JP3483880B2

JP3483880B2 - キシラナーゼ、これに対応する組み換えｄｎａ配列、キシラナーゼ含有剤、及びこの剤の使用

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Publication number: JP3483880B2
Application number: JP50762892A
Authority: JP
Inventors: シュレイン，マルティン; ペテルヘルト−ハンセン，ハンス; ダルベーゲ，ヘンリク; ハルキエル，トルベン; サービィペデルセン，ラース
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1991-04-02
Filing date: 1992-03-27
Publication date: 2004-01-06
Anticipated expiration: 2019-01-06
Also published as: NO933525D0; NZ242201A; DE69228378D1; FI934330L; DK0579672T3; EP0579672B1; US5610048A; FI116795B; DE69228378T2; WO1992017573A1; JPH06506348A; CA2106484A1; KR100234888B1; NO933525L; EP0507723A1; EP0579672A1; ATE176498T1; FI934330A0; ES2130173T3

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、キシラナーゼ、これに対応する組み換えDN
A配列、ベクター、形質転換宿主、当該キシラナーゼの
製造方法、当該キシラナーゼ含有剤、及び当該剤の使用
を含んで成る。

キシラン、すなわち、植物ヘミセルロースの主成分
は、β−1,4−キシロイド結合により結合したＤ−キシ
ロースのポリマーである。キシランは、酸又は酵素によ
る加水分解により、キシロース又はキシロ−オリゴマー
に分解されることができる。キシランの酵素による加水
分解は、酸により形成される副産物（例えば、フラン）
を伴わずに、遊離の糖を生成する。

キシラナーゼについては、現在、５つの主要な利用性
が存在する。それは;1）アルコール燃料の製造のための
農産物廃棄物の酵素分解;2）ヘミセルロース分画のイン
ビボにおける分解のための、家畜飼料若しくは飼料成分
の酵素的修飾又は家畜飼料への添加;3）ベーキング剤と
しての使用;4）セルロース産生の溶解パルプの製造；及
び、５）木材パルプの生物−漂白である［Detroym R.W.
In:Organic Chemicals from Biomass,（CRC Press,Boca
Raton,FL,1981）19−41.;Paice,M.G.,and L.Jurasek.
J.Wood Chem.Technol.4:187−198.;Pommier,J.C.,J.L.F
uentes,G.Goma.Tappi Journal（1989）:187−191.;Seni
or,D.J.,et al.,Biotechnol.Letters 10（1988）:907−
912.］。

パルプ及び製紙工業は、漂白されたパルプの白色度を
強化し、その漂白段階において使用された化学物質の量
を減少させ、そしてそのリサイクル紙の工程においてパ
ルプのフリーネス（freeness）を増大させるために１そ
の漂白工程においてキシラナーゼ組成物を使用している
［Eriksson,K.E.L.,Wood Science and Technology 24
（1990）;79−101.;Paice,M.G.R.Bernier,and L.Jurase
k,Biotechnol.and Bioeng.32（1988）:235−239.;Pommi
er,J.C.,J.L.Fuentes,and G.Goma,Tappi Journal（198
9）:187−191.］。

クラフトパルプの製造、すなわち、上記パルプ及び製
紙工業において広く使用される工程は、そのリグニンの
90〜98％を取り除くための、パルプのアルカリ硫酸塩ク
ッキングを含んでいる。リグニンの残りの２〜10％は、
紫外線の中で又は酸化により、より暗色になる傾向をも
つ暗褐色の色を、そのパルプに与える。高品質紙のため
の白色パルプを得るために、この褐色は、化学物質、例
えば、塩素、二酸化塩素、オゾン、酸素又は過酸化水素
を使用した多段階の漂白工程により、除去されている。

現在、この漂白工程から生じる上記化学物質の環境へ
の影響について大きな関心が在る。酵素は、前記パルプ
からのリグニン除去において、いかなる有害副産物を伴
わずに援助することができる。木材中のリグニンがキシ
ランに結合されているという報告がある［Eriksson,O.,
et al.,Wood Sci.Technol.14（1980）;267.;Takashi,
N.,and T.Koshijiima,Wood Sci.Technol.22（1988）;17
7−189］。このキシランの限定された加水分解により、
リグニンのより大きな放出が、漂白の間に発生する。従
って、漂白に先立ってこのパルプを酵素的に処理するこ
とによって、必要とされている漂白化学物質の量は、こ
れにより減少するであろう［Viikari,L.,et al.,Procee
dings of 3rd International Symposium on Biotechnol
ogy in the Pulp and Paper Industry（1986）;67］。

技術文献に従って、良好な結果が、トリコデルマ属
（Trichoderma）からの真菌類の調製物により得られて
おり［Paice,M.G.,L Jurasek,J.Wood Chem.Technol.4
（1989）:187−198.;Senior,D.J.,et al.,Biotechnol.L
etters.10（1988）:907−912］、ここでは、pH6.0より
低い木材パルプのpH調整を必要としている。

トリコデルマ属（Trichoderma）のキシラナーゼ調製
物、すなわち、Pulpzyme^TMHA（Novo Nordisk A/Kから商
業的に入手できる）を、pH5〜７でのクラフトパルプの
脱リグニン化のために使用してもよい。50℃及び７より
高いpHでは、この酵素は、僅かな効果しか示さない。

バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）のキシラナ
ーゼ調製物、すなわち、Pulpzyme^TMHB（Novo Nordisk A
/Kから商業的に入手できる）を、pH5〜７でのクラフト
パルプの脱リグニン化のために使用してもよい。50℃及
び７より高いpHでは、この酵素は、僅かな効果しか示さ
ない。

フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）の
キシラナーゼは、公知である（Yoshioka,H et al.,Agri
c.Biol.Chem.43（３）（1981）579−586）。この粗調製
物においては、それらは、6.0の最適pH及び60℃の最適
温度をもっている。pH9では、それらは、pH6での活性の
25％を示す。この文書中の情報に従えば、この酵素は、
精製されておらず、そしてそれ故に、有意なセルロース
活性を含むであろう、なぜなら、フミコーラ・インソレ
ンス（H.insolens）は、良いセルロース生産者として知
られているからである（米国特許第4,435,307号を参照
できる）。さらに、この酵素は、セルラーゼに関して
は、分子量、等電点又はアミノ酸組成を特徴付けされて
おらず、そしてクラフトパルプに関して、ベーキングに
おいて、又は家畜飼料について、テストされていない。
Agric.Biol.Chem.中に記載されているフミコーラ・イン
ソレンス（Humicola insolens）YH−８由来の従来技術
のキシラナーゼ調製物及び他の先に示されたキシラナー
ゼ調製物も、その比較的高いセルロース含有量をある程
度の原因として、クラフトパルプの脱リグニン化におけ
る使用については同様に好適でない。

従って、本発明の目的は、非常に少量の他の酵素活
性、特にセルロース活性又は他のキシラナーゼ活性をも
つ調製物として製造されることができるキシラナーゼ、
並びにクラフトパルプの脱リグニン化における使用、ベ
ーキング剤としての及び家畜飼料への添加剤としての使
用に十分に好適なキシラナーゼを提供することである。

本発明のキシラナーゼは、それが、以下の部分的アミ
ノ酸配列：又はこれに少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％
の相同性をもつ部分的アミノ酸配列をもつこという事実
により、特徴付けられる。

驚くべきことに、酵素活性、例えば、非常に少ない濃
度におけるセルラーゼに追加的なキシラナーゼを含むキ
シラナーゼ調製物の一部として本発明のキシラナーゼを
製造し得ることが発見された。特に、本発明のキシラナ
ーゼが、紙パルプへの添加のための剤、ベーキング剤及
び家畜飼料への添加剤の全てに対して素晴らしく好適で
あるフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）D
SM1800から遺伝的に製造された数個のキシラナーゼの中
から選ばれた特別のキシラナーゼであることは、注目さ
れるべきである。また、本発明のキシラナーゼが、前記
従来技術のキシラナーゼのいずれの比活性よりも大きい
比活性を示すことも見つけられた。最も驚くべきこと
は、本発明のキシラナーゼが、全てのこれらの、互いに
無関係な技術分野に関して、優れた性質を示すことであ
る。

本発明のキシラナーゼは、以下に示すように、pH8に
て、パルプからのリグニンの除去において有意な効果を
示す。このリグニン除去効果は、以下に示すように、従
来技術（バチルス・プミラス（B.pumilus））よりも、
有意に高い。

リグニン除去に関するこの高い性能は、驚くべきこと
に、本発明のキシラナーゼ単独により得られる。但し、
それは、フミコーラ・インソレンス（H.insolens）内の
数個のキシラナーゼ成分の中からの１つである。このリ
グニン除去のための工程は、ただ１つのキシラナーゼ成
分（遺伝子工学により、高い収率で製造できる）が必要
であるという理由から、より経済的である。

驚くべきことに、有意なセルロース活性をもたない本
発明のキシラナーゼを製造することが可能であり、この
ことにより、リグニン除去のためのこのキシラナーゼの
使用の間のセルロース繊維に対するセルロース分解攻撃
により引き起こされる収率ロスを回避している。以下に
示す如く、本発明のキシラナーゼは、驚くべきことに、
軟材から、バチルス・プミラス（B.pumilus）のキシナ
ラーゼよりも多いリグニンを除去することができる。但
し、この２つのキシラナーゼは、非常に近いpH曲線をも
っている。

キシラナーゼ（ペントサナーゼの名称が、ベーキング
工業においては、一般的に使用されている。）は、幾つ
かの以下の目的： −ドウの発達（dough development） −ドウの弾性及び安定性の改良 −パンの容量の増加 −クラム（crumb）構造の改良 −抗−カビ発生のために、小麦粉パンのためのベーキング剤として使用
される。幾つかのキシラナーゼは、これにより修飾され
たペントサンがドウの弾性、安定性及び発達を改善する
ような方法で、ペントサン（アラビノキシラン）を分解
すると信じられている。驚くべきことに、本発明のキシ
ラナーゼは、他のキシラナーゼ及びキシラン修飾酵素を
伴わずに製造ざれることができ、そしてこのことによ
り、上記ペントサンの制御された修飾を得ることを可能
にしている。

ドウのpHは、このキシラナーゼをベーキング剤として
の使用のために好ましくする6.0〜5.5にある。なぜなら
ば、本発明のキシラナーゼの最適pHは、5.5〜7.5である
からである。

本発明のキシラナーゼは、ヘミセルロース分画のイン
ビボにおける分解のための、家畜飼料の修飾のために又
は家畜飼料への添加のために使用されることもできる。
本発明のキシラナーゼは、実際には副活性を全くもたな
い調製物として使用されることができる。しかるに、フ
ミコーラ・インソレンス（H.insolens）のキシラナーゼ
製品により代表される、従来技術のキシラナーゼは、他
のキシラナーゼを含む幾つかの副活性を含むであろう。
本発明のキシラナーゼ及び従来技術のキシラナーゼが、
ニワトリの飼育試験における体重増加に関して同様の効
果を生ずることが見つかっている。このことは、本発明
のキシラナーゼが、前記の飼料添加物の使用に関して、
活性であり、又は前記フミコーラ・インソレンス（H.in
solens）のキシラナーゼの１つであることを示してい
る。さらに、本発明のキシラナーゼは、バッチからバッ
チへと比率を変化する多くの異なった副活性を含む従来
技術のキシラナーゼとは反対に、非常に純粋なキシラナ
ーゼを含み、これにより再現性のある体重増加を得るこ
とができるという有意な利点を示している。また、本発
明のキシラナーゼ、すなわち、単一成分キシラナーゼの
使用は、より経済的な飼料添加物の可能性にも門戸を開
いている。

本発明のキシラナーゼの好ましい態様は、このキシラ
ナーゼが、フミコーラ・インソレンス（Humicola insol
ens）,DSM1800から得られた精製キシラナーゼに対して
生じた抗体と免疫反応性があるという事実により特徴付
けされる。

本発明のキシラナーゼの好ましい態様は、このキシラ
ナーゼが、7.5〜9.5の、好ましくは8.0〜8.5の等電点を
もつという事実により特徴付けられる。

本発明のキシラナーゼの好ましい態様は、このキシラ
ナーゼが、330EXU/mg蛋白を超える、好ましくは400EXU/
mg蛋白を超える比活性を示すという事実により特徴付け
られる。このEXUキシラナーゼ活性単位は、AF293.9/1中
に定義されている。このAF出版物及び本明細書中に示す
他のAF出版物は、Novo Nordisk A/S,Novo All,DK−28
80 Bagsvaerd,Denmarkからの要求により入手可能であ
る。

本発明は、本発明のキシラナーゼをコードすることを
特徴とする組み換えDNA配列も含んで成る。

本発明の組み換えDNA配列の好ましい態様は、それ
が、以下の部分的DNA配列を含んで成るという事実によ
り特徴付けられる：本発明の組み換えDNA配列の好ましい態様は、それが、
以下の：ａ）pHD450中のフミコーラ・インソレンス（Humicola i
nsolens）のキシラナーゼDNA挿入物ｂ）ａ）のDNA挿入物に含まれる成熟キシラナーゼのた
めのコード領域にハイブリダイズし、そして、キシラナ
ーゼ活性をもつポリペプチドのための構造遺伝子を含ん
で成り、そして場合により、プロモーター、シグナル若
しくはリーダー・ペプチドのためのコード領域、及び／
又は転写ターミネーターを含んで成るDNA配列ｃ）比較的ストリンジェントな条件（1.0 x SSC,0.1％S
DS,65℃）（T.Maniatis,A laboratory Manual（CSH）を
参照した）の下で、請求項６に示す配列にハイブリダイ
ズするのに十分な相同性をもつDNA配列ｄ）ａ）、ｂ）若しくはｃ）に定義したDNA配列の誘導
体、又は、ｅ）成熟キシラナーゼ又はそれらのシグナル・ペプチド
若しくはリーダー・ペプチドをコードし、そしてａ）、
ｂ）若しくはｃ）のDNA配列に関してその遺伝子コード
の意味の範囲内で縮重されているDNA配列から選ばれたDNA配列を含んで成るという事実により特
徴付けられる。

本願明細書中に使用するとき、「ストリンジェントな
条件」とは、T.Maniatis,A Laboratory Manual（CSH）
中に記載されるような、1.0×SSC,0.1％SDS、及び65℃
なる条件をいう。

本発明は、本発明の上記組み換えDNA配列を含んで成
るという事実により特徴付けられる、ベクターも含んで
成る。

本発明のベクターの好ましい態様は、上記プロモータ
ーが、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryza
e）のTAKAアミラーゼのプロモーターであり、そして／
又は上記キシラナーゼ遺伝子が、EC3−２から単離され
ており、そして／又は上記ターミネーターが、アスペル
ギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）のAMGターミ
ネーターであり、好ましくはpHD450であるという事実に
より特徴付けられる。

pHD450の構築を本明細書の第22頁第10行〜第22行に説
明する。

本発明は、本発明のベクターを含むという事実により
特徴付けられる、形質転換宿主を含んで成る。

本発明の形質転換宿主の好ましい態様は、アスペルギ
ルス（Aspergillus）株であるという事実により特徴付
けられる。

本発明の形質転換宿主の好ましい態様は、アスペルギ
ルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）、アス
ペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペル
ギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はアスペル
ギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）の種に属す
る株であるという事実により特徴付けされる。

本発明の形質転換宿主の好ましい態様は、その非形質
転換条件においては、キシラナーゼを生産しない、又は
有意でない量のキシラナーゼのみを生産する微生物、好
ましくはバチルス・エスピー（Bacillus sp.）、大腸菌
（E.coli）又はサッカロミセス・セレビシエ（S.cerevi
siae）であるという事実により特徴付けられる。

本発明は、その方法が本発明の形質転換宿主を使用す
るという事実により特徴付けられる、キシラナーゼの製
造方法も含んで成る。

本発明は、本発明の方法により製造されるキシラナー
ゼも含んで成る。

本発明は、好ましくは非−発埃性粒状物、安定化液体
又は保護された酵素の形態での本発明のキシラナーゼで
あって、このことにより、キシラナーゼが全酵素蛋白の
少なくとも10％、好ましくは少なくとも30％を占めるも
の、を含む剤を含んで成る。

本発明の剤の好ましい態様は、キシラナーゼ活性とセ
ルラーゼ活性との比が、キシラナーゼ活性（EXU/g）と
セルラーゼ活性（ECU/g）との比として表されるものと
して、10を超える、好ましくは30超え、最も好ましくは
100を超える値をもつという事実により特徴付けられ
る。このセルラーゼ活性単位ECUは、AF302−１に記載さ
れている。

本発明の上記剤の好ましい態様は、少なくとも10ECU/
mg酵素蛋白の、好ましくは少なくとも100EXU/mg酵素蛋
白の、より好ましくは少なくとも300EXU/mg酵素蛋白
の、キシラナーゼ活性を含むことを特徴とする。

また、本発明は、本発明の上記剤の使用であって、こ
の剤がキシラン分解にために使用されることを特徴とす
る使用も含んで成る。

本発明の上記使用の好ましい態様は、この使用が、漂
白の前又は一部として、好ましくはpH値７超えにて、化
学パルプ又はリサイクル紙パルプに関することを特徴と
する。

本発明の上記使用の好ましい態様は、この使用が、小
麦粉を含むパンの製造に関することを特徴とする。

本発明の上記使用の好ましい態様は、この使用が、家
畜飼料に関することを特徴とする。

本発明のキシラナーゼは、以下の方法で製造すること
ができる。キシラナーゼを、フミコーラ・インソレンス
（Humicola insolens）DSM 1800を培養することによ
り、米国特許第4,435,307号の例６の最初から縦欄11行2
9までに記載されたように、製造した。凍結乾燥粉末
を、水で希釈し、そして10％の乾燥物含有量10％まで乾
燥し、そしてpHを10％HClにより2.3まで低下させた。こ
の混合液を22℃で50分間放置し、そして次に、pHをNaOH
により8.0まで上昇させる。次に、pH5.0での液体1kg当
たり250gのNa₂SO₄による塩沈殿を実施した。この塩ケー
キを、再溶解し、そして次に遠心分離し、そして限外濾
過により洗浄した。最後にこの調製物を凍結した。

12％の乾燥物溶液中では、このキシラナーゼ調製物
は、以下の酵素活性:444CSU/ml及び144EXU/mlを示し
た。CSUは、セルラーゼ仮性単位である。AF267を参照の
こと。

この調製物を更に、DEAE sephadex A−50（Pharmaci
a）を用いたバッチのイオン交換により精製し、AMICON
限外濾過により濃縮し、Sephacrly S−200（Pharmaci
a）上でゲル濾過し、そして高充填Ｓ−Sepharose（Phar
macia）を用いてカチオン交換をした。

このキシラナーゼがいかなるセルラーゼ副活性をも示
さないことが見出された。従って、この精製キシラナー
ゼ製品は、0.1CSU/mg蛋白未満のセルラーゼ活性を、そ
して350EXU/mg蛋白を超えるキシラナーゼ活性を示し
た。この精製キシラナーゼ製品は、分子量22kDをもつた
だ１つのSDS−PAGEのバンドを示す。このpIを、等電点
電気泳動法により8.5に決定した。

この精製キシラナーゼ製品と反応する抗体を以下の方
法で製造した。上記精製キシラナーゼに対する抗血清
を、N.Axelsen他により記載された手順:A manual of Qu
antitative Immunoelectrophoresis,Blackwell Scienti
fic Publications,1973,Chapter 23に従ってウサギを免
疫化することにより作り出した。精製免疫グロブリン
を、この抗血清から、塩沈殿（（NH₄）₂SO₄）、続く透
析及びDEAE−Sepadex上イオン交換クロマトグラフィー
により得た。この精製キシラナーゼの免疫化学的特徴
は、ロケット免疫電気泳動（N.Axelsen et al.,Chapter
2）により導かれた。先に示した抗体を用いては、前記
精製キシラナーゼは、ロケット免疫電気泳動におけるそ
の陰極に対して移動する単一のアーチを示した。

このキシラナーゼを化学的に特徴付けるために、全ア
ミノ酸組成を、Moore and Stein（1963）,Methods Enzy
mol.6,819−831に従う酸加水分解により、そしてHeinri
kson and Meredith（1984）,Anal.Biochem.136,65−74
（誘導体形成）及びEdelhoch（1967）,Biochemistry 6,
1948−1954（トリプトファン決定）に従うこの加水分解
混合物中のアミノ酸の定性的及び定量的測定により、決
定した。最後に示した参考文献は、トリプトファン含有
量の分光光度測定について記している。以下のアミノ酸
組成を見出した。

前記精製キシラナーゼのＮ−末端アミノ酸配列を、として、見出した。

また、キモトリプシンによる酵素分解の後、３つのペ
プチドを、配列決定し、これにより、これらの１つは、
他のペプチドの配列決定の間、副配列（ss）として決定
している： CNBrによる化学的分解これに続くペプシンによる酵素
分解の後、２つのペプチドを、配列決定する。

本発明のキシラナーゼが、従来技術のキシラナーゼ、
例えば、スキゾフィラム・コミュヌ（Schizophyllum co
mmunue）、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）及
びバチルス・サブチリス（Bacillus subtillis）から製
造されたキシラナーゼと弱い相同性を示すことが見つか
った。

本発明を、以下の例により、説明する。

例１は、キシラナーゼ製造遺伝子の選択並びに遺伝子
修飾宿主生物によるキシラナーゼの製造について説明し
ている。例２は、キシラナーゼのパイロット・プラント
における製造及びキシラナーゼの精製を説明している。
例３は、紙パルプ製造の間の漂白増強剤としてのキシラ
ナーゼの使用を説明し、そして例４は、ベーキング剤と
してのキシラナーゼの使用を説明する。

例１培地 YPD:10gの酵母抽出物、20gのペプトン、H₂Oで810mlと
し、オートクレーブにかけ、90mlの20％のグルコース
（滅菌濾過した）を添加したもの。

10×Basal塩:66.8gの酵母ナイトロジェンベース、100
gのコハク酸、60gのNaOHに、H₂Oを加え1000mlにし、滅
菌濾過したもの。

SC−URA:90mlの10x Basal塩、22.5mlの20％カザミノ
酸、9mlの１％トリプトファンに、H₂Oを加え806mlに
し、オートクレーブにかけ、3.6mlの５％トレオニン及
び90mlの20％グルコースを添加したもの。

SC−Ｈ寒天：アミノ酸を含まない7.5g/lの酵母ナイト
ロジェンベース、11.3g/lのコハク酸、6.8g/lのNaOH、
ビタミンを含まない5.6g/lのカザミノ酸、0.1g/lのトリ
プトファン及び20g/lの寒天（Bacto）、121℃で20分間
オートクレーブにかけ、オートクレーブ後、450mlの寒
天当たり、55mlの22％グルコース溶液及び1.8mlの５％
トレオニン溶液を添加したもの。

YNB−１寒天:3.3g/lのKH₂PO₄、16.7g/lの寒天、PHを
７に調整し、121℃で20分間オートクレーブにかけ、オ
ートクレーブ後、450mlの寒天当たり、アミノ酸を含ま
ない25mlの13.6％の酵母ナイトロジェンベース、25mlの
40％グルコース溶液、1.5mlの１％Ｌ−ロイシン溶液及
び1.5mlの１％ヒスチジン溶液を添加したもの。

YNB−１ブロス:YNB−１寒天と同じ組成であるが上記
の寒天を含まないもの。

オート・スペルト・キシラン（oat spelt xylan）重
層ゲル:1％アガロース、トリス−マレイン酸緩衝液、PH
7中の１％オート・スペルト・キシラン（sigma Chemica
l Company）、重層を寒天プレート上に注ぐ前に、この
ゲルを沸騰させ、そして次に55℃まで冷却する。

FG−４−寒天:35g/lの寒天、30g/lの大豆粉、15g/lの
マルトデキストリン（Glucidex6）、5g/lのBactoペプト
ン、pH7、121℃で40分間オートクレーブにかけたもの。

FG−４培地:30g/lの大豆粉、15g/lのマルトデキスト
リン（Glucidex6）、5g/lのBactoペプトン、121℃で40
分間オートクレーブにかけたもの。

酵母発現プラスミドの構築商業的に入手可能なプラスミドpYES II（Invitroge
n）を、Spe Iにより切断し、Klenow DNAポロメラーゼ＋
dNTPによりフィルインし、そしてCal Iにより切断し
た。このDNAをアガロース・ゲル上でサイズ分画し、そ
して約2000塩基対のフラグメントを電気溶出により精製
した。前記と同じプラスミドを、Cal I/Pvu IIにより切
断し、そして約3400塩基対のフラグメントを電気溶出に
より精製した。この２つのフラグメントを、酵母TPIプ
ロモーターを含む平滑末端のSph I/EcoR Iフラグメント
に連結した。このフラグメントを、その中でサッカロミ
セス・セレビシエ（S.cerevisiae）（T.Albers and G.K
awasaki,J.Mol.Appl.Genet.1,1992,pp.419−434）が僅
かに変更されている：内部のSph I部位がこの部位のコ
アを構成している４塩基対の欠失により除去されている
プラスミドから単離した。さらに、このプロモーターの
余分の配列を、Bal Iエンドヌクレアーゼ処理、次のSph
Iリンカーの添加により除去した。最後に、EcoR Iリン
カーを−10位に追加した。これらの変更の後、このプロ
モーターは、Sph I−EcoR Iフラグメントに含まれてい
る。元のプロモーターの比較してのその効率は、上記の
変更によっては影響されないようである。得られたプラ
スミドpYHD17を図１に示す。

供与体生物セルロースが豊富な発酵培地内で、十分な通気を確保
するための攪拌を伴って増殖した、フミコーラ・インソ
レンス（H.insolens）,DSM 1800。

mRNAの単離全RNAを、約7gの菌糸体から単離した。この菌糸体を
体液窒素中で凍結し、そして1gの石英砂を用いて、すり
鉢内で粉状に擦り潰した。このRNAをトリシアン酸グア
ニジウムにより抽出し、そしてSambrook et al.,1989,
上掲書中に本質的に記載されたように、CsClを通して遠
心分離した。ポリA RNAをオリゴdTセルロース上のクロ
マトグラフィーにより全RNAから単離した。

cDNAの合成製造者の取扱説明書に従ってInvitrogenからのcDNA合
成キットによりcDNA合成を行った。このDNAをBstx Iリ
ンカー（Invitrogen）の添加により発現ベクターに適合
させ、そしてアガロース・ゲル上でサイズ分画した。５
〜600塩基対より大きいDNAのみを、本ライブラリーの構
築において使用した。この適合されたcDNAを、Bstx Iに
より切断された適切な酵母発現ベクターに連結した。テ
スト連結（ライブラリーのサイズを決定するための）の
後に、このライブラリーを、プレート当たり約5000の形
質転換細胞に達する50個の寒天プレート上に置いた。約
5000の別個のクローンを含むそれぞれのプレートに3ml
の培地を添加した。このバクテリアを剥ぎ取り、1mlの
グリセロールを添加し、そして50プールとして−80℃で
保存した。残りの2mlを、DNA単離のために使用した。DN
A量が酵母形質転換細胞の所望数を与えるのに十分であ
る場合（以下を見よ）は、大量のDNAを、一夜増殖させ
た−80℃の保存バクテリアの50μｌにより接種された50
0mlの培地（TB）から調製した。DNAをこのライブラリー
からの20の別個のクローンから単離し、そしてcDNA挿入
物について分析に供した。この挿入頻度は、〉90％であ
ることが分かり、そしてその平均挿入物サイズは約1400
塩基対であった。

酵母の形質転換使用した酵母株は、yNG231.（MAT alpha,leu2,ura3−
52,his4−539,pep4−delta 1,cir＋）であった。１つの
コロニーを、10mlのYPD中で30℃で一夜増殖させた。こ
の培養液の10、30、及び60μｌを、100mlのYPDを含む３
本の振とうフラスコに添加し、そして30℃で１夜振とう
しながらインキュベートした。0.3〜0.4に最も近いOD
₆₀₀をもつ培養液を選択した。この細胞を、Beckmann遠
心分離機内の50mlチューブ中に収穫し（速度６、10分
間）、この細胞を、2 x 5mlのH₂Oに再懸濁し、前記のよ
うに遠心分離し、0.1M liAc、10mMのTris−Cl、1mMのED
TA、pH7.5を含む5mlのバッファーに再懸濁し、そして再
び遠心分離した。この細胞を、500μｌの上記バッファ
ーに再懸濁し、30℃で60分間インキュベートした。250
μｇの担体DNA（滅菌サケ−精子DNA 10mg/ml、以下参
照）を添加し、そして100μｌの部分を調製した。形質
転換されるべきDNA（約５μｇ）を、この100μｌの部分
に添加し、緩やかに混合し、そして30℃で30分間インキ
ュベートした。700μｌの40％PEG 4000、0.1M liAc、10
mMのTris−Cl、1mMのEDTA、pH7.5を添加し、そして30℃
で60分間インキュベーションを続けた。この形質転換混
合物を、42℃で５分間、熱ショックに供し、マイクロ遠
心分離機内で短時間回転させ、100〜200μｌのH₂Oに再
懸濁し、そしてウラシルを含まないSCプレート上に置
き、次に30℃で３日間、インキュベートした。

担体DNAの調製 100mgのサケ−精子DNAを計量し、そして一夜で、10ml
の10mMのTris−Cl、1mMのEDTA、pH7.5（TE）に溶解し
た。次にこの溶液を、もはや粘度がなくなるまで、氷水
中のプラスチック容器内で音波処理した。次にこの溶液
を、フェノール抽出し、そしてEtOH沈殿し、そしてその
ペレットを洗浄し、そして5mlのTEに再懸濁した。このO
D₂₆₀を測定し、そしてそしてこの懸濁液を10mg/mlまでT
Eにより希釈した。

酵母のスクリーニング前記のように、フミコーラ（Humicola）ライブラリ
ー、プール１〜10からのDNAを、酵母に形質転換し、そ
して20−25,000コロニーを含むプレートをそれぞれのプ
ールから得た。このコロニーを剥ぎ取りそしてグリセロ
ール中に−80℃で保存した。

このライブラリーからの酵母細胞を、全体として約40
0,000コロニーになるまでYNB寒天上に塗布した。プレー
ト当たりのコロニーの数は、50から500まで変化した。
４又は５日間の増殖の後、この寒天プレートをSC−Ｈ寒
天プレートのセット上にレプリカプレートした。これら
のプレートを次に、キシラナーゼの検出のためにこの寒
天プレートをオート・スペルト・キシラン重層ゲルによ
り重層する前に、30℃で２〜４日間、インキュベートし
た。40℃で一夜インキュベートした後、酵素反応を、Co
ngo redに着色した。10〜15mlのCongo redの0.1％溶液
をこの重層の上に注ぎ、そして10〜20分後に除去した。
次にこのプレートを、このプレート上に10〜15mlの2M N
aClを注ぐことにより１又は２回洗浄した。このNaCl溶
液を、15〜25分後に除去した。キシラナーゼ−陽性コロ
ニーは、赤い背景上の透明又は薄赤の明るい領域とし
て、この重層プレート上に同定された。

酵素−陽性コロニーからの細胞を、寒天上の単一コロ
ニー単離のために塗布し、そして酵素−生産単一コロニ
ーを、同定されたキシラナーゼ−生産コロニーのそれぞ
れのために選択した。

キシラナーゼ陽性コロニーの特徴付け 147個の前記のキシラナーゼ−生産コロニーのそれぞ
れを単離した。これらのコロニーの幾つかを、50mlのガ
ラス試験管内の20mlのYNB−１ブロス中に接種した。こ
の試験管を30℃で２時間振とうした。この細胞を3000rp
mで10分間の遠心分離により収穫した。

この細胞を1mlの0.9Mソルビトール、0.1M EDTA、pH7.
5に再懸濁した。このペレットを、Eppendorfチューブに
移し、そして最大速度で30秒間回転した。この細胞を、
0.4mlの0.9Mソルビトール、0.1M EDTA、14mMβ−メルカ
プトエタノールに再懸濁した。100μｌの2mg/mlのZymol
aseを添加し、そしてこの懸濁液を、37℃で30分間イン
キュベートし、そして30秒間回転した。このペレット
（セファロプラスト）を、0.4mlのTEに再懸濁した。90
μｌの（1.5mlの0.5M EDTA、pH8.0、0.6mlの2M Tris−C
l pH8.0、0.6mlの10％SDS）を添加し、そしてこの懸濁
液を65℃で30分間インキュベートした。

80μｌの5M KOAcを添加し、そしてこの懸濁液を氷上
で少なくとも60分間インキュベートし、そして最大速度
で15分間回転した。この上澄み液をEtOH（室温）を満た
した新しい試験管に移し、次に十分であるが緩やかに混
合し、そして30秒間回転した。このペレットを冷70％Et
OHで洗浄し、30秒間回転し、そして室温で乾燥した。こ
のペレットを50μｌのTEに再懸濁し、そして15分間回転
した。この上澄み液を新しいチューブに移した。2.5μ
ｌの10mg/ml RNaseを添加し、次に37℃で30分間インキ
ュベートし、そして500μｌのイソプロパノールを緩や
かに混合しながら添加した。この混合液を30秒間回転
し、そして上澄み液を除去した。このペレットを冷96％
EtOHで濯ぎ、そして室温で乾燥した。このDNAを約100μ
l/mlの最終濃度になるまで、50μｌの水に溶解した。

上記のDNAを、標準的な手順により、大腸菌（E.col
i）に形質転換した。２つの大腸菌（E.coli）コロニー
を、上記の形質転換のそれぞれから単離し、そしてDNA
挿入物を切除する制限酵素Hind III及びXba Iを用いて
分析した。これらのコロニーの１つからのDNAを、酵母
に形質転換し、そして酵素活性について再スクリーニン
グした。

上記陽性コロニーの幾つかのDNA配列を部分的に決定
した。このDNA配列に基づき、15個のクローンを、同一
ファミリーとして分類した。このキシラナーゼ・ファミ
リーの配列は、本発明の精製キシラナーゼのアミノ酸配
列と、最大の相同性を示した。部分的な配列を請求項５
に表す。

pYES2中にキシラナーゼHind III/Xba I cDNAフラグメ
ントを含む大腸菌（E.coli）を、DSM 6995として、1992
年３月18日にDSMに寄託した。このキシラナーゼcDNAフ
ラグメントを、Hind III/Xba Iによる解裂により、上記
クローンの１つから単離した。このHind III/Xba Iフラ
グメントを、電気溶出されたアガロースゲル電気泳動に
より精製し、そして連結反応の準備をした。このDNAフ
ラグメントをHind III/Xba I処理されたpHD414（以下参
照）に連結し、そしてcDNAがアスペルギルス・オリザエ
（Aspergillus oryzae）由来のTAKAプロモーター及びア
スペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のAMG
ターミネーターの転写制御下にあるところのpHD450を作
り出した。

大腸菌（E.coli）中で上記DNAを増幅した後、このプ
ラスミドを、以下に記載するように、アスペルギルス・
オリザエ（Aspergillus oryzae）に形質転換した。

アスペルギルス（Aspergillus）発現ベクターの構築ベクターpHD414（図２）は、プラスミドp775（欧州特
許第238 023号）の誘導体である。このプラスミドに対
して、pHD414は、プロモーターとターミネーターとの間
にユニーク制限部位のひも（string）をもっている。こ
のプラスミドを、ターミネーターの3'末端で、約200塩
基対の長いフラグメント（不所望のRE部位を含む）を除
去することにより、そして次に、プロモーターの5'末端
で、約250塩基対の長いフラグメント（これも不所望の
部位を含む）を除去することにより構築した。この200
塩基対の領域を、Nar I（上記pUCベクター内に位置す
る）及びXba I（ターミネーターのちょうど3'）による
解裂、これに続く、生成末端のklenow DNAポリメラーゼ
＋dNTPによるフィルイン、ゲル上でこのベクター・フラ
グメントの精製、並びにこのベクター・フラグメントの
再連結により除去した。このプラスミドは、pHD413と呼
ばれた。pHD413を、Stu I（このフロモーターの5'末端
に位置する）及びPvu II（上記pUCベクター内の）によ
り切断し、ゲル上で分画し、そして再連結し、pHD414を
得た。図２は、プラスミドpHD414のマップであり、図
中、“AMGターミネーター”は、アスペルギルス・ニガ
ー（A.niger）のグルコアミラーゼ・ターミネーターを
示し、そして“TAKAプロモーター”は、アスペルギルス
・オリザエ（Aspergillus oryzae）のTAKAアミラーゼ・
プロモーターを示している。

アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）の形
質転換 100mlのYPD（Sherman et al.,Methods in Yeast Gene
tics,Cold Spring Harbor Laboratory,1981）を、アス
ペルギルス・オリザエ（A.oryzae）の胞子により接種
し、又は、そして37℃で約２日間振とうしながらインキ
ュベートする。この培地をミラクロス（miracloth）を
通しての濾過により収穫し、そして200mlの0.6M MgSO₄
で洗浄する。この菌糸体を15mlの1.2M MgSO₄、10mM NaH
₂PO₂、pH＝5.8に懸濁する。この懸濁液を氷上で冷却
し、そして120mgのNovozym商標登録234を含む1mlのバッ
ファーを添加する。５分後、1mlの12mg/ml BSA（Sigma
type H25）を添加し、そして多量のプロトプラストが顕
微鏡下で観察されたサンプル内に見られるまで続けられ
る緩やかな攪拌を伴い、37℃で1.5〜2.5時間、インキュ
ベートする。

この懸濁液をミラクロス（miracloth）を通して濾過
し、濾液を滅菌チューブに移し、そして5mlの0.6Mソル
ビトール、100mM Tris−HCl、PH＝7.0により重層する。
遠心分離を100gで15分間行い、そしてプロトプラストを
前記MgSO₄クッションの頂上から回収する。２容のSTC
（1.2Mソルビトール、10mM Tris−HCl、PH＝7.5、10mM
CaCl₂）を、上記プロトプラスト懸濁液に添加し、そし
てこの混合液を1000gで５分間、遠心分離する。このプ
ロトプラストのペレットを3mlのSTCに再懸濁し、そして
再ペレット化する。これを繰り返す。最後に、このプロ
トプラストを0.2〜1mlのSTCに再懸濁する。100μｌのプ
ロトプラスト懸濁液を、10μｌのSTC中で、適切なDNAの
５〜25μｇと共に混合する。プロトプラストを、p3SR2
（アスペルギルス・ニジュランス（A.nidulans）のamdS
遺伝子担持プラスミド）と共に混合する。この混合液
を、室温で25分間放置する。0.2mlの60％PEG 4000（BDH
29576）、10mM CaCl₂及び10mM Tris−HCl、PH＝7.5を
添加し、そして注意して混合し（２回）、そして最後
に、0.85mlの上記と同一の溶液を添加し、そして注意し
て混合する。この混合液を室温で25分間放置し、2500g
で15分間回転し、そしてこのペレットを2mlの1.2Mソル
ビトールに再懸濁する。もう１回沈殿させた後、このプ
ロトプラストを適切なプレート上に塗布する。プロトプ
ラストを、1.0Mシュクロース、pH＝7.0、窒素源として
の10mMアセトアミド及び背景の増殖を抑制するための20
mM CsClを含む最小プレート（Cove,Biochem.Biophys.Ac
ta 113（1966）51−56）上に塗布する。37℃で４〜７日
間のインキュベーションの後、胞子を拾い上げ、そして
単一クローンについて塗布する。この手順を繰り返し、
そして第２回目の単離後の単一クローンの胞子を、定義
された形質転換細胞として保存する。

アスペルギルス（Aspergillus）におけるキシラナーゼ
の発現 11個の形質転換細胞を得て、そして接種し、そしてYP
G−寒天上で維持した。８つの選ばれた形質転換細胞の
それぞれを、YPG−寒天斜面から、150mlのFG−４培地を
満たす500ml振とうフラスコ上に接種した。良好な通気
を確保するために十分な攪拌を伴う４日間の発酵の後、
この培養液を2000gで10分間遠心分離し、この上澄み液
を分析した。最も良いものは、72EXU/mlを産生した。非
形質転換宿主株からの背景は全くない。この株を、Axy4
0/8と命名する。

例２上記株Axy40/8を、以下の方法で、パイロット・プラ
ント規模において発酵した。

以下の組成をもつ寒天基質をFernbachフラスコ内に調
製した：シュクロース 30 g/l KH₂PO₄ 1 g/l NaNO₃ 3 g/l MgSO₄,7H₂O 0.5 g/l FeSO₄,7H₂O 0.01g/l KCl 0.5 g/l 寒天 25 g/l pHを、6.4〜6.5の間に調整し、121℃で20分間、オー
トクレーブにかけた。

上記Fernbachフラスコを、胞子懸濁液により接種し、
そして30℃で５日間、培養した。

以下の組成をもつ基質を500リッターの種母発酵槽内
に調製した：酵母エキス、50％ 6kg ポテト澱粉 9kg CaCO₃ 0.15kg Pluronic L61 150ml Termamyl商標登録60（Ｌ）^＊） 9g^＊）Termamylは、Novo Nordisk A/Sから入手できるα−
アミラーゼである。

水道水を、約225リッターの全容量まで添加した。pH
をH₃PO₄により約6.5に調整した。

上記基質を121℃で1.5時間上記種母発酵槽内で滅菌す
る前に、温度を、60から90℃まで30分間で上昇させ、90
℃で30分間保った。接種前の最終容量は、約300リッタ
ーであった。

前記fernbachフラスコの胞子懸濁液を、上記の種母発
酵槽に移した。種母発酵の条件は：発酵槽の形式：約2.3の高さ／直径比を持つ、従来の
通気及び攪拌発酵槽攪拌:250rpm 通気：分当たり300Nl空気温度:34℃ 時間：約24時間であった。

接種後約35時間目に、150リッターを上記種母発酵槽
から主発酵槽に移した。

以下の組成をもつ基質を2500リッターの主発酵相内に
調製した： MgSO₄,7H₂O 2.6kg KH₂PO₄ 2.6kg K₂SO₄ 3.9kg 微量金属溶液 650ml ポテト澱粉 39.0kg 酵母エキス、50％ 28.6kg 尿素 5.2kg クエン酸 1.053kg Pluronic L61 650ml Termamyl商標登録60（Ｌ） 39g 微量金属溶液は、以下の組成をもつ： ZnSO₄,7H₂O 14.3g/l CuSO₄,7H₂O 2.5g/l NiCl₂,6H₂O 0.5g/l FeSO₄,7H₂O 13.5g/l MnSO₄,H₂O 8.5g/l クエン酸、１水塩 3.0g/l 水道水を約900リッターの全容量まで添加した。pHをH
₃PO₄により約6.5に調整した。

温度を、60から90℃まで30分間で上昇させ、90℃で30
分間保った。次に、PHを、上記基質を123℃で1.5時間上
記主発酵槽内で滅菌する前に、4.5に調整した。接種前
の最終容量は、約1300リッターであった。

次に150リッターの種母培養液を添加した。発酵条件
は：発酵槽の形式：約2.7の高さ／直径比をもつ、従来の
通気及び攪拌発酵槽攪拌:250rpm（２つのタービン翼）通気：分当たり1500nl空気、130時間目に170
0Nl/分に上昇させる温度:34℃ 時間：約130時間であった。

発酵開始25時間後に、マルトデキストリン溶液を、12
時間で１リッター／時間から４リッター／時間まで増加
させる速度で、上記主発酵槽に、無菌的に添加した。こ
のデキストリン溶液を、550リッターのフィード・タン
ク内に、以下の組成を伴って調製した：ポテト澱粉 184kg ビオチン 0.04g チアミン 0.4g クエン酸 0.2kg Pluronic L61 200ml Termamyl商標登録60 L 360ml 水道水を約300リッターの全容量まで添加した。上記
基質を123℃で1.5時間、投与タンク内で滅菌する前に、
90℃で60分間、保った。投与開始前の最終容量は、約40
0リッターであった。

発酵開始25時間後に、pHを7.3〜7.4にNH₃により制御
した。

約130発酵時間の後、上記発酵工程を停止した。約185
0リッターの培養液を約５℃まで冷却し、そして以下の
方法に従って前記酵素を回収した。

上記培養液をpH7で遠心分離し、遠心分離物を、濾過
助剤としてHyflo Super−Cell珪藻土を使用してSeitzフ
ィルター・シート（Type Supra EKS Neu）上で濾過し
た。濾液のPHを4.7に調整し、そしてこの濾液を、限外
濾過を使用して５％の乾燥物含有量まで濃縮した。さら
に、蒸発により、30％の乾燥物含有量までの濃縮を実施
した。この濃縮物のpHを、6.5に調整し、そしてこの濃
縮物を、濾過助剤としてHyflo Super−Cellを使用して
フレーム・フィルター上で濾過し、そしてSeitzフィル
ター・シート（Type Supra EKS Neu）上で滅菌濾過し
た。

この濃縮物を、以降の本明細書中で、調製物１として
定義する。調製物１は、533EXU/gのキシラナーゼ活性を
示す。

調製物１を、以下のように精製した。

全体として200,000EXUを、25％硫酸アンモニウムによ
り沈殿させた。この沈殿物を500mlの水に溶解し、そし
てDow Denmark A/Sからの膜GR90PPを用いたAmicon限外
濾過cell上で洗浄した。導電率を1.7mSまで減少させ
た。この収量は、150,000EXUであった。pHを5.0に調整
し、そしてサンプルを0.45ミクロンのフィルターを通し
て濾過し100,000EXUの収量を得た。このサンプルを、20
0mlのＳ−Sepharose高速カラム・クロマトグラフィー及
びPH5.0の20mM酢酸ナトリウムを含むバッファーを使用
した、カチオン交換クロマトグラフィーにより処理し
た。キシラナーゼは、このpHでは上記カラムに結合し
た。キシラナーゼを、上記と同じバッファー中に1Mの塩
化ナトリウムを含む線型グラジエントを使用して溶出し
た。全体として75,000EXUを、E₂₈₀4.1をもつ160ml中に
回収した。これは、E₂₈₀当たり114EXUに対応する。

ペプチド・マッピング及びその比活性の測定及び特徴
付けのために、上記キシラナーゼを、最終精製段階によ
り、高い純度で得た。サイズ・クロマトグラフィーSupe
rdex 75により、上記キシラナーゼ小部分を、高く精製
した。この精製キシラナーゼは、SDS−PAGE内分子量22k
Dをもつ単一バンド、及びPharmacia IEFゲルを用いた等
電点電気泳動内に8.2の等電点をもつ単一バンドをもっ
ている。

生来のキシラナーゼ及び上記のように精製された本発
明のクローン化キシラナーゼは、精製された生来のキシ
ラナーゼに対して生じたウサギ血清と等しく反応する。
ロケット免疫電気泳動法の使用により、等しいEXUに基
づく両方の酵素が、同一の免疫沈降物を作り出す。

上記のEXU法の使用により、着色キシラン上の上記精
製キシラナーゼの活性は、E₂₈₀当たり130EXUであり、又
はmg蛋白当たり450EXUである。この吸光係数は、3.5E
₂₈₀である。

例３本例においては、従来技術のバチルス・プミラス（B.
pumilus）を、本発明のキシラナーゼと比較した。例２
に記載シタ調製物２を、この比較のために使用した。軟
材パルプに関しては、本発明のキシラナーゼが有意によ
り良い漂白増強効果を与えることが判明した。

本発明のキシラナーゼ：フミコーラ・インソレンス（H.
insolens）のキシラナーゼ液体調製物、533EXU/g 従来技術のキシラナーゼ：バチルス・プミラス（B.pumi
lus）のキシラナーゼ液体調製物、1070EXU/g パルプスウェーデンの工場からの未漂白軟材。このパルプを
洗浄し、風乾し、そして冷室内で、〈５℃で保存した。

このパルプを水中に、〉12時間、浸漬し、その後、そ
れを、１％DS、10,000戻り（reversions）での実験室的
パルプ剤中で、パルプ形成する。

以下の２つの段階：１）酵素処理２）（D50C50）Ｅ脱リグニン化をそれぞれに含んで成る２つの漂白試験を実施した。

実験室漂泊条件酵素 50℃、pH8.0（Britton−Robinsonバッファー）。処理
時間及び投与量を以下の見出し“酵素処理”の下に記載
する。

（D50C50） 45分間、40℃、５％DS、最終pH:1.9〜2.9 aCL−倍数:0.15、0.19、0.23、0.27 Ｅ 60分間、60℃、12％DS、最終pH:10.6〜12.2 NaOH投与量を、脱リグニン化段階における塩素化合物
から、［0.5・（kg Cl₂/ton＋ClO₂/ton）＋３］kg/ton のように計算する。

この漂泊段階を、水浴中で温められたプラスチック・
バッグ内で行った。このバッグを、一定間隔で、手によ
って、こねた。

酵素処理パルプの２つのサンプルを、同一酵素段階:1つは本発
明のキシラナーゼによるもの、そして他方は従来技術の
キシラナーゼによるもの、において処理した。この処理
時間は３時間であり、そして投与量は1000EXU/kgであっ
た。その後、このパルプを冷水で十分に洗浄した。第３
のサンプル−対照−に、酵素の添加なしで、同様の処理
を行った。

本実験においては、上記２つの酵素間の有意差が見ら
れた。

酵素処理後に測定されたカッパ数及び吸光度を、表２
に表す。

（D50C50）Ｅ脱リグニン化上記３つのサンプルのそれぞれから、それぞれ約17g
のパルプの４つの部分を、異なった投与量の活性塩素に
より、脱リグニン化した。その後、カッパ数及びISO白
色度の値を測定した。この結果を、表３に示す。

表３から、本発明のフミコーラ・インソレンス（H.in
solens）のキシラナーゼが、従来技術のキシラナーゼよ
りも顕著に低いカッパ数及びより良好な白色度を提供す
ることが、明らかとなる。表３から、本発明のキシラナ
ーゼに関するカッパ数が、従来技術のキシラナーゼに関
するカッパ数よりも、ほんの僅かに小さいことが明らか
になった場合には、この僅かな差異は、使用した活性塩
素の、より多量の、かつ有意な節約に対応する。

本実験において使用されたパルプに関して、本発明の
キシラナーゼが、従来技術のキシラナーゼよりも、より
高い漂泊増強効果を作り出すであろうという結論を導く
ことができる。

例４本例は、ベーキング剤としての本発明のキシラナーゼ
の使用について説明する。

キシラナーゼ（名称ペントサナーゼがベーキング産業
において一般的に用いられている）を、以下の幾つかの
目的： −ドウの発展 −ドウの弾性及び安定生の改善 −パンの容積の増加 −クラム（crumb）構造の改良 −抗−カビ発生のために、小麦粉のためのベーキング剤として使用す
る。

調製物１を、小麦パンにおいてテストし、そしてそれ
は、パンの品質に関して非常に良好な効果をもってい
る。この酵素は、十分なドウを柔らかくする効果をもっ
ている。43〜150FXUの調製物１の添加は、、５〜20％分
のロールの容積を増加させ、そしてクラム構造はより均
一にあり、そしてクラムは、酵素なしのパンよりも柔ら
かい。これは、商業的な製品と比べてより良い効果をも
っている。このキシラナーゼ活性単位FXUは、AF293.6中
に定義されている。

従来技術のキシラナーゼのベーキング剤は、様々な酵
素活性を含んで成る。しかるに、本発明のベーキング剤
は、キシラナーゼ活性以外の酵素活性を非常に少なく含
有して製造されることができる。従って、本発明のベー
キング剤の使用により、１つのベーキング操作から次の
ベーキング操作までの、より定常的な特徴をもつパン製
を得ることができる。

調理法及びベーキング工程本例における基本的な調理法は： −小麦粉 1000g −塩 16g −砂糖 16g −酵母 50g −水 590g −酵素である。

上記成分を、らせん型ドウ練り機により混合した。次
にこのドウを２分間低速で、５分間高速でこねた。この
ドウの温度は、約26〜28℃であった。10分間静置した
後、このドウを分割し、そして30ロール（roll）と１ロ
ーフ（loaf）とを作った。33℃、湿度80％での、ロール
について45分間、そしてローフについて40分間のプルー
フィング時間（proofing time）の後、このロール及び
ローフを、220℃でそれぞれ、15分間、及び30分間、ベ
ーキングした。

結果アミラーゼ活性のない調製物１においては、その宿主
生物により作られたアミラーゼ活性を、従来のクロマト
グラフィー技術によりキシラナーゼから分離する。

上記のロール及びローフの容積を、伝統的なナタネ法
（rape seeds method）を使用して測定する。この測定
値を次に再計算し相対値にする。

上記のクラムの柔らかさを、SMS−Texture Analyzer
測定する。25mmの直径をもつプランジャーを、パンの11
mm厚のスライスの中央の上に押し当て、速度3.3mm/秒を
用いての、このプランジャーがこのクラム3mmを押し潰
すために必要な力を記録し、そしてこれを、上記のクラ
ムの柔らかさとして表す。次にこの値を、再計算して10
0の指数を定義した上記対照サンプルに比較しての相対
値とする。クラムの柔らかさのための上記指数が低くな
ればなる程、そのクラムは柔らかい。

ドウ発展及びクラム構造についての特徴を、肉眼観察
評価：＋は、ドウが正常であること、及びクラムが粗い
構造を伴って同様に正常であることを意味し、そして＋
＋は、ドウが対照よりも柔らかく、かつ弾性があるこ
と、及びクラム構造が均一であり、絹状であることを意
味している；に従って与える。

ペントパン商標、すなわち、Novo Nordisk A/Sから入
手できる商業的調製物は、フミコーラ・インソレンス
（H.insolens）由来の異なるキシラナーゼを、そしてフ
ミコーラ・インソレンス（H.insolens）の他の酵素活性
をも含む従来技術のベーキング剤である。本発明のキシ
ラナーゼが、より大きな容積及びより柔らかいクラムを
提供するので、従来技術のベーキング剤よりも高い性能
をもっていることが、以上のことにより明らかである。
従来技術のキシラナーゼに比べて、本発明のキシラナー
ゼに関する最も重要なベーキングの利点は、本発明のキ
シラナーゼが実質的に副活性を全くもたないベーキング
剤として使用可能であり、そしてこのことによりバッチ
からバッチまで非常に均一な性質をもつパンを作ること
ができるという事実である。

配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：ノボノルディスクアクティーゼル
スカブ（ii）発明の名称：キシラナーゼ、これに対応する組
み換えDNA配列、キシラナーゼ含有剤、及びこの剤の使
用（iii）配列数:7 （iv）連絡先：（Ａ）宛て先：ノボノルディスクアクティーゼ
ルスカブ（Ｂ）番地：ノボアレ（Novo All）（Ｃ）市:DK−2880バグスバード（Bagsvaerd）（Ｅ）国：デンマーク（Denmark）（ｖ）コンピューター読込形態：（Ａ）媒体形式：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェアー:PatentIn Release＃1.0,Ver
sion＃1.25 （viii）弁理士／代理人情報：（Ａ）氏名：バッハニール（BACH,Niels）（Ｂ）登録番号:GA 24307 （Ｃ）参照／事件番号:3588.204−WO （ix）遠距離通信情報：（Ａ）電話：＋45 4444 8888 （Ｂ）ファックス：＋45 4449 3256 （Ｃ）テレックス:37304 （２）配列番号１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:21アミノ酸（Ｂ）形：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（Ａ）生物名：フミコーラ・インソレンス（Humico
la insolens）（Ｂ）株名:DSM 1800 （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:9アミノ酸（Ｂ）形：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（Ａ）生物名：フミコーラ・インソレンス（Humico
la insolens）（Ｂ）株名:DSM 1800 （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:12アミノ酸（Ｂ）形：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（Ａ）生物名：フミコーラ・インソレンス（Humico
la insolens）（Ｂ）株名:DSM 1800 （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:24アミノ酸（Ｂ）形：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（Ａ）生物名：フミコーラ・インソレンス（Humico
la insolens）（Ｂ）株名:DSM 1800 （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:29アミノ酸（Ｂ）形：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（Ａ）生物名：フミコーラ・インソレンス（Humico
la insolens）（Ｂ）株名:DSM 1800 （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:15アミノ酸（Ｂ）形：アミノ酸、Ｎ−末端（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（vi）起源：（Ａ）生物名：フミコーラ・インソレンス（Humico
la insolens）（Ｂ）株名:DSM 1800 （xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:516塩基対（Ｂ）形：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:rDNA （vi）起源：（Ａ）生物名：フミコーラ・インソレンス（Humico
la insolens）（Ｂ）株名:DSM 1800 （xi）配列：配列番号7:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｓ 3/08 Ｄ２１Ｃ 9/10 ＺＤ２１Ｃ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:685 //(Ｃ１２Ｎ 1/15 1:665 Ｃ１２Ｒ 1:685）Ｃ１２Ｒ 1:07 (Ｃ１２Ｎ 1/15 1:91 Ｃ１２Ｒ 1:665）Ｃ１２Ｒ 1:645 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者ハルキエル，トルベンデンマーク国，デーコー−1900 フレデリクスベルウセー，ボドロフスバイ６ゲー (72)発明者ペデルセン，ラースサービィデンマーク国，デーコー−2800 リングビー，バグスバエルトバイ 69ベー．14 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/09 C12N 9/24 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ストリンジェントな条件（1.0×SSC,0.1％
SDS,65℃）下、以下の部分的DNA: にハイブリダイズすることができ、フミコーラ・インソ
レンス（Humicola insolens）DSM1800のキシラナーゼの
Hind III/Xba I DNA断片に由来し、かつ、SDS−PAGEに
より測定されるとき22kDの分子量を有するキシラナーゼ
をコードする組換えDNA。
【請求項２】配列番号１〜６により示される部分的アミ
ノ酸配列をもつキシラナーゼをコードする、請求項１に
記載の組換えDNA。
【請求項３】7.5〜9.5の等電点、又は5.5〜7.5の最適pH
をもつキシラナーゼをコードする請求項１又は２に記載
の組換えDNA。
【請求項４】330EXU/mg蛋白を超える比活性を示すキシ
ラナーゼをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に
記載の組換えDNA。
【請求項５】プロモーター、シグナル・ペプチドのため
のコーディング領域又は転写ターミネーターをさらに含
む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えDNA。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換
えDNAを含むベクター。
【請求項７】前記プロモーターが、アスペルギルス・オ
リザエ（Aspergillus oryzae）のタカアミラーゼ（taka
amylase）のプロモーターであり、そして／又は前記タ
ーミネーターが、アスペルギルス・オリザエ（Aspergil
lus oryzae）のAMGターミネーターである、請求項６に
記載のベクター。
【請求項８】請求項６又は７に記載のベクターを含む形
質転換された宿主。
【請求項９】前記の形質転換された宿主が、アスペルギ
ルス（Aspergillus）株である、請求項８に記載の形質
転換された宿主。
【請求項１０】前記の形質転換された宿主が、アスペル
ギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）、ア
スペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペ
ルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はアスペ
ルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）の種に属
する株である、請求項９に記載の形質転換された宿主。
【請求項１１】前記の形質転換された宿主が、バチルス
・エスピー（Bacillus sp.）、大腸菌（E.coli）又はサ
ッカロミセス・セレビシエ（S.cerevisiae）の如き、非
形質転換条件下で、キシラナーゼを生産しないか又は有
意でない量のキシラナーゼを生産する微生物である、請
求項８に記載の形質転換された宿主。
【請求項１２】請求項８〜11のいずれか１項に記載の形
質転換された宿主を培養し、そして得られた培養ブロス
から生じたキシラナーゼを回収することを含む、キシラ
ナーゼの製造方法。
【請求項１３】請求項１〜５のいずれか１項に記載のDN
Aによりコードされるキシラナーゼ。
【請求項１４】非−発埃性粒状物、安定化液体又は保護
された酵素の形で、キシラナーゼが全酵素蛋白の少なく
とも10％を占める、請求項13に記載のキシラナーゼ又は
請求項12に記載の方法により製造されたキシラナーゼを
含む剤。
【請求項１５】キシラナーゼ活性とセルラーゼ活性との
比が、キシラナーゼ活性（EXU/g）とセルラーゼ活性（E
CU/g）との比として表すとき、10を超える値をもつ、請
求項14に記載の剤。
【請求項１６】少なくとも10EXU/mg酵素蛋白のキシラナ
ーゼ活性を含む、請求項14又は15に記載の剤。
【請求項１７】請求項13に記載のキシラナーゼ又は請求
項12に記載の方法により製造されたキシラナーゼを含む
ベーキング剤。
【請求項１８】前記剤がキシラン分解のために使用され
ることを特徴とする、請求項15〜17のいずれか１項に記
載の剤の使用方法。
【請求項１９】前記の使用が、漂白の前又は一部とし
て、７を超えるpH値において、化学パルプ又は再生紙パ
ルプに関することを特徴とする、請求項18に記載の使用
方法。
【請求項２０】前記の使用が、小麦粉を含むパンの製造
に関することを特徴とする、請求項18に記載の使用方
法。
【請求項２１】前記の使用が、家畜飼料に関することを
特徴とする、請求項18に記載の使用方法。