JP4112859B2

JP4112859B2 - 分子物質を結合させる方法

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Publication number: JP4112859B2
Application number: JP2001535383A
Authority: JP
Inventors: ベーム、ゲラルト; シュミット、ウルリッヒ; パルティエール、クリストフ; ギュンター、コンスタンツェ
Original assignee: ACGT Progenomics AG
Current assignee: ACGT Progenomics AG
Priority date: 1999-11-03
Filing date: 2000-11-03
Publication date: 2008-07-02
Anticipated expiration: 2020-11-03
Also published as: EP1227848B1; DE19952956A1; US20060252130A1; JP2003517300A; AU2154801A; ATE326984T1; CN1390140A; CN100357314C; WO2001032684A2; US7807782B2; WO2001032684A3; DE50012831D1; EP1227848A2

Description

【０００１】
本発明は、プロリンに富むアミノ酸配列とＷＷタイプのタンパク質ドメインとの親和性に基づいて特異的相互作用を生じさせるアダプターセグメントを用いて、２つ以上の分子物質を結合させる方法に関する。
【０００２】
（発明の範囲および現行技術）
２つ以上の分子物質の相互作用は、生物工学および薬学−医学の研究、開発および応用の分野でしばしば発生する問題である。特に、それに関しては、通常、分子物質として２つ以上のタンパク質またはペプチドの相互作用が考えられる。そのような相互作用は、多くの場合、例えば、細胞間および細胞内伝達、分子レベルでのシグナルトランスダクション、または（特に、２ハイブリッド系およびそれに由来するプロセスの使用における）タンパク質−タンパク質相互作用の分析と同様に、生化学および細胞生物学研究の一部として検討される。さらに、融合タンパク質をｉｎｖｉｔｒｏ合成するために、生体分子、特に２つ以上のタンパク質を結合させる方法は、多くの生物工学的プロセスに極めて重要である。そのような方法で生産された融合タンパク質は、例えば、２つの異なる抗体の結合ドメイン（Ｆａｂ／Ｆｖ／ｓｃＦｖ断片）を含む、ヘテロ二官能（二価）抗体（いわゆるｄｉａｂｏｄｙ；Ｏ．Ｐｅｒｉｓｉｃ，Ｐ．Ａ．Ｗｅｂｂ，Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒｓ＆Ｒ．Ｌ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｄｉａｂｏｄｙ，ａｖｉｂａｌｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２，ｐｐ．１２１７−１２２６，１９９４参照）であり得る。それによって、例えば、両結合価がそれぞれ腫瘍細胞またはナチュラルキラー細胞に向けられると、それに応じて、二価ハイブリッド融合タンパク質は腫瘍細胞上へのキラー細胞の付着を仲介し得る。抗毒素の場合には、抗体は毒性物質と結合し、特異的抗原抗体相互作用を介して細胞毒を所定の細胞型に誘導する（Ｍ．Ａ．Ｇｈｅｔｉｅ＆Ｅ．Ｓ．Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，ｐｐ．７０７−７１４，１９９４参照）。
【０００３】
種々のタンパク質の融合構築物および会合体を用いれば、基本的にどのエフェクターを互いに結合させることもできるし、抗原との適切な相互作用または他の生物学的作用を介して、ハイブリッド分子中で２つの機能または特性を達成することができる。その一連の例が公表されている（Ｊ．Ｐ．ＭｃＧｒａｔｈ，Ｘ．Ｃａｏ，Ａ．Ｓｃｈｕｔｚ，Ｐ．Ｌｙｎｃｈ，Ｔ．Ｅｂｅｎｄａｌ，Ｍ．Ｊ．Ｃｏｌｏｍａ，Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ＆Ｓ．Ｄ．Ｐｕｔｎｅｙ，Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｕｓｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｎｄａｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４７，ｐｐ．１２３−１３３，１９９７；Ｊ．Ｍ．Ｂｅｔｔｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｊａｃｏｂ，Ｍ．Ｈｏｆｎｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．Ｂｒｏｏｍｅ−Ｓｍｉｔｈ，Ｃｒｅａｔｉｎｇａｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｂｙｉｎｓｅｒｔｉｏｎｏｆｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅｉｎｔｏｔｈｅｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，ｐｐ．１２７６−１２７９，１９９７；Ｙ．Ｍａｅｄａ，Ｈ．Ｕｅｄａ，Ｔ．Ｈａｒａ，Ｊ．Ｋａｚａｍｉ，Ｇ．Ｋａｗａｎｏ，Ｅ．Ｓｕｚｕｋｉ＆Ｔ．Ｎａｇａｍｕｎｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｏｔｅｉｎＡ−Ｖａｒｇｕｌａｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２０，ｐｐ．１１６−１２１，１９９６；Ｗ．Ｗｅｌｓ，Ｉ．Ｍ．Ｈａｒｗｅｒｔｈ，Ｍ．Ｚｗｉｃｋｌ，Ｎ．Ｈａｒｄｍａｎ，Ｂ．Ｇｒｏｎｅｒ＆Ｎ．Ｅ．Ｈｙｎｅｓ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｉｔｏｎ，ｂａｃｔｅｒｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｔａｒｇｅｔｅｄｔｏｔｈｅｈｕｍａｎｅｒｂＢ−２ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）１０，ｐｐ．１１２８−１１３２，１９９２）。
【０００４】
多くの場合、ヘテロ二官能構築物が、遺伝子レベルでの融合タンパク質合成を介して生産される。該構築物は、通常、両パートナー間の適切な結合成分（リンカー）と共にアクセス可能なポリペプチド鎖末端を備えていることを前提とする。好ましくない場合には、両パートナーの融合によって、例えば、融合タンパク質が正しい三次元折りたたみトポロジーを創成し得ないために、不活性な融合産物が生じることがある。したがって、多くの場合、両融合パートナーの結合がｉｎｖｉｔｒｏで起こる、すなわち、両パートナーを別々に合成し、折りたたんだ後で起こるのが望ましい。そのような方法により、例えば、新規な遺伝子構築を毎回する必要なく、単成分の種々の組み合わせを高速に生産、分析することが可能になるであろう。これらの成分の融合には、関与パートナーの融合または定方向会合プロセスを該パートナーの生産から分離するアダプターセグメントが必要である。さらに、そのために、アダプターセグメント（ドメインまたはペプチド配列）を、それらの固有の特性を変えることなく、関与パートナー上にしっかり固定することが必要である。
【０００５】
他の用途においては、２つの分子種間に短期間ではあるが強い相互作用が生じるのが望ましい。それに関して、ペプチドおよび小タンパク質ドメインは、タンパク質の組換え生産プロセスにおいて比較的容易に所望の標的タンパク質上に配置され得るので、特に重要な役割を果たす。その用途は、例えば、特異的結合セグメントを介した組換え生産タンパク質の精製である。多くの場合、ニッケルキレートカラムに結合させる場合（Ｐ．Ｈｅｎｇｅｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｉｓ−ＴａｇｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ｔｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０，ｐｐ．２８５−２８６，１９９５参照）、またはＳｔｒｅｐ−Ｔａｇとして知られているペプチドセグメントをストレプトアビジンに結合させる場合（Ｔ．Ｇ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ｋｏｅｐｋｅ，Ｒ．Ｆｒａｎｋ＆Ａ．Ｓｋｅｒｒａ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＳｔｒｅｐ−ｔａｇａｆｆｉｎｉｔｙｐｅｐｔｉｄｅａｎｄｉｔｓｃｏｇｎａｔｅｔａｒｇｅｔ，ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５，ｐｐ．７５３−７６６，１９９６）には、ポリヒスチジンペプチドセグメントが利用される。しかし、Ｈｉｓ−Ｔａｇ法は、ポリヒスチジンペプチドセグメントがニッケルイオンを含有する構造にしか結合しないという欠点を有している。例えば、２つの天然タンパク質またはペプチドの結合はこの方法では不可能である。したがって、この方法は、例外を除いて、分子物質を結合させるためには不適である。この方法で精製された試料には、しばしば、溶液中にニッケルイオンが検出され、そのために、この系は、医学治療用には魅力のないものとなっている。Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ法の場合、結合を仲介する結合パートナーの占める領域は比較的大きく、それゆえ、この方法は、立体配置の点で多くの結合を得るには不適である。さらに、アビジンおよびストレプトアジビンはそれぞれ４つの結合部位を有しており、そのために、溶液中で２つの異なる結合分子物質を制御生成させるのは極めて難しい。
【０００６】
そのようにして標識されたタンパク質を精製するのに使用することの他に、例えば、折りたたみ中の凝集プロセスを阻止するために基質上でタンパク質を折りたたんで、不活性固体基質上にタンパク質を固定化する方法（Ｇ．Ｓｔｅｍｐｆｅｒ，Ｂ．Ｈｏｌｌ−Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ＆Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄｒｅｆｏｌｄｉｎｇｏｆａｎｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４，ｐｐ．３２９−３３４，１９９６参照）、または、酵素をバイオリアクター中に固定化する方法も、生物工学において極めて重要である。しかし、上述のプロセスに今日まで用いられてきた多イオン性配列は、該配列の相互作用が、多イオン（例えば溶液中のＤＮＡ）の存在により、または種々の溶媒添加物により、有意に妨害されるという欠点を有している。
【０００７】
本発明の目的は、上述した現行技術の欠点を示さない分子物質結合法を提供することである。
これは、本発明によれば、２つ以上の分子物質をアダプターセグメントを介して互いに結合させるための請求項１に基づく方法であって、
１つの分子物質を、アダプターセグメントとして、少なくとも１つの領域で、ＷＷドメインまたはＷＷドメイン由来の構造を示するように修飾し、
もう１つの分子物質を、アダプターセグメントとして、少なくとも１つの領域で、該ＷＷドメインまたは該ＷＷドメイン由来の構造に結合するプロリンに富む配列を示するように修飾し、
上記両分子物質が、相互結合を達成するために、該ＷＷドメインまたは該ＷＷドメイン由来の構造とプロリンに富む配列との会合を介して、互いに相互作用することを特徴とする方法により達成される。
【０００８】
有利な実施形態は従属請求項および以下の説明に示されている。
（説明）
２つ以上の異なる分子物質（分子種）を１つの−通常はヘテロ二官能性の−融合構築物へと結合させることは、生物工学上および医薬上極めて重要な方法である。一般に、本発明による適用例の一部として、タンパク質および／またはペプチドを、結合させる分子種として用いる。というのは、本発明のアダプターセグメントはこの化学種に由来するからである。本発明によれば、本発明のアダプターセグメントの一方を有する他の分子物質も利用可能である。例えば、本発明に従って、特定のアダプターセグメントを介して固体基質に分子物質を装填し得る。多くの場合、両結合物質は互いに安定に共有結合しなければならない。逆に、用途によっては、両分子種間の相互作用が一定期間のみ存在し、例えば外部からの添加物により、急速に再溶解し得るのが望ましい場合もある。さらに他の適用例では、例えば、タンパク質の組換え生産における粗細胞抽出物からのタンパク質の精製のため、またはタンパク質の基質支持された折りたたみのために、分子種を一定期間固定化し、それで、基質と特異的に相互作用させなければならない。そのような適用例に本発明は適している。
【０００９】
本発明によれば、例えば、タンパク質をラッピングするためにウィルス様コートの内部に向けたり、または２つ以上の異なるタンパク質を結合させて、例えば二価抗体として新規な特性を有するキメラタンパク質としたりことができる。同様に、この相互作用は、ある分子種を固定化するため、例えば、その物質を物質混合物から分離するために用いることができる。
【００１０】
ＷＷドメインとプロリンに富む配列との相互作用に基づくアダプターセグメントを介した結合の他に、分子物質同士を共有結合させることもできる。両分子物質中の適当な空間部位に人工的に導入されたシステインを介したジスルフィド架橋によるこの共有結合によって、両分子物質間の永続的な結合が生じ得る。ジスルフィド架橋により、生理条件およびすべての通常の溶媒条件下で安定に存在し、それゆえ医学、治療、診断および生物工学的プロセスにも有用な、二官能融合分子を生成することができる。
【００１１】
上記のような本発明の可能な適用形態は、図１にも例示的に示されている。
本発明に従って２つ以上の分子物質を結合させるために、用語「ＷＷドメイン」として知られているタンパク質セグメントと（２〜６アミノ酸からなる短いペプチド鎖内に５０％を超えるプロリン含有率を有する）プロリンに富むペプチド配列との高特異的相互作用を利用する。これら２つの分子種は、一緒にインキュベートすると、互いに対して非常に強い相互作用（Ｋ_D２０〜１００ｎＭ）を示す。両パートナーが徐々に解離するのは、この相互作用が最初は一時的にしか有効でないということである。これが望ましくない場合、ジスルフィド架橋を用いて結合パートナーを固定することにより解離を防ぐことができる。両アダプターセグメントまたはアダプターセグメント領域内の適当な空間位置にシステインを人工的に導入する。パートナーが会合した後、適当な酸化還元条件を選択してシステイン対を酸化することが可能であり、このようにして、パートナー同士を永続的に共有結合させる。生成するハイブリッド融合タンパク質は、基礎をなすそれぞれの分子種本来の特性を示し得る。
【００１２】
ＷＷドメインは、小さな球状のタンパク質ドメインであり、通常、３０〜４０アミノ酸からなる（Ｍ．Ｓｕｄｏｌ，ＴｈｅＷＷＤｏｍａｉｎＢｉｎｄｓＰｏｌｙｐｒｏｌｉｎｅｓａｎｄｉｓＩｎｖｏｌｖｅｄｉｎＨｕｍａｎＤｉｓｅａｓｅｓ，Ｅｘｐ．＆Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２８，ｐｐ．６５−６９，１９９６参照）が、もっと短い変異型も知られている。ＷＷドメインは、プロリンに富むリガンドに対して高い天然親和性を示し、２０〜１００ｎＭの解離定数で結合する。プロリンに富むリガンドは、５０％を超えるプロリン含有率を有する５〜１５アミノ酸セグメントと結合するのに必要な最小の長さを有し、その結果、通常、（５０％を超えるプロリン含有率を有する）２〜６アミノ酸の局所セグメント内で直接相互作用が起こる。そのために、天然リガンドは、ほとんどが、アミノ酸配列中にプロリンに富むセグメントを含むタンパク質であるが、プロリンに富むペプチドもＷＷドメインの特異的リガンドである。
【００１３】
ＷＷドメインという名称は、２つの保存されたトリプトファン残基（ＷＷと略記）が２０〜２２アミノ酸間隔で出現し、そのために、第２トリプトファンと、主として同様に保存された一連の疎水性アミノ酸とがプロリンに富むリガンドの結合ポケットを形成するという知見に由来する。保存されたプロリンは、第２トリプトファンの後に２アミノ酸間隔で位置することが多い。一連の異なるＷＷドメインタイプが公知であり、これらは、現在、４つのクラスに分類され、特に選択的に結合する消化性リガンド（ｐｅｐｔｉｃｌｉｇａｎｄｓ）に関して互いから区別される。ＷＷドメインは、原理上は、プロリンに富むリガンドと結合するために（構造的に関連のない）ＳＨ３−ドメインと競合し得るが、ＳＨ３−ドメインのリガンドはズレた共通配列を示し、その結果、ＷＷドメインが特異的に結合したプロリンに富むペプチドリガンドを得ることができる。さらに、ＷＷドメインとプロリンに富むリガンドとの結合は、通常、ＳＨ３ドメインの結合より強い。以下の表はＷＷドメインタンパク質のタイプおよびリガンド結合能力を示している。
【００１４】
【表１】

タイプＩのＷＷドメインからタイプＩＩのＷＷドメインへの変換と、その結果としてのプロリンに富むペプチドに関する特異性の変化は、例えば、タイプＩＷＷドメイン配列中のアミノ酸Ｌ１４ＷとＨ１６Ｇを交換することにより達成し得る。クラスＩ由来の作用物質（Ｙｅｓ会合タンパク質、ＹＡＰ）の構造は、このＷＷドメインが、βシートを構成する３つのβ鎖からなることを示している（Ｍ．Ｍａｃｉａｓ，Ｍ．Ｈｙｖｏｎｅｎ，Ｅ．Ｂａｒａｌｄｉ，Ｊ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｍ．Ｓｕｄｏｌ，Ｍ．Ｓａｒａｓｔｅ＆Ｍｒ．Ｏｓｃｈｋｉｎａｔ，ＴｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅＷＷＤｏｍａｉｎｉｎＣｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈａＰｒｏｌｉｎｅ−ＲｉｃｈＰｅｐｔｉｄｅ，Ｎａｔｕｒｅ３８２，ｐｐ．６４６−６４９，１９９６参照）。リガンド結合ポケットは、保存された第２トリプトファンの協力を得てβシートの第２β鎖から形成される。
【００１５】
ＷＷドメインの最も重要な生物学的役割が細胞内シグナルトランスダクションにあることは明らかである。さらに、ＷＷドメインは、多くの疾患、例えば、遺伝性リドル症候群、筋ジストロフィーおよびアルツハイマー病に直接または間接に関与することが示唆されている。したがって、ＷＷドメインは、一連の治療計画の標的である。最後に、ＷＷドメインは、腎臓の胚成長およびレトロウィルスの細胞内生活環においてある種の生物学的役割を果たしている。
【００１６】
驚くべきことには、本発明の一部として、ＷＷドメインが、それらの元の分子環境から分離され、他のタンパク質、例えば、ウィルスコートタンパク質中に、または、場合により他のタンパク質と遺伝子融合されても、通常の溶媒条件下で安定な構造（折りたたみトポロジー）を形成し得ることが見出された。これは、例えば、上記条件下に安定な構造（折りたたみトポロジー）を形成する、わずか３１アミノ酸の異常に小さいサイズのホルミン結合タンパク質クラス由来のＷＷドメインに適合する。注目すべきは、有利な条件下でＷＷドメインをアミノ酸セリンおよびグリシンからなるリンカーセグメントと共にタンパク質の外部ループに導入しても、明らかにその折りたたみを妨害しないし、それによってＷＷドメインの結合能力にも悪影響を与えない。これは、例えば、アミノ酸を特定の位置でシステインと交換したＷＷドメインの変異型にも適合することが分った。また、例えば、各ＷＷドメインの結合への貢献度が合算されるか、もしくは有利な場合には、相乗作用する数個の連続して連なるＷＷドメイン、短縮もしくは延長されたＷＷドメイン、または、所望の用途に応じて、例えば、プロリンに富む配列に天然タンパク質ドメインより強くもしくは弱く結合し得る個々のアミノ酸の部位特異的交換を含むＷＷドメインのような、ＷＷドメイン由来の追加構造にも有効であり得る。そのような変性ドメインは、例えば、現行のファージディスプレイ技術を用いた相互作用スクリーニングによって得ることができる。
【００１７】
挿入された（すなわち、宿主タンパク質のポリペプチド鎖内の適当なループ領域に導入された）ＷＷドメインまたは融合された（それぞれ、宿主タンパク質のＮ末端および／もしくはＣ末端に位置する）ＷＷドメインを有するタンパク質は、プロリンに富む配列に対して高い親和性を示す。したがって、これらのプロリンに富む配列は、他のタンパク質、ペプチド、または他の分子物質と融合され得る。さらに、付加された相互作用パートナー（ＷＷドメインおよびプロリンに富む配列）を用いて、２つの任意の分子種を接触させることができる。この会合は、第一に、ＷＷドメインとプロリンに富むリガンドによって仲介される疎水性相互作用に依存する。しかし、この相互作用は、例えば、ＷＷドメインとプロリンに富むリガンドとの間にイオン相互作用を生じさせるか、または共有結合を導入することにより、特異性をより高めかつよりフレキシブルに使用できるように調整することができる。このように、異なる電荷を有する追加のアミノ酸を配置するか、またはアダプターセグメント中またはその近くで点変異を行うことにより、プロリンに富むリガンドとＷＷドメインとの会合を強化またはより特異的に設計することができる。さらに、両成分の共有ジスルフィド架橋により、アダプターセグメントとそれに結合した分子物質との永続的かつ強固な結合が可能になる。
【００１８】
本発明によれば、３つ以上の分子物質を互いに結合させることもできる。
この研究の一部として、解離定数（ｋ_D）などの相互作用の速度論的パラメーターを、表面プラズモン共鳴測定に基づく相互作用測定により決定し得る。それにより、ＷＷドメインとプロリンに富むペプチド配列との相互作用が本発明に記載の適用例に基本的に適していることが分る。
【００１９】
アダプターセグメントの相互作用の性質により、ＷＷドメインを含む部分とプロリンに富む配列を含む部分とからなるへテロマーハイブリッド種だけが生成する。ホモ官能分子（ホモダイマー）の形成を排除し得る。同等な特性を有する他の系に比べ、利用されるＷＷドメインは、並外れて小さくかつコンパクトであるという利点を有する。そのために、ＷＷドメインは、多くの用途、例えば、抗原抗体相互作用を得るのに、他のリガンド結合ドメイン（例えば、リポカリンおよびアンチカリン）よりも明らかに優れている。
【００２０】
さらに、ＷＷドメインとプロリンに富む配列との相互作用の他に、ＷＷドメイン内およびプロリンに富む基質内の特定の位置にシステイン残基を導入して、会合パートナーを共有結合させ、その結果として、融合したタンパク質部分をアダプターセグメント上で安定した結合状態にし得ることも分った。したがって、不利な条件下、例えば、極高もしくは極低塩濃度条件下、または生理的極限温度下においてさえ、相互作用パートナーの解離は生じ得ない。これについて、例えば、Ａｓｐ８位（番号付けはホルミン結合タンパク質ＦＢＰ１１由来のＷＷドメインに従う）またはＬｙｓ１９位でシステインとの交換を行う。これらの位置はただ例として選択されたものであり、ＷＷドメインもしくはその周囲の他の部位に、またはプロリンに富む配列もしくはその周囲に、特定のシステインを導入することも有用でありかつ首尾よく行うことができる。
【００２１】
その特定の利点は、この場合も、ヘテロ二官能種（ヘテロダイマー）のみが形成されるという点にある。というのは、プロリンに富むペプチドとＷＷドメインとの強い相互作用により、先ず、これら２つのアダプターセグメントの会合体のみが形成され得るからである。さらに、その後、酸化条件下のジスルフィド架橋により、共有架橋へテロマー種の形成が誘導される。会合形態のシステインの濃度局所的に高い（推定）ため、弱還元条件下でも、ジスルフィド架橋を、首尾良く、しかも個々の特異性を失わずに行い得る。それに対し、偶発的なジスルフィド架橋の場合、すなわち、アダプターセグメント同士に必要な強い親和性が無い場合（すなわち、本発明による適用例ではない場合）、酸化条件下に副生成物として両相互作用パートナーの望ましくないホモダイマーも形成されるであろう。
【００２２】
本発明に記載されている方法は、溶液中（ｉｎｖｉｔｒｏ）で任意の相互作用パートナーを結合させるのに適しており、両パートナーを一時的に結合させることも永続的に結合させることも可能である。同様に、本発明の方法は、物質混合物から、２つのアダプタータイプ（ＷＷドメインまたはプロリンに富む配列）のうちの一方を有するタンパク質、ペプチドまたは他の分子物質を特異的に分離するのに利用し得る。これは、各相互作用パートナーを共有結合させた基質に可逆的に結合させることにより行う。ストリンジェントな溶媒条件下に、分子がさらにこの基質にも結合するほど強力な結合が生じる。この方法によって、例えば、細菌または真核細胞の粗細胞抽出物から組換えタンパク質を高速かつ効率的に精製し得る。但し、（精製する）組換え分子が、融合状態または挿入体として２つのアダプターセグメント（ＷＷドメインまたはプロリンに富む配列）の一方を有し、対応アダプターセグメントが固相に固定化されていることを条件とする。
【００２３】
さらに、この固定化法は、基質上の固定化タンパク質の特定の修飾や、会合プロセスを防止する該タンパク質の折りたたみを実施するのに適している。最後に、本発明に関して、例えば、バイオセンサーまたはバイオリアクターにおいて、分子物質の簡単かつ安定した固定化が主要な役割を果たす適用例も可能である（Ｒ．Ｓ．Ｐｈａｄｋｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓａｎｄｅｎｚｙｍｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ，Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ２７，ｐｐ．２０３−２０６，１９９２；Ｍ．Ａｂｄｕｌ−Ｍａｚｉｄ，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓａｎｄｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｅｎｚｙｍｅ／ｃｅｌｌｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ．Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）１１，ｐｐ．６９０−６９５，１９９３参照）。
【００２４】
本発明の方法には、タンパク質やペプチドの他に、他の物質を用いることもできる。したがって、ペプチド誘導体、ペプチド系抗生物質、蛍光標識、アルキル化、アセチル化などの修飾側鎖を有するタンパク質、チオール含有物質を含むジスルフィド混合物、および類似の変化を同様に用いることができる。この方法には、炭水化物、核酸または脂質部分を有するペプチドまたはタンパク質共役体も利用し得る。例えば、化学的手段を用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイムなどの核酸、例えばペプチド核酸などの合成核酸、またはそれらのハイブリッドも同様にアダプターセグメントと結合させ得る。さらに、それらは、類似の相互作用パートナーと相互作用させるのにも適している。唯一の要件は、利用されるアダプターセグメントの１つに安定に付着することである。
【００２５】
本発明に従う適用の範囲内で、特に、抗体、抗体類似物質、酵素、構造タンパク質、およびウィルスまたはファージのキャプソマーはタンパク質とみなされる。
【００２６】
プロリンに富む配列もしくはＷＷドメインまたはそれらに由来する構造の、分子物質中への挿入または付着は、それによってＷＷドメインの構造が実質的に影響を受けない限り、分子物質のどの部位でも行うことができる。適切な場合、タンパク質ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０について実施例１に記載されているように、適当なリンカーセグメントを利用して付着または挿入を実施すると有利であり得る。タンパク質中に挿入する場合、αへリックスまたはβシートのような周期的二次構造成分が存在しないようなタンパク質構造領域を求めるのが適当である。ＷＷドメインまたはプロリンに富む配列をタンパク質構造に挿入する場合、通常の定義のターン領域またはランダムコイル領域が存在するところで行うと最も有利である。
【００２７】
異なる物理的相互作用の局面下では両アダプターセグメント同士の結合を検討し得る。したがって、以下の実施例７に示されているように、相互作用が安定化している間は疎水的作用が相互作用を支配し得る。しかし、イオン相互作用、イオン−双極子相互作用、双極子−双極子相互作用、水素架橋結合、ファンデルワールス力または分散力などの他の形態の相互作用も結合に貢献し得る。最後に、非共有結合に関する上述の実施例の他に、両分子物質を共有結合させることもできる。それによって、相互作用パートナーの２つの原子間に、好ましくは２つの関与システイン側鎖のジスルフィド架橋形態の化学的に安定な原子結合が生成される。
【００２８】
アダプターセグメントの一方（ＷＷドメインまたはプロリンに富む配列）を固定化するために、例えば、プロリンに富む配列もしくはＷＷドメインのＮ末端を介して（基質のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを介した結合）、またはプロリンに富む配列もしくはＷＷドメインに含まれるシステインのうちの１つのチオール基を介して（ヨードアセトアミド基を介した基質の結合）、基質を装填し得る。基質としては、現行技術に基づけば、例えば、アガロースおよびアガロース誘導体、アガロースビーズ、セファロース、デキストラン、炭水化物、または同様の高分子物質が考えられる。
【００２９】
本発明の適用例を以下の実施例に示すが、本発明の保護範囲はそれらに限定されるわけではない。
以下の図面を、以下の説明および実施例に関して参照する。
図１は本発明の略図である。プロリンに富む物質とＷＷドメインとの相互作用に基づくアダプターセグメントならびにそれに由来する形態を用いる。（ａ）アダプターセグメントを介した２つの分子種ＡとＢの結合。（ｂ）（ａ）と類似であるが、両パートナーを共有結合させるためにさらにジスルフィド架橋させた２つの分子種ＡとＢの結合。（ｃ）アダプターセグメントを介した分子物質の基質への固定化（一方の分子は基質または基質の一部を表す）。アダプターセグメントは分子の末端に付着させてもよいし、挿入体の形態で結合させてもよい。
【００３０】
図２は、（ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ポリオーマウィルスタンパク質ＶＰ１の異なる変異型、ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ−２４９Ｃ変異型（野生型タンパク質と同等）、およびＷＷドメインが１５０位アミノ酸に近接するループ中に挿入されたＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０変異型のタンパク質質量および精製効率の比較を示す。これらの変異型の生産および精製は実施例１に包括的に記載されている。両変異型に関しては、通常、分子量が小さい方のタンパク質の分解産物の出現が認められる。（ｂ）ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０変異型およびＰＹＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃ変異型の円二色性スペクトル（ＣＤ）。１５０位に挿入されたＷＷドメインは天然の折りたたみを示し、それによってＣＤ−スペクトル中のβシートの割合が高くなる。
【００３１】
図３は、実施例２による、センサーチップ上でのＰｙＰＶ１−ＷＷ１５０と固定化されたプロリンに富むペプチドとの結合を示す。表面プラズモン共鳴に基づく３つの測定値は、それぞれ複合生理的混合物質を表す（ｂ）および（ｃ）に溶媒添加物を用いても、相互作用の親和性および特異性に極くわずかな影響しか及ぼさないことを示している。（ａ）標準溶媒条件下のＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０のセンサー表面への結合。（ｂ）ランニングバッファーとしてダルベッコのＰＢＳを用いた場合のＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０のセンサー表面への結合。（ｃ）生物学的関連物質混合物のモデルとしてウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した場合のＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０のセンサー表面への結合。
【００３２】
図４は、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０のプロリンペプチド含有基質への特異的結合を示すためのＳＤＳゲルを示す。レーン１：（実施例１におけるように精製した）ＶＰ１−ＷＷ１５０の適用；レーン２およびレーン３：異なる洗浄液分画；レーン４およびレーン５：溶離緩衝液中に１％ＳＤＳを含む溶離液分画；レーン６：１０ｋＤａ分子量マーカー。この実施例は、ＷＷドメイン含有タンパク質を基質上に可逆的に固定化し得ることを示している。検出されたＰｙＶＰ１変異型の二重バンドは、天然タンパク質と、通常すべての試料に現われるタンパク質のタンパク質分解産物とを示している。
【００３３】
図５は、ＷＷドメインがＶＰ１中に挿入され、キャプシド表面に露出された状態の、ウィルス様キャプシド表面へのプロリンに富むペプチドの結合を示すためのゲルろ過（ＴＳＫゲルＧ５０００ＰＷＸＬ、トーソーハース社）を示す。キャプシドへのＷＷ１５０タンパク質の組み立ては、実施例４に示されている条件下で起こる。プロリンに富むペプチドは、ウィルス様キャプシド上に結合させることが可能であり、これは、プロリンに富むペプチドに結合させた染料の比吸収により確認される。図５ａ：２６０および２８０ｎｍでの吸収によるキャプシド形成の検証；キャプシドは６〜８ｍｌの体積で溶出し、会合しなかった遊離ペンタマーは９〜１０ｍｌで出現する。図５ｂ：４９０ｎｍでの蛍光標識ペプチドの吸収；溶出はキャプシドの溶出およびペンタマーの溶出と同時に６〜１０ｍｌで起こる。１０ｍｌを超えると、過剰な遊離ペプチドが蛍光染料と共に溶出する。図５ｃ：結合しなかった遊離ペプチドは、基質との相互作用を示さず、１０ｍｌを超えるとほとんど溶出する。図５ｄ：結合ペプチドとキャプシド分画との同時溶出を示するための、図５ａおよび図５ｂのクロマトグラムの重ね合わせ。
【００３４】
図６（ａ）は、変異型ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ１およびＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ［Ｎ−１４］の精製を示す。ＳＤＳゲル（１２％）は、ＷＷドメインを含まないＰｙＶＰ１タンパク質（レーン２）、実施例１のＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０変異型（レーン３）と、実施例７の両変異型（レーン４およびレーン５のＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ１、レーン６のＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ［Ｎ−１４］）を示す。レーン１およびレーン７は標準分子量（１０ｋＤａラダー）である。（ｂ）ＧＦＰ変異型ＧＦＰ−ＰＬＰの精製およびＳＤＳゲル（１５％）上での図。レーンＭ、分子量マーカー（１０ｋＤａラダー）；レーンＩｎｔ、インテインアフィニティーカラムの洗浄液分画；分画１〜９、ＧＦＰ−ＰＬＰ−タンパク質の種々の溶出分画。
【００３５】
図７は、ポリオーマウィルスＶＰ１変異型に基づくウィルス様コート内部への分子物質のパッケージングを示す。（ａ）ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ１を含むコートの内へのＧＦＰ−ＰＬＰのラッピング。ＧＦＰ−ＰＬＰは６倍モル過剰の標準条件下での会合前に添加する。キャプシド分画（９ｍｌで溶出）をＰｙＶＰ１変異型の非会合遊離ペンタマーおよびＧＦＰタンパク質（１１から１３ｍｌ）から分離するゲルろ過実験（ＴＳＫゲルＧ６０００ＰＷＸＬ、トーソーハース社）が示されている。ＷＷドメイン／ポリプロリン相互作用を介してキャプシド内部に向けられた検出可能量のＧＦＰがキャプシド分画に存在する。（ｂ）ＰｙＶＰ１−３Ｃ−［Ｎ−１４］−ＰＬＰ（短縮Ｎ末端のプロリンに富む配列）から組み立てられたＮ末端にＷＷドメインを有するウィルス様キャプシドの内側へのＧＦＰのキャプシド化。（ａ）の実施例と同様に、ＧＦＰ−ＷＷ１をＰｙＶＰ１−３Ｃ−［Ｎ−１４］−ＰＬＰと共にインキュベートし、標準条件下で会合させてキャプシドを生成する。ＷＷドメインに対する親和性により、ポリプロリンペプチドがキャプシドの内部に入る。（ｃ）ウィルス様キャプシド内部への蛍光標識ペプチド（プロリンに富む配列）のキャプシド化。（ａ）の実施例と同様に、このペプチドをＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ［Ｎ−１４］と共にインキュベートし、標準条件下で会合させてキャプシドを生成する。ＷＷドメインに対する親和性により、ポリプロリンペプチドはキャプシド内部に入る。（ｄ）Ｃ末端にプロリンに富む配列を有するＧＦＰのＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ［Ｎ−１４］と組み合わせたウィルス様キャプシド内部によるラッピング。（ａ）の実施例と同様に、ＧＦＰ−ＰＬＰをＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ［Ｎ−１４］と共にインキュベートし、標準条件下に会合させてキャプシドを生成する。ＷＷドメインに対する親和性により、ＧＦＰ−ＰＬＰはキャプシド内部に入る。
【００３６】
図８は、混合物質（この場合細胞抽出物）からのＷＷドメインを含むタンパク質の精製を示すＳＤＳゲルを示す。レーン１：１０ｋＤａ分子量マーカー；レーン２：（ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ１）−インテイン−ＣＢＤ融合タンパク質の粗抽出物；レーン３：流過液；バンド４〜１０：溶離緩衝液中に２％ＳＤＳを含む融合タンパク質の溶離液の種々の分画。この場合、融合タンパク質の固定化は、共有結合したプロリンに富むペプチドを含むカラムを介して行う。粗抽出物をアプライした後、カラムを、２ＭＮａＣｌを含む合計１０カラム体積の緩衝液で洗浄する。融合タンパク質の他に、融合タンパク質由来の分解産物と、ＰｙＶＰ１に結合することが知られている分子シャペロンが検出される。
【００３７】
図９は、アフィニティー精製のためにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合させた、ＷＷドメインを含む分子物質のジスルフィド架橋を示す。架橋には、それぞれ１つの位置でアミノ酸をシステインに交換した２つのＷＷドメイン変異型を用いた。すなわち、一方は、ＷＷドメインの８位のアスパラギン酸をシステインに交換した変異型Ｄ８Ｃ、もう一方は、リシン１９をシステインに置き換えたＫ１９Ｃとした。この場合、分子物質は、分析のために、Ｎ末端のアミノ基を蛍光染料〔オレゴングリーン（ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ）、ＯＧ、モレキュラープローブス社（ＦｉｒｍａＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）〕で標識した、配列ＣＳＧＰ₈ＬＰを含むプロリンに富むペプチドである。ジスルフィド架橋は実施例７に記載のように行った。架橋を分析するために、試料を逆相ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣカラム：ＹＭＣタンパク質−ＲｐＣ₁₈；ランニングバッファーＡ：Ｈ₂Ｏ中０．１％ＴＦＡ、ランニングバッファーＢ：８０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ）にかけた。これらのクロマトグラフによれば、ＷＷドメインと架橋しなかった遊離ペプチドとは互いから分離し得る（溶出時間：ペプチド１２分、ＷＷドメイン２５〜２７分）が、ジスルフィド架橋ペプチドとＷＷドメインはほとんど同時溶出する（２８分）。ペプチドを蛍光標識することにより、ペプチドをＷＷドメインと共に検出することができる。図９（ａ）は、これが、ＷＷドメイン変異型Ｋ１９Ｃには当てはまるが、Ｄ８Ｃには当てはまらないことを示している。その理由は、変異型Ｄ８Ｃのシステインの立体的非接近性にあり得る。この架橋のＷＷドメイン特異性の証拠として、システインを含まないＷＷドメイン変異型を平行実験で分析し、架橋が同様にないことが示された。図９（ｂ）は、ＷＷドメイン変異型Ｋ１９Ｃとプロリンに富むペプチドの共有相互作用を、還元剤（５０ｍＭＤＴＴ）を添加することにより切断し得ることを示している。その後、蛍光発光ペプチドは再び完全遊離した形態で存在する。
【００３８】
（実施例１）
ｉｎｖｉｔｒｏ会合させたウィルス様タンパク質コートの外側セグメントへのＷＷドメインの挿入（ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０）
最初の実施例では、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ＡｓｐのＷＷドメインをウィルスコートタンパク質の特定のループに挿入する。同時に、ＷＷドメインの前後に、交互に並ぶＧｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸からなるリンカーをさらに挿入する。この実施例で用いられるウィルスコアタンパク質は、現行技術に基づいて、ｉｎｖｉｔｒｏでウィルス様コートに組み合わせ得る、溶液中のペンタマーポリオーマウィルスＶＰ１コアタンパク質である。このタンパク質の結晶構造に基づいて、１５０位アミノ酸近くの構造内のあるループ領域が、ＷＷドメインの挿入に適している可能性があることが分る。というのは、このループ領域が、ペンタマータンパク質とウィルス様コートとの会合が起こるときに、コートの外側に見出されるからである。
【００３９】
Ｃ末端に融合したインテインドメインとそれに結合しているキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）とを含む融合タンパク質としてＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０の発現および精製を行う。この目的で、先ず、ＩＭＰＡＣＴ−ＳｙｓｔｅｍのベクターｐＣＹＢ２〔ニューイングランドバイオラブス社（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）〕に基づいてプラスミドを構築する。ｐＣＹＢ２のマルチクローニングサイトを介し、制限部位ＮｄｅＩ−Ｘｍａｌ（ニューイングランドバイオラブス社）を用いて、マウスポリオーマウィルスのＶＰ１遺伝子変異型をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅させ、標準法によりクローニングする。
【００４０】
このためのベースとして、配列中にシステインを全く示さないポリオーマウィルス変異型を用いる。野生型タンパク質の６つのシステインは、前以て、通常の突然変異技術を用いてセリンと置き換えた。このＰｙＶＰ１変異型は、そのタンパク質の状態に溶液の酸化還元条件が何の影響も与えないという利点を有している。そのために、この変異型は、多くの適用例において処理し易い。さらに、後で、挿入ＷＷドメインにシステインを導入することにより、ＷＷドメインとプロリンに富む配列との特異的ジスルフィド架橋を達成し得る。他の変異型としては、２４９部位を修飾する。野生型タンパク質の２４９部位に見出されるトレオニンをシステインに置き換える。野生型タンパク質中のこの部位を、現在の技術に基づいて、蛍光染料を用いて標識すると有利であり得る。ペンタマー中での保護的局在により、望ましくない副作用なしに、この部位を標識することができる。用いたポリオーマウィルスＶＰ１変異型は、正確にはＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃと称され、以後、用語ＰｙＶＰ１と略記される。
【００４１】
ＰＣＲ用に、プライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いる：ｖｐ１ＮＩｍｐ（５′−ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣ−３′）、およびｖｐ１ＣＩｍｐ（５′−ＡＴＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＡＡＴＡＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＣ−３′）。このＰＣＲで、Ｇｌｙ３８３−Ａｓｎ３８４という野生型ＶＰ１タンパク質のＣ末端アミノ酸を同時にＰｒｏ３８３−Ｇｌｙ３８４に変換する。というのは、Ｃ末端に局在するアスパラギンはインテイン切断系の切断特性に関して非常に好ましくないからである。いわゆる点変異は、ＰｙＶＰ１タンパク質の本質的特性にさらなる影響を与えない。ｐＣＹＢ２ベクターのｔａｃプロモーターは融合タンパク質を少量発現させるに過ぎず、したがって、融合構築物ＰｙＶＰ１−インテイン−ＣＢＤをｐＣＹＢ２ベクターから分離し、さらなるＰＣＲによりＴ７ｌａｃプロモーターを含む高発現ｐＥＴベクターのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位でクローニングする〔プラスミド：ｐＥＴ２１ａ、ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）．オリゴヌクレオチド：ｖｐ１−ＮＩｍｐ（５′−ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣ−３′）および５′−ＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＣＡＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＧ−３′〕〕。
【００４２】
１４８位アミノ酸と１４９位アミノ酸の間のＰｙＶＰ１の外ループへの挿入体としてのＷＷドメインのクローニングは数ステップで行う。オリゴヌクレオチドＦＢＰ１１−ＷＷａＮ（５′−ＡＴＡＣＴＣＴＴＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＣＡＣＣＴＧＡＴＧＧ−３′）およびＦＢＰ１１−ＷＷａＣ（５′−ＡＴＡＣＴＣＴＴＣＴＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＡＧＧＴＡＧＡＣＴＧ−３′）を用いて、微生物Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）由来のホルミン結合タンパク質１１（ＦＢＰ１１）を含むＤＮＡ断片でＰＣＲを実施する。特に、ＷＷドメインはこの遺伝子配列でコードされる。同時に、これらのオリゴヌクレオチドに、交互に並ぶグリシン−セリンアミノ酸からなる、１個当たり５アミノ酸の短いリンカー配列を挿入する。上記ベクター上での２回目のＰＣＲにより、オリゴヌクレオチドｖｐ１ＮＩｍｐ（上記参照）およびｖｐ１−１５０−ＷＷａＣ（５′−ＡＴＡＣＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＧＣＧＧＣＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＡＧ−３′）を用いて、ＰｙＶＰ１のアミノ酸１とアミノ酸１４８の間のＮ末端断片を増幅する。最後に、３回目のＰＣＲで、オリゴヌクレオチドｖｐ１−１５０−ＷＷａＮ（５′−ＡＴＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＴＣＧＧＴＴＴＧＴＴＧＡＡＣＣＣＡＴＣ−３′）およびｖｐ１ＣＩｍｐ（上記参照）を用いて、さらにＰｙＶＰ１のアミノ酸１４９とタンパク質のＣ末端の間のＣ末端断片をさらに増幅する。
【００４３】
その後、全３回のＰＣＲ産物をＩＩＳ型制限酵素ＥａｍＩ１０４Ｉ〔ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）〕で消化する。アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ、ニューイングランドバイオラブス社）を用いて、ＰｙＶＰ１のＮ末端およびＣ末端断片（ＰＣＲ産物２および３、上記参照）を脱リン酸化し、調製された３つのＰＣＲ断片から以下の連結反応ステップで、以下の配列：（ＰｙＶＰ１−Ｎ末端）−ＷＷドメイン断片−（ＰｙＶＰ１−Ｃ末端）を用いて遺伝子配列を作成する。その後、オリゴヌクレオチドｖｐ１ＮＩｍｐおよびｖｐ１ＣＩｍｐ（上記参照）を用いたＰＣＲにより、以後、用語「ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０」と略記される、３つの断片の連結反応産物を増幅する。次いで、標準法を用いて、ＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ−平滑末端〔インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）〕にクローニングし得る。制限酵素ＮｄｅＩ−Ｓｍａを用いて、クローニング断片ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０を切断した後、上記プラスミドｐＥＴ２１ａ中で最終クローニングを行うことができる。
【００４４】
最後に生成したベクターにより、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞〔ｍｆｒ．：ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）〕中で、高発現Ｔ７ｌａｃプロモーターを用いて、融合タンパク質（ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０）−インテイン−ＣＢＤを発現させ得る。この目的で、それぞれ２リットルのＬＢ培地を入れた５リットルの三角フラスコ中で、形質転換細胞を、培養細胞のＯＤ₆₀₀が２．０〜２．５に達するまで３７℃で培養する。タンパク質発現は、培地中の１ｍＭＩＰＴＧにより誘導する。その後、培養細胞を１５℃でさらに２０時間インキュベートする。低温によって、ｉｎｖｉｖｏ条件下の融合タンパク質中のインテイン部分の開裂が最小限になる。細胞を遠心して収穫し、７０ｍｌの再懸濁緩衝液〔２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）グリセロール、ｐＨ８．０〕中に溶解させ、高圧ホモジナイゼーションにより溶菌する。粗抽出物を４８，０００Ｇで６０分間遠心した後、透明な細胞抽出物を得る。この抽出物を、１０℃の温度下に、０．５ｍｌ／分の流量で、１０ｍｌキチンアフィニティーカラム（ニューイングランドバイオラブス社）に注入する。その後、カラムを、３カラム体積の再懸濁緩衝液、高イオン強度を有する１５カラム体積の洗浄緩衝液〔２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）グリセロール、ｐＨ８．０〕、次いで、再び３カラム体積の再懸濁緩衝液で洗浄する。それによって、キチンマトリクスから、望ましくないＥ．ｃｏｌｉ宿主タンパク質がすべて除去される。
【００４５】
それぞれ５０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭヒドロキシルアミン、または３０ｍＭＤＴＴと、３０ｍＭヒドロキシルアミンを含むパルス再懸濁緩衝液（３カラム体積）中で、自己切断インテイン活性による融合タンパク質からのＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０モノマーの開裂が引き起こされる。この目的で、装填したキチン基質を一方の指示溶液と共に１０℃で１４時間インキュベートする。それによって、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０タンパク質は完全に遊離し、カラムクロマトグラフィー標準法を用いて、キチン基質および基質に付着している融合タンパク質の残留成分から分離することができる。そのためには、０．１〜２．０ＭＮａＣｌの濃度の線形塩勾配を用いるのが適当である。キチン基質の再生は、製造業者の指示に従って、キチン物質を３カラム体積のＳＤＳ含有緩衝液〔再懸濁緩衝液中１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）〕で洗浄して行う。
【００４６】
記載した方法において、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０タンパク質は可溶性ペンタマーとして現れ、かつ天然である。図２ａは、野生型ＰｙＶＰ１（またはそれ由来の変異型ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃ）および追加挿入されたアミノ酸のせいで高分子量を示すＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０変異型の精製分画に関するＳＤＳゲルを示している。図２ｂは、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．２中の生産タンパク質の比較し得るＣＤスペクトルを示しており、それは、これらのタンパク質種の正しい折りたたみを示している。現行技術による両ＣＤスペクトルのデコンボルーションが示すに、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０ドメインの場合には、ＰｙＶＰ１タンパク質のものに比べてβシート構造の増大が認められ得る。これは、挿入されたＷＷドメインがそのβシートとしての天然構造を維持していることを示唆している。
【００４７】
驚くべきことに、この実施例は、ＷＷドメインを、適当な条件下で、それらの天然構造を実質的に乱すことなく、タンパク質構造のループ領域に正しく折りたたまれた状態で挿入し得ることを示している。溶液中のペンタマーになっているＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０タンパク質は、ポリペプチド鎖内に挿入された天然ＷＷドメインを含み、組み立て後には、それらをウィルス様コートの外側に提示する（実施例２参照）。
【００４８】
（実施例２）
ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０の性質の特性決定
実施例１により、人工挿入されたＷＷドメインを含むタンパク質（ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０）を生産することができる。ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０のプロリンに富むリガンドに関する結合能力は種々の方法で特性決定し得る。このための有利な方法が、表面プラズモン共鳴によって提供される。この実施例では、装置ＢｉａｃｏｒｅＸ〔ビアコアＡＢ社（ＢｉａｃｏｒｅＡＢ）〕を用いる。製造業者の指示に従って、配列ＣｙＳ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏの合成ペプチドを、チオールまたはアミノ結合により、ＣＭ５型センサーチップに結合させる。この方法では、先ず、８０共鳴単位量の指示ペプチド（ＲＵ）を表面に固定化する。以下の測定は、常に、２５℃下に２０μｌ／分の流量で行う。
【００４９】
種々の溶媒条件下に固定化されたプロリンに富むペプチドを用いてＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０とセンサーチップとの結合研究を実施する。最初の測定は、標準溶媒条件下に、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２を用いて行う。ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０のタンパク質濃度を、５〜５０ｎＭの範囲で変化させる。図３ａにおいて、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０が高親和性をもってセンサーチップに結合するのは明らかである。結合能力は、予測されたように、利用されるタンパク質濃度に比例する。それによって、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０の会合定数Ｋ_Dが５ｎＭの値を有することが確認される（図３ａ）。この図からさらに明らかなように、結合は永続的ではなく、タンパク質はセンサー表面に装填された後ゆっくり解離する。これは、相互作用パートナーの相互作用が可逆的であることを示している。
【００５０】
生理的イオン強度条件下の結合をテストするために、２回目の測定用の溶媒としてダルベッコのＰＢＳ〔ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）〕を用いる。残りの実験条件は、先に記載の最初の実験と同じように選択する。図３ｂは、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０とダルベッコのＰＢＳとの結合が標準条件下の結合（図３ａ）に比べて有意な差を示さないことを証明している。この実験から、会合（Ｋ_on＝２×１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1）および解離（Ｋ_off＝１．８×１０^-3ｓ^-1）に関する結合パラメーターを得ることができる。この実施例は、溶媒条件を変えても、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０とプロリンに富むペプチドとの結合に実質的な影響がないことを示しており、かつ両パートナーの相互作用も生理的条件下に安定に起こることを示唆している。したがって、診断または治療分野内の臨床条件下にこの方法を適用することも基本的に可能である。
【００５１】
結合の特異性を決定するために、３回目の測定におけるランニングバッファーとして１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清、ギブコ社）を含むダルベッコのＭＥＭ培地を用いる。ここで、ＦＣＳは、異なるタンパク質の混合物および生物系に関連する他の物質のモデル系を表す。図３ｃは、これらの条件下においても、センサー表面で、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０タンパク質の有意かつ特異的な結合が認められることを示している。上記両実験におけるように、センサー表面における応答シグナルは、この場合も、導入されたＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０タンパク質の濃度に比例する。さらに、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０と固定化されたプロリンに富むペプチドとの相互作用は、例えば、血清中に見出されるような他の物質の混合物の存在には影響を受けないことが分る。
【００５２】
要約すると、ビアコア技術および固定化されたプロリンに富むペプチドを含むセンサー表面を用いた、これら３種の分析により、ＷＷドメインを含む分子物質とプロリンに富むリガンドとの間の結合が、高い親和性および特異性で起こることを示している。その相互作用は可逆的であり、事実上、選択される溶媒条件には依存しない。解離は、会合に比べて比較的ゆっくり起こり、解離定数は２０ｎＭに位置する。
【００５３】
（実施例３）
基質への固定化
結合能力を特性決定するためのさらなる方法は、ＷＷドメインを不活性基質に可逆的に固定化するものである。この目的で、製造業者の指示に従って、チオール結合を介して、プロリンに富む合成ペプチド（配列Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ）をＳｕｌｆｏＬｉｎｋカラム物質〔ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）〕に結合させる。このようにして修飾した基質をクロマトグラフィーカラムに充填する。こうすることによって、試料を基質上にロードし、異なる条件下で、結合したタンパク質と共に溶出させることができる。実施例１のように精製したＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０タンパク質をカラム（溶媒１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、５％グリセリン、ｐＨ７．２）に加える。図４から明らかなように、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０タンパク質は基質に結合し、洗浄液分画中にほんの僅かな量で現れる。その後、ランニングバッファーに１％ＳＤＳまたは３００ｍＭのアルギニンを添加することにより、基質からタンパク質を溶離することができる。
【００５４】
この実験は、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０タンパク質がプロリンに富むペプチドを担持する基質に可逆的に結合し得ることを示している。それによって、一時的な固定化が起こり得る。ランニングバッファーに添加剤を加えることによって、基質からタンパク質を分離することができる。
【００５５】
（実施例４）
プロリンに富むペプチドのキャプシドへの結合
さらなる実験で、プロリンに富む配列を有する蛍光標識ペプチドのウィルス様キャプシド表面（外側）への結合を調べる。現行技術に基づき、上述のものと類似の条件下にタンパク質の会合体を行う（Ｓａｌｕｎｋｅ，Ｃａｓｐａｒ＆Ｇａｒｃｅａ，ＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｉｎｔｈｅａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎＶＰ１，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５６，ｐｐ．８８７−９００，１９８９参照）。タンパク質を１０ｍＭＨＥＰＥＳ、５０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＣａＣｌ₂、５％グリセリン、ｐＨ７．２に対して透析した後でウィルス様キャプシドを得る。製造業者の指示に従って、フルオレセイン−マレイミド誘導体〔モレキュラープローブス社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）〕を用いて、プロリンに富むペプチドＣｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを特定的にＮ末端のシステインで標識する。ウィルスタンパク質変異型がキャプシドへと組み立てられた後、１０倍モル過剰の蛍光標識ペプチドを加える。ゲルろ過〔カラムＴＳＫＧｅｌＧ５０００ＰＷＸＬ、トーソーハース社（ＴｏｓｏＨａａｓ）〕により、ウィルス様キャプシドコートが明確に検出され、会合しなかった遊離キャプシド成分ならびに過剰なペプチドおよび蛍光染料から分離し得る。キャプシド表面に位置するＷＷドメインに結合したペプチドは、キャプシド分画に溶出し、蛍光染料の比吸収により確認することができる（図５）。
【００５６】
この実施例は、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０変異型が適当な条件下でキャプシド構造（ウィルス様コート）を形成し得ることを示している。これらのキャプシドは、プロリンに富むペプチドに結合し得る。したがって、ＷＷドメインとプロリンに富む配列との特異的かつ強い相互作用により、分子物質をウィルス様構造の表面（外側）に向けることができる。
【００５７】
（実施例５）
ウィルス様タンパク質コート内部へのＧＦＰのパッケージング
この実施例において、アダプターセグメントを有利に配置することにより、分子物質の、ウィルスコート、またはウィルス様コート（キャプシド）内部への局在が生じ得ることが示される。現行技術に基づいて、ポリオーマウィルスＶＰ１の三次元構造のために、タンパク質のＮ末端が、キャプシドへと組み立てられた後では、コート内部に局在することは公知である。そのために、タンパク質の最初の１４アミノ酸は、キャプシドのＸ線構造では検出し得ないので、不要であり得る。したがって、２つの異なるＰｙＶＰ１タンパク質変異型、つまり天然の野生型タンパク質のアミノ末端にＷＷドメインを含むもの（変異型ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ１）または１４アミノ酸だけ短縮したＮ末端にＷＷドメインを有するもの（変異型ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ［Ｎ−１４］）、ならびにＮ末端にプロリンに富む配列を有するＰｙＶＰ１タンパク質変異型（ＰｙＶＰ１−３Ｃ−［Ｎ−１４］−ＰＬＰ）を生産する。これらの変異型のベースは、（変異型ＰｙＶＰ１−ＣａｌｌＳ−Ｔ２４９Ｃに類似した）システインＣ１９およびＣ１１４を含み、かつ特定の新規なシステインが追加導入されたＰｙＶＰ１変異型である。この変異型は、以後ＰｙＶＰ１−３Ｃと略記される。
【００５８】
先ず、ＰＣＲによりＷＷドメインの増幅を実施する。それには、実施例１と同じように、マウスのＦＢＰ１１遺伝子がテンプレートとして役立つ。ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドとしては、５′−ＡＡＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＴＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＧＡＣＴ−３′（境界はＮｄｅＩ）、および５′−ＴＡＴＴＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＣＡＣＣＴＧＡＴＧＧ−３′を用いる。次いで、得られたＰＣＲ産物を、オリゴヌクレオチドにより導入された切断部位ＮｄｅＩ−ＮｄｅＩを介して、融合タンパク質ＰｙＶＰ１−インテイン−ＣＢＤの遺伝子を含み、かつその遺伝子の５′末端に単一のＮｄｅＩ制限部位が見出される、実施例１由来の発現ベクターｐＥＴ２１ａにてクローニングする。このベクターの発現遺伝子産物は、所望のタンパク質ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ１である。それと同じように、実施例１に記載の標準法に基づき、１４アミノ酸を短縮したＰｙＶＰ１−３Ｃの断片（ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ［Ｎ−１４］）を用いてクローニングを実施する。この目的で、５′−ＧＣＧＣＧＣＧＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＣＣＡＡＧＡＣＣＣＧ−３′およびオリゴヌクレオチドｖｐ１ＣＩｍｐ（実施例１参照）を用いて、ＰｙＶＰ１遺伝子断片上でＰＣＲを実施する。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩ−ＳｍａＩで消化し、標準法を用いて、この断片を、実施例１由来のベクターｐＥＴ２１ａにクローニングする。両タンパク質の発現および精製は実施例１に従って行う。図６ａでは、精製されたタンパク質が変異型ＰｙＶＰ１およびＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０と比較されている。図６ａは、これらのタンパク質が可溶性であり、かつ天然に生産し得ることを示している。ＷＷドメインの導入によるＮ末端の変化は、ウィルス様シェル構造を作成するタンパク質の組み立て能力に重要な悪影響を与えない。
【００５９】
類似の方法で、ＧＦＰの生産および精製を行う。ＧＦＰは、天然条件下では緑色蛍光（４９０ｎｍでの吸収極大）を示すタンパク質である。ＧＦＰは、複合体や会合体の標識に好適である。プロリンに富む配列を含むＧＦＰ変異型を生産するためには、先ず、テンプレートとして働くプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１〔クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）〕を用いて、ＧＦＰ遺伝子のＰＣＲに基づく増幅を実施する。同時に、ＰＣＲ産物に適当な制限部位を導入する。ＰＣＲは、オリゴヌクレオチド５′−ＴＴＡＴＴＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ−３′（ＮｄｅＩ切断部位を含む）および５′−ＡＴＡＴＣＴＴＡＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３′（ＡｆｌＩＩ切断部位を含む）を用いて行う。そのようにして得られたＰＣＲ産物を、制限部位にわたって、ベクターｐＴＩＰに入れてクローニングし、そこで発現させる。このベクターｐＴＩＰは、ｐＥＴ２１ａを基礎とし、さらにプロリンに富む配列を導入した、実施例１に記載のインテイン精製ベクターの派生物である。このベクターは、プロリンに富む配列がマルチクローニングサイトに組み込まれた遺伝子の５′または３′末端に選択的に融合し得るように構築されている。したがって、プロリンに富む配列は、主として、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを含んでいる。ＧＦＰ−ＰＬＰタンパク質の生産および精製は、実施例１の方法に従ってキチンアフィニティークロマトグラフィーを用いて行う。ＧＦＰ−ＰＬＰの良好な生産および精製が図６ｂに記載されている。プロリンに富む配列Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを有するＧＦＰ−ＰＬＰタンパク質は、溶液中で大量に生産し得る。同時に、このタンパク質溶液の緑色発光色は、このタンパク質がその天然構造に折りたたみ得ることを示している。
【００６０】
類似の方法でＰｙ−ＶＰ１−３Ｃ−ＰＬＰ異性体の生産を行う。このＰｙＶＰ１変異型を生産するために、ＰｙＶＰ１−３Ｃ−［Ｎ−１４］をベクターｐＴＩＰにクローニングし、その結果、このベクター中に含まれているプロリンに富む配列はＮ末端でＰｙ−ＶＰ１−３Ｃ−［Ｎ−１４］に融合する。
【００６１】
それぞれのＮ末端にＷＷドメインを含む両ＰｙＶＰ１変異型の機能特性を調べるために、両変異型をプロリンに富む配列を含むタンパク質と共にインキュベートする。ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ１タンパク質を、先に生産しておいたタンパク質ＧＦＰ−ＰＬＰ（モル比：１：６）と共に１０分間インキュベート（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、５％グリセロール、ｐＨ７．２）し、０．５ｍＭＣａＣｌ₂を含む緩衝液に対して透析して、ＰｙＶＰ１変異型のキャプシド形成を起こす（実施例４参照）。キャプシドが首尾良く検出できたこと（図７ａ）は、変異型ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ１が適当な条件下では会合に対してコンピテントであることを証明している。ゲルろ過アッセイ（カラムＴＳＫＧｅｌＧ６０００ＰＷＸＬ、トーソーハース社）を用いると、（４９０ｎｍでの比吸収により同定可能な）微量の天然ＧＦＰ−ＰＬＰタンパク質が、（９〜１０ｍｌの溶離量で）キャプシド分画中に含まれていることが分る（図７ａ）。これは、ＧＦＰ−ＰＬＰタンパク質をＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ［Ｎ−１４］変異型と共にインキュベートしている間に、両タンパク質同士の結合が起こり、それによって、その後のキャプシド組み立ての間に、ＧＦＰがウィルス様粒子内部に向けられたことを意味する。
【００６２】
（実施例６）
ウィルス様タンパク質コート内部へのペプチドのパッケージング
実験５と類似の第２実験では、１：１０のモル比で、ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ［Ｎ−１４］を前以て蛍光標識したプロリンに富むペプチドと共にインキュベートする。この場合、ペプチド（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ）の標識は、製造業者の指示に従って、フルオレセインマレイミド（モレキュラープローブス社）を用いて、Ｎ末端システインに対する染料のマレイミド結合により行う。この場合も、実施例５におけるように、ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ［Ｎ＝１４］変異型の会合後には、ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ［Ｎ−１４］が適当な条件下に会合に対してコンピテントであることが分る。さらに、このタンパク質は、プロリンに富むペプチドに結合し、タンパク質コートへの組み立て中に、プロリンに富むペプチドをキャプシド内部に運び得る。これは、図７ｂのゲルろ過で、主としてキャプシドの溶出領域（９〜１０ｍｌ）に見出される、ペプチドに共有結合した蛍光染料の４９０ｎｍでの比吸収により示される。
【００６３】
さらに、ＰｙＶＰ１−３Ｃ−［Ｎ−１４］−ＰＬＰ（Ｎ末端にプロリンに富む配列）およびＧＦＰ−ＷＷ１（Ｎ末端にＷＷドメイン）の変異型を用いて、類似の会合実験を実施し得る。これは、結合させる物質中でＷＷドメインおよびプロリンに富むリガンドを逆に配置する、すなわち、ポリオーマコアタンパク質（キャプシド）上にプロリンに富む配列を配置し、ラップすべきタンパク質上にＷＷドメインを配置することによっても、ＧＦＰをウィルス様コート内部に上手く向けられることを示している。
【００６４】
要約すると、実施例５および６の実験は、Ｎ末端に融合したＷＷドメインを含むＰｙＶＰ１変異型は、プロリンに富む配列に結合し、適当な条件下に、これらおよびその上に配置された任意の分子物質を、キャプシドへの組み立て中に、ウィルス様コート内部へと向け得る。したがって、記載した方法は、ウィルスまたはウィルス様キャプシド内に分子物質を誘導ラッピングさせるのに適している。さらに、Ｎ末端に融合したプロリンに富む配列を含むＰｙＶＰ１変異型がＷＷドメインおよびその上に配置された分子物質に結合し得ることも分った。
【００６５】
（実施例７）
修飾ＷＷドメインおよびプロリンに富むペプチドに基づく共有結合のためのジスルフィド架橋
前の実施例１〜６に記載した研究は、ＷＷドメインとプロリンに富むペプチド配列との相互作用により、両アダプターセグメントの一時的な凝集が起こり得ることを示している。相互作用パートナーの永続的架橋は、適当に配置されると結合パートナーを会合後にジスルフィド架橋させるシステインアミノ酸を両アダプターセグメントに特異的に導入することにより達成し得る。
【００６６】
現行技術に基づく慣用法に従って実施した点変異により、両アダプターセグメントの会合に必須ではない個々のアミノ酸を、ＷＷドメイン内およびリガンドのプロリンに富む配列中で、システインに交換し得る。適当な酸化還元（酸化）条件下に、それぞれ１つ以上のシステインを含む結合したプロリンに富むリガンドとＷＷドメインとの間で特異的ジスルフィド架橋を形成し得る。そのために、ＷＷドメインとリガンドとの相互作用によるこの架橋が好ましいのは明らかである。結合していないＷＷドメインとプロリンに富むリガンドとの一時的な相互作用は、ジスルフィド架橋を介した共有結合を形成するのに十分な期間維持される。このように、両アダプターセグメントの相互作用は、生理的条件下のジスルフィド架橋が、例えば、細胞外空間に存在するときには安定であるために、永続的になる。所望なら、ＷＷドメインとプロリンに富むリガンドとのジスルフィド架橋を、還元条件（例えば、５０ｍＭＤＴＴ、ＤＴＥまたはβ−メルカプトエタノール）下にｉｎｖｉｔｒｏで再び取り外すことができる。還元剤を除去して再結合させることも可能である。
【００６７】
マウスポリオーマウィルスのコアタンパク質ＶＰ１の変異型ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０に基づき、アスパラギン酸アミノ酸（ＷＷドメインに向かって８位）を突然変異誘発によりシステインに形質転換する。得られたシステイン含有変異型は、以後、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０−Ｄ８Ｃと称する。表面プラズモン共鳴に基づく結合研究により、ＷＷドメインのこの変異型が、ジスルフィド架橋を作成しなくても、プロリンに富むリガンドＣｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏに結合することが分る。しかし、相互結合度は、ＰｙＶＰ１−ＷＷ１５０の場合よりいくらか弱い。これは、明らかに新規に導入されたシステインのせいであり得る。この相互作用（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）は、５００ｍＭの硫酸アンモニウムを添加することにより強化し得ることが分る。それによって、プロリンに富むリガンドとＷＷドメインとの疎水性相互作用が強化されるであろう。したがって、相互作用の強度を、溶媒中の硫酸アンモニウムの濃度により調節し得る。
【００６８】
次いで、弱酸化条件下に、プロリンに富むリガンドとＷＷドメインとのジスルフィド架橋の形成を行う。この目的で、硫酸アンモニウムを含み、かつ限定された酸化還元条件を有する緩衝液を用いる。酸化還元条件は、酸化還元緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、１ｍＭＥＤＴＡ、５００ｍＭ硫酸アンモニウム）中に１ｍＭＧＳＳＧおよび５ｍＭＧＳＨを用いることにより達成される。それに関して、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）または還元型グルタチオン（ＧＳＨ）がジスルフィド架橋形成の酸化還元シャッフリング系として機能する（Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｉｎｖｉｔｒｏｆｏｌｄｉｎｇｏｆｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＦＡＳＥＢＪ．１０，４９−５６，１９９６参照）。ジスルフィド架橋形成は１５℃で２４時間実施し、５０ｍＭＴｒｉｓ１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７に対して透析して完了する。最後に述べた条件下では、さらなるジスルフィド交換は起こらず、形成されたジスルフィド架橋は安定である。
【００６９】
要約すると、ＷＷドメインにシステインアミノ酸残基を導入することにより、少なくとも１つのシステインを有するポリプロリンに富むリガンドと、ＷＷドメインとの共有架橋が可能になり、それによって、ＷＷドメインとリガンドとの安定な共有結合が生じる（図９参照）。
【００７０】
（実施例８）
アダプターセグメントを用いたタンパク質の精製（ポリプロリン／ＷＷ−アフィニティークロマトグラフィー）
本発明のさらなる応用領域は、粗抽出物（細胞抽出物）からのタンパク質の精製において通常行われているような、混合物質からの分子物質の分離である。この方法においては、プロリンに富むリガンドに対するＷＷドメインの親和性を調べて、タンパク質の複合混合物（粗抽出物）からＷＷドメインを含むタンパク質を分離する（アフィニティークロマトグラフィーの原理）。この目的で、実施例３におけるようなカラムを用いる。これには、製造業者の指示に従って、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ物質（ピアス社、基質とＳＨ基との反応性は、１０個のＣＨ₂基からなるリンカー末端のヨードアセトアミド基に基づく）を、ペプチドＣｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏとのチオール結合を介して充填する。
【００７１】
同様に、ペプチドと他の基質、例えば、ＡｆｆｉＧｅｌ１０〔バイオラド社（Ｂｉｏｒａｄ）、この基質とＮＨ₂基との反応性は、１０個のＣＨ₂基からなるリンカー末端のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基に基づく〕とをペプチドのＮ末端を介して結合させることも可能である。さらに、このペプチドと、ＣＨ−セファロース４Ｂを基にした基質〔シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、この基質の反応基も同様にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである〕との結合もペプチドのＮ末端で起こり得る。この場合、担体物質に対するプロリンに富むリガンドの共有結合も生じ、それにより、その後のＷＷドメインタンパク質の精製が可能となる。
【００７２】
実施例５由来のＰｙＶＰ１変異型ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ１（ＰｙＶＰ１タンパク質のＮ末端のＷＷドメイン）は、インテインおよびキチン結合ドメインを含む融合タンパク質（［ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ１］−インテイン−ＣＢＤ）として生産された、実施例１由来のものと類似である。しかし、この変異型は、キチンアフィニティークロマトグラフィーを用いた上述の標準法で精製するのではない。その代わりに、細胞抽出物を、細胞破壊し、次いで遠心した後、上記カラムに加える。これには、ランニングバッファーとして、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセリン、ｐＨ８．０を用いる。抽出物をアプライした後、カラムを、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセリン、およびさらに２ＭＮａＣｌを含む、１０カラム体積の緩衝液で洗浄する。この洗浄手順により、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ基質から、吸着された非特異的タンパク質および細胞成分がすべて除去される。その後、２％ＳＤＳを含む緩衝液を用いて、結合した融合タンパク質［ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ１］−インテイン−ＣＢＤの溶離を行う。図８で分るように、融合タンパク質［ＰｙＶＰ１−３Ｃ−ＷＷ１］−インテイン−ＣＢＤの結合は、ＷＷドメインとＳｕｌｆｏＬｉｎｋ基質に固定化されたプロリンに富むペプチドとの相互作用により起こる。それによって、融合タンパク質は基質に結合し、細胞抽出物のほとんどの他のタンパク質は流過時または洗浄プロセス中に除去される。次いで、ＳＤＳによる溶離により、完全ＷＷドメイン含有融合タンパク質と、（ＰｙＶＰ１の場合には、現行技術に基づくすべての同等な生産プロセスにおいて現れる）そのタンパク質分解産物、ならびに、一般的に知られているようにＰｙＶＰ１に直接結合し得るが通常分離し得ない分子シャペロンが溶出する。ＳＤＳを用いて結合したＷＷドメインタンパク質を溶離する代わりに、ランニングバッファー中に３００ｍＭのアルギニンを用いて天然たんぱく質を溶離することもできる。その後アルギニンを除去するために溶出液を透析することにより、精製された天然タンパク質が得られる。
【００７３】
要約すると、この実施例は、上述の系を用いることにより、物質混合物（粗抽出物）から特定の分子を分離、精製し得ることを示している。
（実施例９）
アダプターセグメントを介した分子の特異的二量化
アダプターセグメント（ＷＷドメインおよびプロリンに富むペプチド）の相互作用を用いて、二官能または二価ハイブリッド分子のｉｎｖｉｔｒｏ生産を行うこともできる。そのために、用途に応じて同一または異なる特性を有し、各々が常に共有結合したアダプターセグメントの一方を有する、２つの分子物質が生産される。この選択した実施例では、容易に検出し得るＧＦＰタンパク質ダイマーの生産を行う。
【００７４】
この目的で、ＰｙＶＰ１の生産と同様に、実施例１由来のインテインベースの発現系を用いて、ＧＦＰのＮ末端にＷＷドメイン（ＧＦＰ−ＷＷ１）を有するＧＦＰ変異型（ＧＦＰ−ＷＷ１）を生産する。先ず、オリゴヌクレオチド５′−ＴＡＴＡＧＣＴＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣ−３′および５′−ＧＧＧＡＡＴＴＡＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３′を用い、ベクターｐＥＧＦＴ−Ｎ１（クロンテック社、実施例５参照）でＰＣＲを実施する。ＰＣＲ産物を、切断部位ＮｈｅＩ−ＳｍａＩを介して、挿入部位の３′末端に実施例１に記載のインテインとキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）との融合タンパク質を含む実施例５由来のベクターｐＥＴ２１ａに連結させる。挿入部位の５′側に、実施例５に記載のＷＷドメインが見出される。こうして、配列ＷＷドメイン−ＧＦＰ−インテイン−ＣＢＤを含む融合産物ができる。この融合タンパク質をコードするプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し得る。次いで、実施例１および３と同様に、融合タンパク質の生産および精製を行うことができる。記載されているプロセスを用いて、タンパク質ＧＦＰ−ＷＷ１を精製形態で生産し得る。
【００７５】
これと同じように、Ｃ末端にプロリンに富むセグメント（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ）を有する第２のＧＦＰ変異型を生産する。それに関して、ＧＦＰ−ＰＬＰの生産および精製は実施例５のタンパク質についての記載と全く同じように行う。
【００７６】
その後、両ＧＦＰ変異型を一緒にインキュベートする。それによって、両タンパク質がアダプターセグメントを介して相互結合し、その結果、ＴＳＫ−ＰＷ２０００ＸＬゲルろ過カラム（トーソーハース社）中でのゲルろ過により、ＧＦＰモノマーと区別し得るＧＦＰダイマーが形成される。
【００７７】
この実施例は、本発明に記載の方法を用いて、ＷＷドメインまたはプロリンに富むペプチド配列に基づく適切なアダプターセグメントを有する任意の分子物質の結合を行い得ることを示している。それによって、ホモ官能またはヘテロ官能会合体を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の略図。
【図２ａ】ポリオーマウィルスＶＰ１の変異型。ＳＤＳゲルで分離。
【図２ｂ】ポリオーマウィルスＶＰ１の変異型。近紫外線ＣＤスペクトル。
【図３ａ】センサーチップ上でのＰｙＰＶ１−ＷＷ１５０の結合。
【図３ｂ】センサーチップ上でのＰｙＰＶ１−ＷＷ１５０の結合（ダルベッコのＰＢＳ中）。
【図３ｃ】センサーチップ上でのＰｙＰＶ１−ＷＷ１５０の結合（ダルベッコのＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）。
【図４】特異的結合を示すＳＤＳゲル。
【図５ａ】ゲルろ過。
【図５ｂ】ゲルろ過。
【図５ｃ】ゲルろ過。
【図５ｄ】ゲルろ過。
【図６】変異型。
【図７ａ】パッケージング。
【図７ｂ】パッケージング。
【図７ｃ】パッケージング。
【図７ｄ】パッケージング。
【図８】ＳＤＳゲル。
【図９ａ】ジスルフィド架橋のＨＰＬＣ分析。
【図９ｂ】ジスルフィド架橋のＨＰＬＣ分析。
【配列表】

Claims

アダプターセグメントを介して、２つ以上の分子物質を互いに結合させる方法であって、
１つの分子物質を、アダプターセグメントとして、少なくとも１つの領域で、ＷＷドメインまたはＷＷドメイン由来の構造を示すように修飾し、
もう１つの分子物質を、アダプターセグメントとして、少なくとも１つの領域で、該ＷＷドメインまたは該ＷＷドメイン由来の構造に結合するプロリンに富む配列を示すように修飾し、
前記両分子物質が、相互結合を達成するために、該ＷＷドメインまたは該ＷＷドメイン由来の構造とプロリンに富む配列との結合を介して、互いに相互作用を確立する
ことを特徴とする方法。
結合させる前記分子物質が、会合体を得るためにＷＷドメインおよびプロリンに富む配列を組み込み得る、タンパク質もしくはペプチド；炭水化物、核酸または脂質部分を含むペプチドもしくはタンパク質共役体；ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、例えばペプチド核酸などの合成核酸、あるいはそれらのハイブリッド；またはペプチドおよびタンパク質由来もしくは該ペプチドおよび該タンパク質と共役した複数の物質もしくは複数の分子のハイブリッド；から成ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
結合させる前記分子物質が、会合体を得るためにＷＷドメインおよびプロリンに富む配列を組み込み得る、抗体、抗体類似物質、酵素、構造タンパク質、ウィルスもしくはファージのキャプソマー、ペプチド系抗生物質、孤立構造形成性の、触媒もしくは調節タンパク質ドメイン、タンパク質の断片、ペプチド、ペプチドアナログ、抗原担持物質、糖タンパク質、リポタンパク質、プロテオグリカン、または上記物質の組み合わせから成ることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
分子物質の１つが固相基質分子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
ＷＷドメインが、タンパク質構造のループ領域か、タンパク質もしくはペプチド構造のＣ末端もしくはＮ末端に見出されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
プロリンに富む配列が、タンパク質構造のループ領域か、タンパク質もしくはペプチド構造のＣ末端もしくはＮ末端に見出されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
一方の分子物質として、ウィルスキャプソマーまたはファージキャプソマーを用い、該ウィルスキャプソマーまたは該ファージキャプソマーが、他方の分子物質が前記第１分子物質と結合または会合し、さらなるキャプソマーと共にウィルスキャプシドまたはファージキャプシドへと組み合わさった後で、該ウィルスキャプシドまたは該ファージキャプシドの内部に見出されるようなキャプソマー領域でＷＷドメインまたはプロリンに富む配列を示すことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
一方の分子物質として、ウィルスキャプソマーまたはファージキャプソマーを用い、該ウィルスキャプソマーまたは該ファージキャプソマーが、さらなるキャプソマーと共にウィルスキャプシドまたはファージキャプシドへと組み合わさった後で、該キャプシドの外側に見出されるようなキャプソマー領域でＷＷドメインまたはプロリンに富む配列を示すことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
アダプターセグメント間の結合の他に、ＷＷドメインとプロリンに富む配列との相互作用により、分子物質間に共有結合が形成されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
ＷＷドメインまたはＷＷドメイン由来の構造領域中に１個または数個のシステインを特異的に導入し、かつプロリンに富む配列領域に１個または数個のシステインを特異的に導入することにより、分子物質の共有結合が生じることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
分子物質の結合が不可逆的または可逆的に起こることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
ＷＷドメインおよびプロリンに富む配列を分子物質と共有結合または非共有結合させることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１つ分子物質および／または結合領域を合成することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
ＷＷドメイン由来の構造として、天然ＷＷドメインに比べて短縮されるか、延長されるか、もしくは個々のアミノ酸位置で修飾されるか、または空間的に適当な位置にシステインを含むか、または数個の縦列（タンデム）ＷＷドメインを含む変異型を利用することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
組換え生産ウィルスキャプソマーまたはファージキャプソマーとして、ウィルスまたはファージキャプシド由来の修飾または非修飾モノマー、ダイマーまたはオリゴマー成分を利用することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
アダプターセグメントを介して結合した分子物質であって、
一方の分子物質を、アダプターセグメントとして、少なくとも１つの領域で、
ＷＷドメインまたはＷＷドメイン由来の構造を示すように修飾し、
他方の分子物質を、アダプターセグメントとして、該ＷＷドメインまたは該ＷＷドメイン由来の構造に結合する少なくとも１つのプロリンに富む領域を示すように修飾し、
両分子物質が、相互結合を達成するために、該ＷＷドメインまたは該ＷＷドメイン由来の構造とプロリンに富む領域との会合により、互いに相互作用を確立することを特徴とする分子物質。