JP3762779B2

JP3762779B2 - 緑膿菌膜タンパク質由来免疫原性ハイブリッドＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ

Info

Publication number: JP3762779B2
Application number: JP2004363728A
Authority: JP
Inventors: ベルンハルト、クナップ; クラウス−ディーター、フンゲラー; ミヒャエル、ブレッカー; ベルント、ウルリッヒ、フォン、シュペヒト; ホルスト、ドムデイ
Original assignee: カイロンベーリングゲーエムベーハーアンドカンパニー
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 2004-12-15
Publication date: 2006-04-05
Anticipated expiration: 2015-12-18
Also published as: EP0717106B1; JP3712244B2; CA2165401C; US6300102B1; KR960022559A; DE69515613T2; JPH08245699A; ATE190657T1; JP2005097321A; AU4041995A; CA2165401A1; EP0717106A1; US5955090A; DE69515613D1

Description

発明の分野
本発明は、アミノ末端で、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎ
ｏｓａ）外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ又はＯＭＰＦ）のカルボキシ末端部のカル
ボキシ末端に融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉ（ＯｐｒＩ又はＯＭＰＩ）を
含んでなるハイブリッドタンパク質、並びにこのハイブリッドタンパク質のモノ
クローナル又はポリクローナル抗体に関する。ハイブリッドタンパク質並びにハ
イブリッドタンパク質の抗体の両方は、実験動物又はヒトへの緑膿菌の感染を防
止することができる。

背景技術
緑膿菌は、日和見性グラム陰性病原体である。これは、とりわけ熱傷並びに移
植又は癌患者を含む他の免疫日和見患者における院内感染の主要な経路である。
したがって、緑膿菌は、ヒト用薬剤における「問題微生物」とみなされている。

いままで、緑膿菌に対するワクチンの開発に多くの努力がなされてきた。例え
ば、ＥＰ−０２９７２９１では、外膜タンパク質Ｆの完全アミノ酸配列だけでな
く、ＯｐｒＦをコードするヌクレオチド配列も開示されている。ＥＰ−０３５７
０２４では、外膜タンパク質Ｉの完全アミノ酸配列及びさらにはＯｐｒＩをコー
ドするヌクレオチド配列が示されている。さらに、上記両方のタンパク質の場合
、動物又はヒト発端者（ｐｒｏｂａｎｄ）に対して、緑膿菌に対する免疫保護を
付与するのに有用なことがあることが示された。

しかしながら、致死緑膿菌感染に対するワクチン法は、依然として改良が必要
とされている。

驚くべきことに、本発明者等は、ＯｐｒＩがそのＮ末端においてＯｐｒＦのＣ
末端部と連結しているハイブリッドタンパク質が、ＯｐｒＩ若しくはＯｐｒＦを
含んでなる融合タンパク質単独又は後者の融合タンパク質の混合物よりも顕著に
免疫原性があることを見出した。

即ち、本発明は、アミノ末端において、緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキシ
末端部のカルボキシ末端に融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなるハ
イブリッドタンパク質であって、前記カルボキシ末端部が配列番号４のアミノ酸
配列の１〜１６１番配列を含んでなるハイブリッドタンパク質に関する。好まし
い実施態様では、前記カルボキシ末端部の配列が配列番号４のアミノ酸配列の１
〜１５３番の配列である。

さらに、本発明は、アミノ末端において、緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキ
シ末端部のカルボキシ末端に融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなる
ハイブリッドタンパク質であって、前記カルボキシ末端部がＳＥＥ１、ＳＥＥ２
、ＳＥＥ３及びＳＥＥ４からなる群から選択された少なくとも一種の表面露出Ｂ
細胞エピトープを含んでなるハイブリッドタンパク質に関する。これらのＢ細胞
エピトープは、ＯｐｒＦの以下のアミノ酸（ａａ）位置に位置している。ここで
、ＳＥＥ１はａａ２１２〜２４０、ＳＥＥ２はａａ２４３〜２５６、ＳＥＥ３は
ａａ２８５〜２９８及びＳＥＥ４はａａ３３２〜３５０である（アミノ酸の位置
は実施例１及びＨｕｇｈｅｓ等（１９９２）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０
、第３４９７〜３５０３頁参照）。

本発明の別の実施態様では、上記ハイブリッドタンパク質の少なくとも一つを
含んでなるワクチンが提供される。

さらに、本発明は、上記ハイブリッドタンパク質の一つ以上のモノクロ−ナル
又はポリクロ−ナル抗体に関する。これらの抗体は、緑膿菌による感染に対する
受動的防御を被験者に付与するためにワクチンに使用することもできる。

本発明のさらなる態様によれば、上記ハイブリッドタンパク質をコードする核
酸が提供される。

さらに、本発明は、原核細胞又は真核細胞において本発明に係るハイブリッド
タンパク質をコードしている上記核酸を発現させることを含んでなる上記ハイブ
リッドタンパク質の製造法に関する。

本発明を、以下より詳細に説明する。

以下では、微生物源及びＤＮＡ源だけでなく以下の実施例で使用した方法及び
例えば本発明を実施するのに有用とみなされる方法も示す。

アミノ酸配列等
ＯｐｒＦのカルボキシ末端部のアミノ酸配列は配列番号４に記載されている。
上記ＳＥＥ１、ＳＥＥ２、ＳＥＥ３及びＳＥＥ４は、それぞれ、配列番号４のア
ミノ酸配列の２３〜５１番、５４〜６７番、９６〜１０９番、及び１４３〜１６
１番の各配列に対応する。また、後記するＤ１（ａａ１９０〜２１３）は、配列
番号４のアミノ酸配列の１〜２４番の配列に対応する。更にこれらアミノ酸配列
をコードする塩基配列は配列番号３に記載されている。

また、シグナル配列を含まないＯｐｒＩをコードする塩基配列及びそのアミノ
酸配列は配列番号１及び２に記載されている。

微生物
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｎｔｉ
ｇｅｎｉｃＴｙｐｉｎｇＳｃｈｅｍｅセログループＩ（ＡＴＣＣ３３３４８
）を、Ａ．Ｂａｕｅｒｎｆｅｉｎｄ、Ｍａｘ．ｖｏｎＰｅｔｔｅｎｋｏｆｅｒ
−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ、ミュンヘン大学から入手した。バクテリアは、Ｆｉｎｋｅ
，Ｍ．等（１９９０），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５８、第２２４１〜２２
４４頁に記載されているようにして成長させ且つ調製した。組換え体タンパク質
の発現については、大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０ｌａｃｌ^ＱＬ８を使用した。酵
母におけるＯＰＲの発現については、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ株ＨＴ３９３（ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ｐｒａ１，ｐｒｂ１，ｐｒｃ１
，ｐｒｅ１，ｃｐｓ１）を使用した。

ＤＮＡ源
ＤＮＡ源として３種の組換えプラスミドを使用した。

ｐＦＳａｕｌ：アミノ酸位置５７〜３５０のタンパク質のＣ末端をコードして
いる緑膿菌外膜タンパク質Ｆ遺伝子の１．０ｋｂＳａｕ３Ａｌ断片を含んで
いるｐＵＣ１９由来のプラスミド（Ｄｕｃｈｅｎｅ，Ｍ．等（１９８８）、Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０、第１５５〜１６２頁）。

ｐｌＴａｑ１：完全ＯｐｒＩ遺伝子を有する６２６ｂｐＴａｑｌ断片を含むｐ
ＵＣ１９由来プラスミド（Ｄｕｃｈｅｎｅ，Ｍ．等（１９８９）、Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１７１、第４１３０〜４１３７頁）。

ｐＧＥＸ−２ａ：ベクターｐＴＲＣから得たポリリンカーを導入することによ
り変更したベクターｐＧＥＸ−２Ｔ由来の発現ベクター。

ベクターｐＧＥＸ−２ａはｔａｃプロモーターを含み、その後に２６ｋＤａ日
本住血吸虫症（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍ）グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ、トロンビンの開裂部位及びｐＴＲＣ特異的ポリリンカ
ー領域が続いている。

合成ペプチドに対して誘発した抗血清の特徴付け
ＯｐｒＦから得たアミノ酸領域１９０〜２１３（Ｄ１）、２１２〜２４０（Ｄ
２、ＳＥＥ１）、２３９〜２５０（Ｄ３）、２８４〜３１６（Ｄ４）及び３３２
〜３５０（Ｄ５、ＳＥＥ４）を表す合成ペプチドを、Ｒｏｕｓｓｉｌｈｏｎ，Ｃ
．Ｅ．等（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５、第１４９〜１５４頁に
記載のようにして合成した。ウサギを、リンパ節付近の異なる８箇所に、完全フ
ロイントアジュバントにＫＬＨ複合ペプチド２００μｇを添加したもので皮下免
疫し、２週間後、不完全フロイントアジュバントに複合体４００μｇを添加した
もので再免疫した。これらの動物に、最初の免疫から６週間後及び９週間後の２
回、複合体１５０μｇ及び１００μｇを静脈内にブースター注射した。ペプチド
に対する抗体価を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５（ＰＢＳ）に
ペプチドを１ｍｌあたり５ｎｇ添加した溶液を室温で一晩塗布したプレートにつ
いて、ＥＬＩＳＡにより測定した。プレートを、０．０５Ｍクエン酸及び０．０
５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４で３回洗浄した後、シリカゲルで３日間乾燥した。
ウサギ血清を１：１６０に希釈し、大腸菌タンパク質で飽和した。組換えＧＳＴ
融合タンパク質を用いたウエスタンブロッティング解析及び完全な緑膿菌セログ
ループ１１（ＡＴＣＣ３３３５８）に対する免疫螢光測定を、Ｊｏｈｎｓｏｎ，
Ｄ．Ａ．ら（１９８４）ＧｅｎｅＡｎａｌ．Ｔｅｃｈｎ．１、第３〜８頁およ
びＳｃｈｎｏｒｒ，Ｊ．Ｂ．ら（１９９１）、Ｖａｃｃｉｎｅ９、第６７５〜６
８１頁に報告されている方法により実施した。

グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質としてのＯｐｒＦ及び
ＯｐｒＩの発現
ＯｐｒＦ遺伝子の塩基５６８〜５９４番に相当する５´端にＳａｃｌ制限部位
を有するオリゴヌクレオチドｐ１（５´−ＡＡＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＣ
ＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＴＧＣＣＧＡＣ−３´）及び
ＯｐｒＦ遺伝子の塩基１０２８〜１０５３番に相補的な５´端にＨｉｎｄＩＩＩ
制限部位を有するｐ２（５´−ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＣＴＴＧＧＣＴ
ＴＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＧＧ−３´）並びにプラスミドｐＦＳ
ａｕｌ１０ｎｇを用いて、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓＧｅｎ−Ａ
ｍｐＫｉｔによりポリメラーゼ連鎖反応を行って５００ｂｐ断片を得た。増幅
断片をＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクターｐＧＥＸ−２ａに導入し
て、アミノ酸１９０〜３５０のポリンＯｐｒＦのＣ末端をコードするプラスミド
ｐＧＥＸ−ＯｐｒＦを得た。ＯｐｒＩ遺伝子のコード領域の塩基６１〜８７に相
当する５´端のＮｃｏｌ制限部位を有するｐ３（５´−ＣＧＴＡＣＣＡＴＧ
ＧＴＧＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡ
ＧＣＴ−３´）及びＯｐｒＩ遺伝子のコード領域の塩基２３１〜２５５に相補
の５´端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有するｐ４（５´−ＡＡＡＡＡＧＣＴ
ＴＣＴＡＴＴＡＣＴＴＧＣＧＧＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣ−
３´）並びにプラスミドＤＮＡｐｌＴａｑ１１０ｎｇをポリメラーゼ連鎖反
応に使用して２１５ｂｐ断片を増幅した後、制限酵素Ｎｃｏｌ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで処理して、発現ベクターｐＧＥＸ−２ａの対応部位に導入して、ＯｐｒＩの
アミノ酸２１〜８３をコードしているプラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＩを得た。

ＧＳＴ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦ−及びＧＳＴ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブッリド
遺伝子の構築
オリゴヌクレオチドｐ１（上記参照）及びｐ５（５´−ＴＴＣＡＡＣＧＣ
ＧＡＣＧＧＴＴＧＡＴＡＧＣＧＣＧ−３´）（ＯｐｒＦ遺伝子の塩基
１００３〜１０２６に相補）並びにプラスミドｐＦＳａｕ１１０ｎｇを使用し
て４７０ｂｐＯｐｒＦ断片を増幅した。第２ポリメラーゼ連鎖反応を、プラスミ
ドｐｌＴａｑ１１０ｎｇ並びにオリゴヌクレオチドｐ４（上記参照）及びｐ６
（５´−ＧＡＡＧＧＣＣＧＣＧＣＴＡＴＣＡＡＣＣＧＴＣＧＣ
ＧＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣ
ＧＡＡＧＣＴ−３´）（上記ヌクレオチドの１〜３０番はＯｐｒＦ遺伝子の塩
基９９７〜１０２６に相当し、上記ヌクレオチドの３１〜５７番はＯｐｒＩコー
ド領域の塩基６１〜８７に相当する）を用いて実施した。これにより、２４０ｂ
ｐ断片が得られた。

得られたＤＮＡ断片並びにオリゴヌクレオチドｐ１及びｐ４の両方１５０ｎｇ
を用いて、Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．等（１９８９）、Ｇｅｎｅ７７、第６１〜
６８頁に記載されているような第三ポリメラーゼ連鎖反応を行った。得られた６
６０ｂｐ断片を、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し
、ベクターｐＧＥＸ−２ａに導入して、ＯｐｒＦのアミノ酸１９０〜３４２及び
ＯｐｒＩのアミノ酸２１〜８３をコードしているプラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＦ
−ＯｐｒＩを得た。オリゴヌクレオチドｐ３及びＯｐｒＩ遺伝子から得たコード
領域の塩基２２３〜２４９に相補の５´端にＳａｃＩ制限部位を有するｐ７（５
´−ＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴ
ＣＡＧＣＡＴＧＣＧ−３´）及びプラスミドｐｌＴａｑ１１０ｎｇを使
用して２１０ｂｐ断片を増幅し、それを制限酵素ＮｃｏＩ及びＳＡｃＩを用いて
ベクターｐＧＥＸ２ａに導入した。得られたプラスミドを酵素ＳａｃＩ及びＨｉ
ｎｄＩＩＩで消化して、対応の酵素を用いて、プラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＦの
消化により得た４９０ｂｐ断片を導入した。プラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＩ−Ｏ
ｐｒＦは、ＯｐｒＩから得たアミノ酸２１〜８３及びＯｐｒＦから得たアミノ酸
１９０〜３５０をコードしており、これらはＳａｃＩクローニング部位に導入さ
れた２アミノ酸リンカーにより分離されている。

大腸菌における組換えタンパク質の発現及び精製
４種のプラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＦ、ｐＧＥＸ−Ｏｐｒｌ、ｐＧＥＸ−Ｏｐ
ｒＦ−Ｏｐｒｌ及びｐＧＥＸ−Ｏｐｒｌ−ＯｐｒＦを用いて、大腸菌Ｋ−１２株
Ｗ３１１０ｌａｃＩ^ＱＬ８を形質転換した。大規模抗原産生のために、プラスミ
ドを入れた５リットルバクテリア培養をＯＤ_６６０＝１まで成長させ、緑膿菌特
異的組換え抗原の発現を、イソプロピルチオガラクトシドにより誘発させた。細
胞の分裂後、４種の異なるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク
質が水溶液に溶解することが分かった。したがって、４種の融合タンパク質を、
非変性条件下で粗バクテリア溶解産物からアフィニティークロマトグラフィーに
より純度約８０％に精製できた。

活性免疫及び保護実験
４グループ（Ａ〜Ｄ）の６８匹雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０〜１２週齢）の各
々に、抗原：ＧＳＴ（Ａ）、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ＋ＧＳＴ−ＯｐｒＩ（Ｂ）、ＧＳ
Ｔ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ（Ｃ）又はＧＳＴ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦ（Ｄ）１００μ
ｇをアジュバント“ＡＢＭ２ｃｏｍｐｌｅｔｅ”（Ｓｅｂａｋ、Ａｉｄｅｎｂ
ａｃｈ）１００μｌに懸濁したものを０日目に投与した。等量の抗原をＡｌ（Ｏ
Ｈ）_３１００μｌに懸濁したものを、１４日目、２８日目及び４２日目にブー
スター注射した。４９日目に、尾部静脈から放血して血清を採取し、各グループ
からのマウス７〜１０匹のプール血清における抗体価を測定した。４日後、全て
の動物に、免疫抑制処理を施した。免疫抑制のために、マウスに、体重１ｇ当た
りシクロホスファミド（Ｓｅｒｖａ社、ドイツ国ハイデルベルグ）１５０μｇを
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．２５ｍｌを添加したものを、５３日目、５
５日目、５７日目の３回注射した。５８日目に、各抗原グループを、４つのサブ
グル−プＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ（各サブグル−プに１６〜１７匹の動物）に
分けた。グループＡ〜Ｄのマウスには、腹腔内に、５×１０^１（サブグル−プＩ
）、５×１０^２（サブグル−プＩＩ），５×１０^３（サブグル−プＩＩＩ）又は
５×１０^４（サブグル−プＩＶ）ＣＦＵの緑膿菌セログループ１を投与した。１
５匹のさらなる非免疫マウスに、バクテリア抗原投与なしで免疫抑制のみを行っ
た。この対照グループを使用して、白血球減少症の状態の確認及び非特異的感染
の排除を行った。全ての生存動物を、感染後１０日間監視した。

酵母における組換えＯｐｒＦ−ＯｐｒＩの発現及び精製
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける緑膿菌外膜タンパク質の発現のために、酵
母／大腸菌シャトルベクターｐＹｅｐｓｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，Ｃ．等（１９
８７）ＥＭＢＯ．Ｊ．６、第２２９〜２３４頁）を使用した。このプラスミドは
、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓキラートキシンのシグナル配列に
融合したポリペプチドを発現する。

ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブリッドタンパク質をコードするｐＧＥＸ−ＯｐｒＦ
−ＯｐｒＩから得たＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を分離し、ｐＹｅｐｓｅｃ１
にクローニングし、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した（ｐＹｅｐｓｅｃ
１−Ｆ−ｌが得られる）。ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ部位を、結さつ前にクレノー
酵素により平滑末端とし、一方、ＨｉｎｄＩＩＩ部位は処理しなかった。酵母中
で発現させた可溶性ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブリッドタンパク質を、エピトープ
Ｄ１に対するモノクローナル抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーに
より精製した。ＭＡｂを、製造業者の教示にしたがってＢｒＣＮ活性化セファロ
ース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ドイツ国フライブルグ）に連結した。ＰＢＳ
に添加した酵母エキスをカラムにロードし、非特異的結合物質を０．５ＭＮａＣ
ｌを含む０．１ＭグリシンｐＨ９．０緩衝液で溶出させた。ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦ
ハイブリッドタンパク質の溶出を、０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ１１．０で実施
した。カラムを、０．１ＭグリシンンｐＨ２．５で洗浄後ＰＢＳで洗浄すること
により再生した。

特異的免疫グロブリンの産生及び受動免疫
ウサギを、０日目、１４日目及び２８日目に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞
抽出物から分離した精製組換えＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ（又は対照としてＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ単独からの細胞抽出物）１００μｇを不完全フロイントアジュバ
ントに乳化したもので３回免疫した。３８日目に、血液試料を得て、４℃で一晩
凝固させた。血清を除去し、遠心分離し、−２０℃で保存した。３０匹の雌ＳＣ
ＩＤマウス（１８〜２０ｇ、Ｂｏｍｈｏｌｔｇａｒｄ社、デンマーク）のグルー
プでは、このグループの全ての動物に、ウサギ抗ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ血清０．５
ｍｌ又はウサギ抗酵母血清０．５ｍｌを投与した。さらなる対照として、一グル
ープの動物に、通常生理食塩溶液０．５ｍｌを投与した。さらなる一グループの
動物に、緑膿菌のセログループ１の熱不活性化細胞に対するウサギ血清０．５ｍ
ｌを注射した。３時間後、グループ１〜６の動物を、５つのサブグル−プ（ａ〜
ｅ）に分割し、緑膿菌セログループＩ懸濁液（ムチンにそれぞれ１０^１，１０^２
，１０^３，１０^４，１０^５ＣＦＵ／ｍｌ懸濁）を投与した。生存動物を、１週間
観察した。ムチン（Ｓｉｇｍａ社、ドイツ国Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）５ｇを蒸
留水１００ｍｌに懸濁し、ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘブレンダーで１０分間処理
し、ふるいを通過させ、１２０℃で１５分間オートクレーブ処理した。使用直前
に、溶液を無菌１ＮＮａＯＨでｐＨ７．２〜７．４に調整した。

実施例１ＯｐｒＦのエピトープマッピング
Ｏｐｒを主成分とする緑膿菌ワクチンの合理的選択基準としてＢ細胞エピトー
プを表すＯｐｒＦのアミノ酸配列部を同定するために、ＯｐｒＦのアミノ酸５８
〜３５０を表す組換えタンパク質に対するモノクローナル抗体を調製した。ＭＡ
ｂｓの結合を、大腸菌において発現したＯｐｒＦの一連の組換えサブ断片を用い
て分析した。ＭＡｂｓは、次の５つの異なる領域を識別した：ａａ１９０〜２１
３（Ｄ１）、ａａ２１２〜２４０（Ｄ２、ＳＥＥ１）、ａａ２３９〜２５０（Ｄ
３）、ａａ２８４〜３１６（Ｄ４）及びａａ３３２〜３５０（Ｄ５、ＳＥＥ４）
。したがって、ａａ１９０とａａ３５０との間のＯｐｒＦのＣ末端部は、Ｏｐｒ
ＦのＢ細胞エピトープのほとんどをカバーしていると思われた。エピトープをさ
らに分析するために、上記で定義したアミノ酸部に関連した合成ペプチドを調製
し、ＫＬＨに複合化した。これらのペプチドに対するポリクローナル抗血清を、
ウサギにおいて生じさせた。結果は表１に示される通りであった。

表１は、ペプチドＤ１〜Ｄ５が対応のポリクローナル抗血清により認識された
ことを示している。ペプチドＤ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５はモノクローナル抗体と
反応し、ペプチドＤ２、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５も、組換えＯｐｒＦに対して生じさ
せたポリクローナル抗体により認識され、したがって、これらの５エピトープは
Ｂ細胞由来であることが確認された。Ｄ３、Ｄ４及びＤ５に対して生じさせた抗
血清はウエスタンブロット分析においてＯｐｒＦを認識したが、生存緑膿菌細胞
は、Ｄ２及びＤ５に対して生じさせた抗血清とともにインキュベーションした後
のみに陽性蛍光を示した。したがって、これらの２種のエピトープは、表面露出
していると思われる。

合成ペプチドのいずれとも反応しなかったがＧＳＴ−ＯｐｒＦ及びさらには組
換えサブ断片を認識して２つの追加のエピトープＤ６及びＤ７を生じるさらなる
ＭＡｂｓが確認された。これらのエピトープＤ６及びＤ７は、それぞれアミノ酸
残基２４０〜３１６及び１９０〜２５０に相当する。したがって、ＯｐｒＦのア
ミノ酸１９０〜アミノ酸３５０の領域は重要な抗原領域を含むと考えられ、本発
明者等は、これらのエピトープを担持する組換えタンパク質が動物モデルにおけ
る保護を付与することができるかどうかを確認することにした。

実施例２ＯｐｒＩのエピトープマッピング
未変性ＯｐｒＩに対して生じさせたＭＡｂｓ２Ａ１、６Ａ４及び５Ｂ４を用
いて、緑膿菌感染に対して防御能を示し、Ｎ末端に位置したエピトープを認識し
た二種の異なるエピトープを特徴付けした（Ｆｉｎｋｅ，Ｍ．等（１９９１）、
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９、第１２５１〜１２５４頁）。続いて行った研
究によって、もしアミノ酸２１〜アミノ酸８３のアミノ酸配列全体が発現される
ならば、２Ａ１のみが結合することが分かった。したがって、サブユニットワク
チンの手段として組換えＯｐｒＩ抗原を構築するために、完全なアミノ酸領域２
１〜８３が最も適当な抗原であると考えられた。

実施例３大腸菌におけるＯｐｒの発現
緑膿菌感染に対するワクチンにおける緑膿菌の単一外膜タンパク質の効力は、
２種の異なるＯｐｒの融合エピトープの共発現により向上する可能性がある。４
種の異なるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を、大腸菌中
で大量に発現させた：ＧＳＴ−ＯｐｒＦ_{（ａａ１９０−３５０）}、ＧＳＴ−Ｏｐ
ｒＩ_{（ａａ２１−８３）}、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ_{（ａａ１９０−３４２）}−ＯｐｒＩ
_{（ａａ２１−８３）}及びＧＳＴ−ＯｐｒＩ_{（ａａ２１−８３）}−ＯｐｒＦ_（ａａ
_{１９０−３５０）}（図１）。組換えタンパク質を、免疫グルタチオンを用いたア
フィニティークロマトグラフィーにより約８０％に精製できた。ＯｐｒＩ特異的
ＭＡｂ６Ａ４及び２Ａ１並びにエピトープＤ１、Ｄ２、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ５、Ｄ
６及びＤ７に対する異なるＯｐｒＦ特異的ＭＡｂを有する４種の組換え生成物を
ウエスタンブロット解析したところ、ＭＡｂ特異的エピトープが組換え融合タン
パク質により発現されたことが分かった。

実施例４大腸菌由来融合タンパク質による活性免疫
マウスを、２週間間隔で４回、組換えＧＳＴ結合融合タンパク質又はＧＳＴの
みをアジュバント“ＡＢＭｃｏｍｐｌｅｔｅ”に懸濁したもので免疫した。マ
ウス８〜１０匹のプール血清からの各抗体価を、ＥＬＩＳＡだけでなく、緑膿菌
に対する結合活性用ウエスタンブロッティング及びペプチドＤ１〜Ｄ５に対する
ＥＬＩＳＡにより分析した。

図２は、緑膿菌に対する特異的抗体価が、全ての免疫グループにおいて、血清
希釈１：１５６２５以下で得られたことを示している。緑膿菌ポリペプチドを用
いた血清のウエスタンブロット分析により、全ての免疫グループ由来の血清によ
るＯｐｒＩ並びにＯｐｒＦの特異的染色が示された。ＧＳＴ免疫対照グループで
は、ＯｐｒＩ又はＯｐｒＦの染色は観察されなかった。ペプチドＤ１〜Ｄ５に対
する血清のさらなる分析（図３）から、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ−Ｏｐｒｌで免疫され
た動物だけでなくＧＳＴ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦで免疫された動物でも、ペプチド
Ｄ５及びＤ４が優勢であった。外膜融合タンパク質に対して誘発した抗体が緑膿
菌感染からマウスを保護できるかどうかを試験するために、マウスに、免疫抑制
用シクロホスファミドを３回投与した。非免疫対照動物１５匹の末梢血試料にお
いて測定した白血球数は、平均レベル４００／μｌ未満に低下した。１日後、動
物に、５×１０^１、５×１０^２、５×１０^３又は５×１０^４ＣＦＵの緑膿菌セロ
グループ１を抗原投与した。動物の生存を、１週間記録した。図４及び表２に、
４種の異なる抗原投与後の動物の生存率と、プロビット回帰分析により算出した
各ワクチンについてのＬＤ_５０値とを示した。

ＧＳＴのみ又はＧＳＴ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦで免疫したグループについては、
ＬＤ_５０計算値は１．５８及び２．６５と低かった。ＧＳＴ−ＯｐｒＩとＧＳＴ
−ＯｐｒＦとの混合物の同時ワクチン接種では、ＬＤ_５０値が８３．３ＣＦＵに
増加した。しかしながら、この差は、統計的に有意ではないことが分かった。こ
れに対して、ハイブリッドＧＳＴ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩのワクチン接種後では、
ＬＤ_５０の計算値が、１５４０ＣＦＵの方向に大きくシフトした（ｐ≦０．００
１）。ＧＳＴ免疫対照と比較して、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩグループについ
て計算された防御値は９６２であった。これらの結果は、同一に計画した二回目
の実験で確認された（ｐ≦０．００１）。

比例リスクモデルによるデータの解析と、異種のワクチン製剤によりリスク比
の減少計算値を、上記表２に示した。ＧＳＴ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩのワクチン接
種により、リスク比が、ＧＳＴ免疫対照と比較して、０．３まで非常に有意（ｐ
≦０．０００１）に減少した。抗原投与量が５×１０^３ＣＦＵの場合でさえ、Ｇ
ＳＴ、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ＋ＧＳＴ−ＯｐｒＩ、ＧＳＴ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦ免疫
グループ並びに投与１及び２（５×１０^１及び５×１０^２）に対して、リスク比
が０．６９に有意（ｐ≦０．００１９）に減少した。

実施例５酵母におけるＯｐｒＦ−ＯｐｒＩの発現
追加の融合成分のないＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブリッドタンパク質の発現につ
いては、代替宿主としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを
選択し、プラスミドとしてｐＹｅｐｓｅｃ１を選択する。ｐＹｅｐｓｅｃ１−Ｆ
−Ｉ（図１）に含有されているＯｐｒＦ−ＯｐｒＩは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅでは少量でしか発現されなかった。ＯｐｒＩだけでなくＯｐｒＦもペリプラズ
ム空間を介してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅにおいて移出されたので、本
発明者等は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける移出を真似することを試みた。
このために、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブリッドタンパク質を、酵母Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓのキラートキシン（ｋｔ）の分泌シグナル配列に
融合させた。ｐＹｅｐｓｅｃ１−Ｆ−Ｉ（図１）によりコードされているトリパ
ータイトハイブリッドタンパク質ｋｔ．ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩは、ここでは以下の
ポリペプチドストレッチから構成されている：まず酵母分泌シグナル配列の１６
アミノ酸があり、続いてＤＮＡリンカーによりコードされた９アミノ酸があり、
その後アミノ酸１９０〜３４２のＯｐｒＦ特異的ポリペプチドストレッチ及びア
ミノ酸２１〜８３を含むＯｐｒＩペプチドが続いている。ＯｐｒＦ特異的ポリペ
プチドは、可能なグリコシル化部位アスパラギン−Ｘ−トレオニン（表１参照）
を２回担持している。これらのグリコシル化部位は、もし融合タンパク質が分泌
経路に入ったならば認識可能でなければならない。キラートキシンリーダー配列
へ融合すると、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩは、ＵＡＳ_ＧＡＬ／ＣＹＣ１プロモーターの
誘発条件下で発現したとき、酵母細胞抽出物においてウエスタンブロット解析に
より検出されたが、培養ブロスには、分泌抗原は検出されなかった。

酵母において発現したＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ融合タンパク質は、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲルにおいて鮮明なバンドとして移動しなかったが、不均一な分布を
示し、いくつかのスミアバンドに現れた。このことは、Ｎ−グリコシル化による
翻訳後変更を示している。組換え緑膿菌抗原をエンドグリコシダーゼＦとともに
インキュベーションするとより低分子量の鮮明なバンドが現れ、ＯｐｒＦ−Ｏｐ
ｒＩがキラートキシンリーダー配列に融合したときに分泌経路に入ったことと、
２つのグリコシル化可能性部位のうちの少なくとも一つがグリコシル化されたこ
とを示している。

実施例６酵母由来ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩの抗体による受動的免疫
組換えシュードモナス抗原を、酵母細胞抽出物の上清から、エピトープＤ１に
対する抗ＯｐｒＦマウスモノクローナル抗体を用いて、アンモニウム塩析出及び
イムノアフィニティークロマトグラフィーにより濃縮した。次に、ウサギを、抗
原で３回免疫し、動物から血清を採取した。免疫前血清は緑膿菌ＯｐｒＦ又はＯ
ｐｒＩのいずれとも反応性を示さなかったが、免疫ウサギから得た血清は、緑膿
菌の３種の異なるＡＴＣＣ菌株から得た外膜タンパク質ＯｐｒＦ及びＯｐｒＩと
特異的に反応しただけでなく、試験した緑膿菌の３種の異なる臨床分離物とも特
異的に反応した。これらの血清の防御能を、ＳＣＩＤマウスにおいて、緑膿菌の
致死抗原投与に対する防御について試験した。結果は表３に示される通りであっ
た。

表３に示すように、対照抗酵母血清を注射したマウスは、抗原投与量５×１０
^１（表３、グル−プ１）でさえ、感染に対しては防御されなかった。一方、Ｏｐ
ｒＦ−ＯｐｒＩ特異的ウサギ血清を投与したマウスは、５×１０^２ＣＦＵの緑膿
菌の抗原投与に対して十分に防御され（表３、グループ３）、５×１０^３ＣＦＵ
の抗原投与後に４０％の生存が観察された。さらなる対照として、抗原菌株緑膿
菌セログループ１のＬＰＳに対して誘発させたウサギ血清による防御を試験した
。投与量５×１０^３以下で、ＬＰＳ特異的血清で防御された動物の１００％が生
存した（表３、グループ５）。これよりも１０倍高い抗原投与量５×１０^４では
、このグループにおいては生存は観察できなかった。

統計的解析を使用して、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ特異的血清、ＬＰＳ特異的血清及
び抗酵母対照グループの緑膿菌感染に対する防御のための防御投与量を比較した
。その結果、抗酵母血清と比較して、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ血清の効力が８５倍増
加したことが分かった（ｐ≦０．００２、表３、グル−プ３参照）。これに対し
て、ＬＰＳ特異的血清については、効力の計算値が抗酵母血清（ｐ≦０．００１
）よりも３２５倍高かった。

従って、本発明は、以下を提供する：
（１）アミノ末端において、緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部のカルボキ
シ末端と融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなるハイブリッドタンパ
ク質であって、前記カルボキシ末端部が配列番号４のアミノ酸配列の１〜１６１
番の配列を含んでなるハイブリッドタンパク質。
（２）前記カルボキシ末端部の配列が配列番号４のアミノ酸配列の１〜１５３番の配
列である項目１に記載のハイブリッドタンパク質。
（３）アミノ末端において、緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部のカルボキ
シ末端に融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなるハイブリッドタンパ
ク質であって、前記カルボキシ末端部がＳＥＥ１、ＳＥＥ２、ＳＥＥ３及びＳＥ
Ｅ４からなる群から選択された少なくとも一種の表面露出Ｂ細胞エピトープを含
んでなるハイブリッドタンパク質。
（４）項目１〜３いずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質を含んでなるワク
チン。
（５）項目１〜３いずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質に対するモノクロ
−ナル又はポリクロ−ナル抗体。
（６）項目５に記載の抗体を含んでなるワクチン。
（７）項目１〜３いずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質をコードしている
核酸。
（８）項目７に記載の核酸の発現を原核細胞又は真核細胞中で生じさせることを含
んでなる項目１〜３いずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質の製造法。

［配列表］
配列番号：１
配列の長さ：１９２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
起源：
生物名：Pseudomonasaeruginosa
株名：セロタイプ６、ＡＴＣＣ３３３５４
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．１８９
他の情報：配列は、ＯｐｒＩ（シグナル配列を含まない）をコードする。
配列
AGC AGC CAC TCC AAA GAA ACC GAA GCT CGT CTG ACC GCT ACC GAA GAC 48
Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp
1 5 10 15

GCA GCT GCT CGT GCT CAG GCT CGC GCT GAC GAA GCC TAT CGC AAG GCT 96
Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala
20 25 30

GAC GAA GCT CTG GGC GCT GCT CAG AAA GCT CAG CAG ACC GCT GAC GAG 144
Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu
35 40 45

GCT AAC GAG CGT GCC CTG CGC ATG CTG GAA AAA GCC AGC CGC AAG 189
Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys
50 55 60

TAA 192

配列番号：２
配列の長さ：６３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp
1 5 10 15

Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala
20 25 30

Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu
35 40 45

Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys
50 55 60

配列番号：３
配列の長さ：４８６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
起源：
生物名：Pseudomonasaeruginosa
株名：セロタイプ６、ＡＴＣＣ３３３５４
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．４８３
他の情報：配列は、ＯｐｒＦのＣ末端をコードする。
配列
GCT CCG GCT CCG GAA CCG GTT GCC GAC GTT TGC TCC GAC TCC GAC AAC 48
Ala Pro Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp Asn
1 5 10 15

GAC GGC GTC TGC GAC AAC GTC GAC AAG TGC CCG GAC ACC CCG GCC AAC 96
Asp Gly Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala Asn
20 25 30

GTC ACC GTT GAC GCC AAC GGC TGC CCG GCT GTC GCC GAA GTC GTA CGC 144
Val Thr Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val Ala Glu Val Val Arg
35 40 45

GTA CAG CTG GAC GTG AAG TTC GAC TTC GAC AAG TCC AAG GTC AAA GAG 192
Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys Glu
50 55 60
AAC AGC TAC GCT GAC ATC AAG AAC CTG GCC GAC TTC ATG AAG CAG TAC 240
Asn Ser Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln Tyr
65 70 75 80

CCG TCC ACT TCC ACC ACC GTT GAA GGT CAT ACC GAC TCC GTC GGT ACC 288
Pro Ser Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr Asp Ser Val Gly Thr
85 90 95

GAC GCT TAC AAC CAG AAG CTG TCC GAG CGT CGT GCC AAC GCC GTT CGT 336
Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Arg
100 105 110

GAC GTA CTG GTC AAC GAG TAC GGT GTG GAA GGT GGT CGC GTG AAC GCT 384
Asp Val Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly Gly Arg Val Asn Ala
115 120 125

GTC GGT TAC GGC GAG TCC CGC CCG GTT GCC GAC AAC GCC ACC GCT GAA 432
Val Gly Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala Glu
130 135 140

GGC CGC GCT ATC AAC CGT CGC GTT GAA GCC GAA GTA GAA GCC GAA GCC 480
Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ala Glu Val Glu Ala Glu Ala
145 150 155 160

AAG TAA 486
Lys

配列番号：４
配列の長さ：１６１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Ala Pro Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp Asn
1 5 10 15

Asp Gly Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala Asn
20 25 30

Val Thr Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val Ala Glu Val Val Arg
35 40 45

Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys Glu
50 55 60

Asn Ser Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln Tyr
65 70 75 80

Pro Ser Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr Asp Ser Val Gly Thr
85 90 95

Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Arg
100 105 110

Asp Val Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly Gly Arg Val Asn Ala
115 120 125

Val Gly Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala Glu
130 135 140

Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ala Glu Val Glu Ala Glu Ala
145 150 155 160

Lys

配列番号：５
配列の長さ：６４５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
起源：
生物名：Pseudomonasaeruginosa
株名：セロタイプ６、ＡＴＣＣ３３３５４
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．６４２
他の情報：配列は、ＯｐｒＦのＣ末端およびＯｐｒＩ（シグナル配列を含まな
い）をコードする。
配列
GCT CCG GAA CCG GTT GCC GAC GTT TGC TCC GAC TCC GAC AAC GAC GGC 48
Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp Asn Asp Gly
1 5 10 15

GTC TGC GAC AAC GTC GAC AAG TGC CCG GAC ACC CCG GCC AAC GTC ACC 96
Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala Asn Val Thr
20 25 30

GTT GAC GCC AAC GGC TGC CCG GCT GTC GCC GAA GTC GTA CGC GTA CAG 144
Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val Ala Glu Val Val Arg Val Gln
35 40 45

CTG GAC GTG AAG TTC GAC TTC GAC AAG TCC AAG GTC AAA GAG AAC AGC 192
Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys Glu Asn Ser
50 55 60

TAC GCT GAC ATC AAG AAC CTG GCC GAC TTC ATG AAG CAG TAC CCG TCC 240
Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln Tyr Pro Ser
65 70 75 80

ACT TCC ACC ACC GTT GAA GGT CAT ACC GAC TCC GTC GGT ACC GAC GCT 288
Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr Asp Ser Val Gly Thr Asp Ala
85 90 95

TAC AAC CAG AAG CTG TCC GAG CGT CGT GCC AAC GCC GTT CGT GAC GTA 336
Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Arg Asp Val
100 105 110

CTG GTC AAC GA GTAC GGT GTG GAA GGT GGT CGC GTG AAC GCT GTC GGT 384
Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly Gly Arg Val Asn Ala Val Gly
115 120 125

TAC GGC GAG TCC CGC CCG GTT GCC GAC AAC GCC ACC GCT GAA GGC CGC 432
Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala Glu Gly Arg
130 135 140

GCT ATC AAC CGT CGC GTT GAA AGC AGC CAC TCC AAA GAA ACC GAA GCT 480
Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala
145 150 155 160

CGT CTG ACC GCT ACC GAA GAC GCA GCT GCT CGT GCT CAG GCT CGC GCT 528
Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala
165 170 175

GAC GAA GCC TAT CGC AAG GCT GAC GAA GCT CTG GGC GCT GCT CAG AAA 576
Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys
180 185 190

GCT CAG CAG ACC GCT GAC GAG GCT AAC GAG CGT GCC CTG CGC ATG CTG 624
Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu
195 200 205

GAA AAA GCC AGC CGC AAG TAA 645
Glu Lys Ala Ser Arg Lys
210

配列番号：６
配列の長さ：２１４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp Asn Asp Gly
1 5 10 15

Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala Asn Val Thr
20 25 30

Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val Ala Glu Val Val Arg Val Gln
35 40 45

Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys Glu Asn Ser
50 55 60

Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln Tyr Pro Ser
65 70 75 80

Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr Asp Ser Val Gly Thr Asp Ala
85 90 95

Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Arg Asp Val
100 105 110

Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly Gly Arg Val Asn Ala Val Gly
115 120 125

Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala Glu Gly Arg
130 135 140

Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala
145 150 155 160

Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala
165 170 175

Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys
180 185 190

Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu
195 200 205

Glu Lys Ala Ser Arg Lys
210

配列番号：７
配列の長さ：６８１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
起源：
生物名：Pseudomonasaeruginosa
株名：セロタイプ６、ＡＴＣＣ３３３５４
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．６７８
他の情報：配列は、ＯｐｒＩ（シグナル配列を含まない）およびＯｐｒＦのＣ
末端をコードする。
配列
AGC AGC CAC TCC AAA GAA ACC GAA GCT CGT CTG ACC GCT ACC GAA GAC 48
Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp
1 5 10 15

GCA GCT GCT CGT GCT CAG GCT CGC GCT GAC GAA GCC TAT CGC AAG GCT 96
Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala
20 25 30

GAC GAA GCT CTG GGC GCT GCT CAG AAA GCT CAG CAG ACC GCT GAC GAG 144
Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu
35 40 45

GCT AAC GAG CGT GCC CTG CGC ATG CTG GAA AAA GCC AGC CGC AAG GAG 192
Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys Glu
50 55 60

CTC GCT CCG GCT CCG GAA CCG GTT GCC GAC GTT TGC TCC GAC TCC GAC 240
Leu Ala Pro Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp
65 70 75 80

AAC GAC GGC GTC TGC GAC AAC GTC GAC AAG TGC CCG GAC ACC CCG GCC 288
Asn Asp Gly Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala
85 90 95

AAC GTC ACC GTT GAC GCC AAC GGC TGC CCG GCT GTC GCC GAA GTC GTA 336
Asn Val Thr Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val Ala Glu Val Val
100 105 110

CGC GTA CAG CTG GAC GTG AAG TTC GAC TTC GAC AAG TCC AAG GTC AAA 384
Arg Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys
115 120 125

GAG AAC AGC TAC GCT GAC ATC AAG AAC CTG GCC GAC TTC ATG AAG CAG 432
Glu Asn Ser Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln
130 135 140

TAC CCG TCC ACT TCC ACC ACC GTT GAA GGT CAT ACC GAC TCC GTC GGT 480
Tyr Pro Ser Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr Asp Ser Val Gly
145 150 155 160

ACC GAC GCT TAC AAC CAG AAG CTG TCC GAG CGT CGT GCC AAC GCC GTT 528
Thr Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val
165 170 175

CGT GAC GTA CTG GTC AAC GAG TAC GGT GTG GAA GGT GGT CGC GTG AAC 576
Arg Asp Val Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly Gly Arg Val Asn
180 185 190

GCT GTC GGT TAC GGC GAG TCC CGC CCG GTT GCC GAC AAC GCC ACC GCT 624
Ala Val Gly Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala
195 200 205

GAA GGC CGC GCT ATC AAC CGT CGC GTT GAA GCC GAA GTA GAA GCC GAA 672
Glu Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ala Glu Val Glu Ala Glu
210 215 220

GCC AAG TAA 681
Ala Lys
225

配列番号：８
配列の長さ：２２６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp
1 5 10 15

Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala
20 25 30

Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu
35 40 45

Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys Glu
50 55 60

Leu Ala Pro Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp
65 70 75 80

Asn Asp Gly Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala
85 90 95

Asn Val Thr Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val Ala Glu Val Val
100 105 110

Arg Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys
115 120 125

Glu Asn Ser Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln
130 135 140

Tyr Pro Ser Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr Asp Ser Val Gly
145 150 155 160

Thr Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val
165 170 175

Arg Asp Val Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly Gly Arg Val Asn
180 185 190

Ala Val Gly Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala
195 200 205

Glu Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ala Glu Val Glu Ala Glu
210 215 220

Ala Lys
225

緑膿菌の外膜タンパク質の構築組換え融合タンパク質の概略を示した図である。大腸菌Ｋ１２における発現では、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードするベクターｐＧＥＸ−２ａを使用した。表記のＧＳＴ結合組換え外膜タンパク質ワクチン又はＧＳＴ単独で免疫したマウスの血清における緑膿菌に対する抗体価の測定を示した図である。ＥＬＩＳＡ測定は、音波処理緑膿菌セログループ１２を塗布したプレートを用いて実施した。ＯｐｒＦのＢ細胞エピトープを表す表１に示す合成ペプチドＤ１〜Ｄ５に対するＥＬＩＳＡによる抗体測定の結果を示した図である。マウスを、表記の組換え融合タンパク質又はＧＳＴ単独で４回免疫した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを表記ワクチン又はＧＳＴ単独で免疫後、緑膿菌セログループ１の５、５０、５００又は５０００コロニー形成単位を腹腔内抗原投与した後の生存率を示した図である。棒グラフは、抗原投与１回当たりの生存率（ｎ＝１６〜１７）を表す。

Claims

アミノ末端において、緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部のカルボキ
シ末端と融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなるハイブリッドタンパ
ク質であって、前記カルボキシ末端部が配列番号４のアミノ酸配列の１〜１６１
番の配列を含んでなるハイブリッドタンパク質を含んでなるワクチン。