JP3860208B2

JP3860208B2 - 非毒性口内アジュバントとして有効な突然変異エンテロトキシン

Info

Publication number: JP3860208B2
Application number: JP50873596A
Authority: JP
Inventors: ディー．クレメンツ，ジョン; エル．ディッキンソン，ボニー
Original assignee: ザアドミニストレーターズオブザトゥレーンエデュケーショナルファンド
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-07-18
Publication date: 2006-12-20
Anticipated expiration: 2015-07-18
Also published as: EP0777490A4; ZA956412B; US6019982A; KR970705403A; PT777490E; CA2198586C; FI120137B; AU3233795A; WO1996006627A1; FI970799A0; ATE326231T1; CA2198586A1; ES2265148T3; CZ298131B6; RU2160606C2; CZ56297A3; BR9508633A; CN1164191A; EP0777490A1; CN1182868C

Description

この明細書に記載の研究は、米国海軍により部分的に助成された（認可番号Ｎ０００１４−８３−Ｋ−０１９２。政府はこの発明に明確な権利を有している。
１．発明の分野
本発明は、E.coli熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ）の遺伝的に異なる突然変異体、ならびに、粘膜および血清の抗体を誘発させるための口内アジュバントとしてのその使用に関する。特に、突然変異体ＬＴは、その固有の毒性は取り除くが分子のアジュバント特性はそのままにしておく単一アミノ酸置換により変性される
２．発明の背景
微生物病原体は、幾つかの機構の一つにより宿主に感染することができる。それらは外傷により形成された外皮の損傷部分を通って侵入することができ、それらはベクター伝達によって導入され得るものであり、またはそれらは粘膜表面と相互作用し得るものである。ヒト病原体の大部分が最後の機構により、すなわち粘膜表面との相互作用により病気を発生させる。この機構により作用する細菌およびウイルス病原体は、最初に粘膜表面と接触し、そこで、パイエル板および他のリンパ様小節に重なっている上皮内の分化吸収性細胞（Ｍ細胞）と接触してコロニーを形成し得る、または分化吸収性細胞に吸収され得る〔BockmanおよびCooper,1973年版,Am.J.Anat.,第136巻：455〜477頁；Owenら,1986年版,J.Infect.Dis.,第153巻：1108〜1118頁〕。リンパ系組織に侵入した生物はリンパ様小節内で容易に殺され、それにより、抗原として潜在的に感染防御免疫応答を刺激することが、小節内の免疫細胞に伝えられる。（例えば、Vibrio cholerae）。また、局所的防御機構を切り抜けて生きることのできる病原性生物は小節から広がり、続いて局所的または全身的な病気を引き起し得る（すなわち、免疫不全宿主におけるSalmonella spp.、ポリオウイルス、ロタウイルス）。
感染性生物の特異的毒力決定基に対する分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）抗体は、粘膜免疫全体において重要な役割を果たす〔Cebraら,1986年版,In:Vaccines 86,Brownら（編集）,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,129〜133頁〕。多くの場合、感染性生物の毒力決定基に対する粘膜ｓＩｇＡレベルの産生を刺激することにより粘膜表面の初期感染を防止することができる。分泌型ＩｇＡは、付着および／またはコロニー形成を遮断し、表面活性トキシンを中和し、または宿主細胞の侵入を防止することにより、病原と粘膜表面との初期相互作用を妨げることができる。感染性物質に対する保護における細胞性免疫および血清抗体の役割を決定するために広範な研究が成されてきたが、ｓＩｇＡの制御、誘導および分泌についてはあまり知られていない。非経口投与された不活化全細胞および全ウイルス製剤は、病原論において、感染防御血清ＩｇＧおよび重要な血清相を有する生物に対する遅延型過敏応答を誘発させるのに効果的である（すなわち、Salmonella typhi,Ｂ型肝炎）。しかしながら、非経口ワクチンは粘膜ｓＩｇＡ応答の誘発では有効でなく、粘膜表面と相互作用して侵入するものではない細菌に対しては効果的でない（例えば、Vibrio cholerae）。しかしながら、最近、非経口投与されたワクチンが、少なくとも一つのウイルス、すなわち主として粘膜表面と相互作用する、ロタウイルスに対して効果的であり得るということが証明された〔Connerら,1993年版,J.Virol.,第67巻：6633〜6641頁〕。ウイルス中和のために粘膜表面上に抗原特異性ＩｇＧが浸出することから感染防御が生じると考えられる。従って、効果的なワクチンにとっては、血清および粘膜抗体の両方を刺激する機構が重要である。
選択的なＩｇＡＢ細胞の発生が開始されるパイエル板内に含まれるアクセサリー細胞およびＴおよびＢリンパ球に抗原が提示される場合、口内免疫感作は、特異的ｓＩｇＡ応答の誘導にとって効果的であり得る。パイエル板は、Ｂ細胞アイソタイプがＩｇＭ細胞からＩｇＡＢ細胞に直接切り換わるのを媒介するヘルパーＴ（ＴＨ）細胞を含む。この板は、終末にあるＢ細胞の分化を開始させるＴ細胞も含む。得られるＢ細胞は、次に腸間膜リンパ節に移動して分化し、胸管に入り、次に広く循環し、続いて消化管および気道の固有層を含む体の全ての分泌組織に入る。次に、成熟したプラズマ細胞によりＩｇＡが生成され、粘膜結合性分泌成分と複合体化し、粘膜表面上に運ばれ、そこで侵入病原との相互作用に利用される〔StroberおよびJacobs,1985年版,In:Advances in host defense mechanisms,第４巻,Mucosal Immunity,GallinおよびFauci（編集）,Raven Press,New York,1〜30頁；TomasiおよびPlaut,1985年版,In:Advances in host defense mechanisms,第４巻,Mucosal Immunity,GallinおよびFauci（編集）,Raven Press,New York,31〜61頁〕。この共通な粘膜免疫系の存在は、最初に粘膜表面と相互作用することにより感染を開始させる病原性生物に対する免疫防御のための口内免疫感作および生体口内ワクチンの能力を部分的に説明する。
口内免疫感作のために多くの対策が開発され、それは、異種抗原の担体としての細菌の弱毒化突然変異体（すなわち、Salmonella spp.）の使用〔GaedenasおよびClements,1992年版,Clin.Microbiol.Rev.5:328〜342;Clementsら,1992年版,In:Recombinant DNA Vaccines:Rationale and Strategy,Isacson（編集）,Marcel Decker,New York,293〜321頁；ClementsおよびGaedenas,1990年版,Res.Microbiol.,第141巻981〜993頁；ClementsおよびEl-Moshidy,1984年版，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，第46巻564〜569頁〕；ポリ−ＤＬ−ラクチド−グリコライド（ＰＧＬ）、タンパク様ポリマー−プロテイノイド〔Sanitagoら,1993年版,Pharmaceuticcal Research,10:1243〜1247〕からなるミクロスフェア中への抗原の封入、ゼラチンカプセル、リポソームの異なる製剤〔Alvingら,1986,Vaccine,第４巻:166〜172頁;GarconおよびSix,1993年版,J.Immunol.,第146巻:3697〜3702頁；Gould-FogeriteおよびMannino,1993年版,Ｉｎ：ＬｉｐｏｓｏｍｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第２版，第３巻，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（編集）〕；ナノ粒子上への吸着；親油性免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）の使用〔ＭｏｗａｔおよびＤｏｎａｃｈｉｅ,1991年版,Immunology Today,第12巻：３８３〜３８５頁〕；および既知のアジュバント特性を有する細菌生成物の添加〔Clementsら,1988年版,Vaccine,第６巻:269〜277頁；Elson,1989年版,Immunology Today,第146巻:29〜33頁；LyckeおよびHolmgren,1986年版,Immunology,第59巻:301〜308頁；Lyckeら,1992年版,Eur.J.Immunol.,第22巻：2277〜2281頁〕を含む。口内アジュバントとして作用する能力が最も大きい二つの細菌生成物は、V.choleraeの種々の菌株により産生されるコレラトキシン（ＣＴ）およびEscherichia coliの一部のエンテロトキシン産生性菌株により製造される熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ）である。ＬＴとＣＴとは多くの共通する特性を有するが、それらをユニークなものとする生化学的および免疫学的相違点を有する、明らかに異なる分子である。
コレラの激しい下痢は、アデニレートシクラーゼを活性化し続いて環式３’−,５’−アデノシンモノホスファターゼ（ｃＡＭＰ）の細胞内のレベルを増加させる能力を有するエキソ−エンテロトキシンの結果である。コレラエンテロトキシン（ＣＴ）は、二つの主要な、非共有結合している、免疫学的に異なる領域またはドメイン（「コレラ−Ａ」および「コレラ−Ｂ」）からなる８４０００ダルトンの高分子タンパク質である〔FinkelsteinおよびLospalluto,1969年版,J.Expe.Med.,第130巻:185〜202頁〕。これらのうち、５６０００ダルトンの領域、すなわちコレラゲノイドが、宿主細胞の膜レセプターＧ_M1（ガラクトシル−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−（シアリル）−ガラクトシル−グルコシルセラミド）への毒素の結合に関与し、このＧ_M1は本質的に全ての真核生物細胞の表面で見い出される。コレラゲノイドは、５つの非共有結合で会合したサブユニットからなり、Ａ領域（２７０００ダルトン）がトキシンの多様な生物学的効果に関与する。
分子の免疫学的特性に関するＣＴの二つのサブユニットの関係が、白熱した議論の源であった。他方で、ＣＴは、経口投与されたときに、血清および粘膜の抗毒素抗体反応の両方の進行を引き起こす優れた免疫原である。この発見は、コレラ患者において臨床的なコレラからの回復期の間に抗毒素抗体の力価が上昇することが知られているという点で、新規ではない〔Finkelstein,1975年版,Curr.Top. Microbiol.Immunol.,第69巻:137〜196頁〕。この応答の性質の検討における一つの重要な知見は、ＣＴが、大部分の他のタンパク抗原とは異なって、それ自身に対する口内寛容を誘導しないという観察であった〔ElsonおよびＥａｌｄｉｎｇ，１９８４年版,J.Immunol.,第１３２巻：２７３６〜２７４１頁〕。このことは、Ｂサブユニットをマウスに供給したとき、バングラディッシュにおけるコレラワクチンの実地試験おいて、そこで殺菌全細胞と共にＢサブユニットで口内免疫感作することによって粘膜ならびに全身性の抗毒素抗体応答が生じた観察によっても正しいことが見出された〔Svennerholmら,1984年版,J.Infect.Dis.,第149巻:884〜893頁〕。
ＣＴは、性能を有する口内免疫原であることに加えて、多くの他の報告された免疫的特性を有する。前述したように、ElsonおよびEalding〔ElsonおよびEalding,1984年版,J.Immunol.,第133巻:2892〜2897頁〕は、経口投与されたＣＴがそれ自身に対する寛容を誘導しないことを観察した。さらに、可溶性タンパク質抗原であるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と同時にＣＴを経口投与することにより、ＣＴおよびＫＬＨの両方に対する分泌型ＩｇＡ応答が進み、またＫＬＨに対する口内寛容の誘導を排除した。これらの知見は、LyckeおよびHolmgrenにより続いて確認され、拡張された〔LyckeおよびHolmgren,1986年版,Immunology,第59巻:301〜308頁〕。分子のアジュバント特性に関してＣＴのＡおよびＢサブユニットの役割を決定しようと試みたときに、混乱が生じる。Elsonにより要約された以下の観察〔Elson,1989年,Immunology Today,第146巻：29〜33頁〕がその混乱の元である。
・ＣＴは、それ自身に対する口内寛容を誘導しない〔ElsonおよびEalding,1984年,J.Immunol.,第133巻:2892〜2897頁〕。
・ＣＴ−Ｂは、それ自身に対する口内寛容を誘発しない〔ElsonおよびEalding,1984年,J.Immunol.,第133巻:2892〜2897頁〕。
・ＣＴは、同時に投与される他の抗原に対する寛容の誘導を妨げ、またこれらの抗原のためのアジュバントとして作用することができる〔ElsonおよびEalding,1984年,J.Immunol.,第133巻:2892〜2987頁；LyckeおよびHolmgren,1986年,Immunology,第59巻:301〜308頁〕。
・ＣＴは、ＣＴ−Ｂのアジュバントとして作用することができる〔ElsonおよびEalding,1984年,J.Immunol.,第133巻:2892〜2897頁〕。
・熱凝集ＣＴは、毒性がほとんどないが、強い口内免疫原である〔Pierceら,1983年,Infect.Immun.,第40巻：1112〜1118頁〕。
・ＣＴ−Ｂは、伝統的なハプテン−担体配置における免疫学的「担体」として作用することができる〔Cebraら,1986版,In:Vaccines,第86巻,Brownら（編集）,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,129〜133頁；MckenzieおよびHalsey,1984年,J.Immunol.,第133巻：1818〜1824頁〕。
多くの研究者が、これらの知見から、Ｂサブユニットが何か固有のアジュバント活性を有しているにちがいないと結論付けた。Cebraらの発見〔Cebraら,1986年版,In:Vaccines,第86巻,Brown（編集）,Cold Spring Harbor laboratory,New York,129〜133頁〕、LyckeおよびHolmgrenの発見〔LyckeおよびHolmgren,1986年版,Immunology,第59巻:301〜308頁〕およびLiangらの発見〔Liangら,1988年,J.Immunol.,第141巻:1495〜1501頁〕は、この結論に反論している。Cebraら〔Cebraら,1986年版,In:Vaccines,第86巻,Brown（編集）,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,129〜133頁〕は、精製したＣＴ−Ｂが、十二指腸投与した場合にパイエル板における特異的抗コレラトキシンＢ細胞の出現頻度を上昇させるのに有効であるが、ＣＴと対象的に、ＩｇＡ関連Ｂ細胞（IgA committed B-cells）が有意な数にならなかったことを示している。LyckeおよびHolmgren〔LyckeおよびHolmgren,1986年版,Immunology,第59巻:301〜308頁〕は、経口的に免疫感作したマウスの固有層における免疫グロブリン分泌細胞を測定することにより、ＫＬＨへの消化管粘膜免疫応答を上昇させる能力についてＣＴとＣＴ−Ｂとを比較した。彼らは、その系において試験したＢサブユニットの任意の投与量に対する抗ＫＬＨ産生細胞の増加を観察しなかった。最後に、Liangら〔Liangら,1988年,J.Immunol.,第141巻:1495〜1501頁〕は、不活性化センダイウイルスと共にＣＴ−Ｂを経口的に投与したときにアジュバント効果を発見しなかった。
単離したＢサブユニットについてアジュバント活性が発見された場合、それは典型的には、一つまたは二つの理由によるものであった。第１に、Ｂサブユニットを調製する伝統的な方法は、解離剤（すなわち、グアニジン塩酸または蟻酸）の存在下におけるゲル濾過による解離クロマトグラフィーにホロトキシンを供するというものであったことである。次に、単離されたサブユニットをプールして、解離剤を除去する。この技術により調製したＢサブユニットには、再生時に少量のホロトキシンが再構成されるような痕跡量のＡ−サブユニットが一定量混入している。第２の理由は、免疫学的担体の定義に関係する。多くの他の可溶性タンパク質と同様に、Ｂサブユニットは、免疫系の抗原提示のための免疫学的ビヒクルとして作用することができる。免疫性が乏しくなる程充分にこれらの抗原が小さい場合、それらは、伝統的なハプテン−担体配置において免疫原生を有するようにすることができる。同様に、Ｂサブユニットが上皮細胞の表面に結合し、消化管に関連するリンパ節組織によるプロセッシングのために付着した抗原を固定化し得るという、Ｂサブユニットに関する「理論的」な免疫増強（特に経口投与の場合）が存在する。しかしながら、抗原の安定化のこの機構への潜在的な利点は、免疫学的に適切でない組織、すなわち小腸上皮細胞表面を通過する抗原の分布により相殺され得る。粘膜の応答性について、免疫学的に適切な部位は、特に抗原特異的Ｔ細胞依存性Ｂ細胞の活性化のためのパイエル板である〔StroberおよびJacobs,1985年版,In:Advances in host defense mechanisms）,第４巻,Mucosal Immunity,GallinおよびFauci（編集）,Raven Press,New York,１〜３０頁；TomasiおよびPlaut,１９８５年版,In:Advances in host defense mechanisms,第４巻,Mucosal Immunity,GallinおよびFauci（編集）,Raven Press,New York,31〜61頁;Brandtzaeg,1989年版,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,第146巻：13〜25頁〕。すなわち、パイエル板においてＩｇＭ細胞からＩｇＡＢ細胞へのアイソタイプのスイッチングが起こる。上皮細胞表面上に局在化している抗原は、クラスII陽性絨毛状上皮細胞が、分泌部位におけるＴ細胞の活性化のための抗原提示細胞として作用することができ、それによってサイトカインの産生が増加し、終末Ｂ細胞が分化し、分泌成分の発現が上昇し、抗原特異的ＩｇＡの外部移送が増加する、という点において抗原誘導Ｂ細胞の増殖に寄与し得る〔Tomasi,T.B.およびA.G.Plaut,1985年版,In;Advances in host defense mechanisms,第４巻,Mucosal Immunity,GallinおよびFauci（編集）,Raven Press,New York,31〜61頁〕。これらの事項の関係は、他の抗原の担体としてのＢサブユニットについては明確には定義されず、「アジュバント」という用語の使用はそのような事項について不適当なはずである。
レセプターの認識およびＡサブユニットの細胞への浸透を促進のためにＢサブユニットが必要とされるホロトキシン中に、分子のアジュバント特性が帰属することが明らかである。おそらくＡＤＰリボシル化酵素活性およびｃＡＭＰの分子内レベルの上昇能の機能として、Ａサブユニットはアジュバント活性のためにも必要とされる（以下参照）。Ｂサブユニットは単独で他の抗原の担体として作用することができ、これらの抗原に結合したときに、抗原は、消化管に関連するリンパ組織によるプロセッシングに対して固定化され得る。
ＬＴとＣＴとは多くの共通する特徴を有しているが、これらは、それらをユニークにする生化学的および免疫学的相違を有する、明らかに異なる分子であり、その相違は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列相同性における２０％の相違を含む〔DallasおよびFalkow,1980年版,Nature,第288巻:499〜501頁〕。二つの毒素は同じサブユニット数および配列、同じ生物学的作用機構、および多くのin vitroアッセイにおいて同じ特異的活性を有する〔ClementsおよびFinkelstein,1979年版,Infect.Immun.,第24巻:760〜769頁；Clementsら,1980年版,Infect.Immun.,第24巻：91〜97頁〕。
しかしながら、これらの分子間には、それらの腸管毒性の特性に影響を与えるだけではなくアジュバントとして機能する能力にも影響を与える有意な違いがある。まず第１に、V.choleraeにより産生されたＣＴと異なり、ＬＴは結合した細胞に残っており、細胞の溶解中にE.coliから放出されるだけである〔ClementsおよびFinkelstein,1979年版,Infect.Immun.,第24巻:760〜769頁〕。ＣＴは、合成されると直ぐにビブリオ菌から分泌され、培養上清において容易に同定され精製され得る。その結果、ＣＴと対照的に、ＬＴは、最初に細胞から単離されたときに生物学的に充分には活性でない。細菌毒素のＡ−Ｂモデルと一致して、ＬＨは充分に活性であるためにはタンパク質分解およびジスルフィドの還元を必要とする。タンパク質分解のプロセッシングの不存在下において、酵素的に活性なＡ₁部分はＡ₂成分から会離させることができず、小腸上皮細胞の基底外側の表面における標的基質（アデニレートサイクラーゼ）に到達することができない。これはＣＴについても当てはまるが、精製中にト毒素が接触する培養上清中のプロテアーゼがタンパク質分解を行う。ＬＴは生物学的に充分に活性でないので、Ｙ−１副腎細胞アッセイまたは透過性因子アッセイのようなin vitroアッセイを用いる精製中を用いて同定することが困難である。
この単離された物質の活性における相違により、生物系におけるＬＴおよびＣＴの応答性の限界が相違する。例えば、ＣＴは、マウスの小腸において検出可能な実質の液体分泌を５〜10μｇの量で誘導する。ＬＴは、マウスの小腸における検出可能な実質分泌を100μｇを越えるレベルで誘導する。ウサギの結合された回腸輪において、相違は劇的であり、明瞭である。さらに、霊長類において、ＬＴは、１ミリグラムまでの試験した任意の量において液体分泌を誘導しないことが示された。これは、ヒトにおいて液体移動を誘導すると報告されたＣＴの量の20倍である。ＬＴがトリプシン様の特異性を有するタンパク質分解酵素と接触すると、いかなる生物学的アッセイ系においてもこの分子はＣＴから区別できなくなる。これは、ClementsおよびFinkelstein〔ClementsおよびFinkelstein,1979年版,Infect.Immun.,第24巻:760〜769頁〕により明らかに示された。
上記の報告された相違に加えて、ＬＴは、マトリックスに含まれる炭水化物について尋常でない親和性を有する。特に、分子量９００００のＬＴは、見掛けの分子量４５０００のセファデックスカラム（グルコース）および見掛けの分子量０のアガロースカラム（ガラクトース）から溶出する。すなわち、それはガラクトース含有マトリックスに結合し、ガラクトースの適用によりこれらマトリックスから純粋な状態で溶出することができる。ＬＴは、精製に用いるカラム内のアガロースのみならず、より重要なことには、糖タンパク質およびリポポリサッカリドを含めて、ガラクトースを含む他の生物学的分子にも結合する。このＬＴのレクチン様結合特性により、Ｇ_M1にのみ結合するＣＴと比べて、ＬＴについては哺乳類細胞におけるレセプター分布がより広くなる。これは、異なるヘルパーＴリンパ球応答を誘導するこれら二つの分子の報告された能力の相違を部分的に説明し得る〔McGheeら,1994年版,Mucosal Immunology Update,1994年春,Raven Press,New York,21頁〕。
McGheeらにより報告されたこれらの研究〔McGheeら,1994年版,Mucosal Immunology Update,1994年春,Raven Press,New York,21頁〕において、粘膜アジュバントとしてＣＴを用いるテタヌストキソイド（ＴＴ）のようなワクチンによるマウスの口内免疫感作は、ＴＨ細胞により示されるようにパイエル板および脾臓においてＴ_H２型細胞を選択的に誘導することが示された。ＴＨ細胞は、ＩＬ−４およびＩＬ−５を産生するが、ＩＬ−２またはＩＮＦ−γは産生しない〔サイトカインネットワークのより完全な総説としては、Araiら,1990年版,Ann.Rev.Biochem.,第59巻:783〜836頁を参照されたい。〕。重要なことは、ＣＴを粘膜アジュバントとして用いた場合、それがＩｇＡ応答に加えて抗原特異性ＩｇＥ応答をも増強させたことである。そのようなＩｇＥ応答の増強は、即時型過敏応答を誘導する恐れがあるために粘膜アジュバントとしてのＣＴの安全性を大きく損なう。これに対して、ＬＴは、経口投与される粘膜アジュバントとして用いた場合、Ｔ_H１およびＴ_H２細胞の両方ならびにＩｇＥの応答なしで主に抗原特異的ＩｇＡ応答を誘導する。
二つの分子は、免疫拡散研究〔ClementsおよびFinkelstein,1978年版,Infect.Immun.,第21巻：1036〜1039頁；ClementsおよびFinkelstein,1978年版,Infect.Immun.,第22巻:709〜713頁〕、in vitro中和の研究、および志願者におけるＢサブユニット全細胞コレラワクチンにおけるＬＴ関連E.coli性下痢に対する部分的な感染防御〔Clementsら,1988年版,J.Infect.Dis.,第158巻:372〜377頁〕により示されるように、多くの免疫学的相違をも有する。
要約すると、これらの発見は、ＬＴおよびＣＴが見掛け上の類似点にかかわらずユニークな分子であり、ＬＴは実用的な口内アジュバントであるがＣＴはそうではないことを示している。
本発明者らの一人により経口投与された抗原に対する寛容の発現に対するＬＴの影響を調べることにより、ＬＴのアジュバントとしての性質を明らかにした。その２つの分子の差異が観察されたとして、ＬＴも経口寛容の誘導に影響を及ぼすことになるか、ＣＴについて実証されたアジュバント作用を示すか否かについては明らかでなかった。従って、本発明者らは、いくつかのパラメーターを検討した。そのパラメーターとしては、ＯＶＡに対する経口寛容へのＬＴの効果および観察された応答におけるＬＴの２つのサブユニットの役割、ＬＴの送達のタイミングと経路の変更の効果、ＬＴがＯＶＡに対する寛容に影響を与える能力に対するＯＶＡへの前暴露の効果、２つの無関係な抗原とともにアジュバントとしてＬＴを使用すること、および抗ＯＶＡ応答に対する免疫化の経路の効果が挙げられる。これらの検討［Clementsら,1988,Vaccine 6:269-277;Clementsら,1988,Abstract No.B91,88th Ann.Meet.Am.Soc.Microbiol.］から得られた結果を以下にまとめる。
１．ＬＴをＯＶＡと同時に投与すると、ＯＶＡに対する寛容の誘導を妨げ、ＯＶＡで感作された動物およびＰＢＳで感作された動物それぞれよりも血清抗ＯＶＡＩｇＧ応答を３０〜９０倍増加することが示された。この効果は、この毒素の酵素的に活性なＡサブユニットの機能であることが決定された。なぜなら、Ｂサブユニット単独では寛容の誘導に影響を及ぼすことができなかったからである。
２．初期のＯＶＡ感作の後ＯＶＡとともにＬＴを与えた動物は、初期の免疫化においてＯＶＡとともにＬＴを与えた動物よりも、有意に低い血清ＩｇＧおよび粘膜ＩｇＡ抗ＯＶＡ応答を発現した。このことは、その抗原に前暴露すると、ＬＴの有効性が減少して、寛容およびそれがアジュバントとして作用する能力に影響を及ぼすことを示している。ＬＴは、一度確立されると、寛容を終わりにすることができなかった。これは、動物が経口オボアルブミンとＣＴの前にＯＶＡで予備免疫化されたときにＣＴについても当てはまることがわかり、これらのアジュバントを使用したときに標的でない食物抗原に対する抗体の応答が増加しないという有益な観察への何らかの洞察を与える。
３．抗原への最初の暴露において、たった一回ＬＴを与えられた動物における血清ＩｇＧおよび粘膜ＩｇＡ応答は、３回のＯＶＡ／ＬＴの感作の後の応答に相当した。このことは、応答性の約束が初期に、そして抗原への最初の暴露において成されたことを示している。また、優位に血清ＩｇＧまたは粘膜ＩｇＡのいずれかへ応答が向くかということは、非経口追加免疫投与がなされたか否かにより支配されうることが実証された。
４．ＬＴを２つの可溶性タンパク質抗原と同時に投与すると、その動物が前にいずれかによる免疫学的経験をしたことがないなら、両方の抗原に対する血清および粘膜抗体が発現する結果となる。これは重要な知見であった。というのは、複数の抗原に応答する能力が重要である場合、死んだ細菌やウイルスのような複合抗原（complex antigens）に対する粘膜抗体の発現のためにＬＴをアジュバントとして適用することが可能であろうからである。
Tamuraらによる検討［Tamuraら，米国特許第5,182,109号］は、鼻腔内投与されたＬＴおよび／またはＣＴが同時投与された抗原に対する抗体価を増強することを実証した。しかしながら、Tamuraらの文献のどこにも、これらの毒素が経口投与されたときに防御免疫応答を誘導できることが教示されていない。
明らかに、ＬＴは、特定の抗原に対する寛容の誘導を妨げる手段としても、経口投与された抗原のためのアジュバントとしても、有意な免疫調節の可能性を有し、ともに送達される抗原に対する血清ＩｇＧおよび粘膜ＩｇＡの両方の産生を引き起こす。これにより、死んだあるいは弱毒化された作用物または特定の作用物の関連毒性決定基の経口投与を含む広範な病原体に対する有効な免疫化プログラムの可能性が生じる。しかしながら、この“毒素”は、腸プロテアーゼによるようなタンパク質分解により切断されたときに、あるいは、十分に高い濃度で経口投与されたときに、正味の細胞間隙分泌応答（net lumenal secretory response）を刺激することができるという事実は、その可能性の調査を遅らせるか、適当な条件下でのその使用を妨げるかもしれない。この問題は、その分子のアジュバントとしての性質を減じることなくＬＴを“解毒”できるなら、解決できるであろう。これをどのようにして達成しうるか評価するためには、ＬＴおよびＣＴの作用のメカニズムとこれらの分子の構造的および機能的関係をさらに分析する必要がある。前記のように、ＬＴおよびＣＴの両方をＡおよびＢ成分とのマルチサブユニット毒素として合成する。この毒素と宿主細胞膜レセプターとの初期の相互作用の後、Ｂ領域が細胞膜を経由するＡサブユニットの浸透を容易にする。チオール還元により、このＡ成分は２つのより小さなポリペプチド鎖へ解離する。これらのうちの一つであるＡ₁片は、上皮細胞の基底外側表面上でのアデニル酸シクラーゼ酵素複合体における刺激ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇ_S）のＡＤＰリボシル化を触媒し、その結果、ｃＡＭＰの細胞内レベルが増加する。この結果として生じたｃＡＭＰの増加は、１）絨毛性上皮細胞のブラシの縁を越えるＮａＣｌの同時輸送、および２）陰窩細胞（crypt cells）による超電性Ｎａ⁺依存性Ｃｌ^-分泌［Field,1980,In:Secretory diarrhea,Fieldら,(ed.）,Waverly Press,Baltimore.p.21-30］を含む２つのｃＡＭＰ感受性イオン輸送メカニズムとの相互作用による、小腸への水と電解質の分泌を引き起こす。Ａサブユニットはこれらの毒素による免疫増強に関連する主な部分でもある。その上、このサブユニットは、その分子の毒性および免疫学的機能を切り離すために、操作のかっこうの標的となる。Lyckeらによる最近の報告［Lyckeら,1992,Eur,J.Immunol.22:2277-2281］は、この毒素のＡＤＰリボシル化酵素活性に影響を及ぼし、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させる能力を変える変更によっても、その分子がアジュバントとして機能することが妨げられることを明らかにしている。従って、解毒の別の方法を探索しなければならない。
３．発明の概要
本発明は、変異形態のＬＴ（これは、その毒性作用を喪失し、ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を持っていない）がなおも免疫学的アジュバントとしてのその活性を保持しているという驚くべき観察に基づく。変異形態のＬＴは、ひとつのアミノ酸置換、Arg₁₉₂-Gly₁₉₂により野生型とは異なっており、それによりトリプシン感受性部位が非感受性となっている。タンパク質分解性部位の喪失により、その毒性形態へのＡサブユニットのタンパク質分解性プロセシングが妨げられる。天然のＬＴは、細菌から最初に単離されたときには毒性でないが、哺乳類の腸に見いだされるようなプロテアーゼに暴露されたときには十分に毒性である可能性を持っている。タンパク質分解性の活性化のために、この変異形態のＬＴはもはや毒性となる可能性を持っていない。この変異型ＬＴ（以下、ｍＬＴ）は、ＬＴまたは毒性の副作用を全く持たないｍＬＴに関連のない抗原への動物の免疫応答（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ）を増強する能力を保持している。実験的証拠は、ｍＬＴには経口投与される抗原のためのアジュバントとしての有用性があり、そのような投与の結果、ｍＬＴとともに送達される抗原に対する血清ＩｇＧおよび／または粘膜ｓＩｇＡを産生する。本発明は、経口投与された何らかの抗原に対する宿主における血清および／または粘膜免疫応答を誘導する方法であって、有効量の抗原を経口投与するとともに、宿主に有効量のｍＬＴを投与することを含む前記の方法を提供する。好ましくは、抗原およびｍＬＴは同時投与量で初期に投与される。
本発明の方法および組成物は、病原性微生物に対する血清および粘膜抗体を発現するための経口免疫化の改良方式を与える。粘膜表面を越えて浸透または侵入する病原性微生物に対するＩｇＡ抗体応答は、その表面で起こりうる。その一方で、有意な血清抗体応答が発現して、血清抗体がそれから防御する病原性微生物による感染を妨げることができる。本発明は、いかなる特定の抗原に対しても役立つが、ここでは、その抗原に関連する生理的または疾病状態を取り除く際に特異的な中和抗体反応が役立つであろう。
本発明はまた、コレラ様エンテロトキシンを発現する腸管毒性細菌生物に対するワクチンの成分として役立つ組成物、およびその使用方法を提供する。
本発明はまた、これらの方法に役立つ組成物を提供する。この組成物は、有効量の抗原と組み合わせた、有効量のｍＬＴを含む。
４．図面の簡単な説明
本発明は、以下の発明の詳細な説明、本発明の特定の態様の実施例および添付の図面を参照して、より完全に理解されよう。
図１。ｌａｃプロモーターの制御下でサブユニットＡおよびＢの両方をコードするプラスミドｐＢＤ９４の概略図。プラスミドｐＢＤ９５は、サブユニットＡのアミノ酸残基１９２で一組の塩基置換を含んでおり、ＡｒｇではなくＧｌｙをコードしている。この置換は、読み枠を保存しているがタンパク質分解部位を除去している。トリプシン感受性の領域とアミノ酸置換Arg₁₉₂-Gly₁₉₂の部位に対応するアミノ酸配列を示す。
図２。ＣＴの増加量の関数としてのＡＤＰリボシルアグマチンのレベルの投与量依存性増加を図に示した。
図３。１２５μｇの天然のＬＴを与えた後であって、１２５μｇのｍＬＴをマウスに与えた後ではない流体の蓄積。腸−カーカス（carcass）比は、残っているカーカスの重量で腸の重量を割ったものと定義する。
図４。ｍＬＴが免疫学的アジュバントとして作用する能力。図４Ａ、ｍＬＴがＯＶＡへの血清ＩｇＧ応答を誘導する能力。図４Ｂ、ｍＬＴがＯＶＡへの粘膜ｓＩｇＡ応答を誘導する能力。
図５。ｍＬＴがＬＴに対する経口寛容の誘導を妨げる能力を保持していることの実験的な実証。図５Ａ、ｍＬＴがＬＴへの血清ＩｇＧ応答を誘導する能力。図５Ｂ、ｍＬＴがＬＴへの粘膜ｓＩｇＡ応答を誘導する能力。
５．発明の詳細な説明
本発明は、遺伝子的に修飾した細菌毒素と同時に経口投与される抗原に対する粘膜および血清抗体の産生を促進するための組成物およびその使用方法を包含する。この修飾毒素は、遺伝子工学によりそのトリプシン感受性部位を失って非毒性分子にはなったが、予期せぬことに、免疫アジュバントとして作用する能力を残している、大腸菌のある形の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）である。この変異型ＬＴは本明細書では「ｍＬＴ」と呼ばれる。本発明は、ｍＬＴが免疫アジュバンドとしてＬＴと同様に有効であるという発見、予期せぬ驚くべき結果に基づいている。ｍＬＴはもはや、Ａサブユニットをタンパク分解により処理できないため、ＡＤＰ−リボシル化の酵素活性を有していない。ＬＴのＡＤＰ−リボシル化活性に影響する改変はまた、その分子が免疫アジュバントとして機能することも妨げることを明らかにしたLyckeらが発表した研究［Lyckeら,1992,Eur.J.Immunol.22:2277-2281］とは対照的に、本明細書に記載されるｍＬＴは、実施例で証明されるようにＡＤＰ−リボシル化活性を持たないが、免疫アジュバントとしての活性を残している。
本明細書に記載される、この新規な変異型の大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンｍＬＴは、アジュバントとして作用し、ともに送達される抗原に対する血清ＩｇＧおよび粘膜ｓＩｇＡの両方の産生を引き起こす。この驚くべき発見の有用性は、アジュバントとして有効量のｍＬＴを種々の病原体に対する有効な免疫化プログラムにおいて利用することができることであり、これは、ＣＴまたはＬＴの経口投与に関連した現実のまたは潜在する毒性副作用の恐れのない、死んだかもしくは弱毒化した病原体または特異的な病原体の適切な毒性決定基と混合した有効量のｍＬＴアジュバントの経口投与よりなる。
本発明は、ＣＴ、ＬＴ、またはＣＴもしくはＬＴのサブユニットを使用することができる種々の免疫的用途に使用することができるという点で先行技術に取って代わるが、ｍＬＴでは今のところ、その使用に関連する現実のまたは潜在する副作用（例えば下痢）がない。細菌から最初に単離されるときには毒性ではないが、哺乳動物の腸に見られるようなプロテアーゼに暴露されると非常に毒性になる可能性を有するＬＴとは対照的に、ｍＬＴは、タンパク分解活性化によって毒性になる可能性はない。
本発明の別の実施態様は、コレラ様毒素を発現する腸管毒性生物に対するワクチンの成分としてのものである。本発明者らは、ｍＬＴが投与されるときに経口的に誘導される免疫寛容を受けず（下記参照）、そのためｍＬＴは、腸管毒性生物に対するワクチンの成分として機能することができ非常に望ましいものであることを証明した。現在の技術は、死んだ全細胞および毒素のＢサブユニットを含有する、コレラ様毒素を発現する生物に対するワクチンを提供する。ワクチンのＢサブユニットをｍＬＴで置換することにより、このワクチンは２つの異なる面で改善される。第一に、ＡおよびＢサブユニットの両方を有するｍＬＴは、ＢサブユニットだけでなくＡサブユニットに対する免疫応答も同様に誘導する。このため、有効な中和のための多くのエピトープが得られる。第二に、ｍＬＴに本質的なアジュバント活性は、ワクチンの死んだ全細胞成分に対する免疫応答を増強する。
更に、他の研究者［Haeseら,1994,Infect.Immun.62:3051-3057］は、ＡＤＰ−リボシル化酵素活性の活性部位を改変することにより、毒性を失うように修飾したＡサブユニットが、（本発明の主題であるタンパク分解部位とは対照的に）野生型Ａサブユニットに対する免疫応答を誘導できることを証明した。しかしこのように修飾されたＡサブユニットは、免疫アジュバント活性を失っており、このため、ｍＬＴに比べてワクチン成分として望ましいものではない。
更には、ｍＬＴに対する抗体は、ＬＴおよびＣＴと交差反応するため、ｍＬＴは、エシェリキア（Escherichia）種およびビブリオ（Vibrio）種のような、コレラ様毒素を発現する多くの型の腸管毒性細菌生物に対するワクチンに使用することができる。
５．１ｍＬＴの産生
野生型ＬＴ毒素は、この毒素を産生することができる毒素原性大腸菌の株に見られる天然のプラスミドにコードされている。本発明者らは、Ｈ１０４０７と呼ばれる大腸菌のヒト単離体からＬＴ遺伝子を以前にクローン化した。このサブクローンは、プラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に挿入されたＨ１０４０７のエンテロトキシンプラスミドからの５．２kbＤＮＡ断片よりなる［Clementsら,1983,Infect.Immun.40:653］。このｐＤＦ８２と呼ばれる組換えプラスミドは、広範に性状解析されていて、天然のＬＴプロモーターの制御下でＬＴを発現する。このプロセスの次の工程は、強力なプロモーター、この場合はプラスミドｐＵＣ１８上のｌａｃプロモーターの制御下に、このＬＴ遺伝子を置くことであった。これは、ＬＴ−ＡおよびＬＴ−Ｂの遺伝子を別々に単離し、これらをベクタープラスミド中のカセットに組換えることにより達成した。次の解析用に妥当な量のＬＴおよび誘導変異体の精製が可能になったため、これは重要な工程であった。このｐＢＤ９４と呼ばれるプラスミドは、図１に図示する。
ＣＴとＬＴは両方とも、Ａ₁およびＡ₂片を結合するトリプシン感受性ペプチド結合で合成される。このペプチド結合は、この分子が「毒性」であるために刻み目を入れなければならない。これは、原型のＡ−Ｂ毒素であるジフテリア毒素、および種々の他の細菌毒素についても真実である。Ａ₁−Ａ₂結合が、細菌のプロテアーゼまたは腸管腔の腸内プロテアーゼのいずれかにより除去されないならば、Ａ₁片は、腸上皮細胞の基底外側表面上のその標的に到達することができない。ＣＴとは対照的に、ＬＴは最初に細胞から単離されるとき十分に生物学的に活性ではない。ＬＴはまた、十分に活性になるためにタンパク分解を必要とし、細菌の中ではこのタンパク分解活性化が起こらない。したがって、ＡＤＰ−リボシル化酵素活性に影響を与えることなく、この分子の毒性を改変する１つの方法は、遺伝子操作によるＡサブユニットのＡ₁およびＡ₂成分を結合しているトリプシン感受性アミノ酸を除去することであろう。この分子をタンパク分解的に開裂することができないならば、この分子は毒性ではなくなる。しかし当業者であれば、この分子がそのＡＤＰ−リボシル化酵素活性を保持し、結果としてそのアジュバント機能を保持することを予測できるであろう。
図１は、Ａ₁とＡ₂片を分離する、ジスルフィドが限定する領域の配列を示す。この領域の中で、分子の毒性を活性化するのに必要な開裂の部位であると考えられているのは、単一のアルギニン残基である。この領域は、分子がタンパク分解的消化に非感受性になり、結果として、非毒性になるような方法で特定部位の突然変異誘発により変化させた。
特定部位の突然変異誘発は、一本鎖ＤＮＡに、中央部付近のミスマッチの領域を除いてこの一本鎖鋳型に相補的な合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより行われる。目的のヌクレオチド変化を含有するのはこの領域である。一本鎖標的ＤＮＡとのハリブリダイゼーション後、このオリゴヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼで延長して、二本鎖構造を作る。次にニックをＤＮＡリガーゼで封じて、この二本鎖構造を大腸菌宿主に形質転換する。この方法を利用する変異体の理論収率は、ＤＮＡ複製の半保存的モードにより５０％である。実際は、この収率ははるかに低い。しかし、収率を改善し、オリゴヌクレオチド指向性変異体を選択するための多くの方法が利用可能である。利用した系では、二重突然変異法で改変した制限部位を作るために、二番目の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを利用した。
次の工程は、Ａｒｇを別のアミノ酸に置換（即ち、ＧＧＡ＝ＧｌｙがＡＧＡ＝Ａｒｇを置換する）することであり、このため、タンパク分解部位は排除されるが、読み取り枠は保存された。次にｍＬＴは、アガロース親和性クロマトグラフィーにより、配列決定により確認された１つの変異体（ｐＢＤ９５）から精製した。精製の代替法は当業者には明らかであろう。次にＬＴ（_R192G）と呼ばれるこの変異型ＬＴを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、トリプシン感受性結合の修飾について試験した。試料は、トリプシンに暴露して、および暴露なしに試験して、天然（未修飾）ＬＴと比較した。ｍＬＴは、トリプシンと共にインキュベートされてもＡ₁とＡ₂に解離せず、これによりプロテアーゼに対する感受性が無くなったことを示した。
５．２ｍＬＴおよび関連のない（UNRELATED）抗原の投与の形態
本発明により、ｍＬＴは、生物学的に適切な（relevant）抗原および/またはワクチンに対する免疫応答の上昇が達成されるように、該抗原および/またはワクチンと組合せて投与することができる。好適な実施態様において、ｍＬＴおよび抗原は、有効量のｍＬＴおよび有効量の抗原を含む医薬組成物として同時に投与される。投与の形態は経口投与である。ｍＬＴおよび抗原の各々の量は使用される抗原の本体および免疫化される動物の種に応じて変化する。１つの実施態様においては、ｍＬＴおよび抗原の初期投与に続いて、適切な抗原でブーストする。別の実施態様においてブーストは行われない。ブーストのタイミングは、抗原および処理される種に応じて変えてよい。任意の種および抗原に対する用量範囲およびブーストのタイミングの調節は、通常の実験により容易に決定できる。ブーストは、抗原単独かまたはｍＬＴとの組合せで行うことができる。ブーストの投与の形態は、経口、鼻内、または非経口のいずれかであってよい；しかし、ｍＬＴがブーストに使用されるならば、この投与は好適には経口である。
本発明の方法および組成物は、未成熟および成熟脊椎動物、特に鳥類、哺乳動物、およびヒトにおいて使用することが意図されている。有用な抗原は、例としては、全細胞として、または当業者にはよく知られている生物を増殖させるために設計された培地培養物から単離される部分として免疫系に提示される、病原性株の細菌（化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes），肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae），淋菌（Neisseria gonorrheae），髄膜炎菌（Neisseria meningitidis），ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae），ボツリヌス菌（Clostridium botulinum），ウェルシュ菌（Clostridium perfringens），破傷風菌（Clostridium tetani），インフルエンザ菌（Hemophilus influenza e），肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae），Klebsiella ozaenae，Klebsiella rhinoscleromotis，黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus），Vibrio colerae，大腸菌（Escherichia coli），緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa），Campylobacter（Vibrio）fetus，Aeromonas hydrophila，セレウス菌（Bacillus cereus），Edwardsiella tarda，Yersinia enterocolitica，ペスト菌（Yersinia pestis），仮性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis），志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae），フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri），ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei），ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium），梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum），Treponema pertenue，Treponema carateneum，Borrelia vincentii，Borrelia burgdorferi，Leptospira icterohemorrhagiae，結核菌（Mycobacterium tuberculosis），トキソプラズマ原虫（Toxoplasmagondii），カリニ肺胞嚢虫（Pneumocystis carinii），野兎病菌（Francisella tularensis），バング菌（Brucella abortus），Brucella suis，マルタ熱菌（Brucella melitensis），マイコプラズマ（Mycoplasma）種，発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazekii），Rickettsia tsutsugumushi，クラミジア（Chlamydia）種）；病原性真菌（Coccidioides immitis，Aspergillus fumigatus,Candida albicans，Blastomyces dermatitidis，Cryptococcus neoformans，Histoplasma capsulatum）；原生動物（Entomoeba histolytica，Trichomonas tenas，Trichomonas hominis，Trichomonas vaginalis，Trypanosoma gambiense，Trypanosoma rhodesiense，Trypanosoma cruzi，Leishmania donovani，Leishmania tropica，Leishmania braziliensis，Pneumocystis pneumonia，Plasmodium vivax，Plasmodium falciparum，Plasmodium malaria）；または蠕虫（Enterobius vermicularis，Trichuris trichiura，Ascaris lumbricoides，Trichinella spiralis，Strongyloides stercoralis，Schistosoma japonicum，Schistosoma mansoni，Schistosoma haematobium，および鉤虫）からの抗原、あるいは遺伝子工学的方法または化学合成により得られる、このような生物からの保護抗原を含むが、これらに限定されない。
他の適切な抗原は、全体として、または当業者にはよく知られているウイルスを増殖させるために設計された培地培養物から単離される部分として免疫系に提示される、病原性ウイルス（例として、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純疱疹ウィルス１、単純疱疹ウィルス２、アデノウイルス、パポーバウイルス、エンテロウイルス、ピコルナウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、耳下腺炎、麻疹、ＲＳウイルス（respiratory syncytial virus）、風疹、アルボウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、非Ａ／非Ｂ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ロタウイルス、およびヒト免疫不全症ウイルスがあるが、これらに限定されない）、あるいは遺伝子工学的方法または化学合成により得られる、これらからの保護抗原であろう。
適切な抗原の更なる例は、ワクチンを含むが、これらの限定されない。このようなワクチンの例は、インフルエンザワクチン；百日咳ワクチン；百日咳ワクチンと組合せたジフテリアおよび破傷風トキソイド；Ａ型肝炎ワクチン；Ｂ型肝炎ワクチン；Ｃ型肝炎ワクチン；Ｅ型肝炎ワクチン；日本脳炎ワクチン；ヘルペスワクチン；麻疹ワクチン；風疹ワクチン；耳下腺炎ワクチン；麻疹、耳下腺炎および風疹の混合ワクチン；パピローマウイルスワクチン；パルボウイルスワクチン；ＲＳウイルスワクチン；ライム病ワクチン；ポリオワクチン；マラリアワクチン；水痘ワクチン；淋疾ワクチン；ＨＩＶワクチン；住血吸虫症ワクチン；ロタワクチン；マイコプラズマワクチン；肺炎球菌ワクチン；髄膜炎球菌ワクチンなどを含むが、これらに限定されない。これらは、既知の一般的なプロセスにより製造することができる。一般に、このようなワクチンは、当業者にはよく知られている方法により増殖させて単離する全生物体もしくはウイルスを含むか、または遺伝子工学的方法もしくは化学合成により製造される、これらの生物体もしくはウイルスの適切な抗原を含む。これらの製造は、以下により説明されるが、これらに限定されない：
インフルエンザワクチン：エーテルおよび界面活性剤により、胚を有する卵中で増殖させたウイルスを精製することにより、または遺伝子工学的方法もしくは化学合成により、入手可能な、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、核タンパク質およびマトリックスタンパク質の全部または一部よりなるワクチン。
百日咳ワクチン：百日咳菌（Bordetella pertussis）の培養ブロスもしくは細菌細胞から塩析もしくは超遠心分離により抽出される無毒性の毒素から、ホルマリンにより得られるか、または遺伝子工学的方法もしくは化学合成により得られる、百日咳毒素、赤血球凝集素およびＫ−アグルチン（K-agglutin）の全部または一部よりなるワクチン。
百日咳ワクチンと組合せたジフテリアおよび破傷風トキソイド：百日咳ワクチンと、ジフテリアおよび破傷風トキソイドを混合したワクチン。
日本脳炎ワクチン：マウスの脳内でウイルスを培養して、遠心分離もしくはエチルアルコールによりウイルス粒子を精製し、これを不活化することにより得られるか、または遺伝子工学的方法もしくは化学合成により得られる、抗原性タンパク質の全部または一部よりなるワクチン。
Ｂ型肝炎ワクチン：肝炎を媒介する血液から得られたＨＢ抗原を塩析もしくは超遠心分離により単離および精製することにより得られるか、または遺伝子工学的方法もしくは化学合成により得られる、抗原タンパク質の全部または一部よりなるワクチン。
麻疹ワクチン：培養ヒヨコ胚細胞もしくは胚を有する卵中で増殖させたウイルス、または遺伝子工学もしくは化学合成により得られた保護抗原の、全部または一部よりなるワクチン。
風疹ワクチン：培養ヒヨコ胚細胞もしくは胚を有する卵中で増殖させたウイルス、または遺伝子工学的方法もしくは化学合成により得られた縫合抗原の、全部または一部よりなるワクチン。
耳下腺炎ワクチン：培養ウサギ細胞もしくは胚を有する卵中で増殖させたウイルス、または遺伝子工学的方法もしくは化学合成により得られた保護抗原の、全部または一部よりなるワクチン。
麻疹、風疹および耳下腺炎の混合ワクチン：麻疹、風疹および耳下腺炎ワクチンを混合することにより製造されるワクチン。
ロタワクチン：培養ＭＡ１０４細胞中で増殖させたウイルス、もしくは患者の糞便から単離されたウイルス、または遺伝子工学的方法もしくは化学合成により得られた保護抗原の、全部または一部よりなるワクチン。
マイコプラズマワクチン：マイコプラズマ用の液体培地中で増殖させたマイコプラズマ細胞、または遺伝子工学的方法もしくは化学合成により得られた保護抗原の、全部または一部よりなるワクチン。
本方法により有効な予防が達成されるための条件は、当業者には明らかであろう。
本発明のワクチン製剤組成物は、上記で説明した抗原および／またはワクチンをｍＬＴと所望の比で混合することにより調製することができる。この調製は、厳密に無菌的に行う必要があり、また各成分も無菌である必要がある。発熱物質やアレルゲンは当然可能な限り完全に除去すべきである。本発明の抗原調製物は、抗原それ自体とｍＬＴを別々に調製することにより使用することができる。
更に本発明は、有効量の抗原およびアジュバントとして有効量のｍＬＴを含むキットを包含する。使用の際、このキットの成分は、最初に混合してそれから経口投与するか、または相互に短い時間内に別々に経口投与することができる。
本発明のワクチン製剤組成物は、液体または固体薬剤担体と組合せることができ、そしてこの組成物は、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、懸濁剤または液剤の形であってよい。本組成物はまた、適切な保存剤、着色料および香料、または徐放化するための薬剤を含有してもよい。本発明の医薬組成物の調製に使用することができる可能性ある担体は、ゼラチンカプセル、糖類、カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体、ゼラチン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、落花生油などのような植物油、グリセリン、ソルビトール、寒天および水を含むが、これらに限定されない。担体はまた、便利な経口投与のため組成物の錠剤化を容易にするための結合剤として作用してもよい。
本発明のワクチン製剤組成物は、凍結乾燥または当業者によく知られている他の手段により、即座に使用できるよう安定な保存形態で維持することができる。経口投与のため、このワクチン製剤は、緩衝化食塩水、ミルク、または他の任意の生理学的に適合性の液体媒体中で懸濁液として再構成することができる。この媒体は、必要に応じて適切な着色料および香料の添加により更に口に合うようにすることができる。
このワクチン製剤組成物の投与の前に、有効量の胃酸中和剤を経口投与することができる。この目的のために多くの化合物を使用することができるが、重炭酸ナトリウムが好適である。あるいは、このワクチン組成物は、腸溶性コーティングカプセル（即ち、胃を通過して始めて溶解するカプセル）で服用することができる。
６．実施例
以下の実施例は説明の目的のためにのみ示されるもので、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
6.1 mLTの構築
野生型LT毒素は、かかる毒素を産生可能な毒素原性大腸菌株に見出される天然に存在するプラスミド上にコードされている。以前、本発明者らはH10407と呼ばれる大腸菌のヒト分離株由来のLT遺伝子をクローン化した。このサブクローンは、プラスミドpBR322のPst I部位に挿入されたH10407のエンテロトキシンプラスミド由来の5.2kbのＤＮＡ断片からなる（Clements et al.,1983,Infect.Immun.40:653）。このpDF82と呼ばれる組換えプラスミドは広く特性付けられており、天然LTプロモーターの支配下でLTを発現する。このプロセスの次のステップは、強いプロモーター、すなわちこの場合にはプラスミドpUC18のlacプロモーターの支配下にLT遺伝子を配置することであった。このステップは、LT-AとLT-Bの遺伝子を別々に単離し、ベクタープラスミド中にカセットとしてそれらを挿入することにより行われた。このステップは、その後の分析用のLTと誘導変異体を合理的な量で精製することを可能にするので、重要なステップであった。pDF94と呼ばれるこのプラスミドを図１に模式的に示す。
CTとLTの両方を、A₁片とA₂片を結合するトリプシン感受性ペプチド結合を用いて合成する。このペプチド結合はその分子が「毒性」になるようにニックされねばならない。このことは、ジフテリア毒素、始原型A-B毒素およびその他の種々の細菌性毒素にもあてはまる。A₁-A₂結合が細菌性プロテアーゼまたは腸の管腔における腸管プロテアーゼのいずれによっても、すなわち、タンパク質分解性プロセッシングまたは活性化によってはずれない場合、A₁片は腸内上皮細胞の基底外側表面上のそのターゲットに到達することはできない。CTとは対照的に、LTは最初に細胞から単離された時にはあまり生物学的に活性ではない。LTは十分に活性であるためにはタンパク質分解が必要であり、タンパク質分解活性化は細菌の内部では生じない。したがって、ADP-リボシル化酵素活性に影響することなく分子の毒性を変える一つの手段は、遺伝子操作によってＡサブユニットのA₁成分とA₂成分を結合するトリプシン感受性アミノ酸を取り除くことであろう。分子がタンパク質分解的に切断され得ない場合、その分子は毒性にはならないであろう。しかしながら、当業者は、その分子がそのADP-リボシル化酵素活性を保持し、結果としてそのアジュバント機能を保持すると予想するであろう。
図１は、A₁片とA₂片を分離する、ジスルフィド内在領域の配列を示す。この領域内には、分子の毒素特性を活性化するのに必要な切断部位であると考えられている一つのアルギニン残基がある。この領域は、タンパク質分解性消化に対してこの分子を不感受性にして、その結果毒性がなくなるようにする方法である位置特異的突然変異誘発によって変更された。
位置特異的突然変異誘発は、１本鎖ＤＮＡに、その１本鎖ＤＮＡとその中心付近のミスマッチ領域以外は相補的である合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより行われる。かかる領域は所望の一つまたは複数のヌクレオチドの変更を含む。１本鎖標的ＤＮＡとハイブリダイズさせた後、前記オリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼで伸長させて２本鎖構造を作り出す。次いでニックをＤＮＡリガーゼを用いて封鎖し、その二重らせん構造によって大腸菌宿主を形質転換する。この手順を用いる変異体の理論収量は半保存的ＤＮＡ複製により50％である。実際には、その収量はかなり低い。しかしながら、収量を向上させ、オリゴヌクレオチド特異的変異体を選択するのに利用可能な多くの方法がある。二重突然変異戦略において変化制限部位を作り出すために、この用いられる系において第２の突然変異誘発オリゴヌクレオチドを利用した。
次のステップはArgを別のアミノ酸で置換する（すなわち、GGA=GlyがAGA=Argに取って代わる）ことであった。こうして読み枠が保存される一方でタンパク質分解部位が除去される。次いで、mLTを、配列決定により確認された一つの変異体（pBD95）からアガロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。別の精製方法があることは当業者には明白であろう。次に、このLT（_R192G）と呼ばれる変異体LTを、トリプシン感受性結合の修飾についてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって試験した。サンプルをトリプシンにさらしておよびトリプシンにさらさずに試験して天然（修飾されていない）LTと比較した。mLTはトリプシンとインキュベートした場合A₁およびA₂に解離しない。よって、プロテアーゼに対する感受性は除かれたことが示された。
6.2 Y-1副腎細胞に及ぼすmLTの効果
mLTはY-1副腎細胞アッセイにおいて活性でないことは当業者には予測されるであろう。この予測は、ニックされないLTはこのアッセイ系においてCTよりも1000倍以上活性が低く、LTはトリプシン処理によってこのアッセイにおいてCTと同レベルの生物学的活性まで活性化されたという先の所見（Clements and Finkelstein,1979,Infect.Immun.24:760-769）に基づくものであろう。トリプシン活性化の不存在下でのこのアッセイにおいて観察されたLTの残存活性は、説明することができない何らかの残存プロテアーゼの作用であると推定された。例えば、トリプシンはY-1副腎細胞を継代培養するプロセスにおいて用いられる。したがって、ニックされ得ないLTはY-1副腎細胞アッセイにおいて完全に不活性であると仮定された。結果を表Ｉに示す。

表Ｉは、Y-1副腎細胞アッセイにおいて、mLTは、たとえタンパク質分解的にプロセッシングされ得ないとしても基底レベルの活性を保持するという意外な所見を示す。表１に示されているように、CTとトリプシンで処理した天然LTは、Y-1副腎細胞上に同レベルの活性（15pg）を有している。それとは対照的に、mLT（48,000pg）は、CTおよび天然LTよりも活性が＞1,000倍低く、トリプシンによって活性化することができなかった。残存基底活性は、A₁−A₂結合の分離を要する副腎細胞活性化の経路とは異なったこれまで知られていない経路を疑いもなく示している。
6.3 mLTのADP-リボシル化酵素活性
Arg₁₉₂をGly₁₉₂で置換する突然変異は、A₁部分の酵素部位を変化させないので、当業者はmLTがそのADP-リボシル化酵素活性を保持していることを推測するであろう。この特性を試験するために、NAD-アグマチンADP-リボシルトランスフェラーゼアッセイを用いた（Moss et al.,1993,J.Biol.Chem.268:6383-6387）。図２に示されているように、CTはADP-リボシルアグマチンのレベル、すなわちこの分子のADP-リボシルトランスフェラーゼ活性の作用を用量依存的に増加させる。

表IIは、mLTはたとえ酵素部位が変化せず、そしてY-1副腎細胞アッセイにおいて明白な基底レベルの活性を有するとしても、トリプシン活性化の存在下または不存在下で、検出可能なADP-リボシル化酵素活性がないという予期しない所見を示す。
6.4 mLTのエンテロトキシン活性
mLTにはたとえ酵素部位が変化しなくてもトリプシン活性化の存在下または不存在下で検出可能なADP-リボシル化酵素活性がないという予期しない所見およびY-1副腎細胞アッセイにおいて基底レベルの活性を有するという更なる所見のために、mLTがそのエンテロトキシン特性を有するか否かは明らかでなかった。mLTの理想的なアジュバント製剤は免疫学的アジュバントとして作用する能力を保持するがLTまたはCTの使用に伴う下痢などの現実のまたは潜在的な副作用がない。図３は、mLTは125μgの用量ですら特許マウスモデルにおいて正味の体液分泌を誘発しないことを示す。この用量は、このモデルにおけるLTの効果的なアジュバント用量の５倍以上である。重要なことだが、このレベルでは天然LTの潜在的な毒性が見られる。
6.5 mLTのアジュバント活性
当業者は、mLTは明白なADP-リボシルトランスフェラーゼ活性を有さず、腸管毒性ではないので、アジュバント活性がないと予測するだろう。この予測はLyckeらの報告（Lycke et al.,1992,Eur.J.Immunol.22:2277-2281）に基づくものであり、この報告では毒素のADP-リボシル化酵素活性に影響を及ぼし、かつcAMPの細胞内レベルを増加させる能力を変える変異が、分子のアジュバントとしての機能をも妨げることが明らかにされている。上記したように、mLTはADP-リボシル化酵素活性を有さず、Y-1副腎細胞において何らかのはっきりしない基底活性のみを有しており、特許マウスモデルにおける正味の体液分泌を引き起こさない。
mLTのアジュバント活性を試験するために、以下の実験を行った。BALB/cマウス３群を免疫化した。動物は、先端が丸い植え付け送り針（blunt tipped feeding needle）（Popper&Sons,Inc.,New Hyde Park,New York）を用いて胃内に接種された。０日目に、各群を以下のようにして経口的に免疫化した：すなわち、Ａ群にはOVA５mgを含むＰＢＳ0.5mlを投与し、Ｂ群にはOVA５mgおよび天然LT25μgを含むＰＢＳ0.5mlを投与し、Ｃ群にはOVA５mgおよびmLT25μgを含むＰＢＳ0.5mlを投与した。７日目および14日目に、それぞれに再び投与した。21日目に全ての動物をOVA１μgを含む20％Maaloxで腹腔内追加免疫した。腹腔内接種の１週間後、動物を殺して、OVAおよびLTに対して特異的な血清IgGおよび粘膜IgA抗体をELISAによってアッセイした。
ELISA用の試薬および抗血清はSigma Chemical CO.から入手した。ELISA用のサンプルは、リン酸緩衝生理食塩水（pH7.2）−0.05％Tween20（PBS-TWEEN）で連続希釈した。抗LT測定のために、マイクロタイタープレートを混合ガングリオシド（タイプIII）により1.5μg/ウェルでプレコーティングし、次いで精製LTにより１μg/ウェルでプレコーティングした。抗OVAをOVAにより10μg/ウェルでプレコートしたマイクロタイタープレート上で測定した。血清抗LTおよび抗OVAをアルカリホスファターゼに結合したマウスIgGに対するウサギ抗血清を用いて測定した。粘膜抗LTおよび抗OVA IgAをマウスIgAに対するヤギ抗血清（α鎖特異的）を用いてアッセイし、次いでアルカリホスファターゼに結合したヤギIgGに対するウサギ抗血清を用いてアッセイした。３Ｎ NaOHを用いて反応を停止させた。IgG値およびIgA値を、精製マウス骨髄腫タンパク質（MOPC315,gA（IgA12）;MOPC 21,gG1:Litton Bionetics,Inc.,Charleston,SC）を用いた標準曲線から決定した。
6.5.1 血清IgG抗OVA
図4Aに示されたように、OVAおよびLTで経口的に感作し、その後OVAで非経口的に免疫感作した動物（4,058μg/ml）は、OVA単独で感作し、続いてOVAで非経口的に免疫感作した動物（抗OVA応答検出不能）よりも、有意に高い血清IgG抗OVA応答を発現した（スチューデントｔ試験ｐ＝0.031）。また、OVAおよびmLTで経口的に感作し、その後OVAで非経口的に免疫感作した動物（1,338μg/ml）も、OVA単独で感作し、続いてOVAで非経口的に免疫感作した動物（抗OVA応答検出不能）よりも、有意に高い血清IgG抗OVA応答を発現した（スチューデントｔ試験ｐ＝0.0007）。
6.5.2 粘膜sIgA抗OVA
図4Bに示されたように、抗OVA IgA応答をこれらの同じ動物群内で比較した場合にも同様の結果が得られた。OVAおよびLTで経口的に感作し、その後OVAで非経口的に免疫感作した動物（869ng/ml）は、OVA単独で感作し、続いてOVAで非経口的に免疫感作した動物（抗OVA応答検出不能）よりも、有意に高い粘膜IgA抗OVA応答を発現した（スチューデントｔ試験ｐ＝0.0131）。上記のように、OVAおよびmLTで経口的に感作し、その後OVAで非経口的に免疫感作した動物（230ng/ml）も、OVA単独で感作し、続いてOVAで非経口的に免疫感作した動物（抗OVA応答検出不能）よりも、有意に高い粘膜IgA抗OVA応答を発現した（スチューデントｔ試験ｐ＝0.0189）。
6.5.3 血清IgG抗LT
これらの同じ動物において抗LT抗体応答を誘発するLTおよびmLTの能力も試験した。これは、変異型LTが、その他のタンパク質に対するアジュバントとして機能することに加えてそれ自体への免疫寛容の誘発を妨げることができるか否かの指標を提供する点で重要である。図5Aに示されたように、OVAおよびLTで経口的に感作し、その後OVAで非経口的に免疫感作した動物（342μg/ml）は、OVA単独で感作し、続いてOVAで非経口的に免疫感作した動物（抗LT応答検出不能）よりも、有意に高い血清IgG抗LT応答を発現した（スチューデントｔ試験ｐ＝0.0005）。OVAおよびmLTで経口的に感作し、その後OVAで非経口的に免疫感作した動物（552μg/ml）は、OVA単独で感作し、続いてOVAで非経口的に免疫感作した動物（抗LT応答検出不能）よりも、有意に高い血清IgG抗LT応答を発現した（スチューデントｔ試験ｐ＝0.0026）。
6.5.4 粘膜sIgA抗LT
図5Bに示されたように、抗LT IgA応答をこれらの同じ動物群内で比較した場合にも同様の結果が得られた。OVAおよびLTで経口的に感作し、その後OVAで非経口的に免疫感作した動物（4,328ng/ml）は、OVA単独で感作し、続いてOVAで非経口的に免疫感作した動物（抗LT応答検出不能）よりも、有意に高い粘膜IgA抗LT応答を発現した（スチューデントｔ試験ｐ＝0.0047)。上記のように、OVAおよびmLTで経口的に感作し、その後OVAで非経口的に免疫感作した動物（1,463ng/ml）も、OVA単独で感作し、続いてOVAで非経口的に免疫感作した動物（抗LT応答検出不能）よりも、有意に高い粘膜IgA抗LT応答を発現した（スチューデントｔ試験ｐ＝0.0323）。
７．微生物の寄託
下記のプラスミドをアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）、Rockville、MDに1994年８月18日付けで寄託した。そして下記の受託番号を受けている。
プラスミド受託番号
大腸菌LTR192G中のpBD95 ATCC 69683
本明細書で開示した具体的な実施態様は、本発明のいくつかの局面の説明を意図するものであるので、これらの実施態様によって本明細書において記載し、特許請求の範囲で請求した発明の範囲が限定されるものではない。本発明の範囲には、あらゆる均等な実施形態が含まれる。実際、本明細書に示され、記載されたものに加えて本発明の種々の変更があることは上記のことから当業者には明らかになるであろう。そのような変更は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
また、全ての塩基対およびアミノ酸残基の数並びにヌクレオチドおよびペプチドに与えられた大きさはおおよそのものであり、説明の目的のために使用されることも理解されるであろう。
多くの参考文献が本明細書に引用されており、それら全体を参照することによって、これらの開示は全て本明細書に組み込まれる。

Claims

ホロトキシンのサブユニットAの192位のアミノ酸であるアルギニンがグリシンで置き換えられた変異型大腸菌熱不安定性エンテロトキシンホロトキシンであって、Y-1副腎細胞アッセイで測定した場合該ホロトキシンは天然型大腸菌熱不安定性エンテロトキシンホロトキシンよりも実質的に毒性が低く、かつ免疫アジュバンド活性を有しているが、NAD-アグマチンADP-リボシルトランスフェラーゼアッセイで測定した場合ADP-リボシル化酵素活性を欠いている、前記変異型大腸菌熱不安定性エンテロトキシンホロトキシン。
大腸菌熱不安定性エンテロトキシンのサブユニットAとサブユニットBの両方を発現する、ATCC受託番号69683である大腸菌LTR192Gから得ることができるプラスミドpBD95によりコードされる、請求項１に記載の変異型ホロトキシン。
抗原を請求項１に記載の変異型ホロトキシンと組み合わせて含むワクチン製剤。
好適な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項３に記載のワクチン。
抗原がインフルエンザワクチン、水痘ワクチン、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳ワクチン、日本脳炎ワクチン、百日咳とジフテリアおよび破傷風トキソイドとの混合ワクチン、ライム病ワクチン、ポリオワクチン、ヘルペスワクチン、乳頭腫ウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、ロタウイルスワクチン、ヒト免疫不全症ウイルス、カンピロバクター（campylobacter）ワクチン、コレラワクチン、腸病原性大腸菌ワクチン、腸管毒性大腸菌ワクチン、住血吸虫症ワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、おたふくかぜ（流行性耳下腺炎）ワクチン、麻疹と風疹とおたふくかぜの混合ワクチン、およびマイコプラズマワクチンよりなる群から選ばれる、請求項３に記載のワクチン製剤。
2成分：（a）有効量の抗原、および（b）ホロトキシンのサブユニットAの192位のアミノ酸であるアルギニンがグリシンで置き換えられた変異型大腸菌熱不安定性エンテロトキシンホロトキシンのアジュバント有効量を含んでなる、病原体に対する宿主の免疫応答を引き起こすためのキットであって、該変異型大腸菌熱不安定性エンテロトキシンホロトキシンは、Y-1副腎細胞アッセイで測定した場合天然型大腸菌熱不安定性エンテロトキシンホロトキシンよりも実質的に毒性が低く、かつ免疫アジュバンド活性を有しているがNAD-アグマチンADP-リボシルトランスフェラーゼアッセイで測定した場合ADP-リボシル化酵素活性を欠いているものであり、上記2成分の両方が経口的に許容される担体中に存在しており、かつ両成分を一緒に混合した後で投与するかまたは別々に投与してもよい、前記キット。
医薬として使用するための請求項１に記載の変異型エンテロトキシンホロトキシン。
抗原が細菌、ウイルス、原生動物、真菌、蠕虫および他の微生物病原体よりなる群に由来する、請求項３に記載のワクチンまたは請求項６に記載のキット。
抗原が腸管毒性細菌に由来する、請求項３に記載のワクチンまたは請求項６に記載のキット。
腸管毒性細菌がコレラ様毒素を産生する腸管毒性細菌よりなる群から選ばれる、請求項９に記載のワクチンまたはキット。
腸管毒性細菌が大腸菌またはビブリオコレラ菌（Vibrio cholera）である、請求項１０に記載のワクチンまたはキット。