JP3492373B2 - モノクローナル抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、結腸大腸癌の診断および治療に使用できる
抗体に関する。

癌胎児性抗原（CEA）と反応する抗体が知られている
が、膜結合CEAと可溶型CEAの両方と反応するため、結腸
大腸癌の診断に特に有益というわけではない。

モノクローナル抗体PR1A3は、NS1（P3/NS1/I−Ag−４
−１）ミエローマ細胞と正常な結腸大腸上皮細胞で免疫
されたマウスの脾臓細胞とを融合することによって産生
される（Richman ＆ Bodmer 1987）。PR1A3は、十分に
分化した、およびほとんど分化していない両方の結腸直
腸癌腫と強く反応し、その抗原が腫瘍に固定されている
ように見えるが、腫瘍を流出するリンパ管または正常リ
ンパ節内では見られないことから、他の結腸直腸上皮反
応性抗体以上の利点を備えている（Granowska等198
9）。PR1A3は、59/60の結腸大腸腫瘍と反応したが（Ric
hman ＆ Bodmer 1987）、CEA反応性B72.3は75％しか反
応しなかった（Salvatore等1989）。胃、回腸、食道、
気管および乳房の正常細胞に弱く結合することがいくつ
か証明されているが、in vivo試験により、基底膜がこ
れらの組織への上記抗体の接近を妨げることが示された
（Granowska等1990）。

Sheahanら（1990）Am.J.Clin.Path.94,157−164は、
癌胎児性抗原に対する特異性を示す二つのモノクローナ
ル抗体（D14とB7.1）について言及している。

Sakuraiら（1989）J.Surg.Oncol.42,39−46は、癌胎
児性抗原に対する特異性を示す種々のモノクローナル抗
体について述べている。

PR1A3は、イムノグロブリンとして一般に普及してい
るが、そのハイブリドーマは利用されていない。PR1A3
が結合する的確なエピトープは、知られていなかった。

本発明は、結腸直腸癌に対してPR1A3と同等以上の特
異性を備えたモノクローナル抗体を含む分子を提供す
る。このような抗体は、癌胎児性抗原（CEA）、すなわ
ち結腸直腸癌腫に提示された腫瘍マーカーの一部である
ことが判明した新規に見出されたPR1A3エピトープに対
するモノクローナル抗体（MAbs）を産生することによっ
て調製することができる。

本発明の第一の態様は、（ｉ）膜結合性ヒト癌胎児性
抗原（CEA）を結合し、（ii）ヒトの胆汁糖タンパク質
（BGP）の１〜314残基に結合（Ｎ−Ｃ）した完全なヒト
CEAの490残基〜Ｃ末端からなるハイブリッドポリペプチ
ドを結合し、（iii）ヒトのBGPに結合しない分子であっ
て、 V_H鎖の配列が、 あるいはV_H鎖の配列が、V_HCDR1の最初のアミノ酸残基が
グルタミンであること以外は上と同じであり、どちらの
場合でもV_L鎖の配列が であるIgG₁グループII A重鎖とκグループＶ軽鎖とを備
える完全なマウスモノクローナル抗体以外の分子を提供
する。

V_H鎖の配列は、以下のようにも記載できる。

また、V_L鎖の配列は以下のようにも記載できる。

V_HCDR1の最初のアミノ酸残基は、上記V_H配列の31位で
ある。

前記分子は、抗体であることが好ましい。

BGPのＮ−A1−B1−（A2のＮターミナルハーフ）ドメ
インに結合（Ｎ−Ｃ）したヒトCEAの（A3のＣターミナ
ルハーフ）−B3−GPIドメインからなるハイブリッドポ
リペプチドが、実施例１に詳細に記載され、図８にキメ
ラ１として図式的に示されている。これは、BGPの１〜3
14残基をCEAの490残基〜Ｃ末端にＮ−Ｃ型に融合したも
のである。完全なCEAのＣ末端は、668残基である。

“膜結合”という用語により、例えばAmerican Type
Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,
Maryland 20852,USAからカタログナンバーATCC HTB 38
のもとに入手可能な適度に良く分化したグレードIIヒト
結腸アデノカルシノーマ（adenocarcinoma）セルライ
ン、HT−29セルライン等の結腸癌腫細胞に見られるよう
なCEAを意味する。

“結合”という用語は、カバーガラスで生育したアセ
トン固定CEA陽性細胞単層の間接免疫蛍光法によって評
価する際に、蛍光複合抗マウス（またはヒト）IgG抗体
を用いたインキュベーション後、陽性シグナルを見るこ
とができることを意味する。実施例７は、細胞のアセト
ン固定および結合の決定方法について記載する。

抗体重鎖がIgG₁であることは、免疫拡散法ゲル（Ouch
terlony technique）におけるイソタイプ血清に特異的
な抗血清との反応によって、または酵素結合免疫測定法
（ELISA）によって決定することができる。マウスIgG重
鎖に反応し、診断に使用できるモノクローナル抗体は、
市販のものを利用することができ、例えば9x10⁸M^-1の結
合活性を備えたSerotec社、22 Bankside,Station Appro
ach,Kidlington,Oxford OX5 1JE,UKのラットモノクロー
ナル抗体クローンLO−MG1−２を利用することができ
る。

抗体軽鎖がκであることは、免疫拡散法ゲルにおける
特異的抗血清との反応およびELISAによって決定するこ
とができる。マウスκ軽鎖と反応し診断に使用できるモ
ノクローナル抗体は、市販のものを利用することがで
き、例えばSerotec社のラットモノクローナル抗体クロ
ーンMRC OX−20を利用することができる。

IgGグループII AおよびκグループＶは、Ｖ領域のサ
ブタイプと称され、参照として取り込んだKabatら（199
1）Sequence of Proteins of Immunological Interest,
fifth edition,US Department of Health and Human Se
rvices,NIH Publication No91−3242に記載されたＶ領
域フレームワークの配列によって明確にされている。

上記分子は、ヒトの体内に存在し、腸に位置する自然
に産生した他のヒトタンパクに実質的に結合しないこと
が好ましい。このようなタンパクには、コラーゲンおよ
び血清アルブミンが含まれる。

この分子が、Ｎ−A1−Fc、Ｎ−A1−B1−FcもしくはＮ
−A1−B1−A2−Fcに結合しないことが好ましい。ここ
で、A1、B1およびA2はCEAのドメインであり、Fcはイム
ノグロブリンのFc部である。

この分子が、B3ハイブリッドに結合しないことがさら
に好ましい。ここでGPIアンカーは除去されているか、G
PIアンカーはBGPトランスメンブレンセグメントで置換
されている。

この分子が抗体である場合には、ヒトフレームワーク
領域および少なくとも請求項１記載のV_H鎖およびV_L鎖の
相補性決定領域を含有することが好ましく、ここでV_H鎖
のCDR1はVFGMN（SEQ ID No3）、CDR2はWINTKTGEATYVEEF
KG（SEQ ID No4）およびCDR3はWDFYDYVEAMDY（SEQ ID N
o5）であり、V_L鎖のCDR1はKASQNVGTNVA（SEQ ID No
6）、CDR2はSASYRYS（SEQ ID No7）およびCDR3はHQYYTY
PLFT（SEQ ID No8）である。

PR1A3は、IgG₁グループII A重鎖およびκグループＶ
軽鎖を有するマウスモノクローナル抗体であり、V_H鎖の
配列が上述したように本発明の第一の態様から除外され
ているもの、あるいはV_HCDR1の最初のアミノ酸残基がグ
ルタミンであるものであり、かつ、V_L鎖の配列が上述の
ように本発明の第一の態様から除外されているものであ
る。

CEAは、免疫グロブリンスーパージーンファミリー（T
hompson ＆ Zimmermann 1988;Thompsonら1991参照）の
一つである。CEAは、Ｎ−A1−B1−A2−B2−A3−B3−GPI
のドメイン構造を備えており、GPIはグリコホスファチ
ジルイノシトール膜アンカーである。かなりの程度の配
列相同性が、CEAのドメインおよびNCA等のファミリーの
他のメンバーとの間に存在する。

胆汁糖タンパク（BGP）も、免疫グロブリン遺伝子ス
ーパーファミリーの一つであり、Ｎ−A1−B1−A2−TMの
ドメイン構造をとりTMはトランスメンブレンドメインで
あるが、BGPのA1、B1およびA2ドメインは、CEAのA1、B1
およびA2と称されるドメインとは別である。

“抗体”という用語に、モノクローナル抗体とポリク
ローナル抗体、抗体断片を含める。これらは、（ｉ）ヒ
トCEA、（ii）ヒトのBGPの１〜314残基に結合（Ｎ−
Ｃ）したヒトCEAの490残基〜Ｃ末端からなるハイブリッ
ドポリペプチドに特異的かつ可逆的に結合するが、（ii
i）ヒトBGPには結合しないものであって、IgG₁グループ
II A重鎖とκグループＶ軽鎖とを備える完全なマウスモ
ノクローナル抗体、すなわちV_H鎖の配列が（図１に示さ
れたもの）かもしくはV_HCDR1の最初のアミノ酸残基がグ
ルタミンでありかつ、V_L鎖の配列が（図２に示されたも
の）である抗体を除く。

抗体または抗体断片が、モノクローナル抗体から誘導
されることが好ましい。

モノクローナル抗体は、参照として取り込まれたZol
a,H.（1988）（“Monoclonal Antibodies−A manual of
techniques"CRC Press）の技術によって一般的に調製
することができる。Fab、（Fab）_２、Fv、scFvもしくは
dAb断片等の抗体断片は、これに基づいて既知の方法で
調製することができる。抗体は、例えばヒトの抗体のフ
レームワークにマウスの抗体のCDR領域を挿入すること
によって既知の方法でヒューマナイズ（humanized）す
ることができる。抗体様分子は、国際特許第84/03712号
の組換えDNA技術を用いて調製することができる。この
タンパクに特異的な領域を、McCaffertyら（1990）Natu
re 348,552−554の技術を用いてバクテリオファージの
一部として発現させることができる。

本発明の抗体様分子は、細胞内で発現されたCEAまた
はハイブリッドタンパクを固定してファージを選別する
のに使用してGriffithsら（1993）EMBO J.12,725−734
に記載された方法を用いてファージディスプレイライブ
ラリー（phage display libraries）から選別すること
ができる。また、単層で生育され、ホルムアルデヒドま
たはグルタルアルデヒドで固定もしくは固定されていな
い適切な細胞もファージを結合するのに使用することが
できる。関係の無いファージを洗い流して、結合したフ
ァージを、CEAまたはハイブリッドタンパクへの結合を
切断して回収し、バクテリアで再度増幅（reamplifyin
g）する。この選別および増幅工程は、本発明の抗体様
分子である上記分子に係るファージを増すために数回行
う。

また、本発明の抗体様分子にファージディスプレイラ
イブラリーからのペプチドと同様にして、ランダムペプ
チドライブラリーから選別されたペプチドも含める。

抗体の可変重（V_H）領域と可変軽（V_L）領域は抗原認
識に関与し、これは初期のプロテアーゼ分解実験で最初
に認識された事実である。げっ歯類抗体の“ヒューマナ
イゼーション（humanisation）”によってさらなる確証
が得られた。得られた抗体が、げっ歯類を親とする抗体
の抗原特異性を保有するように、げっ歯類に由来する可
変領域を、ヒトに由来する定常領域に融合することがで
き（Morrisonら（1984）Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81,685
1−6855）、げっ歯類の抗体をヒューマナイズするため
に“CDR移植”を用いることができる。追加的または選
択的に、組換えモノクローナル抗体を“プリマタイズ
（primatised）”、すなわち重鎖および軽鎖の可変領域
またはその一部並びに定常領域を二つの異なる霊長類の
種から誘導することができ、好ましくは抗体の可変領域
をマカクザル、定常領域をヒトから誘導する。このよう
な抗体の利点としては、ヒト免疫グロブリンに対する高
い相同性、ヒトエフェクター機能（human effector fun
ctions）の存在、低い免疫原性およびより長い血清半減
期（serum half−life）（Newmanら（1992）Biotechnol
ogy 10,1455）が含まれる。

抗原特異性が可変領域によって付与され、定常領域と
は別であることは、抗体断片の細菌発現を含む実験から
わかっており、全てが一つ以上の可変領域を含んでい
る。これらの分子は、Fab様分子（Betterら（1988）Sci
ence 240,1041）;Fv分子（Skerraら（1988）Science 24
0,1038）;V_HおよびV_Lパートナー領域が柔軟なオリゴペ
プチドを介して連結されたシングルチェーンFv（ScFv）
分子（Birdら（1988）Science 242,423;Hustonら（198
8）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5879）および単離され
たＶ領域を含有するシングルドメイン抗体（dAbs）（Wa
rdら（1989）Nature 341,544）を含む。特異的結合部位
を保有する抗体断片の合成に係る技術の一般的な書評
は、Winter ＆ Milstein（1991）Nature 349,293−299
に見られる。

“ScFv分子”とは、V_HおよびV_Lパートナー領域が柔軟
なオリゴペプチドを介して連結された分子を意味する。

ある状況では、抗体全体より抗体断片を用いた方が有
利である。より小さい大きさの断片は、クリアランスを
早め、かつ非腫瘍に対する腫瘍の割合を改善することが
できる。Fab、Fv、ScFvおよびdAb抗体断片は、E.coliで
発現および分泌され、大量の前記断片を容易に産生する
ことができる。

全体の抗体およびＦ（ab'）_２フラグメントは“二
価”である。“二価”とは、前記抗体およびＦ（ab'）
_２フラグメントが二つの抗原結合部位を有することであ
る。対照的に、Fab、Fv、ScFvおよびdAbフラグメントは
一価であり、一つだけの抗原結合部位を有する。

Tan,L.K.およびMorrison,S.L.（1988）Adv.Drug Deli
v.Rev.2:129−142、Williams,G.（1988）Tibtech 6:36
−42およびNeuberger,M.S.ら（1988）8th Internationa
l Biotechnology Symposium Part 2,792−799（これら
の全てを参照としてここに取り込む）に記載されている
ように、“抗体技術”は急速に進んでおり、本発明の抗
体から誘導された抗体様分子を調製するのに良く適して
いる。

抗体が特異的に結合する抗原の研究もしくは単離およ
び精製、並びに抗原提示細胞の視認化（イメージング）
および処置に係る種々の目的にこれらの抗体を使用する
ことができる。他の実施態様では、本発明の抗体を、シ
ンチグラフィックラジオラベル（scintigraphic radiol
abel）、細胞毒性化合物またはラジオアイソトープ、非
毒性のプロドラッグを細胞毒性の薬剤に変換する酵素、
得られた複合物を結腸の腫瘍に向けるために免疫系を活
性化する化合物、もしくは細胞刺激性化合物に結合す
る。このような複合物は、本発明の抗体からなる“結合
部位”と、ラジオラベル、毒素または酵素等からなる
“機能部位”とを備える。

この抗体は、他の化合物の結合を物理的に妨害するこ
とによって、単にCEA抗原の活性をブロックするための
みに用いることもできる。

この複合体（ペプチドまたはポリペプチド）の結合部
位と機能部位は、O'Sullivanら（1979）Anal.Biochem.1
00,100−108に一般に記載されたような、クロスリンキ
ングポリペプチドの何らかの通常の方法によって互いに
結合することができる。例えば、ある部位にチオール基
を増し、他の部位をこれらのチオール基と反応する二価
性の試薬、例えばヨード酢酸のＮ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル（NHIA）またはＮ−スクシニミジル−３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（SPDP）と反
応させる。例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル等のアミドおよびチオ
エーテル結合は、一般的にジスルヒド結合よりin vivo
でより安定である。

結合部位が炭水化物を含有する場合、抗体またはある
抗体断片の場合等では、欧州特許第0088695号の結合技
術を用いて機能部位を炭水化物部位を介して結合するこ
とができる。

複合体の機能的部位は、例えばBagshaweとその共同者
の複合体（Bagshawe（1987）Br.J.Cancer 56,531;Bagsh
aweら（1988）Br.J.Cancer 58,700;国際特許第88/07378
号）またはシアニド放出システム（国際特許第91/11201
号）等の非毒性のプロドラッグを毒性の薬剤に変換する
ための酵素とすることができる。

複合体に酵素全体が存在する必要はないが、当然に触
媒部位は存在しなければならない。いわゆる“アブザイ
ム（abzymes）”を用いることができ、モノクローナル
抗体は、通常は反応中間状態である、触媒反応を望む反
応に係る化合物に対して産生される。得られた抗体は、
反応のための酵素として作用することができる。

複合体は、サイズ排除またはアフィニティークロマト
グラフィーで精製することができ、二重の生物学的活性
を試験することができる。抗原免疫反応性は、固定化し
た抗原を用いた酵素免疫検定法（enzyme−linked immun
osorbent assay）（ELISA）および生きた細胞内におけ
るラジオイムノアッセイを用いて測定することができ
る。エンザイムアッセイは、グルコース残基が加水分解
されたときに吸収に変化を与える基質、例えば遊離した
２−ニトロフェノールが405nmで分光光学的に測定され
るoNPG（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ド）等を用いて、β−グルコシダーゼに使用することが
できる。

複合体の安定性は、最初に血清中で37度でインキュベ
ートし、次いでサイズ排除FPLC分析を行うことによって
in vitroで試験できる。in vitroでの安定性は、複合体
を注射してから様々な時間経過後に血清を分析すること
によってマウスにおいても同様に試験することができ
る。さらに、複合体形成前に¹²⁵Iで抗体を、また¹³¹Iで
酵素を放射能標識することができ、マウス内における複
合体、遊離した抗体および遊離した酵素の生物学的拡散
（バイオディストリビューション）を測定することがで
きる。

あるいは、前記複合体を組換えDNA技術により融合化
合物として産生することもでき、この技術によれば、互
いに隣接した、もしくは複合体の所望の特性を壊さない
リンカーペプチドをコードする領域で分けられた複合体
の二つの部位をコードする各領域を一本のDNAが備えて
いる。

考えられるところでは、化合物の二つの機能的部位
は、完全または部分的にオーバーラップしてもよい。次
いで、DNAを、既知の方法を用いて適切な宿主中で発現
させる。

この複合体は、例えば等張生理食塩水（静脈内投与す
る場合）等の、標準的な無菌の非発熱原性の希釈および
輸送剤とあわせて、通常は静脈内または腹腔内（intrap
eritoneally）等の非経口的に適切な方法で投与するこ
とができる。複合体が標的細胞に結合して（必要であれ
ば）血流から除去されたら（普通は一日くらいかか
る）、一般的には一回の注入量としてプロドラッグを投
与するか、腫瘍を視認（イメージ）できるようにする。

必要であれば、複合体が抗原性であることから、より
長い間治療できるようにシクロスポリンまたは他の免疫
抑制剤を付与することができるが、普通は必要としな
い。

複合体の投与とプロドラッグの投与との間の時間は、
非発明的方法で最適化することができる。複合体の腫瘍
／正常組織比は（少なくとも静脈輸送が続く）、約４−
６日後に最高となるが、このとき腫瘍に結合した複合体
の絶対量、すなわちグラムあたりの注入量のパーセント
に換算すると前に比べて低くなる。

それゆえ、複合体の投与とプロドラッグの投与との間
の最適な間隔は、酵素のピーク腫瘍濃度と、腫瘍と正常
な組織との間の最適な分散率との間の折衷となる。複合
体の投与量は、通常の基準に従って医師によって選択さ
れる。少なくともβ−グルコシダーゼ等の標的化された
酵素と毒性プロドラッグとしてアミグダリンの静脈内投
与を用いる方法の場合には、体の表面積の平方メートル
あたり0.1〜10.0gの１〜50の日々の投与、好ましくは1.
0〜5.0g/m²が適切であろう。経口治療では、0.05〜10.0
g、好ましくは1.0〜5.0gの一日３回投与を１〜50日間行
うのが適切である。どの複合体の投与量も、特に腫瘍の
タイプ、段階および位置並びに患者の体重を参考に通常
の基準に従って同様に選択される。治療の持続期間は、
複合体に対するあらゆる免疫反応の急速性および範囲に
部分的に依存する。

複合体を診断に使用する際には、通常はこの複合体の
機能的部位が、例えばテクネチウム99m（^99mTc）または
ヨウ素123（¹²³I）等のシンチグラフィーの研究のため
の放射活性原子、もしくはヨウ素123、ヨウ素131、イン
ジウム111、フッ素19、炭素13、窒素15、酸素17、ガド
リニウム（gadolinium）、マンガンもしくは鉄等の核磁
気共鳴（nmr）イメージング（磁気共鳴イメージング、m
riとしても知られる）用のスピンラベルを備える。

腫瘍の選択的破壊のための化合物に用いる場合には、
機能的部位は、隣接する細胞を破壊するのに十分なエネ
ルギーを照射するヨウ素131、レニウム186、レニウム18
8、イッテリウム90または鉛212等の高度に放射活性を備
えた原子、あるいはメトトレキセート、アドリアマイシ
ン、ビンカアルカロイド（vinca alkaloids）（ビンク
リスチン、ビンブラスチン、エトポシド（etoposid
e））、ダウノルビシンもしくは他の挿入剤等の細胞毒
性化学化合物を含有することができる。

放射線または他の標識は、既知の方法で複合体に取り
込むことができる。例えば、ペプチドは、生合成により
もしくは、例えば水素の位置にフッ素19を含む適切なア
ミノ酸前駆物質を用いた化学的アミノ酸合成方法によっ
て合成することもできる。^99mTc、¹²³I、¹⁸⁶Rh、¹⁸⁸Rh
および¹¹¹In等の標識は、ペプチドのシステイン残基を
介して取り付けることができる。イッテリウム90はリジ
ン残基を介して取り付けることができる。ヨードゲン方
法（The IODOGEN method）（Frakerら（1978）Biochem.
Biophys.Res.Commun.80:49−57）は、ヨウ素123の取り
込みに使用できる。“イムノシンチグラフィーにおける
モノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies in Immun
oscintigraphy）”（Chatal,CRC Press 1989）は、詳細
に他の方法を記載している。

本発明の第二の態様は、医薬に用いるための本発明の
第一の態様に定義したような分子、好ましくは抗体を提
供する。

本発明の第三の態様は、結腸のがん腫を診断または治
療することに用いる医薬の製造における、本発明の第一
の態様に定義した分子、好ましくは抗体の使用を提供す
る。

本発明の第四の態様は、単一特異的な抗体を作成する
方法を提供するものであって、この方法は、（ｉ）ヒト
の膜に基づくCEAに結合し、（ii）ヒトBGPの１〜314残
基に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトCEAの490残基〜Ｃ末端から
なるハイブリッドポリペプチドに結合するが、（iii）
ヒトBGPには結合しない単一特異的抗体を選択するため
に抗体のプールをスクリーニングすることを含む。

単一特異的抗体がモノクローナル抗体であり、抗体の
プールがモノクローナル抗体のプールであると好まし
い。プール内の抗体は、組換えDNA方法によって産生さ
れた抗体を有するとさらに好ましい。

好ましい態様では、スクリーニング段階で抗体が以下
の条件合うものである： （１）結腸の癌腫細胞（RichmanとBondmer（1987）Int.
J.Cancer 39,317−328）等のヒトの腫瘍細胞およびヒト
の胃の癌腫セルラインMKN45（Kojamaら（1990）Jpn.J.C
ancer 81,967−970）に結合するもの。例えばアセトン
を用いて細胞をスライドガラスまたはカバーガラスに固
定し、第二の蛍光標識化抗種抗体、例えばもし最初の抗
体がマウスIgGであればFITC標識化した抗マウスIgGによ
って抗体の結合を検出する間接的な免疫蛍光アッセイで
結合を検出する。もしくは懸濁液中の細胞に結合する抗
体を測定することができ、抗体結合を放射線活性標識し
た第二抗体、例えば¹²⁵I標識化抗マウスIgGによって検
出することができる。

（２）ヒトCEAが移入され、ヒトCEAを発現する細胞に結
合するもの。例えば、ベクターpCDM8（Invitrogen）内
のCEA cDNA（Beaucheminら（1987）Mol.Cell.Biol.7,32
21−3230）を用いてエレクトロポレーションによって移
入されたサルウイルス40−形質転換されたサルの繊維芽
細胞ラインCOS−7;デキサメタゾン（dexamethasone）誘
発性ベクターpMAMneo（Clontech）内のCEA cDNAを用い
てエレクトロポレーションによって形質転換されたチャ
イニーズハムスター卵巣細胞（CHO）：プラスミドpSVne
o2を用いたリポフェクションによってマウス結腸直腸の
癌腫セルラインCMT93に共形質転換（co−transfected）
されたCEAのコスミドクローン（Willcocks,T.C.とCrai
g,I.W.（1990）Genomics 8,492−500）;CEA遺伝子クラ
スター、例えばクロモソーム19の長い腕のq13.1−q13.3
領域のICRFy9000C02400を含有し、かつ、pYAC4の右腕の
ベクターアームを備えたプラスミドベクターpAN4（Rago
ussisら（1992）Nucleic Acids Res.290,3135−3138）
を用いた相同的組換え（homologous recombination）に
よってネオマイシン耐性（neo^R）遺伝子を含むように修
飾されたイーストの人工的染色体（yeast artificial c
hromosome）すなわちYACで形質転換したCHO細胞であっ
て、形質転換はイーストスフェロプラスト細胞融合（Bu
rgers,P.とPercival,K.（1987）Anal.Biochem 163,391
−397）によって成されたものとすることができる。

（３）例えばハイブリッド遺伝子を有するプラスミドpC
DM8を用いたエレクトロポレーションで形質転換されたC
OS−７細胞等の、ハイブリッド遺伝子BGP−CEAB3−GP1
が移入され、これを発現する細胞に結合するもの。エレ
クトロポレーションは実施例６に記載されている。

（４）CEAを発現せずにBGPを発現する細胞には結合しな
いもの。例えば、BGPのcDNAを有するプラスミドpCDM8を
用いて形質転換されたCOS−７細胞など。

（５）CEAを発現せずにNCAを発現する細胞には結合しな
いもの。例えば、NCAのcDNAを有するプラスミドpCDM8を
用いて形質転換されたCOS−７細胞など（Heftaら（199
0）Cancer Res.50,2397−2403）。

（６）GPIアンカーが無くハイブリッドBGP−CEAB3を発
現する細胞には結合しないもの。これらの細胞では、正
常に処理されればGPIアンカーで置換されるCEAB3配列内
の疎水性テール部の最初の位置にストップコドンが取り
込まれた、BGP−CEAB3のハイブリッド遺伝子を有するプ
ラスミドpCDM8を用いて形質転換した形質転換型COS−７
がある。PCRは、このようなストップコドンを取り込む
のに使用することができる。

（７）BGP−CEAB3−BGP TMを発現する細胞には結合しな
いもの。例えば、CEAの処理された疎水性セグメントに
代えてCEAのB3ドメインにBGPのトランスメンブレンドメ
インが付加されたハイブリッド遺伝子を有するpCDM8を
用いて形質転換されたCOS−７など。

CEAに結合しない使用可能な対照の抗体は、例えばＴ
細胞マーカーCD4を認識するものである。適切な抗CD4抗
体は、例えばOKT4（抗ヒトヘルパーＴ細胞サブセット;A
TCC CRL 8002）等のATCCから利用できる。

本発明の抗体の選択は、どの順序で上記工程を行って
もよい。

最初のスクリーニングを、ヒト腫瘍セルラインまたは
cDNAまたはコスミドのCEAを発現するトランスフェクト
マ（transfectoma）等のCEA発現細胞ラインで行うこと
が好ましい。

第二のスクリーニングを、上述の遺伝子およびハイブ
リッド遺伝子を用いて形質転換されたセルラインで行う
ことが好ましい。

NCAは非特異的交差反応抗原であって、Ｎ、A1およびB
1ドメインとGPIアンカーを備えている（ThomsonとZimme
rman（1988）Tumour Biol.9,63−83並びにThomsonら（1
991）J.Clin.Lab.Analysis 5,344−366参照）。

発現に適切な親セルラインは、CEAを発現しないCOS細
胞およびCHO細胞を含む。

本発明を、以下の実施例および図面を参照しながら詳
細に記載する。

図１は、マウスのモノクローナル抗体のV_H鎖の推測さ
れるアミノ酸配列（マウスの重鎖;SEQ ID No1）、ヒュ
ーマナイゼーション（humanisation）用のフレームワー
ク配列を提供するために用いたヒト抗体RF−TS3'CLのV_H
配列との比較（RF−TS3バックボーン;SEQ ID No27）お
よび作成したヒューマナイズ化配列（ニューマナイズ化
重鎖;SEQ ID No28）を示す。RF−TS3'CLの配列は、参照
としてここに取り込まれたPascualら（1990）J.Clin.In
vest.86,1320−1328に開示されている。

図２は、マウスのモノクローナル抗体のV_L鎖の推測さ
れるアミノ酸配列（マウスのκ;SEQ ID No2）、ヒュー
マナイゼーション用のフレームワーク配列を提供するた
めに用いたヒト抗体REIのV_L配列との比較（REIバックボ
ーン;SEQ ID No29）および作成したヒューマナイズ化配
列（ヒューマナイズ化κ;SEQ ID No30）を示す。

図３は、CEAとNCA−50とのアミノ酸配列の比較を示
す。対応するドメインは共にグループ化されている。ど
ちらの場合も、点は各グループの一番上の行に示された
CEAドメインのアミノ酸と同一であることを示す。ダッ
シュは、CEAと比較した場合のアミノ酸の欠失を示す。
Ｎ−グリコシル化の可能性のある位置に下線を付した。

図４は、BGPのcDNA配列（SEQ ID No31）と推測される
アミノ酸配列（SEQ ID No32）とを示す。

図５は、GPIの構造を示す。

図６は、ヒューマナイズ化した重鎖の構成を示す。FR
は、フレームワーク領域（framework regions）を示す;
CDRは、相補性決定領域を示す；＝はヒト化重鎖をコー
ドする二本鎖DNAを示す；→は、オーバーラッピングPCR
（overlaping PCR）のためのプライマーとして用いられ
た5'−3'の方向を示す合成オリゴヌクレオチドを示す。

図７は、ヒューマナイズ化した軽鎖の構造を示す。FR
は、フラグメント領域を示す;CDRは相補性決定領域を示
す；＝ヒューマナイズ化した重鎖をコードする二本鎖DN
Aを示す；→は、オーバーラップPCRのためのプライマー
として用いられた5'−3'の方向を示す合成オリゴヌクレ
オチドを示す。

図８は、BGP−CEAキメラ構造物を示す。

図９は、ヒューマナイズ化抗体のＶドメインのモデル
を示す。軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）の相補性決定領域
（CDRs）１〜３の位置を示す。抗原認識に関係する二つ
のグルタミン酸残基、Ｅ（H:106）−重鎖の106位および
Ｅ（H:57）−重鎖の57位にしるしを付した。

図10は、CEAのB3ドメインのモデルを示す。リジンと
アルギニン残基の位置にしるしを付した。KG36（636位
のリジン）とR594（594位のアルギニン）のin vitro変
異は、抗原へのPR1A3結合を破壊する。

図11は、NCAのcDNA配列（SEQ ID No33）および推測さ
れるアミノ酸配列（SEQ ID No34）を示す。

図12は、CEAのcDNA配列（SEQ ID No35）および推測さ
れるアミノ酸配列（SEQ ID No36）を示す。

図13は、PR1A3κ軽鎖のcDNA配列（SEQ ID No37）およ
び推測されるアミノ酸配列（SEQ ID No38）を示す。

図14は、PR1A3の重鎖のcDNA配列（SEQ ID No39）およ
び推測されるアミノ酸配列（SEQ ID No40）を示す。

実施例1:PR1A3によって認識されるエピトープの同定 YAC（イーストの人工的クロモソーム）およびコスミ
ドの研究は、PR1A3抗原をコードする遺伝子を、CEA遺伝
子が位置する染色体の領域にマッピングし、CEA様のPR1
A3エピトープがγ−インターフェロンによってアップレ
ギュレートされることが示された。CEAのcDNAの種々の
細胞への移入により、これらの細胞上にPR1A3が出現
し、モノクローナル抗体PR1A3はCEAのエピトープを認識
することが示唆された。

CEAのドメインを、Ｎ−A1−FC、Ｎ−A1−B1−Fcおよ
びＮ−A1−B1−A2−FcとしてイムノグロブリンのFc部位
への融合物としてCOS細胞内に発現させた。これらのど
の構造物もPR1A3と反応するタンパク質を産生しなかっ
たことから、前記エピトープはＮ−A1−B1−A2領域に位
置していない。

BGPとCEAのハイブリッド構造物は、CEAの（A3のＣ末
端ハーフ）−B3−GPIドメインが、BGPのＮ−A1−B1−
（A2のＮ末端ハーフ）ドメインに融合するように調製さ
れた。CEAとBGPのアミノ酸配列は、図３および４に示さ
れている。このハイブリッド構造物ナンバー１は、BGP
のシステイン314までとCEAのグルタミン酸490〜Ｃ末端
までを含む（図８参照）。このハイブリッド構造物は、
発現プラスミドpCDM8からCOS細胞内に発現された。免疫
蛍光アッセイで分析すると、形質転換されたCOS細胞
は、マウスPR1A3抗体とヒト／マウスキメラ抗体との両
方で正のシグナルを与えた（以下を参照）。これは、PR
1A3エピトープがB3−GPI領域の領域内にあることを確証
する。プラスミドpCDM8は、SeedとAruffo（1987）Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 84,3365−3369に記載されている。

GPIアンカーがタンパク質に添加されないように、ハ
イブリッド構造物ナンバー１にストップコドンを導入し
た。CEA部は、もはや膜結合型ではないが、可溶化され
分泌される。ストップコドンは、CEAの644残基の位置に
導入され、（Ｎ−A1−B1−（A2のＮ末端ハーフ））BGP
−（（A3のＣ末端ハーフ）−B3）CEAが形成された（構
造物ナンバー2;図８）。ベクターpCDM8を用いたこの構
造物のCOS細胞への移入（トランスフェクション）によ
り、BGPと交差反応する抗体3B10を用いた免疫蛍光的研
究で陽性であるが、PR1A3に陰性な細胞を得た。これ
は、ハイブリッドタンパクが発現したが、ハイブリッド
が膜結合型でないときにはPR1A3エピトープが欠如して
いることを確証する。

キメラ構造物3aおよび3bを作成した。これらは、図８
に示すような構造である。

発現構造物の作成に用いたPCR法 BGPのクローニングに以下のプライマーを用いた： キメラ１用にBGPとCEAフラグメントを親分子からPCR
で増幅した。生産物をCla Iで切断し、連結した。アニ
ールした産物の5'と3'末端を、COS−７細胞内における
一過性の発現のためのpCDM8ベクターのHind III−Xba I
部位に連結するために、Hind IIIとXba Iで切断した。

以下のプライマーを用いた： キメラ２は、キメラ１から増幅して、pCDM8への連結
のためにHind IIIとXba Iで切断した。

以下のプライマーを用いた： キメラ3aと3bを作成するために、分子の5'部位を、BG
P5'プライマーと必要な継ぎ目に相補的なアンチセンス
オーバーラッピングプライマーとを用いてキメラ１の鋳
型から増幅した。このBGPトランスメンブレンドメイン
を、センスオーバーラッピングプライマー（sense over
lapping primer）とBGP3'プライマーとを用いたBGPから
増幅した。

アニール化した分子を集めるために、“プライマー−
ダイマー”を形成するために二つの相補的フラグメント
を18PCRサイクルにかけ、12の更なるPCRサイクル用のBG
P5'および3'アウトサイド（outside）プライマーを添加
した。

構造物3a用に以下のプライマーを用いた： 以下のプライマーを構造物3b用に用いた： アンカーの構造は、Ferguson（1992）に記載されてお
り、哺乳類のGPIの遺伝子構造は図５に示されている。G
PIアンカーから脂質の尾部（テール）を切断して可溶性
産物を与えるホスホリパーゼとインキュベートすること
によってMKN45細胞から放出されたCEAを用いた研究によ
り、RP1A3エピトープを含有するCEAを生産できる。SDS
PAGEおよびウェスタンブロッティングで試験する際に、
ジスルフィド結合を切断する還元剤ジチオトレイトール
を含む２％SDSサンプルバッファーでこの抗原を煮沸し
た場合に、弱いシグナルが得られる。還元剤を省いてジ
スルフィド結合を完全に維持させることを除いては同様
の方法で、この抗原を試験した場合には、強いシグナル
が得られた。このことから、このエピトープが少なくと
も部分的に配座的（コンホメーショナル）であることが
示唆される。さらに、NCAは高度の配列相同性を備えた
点でCEAと関係しており、GPIアンカーを備えているが、
PR1A3と反応しない。従って、GPIは、このエピトープに
十分なものではない。

実施例2:分子モデルおよびin vitro変異 抗体PR1A3の分子モデルは、抗体のCDR領域に通常のも
のではない二つの不対のネガティブチャージがあること
を示している。これらのチャージは、抗体によって認識
されたエピトープに相補的なチャージが存在することを
示唆しているのだろう（図９および10参照）。

CEAのB3ドメインの分析および他のファミリーメンバ
ーであるNCAとの比較により、抗原−抗体反応で重要な
役割を演ずるポジティブチャージを有する３つの残基が
あることが示唆された。この残基は、CEA B3ドメインの
610位および636位のリジンと514位のアルギニンであっ
た。抗体PR1A3によって認識されるエピトープにおける
個々のチャージの役割を調べるために、これらの残基を
リジンまたはアルギニンからアラニンに変えた。DNA配
列を変えることによりアミノ酸を変更することが可能で
ある。ポリメラーゼチェーン反応は、増幅プライマーの
一つに取り込まれる部分変異（ポイントミューテーショ
ン）を導入するために使用することができる。このフラ
グメントを、クレノウフラグメントを備えた平滑末端と
するか制限エンドヌクレアーゼで切断し、産物を配列決
定するために適切なベクターに連結する。あるいは、配
列の中部に変異を導入するために、ミューテーションを
包括する二つのフラグメントを互いにアニールし、相互
に開始される合成法（mutually primed synthesis）に
よって延長する。次いで、このフラグメントを切断し、
配列決定するのに適した適切なベクターに連結する。

TaqポリメラーゼおよびTaqリガーゼで増幅する際に、
リン酸化オリゴヌクレオチドを取り込むためにPCRを使
用することもできる（Michel,BioTechniques 16（３）,
410−412）。

変異は、全体的に合成された遺伝子もしくは遺伝子の
一部の調製によっても導入することができる。

配列に変化を導入するのに使用した方法は、Kunkelの
方法（1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,488−492）に
よるオリゴヌクレオチド向け変異誘発（oligonucleotid
e directed mutagenesis）である。

CEAの反復特性は、変異誘発を行うためにCEAのB3ドメ
インおよび下流配列が類似の上流配列から単離される必
要があることを意味する。この領域を、Cla I 5'部位と
Xba I 3'部位を導入するプライマーを用いて増幅し、こ
のフラグメントをpBluescript II KS−にクローン化し
た。このプラスミドを、チミジンの代わりに多量のウラ
シル残基を含むプラスミドを産生するE.coliのdut^-ung^-
F'株（CJ236）に形質転換した。一本鎖鋳型をヘルパー
ファージM13 K07を用いたスーパーインフェクション（s
uperinfection）で産生した。変異配列を含有するリン
酸化オリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールし、二本
鎖環状分子を産生するためにT4 DNAポリメラーゼおよび
リガーゼの存在下で伸長した。このヘテロ二本鎖分子を
野生株（dut⁺ung⁺）に導入することにより、ウラシル含
有野生型鎖の分離および変異鎖の複製を引き起こした。
コロニーを単離し、変異遺伝子型が存在することを確か
めるためにDNAの配列を決定した。

変異構造物の配列決定を行った後、これらのB3ドメイ
ンをBGPの１−314残基およびCEAの490−668残基からな
るキメラタンパクを作成するために用いた。これらの製
造物は、COS細胞で一時的に発現された場合に、PR1A3結
合に陽性であることが示された。

pCDM8に挿入してCOS細胞で発現した後に、免疫蛍光実
験によって、K2（リジン636→アラニン）およびR3（ア
ルギニン594→アラニン）変異を有する製造物はPR1A3に
もはや認識されないが、K1（リジン610→アラニン）変
異は結合に何の影響も与えないことが証明された（図10
参照）。これらの結果は、エピトープのK2およびR3残基
がPR1A3によって認識されることを示す。

実施例3:CEAに反応するモノクローナル抗体の調製およ
び特性 RichmanとBodmer（1987）の方法でCEAに反応するモノ
クローナル抗体を調製した。

組織、細胞、細胞培養 正常な大腸および結腸の腫瘍の新鮮なサンプルを用い
た。これらを、液体窒素で素早く凍結し−70℃で保存し
た。結腸外（extra−clonic）正常成人および胎児の組
織の冷凍サンプルを用いた。

使用した結腸癌腫セルラインは、異なる腫瘍に由来す
る。HT29結腸癌腫セルライン（FoghとTrempe,1975）
は、10％ウシ胎児血清（FCS）を含有する培地RPM1 1640
で、37℃、５％CO₂を空気中に含み100％の湿度で維持し
た。LS174T、SW1222、SW48、SW620およびSW837結腸癌腫
セルライン（Tomら,1976;Leibovitzら,1976）を10％FCS
を含有するダルベッコの調節イーグル培地（Dulbecco's
modified Eagle's medium）で、37℃、10％CO₂を空気
中に含み100％の湿度で維持した。

P3/NS1/1−Ag−４−１（NS1）は、８−アザグアニン
耐性BALB/cミエローマセルラインである。これを、10％
FCSと2x10^-5M 6−チオグアニンを有するRPMI 1640で維
持した。

この研究で産生されたハイブリドーマは、20％FCS、1
0^-4Mヒポキサンチン、1.6x10^-5Mチミジンおよび10^-5メ
トトレキセート（HAT）を有するRPMI 1640で最初に培養
した。クローニング後、ハイブリドーマ細胞からHATを
除き、10％FCSを有するRMPI 1640で維持した。

免疫材料 BALB/cマウスを４種の異なる標品で免疫した。

1.正常な結腸粘膜の検体。正常な大腸のサンプルをコル
ク板（cork board）上にピンでとめた。冷えた無菌リン
酸緩衝液A,pH7.4（PBS−Ａ）で（10回）すすいだ後、粘
膜をメスでこすり落として粘膜筋板から切開した。粘膜
の検体を液体窒素で素早く凍結し、タングステンボール
ベアリング（tungsten ballbearing）を備えたポリプロ
ピレンバイアル中でパウダー状になるまで機械的に振動
を与えた。この物質を、0.2mlの完全フロイントアンジ
ュバントと0.2mlのPBS−Ａで懸濁した。一度の接種につ
き、0.4mlのエマルジョン中の0.2gの湿組織（wet tissu
e）を動物に与えた。

2.正常な結腸上皮のクルードな膜調製物。新鮮な正常結
腸粘膜検体は上述のようにして調製した。湿組織１グラ
ムを、各膜調製物のために使用した。組織サンプルを、
ジチオトレイトール（DTT）を含有する10mlスクロース
バッファーに解かし（戻し）、Dounce−ホモジェナイズ
を行った（250mMスクロース−RNアーゼフリー:50mMトリ
エタノールアミン−HCl pH7.5;60mM MgCl₂;2mM DTT）。
40000gで15分間遠心した後、核およびミトコンドリアの
ペレットを捨てた。その上清を30分間20000gで遠心し
た。このミクロソームペレットを、10mMのTris HCl pH
7.4中の40％スクロースに保持および再懸濁した。この
スクロース溶液を屈折計の値が1.392−５となるように
調節して、10mMのTris HCl pH7.4中の25％スクロース
（屈折計の値が1.375）を上層し、スクロース勾配を４
℃で65000gで15時間遠心した。膜を境界から回収し、10
mMのTris pH7.4で二度洗浄した；タンパク質含量をLowr
yら（1951）の方法で概算した。1gの湿組織から約1mgの
膜タンパクを回収した。注射用に、この膜をPBS−Ａお
よび完全フロイントアジュバントに懸濁した。一度の接
種につき0.4mlのエマルションを動物に与えた。

3.HT29結腸癌腫セルライン。一度の接種につき、0.4ml
のPBS−Ａに懸濁した2x10⁶の生きたトリプシン処理細胞
を与えた。

4.免疫原としてのエピトープ。免疫原は、ハイブリッド
BGP−CEA B3−GPIタンパクを保有する細胞またはCEAのc
DNAまたはコスミドを移入した細胞である。CEA遺伝子を
移入したマウスのＬ細胞を、CEAに対する抗体を与える
のに適したマウスの系統を免疫するために用いた。CEA
を発現するヒト腫瘍細胞を使用することもできる。

免疫化とハイブリドーマの作成 以下のプロトコールに従って、腹腔内接種によって免
疫したBALB/cマウス由来の脾臓を用いて３つの融合（fu
sions）を行った。融合１と２では、粘膜の検体と正常
な結腸直腸の上皮の膜調製物で免疫および上昇（ブース
ト）させた（上記“免疫材料”参照）。融合３では、最
初の免疫化を正常な結腸の膜調製物で行い、次のブース
ター（二次免疫）接種をTH29結腸癌腫細胞で行った。各
融合の６週、２週および４日前にこれらの材料の腹腔内
注射を動物に行った。それぞれの場合に、脾臓を無菌状
態で取り出し、単一細胞懸濁液を機械的に調製し、RPMI
1640中の50％ポリエチレングリコール4000（Merck）を
用いて脾臓細胞を10⁸NSIミエローマ細胞と融合した。こ
れらの細胞を、HAT＋20％FCSを含むRPMI 1640および支
持細胞層のマウス脾臓細胞を入れた24または96ウェルプ
レートに塗布（プレート）した。このプレートを37℃、
100％の湿度、５％CO₂の空気中でインキュベートした。
ハイブリドーマは、一般的に14−21日で顕微鏡で見るこ
とができる。所望のコロニーを同定するための最初のス
クリーニングをクローニングの前に行った。引き延ばさ
れたパスツールピペットで単一の細胞を拾うことによっ
て、これらのコロニーを二重にクローン化し、2mlのRPM
I 1640、HATおよび20％のFCSを上層したマウス脾臓細胞
支持層を備えた96ウェルのミクロタイタープレートの各
ウェルに移し、37℃、100％の湿度、５％CO₂の空気中で
培養した。

抗体産生のスクリーニングアッセイ 全ての融合物からの抗体産生のスクリーニングを、間
接的イムノペルオキシダーゼ技術を用いて組織切片に対
して行った。クリオスタットの切片（６μｍ厚）を正常
な大腸の凍結立方体から切断した。この切片を、0.1％
ポリ−１−リジンで予備被覆（precoated）された10ウ
ェルマルチテストスライド（C.A.Hendley−Essex,Engla
nd）に載せ、室温で30分間空気乾燥した。この切片を15
分間アセトンで固定した。各ウェルを多湿のチャンバー
で室温で30分間20μｌの非濃縮ハイブリドーマ組織培養
上清でインキュベートした。スライドをTrisバッファー
食塩水（TBS）pH7.6（1lの蒸留水中にTris,605mg、NaC
l,8g）で二度洗浄した後、５％正常ヒト血清を含有する
TBSに1:50で希釈したペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マ
ウスイムノグロブリン（DAKO,コペンハーゲン、デンマ
ーク）と共に室温で30分間インキュベーションを行っ
た。このスライドをTBSで再度洗浄し、0.03％過酸化水
素を含有する10mlのTris HCl pH7.6中のジアミノベンジ
ジン（Sigma.St.Louis,MO）5mgの新鮮な濾過液に浸し
た。５分後に、水道水で洗浄することによってペルオキ
シダーゼ基質反応を止め、Heyerのヘマトキシリンで染
色し、アルコールで脱水してDPX（BDX、Poole,UK）に載
せた。

免疫組織化学法（Immunohistochemical methods） 1.ホルマリン固定組織の間接的イムノペルオキシダーゼ
染色。ホルマリン固定、パラフィン包理組織とMAbsとの
反応性を調べるために、正常大腸サンプルを（ａ）10％
中性緩衝化ホルマリンもしくは（ｂ）酸性ホルマリン
（10％ホルマリン中に２％酢酸）のそれぞれに２時間固
定した。一定の処理をした後、３−４μｍの切片を上述
の間接ペルオキシダーゼ技術で染色した（“スクリーニ
ング”参照）。染色の前に、メタノール中の0.5％過酸
化水素の新鮮な調製液を用いて室温で多湿のチャンバー
内で10分間組織片をインキュベーションすることによっ
て内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックした。水道
水で洗浄した後、用いた固定液のタイプに関わらず３つ
の方法の一つでスライドを処理した。（ｉ）直接的染
色；（ii）トリプシンで切断。切断用にスライドを蒸留
水中で37℃に温め、0.1％トリプシン（Sigma,type I
I）、0.1％CaCl₂、NaOHでpH7.8に調節した新鮮な溶液に
５−40分間移した。（iii）他のプロテアーゼ溶液で分
解。温められたスライドを、TBS中のプロテアーゼ（Sig
ma,type IV）,0.025％pH7.6の溶液に５−15分間移し
た。

上記（ｉ）および（ii）では、酵素反応を冷えた流水
で止めた。水とTBSで洗浄した後、分解された切片を間
接的なイムノペルオキシダーゼ技術で染色した。

2.凍結組織切片の間接イムノペルオキシダーゼ染色。正
常な大腸の凍結切片、他の正常な組織および結腸の腫瘍
を上述のように調製した（“スクリーニング”参照）。
これらを４ウェルのマルチテストスライド（C.A.Hendly
−Essex）に拾い、染色した。これらは酵素分解され
ず、内因性ペルオキシダーゼ活性はブロックされていな
かった。全ての組織をMeyerのヘマトキシリンで染色
し、段階的なアルコールで脱水し、キシレンでクリアー
にしてDPXに載せた。

3.凍結切片の免疫蛍光。正常な結腸組織と一部の腫瘍の
両方の凍結切片を、間接的免疫蛍光によって調べること
もできる。アセトンで15分間固定した後、切片をリン酸
緩衝食塩水（PBS）で洗浄した。切片を多湿チャンバー
で30分間20μｌの非濃縮ハイブリドーマの上清でインキ
ュベートし、PBSで３度洗浄し、PBSに1:40で希釈した蛍
光結合ウサギ抗マウスIgG（DAKO）でさらに30分間イン
キュベートした。PBSでさらに３度洗浄して、蒸留水で
最後の洗浄を行った後、切片をGelvato 20/30（Monsant
o,Springfield,MA）に載せ、エピフルオレセンス（epif
luorescence）を備えたLeitz Orthoplan顕微鏡で観察し
た。

4.セルラインの免疫細胞化学的試験。癌腫系統の細胞
を、スライドガラス状で生育する。PBS−Ａでこれらを
三度洗浄し、生きているものか10分間アセトンで固定し
たもののいずれかを染色する。

5.コントロール。免疫組織化学的（Immunohistochemica
l）染色は、一次層として非ハイブリドーマ組織培養培
地（10％FCSを含むRPMI 1640）の使用によって調節され
る。さらに、イムノペルオキシダーゼ染色用の第二の抗
体酵素複合体およびジアミノベンジジン溶液も別々に使
用した。免疫蛍光には、FITC結合ウサギ抗マウスIgGを
単独で使用することができる。これらの試薬による非特
異的染色は観察されなかった。

結腸直腸腫瘍の評価 結腸腺癌は、ヘマトキシリンおよびエオシン（eosi
n）で染色された切片を用いてBlenkinsoppら（1981）の
基準で組織学的に分類された。各抗体に対して、腫瘍を
“陰性”（全く反応しない細胞）、“不均一”（ある細
胞は反応する）もしくは“陽性”（全ての細胞が反応）
と評価した。同じ腫瘍の異なる細胞間、もしくは腫瘍細
胞と隣接した正常な上皮との間の染色強度の違いは時々
観察されたが定量しなかった。

抗体は、空気乾燥してカバーガラス上にアセトン固定
したCEA陽性細胞を用いて間接的免疫蛍光アッセイでス
クリーニングできる。また、CEAを有する細胞全体また
は組織切片が使用され、ELISAまたはラジオイムノアッ
セイ（IRA）で調べることができる。

CEA発現セルラインに陽性、BGP−およびNCA−発現セ
ルラインに陰性、BGP−CEA B3−発現およびBGP−CEA B3
−BGPTM−発現セルラインに陰性である抗体は、本発明
の抗体を含むものである。

実施例4:CEAに対して反応する単一特異的ポリクローナ
ル抗体の調製 CEAに対して反応する単一特異的ポリクローナル抗体
を調製するために、適切な動物（ウサギ、ヤギ等）をBG
P−CEA B3−GPIで免疫化する。次いで、BGP反応性抗体
を除去して本発明に係るCEA反応性抗体を残すために、
このようにして得られた抗血清を、精製したBGPまたはB
GPを発現する細胞で吸収する。

実施例5:結腸癌のラジオイムノシンチグラフィー（RI
S） Nuclear Medicine,trends and possibilities in nuc
lear medicine,pp.531−534 SchmidtとBuraggi（ed
s.）,Schattauer,New York.にGranowskaら（1989）が記
載したRISに抗体を用いる。実施例２の方法で得られた
モノクローナル抗体を、Hnatovichら（1987）の二価性
キレート法を用いてインジウム−111で標識する。イメ
ージングは、メディアム・エナジー・パラレル・ホール
‘ガリウム’コリメーターを備え、Nodecrest V77コン
ピューターに連結されたSiemans75チューブ・ディジト
ラック回転ガンマカメラセットを用いて行われる。イメ
ージは、透明なフィルム上およびコンピューターのディ
スプレイ上にカラーで表示される。

最初のあるいは再発が疑われる結腸直腸癌患者が、外
科医によって選択されRISを受ける。この研究は、保険
社会福祉省（Department of Health）の放射活性物質投
与顧問委員会（Administration of Radioactive Substa
nces Advisory Committee）に承認されている。サイン
の入った通知された同意書を各患者から得られた。外因
性のタンパクにアレルギーの経験がある患者または、抗
体に対して陽性の皮膚試験を有する患者は除外する。低
い直腸の腫瘍を有する患者は、リンホシンチグラフィー
（lymphoscintigraphy）を行うために抗体の直腸の粘膜
下注入として多様のものを用いて研究された。

既知の量の活性の２−3mCi（80−120MBq）の注入後、
イメージングを、放射の断層撮影法（トモグラフィー）
で直ちに、時には４時間、24時間後に行い、さらに48、
72もしくは96時間後に行った。患者の還納（reposition
ing）および各時点における像をチェックするためにボ
ーン・ランド−マーク（the bone land−marks）に見ら
れる６つの放射活性マーカー源と共に、下方の胸部およ
び上方の腹部、および下方の腹部および骨盤の前方およ
び後方の像を得る。ガンマカメライメージも、摘出され
た外科的検体から作成される。腫瘍の組織学的な段階お
よび等級付けが行われる。標準および適切な背景サンプ
ルと共に、腫瘍に関係するかしないかがわかっている腫
瘍、近接する粘膜およびリンパ節の試料を選別し、カウ
ントする。連続的な血液および尿のサンプルもまたアッ
セイされる。

24時間での血液クリアランスは、平均で５分のサンプ
ル体積を100％として注射量の51％;48時間で33％、並び
に72時間で27％である。尿での排出は、３％未満であ
る。

最初のおよび再発性の結腸直腸癌のイメージは、質が
高い。腫瘍部位は、４時間ほどで腹部および骨盤にはっ
きりと同定される。時がたつにつれて、徐々に活性を上
昇させる早期イメージでは、焦点欠陥として肝臓転移が
同定される。In−111抗CEA（すなわち、PR1A3によって
認識されるエピトープを認識しない抗CEA抗体）で慣れ
ているものより正常な腸での取り込みがかなり低い。骨
髄と肝臓の取り込みは似ている。間違った陽性もしくは
間違った陰性の結果は得られない。平面画像が良好であ
ったので、単一のフォトンの放出トモグラフィーは特定
の利益があるものではない。

外科的な被検物のイメージングは、腫瘍およびポリー
プが高度の取り込みを備えること、並びに他のCEA抗体
（PR1A3によって認識されるエピトープを認識しないも
の）と違って正常な節は視認されないことを示す。粘膜
に対する腫瘍の割合は、47:1と高い。ほとんど分化して
いない腫瘍は、この抗体をかなり良く取り込み、平均し
てIn−111抗CEA（PR1A3によって認識されるエピトープ
を認識しない）より優れている。

実施例6:マウスモノクローナル抗体のヒューマナイジン
グ（CDR移植） モノクローナル抗体の種々の領域をコードする相補的
DNA（cDNA）をクローン化して配列決定した。重鎖Ｖ領
域のPCRクローニングに使用したプライマーはOrlandiら
（1989）のものであり、軽鎖Ｖ領域に用いたものはJone
sとBendig（1991）のものであった。それぞれの場合
で、二つの配列が与えられ、それぞれ親のNS1軽鎖およ
び重鎖のもの、および重鎖と軽鎖に独特の配列である。

独特な配列の特異性を確かめるために、これらを、マ
ウス抗体Ｖ領域がヒトの定常領域に融合されたヒト−マ
ウスキメラ抗体として発現させた。マウス抗体V_H領域ク
ローンは、PCR技術でヒトIgG₁重鎖NEWM（Kabatら（199
1）上述）のＣ領域のcDNAクローンに連結した（図１参
照）。マウス抗体V_L領域をPCR技術によってヒトκ軽鎖R
EI（Kabatら（1991）上述）のcDNAクローンに連結した
（図２参照）。

NEWM配列はPoljakら（1977）Biochemistry 16,3412−
3420に開示され、REI配列はPalmとHilschmann（1973）
Z.Physiol.Chem.354,1651−1654に開示されており、参
照としてこれらの両方をここに取り込む。

キメラ軽鎖および重鎖を発現ベクターpCDM8に挿入
し、二つのプラスミドをCOS細胞に共移入（co−transfe
cted）した。培養して８日後、約１μg/mlの抗体レベル
をヒトIgG Fc特的ELISAで調べ、このキメラ抗体はPR1A3
が同定する決定基を備えたヒトの胃癌腫セルラインMKN4
5細胞上に陽性免疫蛍光染色を与えた。

Ｖ領域のDNA配列は、ヒューマナイズ化した抗体を設
計するのに用いられた。データベースの分析により、マ
ウス抗体に類似したヒト抗体の選択が可能である（約75
％の相同性）。このヒト抗体の配列は、オーバーラッピ
ングオリゴヌクレオチドおよびPCRから構成され、次い
でNEWM重鎖のcDNAに連結されたヒューマナイズ化された
抗体の配列を設計するための鋳型として用いられる。

マウスの軽鎖は、ヒトの軽鎖に対して70％の相同性を
有していた。次いで、この軽鎖を、LewisとCrowe（199
1）の方法によりオリゴヌクレオチドおよびPCRを用いて
ヒューマナイズ化されたPR1A3軽鎖を作成するための鋳
型として用いた。

方法 重鎖（図６参照） 合成オリゴヌクレオチド,1−６は、モノクローナル抗
体の重鎖の可変領域をコードする。これらのオリゴヌク
レオチド（90mers）は、各配列オリゴヌクレオチド間に
12塩基対のオーバーラップ（重複）があり、DNAのセン
スもしくはアンチセンス鎖をコードする。オリゴヌクレ
オチド対間のプライマーダイマーフォーメーションを起
こした後に、PCR増幅を行う。

定常領域は、プラスミド内に含まれたヒト重鎖配列か
ら開始された。これらのプライマーに取り込まれたもの
は、可変領域の3'末端との5'のオーバーラップおよび遺
伝子の3'最末端のクローニング部位である。

PCRの条件 軽鎖（図７参照） 軽鎖を重鎖と同様の方法で作成した。オーバーラッピ
ングフラグメントを産生するためにプライマー１＋２、
３＋４、５＋６、７＋８をPCR増幅した。用いたプログ
ラムは、重鎖と同様である。次いでこのフラグメントを
以下のPCRプログラムに用いて連結した。

最初にフラグメントだけを添加する。

外側のプライマーを添加する。

この作成物の鋳型は、プラスミド内に含まれていたヒ
ト軽鎖配列であった。プライマー（20−30mers）は、ヒ
トのフレームワークに相補的な3'領域および外因性の5'
領域（制限酵素部位または部分的なモノクローナル抗体
CDR）を有するように設計された。このフレームワーク
を増幅し、5'外因性配列をこの増幅の間に取り込んだ。
個々のフラグメントを末端でオーバーラップさせ、完全
な遺伝子を形成すべくオーバーラッピングPCRによって
結合させた。

軽鎖および重鎖を発現ベクターpCDM8に挿入し、抗体
をCOS細胞で発現させ、MKN45細胞に対する結合活性を免
疫蛍光法によって確かめた。

PR1A3のＶ領域は、Ｘ線結晶学的研究から知られた抗
体の構造の相関性（co−ordinates）を用いてモデル化
した。相補性決定領域（CDRs）は、Chothiaら（1992）
から引き出されたカノニカル（canonical）ループ構造
を用いたフレームワーク構造に適合するものであった。
このモデルの顕著な特徴は、付加的な残基を含むことで
あり、軽鎖のCDR3にチロシンならびに重鎖のCDR2と重鎖
のCDR3にグルタミン酸残基を一つずつ含むことである。
二つのグルタミン酸は、不対のチャージである点で変わ
っているが、CDR3−Ｌの付加的なチロシンがこのループ
をねじらせ、構造を安定化するためにCDR3−Ｌループの
二つのチロシンとVHの不対グルタミン酸との間に塩橋を
形成する。これらの特徴があることにより、これらが抗
原認識のキーポイントであり、このエピトープが陽性チ
ャージを有することが強力に示唆される。

マウスPR1A3重鎖Ｖ領域を配列決定することにより、C
DR1−Ｈの最初のアミノ酸の二つの残基の選択が一貫し
て与えられ、バリンとグルタミンの両方が見出された。
両方のイソタイプのキメラ抗体は、MKN45細胞を用いた
免疫蛍光的研究で同様に活性であり、モデル化は、両方
のアミノ酸を構造上強いられる拘束のない場所に位置さ
せる。

実施例7:細胞のアセトン固定と結合の決定 細胞懸濁液、約10⁵細胞／リン酸緩衝塩溶液（PBS）m
l、を顕微鏡のスライドガラスに滴下し、乾燥させ、10
分間アセトンに浸してPBSですすいだ。もしくは、10％
ウシ胎児血清を含有するRPMI 1640等の培養液を含有す
るペトリ皿にカバーガラスを配置し、細胞をこのカバー
ガラス上にまく。次いで、このペトリ皿を48〜72時間、
37℃でインキュベートし、ペトリ皿から移し、PBSです
すぎ、10分間アセトンに浸してPBSですすぐ。このスラ
イドガラスまたはカバーガラスを適切な試験抗体とイン
キュベートして洗浄した。この試験抗体は、この細胞に
結合するか否かのいずれかである。

試験抗体の結合を調べるために、フルオレセインイソ
チオシアナート（FITC）で標識した抗種抗体（anti−sp
ecies antibody）を添加して細胞を洗浄した。結合は、
蛍光を測定して調べた。

マウスIgGを試験抗体とする場合には、FITC結合ヒツ
ジ抗マウス抗体（Sigma Chemical Co,Poole,Dorset,U
K）をプローブとして用いる。

結合の研究に用いた細胞は、結腸癌腫セルラインHT−
29（ATCC HTB 38）;CEA cDNAを移入したCOS−７細胞；
および実施例１に記載したDNAキメラ作成物のいずれか
を移入したCOS−７細胞である。

COS−７細胞の移入は、エレクトロポレーションによ
る。

エレクトロポレーション:200μｇのプラスミドDNAを、1
0⁷−10⁸細胞/mlの濃度のPBS中の0.8mlの細胞と混合し
た。細胞をBio−Rad Gene Pulserを用いて1kv、25μFD
のキャパシタンスでパルスした。細胞を少なくとも10分
間氷上に置いてから培養液に移した。37℃で一晩インキ
ュベーションした後に新鮮な培地を細胞に添加した。

実施例8:マウスモノクローナル抗体のヒューマナイズ化
（キメラ融合） マウスモノクローナル抗体の種々の領域を、配列の5'
末端にHind III制限部位を添加し、3'末端がヒト抗体RE
Iのκ鎖の定常ドメインの5'末端とオーバーラップする
領域を有するように設計したプライマーを用いたPCRで
増幅した。これは標準的な増幅工程を用いて増幅される
（95℃で１分間の後、95℃で１分間、60℃で２分間、72
℃で２分間のサイクルを30回繰り返し、最後に72℃で10
分間）。このREIκ定常フラグメントを、モノクローナ
ル抗体κ可変部位の3'末端との5'オーバーラップと3'Xb
a I部位を添加するプライマーで同じ条件で増幅する。
これらのフラグメントを結合させ、相互開始合成（mutu
ally primed synthesis）で伸長して、マウスモノクロ
ーナル抗体のκ鎖の可変領域とヒト抗体REIのκ鎖の定
常ドメインとを含有する配列を作成した。PCRの条件
は、両方のフラグメントを含有する反応を95℃で２分間
および72℃で４分間で７回増幅し、その後、外側プライ
マーを添加して標準増幅工程を行う。

重鎖を、マウスモノクローナル抗体の重鎖の可変領域
とヒト重鎖のNEWMの定常ドメインとを用いて類似の方法
で作成した。

これらのフラグメントをHind IIIとXba Iを用いた制
限エンドヌクレアーゼ分解によって取り出した。これら
をベクターpCDM8に個別に配置し、COS細胞に共移入（co
−transfected）した。キメラ抗体が培地に分泌され、M
KN45細胞の表面に発現したCEAに対する免疫蛍光によっ
て試験するとマウスを起源とする構成物の特徴の全てを
示した。

参考文献 Batesら（1992）FEBS Lett 301,207−214. Blenkinsoppら（1981）J.Clin.Path.34,509−513. Chothiaら（1992）J.Mol.Biol.227,799−817. Clacksonら（1991）Nature 352,624−628. Ferguson（1992）Biochem.Soc.Trans.20,243−256. Fogh ＆ Trempe（1975）“New human tumor cell line"
in J.Fogh（ed.）,Human tumour cells in vitro,pp.11
5−141,Plenum Press,New York. Gramら（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,3376−358
0. Granowskaら（1989）Int.J.Colorect.Dis.4,97−108. Granowskaら（1990）Br.J.Cancer,62（Suppl X）,30−3
3. Hnatowichら（1983）Science 220,613−615. Jones ＆ Bendig（1991）Bio/Technology 9,88−89. Leibovitzら（1976）Cancer Res.36,4562−4569. Lewis ＆ Crowe（1991）Gene 101,297−302. Lowryら（1951）J.Biol.Chem.193,265−275. McCaffertyら（1990）Nature 348,552−554. Orlandiら（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,3833−3
837. Richman ＆ Bodmer（1987）Int.J.Cancer 39,317−328. Salvatoreら（1989）Int.Appl.Instrum.B 16,103−104. Thompson ＆ Zimmermann（1988）Tumour Biol.9,63−8
3. Thompsonら（1991）J.Clin.Lab.Analysis 5,344−366. Tomら（1976）In vitro 12,180.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｅ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/574 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/577 Ａ (72)発明者 ダービン，ヘルガ イギリス国 ロンドン ＷＣ２Ａ ３Ｐ Ｘ ピーオー ボックス 123 リンカ ーンズ イン フィールズ 44 インペ リアル キャンサー リサーチ ファン ド (72)発明者 スネイリー，デイビッド イギリス国 ロンドン ＥＣ１Ａ ７Ｂ Ｅ バーソロミュー クロース 59 ド ミニオン ハウス エスティー バーソ ロミューズ ホスピタル アプライド ディベロップメント ラボラトリー イ ンペリアル キャンサー リサーチ フ ァンド (72)発明者 スチュワート，ローナ マリー ダイエ ット イギリス国 ロンドン ＥＣ１Ａ ７Ｂ Ｅ バーソロミュー クロース 59 ド ミニオン ハウス エスティー バーソ ロミューズ ホスピタル アプライド ディベロップメント ラボラトリー イ ンペリアル キャンサー リサーチ フ ァンド (72)発明者 ヤング，スーザン イギリス国 ロンドン ＥＣ１Ａ ７Ｂ Ｅ バーソロミュー クロース 59 ド ミニオン ハウス エスティー バーソ ロミューズ ホスピタル アプライド ディベロップメント ラボラトリー イ ンペリアル キャンサー リサーチ フ ァンド (72)発明者 ベイツ，ポール アラン イギリス国 ロンドン ＷＣ２Ａ ３Ｐ Ｘ ピーオー ボックス 123 リンカ ーンズ イン フィールズ 44 インペ リアル キャンサー リサーチ ファン ド (56)参考文献 特開 平２−154696（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−186500（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−254992（ＪＰ，Ａ) Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，（1990）Ｖ ｏｌ．62，Ｓｕｐｐｌ．Ｘ，ｐｐ．30− 33 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，（1987) Ｖｏｌ．39，ｐｐ．317−328 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎ ｅ，1993，Ｖｏｌ．20，Ｎｏ．８，ｐ. 690−698 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍ ｍｕｎｏｔｈｅｒ．，1999，Ｖｏｌ. 47，ｐ．299−306 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ，1982，Ｖｏｌ．19，Ｎｏ．12, ｐ．1641−1648 Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ, 1991，Ｖｏｌ．56，Ｎｏ．２，ｐｐ. 173−179 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，1989，Ｖ ｏｌ．44，Ｎｏ．３，ｐｐ．424−433 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒ ｓ，1992，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．３，ｐ ｐ．203−209 Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃ ｔａ，1991，Ｖｏｌ．50，Ｎｏ．12，ｐ ｐ．1261−1267 Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ ｓ．，1992，Ｖｏｌ．83，Ｎｏ．５，ｐ ｐ．505−514 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌ ｏｇｙ，1990，Ｖｏｌ．94，Ｎｏ．２, ｐ．157−164 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃ ａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，1989，Ｖｏ ｌ．42，ｐ．39−46 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，Ｍａｙ 1994，Ｖｏｌ. 91，ｐ．4313−4317 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/08 C07K 1/00 - 19/00 G01N 33/50 - 33/98 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ ＣＡ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (18)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ｉ）膜結合性ヒト癌胎児性抗原と結合
   し、（ii）ヒトの胆汁糖タンパク質の１〜314残基に結
   合（Ｎ−Ｃ）したヒト癌胎児性抗原の490残基〜Ｃ末端
   からなるハイブリッドポリペプチドと結合し、（iii）
   ヒトの胆汁糖タンパク質に結合せず、かつ（iv）可溶性
   でCOS細胞から分泌される、ヒトの胆汁糖タンパク質の
   １〜314残基に結合（Ｎ−Ｃ）したヒト癌胎児性抗原の4
   90〜643残基からなるハイブリッドポリペプチドと結合
   しない抗体もしくはその断片または抗体のV_HおよびV_L領
   域を含む抗体様分子であって、ただし、IgG₁グループII
   A重鎖とκグループＶ軽鎖とを備える完全なマウスモノ
   クローナル抗体であって、そのV_H鎖の配列が、 であるか、あるいは、V_HCDR1の最初のアミノ酸残基がグ
   ルタミンであること以外は上記配列と同じである配列で
   あり、かつ、これらいずれの場合でも前記完全なモノク
   ローナル抗体におけるV_L鎖の配列が である完全なマウスモノクローナル抗体を除く抗体もし
   くはその断片または抗体のV_HおよびV_L領域を含む抗体様
   分子。
2. 【請求項２】単一特異的抗体である請求項１記載の抗
   体、断片、または抗体様分子。
3. 【請求項３】Fab様分子、Fv分子、シングルチェーンFv
   （scFv）分子、およびシングルドメイン抗体（sAbs）か
   らなる群から選択される、請求項１記載の抗体、断片、
   または抗体様分子。
4. 【請求項４】ヒトフレームワーク領域と、請求項１に記
   載されたV_H鎖とV_L鎖の少なくとも一つの相補性決定領域
   を有する抗体であって、V_H鎖のCDR1がVFGMN、CDR2がWIN
   TKTGEATYVEEFKGおよびCDR3がWDFYDYVEAMDYであり、V_L鎖
   のCDR1がKASQNVGTNVA、CDR2がSASYRYSおよびCDR3がHQYY
   TYPLFTとされた抗体である請求項１記載の抗体、断片、
   または抗体様分子。
5. 【請求項５】抗体がモノクローナル抗体である請求項４
   記載の抗体、断片、または抗体様分子。
6. 【請求項６】さらに直接的または間接的な細胞毒性分子
   を備えた請求項１ないし５のいずれか一項に記載の抗
   体、断片、または抗体様分子を含む分子。
7. 【請求項７】さらに検出可能な標識を備えた請求項１な
   いし５のいずれか一項に記載の抗体、断片、または抗体
   様分子を含む分子。
8. 【請求項８】（ｉ）ヒト癌胎児性抗原と結合し、（ii）
   ヒトの胆汁糖タンパク質の１〜314残基に結合（Ｎ−
   Ｃ）したヒト癌胎児性抗原の490の残基〜Ｃ末端からな
   るハイブリッドポリペプチドと結合し、かつ（iii）ヒ
   トの胆汁糖タンパク質に結合しない単一特異的抗体を選
   択するように、抗体のプールをスクリーニングすること
   を含む、請求項２記載の単一特異的抗体の製造方法。
9. 【請求項９】単一特異的抗体がモノクローナル抗体であ
   り、抗体のプールがモノクローナル抗体のプールである
   請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】プール内の抗体が、組換えDNA方法によ
    って製造された抗体である請求項８記載の方法。
11. 【請求項１１】抗体の結合部位が、レプリカベクターの
    表面に提示される請求項10記載の方法。
12. 【請求項１２】レプリカベクターがバクテリオファージ
    である請求項11記載の方法。
13. 【請求項１３】請求項８ないし12のいずれか一項に記載
    の方法によって得られる単一特異的抗体であって、 ただし、IgG₁グループII A重鎖とκグループＶ軽鎖とを
    備える完全なマウスモノクローナル抗体であって、その
    V_H鎖の配列が、 であるか、あるいは、V_HCDR1の最初のアミノ酸残基がグ
    ルタミンであること以外は上記配列と同じである配列で
    あり、かつ、これらいずれの場合でも前記完全なモノク
    ローナル抗体におけるV_L鎖の配列が である完全なマウスモノクローナル抗体を除く単一特異
    的抗体。
14. 【請求項１４】ヒトの胆汁糖タンパク質の１〜314残基
    に結合（Ｎ−Ｃ）したヒト癌胎児性抗原の490残基〜Ｃ
    末端からなるハイブリッドポリペプチド。
15. 【請求項１５】ヒトの胆汁糖タンパク質の１〜314残基
    に結合（Ｎ−Ｃ）したヒト癌胎児性抗原の490〜643残基
    からなるハイブリッドポリペプチド。
16. 【請求項１６】ヒトの胆汁糖タンパク質の１〜314残
    基、ヒト癌胎児性抗原の490〜644残基、ヒトの胆汁糖タ
    ンパク質の391〜430残基の順で結合（Ｎ−Ｃ）したハイ
    ブリッドポリペプチド。
17. 【請求項１７】ヒトの胆汁糖タンパク質の１〜314残
    基、ヒト癌胎児性抗原の490〜642残基、ヒトの胆汁糖タ
    ンパク質の387〜430残基の順で結合（Ｎ−Ｃ）したハイ
    ブリッドポリペプチド。
18. 【請求項１８】請求項１ないし５および７のいずれか一
    項に記載の抗体、断片、または抗体様分子からなる結腸
    直腸癌の診断剤。