JP4063882B2 - 新規テルフェニル化合物およびそれを含有する医薬 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は医薬として有用な化合物とその製造方法、およびその用途に関する。詳しくは、免疫抑制作用、抗炎症作用および抗癌作用を有する新規テルフェニル化合物とその製造方法、並びにそれを含有する免疫抑制剤、抗炎症剤および抗癌剤に関する。
背景技術
近年数多く行なわれるようになった組織、臓器等の移植手術は、機能の低下した臓器および組織の機能回復を計る手法として脚光を浴びている。しかし、術後の移植部分を排斥しようとする拒絶反応が移植手術の大きな課題であり、それを回避することが移植手術の成否を決定するといっても過言ではない。
そうした中で、免疫抑制剤は臓器または組織移植に対する拒絶反応、骨髄移植によって起こる移植片対宿主反応の予防および治療に用いられており、重要な役割を担う薬剤である。また、移植手術に伴う拒絶反応以外にも、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療およびアレルギー性疾患の治療にも多用されている。現在、アザチオプリン、コルチコイド、シクロスポリンＡやタクロリムス等種々の免疫抑制剤が開発・実用化されているが、効果や副作用の点で必ずしも満足できるものではない。
一方、抗癌剤も多数が実用化されてはいるが、それらの多くは強い抗癌作用の反面、副作用としての毒性も併せ持っている為、その使用量が限定されている。
これらの状況から、強い活性を有し、かつ安全に用いることができる免疫抑制剤および抗癌剤の開発が望まれていた。
本発明化合物と同系統の化合物が、ケミカル ファ−マシュ−ティックス ビュ−リチン（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２４（４），６１３−６２０（１９７６））、ザ ジャ−ナル オブ アンチバイオチックス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，３２（６），５５９−５６４（１９７９））およびアグリカルチュアル バイオロジカル ケミストリ−（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（３），８６７−８６８（１９８５））等に記載されている。これらの文献には、ウニの胚細胞やヒラ細胞に対して毒性を有することが開示されているが、免疫抑制作用、抗炎症作用及び抗癌作用については全く言及されていない。
発明の開示
本発明の目的は、優れた免疫抑制作用、抗炎症作用または抗癌作用を有する新規化合物、その製造方法およびそれを含有する免疫抑制剤、抗炎症剤または抗癌剤を提供することにある。
本発明者らは、糸状菌の一種であるアスペルギルス カンディダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ）ＲＦ−５７６２株の培養液中に強い免疫抑制作用、抗炎症作用および腫瘍細胞増殖抑制作用を有する化合物が含まれていることを見出し、その活性化合物を単離・精製し、本発明を完成した。
即ち、本発明は式（Ｉ）：

（式中、Ｒ¹は水素またはヒドロキシであり、Ｒ²はヒドロキシまたはメトキシである。）
で示される化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物を提供するものである。また、本発明はアスペルギルス属に属し、化合物（Ｉ）を産生し得る微生物を培養し、得られた培養物から化合物（Ｉ）を採取することを特徴とする化合物（Ｉ）の製造方法を提供するものである。さらに本発明は、化合物（Ｉ）の前駆体である、式（ＩＩ）：

（式中、Ｒ¹およびＲ²は前記と同義である）
で示される化合物を３−メチル−２−ブテニル化することを特徴とする、化合物（Ｉ）の製造方法を提供するものである。
また、別の態様として、本発明は化合物（Ｉ）を含有する医薬、詳しくは免疫抑制剤、抗炎症剤または抗癌剤を提供する。さらに、化合物（Ｉ）を投与することを特徴とする、免疫反応の抑制の方法、炎症の治療または予防の方法および癌の治療の方法を提供する。さらに別の態様として、免疫反応の抑制、炎症の治療または予防および癌の治療のための医薬を製造するための、化合物（Ｉ）またはの使用を提供する。さらに、本発明はアスペルギルス カンディダス属に属し、化合物（Ｉ）を産生する微生物に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明化合物（Ｉ）の微生物培養による製造方法および化学合成による製造方法を説明する。
微生物培養による製造方法
本微生物培養法においては、本発明化合物（Ｉ）を産生し得る微生物を通常の発酵生産に用いる培地組成、培地条件で培養し、通常の発酵生産物を分離採取する方法により化合物（Ｉ）を単離する。
本発明化合物（Ｉ）を産生し得る微生物としては、アスペルギルス属に属する微生物、例えばアスペルギルス カンディダス ＲＦ−５７６２株が例示される。アスペルギルス カンディダス ＲＦ−５７６２株は以下のような形態学的性状を有していた。
本菌株はツァペック寒天培地上、コロニーは白色からクリーム色を呈し、偏平で、辺縁は切裂状である。
分生子頭の生育は良好で、コロニー裏面は無色からクリーム色である。時として寒天中に茶色の色素を出す。分生子頭は直径１５０〜２５０μｍのゆるい球形で、後に裂けて分枝し、同時に直径２５〜５０μｍの小型分生子頭も形成される。
分生子柄は長さ２０〜３００μｍ、直径４．０〜６．０μｍで壁面は薄く、隔壁がある。
頂のうは球形〜長球形で、１３．０〜１５．０×１３．０〜１５．０μｍである。表面にメトレを形成するが、小型の分生子頭ではこれを欠き、ペニシラス状になる。
メトレは３．５〜４．５×６．５〜７．５μｍで、ときに肥大化し、球形〜洋ナシ形となり、サイズは１０．０〜１４．０×１０．０〜１４．０μｍである。
フィアライドは１．５〜２．５×４．０〜８．０μｍ。分生子は直径２．５〜４μｍの球形で、表面は平滑である。
生育温度は１４℃〜３６℃であり、至適生育温度は２２℃〜３２℃である。
以上の性状を文献（ザ ジ−ナス アスペルギルス（Ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ），３４７−３５０（１９６５）ウィリアムズ＆ウィルキンス社（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）；ジャ−ナル オブ ジ アンチバクテリウム アンド アンチフンガル エイジェンツ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ａｇｅｎｔｓ）１９（９），４８９−４９５（１９９１）；菌類図鑑（下），１００６−１０４５（１９７７）、講談社；コンペンディウム オブ ソイル フンギ リプリント（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｏｉｌ Ｆｕｎｇｉ Ｒｅｐｒｉｎｔ）１９９３，８３−８５）に記載されているアスペルギルス属の既知種と比較した。その結果、本菌をアスペルギルス カンディダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ Ｌｉｎｋ ｅｘ Ｌｉｎｋ １８２４）と同定した。
尚、本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号、郵便番号３０５）に受託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−１５４３９」として平成８年（１９９６年）２月１５日より寄託されており、平成９年（１９９７年）３月２１日に受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８２」としてブタペスト条約に基づく国際寄託に移管された。
本発明化合物（Ｉ）の生産用培地としては、炭素源、窒素源及び無機塩を適当量含有するものであれば合成培地または天然培地のいずれでも好適に用いることができる。必要に応じて、ビタミン類またはその他栄養物質を適宜加えてもよい。
炭素源としては例えば、グルコ−ス、マルト−ス、フラクト−ス、シュ−クロ−ス、デンプン等の糖類、グリセロ−ル、マンニト−ル等のアルコ−ル類、グリシン、アラニン、アスパラギン等のアミノ酸類、グルコン酸、ピルビン酸、酢酸等の有機酸、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸およびそのグリセライド等のの一般的な炭素源より微生物の資化性を考慮して１種または２種以上を適宜選択して用いればよい。
窒素源としては、大豆粉、コ−ンスチ−プリカ−、ビ−フエキス、ペプトン、酵母エキス、各種アミノ酸等の有機含窒素化合物またはアンモニウム塩、硝酸塩、無機窒素化合物等が挙げられ、微生物の資化性を考慮して１種または２種以上を適宜選択して用いればよい。
無機塩としては、例えば炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバルト、各種リン酸塩を必要に応じて添加すれば良い。
また、消泡剤、例えば植物油、ラ−ド、ポリプロピレングリコ−ル等は必要に応じて添加することができる。
さらに、結晶セルロースやパルプのような固形分を培地に添加することにより、発酵を安定化することも可能である。
培養温度は微生物が発育し、本発明化合物（Ｉ）を生産する範囲で適宜変更できるが、好ましくは１５℃〜３０℃であり、さらに好ましくは２０℃〜２６℃である。ｐＨは６〜８付近が好ましく、培養時間は通常数日〜数週間程度であるが、本発明化合物（Ｉ）の生産量が最高に達した時に培養を終了すればよい。培養方法は固相培養、通気撹拌培養等の通常用いられる方法であればいずれも好適に用い得る。なお、本培養工程では本発明化合物（Ｉ）の前駆体である化合物（ＩＩ）も同時に産生され得る。
培養物から発酵生産物を分離採取する方法には、濾過、遠心分離、各種イオン交換樹脂やその他の活性吸着剤による吸脱着やクロマトグラフィ−、各種有機溶媒による抽出等を適当に組み合わせた通常の発酵生産物分離精製法を用いることができる。例えば、培養物より分離した菌体を有機溶媒（酢酸エチル、アセトン、メチルエチルケトン等）で抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーと高速液体カラムクロマトグラフィーを組み合わせて分離精製すればよい。
化学合成による製造方法
発酵により得られた化合物が本発明化合物（Ｉ）の前駆体である（式（ＩＩ）で表わされる化合物である）場合には、適当な条件下、３−メチル−２−ブテニル化反応に付して本発明化合物（Ｉ）に誘導すればよい。
まず、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン等の有機溶媒を用いて前駆体を溶解し、これにアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の水酸化物もしくは炭酸塩または三級アミン等の塩基性助剤を加える。ここで用いられるアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の水酸化物もしくは炭酸塩としては例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムおよび炭酸カルシウム等が挙げられる。また、三級アミンとしては例えばトリエチルアミン等が挙げられる。
次いで得られた溶液に３−メチル−２−ブテニルブロマイド等の３−メチル−２−ブテニルハライドを加え、選択的に３−メチル−２−ブテニル化することにより本発明化合物（Ｉ）が得られる。
また、本発明化合物（Ｉ）の一つである、式（Ｉ）においてＲ¹およびＲ²がヒドロキシである化合物（以下化合物（Ｉ−１）とする）をアルキル化反応に付すことによりＲ¹がヒドロキシ、Ｒ²がメトキシである化合物（以下化合物（Ｉ−３）とする）が得られる。
具体的には、化合物（Ｉ−１）を有機溶媒に溶解し、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の水酸化物もしくは炭酸塩または三級アミン等の塩基性助剤を加える。ここで用いることができる有機溶媒、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の水酸化物もしくは炭酸塩および三級アミン等の塩基性助剤は前記と同様のものが挙げられる。次いで得られた溶液にジメチル硫酸、ベンゼンスルホン酸等のメチル硫酸エステル類またはヨウ化メチルおよび臭化メチル等のメチルハライド等のメチル化剤を加えてメチル化すればよい。
本発明化合物（Ｉ）は、生成可能であり、製薬上許容される塩をも包含し、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。塩は通常用いられる反応を用いて形成させることができる。
また、本発明化合物（Ｉ）はその水和物をも包含し、本発明化合物１分子に対して任意の数の水分子と結合していてもよい。
本発明化合物（Ｉ）は強い免疫抑制作用および抗炎症作用を有している。具体的には、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−５のサイトカイン産生抑制作用、Ｔ、Ｂ両細胞に対する非常に強い増殖抑制作用および／または抗体産生抑制作用（例えばＩｇＥ、ＩｇＧ等、特にＩｇＥ）を有する。また、腫瘍細胞増殖抑制作用も有している為、医薬としてヒトを含む動物の免疫抑制、抗炎症または腫瘍増殖抑制のために投与することができる。
免疫抑制剤または抗炎症剤としての本発明化合物（Ｉ）は、臓器または組織移植に対する拒絶反応、骨髄移植によって起こる移植片対宿主反応、アレルギー性疾患（例えば気管支喘息、アレルギ−性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アトピー等）、高好酸球症候群、アレルギー性結膜炎、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、ＭＣＴＤ、慢性関節リウマチ、炎症性大腸炎、虚血再潅流における傷害、花粉症、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹および乾癬等のアレルギー性疾患の予防または治療に有用である。また、抗癌剤として種々の血液系腫瘍、固形癌等の腫瘍の治療に有用である。
本発明化合物（Ｉ）を医薬として投与する場合、経口的、非経口的のいずれでも安全に投与することができる。経口投与は常法に従って錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、丸剤、液剤、シロップ剤、バッカル剤または舌下剤等の通常用いられる剤型に調製して投与すればよい。非経口投与は、例えば筋肉内投与、静脈内投与等の注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等、通常用いられるいずれの剤型でも好適に投与することができる。特に経口投与が好ましい。
本発明化合物（Ｉ）の有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤とを必要に応じて混合し医薬製剤とすることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。
具体的には、賦形剤としては乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウムもしくは結晶セルロ−ス等、結合剤としてはメチルセルロ−ス、カルボキシメピロリドン等、崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロ−ス、カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末もしくはラウリル硫酸ナトリウム等、滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウムもしくはマクロゴ−ル等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴ−ルもしくはメチルセルロ−ス等を用いることができる。また液剤もしくは乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加しても良く、経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えても良い。
本発明化合物（Ｉ）の免疫抑制剤、抗炎症剤または抗癌剤としての投与量は、患者の年齢、体重、疾病の種類や程度、投与経路等を考慮した上で設定することが望ましいが、成人に経口投与する場合、通常０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。非経口投与の場合には投与経路により大きく異なるが、通常０．００５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。これを１日１回〜数回に分けて投与すれば良い。
以下に実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
実施例
実施例１ 化合物（Ｉ）の分離採取
１．発酵工程
アスペルギルス カンディダスＲＦ−５７６２の発酵：グルコース５．０％、コーンスチープリカー５．０％、炭酸カルシウム０．２％および水道水からなる培地１００ｍｌ（ｐＨ７．０、滅菌前）を含む５００ｍｌ容マイヤーフラスコに、試験管に斜面培養したアスペルギルス カンディダスＲＦ−５７６２を植菌し、２２０回転／分の回転振盪機上、２５℃で４日間培養を行った。この培養液４ｍｌずつを、グリセリン２．０％、シュ−クロ−ス２．０％、ビ−フエキス０．３％、酵母エキス０．２％よりなる発酵培地１００ｍｌ（ｐＨ７．０、滅菌前）を含む５００ｍｌ容マイヤ−フラスコ２０本に植菌し、１８０回転／分の回転振盪機上、２３℃で、１２日間培養した。
２．分離・精製工程
発酵工程で得られた培養液２Ｌを減圧濾過によって瀘液と菌体に分けた。菌体部はアセトン５００ｍｌで２回抽出、減圧濾過後、瀘液を減圧下濃縮した後、先の濾液と共に酢酸エチル抽出（ｐＨ６、５００ｍｌ×２）を行ない、水洗後減圧下溶媒を留去し粗製物質７．８５ｇを得た。粗製物質７．８５ｇを３０ｍｌのクロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０、７０〜２３０ｍｅｓｈ、３２ｍｍ ｉ．ｄ．×３００ｍｍ）に付した。クロロホルム３００ｍｌ、次いでクロロホルム：メタノール（２０：１）４００ｍｌで展開し、化合物（Ｉ−１）、（ＩＩ−１）、（Ｉ−２）および（Ｉ−３）を含む分画Ｆｒ．１〜３（４２０ｍｌ）を集め、減圧下で濃縮乾固し粗精製物０．６５７ｇを得た。
続いて溶出されるＦｒ．４〜７（２８０ｍｌ）は化合物（ＩＩ−２）を含んでおり、それを濃縮乾固し、粗精製物０．５７７ｇを得た。さらに、クロロホルム：メタノール（２０：１．５）４００ｍｌで展開し、溶出される分画Ｆｒ．８〜９（２１０ｍｌ）より化合物（ＩＩ−３）１．６ｇを、続いてさらにメタノール含量を増やしたクロロホルム：メタノール（２０：１０）３００ｍｌで溶出される分画Ｆｒ．１０〜１２（１６０ｍｌ）より化合物（ＩＩＩ）を含む粗精製物１．４６ｇを得た。
２−１．化合物（Ｉ−１）、（ＩＩ−１）、（Ｉ−２）、（Ｉ−３）の分離
化合物（Ｉ−１）、（ＩＩ−１）、（Ｉ−２）および（Ｉ−３）を含む分画Ｆｒ．１〜３粗精製物（０．６５７ｇ）は再びシリカゲルクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０、７０〜２３０ｍｅｓｈ，２０ｍｍ ｉ．ｄ．×３５０ｍｍ）に付した。粗精製物０．６５７ｇを展開溶媒トルエン：アセトニトリル（８５：１５）、５ｍｌに溶解し、同溶媒で展開して５ｇずつフラクションを集めた。Ｆｒ．１３〜１６に化合物（Ｉ−２）、Ｆｒ．２３〜２６に化合物（Ｉ−３）、Ｆｒ．２７〜３３に化合物（Ｉ−１）および（ＩＩ−１）がそれぞれ含まれており、各分画を濃縮乾固して９７ｍｇ，１２８ｍｇ，１１７ｍｇを各々得た。
２−２．化合物（Ｉ−１）、（ＩＩ−１）の精製
化合物（Ｉ−１）および（ＩＩ−１）を含む１１７ｍｇをシリカゲルクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０、７０〜２３０ｍｅｓｈ、２０ｍｍ ｉ．ｄ．×３５０ｍｍ）に付し、展開溶媒トルエン：アセトニトリル（９０：１０）、３ｍｌに溶解し、同溶媒で展開して５ｇずつフラクションを集めた。Ｆｒ．４８〜６５（９０ｍｌ）に化合物（Ｉ−１）および（ＩＩ−１）が溶出された。減圧下濃縮乾固し、９０ｍｇの分画を得た。次に中圧液体クロマトグラフィーにより分離精製を行なった。ＹＭＣ ＧＥＬ ＯＤＳ−ＡＭ１２０−Ｓ５０、２０ｍｍ ｉ．ｄ．×５００ｍｍのカラムを用い、展開溶媒として５０％アセトニトリル水溶液を用いた。５９４〜６４８ｍｌに溶出される分画に化合物（ＩＩ−１）が、７０２〜７５６ｍｌに溶出される分画に化合物（Ｉ−１）が溶出された。各分画を集め、減圧下濃縮し、アセトニトリルを除いた後、残渣を酢酸エチルで抽出、無水硫酸ソーダで乾燥、濃縮乾固して純粋な無色粉末の（ＩＩ−１）を１０ｍｇ、純粋な無色粉末の化合物（Ｉ−１）を７０ｍｇそれぞれ得た。（ＩＩ−１）は式（ＩＩ）においてＲ¹およびＲ²が水素である化合物であり、ケミカル ファ−マシュ−ティックス ビュ−リチン（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２４（４），６１３−６２０（１９７６））に記載の４″−デオキシテルフェニリンであった。
化合物（Ｉ−１）：Ｒ¹＝Ｒ²＝ＯＨ
化合物名：３’，６’−ジメトキシ−４−（３−メチル−２−ブテニルオキシ）−［１，１’：４’，１’’］テルフェニル−３，２’，４’’−トリオ−ル
性状：無色プリズム状結晶
溶解性：アセトン、酢酸エチル、クロロホルムに可溶 水に不溶
融点：１５５．５〜１５６℃
ＨＲ−ＬＳＩＭＳ，ｍ／ｚ：計算値Ｃ₂₅Ｈ₂₆Ｏ₆：４２２．１７２８
実測値 ：４２２．１７３０［Ｍ］⁺
ＬＳＩ−ＭＳ，ｍ／ｚ：４２２［Ｍ］⁺
ＵＶ（メタノール）ｎｍ（ε）：
２３０（ｓｈ），２７７（２５，７００）
２３５（ｓｈ），２９７（２６，２００） ０．０１Ｎ−ＮａＯＨ添加
２３０（ｓｈ），２７６（２４，５００） ０．０１Ｎ−ＨＣｌ添加
ＩＲｃｍ^-1（ＫＢｒ）：３３９３，２９３２，１６１１，１５８８，１５２２，１４９０，１１１７，１０７１，１００１
¹ＨＮＭＲ（アセトン−ｄ₆，６００ＭＨｚ）δ：１．７７（３Ｈ，ｂｒ．ｓ ｌｉｋｅ），１．７９（３Ｈ，ｂｒ．ｓ ｌｉｋｅ），３．３７（３Ｈ，ｓ），３．７３（３Ｈ，ｓ），４．６３（２Ｈ，ｂｒ．ｄ ｌｉｋｅ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），５．５２（１Ｈ，ｍ）、６．４９（１Ｈ，ｓ），６．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．２Ｈｚ），６．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），６．９４（２Ｈ，７ｍ），６．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．５４（２Ｈ，ｍ），７．６２（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．７８（１Ｈ，ｓ），８．６４（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）
¹³ＣＮＭＲ（アセトン−ｄ₆，１５０ＭＨｚ）δ：１８．３１（ｑ），２６．００（ｑ），５６．０４（ｑ），６０．６７（ｑ），６６．１８（ｔ），１０３．８５（ｄ），１１２．７５（ｄ），１１６．０６（ｄ），１１７．６１（ｓ），１１８．９７（ｄ），１２１．４４（ｄ），１２３．１５（ｄ），１２７．９１（ｓ），１３０．４８（ｓ），１３０．８５（ｄ），１３３．５４（ｓ），１３７．５０（ｓ），１４０．０４（ｓ），１４６．２３（ｓ），１４６．７９（ｓ），１４９．２４（ｓ），１５４．５１（ｓ），１５７．７９（ｓ）
ＴＬＣＲｆ値（濃硫酸試薬で検出）：０．２３（トルエン：アセトニトリル＝８５：１５）
ＨＰＬＣ分析：
保持時間：５．６分
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ、ＡＭ−３０２、４．６ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（株式会社ワイエムシイ製）
移動相：アセトニトリル：水＝５５：４５
流速：１ｍｌ／分
検出：２８０ｎｍ（ＵＶ）
２−３．化合物（Ｉ−２）の精製
化合物（Ｉ−２）成分を含む９７ｍｇは中圧液体クロマトグラフィーに付した。ＹＭＣ ＧＥＬ ＯＤＳ−ＡＭ１２０−Ｓ５、２０ｍｍ ｉ．ｄ．×５００ｍｍのカラムを用い展開溶媒として７０％アセトニトリル水溶液を用いた。３７５〜４３５ｍｌに溶出される分画を集め減圧下濃縮しアセトニトリルを除いた後、残渣を酢酸エチルで抽出、無水硫酸ソーダで乾燥、濃縮乾固して純粋な無色粉末の化合物（Ｉ−２）を７０ｍｇ得た。
化合物（Ｉ−２）：Ｒ¹＝Ｈ、Ｒ²＝ＯＨ
化合物名：３’，６’−ジメトキシ−４−（３−メチル−２−ブテニルオキシ）−［１，１’；４’，１’’］テルフェニル−３，２’−ジオール
性状：無色粉末
溶解性：アセトン、酢酸エチル、クロロホルムに可溶 水に不溶
ＨＲ−ＬＳＩＭＳ，ｍ／ｚ：計算値Ｃ₂₅Ｈ₂₆Ｏ₅：４０６．１７７９
実測値 ：４０６．１７８０［Ｍ］⁺
ＬＳＩ−ＭＳ，ｍ／ｚ：４０６［Ｍ］⁺
ＵＶ（メタノール）ｎｍ（ε）：
２２５（ｓｈ），２７４（１７，６００）
２２５（ｓｈ），２５５（ｓｈ），２９５（２６，２００）０．０１Ｎ−ＮａＯＨ添加
２２５（ｓｈ），２７３（１８，０００）０．０１Ｎ−ＨＣｌ添加
ＩＲｃｍ^-1（ＫＢｒ）：３５０６，３４６５，２９３４，１５８５，１５１８，１４０８，１１１６，１０７０，１００８
¹ＨＮＭＲ（アセトン−ｄ₆，６００ＭＨｚ）δ：１．７７（３Ｈ，ｓ−ｌｉｋｅ），１．７８（３Ｈ，ｓ−ｌｉｋｅ），３．３８（３Ｈ，ｓ），３．７３（３Ｈ，ｓ），４．６３（２Ｈ，ｂｒ．ｄ−ｌｉｋｅ），５．５３（１Ｈ，ｍ），６．５２（１Ｈ，ｓ），６．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．２Ｈｚ），６．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．３５（１Ｈ，ｍ），７．４４（１Ｈ，ｓ），７．４６（２Ｈ，ｍ），７．６５（１Ｈ，ｓ），７．６６（２Ｈ，ｍ）
¹³ＣＮＭＲ（アセトン−ｄ₆，１５０ＭＨｚ）δ：１８．３４（ｑ），２６．００（ｑ），５６．２６（ｑ），６１．０４（ｑ），６６．４４（ｔ），１０４．４５（ｄ），１１３．１０（ｄ），１１８．６３（ｓ），１１９．０７（ｄ），１２１．５６（ｄ），１２３．２８（ｄ），１２７．９６（ｓ），１２８．２５（ｄ），１２９．３５（ｄ），１２９．８４（ｄ），１３３．８５（ｓ），１３７．７０（ｓ），１３９．６５（ｓ），１４０．４６（ｓ），１４６．５０（ｓ），１４７．０７（ｓ），１４９．４０（ｓ），１５４．７８（ｓ）
ＴＬＣＲｆ値（濃硫酸試薬で検出）：０．５４（トルエン：アセトニトリル＝８５：１５）
ＨＰＬＣ分析：
保持時間；１３．５分
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ、ＡＭ−３０２、４．６ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（株式会社ワイエムシイ製）
移動相：アセトニトリル：水＝５５：４５
流速：１ｍｌ／分
検出：２８０ｎｍ（ＵＶ）
２−４．化合物（Ｉ−３）の精製
化合物（Ｉ−３）成分を含む１２８ｍｇはアセトニトリル１ｍｌに加熱溶解させた後、室温放置により生ずる沈澱物を瀘去後、瀘液を濃縮乾固し残査３５ｍｇを得た。これを高速液体クロマトグラフィーにより分離精製した。ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ、２０ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍのカラムを用い展開溶媒として７０％アセトニトリル水溶液を用いた。１回の分取は５ｍｇずつ行い、７２〜７６ｍｌに溶出される分画を集めて減圧下濃縮し、アセトニトリルを除いた後、残渣を酢酸エチルで抽出、無水硫酸ソーダで乾燥、濃縮乾固して純粋な無色粉末の化合物（Ｉ−３）を２．７ｍｇ得た。
化合物（Ｉ−３）：Ｒ¹＝ＯＨ、Ｒ²＝ＯＣＨ₃
化合物名：３，３’，６’−トリメトキシ−４−（３−メチル−２−ブテニルオキシ）−［１，１’；４’，１’’］テルフェニル−２’，４’’−ジオ−ル
性状：無色粉末
溶解性：アセトン、酢酸エチル、クロロホルムに可溶 水に不溶
ＨＲ−ＬＳＩＭＳ，ｍ／ｚ：計算値 Ｃ₂₆Ｈ₂₈Ｏ₆：４３６．１８８４
実測値： ：４３６．１８８０［Ｍ］⁺
ＬＳＩ−ＭＳ，ｍ／ｚ：４３６［Ｍ］⁺
ＵＶ（メタノール）ｎｍ（ε）：
２３０（ｓｈ），２７８（２５，３００）
２３５（ｓｈ），２９５（２５，１００） ０．０１Ｎ−ＮａＯＨ添加
２３０（ｓｈ），２７８（２４，５００） ０．０１Ｎ−ＨＣｌ添加
ＩＲｃｍ^-1（ＫＢｒ）：３４３０，２４３２，１６１２，１５２２，１４８８，１３９８，１２３７，１１１６，１０７５
¹ＨＮＭＲ（アセトン−ｄ₆，６００ＭＨｚ）δ：１．７７（３Ｈ，ｂ．ｓ ｌｉｋｅ），１．７９（３Ｈ，ｂｒ．ｓ ｌｉｋｅ），３．３８（３Ｈ，ｓ），３．７４（３Ｈ，ｓ），３．８０（３Ｈ，ｓ），４．５９（２Ｈ，ｂｒ．ｄ ｌｉｋｅ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），５．５３（１Ｈ，ｍ），６．５０（１Ｈ，ｓ），６．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．３Ｈｚ），６．９５（２Ｈ，ｍ），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．５４（２Ｈ，ｍ），７．８３（１Ｈ，ｓ），８．６５（１Ｈ，ｓ）
¹³ＣＮＭＲ（アセトン−ｄ₆，１５０ＭＨｚ）δ．：１８．１９（ｑ），２５．８４（ｑ），５６．１３（ｑ），５６．１６（ｑ），６０．６５（ｑ），６６．１８（ｔ），１０４．１７（ｄ），１１３．８０（ｄ），１１６．０６（ｄ），１１６．４２（ｄ），１１７．７０（ｓ），１２１．６３（ｄ），１２４．３７（ｄ），１２７．７３（ｓ），１３０．５０（ｓ），１３０．７９（ｄ），１３３．６６（ｓ），１３７．４０（ｓ），１４０．１７（ｓ），１４８．３７（ｓ），１４９．１６（ｓ），１４９．９８（ｓ），１５４．５２（ｓ），１５７．８０（ｓ）
ＴＬＣＲｆ値（濃硫酸試薬で検出）：０．３４（トルエン：アセトニトリル＝８５：１５）
ＨＰＬＣ分析：
保持時間：７．４分
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ，ＡＭ−３０２，４．６ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（株式会社ワイエムシイ製）
移動相：アセトニトリル：水＝５５：４５
流速：１ｍｌ／分
検出：２８０ｎｍ（ＵＶ）
２−５．化合物（ＩＩ−２）の精製
化合物（ＩＩ−２）成分を含む粗精製物０．５７７ｇはシリカゲルクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０、７０〜２３０ｍｅｓｈ、２．４ｍｍ ｉ．ｄ．×２００ｍｍ）で精製を行った。粗精製物０．５７７ｇはトルエン：アセトニトリル（８０：２０）３ｍｌに溶解し、同溶媒で展開し、Ｆｒ．１〜３（１２０ｍｌ）を集め減圧下濃縮し部分精製物４２０ｍｇを得た。次に中圧液体クロマトグラフィーにより分離精製を行なった。ＹＭＣ ＧＥＬ ＯＤＳ−ＡＭ１２０−Ｓ５０、２０ｍｍ ｉ．ｄ．×５００ｍｍのカラムを用い展開溶媒として４０％アセトニトリル水溶液を用いた。４３２〜４６８ｍｌに溶出される分画を集め減圧下濃縮しアセトニトリルを除いた後、残渣を酢酸エチルで抽出、無水硫酸ソーダで乾燥、濃縮乾固して純粋な無色粉末の化合物（ＩＩ−２）を９０ｍｇ得た。化合物（ＩＩ−２）は式（ＩＩ）においてＲ¹がヒドロキシ、Ｒ²が水素である化合物であり、アグリカルチュアル バイオロジカル ケミストリ−（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（３），８６７−８６８（１９８５）に記載のテルフェニリンであった。
２−６．化合物（ＩＩ−３）の精製
化合物（ＩＩ−３）成分を含む粗精製物１．６ｇはメタノ−ル（６ｍｌ）に溶解し、ノーリットＳＸ−３（和光純薬工業社製）（８０ｍｇ）を加え、室温で１時間撹拌後、ノーリットを瀘去して水（１４ｍｌ）を加え、生じた沈殿を加熱溶解後、一晩室温放置する。生じた無色針状結晶を瀘取し、純粋な化合物（ＩＩ−３）を１．０ｇ得た。化合物（ＩＩ−３）は式（ＩＩ）においてＲ¹およびＲ²がヒドロキシである化合物であり、アグリカルチュアル バイオロジカル ケミストリ−（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（３），８６７−８６８（１９８５））に記載の３−ヒドロキシテルフェニリンであった。
２−７．化合物（ＩＩＩ）の精製
化合物（ＩＩＩ）を含む粗精製物１．４６ｇはシリカゲルクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０、７０〜２３０ｍｅｓｈ、２．４ｍｍ ｉ．ｄ．×２００ｍｍ）で精製を行った。粗精製物１．４６ｇはトルエン：アセトニトリル（８０：２０）１２ｍｌに溶解し、同溶媒で展開し、Ｆｒ．４〜８（２００ｍｌ）を集め減圧下濃縮して純粋な無色粉末の化合物（ＩＩＩ）を８００ｍｇ得た。化合物（ＩＩＩ）はアグリカルチュアル バイオロジカル ケミストリ−（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（３），８６７−８６８（１９８５））に記載の３，３’’−ジヒドロキシテルフェニリンであった。
実施例２ 化合物（ＩＩ−３）を用いた化合物（Ｉ−１）の製造
化合物（ＩＩ−３）３５４ｍｇのアセトン（５ｍｌ）溶液に、無水炭酸カリウム４０２ｍｇとプレニルブロマイド１４９ｍｇをアセトン２ｍｌと共に加え、室温下６時間撹拌した。不溶物を瀘去後、瀘液を減圧下濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物を中圧カラムクロマトグラフィー（カラム：ＹＭＣ−ＧＥＬ ＯＤＳ−ＡＭ１２０−Ｓ５、２０ｍｍ ｉ．ｄ．×５００ｍｍ、溶媒：５０％アセトニトリル水溶液）に付し、１０ｇずつフラクションを集めた。Ｆｒ．４３〜５０に化合物（Ｉ−１）が溶出され、減圧下濃縮しアセトニトリルを除いた後、残渣を酢酸エチルで抽出、無水硫酸ソーダで乾燥、濃縮乾固して純粋な化合物（Ｉ−１）を１３８ｍｇ得た。
試験例１ マウス脾細胞の試験管内マイトジェン反応における抑制効果
１−１．コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）反応抑制効果
９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにＢＤＦ１マウス脾細胞５×１０⁵個を０．１ｍｌの１０％牛胎仔血清加ＲＰＭＩ１６４０培地（炭酸水素ナトリウム２ｍＭ、ペニシリン５０単位／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌおよび２−メルカプトエタノ−ル５×１０^-5Ｍを添加）に浮遊したものを加え、その各ウェルにマイトジェンとしてＣｏｎＡ５μｇ／ｍｌと、化合物（Ｉ−１）、化合物（Ｉ−２）、化合物（Ｉ−３）を種々の濃度で加え、各ウェルの最終容量を０．２ｍｌとした。各本発明化合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、上記ＲＰＭＩ１６４０培地にて希釈し最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ以下になるように添加した。９６ウェルマイクロタイタ−プレ−トは、湿度１００％、二酸化炭素５％、空気９５％に保持された培養器内で３７℃、４８時間培養し、ハ−ベストする６時間前に３Ｈ−チミジン（１８．５ＫＢｑ／ウェル）でパルスラベルし、培養終了後セルハ−ベスタ−にて細胞を回収し、細胞に取り込まれた放射能の量を測定して細胞増殖活性の指標とした。対照にはＣｏｎＡ無添加（−ＣｏｎＡ）を用いた。結果を表１に示す。

表１に示すように、化合物（Ｉ−１）、（Ｉ−２）および（Ｉ−３）は、マウス脾細胞のＣｏｎＡ反応を化合物濃度依存的に強く抑制した。
１−２．リポポリサッカライド反応抑制効果
上記１−１と同様の方法でコンカナバリンＡをリポポリサッカライド（ＬＰＳ、１０μｇ／ｍｌ）に変え、反応の抑制効果を検討した。対照としてはＬＰＳ無添加（−ＬＰＳ）を用いた。結果を表２に示す。

表２に示すように、化合物（Ｉ−１）、（Ｉ−２）および（Ｉ−３）は、マウス脾細胞のＬＰＳ反応を化合物濃度依存的に強く抑制した。
試験例２ 化合物（Ｉ−１）の細胞増殖抑制効果
９６ウェルマイクロタイタ−プレ−トの各ウェルに各種細胞株の細胞数を０．１ｍｌのスケ−ルで加え、試験例１と同じ培養条件下で１日前培養し、０〜１００００ｎｇ／ｍｌとなるように化合物（Ｉ−１）を０．１ｍｌ添加した。そして３〜４日間培養を続け、培養終了後、６ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾ−ル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］（シグマ製）溶液を２５μｌ各ウェルに加え、３７℃にて４時間同一条件下で培養した。培養終了後、生成したホルマザンを、２０％ドデシルナトリウムスルホン酸（ＳＤＳ）の０．０２Ｎ塩酸溶液を５０μｌ加え３７℃で２４時間放置して溶解させた。生細胞数に比例して生成したホルマザンを、５７０ｎｍのフィルタ−を装着したイムノリ−ダ−（ＩｎｔｅｒＭｅｄ）で吸光強度（ＯＤ）を測定した。（ザ・ジャ−ナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ、６５巻，５５〜６３頁，１９８３年参照）。そして、化合物（Ｉ−１）の濃度と吸光強度との相関より５０％の細胞増殖阻止濃度（ＩＣ₅₀値）を算出した。結果を表３に示す。

表３に示すように化合物（Ｉ−１）は、正常肺細胞ＣＣＤ−１９Ｌｕには作用せず、腫瘍細胞に対してのみ強い細胞増殖抑制効果がみられた。

ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびステアリン酸マグネシウムを除く上記処方成分を均一に混合した後、ヒドロキシプロピルメチルセルロース８％（ｗ／ｗ）水溶液を結合剤として湿式造粒法にて打錠用顆粒を調製した。これにステアリン酸マグネシウムを混合した後、打錠機を用いて直径７ｍｍ、１錠重量１３０ｍｇに形成し、内服錠とした。
発明の効果
以上の試験例から明らかなように、本発明化合物（Ｉ）は強い免疫抑制作用、抗炎症作用および腫瘍細胞増殖抑制作用を示す。従って、本発明化合物（Ｉ）は免疫抑制剤、抗炎症剤および抗癌剤として非常に有用である。

Claims (9)

1. 式（Ｉ）：
   

   

   （式中、Ｒ¹は水素またはヒドロキシであり、Ｒ²はヒドロキシまたはメトキシである）
   で示される化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物。
2. アスペルギルス カンディダス ＲＦ−５７６２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃａｎｄｉｄｕｓ ＲＦ−５７６２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８２）を培養し、得られた培養物から請求の範囲第１項記載の化合物を採取することを特徴とする該化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物の製造方法。
3. 式（ＩＩ）：
   

   

   （式中、Ｒ¹は水素またはヒドロキシであり、Ｒ²はヒドロキシまたはメトキシである）
   で示される化合物を３−メチル−２−ブテニル化することを特徴とする請求の範囲第１項記載の化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物の製造方法。
4. 請求の範囲第１項記載の化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物を有効成分とする医薬。
5. 請求の範囲第１項記載の化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物を有効成分とする免疫抑制剤。
6. 請求の範囲第１項記載の化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物を有効成分とする抗炎症剤。
7. 請求の範囲第１項記載の化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物を有効成分とする抗癌剤。
8. 免疫反応の抑制、炎症の治療または予防および癌の治療のための医薬を製造するための、請求の範囲第１項記載の化合物もしくはその製薬上許容される塩またはそれらの水和物の使用。
9. 請求の範囲第１項記載の化合物を産生するアスペルギルス カンディダスＲＦ−５７６２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ ＲＦ−５７６２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８２）。