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JP4163834B2 - Hematopoietic stem cell proliferating agent containing cyclophilin - Google Patents

Hematopoietic stem cell proliferating agent containing cyclophilin Download PDF

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JP4163834B2
JP4163834B2 JP34554299A JP34554299A JP4163834B2 JP 4163834 B2 JP4163834 B2 JP 4163834B2 JP 34554299 A JP34554299 A JP 34554299A JP 34554299 A JP34554299 A JP 34554299A JP 4163834 B2 JP4163834 B2 JP 4163834B2
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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、造血幹細胞の生存維持活性、増殖活性、および分化活性を有する造血幹細胞増殖因子としてのサイクロフィリン類を含有し、各種の造血器官疾患、癌の放射線治療および化学療法の際の造血不全に対する治療薬として利用され得る造血幹細胞増殖剤に関する。本発明の造血幹細胞増殖剤はまた、血球の大量生産、および遺伝子治療時の造血幹細胞への遺伝子導入効率向上に利用され得、さらに診断薬および検査薬として活用され得る。
【０００２】
【従来の技術】
造血幹細胞は、すべての成熟した血球に分化する能力（多分化能）と、自己と同じ能力を有する細胞を複製する能力（自己複製能）とを有し、長期にわたり造血を支持し続ける。ヒトの生体における造血は、一般に、細胞間の直接的な相互作用および体液中に存在する種々の物質（すなわち、液性の造血調節因子）により、調節されていると考えられる。細胞間の直接的な相互作用としては、造血幹細胞、特定の血球に分化することがコミットされた造血前駆細胞、およびこれらを取り巻く造血微小環境である間質細胞の間の相互作用が挙げられる。
【０００３】
液性の造血調節因子は、ここ十数年のバイオテクノロジーの進歩により、種々のものが見出された。例えば、エリスロポエチン（リンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：７５８０（１９８５））、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（ナガタら、ＥＭＢＯ Ｊ．、５：５７５（１９８６））、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（ミヤタケら、ＥＭＢＯ Ｊ、４：２５６１（１９８５））、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）（ウオングら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：１５０４（１９８７））、トロンボポエチン（ソーベッジら、Ｎａｔｕｒｅ、３６９：５３３（１９９４））、幹細胞因子（ＳＣＦ）（アンダーソンら、Ｃｅｌｌ、６３：２３５（１９９０））、Ｆｌｔ−３リガンド（リマネットら、Ｃｅｌｌ、７５：１１５７（１９９３））、白血病増殖阻止因子（ＬＩＦ）（スタールら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、（１５）：８８３３（１９９０））、インターロイキン１（ＩＬ１）（クラークら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４、：７８９７（１９８６））、インターロイキン３（ＩＬ３）（ドルサーズら、Ｇｅｎｅ、５５：１１５（１９８７））、インターロイキン６（ＩＬ６）（ヤスカワら、ＥＭＢＯ Ｊ、６：２９３９（１９８７））、インターロイキン１１（ＩＬ１１）（ポールら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：７５１２（１９９０））、インターロイキン１２（ＩＬ１２）（ウオルフら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３０７４（１９９１））などである。
【０００４】
これらのサイトカインはいずれも、造血幹細胞を、単独ではあまり増殖させることができず、ある程度増殖させるためには２つ以上、好ましくは３つ以上を組み合わせて用いることが必要である。したがって、造血幹細胞をより効率的に増殖させ得る血球増殖因子を提供することが望まれている。
【０００５】
サイクロフィリンは、免疫抑制剤サイクロスポリンＡに結合する蛋白質として見出された（ハンドシュマッカーら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２６：５４４（１９８４））。１９８９年に、この蛋白質はペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（ロタマーゼ）という酵素と同一であり、サイクロスポリンＡと結合することにより、その酵素活性が阻害されることが見出された（タカハシら、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：４７３（１９８９））。サイクロフィリンの酵素活性は、ペプチジル−プロリルアミド結合のシス−、トランス−回転異性体の転換を触媒するものである。
【０００６】
ヒトサイクロフィリンとしては、サイクロフィリンＡ（ヘンドラーら、ＥＭＢＯ Ｊ、６（４）：９４７（１９８７））、サイクロフィリンＢ（プライスら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８（５）：１９０３（１９９１））およびサイクロフィリンＣ（シュナイダーら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３（２７）：８２１８（１９９４））が知られている。サイクロフィリンは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の構成蛋白質であるギャグ（ｇａｇ）蛋白質と細胞質内で結合して、ＨＩＶ−１粒子内に取り込まれることが明らかにされた（ルーバンら、Ｃｅｌｌ、７３：１０６７（１９９３））。しかし、サイクロフィリンの幹細胞に対する生理作用については、報告された例がない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヒト造血幹細胞および造血前駆細胞を体外で従来よりも効率的に増殖させ得る造血幹細胞増殖剤を提供することにある。本発明のさらなる目的は、各種の造血器官疾患、癌の放射線治療および化学療法の際の造血不全に対する治療薬として利用され得、血球の大量生産に利用され得、遺伝子治療時の造血幹細胞への遺伝子の導入効率の向上に利用され得、さらに診断薬および検査薬として活用され得る、造血幹細胞増殖剤を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、マウス骨髄腫細胞（ＮＳ−１細胞）培養上清に造血幹細胞の増殖を活性化する蛋白質が存在することを見出した。本発明者らは、この蛋白質を分離、精製、および同定することにより、この蛋白質が造血幹細胞増殖因子として新規である、サイクロフィリン（サイクロフィリンＢ、サイクロフィリンＡ、および修飾型サイクロフィリンＡ）であることを明らかにし、それらの造血幹細胞増殖活性を利用することにより、本発明を完成するにいたった。
【０００９】
本発明の造血幹細胞増殖剤は、サイクロフィリンを含有する。
【００１０】
１つの実施態様では、上記サイクロフィリンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチド、またはこれらの修飾体であり得る。
【００１１】
１つの実施態様では、上記サイクロフィリンは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチド、またはこれらの修飾体であり得る。
【００１２】
１つの実施態様では、上記サイクロフィリンは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチド、またはこれらの修飾体であり得る。
【００１３】
１つの実施態様では、上記サイクロフィリンは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチド、またはこれらの修飾体であり得る。
【００１４】
１つの実施態様では、上記修飾体は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有し、かつそのアミノ末端がアセチル化されたポリペプチドであり得る。
【００１５】
１つの実施態様では、上記修飾体は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有し、かつそのアミノ末端がアセチル化されたポリペプチドであり得る。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有しかつアミノ末端がアセチル化されたポリペプチド、または配列番号３で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、そのアミノ末端がアセチル化され、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチドである。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有しかつアミノ末端がアセチル化されたポリペプチド、または配列番号４で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、そのアミノ末端がアセチル化され、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチドである。
【００１８】
本発明の造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖方法は、上記のいずれかの造血幹細胞増殖剤を用いて非ヒト動物またはインビトロにおいて造血幹細胞または造血前駆細胞を増殖させる工程を包含する。
【００１９】
１つの実施態様では、上記造血幹細胞増殖剤は、ヒトまたはマウス由来の骨髄腫細胞の培養上清であり得る。
【００２０】
１つの実施態様では、上記増殖工程において、造血幹細胞または造血前駆細胞に外来遺伝子が導入され得る。
【００２１】
本発明のヒト組織幹細胞または組織前駆細胞の増殖方法は、上記のいずれかの造血幹細胞増殖剤を用いて非ヒト動物またはインビトロにおいてヒト組織幹細胞または組織前駆細胞を増殖させる工程を包含する。
【００２２】
本発明の血液系の疾患の診断薬または検査薬は、上記のいずれかの造血幹細胞増殖剤を含む。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施においては、特に指示のない限り、当該分野で既知であるタンパク質の分離および分析法、組換えＤＮＡ技術およびアッセイ方法が採用される。
【００２４】
Ｉ．定義
以下に、本発明を説明する上で用いられる用語を説明する。
【００２５】
サイクロフィリンは、上述のように、当初、免疫抑制剤サイクロスポリンＡに結合する蛋白質として単離されたポリペプチドであり、サイクロフィリンＡ、サイクロフィリンＢ、およびサイクロフィリンＣが知られている。本発明において、用語「サイクロフィリン」は、これらの特定のポリペプチドに限定されず、これらのポリペプチドのいずれかに対してアミノ酸配列における実質的な相同性を有するポリペプチド、およびこれらのポリペプチドのいずれかの修飾体もまた含んでいう。相同なポリペプチドの例として、種変異体、および対立遺伝子変異体がある。
【００２６】
ヒト由来のサイクロフィリンＡは、配列表の配列番号３のアミノ酸配列を含む。マウス由来のサイクロフィリンＡの場合、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
ヒト由来のサイクロフィリンＢは、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を含む。マウス由来のサイクロフィリンＢの場合、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
ヒト由来のサイクロフィリンＣは、配列表の配列番号９のアミノ酸配列を含む。マウス由来のサイクロフィリンＣの場合、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
ヒトの疾患または治療の目的において、およびヒトの造血幹細胞の増殖においてヒト由来のポリペプチドが好ましいことは明らかである。しかし、他の哺乳動物由来の相同なポリペプチドもまた目的に応じて使用可能である。さらに、他の哺乳動物由来のポリペプチドとの比較は、ヒト由来のポリペプチドの所望の活性が保持された改変体を得るうえで重要である。
【００３０】
本発明に用いられるサイクロフィリンは、上記の特定の配列によって必ずしも限定されることはなく、これらの配列のいずれかに対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ所望の活性が保持された相同なポリペプチド（すなわち、サイクロフィリンの相同体）も対象として含まれる。ここで、「数個」までのアミノ酸の変異とは、所望の活性が得られる限り、必ずしも特定の上限値に束縛されることを意図しないが、代表的には約６０個以下、好ましくは約４０個以下、より好ましくは約２０個以下の範囲であり得る。アミノ酸の付加の例には、Ｎ末端の１個のＭｅｔ残基の付加（これはＭ型のサイクロフィリンを与える）が含まれる。
【００３１】
アミノ酸の保存的置換は、相同なポリペプチドを得るための好ましい手段のひとつである。保存的置換は、代表的には以下のグループ内での置換を包含する：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００３２】
２つのアミノ酸配列の間の配列同一性（相同性）は、必要であればギャップを導入して、残基の適合を最適化することにより決定される。ヒトのサイクロフィリンに実質的なアミノ酸配列相同性を有するポリペプチドは、ヒトのサイクロフィリンのいずれかのアミノ酸配列と比較して、代表的には少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％以上の相同性を有するポリペプチドとして表され得る。相同性決定のためのソフトウェアは、容易に入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｗｏｒｋｓ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）などが入手可能である。
【００３３】
本発明に用いられるサイクロフィリンの修飾体としては、上記の配列と同一または相同な配列を有するポリペプチドであって、そのアミノ酸側鎖またはアミノ末端またはカルボキシル末端が修飾され、かつ所望の活性が保持されたポリペプチドが含まれる。サイクロフィリンの相同体と修飾体とを総称して、機能的等価体ともいう。上記の修飾体の例として、アミノ末端がアシル化（例えば、アセチル化）されたポリペプチド、およびカルボキシ末端がアミド化またはエステル化されたペプチドが挙げられる。好ましい修飾体としては、配列表の配列番号３および配列番号４のアミノ末端のバリンのアミノ基がアセチル化されたポリペプチドが挙げられる。より好ましくは、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００３４】
本発明において「造血幹細胞増殖活性を有する」とは、定義上、下記の実施例１４と実質的に同一の条件（サイクロフィリンＢの添加濃度は２０ｎｇ/ｍｌとする）で測定したとき、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞数が実施例１４の対照区に示された細胞数よりも多いこと、代表的には約１１０％以上、好ましくは約２００％以上であることをいう。
【００３５】
「造血幹細胞」とは、赤血球、白血球、巨核球などの骨髄細胞のみならず、Ｔ細胞、Ｂ細胞などのリンパ系を含めた全ての血液系への分化能を有する多能性の細胞であって、自己増殖可能な細胞をいう。造血幹細胞は、ＣＤ３４抗原が陽性でかつＣＤ３８抗原が陰性であることにより特徴付けられる。「造血前駆細胞」とは、血液系の特定の細胞系列への分化が決定付けられているが、分裂により自己増殖可能な細胞をいう。造血前駆細胞は、ＣＤ３４抗原とＣＤ３８抗原とがいずれも陽性であることにより特徴付けられる。
【００３６】
「組織幹細胞」とは、分裂に伴って自己再生能を示すとともに、同時に性質の異なる細胞を生じる分化能を有する細胞をいい、造血幹細胞、表皮基底膜の幹細胞、小腸粘膜上皮の幹細胞、神経系幹細胞など、あらゆる種類の幹細胞を含む。「組織前駆細胞」とは、特定の組織に分化および成熟する前段階の細胞をいう。
【００３７】
ＩＩ．造血幹細胞増殖活性を有するサイクロフィリン
本発明においては、サイクロフィリンは、造血幹細胞増殖剤の有効成分として利用される。サイクロフィリンは、天然の供給源から単離されたもの、組換えＤＮＡ技術を使用して産生したもの、または化学合成したものであり得る。
【００３８】
サイクロフィリンを天然の供給源から単離する場合、例えば、以下のようにして精製し得る。まず、骨髄腫細胞（例えば、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（略称：ＮＳ−１）細胞）を培養し、得られる培養上清から造血幹細胞増殖活性蛋白質を分離および精製する。
【００３９】
「骨髄腫細胞」とは、永久増殖能を有する、ガン化した株化細胞である。骨髄腫細胞は、種々の用途が知られており、例えば、ケーラーおよびミルシュタインは、マウス由来の骨髄腫細胞であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８（略称Ｘ６３）細胞を、ヒツジ赤血球細胞で感作したマウス脾臓由来のリンパ球と細胞融合し、Ｂ細胞ハイブリドーマを作製した（ケーラーら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５））。Ｘ６３細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩｇＧ１カッパ鎖産生骨髄腫細胞から、８−アザグアニン耐性であり、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地では増殖できない細胞集団を、クローニングにより選択して得られた細胞株である。ＮＳ−１細胞は、Ｘ６３細胞由来の骨髄腫細胞で、ＩｇＧ１カッパ鎖のみを合成するが、分泌はしないことが知られている（ケーラーら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６：５１１（１９７６））。
【００４０】
本発明者らは、このＮＳ−１細胞培養上清に、驚くべきことに、造血幹細胞増殖活性が存在することを見出した。従って、本発明における造血幹細胞増殖活性因子は、ＮＳ−１細胞の培養上清、または同様な活性を示す他の骨髄腫細胞の培養上清から単離することができる。骨髄腫細胞培養上清に見出された造血幹細胞増殖活性蛋白質の分離精製は、造血幹細胞増殖活性を示す骨髄腫細胞培養上清を大量に調製することから始める。細胞の培養は、通常の株化細胞の培養方法に準じればよい。例えば、適当な比率の牛胎児血清（ＦＣＳ）を含有する動物細胞培養用培地中で、３７℃に設定したＣＯ2インキュベーターで培養する。
【００４１】
培養上清から蛋白質を分離および精製するためには、夾雑蛋白質をできるだけ減少させる必要がある。そのために、最も造血幹細胞増殖活性蛋白質の含有量が増える直前期に、培地を無血清培地に交換して、培養を継続し、その後培養上清を回収することが好ましい。回収した培養上清をフィルターに通して、細胞残渣を除くことができる。
【００４２】
得られた培養上清から、造血幹細胞増殖活性蛋白質を分離および精製するためには、通常の蛋白質の分離精製方法を用いることができる。培養上清を濃縮するためには、限外ろ過膜を用い得る。濃縮した培養上清を、ＨＰＬＣを用いたゲルろ過カラムにアプライし、造血幹細胞増殖活性を有する画分を回収する。得られた活性画分を逆相ＨＰＬＣカラムに供する。溶出したものの中から、造血幹細胞増殖活性を有する画分を回収する。こうして得られた画分は充分な純度を有し、さらなる精製を行なわずにこのままプロテインシークエンサーによるアミノ酸配列分析に供することができる。アミノ末端がエドマン分解できない構造を有する場合、トリプシンなどの蛋白質分解酵素によるペプチドマップを作製して、解析することができる。こうして、骨髄腫細胞培養上清に見出される造血幹細胞増殖活性蛋白質を同定することができる。
【００４３】
サイクロフィリンを組換えＤＮＡ技術を使用して産生する場合、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、種々の組換え系を用いて発現される。発現ベクターの構築および適切なＤＮＡ配列を有する形質転換体の作製は、当該技術分野で公知の方法によって実施される。発現は、原核生物系または真核生物系で実施され得る。
【００４４】
サイクロフィリンＡ、ＢおよびＣをコードするＤＮＡ配列は、当該分野で公知であり、これらの配列を含むポリヌクレオチドは容易に入手可能である。サイクロフィリンの相同体をコードするＤＮＡ配列は、例えば、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーなどからスクリーニングすることができる。
【００４５】
原核生物宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、バチルス属菌、およびその他のバクテリアが用いられる。そのような原核生物には、複製部位と宿主に適合する制御配列とを含むプラスミドベクターが用いられる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のプラスミドである、ｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される。ここでの制御配列とは、転写開始のためのプロモーター、必要に応じてオペレーター、およびリボソーム結合部位配列を含むと定義される。この制御配列には、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、トリプトファンプロモーター系、およびλファージ由来のＰLプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位のような一般的に用いられているものが包含される。
【００４６】
真核生物宿主としては、例えば酵母および哺乳動物細胞が用いられ得る。このような真核生物には、複製部位と宿主に適合する制御配列とを含むプラスミドベクターが用いられる。例えば、酵母は、ｐＹＥＵｒａ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて形質転換される。その他に、真核生物宿主で有用なプロモーターには、例えば糖分解酵素を合成するためのプロモーター（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター）；エノラーゼ遺伝子由来のプロモーター；ＹＥｐ１３から得られたＬｅｕ２遺伝子由来のプロモーター；メタロチオネイン由来のプロモーター；ＳＶ４０由来の初期または後期プロモーター、ポリオーマウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシ乳頭腫ウイルス、およびトリ肉腫ウイルス由来のプロモーターのような他のウイルスプロモーターが包含される。宿主細胞と適切なプロモーターとの組合せは当業者に公知であり、必要に応じて適切に選択され得る。
【００４７】
発現ベクターを適合性の宿主細胞に導入することによって形質転換体が得られる。この形質転換体を適切な条件で培養することにより、所望のサイクロフィリンを得ることができる。サイクロフィリンの修飾体は、宿主細胞中での発現後修飾の結果として得られる場合がある。所望により、単離精製したサイクロフィリンを公知の化学合成技術を利用して修飾体に変換することもできる。
【００４８】
大腸菌によるヒトサイクロフィリンＢの生産の例を説明する。最初に、ヒトサイクロフィリンＢのｃＤＮＡの５’側が制限酵素ＮｄｅＩ部位に、３’側が制限酵素ＥｃｏＲＩ部位になるように設計した合成プライマーを用いて、ヒトサイクロフィリンＢのｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、ヒトサイクロフィリンＢのｃＤＮＡ（制限酵素ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片）を増幅する。増幅したｃＤＮＡを大腸菌発現ベクターｐＥＴ１１ｂ（制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで処理したもの）にライゲーションすることにより、ヒトサイクロフィリンＢ大腸菌発現ベクターを作製する。作製された発現ベクターを、大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションして、大腸菌トランスフォーマントを取得する。
【００４９】
次にこの大腸菌トランスフォーマントから、ヒトサイクロフィリンＢを、例えば以下のようにして生産させる。まず、大腸菌トランスフォーマントを、アンピシリンを含むＬＢ液体培地に植菌して、３７℃にて培養する。６００ｎｍの吸光度が約０．７になったら、イソプロピル−１−チオ−ベータ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を０．１〜１．０ｍＭ、好ましくは０．４ｍＭ添加して、３７℃にて、さらに２時間培養した後、大腸菌を遠心分離にて集菌する。
【００５０】
集菌された菌体をリシスバッファー（組成：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ２ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌペプスタチン）で懸濁し、ソニケーションにより菌体を破砕し、菌体破砕液を得る。菌体破砕液を遠心分離し、得られる上清に硫酸アンモニウムを４０％飽和となるように添加し、不要なタンパク質を沈澱させる。沈澱後、遠心分離を行ない、得られる上清をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に透析する。この透析した溶液をＴＳＫ−ｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷに供し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でＮａＣｌ濃度を０から１ｍＭに上げるグラジエントで溶出し、サイクロフィリンＢの画分を集める。集めた画分を、限外ろ過装置（分画分子量１０，０００）で濃縮する。この濃縮液をＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷXLに供し、Ｃａ2+およびＭｇ2+を含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ（−））で精製を行う。精製されたサイクロフィリンＢの画分を再度ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷXLによりさらに精製し、ヒトサイクロフィリンＢ蛋白質の高純度標品を得ることができる。
【００５１】
ここではヒトサイクロフィリンの生産の例を挙げたが、マウスのサイクロフィリンＢなどについてもヒトと同様にして作製できる。
【００５２】
サイクロフィリンの化学合成は、当該技術分野で公知の方法で行われ得る。例えば、ペプチド合成機による固相法で合成され得る。例えば、ベンズヒドリルアミンレジンを用いて、ペプチド合成機にて、Ｃ末端アミノ酸から順次Ｎ末端アミノ酸まで標準的なＤＣＣ／ＨＯＢｔ法で縮合させ、得られたペプチドレジンから標準的な開裂法（トリフルオロメタンスルホン酸法）で生成ペプチドを切り出すことによって、Ｃ末端がアミド化されたペプチドを作製し得る。
【００５３】
作製したサイクロフィリンが正しい分子構造を取れているかどうかは、サイクロフィリンのペプチジルプロリルイソメラーゼ活性を測定することにより判断できる。シス-Ｎ-サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリジン（ｃｉｓ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｉｎｅ）を最終５０μＭ、Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ８．０）を４０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を０．０１５％（ｗ／ｖ）に加えて、サイクロフィリンを５０ｎＭ添加し、１０℃でインキュベーションし、これに２００μＭキモトリプシンを加えてすばやく分光光度計にて、３９０ｎｍの吸収を測定することにより活性を測定して判断できる。
【００５４】
ＩＩＩ．造血幹細胞増殖活性の確認
次にサイクロフィリンの造血幹細胞増殖活性の確認の方法の例を説明する。
【００５５】
臍帯血から調製した造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞）を、マイクロタイタープレートにプレーティングする。造血幹細胞の増殖に使用する培地としては、試験区では、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０に、サイトカインであるＳＣＦおよびＩＬ３を添加した培地（ＳＣＦ／ＩＬ３培地）を用意し、これに造血幹細胞活性を検定しようとする目的のポリペプチド（例えば、ヒトサイクロフィリンＢ）を含有するサンプルを添加した培地である。対照区では、目的のポリペプチドを含有する上記サンプルの代わりに、２％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０をＳＣＦ／ＩＬ３培地に加えた培地を用いる。これらを約３７℃で１０〜２０日間程度培養した後、生細胞数をトリパンブルー法で測定し、試験区と対照区での生細胞数を比較することにより、目的ポリペプチドの造血幹細胞増殖活性が確認できる。
【００５６】
他の方法では、次のように造血幹細胞増殖活性が測定され得る。臍帯血から調製した造血幹細胞をプレーティングする。造血幹細胞の増殖に使用する培地としては、試験区では、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０に、サイトカインであるＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ３を添加した培地（ＳＣＦ／ＩＬ６／ＩＬ３培地）を用意し、これに造血幹細胞活性を検定しようとする目的ポリペプチド（例えば、ヒトサイクロフィリンＢ、ＩＬ７、Ｆｌｔ−３リガンド、およびＮＳ−１培養上清１０倍濃縮溶液）を含有するサンプルを添加した培地である。対照区では、目的のポリペプチドを含有する上記サンプルの代わりに、２％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０をＳＣＦ／ＩＬ６／ＩＬ３培地に加えた培地を用いる。約３７℃で２０〜３５日間培養した後、生細胞数をトリパンブルー法で測定し、試験区と対照区での生細胞数を比較することにより、目的のポリペプチドの造血幹細胞増殖活性が確認できる。
【００５７】
別の方法では、臍帯血から調製した造血幹細胞をプレーティングする。造血幹細胞の増殖に使用する培地として、試験区では、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０に、サイトカインであるＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ３を添加した培地（ＳＣＦ／ＩＬ６／ＩＬ３培地）を用意し、これを造血幹細胞活性を検定しようとする目的ポリペプチド（例えば、大腸菌型ヒトサイクロフィリンＢ、大腸菌型マウスサイクロフィリンＢそして大腸菌型ヒトサイクロフィリンＡを含有するサンプルを添加した培地である。対照区では、目的のポリペプチドを含有する上記サンプルの代わりに、２％ＦＣＳ−ＩＭＤＭ（イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ）モディファイド ダルベッコ培地）をＳＣＦ／ＩＬ６／ＩＬ３培地に加えた培地を用いる。約３７℃で１０〜２０日間程度培養した後、細胞にＣＤ３４（ＦＩＴＣ）抗体処理を行い、各一定時間ＦＡＣＳｃａｎにて細胞の取り込みを行いＣＤ３４＋細胞比率を求める。また、トリパンブルー法で生細胞数を測定し、生細胞数にＣＤ３４+細胞比率を乗じて算出することにより、ＣＤ３４陽性細胞数を求める。このようにして、目的ポリペプチドの造血幹細胞増殖活性の確認ができる。
【００５８】
ＩＶ．造血幹細胞増殖剤およびその利用
本発明の造血幹細胞増殖剤は、造血幹細胞増殖活性を有するサイクロフィリンと、その活性を実質的に阻害しない任意の媒体とを含有する組成物として提供される。従って、上記のサイクロフィリンを含有する培養上清自体も、造血幹細胞増殖剤の定義に含まれる。ここで「サイクロフィリン」は広義に用いられ、サイクロフィリンＡ、Ｂ、およびＣのほか、上述したサイクロフィリンの相同体および修飾体を含む意である。ヒトへの投与のための造血幹細胞増殖剤は、代表的には、有効量のサイクロフィリンに加えて、当業者に公知の任意の薬学的に受容可能な賦形剤を含有し得る。賦形剤の例としては、乳糖、コーンスターチ、ステアリン酸マグネシウム、ミョウバンなどが挙げられる。
【００５９】
本発明の造血幹細胞増殖剤は、当該分野で公知の方法に従って調製され得る。
【００６０】
本発明の造血幹細胞増殖剤は、任意の形状であり得る。本発明の造血幹細胞増殖剤は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような固体；または水溶液および懸濁液のような液体であり得る。本発明の造血幹細胞増殖剤を錠剤として経口投与する場合、通常、乳糖、コーンスターチ、およびステアリン酸マグネシウムのような賦形剤が使用され得る。本発明の造血幹細胞増殖剤をカプセル剤として経口投与する場合、通常、乳糖および乾燥コーンスターチのような賦形剤が使用され得る。水性懸濁液として経口投与するためには、サイクロフィリンを乳濁液または懸濁液と組み合わせて使用し得る。水性懸濁液は、必要に応じて、甘味剤および香料を含有し得る。本発明の造血幹細胞増殖剤を筋肉内、腹腔内、皮下、および静脈内注射する場合は、滅菌した溶液にサイクロフィリンを溶解させて緩衝液を調製し、ｐＨを適切な値に調節する。本発明の造血幹細胞増殖剤を静脈内投与する場合は、この増殖剤は等張であることが好ましい。
【００６１】
本発明の造血幹細胞増殖剤を用いることにより、造血幹細胞または造血前駆細胞を含む組織幹細胞または組織前駆細胞を大量に増殖させることが可能である。例えば、本発明の造血幹細胞増殖剤を用いて、インビトロにおいて造血幹細胞または造血前駆細胞を増殖させることにより、血球を大量生産することができる。造血幹細胞増殖剤の有効量ならびに血球の生産および回収の条件などは、当業者により適宜選択され得る。
【００６２】
さらに、本発明の造血幹細胞増殖剤は、免疫抑制障害などの各種の造血器官疾患、ならびに癌の放射線治療および化学療法による造血不全のような、血球の増加が所望される患者の治療に用いることができる。治療用途において、本発明の造血幹細胞増殖剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社（Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に記載されているような従来のポリペプチドの処方物の形で投与され得る。例えば、本発明の造血幹細胞増殖剤は、経口投与、静脈投与、筋肉注射、腹腔内注射、および皮下注射のような非経口投与により投与され得る。これらのポリペプチドを羊水中へ補充することも可能である。好ましくは、これらのポリペプチドは、注射によって投与され得る。
【００６３】
本発明の造血幹細胞増殖剤を、ヒトに投与する場合、１日あたりの用量は、通常、患者の症状、重篤度、感受性に対する個体差、体重、年齢などを考慮して、当業者によって適切に決定され得る。本発明の造血幹細胞増殖剤は、１日１回投与されてもよいし、１日数回に分けて投与されてもよい。
【００６４】
遺伝子治療においては、目的の遺伝子の導入効率は、遺伝子を細胞に導入工程で、どれだけ多数の細胞が分裂を行なっているかに左右されることが知られている。従って、本発明の造血幹細胞増殖剤を用いて造血幹細胞または造血前駆細胞を増殖させつつ遺伝子を導入することにより、非常に高い遺伝子導入効率を得ることができる。
【００６５】
さらに、本発明の造血幹細胞増殖剤は、そのままで血液系の疾患（例えば、白血病、骨髄腫、貧血など）の診断薬および検査薬として用いることができる。
【００６６】
【実施例】
以下、本発明における造血幹細胞増殖因子としてのサイクロフィリンについてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００６７】
（実施例１：ヒト臍帯血からの、造血幹細胞の調製）
産婦人科からインフォームドコンセントにて供与された、ヒト臍帯血（抗凝固剤としてヘパリンを用いたもの約５０ｍｌ）からフィコール法（アマシャムファルマシアバイオテク社製、フィコールパックを用いた）にて、単核球画分を調製し、凍結保存した。これをアッセイ開始時に凍結融解後、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０（株式会社日研生物医学研究所製）にて洗浄し、細胞に、ＣＤ３４（ＦＩＴＣ）、ＣＤ３８（ＰＥ）各抗体処理を行い、ＦＡＣＳｔａｒ（ベクトンディッキンソン社製）にて、造血幹細胞ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性（以下ＣＤ３４＋ＣＤ３８−と表す）細胞を分取した。
【００６８】
（実施例２：ヒト臍帯血の造血幹細胞を用いた造血幹細胞増殖因子検出系の構築）
実施例１で分取したヒト臍帯血のＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞を、９６ウエルＵ型プレート（コースター社製）にプレーティングした（５０細胞／１００μｌ／ウエル）。用いた培地は、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０に、サイトカインであるＳＣＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ３（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加したものであり、さらに、造血幹細胞増殖活性について測定しようとするサンプル２０μｌ／ウエルを添加した。
【００６９】
３７℃で１３〜３２日間液体培養した後、生細胞数をトリパンブルー法（トリパンブルーは大日本製薬社のものを用いた）にて測定した。細胞のカウントには血球計算盤を用いた。
【００７０】
ＣＤ３４＋細胞数およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞数は、以下の通りに算出した。まず、液体培養後の細胞をＣＤ３４（ＦＩＴＣ）抗体（イムノテック社製）およびＣＤ３８（ＰＥ）抗体（イムノテック社製）（細胞１０5個に対して抗体５０ｎｇ）で染色した。染色された細胞を、ＰＢＳ（−）溶液（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ヨウ化プロピジウム（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えて細胞核を染色した。染色された細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社製）で解析して、ＣＤ３４＋細胞比率およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞比率を求め、生細胞数にその比率を乗じることにより、ＣＤ３４＋細胞数およびＣＤ３４ＣＤ３８−細胞数を算出した。
【００７１】
（実施例３：マウス骨髄腫細胞培養およびその培養上清の調製）
マウス骨髄腫細胞（ＮＳ−１）を、１．０×１０5細胞／ｍｌの濃度になるように、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地１５ｍｌに懸濁し、カルチャーディッシュ（グライナー社製）（直径１０ｃｍ）に入れ、５％ＣＯ2インキュベーターで、３７℃で培養を開始した。培養０、１、２、３、４、５、６、７および８日目に培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルターを通過した上清を集めた。
【００７２】
（実施例４：ＮＳ−１細胞増殖曲線の作製）
ＮＳ−１細胞培養０、１、２、３、４、５、６、７および８日目に、生細胞数および死細胞数をトリパンブルー法にて測定した。測定の結果、生細胞濃度は、それぞれ１×１０5個／ｍｌ、４×１０5個／ｍｌ、１０×１０5個／ｍｌ、１７×１０5個／ｍｌ、１８×１０5個／ｍｌ、１４×１０5個／ｍｌ、１０×１０5個／ｍｌ、５×１０5個／ｍｌ、２×１０5個／ｍｌであった。死細胞濃度は、０．０５×１０5個／ｍｌ、０．１×１０5個／ｍｌ、０．５×１０5個／ｍｌ、１×１０5個／ｍｌ、４×１０5個／ｍｌ、１０×１０5個／ｍｌ、１３×１０5個／ｍｌ、１７×１０5個／ｍｌ、２０×１０5個／ｍｌであった。この結果、培養４日目に生細胞数が最大になることがわかった。
【００７３】
（実施例５：ＮＳ−１細胞培養上清回収時期の決定）
上記実施例３でＮＳ−１細胞を培養して、培養０、１、２、３、４、５、６、７および８日目に回収して得た培養上清を、実施例２で構築したヒト臍帯血造血幹細胞を用いた造血幹細胞増殖因子検出系を用いて評価を行った。各培養上清を９６穴Ｕ型ウエルに２０μｌずつ添加した。ＣＤ３４＋細胞数は、培養４、５、６、７および８日目に回収した上清についてそれぞれ、３６２個、５５０個、１５３個、１１５個および９３個であった。その結果、培養５日目の上清に最も高い造血幹細胞増殖活性が存在することがわかった。
【００７４】
（実施例６：ＮＳ−１細胞培養上清の造血幹細胞増殖活性の濃度依存性についての検討）
実施例３で回収したＮＳ−１細胞培養上清の造血幹細胞増殖活性の濃度依存性について検討した。ヒト臍帯血造血幹細胞を用いた造血幹細胞増殖因子検出系を用いて、培養２５日目のＮＳ−１細胞培養上清を、原液のまま、２倍希釈、４倍希釈、８倍希釈、１６倍希釈、３２倍希釈、６４倍希釈、１２８倍希釈および２５６倍希釈して添加して造血幹細胞増殖活性を評価した。ＣＤ３４＋細胞数はそれぞれ、２３８個、１４４個、７４個、１０４個、４５個、１個、０個、１１個および１０個であった。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞数はそれぞれ、１０７個、３６個、４４個、３７個、１７個、１個、０個、２個および１個であった。このように、造血幹細胞の増殖はＮＳ−１細胞培養上清の濃度にほぼ依存していた。
【００７５】
（実施例７：ＮＳ−１細胞培養上清の大量調製）
ＮＳ−１細胞を１．０×１０5／ｍｌの濃度になるように、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地５０ｍｌに懸濁し、カルチャーフラスコ（グライナー社製、１５０ｃｍ2）に入れた。５％ＣＯ2インキュベーターで、３７℃の条件で培養を開始し、培養後５日目の培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルターを通過した上清を集めた。合計３，６２０ｍｌの培養上清を回収した。
【００７６】
（実施例８：ＮＳ−１細胞培養上清のゲルろ過による精製）
実施例７で回収したＮＳ−１細胞培養上清１５ｍｌを、分画分子量１０，０００の限外ろ過フィルター（ゲルマンサイエンシズ社製）で１ｍｌに濃縮後、全量をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）（直径１０ｍｍ、高さ１９．１ｃｍ）にアプライした。平衡化緩衝液には、ＲＰＭＩ １６４０培地（日水製薬製）を用いて、溶出画分を集めた。
【００７７】
溶出画分を、実施例２で構築したヒト臍帯血造血幹細胞を用いた造血幹細胞増殖因子検出系で造血幹細胞増殖活性について評価したところ、分子量２万付近の画分に活性が認められた。
【００７８】
５日間３７℃で保存した１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地を同様にしてＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００カラムでゲルろ過したものを対照にして、同じ造血幹細胞増殖因子検出系で評価したが、対照では造血幹細胞増殖活性はほとんど認められなかった。
【００７９】
以上から、分子量２万付近の培養上清画分に造血幹細胞増殖活性因子が存在することがわかった。
【００８０】
（実施例９：ＮＳ−１細胞培養上清のゲルろ過画分の逆相ＨＰＬＣによる精製）
実施例８で得られたゲルろ過での活性画分を逆相ＨＰＬＣに供した。逆相ＨＰＬＣカラムとして、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（株式会社ワイエムシィ製、長さ２５０ｍｍ、内径４．６ｍｍ）を用い、ＨＰＬＣ装置は島津製作所製ＬＣ−１０Ａを使った。溶出はＴＦＡ−ＣＨ3ＣＮの系で行った。すなわちＡ液には０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．０）、Ｂ液には８０％ＣＨ3ＣＮ−０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．０）を用いて、最初の５分間はＢ液の濃度を０％、次の７０分間でＢ液の濃度を０％から７０％に直線グラジエントで、次の１０分間で７０％から１００％まで同様に直線グラジエントで溶出した。溶出画分を、ヒト臍帯血造血幹細胞を用いた造血幹細胞増殖因子検出系で評価を行った（図１）。リテンション時間６０分付近の画分および６３分付近の画分に活性が認められた。
【００８１】
（実施例１０：無血清培養によるＮＳ−１細胞培養およびその培養上清の調製）
１５％ＦＣＳ含有培地よりも、より精製が容易な培養上清を作製するために、無血清培養によるＮＳ−１細胞培養方法を確立した。ＮＳ−１細胞を１×１０5／ｍｌの濃度で１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地４０ｍｌで、直径１４．５ｃｍのディシュ（グライナー社製）にて培養開始した。培養４日目に新しい１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地４０ｍｌに交換し、さらに１日培養した。次いで、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、血清を含まないＲＰＭＩ １６４０培地４０ｍｌに移し、新しいディッシュで１日間培養した。次いで、培養物を０．２２μｍのフィルターを通し、細胞残渣を除去して、培養上清を回収した。回収した培養上清を、ヒト臍帯血造血幹細胞を用いた造血幹細胞増殖因子検出系での評価に供して活性が存在することを確認した。
【００８２】
（実施例１１：ＮＳ−１細胞無血清培養上清のゲルろ過による精製）
実施例１０で回収したＮＳ−１細胞無血清培養上清２０ｍｌを、分画分子量１０，０００の限外ろ過フィルター（ゲルマンサイエンシズ社製）で１／１０に濃縮して得た濃縮培養上清２ｍｌを、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷXLカラムにアプライした。平衡化緩衝液には、０．３Ｍ食塩を含む５０ｍＭリン酸緩衝液を用い、溶出画分を集めた。溶出画分を、ヒト臍帯血造血幹細胞を用いた造血幹細胞増殖因子検出系で評価を行ったところ、分子量２万付近の画分に活性が認められた。
【００８３】
（実施例１２：ＮＳ−１細胞無血清培養上清のゲルろ過画分の逆相ＨＰＬＣによる精製）
実施例１１で得られたゲルろ過での活性画分１４ｍｌを逆相ＨＰＬＣに供した。逆相ＨＰＬＣカラムとして、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（株式会社ワイエムシィ製、長さ２５０ｍｍ、内径４．６ｍｍ）を用い、ＨＰＬＣ装置は島津製作所製ＬＣ−１０Ａを使った。溶出はＴＦＡ−ＣＨ3ＣＮの系で行った。すなわちＡ液には０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．０）、Ｂ液には８０％ＣＨ3ＣＮ−０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．０）を用いて、最初の１５分間はＢ液の濃度を０％、次の７０分間でＢ液の濃度を０％から７０％に直線グラジエントで、次の１０分間で７０％から１００％まで同様に直線グラジエントで溶出した（図２）。
【００８４】
ＣＨ3ＣＮ濃度が４７％付近のピーク（リテンション時間が７１分、７２分、および７４分の合計３つ）を回収して、再度同じカラムでリクロマトグラフィーを行い同様に精製した。
【００８５】
（実施例１３：精製サンプルのアミノ末端アミノ酸配列確認）
上記の実施例１２においてＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰのリクロマトグラフィーで精製して得られた３つのサンプルを、プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｃｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ：Ｍｏｄｅｌ ４９２）にアプライして、分析した。
【００８６】
リテンション時間が７１分のサンプルは、２５アミノ酸残基のアミノ末端を分析したところ、マウスサイクロフィリンＢに一致した。リテンション時間が７２分のサンプルは、マウスサイクロフィリンＡに一致した。リテンション時間が７４分のサンプルは、エドマン分解できない構造と思われた。
【００８７】
次いで、上記の実施例１２において得られた３つのサンプルを、ＴＰＣＫ−トリプシンを用いてペプチドマップを作製して分析したところ、リテンション時間が７１分のサンプルは、マウスサイクロフィリンＢに一致した。またリテンション時間が７２分のサンプルも、マウスサイクロフィリンＡに一致した。リテンション時間が７４分のサンプルは、アミノ末端のペプチドがエドマン分解できなかったが、その他のトリプシンペプチドはマウスサイクロフィリンＡに一致した。そこでアミノ末端のペプチド１５μｌ（１００ｐｍｏｌ）をアミノ酸分析した。
【００８８】
試料をガラス試験管に採取し、乾固後、２０μｌの６Ｎ塩酸を添加、真空封管下、１３５℃で３時間加水分解した。試料を乾固後、再び７５μｌの精製水に溶解し、内５０μｌを、条件として、特殊アミノ酸分析法／ニンヒドリン発色、装置は日立アミノ酸分析計Ｌ−８５００型で分析した。マウスサイクロフィリンＡのアミノ末端のペプチドと比較すると、全く同じ値が得られたため、アミノ酸配列上はマウスサイクロフィリンＡと同様であると考えられた。
【００８９】
次にアミノ末端のペプチド１μｌをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。試料１μｌに内標としてサブスタンスＰ（分子量１３４８．６）を添加し、サンプルスライドに添加した。乾固後、１μｌのマトリックス（アルファ−シアノ−１−ヒドロキシシナミックアシッド １０ｍｇ／ｍｌ）を添加して、以下の条件で測定した。ＭＳ測定条件は、質量分析装置として、ＫＯＭＰＡＣＴ ＭＡＬＤＩＩ（島津製作所／ＫＲＡＴＯＳ）、レーザー光波長を３３７ｎｍ（窒素レーザー）で測定した。結果はアミノ酸組成から計算したペプチドの分子量（理論値）（２，００５）と、得られたマススペクトルの平均値（２，０４８）との差が４３であることから、アミノ末端ブロック基は分子量が４３に相当するアセチル基であると推定された。以下このアミノ末端のバリンがアセチル化されたマウスサイクロフィリンＡを、マウス修飾型サイクロフィリンＡと称す。
【００９０】
（実施例１４：精製サンプルの造血幹細胞増殖活性確認）
未熟な造血幹細胞であるＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞数の増加を指標に、実施例１２で得た３つのサンプルの活性を調べた。すなわち、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰでリクロマトグラフィーを行い精製した、マウスサイクロフィリンＢ、マウス修飾型サイクロフィリンＡおよびマウスサイクロフィリンＡの活性を実施例２で構築した造血幹細胞増殖因子検出系を用いて調べた。対照としては、２％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０を用いた。比較する、既知の造血幹細胞増殖活性を有するサイトカインとして、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦおよびＩＬ７を用いた。
【００９１】
それぞれ、９６穴ウエルの５ウエルで培養した細胞を混合して、ＦＡＣＳｃａｎにて解析した。実験は４回、異なるドナーの臍帯血の幹細胞を用いて行った。添加したサイトカインの濃度は、マウスサイクロフィリンＢ以外はすべて、最終２０ｎｇ／ｍｌになるようにした。マウスサイクロフィリンＢの濃度は、正確には決定されなかったが、約２０〜１００ｎｇ/ｍｌ程度の範囲内の濃度であった。
【００９２】
結果は、マウスサイクロフィリンＢ、マウス修飾型サイクロフィリンＡおよびマウスサイクロフィリンＡの造血幹細胞増殖活性は既存のサイトカインに比べて高かった。代表的な結果を図３に示す。
【００９３】
（実施例１５：ヒトサイクロフィリンＢ遺伝子クローニングおよびその大腸菌用発現ベクターの作製）
ヒトｃＤＮＡライブラリー（ヒト胸腺、プラスミド型、宝酒造株式会社製）をテンプレートにして、ヒトサイクロフィリンｃＤＮＡの５’サイトが制限酵素ＮｄｅＩ（宝酒造株式会社製）に、そして３’サイトが制限酵素ＥｃｏＲＩになるように設計した合成プライマーを用いて、常法通りＰＣＲを行い、ヒトサイクロフィリンｃＤＮＡ（ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片）を作製した。このＰＣＲに用いた合成プライマーＢ１−１の配列は、配列番号５で表される。合成プライマーＢ１−２の配列は、配列番号６で表される。
【００９４】
ＰＣＲは、これらプライマーを１０μＭ分５μｌずつ添加、ｄＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ）１０μｌ、ヒトｃＤＮＡライブラリー（ヒト胸腺）１００分の１量分、エクスタック（宝酒造株式会社製）０．５μｌ、エクスタック１０倍濃縮バッファー１０μｌ、滅菌水５９．５μｌ、合計１００μｌの系で、ミネラルオイルを添加して、９５℃で３０秒間；５５℃で３０秒間；および７２℃で３０秒間のサイクルを３０サイクル行った。ＰＣＲの終了後、ミネラルオイルを取らないようにして、ＤＮＡ溶液を回収した。回収したＤＮＡ溶液を、クロロホルム抽出、エタノール沈殿による精製を行い、制限酵素ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＮｄｅＩ（宝酒造株式会社製）で処理した後、０．７％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを切り出し、精製した。
【００９５】
大腸菌用発現ベクターはｐＥＴ発現系のｐＥＴ１１ｂ（ストラタジーン社製）を用いた。２μｌ（２μｇ）のｐＥＴ１１ｂを制限酵素ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＮｄｅＩで、３７℃にて１６時間処理した。酵素処理したｐＥＴ１１ｂを含むサンプルを、０．９％アガロースゲル電気泳動にて精製した。
【００９６】
この制限酵素ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＮｄｅＩで切断した精製されたｐＥＴ１１ｂに、上記のＰＣＲで作製したヒトサイクロフィリンｃＤＮＡ（ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片）およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）を加え、１６℃にて１６時間処理し、ライゲーションを行なった。ライゲーションした処理サンプル２μｌに大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）（ストラタジーン社製）３０μｌを加え、氷水上に３０分間放置し、４２℃で６０秒間処理した後、ただちに氷水上に５分間放置した。これにＳＯＣ培地（トリプトン２０ｇ、イーストエクストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ０．５８５ｇ、ＫＣｌ ０．１８６ｇ、ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＭｇＳＯ4 １０ｍＭに水を加えて溶解し合計１Ｌとし、これに２Ｍグルコースを１０ｍｌ添加した）９００μｌを加え、３７℃、１時間振盪培養した後、アンピシリンナトリウム（和光純薬工業株式会社製）１００μｇ／ｍｌを含むＬＢアガープレートにプレーティングした。次いで、３７℃にて１６時間培養し、コロニーを得、トランスフォーマント（発現ベクターｐＥＴ１１Ｈｕ１−１を含有する）を取得した。
【００９７】
（実施例１６：マウスサイクロフィリンＢ遺伝子クローニングおよびその大腸菌用発現ベクターの作製）
マウスｃＤＮＡライブラリー（マウス胸腺、プラスミド型、宝酒造株式会社製）をテンプレートにして、マウスサイクロフィリンｃＤＮＡの５’サイトが制限酵素ＮｄｅＩ（宝酒造株式会社製）に、そして３’サイトが制限酵素ＥｃｏＲＩになるように設計した合成プライマーを用いて常法通りＰＣＲを行ない、マウスサイクロフィリンｃＤＮＡ（ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片）を作製した。このＰＣＲに用いた合成プライマーＢ２−１の配列は、配列番号７で表される。合成プライマーＢ２−２の配列は、配列番号８で表される。
【００９８】
ＰＣＲは、これらプライマーを１０μＭ分５μｌずつ添加、ｄＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ）１０μｌ、マウスｃＤＮＡライブラリー（マウス胸腺）１００分の１量分、エクスタック（宝酒造株式会社製）０．５μｌ、エクスタック１０倍濃縮バッファー１０μｌ、滅菌水５９．９μｌ、合計１００μｌの系で、ミネラルオイルを添加して３０サイクルを行なった。ＰＣＲの終了後、ミネラルオイルを取らないようにして、ＤＮＡ溶液を回収した。回収したＤＮＡ溶液を、クロロホルム抽出、エタノール沈澱による精製を行ない、制限酵素ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＮｄｅＩで処理した後、０．７％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを切り出し、精製した。
【００９９】
大腸菌用発現ベクターはｐＥＴ発現系のｐＥＴ１１ｂ（ストラタジーン社製）を用いた。上記実施例１５で得た、制限酵素ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＮｄｅＩで切断した精製されたｐＥＴ１１ｂに、上記のＰＣＲで作製したマウスサイクロフィリンｃＤＮＡ（ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片）およびＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、１６℃にて１６時間処理し、ライゲーションを行なった。ライゲーションした処理サンプル２μｌに大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）３０μｌを加え、氷水上に３０分間放置し、４２℃で６０秒間処理した後、ただちに氷水上に５分間放置した。これにＳＯＣ培地９００μｌを加え、３７℃、１時間振盪培養した後、アンピシリンナトリウム（和光純薬工業株式会社製）１００μｇ／ｍｌを含むＬＢアガープレートにプレーティングした。次いで、３７℃にて１６時間培養し、コロニーを得、トランスフォーマント（発現ベクターｐＥＴ１１ＭＣＰＢ１．１を含有する）を取得した。
【０１００】
（実施例１７：大腸菌でのヒトサイクロフィリンＢの作製）
上記実施例１５で得られた、発現ベクターｐＥＴ１１Ｈｕ１−１を含有するトランスフォーマントを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃でプレカルチャーした。翌日、この菌体含有液１０ｍｌを、５００ｍｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に植菌し、合計４Ｌ分を３７℃で培養した。６００ｎｍの吸光度が約０．７になったときに、ＩＰＴＧ ０．４ｍＭを添加し、３７℃にてさらに２時間培養した後、細胞を遠心分離で回収した。
【０１０１】
培養液２Ｌ分をリシスバッファー（組成：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ２ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌペプスタチン）６０ｍｌで懸濁した。この懸濁液に、ソニケーションをソニケーター島津製作所製ＵＳＰ−６００で、％デューティーサイクル６０、アウトプット７にて、１分間を１５回行い、細胞を破砕した。細胞破砕液を、１２，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を得た。その上清に４０％飽和分の硫酸アンモニウムを添加した。４℃で１時間放置した後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を得た。上清をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で４℃で透析した。この透析後の溶液をＴＳＫ−ｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷに供し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でＮａＣｌ濃度を０から１ｍＭに増加させるグラジエントで溶出した。
【０１０２】
サイクロフィリンＢの画分を集め、ＰＢＳ（−）を加えて、限外ろ過装置（分画分子量１０，０００）で濃縮した。この濃縮液をＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷXLに供し、ＰＢＳ（−）バッファーで精製を行った。サイクロフィリンＢの画分を再度ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷXLにより精製した。得られたヒトサイクロフィリンＢを、大腸菌型ヒトサイクロフィリンと称する。
【０１０３】
（実施例１８：大腸菌でのマウスサイクロフィリンＢの作製）
上記実施例１６で得られた、発現ベクターｐＥＴ１１ＭＣＰＢ１．１を含有するトランスフォーマントを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃でプレカルチャーした。翌日、この菌体含有液１０ｍｌを、５００ｍｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に植菌し、合計４Ｌ分を３７℃で培養した。６００ｎｍの吸光度が約０．７になったときに、ＩＰＴＧ ０．４ｍＭを添加し、３７℃にてさらに２時間培養した後、細胞を遠心分離で回収した。
【０１０４】
培養液２Ｌ分をリシスバッファー６０ｍｌで懸濁し、この懸濁液に１分間のソニケーションを１５回行い、細胞を破砕した。細胞破砕液を、１２，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を得た。その上清に４０％飽和分の硫酸アンモニウムを添加した。４℃で１時間放置後、１２，０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上清を得た。上清をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に４℃で透析した。この透析後の溶液をＴＳＫ−ｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷに供し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でＮａＣｌ濃度を０から１ｍＭに増加させるグラジエントで溶出した。
【０１０５】
サイクロフィリンＢの画分を集め、ＰＢＳ（−）を加えて、限外ろ過装置（分画分子量１０，０００）で濃縮した。この濃縮液をＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷXLに供し、ＰＢＳ（−）バッファーで精製を行った。サイクロフィリンＢの画分を再度ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷXLにより精製した。得られたマウスサイクロフィリンＢを、大腸菌型マウスサイクロフィリンと称する。
【０１０６】
（実施例１９：ペプチジルプロリルイソメラーゼ活性の測定）
上記実施例１７および１８で作製したサイクロフィリンＢが正しい分子構造を取れているかどうかを、次のようにサイクロフィリンのペプチジルプロリルイソメラーゼ活性を測定して判断した。
【０１０７】
シス−Ｎ−サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリジンを最終５０μＭ、Ｈｅｐｅｓバッファー（ｐＨ８．０）を４０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を０．０１５％（ｗ／ｖ）となるように加え（合計５００μｌ）、次いでサイクロフィリンを５０ｎＭ、５μｌ添加し、１０℃でインキュベーションした。これに２００μＭキモトリプシンを５０μｌ加えた後ただちに分光光度計にて、３９０ｎｍの吸収を測定した（６秒ごとに１５０秒後まで測定した）。対照として、市販のサイクロフィリンＡ（ベーリンガーマンハイム社）を用いた。
【０１０８】
結果は市販のサイクロフィリンＡを含め、すべてのサイクロフィリンＢにイソメラーゼ活性は認められた。
【０１０９】
（実施例２０：大腸菌型ヒトサイクロフィリンＢの造血幹細胞増殖活性の確認）
ヒト臍帯血から調製した造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞）を９６ウエルＵ型プレートの各５ウエルにプレーティングした（５０細胞／１００μｌ／ウエル）。造血幹細胞の増殖に使用した培地は、試験区では、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０に、サイトカインであるＳＣＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ３（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地（ＳＣＦ／ＩＬ３培地）を用意し、これにさらに大腸菌型ヒトサイクロフィリンＢを含有するサンプル（サイクロフィリンＢを、２％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０に２００ｎｇ／ｍｌで溶解させたもの）を２０μｌ／ウエルで添加した培地であった。対照区では、サイクロフィリンを含有する上記サンプルの代わりに、２％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０を２０μｌ／ウエルでＳＣＦ／ＩＬ３培地に加えた培地を用いた。
【０１１０】
３７℃で１４日間培養した後、５ウエルを１つにあわせ、この中に含まれる生細胞数をトリパンブルー法で測定した。ＳＣＦ＋ＩＬ３＋ヒトサイクロフィリンＢでは、１ウエル当たり１，６００個の生細胞に対し、ＳＣＦ＋ＩＬ３＋２％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０の群では、４０個であった（図４）。ヒトサイクロフィリンＢが造血幹細胞を増殖させる効果を有することが明らかである。
【０１１１】
（実施例２１：大腸菌型ヒトサイクロフィリンＢ、大腸菌型マウスサイクロフィリンＢおよび大腸菌型ヒトサイクロフィリンＡの造血幹細胞増殖活性の確認）ヒト臍帯血から調製した造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞）を９６ウエルＵ型プレートの各６ウエルにプレーティングした（２００細胞／１００μｌ／ウエル）。造血幹細胞の増殖に使用した培地は、試験区では、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０に、サイトカインであるＳＣＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ３（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地（ＳＣＦ／ＩＬ６／ＩＬ３）を用意し、これに実施例１７で得た大腸菌型ヒトサイクロフィリンＢまたは実施例１８で得た大腸菌型マウスサイクロフィリンＢを含有するサンプル（大腸菌型ヒトサイクロフィリンＢ（Ｍ型、すなわち、ヒトサイクロフィリンＢのＮ末端にＭｅｔ残基が１つ付加されたもの）を２００ｎｇ／ｍｌおよび４０ｎｇ／ｍｌで、大腸菌型マウスサイクロフィリンＢを２００ｎｇ／ｍｌおよび４０ｎｇ／ｍｌで、または市販の大腸菌型ヒトサイクロフィリンＡ（ベーリンガーマンハイム社製）を２００ｎｇ／ｍｌおよび４０ｎｇ／ｍｌを２％ＦＣＳ−ＩＭＤＭに溶解させたもの）を２０μｌ／ウエルで添加した培地であった。対照区は、サイクロフィリンを含有する上記サンプルの代わりに、２％ＦＣＳ−ＩＭＤＭを２０μｌ／ウエルでＳＣＦ／ＩＬ６／ＩＬ３培地に加えた培地を用いた。
【０１１２】
３７℃で１３日間培養した後、６ウエルを１つにあわせ、細胞にＣＤ３４（ＦＩＴＣ）抗体処理を行い、各一定時間ＦＡＣＳｃａｎにて細胞の取り込みを行いＣＤ３４＋細胞比率を求めた。一方、トリパンブルー法で生細胞数を測定し、生細胞数にその比率を乗じて算出し、ＣＤ３４陽性細胞数を求めた。いずれのサイクロフィリンのサンプルにも、ＣＤ３４＋細胞増殖効果が認められた（図５）。
【０１１３】
【発明の効果】
本発明により、サイクロフィリンを含有する造血幹細胞増殖剤が提供される。この造血幹細胞増殖剤は、各種の造血器官疾患、癌の放射線治療および化学療法の際の造血不全に対する治療薬として利用され得、血球の大量生産に利用され得、遺伝子治療時に造血幹細胞への遺伝子の導入効率の向上に利用され得、さらに診断薬および検査薬として活用され得る。
【０１１４】
【配列表】

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【図面の簡単な説明】
【図１】 ＮＳ−１細胞培養上清のゲルろ過画分の逆相ＨＰＬＣによる精製クロマトパターン、および各画分のヒト臍帯血造血幹細胞増殖活性を示す図である。
図１（ａ）は、縦軸にそれぞれの画分についての造血幹細胞増殖検出系で増殖した細胞数を、そして横軸にリテンション時間（分）を示す。ドットの多いカラムは、造血幹細胞増殖因子検出系にて培養２５日目に見られたＣＤ３４+細胞の数を；黒いカラムは、造血幹細胞増殖因子検出系にて培養３２日目に見られたＣＤ３４+細胞の数を；白いカラムは、造血幹細胞増殖因子検出系にて培養２５日目に見られたＣＤ３４+ＣＤ３８−細胞の数を；そしてドットの少ないカラムは、造血幹細胞増殖因子検出系にて培養３２日目に見られたＣＤ３４+ＣＤ３８−細胞の数を示す。
図１（ｂ）は、縦軸にそれぞれの画分についての２１４ｎｍでの吸収を、そして横軸にリテンション時間（分）を示す。２１４ｎｍでの吸収は、それぞれの画分に含まれるタンパク質量を反映する。
【図２】 ＮＳ−１細胞無血清培養上清のゲルろ過画分の逆相ＨＰＬＣによる精製クロマトパターンを、その中でマウスサイクロフィリンＢ、マウスサイクロフィリンＡおよびマウス修飾型サイクロフィリンＡの画分を明示して示した図である。図２は、縦軸にそれぞれの画分についての２１４ｎｍでの吸収を、そして横軸にリテンション時間（分）を示す。２１４ｎｍでの吸収は、それぞれの画分に含まれるタンパク質量を反映する。
【図３】 ＮＳ−１細胞無血清培養上清から精製したマウスサイクロフィリンＢ、マウスサイクロフィリンＡおよびマウス修飾型サイクロフィリンＡのヒト臍帯血造血幹細胞増殖活性（培地は、ＳＣＦ、ＩＬ６およびＩＬ３（３因子）を含有する）を、他のサイトカインと比較して示す図である。図３は、縦軸がＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞数を示し、そして横軸が添加したサンプルの種類を示す。
【図４】 大腸菌型ヒトサイクロフィリンＢのヒト臍帯血造血幹細胞増殖活性を示す図である。
【図５】 大腸菌型ヒトサイクロフィリンＢ、大腸菌型マウスサイクロフィリンＢおよび大腸菌型ヒトサイクロフィリンＡのヒト臍帯血造血幹細胞増殖活性（ＣＤ３４＋細胞の増殖を指標とする）を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention contains cyclophilins as hematopoietic stem cell growth factors having hematopoietic stem cell survival maintenance activity, proliferation activity, and differentiation activity, and hematopoietic failure during various hematopoietic organ diseases, cancer radiotherapy and chemotherapy The present invention relates to a hematopoietic stem cell proliferating agent that can be used as a therapeutic agent for the disease. The hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention can also be used for mass production of blood cells and improvement of gene introduction efficiency into hematopoietic stem cells during gene therapy, and further can be used as a diagnostic agent and a test agent.
[0002]
[Prior art]
Hematopoietic stem cells have the ability to differentiate into all mature blood cells (multipotency) and the ability to replicate cells having the same ability as self (self-renewal ability), and continue to support hematopoiesis for a long time. Hematopoiesis in the human body is generally considered to be regulated by direct interactions between cells and various substances present in body fluids (ie, humoral hematopoietic regulators). Direct interactions between cells include interactions between hematopoietic stem cells, hematopoietic progenitor cells committed to differentiate into specific blood cells, and stromal cells that are the hematopoietic microenvironment surrounding them.
[0003]
Various humoral hematopoietic regulators have been discovered by the progress of biotechnology in the last decades. For example, erythropoietin (Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7580 (1985)), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) (Nagata et al., EMBO J., 5: 575 (1986)), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) (Miyatake et al., EMBO J, 4: 2561 (1985)), macrophage colony stimulating factor (M-CSF) (Wong et al., Science, 235: 1504 (1987)), thrombopoietin (Sovage et al., Nature, 369: 533 (1994)), stem cell factor (SCF) (Anderson et al., Cell, 63: 235 (1990)), Flt-3 ligand (Limanet et al., Cell, 75: 1157 (1993)), leukemia growth inhibitory factor ( IF) (Starl et al., J. Biol. Chem., 265, (15): 8833 (1990)), interleukin 1 (IL1) (Clark et al., Nucleic Acids Res., 14 ,: 7897 (1986)), Inter. Leukine 3 (IL3) (Dolcers et al., Gene, 55: 115 (1987)), Interleukin 6 (IL6) (Yaskawa et al., EMBO J, 6: 2939 (1987)), Interleukin 11 (IL11) (Paul et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 7512 (1990)), interleukin 12 (IL12) (Wolf et al., J. Immunol. 146: 3074 (1991)).
[0004]
None of these cytokines can proliferate hematopoietic stem cells by themselves, and in order to proliferate to some extent, it is necessary to use a combination of two or more, preferably three or more. Accordingly, it is desired to provide a blood cell growth factor that can proliferate hematopoietic stem cells more efficiently.
[0005]
Cyclophilin has been found as a protein that binds to the immunosuppressive agent cyclosporin A (Handschucker et al., Science, 226: 544 (1984)). In 1989, this protein was found to be identical to the enzyme peptidylprolyl cis-trans isomerase (rotamase), and binding to cyclosporin A inhibited its enzymatic activity (Takahashi et al., Nature, 337: 473 (1989)). The enzyme activity of cyclophilin catalyzes the conversion of the cis- and trans-rotamers of the peptidyl-prolylamide bond.
[0006]
Examples of human cyclophilins include cyclophilin A (Hendler et al., EMBO J, 6 (4): 947 (1987)), and cyclophilin B (Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88). (5): 1903 (1991)) and cyclophilin C (Schneider et al., Biochemistry, 33 (27): 8218 (1994)) are known. Cyclophilin binds in the cytoplasm with gag protein, which is a constituent protein of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), which is the causative virus of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), and HIV-1 particles. It has been shown to be incorporated into (Luban et al., Cell, 73: 1067 (1993)). However, there are no reported examples of the physiological effects of cyclophilin on stem cells.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a hematopoietic stem cell proliferating agent that can proliferate human hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells outside the body more efficiently than before. A further object of the present invention is to be used as a therapeutic agent for various hematopoietic organ diseases, cancer radiotherapy and hematopoietic failure during chemotherapy, to be used for mass production of blood cells, and to hematopoietic stem cells at the time of gene therapy. It is an object of the present invention to provide a hematopoietic stem cell proliferating agent that can be used for improving the efficiency of gene introduction and further used as a diagnostic agent and a test agent.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have found that a protein that activates the proliferation of hematopoietic stem cells exists in the culture supernatant of mouse myeloma cells (NS-1 cells). By isolating, purifying, and identifying this protein, the present inventors have identified that this protein is a novel hematopoietic stem cell growth factor, cyclophilin (cyclophilin B, cyclophilin A, and modified cyclophilin A). It was clarified that the present invention was completed by utilizing their hematopoietic stem cell proliferation activity.
[0009]
The hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention contains cyclophilin.
[0010]
In one embodiment, the cyclophilin is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It may be a polypeptide having an amino acid sequence and having hematopoietic stem cell proliferation activity, or a modified form thereof.
[0011]
In one embodiment, the cyclophilin is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, wherein one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It may be a polypeptide having an amino acid sequence and having hematopoietic stem cell proliferation activity, or a modified form thereof.
[0012]
In one embodiment, the cyclophilin is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, wherein one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. It may be a polypeptide having an amino acid sequence and having hematopoietic stem cell proliferation activity, or a modified form thereof.
[0013]
In one embodiment, the cyclophilin is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, wherein one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. It may be a polypeptide having an amino acid sequence and having hematopoietic stem cell proliferation activity, or a modified form thereof.
[0014]
In one embodiment, the modified product may be a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and acetylated at the amino terminus.
[0015]
In one embodiment, the modified form may be a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and acetylated at the amino terminus.
[0016]
The polypeptide of the present invention has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and the amino terminus is acetylated, or one or several amino acids are substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, A polypeptide having a deleted or added amino acid sequence, an amino terminus of which is acetylated, and a hematopoietic stem cell proliferating activity.
[0017]
The polypeptide of the present invention has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and is amino-terminally acetylated, or one or several amino acids are substituted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, A polypeptide having a deleted or added amino acid sequence, an amino terminus of which is acetylated, and a hematopoietic stem cell proliferating activity.
[0018]
The method for proliferating hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells of the present invention includes the step of proliferating hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells in a non-human animal or in vitro using any of the hematopoietic stem cell proliferating agents described above.
[0019]
In one embodiment, the hematopoietic stem cell proliferating agent can be a culture supernatant of human or mouse-derived myeloma cells.
[0020]
In one embodiment, a foreign gene can be introduced into a hematopoietic stem cell or a hematopoietic progenitor cell in the expansion step.
[0021]
The method for proliferating human tissue stem cells or tissue progenitor cells of the present invention includes the step of proliferating human tissue stem cells or tissue progenitor cells in a non-human animal or in vitro using any of the hematopoietic stem cell proliferating agents described above.
[0022]
The diagnostic or testing agent for blood system diseases of the present invention contains any of the above hematopoietic stem cell proliferating agents.
[0023]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In practicing the present invention, protein separation and analysis methods, recombinant DNA techniques and assay methods known in the art are employed unless otherwise indicated.
[0024]
I. Definition
Hereinafter, terms used to describe the present invention will be described.
[0025]
As described above, cyclophilin is a polypeptide originally isolated as a protein that binds to the immunosuppressive agent cyclosporin A, and cyclophilin A, cyclophilin B, and cyclophilin C are known. In the present invention, the term “cyclophilin” is not limited to these specific polypeptides, polypeptides having substantial homology in amino acid sequence to any of these polypeptides, and these polypeptides Any modification of is also included. Examples of homologous polypeptides are species variants and allelic variants.
[0026]
Human-derived cyclophilin A includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. In the case of mouse-derived cyclophilin A, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is included.
[0027]
Human-derived cyclophilin B includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. In the case of mouse-derived cyclophilin B, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is included.
[0028]
Human-derived cyclophilin C includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 in the Sequence Listing. In the case of mouse-derived cyclophilin C, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is included.
[0029]
It is clear that human-derived polypeptides are preferred for human disease or therapeutic purposes and in the proliferation of human hematopoietic stem cells. However, homologous polypeptides from other mammals can also be used depending on the purpose. Furthermore, comparison with other mammalian polypeptides is important in obtaining a variant that retains the desired activity of a human-derived polypeptide.
[0030]
The cyclophilin used in the present invention is not necessarily limited by the specific sequence described above, and an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added to any of these sequences. A homologous polypeptide having a desired activity and having a desired activity (that is, a cyclophilin homolog) is also included. Here, the mutation of up to “several” amino acids is not necessarily intended to be restricted to a specific upper limit as long as the desired activity is obtained, but typically about 60 or less, preferably about It may be in the range of 40 or less, more preferably about 20 or less. Examples of amino acid additions include the addition of one N-terminal Met residue, which gives an M-type cyclophilin.
[0031]
Conservative substitution of amino acids is one of the preferred means for obtaining homologous polypeptides. Conservative substitutions typically include substitutions within the following groups: glycine, alanine; valine, isoleucine, leucine; aspartic acid, glutamic acid; asparagine, glutamine; serine, threonine; lysine, arginine; Tyrosine.
[0032]
Sequence identity (homology) between two amino acid sequences is determined by introducing gaps if necessary to optimize residue fit. Polypeptides having substantial amino acid sequence homology to human cyclophilin are typically at least about 60%, preferably at least about 70%, more than any amino acid sequence of human cyclophilin. Preferably, it can be expressed as a polypeptide having at least about 80%, more preferably at least about 90% or more homology. Software for determining homology is easily available, for example, Gene Works (Intelligenetics Inc.).
[0033]
The modified form of cyclophilin used in the present invention is a polypeptide having a sequence identical or homologous to the above sequence, the amino acid side chain or amino terminus or carboxyl terminus of which is modified, and the desired activity is retained. Polypeptides are included. Cyclophilin homologues and modifications are collectively referred to as functional equivalents. Examples of the above-mentioned modifications include polypeptides in which the amino terminus is acylated (for example, acetylated), and peptides in which the carboxy terminus is amidated or esterified. Preferable modifications include polypeptides in which the amino group of valine at the amino terminus of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is acetylated. More preferably, it is a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
[0034]
In the present invention, “having hematopoietic stem cell proliferation activity” is defined as CD34 + CD38− when measured under substantially the same conditions as in Example 14 below (the addition concentration of cyclophilin B is 20 ng / ml). It means that the number of cells is larger than the number of cells shown in the control group of Example 14, typically about 110% or more, preferably about 200% or more.
[0035]
A “hematopoietic stem cell” is a pluripotent cell having the ability to differentiate into all blood systems including not only bone marrow cells such as red blood cells, white blood cells and megakaryocytes but also lymphoid systems such as T cells and B cells. Refers to cells that are capable of self-proliferation. Hematopoietic stem cells are characterized by being positive for CD34 antigen and negative for CD38 antigen. A “hematopoietic progenitor cell” refers to a cell that has been determined to differentiate into a specific cell lineage of the blood system, but can proliferate by division. Hematopoietic progenitor cells are characterized by being positive for both CD34 and CD38 antigens.
[0036]
“Tissue stem cell” refers to a cell that exhibits the ability to self-renew as it divides, and at the same time, has the ability to differentiate into cells with different properties. Includes all types of stem cells, including stem cells. “Tissue progenitor cells” refer to cells in the previous stage that differentiate and mature into a specific tissue.
[0037]
II. Cyclophilin with hematopoietic stem cell proliferation activity
In the present invention, cyclophilin is used as an active ingredient of a hematopoietic stem cell proliferating agent. Cyclophilins can be isolated from natural sources, produced using recombinant DNA technology, or chemically synthesized.
[0038]
When cyclophilin is isolated from a natural source, it can be purified, for example, as follows. First, myeloma cells (for example, P3-NSI / 1-Ag4-1 (abbreviation: NS-1) cells) are cultured, and hematopoietic stem cell proliferating protein is separated and purified from the obtained culture supernatant.
[0039]
A “myeloma cell” is a cancerous cell line that has the ability to permanently proliferate. Myeloma cells are known for a variety of uses. For example, Kohler and Milstein have sensitized mouse-derived myeloma cells, P3-X63-Ag8 (abbreviated as X63) cells, with sheep red blood cells. Cell fusion with spleen-derived lymphocytes produced a B cell hybridoma (Kehler et al., Nature, 256: 495 (1975)). X63 cells can be obtained by cloning a cell population that is resistant to 8-azaguanine and cannot grow in a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine from IgG1 kappa chain-producing myeloma cells derived from BALB / c mice. Cell line. NS-1 cells are X63 cell-derived myeloma cells that are known to synthesize only IgG1 kappa chains but not to secrete (Kehler et al., Eur. J. Immunology, 6: 511 (1976)). .
[0040]
The present inventors have surprisingly found that hematopoietic stem cell proliferating activity exists in this NS-1 cell culture supernatant. Therefore, the hematopoietic stem cell proliferating factor in the present invention can be isolated from the culture supernatant of NS-1 cells or the culture supernatant of other myeloma cells exhibiting similar activity. Separation and purification of the hematopoietic stem cell proliferation activity protein found in the myeloma cell culture supernatant begins with the preparation of a large amount of myeloma cell culture supernatant exhibiting hematopoietic stem cell proliferation activity. Cell culture may be performed in accordance with a normal cell line culture method. For example, in an animal cell culture medium containing an appropriate ratio of fetal calf serum (FCS), CO set at 37 ° C. 2 Incubate in an incubator.
[0041]
In order to separate and purify proteins from the culture supernatant, it is necessary to reduce contaminating proteins as much as possible. Therefore, it is preferable that the medium is replaced with a serum-free medium immediately before the increase in the content of the hematopoietic stem cell proliferation activity protein, and the culture is continued, and then the culture supernatant is collected. The collected culture supernatant can be passed through a filter to remove cell debris.
[0042]
In order to separate and purify the hematopoietic stem cell proliferation activity protein from the obtained culture supernatant, a normal protein separation and purification method can be used. To concentrate the culture supernatant, an ultrafiltration membrane can be used. The concentrated culture supernatant is applied to a gel filtration column using HPLC, and a fraction having hematopoietic stem cell proliferation activity is collected. The resulting active fraction is applied to a reverse phase HPLC column. A fraction having hematopoietic stem cell proliferation activity is recovered from the eluted fraction. The fraction thus obtained has sufficient purity, and can be subjected to amino acid sequence analysis using a protein sequencer without further purification. When the amino terminus has a structure that cannot be degraded by Edman, a peptide map using a proteolytic enzyme such as trypsin can be prepared and analyzed. Thus, hematopoietic stem cell proliferating activity protein found in myeloma cell culture supernatant can be identified.
[0043]
When producing cyclophilin using recombinant DNA technology, the DNA sequence encoding the polypeptide of interest is expressed using a variety of recombinant systems. Construction of an expression vector and production of a transformant having an appropriate DNA sequence are performed by methods known in the art. Expression can be performed in prokaryotic or eukaryotic systems.
[0044]
DNA sequences encoding cyclophilins A, B and C are known in the art, and polynucleotides containing these sequences are readily available. A DNA sequence encoding a cyclophilin homolog can be screened from, for example, a cDNA library according to a conventional method.
[0045]
Prokaryotic hosts include E. coli. E. coli, Bacillus, and other bacteria are used. For such prokaryotes, plasmid vectors containing replication sites and control sequences compatible with the host are used. For example, E.I. E. coli is typically E. coli. It is transformed with a derivative of pBR322, a plasmid derived from E. coli. The control sequence herein is defined to include a promoter for initiation of transcription, an operator as necessary, and a ribosome binding site sequence. This regulatory sequence includes β-lactamase and lactose promoter systems, tryptophan promoter system, and P from λ phage. L Commonly used ones such as promoters and N gene ribosome binding sites are included.
[0046]
For example, yeast and mammalian cells can be used as eukaryotic hosts. For such eukaryotes, plasmid vectors containing replication sites and control sequences that are compatible with the host are used. For example, yeast is transformed with pYEUra3 (Clontech). Other useful promoters in eukaryotic hosts include, for example, promoters for synthesizing glycolytic enzymes (eg, promoters for 3-phosphoglycerate kinase); promoters from enolase genes; obtained from YEp13 Other viral promoters are included such as promoters from the Leu2 gene; promoters from metallothionein; early or late promoters from SV40, polyomavirus, adenovirus II, bovine papilloma virus, and avian sarcoma virus . Combinations of host cells and appropriate promoters are known to those skilled in the art and can be appropriately selected as necessary.
[0047]
Transformants are obtained by introducing an expression vector into a compatible host cell. A desired cyclophilin can be obtained by culturing the transformant under appropriate conditions. A modified form of cyclophilin may be obtained as a result of post-expression modification in a host cell. If desired, the isolated and purified cyclophilin can be converted into a modified form using a known chemical synthesis technique.
[0048]
An example of human cyclophilin B production by E. coli will be described. First, PCR was performed using human cyclophilin B cDNA as a template, using a synthetic primer designed so that the 5 ′ side of human cyclophilin B cDNA was the restriction enzyme NdeI site and the 3 ′ side was the restriction enzyme EcoRI site. The human cyclophilin B cDNA (restriction enzyme NdeI-EcoRI fragment) is amplified. A human cyclophilin B E. coli expression vector is prepared by ligating the amplified cDNA to the E. coli expression vector pET11b (treated with restriction enzymes NdeI and EcoRI). The produced expression vector is transformed into E. coli competent cell BL21 (DE3) to obtain an E. coli transformant.
[0049]
Next, human cyclophilin B is produced from this E. coli transformant, for example, as follows. First, the E. coli transformant is inoculated into an LB liquid medium containing ampicillin and cultured at 37 ° C. When the absorbance at 600 nm reaches about 0.7, isopropyl-1-thio-beta-D-galactoside (IPTG) is added in an amount of 0.1 to 1.0 mM, preferably 0.4 mM. After culturing for 2 hours, E. coli is collected by centrifugation.
[0050]
The collected cells were lysed with a lysis buffer (composition: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA disodium, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 μg / ml aprotinin, 1 μg / ml leupeptin, and 1 μg / ml). The suspension is suspended in ml pepstatin) and disrupted by sonication to obtain a disrupted cell suspension. The cell disruption solution is centrifuged, and ammonium sulfate is added to the obtained supernatant so as to be 40% saturation, thereby precipitating unnecessary proteins. After precipitation, the mixture is centrifuged and the resulting supernatant is dialyzed against Tris-HCl (pH 8.0). The dialyzed solution is applied to TSK-gel DEAE-5PW, and eluted with a gradient increasing the NaCl concentration from 0 to 1 mM with 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), and the fraction of cyclophilin B is collected. The collected fractions are concentrated with an ultrafiltration device (fraction molecular weight 10,000). This concentrated solution is TSK-gel G3000SW. XL For Ca 2+ And Mg 2+ Purification is performed with phosphate buffered saline (PBS (-)) that does not contain. The purified cyclophilin B fraction was again added to TSK-gel G3000SW. XL To obtain a high-purity sample of human cyclophilin B protein.
[0051]
Although an example of production of human cyclophilin is given here, mouse cyclophilin B and the like can be produced in the same manner as humans.
[0052]
The chemical synthesis of cyclophilin can be performed by methods known in the art. For example, it can be synthesized by a solid phase method using a peptide synthesizer. For example, using a benzhydrylamine resin, a peptide synthesizer sequentially condenses the C-terminal amino acid to the N-terminal amino acid by a standard DCC / HOBt method, and the resulting peptide resin is subjected to a standard cleavage method (trifluoromethane). By cleaving the produced peptide by the sulfonic acid method, a peptide in which the C-terminal is amidated can be prepared.
[0053]
Whether the prepared cyclophilin has the correct molecular structure can be determined by measuring the peptidylprolyl isomerase activity of cyclophilin. Cis-N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilysin (cis-N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroaniline) was finally added at 50 μM, and Hepes buffer (pH 8.0) was added. Add 40 mM Triton-X100 to 0.015% (w / v), add 50 nM cyclophilin, incubate at 10 ° C., add 200 μM chymotrypsin to this, and quickly absorb 390 nm with a spectrophotometer. The activity can be determined by measuring.
[0054]
III. Confirmation of hematopoietic stem cell proliferation activity
Next, an example of a method for confirming the hematopoietic stem cell proliferation activity of cyclophilin will be described.
[0055]
Hematopoietic stem cells (CD34 + CD38− cells) prepared from umbilical cord blood are plated on microtiter plates. As a medium used for the growth of hematopoietic stem cells, in the test group, a medium (SCF / IL3 medium) prepared by adding SCF and IL3 as cytokines to 15% FCS-RPMI 1640 is prepared, and hematopoietic stem cell activity is assayed. A medium supplemented with a sample containing the polypeptide of interest (eg, human cyclophilin B). In the control group, a medium in which 2% FCS-RPMI 1640 is added to the SCF / IL3 medium is used in place of the sample containing the polypeptide of interest. After culturing these at about 37 ° C. for about 10 to 20 days, the number of viable cells is measured by trypan blue method, and the number of viable cells in the test group and the control group is compared. Can be confirmed.
[0056]
In other methods, hematopoietic stem cell proliferating activity can be measured as follows. Plate hematopoietic stem cells prepared from umbilical cord blood. As a medium used for the proliferation of hematopoietic stem cells, a medium (SCF / IL6 / IL3 medium) prepared by adding cytokines SCF, IL6, and IL3 to 15% FCS-RPMI 1640 is prepared in the test group. It is a medium to which a sample containing a target polypeptide to be assayed for hematopoietic stem cell activity (for example, human cyclophilin B, IL7, Flt-3 ligand, and NS-1 culture supernatant 10-fold concentrated solution) is added. In the control group, a medium in which 2% FCS-RPMI1640 is added to the SCF / IL6 / IL3 medium is used instead of the sample containing the polypeptide of interest. After culturing at about 37 ° C. for 20 to 35 days, the number of viable cells is measured by trypan blue method, and the number of viable cells in the test group and the control group is compared to confirm the hematopoietic stem cell proliferating activity of the target polypeptide. it can.
[0057]
In another method, hematopoietic stem cells prepared from umbilical cord blood are plated. As a medium used for the growth of hematopoietic stem cells, a medium (SCF / IL6 / IL3 medium) prepared by adding 15% FCS-RPMI 1640 to cytokines SCF, IL6, and IL3 (SCF / IL6 / IL3 medium) is prepared in the test group. A target polypeptide to be assayed for stem cell activity (for example, a medium containing a sample containing E. coli human cyclophilin B, E. coli mouse cyclophilin B, and E. coli human cyclophilin A. In the control group, the target polypeptide is used. Instead of the above-mentioned sample containing the polypeptide, a medium in which 2% FCS-IMDM (Iscove's modified Dulbecco medium) is added to the SCF / IL6 / IL3 medium is used at about 37 ° C. for about 10 to 20 days. After culturing, the cells were treated with CD34 (FITC) antibody. The cells are taken up by FACScan for a fixed time to obtain the CD34 + cell ratio, and the number of viable cells is measured by the trypan blue method, and the number of viable cells is multiplied by the CD34 + cell ratio to calculate the number of CD34 positive cells. In this way, hematopoietic stem cell proliferation activity of the target polypeptide can be confirmed.
[0058]
IV. Hematopoietic stem cell proliferating agent and use thereof
The hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention is provided as a composition containing cyclophilin having hematopoietic stem cell proliferating activity and any medium that does not substantially inhibit the activity. Therefore, the culture supernatant itself containing the above cyclophilin is also included in the definition of the hematopoietic stem cell proliferating agent. Here, “cyclophilin” is used in a broad sense, and includes cyclophilin A, B, and C as well as homologues and modifications of the above-mentioned cyclophilin. Hematopoietic stem cell proliferating agents for human administration typically can contain any pharmaceutically acceptable excipient known to those of skill in the art in addition to an effective amount of cyclophilin. Examples of excipients include lactose, corn starch, magnesium stearate, alum and the like.
[0059]
The hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention can be prepared according to a method known in the art.
[0060]
The hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention can be in any shape. The hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention can be a solid such as a tablet, pill, capsule, granule; or a liquid such as an aqueous solution and suspension. When the hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention is orally administered as a tablet, excipients such as lactose, corn starch, and magnesium stearate can be usually used. When the hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention is orally administered as a capsule, usually excipients such as lactose and dried corn starch can be used. For oral administration as an aqueous suspension, cyclophilin may be used in combination with an emulsion or suspension. Aqueous suspensions may contain sweetening and flavoring agents as desired. When the hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention is injected intramuscularly, intraperitoneally, subcutaneously, or intravenously, cyclophilin is dissolved in a sterilized solution to prepare a buffer solution, and the pH is adjusted to an appropriate value. When the hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention is administered intravenously, the proliferating agent is preferably isotonic.
[0061]
By using the hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention, it is possible to proliferate a large amount of tissue stem cells or tissue progenitor cells containing hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells. For example, blood cells can be mass-produced by growing hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells in vitro using the hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention. The effective amount of the hematopoietic stem cell proliferating agent and the conditions for production and recovery of blood cells can be appropriately selected by those skilled in the art.
[0062]
Furthermore, the hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention is used for the treatment of various hematopoietic organ diseases such as immunosuppressive disorders, and patients whose increase in blood cells is desired, such as cancer hematopoietic failure due to radiotherapy and chemotherapy. Can do. In therapeutic use, the hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention can be administered in the form of a conventional polypeptide formulation as described in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing (Easton, PA). For example, the hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention can be administered by parenteral administration such as oral administration, intravenous administration, intramuscular injection, intraperitoneal injection, and subcutaneous injection. These polypeptides can be supplemented into amniotic fluid. Preferably, these polypeptides can be administered by injection.
[0063]
When the hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention is administered to a human, the daily dose is usually determined by a person skilled in the art in consideration of patient symptoms, severity, individual differences in sensitivity, body weight, age, etc. Can be determined. The hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention may be administered once a day or divided into several times a day.
[0064]
In gene therapy, it is known that the efficiency of introducing a target gene depends on how many cells are dividing in the process of introducing a gene into a cell. Therefore, a very high gene transfer efficiency can be obtained by introducing a gene while proliferating hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells using the hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention.
[0065]
Furthermore, the hematopoietic stem cell proliferating agent of the present invention can be used as it is as a diagnostic agent and a diagnostic agent for blood system diseases (for example, leukemia, myeloma, anemia, etc.).
[0066]
【Example】
Hereinafter, cyclophilin as a hematopoietic stem cell growth factor in the present invention will be described more specifically. The present invention is not limited by the following examples.
[0067]
(Example 1: Preparation of hematopoietic stem cells from human umbilical cord blood)
Mononuclear from human umbilical cord blood (approx. 50 ml using heparin as an anticoagulant) donated by the obstetrics and gynecology department using the Ficoll pack (made by Amersham Pharmacia Biotech) Spherical fractions were prepared and stored frozen. This was frozen and thawed at the start of the assay, washed with 15% FCS-RPMI 1640 (manufactured by Nikken Biomedical Research Institute), and the cells were treated with each antibody of CD34 (FITC) and CD38 (PE), and FACStar Hematopoietic stem cells CD34-positive CD38-negative (hereinafter referred to as CD34 + CD38-) cells were collected using Becton Dickinson.
[0068]
(Example 2: Construction of hematopoietic stem cell growth factor detection system using hematopoietic stem cells of human umbilical cord blood)
The human umbilical cord blood CD34 + CD38− cells collected in Example 1 were plated on a 96-well U-type plate (manufactured by Coaster) (50 cells / 100 μl / well). The medium used was obtained by adding 15% FCS-RPMI 1640 to cytokines SCF (25 ng / ml), IL6 (20 ng / ml), and IL3 (20 ng / ml), and further hematopoietic stem cell proliferation activity. The sample to be measured for was added 20 μl / well.
[0069]
After liquid culture at 37 ° C. for 13 to 32 days, the number of viable cells was measured by the trypan blue method (trypan blue used by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). A hemocytometer was used for cell counting.
[0070]
The number of CD34 + cells and the number of CD34 + CD38− cells were calculated as follows. First, the cells after liquid culture were treated with CD34 (FITC) antibody (manufactured by Immunotech) and CD38 (PE) antibody (manufactured by Immunotech) (cell 10 Five Were stained with 50 ng antibody). The stained cells were washed twice with a PBS (−) solution (containing 1% FCS and 0.01% sodium azide), and then propidium iodide (manufactured by Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.) was adjusted to a final concentration of 10 μg / ml. In addition, cell nuclei were stained. The stained cells are analyzed by FACScan (manufactured by Becton Dickinson) to obtain the CD34 + cell ratio and CD34 + CD38− cell ratio, and the number of living cells is multiplied by the ratio to calculate the number of CD34 + cells and CD34CD38− cells. did.
[0071]
(Example 3: Preparation of mouse myeloma cell culture and culture supernatant thereof)
Mouse myeloma cells (NS-1) were Five Suspended in 15 ml of 15% FCS-RPMI 1640 medium to a concentration of cells / ml, placed in a culture dish (made by Greiner) (diameter: 10 cm), 5% CO 2 The culture was started at 37 ° C. in an incubator. Culture supernatants were collected on days 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 8 of culture, and supernatants that passed through a 0.22 μm filter were collected.
[0072]
(Example 4: Preparation of NS-1 cell growth curve)
The number of live cells and the number of dead cells were measured by the trypan blue method on days 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 of NS-1 cell culture. As a result of the measurement, the viable cell concentration was 1 × 10 respectively. Five Pieces / ml, 4 × 10 Five Piece / ml, 10 × 10 Five Pieces / ml, 17 × 10 Five Piece / ml, 18 × 10 Five Pieces / ml, 14 × 10 Five Piece / ml, 10 × 10 Five Pieces / ml, 5 × 10 Five Pieces / ml, 2 × 10 Five Pieces / ml. The dead cell concentration is 0.05 × 10 Five Piece / ml, 0.1 × 10 Five Pieces / ml, 0.5 × 10 Five Pieces / ml, 1 × 10 Five Pieces / ml, 4 × 10 Five Piece / ml, 10 × 10 Five Pieces / ml, 13 × 10 Five Pieces / ml, 17 × 10 Five Pieces / ml, 20 × 10 Five Pieces / ml. As a result, it was found that the number of viable cells was maximized on the fourth day of culture.
[0073]
(Example 5: Determination of NS-1 cell culture supernatant recovery time)
The culture supernatant obtained by culturing NS-1 cells in Example 3 and collecting on day 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 8 is constructed in Example 2. Evaluation was performed using a hematopoietic stem cell growth factor detection system using human umbilical cord blood hematopoietic stem cells. 20 μl of each culture supernatant was added to a 96-well U-type well. The number of CD34 + cells was 362, 550, 153, 115 and 93, respectively, for the supernatants collected on days 4, 5, 6, 7 and 8 of culture. As a result, it was found that the highest hematopoietic stem cell proliferating activity was present in the supernatant on the fifth day of culture.
[0074]
(Example 6: Examination of concentration dependency of hematopoietic stem cell proliferation activity of NS-1 cell culture supernatant)
The concentration dependence of the hematopoietic stem cell proliferation activity of the NS-1 cell culture supernatant collected in Example 3 was examined. Using a hematopoietic stem cell growth factor detection system using human umbilical cord blood hematopoietic stem cells, the NS-1 cell culture supernatant on the 25th day of culture is kept undiluted, 2-fold diluted, 4-fold diluted, 8-fold diluted, 16-fold. Dilution, 32-fold dilution, 64-fold dilution, 128-fold dilution, and 256-fold dilution were added to evaluate hematopoietic stem cell proliferation activity. The numbers of CD34 + cells were 238, 144, 74, 104, 45, 1, 0, 11 and 10, respectively. The numbers of CD34 + CD38− cells were 107, 36, 44, 37, 17, 1, 0, 2, and 1, respectively. Thus, the growth of hematopoietic stem cells was almost dependent on the concentration of NS-1 cell culture supernatant.
[0075]
(Example 7: Large-scale preparation of NS-1 cell culture supernatant)
NS-1 cells 1.0 × 10 Five / Ml in a 15% FCS-RPMI 1640 medium 50 ml, culture flask (Greiner, 150 cm 2 ). 5% CO 2 Cultivation was started at 37 ° C. in an incubator, and the culture supernatant on the fifth day after culturing was collected, and the supernatant that passed through a 0.22 μm filter was collected. A total of 3,620 ml of culture supernatant was collected.
[0076]
(Example 8: Purification of NS-1 cell culture supernatant by gel filtration)
15 ml of the NS-1 cell culture supernatant collected in Example 7 was concentrated to 1 ml with an ultrafiltration filter (manufactured by Gelman Sciences) with a molecular weight cut off of 10,000, and the entire amount was separated by Sephacryl S-200 column (Amersham Pharmacia Biotech). (Made by company) (diameter 10 mm, height 19.1 cm). For the equilibration buffer, RPMI 1640 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical) was used to collect the eluted fractions.
[0077]
When the elution fraction was evaluated for hematopoietic stem cell growth activity using a hematopoietic stem cell growth factor detection system using human umbilical cord blood hematopoietic stem cells constructed in Example 2, activity was observed in the fraction having a molecular weight of about 20,000.
[0078]
A 15% FCS-RPMI 1640 medium stored at 37 ° C. for 5 days was subjected to gel filtration using a Sephacryl S-200 column in the same manner, and the same hematopoietic stem cell growth factor detection system was evaluated. Little activity was observed.
[0079]
From the above, it was found that the hematopoietic stem cell growth activity factor is present in the culture supernatant fraction having a molecular weight of about 20,000.
[0080]
(Example 9: Purification of NS-1 cell culture supernatant by gel filtration fraction by reverse phase HPLC)
The active fraction obtained by gel filtration obtained in Example 8 was subjected to reverse phase HPLC. As the reverse phase HPLC column, YMC-Pack PROTEIN-RP (manufactured by YMC Co., Ltd., length 250 mm, inner diameter 4.6 mm) was used, and LC-10A manufactured by Shimadzu Corporation was used as the HPLC apparatus. Elution is TFA-CH Three Performed in a CN system. That is, 0.1% TFA (pH 2.0) for solution A and 80% CH for solution B Three Using CN-0.1% TFA (pH 2.0), the concentration of solution B was 0% for the first 5 minutes, and the concentration of solution B was changed from 0% to 70% in the next 70 minutes. Similarly, elution was performed with a linear gradient from 70% to 100% in 10 minutes. The eluted fraction was evaluated with a hematopoietic stem cell growth factor detection system using human umbilical cord blood hematopoietic stem cells (FIG. 1). Activity was observed in the fraction with a retention time of around 60 minutes and the fraction around 63 minutes.
[0081]
(Example 10: NS-1 cell culture by serum-free culture and preparation of culture supernatant thereof)
In order to produce a culture supernatant that is easier to purify than a medium containing 15% FCS, an NS-1 cell culture method by serum-free culture was established. NS-1 cells 1 × 10 Five The culture was started with 40 ml of 15% FCS-RPMI 1640 medium at a concentration of / ml in a dish (made by Greiner) having a diameter of 14.5 cm. On the fourth day of culture, the medium was replaced with 40 ml of fresh 15% FCS-RPMI 1640 medium, and further cultured for one day. Subsequently, the plate was washed twice with PBS (−), transferred to 40 ml of RPMI 1640 medium without serum, and cultured in a new dish for 1 day. Next, the culture was passed through a 0.22 μm filter to remove cell debris, and the culture supernatant was collected. The collected culture supernatant was subjected to evaluation with a hematopoietic stem cell growth factor detection system using human umbilical cord blood hematopoietic stem cells to confirm that there was activity.
[0082]
(Example 11: Purification of NS-1 cell serum-free culture supernatant by gel filtration)
2 ml of concentrated culture supernatant obtained by concentrating 20 ml of NS-1 cell serum-free culture supernatant collected in Example 10 to 1/10 with an ultrafiltration filter (manufactured by Gelman Sciences) with a molecular weight cut off of 10,000. , TSKgel G3000SW XL Applied to the column. As the equilibration buffer, a 50 mM phosphate buffer containing 0.3 M sodium chloride was used, and the eluted fractions were collected. When the eluted fraction was evaluated by a hematopoietic stem cell growth factor detection system using human umbilical cord blood hematopoietic stem cells, activity was recognized in the fraction having a molecular weight of around 20,000.
[0083]
(Example 12: Purification of NS-1 cell serum-free culture supernatant by gel filtration fraction by reverse phase HPLC)
14 ml of the active fraction obtained by gel filtration obtained in Example 11 was subjected to reverse phase HPLC. As the reverse phase HPLC column, YMC-Pack PROTEIN-RP (manufactured by YMC Co., Ltd., length 250 mm, inner diameter 4.6 mm) was used, and LC-10A manufactured by Shimadzu Corporation was used as the HPLC apparatus. Elution is TFA-CH Three Performed in a CN system. That is, 0.1% TFA (pH 2.0) for solution A and 80% CH for solution B Three Using CN-0.1% TFA (pH 2.0), the concentration of solution B was 0% for the first 15 minutes, and the concentration of solution B was changed from 0% to 70% in the next 70 minutes. Similarly, elution was performed with a linear gradient from 70% to 100% in 10 minutes (FIG. 2).
[0084]
CH Three Peaks with a CN concentration of around 47% (retention times of 71 minutes, 72 minutes, and 74 minutes in total 3) were collected, re-chromatographed on the same column again, and purified in the same manner.
[0085]
(Example 13: Confirmation of amino terminal amino acid sequence of purified sample)
Three samples obtained by purification by rechromatography of YMC-Pack PROTEIN-RP in Example 12 above were applied to a protein sequencer (Applied Biosystems Sequencer: Model 492) and analyzed.
[0086]
A sample with a retention time of 71 minutes matched mouse cyclophilin B when analyzed at the amino terminus of 25 amino acid residues. A sample with a retention time of 72 minutes matched mouse cyclophilin A. The sample with a retention time of 74 minutes appeared to have a structure that could not be degraded by Edman.
[0087]
Subsequently, the three samples obtained in Example 12 were analyzed by preparing a peptide map using TPCK-trypsin, and the sample with a retention time of 71 minutes was consistent with mouse cyclophilin B. A sample with a retention time of 72 minutes also coincided with mouse cyclophilin A. In the sample with a retention time of 74 minutes, the amino-terminal peptide could not be degraded by Edman, but the other tryptic peptides were consistent with mouse cyclophilin A. Therefore, amino acid analysis was performed on 15 μl (100 pmol) of the amino terminal peptide.
[0088]
A sample was collected in a glass test tube, dried, added with 20 μl of 6N hydrochloric acid, and hydrolyzed at 135 ° C. for 3 hours in a vacuum sealed tube. After drying the sample, it was dissolved again in 75 μl of purified water, and 50 μl of the sample was analyzed under the conditions of special amino acid analysis / ninhydrin coloration using Hitachi amino acid analyzer L-8500. Compared with the amino terminal peptide of mouse cyclophilin A, the same value was obtained, so it was considered that the amino acid sequence was similar to mouse cyclophilin A.
[0089]
Next, 1 μl of amino terminal peptide was analyzed by MALDI-TOF-MS. Substance P (molecular weight 1348.6) was added as an internal standard to 1 μl of the sample and added to the sample slide. After drying, 1 μl of matrix (alpha-cyano-1-hydroxycinamic acid 10 mg / ml) was added, and measurement was performed under the following conditions. MS measurement conditions were as follows: KOMACT MALDI (Shimadzu / KRATOS) as a mass spectrometer, and laser light wavelength was measured at 337 nm (nitrogen laser). As a result, the difference between the molecular weight (theoretical value) of the peptide calculated from the amino acid composition (theoretical value) (2,005) and the average value of the obtained mass spectrum (2,048) is 43. Is an acetyl group corresponding to 43. Hereinafter, mouse cyclophilin A in which the amino terminal valine is acetylated is referred to as mouse-modified cyclophilin A.
[0090]
(Example 14: Confirmation of hematopoietic stem cell proliferation activity of purified sample)
Using the increase in the number of CD34 + CD38− cells, which are immature hematopoietic stem cells, as an index, the activities of the three samples obtained in Example 12 were examined. That is, using the hematopoietic stem cell growth factor detection system constructed in Example 2 with the activity of mouse cyclophilin B, mouse modified cyclophilin A and mouse cyclophilin A purified by rechromatography with YMC-Pack PROTEIN-RP I investigated. As a control, 2% FCS-RPMI 1640 was used. G-CSF, GM-CSF, LIF and IL7 were used as cytokines having known hematopoietic stem cell proliferation activity to be compared.
[0091]
Cells cultured in 5 wells of 96 wells were mixed and analyzed by FACScan. The experiment was performed 4 times using cord blood stem cells from different donors. The concentration of the added cytokine was adjusted to 20 ng / ml in all cases except for mouse cyclophilin B. The concentration of mouse cyclophilin B was not accurately determined, but was in the range of about 20-100 ng / ml.
[0092]
As a result, hematopoietic stem cell proliferating activity of mouse cyclophilin B, mouse modified cyclophilin A and mouse cyclophilin A was higher than that of existing cytokines. A representative result is shown in FIG.
[0093]
(Example 15: Cloning of human cyclophilin B gene and preparation of its expression vector for E. coli)
Using a human cDNA library (human thymus, plasmid type, Takara Shuzo Co., Ltd.) as a template, the 5 ′ site of human cyclophilin cDNA is the restriction enzyme NdeI (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the 3 ′ site is the restriction enzyme EcoRI. Using the synthetic primers designed as described above, PCR was performed as usual to prepare human cyclophilin cDNA (NdeI-EcoRI fragment). The sequence of the synthetic primer B1-1 used for this PCR is represented by SEQ ID NO: 5. The sequence of the synthetic primer B1-2 is represented by SEQ ID NO: 6.
[0094]
For PCR, 5 μl of each of these primers was added at 10 μM, 10 μl of dNTP mixture (2.5 mM), human cDNA library (human thymus) 1/100, Exstack (Takara Shuzo Co., Ltd.) 0.5 μl, Exstack Mineral oil was added in a system of 10 μl concentration buffer 10 μl, sterile water 59.5 μl, total 100 μl, and 30 cycles of 95 ° C. for 30 seconds; 55 ° C. for 30 seconds; and 72 ° C. for 30 seconds were performed. . After completion of PCR, the DNA solution was recovered without removing mineral oil. The recovered DNA solution was purified by chloroform extraction and ethanol precipitation, treated with restriction enzyme EcoRI and restriction enzyme NdeI (Takara Shuzo Co., Ltd.), and then DNA was excised and purified by 0.7% agarose gel electrophoresis.
[0095]
The pET expression system pET11b (Stratagene) was used as an expression vector for E. coli. 2 μl (2 μg) of pET11b was treated with restriction enzyme EcoRI and restriction enzyme NdeI at 37 ° C. for 16 hours. A sample containing enzyme-treated pET11b was purified by 0.9% agarose gel electrophoresis.
[0096]
To the purified pET11b cleaved with this restriction enzyme EcoRI and restriction enzyme NdeI, human cyclophilin cDNA (NdeI-EcoRI fragment) and T4 DNA ligase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) prepared by the above PCR are added, and at 16 ° C. Ligation was performed for 16 hours. 30 μl of E. coli competent cell BL21 (DE3) (Stratagene) was added to 2 μl of the ligated treated sample, left on ice water for 30 minutes, treated at 42 ° C. for 60 seconds, and immediately left on ice water for 5 minutes. To this, SOC medium (tryptone 20 g, yeast extract 5 g, NaCl 0.585 g, KCl 0.186 g, MgCl 2 10 mM, MgSO Four Add 10 μL of water to 10 mM and dissolve to a total of 1 L, add 900 ml of 2 M glucose to this), shake culture at 37 ° C. for 1 hour, and then add ampicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 μg / ml Plated on containing LB agar plates. Subsequently, it culture | cultivated at 37 degreeC for 16 hours, the colony was obtained, and the transformant (containing expression vector pET11Hu1-1) was acquired.
[0097]
(Example 16: Cloning of mouse cyclophilin B gene and preparation of its expression vector for E. coli)
Using mouse cDNA library (mouse thymus, plasmid type, Takara Shuzo Co., Ltd.) as a template, mouse cyclophilin cDNA 5 'site is restriction enzyme NdeI (Takara Shuzo Co., Ltd.), and 3' site is restriction enzyme EcoRI. PCR was carried out in the usual manner using the synthetic primers designed as described above to prepare mouse cyclophilin cDNA (NdeI-EcoRI fragment). The sequence of synthetic primer B2-1 used for this PCR is represented by SEQ ID NO: 7. The sequence of the synthetic primer B2-2 is represented by SEQ ID NO: 8.
[0098]
For PCR, 5 μl of each of these primers was added at 10 μM, 10 μl of dNTP mixture (2.5 mM), mouse cDNA library (mouse thymus) for 1/100, Exstack (Takara Shuzo) 0.5 μl, Exstack Mineral oil was added and 30 cycles were performed in a system of 10 μl of 10-fold concentrated buffer and 59.9 μl of sterilized water for a total of 100 μl. After completion of PCR, the DNA solution was recovered without removing mineral oil. The recovered DNA solution was purified by chloroform extraction and ethanol precipitation, treated with restriction enzymes EcoRI and restriction enzyme NdeI, and then excised and purified by 0.7% agarose gel electrophoresis.
[0099]
The pET expression system pET11b (Stratagene) was used as an expression vector for E. coli. The mouse cyclophilin cDNA (NdeI-EcoRI fragment) and T4 DNA ligase prepared by PCR described above were added to the purified pET11b cleaved with the restriction enzyme EcoRI and the restriction enzyme NdeI obtained in Example 15 above. And ligation was performed for 16 hours. 30 μl of E. coli competent cell BL21 (DE3) was added to 2 μl of the ligated treated sample, left on ice water for 30 minutes, treated at 42 ° C. for 60 seconds, and immediately left on ice water for 5 minutes. To this, 900 μl of SOC medium was added and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour, and then plated on an LB agar plate containing 100 μg / ml of ampicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Subsequently, it culture | cultivated at 37 degreeC for 16 hours, the colony was obtained, and the transformant (containing expression vector pET11MCPB1.1) was acquired.
[0100]
(Example 17: Production of human cyclophilin B in E. coli)
The transformant containing the expression vector pET11Hu1-1 obtained in Example 15 was inoculated into 100 ml of LB medium containing 100 μg / ml ampicillin and precultured at 37 ° C. The next day, 10 ml of this bacterial cell-containing solution was inoculated into 500 ml of LB medium (containing 100 μg / ml ampicillin), and a total of 4 L was cultured at 37 ° C. When the absorbance at 600 nm reached about 0.7, IPTG 0.4 mM was added, and the cells were further cultured at 37 ° C. for 2 hours, and then the cells were collected by centrifugation.
[0101]
2 L of the culture solution was lysed with a lysis buffer (composition: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA 2 sodium, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 μg / ml aprotinin, 1 μg / ml leupeptin, and 1 μg / ml pepstatin). ) Suspended in 60 ml. The suspension was subjected to sonication with a sonicator USP-600 manufactured by Shimadzu Corporation at 15% duty cycle 60 and output 7 for 15 minutes to disrupt the cells. The cell lysate was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to obtain a supernatant. 40% saturated ammonium sulfate was added to the supernatant. After leaving at 4 ° C. for 1 hour, the mixture was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant. The supernatant was dialyzed against Tris-HCl (pH 8.0) at 4 ° C. This dialyzed solution was applied to TSK-gel DEAE-5PW and eluted with a gradient increasing the NaCl concentration from 0 to 1 mM with 20 mM Tris-HCl (pH 8.0).
[0102]
The fraction of cyclophilin B was collected, PBS (-) was added, and the mixture was concentrated with an ultrafiltration device (fraction molecular weight 10,000). This concentrated solution is TSK-gel G3000SW. XL And purified with PBS (−) buffer. Recycle the fraction of cyclophilin B with TSK-gel G3000SW XL Purified by The obtained human cyclophilin B is referred to as E. coli type human cyclophilin.
[0103]
(Example 18: Production of mouse cyclophilin B in E. coli)
The transformant obtained in Example 16 and containing the expression vector pET11MCPB1.1 was inoculated into 100 ml of LB medium containing 100 μg / ml ampicillin and precultured at 37 ° C. The next day, 10 ml of this bacterial cell-containing solution was inoculated into 500 ml of LB medium (containing 100 μg / ml ampicillin), and a total of 4 L was cultured at 37 ° C. When the absorbance at 600 nm reached about 0.7, IPTG 0.4 mM was added, and the cells were further cultured at 37 ° C. for 2 hours, and then the cells were collected by centrifugation.
[0104]
2 L of the culture solution was suspended in 60 ml of lysis buffer, and 1 minute of sonication was performed 15 times on this suspension to disrupt the cells. The cell lysate was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to obtain a supernatant. 40% saturated ammonium sulfate was added to the supernatant. After standing at 4 ° C. for 1 hour, the mixture was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant. The supernatant was dialyzed against Tris-HCl (pH 8.0) at 4 ° C. This dialyzed solution was applied to TSK-gel DEAE-5PW and eluted with a gradient increasing the NaCl concentration from 0 to 1 mM with 20 mM Tris-HCl (pH 8.0).
[0105]
The fraction of cyclophilin B was collected, PBS (-) was added, and the mixture was concentrated with an ultrafiltration device (fraction molecular weight 10,000). This concentrated solution is TSK-gel G3000SW. XL And purified with PBS (−) buffer. Recycle the fraction of cyclophilin B with TSK-gel G3000SW XL Purified by The obtained mouse cyclophilin B is referred to as E. coli mouse cyclophilin.
[0106]
(Example 19: Measurement of peptidylprolyl isomerase activity)
Whether cyclophilin B prepared in Examples 17 and 18 had a correct molecular structure was determined by measuring the peptidylprolyl isomerase activity of cyclophilin as follows.
[0107]
The final concentration of cis-N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilysin is 50 μM, Hepes buffer (pH 8.0) is 40 mM, and Triton-X100 is 0.015% (w / v). Add (total 500 μl), then add 50 nM cyclophilin, 5 μl and incubate at 10 ° C. Immediately after adding 50 μl of 200 μM chymotrypsin, absorption at 390 nm was measured with a spectrophotometer (measured every 6 seconds until 150 seconds later). As a control, commercially available cyclophilin A (Boehringer Mannheim) was used.
[0108]
As a result, isomerase activity was observed in all cyclophilin B including commercially available cyclophilin A.
[0109]
(Example 20: Confirmation of hematopoietic stem cell proliferation activity of Escherichia coli human cyclophilin B)
Hematopoietic stem cells (CD34 + CD38− cells) prepared from human umbilical cord blood were plated in 5 wells of a 96-well U-type plate (50 cells / 100 μl / well). As a medium used for the growth of hematopoietic stem cells, a medium (SCF / IL3 medium) prepared by adding cytokines SCF (25 ng / ml) and IL3 (20 ng / ml) to 15% FCS-RPMI 1640 is prepared in the test group. Furthermore, this was a medium supplemented with a sample containing E. coli human cyclophilin B (cyclophilin B dissolved in 2% FCS-RPMI 1640 at 200 ng / ml) at 20 μl / well. In the control group, a medium in which 2% FCS-RPMI1640 was added to SCF / IL3 medium at 20 μl / well was used instead of the above-mentioned sample containing cyclophilin.
[0110]
After culturing at 37 ° C. for 14 days, 5 wells were combined into one, and the number of viable cells contained therein was measured by the trypan blue method. In SCF + IL3 + human cyclophilin B, there were 40 cells in the SCF + IL3 + 2% FCS-RPMI1640 group compared to 1,600 viable cells per well (FIG. 4). It is clear that human cyclophilin B has the effect of proliferating hematopoietic stem cells.
[0111]
(Example 21: Confirmation of hematopoietic stem cell proliferation activity of E. coli human cyclophilin B, E. coli mouse cyclophilin B, and E. coli human cyclophilin A) Hematopoietic stem cells (CD34 + CD38− cells) prepared from human umbilical cord blood Each well of the mold plate was plated (200 cells / 100 μl / well). The medium used for the growth of hematopoietic stem cells was a medium in which 15% FCS-RPMI 1640 was added with cytokines SCF (25 ng / ml), IL6 (20 ng / ml), and IL3 (20 ng / ml) in the test group. (SCF / IL6 / IL3) was prepared, and a sample containing E. coli human cyclophilin B obtained in Example 17 or E. coli mouse cyclophilin B obtained in Example 18 (E. coli human cyclophilin B ( M-type, ie, one Met residue added to the N-terminus of human cyclophilin B) at 200 ng / ml and 40 ng / ml, E. coli mouse cyclophilin B at 200 ng / ml and 40 ng / ml, Alternatively, commercially available Escherichia coli human cyclophilin A (Boehringer Mannheim) 200n g / ml and 40 ng / ml dissolved in 2% FCS-IMDM) were added at 20 μl / well. As a control group, a medium in which 2% FCS-IMDM was added to SCF / IL6 / IL3 medium at 20 μl / well instead of the above-mentioned sample containing cyclophilin was used.
[0112]
After culturing at 37 ° C. for 13 days, 6 wells were combined into one, the cells were treated with CD34 (FITC) antibody, and cells were taken up by FACScan for a certain period of time to determine the CD34 + cell ratio. On the other hand, the number of living cells was measured by the trypan blue method, and the number of living cells was calculated by multiplying the ratio to obtain the number of CD34 positive cells. CD34 + cell proliferation effect was observed in any cyclophilin sample (FIG. 5).
[0113]
【The invention's effect】
According to the present invention, a hematopoietic stem cell proliferating agent containing cyclophilin is provided. This hematopoietic stem cell proliferating agent can be used as a therapeutic agent for various hematopoietic organ diseases, cancer radiotherapy and hematopoietic failure during chemotherapy, it can be used for mass production of blood cells, and gene for hematopoietic stem cells during gene therapy It can be used to improve the efficiency of introduction of and further utilized as a diagnostic agent and a test agent.
[0114]
[Sequence Listing]
Figure 0004163834
Figure 0004163834
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[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a purified chromatographic pattern of gel filtration fractions of NS-1 cell culture supernatant by reverse phase HPLC, and human cord blood hematopoietic stem cell proliferation activity of each fraction.
FIG. 1A shows the number of cells grown in the hematopoietic stem cell proliferation detection system for each fraction on the vertical axis, and the retention time (min) on the horizontal axis. The column with many dots shows the number of CD34 + cells found on the 25th day in the hematopoietic stem cell growth factor detection system; the black column shows CD34 found on the 32nd day in the culture with the hematopoietic stem cell growth factor detection system. + The number of cells; white column is the number of CD34 + CD38 − cells found on day 25 of culture in the hematopoietic stem cell growth factor detection system; and the column with fewer dots is the hematopoietic stem cell growth factor detection system. The number of CD34 + CD38 − cells found on the 32nd day of culture is shown.
FIG. 1 (b) shows the absorption at 214 nm for each fraction on the vertical axis and the retention time (minutes) on the horizontal axis. Absorption at 214 nm reflects the amount of protein contained in each fraction.
FIG. 2 shows a purified chromatographic pattern obtained by reverse-phase HPLC of a gel filtration fraction of NS-1 cell serum-free culture supernatant, and fractions of mouse cyclophilin B, mouse cyclophilin A and mouse modified cyclophilin A therein. It is the figure which showed clearly. FIG. 2 shows the absorption at 214 nm for each fraction on the vertical axis and the retention time (minutes) on the horizontal axis. Absorption at 214 nm reflects the amount of protein contained in each fraction.
FIG. 3 shows the human umbilical cord blood hematopoietic stem cell proliferating activity of mouse cyclophilin B, mouse cyclophilin A, and mouse modified cyclophilin A purified from serum-free culture supernatant of NS-1 cells (the medium is SCF, IL6 and IL3 ( FIG. 3 is a diagram showing a comparison with other cytokines. FIG. 3 shows the number of CD34 + CD38− cells on the vertical axis and the type of sample added on the horizontal axis.
FIG. 4 is a graph showing the human umbilical cord blood hematopoietic stem cell proliferating activity of Escherichia coli human cyclophilin B.
FIG. 5 shows the human umbilical cord blood hematopoietic stem cell proliferating activity of E. coli type human cyclophilin B, E. coli type mouse cyclophilin B and E. coli type human cyclophilin A (using proliferation of CD34 + cells as an index).

Claims (11)

サイクロフィリンを含有する造血幹細胞増殖剤。  A hematopoietic stem cell proliferating agent containing cyclophilin. 前記サイクロフィリンが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチド、またはこれらの修飾体であって、該修飾体は、該ポリペプチドのアミノ末端がアシル化されたポリペプチドであるかまたは該ポリペプチドのカルボキシル末端がアミド化もしくはエステル化されたポリペプチドである、請求項１に記載の造血幹細胞増殖剤。The cyclophilin has a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, And a polypeptide having hematopoietic stem cell proliferation activity, or a modified form thereof, wherein the modified form is a polypeptide in which the amino terminus of the polypeptide is acylated or the carboxyl terminus of the polypeptide is amidated. Alternatively, the hematopoietic stem cell proliferating agent according to claim 1, which is an esterified polypeptide . 前記サイクロフィリンが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチド、またはこれらの修飾体であって、該修飾体は、該ポリペプチドのアミノ末端がアシル化されたポリペプチドであるかまたは該ポリペプチドのカルボキシル末端がアミド化もしくはエステル化されたポリペプチドである、請求項１に記載の造血幹細胞増殖剤。The cyclophilin has a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, And a polypeptide having hematopoietic stem cell proliferation activity, or a modified form thereof, wherein the modified form is a polypeptide in which the amino terminus of the polypeptide is acylated or the carboxyl terminus of the polypeptide is amidated. Alternatively, the hematopoietic stem cell proliferating agent according to claim 1, which is an esterified polypeptide . 前記サイクロフィリンが、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチド、またはこれらの修飾体であって、該修飾体は、該ポリペプチドのアミノ末端がアシル化されたポリペプチドであるかまたは該ポリペプチドのカルボキシル末端がアミド化もしくはエステル化されたポリペプチドである、請求項１に記載の造血幹細胞増殖剤。The cyclophilin has a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, And a polypeptide having hematopoietic stem cell proliferation activity, or a modified form thereof, wherein the modified form is a polypeptide in which the amino terminus of the polypeptide is acylated or the carboxyl terminus of the polypeptide is amidated. Alternatively, the hematopoietic stem cell proliferating agent according to claim 1, which is an esterified polypeptide . 前記サイクロフィリンが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチド、またはこれらの修飾体であって、該修飾体は、該ポリペプチドのアミノ末端がアシル化されたポリペプチドであるかまたは該ポリペプチドのカルボキシル末端がアミド化もしくはエステル化されたポリペプチドである、請求項１に記載の造血幹細胞増殖剤。The cyclophilin has a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, And a polypeptide having hematopoietic stem cell proliferation activity, or a modified form thereof, wherein the modified form is a polypeptide in which the amino terminus of the polypeptide is acylated or the carboxyl terminus of the polypeptide is amidated. Alternatively, the hematopoietic stem cell proliferating agent according to claim 1, which is an esterified polypeptide . 前記修飾体が、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有し、かつそのアミノ末端がアセチル化されたポリペプチドである、請求項４に記載の造血幹細胞増殖剤。  The hematopoietic stem cell proliferating agent according to claim 4, wherein the modified product is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and acetylated at the amino terminus. 前記修飾体が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有し、かつそのアミノ末端がアセチル化されたポリペプチドである、請求項５に記載の造血幹細胞増殖剤。  The hematopoietic stem cell proliferating agent according to claim 5, wherein the modified product is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and acetylated at the amino terminus. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の造血幹細胞増殖剤を用いて非ヒト動物またはインビトロにおいて造血幹細胞または造血前駆細胞を増殖させる工程を包含する、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖方法。  A method for proliferating hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells, comprising a step of proliferating hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells in a non-human animal or in vitro using the hematopoietic stem cell proliferating agent according to any one of claims 1 to 7. 前記造血幹細胞増殖剤が、ヒトまたはマウス由来の骨髄腫細胞の培養上清である、請求項８に記載の方法。The method according to claim 8 , wherein the hematopoietic stem cell proliferating agent is a culture supernatant of human or mouse-derived myeloma cells. 前記増殖工程において、造血幹細胞または造血前駆細胞に外来遺伝子が導入される、請求項８に記載の方法。The method according to claim 8 , wherein a foreign gene is introduced into the hematopoietic stem cell or hematopoietic progenitor cell in the expansion step. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の造血幹細胞増殖剤を含む、血液系の疾患の診断薬または検査薬。  A diagnostic or test agent for a disease of the blood system, comprising the hematopoietic stem cell proliferating agent according to any one of claims 1 to 7.
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