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JP3519139B2 - エンドセリン拮抗阻害剤スクリーニング用キット及びスクリーニング方法 - Google Patents

エンドセリン拮抗阻害剤スクリーニング用キット及びスクリーニング方法

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JP3519139B2
JP3519139B2 JP25110294A JP25110294A JP3519139B2 JP 3519139 B2 JP3519139 B2 JP 3519139B2 JP 25110294 A JP25110294 A JP 25110294A JP 25110294 A JP25110294 A JP 25110294A JP 3519139 B2 JP3519139 B2 JP 3519139B2
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康明 伊藤
幸夫 藤沢
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は，エンドセリン拮抗阻害
剤スクリーニング用キット及びエンドセリン拮抗阻害剤
のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】エンドセリン（ＥＴ）は、１９８８年、
柳沢らによりブタ大動脈内皮細胞の培養上清から単離さ
れ構造決定された２１個のアミノ酸からなる血管収縮性
ペプチドである［柳沢ら、ネイチャー（Nature),332巻,
411〜415頁,1988年］。その後、エンドセリンをコード
する遺伝子断片の研究から、エンドセリンにファミリー
が存在することが明らかにされ、それぞれエンドセリン
−１（ＥＴ−１）、エンドセリン−２（ＥＴ−２）、エ
ンドセリン−３（ＥＴ−３）と命名されている［井上
ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA),86巻,2863〜2867頁,1989年］。上記のエ
ンドセリンファミリーは生体内に存在し、強い血管収縮
作用を有していることから、循環系調節に関与する内因
性因子であると予想され、高血圧症、心・脳循環疾患
（たとえば心筋梗塞）、腎疾患（たとえば急性腎不全）
との関連が示唆されている。また、気管支平滑筋収縮作
用も有しており、喘息との関連も示唆されている。
【０００３】一般に、生理活性物質に対する拮抗薬（ア
ンタゴニスト）や作動薬（アゴニスト）は、さまざまな
病気に対する医薬として利用することができるが、これ
らアンタゴニストやアゴニストを開発しようとすると
き、一般には最初に膨大な化合物、発酵生産物、天然物
等から、特定の受容体に親和性を持つ物質をスクリーニ
ングして、リード化合物を選び出すことが行われてい
る。
【０００４】エンドセリンの受容体には、ＥＴ−３より
もＥＴ−１に対して親和性が高いＥＴA受容体と、ＥＴ
−１とＥＴ−３に対して同程度の親和性を持つＥＴB受
容体の２種類あることが知られている。またそれらのｃ
ＤＮＡがクローニングされ、ＥＴA受容体及びＥＴB受容
体のアミノ酸配列が明らかになっている［ＥＴA受容
体：荒井ら、ネイチャー（Nature),348巻,730〜732頁,1
990年、ＥＴB受容体：桜井ら、ネイチャー（Nature),34
8巻,732〜735頁,1990年］。
【０００５】また、ヒトのＥＴA及びＥＴBのｃＤＮＡも
クローニングされており［ヒト・ＥＴA：細田ら、フェ
ブス・レターズ（FEBS Letters),287巻,23〜26頁,1991
年、ヒト・ＥＴB：なかむたら、バイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.),177巻,34〜39
頁,1991年］、ヒト・ＥＴA及びＥＴBを、動物細胞や昆
虫細胞で発現させた例が報告されている。しかしなが
ら、動物細胞を用いるものは培養コストが高い上にその
発現量が低く、スクリーニング用の大量の受容体標品の
調製に適したものではない。また、昆虫細胞を用いた発
現例［Breuら、第３回国際エンドセリンカンファレンス
1993年］では、ＥＴAアンタゴニストＢＱ１２３に対
する親和性が動物細胞由来のものとは異なっていたこと
から、昆虫細胞由来のエンドセリン受容体は天然のもの
とは異なっていて、スクリーニングに用いることは不適
当と結論されていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ヒト型エンドセリン受
容体を使用して、エンドセリン拮抗阻害剤をスクリーニ
ングすることができれば、ヒトに対して有効な医薬の開
発が効率よく行えるようになることが期待される。
【０００７】本発明は、ヒト型エンドセリン受容体を用
いることによるエンドセリン拮抗阻害剤をスクリーニン
グする方法、及びここにおいて用いられるスクリーニン
グ用キットを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記した
事情に鑑み、エンドセリン拮抗阻害剤をスクリーニング
する方法につき鋭意研究の結果、ヒト型エンドセリン受
容体を用いることにより、効率良くスクリーニングを行
うことができることを見い出し、この知見に基づいてさ
らに研究した結果、本発明を完成した。
【０００９】本発明は、（１）ヒト型エンドセリン受容
体を含むエンドセリン拮抗阻害剤スクリーニング用キッ
ト、（２）ヒト型エンドセリン受容体を用いることを特
徴とするエンドセリン拮抗阻害剤のスクリーニング方
法、（３）ヒト型エンドセリン受容体をコードするＤＮ
Ａを導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞、
（４）上記（３）記載の昆虫細胞から得られたヒト型エ
ンドセリン受容体を含有する膜画分、および（５）上記
（３）の昆虫細胞を培養することを特徴とするヒト型エ
ンドセリン受容体の製造法、である。
【００１０】ヒト型エンドセリン受容体としては、ヒト
の心臓（ＥＴA）や脳（ＥＴB）の膜画分が考えられる
が、ヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、ス
クリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用
いて大量発現させたヒト型エンドセリン受容体またはこ
れと実質的に同質の活性を有するものが挙げられる。本
発明のヒト型エンドセリン受容体と実質的に同質の活性
を有するものは、ヒト型エンドセリン受容体を発現した
宿主細胞から単離され得る。さらに、本発明の製造法以
外の方法で製造されたものであってもよい。
【００１１】本発明のヒト型エンドセリン受容体のアミ
ノ酸配列の具体的としては、例えば、ネイチャー３４８
巻７３０〜７３２頁１９９０年，ネイチャー３４８巻７
３２〜７３５頁１９９０年に記載のそれらが挙げられる
が、これらの１〜５個以上のアミノ酸が欠失したアミノ
酸配列、１〜５個以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列、あるいは１〜５個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列を含有するものでもよい。さら
に、Ｎ末端のシグナルペプチドが切断されていてもよい
し、分子内のアミノ酸の側鎖が適当な保護基（例えば、
ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アシル基など）で
保護されていてもよいし、あるいは糖鎖などが結合して
いてもよい。
【００１２】該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵
母、昆虫細胞、及び動物細胞などが挙げられるが、なか
でも昆虫細胞が好ましい。該昆虫細胞としては、例え
ば、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperd
a cell；Ｓｆ細胞）、蚕由来株化細胞（Bombyx mori
N；ＢｍＮ細胞）などが挙げられる。より詳しくは、宿
主としては、ウイルスがＡｃＮＰＶの時は夜盗蛾の幼虫
由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細
胞）、ＢｍＮＰＶの場合は蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N；ＢｍＮ細胞）を用いる。
【００１３】ヒト型エンドセリン受容体をコードするＤ
ＮＡ断片を、昆虫細胞を宿主細胞とするバキュロウイル
スに導入し、該バキュロウイルスを昆虫細胞に感染させ
ることによって、本発明のヒト型エンドセリン受容体を
コードするＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染さ
せた昆虫細胞を製造し得る。昆虫細胞を宿主細胞とする
バキュロウイルスとしては、例えば、核多角体病ウイル
ス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）などが挙げ
られる。バキュロウイルスの昆虫細胞への感染方法とし
ては、ｍ.ｏ.ｉ.（multiplicity of infection）が約
０.１〜１００、望ましくは約１〜１０になるようにバ
キュロウィルスを昆虫細胞の培養液に添加する方法が用
いられる。
【００１４】以下に、本発明のヒト型エンドセリン受容
体をコードするＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感
染させた昆虫細胞の製造法を具体的に説明する。目的部
分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられる
が、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば遺
伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。ＥＴA受容体や
ＥＴB受容体あるいはこれと同質のペプチドをコードす
るＤＮＡ断片を宿主細胞に導入し、それらを効率よく発
現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバ
キュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear
polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモー
ターの下流に組み込むのが好ましい。ベクターとして
は、キンウワバ亜科のAutographa californica ＮＰＶ
（ＡｃＮＰＶ）とカイコのBombyx mori ＮＰＶ（ＢｍＮ
ＰＶ）の２つのウイルスが挙げられる。バキュロウイル
スは、環状の２本鎖ＤＮＡ（１３０kb）を持ち、脊椎動
物及び植物にはまったく感染性を示さない。ウイルスＤ
ＮＡは１３０kbもあるので、直接発現したいＤＮＡ断片
を多角体プロモーターの下流に挿入するのは不可能であ
る。そこで実際にはまずプロモーター部分を含むポリヘ
ドリン遺伝子部分をウイルスから切り出し、これをｐＵ
Ｃ１８などの大腸菌を宿主とするベクターに組み込みト
ランスファーベクターを作製する。次いで目的とするＤ
ＮＡ断片をトランスファーベクターのポリヘドリンプロ
モーターの下流へ挿入し、これをバキュロウイルスＤＮ
Ａと共に昆虫細胞に同時に感染させて培養し、昆虫細胞
の中で相同組換えをおこさせて組換えバキュロウイルス
を得る。組換えウイルスは多角体を作るかわりに新しく
導入された目的産物を作るようになる。宿主としてはウ
イルスがＡｃＮＰＶの時は夜盗蛾の幼虫由来株化細胞
（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、ＢｍＮＰ
Ｖの場合は蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細
胞）を用いる。
【００１５】バキュロウイルス及び昆虫細胞を用いた発
現系としては市販されているものが利用でき（例えばIn
vitrogen社 MAXBAC(TM)）、手段についてもそれに添付
されている実験書や文献［バイオテクノロジー（Bio／T
echnology),6巻,47〜55頁,1988年］に記載のものが採用
され得る。発現した受容体の量と質の検査はそれ自体公
知の方法で行うことができる。例えば、文献［Nambi,P.
ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J. Biol. Chem.),267巻,19555〜19559頁,1992年]
に記載の方法に従っておこなうことができる。
【００１６】本発明のヒト型エンドセリン受容体をコー
ドするＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染させた
昆虫細胞を静地培養または浮遊培養することにより、該
細胞にヒト型エンドセリン受容体を大量発現させること
ができる。昆虫細胞を培養するための培地としては、グ
レース昆虫細胞用培地サプリメント入り、ＩＰＬ−４１
昆虫細胞用培地、Ｓｆ−９００昆虫細胞用無血清培地、
ＴＣ−１００昆虫細胞用培地（いずれも GIBCO-BRL社）
などが挙げられる。またこれらの培地に約５％〜２０％
の牛胎児血清、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン、ゲ
ンタマイシンなどの抗生物質、約０.１％のプルロニッ
クＦ−６８（GIBCO-BRL社）などを添加してもよい。培
養は約２０℃から３０℃、望ましくは約２６℃から２７
℃で、約１２時間から１２０時間、望ましくは約２４時
間から７２時間行い、シャーレやフラスコの中で静置し
てもよいし、スピナーフラスコを用いて約５０ｒｐｍ〜
２００ｒｐｍで撹拌してもよい。
【００１７】本発明のスクリーニング用キットやスクリ
ーニング方法においては、ヒト型エンドセリン受容体
は、それを含有する細胞を用いてもよく、また、それを
含有する細胞の膜画分を用いてもよく、さらに、それら
から単離され得るものであってもよいが、ヒト型エンド
セリン受容体を含有する昆虫細胞の膜画分が最も好まし
い。膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知
の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをい
う。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモ
ジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダ
ーやポリトロン（Kinematica社）による破砕、超音波に
よる破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細
いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられ
る。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心
分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば細胞破砕液を低速（約５００rpm〜３０００r
pm）で短時間（約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに
高速（約１５０００rpm〜３００００rpm）で約３０分〜
２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分
中には、発現したヒト型エンドセリン受容体と細胞由来
のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。該
ヒト型エンドセリン受容体を含有する細胞や膜画分中の
ヒト型エンドセリン受容体の量は、１細胞当たり約１０
3〜１０7分子に達するが、約１０5〜１０7分子であるの
が好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりの
エンドセリン結合活性（比活性）が高くなり、高感度な
スクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同
一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００１８】ヒト型エンドセリン受容体を含有する昆虫
細胞からヒト型エンドセリン受容体を単離するには、例
えば下記の方法により行なうことができる。ヒト型エン
ドセリン受容体を培養昆虫細胞から抽出するに際して
は、培養後、公知の方法で昆虫細胞を集め、これを適当
な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または
凍結融解などによって昆虫細胞を破壊したのち、遠心分
離やろ過によりヒト型エンドセリン受容体の粗抽出液を
得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩
酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンＸ−１
００（登録商標。以下、ＴＭと省略することがあ
る。）、ＣＨＡＰＳ、ジギトニンなどの界面活性剤が含
まれていてもよい。得られた抽出液中に含まれるヒト型
エンドセリン受容体の精製は、自体公知の分離・精製法
を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公
知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶
解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過
法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換
クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、ア
フィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等
電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００１９】さらに詳しくは、上述のようにして得られ
るヒト型エンドセリン受容体が遊離体で得られた場合に
は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって
塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自
体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体
または他の塩に変換することができる。なお、組換え体
が産生するヒト型エンドセリン受容体を、精製前または
精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、
任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去す
ることもできる。蛋白修飾酵素としては、トリプシン、
キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロ
テインキナーゼなどが用いられる。
【００２０】本発明で用いるヒト型エンドセリン受容体
は、上記のごとく、ヒト型エンドセリン受容体を含有す
る昆虫細胞からそれ自体公知の方法あるいはそれに準じ
る方法によって単離精製されたものであってもよいし、
該昆虫細胞の細胞膜上に存在しているものであってもよ
いし、該細胞の膜画分に存在するものであってもよい。
本発明のヒト型エンドセリン受容体の部分ペプチドとし
ては、例えば、本発明のヒト型エンドセリン受容体分子
のうち、細胞膜の外に露出している部位などが用いられ
る。具体的には、疎水性プロット解析において細胞外領
域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された
部分ペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部
位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。
さらに、個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得
るが、複数のドメインを同時に含む部分ペプチドでもよ
い。本発明のヒト型エンドセリン受容体の部分ペプチド
の塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩
が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例え
ば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるい
は有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル
酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ
酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスル
ホン酸）との塩などが用いられる。
【００２１】本発明のヒト型エンドセリン受容体の部分
ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法
に従って、あるいは本発明のヒト型受容体を適当なペプ
チダーゼで切断することによって製造することができ
る。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液
相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明の
蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残
余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保
護基を脱離することにより目的のペプチドを製造するこ
とができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはた
とえば、以下の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当
な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。
【００２２】本発明のヒト型エンドセリン受容体を含有
する昆虫細胞またはその細胞膜画分、あるいは単離した
ヒト型エンドセリン受容体、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩は、ヒト型受容体拮抗阻害化合物のスクリーニ
ングに有用である。すなわち、本発明のヒト型受容体結
合阻害化合物のスクリーニング方法は、結合阻害実験
（あるいは、リガンド結合実験、受容体結合実験などと
称する場合もある。）において、上記で得られたヒト型
エンドセリン受容体を含有する昆虫細胞またはその細胞
膜画分、あるいは単離したヒト型エンドセリン受容体、
その部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴
とする。
【００２３】エンドセリンの拮抗阻害剤をスクリーニン
グするためには、適当なエンドセリン受容体あるいはそ
れを含有する細胞や膜画分あるいはそれから単離され得
るものと、標識されたエンドセリンが必要である。エン
ドセリン受容体画分としては、天然型のヒト型エンドセ
リン受容体（ＥＴA及びＥＴB）か、またはリガンドに対
する親和性がそれと同等の組換え型ヒト型エンドセリン
受容体が望ましい。後述の参考例に記載した昆虫細胞由
来ヒト型ＥＴA受容体とヒト型ＥＴB受容体は天然型の受
容体と親和性が同等であるばかりでなく、膜蛋白当たり
の比活性が極めて高く、混入する他の膜成分による干渉
を低減させることができる。また産生量が多く同一ロッ
トで実験を継続することができるため、受容体画分のロ
ット間による違いを排除でき、測定キットを作る上でも
優れている。標識されたエンドセリンとしては、［125
Ｉ］で標識されたエンドセリン−１、エンドセリン−
２、及びエンドセリン−３が市販されている（Amersham
及びDupon社）ので、それらを利用することができる。
【００２４】エンドセリン拮抗阻害剤のスクリーニング
を行うには、まずヒト型エンドセリン受容体を含有する
細胞または細胞の膜画分あるいはそれから単離され得る
ものを、スクリーニングに適したバッファーに懸濁する
ことにより受容体標品を調製する。バッファーには、pH
約４〜１０（望ましくはpH約６〜８）のリン酸バッファ
ー、トリス−塩酸バッファーなど、エンドセリンと受容
体の結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよ
い。また非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰ
Ｓ、Ｔｗｅｅｎ−８０(TM)（花王−アトラス社）、ジギ
トニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファ
ーに加えることもできる。さらにプロテアーゼによる受
容体やリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペ
プチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所）、ペプスタチンな
どのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.
０１ml〜１０mlの該受容体に、一定量（約５０００cpm
〜５０００００cpm）の［125Ｉ］−エンドセリン−１，
［125Ｉ］−エンドセリン−２または［125Ｉ］−エンド
セリン−３を添加し、同時に１０- 4 Ｍ〜１０- 1 0Ｍ
の検体化合物や発酵生産物等を共存させる。非特異的結
合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンド
を加えた反応チューブも用意する。反応は約０℃から５
０℃、望ましくは約４℃から３７℃で約２０分から２４
時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガ
ラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄し
た後、ガラス繊維濾紙に残存する［125Ｉ］をγ−カウ
ンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント
(Ｂ0）からＮＳＢを引いたカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）を
１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例え
ば５０％以下になる検体化合物を拮抗阻害能力のある候
補物質として選択することができる。
【００２５】試験化合物としては、例えば、天然ペプチ
ド、合成ペプチド、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出
液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられる。こ
れらは、新規な化合物であってもよいし、あるいは公知
の化合物であってもよい。
【００２６】このように、本発明は、 （１）（ｉ）本発明のヒト型エンドセリン受容体、その
部分ペプチドまたはそれらの塩に、ヒト型エンドセリン
を接触させた場合と（ii）本発明のヒト型エンドセリン
受容体、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ヒト型
エンドセリンおよび試験化合物を接触させた場合との比
較を行なうことを特徴とするヒト型エンドセリン受容体
拮抗阻害化合物のスクリーニング方法、および （２）（ｉ）本発明のヒト型エンドセリン受容体を含有
する昆虫細胞またはその細胞膜画分に、ヒト型エンドセ
リンを接触させた場合と（ii）本発明のヒト型エンドセ
リン受容体を含有する昆虫細胞またはその細胞膜画分
に、ヒト型エンドセリンおよび試験化合物を接触させた
場合との比較を行なうことを特徴とするヒト型エンドセ
リン受容体拮抗阻害化合物のスクリーニング方法を提供
するものである。 具体的には、本発明のスクリーニング方法においては、
（ｉ）と（ii）の場合における、例えば該ヒト型エンド
セリン受容体、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対
するヒト型エンドセリンの結合量を測定して、比較する
ことを特徴とするものである。
【００２７】より具体的には、本発明は、 （１ａ）（ｉ）標識したヒト型エンドセリンを、本発明
のヒト型エンドセリン受容体、その部分ペプチドまたは
それらの塩に接触させた場合と、（ii）標識したヒト型
エンドセリンおよび試験化合物を、本発明のヒト型エン
ドセリン受容体、その部分ペプチドまたはそれらの塩に
接触させた場合における、標識したヒト型エンドセリン
の該受容体、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対す
る結合量を測定し、比較することを特徴とするヒト型エ
ンドセリン受容体拮抗阻害化合物のスクリーニング方
法、 （２ａ）（ｉ）標識したヒト型エンドセリンを、本発明
のヒト型エンドセリン受容体を含有する昆虫細胞または
その細胞膜画分に接触させた場合と、（ii）標識したヒ
ト型エンドセリンおよび試験化合物を、本発明のヒト型
エンドセリン受容体を含有する昆虫細胞またはその細胞
膜画分に接触させた場合における、標識したヒト型エン
ドセリンの該昆虫細胞またはその細胞膜画分に対する結
合量を測定し、比較することを特徴とするヒト型エンド
セリン受容体拮抗阻害化合物のスクリーニング方法を提
供する。 上記の（１ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法に
おいて、ヒト型エンドセリン受容体に結合して、ヒト型
エンドセリンとヒト型エンドセリン受容体との結合を阻
害する化合物がヒト型エンドセリン受容体拮抗阻害化合
物の候補として選択できる。具体的には、上記の（１
ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法を実施するに
は、許容できる結合活性を保ったヒト型エンドセリン受
容体を含有する細胞またはその細胞膜画分あるいはそれ
から単離され得るものと、標識されたリガンドが必要で
ある。
【００２８】ヒト型エンドセリン受容体を含有する細胞
や、該細胞の膜画分としては、ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞
などのヒト型エンドセリン受容体を発現しているヒト由
来培養細胞や、ヒト型エンドセリン受容体をコードする
ＤＮＡを導入し、ヒト型エンドセリン受容体を発現でき
るようにした形質転換体やそれらの膜画分などが用いら
れる。形質転換体としては、大腸菌、枯草菌、放線菌な
どの原核生物や、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの真核
生物が用いられるが、中でも上述した本発明の昆虫細胞
が発現産物の質と量の両面で優れており好ましい。
【００２９】標識されたリガンドとしては、例えば、〔
125Ｉ〕で標識されたエンドセリン−１、エンドセリン
−２，およびエンドセリン−３が市販されている（Amer
sham社およびDupon社）のでそれらを使用することがで
きる。
【００３０】本発明のエンドセリン拮抗阻害剤スクリー
ニング用キットの具体例としては、次のものが挙げられ
る。 １．スクリーニング用試薬 これらを１リットルの蒸留水に溶解する。 これらを１mlのＤＭＳＯに溶解し、上記の１リットルに
加える。６Ｎ ＨＣｌを約２ml加えpH７.２に調整する。
ＢＳＡ１gを溶解させた後、４℃で保存する。 これを９００mlの測定用緩衝液に溶解し、４℃で保存す
る。 （３）ヒト型エンドセリン受容体標品 ヒト型エンドセリン受容体を発現させた昆虫細胞（Ｓｆ
９）の膜画分を、使用前に測定用緩衝液で０.５〜５μg
蛋白／mlとなるように希釈する。 蒸留水５０μlを加えて溶解し、測定用緩衝液４５０μl
を加えて−２０℃で保存する。 （５）エンドセリン−１標準溶液 エンドセリン−１（ペプチド研）を５０％ＤＭＳＯで１
０-4Ｍになるように希釈し、−２０℃に保存する。使用
前に測定用緩衝液で１０倍希釈する。
【００３１】２．測定法 （１）ヒト型エンドセリン受容体を含有するＳｆ９細胞
［Vaughn, J. L．ら、Invitro,13巻,213〜217頁,1977
年］の膜画分を測定用緩衝液で１μg蛋白／mlになるよ
うに希釈し、チューブ（Falcon社）に１００μlずつ分
注する。 （２）１０-4〜１０-10Ｍの検体３μl、または１０μl
以内の発酵生産物を加えた後、［125Ｉ］標識エンドセ
リン−１を２μl加え２５℃で６０分間反応させる。非
特異的結合量を調べるためには検体のかわりに10-5Ｍエ
ンドセリン−１を３μl加えておく。 （３）洗浄用緩衝液１.５mlを加え、ガラス繊維瀘紙（W
hatman社 GF／F）で濾過後、残ったチューブにさらに
同緩衝液１.５mlを加え、再度濾過する。 （４）ガラス繊維濾紙に残存する［125Ｉ］をγ−カウ
ンターで計測し、PercentMaximum Binding（ＰＭＢ）を
次の式〔数１〕で求める。
【数１】 ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non−specific Binding（非特異的結合） Ｂ0：最大結合量
【００３２】本発明のスクリーニング方法を用いると、
ヒト型エンドセリン受容体に対して阻害作用を有する化
合物等を選択することができるようになるので、循環機
能改善剤、心筋梗塞・急性腎不全の治療剤または喘息治
療剤等のヒトの医薬品を早期に見い出すことができる。
【００３３】本明細書で使用される略号を次に示す。 ＣＨＡＰＳ：3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]
-1-propanesulfonate ＰＭＳＦ：phenylmethylsulfonyl fluoride ＥＧＴＡ：ethylene glycol bis(2-aminoethylether)te
traacetic acid ＢＳＡ：bovine serum albumin ＤＭＳＯ：dimethyl sulfoxide また、本明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commis
ion on Biochemical Nomenclature による略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例
を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る
場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００３４】
【実施例】以下に参考例および実施例を挙げて本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明がそれらに限定され
るものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法
は、成書(Maniatisら、モレキュラー・クローニング（M
olecular Cloning：A laboratory manual）,Cold Sprin
g Harbor Laboratory,1989年)に記載されている方法に
従った。また昆虫細胞を用いての遺伝子操作法は、Invi
trogen社の推奨する方法（A Manual of Methods for Ba
culovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedu
res， Version 1.5.6）に従った。
【００３５】参考例１（ヒト・エンドセリンタイプAレ
セプターｃＤＮＡ（ＥＴAｃＤＮＡ）のクローニング） 既知の該塩基配列（細田ら、フェブス・レターズ（FEBS
Letters),287巻,23〜26頁,1991年）に基づき、ＤＮＡ
オリゴマー＃４９１及び＃４９３を合成した。＃４９１
は、５’−pGGAATTCTTCCTCAAATTTGCCTCAAG−３’（配列
表：配列番号１）であり、５’末端がリン酸化された制
限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列と−２０〜−１（翻訳開始
部位を＋１とする）のセンス配列を含むオリゴマーであ
る。また＃４９３は、５’−pGGAATTCAGAGGATTATGGGAGT
ACCG−３’（配列表：配列番号２）であり、５’末端が
リン酸化された制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列と＋１３
０５〜＋１３２４のアンチセンス配列を含むオリゴマー
である。ヒト胎盤由来ｃＤＮＡをλｇｔ１１ベクターに
クローニングしているｃＤＮＡライブラリー（クロンテ
ック社 カタログ番号 HL1075b）のファージ溶液５μl
を蒸留水５０μlに希釈し、９５℃で１０分間、氷中で
１０分間静置して鋳型溶液とした。鋳型溶液１０μl
に、上記ＤＮＡオリゴマーをそれぞれ１００pmolずつ加
え、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランド
バイオラブス社 カタログ番号254）５単位を用いてポ
ロメラーゼ連鎖反応を行った。反応液組成はＶｅｎｔＤ
ＮＡポリメラーゼに添付された指示書に従った。反応条
件は、９４℃で１分間、５２℃で２分間、７２℃で３分
間を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。反応液
を０.７％アガロースゲルで電気泳動したところ、目的
とするサイズのＤＮＡ断片が特異的に増幅されていた。
該ＤＮＡ断片をアガロースゲルから常法に従って回収
し、ＨｉｎｃIIサイトの開裂したｐＵＣ１１９に接続
し、コンピテントセルＪＭ１０９を形質転換した。該Ｄ
ＮＡ断片を含むプラスミドを有する形質転換体２０株を
選抜し、蛍光色素を用いた自動塩基配列解析装置（アプ
ライドバイオシステムズ社 カタログ番号373A）で、挿
入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認したところ、上述の報告
に記載されたエンドセリンタイプＡレセプターｃＤＮＡ
の塩基配列（−２０〜＋１３２４）と完全に一致するＤ
ＮＡ断片を有するクローン（ｐＨＥＲＡ１０５−２）が
得られた。
【００３６】参考例２（ヒト・エンドセリンタイプＢリ
セプターｃＤＮＡ（ＥＴBｃＤＮＡ）のクローニング） 既知の該塩基配列（なかむたら、Biochem. Biophys. Re
s. Commun.，177巻,34〜39頁,1991年）に基づき、ＤＮ
Ａオリゴマー＃４８４及び＃４８６を合成した。＃４８
４は、５’−pGGAATTCCTTCTGGAGCAGGTAGCAGC−３’（配
列表：配列番号３）であり、５’末端がリン酸化された
制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列と−２０〜−１（翻訳開
始部位を＋１とする）のセンス配列を含むオリゴマーで
ある。また＃４８６は、５’−pGGAATTCTACAGTGAATAGTT
CTTCTT−３’（配列表：配列番号４）であり、５’末端
がリン酸化された制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列と＋１
３３０〜＋１３４９のアンチセンス配列を含むオリゴマ
ーである。ヒト胎盤由来ｃＤＮＡをλｇｔ１１ベクター
にクローニングしているｃＤＮＡライブラリー（クロン
テック社 カタログ番号 HL1075b）のファージ溶液５
μlを蒸留水５０μlに希釈し、９５℃で１０分間、氷中
で１０分間静置して鋳型溶液とした。鋳型溶液１０μl
に、上記ＤＮＡオリゴマーをそれぞれ１００pmolずつ加
え、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランド
バイオラブス社 カタログ番号254）５単位を用いてポ
ロメラーゼ連鎖反応を行った。反応液組成はＶｅｎｔＤ
ＮＡポリメラーゼに添付された指示書に従った。反応条
件は、９４℃で１分間、５２℃で２分間、７２℃で３分
間を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。反応液
を０.７％アガロースゲルで電気泳動したところ、目的
とするサイズのＤＮＡ断片が特異的に増幅されていた。
該ＤＮＡ断片をアガロースゲルから常法に従って回収
し、ＨｉｎｃIIサイトの開裂したｐＵＣ１１９に接続
し、コンピテントセルＪＭ１０９を形質転換した。該Ｄ
ＮＡ断片を含むプラスミドを有する形質転換体２０株を
選抜し、蛍光色素を用いた自動塩基配列解析装置（アプ
ライドバイオシステムズ社 カタログ番号373A）で、挿
入ＤＮＡ断片の塩基配列を確認したところ、上述の報告
に記載されたエンドセリンタイプＢレセプターｃＤＮＡ
の塩基配列（−２０〜＋１３４９）と完全に一致するＤ
ＮＡ断片を有するクローン（ｐＨＥＲＢ１０２−２７）
が得られた。
【００３７】実施例１（ヒト型ＥＴA発現用組換え体ウ
イルスの作製） 参考例１に記載のヒト・ＥＴAｃＤＮＡ断片を有するプ
ラスミドｐＨＥＲＡ１０５−２ １０μgを制限酵素Ｐ
ｓｔＩとＳｍａＩで消化した後、１％アガロースゲル電
気泳動を行い、ＥＴA受容体をコードする１.４kbＤＮＡ
断片を回収した。トランスファーベクターｐＢｌｕｅＢ
ａｃIII（Invitrogen社）２μgをＨｉｎｄIIIで消化し
た後、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメン
ト）を用いて平滑末端にした。さらにこれをＰｓｔＩで
消化し、ヒト・ＥＴAｃＤＮＡ断片を挿入するためのク
ローニング部位を作製した。該トランスファーベクター
断片と１.４kbＤＮＡ断片をＴ4ＤＮＡリガーゼを用いて
結合し、ヒト・ＥＴAｃＤＮＡ断片が、ポリヘドリンプ
ロモーターに対して順方向に挿入されたトランスファー
プラスミドｐＢａｃ０３を得た。ｐＢａｃ０３ ３μg
と線状ＡｃＮＰＶ ＤＮＡ１μgを同時にリポソームを
用いてＳｆ９細胞に導入し、２７℃で２日間培養した
後、培養上清を回収した。該培養上清から組換え体ウイ
ルスを選び出すために、5-bromo-4-chloro-3-indolyl-
β-D-galactoside（Ｘ−ｇａｌ）を含む軟寒天中でプラ
ークを作らせ、青色を呈する組換え体ウイルス（ｖＢａ
ｃ０３）を得た。これを用いて再度単一プラークを作ら
せた後、２回増幅操作を行って発現のためのウイルスス
トックを作製した。
【００３８】実施例２（ヒト型ＥＴB発現用組換え体ウ
イルスの作製） 参考例２に記載のヒト・ＥＴBｃＤＮＡ断片を有するプ
ラスミドｐＨＥＲＢ１０２−２７ １０μgを制限酵素
ＰｓｔＩとＳｍａＩで消化した後、１％アガロースゲル
電気泳動を行い、ＥＴB受容体をコードする１.４kbＤＮ
Ａ断片を回収した。該ＤＮＡ断片と実施例１に記載のト
ランスファーベクター断片をＴ4ＤＮＡリガーゼを用い
て結合し、ヒト・ＥＴBｃＤＮＡ断片が、ポリヘドリン
プロモーターに対して順方向に挿入されたトランスファ
ープラスミドｐＢａｃ０５を得た。 ｐＢａｃ０５ ３
μgを用いて実施例１に記載の方法でＸ−ｇａｌの存在
下、青色を呈する組換え体ウイルス（ｖＢａｃ０５）を
得た。これを用いて再度単一プラークを作らせた後、２
回増幅操作を行って発現のためのウイルスストックを作
製した。
【００３９】実施例３（昆虫細胞を用いたヒト型ＥＴA
及びヒト型ＥＴBの発現） Ｓｆ９細胞を１００ml用のスピナーフラスコを用いて５
０mlの培地［１０％牛胎児血清、０.１％プルロニック
Ｆ−６８（TM）（GIBCO−BRL社）、５０μg／mlゲンタ
マイシンを含むグレース培地（GIBCO−BRL社）］で浮遊
培養し、細胞濃度が２×１０6個／mlの時、実施例１と
実施例２で作製した組換え体ウイルスｖＢａｃ０３また
はｖＢａｃ０５のストック液（約５×１０7個プラーク
形成能／ml）を５ml加えてウイルスを感染させた。さら
に２７℃で３日間培養した後、細胞を回収した。同様な
感染は野生型ウイルスを用いても行った。細胞または細
胞膜画分のエンドセリン受容体活性の測定は以下の方法
で行った。ＥＴA受容体はｖＢａｃ０３感染細胞、ＥＴB
受容体はｖＢａｃ０５感染細胞を、測定用緩衝液［２０
mM トリス−塩酸，２mM ＥＧＴＡ，５mM 酢酸マグネ
シウム，０.１％ ＢＳＡ，０.０３％ ＮａＮ3，０.５
mM ＰＭＳＦ，２０μg／ml ロイペプチン，４μg／ml
Ｅ−６４，１μg／ml ペプスタチン（pH７.２）］で
希釈し、細胞数を１０4個／mlに調整した。各１００μl
を分注し、５nM［125Ｉ］エンドセリン−１（２μl）を
添加し、２５℃、６０分間インキュベーションした。ま
た、最大結合量（Ｂ0）及び非特異的結合量（ＮＳＢ）
を測定するために、ジメチルスルホキシド溶液（３μ
l）あるいは、エンドセリン−１（１０-5Ｍ）を含むジ
メチルスルホキシド溶液（３μl）を添加したロットも
インキュベーションした。０.０５％ＣＨＡＰＳ−測定
用緩衝液（１.５ml）を添加し、ＧＦ／Ｆガラス繊維濾
紙で濾過、さらに同緩衝液（１.５ml）で洗浄した。濾
紙の［125Ｉ］をγ−カウンターで計測した。その結果
を〔表１〕に示す。
【表１】
【００４０】実施例４（昆虫細胞由来ヒト型ＥＴA受容
体及びヒト型ＥＴB受容体の特異性の検討） 実施例３で得られたｖＢａｃ０３感染細胞及びｖＢａｃ
０５感染細胞（５０ml相当量、約１０8細胞）を、実施
例３に記載の測定用緩衝液１０mlに懸濁した後、Ｇ２７
の注射針の中を１０回通すことにより細胞を破砕し、１
２０００rpm、１５分の遠心（BECKMAN社 JA−20ロータ
ー）した後、沈澱を膜画分として回収した。ｖＢａｃ０
３感染細胞からは、ヒト型ＥＴA受容体画分、ｖＢａｃ
０５感染細胞からはヒト型ＥＴB受容体画分が得られ
た。該受容体画分のリガンド特異性を調べる目的で、一
定量の［125Ｉ］−ＥＴ−１に対して可変量のＥＴ−
１、ＥＴ−３または他の化合物を加えて結合阻害実験を
行った。蛋白濃度はヒト型ＥＴA受容体画分は１.５μg
／ml、ヒト型ＥＴB受容体画分は０.５μg／mlとした。
各１００μlを分注し、５nM［125Ｉ］エンドセリン−１
（２μl）を添加し、同時に可変量の競合物を添加し
（３μl）、２５℃、６０分間インキュベーションし
た。０.０５％ ＣＨＡＰＳ−測定用緩衝液（１.５ml）
を添加し、ＧＦ／Ｆガラス繊維濾紙で濾過、さらに同緩
衝液（１.５ml）で洗浄した。濾紙の［125Ｉ］をγ−カ
ウンターで計測し、下記の式〔数２〕の計算式に従って
計算して、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を求め
た。またＰＭＢ＝５０％を与える濃度をＩＣ50値として
求めた。
【数２】 Ｂ：結合量 ＮＳＢ：非特異的結合量 Ｂ0：最大結合量 ヒト型ＥＴA受容体画分におけるＩＣ50はエンドセリン
−１が約２×１０-10Ｍでエンドセリン−３が約５×１
０-8ＭでＥＴA受容体のリガンド特異性（親和性がＥＴ
−１＞ＥＴ−３）を有していた。またヒト型ＥＴB受容
体画分におけるＩＣ50はエンドセリン−１とエンドセリ
ン−３ともに約３×１０-10ＭでＥＴB受容体のリガンド
特異性（親和性がＥＴ−１＝ＥＴ−３）を有していた。
結果を〔図１〕及び〔図２〕に示す。〔図１〕及び〔図
２〕において、−●−はエンドセリン−１についての結
果を、−○−はエンドセリン−３についての結果をそれ
ぞれ示す。さらにＥＴAアンタゴニストＢＱ−１２３
や、他の低分子化合物についても結合親和性の検討を行
ったが、天然型のＥＴA及びＥＴB受容体と同様の値を示
した。
【００４１】実施例５（昆虫細胞由来ヒト型ＥＴA受容
体及びヒト型ＥＴB受容体を用いたスクリーニング） 昆虫細胞（Ｓｆ９）を１リットル用のスピナーフラスコ
を用いて５００mlの実施例３に記載の培地で浮遊培養
し、細胞濃度が２×１０6個／mlの時、実施例１と実施
例２で作製した組換え体ウイルスｖＢａｃ０３またはｖ
Ｂａｃ０５のストック液を５０ml加えた。さらに２７℃
で４日間培養した後、細胞を遠心分離（３０００rpm，
１０分）で回収した。得られた細胞を２０倍容の参考例
５に記載の測定用緩衝液に懸濁した後、ポリトロンホモ
ジナイザーを用いて、細胞を破砕した。１２０００rp
m，１５分遠心した後、沈澱を膜画分として回収し、−
７０℃で保存した。用時、測定用緩衝液を加えて蛋白濃
度を１μg／mlになるように調製し、受容体画分とし
た。１００μlの受容体画分に５nM ［125Ｉ］エンドセ
リン−１（２μl）を添加し、同時にスクリーニングの
対象となる検体（化合物または発酵生産物）を含むジメ
チルスルホキシド溶液（３μl）を添加し、２５℃，６
０分間インキュベーションした。また、最大結合量（Ｂ
0）及び非特異的結合量（ＮＳＢ）を測定するために、
ジメチルスルホキシド溶液（３μl）あるいは、エンド
セリン−１（１０-5Ｍ）を含むジメチルスルホキシド溶
液（３μl）を添加したロットもインキュベーションし
た。０.０５％ＣＨＡＰＳ−測定用緩衝液（１.５ml）を
添加し、ＧＦ／Ｆガラス繊維濾紙（Whatman社）で濾過
し、さらに同緩衝液（１.５ml）で洗浄した後、濾紙の
［125Ｉ］をγ−カウンターで計測した。この方法で、
結合阻害活性を示す検体（化合物または発酵生産物）を
複数選び出した。この方法によって、発酵生産物の中か
ら、ＢＥ−１８２５７Ｂ（バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Bi
ochem. Biophys. Res. Commun.）１７８巻１３２−１３
７頁１９９１年）と同一の化合物がヒト型エンドセリン
と拮抗的に結合阻害活性を示すことが見い出された。
【００４２】
【発明の効果】本発明のスクリーニング方法を用いる
と、エンドセリン拮抗阻害作用を有する化合物等を有利
に選択できるので、循環機能改善剤などの医薬品を早期
に発見することができる。
【００４３】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２７ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGAATTCTTC CTCAAATTTG CCTCAAG 27
【００４４】
【配列番号：２】 配列の長さ：２７ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGAATTCAGA GGATTATGGG AGTACCG 27
【００４５】
【配列番号：３】 配列の長さ：２７ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGAATTCCTT CTGGAGCAGG TAGCAGC 27
【００４６】
【配列番号：４】 配列の長さ：２７ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGAATTCTAC AGTGAATAGT TCTTCTT 27
【図面の簡単な説明】
【図１】は、実施例４で得られた、ヒト型ＥＴA画分の
リガンド特異性を示す結合阻害曲線を示す。
【図２】は、実施例４で得られた、ヒト型ＥＴB画分の
リガンド特異性を示す結合阻害曲線を示す。
フロントページの続き (56)参考文献 特表 平８−502647（ＪＰ，Ａ) 国際公開93／013130（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト型エンドセリン受容体を含有する昆
    虫細胞またはその膜画分を含むエンドセリン拮抗阻害剤
    スクリーニング用キット。
  2. 【請求項２】 昆虫細胞がヒト型エンドセリン受容体を
    コードするＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染さ
    せた昆虫細胞である請求項１記載のキット。
  3. 【請求項３】 ヒト型エンドセリン受容体を含有する昆
    虫細胞の膜画分を含む請求項１記載のキット。
  4. 【請求項４】 昆虫細胞が夜盗蛾の幼虫由来株化細胞で
    ある請求項１記載のキット。
  5. 【請求項５】 ヒト型エンドセリン受容体がＥＴAであ
    る請求項１記載のキット。
  6. 【請求項６】 ヒト型エンドセリン受容体がＥＴBであ
    る請求項１記載のキット。
  7. 【請求項７】 ヒト型エンドセリン受容体を含有する昆
    虫細胞またはその膜画分を用いることを特徴とするエン
    ドセリン拮抗阻害剤のスクリーニング方法。
  8. 【請求項８】 昆虫細胞がヒト型エンドセリン受容体を
    コードするＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染さ
    せた昆虫細胞である請求項７記載のスクリーニング方
    法。
  9. 【請求項９】 ヒト型エンドセリン受容体を含有する昆
    虫細胞の膜画分を用いる請求項７記載のスクリーニング
    方法。
  10. 【請求項１０】 昆虫細胞が夜盗蛾の幼虫由来株化細胞
    である請求項７記載のスクリーニング方法。
  11. 【請求項１１】 ヒト型エンドセリン受容体がＥＴAで
    ある請求項７記載のスクリーニング方法。
  12. 【請求項１２】 ヒト型エンドセリン受容体がＥＴBで
    ある請求項７記載のスクリーニング方法。
  13. 【請求項１３】 ヒト型エンドセリン受容体を含有する
    昆虫細胞またはその膜画分。
  14. 【請求項１４】 ヒト型エンドセリン受容体をコードす
    るＤＮＡを導入したバキュロウイルスを感染させた昆虫
    細胞である請求項１３記載の昆虫細胞またはその膜画
    分。
  15. 【請求項１５】 昆虫細胞が夜盗蛾の幼虫由来株化細胞
    である請求項１３記載の昆虫細胞またはその膜画分。
  16. 【請求項１６】 請求項１３記載の昆虫細胞から得られ
    たヒト型エンドセリン受容体を含有する膜画分。
  17. 【請求項１７】 請求項１３記載の昆虫細胞を培養する
    ことを特徴とするヒト型エンドセリン受容体の製造法。
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