JP4132297B2 - オリゴ糖の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、α−Ｌ−フコシダーゼを用いたα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖タンパク質や糖脂質中に含まれる複合糖質の糖鎖の非還元未端あるいは枝分れ部分には、α−Ｌ−フコシル基を含むものが多く見出されている。例えば、植物キシログルカン由来のフコースを含むオリゴサッカライドにエリシター様の活性があることが報告されている。また、Ｌ−フコースを含む複合脂質中の糖鎖は、血液型の型決定基、肝臓への血清糖タンパク質の取り込み、マクロファージ遊走阻止因子の受容体、細胞−細胞相互作用など、さまざまな生理活性を有していると言われている。さらに細胞のガン化に伴い血中のＬ−フコース量が増加することが観察されている。
【０００３】
α−Ｌ−フコシダーゼは糖鎖中のα−Ｌ−フコシド結合を加水分解する酵素であり、複合糖質中の糖鎖の構造解析や、構造と機能との関連あるいは生理活性などを研究する上で、Ｌ−フコースを特異的にはずす酵素試薬として重要な意味を持っている。一方、同様の理由から、α−Ｌ−フコシダーゼのＬ−フコース転移能を利用して、Ｌ−フコースを含むオリゴ糖を人工的に合成することが求められている。しかしながら、フコースを含む糖鎖の合成は一部のものが化学合成法または酵素法によりなされているにすぎないのが現状である。
【０００４】
すなわち、化学合成法においては、水酸基のうちで反応に関与しない水酸基を保護した受容体の１位を活性化し、残りの水酸基を保護した供与体を作用させて縮合反応を行い、反応終了後に保護基を脱離させて目的物を得るという繁雑な工程を必要とする。しかも、工程の数が多いために必然的に収率は低いものとならざるを得ない。
【０００５】
一方、酵素を用いてＬ−フコースを含むオリゴ糖を合成する試みは数多く行われている。例えば、スベンソン（Svensson）およびチエム（Thime）は、ブタ肝臓由来のα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、Ｌ−フコースがα１→２またはα１→６結合したＬ−フコシル−メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを合成している（Carbohydr. Res., 200, 391-402. 1990）。しかしながら、このα−Ｌ−フコシダーゼは酵素活性が低く、またこのα−Ｌ−フコシダーゼを用いてα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造することはできない。
【０００６】
また、微生物由来のα−Ｌ−フコシダーゼを用いてＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造する方法として、特開平５−１３７５８９号公報には、コリネバクテリウム属細菌由来のα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、糖転移反応を行わせることにより、α１→２結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造する方法が記載されている。しかしながら、このα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造することはできない。
【０００７】
さらに、特開平８−２４２８７６号公報には、アルカリジェネス属に属する細菌の生産するα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、糖転移反応を行わせることにより、α１→２結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法が記載されている。しかしながら、このα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造することはできない。
【０００８】
また、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法として、特開平４−９９４９２号公報には、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、糖転移反応を行わせることにより、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法が記載されている。そして実施例において、受容体としてＤ−グルコースまたはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単糖を用いて糖転移反応を行うことにより、Ｄ−グルコースまたはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンにα−Ｌ−フコースがα１→３結合した二糖類（オリゴ糖）を製造している。
【０００９】
しかしながら、上記のα−Ｌ−フコシダーゼは、受容体としてＤ−ガラクトースを用いた場合には糖転移反応は起こらない（Carbohydr. Res., 224, 291-299(1992)）。またラクトースまたは１−Ｏ−メチルラクトース等の二糖類に糖転移反応を行った実施例はなく、α−Ｌ−フコースがα１→３結合した三糖以上のオリゴ糖を製造することはできない。従って、糖転移反応受容体についてはスペクトラムが狭く、生体中での糖鎖の生理活性を明らかにするための試薬としては不向きである。
【００１０】
またペニシリウム・マルチコラー（Penicillium multicolor）由来のα−Ｌ−フコシダーゼ（Carbohydr. Res., 309, 125-129(1998)）も知られているが、このα−Ｌ−フコシダーゼの受容体に対する特異性は、前記特開平４−９９４９２号公報のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のα−Ｌ−フコシダーゼと同じであり、従って糖転移反応受容体についてはスペクトラムが狭く、生体中での糖鎖の生理活性を明らかにするための試薬としては不向きである。
【００１１】
以上のように、α−Ｌ−フコースがα１→３結合した三糖以上のオリゴ糖を合成することができるα−Ｌ−フコシダーゼはこれまで知られておらず、このため糖鎖の構造解析や、生体中での糖鎖の生理活性などを研究する上で必要となるα１→３結合したα−Ｌ−フコースを含む三糖以上のオリゴ糖およびこのオリゴ糖を合成することができるα−Ｌ−フコシダーゼが求められている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、生体中の複合糖質中の糖鎖においてＬ−フコースを含むオリゴ糖は構造上および生理活性上重要な位置を占めており、特にα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は、その新たな生理活性に興味が持たれるところである。従って、糖転移反応受容体の種類や分子量に影響されることなく、Ｌ−フコースを受容体の３位に選択的に糖転移反応させ、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法が求められている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、α−Ｌ−フコシダーゼを用いて、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を効率よく製造することができるオリゴ糖の製造方法を提案することである。
【００１４】
本発明は次のオリゴ糖の製造方法である。
〔１〕 Ｌ−フコースの供与体と、Ｌ−フコースの受容体とを含む溶液に、下記の酵素学的性質を有するα−Ｌ−フコシダーゼを添加して糖移転反応を行う方法であって、前記α−Ｌ−フコシダーゼが、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１６９４４の受託番号で寄託されているアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（ Alcaligenes sp. KSF-9687 ）菌株由来であることを特徴とするα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法。
（１）作用
・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα−Ｌ−フコシド結合を特異的に加水分解し、Ｌ−フコースを遊離する。
・α−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを、受容体である単糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を行い、Ｌ−フコースを含むオリゴ糖を生成する。
（２）加水分解での基質特異性
・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→２またはα１→３結合しているＬ−フコースを加水分解する。
・合成基質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシドを加水分解する。
・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→４またはα１→６結合しているＬ−フコースには作用しない。
（３）糖転移反応での特異性
・α−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを、受容体である単糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を行い、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を生成する。
・α１→２、α１→４またはα１→６結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は生成しない。
（４）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲
・至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０であり、安定ｐＨ範囲は、４５℃で１時間の保持条件においてｐＨ６．０〜９．０である。
（５）至適温度および安定温度範囲
・至適温度は５５℃であり、ｐＨ７．０で１０分間処理した時、５０℃まで安定であり、６５℃以上で失活する。
（６）阻害剤などの影響
・酵素活性は銅、水銀またはパラクロルメルクリ安息香酸により著しく阻害されるが、その他の金属イオン、ＳＨ試薬および糖によりほとんど影響を受けない。
（７）分子量
・ＰＡＧＥにより測定した分子量は約１０２，０００である。
・ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は約５１，０００である。
〔２〕 Ｌ−フコースの供与体がｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシドまたはα−Ｌ−フコピラノシルフルオリドである上記〔１〕記載の製造方法。
〔３〕 Ｌ−フコースの受容体が単糖または二糖以上のオリゴ糖である上記〔１〕または〔２〕項記載の製造方法。
〔４〕 Ｌ−フコースの受容体がＤ−ガラクトース、１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、ラクトースまたはＮ−アセチルラクトサミンである上記〔１〕ないし〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔５〕 製造するオリゴ糖が下記式（１）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトースである上記〔１〕ないし〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
【化７】
〔６〕 製造するオリゴ糖が下記式（２）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−マンノースである上記〔１〕ないし〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
【化８】
〔７〕 製造するオリゴ糖が下記式（３）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースである上記〔１〕ないし〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
【化９】
〔８〕 製造するオリゴ糖が下記式（４）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−ラクトースである上記〔１〕ないし〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
【化１０】
〔９〕 製造するオリゴ糖が下記式（５）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−１−Ｏ−メチルラクトースである上記〔１〕ないし〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
【化１１】
〔１０〕 製造するオリゴ糖が下記式（６）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−Ｎ−アセチルラクトサミンである上記〔１〕ないし〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
【化１２】
（式中、Ａｃはアセチル基である。）
【００１５】
本発明で用いるα−Ｌ−フコシダーゼはアルカリジェネス（Alcaligenes）属に属する菌株から得ることができる。アルカリジェネス属に属する菌株としては、、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１６９４４の受託番号で寄託されているアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株を用いる。この菌株の菌学的性質は次の通りである。
【００１６】
《形態的所見》
（１）細胞の形態、大きさ：桿菌、０．７〜０．８×１．５〜２．５μｍ
（２）多形性：なし
（３）運動性：あり
（４）胞子：なし
（５）べん毛：周ベん毛
（６）グラム染色性：陰性
【００１７】
《生育状態》
（１）肉汁寒天平板培養
集落の形状は円形であり、周縁は平滑で、表面隆起は扁平状である。また、集落の色調は半透明である。
（２）肉汁液体培養
生育し混濁する。
（３）ゼラチン穿刺培養
液化しない。
【００１８】
【００１９】
《その他》
後述する酵素学的および理化学的性質を有するα−Ｌ−フコシダーゼを菌体内および菌体外に産出する。
【００２０】
以上の性質から、Bergey's Manual of Systematic Bacteriologyを参照し、この菌株をアルカリジェネスに属する菌株と同定し、アルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）と命名した。最も類似した性質を示すものとしてアルカリジェネス・デニトリフィカンス（Alcaligenes denitrificans）があげられる。
【００２１】
次に、上記アルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株により生産される本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの酵素学的および理化学的性質について説明する。
（１）酵素の作用
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα−Ｌ−フコシド結合を特異的に加水分解し、Ｌ−フコースを遊離する。またα−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを、受容体である単糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を行い、Ｌ−フコースを含む二糖または三糖以上のオリゴ糖を生成する。
【００２２】
（２）加水分解での基質特異性
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→２またはα１→３結合しているＬ−フコースを加水分解する。また合成基質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド（ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド）を加水分解する。しかし、天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→４またはα１→６結合しているＬ−フコースには作用しない。
【００２３】
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの種々のα−Ｌ−フコシド結合含有基質に対する酵素活性を表１に示した。表１から明らかなように、本発明のα−Ｌ−フコシダーゼはｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドのような合成基質、ならびにα−Ｌ−フコピラノシル−（１→２’）−ラクトース（２′−フコシルラクトース）、α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−ラクトース（３′−フコシルラクトース）などのオリゴ糖およびムチン等の天然基質に作用することが分かる。すなわち、本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは、合成基質中のα−Ｌ−フコシド結合を加水分解し、またオリゴ糖鎖中のα１→２またはα１→３結合しているフコースを加水分解することが分かる。一方、オリゴ糖鎖中および天然高分子基質中のα１→４またはα１→６結合しているＬ−フコースには作用しないことが分かる。なお、表１中の相対活性は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドに対する活性を１００として表示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
（３）糖転移反応での基質特異性
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼが触媒する糖転移反応において、Ｌ−フコースの供与体となる化合物は、α−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを有する化合物である。供与体の具体的なものとしては、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシドまたはα−Ｌ−フコピラノシルフルオリドなどがあげられる。
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼが触媒する糖転移反応において、Ｌ−フコースの受容体となる化合物は、Ｄ−ガラクトース、１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースおよびＤ−マンノースなどの単糖；ラクトースおよびＮ−アセチルラクトサミンなどの二糖以上のオリゴ糖等である。
【００２６】
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼが触媒する糖転移反応では、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖が選択的に生成し、α１→２、α１→４またはα１→６結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は生成しない。すなわち、上記受容体の３位にＬ−フコースがα１→３フコシド結合したオリゴ糖だけが生成する。糖転移反応により生成するオリゴ糖は、二糖以上のオリゴ糖である。例えば、受容体として単糖を用いた場合には、この受容体にＬ−フコースがα１→３結合した二糖のオリゴ糖が生成し、受容体として二糖を用いた場合には、この受容体にＬ−フコースがα１→３結合した三糖のオリゴ糖が生成する。
【００２７】
（４）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲
加水分解および糖転移反応の至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０である。安定ｐＨ範囲は、４５℃で１時間の処理条件の場合、ｐＨ６．０〜９．０である。
【００２８】
（５）力価の測定法
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの加水分解活性の測定は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドを基質として、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液中、５０℃で反応を行い、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）を加えて反応を停止させた後、遊離したｐ−ニトロフェノールの量を４１０ｎｍ吸光度を測定することにより行うことができる。酵素の単位は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素量を１ユニットとした。その他の基質については、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液中、５０℃で３０分間反応を行った後、沸騰浴中３分間加熱して反応を停止し、次に遠心分離し、その上清中の遊離Ｌ−フコース量をシュードモナス由来のＬ−フコースデヒドロゲナーゼを用いて測定することにより行うことができる。あるいは、ピリジルアミノ化により蛍光ラベルした基質および生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析することにより測定することもできる。
【００２９】
また糖転移反応の活性の測定方法は次のようにして行うことができる。すなわち、Ｌ−フコース供与体と、受容体となるオリゴ糖とを緩衝液などに溶解し、この溶液に本発明のα−Ｌ−フコシダーゼを添加し、３７℃付近で反応を行う。反応後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを用いて、反応生成物を確認する。
【００３０】
（６）至適温度および安定温度
加水分解および糖転移反応の至適温度は５５℃である。安定温度範囲は、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液中に各温度で１０分間保温して残存活性を測定した時、５０℃まで安定であり、５５℃で約６０％残存活性を示す。
【００３１】
（７）ｐＨ、温度による失活の条件
６５℃で１０分間の処理により完全に失活する。またｐＨ１１以上において４５℃で６０分間の処理によって完全に失活する。
【００３２】
（８）阻害剤等の影響
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼに対する種々の添加物質の影響について検討したところ、加水分解および糖転移反応において、銅（０．１ｍＭ）、水銀（０．１ｍＭ）またはパラクロルメルクリ安息香酸（０．５ｍＭ）により著しく阻害されたが、その他の金属イオン（１ｍＭ）およびＳＨ試薬（１ｍＭ）によりほとんど影響を受けない。また加水分解反応は、生成物であるＬ−フコース（１ｍＭ）によりほとんど影響を受けない。
【００３３】
（９）精製方法
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの精製は、既知の精製法が単独または併用して利用され得る。本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは菌体内および菌体外に生産されるが、酵素の精製には菌体外酵素を用いる方が望ましい。例えば、培養液を濾過または遠心分離にかけ菌体を除去し、次いで塩析法、各種クロマトグラフ法等を適宜に組み合せて行うことができる。精製法の一例を次に示す。
【００３４】
培養終了後、ストリームライン−ディアエ（ファルマシア製）に菌体を含む培養物を通し、吸着した酵素を溶出する。活性画分を最終濃度１Ｍになるよう硫酸アンモニウムを加え、ブチルトヨパール６５０Ｍカラムに通し、活性画分を溶出する。活性画分を集め、フコース−セルロファインカラムに通し、吸着した酵素を溶出する。活性画分を、一晩透析を行い、ＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ Ｑカラムに通し、活性画分を溶出する。溶出された活性画分はこの時点で電気泳動的に単一バンドを示すが、ポリッシングのためセファクリルＳ−３００ＨＲカラムを用いてゲル濾過を行うこともできる。
【００３５】
（１０）分子量
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの分子量は、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気電気泳動）法により約１０２，０００と測定された。
【００３６】
（１１）ポリアクリルアミド電気泳動
精製されたα−Ｌ−フコシダーゼは、ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動において単一のバンドを示した。また、この時の分子量はそれぞれ１０２，０００、５１，０００と測定された。
【００３７】
以上のような本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは菌体内および菌体外に生産されるため、菌から酵素を得る際には菌体外に生産された酵素を分離するだけで容易に得ることができる。例えば、菌の培養液からα−Ｌ−フコシダーゼを分離するだけで容易に得ることができる。このため、菌体を破砕して活性画分を抽出する操作を必要としないので、工業的生産に適している。また本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは中性付近に至適ｐＨを有し、しかも熱に安定であるので、糖鎖の構造解析や機能の研究に好適に利用することができる。
【００３８】
上記性質をもつ新規なα−Ｌ−フコシダーゼを用いることによって、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法を確立した。本発明によるＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法を以下に詳細に記述する。
本発明のオリゴ糖の製造方法は、Ｌ−フコースの供与体と、Ｌ−フコースの受容体とを含む溶液に、前記本発明のα−Ｌ−フコシダーゼを添加して糖移転反応を行って、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造する方法である。
【００３９】
上記Ｌ−フコースの供与体としては、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシドまたはα−Ｌ−フコピラノシルフルオリドなどがあげられる。これらの供与体は精製品はもちろん、これらの化合物を含む化合物などを用いることもできる。
上記Ｌ−フコースの受容体としては、Ｄ−ガラクトース、１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノースなどの単糖；ラクトースまたはＮ−アセチルラクトサミンなどの二糖以上のオリゴ糖等があげられる。これらの受容体は精製品はもちろん、これらの糖を含む糖などを用いることもできる。
【００４０】
本発明のオリゴ糖の製造方法では、前記本発明のα−Ｌ−フコシダーゼを用いているので、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を選択的に製造することができる。すなわち、本発明のオリゴ糖の製造方法では、α１→２、α１→４またはα１→６結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は生成しない。本発明のオリゴ糖の製造方法で選択的に得られるオリゴ糖は、前記受容体の３位にＬ−フコースがα１→３フコシド結合したオリゴ糖、すなわちα−Ｌ−フコピラノシル（１→３）基を含むオリゴ糖である。
【００４１】
本発明のオリゴ糖の製造方法では、受容体を選択することにより、二糖または三糖以上のオリゴ糖を製造することができる。例えば受容体として単糖を用いることにより、Ｌ−フコースがα１→３結合した二糖のオリゴ糖を製造することができる。また、受容体として二糖を用いることにより、Ｌ−フコースがα１→３結合した三糖のオリゴ糖を製造することができる。
【００４２】
本発明のオリゴ糖の製造方法の好ましい方法として、次の方法が例示できる。まず、リン酸カリウム緩衝液と、ジメチルスルフォキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびアセトニトリル等の水溶性有機溶媒からなる群から選ばれる少なくとも１種の有機溶媒との混合溶液を調製する。この混合溶液に前記受容体および供与体を添加し、２７℃〜６０℃、好ましくは３５℃〜５５℃の間で６時間〜７２時間、好ましくは１８時間〜４８時間反応させる。このときの受容体および供与体の濃度は０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．１重量％〜１０重量％とするのが望ましい。また受容体と供与体との混合比は、重量比で１：１〜２０：１、好ましくは２：１〜１０：１とするのが望ましい。反応温度は２７℃〜６０℃、好ましくは３５℃〜５５℃とするのが望ましい。反応ｐＨは６〜９、好ましくはｐＨ７〜８とするのが望ましい。使用するα−Ｌ−フコシダーゼは精製したほうが好ましいが、粗精製の酵素を使用することもできる。
【００４３】
上記のような方法によりＬ−フコースの糖転移反応を行うことにより、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を選択的に容易に製造することができる。このような方法により製造することができるオリゴ糖の具体的なものとしては、前記式（１）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトース、前記式（２）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−マンノース、前記式（３）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース、前記式（４）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−ラクトース、前記式（５）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−１−Ｏ−メチルラクトース、前記式（６）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−Ｎ−アセチルラクトサミンなどがあげられる。これらはいずれも新規な化合物であり、糖鎖の構造解析、糖の機能の研究および糖の代謝の研究などに有用であるほか、生理活性が期待される。
【００４４】
【発明の効果】
本発明で用いるα−Ｌ−フコシダーゼは天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα−Ｌ−フコシド結合を特異的に加水分解し、しかもα１→３結合したα−Ｌ−フコースを含む三糖以上のオリゴ糖を合成することができるので、糖鎖の構造解析や機能の研究に有用である。
【００４６】
本発明で用いるアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株は、α−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有しており、しかも菌体外にこの酵素を生産するので、この菌株を用いることにより、α−Ｌ−フコシダーゼを容易に製造、精製することができる。
【００４７】
本発明のＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法は、上記α−Ｌ−フコシダーゼを用いて糖転移反応を行っているので、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を容易に製造することができる。
【００４８】
本発明で製造するα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は新規な化合物であり、糖鎖の構造解析、糖の機能の研究および糖の代謝の研究などに有用である。
【００４９】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５０】
実施例１
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド０．０５重量％、グルコース１重量％、ペプトン０．５重量％、カザミノ酸０．２５重量％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１重量％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２重量％および寒天２重量％を含む培地をｐＨ９．０に調整した。また静岡県掛川市より採取した土壌を滅菌水により希釈し、土壌懸濁液とした。この土壌懸濁液を上記培地からなる平板培地上に広げ、３７℃で２日間培養を行った。培養後、培地中の黄色く発色しているコロニーを分離した。このようにしてアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株をスクリーニングした。
【００５１】
実施例２
《α−Ｌ−フコシダーゼの製造》
ペプトン０．５重量％、酵母エキス０．２５重量％、塩化ナトリウム０．５重量％（ｐＨ７．２）を含む培地５００ｍｌにアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株を植菌し、容振とう培養して種培養液とした。次いで種培養と同組成の培地３ literを５ liter容ジャーファーメンター３基に入れ、１２１℃で２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液を接種し、３７℃で２日間、毎分３ literの通気量と毎分３００回転の攪拌速度の条件で培養した。
【００５２】
培養終了後、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化したストリームライン−ディアエカラム（ファルマシア製、５．０×１７ｃｍ）に菌体を含む培養物を通し、吸着した酵素を０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で溶出した。活性画分を集め、最終濃度１Ｍになるように硫酸アンモニウムを溶解した。１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で予め平衡化したブチルヨパール６５０Ｍカラム（東ソー製、２．６×３０ｃｍ）に通し、１Ｍ〜０Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液のリニアーグラジェント法で溶出した。溶出された活性画分を集めて予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したフコースセルロファインカラム（１．６×７．５ｃｍ）に通し、吸着した酵素を５０ｍＭ Ｌ−フコースを含む同緩衝液で溶出した。活性画分を一晩１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析を行った。次に同緩衝液にて平衡化したＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ Ｑ（ファルマシア製）に通し、吸着した酵素を０Ｍ〜０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液のリニアーグラジェント法で溶出した。
【００５３】
この時点で当酵素は電気泳動的に単一バンドを与えるが、ポリッシングのため活性画分を濃縮後セファクリルＳ−３００ＨＲ（ファルマシア製、１．６×６０ｃｍ）を行い、α−Ｌ−フコシダーゼの精製標品７４μｇ（比活性１２６ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、収率２０重量％）を得た。
【００５４】
実施例３
実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼの種々の基質に対する加水分解活性を次のようにして測定した。
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドを基質とした場合は、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液に１００μｌの酵素および２００μｌの基質を加え、５０℃で１５分間反応を行った後、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）を加えて反応を停止させた。次に、遊離したｐ−ニトロフェノールの量を４１０ｎｍ吸光度を測定することにより定量した。その他の基質についてはｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液に１００μｌの酵素および２００μｌの基質を加え、５０℃で３０分間反応を行った後、沸騰浴中で３分間加熱して反応を停止し、次に遠心分離し、上清中の遊離Ｌ−フコース量をシュードモナス由来のＬ−フコースデヒドロゲナーゼを用いて定量した。結果は表１に示した通りである。
【００５５】
実施例４
《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトースの合成》
Ｌ−フコースの受容体としての単糖のＤ−ガラクトース（５００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド（５０ｍｇ）とを、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１０ｍｌ）とジメチルスルフォキシド（１０００μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行った。
【００５６】
得られた反応物を活性炭素カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒を蒸留で留去したところ、非晶性固体を２０．５ｍｇ得た。このときの回収率は１８重量％であった。
【００５７】
この非晶性固体の分子量を測定したところ３２６であった。また1Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られたスペクトルを解析した。得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムを図１に示す。これらの結果から、得られた非晶性固体は前記式（１）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトース（３−フコピラノシル−Ｄ−ガラクトース）であることが判明した。
【００５８】
実施例５
《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−マンノースの合成》
Ｌ−フコースの受容体としての単糖のＤ−マンノース（５００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド（１００ｍｇ）とを、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１０ｍｌ）とディメチルスルフォキシド（１０００μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行った。
【００５９】
得られた反応物を活性炭素カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒を蒸留で留去したところ、非晶性固体を１０．３ｍｇ得た。このときの回収率は９重量％であった。
【００６０】
この非晶性固体の分子量を測定したところ３２６であった。また1Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られたスペクトルを解析した。得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムを図２に示す。これらの結果から、得られた非晶性固体は前記式（２）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−マンノース（３−フコピラノシル−Ｄ−マンノース）であることが判明した。
【００６１】
実施例６
《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースの合成》
Ｌ−フコースの受容体としての単糖の１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース（３００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド（２４ｍｇ）とを、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、４．２ｍｌ）とディメチルスルフォキシド（４２０μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行った。
【００６２】
得られた反応物を活性炭素カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒を蒸留で留去したところ、非晶性固体を１０ｍｇ得た。このときの回収率は２３重量％であった。
【００６３】
この非晶性固体の分子量を測定したところ３４０であった。また1Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られたスペクトルを解析した。得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムを図３に示す。これらの結果から、得られた非晶性固体は前記式（３）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース（３−フコピラノシル−１−Ｏ−メチルガラクトース）であることが判明した。
【００６４】
実施例７
《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−ラクトースの合成》
Ｌ−フコースの受容体としての二糖のラクトース（５００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド（５０ｍｇ）とを、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、４．２ｍｌ）とジメチルスルフォキシド（４２０μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行った。
【００６５】
得られた反応物を活性炭素カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、三糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒を蒸留で留去したところ、非晶性固体を２０．５ｍｇ得た。このときの回収率は２３重量％であった。
【００６６】
この非晶性固体の分子量を測定したところ４８８であった。また1Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られたスペクトルを解析した。得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムを図４に示す。これらの結果から、得られた非晶性固体は前記式（４）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−ラクトース（３′−フコピラノシル−ラクトース）であることが判明した。
【００６７】
実施例８
《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−１−Ｏ−メチルラクトースの合成》
Ｌ−フコースの受容体としての二糖の１−Ｏ−メチルラクトース（３００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド（２４ｍｇ）とを、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、４．２ｍｌ）とディメチルスルフォキシド（４２０μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行った。
【００６８】
得られた反応物を活性炭素カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒を蒸留で留去したところ、非晶性固体を１０ｍｇ得た。このときの回収率は２３重量％であった。
【００６９】
この非晶性固体の分子量を測定したところ５０２であった。また1Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られたスペクトルを解析した。得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムを図５に示す。これらの結果から、得られた非晶性固体は前記式（５）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−１−Ｏ−メチルラクトース（３′−フコピラノシル−１−Ｏ−メチルラクトース）であることが判明した。
【００７０】
実施例９
《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−Ｎ−アセチルラクトサミンの合成》
Ｌ−フコースの受容体としての二糖のＮ−アセチルラクトサミン（５００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド（３０ｍｇ）とを、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、５．０ｍｌ）とディメチルスルフォキシド（５００μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行った。
【００７１】
得られた反応物を活性炭素カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒を蒸留で留去したところ、非晶性固体を８．４ｍｇ得た。このときの回収率は１５重量％であった。
【００７２】
この非晶性固体の分子量を測定したところ５２９であった。また1Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られたスペクトルを解析した。得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムを図６に示す。これらの結果から、得られた非晶性固体は前記式（６）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−Ｎ−アセチルラクトサミン（３′−フコピラノシル−Ｎ−アセチルラクトサミン）であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４で得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムである。
【図２】実施例５で得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムである。
【図３】実施例６で得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムである。
【図４】実施例７で得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムである。
【図５】実施例８で得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムである。
【図６】実施例９で得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、α−Ｌ−フコシダーゼを用いたα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖タンパク質や糖脂質中に含まれる複合糖質の糖鎖の非還元未端あるいは枝分れ部分には、α−Ｌ−フコシル基を含むものが多く見出されている。例えば、植物キシログルカン由来のフコースを含むオリゴサッカライドにエリシター様の活性があることが報告されている。また、Ｌ−フコースを含む複合脂質中の糖鎖は、血液型の型決定基、肝臓への血清糖タンパク質の取り込み、マクロファージ遊走阻止因子の受容体、細胞−細胞相互作用など、さまざまな生理活性を有していると言われている。さらに細胞のガン化に伴い血中のＬ−フコース量が増加することが観察されている。
【０００３】
α−Ｌ−フコシダーゼは糖鎖中のα−Ｌ−フコシド結合を加水分解する酵素であり、複合糖質中の糖鎖の構造解析や、構造と機能との関連あるいは生理活性などを研究する上で、Ｌ−フコースを特異的にはずす酵素試薬として重要な意味を持っている。一方、同様の理由から、α−Ｌ−フコシダーゼのＬ−フコース転移能を利用して、Ｌ−フコースを含むオリゴ糖を人工的に合成することが求められている。しかしながら、フコースを含む糖鎖の合成は一部のものが化学合成法または酵素法によりなされているにすぎないのが現状である。
【０００４】
すなわち、化学合成法においては、水酸基のうちで反応に関与しない水酸基を保護した受容体の１位を活性化し、残りの水酸基を保護した供与体を作用させて縮合反応を行い、反応終了後に保護基を脱離させて目的物を得るという繁雑な工程を必要とする。しかも、工程の数が多いために必然的に収率は低いものとならざるを得ない。
【０００５】
一方、酵素を用いてＬ−フコースを含むオリゴ糖を合成する試みは数多く行われている。例えば、スベンソン（Svensson）およびチエム（Thime）は、ブタ肝臓由来のα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、Ｌ−フコースがα１→２またはα１→６結合したＬ−フコシル−メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを合成している（Carbohydr. Res., 200, 391-402. 1990）。しかしながら、このα−Ｌ−フコシダーゼは酵素活性が低く、またこのα−Ｌ−フコシダーゼを用いてα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造することはできない。
【０００６】
また、微生物由来のα−Ｌ−フコシダーゼを用いてＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造する方法として、特開平５−１３７５８９号公報には、コリネバクテリウム属細菌由来のα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、糖転移反応を行わせることにより、α１→２結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造する方法が記載されている。しかしながら、このα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造することはできない。
【０００７】
さらに、特開平８−２４２８７６号公報には、アルカリジェネス属に属する細菌の生産するα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、糖転移反応を行わせることにより、α１→２結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法が記載されている。しかしながら、このα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造することはできない。
【０００８】
また、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法として、特開平４−９９４９２号公報には、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のα−Ｌ−フコシダーゼを用いて、糖転移反応を行わせることにより、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法が記載されている。そして実施例において、受容体としてＤ−グルコースまたはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの単糖を用いて糖転移反応を行うことにより、Ｄ−グルコースまたはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンにα−Ｌ−フコースがα１→３結合した二糖類（オリゴ糖）を製造している。
【０００９】
しかしながら、上記のα−Ｌ−フコシダーゼは、受容体としてＤ−ガラクトースを用いた場合には糖転移反応は起こらない（Carbohydr. Res., 224, 291-299(1992)）。またラクトースまたは１−Ｏ−メチルラクトース等の二糖類に糖転移反応を行った実施例はなく、α−Ｌ−フコースがα１→３結合した三糖以上のオリゴ糖を製造することはできない。従って、糖転移反応受容体についてはスペクトラムが狭く、生体中での糖鎖の生理活性を明らかにするための試薬としては不向きである。
【００１０】
またペニシリウム・マルチコラー（Penicillium multicolor）由来のα−Ｌ−フコシダーゼ（Carbohydr. Res., 309, 125-129(1998)）も知られているが、このα−Ｌ−フコシダーゼの受容体に対する特異性は、前記特開平４−９９４９２号公報のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のα−Ｌ−フコシダーゼと同じであり、従って糖転移反応受容体についてはスペクトラムが狭く、生体中での糖鎖の生理活性を明らかにするための試薬としては不向きである。
【００１１】
以上のように、α−Ｌ−フコースがα１→３結合した三糖以上のオリゴ糖を合成することができるα−Ｌ−フコシダーゼはこれまで知られておらず、このため糖鎖の構造解析や、生体中での糖鎖の生理活性などを研究する上で必要となるα１→３結合したα−Ｌ−フコースを含む三糖以上のオリゴ糖およびこのオリゴ糖を合成することができるα−Ｌ−フコシダーゼが求められている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、生体中の複合糖質中の糖鎖においてＬ−フコースを含むオリゴ糖は構造上および生理活性上重要な位置を占めており、特にα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は、その新たな生理活性に興味が持たれるところである。従って、糖転移反応受容体の種類や分子量に影響されることなく、Ｌ−フコースを受容体の３位に選択的に糖転移反応させ、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法が求められている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、α−Ｌ−フコシダーゼを用いて、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を効率よく製造することができるオリゴ糖の製造方法を提案することである。
【００１４】
本発明は次のオリゴ糖の製造方法である。
〔１〕 Ｌ−フコースの供与体と、Ｌ−フコースの受容体とを含む溶液に、下記の酵素学的性質を有するα−Ｌ−フコシダーゼを添加して糖移転反応を行う方法であって、前記α−Ｌ−フコシダーゼが、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１６９４４の受託番号で寄託されているアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（ Alcaligenes sp. KSF-9687 ）菌株由来であることを特徴とするα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法。
（１）作用
・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα−Ｌ−フコシド結合を特異的に加水分解し、Ｌ−フコースを遊離する。
・α−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを、受容体である単糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を行い、Ｌ−フコースを含むオリゴ糖を生成する。
（２）加水分解での基質特異性
・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→２またはα１→３結合しているＬ−フコースを加水分解する。
・合成基質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシドを加水分解する。
・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→４またはα１→６結合しているＬ−フコースには作用しない。
（３）糖転移反応での特異性
・α−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを、受容体である単糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を行い、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を生成する。
・α１→２、α１→４またはα１→６結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は生成しない。
（４）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲
・至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０であり、安定ｐＨ範囲は、４５℃で１時間の保持条件においてｐＨ６．０〜９．０である。
（５）至適温度および安定温度範囲
・至適温度は５５℃であり、ｐＨ７．０で１０分間処理した時、５０℃まで安定であり、６５℃以上で失活する。
（６）阻害剤などの影響
・酵素活性は銅、水銀またはパラクロルメルクリ安息香酸により著しく阻害されるが、その他の金属イオン、ＳＨ試薬および糖によりほとんど影響を受けない。
（７）分子量
・ＰＡＧＥにより測定した分子量は約１０２，０００である。
・ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は約５１，０００である。
〔２〕 Ｌ−フコースの供与体がｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシドまたはα−Ｌ−フコピラノシルフルオリドである上記〔１〕記載の製造方法。
〔３〕 Ｌ−フコースの受容体が単糖または二糖以上のオリゴ糖である上記〔１〕または〔２〕項記載の製造方法。
〔４〕 Ｌ−フコースの受容体がＤ−ガラクトース、１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、ラクトースまたはＮ−アセチルラクトサミンである上記〔１〕ないし〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔５〕 製造するオリゴ糖が下記式（１）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトースである上記〔１〕ないし〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【００１５】
本発明で用いるα−Ｌ−フコシダーゼはアルカリジェネス（Alcaligenes）属に属する菌株から得ることができる。アルカリジェネス属に属する菌株としては、、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１６９４４の受託番号で寄託されているアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株を用いる。この菌株の菌学的性質は次の通りである。
【００１６】
《形態的所見》
（１）細胞の形態、大きさ：桿菌、０．７〜０．８×１．５〜２．５μｍ
（２）多形性：なし
（３）運動性：あり
（４）胞子：なし
（５）べん毛：周ベん毛
（６）グラム染色性：陰性
【００１７】
《生育状態》
（１）肉汁寒天平板培養
集落の形状は円形であり、周縁は平滑で、表面隆起は扁平状である。また、集落の色調は半透明である。
（２）肉汁液体培養
生育し混濁する。
（３）ゼラチン穿刺培養
液化しない。
【００１８】
《その他》
後述する酵素学的および理化学的性質を有するα−Ｌ−フコシダーゼを菌体内および菌体外に産出する。
【００２０】
以上の性質から、Bergey's Manual of Systematic Bacteriologyを参照し、この菌株をアルカリジェネスに属する菌株と同定し、アルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）と命名した。最も類似した性質を示すものとしてアルカリジェネス・デニトリフィカンス（Alcaligenes denitrificans）があげられる。
【００２１】
次に、上記アルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株により生産される本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの酵素学的および理化学的性質について説明する。
（１）酵素の作用
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα−Ｌ−フコシド結合を特異的に加水分解し、Ｌ−フコースを遊離する。またα−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを、受容体である単糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を行い、Ｌ−フコースを含む二糖または三糖以上のオリゴ糖を生成する。
【００２２】
（２）加水分解での基質特異性
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→２またはα１→３結合しているＬ−フコースを加水分解する。また合成基質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド（ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド）を加水分解する。しかし、天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→４またはα１→６結合しているＬ−フコースには作用しない。
【００２３】
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの種々のα−Ｌ−フコシド結合含有基質に対する酵素活性を表１に示した。表１から明らかなように、本発明のα−Ｌ−フコシダーゼはｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドのような合成基質、ならびにα−Ｌ−フコピラノシル−（１→２’）−ラクトース（２′−フコシルラクトース）、α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−ラクトース（３′−フコシルラクトース）などのオリゴ糖およびムチン等の天然基質に作用することが分かる。すなわち、本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは、合成基質中のα−Ｌ−フコシド結合を加水分解し、またオリゴ糖鎖中のα１→２またはα１→３結合しているフコースを加水分解することが分かる。一方、オリゴ糖鎖中および天然高分子基質中のα１→４またはα１→６結合しているＬ−フコースには作用しないことが分かる。なお、表１中の相対活性は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドに対する活性を１００として表示した。
【００２４】
【表１】
（３）糖転移反応での基質特異性
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼが触媒する糖転移反応において、Ｌ−フコースの供与体となる化合物は、α−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを有する化合物である。供与体の具体的なものとしては、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシドまたはα−Ｌ−フコピラノシルフルオリドなどがあげられる。
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼが触媒する糖転移反応において、Ｌ−フコースの受容体となる化合物は、Ｄ−ガラクトース、１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースおよびＤ−マンノースなどの単糖；ラクトースおよびＮ−アセチルラクトサミンなどの二糖以上のオリゴ糖等である。
【００２６】
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼが触媒する糖転移反応では、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖が選択的に生成し、α１→２、α１→４またはα１→６結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は生成しない。すなわち、上記受容体の３位にＬ−フコースがα１→３フコシド結合したオリゴ糖だけが生成する。糖転移反応により生成するオリゴ糖は、二糖以上のオリゴ糖である。例えば、受容体として単糖を用いた場合には、この受容体にＬ−フコースがα１→３結合した二糖のオリゴ糖が生成し、受容体として二糖を用いた場合には、この受容体にＬ−フコースがα１→３結合した三糖のオリゴ糖が生成する。
【００２７】
（４）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲
加水分解および糖転移反応の至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０である。安定ｐＨ範囲は、４５℃で１時間の処理条件の場合、ｐＨ６．０〜９．０である。
【００２８】
（５）力価の測定法
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの加水分解活性の測定は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドを基質として、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液中、５０℃で反応を行い、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）を加えて反応を停止させた後、遊離したｐ−ニトロフェノールの量を４１０ｎｍ吸光度を測定することにより行うことができる。酵素の単位は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素量を１ユニットとした。その他の基質については、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液中、５０℃で３０分間反応を行った後、沸騰浴中３分間加熱して反応を停止し、次に遠心分離し、その上清中の遊離Ｌ−フコース量をシュードモナス由来のＬ−フコースデヒドロゲナーゼを用いて測定することにより行うことができる。あるいは、ピリジルアミノ化により蛍光ラベルした基質および生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析することにより測定することもできる。
【００２９】
また糖転移反応の活性の測定方法は次のようにして行うことができる。すなわち、Ｌ−フコース供与体と、受容体となるオリゴ糖とを緩衝液などに溶解し、この溶液に本発明のα−Ｌ−フコシダーゼを添加し、３７℃付近で反応を行う。反応後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを用いて、反応生成物を確認する。
【００３０】
（６）至適温度および安定温度
加水分解および糖転移反応の至適温度は５５℃である。安定温度範囲は、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液中に各温度で１０分間保温して残存活性を測定した時、５０℃まで安定であり、５５℃で約６０％残存活性を示す。
【００３１】
（７）ｐＨ、温度による失活の条件
６５℃で１０分間の処理により完全に失活する。またｐＨ１１以上において４５℃で６０分間の処理によって完全に失活する。
【００３２】
（８）阻害剤等の影響
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼに対する種々の添加物質の影響について検討したところ、加水分解および糖転移反応において、銅（０．１ｍＭ）、水銀（０．１ｍＭ）またはパラクロルメルクリ安息香酸（０．５ｍＭ）により著しく阻害されたが、その他の金属イオン（１ｍＭ）およびＳＨ試薬（１ｍＭ）によりほとんど影響を受けない。また加水分解反応は、生成物であるＬ−フコース（１ｍＭ）によりほとんど影響を受けない。
【００３３】
（９）精製方法
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの精製は、既知の精製法が単独または併用して利用され得る。本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは菌体内および菌体外に生産されるが、酵素の精製には菌体外酵素を用いる方が望ましい。例えば、培養液を濾過または遠心分離にかけ菌体を除去し、次いで塩析法、各種クロマトグラフ法等を適宜に組み合せて行うことができる。精製法の一例を次に示す。
【００３４】
培養終了後、ストリームライン−ディアエ（ファルマシア製）に菌体を含む培養物を通し、吸着した酵素を溶出する。活性画分を最終濃度１Ｍになるよう硫酸アンモニウムを加え、ブチルトヨパール６５０Ｍカラムに通し、活性画分を溶出する。活性画分を集め、フコース−セルロファインカラムに通し、吸着した酵素を溶出する。活性画分を、一晩透析を行い、ＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ Ｑカラムに通し、活性画分を溶出する。溶出された活性画分はこの時点で電気泳動的に単一バンドを示すが、ポリッシングのためセファクリルＳ−３００ＨＲカラムを用いてゲル濾過を行うこともできる。
【００３５】
（１０）分子量
本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの分子量は、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気電気泳動）法により約１０２，０００と測定された。
【００３６】
（１１）ポリアクリルアミド電気泳動
精製されたα−Ｌ−フコシダーゼは、ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動において単一のバンドを示した。また、この時の分子量はそれぞれ１０２，０００、５１，０００と測定された。
【００３７】
以上のような本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは菌体内および菌体外に生産されるため、菌から酵素を得る際には菌体外に生産された酵素を分離するだけで容易に得ることができる。例えば、菌の培養液からα−Ｌ−フコシダーゼを分離するだけで容易に得ることができる。このため、菌体を破砕して活性画分を抽出する操作を必要としないので、工業的生産に適している。また本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは中性付近に至適ｐＨを有し、しかも熱に安定であるので、糖鎖の構造解析や機能の研究に好適に利用することができる。
【００３８】
上記性質をもつ新規なα−Ｌ−フコシダーゼを用いることによって、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法を確立した。本発明によるＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法を以下に詳細に記述する。
本発明のオリゴ糖の製造方法は、Ｌ−フコースの供与体と、Ｌ−フコースの受容体とを含む溶液に、前記本発明のα−Ｌ−フコシダーゼを添加して糖移転反応を行って、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を製造する方法である。
【００３９】
上記Ｌ−フコースの供与体としては、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシドまたはα−Ｌ−フコピラノシルフルオリドなどがあげられる。これらの供与体は精製品はもちろん、これらの化合物を含む化合物などを用いることもできる。
上記Ｌ−フコースの受容体としては、Ｄ−ガラクトース、１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノースなどの単糖；ラクトースまたはＮ−アセチルラクトサミンなどの二糖以上のオリゴ糖等があげられる。これらの受容体は精製品はもちろん、これらの糖を含む糖などを用いることもできる。
【００４０】
本発明のオリゴ糖の製造方法では、前記本発明のα−Ｌ−フコシダーゼを用いているので、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を選択的に製造することができる。すなわち、本発明のオリゴ糖の製造方法では、α１→２、α１→４またはα１→６結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は生成しない。本発明のオリゴ糖の製造方法で選択的に得られるオリゴ糖は、前記受容体の３位にＬ−フコースがα１→３フコシド結合したオリゴ糖、すなわちα−Ｌ−フコピラノシル（１→３）基を含むオリゴ糖である。
【００４１】
本発明のオリゴ糖の製造方法では、受容体を選択することにより、二糖または三糖以上のオリゴ糖を製造することができる。例えば受容体として単糖を用いることにより、Ｌ−フコースがα１→３結合した二糖のオリゴ糖を製造することができる。また、受容体として二糖を用いることにより、Ｌ−フコースがα１→３結合した三糖のオリゴ糖を製造することができる。
【００４２】
本発明のオリゴ糖の製造方法の好ましい方法として、次の方法が例示できる。まず、リン酸カリウム緩衝液と、ジメチルスルフォキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびアセトニトリル等の水溶性有機溶媒からなる群から選ばれる少なくとも１種の有機溶媒との混合溶液を調製する。この混合溶液に前記受容体および供与体を添加し、２７℃〜６０℃、好ましくは３５℃〜５５℃の間で６時間〜７２時間、好ましくは１８時間〜４８時間反応させる。このときの受容体および供与体の濃度は０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．１重量％〜１０重量％とするのが望ましい。また受容体と供与体との混合比は、重量比で１：１〜２０：１、好ましくは２：１〜１０：１とするのが望ましい。反応温度は２７℃〜６０℃、好ましくは３５℃〜５５℃とするのが望ましい。反応ｐＨは６〜９、好ましくはｐＨ７〜８とするのが望ましい。使用するα−Ｌ−フコシダーゼは精製したほうが好ましいが、粗精製の酵素を使用することもできる。
【００４３】
上記のような方法によりＬ−フコースの糖転移反応を行うことにより、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を選択的に容易に製造することができる。このような方法により製造することができるオリゴ糖の具体的なものとしては、前記式（１）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトース、前記式（２）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−マンノース、前記式（３）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース、前記式（４）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−ラクトース、前記式（５）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−１−Ｏ−メチルラクトース、前記式（６）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−Ｎ−アセチルラクトサミンなどがあげられる。これらはいずれも新規な化合物であり、糖鎖の構造解析、糖の機能の研究および糖の代謝の研究などに有用であるほか、生理活性が期待される。
【００４４】
【発明の効果】
本発明で用いるα−Ｌ−フコシダーゼは天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα−Ｌ−フコシド結合を特異的に加水分解し、しかもα１→３結合したα−Ｌ−フコースを含む三糖以上のオリゴ糖を合成することができるので、糖鎖の構造解析や機能の研究に有用である。
【００４６】
本発明で用いるアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株は、α−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有しており、しかも菌体外にこの酵素を生産するので、この菌株を用いることにより、α−Ｌ−フコシダーゼを容易に製造、精製することができる。
【００４７】
本発明のＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法は、上記α−Ｌ−フコシダーゼを用いて糖転移反応を行っているので、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を容易に製造することができる。
【００４８】
本発明で製造するα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は新規な化合物であり、糖鎖の構造解析、糖の機能の研究および糖の代謝の研究などに有用である。
【００４９】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５０】
実施例１
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド０．０５重量％、グルコース１重量％、ペプトン０．５重量％、カザミノ酸０．２５重量％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１重量％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２重量％および寒天２重量％を含む培地をｐＨ９．０に調整した。また静岡県掛川市より採取した土壌を滅菌水により希釈し、土壌懸濁液とした。この土壌懸濁液を上記培地からなる平板培地上に広げ、３７℃で２日間培養を行った。培養後、培地中の黄色く発色しているコロニーを分離した。このようにしてアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株をスクリーニングした。
【００５１】
実施例２
《α−Ｌ−フコシダーゼの製造》
ペプトン０．５重量％、酵母エキス０．２５重量％、塩化ナトリウム０．５重量％（ｐＨ７．２）を含む培地５００ｍｌにアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（Alcaligenes sp. KSF-9687）菌株を植菌し、容振とう培養して種培養液とした。次いで種培養と同組成の培地３ literを５ liter容ジャーファーメンター３基に入れ、１２１℃で２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液を接種し、３７℃で２日間、毎分３ literの通気量と毎分３００回転の攪拌速度の条件で培養した。
【００５２】
培養終了後、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化したストリームライン−ディアエカラム（ファルマシア製、５．０×１７ｃｍ）に菌体を含む培養物を通し、吸着した酵素を０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で溶出した。活性画分を集め、最終濃度１Ｍになるように硫酸アンモニウムを溶解した。１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で予め平衡化したブチルヨパール６５０Ｍカラム（東ソー製、２．６×３０ｃｍ）に通し、１Ｍ〜０Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液のリニアーグラジェント法で溶出した。溶出された活性画分を集めて予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したフコースセルロファインカラム（１．６×７．５ｃｍ）に通し、吸着した酵素を５０ｍＭ Ｌ−フコースを含む同緩衝液で溶出した。活性画分を一晩１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析を行った。次に同緩衝液にて平衡化したＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ Ｑ（ファルマシア製）に通し、吸着した酵素を０Ｍ〜０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液のリニアーグラジェント法で溶出した。
【００５３】
この時点で当酵素は電気泳動的に単一バンドを与えるが、ポリッシングのため活性画分を濃縮後セファクリルＳ−３００ＨＲ（ファルマシア製、１．６×６０ｃｍ）を行い、α−Ｌ−フコシダーゼの精製標品７４μｇ（比活性１２６ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、収率２０重量％）を得た。
【００５４】
実施例３
実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼの種々の基質に対する加水分解活性を次のようにして測定した。
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドを基質とした場合は、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液に１００μｌの酵素および２００μｌの基質を加え、５０℃で１５分間反応を行った後、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）を加えて反応を停止させた。次に、遊離したｐ−ニトロフェノールの量を４１０ｎｍ吸光度を測定することにより定量した。その他の基質についてはｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液に１００μｌの酵素および２００μｌの基質を加え、５０℃で３０分間反応を行った後、沸騰浴中で３分間加熱して反応を停止し、次に遠心分離し、上清中の遊離Ｌ−フコース量をシュードモナス由来のＬ−フコースデヒドロゲナーゼを用いて定量した。結果は表１に示した通りである。
【００５５】
実施例４
《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトースの合成》
Ｌ−フコースの受容体としての単糖のＤ−ガラクトース（５００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド（５０ｍｇ）とを、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１０ｍｌ）とジメチルスルフォキシド（１０００μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行った。
【００５６】
得られた反応物を活性炭素カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒を蒸留で留去したところ、非晶性固体を２０．５ｍｇ得た。このときの回収率は１８重量％であった。
【００５７】
この非晶性固体の分子量を測定したところ３２６であった。また1Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られたスペクトルを解析した。得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムを図１に示す。これらの結果から、得られた非晶性固体は前記式（１）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトース（３−フコピラノシル−Ｄ−ガラクトース）であることが判明した。
【００５８】
実施例５
《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−マンノースの合成》
Ｌ−フコースの受容体としての単糖のＤ−マンノース（５００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド（１００ｍｇ）とを、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１０ｍｌ）とディメチルスルフォキシド（１０００μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行った。
【００５９】
得られた反応物を活性炭素カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒を蒸留で留去したところ、非晶性固体を１０．３ｍｇ得た。このときの回収率は９重量％であった。
【００６０】
この非晶性固体の分子量を測定したところ３２６であった。また1Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られたスペクトルを解析した。得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムを図２に示す。これらの結果から、得られた非晶性固体は前記式（２）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−マンノース（３−フコピラノシル−Ｄ−マンノース）であることが判明した。
【００６１】
実施例６
《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースの合成》
Ｌ−フコースの受容体としての単糖の１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース（３００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド（２４ｍｇ）とを、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、４．２ｍｌ）とディメチルスルフォキシド（４２０μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行った。
【００６２】
得られた反応物を活性炭素カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒を蒸留で留去したところ、非晶性固体を１０ｍｇ得た。このときの回収率は２３重量％であった。
【００６３】
この非晶性固体の分子量を測定したところ３４０であった。また1Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られたスペクトルを解析した。得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムを図３に示す。これらの結果から、得られた非晶性固体は前記式（３）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース（３−フコピラノシル−１−Ｏ−メチルガラクトース）であることが判明した。
【００６４】
実施例７
《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−ラクトースの合成》
Ｌ−フコースの受容体としての二糖のラクトース（５００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド（５０ｍｇ）とを、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、４．２ｍｌ）とジメチルスルフォキシド（４２０μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行った。
【００６５】
得られた反応物を活性炭素カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、三糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒を蒸留で留去したところ、非晶性固体を２０．５ｍｇ得た。このときの回収率は２３重量％であった。
【００６６】
この非晶性固体の分子量を測定したところ４８８であった。また1Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られたスペクトルを解析した。得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムを図４に示す。これらの結果から、得られた非晶性固体は前記式（４）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−ラクトース（３′−フコピラノシル−ラクトース）であることが判明した。
【００６７】
実施例８
《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−１−Ｏ−メチルラクトースの合成》
Ｌ−フコースの受容体としての二糖の１−Ｏ−メチルラクトース（３００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド（２４ｍｇ）とを、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、４．２ｍｌ）とディメチルスルフォキシド（４２０μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行った。
【００６８】
得られた反応物を活性炭素カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒を蒸留で留去したところ、非晶性固体を１０ｍｇ得た。このときの回収率は２３重量％であった。
【００６９】
この非晶性固体の分子量を測定したところ５０２であった。また1Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られたスペクトルを解析した。得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムを図５に示す。これらの結果から、得られた非晶性固体は前記式（５）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−１−Ｏ−メチルラクトース（３′−フコピラノシル−１−Ｏ−メチルラクトース）であることが判明した。
【００７０】
実施例９
《α−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−Ｎ−アセチルラクトサミンの合成》
Ｌ−フコースの受容体としての二糖のＮ−アセチルラクトサミン（５００ｍｇ）と、Ｌ−フコースの供与体としてのｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド（３０ｍｇ）とを、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、５．０ｍｌ）とディメチルスルフォキシド（５００μｌ）との混合溶液に溶解した。この混合溶液に、実施例２で得られたα−Ｌ−フコシダーゼを加え、３７℃で４８時間糖転移反応を行った。
【００７１】
得られた反応物を活性炭素カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜２０％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液グラジエント（合計４００ｍｌ）で溶出して、二糖類の画分に相当する分画を集めた。集めた画分の溶媒を蒸留で留去したところ、非晶性固体を８．４ｍｇ得た。このときの回収率は１５重量％であった。
【００７２】
この非晶性固体の分子量を測定したところ５２９であった。また1Ｈ−ＮＭＲを測定し、得られたスペクトルを解析した。得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムを図６に示す。これらの結果から、得られた非晶性固体は前記式（６）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−Ｎ−アセチルラクトサミン（３′−フコピラノシル−Ｎ−アセチルラクトサミン）であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４で得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムである。
【図２】実施例５で得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムである。
【図３】実施例６で得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムである。
【図４】実施例７で得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムである。
【図５】実施例８で得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムである。
【図６】実施例９で得られた1Ｈ−ＮＭＲのスペクトラムである。
Claims (10)
- Ｌ−フコースの供与体と、Ｌ−フコースの受容体とを含む溶液に、下記の酵素学的性質を有するα−Ｌ−フコシダーゼを添加して糖移転反応を行う方法であって、前記α−Ｌ−フコシダーゼが、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１６９４４の受託番号で寄託されているアルカリジェネス・スピーシス・ＫＳＦ−９６８７（ Alcaligenes sp. KSF-9687 ）菌株由来であることを特徴とするα１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖の製造方法。
（１）作用
・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα−Ｌ−フコシド結合を特異的に加水分解し、Ｌ−フコースを遊離する。
・α−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを、受容体である単糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を行い、Ｌ−フコースを含むオリゴ糖を生成する。
（２）加水分解での基質特異性
・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→２またはα１→３結合しているＬ−フコースを加水分解する。
・合成基質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシドを加水分解する。
・天然高分子基質、オリゴ糖または合成基質中のα１→４またはα１→６結合しているＬ−フコースには作用しない。
（３）糖転移反応での特異性
・α−Ｌ−フコシド結合しているＬ−フコースを、受容体である単糖または二糖以上のオリゴ糖に糖転移反応を行い、α１→３結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖を生成する。
・α１→２、α１→４またはα１→６結合したＬ−フコースを含むオリゴ糖は生成しない。
（４）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲
・至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０であり、安定ｐＨ範囲は、４５℃で１時間の保持条件においてｐＨ６．０〜９．０である。
（５）至適温度および安定温度範囲
・至適温度は５５℃であり、ｐＨ７．０で１０分間処理した時、５０℃まで安定であり、６５℃以上で失活する。
（６）阻害剤などの影響
・酵素活性は銅、水銀またはパラクロルメルクリ安息香酸により著しく阻害されるが、その他の金属イオン、ＳＨ試薬および糖によりほとんど影響を受けない。
（７）分子量
・ＰＡＧＥにより測定した分子量は約１０２，０００である。
・ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は約５１，０００である。 - Ｌ−フコースの供与体がｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシドまたはα−Ｌ−フコピラノシルフルオリドである請求項１記載の製造方法。
- Ｌ−フコースの受容体が単糖または二糖以上のオリゴ糖である請求項１または２記載の製造方法。
- Ｌ−フコースの受容体がＤ−ガラクトース、１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、ラクトースまたはＮ−アセチルラクトサミンである請求項１ないし３のいずれかに記載の製造方法。
- 製造するオリゴ糖が下記式（１）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−ガラクトースである請求項１ないし４のいずれかに記載の製造方法。
- 製造するオリゴ糖が下記式（２）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−Ｄ−マンノースである請求項１ないし４のいずれかに記載の製造方法。
- 製造するオリゴ糖が下記式（３）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−１−Ｏ−メチル−Ｄ−ガラクトースである請求項１ないし４のいずれかに記載の製造方法。
- 製造するオリゴ糖が下記式（４）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−ラクトースである請求項１ないし４のいずれかに記載の製造方法。
- 製造するオリゴ糖が下記式（５）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−１−Ｏ−メチルラクトースである請求項１ないし４のいずれかに記載の製造方法。
- 製造するオリゴ糖が下記式（６）で表されるα−Ｌ−フコピラノシル−（１→３’）−Ｎ−アセチルラクトサミンである請求項１ないし４のいずれかに記載の製造方法。
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