JP3640387B2 - レーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステム - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムに関し、さらに詳細には、従来と比較すると分析の効率を著しく向上することを可能にしたレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムに関し、例えば、ＤＮＡ、蛋白質、ＲＮＡ、ＰＮＡ、脂質、糖などの各種の高分子の質量分析に用いて好適なレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、質量分析法の応用範囲は、物理や化学の分野から医学や生化学などのライフサイエンスの分野へと急速に広がってきている。特に、蛋白質の分子量の決定解析やアミノ酸配列の決定解析などへの発展には、目を見張るものがある。
【０００３】
こうした質量分析法の原理は、試料を様々な方法でイオン化して、イオン化により得られたイオンを質量／電荷に従って分離し、分離した各イオンの強度を測定するというものである。
【０００４】
ところで、従来の高分子の質量分析は、高分子そのものに電子を付加してイオン化し、その質量を解析したり、高分子量の分子を低分子量の分子イオンに細分化して質量分析を行い、構成分子を比較するというものであった。
【０００５】
ここで、従来の高分子の質量分析におけるイオン生成方法としては、例えば、高分子に高エネルギー原子イオンを衝突させてイオン化する２次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）法や、電子衝撃によって低分子量の分子イオンに細分化して質量分析を行う電子イオン化（ＥＤ）法、マトリックス支援レーザーイオン化（ＭＡＬＤＩ）法などが知られている。
【０００６】
しかしながら、上記したいずれの方法においても、高分子イオンを質量分析するため高分解能の質量分析装置が必要であるという問題点や、中途半端に分解生成したフラグメントイオンの存在が質量スペクトルの解析を困難にするという問題点などがあった。
【０００７】
一方、従来より、化学分析に際して同位元素で標識した高分子試料の質量分析方法としては、例えば、ナノ秒レーザーにより原子化およびイオン化を行うレーザー原子化共鳴イオン化（ＬＡＲＩＭＰ）法が知られている。
【０００８】
しかしながら、このＬＡＲＩＭＰ法によれば、レーザーとして、標識元素を原子化するための原子化レーザーと原子化された標識元素の原子をイオン化するための共鳴イオン化レーザーとの２台のレーザーが必要となるため、システム構成が複雑になるという問題点があった。
【０００９】
さらに、ＬＡＲＩＭＰ法においては、上記したように標識原子を共鳴イオン化する必要がある。このため、各標識原子に対して固有の波長のレーザー光を照射する必要があり、多種類の標識同位体が混入した状況では効率の良い分析を行うことが極めて困難であるという問題点があった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記したような従来の技術の有する種々の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、高分子を構成する構成原子の原子イオンを生成し、生成した原子イオンを分析するようにしたレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムであって、高分解能の分析装置を要しないようにしたレーザーアブレーションを用いた高分子の質量分析方法およびそのシステムを提供しようとするものである。より詳細には、例えば、質量分析を行う場合には、質量スペクトルの解析が困難になる恐れを排除するとともに、質量分析装置に高分解能を要しないようにしたレーザーアブレーションを用いた高分子の質量分析方法およびそのシステムを提供しようとするものである。
【００１１】
また、本発明の目的とするところは、高分子を構成する構成原子の原子化とイオン化とを１台のレーザーで同時に実現することを可能にして、システム構成を大幅に簡潔化することを可能にしたレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムを提供しようとするものである。
【００１２】
さらに、本発明の目的とするところは、多種類の標識同位体が混入した状況においても、効率の良い分析を行うことを可能にしたレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムを提供しようとするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明によるレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムは、例えば、ＤＮＡ、蛋白質、ＲＮＡ、ＰＮＡ、脂質、糖などの各種の高分子を超短パルスレーザー光でアブレーションすることにより、それら高分子を原子イオン化して原子イオンを生成し、生成した原子イオンを分析するようにしたものである。これにより、各種の高分子の化学分析を行うことができるものである。
【００１４】
即ち、本発明のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムによれば、高分子を超短パルスレーザー光でアブレーションすることにより、高分子をバラバラに分解して当該高分子を構成する各原子毎に原子化すると同時に、原子化した原子を１価のイオンにイオン化するものであり、このイオン化により生成された原子イオンを分析することにより、定量分析が可能となるものである。
【００１５】
従って、本発明のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムにおいて質量分析を行う場合には、低質量の原子イオンを質量分析することになり、質量スペクトルの解析が困難になる恐れがなくなるのみならず、質量分析装置が高分解能を備える必要がなくなる。
【００１６】
また、上記したように、本発明のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムによれば、超短パルスレーザー光で高分子をアブレーションすることにより、高分子の原子化と同時に、原子化された原子の一価のイオンへのイオン化を効率良く行うことが可能となる。従って、システム構成を簡潔化することができるようになるとともに、例えば、化学分析に際して多種類の標識元素を同時に使用することが可能となるため、解析効率を著しく向上させることができる。
【００１７】
つまり、本発明のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムにおいては、標識元素の原子化とイオン化とを１台の超短パルスレーザーで同時に行うことができるため、システム構成を大幅に簡略化することが可能となる。
【００１８】
さらに、上記したイオン化は、超短パルスレーザー光の高い尖頭値強度によって非共鳴過程によって行われるイオン化（非共鳴イオン化）であるので、多種類の標識同位体が混入した状況においても各標識原子をそれぞれイオン化することができ、多標識系への応用が容易であり、高精度かつ高効率な高分子の分析を行うことができるようになる。
【００１９】
このため、本発明のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムは、今後ますます重要性を増す遺伝子発現量の定量解析などに用いて極めて好適である。
【００２０】
即ち、本発明のうち請求項１に記載の発明は、分析の対象である高分子にレーザー光を照射して該高分子をアブレーションすることにより、高分子を構成元素に原子化し、原子化した構成元素をイオン化し、イオン化した構成元素を分析するレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法であって、分析の対象である高分子に照射して、該高分子をアブレーションするレーザー光は超短パルスレーザー光であり、該超短パルスレーザー光を分析の対象である高分子に照射して、該高分子をアブレーションすることによって、該高分子を構成元素に原子化すると同時にイオン化し、イオン化した構成元素を分析するようにしたものである。
【００２１】
ここで、上記分析としては、例えば、質量分析を挙げることができるが、質量分析以外の分析としては、具体的には、例えば、化学的分析（通常のいわゆる化学分析）や光学的分析（蛍光法など）が挙げられる。
【００２２】
また、本発明のうち請求項２に記載の発明は、本発明のうち請求項１に記載の発明において、分析の対象である高分子は、固相化されたものであるようにしたものである。
【００２３】
また、本発明のうち請求項３に記載の発明は、本発明のうち請求項２に記載の発明において、高分子の固相化の方法は、基板上に分析の対象である高分子の溶液を滴下して乾燥することにより固相化する過程を含む方法であるようにしたものである。
【００２５】
また、本発明のうち請求項４に記載の発明は、本発明のうち請求項１に記載の発明において、分析の対象である高分子は、元素標識を付けたものとしたものである。
【００３０】
また、本発明のうち請求項５に記載の発明は、本発明のうち請求項４に記載の発明において、上記元素標識は、安定同位元素標識であるようにしたものである。
【００３１】
また、本発明のうち請求項６に記載の発明は、本発明のうち請求項１、２、３、４または５のいずれか１項に記載の発明において、分析の対象である高分子に照射して、該高分子をアブレーションする超短パルスレーザー光は、パルス時間幅が１０ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１０メガワット以上であるようにしたものである。
【００３２】
また、本発明のうち請求項７に記載の発明は、本発明のうち請求項６に記載の発明において、分析の対象である高分子に照射して、該高分子をアブレーションする超短パルスレーザー光は、パルス時間幅が１フェムト秒以上１ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１ギガワット以上１０ギガワット以下であるようにしたものである。
【００３３】
また、本発明のうち請求項８に記載の発明は、本発明のうち請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれか１項に記載の発明において、上記イオン化した構成元素の分析は、質量分析であるようにしたものである。
【００３４】
また、本発明のうち請求項９に記載の発明は、本発明のうち請求項８に記載の発明において、質量分析は、飛行時間法による質量分析であるようにしたものである。
【００３５】
また、本発明のうち請求項１０に記載の発明は、本発明のうち請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載の発明において、イオン化した複数の構成元素を同時に分析するようにしたものである。
【００３６】
また、本発明のうち請求項１１に記載の発明は、本発明のうち請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のいずれか１項に記載の発明において、分析の対象である高分子は、ＤＮＡマイクロアレイに定着された核酸または核酸の類似体であるようにしたものである。
【００３７】
なお、核酸または核酸の類似体としては、具体的には、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡが挙げられる。
【００３８】
また、本発明のうち請求項１２に記載の発明は、本発明のうち請求項１１に記載の発明において、上記ＤＮＡマイクロアレイは、多チャンネル化したＤＮＡマイクロアレイであるようにしたものである。
【００４０】
また、本発明のうち請求項１３に記載の発明は、分析の対象である高分子にレーザー光を照射して該高分子をアブレーションすることにより、高分子を構成元素に原子化し、原子化した構成元素をイオン化し、イオン化した構成元素を分析するレーザーアブレーションを用いた高分子の分析システムであって、内部にターゲットを配置可能な真空槽と、上記真空槽内に配置された分析器と、超短パルスレーザー光を出射して上記真空槽内に配置されたターゲットへ照射する超短パルスレーザーとを有するようにしたものである。
【００４４】
また、本発明のうち請求項１４に記載の発明は、本発明のうち請求項１３に記載の発明において、上記分析器は、質量分析器であるようにしたものである。
【００４５】
また、本発明のうち請求項１５に記載の発明は、本発明のうち請求項１４に記載の発明において、上記質量分析器は、四重極質量分析器であるようにしたものである。
【００４６】
また、本発明のうち請求項１６に記載の発明は、本発明のうち請求項１４に記載の発明において、上記質量分析器は、飛行時間質量分析器であるようにしたものである。
【００４８】
また、本発明のうち請求項１７に記載の発明は、本発明のうち請求項１３、１４、１５または１６のいずれか１項に記載の発明において、上記超短パルスレーザーは、パルス時間幅が１０ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１０メガワット以上である短パルスレーザー光を照射するようにしたものである。
【００４９】
また、本発明のうち請求項１８に記載の発明は、本発明のうち請求項１７に記載の発明において、上記超短パルスレーザーは、パルス時間幅が１フェムト秒以上１ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１ギガワット以上１０ギガワット以下である短パルスレーザー光を照射するようにしたものである。
【００５０】
ここで、本発明において超短パルスレーザー光により高分子をアブレーションする際には、高分子に超短パルスレーザー光を１ショット（１パルス）照射すれば十分である。しかしながら、高分子に超短パルスレーザー光を複数ショット（複数パルス）照射してもよく、高分子への照射する超短パルスレーザー光のショット数（パルス数）は適宜に選択すればよい。
【００５１】
また、超短パルスレーザーとは、パルス時間幅が１０ピコ秒以下であることが好ましく、特に、１フェムト秒以上１ピコ秒以下の通常はフェムト秒レーザーと称されるレーザーを用いるのが適当である。その尖頭値出力としては、１０メガワット以上が好ましく、特に、１ギガワット以上１０ギガワット以下が好ましい。
【００５２】
この範囲以上に大きいと多価イオンが生成されて、質量スペクトルの解析が困難となり、これ以下だと原子化・イオン化の効率が低下して、原子イオン信号を観測することができないからである。
【００５３】
なお、後述する発明者による実験によれば、例えば、パルス時間幅が１１０フェムト秒、尖頭値出力２ギガワットの場合には、極めて良好な結果を得ることができた。
【００５４】
また、本発明によれば、原子化と同時にイオン化を効率良く行うことのできるフェムト秒レーザー光などの超短パルスレーザー光を、同位元素で標識した高分子試料に照射するようにしている。このため、標識元素を選択的にイオン化する必要が無くなり、種々様々な標識元素を使用することが可能となる。その上、レーザー照射の繰り返しレートを数ｋＨｚまで上げることが可能であるため、高速解析に適している。
【００５５】
また、本発明では、高分子をアブレーションする短パルスレーザー光と分析の対象である高分子とは、少なくともいずれか一方を移動させることにより、該高分子をアブレーションする短パルスレーザー光により該分析の対象である高分子を遺漏、重複なくアブレーションして分析を行うようにしている。即ち、本発明においては、例えば、短パルスレーザー光のスポットと試料として分析の対象である高分子を塗布した基板との移動により、広い面積にわたって塗布された多数の試料を遺漏・重複することなくアブレーションすることを可能にしている。これは、ＤＮＡマイクロアレイへの応用において、特に有効である。
【００５６】
本発明は、これらの特徴から、解析速度が従来と比較して格段に早くなるばかりか、発現量の極めて少ない遺伝子の発現の同時解析を行うことを可能にするものである。
【００５７】
そして、本発明の具体的な応用例としては、例えば、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析があり、その解析を高速化することが可能となる。即ち、本発明によれば標識として多種類の同位元素を用いることが可能となり、標識として、例えば、安定同位元素を用いれば、標識の種類は多種類の安定同位体の数（２７０種類）にも増やすことができる。これは、従来の標識法である蛍光法（２〜６種類）や放射性同位元素（約１０種類）と比較して、飛躍的に情報量を増やすことができる。
【００５８】
より詳細には、ＤＮＡマイクロアレイ実験で用いる標識として、例えば、周期律表において１族の安定同位体である^３９Ｋ、^４１Ｋなど、周期律表において１６族の安定同位体である^３２Ｓ、^３５Ｓなど、周期律表において１７族の安定同位体である^３５Ｃｌ、^３７Ｃｌ、周期律表において１４族の安定同位体である^１１８Ｓｎ、^１２０Ｓｎなどの安定同位元素を含むヌクレオチドでプローブを標識して使う。
【００５９】
プローブをＤＮＡマイクロアレイ上のターゲット核酸とハイブリダイゼーションさせたのち、超短パルスレーザーでアブレーションし、分子の原子イオン化を行い、その後に、例えば、質量分析器で検出すれば、ハイブリダイゼーションしたプローブ内に含まれていた同位元素の量を定量できる。従って、プローブの量比を計算して求めることができる。
【００６０】
ここで、従来のＤＮＡマイクロアレイ技術においては、蛍光色素でプローブを標識していた。こうした従来の方法では、ハイブリダイゼーション後の検出に、専用検出装置を用いて１０分間程度の時間を要していた。しかしながら、本発明を用いれば、高速化を図ることができる。
【００６１】
また、現在利用されている蛍光色素はわずか２種（Ｃｙ−３，Ｃｙ−５）だけであり、急速な増加は見込めないのが現状である。それに対して、例えば、安定同位元素を使えば、標識の種類を２７０種にも増やすことができる。
【００６２】
また、ＤＮＡマイクロアレイの遺伝子の発現データは、参照用サンプルに対する相対値として得られる。つまり、２種の蛍光ラベルしか利用できない従来のＤＮＡマイクロアレイ実験では、多数の試料のデータを実験間で比較することが難しい。
【００６３】
しかしながら、別々の元素でラベルした３種類以上の複数のプローブを混合し、同時にターゲットとハイブリダイゼーションさせ、本発明によるレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法で計測する多チャンネル化したＤＮＡマイクロアレイを用いると、複数試料間のデータを比較することができる。
【００６４】
このように、本発明によって、多種類の安定同位元素標識による高感度・高速質量分析法を確立することができるものであり、従って、本発明は、蛍光色素や放射性同位元素で標識を行っている全ての研究分野へ応用可能である。
【００６５】
また、本発明によれば、標識元素に放射性同位元素を用いることなく、安定同位元素を用いることができるので、その場合には使用される施設に制限を受けないため、医療施設や民間企業への設置も可能となり、その波及効果は計り知れないものがある。
【００６６】
【発明の実施の形態】
以下、添付の図面を参照しながら、本発明によるレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムの実施の形態の一例を詳細に説明するものとする。
【００６７】
図１には、本発明によるレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法を実施するための高分子の分析システムの一例として、質量分析システムの構成の一例の概念構成説明図が示されている。
【００６８】
この質量分析システム１０は、１０^−８〜１０^−６Ｔｏｒｒの真空度に設定可能な真空槽１２と、この真空槽１２内に配置されたターゲット１４と、真空槽１２内に配置された四重極質量分析器１６と、ターゲット１４を回転する回転導入端子１８と、超短パルスレーザー光を出射してターゲット１４へ照射する超短パルスレーザー２０と、超短パルスレーザー２０から照射された超短パルスレーザー光をターゲット１４上へ集光するフォーカスレンズ２２とを有している。
【００６９】
ここで、超短パルスレーザー２０は、チタンサファイアレーザーにより構成され、以下に示すようなパラメータを備えている。即ち、
ピーク幅（パルス時間幅）：〜１１０ｆｓ（フェムト秒）
出力 ：５０〜４８０μＪ（マイクロジュール）
（尖頭値出力：０．５〜４ＧＷ（ギガワット））
波長 ：〜８００ｎｍ（ナノメートル）
繰り返し ：１ｋＨｚ（キロヘルツ）
である。
【００７０】
なお、四重極質量分析器１６は、超短パルスレーザー２０から出射されてターゲット１４に照射される超短パルスレーザー光の照射方向に対して、９０度垂直方向に設置されている。
【００７１】
また、超短パルスレーザー２０から出射された超短パルスレーザー光を集光するフォーカスレンズ２２の焦点距離は、例えば、２５ｃｍに設定されている。
【００７２】
以上の構成において、上記した質量分析システム１０を用いて実際に質量分析を行った実験結果について説明する。
【００７３】
まず、実験の試料として、図２に示す仕様の２種類のサンプル（サンプル１およびサンプル２）を用いた。そして、この２種類のサンプルを用いてターゲット１４をスピンコート法により作成した。
【００７４】
即ち、まず、一辺が約２ｃｍの略四角形状のシリコン基板を用意し、その上にサンプル１またはサンプル２の濃い溶液をスポイトで滴下する。その後に、１０００回転／秒で９０秒間このシリコン基板を回転する。そうすることで、シリコン基板上に滴下されたサンプル１またはサンプル２の溶液は、広がりながら溶媒を蒸発させて固相化し、表面を平らに保ちながら硬化する。それから、表面にサンプル１またはサンプル２が硬化したシリコン基板を、さらに約１２０度の恒温槽に入れ、３０分〜１時間放置する。
【００７５】
この方法により、均一、かつ、超短パルスレーザー２０から出射された超短パルスレーザー光の１ショットのスポット当たり１０^１３程度の濃度で、１ｃｍφ以上の面積を覆うサンプル１またはサンプル２を形成したターゲット１４を作ることができる。
【００７６】
ここで、基板の材質は半導体である必要はなく、金属や絶縁体であっても良い。超短パルスレーザー光を用いたレーザーアブレーションでは、熱伝導度の高い基板が、より高いイオン検出効率を与える。なお、基板としては固体を用いるものであり、この基板として用いる固体の熱伝導率は０．１Ｗ・ｍ^−１・Ｋ^−１以上であることが好ましい。
【００７７】
上記のようにして作成したターゲット１４を真空槽１２内に装着して、真空槽１２内を真空に引いて、真空槽１２内の真空度が１０^−６Ｔｏｒｒ以下となるように設定する。
【００７８】
次に、超短パルスレーザー２０から出射された超短パルスレーザー光を、フォーカスレンズ２２を用いてターゲット１４上に集光して、ターゲット１４上に形成されたサンプル１またはサンプル２をアブレーションする。
【００７９】
なお、超短パルスレーザー２０から出射される超短パルスレーザー光のパルス幅は１１０フェムト秒であり、出力は５３μＪ、２３０μＪ、４８０μＪに変化させた。
【００８０】
そして、四重極質量分析器１６によって、ターゲット１４への超短パルスレーザー光の照射により発生した一価のイオンの質量を測定する。
【００８１】
図３（ａ）（ｂ）（ｃ）には、上記した手法により、四重極質量分析器１６によって測定されたサンプル１の質量スペクトラムが示されている。
【００８２】
短パルスレーザー光の出力を５３μＪ（図３（ｂ）参照）から２３０μＪ（図３（ａ）参照）にあげることで、一価のイオンとなった^１２Ｃ、^１６Ｏ、^１９Ｆをほぼ構成比に対応した量で検出することができた。
【００８３】
これにより、サンプル１の高分子は、フェムト秒レーザーなどの超短パルスレーザーによるアブレーションにより原子化され、その原子化と同時にイオン化されたことが確認された。
【００８４】
ここで、さらに短パルスレーザー光の出力を４８０μＪにあげると、Ｃの割合が増加し、また、二価のシリコンイオンと思われるピークが顕著に現れてきた（図３（ｃ）参照）。なお、図３（ｃ）の測定に関しては、四重極質量分析器１６の感度を図３（ａ）ならびに図３（ｂ）の測定の場合よりも二桁下げて測定した。
【００８５】
次に、図４には、超短パルスレーザー光の照射によってサンプル１が剥ぎ取られたターゲット１４の状態を示す顕微鏡写真が示されている。図４においては、同心円状に形成された二重円たる内側の白い円とその周りの外側の黒い円とが視認される。この１スポットは、シャッターの開放時間８ｍｓの照射に対応する。つまり、超短パルスレーザー光の約８ショット分のパルスによって剥ぎ取られた言える。
【００８６】
図５は、ターゲット１４に形成された傷の深さと面積とを測定した結果を示している。ここで、深さレベルＢ（Ｌｖ．Ｂ）がシリコン基板の表面と考えられ、深さ８μｍ、幅２２４μｍの円筒内にあったサンプル１と深さ６μｍ、幅４８μｍの円錐内のシリコンとが、８ショット分のパルスで剥ぎ取られたものと認められる。これから、超短パルスレーザー光の１ショットで剥ぎ取られたサンプルの量とシリコンの量とを見積もると、以下の結果となる。
【００８７】
即ち、
超短パルスレーザー光の１ショットで剥ぎ取られたサンプルの量：
（２２４／２）^２π×８×１０^−１２［ｃｍ^３］×１［ｇ／ｃｍ^３］×｛（６．０２×１０^２３）／１１９３｝÷８＝２．０×１０^１３
超短パルスレーザー光の１ショットで剥ぎ取られたシリコンの量：
（４８／２）^２π×６×１０^−１２×（１／３）［ｃｍ^３］×２．３３［ｇ／ｃｍ^３］×｛（６．０２×１０^２３）／２８｝÷８＝２．３×１０^１３
上記したように、サンプル１に関する実験結果から、超短パルスレーザー光（具体的には、パルス時間幅が１１０フェムト秒のフェムト秒レーザー光である。）のアブレーションにより、高分子を原子化・イオン化することが可能であることが実証された。
【００８８】
次に、ラベルのついたＤＮＡサンプルでの実験を行うために、サンプル２として市販のｄＡＴＰを用いて、サンプル１の場合と同様にして実験を行った。
【００８９】
図６には、この実験により得られた質量スペクトラムが示されており、構成元素の^１２Ｃ、^１４Ｎ、^１６Ｏ、^２３Ｎａ、^３１Ｐのピークを観測することができた。
【００９０】
この結果からも、超短パルスレーザー光（具体的には、パルス時間幅が１１０フェムト秒のフェムト秒レーザー光である。）のアブレーションにより、高分子（分子量５００程度）も原子化・イオン化させることができることが確認できた。さらに、Ｐの同位元素をラベルとして用いることも可能であることが言える。
【００９１】
以上のことから、高分子を高密度でシリコン基板上に塗布することにより、有機分子内の構成要素であるＣ、Ｎ、Ｏ、Ｎａ、Ｆ、Ｐなどを超短パルスレーザー光のアブレーションによって原子化・イオン化して検出できることが実証された。ｄＡＴＰ内のＰを検出できたことにより、Ｐの同位元素をラベルとして利用することができる。
【００９２】
次に、以下に示す試料（１６族元素をもつＤＮＡサンプルとして、Ｓ置換ＤＮＡサンプル）をサンプル３として用いるとともに、超短パルスレーザー２０のパルス時間幅を１１０フェムト秒、尖頭値出力を２ＧＷに設定した場合の実験結果について説明する。
【００９３】
サンプル３：２′−Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５′−Ｏ−（１−Ｔｈｉｏｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
化学式：Ｃ_１０Ｈ_１３Ｎ_５Ｏ_１１Ｐ_３ＳＮａ_３・３Ｈ_２Ｏ
このサンプル３の場合にも、サンプル１ならびにサンプル２に関する実験の場合と同様に、質量分析システム１０により高分子の質量分析を行う前に、まず、ターゲット１４として、質量分析の対象となる試料たる高分子（上記したＳ置換ＤＮＡサンプルである。）を溶媒に溶かした溶液をシリコン基板に塗布し、そのシリコン基板を摂氏５０度の恒温槽内に約３０分間放置し、シリコン基板に塗布された溶媒を蒸発させたものを準備する。
【００９４】
上記のようにして表面にサンプル３が硬化したターゲット１４を真空槽１２内に装着して、真空槽１２内を真空に引いて、真空槽１２内の真空度が１０^−６Ｔｏｒｒ以下となるように設定する。
【００９５】
次に、超短パルスレーザー２０から出射された上記したパラメータを備えた超短パルスレーザー光を、フォーカスレンズ２２を用いてターゲット１４上に集光して、ターゲット１４をアブレーションする。
【００９６】
回転導入端子１８によりターゲット１４を回転することにより、ターゲット１４を遺漏・重複なくスポット状にアブレーションする。また、この際に、フォーカスレンズ２２を移動しながらシャッターを開閉することにより、ターゲット１４上をスポット状に遺漏・重複なくアブレーションすることができる。
【００９７】
そして、四重極質量分析器１６によって、ターゲット１４への超短パルスレーザー光の照射により発生した一価のイオンの質量を測定する。
【００９８】
図７には、上記した手法により、四重極質量分析器１６によって測定された試料の質量スペクトラムの一例が示されている。
【００９９】
次に、以下に示す試料（１７族元素をもつＤＮＡサンプルとして、Ｃｌ置換ＤＮＡサンプル）をサンプル４として用いるとともに、超短パルスレーザー２０のパルス時間幅を１１０フェムト秒、尖頭値出力を２ＧＷに設定した場合の実験結果について説明する。
【０１００】
サンプル４：５−Ｃｈｌｏｒｏ−２′−Ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ
化学式：Ｃ_９Ｈ_１１ＣｌＮ_２Ｏ_５
このサンプル４の場合にも、サンプル１ならびにサンプル２に関する実験の場合と同様に、質量分析システム１０により高分子の質量分析を行う前に、まず、ターゲット１４として、質量分析の対象となる試料たる高分子（上記したＣｌ置換ＤＮＡサンプルである。）を溶媒に溶かした溶液をシリコン基板に塗布し、そのシリコン基板を摂氏５０度の恒温槽内に約３０分間放置し、シリコン基板に塗布された溶媒を蒸発させたものを準備する。
【０１０１】
上記のようにして表面にサンプル４が硬化したターゲット１４を真空槽１２内に装着して、真空槽１２内を真空に引いて、真空槽１２内の真空度が１０^−６Ｔｏｒｒ以下となるように設定する。
【０１０２】
次に、超短パルスレーザー２０から出射された上記したパラメータを備えた超短パルスレーザー光を、フォーカスレンズ２２を用いてターゲット１４上に集光して、ターゲット１４をアブレーションする。
【０１０３】
フォーカスレンズ２２を移動しながらシャッターを開閉することにより、ターゲット１４を遺漏・重複なくスポット状にアブレーションする。
【０１０４】
そして、四重極質量分析器１６によって、ターゲット１４への超短パルスレーザー光の照射により発生した一価のイオンの質量を測定する。
【０１０５】
図８には、上記した手法により、四重極質量分析器１６によって測定された試料の質量スペクトラムの一例が示されている。
【０１０６】
なお、本発明によるレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法は、例えば、ＤＮＡ、蛋白質、ＲＮＡ、ＰＮＡ、脂質、糖などの各種の高分子の質量分析に用いることが可能である。
【０１０７】
また、これら各種の高分子に関しては、元素標識を付けたものも解析することができるのは勿論である。
【０１０８】
即ち、超短パルスレーザーにより単数または複数の同位体元素で標識した蛋白、アルブミン、ＤＮＡなどの高分子をアブレーションすることにより、高分子構成元素を完全に原子イオン化し、イオン化した標識元素を質量分析することにより高分子の定量測定を行うことができる。これにより、多種類の同位体元素を標識として使用することができるようになる。従って、質量分析することができる高分子の対象範囲を飛躍的に広げることができるようになる。
【０１０９】
つまり、本発明によって、同位体元素で標識した高分子試料それ自体を原子レベルでイオン化し、標識元素を検出することが可能となるから、質量分析可能な対象範囲を飛躍的に広げることができるようになる。例えば、ＤＮＡの標識として同位体元素を用いることが可能となり、標識の種類をたとえば安定同位体元素の数である２７０にも増やすことができる。これは、従来の標識法である蛍光法（２種類）や放射性同位元素（約１０種類）と比較して、飛躍的に情報量を増やすことができる。
【０１１０】
なお、上記した実施の形態においては、質量分析器として四重極質量分析器を用いるようにしたが、これに限られるものではないことは勿論であり、原子の飛行時間を測定することにより質量分析を行う飛行時間質量分析器を用いた場合には、一回のレーザー照射で複数の原子の質量分析を同時に行うことができる。また、質量分析器としてイオンサイクロトロン型フーリエ変換質量分析器を用いた場合にも、複数の原子の質量分析を同時に行うことが可能となる。
【０１１１】
また、上記した実施の形態においては、高分子の分析方法として質量分析に関して説明したが、これに限られるものではないことは勿論であり、質量分析以外の分析に関して本発明を用いるようにしてもよい。
【０１１２】
また、上記した実施の形態においては、ターゲット１４を移動する移動手段として、ターゲット１４を回転する回転導入端子１８を用いたが、これに限られるものではないことは勿論であり、ターゲット１４を載置可能な移動自在のテーブルなどの適宜の移動手段を用いるようにしてもよい。
【０１１３】
また、上記した実施の形態においては、回転導入端子１８を用いてターゲット１４を回転することにより、ターゲット１４を遺漏・重複なくアブレーションするようにしたが、これに限られるものではないことは勿論であり、超短パルスレーザー光のターゲットへの照射位置を移動する移動手段を設けるようにして、ターゲット１４を遺漏・重複なくアブレーションするようにしてもよい。
【０１１４】
【発明の効果】
本発明は、以上説明したように構成されているので、高分子を構成する構成原子の原子イオンを生成し、生成した原子イオンを分析するようにしたレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法およびそのシステムであって、高分解能の分析装置を要しないようにしたレーザーアブレーションを用いた高分子の質量分析方法およびそのシステムを提供することができるという優れた効果を奏する。ここで、より詳細には、例えば、質量分析を行う場合には、質量スペクトルの解析が困難になる恐れを排除することができるとともに、高分解能の質量分析装置を必要とすることがないという優れた効果を奏する。
【０１１５】
また、本発明は、以上説明したように構成されているので、システム構成を大幅に簡潔化することができるという優れた効果を奏する。
【０１１６】
さらに、本発明は、以上説明したように構成されているので、多種類の標識同位体が混入した状況においても、効率の良い分析を行うことができるようになるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法を実施するための高分子の分析システムの一例たる質量分析システムの構成の一例の概念構成説明図である。
【図２】実験に用いた２種類のサンプル（サンプル１およびサンプル２）の仕様を示す図表である。
【図３】（ａ）（ｂ）（ｃ）は、四重極質量分析器によって測定されたサンプル１の質量スペクトラムである。（ａ）は短パルスレーザー光の出力を２３０μＪとした場合を示し、（ｂ）は短パルスレーザー光の出力を５３μＪとした場合を示し、（ｃ）は短パルスレーザー光の出力を４８０μＪとした場合を示す。なお、（ｃ）の測定に関しては、四重極質量分析器の感度を（ａ）ならびに（ｂ）の測定の場合よりも二桁下げて測定した。
【図４】超短パルスレーザー光の照射によってサンプル１が剥ぎ取られたターゲットの状態を示す顕微鏡写真である。
【図５】ターゲットに形成された傷の深さと面積とを測定した結果を示す説明図である。
【図６】四重極質量分析器によって測定されたサンプル２の質量スペクトラムである。
【図７】四重極質量分析器によって測定されたサンプル３の質量スペクトラムである。
【図８】四重極質量分析器によって測定されたサンプル４の質量スペクトラムである。
【符号の説明】
１０ 質量分析システム
１２ 真空槽
１４ ターゲット
１６ 四重極質量分析器
１８ 回転導入端子
２０ 超短パルスレーザー
２２ フォーカスレンズ

Claims (18)

1. 分析の対象である高分子にレーザー光を照射して該高分子をアブレーションすることにより、高分子を構成元素に原子化し、原子化した構成元素をイオン化し、イオン化した構成元素を分析するレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法であって、
   分析の対象である高分子に照射して、該高分子をアブレーションするレーザー光は超短パルスレーザー光であり、
   該超短パルスレーザー光を分析の対象である高分子に照射して、該高分子をアブレーションすることによって、該高分子を構成元素に原子化すると同時にイオン化し、イオン化した構成元素を分析する
   ものであるレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法。
2. 請求項１に記載のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法において、
   分析の対象である高分子は、固相化されたもの
   であるレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法。
3. 請求項２に記載のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法において、
   高分子の固相化の方法は、基板上に分析の対象である高分子の溶液を滴下して乾燥することにより固相化する過程を含む方法
   であるレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法。
4. 請求項１に記載のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法において、
   分析の対象である高分子は、元素標識を付けたもの
   であるレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法。
5. 請求項４に記載のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法において、
   前記元素標識は、安定同位元素標識である
   レーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法。
6. 請求項１、２、３、４または５のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法において、
   分析の対象である高分子に照射して、該高分子をアブレーションする超短パルスレーザー光は、パルス時間幅が１０ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１０メガワット以上である
   レーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法。
7. 請求項６に記載のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法において、
   分析の対象である高分子に照射して、該高分子をアブレーションする超短パルスレーザー光は、パルス時間幅が１フェムト秒以上１ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１ギガワット以上１０ギガワット以下である
   レーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法。
8. 請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法において、
   前記イオン化した構成元素の分析は、質量分析である
   レーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法。
9. 請求項８に記載のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法において、
   質量分析は、飛行時間法による質量分析
   であるレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法。
10. 請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法において、
    イオン化した複数の構成元素を同時に分析する
    ものであるレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法。
11. 請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のいずれか１項に記載のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法において、
    分析の対象である高分子は、ＤＮＡマイクロアレイに定着された核酸または核酸の類似体である
    レーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法。
12. 請求項１１に記載のレーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法において、
    前記ＤＮＡマイクロアレイは、多チャンネル化したＤＮＡマイクロアレイである
    レーザーアブレーションを用いた高分子の分析方法。
13. 分析の対象である高分子にレーザー光を照射して該高分子をアブレーションすることにより、高分子を構成元素に原子化し、原子化した構成元素をイオン化し、イオン化した構成元素を分析するレーザーアブレーションを用いた高分子の分析システムであって、
    内部にターゲットを配置可能な真空槽と、
    前記真空槽内に配置された分析器と、
    超短パルスレーザー光を出射して前記真空槽内に配置されたターゲットへ照射する超短パルスレーザーと
    を有する高分子の分析システム。
14. 請求項１３に記載の高分子の分析システムにおいて、
    前記分析器は、質量分析器である
    高分子の分析システム。
15. 請求項１４に記載の高分子の分析システムにおいて、
    前記質量分析器は、四重極質量分析器である
    高分子の分析システム。
16. 請求項１４に記載の高分子の分析システムにおいて、
    前記質量分析器は、飛行時間質量分析器である
    高分子の分析システム。
17. 請求項１３、１４、１５または１６のいずれか１項に記載の高分子の分析システムにおいて、
    前記超短パルスレーザーは、パルス時間幅が１０ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１０メガワット以上である短パルスレーザー光を照射する
    高分子の分析システム。
18. 請求項１７に記載の高分子の分析システムにおいて、
    前記超短パルスレーザーは、パルス時間幅が１フェムト秒以上１ピコ秒以下であり、尖頭値出力が１ギガワット以上１０ギガワット以下である短パルスレーザー光を照射する
    高分子の分析システム。

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