JP3515782B2

JP3515782B2 - 蛍光消光によるグリコヘモグロビンの測定

Info

Publication number: JP3515782B2
Application number: JP51583493A
Authority: JP
Inventors: ブラント，ダグラス・アール; ブラウン，ウイリアム・イー; レーン，テリーザ・エル; ウイルソン，デイビツド・エイチ
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1992-03-04
Filing date: 1993-03-03
Publication date: 2004-04-05
Anticipated expiration: 2019-04-05
Also published as: CA2591834A1; DE69332138T2; JPH06507978A; DK0589001T3; ATE221203T1; CA2591834C; DE69332138D1; CA2102417C; EP1239287A3; EP0589001A4; CA2102417A1; ES2182826T3; US5478754A; WO1993018407A1; AU3737093A; EP1239287A2; EP0589001A1; EP0589001B1

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景グリコヘモグロビンは種々の糖、最も一般的にはグル
コースがヘモグロビン分子に結合して形成された、一連
の微量ヘモグロビン成分を意味する一般名である。これ
らの微量ヘモグロビン成分のうち糖尿病に関して最も重
要なものはA_1cである。これはヘモグロビンＡの一方ま
たは両方のβ鎖のＮ−末端アミノ酸残基、バリンにグル
コースが結合して形成される（Goldstein,D.E.et al.,C
lin.Chem.32:B64−B70,1986）。

ヒトの赤血球をグルコースは自由に透過できる。各赤
血球の中で、グリコヘモグロビンは（元の、天然型の）
ヘモグロビンＡから周囲のヘモグロビン濃度に比例した
速度で形成される。この反応は自発的で、酵素の触媒作
用は受けないが、非常にゆっくりと進むため赤血球の寿
命（120日）の間にヘモグロビンの一部が修飾されるだ
けで、また非可逆的である。その結果、グリコヘモグロ
ビンは過去の血糖値の加重「移動」平均を提供するが、
最近の血糖値がより大きく影響する（Singer,et al.,An
n.Clin.Biochem.26:213−219,1989）。

グリコヘモグロビン濃度の上昇は真性糖尿病に伴うこ
とが知られている。グリコヘモグロビンは、糖尿病では
ない場合も総ヘモグロビンの約５％存在するが、糖尿病
患者ではその２〜４倍となる。グリコヘモグロビン濃度
は血糖値の短期（時間単位）変動の影響は比較的受け
ず、従って、糖尿病における血糖コントロールの状態を
比較的正確に反映し、その結果は過去１〜３カ月の時平
均血糖濃度の指標である。グリコヘモグロビンの測定値
は糖尿病患者でグルコース不耐性の重症度を評価すると
き及び真性糖尿病の管理に使用する（Lester,Ann.Clin.
Biochem.26:213−219,1989;Kennedy,et al.,Br.Med.Bul
l.45:174−190,1989;Fluckiger,et al.,J.Chromatogr.4
29:279−292,1988;Goldstein,et al.,Clin.Chem.32:B64
−70,1986;Mortensen,Dan.Med.Bull.32:309−328,1985;
Goldstein,et al.,CRC Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.21:187
−228,1984;Peacock,J.Clin.Pathol.37:841−851,1984;
Miedema,et al.Ann.Clin.Biochem.21:2−15,1984;Maye
r,et al.,Clin.Chem.Acta 127:147−184,1983;Gabbay,M
ed.Clin.North Am.66:1309−1315,1982）。

ヘモグロビンA_1cまたはヘモグロビンA1として、また
は総グリコヘモグロビンとしてグリコヘモグロビンを測
定するには種々の方法がある（イオン交換クロマトグラ
フィー、チオバルビツール酸法、等電点電気泳動、及び
親和性クロマトグラフィーアッセイ）（Cole,R.A.,et a
l.,Metabolism 27:289−301,1978;Nathan,D.M.,Clin.Ch
em.27:1261−1263,1981;Moore,J.C.et al.,Ann.Clin.Bi
ochem.23:85−91,1986）。イオン交換クロマトグラフィ
ーでは、ヘモグロビンA_1cを含むグリコヘモグロビンの
多くはヘモグロビンA0に比べて中性pHで正の荷電が弱
く、負に荷電した樹脂への結合が弱い（Rosenthal,P.K.
et al.,Am.J.Clin.Pathol.75:45−49,1981:米国特許第
4,407,961号、米国特許第4,649,122号）。ヘモグロビン
A_1a+b画分からヘモグロビン_1cを分離する二三の方法が
報告されている（Goldstein,D.E.et al.,Diabetes 31:7
0−78,1982:Maquart,F.X.et al.,Clin.Chim.Acta 108:3
29−332,1980;Jones,M.D.et al.,Hemoglobin 2:53−58,
1978;Clarke,J.T.et al.,Diabete Metabol.5:293−296,
1979;Davis,J.E.et al.,Diabetes 27:102−107,1978;Co
le,R.A.et al.,Metabolism 27:289−301,1978;米国特許
第4,389,491号;Bio−Rad Laboratories,Hemoglobin A_1c
Micro Column Test Instruction Manual、1990年３
月）。しかし、これらの方法にはいくつかの欠点があ
る。これらの方法の多くでは２つのバッファを使用す
る。１つのバッファは特異的に結合している物質は放出
させないように、イオン交換樹脂から未結合物質を溶出
するためのものである。第二のバッファは異なるpH、イ
オン強度で使用するか、または競合阻害剤を含むことを
要し、特異的に結合していた物質を溶出する。温度、p
H、イオン強度及びカラムサイズは試験結果に影響を与
える（Simon,M.et al.,Diabetes 29:467−474,1980;Sch
ellekens,A.P.M.et al.,Clin.Chem.27:94−99,1981;Cas
tagnola,M.et al.,J.Chromatogr.272:51−65,1983）。
さらに、これらの方法は複数の異なるステップ、複数の
容器を必要とし、それらのほとんどが自動化されていな
いかまたは半自動に過ぎない。

これらの従来法の他の限定要因としては、使用する方
法によって、可逆的な中間体糖化型の「プレ−ヘモグロ
ビン−Alc」が含まれ、それをアッセイ前に除去しなけ
ればならないことがある（Goldstein,D.E.et al.,Diabe
tes 31:70−78,1982;Bunn,H.F.,Diabetes 30:613−617,
1981;Nathan,D.M.,Clin.Chem.27:1261−1263,1981;Maye
r,T.K.et al.,Clin.Chim.Acta 127:147−184,1983;Heal
th and Public Policy Committee,American College of
Physicians Ann.Intern Med.101:710−713,1984）（Na
than,D.M.,Clin.Chem.27:1261−1263,1981）。高濃度の
胎児ヘモグロビン、鎌型ヘモグロビン及び他の希な条件
がアッセイを妨害する可能性もある（Niejadlik,D.C.,e
t al.,JAMA 224:1734−1736,1973）。

グリコヘモグロビンを測定する他の方法では、グリコ
ヘモグロビンと特異的に結合する、親和性試薬または結
合剤を使用する。以下の特許明細書：米国特許第4,200,
435;4,260,516;4,274,978;4,255,385及び4,438,204号で
は、親和性法またはヘモグロビンのアロステリック特性
を使用して測定する。独国特許第1595 69号では、親和
性試薬として糖結合蛋白質を記載している。

他の親和性結合法はグリコヘモグロビンとホウ酸誘導
体の間の特異的な複合体形成に基づいている（Middle e
t al.,Biochem.J.209:771−779,1983;Klenk et al.,Cli
n.Chem.28:2088−2094,1982;Little et al.,Clin.Chem.
32:358−360,1986;米国特許第4,269,605号；米国特許第
4,861,728号；英国特許出願GB 2 206 411 A;Isolab,In
c.,Technical Publication:Glyc−Affin^TM GHb,1986;Fo
rrest,R.D.et al.,Clin.Chem.34:145−148,1988）。親
和性結合法はHbA_1cの他にグリコヘモグロビン種も検出
するが、この方法はHbA_1cにより特異的な方法例えばイ
オン交換クロマトグラフィーと直線的に相関する（Litt
le et al.Clin.Chem.32:358−360,1986）。グリコヘモ
グロビンのイオン交換及び比色アッセイと同様に、親和
性法にも制約がある。その制約の１つは２つの異なるバ
ッファが必要なことである。最初のバッファはシス−デ
ィオール基を持たない非糖化画分を溶出する。グリコヘ
モグロビンを多く含む結合画分は、カラムからグリコヘ
モグロビンを置換する置換剤例えば糖アルコールを含む
第二バッファで溶出する。また、流速及びカラムサイズ
も親和性試薬に結合するヘモグロビン量を限定する。

容易に実施でき、干渉がなく、実験による変動例えば
pH及び温度に対して比較的感受性がないグリコヘモグロ
ビンアッセイが必要とされている。本発明の目的はグリ
コヘモグロビンを正確に、精密に測定する方法及び試薬
を開発することである。

発明の概要本発明は蛍光消光によるグリコヘモグロビンの測定に
関する。グリコヘモグロビン及び通常のヘモグロビンは
両方とも同程度に蛍光を消光するが、本発明者らは蛍光
消光を使用して血液試料中のグリコヘモグロビン濃度を
評価できるという意外な事実を発見した。本発明は、２
回連続して蛍光消光を測定すること、すなわち、試料中
の総ヘモグロビンによる蛍光消光を測定し、２番目に試
料中に存在するグリコヘモグロビンまたは非糖化ヘモグ
ロビンの蛍光消光を測定するという独自の手法を含んで
いる。グリコヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンの分離
は、イオン捕獲及び固相分離を含む本明細書に記載の種
々の方法で可能である。

図面の説明第１図：本発明の実施例６のアッセイ手順に基づき、
第１表に挙げた較正溶液による総ヘモグロビン及びグリ
コヘモグロビンについての典型的な較正曲線（較正溶液
Ａに対する蛍光（％）対ヘモグロビン（mM））の典型的
な較正曲線。

第２図：本発明（実施例６）及びIsolabのGlyc−Affn
アッセイを使用してグリコヘモグロビン百分率（％）に
ついてテストした201個の患者試料の相関曲線。

第３図：本発明の実施例８のアッセイ手順に基づき実
施例４の較正溶液を使用した、グリコヘモグロビンにつ
いての典型的な較正曲線（蛍光の逆数（カウント／秒）
対ヘモグロビン濃度（mM））。

第４図：本発明の実施例８のアッセイ手順に基づき実
施例４の較正溶液を使用した、総ヘモグロビンについて
の典型的な較正曲線（蛍光の逆数（カウント／秒）対ヘ
モグロビン濃度（mM））。

第５図：本発明（実施例８）及びIsolabのGlyc−Affn
アッセイを使用してグリコヘモグロビン百分率（％）に
ついてテストした20人の患者試料の相関曲線。

発明の詳細な説明本発明は蛍光消光によるグリコヘモグロビンの測定に
関する。グリコヘモグロビン及び通常のヘモグロビンは
両方とも同程度に蛍光を消光するが、本発明者らは蛍光
消光を使用して血液試料中のグリコヘモグロビン濃度を
評価できるという意外な事実を発見した。本発明は、２
回連続して蛍光消光を測定すること、すなわち、試料中
の総ヘモグロビンによる蛍光消光を測定し、２番目に非
糖化ヘモグロビンを除去した後に試料中に存在するグリ
コヘモグロビンによる蛍光消光を測定するという独自の
手法を含んでいる。グリコヘモグロビンと非糖化ヘモグ
ロビンの分離は、イオン捕獲及び固相分離を含む本明細
書に記載の種々の方法で可能である。

蛍光消光は、ある種の分子例えばヘモグロビンのヘム
部分が、入射励起放射に曝された隣接する蛍光化合物の
励起エネルギーを吸収する能力に関する。通常、適切な
波長の入射励起放射に曝された蛍光化合物はエネルギー
を吸収（励起）し、次に蛍光放射の形でそのエネルギー
を放出する。励起状態にあるときには、蛍光化合物は別
の物質、例えばヘモグロビンのヘムのような消光性化合
物にそのエネルギーを移行させることにより、吸収した
エネルギーを放出することもできる。このエネルギー移
行が通常生じるべき蛍光の量を減少させ、消光と呼ばれ
る。

血液試料中のグリコヘモグロビンの測定の第一段階と
して、赤血球を溶解する必要がある。赤血球が溶解する
と、その細胞からグリコヘモグロビンと非糖化ヘモグロ
ビンの両方が放出される。一般的な陽イオン（例えば臭
化セチルトリメチルアンモニウム）、陰イオン（例えば
ドデシル硫酸ナトリウム及びデオキシコール酸ナトリウ
ム）、及び非イオン（例えば、サポニン及びポリオキシ
エチレン）の活性剤が赤血球の溶解に有用である。約0.
1〜５％（v/v）の濃度の非イオン活性剤、例えばサポニ
ンが好ましく、より好ましい濃度範囲は約0.5〜約２％
（v/v）である。機械的な破壊、例えば超音波及び低張
溶解も赤血球からヘモグロビンを放出させる有効な方法
である。好ましくは、活性剤例えば約0.5％のTriton X
−100を加え、ピペットで混合物を急速に吸い上げ、吹
き出すことを２回繰り返して、赤血球を溶解させる。こ
の方法では新鮮な全血をほぼ一瞬で溶血させる。

好ましい方法では、赤血球を溶解した後、試料を検出
可能な蛍光信号を持つ指示薬と接触させる。グリコヘモ
グロビンと非糖化ヘモグロビンの混合物（総ヘモグロビ
ン）で生じる蛍光消光により第一の測定値が得られる。
グリコヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンを分離し、グ
リコヘモグロビンまたは非糖化ヘモグロビンで生じる蛍
光消光により第二の測定値を得る。次に、これらの２つ
の測定値からグリコヘモグロビンの百分率を計算でき
る。

別の好ましい方法では、赤血球を溶解した後、試料を
検出可能な蛍光信号を有する指示薬と接触させ、グリコ
ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンを分離する。グリコ
ヘモグロビンまたは非糖化ヘモグロビンで生じた蛍光消
光により第一の測定値を得る。次に、グリコヘモグロビ
ンと非糖化ヘモグロビンの両方で生じた蛍光消光により
第二の測定値を得る。この二番目の測定は、総ヘモグロ
ビンによる蛍光消光を測定するか、非糖化ヘモグロビン
による蛍光消光を測定し、この値を第一の測定値に加え
ることにより実施できる。次に、グリコヘモグロビンの
百分率を第一測定値及び第二測定値から計算できる。

もう１つ別の好ましい方法では、グリコヘモグロビン
と非糖化ヘモグロビンの分離に使用する固相またはマト
リックスに指示薬を直接または間接的に取り込ませる。

指示薬はその蛍光がヘモグロビンにより測定可能な程
度に消光される蛍光化合物からなる。本発明に使用でき
る蛍光化合物には、メチルウンベリフェロン及び他のク
マリン類、フルオレセン、ローダミン等を含んでいる。

グリコヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンは種々の方
法で分離できる。好ましい実施態様では、分離過程に、
グリコヘモグロビンに特異的な特異結合物質を使用す
る。本明細書で使用する特異結合物質とは、特異結合対
の一員、すなわち、分子の１つが化学的または物理的手
段を介して第二の分子と特異的に結合するような２つの
異なる分子の一方を意味する。特異結合物質には、ジヒ
ドロキシボリル部分、レクチン、モノクローナル抗体ま
たはポリクローナル抗体、例えば抗HbA_1c抗体、及び組
換え蛋白質を含む他の結合蛋白質を含んでいる。モノク
ローナル抗HbA_1c抗体の例はKnowles,et al.,の米国特許
第4,727,036号明細書に記載されている。

グリコヘモグロビンに特異的な好ましい特異結合物質
は、本明細書に参考として含む米国特許第4,269,605号
明細書に記載のようにジヒドロキシボリル部分である。
この部分は好ましくはフェニルまたは置換フェニルホウ
素酸、ホウ酸または他のホウ素酸例えばエタンホウ素酸
及び１−プロパンホウ素酸等である。反応が実質的に始
まる前に、ホウ素酸塩は先ず正四面体陰イオン型となっ
ていなければならない（すなわち、溶液のpHはホウ素酸
塩のpKより高くなければならない）。反応機構は解明さ
れていないが、正四面体ホウ素酸塩はヒドロキシルを1,
2−シス−ジオールと交換し、水２分子を放出し、五員
環共有複合体を形成する。

好ましくは、ホウ素酸塩／ジオール複合体はこれを強
化する作用を持つバッファの存在下で形成する。このテ
スト系に適合するバッファはpKaが約7.5〜11.0の範囲の
バッファである。この域のバッファは当業界で公知であ
る。アッセイ中、37℃で、pHを約7.8〜9.6、より好まし
くは約8.5〜9.2、最も好ましくは９〜9.2の範囲に維持
するためには、バッファのpKaが約8.5〜9.2であるのが
好ましい。アミン類は複合体を強化でき、グリシン、モ
ルホリン、HEPESまたは付加物例えばアンモニウム塩ま
たはピペラジンのようなバッファがホウ素酸塩／ジオー
ル複合体形成を促進するのに有利でありうる。陽子化さ
れていないアミン類は電子供与体として作用してホウ素
酸塩と中性複合体を形成することができ、この複合体中
ではホウ素酸塩には負の電荷密度、アミンには正の電荷
密度がかかる。この状態では、２つのホウ素ヒドロキシ
ルがまだ1,2−シス−ジオール、例えばグリコヘモグロ
ビンとの結合に使用できる状態にある。好ましくは、ア
ミンバッファ例えばHEPESバッファをホウ素／ジオール
反応、好ましくは赤血球溶解反応に加える。アミン類
は、おそらくホウ素酸塩の見かけ上のpKaを低下させ
て、形成されたホウ素酸塩／ジオール複合体を強化する
のであろう。しかし、ヒドロキシル−アミノバッファ例
えばトリスバッファはホウ素と複合体を形成することに
よりホウ素酸塩／ジオール複合体の形成を妨害すること
がある。

好ましくはMg²⁺の存在下でホウ素酸塩／ジオール複合
体を形成する。本出願人による、本明細書に参考として
含む米国特許出願第717,558号「グリコヘモグロビンの
迅速な測定」、Middle,et al.,Biochem.J.209:771−779
（1983）及びBoronate Ligands in Biochemical Separa
tions,Publication 501,Amicon Corporation（1981）
に、二価陽イオン主としてMgCl₂またはMgSO₄由来のMg²⁺
を使用して、負に荷電されたホウ素酸塩と負に荷電され
たリガンドとの間の反発作用を克服することが述べられ
ている。

好ましくは、分離過程はグリコヘモグロビンと非糖化
ヘモグロビンを含有する溶解した赤血球の試料を、グリ
コヘモグロビンに特異的な特異結合物質を結合させた固
相と接触させ、固相と試料の残部を分離して実施する。
特異結合物質は物理的または化学的手段、好ましくは直
接共有結合によって固相に結合させることができる。特
異結合物質は、後続反応中に特異結合物質の実質的に全
部がはずれることのないような方法で固相に結合させる
とよい。選択した特異結合物質及び結合方法の如何に関
わらず、その特異結合物質はグリコヘモグロビンに結合
できなければならない。例えば、選択したジヒドロキシ
ボリル部分及び結合方法に関係なく、ジヒドロキシボリ
ル部分はグリコヘモグロビンの糖部分に結合できなけれ
ばならない。

本発明の固相はグリコヘモグロビンに特異的な特異結
合物質が化学的または物理的に結合したポリマー微小粒
子の混合物でありうる。使用できる微小粒子には、直径
約0.1μｍ〜約0.25インチのポリスチレン、カルボキシ
ル化ポリスチレン、ポリメチルアクリレートまたは同様
の粒子が含まれる。これらの粒子の好ましい分離法は、
多孔質マトリックス例えばガラス繊維上への微小粒子捕
獲である。

使用できる他の固相には、グリコヘモグロビンに特異
的な特異結合物質が化学的または物理的に結合した磁化
できるポリマー微小粒子を含んでいる。使用できる磁化
可能な微小粒子は好ましくは酸化鉄または酸化クロムの
核とポリスチレン、カルボキシル化ポリスチレンまたは
ポリメチルアクリレートの被覆を有している。その他の
固体支持体も当業界で公知であり、反応トレーのウェル
の壁、試験管、ポリスチレンビーズ、ニトロセルロース
・ストリップ、膜等を含んでいる。天然、合成または合
成的に修飾した天然物質を固相材料として使用でき、こ
れには多糖、紙及びセルロース誘導体、例えば酢酸セル
ロース及びニトロセルロースのようなセルロース材料；
シリカ；ポリマー例えば塩化ビニル、塩化ビニル−プロ
ピレンコポリマー、及び塩化ビニル−酢酸ビニルコポリ
マーを含む多孔性ポリマーマトリックスに均一に分散し
た無機物質、例えば不活性化アルミナ、珪藻土、MgS
O₄、または他の無機の微細に分割した物質；天然布（例
えば、綿）及び合成布（例えばナイロン）；多孔質ゲル
例えばシリカゲル、アガロース、デキストラン及びゼラ
チン；ポリマーフィルム例えばポリアクリルアミド等を
含んでいる。固相材料は適当な強度を持つとよくまたは
支持体により強度を提供することもでき、検出すべき信
号の発生を妨害してはならない。

別の好ましい分離法は、同時係属中の米国特許出願第
150,278号及び米国特許出願第375,029号に記載の方法で
ある。これらの特許出願は両方とも本出願人によるもの
で、両方とも参考として本明細書に含むものとする。こ
れらの出願ではイオン捕獲分離の使用を記載しており、
ここで、当該アッセイに使用する特異結合物質は最初の
ポリイオン化合物及びその第一のポリイオン化合物に結
合した第二のポリイオン化合物が結合されている多孔質
マトリックスに結合している。特異結合対が形成され、
第一のポリイオン化合物と第二のポリイオン化合物の間
の静電的相互作用により反応混合物から分離される。特
異結合物質は好ましくは第一のポリイオン化合物と共有
的に結合している。

好ましくは、第一のポリイオン化合物はポリ陰イオン
酸、例えばポリアスパラギン酸、ヘパリン、カルボキシ
メチルアミロース、ポリグルタミン酸またはポリアクリ
ル酸であり、第二のポリイオン化合物は陽イオンポリマ
ー、例えば、高分子第四アンモニウム化合物であるGafQ
uattm（GAF Corporation,Wayne,NJ,07470）、ジエチル
アミノエチル−デキストラン（Sigma Chemical Compan
y,St.Louis,MO）、水溶性セルロース誘導体、例えば、
いずれも高分子第四化合物であるCelquat^TM L−200及び
Celquat^TM H−100（National Starch ＆ Chemical Corp
oration,Bridgewater,NJ,08807）、またはMerquat^R 100
（Calgon Corporationから市販されている）である。多
孔質マトリックスを陽イオンポリマーで処理してマトリ
ックスを正に荷電する。陽イオンポリマーは吸収、吸着
または共有もしくはイオン結合によってマトリックスに
結合する。反応生成物は、正に荷電したパッドと負に荷
電したポリ陰イオン複合体の間の静電性相互作用を利用
して分離する。

多孔質マトリックスは、好適な多孔性物質を含むこと
ができる。「多孔性」とは、流体が流れ、容易に通過で
きる物質を意味する。本発明では、マトリックスはポリ
プロピレン、ポリエチレン、Teflon、ガラス繊維、セル
ロースまたはナイロンパッド、または１つ以上のアッセ
イ試薬を含む１つ以上の層を持つ注入・フロースルー・
アッセイ・デバイスに使用するために当業者によく知ら
れている他の多孔性物質を含むことができる。

好ましい固相材料には、多孔質ガラス繊維材料、例え
ば見かけ上の厚さ0.33mmの「Whatman 934−AH」濾紙、
本出願人の使い捨てIMx^Rカートリッジ及びTestPack
^TM（繊維マトリックス）装置が含まれる。このような物
質の厚さは臨界的ではなく、アッセイすべき試料または
分析物の特性、例えば被験試料の流動性に大きく基づい
て選択する。

ヘモグロビンによる実際の蛍光消光は、当業界で公知
の任意の方法で測定できる。例えば、蛍光スペクトルは
可視スペクトロメータで観察するか、または高い集光力
のスペクトログラフで撮影することができるが、蛍光ス
ペクトロメータが好ましい。好ましい実施態様では、水
銀アークランプを光源として使用するフルオロメータで
ある光学アセンブリーを持つIMx^R（本出願人）自動卓上
分析器を使用して蛍光を検出する。この機器はFiore,M.
et al.1988.Clin.Chem.34/9:1726−1732に記載してお
り、この内容は参考として本明細書に含む。観察された
蛍光消光は、測定された試料中のヘモグロビン量に比例
する。

最も好ましい方法では、同じ繊維マトリックス、例え
ばIMx^R使い捨てカートリッジ（本出願人から市販）を使
用して、２回の蛍光測定を行なう。試料中の赤血球は溶
解させる。溶血物は、第一の容器またはウェル中で、溶
血物のアリコートを水性バッファ例えばHEPESバッファ
と混合して希釈し、第二の容器またはウェルで、溶血物
のアリコートに、微小粒子またはポリイオン化合物に結
合したグリコヘモグロビンに特異的な特異結合物質例え
ばラテックス微小粒子またはポリアクリル酸に共有結合
したメタ−アミノベンゼンホウ素酸を含有する水性バッ
ファ例えばHEPESバッファと混合して希釈する（また
は、ホウ酸塩またはポリマーを溶解溶液に加えることも
できる）。ホウ素酸塩・グリコヘモグロビン複合体は、
第二容器中の混合物中で形成され、第一容器中では形成
されない。第二容器中の混合物のアリコートを繊維マト
リックス、例えばガラス繊維または第一のポリイオン化
合物に結合するポリイオン化合物例えばMerquatで被覆
したガラス繊維に移す。ホウ素酸塩・グリコヘモグロビ
ン複合体はこのマトリックスに捕獲され、マトリックス
は蛍光化合物例えば４−メチルウンベリフェロンを含む
洗浄バッファで洗う（また、好ましくは、蛍光化合物は
アッセイに使用する全ての溶液中に存在してよい）。洗
浄により非糖化ヘモグロビンは除去され、マトリックス
の蛍光を測定する。測定した蛍光消光はマトリックスに
存在するグリコヘモグロビンによるものである。次に、
マトリックスをシス−1,2−ジオール化合物例えばソル
ビトールのような糖を含有する溶液で洗う。好ましく
は、シス−1,2−ジオール化合物も第一容器の混合物に
加える。ソルビトールはグリコヘモグロビンと結合親和
性試薬について競合し、グリコヘモグロビンが除去され
る。洗浄溶液は、好ましくは約１〜30％（w/v）、より
好ましくは約５〜約30％、最も好ましくは10％の濃度の
ソルビトールを含む。ホウ素酸塩・グリコヘモグロビン
複合体を壊す他の化合物、例えば1,2−アミノ−ヒドロ
キシ化合物例えばトリス・バッファも使用できる。第一
容器の混合物のアリコートを洗浄したマトリックスに移
し、マトリックスの蛍光を測定する。測定した蛍光消光
はグリコヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンの両方によ
るものである。これにより、総ヘモグロビン濃度及びグ
リコヘモグロビン濃度が各較正曲線から決定でき、総ヘ
モグロビン中のグリコヘモグロビンの百物率を計算す
る。

較正曲線は一般に既知の濃度のグリコヘモグロビンま
たはヘモグロビンを含む較正溶液から作成する。「グリ
コヘモグロビンの迅速な測定」という表題の米国特許出
願第717,558号は本出願人によるもので、本明細書に参
考として含むが、グリコヘモグロビンのアッセイに有用
な安定なグリコヘモグロビン較正溶液及び対照を開示し
ている。好ましくは６種の濃度の較正溶液を使用して較
正曲線を得るが、所望の正確さや精密さに応じてそれよ
り多くまたは少なくすることができる。ヘモグロビン
（［総Hb］）及びグリコヘモグロビン（［Gly Hb］）
は順次多くするが、総ヘモグロビンに対するグリコヘモ
グロビンの割合（％Gly Hb）は一定に維持するとよ
い。例えば、第１表は１組の較正溶液の組成を示してい
る（実施例４参照）。当業者は他の較正溶液や対照処方
に変えることもできよう。対照は一般に較正曲線または
アッセイ試薬の信頼性を確認するために、アッセイの際
に使用する。好ましくは、対照の処方は較正溶液の処方
と同じであるが、グリコヘモグロビンの百分率、ヘモグ
ロビン濃度及びグリコヘモグロビン濃度は、いずれの較
正溶液のそれとも一致しなくてよい。

操作の間、無菌状態を維持するために、溶媒、抗生物
質及び毒を含む抗微生物剤を系に少量加えるのが望まし
いことがある。グリコヘモグロビンの測定に使用する他
の生化学物質例えばKCNを溶血試料に入れることができ
る。

以下の実施例は本発明を説明するものであって、請求
の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
当業者は本発明の概念を応用できる多くの他のデバイス
や方法を考えられることが理解されよう。

実施例１ヘモグロビン試料（第２表参照）50μｌを、50mM MgC
l₂及び50％（v/v）ジヒドロボリル樹脂（Glycogel、Pie
rce Chemical Company,ILから市販されている）を含むp
H8.0の50mM酢酸アンモニウムバッファ中0.25mMのメチル
ウンベリフェロン200μと混合した。混合物を吸着パ
ッドと液体でつながっているガラス繊維マトリックス
（例えば、本出願人から市販の使い捨てIMx^Rカートリッ
ジ）に移し、（Fiore,M.et al.,1988,Clin.Chem.34/9:1
726−1732、この内容は参考として本明細書に含むもの
とする、に記載のように）光源として水銀アークランプ
を使用するフルオロメータで蛍光を測定した。蛍光消光
の大きさは総ヘモグロビンによるものである。マトリッ
クスを0.20mMメチル−ウンベリフェロンを含む酢酸アン
モニウムバッファ200μで３回洗った。蛍光を再度測
定した。蛍光消光の大きさはグリコヘモグロビンによる
ものである。総ヘモグロビン濃度（［総Hb］）及びグリ
コヘモグロビン濃度（［Gly Hb］）は０、0.1、0.6、
2.9mMのヘモグロビン較正溶液から作成した標準曲線か
ら得られる（第２表参照）。総ヘモグロビンに対するグ
リコヘモグロビンの割合であるグリコヘモグロビン百分
率（％Gly Hb）も測定できる（第２表参照）。

実施例２第３表に示す既知ヘモグロビン濃度の各試料50μ
を、50mM MgCl₂を含むpH8.0の50mM酢酸アンモニウムバ
ッファ中の0.25mMメチルウンベリフェロン200μと混
合し、混合物を吸着パッド（例えば、本出願人から市販
されている使い捨てIMx^Rカートリッジ）と液体でつなが
っている繊維マトリックスに移した。直ちに、（Fiore,
M.et al.1988.Clin.Chem.34/9:1726−1732、この内容は
参考として本明細書に含む、に記載のような）光源とし
て水銀アークランプを使用するフルオロメータで蛍光を
測定した。第３表に示す結果は、ヘモグロビン濃度が上
昇するにつれて蛍光強度（ミリボルト）が低下すること
を示している。

実施例３第４表に示す試料の総ヘモグロビンによる蛍光消光
は、50mM MgCl₂を含むpH8.0の50mM酢酸アンモニウムバ
ッファ中0.25mMのメチルウンベリフェロン200μと各
試料50μを混合し、混合物を吸着パッド（例えば、本
出願人から市販されている使い捨てIMx^Rカートリッジ）
と液体でつながっている繊維マトリックスに移し、（Fi
ore,M.et al.1988.Clin.Chem.34/9:1726−1732、この内
容は参考として本明細書に含む、に記載のような）光源
として水銀アークランプを使用するフルオロメータで蛍
光を測って測定した。

第４表に示す試料のグリコヘモグロビンによる蛍光消
光は、50mM MgCl₂及び50％（v/v）ジヒドロボリル樹脂
（Glyco−gel）を含むpH8.0の50mM酢酸アンモニウムバ
ッファ中0.25mMのメチルウンベリフェロン200μと各
試料50μを混合し、混合物をIMx^R使い捨てカートリッ
ジの繊維マトリックスに移し、マトリックスを0.20mMメ
チルウンベリフェロンを含有する酢酸アンモニウムバッ
ファ300μで洗い、IMx^R機器を使用して繊維マトリッ
クス上の蛍光を測って、測定した。次に、0.20mMメチル
ベリフェロン及び200mMソルビトールを含有する酢酸ア
ンモニウムバッファでマトリックスを洗った後、再度、
蛍光消光を測定した。蛍光は全てミリボトル単位で読み
取る。

明らかに、ソルビトールがマトリックス上にあるグリ
コヘモグロビンを実質的に全て置換した。

実施例４ヘモグロビン及びグリコヘモグロビン較正溶液は、
（本出願人による、参考のために本明細書に含む「グリ
コヘモグロビンの迅速な測定」という表題の米国特許出
願第717,558号に記載のように）250mMグルコースを37℃
で96時間混合して約40％糖化となるまで人工的にヘモグ
ロビンに糖付加した赤血球溶解ヒト血液試料（Glyc−Af
fn,Isolab）を順次希釈して調製した。Glyc−Affn Assa
y（Isolab,Inc.,OH）を使用して試料中のヘモグロビン
及びグリコヘモグロビン濃度を測定した。グリコヘモグ
ロビンを最も高い濃度で含む較正溶液（F cal）は、20
％のグリコヘモグロビン濃度が得られように（本出願人
による、参考のために本明細書に含む「グリコヘモグロ
ビンの迅速な測定」という表題の米国特許出願第717,55
8号に開示した方法で調製した）低及び高バルクのヒト
のグリコヘモグロビン試料を混合し、次に、総ヘモグロ
ビン濃度が12mM（19.3g/d）となるようにリン酸緩衝
食塩水で混合物を希釈して調製した。次に、他の較正溶
液を、最終ヘモグロビン濃度９、６、３及び1mM（各々
Ｅ、Ｄ、Ｃ及びＢ較正溶液）となるまでリン酸塩緩衝食
塩水で希釈してF calから調製した。６番目の較正溶液
はリン酸塩緩衝食塩水自体から調製し、総ヘモグロビン
濃度は0mMであった。各較正溶液のヘモグロビン及びグ
リコヘモグロビン濃度を第１表に示す。典型的な総ヘモ
グロビン及びグリコヘモグロビンの較正曲線を第１図に
示し、この調製は実施例６に示すように実施した。

実施例５ホウ素酸ポリアクリル酸を次のように調製した。25mM
MESバッファ（pH5.5）中のポリアクリル酸（48.6g）
と25mM MESバッファ（pH5.5）中のｍ−アミノベンゼン
ホウ素酸（8g）を混合し、pHを6.1に合わせた。１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド（EDAC）（20.7g）を加えた。混合物を室温で50分
間撹拌し、pH9.8で24％グリシンを加えて反応を止め
た。反応液を６容の50mMタウリン（pH9.0）に対して透
析濾過し、無菌的に濾過した。

実施例６本明細書のアッセイ手順をIMx^R機器（本出願人から市
販されており、EP−Ａ−288 793及びFiore et al.,Cli
n.Chem.34/9:1726−1732（1988）に記載されており、こ
のいずれも参考として本明細書に含む）で実施した。試
料（10μ）中の赤血球を、溶解溶液（50mM MgCl₂、1
00mM塩化ナトリウム及び0.1％アジ化ナトリウムを含有
する50mM HEPESバッファ（pH8.0）中の１％（w/v）Tri
ton X−100及び0.70mMの４−メチル−ウンベリフェロ
ン）70μ及びポリ陰イオン試薬溶液（pH9.0の50mMタ
ウリン中0.9％（w/v）の実施例５からのホウ素酸ポリア
クリル酸）を加え、次に機器のピペットから混合物を２
回吸い上げ、吹き出した。この方法で、ほぼ瞬時に新鮮
な全血を溶血させた。

第二混合物は、この第一混合物のアリコート（17μ
）をIMx^R使い捨てカートリッジの反応ウェルに移し、
300mMの塩化ナトリウムを含むpH7.5の100mMトリスバッ
ファ170μとソルビトール洗浄溶液（300mMの塩化ナト
リウムを含むpH7.5の100mMトリスバッファ中10％（w/
v）のソルビトール及び17.5mMの４−メチル−ウンベリ
フェロン）40μを反応ウェルに加えることにより、こ
の第一混合物から調製する。

第一混合物の第二のアリコート（50μ）を、0.2％
（w/v）（5.425g/）Merquat^R 100（Calgon Corporati
onから市販されている）溶液（Tromethane6.35g/、塩
化ナトリウム5.84g/、蔗糖1g/L及び魚ゼラチン0.95m
／）で被覆したIMx^R使い捨てカートリッジの繊維マ
トリックス（本出願人から市販されている）に移す。ホ
ウ素酸ポリアクリル酸・グリコヘモグロビン複合体はMe
rquat^R 100と結合し、マトリックスを洗浄溶液（25mMア
スパラギン、25mMメチオニン、100mM MgCl₂及び0.1％
アジ化ナトリウムを含む50mMタウリンバッファ（pH9.
0）中7.5mMの４−メチル−ウンベリフェロン）240μ
で洗って、非糖化ヘモグロビンを実質的に全部除去す
る。次に、マトリックス上のグリコヘモグロビンによる
蛍光消光を測定する。

マトリックスを約50μのソルビトール洗液で洗う。
ソルビトールはグリコヘモグロビンと結合親和性につい
て競合し、グリコヘモグロビンが除去される。第二混合
物のアリコート（50μ）をマトリックスに移し、グリ
コヘモグロビン及び非糖化ヘモグロビンの両者による蛍
光消光を測定する。総ヘモグロビン濃度及びグリコヘモ
グロビン濃度を、このアッセイ手順に従って実施例４の
較正溶液を使用して作成した別々の較正曲線から決定
し、グリコヘモグロビンの百分率を計算する。

実施例７実施例６のアッセイ手順を使用して、201個の患者試
料をテストし、IsolabのGlyc−Affnアッセイから得た結
果と比較した。データは第２図の相関曲線に示す。

実施例８総ヘモグロビンを測定した後、ホウ素酸アクリルアミ
ド微小粒子（Hageman et al.,Anal.Biochem.80:547（19
77）及びInman et al.,Biochem.8:4078（1969）の方法
を使用して作製）を用いて、グリコヘモグロビンを測定
するように変更した実施例６のアッセイ手順を使用して
グリコヘモグロビンを測定した。ホウ酸微小粒子の１％
（w/v）溶液をホウ素酸ポリアクリル酸の代わりに使用
した。較正曲線は実施例４の較正溶液から作成し、第３
図及び第４図に示す。20人の患者試料をこのアッセイ手
順を使用してテストし、IsolabのGlyc−Affnアッセイか
ら得た結果と比較した。第５図はこのアッセイ手順及び
IsolabのGlyc−Affnアッセイを使用してグリコヘモグロ
ビン百分率についてテストした20人の患者試料の相関曲
線を示す。

記載した実施態様及び示した別の実施態様は限定のた
めではなく例示のためのものである。従って、本発明は
本発明を開示した特定の実施態様に限定されるものでは
なく、上記及び添付の請求の範囲に記載した発明の精神
及び範囲内の全ての均等物及び主題も含むものと意図さ
れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ブラント，ダグラス・アールアメリカ合衆国、イリノイ・60060、マンダリン、サウス・リンカーン・28 (72)発明者ブラウン，ウイリアム・イーアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイービル、ベツドフオード・レーン・810 (72)発明者レーン，テリーザ・エルアメリカ合衆国、イリノイ・60201、エバンストン、オーク・アベニユー・ 1321、ナンバー・３・エイ (72)発明者ウイルソン，デイビツド・エイチアメリカ合衆国、イリノイ・60202、エバンストン、シエリダン・ロード・ 613・１／２、アパートメント・107 (56)参考文献米国特許4269605（ＵＳ，Ａ) 米国特許4861728（ＵＳ，Ａ) Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，28／10 （1982），ｐ．2088〜2094 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ. Ｂｉｏｃｈｅｍ．，26（1988），ｐ. 809〜813

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】血液試料中のヘモグロビンまたはグリコヘ
モグロビンを定量する方法であって、 a.試料の赤血球細胞を溶解させてヘモグロビンを放出さ
せ； b.グリコヘモグロビンの場合には、前記試料から前記グ
リコヘモグロビンを分離し； c.ヘモグロビンまたはグリコヘモグロビンを蛍光化合物
と接触させ； d.前記ヘモグロビンまたはグリコヘモグロビンで生じた
蛍光消光を測定し； e.前記ヘモグロビンまたはグリコヘモグロビンの蛍光消
光をヘモグロビンまたはグリコヘモグロビンの較正曲線
と比較することからなる方法。
【請求項２】前記赤血球溶解が前記赤血球を活性剤と混
合することからなる請求項１の方法。
【請求項３】前記活性剤がトリトン（Triton）Ｘ−100
である請求項２の方法。
【請求項４】前記グリコヘモグロビンの前記分離が、前
記グリコヘモグロビンをグリコヘモグロビンに特異的な
特異結合物質と接触させて特異結合物質／グリコヘモグ
ロビン複合体を形成し、前記試料から前記複合体を分離
することからなる請求項１の方法。
【請求項５】前記特異結合物質が固相と結合している請
求項４の方法。
【請求項６】前記固相が粒子、フィルム、繊維、管また
はウェルである請求項５の方法。
【請求項７】特異結合物質が、固相と結合した第二のポ
リイオン化合物に結合する第一のポリイオン化合物に結
合している請求項４の方法。
【請求項８】前記第一のポリイオン化合物がポリアスパ
ラギン酸、ヘパリン、カルボキシメチルアミロース、ポ
リグルタミン酸またはポリアクリル酸である請求項７の
方法。
【請求項９】前記第二のポリイオン化合物が高分子第四
アンモニウム化合物、ジエチルアミノエチル−デキスト
ランまたはマーコート（Merquat）100である請求項７の
方法。
【請求項１０】前記固相が繊維マトリックスである請求
項７の方法。
【請求項１１】前記特異結合物質がジヒドロキシボリル
部分、抗グリコヘモグロビン抗体またはレクチンである
請求項４の方法。
【請求項１２】前記蛍光化合物がフルオレセン、ローダ
ミン、ウンベリフェロンまたはその誘導体である請求項
１の方法。
【請求項１３】前記蛍光化合物が固相に結合している請
求項１の方法。
【請求項１４】血液試料中のグリコヘモグロビンを定量
する方法であって、 a.試料の赤血球を溶解させてヘモグロビンを放出させ； b.前記ヘモグロビンと蛍光化合物を混合し、前記ヘモグ
ロビンにより生じた蛍光消光を測定し； c.グリコヘモグロビンをヘモグロビンから分離し、前記
グリコヘモグロビンを前記蛍光化合物と接触させ、前記
グリコヘモグロビンで生じた蛍光消光を定量し；そして d.前記ヘモグロビンの蛍光消光と前記グリコヘモグロビ
ンの蛍光消光を比較することからなる方法。
【請求項１５】前記グリコヘモグロビンの前記分離が、
前記グリコヘモグロビンをグリコヘモグロビンに特異的
な特異結合物質と接触させて特異結合物質／グリコヘモ
グロビン複合体を形成し、前記試料から前記複合体を分
離することからなる請求項14の方法。
【請求項１６】前記特異結合物質が粒子、または繊維マ
トリックスに結合した第二のポリイオン化合物に結合し
ている第一のポリイオン化合物に結合する請求項14の方
法。
【請求項１７】ステップｂ及びｃの蛍光消光測定を共通
のマトリックスで実施する請求項14の方法。
【請求項１８】前記ステップｃをステップｂの前に実施
し、ステップｃの後で洗浄溶液でこのマトリックスを洗
浄する請求項17の方法。
【請求項１９】前記洗浄用溶液が1,2−シスジオール化
合物からなる請求項18の方法。
【請求項２０】前記1,2−シスジオール化合物がソルビ
トールである請求項19の方法。
【請求項２１】請求項１〜20に記載の方法におけるグリ
コヘモグロビンの分離工程に使用するための、ホウ酸と
水溶性ポリアニオン酸とが共有結合した溶液状態のイオ
ン捕獲物離剤。
【請求項２２】ホウ酸がアミノフェニルホウ酸である、
請求項21に記載の捕獲分離剤。
【請求項２３】ポリアニオン酸がポリアクリル酸、ポリ
アスパラギン酸、ヘパリン、カルボキシメチルアミロー
スまたはポリグルタミン酸に由来する、請求項21に記載
のイオン捕獲分離剤。