JP3583428B2 - ゲル浸透クロマトグラフィのための方法及び担持物 - Google Patents

Description

本発明は、ゲル浸透クロマトグラフィのための改良方法及びこの方法のための担持物に関する。
マクロ分子のサイズ分離のためのゲル浸透クロマトグラフィ（GPC）は、バイオポリマー、特に蛋白質の分離のための標準的な方法となっている。これには、親水性の表面を有し、さらに可能ならば不特定の吸着挙動を示さない担持物を必要とする。誘導されたものでない多孔性シリカゲルを用いるときに起る強度に不特定な吸着行動を回避するために、アメリカ特許第5,035,803号は、シリカゲルの表面が水溶性のビニルポリマーで占められるようにすることを提案している。この刊行物において使用するグラフトプロセスは、このポリマー鎖の任意の箇所おそらく複数の箇所で、ベースの担体にランダムに連結するポリマーをあげている。
細孔の径はそれぞれの分離の課題にマッチするものでなければならない。分離材の細孔の径を定めるのに使用する各種の方法は、往々にして多大の努力を必要とする。この目的のために、重合の際の架橋度を調節するか、又はシリカゲルの細孔を後処理の段階で拡大させてもよい。
細孔の径が大きいためにゲル浸透クロマトグラフィに基く物質の分離が全くできないか又は不充分にしか分離できないような、拡大した細孔を有する担持物も、これら担体の脂肪族ヒドロキシル基に水溶性ビニルモノマーの線状ポリマーをグラフトさせると、すぐれた分離成績をあげることがわかった。本発明のこれらの担持物においては、１つの末端モノマー単位が、各々の場合ベースの担体に共有結合で結合している。
それぞれの分離の課題に対する細孔径の選択はしたがって大して重要ではなく、担持物の選択率はグラフトさせるポリマーの性質によって決められ、このポリマーの性質は重合条件によって容易に調節することができる。
本発明は、ゲル浸透クロマトグラフィ手段によって混合物中の２つ以上の物質を分離するための方法を提供するものであり、その特徴は、使用する担持物が、ベースの担体の脂肪族ヒドロキシル基にグラフトしており、かつ、このベースの担体に末端のモノマー単位で共有結合している、水溶性ビニルモノマーの線状ポリマーからなることである。
本発明はまた、脂肪族ヒドロキシル基を含むベースの担体に、水溶性ビニルモノマーの共有結合した線状ポリマーがグラフトしており、このポリマーが末端のモノマー単位でベースの担体に共有結合している、前記ベースの担体からなる、ゲル浸透クロマトグラフィのための担持物の使用にも関する。
本発明はさらに、ヒドロキシルを含有するベースの担体表面にポリマーが共有結合している該ベースの担体を基礎とする、ゲル浸透クロマトグラフィのための担持物を提供する。その特徴は以下のａ）〜ｄ）にある。
ａ）該ベースの担体は脂肪族ヒドロキシル基を含み、
ｂ）該共有結合ポリマーは、末端モノマー単位を通して担体に結合しており、
ｃ）該ポリマーは式Ｉのモノマー単位からなり、
ｄ）該モノマー単位は線状に連結している。

但し上式中、R¹、R²及びR³は互いに独立にＨ又はCH₃であり、Ｘは複素環式ラジカル、又は式IIのラジカル、

又は式IIIのラジカルであり、

R⁴は単一又は重複してヒドロキシル化したC₂−C₇−アルキルラジカルであり、このラジカル中１個以上の非隣接CH₂基は−Ｏ−によって置き換えることができ、R⁵及びR⁶は互いに独立に、各々が単一又は重複してヒドロキシル化したC₂−C₇−アルキルラジカルであり、このラジカル中１個以上の非隣接基は−Ｏ−によって置き換えることができ、R⁵又はR⁶の２つのラジカルのうちの１つはＨであることもできる。
本発明は、ヒドロキシルを含有するベースの担体表面にポリマーがグラフト重合により共有結合している該ベースの担体に基ずく担持物を製造する方法を提供する。その特徴は、式IV

のモノマーからなる溶液中において、セリウム（IV）イオンの存在下にヒドロキシルを含有するベースの担体粒子を懸濁させて重合させることにある。
但し上式中、
R¹、R²及びR³は互いに独立にＨ又はCH₃であり、
Ｙは複素環式ラジカル、又は式Ｖのラジカル、

又は式VIのラジカル

であり、
R⁷はヒドロキシル基のための１つ以上の前駆基を含むC₂−C₇−アルキルラジカルであり、このラジカル中１個以上の非隣接CH₂基は−Ｏ−によって置き換えることができ、
R⁸及びR⁹は互いに独立に、それぞれヒドロキシル基のための１つ以上の前駆基を含むC₂−C₇−アルキルラジカルであって、このラジカル中１個以上の非隣接CH₂基は−Ｏ−によって置き換えることができ、R⁸又はR⁹ラジカルのうちの１つはＨであることもでき、
そしてもし必要ならば、前駆化合物はヒドロキシル基に変換される。
図１は分離の挙動を示す：ベースの担体としてシリカゲルを使用し、重合の反応時間を変化させた。
図２は未修飾のヒドロキシル化ポリメタクリレート［フラクトゲル（Fractogel）HW65（Ｓ）：登録商標］の分離挙動と、本発明により修飾した同上ポリマーの分離挙動とを比較している。
適当なベースの担体は、クロマトグラフィに慣用の多孔性の担体物質であって脂肪族ヒドロキシル基を含むものである。そのような担体物質は、架橋したデキストラン又はグルコマンナンなどのポリサッカリド、さらにヒドロキシル−含有ポリ（メタ）アクリル酸誘導体及びDIOL−修飾シリカゲルを含む。
ベースの担体の細孔径は、意図する分離の課題に相応すると思われる細孔径よりも大きいことが好ましい。前記の拡大した細孔と云う用語を本発明において用いるのはこの関係においてである。例えば、500〜4000オングストロームの細孔径を有するDIOL−修飾シリカゲルをベースの担体として使用するのが好ましい。
多数の水溶性ビニルモノマーが当業者には知られている。これらは、アクリルアミド又はメタクリルアミド、2,3−ジヒドロキシプロピルメタクリレート又はＮ−（２−メトキシエチル）アクリルアミド又はＮ−（2,3−ジヒドロキシプロピル）−アクリルアミドのような（メタ）アクリル酸誘導体を含む。さらに、これらは、例えば１−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、４−ビニルピロリドン−Ｎ−オキシドのようなビニル化した複素環を含む。
三野（Mino）及びカイザーマン（Kaizerman）のJ.Polymer.Sc.31,242〜243（1958）及びJ.Polymer.Sc.38,393〜401（1959）によれば、グラフト反応は脂肪族ヒドロキシル基との反応に基くので、2,3−エポキシプロピルメタクリレートのような前駆化合物を、2,3−ジヒドロキシプロピルメタクリレートのようなヒドロキシル−含有モノマーの代りに使用しなければならない。重合後、既知の方法によってヒドロキシル基が得られる。特定の条件下での重合により、DE38 11 042に正確に開示されているように、低重合度

のポリマーが得られる。したがって細孔のスペースは完全には満たされていない。
本発明のクロマトグラフ分離法においては、マクロ分子の拡散は従来技術のゲル浸透クロマトグラフィでの分離から類似して知られるように、ベースの担体上にグラフトする線状ポリマーによって強く影響される。しかしながら本発明の分離法は、細孔スペースが分析物にとって完全にアクセス可能な、拡大した細孔を有するマトリックスを使用する。このような条件の下では、従来法のゲル浸透クロマトグラフィでは分離は達成できないであろう。
図１において、一連の標準検定蛋白質（12,600〜1,320,000ダルトン）について、流体力学的半径の対数（log R_h）が移動相と多孔内相との間の分配係数K_Dに対してプロットされている。
重合の際の異なる反応時間によって種々の担持物が得られた：

その他の実験詳細は実施例１及び３に挙げられている。
図から見られるように、出発物質は使用した蛋白質に対して殆んど分離性を示さない；内部の細孔スペース全体がすべての蛋白質にとって同等にアクセス可能である。
時間を増加させてグラフトの後、この物質は蛋白質に対する使用範囲で２〜３倍オーダー（表１参照）の高選択率を有するGPC担持物となる。21時間後に達成される選択率の0.37は、本発明の担持物がすぐれたGPC担持物であることを示している。

図２には、未修飾のフラクトゲル（商標）

と本発明による修飾フラクトゲル（商標）

を使用した結果を同様の方法で比較している。実験の詳細は実施例２及び３にあげられている。
表２は得られた生成物の特性データをまとめたものである。選択率は修飾により0.151から0.348に増加する。

さらに説明の要もなく、当業者は上記記載を広範囲にわたって利用できることはもちろんである。したがって前記の好ましい実施態様は単に開示の説明として解釈さるべきであり、いかなる形でも開示を限定するものでない。
前述のすべての出願、特許及び刊行物の完全な開示、ならびに1993年５月13日出願の該当出願P43 16 136を本出願中に引用文献として組み入れる。
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
実施例：
実施例１：シリカゲル上にグラフトさせることによるGPC担持物の製造
150mlのLichrospher−Diol（登録商標）（細孔径が2000オングストローム；粒径が７μｍ）を200mlの水及び100mlのＮ−（２−メトキシエチル）アクリルアミド４モル水溶液と共に30％HClO₄を使用してpH2に調節し、40℃で撹拌しながら、0.5M HNO₃中11.7gの硝酸セリウム（IV）アンモニウムを含む溶液の50mlとアルゴン雰囲気の下で混合した。30、90、及び240分後毎に100mlの懸濁液をとり、それぞれの場合に400mlの水で稀釈し、濾紙上で吸引濾過した。続いて生成物を各ケースとも、それぞれ50mlの0.4M Na₂SO₃と0.4M H₂SO₄の混合物中に懸濁させ、完全脱色後、100mlの水、250mlの0.2M醋酸ソーダ溶液及び500mlの水で洗浄して中性にした。残留混合物を合計21時間後、同様方法で操作する。
実施例２：フラクトゲル（商標）上にグラフトさせることによるGPC担持物の製造
100mlのフラクトゲル（商標）HW65（Ｓ）を200mlの0.2M醋酸ソーダ溶液及び800mlの水で洗浄し、200mlの水及び84mlのＮ−（２−メトキシエチル）アクリルアミド４モル水溶液中に懸濁させ、さらに450mlに調合して30％過塩素酸によりpHを２に調節後、40℃において撹拌しながら、50mlの0.5M硝酸中5.85gの硝酸セリウム（IV）アンモニウムを含む溶液とアルゴン雰囲気の下で混合した。16時間後、この混合物を実施例１に説明したように操作する。
実施例３:GPC担持物上での蛋白質のクロマトグラフィ
各々が1M NaCl、50mMリン酸塩緩衝液（pH7.5）の中の、実施例１及び２の各GPCゲルをガラスカラム［スーパーフォーマンス（Superformance）（登録商標）300×10mm］中に加圧下に充填し、不活性のHPLCユニット（Merck−Hitachi）で10mMリン酸ソーダ緩衝液（pH7.2）中0.3M NaClを含む溶液を1.5ml/分の流速で使用して平衡させた。ついで検定蛋白質を、単独で又は混合物で各ケースとも0.2mlの緩衝液［10mMリン酸ソーダ緩衝液（pH7.2）中0.3M NaClを含む］中1mgの濃度で使用し、0.5ml/分の速度で溶離させた。溶離曲線は280nmにおける光度測定法で求めた。

Claims (5)

1. 使用する担持物が、ベースの担体の脂肪族ヒドロキシル基にグラフトしており、かつ、該ベースの担体に末端モノマー単位によって共有結合している、水溶性ビニルモノマーの線状ポリマーからなることを特徴とする、ゲル浸透クロマトグラフィ手段による混合物中の２つ以上の物質を分離する方法。
2. 脂肪族ヒドロキシル基を含むベースの坦体上に共有結合している水溶性ビニルモノマーの線状ポリマーがグラフトしており、該ポリマーは末端モノマー単位によってベースの担体に共有結合している、該ベースの担体からなるゲル浸透クロマトグラフィのための担持物の使用。
3. ヒドロキシルを含有するベースの担体表面上にポリマーが共有結合している該ベースの担体を基礎とする、ゲル浸透クロマトグラフィのための担持体であって、以下：
   ａ）該ベースの担体は脂肪族ヒドロキシル基を含み、
   ｂ）該共有結合しているポリマーは末端モノマー単位によって該担体に結合しており、
   ｃ）該ポリマーは式Ｉのモノマー単位からなり、
   ｄ）該モノマー単位は線状に連結しており、
   

   

   ［但し上式中、R¹、R²及びR³は互いに独立にＨ又はCH₃であり、Ｘは複素環式ラジカルであるが、｛但しＸが
   

   

   又は−CH ₂ −R'R"
   （但し上式中、R'及びR"はそれぞれ炭素原子数５−10の 環式若しくは２環式基であって、炭素原子の１つ若しく はいくつかがＮ若しくはNH及びＳ若しくはＮ若しくはNH 及びＯによって置換されていることができ）である場合 を除く｝、又は式II
   

   

   のラジカル、又は式III
   

   

   のラジカルであり、
   （但し式II及びIII中、R⁴は１若しくは多ヒドロキシル化したC₂−C₇−アルキルラジカルであり、該ラジカル中１個以上の非隣接CH₂基は−Ｏ−によって置き換えることができ、そしてR⁵及びR⁶は互いに独立して１若しくは 多ヒドロキシル化したC₂−C₇−アルキルラジカルであり、該ラジカル中１個以上の非隣接CH₂基は−Ｏ−によって置き換えることができ、かつ２つの基R ⁵ 及びR ⁶ 中の１つがＨであることも可能である）］
   を特徴とする前記担持物。
4. ヒドロキシルを含有するベースの担体表面上にポリマーがグラフト重合によって共有結合している、該ベースの担体を基礎とする担持物の製造方法であって、該ヒドロキシルを含有するベースの担体粒子を式IV
   

   

   ［但し、上式中、R¹、R²及びR³は互いに独立にＨ又はCH₃であり、
   Ｙは複素環式ラジカルであるか、｛但しＹが
   

   

   又は−CH ₂ −R'R"
   （但し上式中、R'及びR"はそれぞれ炭素原子数５−10の 環式若しくは２環式基であって、炭素原子の１つ若しく はいくつかがＮ若しくはNH及びＳ若しくはＮ若しくはNH 及びＯによって置換されていることができ）である場合 を除く｝、又は式Ｖ
   

   

   のラジカルであるか、又は式VI
   

   

   のラジカルであり、
   （但し式Ｖ及びVI中、R⁷はヒドロキシル基のための１個以上の前駆基を含むC₂−C₇−アルキルラジカルであり、該ラジカル中１個以上の非隣接CH₂基は−Ｏ−によって置き換えることができ、そしてR⁸及びR⁹は互いに独立し てヒドロキシル基のための１個以上の前駆基を含むC₂−C₇−アルキルラジカルであり、該ラジカル中１個以上の非隣接CH₂基は−Ｏ−によって置き換えることができ、かつ２つの基R ⁸ 及びR ⁹ 中の１つがＨであることも可能で あり、そして該モノマーは重合しており、かつ、もし必要なら前駆化合物はヒドロキシル基に転換される）］のモノマーからなる溶液中において、セリウム（IV）イオンの存在下で懸濁及び重合させることを特徴とする、前記担持物の製造方法。
5. 前記式IVの異なるモノマーを共重合させる請求項４に記載の製造方法。

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