JP4104393B2

JP4104393B2 - 生体試料中の特定成分の定量方法及び定量用試薬

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Publication number: JP4104393B2
Application number: JP2002219222A
Authority: JP
Inventors: 宏幸海老沼; 久美子結城
Original assignee: 第一化学薬品株式会社
Priority date: 2002-07-29
Filing date: 2002-07-29
Publication date: 2008-06-18
Anticipated expiration: 2022-07-29
Also published as: JP2004061263A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電子受容体の存在下で、特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素を生体試料に作用させ、生成された電子受容体の還元体を測定することにより、生体試料中の特定成分を定量する際に、ヘモグロビンによる影響を回避し、正確に定量することができるようにした生体試料中の特定成分の定量方法及び定量用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料中の特定成分を定量する方法の一つとして、電子受容体の存在下で、該特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素を生体試料に作用させ、生成された電子受容体の還元体を測定することにより、試料中の特定成分を間接的に定量する方法が知られている。特に、定量しようとする特定成分が微量成分であるような場合は、より高感度に測定するために、上記生成された電子受容体の還元体を、より発色感度の高い発色剤を用いて検出、定量することも行なわれている。例えば、電子受容体としてNAD又はNADPを用いた場合、その還元体であるNADH又はNADPHに、ジアホラーゼ等の電子キャリアーとテトラゾリウム塩を作用させてホルマザンを形成させることにより検出、定量することが行なわれている。
【０００３】
しかしながら、上記のような定量方法は、生体試料中の夾雑物、例えば金属（イオン）や金属蛋白の影響を受けやすく、特に、分子内に鉄を含有しているヘモグロビンが混在する生体試料を用いた場合、正確に定量できないという問題があった。ヘモグロビンの影響としては、例えば、ヘモグロビンが酸化等の影響を受けることによる吸収波長の変化が挙げられる。この反応が測定中に起こった場合、測定する波長によっては、非特異反応として測定値に誤差を与える場合がある。また、ヘモグロビン蛋白は分子内に鉄を有していることから、電子伝達系を阻害する可能性も考えられる。
【０００４】
そのため、従来より、試料中に含まれる成分を分析又は定量する際に、ヘモグロビンの影響を回避する方法として様々な方法が提案されている。例えば、特開昭60-168050号公報には、試液中に、特定の界面活性剤を添加する臨床化学分析方法が開示されている。また、特開昭62-248500号公報には、チオ尿素を含有させた血清中の酵素活性測定用試薬が開示されている。また、特開平9-84598号公報には、検体中の特定の酵素の活性を測定する際に、スルホキシ無機塩系還元剤を含む酵素活性測定用試薬を用いる方法が開示されている。また、特開2001-292795号公報には、ヘモグロビンを含有する生物学的液体に含まれる分析物の濃度を測定するための試薬に、ヘモグロビンとテトラゾリウム化合物との不要な反応を抑えるために、亜硝酸塩を添加することが開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、電子受容体の存在下で、特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素を生体試料に作用させ、生成された電子受容体の還元体を測定することにより、生体試料中の特定成分を定量する方法においては、ヘモグロビンの吸収波長の変化や還元性による影響だけではなく、電子伝達系への妨害を受けることを考慮する必要があり、上記のような方法であっても、ヘモグロビンの影響を充分に回避できるものではなかった。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、電子受容体の存在下で、特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素を、ヘモグロビンを含む生体試料に作用させ、生成された電子受容体の還元体を測定することにより、生体試料中の特定成分を定量する際に、効果的にヘモグロビンの影響を回避し、目的とする特定成分を正確に定量することができる定量方法及び定量用試薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、アルブミンを含有する測定試薬を用いることによって、ヘモグロビンを含む生体試料中の特定成分を、ヘモグロビンの影響を受けることなく正確に定量することができ、更には、生成された電子受容体の還元体を、発色剤を用いて検出して定量する際にも有効であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明の生体試料中の特定成分の定量方法は、ヘモグロビンを含有する生体試料にアルブミンを作用させ、ついで、電子受容体の存在下で、特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素を作用させ、生成された電子受容体の還元体を測定することを特徴とする。
【０００９】
本発明の定量方法によれば、アルブミンを含有する測定試薬を用いることにより、試料中に含まれるヘモグロビンの影響を回避することができ、正確に目的成分を定量することができる。
【００１０】
本発明の定量方法におけるアルブミンの作用機序は明確ではないが、ヘモグロビンの吸収波長の変化に関係するものではないことを確認しており、電子伝達系において、電子がヘモグロビンに捕捉されるのをブロックしているものと考えられる。
【００１１】
本発明の定量方法においては、前記生体試料が、血液、血漿、血清、又は尿であることが好ましい。また、前記特定成分が、グルコース、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、尿素窒素、尿酸、中性脂肪、マンノース、１，５−アンヒドログルシトール、アラビニトール、イノシトール、ソルビトール、フルクトース、ガラクトース、胆汁酸、３−デオキシグルコソン、及びアルコールからなる群から選ばれた１種であることが好ましい。更に、前記アルブミンは、ヒト又はウシ由来のものであることが好ましい。この態様によれば、効率よくヘモグロビンの影響を回避することができる。また、この場合、前記アルブミンとして、ヒト由来アルブミンを用いる場合は、測定試薬中に０．４〜５％含むものであることが好ましく、前記アルブミンとして、ウシ由来アルブミンを用いる場合は、測定試薬中に１〜１０％含むものであることが好ましい。
【００１２】
また、前記生成された電子受容体の還元体を測定する際に、発色剤を用いることが好ましく、前記発色剤は、テトラゾリウム塩であることが好ましい。これらの態様によれば、微量成分を高感度に定量することができる。
【００１３】
また、前記電子受容体の還元体は、NADH又はNADPHであることが好ましい。この態様によれば、ヘモグロビンの吸収波長の変化の影響を回避することができる。また、その場合、電子受容体として NAD 又は NADP を用い、その還元体である NADH 又は NADPH に、テトラゾリウム塩、及びジアホラーゼやフェナジンメトサルフェート類等の電子キャリアーを作用させて生じるホルマザンを比色定量することが好ましい。
【００１４】
また、本発明の生体試料中の特定成分の定量用試薬は、アルブミンと、電子受容体と、生体試料中の特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素とを含む生体試料中の特定成分の定量用試薬であって、（１）アルブミンを含有し前記酵素を含まない第一の測定試薬であって、前記アルブミンが、ヒト由来のものであり、且つ、測定試薬中に０．４〜５％含む第一の測定試薬、又は、前記アルブミンが、ウシ由来のものであり、且つ、測定試薬中に１〜１０％含む第一の測定試薬と、（２）前記酵素を含む第二の測定試薬とを含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明の定量用試薬によれば、試薬中にアルブミンを含有させることにより、試料中のヘモグロビンの影響を回避して、目的成分を正確に定量することができる。また、前記アルブミンは、ヒト又はウシ由来のものであるので、効率よくヘモグロビンの影響を回避することができる。
【００１６】
本発明の定量用試薬においては、前記酵素が、グルコース、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、尿素窒素、尿酸、中性脂肪、マンノース、１，５−アンヒドログルシトール、アラビニトール、イノシトール、ソルビトール、フルクトース、ガラクトース、胆汁酸、３−デオキシグルコソン、アルコール、及びそれらより派生した物質からなる群から選ばれた１種に対して脱水素による酸化能を有する酵素であることが好ましい。
【００１７】
また、更に、発色剤を含むことが好ましく、前記発色剤は、テトラゾリウム塩であることが好ましい。これらの態様によれば、微量成分を高感度に定量することができる。
【００１８】
また、前記電子受容体は、NAD又はNADPであることが好ましい。この態様によれば、ヘモグロビンの吸収波長の変化の影響を回避することができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の定量方法が適用される生体試料としては、ヘモグロビンが共存する可能性の高い各種体液等が挙げられ、特に血液、血漿、血清又は尿等が好適に挙げられる。
【００２０】
また、生体試料中に含まれる測定対象となる特定成分としては、電子受容体の存在下で、該特定成分に対して脱水素による酸化能を有する酵素が使用できるもの、あるいは該特定成分より派生した物質に対して、電子受容体の存在下で、脱水素による酸化能を有する酵素が使用できるものであれば特に制限はなく、例えば、グルコース、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、尿素窒素、尿酸、中性脂肪等が挙げられる。特に、マンノース、１，５−アンヒドログルシトール、アラビニトール、イノシトール、ソルビトール、フルクトース、ガラクトース、胆汁酸、３−デオキシグルコソン、アルコール等の高感度な検出が要求される微量成分を定量する際に好適に適用される。
【００２１】
本発明で用いられる酵素は、測定対象となる特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して、電子受容体の存在下で、脱水素による酸化能を有する酵素（以下、脱水素酵素という。）であればよい。すなわち、特定成分に直接作用する酵素に限定されず、酵素共役系等により特定成分から定量的に派生した物質に対する脱水素酵素も用いることができる。例えば、特定成分がグルコースの場合、好ましくはグルコースに直接作用するグルコース脱水素酵素が用いられるが、グルコースに対してリン酸化作用を示すヘキソキナーゼを作用させることにより生成したグルコース−６−リン酸に対する脱水素酵素（グルコース−６−リン酸脱水素酵素）等を用いることもできる。なお、上記に例示した他の特定成分についても、該特定成分に直接作用する酵素だけでなく、酵素共役系等により該特定成分から定量的に派生した物質に対する脱水素酵素も用いることができるが、これらの酵素についても公知の酵素を用いることができる。
【００２２】
また、電子受容体としては、生成された電子受容体の還元体を直接定量できるもの、あるいは該還元体を、発色剤を用いて比色定量できるものであれば、特に制限なく用いることができる。具体的には、NAD、NADP等の補酵素、フェナジンメトサルフェート類、ジクロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化合物等が好ましく例示でき、中でもNAD又はNADPが特に好ましく用いられる。
【００２３】
また、発色剤としては、テトラゾリウム又はその塩が好ましく挙げられる。具体的には、ニトロテトラゾリウムブルー、2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2Hテトラゾリウムクロライド、3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2Hテトラゾリウムブロマイド、2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルフォフェニル)-2Hテトラゾリウム塩（以下、WST-1と略す。）等が利用できる。
【００２４】
以下、本発明の定量方法について、好ましい態様を挙げて説明する。なお、「％」は特に断りのない限り「質量％」を意味する。
【００２５】
本発明の定量方法は、ヘモグロビンを含有する生体試料にアルブミンを作用させ、ついで、電子受容体の存在下で、特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素を作用させ、生成された電子受容体の還元体を測定することを特徴とするものである。
【００２６】
したがって、基本的な定量方法については、公知の方法に準じて行なうことができる。
【００２７】
本発明において、測定試薬中のアルブミンの濃度は、使用するアルブミンの由来、試料中のヘモグロビン含量、試料中に元々含まれているアルブミン含量等によって異なり、一概に決定することができないため、各試料に応じて適宜至適濃度を決定すればよい。例えば、ヒト由来アルブミンを用いる場合は、通常、測定試薬中に０．４〜５％含むことが好ましく、０．６〜２％含むことがより好ましい。また、ウシ由来アルブミンを用いる場合は、測定試薬中に１〜１０％含むことが好ましく、２．５〜１０％含むことがより好ましい。
【００２８】
そして、試薬としてアルブミンと、電子受容体と、測定しようとする特定成分又は該特定成分より派生した物質に作用する脱水素酵素とを添加して、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等）中で酵素反応を行ない、生成された電子受容体の還元体を定量すればよい。
【００２９】
電子受容体の添加濃度は、その種類により適宜設定すればよい。また、脱水素酵素の添加濃度は、試料中の特定成分に対して十分に作用できる量を添加すればよく、使用する酵素の種類等によって適宜設定すればよい。
【００３０】
本発明において、電子受容体の還元体を定量する方法としては、電子受容体の還元体を直接定量してもよいが、感度等の点から該還元体を、発色剤を用いて比色定量することが好ましい。具体的には、電子受容体としてNAD又はNADPを用い、その還元体であるNADH又はNADPHに、テトラゾリウム塩、及びジアホラーゼやフェナジンメトサルフェート類等の電子キャリアーを作用させて生じるホルマザンを比色定量することが好ましい。
【００３１】
本発明の定量用試薬は、上記の生体試料中の特定成分の定量方法を簡便に実施できるように構成されたものであり、アルブミンと、電子受容体と、生体試料中の特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素とを含む生体試料中の特定成分の定量用試薬であって、（１）アルブミンを含有し前記酵素を含まない第一の測定試薬であって、前記アルブミンが、ヒト由来のものであり、且つ、測定試薬中に０．４〜５％含む第一の測定試薬、又は、前記アルブミンが、ウシ由来のものであり、且つ、測定試薬中に１〜１０％含む第一の測定試薬と、（２）前記酵素を含む第二の測定試薬とを含むものであり、更に、発色剤を含むことが好ましく、必要に応じて、ジアホラーゼやフェナジンメトサルフェート類等の電子キャリアーを含むことができる。
また、前記酵素として、グルコース、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、尿素窒素、尿酸、中性脂肪、マンノース、１，５−アンヒドログルシトール、アラビニトール、イノシトール、ソルビトール、フルクトース、ガラクトース、胆汁酸、３−デオキシグルコソン、アルコール、及びそれらより派生した物質からなる群から選ばれた１種に対して脱水素による酸化能を有する酵素を用いることができる。
【００３３】
【実施例】
以下、生体試料中の特定成分がマンノースの場合の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実施例において使用したアルブミンは、ヒト由来アルブミン（品番「A-1653」、シグマ社製）及びウシ由来アルブミン（熱処理、インタージェン社製）である。また、電子受容体の存在下で、マンノースに対して脱水素による酸化能を有する酵素として、グルコノバクター属に属する微生物由来から精製したアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを用い、必要に応じてグルコース消去系を組み合わせた（特開2001-197900号公報参照）。
【００３４】
実施例１
電子受容体として補酵素NADP、脱水素酵素としてアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを用いて、下記に示す第１試薬及び第２試薬からなる定量用試薬を調製した。なお、第１試薬は、ヒト由来アルブミン（ＨＳＡ）含量が0、0.5、0.75、1.0%となるように濃度を変化させたものをそれぞれ調製した。
【００３５】
第１試薬：
ホウ酸緩衝液 25mM（pH8.0）
Tween20 1.3％
ヒト由来アルブミン（ＨＳＡ） 0〜1%
第２試薬：
ホウ酸緩衝液 25mM（pH8.0）
NADP 4mM
アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ 70u/mL
そして、マンノース水溶液（25μg/mL）にヘモグロビンを９：１で混合し、ヘモグロビン含量が0、125、250、500mg/dLとなるように各測定用試料を調製し、上記試薬を用いてマンノース濃度を測定した。検量線は0及び10μg/mLのマンノース溶液を用いた。
【００３６】
具体的には、上記各測定用試料8μLに対し、上記第１試薬240μLを添加して３７℃で５分間反応させ、次いで上記第２試薬60μLを添加して同じく３７℃で５分間反応させた後、主波長340nm、副波長700nmの２波長とし、２ポイントアッセイにて吸光度を測定した。これらの操作は、日立７１５０形自動分析装置にて実施した。その結果を表１に示した。
【００３７】
【表１】

【００３８】
表１より、ＨＳＡを添加することにより、ヘモグロビンの影響が回避され、マンノースを正確に定量できることが分かる。
【００３９】
実施例２
実施例１の試薬１において、ＨＳＡの代わりにウシ由来アルブミン（ＢＳＡ）を0、1.0、3.0、5.0%となるように濃度を変化させたものを用いた以外は、同様の試薬、測定用試料を用いてマンノースを定量した。その結果を表２に示した。
【００４０】
【表２】

【００４１】
表２より、ＢＳＡを添加することにより、ヘモグロビンの影響が回避され、マンノースを正確に定量できるできることが分かる。なお、ＢＳＡと比べるとＨＳＡの方がより低濃度でヘモグロビンの影響を回避できることが分かる。
【００４２】
実施例３
電子受容体として補酵素NADP、還元性発色剤にWST-1、脱水素酵素としてアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ、電子キャリアーとしてジアホラーゼを用いて、下記に示す第１試薬及び第２試薬からなる定量用試薬を調製した。なお、第１試薬は、ヒト由来アルブミン（ＨＳＡ）を0、0.5、0.75、1.0%となるように濃度を変化させたものをそれぞれ調製した。
第１試薬：
ホウ酸緩衝液 25mM（pH8.0）
WST-1 0.78mM
ジアホラーゼ 6.4u/mL
Tween20 1.3%
グルコキナーゼ 4u/mL
ATP 13mM
酢酸マグネシウム 4mM
ヒト由来アルブミン（ＨＳＡ） 0〜1％
第２試薬：
ホウ酸緩衝液 25mM（pH8.0）
NADP 4mM
アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ 70u/mL
そして、血清にヘモグロビンを９：１で混合し、ヘモグロビン含量が0、125、250、500mg/dLとなるように各測定用試料を調製し、上記試薬を用いてマンノース濃度を測定した。検量線は、0及び10μg/mLのマンノース溶液を用いた。
【００４３】
具体的には、上記各血清試料8μLに対し、上記第１試薬240μLを添加して３７℃で５分間反応させ、次いで上記第２試薬60μLを添加して同じく３７℃で５分間反応させた後、主波長450nm、副波長700nmの２波長とし、２ポイントアッセイにて吸光度を測定した。これらの操作は、日立７１５０形自動分析装置にて実施した。その結果を表３に示した。
【００４４】
【表３】

【００４５】
表３より、ＨＳＡを添加することにより、ヘモグロビンの影響が回避され、マンノースを正確に定量できることが分かる。
実施例４
実施例３の試薬１において、ＨＳＡの代わりにウシ由来アルブミン（ＢＳＡ）を0、1.0、3.0、5.0%となるように濃度を変化させたものを用いたもの以外は、同様の試薬、測定用試料を用いてマンノースを定量した。その結果を表４に示した。
【００４６】
【表４】

【００４７】
表４より、ＢＳＡを添加することにより、ヘモグロビンの影響が回避され、マンノースを正確に定量できるできることが分かる。なお、ＢＳＡと比べるとＨＳＡの方がより低濃度でヘモグロビンの影響を回避できることが分かる。
【００４８】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、電子受容体の存在下で、特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素を、ヘモグロビンを含有する生体試料に作用させ、生成された電子受容体の還元体を測定して生体試料中の特定成分を定量する際に、アルブミンを含有する測定試薬を用いることにより、試料中に含まれるヘモグロビンの影響を回避することができ、目的とする特定成分を正確に定量することができる。

Claims

ヘモグロビンを含有する生体試料にアルブミンを作用させ、ついで、電子受容体の存在下で、特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素を作用させ、生成された電子受容体の還元体を測定することを特徴とする生体試料中の特定成分の定量方法。
前記生体試料が、血液、血漿、血清、又は尿である請求項１に記載の生体試料中の特定成分の定量方法。
前記特定成分が、グルコース、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、尿素窒素、尿酸、中性脂肪、マンノース、１，５−アンヒドログルシトール、アラビニトール、イノシトール、ソルビトール、フルクトース、ガラクトース、胆汁酸、３−デオキシグルコソン、及びアルコールからなる群から選ばれた１種である請求項１又は２に記載の生体試料中の特定成分の定量方法。
前記アルブミンは、ヒト又はウシ由来のものである、請求項１〜３のいずれか一つに記載の生体試料中の特定成分の定量方法。
前記アルブミンが、ヒト由来のものであり、且つ、測定試薬中に０．４〜５％含むものである、請求項１〜３のいずれか一つに記載の生体試料中の特定成分の定量方法。
前記アルブミンが、ウシ由来のものであり、且つ、測定試薬中に１〜１０％含むものである、請求項１〜３のいずれか一つに記載の生体試料中の特定成分の定量方法。
前記生成された電子受容体の還元体を測定する際に、発色剤を用いる、請求項１〜６のいずれか一つに記載の生体試料中の特定成分の定量方法。
前記発色剤は、テトラゾリウム塩である、請求項７に記載の生体試料中の特定成分の定量方法。
前記電子受容体の還元体は、NADH又はNADPHである、請求項１〜８のいずれか一つに記載の生体試料中の特定成分の定量方法。
電子受容体として NAD 又は NADP を用い、その還元体である NADH 又は NADPH に、テトラゾリウム塩及び電子キャリアーを作用させて生じるホルマザンを比色定量する請求項９に記載の生体試料中の特定成分の定量方法。
アルブミンと、電子受容体と、生体試料中の特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素とを含む生体試料中の特定成分の定量用試薬であって、（１）アルブミンを含有し前記酵素を含まない第一の測定試薬であって、前記アルブミンが、ヒト由来のものであり、且つ、測定試薬中に０．４〜５％含む第一の測定試薬、又は、前記アルブミンが、ウシ由来のものであり、且つ、測定試薬中に１〜１０％含む第一の測定試薬と、（２）前記酵素を含む第二の測定試薬とを含むことを特徴とする、生体試料中の特定成分の定量用試薬。
前記酵素が、グルコース、コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、尿素窒素、尿酸、中性脂肪、マンノース、１，５−アンヒドログルシトール、アラビニトール、イノシトール、ソルビトール、フルクトース、ガラクトース、胆汁酸、３−デオキシグルコソン、アルコール、及びそれらより派生した物質からなる群から選ばれた１種に対して脱水素による酸化能を有する酵素である請求項１１に記載の生体試料中の特定成分の定量用試薬。
更に、発色剤を含む、請求項１１又は１２に記載の生体試料中の特定成分の定量用試薬。
前記発色剤は、テトラゾリウム塩である、請求項１３に記載の生体試料中の特定成分の定量用試薬。
前記電子受容体は、NAD又はNADPである、請求項１１〜１４のいずれか一つに記載の生体試料中の特定成分の定量用試薬。