JP4033390B2

JP4033390B2 - 不死化ナチュラルキラー細胞株

Info

Publication number: JP4033390B2
Application number: JP2002316870A
Authority: JP
Inventors: 悟飯塚; 俊行高井; 由美伊藤; 梢伊藤; 益夫帯刀
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-10-30
Filing date: 2002-10-30
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2022-10-30
Also published as: WO2004039967A1; EP1589099A1; JP2004147565A; EP1589099A4; US20060067914A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、不死化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株に関し、詳しくはＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの脾臓細胞由来のＮＫ細胞を継代培養して樹立することができる、不死化ＮＫ細胞株やその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、医薬品の安全性や有効性に関する試験研究には主として動物が用いられていたが、動物愛護の観点から動物を使用する代わりに、培養細胞等を用いてインビトロで医薬品の有効性や安全性を試験研究する技術の実用化レベルでの研究が行われている。例えば、生体組織から採取した初代培養細胞や無限増殖する不死化細胞（樹立細胞）系を用いる方法で予め試験した後に動物試験が行われている。しかし、初代細胞は初期段階ではよく増殖するが、継代培養とともに次第に増殖が停止し、やがては死滅する（この現象を細胞老化という）。さらに、初代細胞は、その特性が生体組織から採取する度に異なるという危惧に加え、継代とともに変化することが指摘されている。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合には、試験に供するに足る初代細胞を得ることは非常に困難であるとされている。
【０００３】
一方、初代培養の継代を重ねるなかで、細胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得した不死化細胞では、安定して均一の特性を有することになるが、このような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失することが多い。そのため、このような不死化細胞株を用いた試験では、その細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映することは難しいとされていた。そこで、初代細胞にｒａｓ遺伝子やｃ−ｍｙｃ遺伝子などの発癌遺伝子、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原遺伝子、ヒトパピローマウイルスのＨＰＶ１６遺伝子等を導入して細胞を形質転換し、初代細胞の有する活発な増殖能を継続的に保持し、さらに継代することによってその細胞固有の特性を喪失しない不死化細胞を樹立する試みがなされている。ところが、このような不死化細胞においても、対象とする臓器によっては、その初代細胞を調製し、これらの癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入する時点で、すでに幾つかの機能を喪失するため、本来の機能を保持する厳密な意味での不死化細胞の取得は困難であった。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合の初代細胞を調製して株化することは極めて困難であった。
【０００４】
これに対し、近年確立された動物個体への遺伝子導入技術を用いて、個々の細胞に癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入するかわりに、これらの遺伝子を安定的に染色体に組み込んだ遺伝子導入動物を作出し、個体の発生時点において既に癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を細胞の中に保有する動物の臓器から初代細胞を調製して、これを継代することによって不死化細胞を樹立する方法が報告されている。特にＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの臓器から得られる不死化細胞は、その増殖や分化形質の発現を温度を変えることによって操作することができるため、非常に有効であるとされている（例えば、非特許文献１〜８参照。）。
【０００５】
他方、ＮＫ細胞は、ヒト末梢血リンパ球の約５〜１５％を占め、骨髄から分化し、形態学的には細胞質内にアズール顆粒を有する大型顆粒リンパ球で、抗原による前感作なしに腫瘍細胞やウイルス感染細胞などの標的抗原細胞を障害することができる、生体の恒常性維持のために重要な細胞である。ＮＫ細胞はまた、癌の増殖抑制に有効であることがよく知られており、癌細胞に対し、非特異的に、また主要組織適合抗原系（ＭＨＣ）による拘束を受けることなく、キラーＴ細胞より広い範囲の癌細胞を攻撃する。かかる特徴から、ＮＫ細胞は癌やウイルスによる感染症の治療に用いることが期待されている。しかし、治療に用いるためには、標的の認識機構を含め、ＮＫ細胞の詳細を明らかにする必要がある。そして、かかる研究を容易ならしめるため、ＮＫ細胞の株化が強く望まれていた。
【０００６】
従来、高い細胞傷害活性を保った状態のＮＫ細胞を効率的に増殖する方法として、末梢血単核球細胞とあらかじめ増殖能を失わせたヒトウイルス腫瘍細胞株ＨＦＷＴとをインターロイキン−２の存在下で混合培養する工程を含む、ヒトＮＫ細胞の増殖方法（例えば、特許文献１参照。）や、増殖刺激用細胞の混入のないヒトＮＫ細胞を提供することを目的として、ヒトＮＫ細胞を増殖刺激用細胞の存在下で増殖培養するために用いる足場依存性の増殖刺激用細胞であって、検出手段が導入されたことを特徴とする細胞、及びこの細胞を用いてヒトＮＫ細胞を増殖培養する方法（例えば、特許文献２参照。）が知られているが、これらＮＫ細胞の増殖方法は、特定条件下でＮＫ細胞を増殖させ、ＮＫ細胞を容易に得ることを目的としている。しかし、ＮＫ細胞の細胞株の樹立と異なり、半永久的にＮＫ細胞を産生することができるわけではなく、ＮＫ細胞を一時的に増殖する方法を開示しているに過ぎない。
【０００７】
また、安定的に増殖し続けるＮＫ細胞株の作製は非常に困難であり、これまでにマウスＮＫ細胞株として４例が報告されている（例えば、非特許文献９〜１２参照。）が、ＮＫ細胞としての詳細な解析がなされておらず、単にNatural Killing能を有していることが報じられているに過ぎず、動物から単離したＮＫ細胞と同等の特徴を有するものであるか否かは明らかではない。さらに、これらマウスＮＫ細胞株に関する報告にある細胞株については、広く配布されていないこと、及び、その動態が明らかでないことから研究・実験材料として使用されておらず、免疫の誘導、修飾及び治療などに用いられていない。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００１−１４９０６９号公報
【特許文献２】
特開２００２−４５１７４号公報
【非特許文献１】
Transgenic Research 4, 215-225, 1995、
【非特許文献２】
Genes to Cells, 2, 235-244, 1997
【非特許文献３】
Exp. Cell Res., 197, 50-56, 1991
【非特許文献４】
Exp. Cell Res., 209, 382-387, 1993
【非特許文献５】
Exp. Cell Res., 218, 424-429, 1995
【非特許文献６】
Blood, 86, 2590-2597, 1995
【非特許文献７】
J. Cell. Physiol., 164, 55-64, 1995
【非特許文献８】
Exp. Hematol., 27, 1087-1096, 1999
【非特許文献９】
Nature, 287, 47-49, 1980
【非特許文献１０】
J. Exp. Med., 181, 1785-1795, 1995
【非特許文献１１】
J. Immunol., 158, 112-119, 1997
【非特許文献１２】
Int. Immunol., 10, 1093-1101, 1998
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
ＮＫ細胞は、ウイルスに感染した細胞や癌化した細胞を認識し、それを殺傷することで、生体防御の一端を担っている。この特徴から、感染や癌の治療が可能であることが示唆されるが、それには標的の認識機構を含め、この細胞の詳細を明らかにする必要がある。従来のＮＫ細胞研究においては、マウスを処分し、ＮＫが常在する脾臓や末梢血から２〜３時間かけて精製を行ったのち、実験に用いていた。この方法では、時間がかかること、ＮＫ細胞以外の細胞の混入の可能性があること、マウスを毎回殺す必要があること、という点で不利・不便であった。また、せっかく単離し、培養したＮＫ細胞であっても、その寿命は限られており、サイトカイン存在下で培養したとしても１ヶ月が限界であって、その後は死滅するという問題があった。本発明の課題は、ＮＫ細胞本来の機能・特性を保持する不死化ＮＫ細胞株及びその樹立方法並びに当該不死化ＮＫ細胞株を用いた有用物質のスクリーニング方法や細胞ワクチンを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、不死化遺伝子としてのＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの脾臓からＮＫ細胞を単離し、得られたＮＫ細胞を１０ヶ月以上継代培養することによって不死化ＮＫ細胞株を樹立し、得られた不死化ＮＫ細胞株が安定した増殖を示し、ＮＫ細胞の特徴を保持していることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、（１）脾臓細胞に由来し、細胞質内にアズール顆粒を有し、前感作無しで標的細胞を殺傷する能力及び抗体で被覆された標的細胞を殺傷する能力を保持し、インターロイキン−２により増殖・活性化することを特徴とする不死化ナチュラルキラー細胞株や、（２）３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が抑制されることを特徴とする上記（１）記載の不死化ナチュラルキラー細胞株や、（３）齧歯類起源であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の不死化ナチュラルキラー細胞株や、（４）齧歯類がマウスであることを特徴とする上記（３）記載の不死化ナチュラルキラー細胞株や、（５）不死化ナチュラルキラー細胞株が、細胞表面抗原としてＤＸ５、ＦｃγＲ３、Ｌｙ４９Ｈ及びＣＤ９４を有しており、かつ、ＮＫ１．１を有していないことを特徴とする上記（４）記載の不死化ナチュラルキラー細胞株や、（６）不死化ナチュラルキラー細胞株が、細胞表面抗原としてＦｃγＲ３及びＣＤ９４を有しており、かつ、ＮＫ１．１、ＤＸ５及びＬｙ４９Ｈを有していないことを特徴とする上記（４）記載の不死化ナチュラルキラー細胞株や、（７）不死化ナチュラルキラー細胞株が、細胞表面抗原としてＮＫ１．１、ＦｃγＲ３及びＣＤ９４を有しており、かつ、ＤＸ５及びＬｙ４９Ｈを有していないことを特徴とする上記（４）記載の不死化ナチュラルキラー細胞株や、（８）不死化ナチュラルキラー細胞株が、細胞表面抗原としてＮＫ１．１、ＤＸ５、ＦｃγＲ３及びＣＤ９４を有しており、かつ、Ｌｙ４９Ｈを有していないことを特徴とする上記（４）記載の不死化ナチュラルキラー細胞株や、（９）不死化ナチュラルキラー細胞株が、細胞表面抗原としてＦｃγＲ３、Ｌｙ４９Ｈ及びＣＤ９４を有しており、かつ、ＮＫ１．１及びＤＸ５を有していないことを特徴とする上記（４）記載の不死化ナチュラルキラー細胞株や、（１０）不死化ナチュラルキラー細胞株が、細胞表面抗原としてＮＫ１．１、ＤＸ５、ＦｃγＲ３、Ｌｙ４９Ｈ及びＣＤ９４を有していることを特徴とする上記（４）記載の不死化ナチュラルキラー細胞株に関する。
【００１２】
また本発明は、（１１）不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ１（ＦＥＲＭＢＰ−０８５１８）や、（１２）不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ２（ＦＥＲＭＢＰ−０８５１９）や、（１３）不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ３（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２０）や、（１４）不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ４（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２１）や、（１５）不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ６（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２２）や、（１６）不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ８（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２３）や、（１７）不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ９（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２４）や、（１８）不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ１０（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２５）や、（１９）不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫｂ（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２６）に関する。
【００１３】
さらに本発明は、（２０）ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの脾臓から単離して得られるナチュラルキラー細胞を培養して、細胞質内にアズール顆粒を有し、前感作無しで標的細胞を殺傷する能力及び抗体で被覆された標的細胞を殺傷する能力を保持し、インターロイキン−２により増殖・活性化する細胞株を樹立することを特徴とする不死化ナチュラルキラー細胞株の製造方法や、（２１）被検物質の存在下、上記（１）〜（１９）のいずれか記載の不死化ナチュラルキラー細胞株を培養し、該不死化細胞株における細胞傷害活性の程度を測定・評価することを特徴とするナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の不死化ＮＫ細胞株としては、脾臓細胞に由来し、細胞質内にアズール顆粒を有し、前感作無しで標的細胞を殺傷する能力（Natural Killing）及び／又は抗体で被覆された標的細胞を殺傷する能力（ＡＤＣＣ）を保持し、インターロイキン−２により増殖・活性化する樹立細胞株であればどのようなものでもよく、３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が抑制される細胞株が好ましい。かかる細胞株として、不死化ＮＫ細胞株ＴＮＫ１（この不死化ＮＫ細胞株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭＰ−１９０３５として寄託されている。以下同様である。）、不死化ＮＫ細胞株ＴＮＫ４（ＦＥＲＭＰ−１９０３８）、不死化ＮＫ細胞株ＴＮＫ８（ＦＥＲＭＰ−１９０４０）、不死化ＮＫ細胞株ＴＮＫ９（ＦＥＲＭＰ−１９０４１）を具体的に挙げることができる。また、本発明の不死化ＮＫ細胞株の由来は特に制限されないが、マウス等の齧歯類起源の不死化ＮＫ細胞株を好適に例示することができる。
【００１５】
このような不死化ＮＫ細胞株として、上記特徴のほか、細胞表面抗原としてＤＸ５、ＦｃγＲ３、Ｌｙ４９Ｈ及びＣＤ９４を有しており、かつ、ＮＫ１．１を有していない不死化ＮＫ細胞株を例示することができ、かかる不死化ＮＫ細胞株として、不死化ＮＫ細胞株ＴＮＫ１（ＦＥＲＭＰ−１９０３５）を具体的に挙げることができ、細胞表面抗原としてＦｃγＲ３及びＣＤ９４を有しており、かつ、ＮＫ１．１、ＤＸ５及びＬｙ４９Ｈを有していない不死化ＮＫ細胞株を例示することができ、かかる不死化ＮＫ細胞株として、不死化ＮＫ細胞株ＴＮＫ２（ＦＥＲＭＰ−１９０３６）を具体的に挙げることができ、細胞表面抗原としてＮＫ１．１、ＦｃγＲ３及びＣＤ９４を有しており、かつ、ＤＸ５及びＬｙ４９Ｈを有していない不死化ＮＫ細胞株を例示することができ、かかる不死化ＮＫ細胞株として、不死化ＮＫ細胞株ＴＮＫ３（ＦＥＲＭＰ−１９０３７）、ＴＮＫ６（ＦＥＲＭＰ−１９０３９）、ＴＮＫ１０（ＦＥＲＭＰ−１９０４２）及びＴＮＫｂ（ＦＥＲＭＰ−１９０４３）を具体的に挙げることができ、細胞表面抗原としてＮＫ１．１、ＤＸ５、ＦｃγＲ３及びＣＤ９４を有しており、かつ、Ｌｙ４９Ｈを有していない不死化ＮＫ細胞株を例示することができ、かかる不死化ＮＫ細胞株として、不死化ＮＫ細胞株ＴＮＫ４（ＦＥＲＭＰ−１９０３８）を具体的に挙げることができ、細胞表面抗原としてＦｃγＲ３、Ｌｙ４９Ｈ及びＣＤ９４を有しており、かつ、ＮＫ１．１及びＤＸ５を有していない不死化ＮＫ細胞株を例示することができ、かかる不死化ＮＫ細胞株として、不死化ＮＫ細胞株ＴＮＫ８（ＦＥＲＭＰ−１９０４０）を具体的に挙げることができ、細胞表面抗原としてＮＫ１．１、ＤＸ５、ＦｃγＲ３、Ｌｙ４９Ｈ及びＣＤ９４を有している不死化ＮＫ細胞株を例示することができ、かかる不死化ＮＫ細胞株として、不死化ＮＫ細胞株ＴＮＫ９（ＦＥＲＭＰ−１９０４１）を具体的に挙げることができる。
【００１６】
また、本発明の不死化ＮＫ細胞株の製造方法としては、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの脾臓から単離して得られるナチュラルキラー細胞を培養して、細胞質内にアズール顆粒を有し、前感作無しで標的細胞を殺傷する能力及び／又は抗体で被覆された標的細胞を殺傷する能力を保持し、インターロイキン−２により増殖・活性化する細胞株を樹立する方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、上記トランスジェニックマウスの脾臓から、ＮＫ１．１⁺ＭＡＣＳ（磁気ビーズ法）を用いてＮＫ細胞を単離し、単離したＮＫ細胞に、増殖を促すサイトカインであるインターロイキン−２を１０００Ｕ／ｍＬ含む培地で５％ＣＯ₂、３３℃の条件下で、１０ヶ月以上継代培養することによって不死化ＮＫ細胞株を樹立することができる。
【００１７】
また、上記トランスジェニックマウスは、以下のようにして作製することができる。例えば、ＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠失させたｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２の全ＤＮＡを制限酸素ＢａｍＨＩで開環してｐＢＲ３２２に導入したプラスミドｐＳＶｔｓＡ５８（−）−２（Ohno T. et al., Cytotechnology 7, 165-172, 1991）を常法に従い大腸菌内で大量に増幅させ、この増幅したプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断してベクター部位を除去し、ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を有するＤＮＡ断片を調製する。このラージＴ抗原遺伝子のプロモーターが内在するＤＮＡ断片を常法に従いマウス等の齧歯類などの動物の全能性細胞に遺伝子導入することにより、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を全ての細胞内に有する遺伝子導入マウス、すなわちトランスジェニックマウスを作出することができる。かかるトランスジェニックマウスは、その全ての体細胞においてｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が発現することになる。そして、上記全能性細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞などを具体的に挙げることができる。また、全能性細胞へのＤＮＡの導入方法としては、マイクロインジェクション法、電気パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等の公知の遺伝子導入法を用いることができる。
【００１８】
上記マウスの全能性細胞（培養細胞）の核を、除核未受精卵に移植して初期化すること（核移植）で卵子にＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入することができる。また、前核期受精卵の雄性前核にＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子をマイクロインジェクションして得られる受精卵を仮親の卵管に移植して産仔を得た後、注入した遺伝子を持つ産仔を選出し、安定的にかかる遺伝子が組み込まれた個体を得ることで、個体発生時にすでにｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が各組織の細胞の染色体に組み込まれた遺伝子導入マウス、すなわちトランスジェニックマウスを効率よく作出することができる。
【００１９】
本発明の不死化ＮＫ細胞は、３３℃において永久的増殖能を保持し、３７℃においては増殖が抑制され、３９℃においては増殖を停止するため、細胞固有の分化形質の発現を制御することができるという特色を有している。また、本発明の不死化ＮＫ細胞は、１０ヶ月の継代培養後においても３３℃で良好な増殖性を示し、ＮＫ細胞としての機能を保持していることから、免疫の誘導・修飾、癌の治療、ウイルス疾患の治療の研究や、これら病態に関連する疾患等の診断薬や治療薬の開発を細胞レベルで研究するのに有用である。また、癌細胞やウイルス感染細胞をＭＨＣ非拘束的に攻撃・殺傷する能力を保持していることから細胞ワクチンとして有用である上に、以下に示すように、ＮＫ細胞の細胞傷害活性促進又は抑制物質のスクリーニングに用いることができる。
【００２０】
本発明におけるＮＫ細胞の細胞傷害活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、被検物質の存在下、上記不死化ＮＫ細胞株を培養し、該不死化細胞株における細胞傷害活性の程度、すなわち、前感作無しで標的細胞を殺傷する（Natural Killing）能力及び／又は抗体で被覆された標的細胞を殺傷する（ＡＤＣＣ）能力の程度を測定・評価する方法であれば特に制限されず、通常、被検物質の非存在下に培養した対照の測定値と比較・評価することにより行われる。そして、上記スクリーニング方法により得られるＮＫ細胞の細胞傷害活性促進物質又は抑制物質も免疫の誘導・修飾、各種癌、各種ウイルス感染症の治療薬、予防及び／又は症状改善剤として利用できる可能性があり、本発明に含まれる。
【００２１】
本発明の細胞ワクチンとしては、上記本発明の不死化ＮＫ細胞株を主成分とするものであれば特に制限されるものではないが、上記不死化ＮＫ細胞株としてはヒト由来の不死化ＮＫ細胞株が好ましく、かかるヒト由来の不死化ＮＫ細胞株は、ヒト末梢血よりＮＫ細胞を単離し、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入し、継代培養を繰り返すことにより、あるいはヒトの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）にＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入し、これをインビトロでＮＫ細胞に分化させ、継代培養を繰り返すことにより樹立することができる。また、不死化ＮＫ細胞株としては、３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が抑制されるものが好ましい。本発明の細胞ワクチンは、インビボ、エクスビボ又はインビトロで作用させることができる。例えば、本発明の不死化ＮＫ細胞株の懸濁液からなる本発明の細胞ワクチンは、ヒト体内に治療用のワクチンとして接種されることになるが、３７℃では増殖が抑制されることから安全性が高い。通常、細胞ワクチンとしての安全性を高めるために、加熱処理、放射線処理、あるいはマイトマイシンＣ処理などが必要とされるが、本発明の不死化ＮＫ細胞株は、かかる細胞不活化処理が不要で、かつ、３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が抑制されることから極めて安全性が高いワクチンということができる。
【００２２】
本発明の細胞ワクチン、特にヒト由来の不死化ＮＫ細胞株を主成分とする細胞ワクチンは、ヒトに移入可能な細胞ワクチンとして、白血病、肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌などの各種腫瘍、及び各種ウイルス、細菌等による感染症等に対して有利に利用することができる。本発明の細胞ワクチンの投与量は、患者の年齢、体重、性別、癌の種類及び癌の進行度、症状等により異なり、一概に決定できないが、現在行われている細胞ワクチン療法で注入されるのと同程度の量が患者に投与することができる。本発明の細胞ワクチンは、患者本人に使用することもできるが、患者本人以外の多数の患者にも投与することができる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（トランスジェニックマウスの作出）
ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のＤＮＡを導入したトランスジェニックマウスは、下記の手順で作出した。
【００２４】
（導入遺伝子の調製）
マイクロインジェクションにはＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡを遺伝子工学的手法で改変したものを使用した。ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで開環し、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に導入し、ＳｆｉＩ配列をＳａｃIIに変換してＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠失するｏｒｉ（−）としたＤＮＡクローンｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２（Ohno T. et al., Cytotechnology, 165-172, 1991）から常法に従い導入用ＤＮＡを調製した。すなわち、大腸菌内で大量に増幅させることにより得られたプラスミドＤＮＡのｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化した後、アガロース電気泳動法（１％ゲル；ベーリンガー社製）により分離し、ゲルを溶解した後、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿処理を行いＤＮＡを回収した。回収した精製ＤＮＡをＴＥバッファー（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）に溶解して１７０μｇ／ｍｌの精製ＤＮＡを含む溶液を得た。このＤＮＡ溶液を注入用バッファー（０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）で５μｇ／ｍｌとなるように希釈して注入用ＤＮＡ溶液を調製した。なお、調製したＤＮＡ溶液は注入操作まで−２０℃で保存した。
【００２５】
（トランスジェニックマウスの作出）
マウス前核期受精卵への上記調製した注入用ＤＮＡ溶液のマイクロインジェクションは下記の要領で行った。性成熟した８週齢のウィスターマウスを明暗サイクル１２時間（４：００〜１６：００を明時間）、温度２３±２℃、湿度５５±５％で飼育し、膣スメアにより雌の性周期を観察して、ホルモン処理日を選択した。まず、雌マウスにより１５０ＩＵ／ｋｇの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（日本ゼンヤク社製；ＰＭＳゴナドトロピン（pregnanto mare serum gonadotropin：ＰＭＳＧ））を腹腔内投与し、その４８時間後に７５ＩＵ／ｋｇのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（三共臓器社製；プベローゲン（human chorionic gonadotropin：ｈＣＧ））を投与して過剰排卵処理を行った後、雄との同居により交配を行った。ｈＣＧ投与３２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。卵管灌流及び卵の培養にはｍＫＲＢ液（Toyoda Y. and Chang M.C., J. Reprod. Fertil., 36, 9-22, 1974）を使用した。採取した受精卵を０．１％のヒアルロニダーゼ（シグマ社製；Hyaluronidase Typel-S）を含むｍＫＲＢ液中で３７℃、５分間の酵素処理を行い卵丘細胞を除去した後、ｍＫＲＢ液で３回洗浄して酵素を除去し、ＤＮＡ注入操作までＣＯ₂−インキュベーター内（５％のＣＯ₂−９５％のＡｉｒ，３７℃、飽和湿度）に保存した。この様にして準備したマウス受精卵の雄性前核に前記ＤＮＡ溶液を注入した。注入した２２８個の卵を９匹の仮親に移植して出産させ８０匹の産仔を得た。注入ＤＮＡのマウスへの導入は、離乳直後に断尾して得た尾より調製したＤＮＡをＰＣＲ法により検定した［使用プライマー；ｔｓＡ５８−１Ａ，５’−ＴＣＣＴＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’（１３６５〜１３８４部位に相当：配列番号１）、ｔｓＡ５８−１Ｂ，５’−ＡＴＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧ−３’（１５７１〜１５９０部位に相当：配列番号２）］。その結果、遺伝子導入の認められた２０匹（雄６匹、雌８匹、性別不明６匹）の産仔の中から性成熟期間を経過する１２週齢まで生存した１１ラインのトランスジェニックマウス（雄ライン：＃０７−２，＃０７−５，＃０９−６，＃１２−３，＃１９−５，雌ライン：＃０９−７，＃１１−６，＃１２−５，＃１２−７，＃１８−５，＃１９−８）を得た。これらのＧ₀世代のトランスジェニックマウスとウィスターマウスを交配し、雄ファウンダーの２ライン（＃０７−２，＃０７−５）と雌ファウンダーの３ライン（＃０９−７，＃１１−６，＃１９−８）において次世代以降への遺伝子の伝達を確認した。
【００２６】
実施例２（脾臓からのＮＫ細胞の分離・調製）
脾臓からのＮＫ細胞の分離・調製は以下のようにして行った。実施例１で得られたＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（１匹）から脾臓を摘出し、ＮＫ１．１⁺ＭＡＣＳ（磁気ビーズ法）でＮＫ細胞を単離した。これをＮＫ細胞の増殖を促すサイトカインである、インターロイキン−２を１０００Ｕ／ｍＬ含む培地［ＲＰＭＩ−１６４０（SIGMA社製、R8758）、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（SIGMA社製、Lot:40k2368）、５０μＭペニシリン・５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（大日本製薬社製、16-700-49）、５０μＭ２−メルカプトエタノール、１ｍＭピルビン酸、１×ＭＥＭ Non-essential Amino Acid Solution（GIBCO BRL社製、11140-850）、１０００Ｕ／ｍＬ recombinant human インターロイキン−２（ペプロテック社製、200-02またはストラスマン・バイオテック社、IL2-50）］で約１ヶ月間培養し、０．２個／wellに希釈して９６well培養プレートに蒔いた。すべての培養は、５％ＣＯ₂、３３℃インキュベーター内で行った。２４４wellに蒔いたうち、約３０wellから細胞の増殖が見られたが、最終的に増殖の良好であった８株、すなわち、ＴＮＫ１、ＴＮＫ２、ＴＮＫ３、ＴＮＫ４、ＴＮＫ６、ＴＮＫ８、ＴＮＫ９、ＴＮＫ１０を選択した。これら８種の不死化ＮＫ細胞株について、以下に示すＮＫ細胞の特徴を正常に保持しているか調べてみた。
１．ウイルスに感染したり癌化した細胞を、前感作なしに殺傷する。
２．抗体で被覆された細胞を、殺傷する。
３．刺激に応答して、ＩＦＮ−γなどのサイトカインを生産する。
４．特徴的細胞表面抗原（ＮＫ１．１など）を有する。
５．インターロイキン−２により増殖・活性化する。
【００２７】
実施例３（ライトギムザ染色による形態観察）
ＮＫ細胞は標的細胞の殺傷にかかわる顆粒を蓄えており、ライトギムザ（Wright-Giemsa）染色法で染めると顆粒が可視化できる。８種の不死化ＮＫ細胞株及び実施例２における希釈前の不死化ＮＫ細胞群（ＴＮＫｂ）をサイトスピンでスライドグラスに接着させライトギムザ法（ライト染色液・ギムザ染色液、ともにメルク社製）にて染色し、可視化した。結果を図１（例えば、参考写真１参照。）に示す。図１中、Ｂは、上記ＴＮＫｂを意味する。この結果、各不死化ＮＫ細胞株とも、紫色に染まり、アズール顆粒を認めることができた。このことから、各不死化ＮＫ細胞とも形態的に正常なＮＫ細胞の特徴を有していることが確認された。
【００２８】
実施例４（ＳＶ４０トランスジェニックマウス由来であることの確認）
得られた８種の不死化ＮＫ細胞株及びＴＮＫｂ等について、ＰＣＲ法を用いてＳＶ４０Ｔ遺伝子の有無を確認した［使用プライマー；ＳＶ４０４４４１Ｓ，５’−ＧＧＡＧＧＡＧＴＡＧＡＡＴＧＴＴＧＡＧ−３’ ：配列番号３、ＳＶ４０Ｔ４８９２ＡＳ，５’−ＧＴＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＴＧＴＡＣＴＧＣ−３’ ：配列番号４］。なお、コントロールとして、ＦｃεＲＩｇを用いた。その結果、８種の不死化ＮＫ細胞株においてＳＶ４０遺伝子の特徴的なバンドを検出することができ、該トランスジーンを持つことが確認できた。同様に、ウエスタンブロット法を用いてＳＶ４０Ｔタンパク質を検出した。その結果、８種の不死化ＮＫ細胞株及びＴＮＫｂにおいてＳＶ４０Ｔタンパク質の特徴的バンドを検出することができ、該タンパク質が存在することが確認できた。なお、コントロールとしてＧ３ＰＤＨを用いた。また、このマウスに由来する細胞株は、トランスジーンの構造上、３３℃で不死化し３９℃で不死化が解除され増殖停止・死滅する。ＭＴＴ（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazo-lium bromide)はミトコンドリア内膜の脱水素酵素などにより開裂されて赤紫色のＭＴＴ-formazanを生成する。この呈色反応が細胞の増殖能に比例することに基づいたＭＴＴアッセイで８種の不死化ＮＫ細胞株及びＴＮＫｂの増殖を調べたところ、各ＮＫ細胞株とも上記の温度依存的な増殖が見られた。これらのことから、８種の各不死化ＮＫ細胞株はＳＶ４０Ｔトランスジェニックマウス由来の細胞株であることが確認された。結果を図２に示す。
【００２９】
実施例５（増殖因子要求性）
免疫細胞は生体外へ単離すると、特定の増殖因子を含む培地で培養する必要があるものが多い。ＮＫ細胞は、増殖にインターロイキン−２を要求することが知られている。増殖因子は高価であり、長期保存にも注意が必要であることから、これを必要とせず培養できれば、もっとも好ましい。本発明にかかる細胞株は、培養開始当初から１０００Ｕ／ｍＬのインターロイキン−２を含む培地で培養を行ってきたが、これを減らす、又は、含まない状態で培養できるかを検討した。各種濃度のヒト組換えインターロイキン−２（ペプロテック社製またはストラスマン・バイオテック社製）で６日間の培養を行ったのち、ＭＴＴアッセイでＮＫ細胞の増殖を調べた。結果を図３に示す。その結果、これら８種の不死化ＮＫ細胞株及びＴＮＫｂの増殖はいずれも１０００Ｕ／ｍＬが最良であった。この実験の結果、得られたＮＫ細胞株はインターロイキン−２濃度依存的に増殖していることから、インターロイキン−２を減らさない方がよいことがわかった。
【００３０】
実施例６（細胞傷害活性）
ＮＫ細胞は、２つの殺傷機構を有している。１つは、前感作なしでウイルスに感染したり、癌化した細胞を殺傷するというもの（Natural Killing）で、もう一つは抗体で被覆された細胞を殺傷する（ＡＤＣＣ）というものである。８種の各ＮＫ細胞株及びＴＮＫｂ（Ｅ）が、この２つの殺傷機構を保持するか、⁵¹Ｃｒ遊離試験で検討した。標的細胞（Ｔ）として、ＮＫ細胞による細胞傷害に感受性であるＹＡＣ−１細胞、ＲＬ♂１細胞及びＢ１６−Ｆ１０細胞をそれぞれＥ：Ｔ＝１０：１の割合で用いてNatural Killing能を測定し、また、標的細胞（Ｔ）として、トリニトロフェノール（ＴＮＰ）を細胞表面に結合させたＥＬ−４細胞とマウス抗ＴＮＰＩｇＧ１抗体免疫複合体をＥ：Ｔ＝１０：１の割合で用いてＡＤＣＣ能を測定した。結果を図４に示す。図４中、ＬＡＫは１０００Ｕ／ｍＬインターロイキン−２を含む培地で約７日間刺激・増殖させた脾臓由来のフレッシュなＮＫ細胞を意味する。図４（上）から、ＴＮＫ８株がＬＡＫ同様に特に高いNatural Killing能を示したことから、ＴＮＫ８株はNatural Killingのメカニズムの解明に特に有用であることがわかった。また、図４（下）から、ＮＫ細胞による細胞傷害に非感受性であるＥＬ−４細胞であっても、抗体との免疫複合体の場合には、８種の各不死化ＮＫ細胞株、とりわけＴＮＫ２、ＴＮＫ３、ＴＮＫ６、ＴＮＫ８、ＴＮＫ１０の各細胞株が抗体濃度依存的に高いＡＤＣＣ能を示した。
【００３１】
実施例７（細胞表面抗原）
ＮＫ細胞は、図５から読み取り得るＮＫ１．１、ＤＸ５、ＦｃγＲ３、Ｌｙ４９Ｈ、ＣＤ９４等の特徴的抗原を、その表面に有している。８種の不死化ＮＫ細胞株及びＴＮＫｂがこの抗原を正常に保持しているか、フローサイトメトリーで確認した。細胞懸濁液を作製し、特異的モノクローナル抗体と氷上で１５分反応させた。緩衝液で洗浄ののち、２次反応が必要なものは標識２次抗体と氷上で１５分反応させた。モノクローナル抗体で標識した細胞をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製フローサイトメトリー解析機）で解析した。結果を図５に示す。図５から、８種の不死化ＮＫ細胞株及びＴＮＫｂには、いくつかの特徴的抗原の発現が失われたり、減少しているがことがわかった。
【００３２】
実施例８（サイトカイン生産性）
ＮＫ細胞は、刺激に応答して、ＩＦＮ−γなどのサイトカインを生産する。８種の各ＮＫ細胞株及びＴＮＫｂ（Ｅ）が、標的細胞（Ｔ）との接触刺激に応答して、ＩＦＮ−γを生産するかどうか調べてみた。標的細胞として、ＮＫ細胞に障害されるＹＡＣ−１又は障害されないＥＬ−４を用い、９６穴培養プレート内で接触した状態で共培養を行った。２４時間後に培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法でＩＦＮ−γを測定した。結果を図６に示す。その結果、８種の各不死化ＮＫ細胞株及びＴＮＫｂは、障害されないＥＬ−４との接触ではサイトカインを生産せず、障害されるＹＡＣ−１との接触ではサイトカインを生産し、正常に機能を保持することが確認できた。また、ＴＮＫ８株がＬＡＫ同様に特に高いサイトカイン生産能を示したことから、ＴＮＫ８株はサイトカイン生産のメカニズムの解明に、特に有用であることがわかった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によると、安定的に増殖し続ける不死化ＮＫ細胞株を得ることができ、該細胞株を用いると、ＮＫ細胞の標的の認識機構、その他のＮＫ細胞の詳細な研究や、ＮＫ細胞による癌の治療及びウイルスによる感染症の治療に関する研究を有利に行うことができる。また、本発明によれば、ＮＫ細胞の機能・特性を保持しているので、これを用いたＮＫ細胞の作用を促進する有用物質および抑制物質のスクリーニングを行うことができる。
【００３４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の８種の不死化ＮＫ細胞株における、ライトギムザ染色法による形態観察の結果を示す図である。
【図２】本発明の８種の不死化ＮＫ細胞株が、ＳＶ４０Ｔトランスジェニックマウス由来であることを確認するための、ＰＣＲによるＳＶ４０Ｔ遺伝子の検出結果およびウエスタンブロット法によるＳＶ４０Ｔタンパク質の検出結果および温度依存性増殖を示す図である。
【図３】本発明の８種の不死化ＮＫ細胞株の増殖因子（インターロイキン−２）要求性を示す図である。
【図４】本発明の８種の不死化ＮＫ細胞株が、細胞傷害活性（Natural Killing能及びＡＤＣＣ能）を有すること示す図である。
【図５】本発明の８種の不死化ＮＫ細胞株の細胞表面抗原の解析結果を示す図である。
【図６】本発明の８種の不死化ＮＫ細胞株がサイトカイン生産能を有することを示す図である。

Claims

脾臓細胞に由来し、細胞質内にアズール顆粒を有し、前感作無しで標的細胞を殺傷する能力及び抗体で被覆された標的細胞を殺傷する能力を保持し、インターロイキン−２により増殖・活性化することを特徴とする不死化ナチュラルキラー細胞株。
３３℃で増殖することができるが、３７℃では増殖が抑制されることを特徴とする請求項１記載の不死化ナチュラルキラー細胞株。
齧歯類起源であることを特徴とする請求項１又は２記載の不死化ナチュラルキラー細胞株。
齧歯類がマウスであることを特徴とする請求項３記載の不死化ナチュラルキラー細胞株。
不死化ナチュラルキラー細胞株が、細胞表面抗原としてＤＸ５、ＦｃγＲ３、Ｌｙ４９Ｈ及びＣＤ９４を有しており、かつ、ＮＫ１．１を有していないことを特徴とする請求項４記載の不死化ナチュラルキラー細胞株。
不死化ナチュラルキラー細胞株が、細胞表面抗原としてＦｃγＲ３及びＣＤ９４を有しており、かつ、ＮＫ１．１、ＤＸ５及びＬｙ４９Ｈを有していないことを特徴とする請求項４記載の不死化ナチュラルキラー細胞株。
不死化ナチュラルキラー細胞株が、細胞表面抗原としてＮＫ１．１、ＦｃγＲ３及びＣＤ９４を有しており、かつ、ＤＸ５及びＬｙ４９Ｈを有していないことを特徴とする請求項４記載の不死化ナチュラルキラー細胞株。
不死化ナチュラルキラー細胞株が、細胞表面抗原としてＮＫ１．１、ＤＸ５、ＦｃγＲ３及びＣＤ９４を有しており、かつ、Ｌｙ４９Ｈを有していないことを特徴とする請求項４記載の不死化ナチュラルキラー細胞株。
不死化ナチュラルキラー細胞株が、細胞表面抗原としてＦｃγＲ３、Ｌｙ４９Ｈ及びＣＤ９４を有しており、かつ、ＮＫ１．１及びＤＸ５を有していないことを特徴とする請求項４記載の不死化ナチュラルキラー細胞株。
不死化ナチュラルキラー細胞株が、細胞表面抗原としてＮＫ１．１、ＤＸ５、ＦｃγＲ３、Ｌｙ４９Ｈ及びＣＤ９４を有していることを特徴とする請求項４記載の不死化ナチュラルキラー細胞株。
不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ１（ＦＥＲＭＢＰ−０８５１８）。
不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ２（ＦＥＲＭＢＰ−０８５１９）。
不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ３（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２０）。
不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ４（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２１）。
不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ６（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２２）。
不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ８（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２３）。
不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ９（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２４）。
不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫ１０（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２５）。
不死化ナチュラルキラー細胞株ＴＮＫｂ（ＦＥＲＭＢＰ−０８５２６）。
ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの脾臓から単離して得られるナチュラルキラー細胞を培養して、細胞質内にアズール顆粒を有し、前感作無しで標的細胞を殺傷する能力及び抗体で被覆された標的細胞を殺傷する能力を保持し、インターロイキン−２により増殖・活性化する細胞株を樹立することを特徴とする不死化ナチュラルキラー細胞株の製造方法。
被検物質の存在下、請求項１〜１９のいずれか記載の不死化ナチュラルキラー細胞株を培養し、該不死化細胞株における細胞傷害活性の程度を測定・評価することを特徴とするナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。