラスミド関連DNAは初
めのうちはオフサイズ制限フラグメントとして発生す
る。さらに、オフサイズ制限フラグメントはオートラジ
オグラムの露光時間を長くすればIE1FB2やIE1FB4のDNA
中にも検出できる。しかしながら、後者の２つのクロー
ンにおけるハイブリッド形成パターンからを見ると、こ
れらのクローンは組込んだプラスミドDNAの縦列反復を
含むことが分かる。最後に、IE1FB2からのDNA中に検出
された多重オフサイズ制限フラグメントを見ると、プラ
スミドはクローンの様々な部位に組込めることが分か
る。
1FB関連配列が欠如することによってIE1FB2（P4では正
であったがP29では負；表２）でもβ−ガラクトシダー
ゼ活性が失われることが分かる。反対に、IE1FB2DNAはP
55でも依然として多量のpIE1FB関連配列を含んでおり、
これらの配列はこのクローン内では安定に維持されると
いうことが示された。全細胞DNAのサザンブロットを見
ると、pIE1FBはIE1FBクローン２、４、７に組込まれる
ことが分かる。IE1FB7におけるプラスミド関連DNAは初
めのうちはオフサイズ制限フラグメントとして発生す
る。さらに、オフサイズ制限フラグメントはオートラジ
オグラムの露光時間を長くすればIE1FB2やIE1FB4のDNA
中にも検出できる。しかしながら、後者の２つのクロー
ンにおけるハイブリッド形成パターンからを見ると、こ
れらのクローンは組込んだプラスミドDNAの縦列反復を
含むことが分かる。最後に、IE1FB2からのDNA中に検出
された多重オフサイズ制限フラグメントを見ると、プラ
スミドはクローンの様々な部位に組込めることが分か
る。
S1ヌクレアーゼ保護アッセイを行い、IE1FBクローン
に組込まれたpIE1FB関連配列は転写されるか否かを判定
した。継代18の細胞から全細胞RNAを抽出し、５′末端
標識pIE1NeoおよびpIE1FBフラグメントをプローブとし
て使用してS1マッピングを行った。pIE1Neoプローブの1
68塩基対フラグメントはRNAによってIE1FBクローンの各
々から保護された状態となっていたが、非形質転換Sf9
細胞から保護したのはRNAではなかった。このことか
ら、抗生物質耐性Neo−Ｒ遺伝子はIE1FBクローンの各々
に転写されるということが分かり、これらの遺伝子は抗
生物質G418の存在下で生存し得るということを確証でき
る。さらに、転写は特にIE1プロモータ内で開始される
ということも分かる。pIE1FBプローブの293塩基対フラ
グメントはRNAによってIE1FB2およびIE1FB4から保護さ
れていたが、非形質転換Sf9細胞やIE1FB1、IE1FB5、IE1
FB7から保護したのはRNAではなかった。
に組込まれたpIE1FB関連配列は転写されるか否かを判定
した。継代18の細胞から全細胞RNAを抽出し、５′末端
標識pIE1NeoおよびpIE1FBフラグメントをプローブとし
て使用してS1マッピングを行った。pIE1Neoプローブの1
68塩基対フラグメントはRNAによってIE1FBクローンの各
々から保護された状態となっていたが、非形質転換Sf9
細胞から保護したのはRNAではなかった。このことか
ら、抗生物質耐性Neo−Ｒ遺伝子はIE1FBクローンの各々
に転写されるということが分かり、これらの遺伝子は抗
生物質G418の存在下で生存し得るということを確証でき
る。さらに、転写は特にIE1プロモータ内で開始される
ということも分かる。pIE1FBプローブの293塩基対フラ
グメントはRNAによってIE1FB2およびIE1FB4から保護さ
れていたが、非形質転換Sf9細胞やIE1FB1、IE1FB5、IE1
FB7から保護したのはRNAではなかった。
また、組込まれた配列は転写され、転写は特にIE1プ
ロモータ内で開始されるということも分かる。さらに、
異なるIE1FBクローンで発現したRNAの相対量はヌクレア
ーゼ保護の程度によって確認でき、産生されたβ−ガラ
クトシダーゼ融合タンパク質の量と密接に対応している
ことが分かった。このことから、様々なIE1FBクローン
によって産生されたβ−ガラクトシダーゼの相対量にお
ける差異は組込まれたプラスミドDNA配列の全転写レベ
ルの差異によって左右されるということが分かる。
ロモータ内で開始されるということも分かる。さらに、
異なるIE1FBクローンで発現したRNAの相対量はヌクレア
ーゼ保護の程度によって確認でき、産生されたβ−ガラ
クトシダーゼ融合タンパク質の量と密接に対応している
ことが分かった。このことから、様々なIE1FBクローン
によって産生されたβ−ガラクトシダーゼの相対量にお
ける差異は組込まれたプラスミドDNA配列の全転写レベ
ルの差異によって左右されるということが分かる。
例Ｖ IE1プロモータからヒトプラスミノーゲン活性化因子を
連続的に発現する安定形質転換Sf9細胞の構成 例Ｉ乃至IVにおいて詳細に説明した方法を使用して、
安定形質転換変異型を構成した。この変異型はヒトプラ
スミノーゲン活性化因子（tPA）を連続的に発現するも
のである。例IVと同じような方法で、pIE1tPAおよびpIE
1NeoでSf9細胞を同時に導入した。導入後、例Ｉ乃至III
において上述したように、G418耐性細胞を選択してコロ
ニーを単離した。十分に単離されたコロニーを取り出し
て増幅した。例IVと同様に、形質転換Sf9細胞クローン
中のtPA関連ポリペプチドの存在を確認するために、細
胞をパルス標識し、デタージェント抽出し、SDS−PAGE
によって免疫沈降を分析した。いくつかのクローンは、
免疫活性および分子量を判定の基準として信頼できるtP
Aと同一のポリペプチドを発現した。pIE1tPA形質転換ク
ローンの発現活性は、941−tPAで24時間感染させたSf9
細胞の発現活性よりもかなり小さかった。941−tPAは、
一過的BEV系において多角体プロモータがtPA遺伝子の発
現を促進する組換えバキュロウィルスである。（D.L.Ja
rvosおよびM.D.Summers,Mol.Cell.Biol.,9:214−223（1
989）参照のこと。） 安定形質転換細胞系によるtPA発現量はBEV系による発
現量よりもかなり少なく、両系のtPA分泌量は実質的に
同一であった。有意なことに、安定形質細胞系において
発現したtPAの殆どが分泌され、形質転換細胞は新たに
合成したタンパク質を変化させずに維持できるというこ
とが示された。一方、外来遺伝子産物を処理する細胞能
力に悪影響を及ぼす後期ウィルス作用のため、BEV系に
よって発現したtPAは極めてわずかしか分泌されなかっ
た。
連続的に発現する安定形質転換Sf9細胞の構成 例Ｉ乃至IVにおいて詳細に説明した方法を使用して、
安定形質転換変異型を構成した。この変異型はヒトプラ
スミノーゲン活性化因子（tPA）を連続的に発現するも
のである。例IVと同じような方法で、pIE1tPAおよびpIE
1NeoでSf9細胞を同時に導入した。導入後、例Ｉ乃至III
において上述したように、G418耐性細胞を選択してコロ
ニーを単離した。十分に単離されたコロニーを取り出し
て増幅した。例IVと同様に、形質転換Sf9細胞クローン
中のtPA関連ポリペプチドの存在を確認するために、細
胞をパルス標識し、デタージェント抽出し、SDS−PAGE
によって免疫沈降を分析した。いくつかのクローンは、
免疫活性および分子量を判定の基準として信頼できるtP
Aと同一のポリペプチドを発現した。pIE1tPA形質転換ク
ローンの発現活性は、941−tPAで24時間感染させたSf9
細胞の発現活性よりもかなり小さかった。941−tPAは、
一過的BEV系において多角体プロモータがtPA遺伝子の発
現を促進する組換えバキュロウィルスである。（D.L.Ja
rvosおよびM.D.Summers,Mol.Cell.Biol.,9:214−223（1
989）参照のこと。） 安定形質転換細胞系によるtPA発現量はBEV系による発
現量よりもかなり少なく、両系のtPA分泌量は実質的に
同一であった。有意なことに、安定形質細胞系において
発現したtPAの殆どが分泌され、形質転換細胞は新たに
合成したタンパク質を変化させずに維持できるというこ
とが示された。一方、外来遺伝子産物を処理する細胞能
力に悪影響を及ぼす後期ウィルス作用のため、BEV系に
よって発現したtPAは極めてわずかしか分泌されなかっ
た。
例VI 前初期転移ベクター（IETV）の詳細な説明 図２は前初期転移ベクター（pIETV）を示す図であ
る。pIETVはAcNPVDNAのEcoR Iフラグメントから構成さ
れる。（）は構成中に破壊される部位を示す。矢印は図
示の遺伝子の転写方向を示す。矢印の先端はポリアデニ
ル化部位を示す。斜線を付したブロックは多重クローニ
ング部位の配列（図２の下に示す配列）を示す。
る。pIETVはAcNPVDNAのEcoR Iフラグメントから構成さ
れる。（）は構成中に破壊される部位を示す。矢印は図
示の遺伝子の転写方向を示す。矢印の先端はポリアデニ
ル化部位を示す。斜線を付したブロックは多重クローニ
ング部位の配列（図２の下に示す配列）を示す。
このプラスミドは、Eco R V部位において逆配向で位
置するバキュロウイルスIE1およびIEN遺伝子からのプロ
モータを含有する。これは多角体翻訳開始部位（図２）
の約100bp上流に位置している。E.coli lac Ｚ遺伝子
のクローンコピーは活性β−ガラクトシダーゼを酵素的
にコード化するものだか、このコピーをIENプロモータ
の３′直後に挿入する。IENプロモータは前初期類に属
するので、このプラスミドは、組換えバキュロウィルス
に組込むと感染の前初期相において非感染昆虫細胞でβ
−ガラクトシダーゼを発現する。
置するバキュロウイルスIE1およびIEN遺伝子からのプロ
モータを含有する。これは多角体翻訳開始部位（図２）
の約100bp上流に位置している。E.coli lac Ｚ遺伝子
のクローンコピーは活性β−ガラクトシダーゼを酵素的
にコード化するものだか、このコピーをIENプロモータ
の３′直後に挿入する。IENプロモータは前初期類に属
するので、このプラスミドは、組換えバキュロウィルス
に組込むと感染の前初期相において非感染昆虫細胞でβ
−ガラクトシダーゼを発現する。
β−ガラクトシダーゼを発現した昆虫細胞形質転換株
すなわちプラスミドDNA配列を含む組換えウィルスは、
色素原基質で保温した時に青色となるため迅速かつ簡単
に同定することができる。IEN−β−ガラクトシダーゼ
遺伝子は３′側でポリアデニル化部位および通常は多角
体プロモータの５′部位に見られる非コード配列と隣接
している。IEN−β−ガラクトシダーゼ遺伝子の他方の
側面は、逆配向で位置しているIE1プロモータである。I
E1翻訳開始コドンの第１ヌクレオチドの直後に多重クロ
ーニング部位（MCS）を挿入する。MCSは、外来遺伝子を
挿入するための固有制限エンドヌクレアーゼ部位をいく
つか含む。
すなわちプラスミドDNA配列を含む組換えウィルスは、
色素原基質で保温した時に青色となるため迅速かつ簡単
に同定することができる。IEN−β−ガラクトシダーゼ
遺伝子は３′側でポリアデニル化部位および通常は多角
体プロモータの５′部位に見られる非コード配列と隣接
している。IEN−β−ガラクトシダーゼ遺伝子の他方の
側面は、逆配向で位置しているIE1プロモータである。I
E1翻訳開始コドンの第１ヌクレオチドの直後に多重クロ
ーニング部位（MCS）を挿入する。MCSは、外来遺伝子を
挿入するための固有制限エンドヌクレアーゼ部位をいく
つか含む。
lac Ｚ遺伝子と同様、外来遺伝子挿入物は非感染昆
虫細胞に発現し、組換えウィルスに組込むとウィルス感
染の前初期相において発現する。MCSの３′側の配列
は、IE1ポリアデニル化部位を含み、その後ろに多角体
プロモータ、まったく変化していない多角体コード配
列、通常は多角体遺伝子の３′部位に見られる３′非コ
ード配列が続いている。
虫細胞に発現し、組換えウィルスに組込むとウィルス感
染の前初期相において発現する。MCSの３′側の配列
は、IE1ポリアデニル化部位を含み、その後ろに多角体
プロモータ、まったく変化していない多角体コード配
列、通常は多角体遺伝子の３′部位に見られる３′非コ
ード配列が続いている。
以下に示す３つの理由のため、２つの初期プロモータ
と隣接する配列が特異的に含まれる。
と隣接する配列が特異的に含まれる。
（１）ポリアデニル化部位は転写物を処理するための信
号を出力する。
号を出力する。
（２）他の非コード配列は、相同的組換えによってプラ
スミド配列をウィルスゲノムに挿入できる野生型バキュ
ロウィルスDNAの多角体遺伝子座にプラスミドDNAの目標
においている。
スミド配列をウィルスゲノムに挿入できる野生型バキュ
ロウィルスDNAの多角体遺伝子座にプラスミドDNAの目標
においている。
多角体プロモータおよび多角体コード配列の両方を含
むため、組換えウィルスによって吸蔵子孫ウィルスを産
生することができる。このような特徴から、非吸蔵組換
えウィルスに比べて吸蔵ウイルスはin vivoで感染しや
すく、周囲の非活性状態に対する耐性も大きいので、組
換え物を昆虫感染用として理想的なものにすることがで
きる。
むため、組換えウィルスによって吸蔵子孫ウィルスを産
生することができる。このような特徴から、非吸蔵組換
えウィルスに比べて吸蔵ウイルスはin vivoで感染しや
すく、周囲の非活性状態に対する耐性も大きいので、組
換え物を昆虫感染用として理想的なものにすることがで
きる。
例VII 一過的または安定した外来遺伝子発現へのIETV転移プラ
スミドベクターの使用 図３は、２つの異なる方法で前初期転移ベクタープラ
スミドDNA（pIETV）を使用した形質転換昆虫細胞クロー
ンおよび組換えバキュロウィルスのいずれかの生成を示
す図である。
スミドベクターの使用 図３は、２つの異なる方法で前初期転移ベクタープラ
スミドDNA（pIETV）を使用した形質転換昆虫細胞クロー
ンおよび組換えバキュロウィルスのいずれかの生成を示
す図である。
この改良されたプラスミドベクターを使用して昆虫細
胞形質転換株や組換えバキュロウィルスを産生すること
ができる。このベクターによって、非感染昆虫細胞また
は感染の前初期感染相のあいだは昆虫細胞や昆虫に外来
遺伝子を発現させることができる。この改良されたプラ
スミドは、組換えウィルス全体で目的の形質転換細胞ク
ローンを迅速かつ簡単に同定するための標識遺伝子を含
む。このベクターは、発現させたい外来遺伝子の挿入を
容易にするための多重クローニング部位も含む。
胞形質転換株や組換えバキュロウィルスを産生すること
ができる。このベクターによって、非感染昆虫細胞また
は感染の前初期感染相のあいだは昆虫細胞や昆虫に外来
遺伝子を発現させることができる。この改良されたプラ
スミドは、組換えウィルス全体で目的の形質転換細胞ク
ローンを迅速かつ簡単に同定するための標識遺伝子を含
む。このベクターは、発現させたい外来遺伝子の挿入を
容易にするための多重クローニング部位も含む。
これらのベクターを使用して構成された組換えウィル
スは、吸蔵子孫ウィルスを産生する。この能力は他の方
法で計画した組換えバキュロウィルスには見られないも
のであり、昆虫に感染して感染の初期段階にin vivoで
外来遺伝子を発現させるものである。このような改良さ
れたベクターから産生した組換えウィルスは多角体を合
成する。したがって、このウィルスによってin vivoに
おける感染性が高く周囲の非活性状態に対する耐性を有
する吸蔵子孫を産生することができる。このような性質
は、駆虫剤を含む外来遺伝子産物を昆虫に発現させる際
には特に重要なものである。
スは、吸蔵子孫ウィルスを産生する。この能力は他の方
法で計画した組換えバキュロウィルスには見られないも
のであり、昆虫に感染して感染の初期段階にin vivoで
外来遺伝子を発現させるものである。このような改良さ
れたベクターから産生した組換えウィルスは多角体を合
成する。したがって、このウィルスによってin vivoに
おける感染性が高く周囲の非活性状態に対する耐性を有
する吸蔵子孫を産生することができる。このような性質
は、駆虫剤を含む外来遺伝子産物を昆虫に発現させる際
には特に重要なものである。
図３において示すように、改良されたプラスミドベク
ター（pIETV−１）によって、形質転換昆虫細胞クロー
ンまたは組換えバキュロウィルスに所望の遺伝子を発現
させることができる。
ター（pIETV−１）によって、形質転換昆虫細胞クロー
ンまたは組換えバキュロウィルスに所望の遺伝子を発現
させることができる。
一般に、以下のステップを実施して形質転換昆虫細胞
クローンを産生する。
クローンを産生する。
1. ２μｇプラスミドpIETV−1DNAと１μｇ pIE1−NEO
DNAとを同時にSf9細胞中に導入。細胞を一晩放置して
修復し、低密度で播種。
DNAとを同時にSf9細胞中に導入。細胞を一晩放置して
修復し、低密度で播種。
2. G418を１μg/ml含有する培地でNEO遺伝子含有細胞
を選択。G418含有培地で２週間おいた後、個々のクロー
ンを取り出して24のプレートウェルの各ウェルに転移。
を選択。G418含有培地で２週間おいた後、個々のクロー
ンを取り出して24のプレートウェルの各ウェルに転移。
3. ウェルにＸ−galを添加。青色になったウェルにはN
EO遺伝子およびIEN−β−ガラクトシダーゼ遺伝子を組
込んだ細胞が含まれる。NEO陽性かつβ−ガラクトシダ
ーゼ陽性の形質転換株は、IETV構成の一部としてβ−ガ
ラクトシダーゼと一緒に導入した目的の遺伝子の構成的
遺伝子発現性を有する。選択した目的の遺伝子を必要量
産生し、遺伝子発現およびタンパク質生成の当業者によ
って周知の標準的な技術を使用して単離。
EO遺伝子およびIEN−β−ガラクトシダーゼ遺伝子を組
込んだ細胞が含まれる。NEO陽性かつβ−ガラクトシダ
ーゼ陽性の形質転換株は、IETV構成の一部としてβ−ガ
ラクトシダーゼと一緒に導入した目的の遺伝子の構成的
遺伝子発現性を有する。選択した目的の遺伝子を必要量
産生し、遺伝子発現およびタンパク質生成の当業者によ
って周知の標準的な技術を使用して単離。
上述したステップは、例IIおよびIVで述べたNEO選択
物で細胞系を産生する方法と基本的に同じである。
物で細胞系を産生する方法と基本的に同じである。
簡単に言えば、組換えバキュロウィルスは以下のよう
な方法で産生する。（詳細な説明については例VIIIを参
照のこと。） 1. ２μｇプラスミドDNA（pIETV−１）と１μｇバキュ
ロウィルスDNAとを同時にSF9細胞に導入。３〜５日後に
培地を収集して不純物を除去し、溶菌斑アッセイによっ
てウィルスクローンを単離。
な方法で産生する。（詳細な説明については例VIIIを参
照のこと。） 1. ２μｇプラスミドDNA（pIETV−１）と１μｇバキュ
ロウィルスDNAとを同時にSF9細胞に導入。３〜５日後に
培地を収集して不純物を除去し、溶菌斑アッセイによっ
てウィルスクローンを単離。
2. ウィルス生成。
3. Ｘ−gal含有アガロース・オーバーレイによって青
色溶菌斑（組換えウィルス）を同定。
色溶菌斑（組換えウィルス）を同定。
4. 組換えウィルス単離。感染後の早い段階で目的の遺
伝子を発現する能力について個々の単離物を試験。この
単離物は吸蔵陽性である。
伝子を発現する能力について個々の単離物を試験。この
単離物は吸蔵陽性である。
例VIII IE1プロモータの後ろへの挿入を行わずにIETVで組換え
ウィルスを産生することについての詳細な説明 バキュロウィルスベクターおよびバキュロウィルスDN
Aの構成、特徴付け、単離、精製のための方法および昆
虫細胞培養手順は当業者によって周知のものを使用し、
その概略はＡ Manual of Methods for Baculoviru
s Vectors and Insect Cell Culture Procedure
s,（Summers,M.D.およびG.E.Smith,TAES Bulletin N
o.1555,1988）に示されている。相同的組換え、溶菌斑
選択、精製、増殖の手順および導入プロトコルは当業者
によって周知のものを使用（同上）する。
ウィルスを産生することについての詳細な説明 バキュロウィルスベクターおよびバキュロウィルスDN
Aの構成、特徴付け、単離、精製のための方法および昆
虫細胞培養手順は当業者によって周知のものを使用し、
その概略はＡ Manual of Methods for Baculoviru
s Vectors and Insect Cell Culture Procedure
s,（Summers,M.D.およびG.E.Smith,TAES Bulletin N
o.1555,1988）に示されている。相同的組換え、溶菌斑
選択、精製、増殖の手順および導入プロトコルは当業者
によって周知のものを使用（同上）する。
細菌形質転換、制限マッピングによるスクリーニン
グ、抽出、細菌形質転換ベクターの構成、細菌プラスミ
ドDNAの精製および他の標準的な分子生化学的手順は、
標準的な組換えDNA技術（Maniatis他,Molecular cloni
ng:A laboratory manual,Cold Spring Harbor Pre
ss,Cold Spring Harbor,NY（1982））を使用して完成
させる。
グ、抽出、細菌形質転換ベクターの構成、細菌プラスミ
ドDNAの精製および他の標準的な分子生化学的手順は、
標準的な組換えDNA技術（Maniatis他,Molecular cloni
ng:A laboratory manual,Cold Spring Harbor Pre
ss,Cold Spring Harbor,NY（1982））を使用して完成
させる。
標準的な組換え手順を使用して組換えプラスミドを構
成（Maniatis他,1982）し、さらに組換えバキュロウィ
ルス菌株を生成して増殖（SummersおよびSmith,1987）
させる。
成（Maniatis他,1982）し、さらに組換えバキュロウィ
ルス菌株を生成して増殖（SummersおよびSmith,1987）
させる。
一般に、組換えバキュロウィルスは、野生型バキュロ
ウィルスDNAとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子含有転移ベ
クタープラスミドDNAとでSf9細胞を同時に導入すること
によって得られる。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む
組換えバキュロウィルスは青色溶菌斑を産生し、標準的
な溶菌斑アッセイ（SummersおよびSmith,1987）で簡単
に単離できるので、次のステップでは青色ウィルス溶菌
斑を選択する。ウィルスの青色溶菌斑を同定したら組換
えバキュロウィルスを単離精製し、当業者によって周知
の方法で増殖させる。
ウィルスDNAとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子含有転移ベ
クタープラスミドDNAとでSf9細胞を同時に導入すること
によって得られる。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む
組換えバキュロウィルスは青色溶菌斑を産生し、標準的
な溶菌斑アッセイ（SummersおよびSmith,1987）で簡単
に単離できるので、次のステップでは青色ウィルス溶菌
斑を選択する。ウィルスの青色溶菌斑を同定したら組換
えバキュロウィルスを単離精製し、当業者によって周知
の方法で増殖させる。
IEN遺伝子の初期プロモータに隣接するβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子のクローニングについて簡単に述べる。
このバキュロウィルス転移ベクターは、IE1遺伝子の初
期プロモータを含有することに加えて、多角体遺伝子座
で相同的組換えによってウィルス組換え物を産生するた
めに必要な、ウィルスと側面を接する配列を含む。pMN1
871由来のSma1−Pst1フラグメント（Shapira他,Gene 2
5:71−82（1983））をIE1遺伝子の初期プロモータに対
する転移ベクター３′にクローンする。このpMN1871Sma
1−Pst1フラグメントは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
をコード化（アミノ酸９から開始して自然終結部位まで
進行）する配列を含む。
シダーゼ遺伝子のクローニングについて簡単に述べる。
このバキュロウィルス転移ベクターは、IE1遺伝子の初
期プロモータを含有することに加えて、多角体遺伝子座
で相同的組換えによってウィルス組換え物を産生するた
めに必要な、ウィルスと側面を接する配列を含む。pMN1
871由来のSma1−Pst1フラグメント（Shapira他,Gene 2
5:71−82（1983））をIE1遺伝子の初期プロモータに対
する転移ベクター３′にクローンする。このpMN1871Sma
1−Pst1フラグメントは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
をコード化（アミノ酸９から開始して自然終結部位まで
進行）する配列を含む。
相同的組換えおよび標準的な溶菌斑アッセイ手順を含
む選択方法の詳細は当業者間で周知のものだが、これら
についてここで簡単に説明しておく。実験にはIPLB−Sf
21 AE細胞系のSf9クローンを使用する（Spodopters f
rugiperds:Vaughn他,In Vitro 13:213−217（1977）
から誘導）。個々のSf9細胞培養物を野生型バキュロウ
ィルスDNAとIETV（IE1−β−ガラクトシダーゼ）細胞プ
ラスミドDNAとで同時に導入する。
む選択方法の詳細は当業者間で周知のものだが、これら
についてここで簡単に説明しておく。実験にはIPLB−Sf
21 AE細胞系のSf9クローンを使用する（Spodopters f
rugiperds:Vaughn他,In Vitro 13:213−217（1977）
から誘導）。個々のSf9細胞培養物を野生型バキュロウ
ィルスDNAとIETV（IE1−β−ガラクトシダーゼ）細胞プ
ラスミドDNAとで同時に導入する。
導入後約５日目に成長培地を収集して不純物を除去
し、新鮮なSf9細胞単層の溶菌斑アッセイに使用する。
添加したIE1配列によってβ−ガラクトシダーゼ活性が
損なわれることはないと仮定すると、プラスミドのβ−
ガラクトシダーゼ部分は酵素的活性を維持する。色素原
基質「ｘ−gal」（Promega−Biotech）はβ−ガラクト
シダーゼと反応させると青色に変色するのだが、溶菌斑
アッセイの際にこの基質をアガロース・オーバーレイに
添加する。組換えウィルス溶菌斑は、この青色を基準に
同定する。青色溶菌斑を単離し、溶菌斑を精製し、Sf9
細胞において活動ウィルスストックを調整し、標準的な
方法（Step G:SummersおよびSmith,TAES Bull,1555
（1987）を使用して保存する。
し、新鮮なSf9細胞単層の溶菌斑アッセイに使用する。
添加したIE1配列によってβ−ガラクトシダーゼ活性が
損なわれることはないと仮定すると、プラスミドのβ−
ガラクトシダーゼ部分は酵素的活性を維持する。色素原
基質「ｘ−gal」（Promega−Biotech）はβ−ガラクト
シダーゼと反応させると青色に変色するのだが、溶菌斑
アッセイの際にこの基質をアガロース・オーバーレイに
添加する。組換えウィルス溶菌斑は、この青色を基準に
同定する。青色溶菌斑を単離し、溶菌斑を精製し、Sf9
細胞において活動ウィルスストックを調整し、標準的な
方法（Step G:SummersおよびSmith,TAES Bull,1555
（1987）を使用して保存する。
例IX IENプロモータ制御下でのβ−ガラクトシダーゼのクロ
ーニングおよびIE1プロモータの制御下でのβ−グルコ
シダーゼのクローニング 以下に述べるpIETV構成は２種類の異なる遺伝子の発
現試験に有益である。例えば、細胞β−グルコシダーゼ
（GUS）はpIETVのPst1部位にクローンできる。GUS遺伝
子をIE1プロモータで直接制御する。GUSはその発現を色
素原基質を使用して簡単にモニタリングできるという点
でβ−ガラクトシダーゼと類似している。したがって、
別の試験遺伝子としてGUSを使用する。ウィルス組換え
体や安定細胞系は上述したように産生することができ
る。このため、β−ガラクトシダーゼの発現はIENプロ
モータによって制御され、GUSの発現はIE1プロモータに
よって制御される。
ーニングおよびIE1プロモータの制御下でのβ−グルコ
シダーゼのクローニング 以下に述べるpIETV構成は２種類の異なる遺伝子の発
現試験に有益である。例えば、細胞β−グルコシダーゼ
（GUS）はpIETVのPst1部位にクローンできる。GUS遺伝
子をIE1プロモータで直接制御する。GUSはその発現を色
素原基質を使用して簡単にモニタリングできるという点
でβ−ガラクトシダーゼと類似している。したがって、
別の試験遺伝子としてGUSを使用する。ウィルス組換え
体や安定細胞系は上述したように産生することができ
る。このため、β−ガラクトシダーゼの発現はIENプロ
モータによって制御され、GUSの発現はIE1プロモータに
よって制御される。
例Ｘ IENプロモータ制御下でのβ−ガラクトシダーゼのクロ
ーニングおよびIE1プロモータ制御下での組織プラスミ
ノーゲン活性化因子のクローニング 実質的にどんな目的遺伝子でもpIETVベクターのIE1プ
ロモータによって制御することができる。遺伝子すなわ
ち目的遺伝子によって研究者らが特異的な関連態様を研
究できるような発現に必要な内容に基づいて目的遺伝子
を選択する。例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子
（tPA）はpIETVベクターにクローンすることができる。
組換えウィルスの産生や形質転換細胞系の生成のために
β−ガラクトシダーゼ含有細胞を選択する。選択の際に
は、上述したようなβ−ガラクトシダーゼ標識系を利用
する。タンパク質自体の処理を研究する上でtPAは特に
関心が持たれている。本願発明者らは、この実験の結果
は安定細胞においてIE1の制御下のtPAを研究して得られ
た結果と似ているのではないかと考えている。IE1の制
御下の安定細胞系において、tPAは効率良く処理でき
る。しかしながら、多角体制御下の非感染細胞ではtPA
の発現および処理は最適なものとはならない。
ーニングおよびIE1プロモータ制御下での組織プラスミ
ノーゲン活性化因子のクローニング 実質的にどんな目的遺伝子でもpIETVベクターのIE1プ
ロモータによって制御することができる。遺伝子すなわ
ち目的遺伝子によって研究者らが特異的な関連態様を研
究できるような発現に必要な内容に基づいて目的遺伝子
を選択する。例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子
（tPA）はpIETVベクターにクローンすることができる。
組換えウィルスの産生や形質転換細胞系の生成のために
β−ガラクトシダーゼ含有細胞を選択する。選択の際に
は、上述したようなβ−ガラクトシダーゼ標識系を利用
する。タンパク質自体の処理を研究する上でtPAは特に
関心が持たれている。本願発明者らは、この実験の結果
は安定細胞においてIE1の制御下のtPAを研究して得られ
た結果と似ているのではないかと考えている。IE1の制
御下の安定細胞系において、tPAは効率良く処理でき
る。しかしながら、多角体制御下の非感染細胞ではtPA
の発現および処理は最適なものとはならない。
＊ ＊ ＊ 以上、本発明による構成および方法を好ましい実施例
について述べてきたが、本発明の概念、趣旨および範囲
を逸脱することなく、上述した構成、方法、これらの方
法のステップや時間的順序などについて様々な変更や修
正が可能であることは当業者によって容易に理解できよ
う。例えば、化学的および生化学的に関連のある作用物
質を上述した作用物質に置き換えても同様の結果を得る
ことができる。上述した例で概略的に示した方法は、目
的遺伝子を連続的に継続して発現する安定形質転換細胞
系を産生する方法である。これらの例は、形質転換昆虫
細胞クローンまたは組換えバキュロウィルスの生成を可
能にする新規なベクターについて詳細に説明したもので
ある。本発明は、長期間または一過的に、ヒト、動物、
植物のタンパク質産生の可能性を生むものである。これ
と等価のものや修正して得られるものなどは、添付の請
求の範囲に規定される本発明の趣旨、範囲および概念に
包含されることは当業者によって理解できよう。
について述べてきたが、本発明の概念、趣旨および範囲
を逸脱することなく、上述した構成、方法、これらの方
法のステップや時間的順序などについて様々な変更や修
正が可能であることは当業者によって容易に理解できよ
う。例えば、化学的および生化学的に関連のある作用物
質を上述した作用物質に置き換えても同様の結果を得る
ことができる。上述した例で概略的に示した方法は、目
的遺伝子を連続的に継続して発現する安定形質転換細胞
系を産生する方法である。これらの例は、形質転換昆虫
細胞クローンまたは組換えバキュロウィルスの生成を可
能にする新規なベクターについて詳細に説明したもので
ある。本発明は、長期間または一過的に、ヒト、動物、
植物のタンパク質産生の可能性を生むものである。これ
と等価のものや修正して得られるものなどは、添付の請
求の範囲に規定される本発明の趣旨、範囲および概念に
包含されることは当業者によって理解できよう。
フロントページの続き (56)参考文献 特表 平２−501114（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．57，Ｎ ｏ．２（1986）ｐ．563−571 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ. 71，Ｎｏ．４（1990，Ｍａｙ）ｐ．971 −976 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．60，Ｎ ｏ．１（1986）ｐ．215−223 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 5/00 - 5/28 C12N 7/00 - 7/08 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ
Claims (20)
- 【請求項１】以下の構成が、左から右方向へ配列され
た、バキュロウイルス転移ベクター： ａ） バキュロウイルス前初期（immediate−early）遺
伝子由来の第１のプロモータ領域を包含するDNA領域； ｂ） 前記第１のプロモータ領域と反対方向に置かれた
バキュロウイルス前初期遺伝子由来の第２のプロモータ
領域を包含するDNA領域； ｃ） 所望の蛋白質をコードするDNA配列を挿入し得る
クローニング制限部位を包含するDNA領域。 - 【請求項２】前記第１のプロモータ領域をコードするDN
A領域部位の上流部位でかつ枠内に位置する選択可能な
マーカー遺伝子をさらにコードするDNA領域を含み、前
記第１のプロモータ領域が前記マーカー遺伝子の発現を
指令する、請求の範囲第１項に記載のバキュロウイルス
転移ベクター。 - 【請求項３】前記クローニング制限部位が、エレメント
ｂの前記第２のプロモータ領域の下流部位でかつ枠内に
位置するマルチクローニングカセット配列を含んでな
る、請求の範囲第１項に記載のバキュロウイルス転移ベ
クター。 - 【請求項４】前記クローニング制限部位でかつ枠内で、
前記第２のプロモータ領域部位とともに位置する所望の
蛋白質をコードするDNA配列をさらに包含し、それによ
って前記第２のプロモータ領域が、前記所望の蛋白質の
発現を指令する、請求の範囲第１項に記載のバキュロウ
イルス転移ベクター。 - 【請求項５】前記選択可能なマーカー遺伝子が、β−ガ
ラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、またはクロラ
ムフェニコール アセチルトランスフェラーゼをコード
するものである、請求の範囲第２項に記載のバキュロウ
イルス転移ベクター。 - 【請求項６】前記第１あるいは第２のプロモータ領域
が、バキュロウイルス前初期遺伝子IE1またはバキュロ
ウイルス前初期遺伝子IEN由来である、請求の範囲第１
項に記載のバキュロウイルス転移ベクター。 - 【請求項７】39K後初期遺伝子およびhr5エンハンサー由
来のバキュロウイルス後初期遺伝子プロモーターをコー
ドするDNA配列を更に含んでなる、請求の範囲第６項に
記載のバキュロウイルス転移ベクター。 - 【請求項８】前記第１あるいは第２のプロモータ領域
が、Autographa californica NPV、Spodoptera exigua
NPV、またはGalleria mellonella NPVのウイルスDNAに
由来するものである、請求の範囲第１項に記載のバキュ
ロウイルス転移ベクター。 - 【請求項９】請求の範囲第１項に記載のバキュロウイル
ス転移ベクターと、クローニング制限部位に位置する所
望の蛋白質をコードするDNA配列とを含んでなる、形質
転換された昆虫細胞クローン。 - 【請求項１０】前記クローンが、安定に形質転換された
昆虫細胞クローンである、請求の範囲第９項に記載の形
質転換された昆虫細胞クローン。 - 【請求項１１】前記クローンが、Bombyx mori,Heliothi
s virescens,Heliothis zea,Mamestra brassicas,Estig
mene acreaまたはTrichoplusia niから選択される鱗翅
類（Lepidopteran）昆虫由来の鱗翅類昆虫細胞クローン
である、請求の範囲第９項に記載の形質転換された昆虫
細胞クローン。 - 【請求項１２】前記クローンが、細胞系Sf9に由来する
ものである、請求の範囲第11項に記載の形質転換された
細胞クローン。 - 【請求項１３】以下の構成を左から右方向へ含んでな
る、バキュロウイルス転移ベクター： ａ） バキュロウイルス非特異遺伝子部位の５′末端フ
ランキング配列をコードするバキュロウイルスのウイル
スDNA配列； ｂ） バキュロウイルス前初期遺伝子由来の第１のプロ
モータ領域を包含するDNA領域； ｃ） 前記第１のプロモータ領域と反対方向に置かれた
バキュロウイルス前初期遺伝子由来の第２のプロモータ
領域を包含するDNA領域； ｄ） 所望の蛋白質をコードするDNA配列を挿入可能な
クローニング制限部位を包含するDNA領域： ｅ） ポリヘドリンプロモータを有するポリヘドリン遺
伝子をコードするDNA領域；および ｆ） バキュロウイルス非特異遺伝子部位の３′末端フ
ランキング配列をコードするバキュロウイルスのウイル
スDNA配列。 - 【請求項１４】前記クローニング制限部位でかつ枠内で
前記第２のプロモータ領域部位とともに位置する所望の
蛋白質をコードするDNA配列をさらに包含し、それによ
って前記第２のプロモータ領域が、前記所望の蛋白質の
発現を指令する、請求の範囲第13項に記載のバキュロウ
イルス転移ベクター。 - 【請求項１５】左から右方向へ以下の構成を含んでなる
組換えバキュロウイルス転移ベクターによって安定に核
導入された、または一時的に感染させた鱗翅類昆虫細胞
を含んでなる、組換えバキュロウイルス発現系： ａ） バキュロウイルス非特異遺伝子部位の５′末端フ
ランキング配列をコードするバキュロウイルスのウイル
スDNA配列； ｂ） バキュロウイルス前初期遺伝子由来の第１のプロ
モータ領域を包含するDNA領域； ｃ） 前記第１のプロモータ領域と反対方向に置かれた
バキュロウイルス前初期遺伝子由来の第２のプロモータ
領域を包含するDNA領域； ｄ） 所望の蛋白質をコードするcDNA配列を挿入可能な
クローニング制限部位を包含するDNA領域； ｅ） 前記クローニング制限部位に挿入される所望の蛋
白質をコードするDNA領域； ｆ） ポリヘドリンプロモータを有するポリヘドリン遺
伝子をコードするDNA領域；および ｇ） バキュロウイルス非特異遺伝子部位の３′末端フ
ランキング配列をコードするバキュロウイルスのウイル
スDNA配列。 - 【請求項１６】前記第１あるいは第２のプロモータ領域
が、バキュロウイルス前初期遺伝子IE1またはバキュロ
ウイルス前初期遺伝子IENである、請求の範囲第13項に
記載のバキュロウイルス転移ベクター。 - 【請求項１７】前記第１あるいは第２のプロモータ領域
が、バキュロウイルス前初期遺伝子IE1またはバキュロ
ウイルス前初期遺伝子IENである、請求の範囲第15項に
記載のバキュロウイルス発現系。 - 【請求項１８】39K後初期遺伝子およびhr5エンハンサー
由来のバキュロウイルス後初期遺伝子プロモーターをコ
ードするDNAを更に含んでなる、請求の範囲第15項に記
載のバキュロウイルス発現系。 - 【請求項１９】前記選択可能なマーカー遺伝子が、β−
ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、またはクロ
ラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼをコー
ドするものである、請求の範囲第15項に記載のバキュロ
ウイルス発現系。 - 【請求項２０】鱗翅類昆虫細胞が、Spodoptera frugipe
rda,Bombyx mori,Heliothis virescens,Heliothis zea,
Mamestra brassicas,Estigmene acreaもしくはTrichopl
usia niからなる鱗翅類昆虫の群から選択される、請求
の範囲第15項に記載のバキュロウイルス発現系。
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