JP3649739B2 - 全血分離方法およびデバイス - Google Patents

Description

発明の背景
発明の分野
本発明は、一般的には、全血中に存在する分析物の化学的分析に関し、そしてより詳細には、全血から血漿または血清を分離するための方法およびデバイスに関する。従って、このような化学的分析のための、簡便かつ正確な手段を提供する。
背景の情報
現在、非常に多くの試験デバイスが、特定の分析物の存在または濃度を測定するために、体液の分析について利用され得る。例えば、試験は、全血の分離後、グルコース、フルクトサミン、アルブミン、カルシウム、尿素、尿酸、ビリルビン、コレステロール、および全血または血液の液体部分中に存在する他の可溶性分析物（すなわち、血漿または血清）の検出に利用され得る。
多くのこれらの試験デバイスは、検出される分析物の存在もしくは非存在、または濃度を示すために、色素産生性または他の可視応答を利用する。全血の細胞性物質、特に赤血球は、色素産生性または他の可視試験を実質的に干渉する、深赤色を有する。従って、高度に色づく赤血球、ならびにヘモグロビンおよび白血球細胞を含む血液中に存在する他の干渉物質は、血液サンプルが特定の分析物について分析される前に、血漿または血清から分離される。
通常、血漿または血清は、遠心分離によって、全血の細胞性物質から分離される。細胞性物質は遠心管の底に集まり、そして上清の血漿または血清は移され、そして特定の分析物について試験される。しかし、遠心分離は、時間を消費し、余分な操作工程を含み、そして一般には臨床的実験室の外に存在しない装備が必要とされる。従って、遠心分離への依存は、医者の診療室、または患者の自宅での試験のような実地試験を困難にする。
遠心分離以外の特定の方法が、血漿または血清から全血の細胞性物質を分離するために開発されてきた。いくつかの初期の方法（例えば、Chenの米国特許第4,543,338号に記載される）は、試験試薬を含浸させ、そして半透膜で覆ったキャリア膜の使用を包含する。半透膜は、細胞またはヘモグロビンのような大きな分子を濾過して除去するための手段として有効に働くが、水分を吸収しやすいマトリクスに含浸された試験試薬と次いで接触する、より小さな分子およびイオンを通過させる。しかし、これらの方法は、代表的には、半透膜に残っている細胞性物質を除去するために、試験デバイスを水で洗い流すか、またはふき取るなどの余分な操作工程を必要とする。このような技術は、煩わしくそして面倒であり得る。さらに、赤血球細胞が半透性バリアから十分に除去されないかまたは洗い流されない場合、アッセイに伴う干渉が問題として残る。
別の全血分離法は、Vogelらの米国特許第4,477,575号に記載され、これは規定される平均の直径および密度を有するガラス繊維の層を使用する全血からの血漿または血清の分離を記載する。同様に、Baumgardnerらは、米国特許第5,186,843号で、単一分離層におけるガラス繊維の使用を記載する。しかし、ガラス繊維フィルターを使用する血液分離デバイスは、比較的遅い速度で血清を分離する傾向があり、そしてガラス繊維マトリクスの隙間に、かなりの量の血清または血漿を残す傾向がある。
血液分離の別のアプローチは、凝集試薬または他の分離試薬をマトリクス中に取り込む工程を含む。例えば、Aunetらの米国特許第4,933,092号、Daubneyらの公開されたカナダ特許出願第2,104,976号、およびLimbachの欧州特許出願第0 194 502号は、全て、カチオン性ポリマーのようなポリマー性凝集試薬の使用を記載する。このポリマー凝集試薬は、例えば、DaubneyおよびLimbachにおいては、レクチンのような添加的な凝集試薬と組み合わせられる。同様に、Barkesらは欧州特許出願第0 436 897号で、適切なキャリアマトリクスに組み込まれたレクチンおよびトロンビンの使用を記載する。しかし、これらのタイプの凝集試薬を取り込んだこのようなマトリクスは、ガラス繊維マトリクスに伴う問題と同様の問題を示す。例えば、分離は比較的遅い速度で生じ、そして分離された血漿または血清の量は、マトリクスの吸収容量の50％に制限され、最大の効率および血漿または血清の最大量を得るためには、欧州特許出願第0 194 502号のように、しばしば外部からの圧力の使用を必要とする。
他の分離用薬剤（例えば、水溶性塩、アミノ酸、炭水化物、およびポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどのような大きいポリマー）は、１つのマトリクス試験小板に組み込まれている。Fetterは、米国特許第3,552,925号および同第3,552,928号で、マトリクス上の第１の領域で無機塩またはアミノ酸を含浸した水分を吸収しやすいマトリクスを有する試験デバイス、および隣接する第２の領域で含浸される試験試薬を記載する。この方法で使用された塩またはアミノ酸が全血から細胞性物質を分離し得る一方で、それらはまた血漿または血清中に汚染イオンまたは分子を導入し、そして可溶性の血漿または血清の成分の一部を沈殿させる。従って、可溶性成分についての定量的分析が信頼できないものになる。Rapkinらは、米国特許第4,678,757号で、キャリアに含浸されるかまたはキャリア上でコートされる、好ましくは、不透過性キャリア上でコートされる、マンニトールのような炭水化物の使用を記載する。しかし、記載したデバイスは、透過性または不透過性のキャリアを有していようと有していまいと、血液の毛細管輸送および横方向への輸送を提供するのみである。それゆえ、Rapkinらの血液分離マトリクスは、現在医者または患者に使用されている多くの多層試験デバイスが機能するように、重力の力によって主に機能する試験デバイスにおいて有用であるとは記載されない。Kiserらは、米国特許第5,306,623号で、重力の流れにより機能し得る分離マトリクスを記載する一方で、Kiserらは、ポリエチレングリコール、ポリスチレンスルホン酸、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびポリアクリル酸のような、大きなポリマー性分離試薬を使用している。全血サンプルに適用する際、マトリクスに含まれるこのような大きなポリマーは可溶化され、マトリクスの孔を潜在的にブロックし、そして最も詳細にはサンプルをより粘性にし、それゆえ分離工程を遅くし、そして血漿の産生を減少させる。
これらの方法の短所により、全血から血漿または血清を分離するための迅速で有効な方法を提供するデバイスの必要性が存在する。特に、医者の診察室、または、より好ましくは、自宅で診断アッセイを行い得ることについての、重要性に対する認識が増加し、従って、その必要性が増加する。それゆえ、試験デバイスの洗浄またはふき取り、あるいは外部からの圧力の適用のような任意の余分な操作工程を最少化する必要性が存在する。さらに、信頼性があり、そして干渉物質を含まない、迅速な分離が必要である。本発明は、これらの必要性を満たし、そして同様に関連する利点を提供する。
発明の要旨
本発明は、全血から血漿を分離するための方法およびデバイスに関する。本方法およびデバイスは、赤血球細胞を凝集させ得るポリオールを含む透過性非ガラス繊維マトリクスを使用する。マトリクスは、このようなポリオールの非存在下に限れば、赤血球細胞が浸透する。ポリオール含有マトリクスは、第１の表面および第２の表面を有し、第１の表面に適用された全血サンプルが、第２の表面に向かって流れ得る。全血から分離された血漿は、マトリクスの第２の表面で利用可能になり、そして本発明の多層試験デバイスにより提供されるように、特定の分析物（例えば、グルコースやフルクトサミン）の存在について試験され得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、全血サンプルから血漿を分離し、そしてフルクトサミンの濃度を測定するために使用され得る、多層フルクトサミン試験デバイスの１つの実施態様を示す。
図２は、全血から血漿を分離し、そしてグルコースの濃度を測定するために有用なグルコース試験デバイスの１つの実施態様を例示する。
発明の詳細な説明
診断アッセイを医師の診療室またはより好ましくは自宅で行い得ることの重要性への認識が高まっている。例えば、糖尿病患者の血液グルコースレベルは、食物、活動度、および処置に影響され、所定の１日を通して顕著に変動する。個々の症例の性質および重篤性に依存して、何人かの糖尿病患者が、１日に７回まで血液グルコースレベルを測定する。明らかに、これらの試験の結果は、即時に患者に対し利用可能であるべきである。
所定の１日においてグルコースレベルの変動が頻繁に起こるので、患者の食物、活動度、および／または処置に依存せず、かつ血液グルコースレベルのより長期の指示を提供する試験が開発されてきた。これらの試験は、グリケート化（glycated）タンパク質または「フルクトサミン（frucosamine）」の濃度を測定する。全血、血漿、血清、および他の生物学的液体に存在するタンパク質のようなタンパク質は、非酵素的条件下でグルコースと反応して、グリケート化タンパク質を産生する。反応の程度は、血液のグルコース濃度に直接依存する。血清または血漿のフルクトサミンレベルの測定は、糖尿病の制御をモニターするのに有用である。なぜなら、血清または血漿におけるフルクトサミン濃度は、約半月の期間にわたる、血液グルコースレベルの平均値を反映するからである。
北欧の研究者らは、近年、自己のグリケート化タンパク質試験の結果を認識している医師および患者は、そのような結果を認識していない医師および患者よりも良好な血糖症の制御ができることを示した。さらに、現在グリケート化タンパク質は、網膜症、腎臓障害、神経障害、および心臓血管疾患を包含する、糖尿病に関連する合併症の作因であり得ると考えられている。従って、情報伝達のいかなる遅延（例えば、臨床試験の結果を患者に報告する際の医師の遅延）も、試験結果の価値を減少させる。さらに、このことは、診断アッセイを医師の診察室または自宅で行い得ることの重要性を強調する。
医師の診療室または自宅において有用なアッセイのために、試験はアッセイが行われる条件下の小さい変化に対する感受性が比較的低いべきである。そして、測定は、正確かつ信頼できるものであるべきである。同様に重要なことに、（より重要ではないとしても）、アッセイは、余分の操作工程を含まない単純かつ簡便なプロトコルを有さなければならない。このような試験の単純性および簡便性を増強するために、グルコースおよびフルクトサミンのような分析物を試験するのに好ましい体液は、指または耳たぶの穿刺により簡単に採血され得る全血である。血中の分析物のこのような単純かつ迅速な測定は、特に、緊急の場合に望ましい。
上記のように、このような試験の単純性および正確さは、試験デバイス内に含まれる全血分離層、および汚染されていない血漿または血清を提供するための血液分離マトリクスの能力に大部分依存する。本発明は、このような単純かつ正確な血液分離が可能な方法およびデバイス、すなわち血液分離マトリクスを提供する。特に重要なことは、このマトリクスは、全血に含まれる赤血球を凝集させるポリオールを含有することである。凝集した赤血球は、マトリクス中に保持され得るか、またはフィルター材料により濾過され得る。この方法およびマトリクスは、特定の分析物について全血を分析する種々の試験デバイス（例えば、本発明により提供されるフルクトサミンおよびグルコース試験デバイス）において使用され得る。
本明細書において使用される用語「血漿」は、分離プロセスおよび本発明のデバイスにより赤血球が除去された後に全血サンプルから得られる、実質的に無色の流体を意味する。血漿は、凝固タンパク質フィブリノーゲンを加えた血清であるので、用語「血漿」は、本明細書中で、血漿および血清の両方を包含して広く使用される。
全血から血漿を得るために、本発明は、赤血球を凝集させ得るポリオールを含む、透過性非ガラス繊維マトリクスを提供する。このマトリクスは、このようなポリオールの非存在下で、赤血球を浸透させる。このマトリクスは、サンプル付与のための第１の表面と、血漿が受容されるかまたは利用可能になる、第２の表面を有する。所望であれば、マトリクスは、さらにポリカチオン性ポリマーを含有し得る。赤血球に対して最終的なフィルターとして作用するおよび／またはアッセイに効果的な試薬層を供給する分離マトリクスを支持する透過性フィルター材料または膜もまた、必要ではないが、有用である。本発明のこれらの成分の各々、ならびに本発明の血液分離方法およびマトリクスを用いる試験デバイスが、詳細に開示される。
マトリクス
本発明の分離マトリクスは、ガラス繊維を含まない透過性マトリクスであり、そして、それゆえに「透過性非ガラス繊維マトリクス」と呼ばれる。用語「透過性」は、マトリクスがポリオールの非存在下で供給された場合、血漿に対して透過性である液体透過性、および赤血球に対する透過性または赤血球を浸透させることを意味する。本明細書中で使用される、句「ポリオールの非存在下で、マトリクスが赤血球を浸透させる」は、マトリクス中またはマトリクス上に含まれるポリオールが存在しない場合、赤血球は簡単に、事実上即時にマトリクスを通過することを意味する。ポリオールの非存在下では、赤血球は濾過または別の方法により、マトリクス中に保持されない。
マトリクス内またはマトリクス上に含まれるポリオールは、全血サンプルと化学的に反応して、赤血球を凝集させる。本明細書中で使用される、「凝集する」または「凝集」は、全血のサンプル中に分布している赤血球が、集まって塊または群になることを意味する。いかなる理論または機構にも束縛されることを望まないが、凝集は、膠着、凝固など、あるいはポリオールと赤血球との間のいくつかの他の化学的相互作用の結果であり得る。従って、本発明は、厳密に言えば、濾過プロセス（例えば、Chenの米国特許第4,543,338号に記載のように、マトリクスの孔サイズに基づくか、あるいは例えばVogelらの米国特許第4,477,575号に記載のようなガラス繊維プレフィルターにおいて使用される）ではない。むしろ、それは、赤血球を凝集させることにより血漿を全血から分離する能力を有するマトリクスを提供するポリオールの存在である。
驚くべきことに、ポリオールによる赤血球の凝集は、マトリクスを通る全血サンプルまたは血漿の流れを実質的にブロックしない。従って、十分な量の血漿が、マトリクスの第２の表面で利用可能になる。十分な量の血漿は、本明細書中に例示される特定の適用、すなわち、数滴の全血中のフルクトサミンまたはグルコースの濃度の分析について迅速に得られ得る。本発明は同様に、より多い容量の血液を使用するかまたはより多い血漿を必要とする適用を包含する他の適用および診断アッセイとともに使用され得る。3/16インチ程に小さい直径の円の本発明のポリオール含有マトリクスを用いて、１滴の血液から、10μｌ程の量の血漿を得ることができる。従って、本発明のマトリクスは、１滴の血液よりも大きい容積の血液を分離するのに使用され得る。従って、このマトリクスは、より大量の血液を分析する診断上の適用（例えば、いくつかの公知のコレステロール試験）において使用され得る。
有用な透過性マトリクスは、織布性（woven）または不織布性（non−woven）材料であり得、かつ親水性であってもそうでなくてもよい吸収性または非吸収性の材料であり得る。マトリクスに特に適切である材料には、例えば、織布性または不織布性の、吸収性または非吸収性である、ナイロン、レーヨン、綿、およびポリエステルが挙げられる。本発明の１つの実施態様では、マトリクスは、不織布性非吸収性のポリエステルである。このポリエステルは、好ましくは、Sontara^▲Ｒ▼（DuPont,Inc.、Wilmington、Delaware）として販売される好ましいポリエステルにおいて使用されるような、ポリ（パラフェニレンテレフタレート）である。別の好ましいマトリクスは、織布性吸収性ナイロンであるTetex^▲Ｒ▼３−3710（Tetko,Inc.、Lancaster、NY）である。
マトリクスの多孔性または他の特性に依存して、凝集した赤血球は、マトリクス中に保持されるか、または以下に記載のように、フィルター材料により濾過されるかのいずれかである。不織布性の非吸収性のポリエステルのような、上記のマトリクス材料のいくつかは、従来的な意味での「孔」（すなわち、例えば孔サイズ（ミクロン）で測定され得る孔）を有さない。本発明のポリオールの非存在下では、このような材料は、多孔性の制限を本質的に有さず、かつ５μｍの平均サイズを有する赤血球を浸透させる。このようなマクロ多孔性材料では、ポリオールが存在しない場合、赤血球はほとんど即時にマトリクスを通過する。孔サイズに基づいて特徴づけられ得るこれらのマトリクス材料について、本発明で使用されるマトリクスは、一般に約２μｍ〜約10μｍの孔サイズを有し得る。このような孔サイズは、凝集した赤血球を保持するために有用であり得る。多孔性、厚み（一般に、200〜1100μｍである）、およびマトリクスの他の特性（例えば、吸収性）に依存して、凝集した赤血球はマトリクス中に保持されるか、または下記のような最終フィルター材料に捕獲される。
ポリオール含有マトリクスは、サンプル付与のための第１の表面、および血漿が受容されるか、あるいは試験またはさらなる分離に利用可能になる、第２の表面を有する。一般に、第１および第２の表面は、マトリクスの反対側に提供される。全血サンプルは、このような向きを有する流れを提供する条件（例えば、重力、真空、または外圧）下で、第１の表面から第２の表面に向かって流れる。方法の単純性を増強するために、所望であれば、分離を重力のみによって行い得る。好ましくは、分離マトリクスは、好ましくは重力によって垂直方向の流れを提供する。
Rapkinらは、米国特許第4,678,757号において、キャリア上に含浸させるかまたはコーティングした（好ましくは、不透過性キャリア上にコーティングした）マンニトールのような炭水化物の使用を記載する。しかし、透過性または不透過性のいずれのキャリアを有しても、Rapkinらの記載されたデバイスは、血液の毛細管輸送および横方向の輸送を提供するのみである。全血サンプルとマトリクスとの間の連続的な相互作用を含み得る、遅いプロセスである横方向の流れに対して、比較的短い接触期間である垂直な流れにより提供される、異なる（divergent）接触時間が存在し得る。これらの可変的な接触時間のために、横方向の流れによって作用するものが垂直の流れの下で同様に作用するとは予測できない。予期せぬことに、本発明を用いて、ポリオールの非存在下で赤血球が浸透するマトリクスでさえも、ポリオールを含むマトリクスは、血液サンプルが垂直にマトリクスを通過する場合でさえ、全血から血漿を効果的に分離し得る。
ポリオール
分離方法およびデバイスは、ポリオールを含む透過性非ガラス繊維マトリクスを包含する。本明細書で使用される、用語「ポリオールを含むマトリクス」および「ポリオール含有マトリクス」は、ポリオールが別々にマトリクスに添加され、かつポリオールが最初に組成物中に見出される成分ではないか、またはマトリクス（例えば、セルロース濾紙）を構成するということを意味する。さらに、「ポリオールを含むマトリクス」は、ポリオールがマトリクスに含浸され得るか、あるいはマトリクス中またはマトリクス上にコーティングされ得るか、あるいはマトリクスに共有結合または非共有結合され得ることを意味する。好ましい実施態様では、ポリオールは、マトリクス中に含浸される。
本明細書中で使用される、用語「ポリオール」は、１より多いヒドロキシル基を含むアルキルまたは芳香族である、多価アルコールを意味する。「ポリオール」に使用されるような用語「ポリ」は、アルキルまたは芳香族化合物が、繰り返しモノマー単位からなる大きいポリマーであることを意味するものではなく、代わりに、化合物中に１より多いヒドロキシル基が存在することを示す。以下でより十分に議論されるように、多糖類を除いて、本発明で用いられるポリオールは、単純な糖または糖アルコール、オリゴ糖、あるいは他の天然に存在するかまたは天然に存在しない非ポリマー性アルキルまたは芳香族化合物である。従って、用語「ポリオール」は、糖、本明細書中で「糖アルコール」と呼ばれる糖のアルコール誘導体、および他の天然に存在するかまたは天然に存在しない非ポリマー性ポリオールを包含する。
本明細書中で使用される「糖」は、単糖、オリゴ糖、および多糖を包含する。単糖は、アルデヒド基またはケトン基のいずれかを含む、直線状、分岐状、または環状の多価アルコールのような、単純な糖である。代表的な単糖には、マンノース、グルコース、タロース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、リキソース、リボース、およびフルクトースが挙げられるが、これらに限定されない。オリゴ糖は、グリコシド結合によって結合した２〜10の単糖単位からなる、直線状または分岐状の炭水化物である。本発明で使用され得るオリゴ糖には、スクロース、トレハロース、ラクトース、およびマルトースのような二糖が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用され得る、より大きなオリゴ糖の例には、α−シクロヘキシルアミロース、β−シクロヘプタアミロース、およびγ−シクロオクトアミロースのようなシクロデキストリン、ならびに当該分野で周知の他のオリゴ糖が挙げられる。多糖は、グリコシド結合により互いに結合した10より多い単糖を有する、任意の直線状または分岐状のポリマーである。代表的な多糖には、フィコール（ficoll）、ポリスクロース、およびヒドロキシエチルスターチが挙げられるが、これらに限定されない。
「糖」には、天然に存在する糖、および公知であるが、植物または動物において天然に存在することが未だ同定されていない糖が包含する。例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノコース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、およびＬ−ガラクトースを包含する、５つの公知の天然に存在するアルドヘキソースが存在する。しかし、アルドヘキソース構造は、４つのキラルな炭素を有し、従って、16個の可能な立体異性体（その全てが公知である）を有するが、上記で列挙した５つのみが、植物または動物に天然に存在することが同定されている。従って、「糖」は、糖のＤ体またはＬ体のいずれかのエナンチオマー、およびそれらのラセミ混合物を包含する。
本発明のポリオールはまた、「糖アルコール」でもあり得る。「糖アルコール」は、単糖またはオリゴ糖上のアルデヒドまたはケトン部分の還元により一般に形成される。単糖またはオリゴ糖のアルコール誘導体である。代表的な糖アルコールには、マンニトール、ソルビトール、アラビトール、イノシトール、ガラクチトール、エリトリトール、およびスレイトールが挙げられるが、これらに限定されない。「糖アルコール」の定義の範囲内には、上記の単糖およびオリゴ糖のアルコール誘導体もまた包含される。
糖アルコール中にキラルな炭素が存在する場合、糖アルコールは、Ｄ−スレイトールまたはＬ−スレイトールのようなＤ体またはＬ体であり得るか、またはＤ体およびＬ体の両方のラセミ混合物であり得る。糖アルコールは、天然に存在し得るが、必ずしもそうである必要はない。すなわち、糖アルコールは、公知の天然に存在する糖の誘導体であり得、あるいは、糖アルコールは、存在することが知られているＤまたはＬの立体配置を有し得るが、必ずしも天然に存在するとして同定される必要はない。糖アルコールはまた、還元アルコールの形態で天然に見出され得る糖であり得るか、またはその誘導体が天然に存在することが知られていない、糖のアルコール誘導体であり得る。
糖または糖アルコールに加えて、ポリオールは、非ポリマー性の天然に存在するかまたは天然に存在しないポリオールであり得、このポリオールは、１より多いヒドロキシル基を含む直線状、分岐状、または環状のアルキルまたは芳香族化合物を包含する。本明細書中で使用される、用語「非ポリマー性」は、アルキルまたは芳香族化合物がポリマーではないことを意味する。ポリマーは、開環状、閉環状、直線状、分岐状であるか、または架橋され得る長鎖からなる高分子量の化合物として定義され、その鎖は、同一または異なり得る、モノマーと呼ばれる繰り返し単位からなる。本明細書中で使用される、「天然に存在する」これらのポリオールは、天然に存在するポリオールであり、そして「天然に存在しない」ポリオールは、天然には見出されない。一般に、これらの天然に存在するかまたは天然に存在しないアルキルまたは芳香族化合物は、サイズが３個〜20個の炭素（C₃〜C₂₀）の範囲にあり、そしてより好ましくは、３個〜10個の炭素（C₃〜C₁₀）の範囲にある。このような天然に存在する非ポリマー性のポリオールの例には、グリセロール（多くの脂質中に存在する、３個の炭素のトリヒドロキシアルコール）、およびキナ酸（1,3,4,5−テトラヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸）（この酸は、塩の形態であり得る）が挙げられる。天然に存在しない非ポリマー性のポリオールの例には、ペンタエリトリトールおよびジペンタエリトリトールが挙げられる。
Kiserらは、米国特許第5,306,623号において、ポリエチレングリコール、ポリスチレンスルホン酸、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびポリアクリル酸のような、大きなポリマー性分離試薬の使用を記載する。全血サンプルの付与の際に、マトリクス内に含まれるこのような大きなポリマーは、可溶化され、マトリクスの孔を潜在的にブロックし、そして非常に確実に、サンプルをより粘性にし、それによって分離プロセスを遅くし、かつ血漿の収量を減少させる。従って、上記の多糖を除いて、本発明は、第１の分離剤として、大きなアルキルポリマーの使用を包含しない。米国特許第5,306,623号に記載のマトリクスは同様に、多くの他の局面において、本発明と異なる。例えば、米国特許第5,306,623号で示される実施例は、１μｍ未満の非常に小さい孔サイズを有し、開示されるポリマーの非存在下で赤血球のフィルターとして作用するマトリクスの使用を包含する。上記のように、本発明は、厳密には濾過プロセスではなく、むしろ、赤血球を凝集させ、かつこのような赤血球の非存在下ではマトリクスが赤血球を浸透させるポリオールの使用を包含する。さらに、Kiserらにより教示されるマトリクスはまた、ポリマーに加えて試験試薬を含み、この試薬は実質的に分離および試験の結果に影響を及ぼし得る。本発明の分離マトリクスは、試験試薬を含まない。以下により詳細に開示されるように、試験試薬は、フィルター材料上またはさらなる試験試薬層などの上のいずれかに存在する。
１つの実施態様では、ポリオールをマトリクスに塗布するために、ポリオールは一般に、単独で用いられる場合は約20％の濃度で、そしてポリカチオン性ポリマー（これは、以下により十分に記載するように、一般に約0.5％〜５％の濃度で存在する）と組み合わせる場合は、約10％の濃度で、簡単に水溶液に溶解され得る。所望ならば、低濃度でポリオールを含むマトリクスの複数の層、例えば５％のポリオールを含むマトリクスの４つの層もまた使用され得る。あるいは、ポリオール、および存在するのであれば、ポリカチオン性ポリマーは、生理学的食塩水（0.85％NaCl）、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、有機溶媒などに溶解され得る。
ポリカチオン性ポリマー
ポリオールに加えて、ポリカチオン性ポリマーがマトリクスに添加され得る（しかし、添加される必要はない）。マトリクスへのポリオールの添加と同様に、ポリカチオン性ポリマーもまた、物理的にマトリクスに含浸され得、マトリクスの中またはマトリクス上にコーティングされるか、あるいはマトリクスに共有結合的または非共有結合的に結合され得る。ポリカチオン性ポリマーはまた、赤血球の凝集、ならびに凝集した赤血球の安定化にも有用である。この後者は、例えば、Daubneyらの公開されたカナダ特許出願第2,104,976号に記載される（これは、本明細書中に参考として援用される）。
ポリカチオン性ポリマー成分は、１つより多いカチオン性部位を有する任意のポリマーであり得、そして一般的にアミン基を含有するモノマーに基づく。適切なポリカチオン性ポリマーには、例えば、ヘキサジメトリンブロミド（hexadimethrine bromide）、トリメチレンヘキサメチレンジアンモニウムブロミド、ポリリジン、ポリアリルアミン、ポリアルギニン、ポリ（N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート、N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレートとメチルメタクリレートとのコポリマー、ポリエチレンイミン、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（1,1−ジメチル−3,5−ジメチレンピペリジニウムクロリド）、およびそれらの混合物が含まれる。重合した正に荷電したアミノ酸（例えば、ポリリジン）は、Ｄ型またはＬ型（例えば、ポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｄ−リジン）のいずれかの型のアミノ酸、あるいはそれらのラセミ混合物（例えば、ポリ−D,L−リジン）を有し得る。
上記のように、１つの実施態様において、マトリクスにカチオン性ポリマーを付与するために、ポリマーを溶液（例えば、水、生理食塩水、PBS、有機溶媒など）に溶解し得、次いでマトリクスをポリマーを含有する溶液中に浸す。一般的に、ポリマーは約0.5％〜５％の濃度である。マトリクス中にポリオールとポリマーの両方が含まれる場合、ポリオールおよびポリマーをマトリクス中に添加する順番は無関係である。例えば、ポリオールおよびポリマーは上記のような水性の溶液または溶媒中に、同時にまたは連続的に溶解され得、そして以下の実施例に記載のように、ポリオールおよびポリマーの両方が同時にマトリクスに付与され得る。あるいは、ポリオールおよびポリマーは、任意の順番で連続的にマトリクスに付与され得る。
非溶血性界面活性剤（例えば、Pluronic（Pragmatics,Inc.,Elkhart,IN））が、上記の水性溶液または溶媒に、一般的に0.01％〜0.1％の濃度で添加され得る。このような界面活性剤は、マトリクスへのポリオールの含浸の最大化を助け、それにより、全血サンプルおよび血漿の流速を改善する。流速をさらに増加させ得る他の任意の薬剤としては、例えば、ポリビニルピロリドンまたは類似のポリマー、ならびにマトリクスおよび下記のフィルター材料に剛性を与える他の充填剤が挙げられる。
フィルター
必要ではないが、本発明のマトリクスと組み合わせてフィルター材料が用いられ得る。適切なフィルター材料としては、例えば、ナイロン、セルロースアセテート、ポリスルホン、合成繊維、およびポリカーボネートが挙げられる。フィルターは、膜であり得るが、膜である必要はない。例示的なフィルターおよび膜としては、例えば、BTSポリスルホン膜（Memtek,Inc.,San Diego,CA）、Ahlstrom合成繊維シート（例えば、94−30A（Ahlstrom Filtrarion,Inc.,Mt.Holly Spring,PA））、Biodyne A^▲Ｒ▼ナイロン膜（Pall Corp.,East Hills,NY）、Ultrabind 450（Gelman,Ann Arbor,MI）、およびNucleopore^▲Ｒ▼ポリカーボネート（Costar,Corp.,Cambridge,MA）が挙げられる。
付加的なフィルター材料の必要性は、マトリクスの多孔性、厚さ、吸収性、または他の特性に大部分依存する。例えば、凝集した赤血球は、マトリクスの上記の特性に依存して、マトリクス中に保持され得る。あるいは、またはそれに加えて、最終フィルター材料を用いて、赤血球のさらなる凝集物を捕捉または保持し得る。存在する場合、フィルター材料は、一般的に、約12μｍまでの多孔性を有し得、そして好ましくは、10μｍ未満の孔サイズを有し、そしてより好ましくは、５μｍ以下である。
フィルター材料はポリオール含有分離マトリクスの下に配置され得、それにより、マトリクスを支持し得る。フィルターまたは膜はマトリクスの第２の表面（ここでは血漿が利用可能となる）にあるので、フィルター材料はまた試薬層としても働き得る。フィルター材料は血漿中の分析物の存在を測定するための少なくとも１つの化学試薬を含有し得る。分析物の存在を測定することは、質的測定または量的測定であり得る。
本発明の好ましい実施態様において、血液分離の方法およびデバイスは、マンニトールで含浸された、不織布性、非吸収性のポリエステルマトリクス、およびマトリクスの下のナイロン膜またはポリスルホン膜のいずれかを包含する。好ましくは、マトリクスはさらに、ヘキサジメトリンブロミドを含有する。膜はさらに、全血サンプル中に存在するグルコースのような分析物の濃度を分析するための少なくとも１つの化学試薬を含有し得る。
図２および実施例２に提供される本発明の１つの実施態様において、フィルター膜は全血中のグルコース濃度を測定するための試験試薬を含有する。図２についていえば、本発明のグルコース試験デバイスはポリオール含有血液分離マトリクス15を有し、これは、マスク14およびプラスチック支持部材16により、正しい位置に保持され得る。プラスチック支持部材16の下は、グルコース試験試薬を含有する膜17である。これは、プラスチック支持部材18により正しい位置に保持される。
種々の分析物（例えば、グルコースまたはフルクトサミン）の存在または非存在またはその濃度を決定するための化学試薬は、当該分野で周知である。例えば、グルコースに応答してシグナルを生成するこのような試験試薬としては、代表的には、グルコースオキシダーゼ酵素反応が関与する。グルコースとグルコースオキシダーゼ酵素とは反応して過酸化水素を生成する。ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および酸化還元指示薬（例えば、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、3,3,5,5−テトラメチルベンジジン（TMB）、４−アミノアンチピリン、および当該分野で周知の他の指示薬）は、過酸化水素の存在下で酸化され得、着色生成物を生成する。グルコースの存在および濃度を測定するためのこのような試薬は、例えば、Chenによる欧州特許出願第0388782号およびPhillipsらによる米国特許第5,304,468号に開示される（これらは両方とも、本明細書中に参考として援用される）。
上記のように、必要ではないが、フィルター材料は血液分離プロセスにおいて最終フィルターとして働き得る。別の実施態様において、フィルターは、化学試験試薬の非存在下で提供される。例えば、本発明の別の実施態様についていえば、図１に示すように、膜と組み合わせた、本発明の血液分離マトリクスを含有する多層フルクトサミン試験デバイスを用いて、全血中に存在するフルクトサミンの濃度を測定し得る。ここで図１についていえば、フルクトサミン多層試験デバイス１は血液分離マトリクス４および膜５を有し、膜５の下に試薬層があり、これは、緩衝液層６および指示薬層７、ならびに指示薬層７の試験結果を読み取るための透明なプラスチック窓８を含む。メッシュ層３（これは多層を一緒に圧縮するために用いられる）および分離マトリクス４は保護部品11中に含まれ、そして膜５で密封される。層６、７、および８は、プラスチック支持部材９上にあるウェル13の開口部12中に含まれる。それぞれの層を含む部品11および13は、２と一緒に超音波的に溶接される。
フルクトサミンの存在または濃度を測定するための試験試薬（例えば、適切な緩衝液、および色素産生性色素または蛍光試薬を含む指示薬試薬）は、例えば、米国特許出願番号第08/269,351号（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載のように当該分野で公知である。
フルクトサミン試験の緩衝液層６は一般的に少なくとも９のpH値を有する緩衝液を含む。フルクトサミンがエネアミノール型（eneaminol form）に変換されるに十分高いpHを緩衝液が提供する限り、種々の公知の緩衝液が緩衝液層に含まれ得る。フルクトサミンのエネアミノール型は、フルクトサミンによって還元され得る適切な指示薬と反応する化学的に活性な還元物質である。これを達成するために、緩衝液のpHは約９と約13との間のpH値であるべきであり、そして最適の結果のためには、pHは10と12との間のpH値である。このような緩衝液の例としては、リン酸水素カリウム、リン酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、グアニジウム塩、特定のアミノ酸、および当該分野で周知の他の適切な緩衝液、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
フルクトサミン試験デバイスの指示薬層７は、フルクトサミンによって還元され得る任意の指示薬（例えば、色素産生性色素を含む特定の色素、または蛍光試薬）が含まれる。液体サンプル中に存在するフルクトサミンの量に基づいて色を変化させる適切な色素産生性色素の例として、テトラゾリウム色素（例えば、ネオテトラゾリウムクロリド（NT）、テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド（TNBT）、ブルーテトラゾリウムクロリド（BT）、ヨードニトロテトラゾリウムクロリド、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（NBT）、ニトロブルーモノテトラゾリウムクロリド、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（MTT）、テトラゾリウムバイオレット、2,3,5−トリフェニル−２−Ｈ−テトラゾリウムクロリド、チオカルバミルニトロブルーテトラゾリウムクロリド（TCNBT）、テトラゾリウムXTT（XTT）、２−2'−ベンゾチアゾリル−５−スチリル−３−（4'−フタルヒドラジジル）テトラゾリウムクロリド（BSPT）、ジスチリルニトロブルーテトラゾリウムクロリド（DSNBT））が挙げられる。適切な蛍光試薬の例としては、５−シアノ−2,3−ジトリルテトラゾリウムクロリド（CTC）が挙げられる。
以下の実施例は、本発明を説明することが意図されるが、本発明を限定することは意図されない。
実施例Ｉ
フルクトサミン試験
本実施例は、本発明の全血分離マトリクスを用いる多層フルクトサミン試験デバイスの調製および試験を提供する。赤血球の存在は、通常全血中のフルクトサミンの分析を実質的に干渉するので、本実施例では本発明を用いる全血サンプル中のフルクトサミンについての試験と、血清サンプル中のフルクトサミンについての試験とを比較する。
A.血液分離層
メッシュ：１％Pluronic（Pragmatics,Inc.）の界面活性剤溶液中に、Tetkoメッシュ＃７−280/44（Tetko,Inc.Rueschlikon,Switzerland）を１分間置いた。過剰の界面活性剤を除去し、そしてメッシュを60℃で10分間加熱することによって乾燥させた。メッシュを、使用準備が整うまで、乾燥したプラスチックバッグ中に保存した。使用時に、メッシュの3/16インチサークルをフルクトサミン多層試験デバイス中に配置した。
血液分離マトリクス：生理食塩水（0.85％NaCl）中の10％マンニトールおよび1.25％ヘキサジメトリンブロミドの溶液を、自動含浸／乾燥ユニット（AFM Engineering,Santa Anna,CA）上のSontara^▲Ｒ▼＃8007（DuPont,Inc.）上に含浸させた。乾燥温度は、100℃で約10分間であった。
膜：0.85μｍ孔サイズの未処理BTSポリスルホン酸（Memtek,Inc.）を、血液分離マトリクスの下のさらなるフィルターとして使用するために、3/16インチに切断した。
B.試薬層：
緩衝液層：1M炭酸グアニジニウム緩衝液を含有する水性リン酸ナトリウム（水性NaH₂PO₄）の1M溶液を、水酸化ナトリウム（NaOH）で滴定し、pH11で100mlの溶液を得た。0.5％Surfactant 10G界面活性剤（Pragmatics,Inc.）を添加した後、混合物をWhatman 540濾紙上に含浸させ、そして100℃で10分間乾燥させた。
色素層：200μＭのＮ−エチルメトキシフェナジンエチルスルフェートおよび１％Gantrez^▲Ｒ▼AN 119を含有するニトロブルーテトラゾリウムクロリド（NBT）の10mMメタノール性（methanolic）溶液を、Whatman 54濾紙上に含浸させ、そして60℃で15分間乾燥させた。
層（3/16インチサークル）を、以下のように組み立てた：
Tetkoメッシュ（頂部）
マンニトール含有マトリクス
ポリスルホン膜
緩衝液層
色素層（底部）
層を、射出成形したプラスチック部分によって正しい位置に保持した。同じドナー由来の全血および血清（15μｌ）を、頂部で付与し、そして反応速度を以下のように底部で測定した：
サンプル 開始K/S ΔK/S
（１〜２分）
全血 0.214 0.184
血清 0.201 0.184
この結果は、全血サンプルとの反応速度が血清サンプルとの反応速度と同じであることを示す。これらの結果は、赤血球による干渉がないこと、そしてそれゆえ、本発明の全血分離が全血サンプル中に存在する赤血球を上首尾に除去したことを示す。
実施例II
グルコース試験
この実施例は、本発明の血液分離マトリクスを含有する迅速なグルコース試験の調製および試験を実証する。この実施例は、スパイクした全血サンプル中のグルコースについて試験する。
A.血液分離マトリクス：
10％マンニトールおよび1.25％ヘキサジメトリンブロミドで含浸させた＃8007 Sontara^▲Ｒ▼を、糖アルコールおよびポリマーを水に溶解させた以外は上記の通りに調製した。
B.フィルター膜および化学試薬層：
0.45μm Biodyne A^▲Ｒ▼ナイロン（Pall Corp.）のシートを、以下の試薬を含有する水性溶液中に浸した：
0.30Mクエン酸緩衝液
1.25％ゼラチン150ブルーム（Bloom）
1106U/mlグルコースオキシダーゼ
479U/ml西洋ワサビペルオキシダーゼ
0.43％４−アミノアンチピリン（AAP）
1.52％Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシル−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム塩（TOOS）
0.25％Pluronic L64（ポリ（オキシエチレン−コ−オキシプロピレン））ブロックポリマー
１％Gantrez^▲Ｒ▼L139
浸した後、このシートを20分間50℃で乾燥した。血液分離マトリクスを、試験試薬を含有するナイロン膜の上部に取り付け、そしてその２つを接着剤によって結合させた。４つのグルコースでスパイクした血液サンプルの各々の１滴を、マンニトールを含有するSontara^▲Ｒ▼マトリクスの第１の表面に付与した。結果は以下の通りである：
グルコースレベル K/S
（mg/dl） （45秒で）
98 0.732
180 0.986
297 1.312
450 1.747
これらの結果は、生成された色が、血液サンプル中のグルコース濃度に比例したこと、および直線の用量／応答曲線が正確に得られ、良い性能を示したことを実証する。
本発明は、開示された実施態様を参照して記載されたが、当業者は、詳述された特定の実施例が本発明の例示にすぎないことを容易に認識する。本発明の精神から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ制限される。

Claims (22)

1. 全血サンプルから血漿を分離するための方法であって、
   （ａ）該全血サンプルを、（１）赤血球を凝集させ得るC ₃ −C ₂₀ ポリヒドロキシアルコールと（２）ポリカチオ ン性ポリマーとを含む透過性非ガラス繊維マトリクスで あって、該ポリヒドロキシアルコールの非存在下で赤血 球を浸透させる透過性非ガラス繊維マトリクスの第１の表面に適用する工程と、
   （ｂ）該全血サンプルが該透過性非ガラス繊維マトリクスの両側に位置する第１および第２の側面のうちの第２表面に向かって垂直に流れる条件下で、該全血サンプル を流す工程と、
   ｃ）該全血サンプルから分離された血漿を、該第２の表面で受容する工程と
   を含む、方法。
2. 前記ポリカチオン性ポリマーが、ヘキサジ メチレンブロミドである、請求項１に記載の方法。
3. 前記マトリクスが、透過性フィルター材料により支持される、請求項１に記載の方法。
4. 前記ポリヒドロキシアルコールが、前記マトリクスに含浸される、請求項１に記載の方法。
5. 前記マトリクスが、ポリエステル、ナイロン、レーヨン、および綿からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
6. 前記マトリクスが、不織布性、非吸収性ポリエステルである、請求項１に記載の方法。
7. 前記ポリエステルが、ポリ（パラフェニレンテレフタレート）である、請求項６に記載の方法。
8. 前記マトリクスが、Sontara^▲Ｒ▼である、請求項７に記載の方法。
9. 前記透過性フィルター材料が、血漿中の分析物の存在を決定するための少なくとも１つの化学試薬を含む試薬層である、請求項３に記載の方法。
10. 前記化学試薬が、色の測定を提供する、請求項９に記載の方法。
11. 前記透過性フィルター材料が、ナイロン、セルロースアセテート、ポリスルホン、合成繊維、およびポリカーボネートからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
12. 全血サンプルから血漿を分離するためのデバイスであって、赤血球を凝集させ得るC ₃ −C ₂₀ ポリ ヒドロキシアルコールと（２）ポリカチオン性ポリマー とを含有する透過性非ガラス繊維マトリクスであって、 該ポリヒドロキシアルコールの非存在下で赤血球を浸透 させる透過性非ガラス繊維マトリクスを含み、該透過性 非ガラス繊維マトリクスは該透過性非ガラス繊維マトリ クスの両側に位置する第１の表面および第２の表面をさらに有し、該全血サンプルは該第１の表面から該第２の表面に向かって垂直に流れ、そして、全血サンプルから分離された血漿が該第２の表面で利用可能になる、デバイス。
13. 前記ポリカチオン性ポリマーが、ヘキサ ジメチレンブロミドである、請求項12に記載のデバイス。
14. 前記マトリクスが、透過性フィルター材料により支持される、請求項12に記載のデバイス。
15. 前記ポリヒドロキシアルコールが、マトリクスに含浸される、請求項12に記載のデバイス。
16. 前記マトリクスが、ポリエステル、ナイロン、レーヨン、および綿からなる群より選択される、請求項12に記載のデバイス。
17. 前記マトリクスが、不織布性、非吸収性ポリエステルである、請求項12に記載のデバイス。
18. 前記ポリエステルが、ポリ（パラフェニレンテレフタレート）である、請求項17に記載のデバイス。
19. 前記マトリクスが、Sontara^▲Ｒ▼である、請求項18に記載のデバイス。
20. 前記透過性フィルター材料が、血漿中の分析物の存在を決定するための少なくとも１つの化学試薬を含む試薬層である、請求項14に記載のデバイス。
21. 分析物の存在の測定が、定量的測定である、請求項20に記載のデバイス。
22. 前記透過性フィルター材料が、ナイロン、セルロースアセテート、ポリスルホン、合成繊維、およびポリカーボネートからなる群より選択される、請求項14に記載のデバイス。

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