【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−アスパラギン酸の製造方法に関するものである。詳しくは、マレイン酸及び／又は無水マレイン酸を原料とし、酵素作用によりＬ−アスパラギン酸を製造するための工業的に有利なプロセスに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−アスパラギン酸は医薬、食品添加物として需要が増加している。また、新たな用途開発も検討されているが、現在のところ製造コストが高く経済的に優れた工業的プロセスは確立されていない。
Ｌ−アスパラギン酸の製造法としては、フマル酸とアンモニアをアスパルターゼ又はこれを産生する微生物の存在下、酵素反応により得る方法が知られている。
【０００３】
また、マレイン酸とアンモニアをイソメラーゼ又はこれを産生する微生物の存在下異性化しフマル酸を得た後、上記と同様な酵素反応によりＬ−アスパラギン酸を得る方法も知られている。［Ｙ．Ｔａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３０，Ｎｏ．４，３４５〜３５０（１９６６）］
しかしながら、従来法は、酵素反応後のＬ−アスパラギン酸アンモニウムを硫酸又は塩酸により酸析するため、経済的価値の低い無機酸アンモニウム塩を大量に副生し、結果的にＬ−アスパラギン酸の製造コストを高めることとなっていた。
【０００４】
この欠点を改良する方法として、酵素反応後のＬ−アスパラギン酸アンモニウムをマレイン酸又は無水マレイン酸により酸析し、Ｌ−アスパラギン酸結晶を回収した後のマレイン酸アンモニウムを含む母液を原料として利用する方法が提案されている（米国特許第４５６０６５３号明細書、特開平８−３３４９１号公報）。これらの方法は、原料として大量に入手が容易で、しかも安価な無水マレイン酸を用いるので、工業的に非常に望ましい方法となり得る。
【０００５】
しかしながら、上記提案の方法は、マレイン酸アンモニウムの異性化反応に、従来より知られている化学反応又は酵素反応を適応させたものであるので、工業的に安定した連続操作を継続的に行ない、Ｌ−アスパラギン酸を安価にかつ効率的に製造することは未だ困難であった。
【０００６】
特に、酵素反応を用いるケースでは、マレイン酸をフマル酸に異性化する反応とフマル酸をアスパラギン酸に変換する二つの反応を多段にあるいは同時に実施することが必要となり、この場合にイソメラーゼ又はこれを産生する微生物の酵素作用を工業的に満足のいく長時間の連続運転を継続的に維持すると、イソメラーゼ又はこれを産生する微生物の酵素活性が低下する問題のあることが判明した。
【０００７】
また、Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムの晶析に当たり、大量のマレイン酸を添加しないとＬ−アスパラギン酸結晶の回収率を高めることができず、晶析工程で添加するマレイン酸の量が、晶析すべきＬ−アスパラギン酸の量を超える条件となっている。そのため、晶析後のマレイン酸アンモニウムを含む母液を反応系にリサイクル使用すると、次第に、系内のＬ−アスパラギン酸濃度が上昇する問題が生じ、連続運転が困難となる場合が生じ効率的な工業的製法とは言い難かった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マレイン酸及び／又は無水マレイン酸を原料とし、イソメラーゼ又はこれを産生する微生物により水溶媒中でこれを異性化し、次いでアスパルターゼ又はこれを産生する微生物、及びアンモニアの存在下、水溶媒中で酵素反応させてＬ−アスパラギン酸アンモニウムを得て、酵素反応後のＬ−アスパラギン酸アンモニウムをマレイン酸及び／又は無水マレイン酸により酸析し、Ｌ−アスパラギン酸結晶を回収した後のマレイン酸アンモニウムを含む母液を異性化反応工程にリサイクルするＬ−アスパラギン酸の製造方法において、バランスのとれた安定した連続操作が可能なＬ−アスパラギン酸の製造プロセスを提供し、かつ、酵素反応におけるイソメラーゼ又はこれを産生する微生物の酵素作用を低下することなく継続的に維持する新規な方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記実情に鑑み鋭意検討した結果、酵素反応を効率的に行うためには、イソメラーゼ又はこれを産生する微生物を用い、マレイン酸を異性化するに際し、水溶媒中の溶存酸素濃度を４ｐｐｍ以下に維持して反応することにより、イソメラーゼの活性の低下を抑制し安定的に酵素反応を進行させることが可能なことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は、マレイン酸及び／又は無水マレイン酸をイソメラーゼ又はこれを産生する微生物の存在下異性化させる反応、及び、前記異性化反応物の少なくとも一部及びアンモニアをアスパルターゼ又はこれを産生する微生物の存在下水溶媒中で反応させてＬ−アスパラギン酸アンモニウムを生成させる反応、を順次又は同時に実施してＬ−アスパラギン酸を製造する方法において、少なくとも異性化反応における水溶液中の溶存酸素濃度を４ｐｐｍ以下に維持して実施することを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造方法に存する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
（工程▲１▼）
本発明では、マレイン酸及び／又は無水マレイン酸をイソメラーゼ又はこれを産生する微生物の存在下、異性化させたのち、異性化反応物の少なくとも一部及びアンモニアをアスパルターゼ又はこれを産生する微生物の存在下、水溶媒中で反応させてＬ−アスパラギン酸アンモニウムを生成させる。反応は、マレイン酸アンモニウムをフマル酸アンモニウムに異性化した後、これを酵素としてアスパルターゼ又はこれを産生する微生物の存在下、反応処理してアスパラギン酸アンモニウムを生成させる二段反応法、又は、マレイン酸アンモニウムの異性化とアスパラギン酸アンモニウムの生成とを同時に行なう一段反応法のいずれでもよい。
【００１２】
マレイン酸アンモニウムをフマル酸アンモニウムに異性化する反応及びフマル酸アンモニウムをアスパラギン酸アンモニウムに変換する反応は公知であり、本発明はこれらの反応自体は公知法に準じて実施することができる。
【００１３】
本発明に用いられるマレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物としては、本活性を有する微生物であれば特に限定されるものではないが、アルカリゲネス属、シュードモナス属、キサントモナス属、バチルス属に属する微生物が好適に用いられる。特にアルカリゲネス フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＦＯ １２６６９、同ＩＦＯ １３１１１、同ＩＡＭ １４７３、アルカリゲネス ユウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、シュウドモナス フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｌｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ ２３７２８、キサントモナス マルトモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｒｕｔｏｍｏｎａｓｕ）ＡＴＣＣ １３２７０、バチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＭＩ−１０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８０１）、バチルス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＭＩ−１０３（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８０３）等が好適に用いられる。さらに、上記、遺伝子を組換えた遺伝子改変微生物を用いても何等差し支えない。
【００１４】
培養した各菌体は、予め、リン酸緩衝液等の緩衝液（ｐＨ７）等で洗浄した後用いることも出来る。洗浄用のリン酸緩衝液の濃度は０．０５Ｍ〜０．２Ｍ程度が好適に用いられる。菌体はそのまま使用することができるし、必要により、該菌体を超音波破砕等で処理をした菌体破砕物や該破砕物を遠心分離した無細胞抽出液、該無細胞抽出液を硫安分画法、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム等で精製した部分精製酵素、または該菌体や菌体破砕物をアクリルアミドモノマー、アルギン酸等の担体を用いて固定化した固定化物を用いることもできる。菌体を用いる場合、予め菌体を凍結したり、上記緩衝液中にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０等の界面活性剤を０．０１〜０．２重量％添加した液中で、１５〜４０℃の温度で、１０〜１２０分菌体を処理することにより菌体の透過性を高めてから使用する事もできる。
【００１５】
本発明では、マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物またはその処理物をマレイン酸を含有する水溶液中で酵素反応させるに際し、マレイン酸を含有する水溶液中の溶存酸素濃度（以下、ＤＯと略記することがある）を４ｐｐｍ以下、好ましくは１ｐｐｍ以下、さらに好ましくは０．５ｐｐｍ以下に維持して反応させることに特徴を有する。
【００１６】
溶存酸素濃度が高いと、異性化反応を長時間実施すると酵素イソメラーゼの活性が低下し、異性化反応を安定的に継続することが困難となり、イソメラーゼ又はこれを産生する微生物を反応終了後に回収する等により、繰り返しバッチ運転を実施したり、長時間の連続運転を実施することは難しくなる。
【００１７】
本発明において前記水溶液中の酸素濃度を調節する方法としては、通常、前記水溶液中に不活性なガスを流通させる方法、又は、脱酸素剤である亜硫酸塩を前記水溶液に添加する方法などが挙げられる。これらの処理は反応に供する原料水溶液を対象として通常実施されるが、反応系にて実施してもよい。
【００１８】
本発明に用いる反応に不活性なガスとは、酸素を含むガスでなければ特に限定されるものではない。Ａｒ、Ｈｅのようないわゆる希ガス、窒素ガス、炭酸ガス等から選択されるガスでよく、一種のガスか、２種以上のガスを組み合わせてもよい。これらのガスにより処理する方法としては、例えば、マレイン酸水溶液中に上記ガスを連続的又は間歇的に吹き込みながら攪拌する方法が一般的である。また、処理後は引き続きマレイン酸含有水溶液槽内を前記ガスでシールしておくことが好ましい。
【００１９】
本発明に用いる亜硫酸塩とは、亜硫酸の塩であれば良く、例えば亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸カルシウム等の無機亜硫酸塩が好ましいが、マレイン酸イソメラーゼ活性を阻害することが知られる水銀、銅との塩は用いられない。亜硫酸塩を添加する場合の濃度としては、１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ、好ましくは１０ｐｐｍ〜５００ｐｐｍが用いられる。亜硫酸塩の添加位置としては、特に限定されるものではなく、どの工程でも、またどの工程の間へでも構わない。数カ所に分割して添加してもよい。
【００２０】
本発明において、フマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸アンモニウムに変換するには、アスパルターゼあるいはアスパルターゼを産生する微生物の存在下に実施されるが、この方法は公知の方法により行なうことが出来る。アスパルターゼを産生する微生物としては、フマル酸とアンモニアからＬ−アスパラギン酸を生成しうる能力を有する微生物であれば特に制限がなく、例えば、ブレビバクテリウム属、エシェリヒア属、シュードモナス属、バチルス属等の微生物が挙げられる。具体的には、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ ６８７２、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ １１３０３、同ＡＴＣＣ ２７３２５等を例示することが出来る。
【００２１】
異性化反応及びＬ−アスパラギン酸を生成させる反応の原料水溶液濃度は、通常、後述する工程▲３▼から回収されるマレイン酸モノアンモニウム水溶液の濃度により決定される。本発明においては、工程▲１▼における原料水溶液の濃度は、通常、マレイン酸モノアンモニウム換算で、４５〜７００ｇ／ｌ、好ましくは９０〜４５０ｇ／ｌである。
【００２２】
本発明における工程▲１▼の異性化反応及びＬ−アスパラギン酸を生成させる反応は、アンモニア以外のアルカリ剤を併用したｐＨ調整下で実施することもできる。この際の前記反応系内のｐＨはそれぞれ通常、７．５〜１０が好ましく、両反応を同時に同一反応槽で実施しても差し支えない。同時に行なう場合には、各々の性質を持つ菌を併用し、両反応に適した条件を選定して行なうことができる。また、両方の性質を有するものであれば併用の必要は必ずしもない。
【００２３】
アルカリ剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど特に限定されるものではないが、Ｌ−アスパラギン酸を生成させる反応の原料であるアンモニアを使用することが、本発明においては好ましく、異性化反応に対しても何ら悪影響を与えない。アンモニアを単独で使用する場合アンモニアの使用量は原料マレイン酸モノアンモニウムに対して、１．０５〜２．０モル倍であり、好ましくは１．１〜１．６モル倍である。また、上記アルカリ剤をアンモニアと併する場合は、前記反応系内のｐＨ範囲になる量に、アンモニア及びアルカリ剤の量が調節される。
【００２４】
異性化反応及びＬ−アスパラギン酸を生成させる反応の温度は、酵素反応が効率的に行なわれる温度が選定され、通常１０〜８０℃、好ましくは５０〜６０℃である。
【００２５】
酵素反応の反応操作としては、限定されるものではないが、バッチ操作に比べて連続操作がより好ましい。通常、反応方式として菌体を固定化した充填層に原料水溶液を通液する方法、又は、菌体自体又は固定化した菌体を懸濁した反応器中に原料水溶液を供給する一方、反応液を抜き出し、これを分離膜や遠心分離機を用いて菌体を分離し反応器に戻す方法が挙げられる。
【００２６】
Ｌ−アスパラギン酸を生成させる反応で得られる反応液はＬ−アスパラギン酸アンモニウムを主体として含むが、このアンモニウム塩はモノアンモニウム塩とジアンモニウム塩の混合物である。ジアンモニウム塩の割合は通常、１０〜６０％モルである。また、この反応液中には未反応のフマル酸アンモニウム及びマレイン酸アンモニウムを含む場合もあるが、この含有量は５ｇ／ｌ以下、好ましくは２ｇ／ｌ以下、特に１ｇ／ｌ以下に制御することが望ましい。
【００２７】
工程▲１▼の酵素反応した反応液は、常法により菌体を分離した後、次工程に送られる。通常、分離膜や遠心分離機を用いて菌体を分離する。
【００２８】
（工程▲２▼）
上記工程▲１▼で得られた溶液にマレイン酸及び／又は無水マレイン酸を添加して、Ｌ−アスパラギン酸を晶析させる。添加するマレイン酸、無水マレイン酸は、粉末でも、溶融液でも、水溶液でも、またスラリーであってもよい。この二種類の酸を任意の比で混合することも何ら制限をうけるものでない。
【００２９】
工程▲２▼で添加されるマレイン酸及び／又は無水マレイン酸の量は、（マレイン酸＋無水マレイン酸）／Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムのモル比が、０．５〜１．４、好ましくは０．６〜１．３となる様に添加される。このモル比が小さすぎると、晶析回収でのＬ−アスパラギン酸の回収率が充分でなく、リサイクル系内のアスパラギン酸濃度が高くなり、また大きすぎると、添加したマレイン酸および無水マレイン酸が効率的に晶析に利用されない。
【００３０】
晶析温度は通常、０〜９０℃、好ましくは、１０〜８０℃である。あまり低温の場合、得られる結晶が細かくなりすぎ、固液分離操作が面倒となる上、リンス効率も悪化する。すなわち、固液分離で得られる湿ケーキの母液保持量（含水液量）が多くなり、さらに充分なリンス効果が得られないため、結晶純度が低下するか、リンス量を増やしてＬ−アスパラギン酸の回収率を低下させるかの状況になる。一方、あまり高温では、Ｌ−アスパラギン酸の回収率が低いばかりか、マレイン酸の熱劣化が生ずる恐れがあり、好ましくない。
【００３１】
また晶析工程の処理時間は通常０．５〜５時間程度である。
晶析は通常、攪拌槽タイプの晶析槽を用いて実施される。マレイン酸及び／又は無水マレイン酸の添加位置は晶析槽又はこれに通じる工程▲１▼からの移送配管中のいずれでもよい。また、晶析は、工程▲１▼で得られた溶液、又は必要により後述する工程▲４▼で得られた溶液の脱アンモニア後の水溶液と、マレイン酸及び／又は無水マレイン酸とを連続的に供給する一方で、生成スラリーを連続的に抜き出す連続式が望ましいが、一部、間歇的操作もしくは回分式で行なってもよい。
【００３２】
（工程▲３▼）
上記工程▲２▼で得られたスラリーを固液分離し、必要に応じて得られた結晶を水でリンスすることによりＬ−アスパラギン酸結晶を回収する。得られた結晶は、常法により乾燥し純度９９％以上の製品として回収することができる。
【００３３】
固液分離で得られる母液には、マレイン酸モノアンモニウムが含まれ、さらに溶解度分のＬ−アスパラギン酸アンモニウムも含まれている。この母液は上記工程▲１▼にリサイクルされ、工程▲１▼の原料として再使用される。
【００３４】
スラリーの固液分離は、特に限定するものではないが、０〜８０℃の温度範囲、好ましくは、１０〜５０℃で行なう。低温下ではスラリーの粘性が高く取扱いが困難になり、高温下では、Ｌ−アスパラギン酸の溶解度が高くなり、回収率が低下してしまう。必要に応じて行なうリンス操作に用いる水の量は、特に限定するものではないが、湿ケーキに対して５重量倍以下、好ましくは、３重量倍以下で行なう。リンス量が少なすぎるとリンス効果が充分でなく、多すぎるとＬ−アスパラギン酸の回収率が低下する。リンス水の温度についても特に限定されるものではない。
【００３５】
分離操作は、限定されるものではないが、例えばヌッチェ、遠心分離等の常法により行なうことができる。
固液分離で得られる母液は、主にマレイン酸モノアンモニウムが含まれ、ｐＨが３〜６程度の酸性水溶液である。必要に応じて濃縮工程により水を除去し、更にアンモニアを加えて工程▲１▼にリサイクルすることができる。
【００３６】
（工程▲４▼）
本発明の方法においては、工程▲１▼で得た反応液を工程▲２▼の実施の前に蒸留又はストリッピングしてアンモニアの一部を除去することにより、Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムを実質的に、Ｌ−アスパラギン酸モノアンモニウム塩とすることができ、さらに有利なプロセスとなる。工程▲４▼を実施した場合に得られるＬ−アスパラギン酸モノアンモニウム塩の割合は、全体のＬ−アスパラギン酸アンモニウム塩に対して９０モル％以上、好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９８モル％以上、である。
【００３７】
この脱アンモニア処理により、工程▲２▼で用いるマレイン酸又は無水マレイン酸の使用量が抑制でき、バランスのとれた一層長期間の連続運転可能な工業的プロセスが実現するのである。
【００３８】
好ましい態様として工程▲４▼を実施する場合のプロセスにおいて、工程▲４▼で得られた液は、工程▲２▼に送られ酸析に供されるが、その場合のマレイン酸及び／又は無水マレイン酸の添加量は、（マレイン酸＋無水マレイン酸）／Ｌ−アスパラギン酸モノアンモニウムのモル比で、０．５〜１．１、好ましくは０．６〜１．０である。このモル比が小さすぎると、晶析回収でのＬ−アスパラギン酸の回収率が充分でなく、リサイクル系内のアスパラギン酸濃度が高くなり効率的でなく、また大きすぎると、添加したマレイン酸および無水マレイン酸が効率的に晶析に利用されない。
【００３９】
工程▲４▼を実施する場合のプロセスにおける工程▲２▼の他の晶析条件については、前記工程▲２▼に記載した方法によればよい。
蒸留操作又はストリッピング操作（以下、アンモニア除去操作ということがある）は、常圧下でも減圧下でもよく、３０〜１００℃の範囲で、好ましくは、４０〜８０℃で行なうことができる。低温下でアンモニア除去操作を行なうには、減圧度を高めなくてはならず操作上の制約が大きくなる。
【００４０】
一方、高温下では、液組成の熱劣化を招くので好ましくない。本発明の方法における全工程のうち、最も高温で処理することにもなり得る本工程の温度条件、特に上限温度については、この観点から上記の様に規定されるべきである。アンモニア蒸留塔の形式は通常の棚段塔又は充填塔が使用できる。
【００４１】
工程▲１▼の酵素反応により得られたＬ−アスパラギン酸アンモニウム水溶液を、上記の方法でアンモニア除去操作することにより、蒸留釜にはＬ−アスパラギン酸に対するアンモニアのモル比が約１．０の、即ち、Ｌ−アスパラギン酸モノアンモニウム、を含む残液を得ることができる。
【００４２】
アンモニア除去操作で蒸気として分離されるのは、アンモニアおよび水のみであり、冷却管等を用いてこの蒸気を液として回収すれば、アンモニア水が得られる。この得られるアンモニア水の濃度は、アンモニア除去操作の温度、圧力および蒸気回収温度等に影響される。
【００４３】
上記操作後の水溶液は工程▲２▼に送り、Ｌ−アスパラギン酸結晶を回収するが、晶析工程に供給する水溶液中のＬ−アスパラギン酸アンモニウム濃度は通常、５０〜８００ｇ／ｌ、好ましくは１００〜５００ｇ／ｌである。この濃度があまり低いと結晶回収率が低くなり、逆にあまり高いと回収スラリーの濃度が高くなりすぎ操作上好ましくない。
【００４４】
工程▲４▼のアンモニア除去操作で蒸気として分離し、冷却管等で回収されたアンモニア水は、上記の工程▲３▼あるいは工程▲１▼に必要に応じて再使用される。この場合の供給温度は、特に限定されないが、それぞれの工程の反応又は操作温度を考慮して５〜８０℃、好ましくは、１０〜５０℃が採用できる。高温下では、アンモニアの蒸気圧が高くなり好ましくない。また、反応温度より低温で供給しても何ら問題ない。
【００４５】
リサイクルするアンモニアを供給する方法は、特に限定するものではないが、工程▲１▼の異性化反応及びＬ−アスパラギン酸を生成する酵素反応の二つの反応に適当に分配しても、またいずれかの反応に一括して供給しても何ら問題にならない。また、異性化反応とＬ−アスパラギン酸を生成する酵素反応を同一反応器内で行なう場合、工程▲３▼で分離された母液に供給してもよい。
【００４６】
（ブリード）
本発明のＬ−アスパラギン酸の製造方法では、リサイクルの工程を含むため不純物や反応副生成物の蓄積を考慮して、必要に応じてブリードを行なうことが可能である。
【００４７】
ブリードする位置としては、特に限定するものではなく各工程後のいずれの位置からブリードしてもよい。また、複数の箇所においてブリードすることも可能である。中でも工程▲１▼で得た釜残水溶液から、即ち、工程▲１▼と工程▲２▼の間、又は工程▲１▼と工程▲４▼の間から、ブリードするのが好ましい。
【００４８】
ブリード量は、通常、釜残水溶液の容量ベースで１〜２０％、好ましくは３〜１７％である。ブリード率が低いとその効果が小さく意味がなく、高ければ主工程と同じ程度の機器容積をブリード系がもつことになり、経済的に不利なプロセスを与える。ブリードする方法は、このブリード率を満足する範囲において連続的であっても、また、間歇的であっても良い。
【００４９】
ブリード液からＬ−アスパラギン酸を結晶として回収するのが好ましく、その方法としては、通常、硫酸又は塩酸等の無機酸を添加して行なうのが好ましい。無機酸の添加量はアスパラギン酸アンモニウムに対して当量以上である。すなわち、Ｌ−アスパラギン酸の等電点２．８になるようにブリード液に無機酸を加えるのが回収率を向上させるために望ましい。
【００５０】
上述のブリード液の処理により、含有されるＬ−アスパラギン酸アンモニウムは損失することなく回収でき、しかも、系内に蓄積する不純物はブリードによりパージされるので好ましい結果を与える。本発明は、工程▲１▼〜▲３▼のメインライン及び好ましくは工程▲４▼の脱アンモニウム工程からのアンモニア回収、また好ましくはブリード液処理工程、の各工程を連結することにより、バランスのとれた安定して連続運転可能な工業的に有利なプロセスを提供することができ、かつ高純度のＬ−アスパラギン酸の製造を可能とするものである。
【００５１】
また、本発明は上記▲１▼〜▲３▼の各工程の処理操作を逐次実施するが、▲１▼〜▲３▼の各工程は回分法でも、連続法でもよい。例えば、全工程を回分法で実施する場合でも、本発明によれば、繰り返し反応を行なっても、各工程とも同一処理量で同一条件にて操作することが可能である。
もちろん、全工程を連続法で実施する場合には、バランスのとれた安定したプロセスとなるのである。
【００５２】
【実施例】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、実施例の記述に限定されるものではない。
尚、Ｌ−アスパラギン酸（以下、ＡＳＰと略記する）、マレイン酸（以下、ＭＡと略記する）およびフマル酸（以下、ＦＡと略記する）の分析は高速液体クロマトグラフィーにより、ＡＳＰ結晶中のアンモニア（以下、ＮＨ3 と略記する）含量の分析はイオンクロマトグラフィーにより定量した。
【００５３】
［参考例］酵素の調整
（１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養
肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ、ＮａＣｌ：５ｇ、マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、アルカリゲネス フェカリス ＩＦＯ １２６６９菌株を植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。
【００５４】
また、上記と同様の培地１０００ｍｌを容量３Ｌのジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液３０ｍｌを接種し、これを３０℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌した菌体を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、以下の反応に供試した。
【００５５】
（２）フマル酸よりアスパラギン酸生成能を有する微生物の培養
尿素：４ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ：１４ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ：０．５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：２０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・ｎＨ2 Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）の培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブレビバクテリウム フラバム ＡＢ−４１菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）を植菌し、３３℃にて２４時間振とう培養した。
【００５６】
また、上記と同様の培地１０００ｍｌを容量２Ｌのジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液２０ｍｌと滅菌済み５０％グルコース水溶液２００ｍｌを加え、これを３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌した。本菌体は、夾雑するリンゴ酸副生活性を以下の方法で除いた。すなわち、アスパラギン酸：１００ｇ、アンモニア：１８０ｍｌ、塩化カルシウム：２．２ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０：０．８ｇ（水で全量１Ｌとする）よりなる組成液に集菌体を懸濁し、４５℃、３時間振とうし、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して菌体を回収した。
【００５７】
［実施例１］酵素反応
（１）予め窒素ガスを３０分吹き込みながら攪拌し、窒素置換した反応液〈マレイン酸１５０ｇ、２５％アンモニア水２２０ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〉を容量３Ｌのジャーファーメンターに移し、上記で回収した両菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルターゼ菌１２０ｇ）を添加し、窒素ガスを０．０２ｖｖｍの速度で供給して槽内を窒素ガスでシールし、反応中、溶存酸素濃度を０．５ｐｐｍ以下に維持した。
３０℃で４８時間反応させたところ、反応液中にＬ−アスパラギン酸は、１６９ｇ／ｌ得られた。
【００５８】
（２）予め窒素ガスを３０分吹き込みながら攪拌し、窒素置換した反応液〈マレイン酸１５０ｇ、２５％アンモニア水２２０ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〉を密閉された容量３Ｌのジャーファーメンターに移し、溶存酸素濃度が安定になったところで上記で回収した菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルターゼ菌１２０ｇ）を添加した。反応中、溶存酸素濃度はおよそ３ｐｐｍ以下に維持された。
３０℃で４８時間反応させたところ、反応液中にＬ−アスパラギン酸は、１３６ｇ／ｌ得られた。
【００５９】
（３）反応液〈マレイン酸１５０ｇ、２５％アンモニア水２２０ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〉に０．２ｇ／ｌの亜硫酸ソーダを加え、密閉された容量３Ｌのジャーファーメンターに移し、溶存酸素濃度が安定になったところで上記で回収した菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルターゼ菌１２０ｇ）を添加した。反応中、溶存酸素濃度はおよそ３ｐｐｍ以下に維持された。
３０℃で４８時間反応させたところ、反応液中にＬ−アスパラギン酸は、１３３ｇ／ｌ得られた。
【００６０】
［比較例１］酵素反応
溶存酸素低下処理を行わなかった反応液〈マレイン酸１５０ｇ、２５％アンモニア水２２０ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〉を容量３Ｌのジャーファーメンターに移し、上記で回収した菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルターゼ菌１２０ｇ）を添加し、反応中も特に溶存酸素低下処理を行わなかった。反応中、溶存酸素濃度はおよそ７ｐｐｍであった。
３０℃で４８時間反応させたところ、反応液中にＬ−アスパラギン酸は、１０１ｇ／ｌ得られた。
【００６１】
［実施例２］リサイクル操作
（Ａ）実施例１（１）と同様にして得られた酵素反応液を溶存酸素濃度の上昇がないように窒素ガスでシールしたまま、限外ろ過膜（旭化成社製−ＡＣＶ−３０５０）を用い、菌体を除去した。菌体の濃縮液は、窒素ガスシールの容器に移し、４℃で冷蔵保存した。
【００６２】
一方、得られた反応濾液１Ｌを容量２Ｌのナス型フラスコに仕込み、ラボ用エバポレーターを用いて、８０℃、３８０ｍｍＨｇの条件下、アンモニアを蒸留分離した。得られる蒸気の回収を目的に、５０ｗｔ％エチレングリコールの冷却水が０℃で循環する冷却管をとりつけた。１５分後、常圧に戻して、アンモニア除去操作を終了した。
【００６３】
蒸留釜の残液は、ＡＳＰが２０７ｇ／ｌ、ＮＨ3 が２６．５ｇ／ｌの組成で、８２５ｍｌの容量であった。この残液に蒸留水を加えて、ＡＳＰが２００ｇ／ｌ、ＮＨ3 が２５．９ｇ／ｌの組成（ＮＨ3 ／ＡＳＰモル比は１．０、すなわち、全てがＡＳＰモノアンモニウム塩）で８５０ｍｌの釜残液を作成した。
冷却管で得られた回収液は、ＮＨ3 が２７ｇ／ｌのアンモニア水１８５ｍｌであった。
【００６４】
（Ｂ）上記（Ａ）で得られたＡＳＰモノアンモニウム水溶液 ８５０ｍｌを容量１０００ｍｌのジャケット付きセパラブルフラスコ内でジャケットに温水を流すことで６０℃に保温し、攪拌しながらＭＡ１１９ｇ（ＭＡ／ＡＳＰモル比は０．８０）を添加し、晶析した。ＭＡの添加後、攪拌を続けながら３０分間６０℃で保温した後、１時間かけ、２０℃まで冷却し、さらに３０分間保温した。
【００６５】
（Ｃ）得られたスラリーは、ヌッチェで固液分離し、さらに蒸留水 ４００ｇでリンスし、減圧下、約６０℃で乾燥したところ、１３８．５ｇの白色固体を得た。
得られた固体は、ＡＳＰが９９．３重量％で、ＭＡアンモニウム ０．６重量％、ＦＡアンモニウム ０．１重量％を含んでいた。ＡＳＰの回収率は、８０．９％であった。一方、固液分離で得られた母液は、ＡＳＰ ２７．１ｇ／ｌ、ＭＡ ９８．６ｇ／ｌ、ＮＨ3 １８．６ｇ／ｌの組成であり、ｐＨは約４．５、容量１．２Ｌであった。なお、ここで得られたＭＡアンモニウムはそのＮＨ3 バランスから見て実質的全てがモノアンモニウム塩であった。
【００６６】
（Ｄ）上記（Ｃ）で得られた母液 １．２Ｌは、８０℃、減圧（３００〜４００ｍｍＨｇ）下、水を飛ばし濃縮した。得られた濃縮液に２５％アンモニア水、上記（Ａ）で回収したアンモニア水１８５ｍｌ、および蒸留水を添加して、ｐＨ９．０、容量約１Ｌの液を作成したところ、ＡＳＰ ３２．９ｇ／ｌ、ＦＡ ０．９ｇ／ｌ、ＭＡ １１９．６ｇ／ｌ、ＮＨ3 ４４．６ｇ／ｌの組成であった。
【００６７】
（Ｅ）上記（Ｄ）で得られた反応液を、上記（Ａ）で冷蔵保存した菌体を用い、実施例１（１）と同様に３０℃、４８時間酵素反応したところ、得られた酵素反応液はＡＳＰ １６８ｇ／ｌ、ＦＡ １．１ｇ／ｌ、ＭＡ ０．７ｇ／ｌ、ＮＨ3 ２７．５ｇ／ｌ、ＮＨ3 ／ＡＳＰモル比は１．２７、ｐＨは９であった。
【００６８】
（Ｆ）さらに上記（Ｂ）〜（Ｅ）と同様の操作を条件を変えずに３回繰り返した。結果を第１表に示す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
［比較例２］リサイクル操作
（Ａ）比較例１と同様に酵素反応を行い、７２時間後に反応が終了したことを確認した。反応中、溶存酸素濃度はおよそ７ｐｐｍを維持していた。酵素反応液は、限外ろ過膜（旭化成社製−ＡＣＶ−３０５０）を用い、菌体を除去し、菌体の濃縮液は、容器に移し、４℃で冷蔵保存した。
【００７１】
一方、得られた反応濾液１Ｌを容量２Ｌのナス型フラスコに仕込み、ラボ用エバポレーターを用いて、８０℃、３８０ｍｍＨｇの条件下、アンモニアを蒸留分離した。得られる蒸気の回収を目的に、５０ｗｔ％エチレングリコールの冷却水が０℃で循環する冷却管をとりつけた。１５分後、常圧に戻して、アンモニア除去操作を終了した。
【００７２】
蒸留釜の残液は、ＡＳＰが２０５ｇ／ｌ、ＮＨ3 が２６．３ｇ／ｌの組成で、８２０ｍｌの容量であった。この残液に蒸留水を加えて、ＡＳＰが２００ｇ／ｌ、ＮＨ3 が２５．９ｇ／ｌの組成（ＮＨ3 ／ＡＳＰモル比は１．０、すなわち、全てがＡＳＰモノアンモニウム塩）で８５０ｍｌの釜残液を作成した。
冷却管で得られた回収液は、ＮＨ3 が２７ｇ／ｌのアンモニア水１８５ｍｌであった。
【００７３】
（Ｂ）上記（Ａ）で得られたＡＳＰモノアンモニウム水溶液 ８５０ｍｌを容量１０００ｍｌのジャケット付きセパラブルフラスコ内でジャケットに温水を流すことで６０℃に保温し、攪拌しながらＭＡ１１９ｇ（ＭＡ／ＡＳＰモル比は０．８０）を添加し、晶析した。ＭＡの添加後、攪拌を続けながら３０分間６０℃で保温した後、１時間かけ、２０℃まで冷却し、さらに３０分間保温した。
【００７４】
（Ｃ）得られたスラリーは、ヌッチェで固液分離し、さらに蒸留水 ４００ｇでリンスし、減圧下、約６０℃で乾燥したところ、１３８．５ｇの白色固体を得た。
得られた固体は、ＡＳＰが９９．３重量％で、ＭＡアンモニウム ０．６重量％、ＦＡアンモニウム ０．１重量％を含んでいた。ＡＳＰの回収率は、８０．９％であった。一方、固液分離で得られた母液は、ＡＳＰ ２７．１ｇ／ｌ、ＭＡ ９８．６ｇ／ｌ、ＮＨ3 １８．６ｇ／ｌの組成であり、ｐＨは約４．５、容量１．２Ｌであった。なお、ここで得られたＭＡアンモニウムはそのＮＨ3 バランスから見て実質的全てがモノアンモニウム塩であった。
【００７５】
（Ｄ）上記（Ｃ）で得られた母液 １．２Ｌは、８０℃、減圧（３００〜４００ｍｍＨｇ）下、水を飛ばし濃縮した。得られた濃縮液に２５％アンモニア水、上記（Ａ）で回収したアンモニア水１８５ｍｌ、および蒸留水を添加して、ｐＨ９．０、容量約１Ｌの液を作成したところ、ＡＳＰ ３２．９ｇ／ｌ、ＦＡ ０．９ｇ／ｌ、ＭＡ １１９．６ｇ／ｌ、ＮＨ3 ４４．６ｇ／ｌの組成であった。
【００７６】
（Ｅ）上記（Ｄ）で得られた反応液を、上記（Ａ）で冷蔵保存した菌体を用い、比較例１と同様に３０℃、７２時間酵素反応したところ、得られた酵素反応液には、ＡＳＰが１０１ｇ／ｌ（反応回収率５９％）含まれていたが、それ以上反応が進行しなかった。
【００７７】
【発明の効果】
本発明によれば、異性化反応における水溶液中の溶存酸素量を特定量以下に低減させることにより、長期間安定した反応を行なうことができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing L-aspartic acid. More specifically, the present invention relates to an industrially advantageous process for producing L-aspartic acid by enzymatic action using maleic acid and / or maleic anhydride as a raw material.
[0002]
[Prior art]
Demand for L-aspartic acid is increasing as a pharmaceutical and food additive. Further, development of new applications is under consideration, but at present, an industrial process with high manufacturing cost and economically excellent has not been established.
As a method for producing L-aspartic acid, a method is known in which fumaric acid and ammonia are obtained by an enzymatic reaction in the presence of aspartase or a microorganism producing the same.
[0003]
A method is also known in which maleic acid and ammonia are isomerized in the presence of isomerase or a microorganism producing the same to obtain fumaric acid, and then L-aspartic acid is obtained by the same enzymatic reaction as described above. [Y. Takamura et al. Agric. Biol. Chem. 30 , No. 4, 345-350 (1966)]
However, in the conventional method, since ammonium L-aspartate after enzymatic reaction is acidified with sulfuric acid or hydrochloric acid, a large amount of inorganic acid ammonium salt with low economic value is produced as a by-product, resulting in the production of L-aspartic acid. It was supposed to increase the cost.
[0004]
As a method of improving this defect, the mother liquor containing ammonium maleate after acid precipitation of maleic acid or maleic anhydride with L-aspartic acid ammonium after enzymatic reaction and recovery of L-aspartic acid crystals is used as a raw material. A method has been proposed (US Pat. No. 4,560,653, JP-A-8-33491). Since these methods use maleic anhydride which is easily available in a large amount as a raw material and is inexpensive, it can be a very desirable method industrially.
[0005]
However, since the above proposed method is an adaptation of a conventionally known chemical reaction or enzyme reaction to the isomerization reaction of ammonium maleate, continuous industrially stable operation is continuously performed. It was still difficult to produce L-aspartic acid at low cost and efficiently.
[0006]
In particular, in the case of using an enzyme reaction, it is necessary to carry out the reaction of isomerizing maleic acid into fumaric acid and the two reactions of converting fumaric acid into aspartic acid in multiple stages or in this case. It has been found that there is a problem that the enzyme activity of the isomerase or the microorganism that produces the isomerase decreases if the enzymatic action of the microorganism that is produced is continuously maintained for a long time that is industrially satisfactory.
[0007]
Further, in crystallization of ammonium L-aspartate, unless a large amount of maleic acid is added, the recovery rate of L-aspartic acid crystals cannot be increased, and the amount of maleic acid added in the crystallization step is crystallized. The condition exceeds the amount of L-aspartic acid. For this reason, when the mother liquor containing ammonium maleate after crystallization is recycled in the reaction system, there is a problem that the concentration of L-aspartic acid in the system gradually increases, and continuous operation may become difficult. It was hard to say that it was a manual manufacturing method.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention uses maleic acid and / or maleic anhydride as a raw material, isomerizes it in an aqueous solvent with isomerase or a microorganism that produces it, and then aspartase or a microorganism that produces it, and water in the presence of ammonia. Maleate after enzymatic reaction in a solvent to obtain ammonium L-aspartate, ammonium salt of L-aspartate after enzymatic reaction was acidified with maleic acid and / or maleic anhydride, and L-aspartic acid crystals were recovered A method for producing L-aspartic acid, in which a mother liquor containing ammonium acid is recycled to an isomerization reaction step, provides a process for producing L-aspartic acid capable of balanced and stable operation, and isomerase in an enzymatic reaction Or continuously maintain without reducing the enzymatic action of the microorganisms that produce it That is to provide a novel method.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in view of the above circumstances, the present inventors have conducted isomerase or microorganisms that produce the enzyme to efficiently carry out the enzyme reaction. When isomerizing maleic acid, the dissolved oxygen concentration in the aqueous solvent It was found that the reaction can be carried out stably while suppressing the decrease in the activity of isomerase and the enzyme reaction can proceed stably by keeping the reaction at 4 ppm or less, and the present invention has been completed.
[0010]
That is, the gist of the present invention is to isomerize maleic acid and / or maleic anhydride in the presence of isomerase or a microorganism producing the same, and to convert at least a part of the isomerization reaction product and ammonia into aspartase or the same. In a method for producing L-aspartic acid by sequentially or simultaneously performing a reaction in which an ammonium L-aspartate is produced by reacting in a water solvent in the presence of a microorganism that produces lactic acid, dissolved oxygen in an aqueous solution at least in an isomerization reaction It exists in the manufacturing method of L-aspartic acid characterized by maintaining and carrying out a density | concentration at 4 ppm or less.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
(Process (1))
In the present invention, maleic acid and / or maleic anhydride is isomerized in the presence of isomerase or a microorganism producing the same, and then at least a part of the isomerization reaction product and ammonia are produced aspartase or the microorganism producing the same. In the presence, it is reacted in an aqueous solvent to produce ammonium L-aspartate. The reaction is a two-stage reaction method in which ammonium maleate is isomerized to ammonium fumarate and then treated as an enzyme in the presence of aspartase or a microorganism producing the same to produce ammonium aspartate. Any one-stage reaction method in which the isomerization of ammonium acid and the production of ammonium aspartate are simultaneously performed may be used.
[0012]
The reaction for isomerizing ammonium maleate to ammonium fumarate and the reaction for converting ammonium fumarate to ammonium aspartate are known, and the present invention can be carried out according to known methods.
[0013]
The microorganism having maleate isomerase activity used in the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism having this activity, but microorganisms belonging to the genus Alkagenes, Pseudomonas, Xanthomonas, and Bacillus are preferably used. It is done. In particular, Alcaligenes faecalis IFO 12669, IFO 13111, IAM 1473, Alcaligenes eutrophus (Alcaligenes eutrophus month fluorscens) ATCC 2 (Bacillus stearothermophilus) MI-101 (FERM P-14801), Bacillus brevis (Bacillus brevis) MI-103 (FERM P-14803) etc. are used suitably. Furthermore, there is no problem even if a genetically modified microorganism obtained by recombining the gene is used.
[0014]
Each cultured cell can be used after being previously washed with a buffer solution (pH 7) such as a phosphate buffer solution. The concentration of the phosphate buffer for washing is preferably about 0.05M to 0.2M. The microbial cells can be used as they are, and if necessary, the microbial cells crushed by ultrasonic pulverization or the like, the cell-free extract obtained by centrifuging the crushed material, A partially purified enzyme purified by a fractionation method, an ion exchange column, a gel filtration column, or the like, or an immobilized product obtained by immobilizing the cells or crushed cells using a carrier such as acrylamide monomer or alginic acid can also be used. When using bacterial cells, the bacterial cells are frozen in advance, or in a solution in which 0.01 to 0.2% by weight of a surfactant such as Triton X-100 or Tween 20 is added to the above buffer solution. It can also be used after improving the permeability of the cells by treating the cells for 10 to 120 minutes at a temperature of ° C.
[0015]
In the present invention, when a microorganism having maleate isomerase activity or a processed product thereof is subjected to an enzymatic reaction in an aqueous solution containing maleic acid, the dissolved oxygen concentration (hereinafter abbreviated as DO) in the aqueous solution containing maleic acid may be used. ) Is maintained at 4 ppm or less, preferably 1 ppm or less, and more preferably 0.5 ppm or less.
[0016]
If the dissolved oxygen concentration is high, the activity of the enzyme isomerase decreases if the isomerization reaction is carried out for a long time, making it difficult to stably continue the isomerization reaction, and recovering the isomerase or the microorganism producing it after the reaction is completed. For example, it becomes difficult to repeatedly perform batch operation or to perform continuous operation for a long time.
[0017]
In the present invention, the method for adjusting the oxygen concentration in the aqueous solution usually includes a method of circulating an inert gas in the aqueous solution or a method of adding a sulfite as an oxygen scavenger to the aqueous solution. It is done. These treatments are usually performed on the raw material aqueous solution to be subjected to the reaction, but may be performed in a reaction system.
[0018]
The gas inert to the reaction used in the present invention is not particularly limited as long as it is not a gas containing oxygen. A gas selected from a so-called rare gas such as Ar and He, nitrogen gas, carbon dioxide gas, or the like may be used, and one kind of gas or a combination of two or more kinds of gases may be used. As a method for treating with these gases, for example, a method of stirring while blowing the gas continuously or intermittently into a maleic acid aqueous solution is generally used. Moreover, it is preferable that the maleic acid-containing aqueous solution tank is continuously sealed with the gas after the treatment.
[0019]
The sulfite used in the present invention may be any salt of sulfite, and for example, inorganic sulfites such as sodium sulfite, potassium sulfite, ammonium sulfite, ammonium hydrogen sulfite, calcium sulfite and the like are preferred, but the maleate isomerase activity is inhibited. No known salt with mercury or copper. The concentration in the case of adding sulfite is 1 ppm to 1000 ppm, preferably 10 ppm to 500 ppm. The addition position of the sulfite is not particularly limited, and it may be performed at any step or between any steps. You may divide and add to several places.
[0020]
In the present invention, ammonium fumarate is converted to ammonium L-aspartate in the presence of aspartase or a microorganism that produces aspartase. This method can be performed by a known method. The microorganism producing aspartase is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of producing L-aspartic acid from fumaric acid and ammonia, such as Brevibacterium, Escherichia, Pseudomonas, Bacillus, etc. Of the microorganisms. Specifically, Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497), MJ-233-AB-41 (FERM BP-1498), Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, Escherichia Examples include Escherichia coli ATCC 11303, ATCC 27325, and the like.
[0021]
The concentration of the raw material aqueous solution for the isomerization reaction and the reaction for producing L-aspartic acid is usually determined by the concentration of the monoammonium maleate aqueous solution recovered from step (3) described later. In the present invention, the concentration of the aqueous raw material solution in step (1) is usually 45 to 700 g / l, preferably 90 to 450 g / l, in terms of monoammonium maleate.
[0022]
The isomerization reaction in step (1) and the reaction for producing L-aspartic acid in the present invention can also be carried out under pH adjustment using an alkaline agent other than ammonia. In this case, the pH in the reaction system is usually preferably 7.5 to 10, and both reactions may be carried out simultaneously in the same reaction tank. When carrying out simultaneously, it can carry out by selecting the conditions suitable for both reaction, using together the microbe which has each property. Moreover, the combination is not necessarily required as long as it has both properties.
[0023]
The alkali agent is not particularly limited, such as sodium hydroxide or potassium hydroxide, but it is preferable in the present invention to use ammonia which is a raw material for the reaction for producing L-aspartic acid, and the isomerization reaction. Does not have any adverse effect on When ammonia is used alone, the amount of ammonia used is 1.05 to 2.0 mol times, preferably 1.1 to 1.6 mol times, relative to the raw material monoammonium maleate. Moreover, when using the said alkali agent together with ammonia, the quantity of ammonia and an alkali agent is adjusted to the quantity used as the pH range in the said reaction system.
[0024]
The temperature for the isomerization reaction and the reaction for producing L-aspartic acid is selected as the temperature at which the enzyme reaction is carried out efficiently, and is usually 10 to 80 ° C., preferably 50 to 60 ° C.
[0025]
The reaction operation of the enzyme reaction is not limited, but continuous operation is more preferable than batch operation. Usually, as a reaction method, a raw material aqueous solution is passed through a packed bed in which microbial cells are immobilized, or a raw material aqueous solution is supplied into a reactor in which the microbial cells themselves or the immobilized microbial cells are suspended, while the reaction solution And a method of separating the cells using a separation membrane or a centrifuge and returning them to the reactor.
[0026]
The reaction solution obtained by the reaction for producing L-aspartic acid mainly contains ammonium L-aspartate, and this ammonium salt is a mixture of a monoammonium salt and a diammonium salt. The proportion of diammonium salt is usually 10-60% mol. The reaction solution may contain unreacted ammonium fumarate and ammonium maleate, but the content should be controlled to 5 g / l or less, preferably 2 g / l or less, particularly 1 g / l or less. Is desirable.
[0027]
The reaction solution subjected to the enzyme reaction in step (1) is sent to the next step after separating the cells by a conventional method. Usually, microbial cells are separated using a separation membrane or a centrifuge.
[0028]
(Process (2))
Maleic acid and / or maleic anhydride is added to the solution obtained in the above step (1) to crystallize L-aspartic acid. The maleic acid and maleic anhydride to be added may be a powder, a melt, an aqueous solution, or a slurry. Mixing these two types of acids in an arbitrary ratio is not limited.
[0029]
The amount of maleic acid and / or maleic anhydride added in step (2) is such that the molar ratio of (maleic acid + maleic anhydride) / ammonium L-aspartate is 0.5 to 1.4, preferably 0. .6 to 1.3 to be added. If this molar ratio is too small, the recovery rate of L-aspartic acid in the crystallization recovery is not sufficient, the concentration of aspartic acid in the recycling system becomes high, and if it is too large, the added maleic acid and maleic anhydride Not efficiently used for crystallization.
[0030]
The crystallization temperature is usually 0 to 90 ° C, preferably 10 to 80 ° C. When the temperature is too low, the resulting crystal becomes too fine, and the solid-liquid separation operation becomes troublesome, and the rinsing efficiency also deteriorates. That is, the amount of mother liquor retained in the wet cake obtained by solid-liquid separation (the amount of water content) increases, and a sufficient rinsing effect cannot be obtained, so that the crystal purity decreases or the amount of rinsing increases to increase L-aspartic acid. It will be the situation of reducing the recovery rate. On the other hand, if the temperature is too high, not only the recovery rate of L-aspartic acid is low but also thermal degradation of maleic acid may occur.
[0031]
Moreover, the processing time of a crystallization process is about 0.5 to 5 hours normally.
Crystallization is usually carried out using a stirred tank type crystallization tank. The addition position of maleic acid and / or maleic anhydride may be either in the crystallization tank or in the transfer pipe from step (1) leading to this. In addition, the crystallization is performed by continuously mixing the solution obtained in step (1), or if necessary, the aqueous solution after deammonification of the solution obtained in step (4) described later, and maleic acid and / or maleic anhydride. However, it may be partly performed intermittently or batchwise.
[0032]
(Process (3))
The slurry obtained in the above step (2) is subjected to solid-liquid separation, and the crystals obtained are rinsed with water as necessary to recover L-aspartic acid crystals. The obtained crystals can be recovered by a conventional method and recovered as a product having a purity of 99% or more.
[0033]
The mother liquor obtained by solid-liquid separation contains monoammonium maleate and further contains ammonium L-aspartate for the solubility. This mother liquor is recycled to the above step (1) and reused as a raw material in the step (1).
[0034]
The solid-liquid separation of the slurry is not particularly limited, but is performed at a temperature range of 0 to 80 ° C, preferably 10 to 50 ° C. At low temperatures, the slurry is highly viscous and difficult to handle. At high temperatures, the solubility of L-aspartic acid increases and the recovery rate decreases. The amount of water used for the rinsing operation performed as necessary is not particularly limited, but is 5 times or less, preferably 3 times or less the wet cake. When the amount of rinsing is too small, the rinsing effect is not sufficient, and when too much, the recovery rate of L-aspartic acid is lowered. The temperature of the rinsing water is not particularly limited.
[0035]
The separation operation is not limited, but can be performed by a conventional method such as Nutsche and centrifugation.
The mother liquor obtained by solid-liquid separation is an acidic aqueous solution mainly containing monoammonium maleate and having a pH of about 3-6. If necessary, water can be removed by a concentration step, and ammonia can be further added to recycle to step (1).
[0036]
(Process (4))
In the method of the present invention, the reaction liquid obtained in the step (1) is distilled or stripped before carrying out the step (2) to remove a part of ammonia, thereby substantially reducing ammonium L-aspartate. And L-aspartic acid monoammonium salt, which is a more advantageous process. The proportion of L-aspartic acid monoammonium salt obtained when step (4) is carried out is 90 mol% or more, preferably 95 mol% or more, more preferably 98 mol, relative to the total ammonium salt of L-aspartic acid. % Or more.
[0037]
By this deammonification treatment, the amount of maleic acid or maleic anhydride used in step (2) can be suppressed, and a balanced industrial process capable of continuous operation for a longer period of time can be realized.
[0038]
In the process for carrying out step (4) as a preferred embodiment, the liquid obtained in step (4) is sent to step (2) and subjected to acid precipitation. In that case, maleic acid and / or anhydrous The addition amount of maleic acid is 0.5 to 1.1, preferably 0.6 to 1.0 in terms of (maleic acid + maleic anhydride) / L-aspartate monoammonium molar ratio. If this molar ratio is too small, the recovery rate of L-aspartic acid in the crystallization recovery is not sufficient, the concentration of aspartic acid in the recycling system becomes high and is not efficient, and if too large, the added maleic acid and Maleic anhydride is not efficiently used for crystallization.
[0039]
Regarding the other crystallization conditions in the step (2) in the process when the step (4) is performed, the method described in the step (2) may be used.
The distillation operation or stripping operation (hereinafter sometimes referred to as ammonia removal operation) may be performed under normal pressure or under reduced pressure, and can be performed in the range of 30 to 100 ° C, preferably 40 to 80 ° C. In order to perform the ammonia removal operation at a low temperature, it is necessary to increase the degree of pressure reduction, which increases operational restrictions.
[0040]
On the other hand, a high temperature is not preferable because the liquid composition is thermally deteriorated. Of all the steps in the method of the present invention, the temperature conditions of this step that can be treated at the highest temperature, particularly the upper limit temperature, should be defined as described above from this viewpoint. As the form of the ammonia distillation column, a normal plate column or packed column can be used.
[0041]
The aqueous ammonium L-aspartate solution obtained by the enzymatic reaction in step (1) was subjected to ammonia removal operation by the above method, whereby the molar ratio of ammonia to L-aspartic acid was about 1.0 in the distillation kettle. That is, a residual liquid containing L-monoammonium aspartate can be obtained.
[0042]
Only ammonia and water are separated as vapor in the ammonia removal operation. If this vapor is recovered as a liquid using a cooling pipe or the like, aqueous ammonia can be obtained. The concentration of the obtained aqueous ammonia is affected by the temperature, pressure, steam recovery temperature, etc. of the ammonia removal operation.
[0043]
The aqueous solution after the above operation is sent to step (2) to recover L-aspartic acid crystals. The concentration of ammonium L-aspartate in the aqueous solution supplied to the crystallization step is usually 50 to 800 g / l, preferably 100. ~ 500 g / l. If this concentration is too low, the crystal recovery rate will be low, and conversely if it is too high, the concentration of the recovered slurry will be too high, which is not preferable for operation.
[0044]
The ammonia water separated as a vapor by the ammonia removal operation in the step (4) and recovered by a cooling pipe or the like is reused in the step (3) or the step (1) as necessary. The supply temperature in this case is not particularly limited, but 5 to 80 ° C., preferably 10 to 50 ° C. can be adopted in consideration of the reaction or operation temperature of each step. Under high temperature, the vapor pressure of ammonia becomes high, which is not preferable. Moreover, there is no problem even if it is supplied at a temperature lower than the reaction temperature.
[0045]
The method for supplying ammonia to be recycled is not particularly limited, but it may be appropriately distributed to the two reactions of the isomerization reaction in step (1) and the enzyme reaction for producing L-aspartic acid. There is no problem even if it is supplied to the reaction in batch. Further, when the isomerization reaction and the enzyme reaction for producing L-aspartic acid are carried out in the same reactor, they may be supplied to the mother liquor separated in step (3).
[0046]
(Bleed)
Since the method for producing L-aspartic acid of the present invention includes a recycling step, it is possible to perform bleed as necessary in consideration of accumulation of impurities and reaction byproducts.
[0047]
The bleed position is not particularly limited, and bleed may be performed from any position after each step. It is also possible to bleed at a plurality of locations. In particular, it is preferable to bleed from the residual residue aqueous solution obtained in step (1), that is, between step (1) and step (2) or between step (1) and step (4).
[0048]
The amount of bleed is usually 1 to 20%, preferably 3 to 17%, based on the volume of the residual residue aqueous solution. If the bleed rate is low, the effect is small and meaningless. If the bleed rate is high, the bleed system has the same volume of equipment as the main process, giving an economically disadvantageous process. The bleed method may be continuous as long as the bleed rate is satisfied, or may be intermittent.
[0049]
It is preferable to recover L-aspartic acid as crystals from the bleed solution, and the method is usually preferably performed by adding an inorganic acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid. The amount of inorganic acid added is equal to or greater than the equivalent amount of ammonium aspartate. That is, it is desirable to add an inorganic acid to the bleed liquid so that the isoelectric point of L-aspartic acid is 2.8 in order to improve the recovery rate.
[0050]
By the treatment of the bleed solution described above, the contained ammonium L-aspartate can be recovered without loss, and impurities accumulated in the system are purged by the bleed, giving favorable results. The present invention achieves a balance by connecting the ammonia recovery from the main line of steps (1) to (3) and preferably the deammonium step of step (4), and preferably the bleed liquid treatment step. It is possible to provide an industrially advantageous process that can be stably and continuously operated, and enables production of high-purity L-aspartic acid.
[0051]
In the present invention, the processing operations of the above steps (1) to (3) are sequentially performed. The steps (1) to (3) may be a batch method or a continuous method. For example, even when the entire process is carried out by a batch method, according to the present invention, even if the reaction is repeated, it is possible to operate each process under the same conditions with the same throughput.
Of course, when all the steps are carried out in a continuous manner, the process is balanced and stable.
[0052]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the description of the examples unless it exceeds the gist.
The analysis of L-aspartic acid (hereinafter abbreviated as ASP), maleic acid (hereinafter abbreviated as MA) and fumaric acid (hereinafter abbreviated as FA) was carried out by high performance liquid chromatography, and ammonia in ASP crystals was analyzed. (Hereafter, NH Three Content analysis was quantified by ion chromatography.
[0053]
[Reference example] Preparation of enzyme
(1) Culture of microorganisms having maleate isomerase activity
Meat extract: 10 g, peptone: 10 g, NaCl: 5 g, maleic acid 10 g and distilled water: 1000 ml (adjusted to pH 7.0 with caustic soda) was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. Alkalinegenes faecalis IFO 12669 strain was inoculated into the treated product and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours.
[0054]
Further, 1000 ml of the same medium as described above was placed in a 3 L jar fermenter, sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, inoculated with 30 ml of the shaking culture solution, and cultured at 30 ° C. for 24 hours. The cells collected by centrifugation of the obtained culture solution (8000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.) were washed once with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) and used in the following reaction. did.
[0055]
(2) Culture of microorganisms capable of producing aspartic acid from fumaric acid
Urea: 4 g, (NH Four ) 2 SO Four : 14g, KH 2 PO Four : 0.5 g, K 2 HPO Four : 0.5 g, MgSO Four ・ 7H 2 O: 0.5 g, FeSO Four ・ 7H 2 O: 20 mg, MnSO Four ・ NH 2 O: 20 mg, D-biotin: 200 μg, thiamine hydrochloride: 100 μg, yeast extract 1 g, casamino acid 1 g and distilled water: 1000 ml (pH 6.6) of medium 100 ml were dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask at 120 ° C., 15 4 ml of sterilized 50% glucose aqueous solution was added to the sterilized solution for 5 minutes, and Brevibacterium flavum AB-41 strain (FERM BP-1498) was inoculated, followed by shaking culture at 33 ° C. for 24 hours.
[0056]
Further, 1000 ml of the same medium as described above was placed in a jar fermenter having a volume of 2 L, sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, and 20 ml of the shaking culture solution and 200 ml of sterilized 50% glucose aqueous solution were added, and this was added to 33 ° C. For 24 hours. The resulting culture was collected by centrifugation (8000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.). This bacterial cell was freed from contaminating malic acid by-life by the following method. That is, the collected cells are suspended in a composition liquid consisting of aspartic acid: 100 g, ammonia: 180 ml, calcium chloride: 2.2 g, Tween 20: 0.8 g (total amount is 1 L with water), and shaken at 45 ° C. for 3 hours. The cells were collected by centrifugation (8000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.).
[0057]
[Example 1] Enzymatic reaction
(1) Stirring while blowing nitrogen gas for 30 minutes in advance, transfer the reaction solution purged with nitrogen (maleic acid 150 g, 25% ammonia water 220 ml (with water to 1000 ml)) to a 3 L jar fermenter, Both microbial cells recovered in step (20 g of isomerase bacteria, 120 g of aspartase bacteria) were added, nitrogen gas was supplied at a rate of 0.02 vvm, and the inside of the tank was sealed with nitrogen gas. Maintained below 5 ppm.
When reacted at 30 ° C. for 48 hours, 169 g / l of L-aspartic acid was obtained in the reaction solution.
[0058]
(2) Stirring while blowing nitrogen gas for 30 minutes in advance, the reaction solution purged with nitrogen (150 g of maleic acid, 220 ml of 25% ammonia water (to make the total amount 1000 ml with water)) was sealed in a 3 L jar fermenter. When the dissolved oxygen concentration became stable, the cells recovered above (20 g of isomerase bacteria, 120 g of aspartase bacteria) were added. During the reaction, the dissolved oxygen concentration was maintained below about 3 ppm.
When reacted at 30 ° C. for 48 hours, 136 g / l of L-aspartic acid was obtained in the reaction solution.
[0059]
(3) 0.2 g / l sodium sulfite was added to the reaction solution (maleic acid 150 g, 25% ammonia water 220 ml (with water to 1000 ml)), transferred to a sealed 3 L jar fermenter and dissolved. When the oxygen concentration became stable, the cells recovered above (20 g of isomerase, 120 g of aspartase) were added. During the reaction, the dissolved oxygen concentration was maintained below about 3 ppm.
When reacted at 30 ° C. for 48 hours, 133 g / l of L-aspartic acid was obtained in the reaction solution.
[0060]
[Comparative Example 1] Enzymatic reaction
The reaction solution (150 g of maleic acid, 220 ml of 25% ammonia water (with a total volume of 1000 ml with water)) that had not undergone the dissolved oxygen reduction treatment was transferred to a 3 L jar fermenter, and the cells recovered above (20 g of isomerase bacteria) Aspartase bacteria 120 g) was added, and the dissolved oxygen lowering treatment was not particularly performed during the reaction. During the reaction, the dissolved oxygen concentration was approximately 7 ppm.
When reacted at 30 ° C. for 48 hours, 101 g / l of L-aspartic acid was obtained in the reaction solution.
[0061]
[Example 2] Recycling operation
(A) An ultrafiltration membrane (Asahi Kasei Co., Ltd.-ACV-3050) was used while the enzyme reaction solution obtained in the same manner as in Example 1 (1) was sealed with nitrogen gas so as not to increase the dissolved oxygen concentration. Used to remove the cells. The bacterial cell concentrate was transferred to a nitrogen gas-sealed container and refrigerated at 4 ° C.
[0062]
On the other hand, 1 L of the obtained reaction filtrate was charged into a 2 L eggplant-shaped flask, and ammonia was distilled and separated using a laboratory evaporator under conditions of 80 ° C. and 380 mmHg. For the purpose of recovering the steam obtained, a cooling pipe in which 50 wt% ethylene glycol cooling water was circulated at 0 ° C. was attached. After 15 minutes, the pressure was returned to normal pressure, and the ammonia removal operation was completed.
[0063]
The residual liquid in the still is ASP at 207 g / l, NH Three With a composition of 26.5 g / l and a volume of 825 ml. Distilled water is added to this residual liquid, ASP is 200 g / l, NH Three Of 25.9 g / l (NH Three / ASP molar ratio was 1.0, that is, all were ASP monoammonium salt) to prepare 850 ml of kettle residue.
The recovered liquid obtained in the cooling pipe is NH Three Was 185 ml of 27 g / l aqueous ammonia.
[0064]
(B) 850 ml of the ASP monoammonium aqueous solution obtained in (A) above was kept at 60 ° C. by flowing warm water in the jacket in a separable flask with a capacity of 1000 ml and MA119 g (MA / ASP molar ratio) with stirring. Was added and crystallized. After the addition of MA, the mixture was kept at 60 ° C. for 30 minutes while continuing stirring, then cooled to 20 ° C. over 1 hour, and further kept for 30 minutes.
[0065]
(C) The obtained slurry was subjected to solid-liquid separation with Nutsche, further rinsed with 400 g of distilled water, and dried at about 60 ° C. under reduced pressure to obtain 138.5 g of a white solid.
The resulting solid had an ASP of 99.3% by weight, MA ammonium 0.6% by weight, and FA ammonium 0.1% by weight. The ASP recovery rate was 80.9%. On the other hand, the mother liquor obtained by solid-liquid separation was ASP 27.1 g / l, MA 98.6 g / l, NH Three The composition was 18.6 g / l, the pH was about 4.5, and the volume was 1.2 L. The MA ammonium obtained here is its NH. Three Substantially all from the balance was monoammonium salt.
[0066]
(D) The mother liquor 1.2L obtained in the above (C) was concentrated by removing water at 80 ° C. under reduced pressure (300 to 400 mmHg). 25% aqueous ammonia, 185 ml of aqueous ammonia recovered in (A) above, and distilled water were added to the resulting concentrated liquid to prepare a liquid having a pH of 9.0 and a volume of about 1 L. As a result, ASP 32.9 g / l , FA 0.9 g / l, MA 119.6 g / l, NH Three The composition was 44.6 g / l.
[0067]
(E) The reaction solution obtained in (D) above was subjected to an enzymatic reaction at 30 ° C. for 48 hours in the same manner as in Example 1 (1) using the cells refrigerated in (A) above. The enzyme reaction solution is ASP 168 g / l, FA 1.1 g / l, MA 0.7 g / l, NH Three 27.5 g / l, NH Three The / ASP molar ratio was 1.27 and the pH was 9.
[0068]
(F) Further, the same operations as in the above (B) to (E) were repeated three times without changing the conditions. The results are shown in Table 1.
[0069]
[Table 1]
[0070]
[Comparative Example 2] Recycling operation
(A) Enzymatic reaction was performed in the same manner as in Comparative Example 1, and it was confirmed that the reaction was completed after 72 hours. During the reaction, the dissolved oxygen concentration was maintained at approximately 7 ppm. The enzyme reaction solution was an ultrafiltration membrane (manufactured by Asahi Kasei Corporation-ACV-3050), the cells were removed, and the concentrated solution of the cells was transferred to a container and stored refrigerated at 4 ° C.
[0071]
On the other hand, 1 L of the obtained reaction filtrate was charged into a 2 L eggplant-shaped flask, and ammonia was distilled and separated using a laboratory evaporator under conditions of 80 ° C. and 380 mmHg. For the purpose of recovering the steam obtained, a cooling pipe in which 50 wt% ethylene glycol cooling water was circulated at 0 ° C. was attached. After 15 minutes, the pressure was returned to normal pressure, and the ammonia removal operation was completed.
[0072]
The residual liquid in the still is ASP at 205 g / l, NH Three With a composition of 26.3 g / l and a capacity of 820 ml. Distilled water is added to this residual liquid, ASP is 200 g / l, NH Three Of 25.9 g / l (NH Three / ASP molar ratio was 1.0, that is, all were ASP monoammonium salt) to prepare 850 ml of kettle residue.
The recovered liquid obtained in the cooling pipe is NH Three Was 185 ml of 27 g / l aqueous ammonia.
[0073]
(B) 850 ml of the ASP monoammonium aqueous solution obtained in (A) above was kept at 60 ° C. by flowing warm water in the jacket in a separable flask with a capacity of 1000 ml and MA119 g (MA / ASP molar ratio) with stirring. Was added and crystallized. After the addition of MA, the mixture was kept at 60 ° C. for 30 minutes while continuing stirring, then cooled to 20 ° C. over 1 hour, and further kept for 30 minutes.
[0074]
(C) The obtained slurry was subjected to solid-liquid separation with Nutsche, further rinsed with 400 g of distilled water, and dried at about 60 ° C. under reduced pressure to obtain 138.5 g of a white solid.
The resulting solid had an ASP of 99.3% by weight, MA ammonium 0.6% by weight, and FA ammonium 0.1% by weight. The ASP recovery rate was 80.9%. On the other hand, the mother liquor obtained by solid-liquid separation was ASP 27.1 g / l, MA 98.6 g / l, NH Three The composition was 18.6 g / l, the pH was about 4.5, and the volume was 1.2 L. The MA ammonium obtained here is its NH. Three Substantially all from the balance was monoammonium salt.
[0075]
(D) The mother liquor 1.2L obtained in the above (C) was concentrated by removing water at 80 ° C. under reduced pressure (300 to 400 mmHg). 25% aqueous ammonia, 185 ml of aqueous ammonia recovered in (A) above, and distilled water were added to the resulting concentrated liquid to prepare a liquid having a pH of 9.0 and a volume of about 1 L. As a result, ASP 32.9 g / l , FA 0.9 g / l, MA 119.6 g / l, NH Three The composition was 44.6 g / l.
[0076]
(E) The reaction solution obtained in (D) above was subjected to an enzyme reaction at 30 ° C. for 72 hours in the same manner as in Comparative Example 1 using the cells refrigerated in (A) above. Contained 101 g / l of ASP (reaction recovery: 59%), but the reaction did not proceed any further.
[0077]
【The invention's effect】
According to the present invention, a stable reaction can be performed for a long period of time by reducing the amount of dissolved oxygen in an aqueous solution in an isomerization reaction to a specific amount or less.