JP4249612B2 - 初期腎機能障害の検査方法 - Google Patents

Description

本発明は、初期腎機能障害の診断方法に関するものである。

糖タンパク質アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（アポＡ−ＩＶ）は、ほとんどヒト腸細胞のみで産生されており、リンパに分泌されている（１）。乳状脂粒の構造タンパク質であり、平均血漿レベルはおよそ１５ｍｇ／ｄｌ（２）である。絶食状態では、アポＡ−ＩＶの大半はアポＡ−Ｉを含有せず脂質の少ない低分子ＨＤＬ様粒子の一部として血漿中を循環する（３、４）。アポＡ−ＩＶの生理的機能は、まだ解明されておらず、議論の最中である。脂質吸収（５）及び食物摂取の制御に関わっていると仮定されたが、こうした発見は遺伝学的に改変されたマウスにおいて確認されなかった（７、８）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、アポＡ−ＩＶが、コレステロールを末梢細胞から除去し、代謝のため肝臓及びステロイド産生臓器に送るコレステロール逆輸送経路のいくつかの工程に関与しているという説得力のある証拠を報告した（９〜１１）。アポＡ−ＩＶはレシチン−コレステロール アシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）を活性化し（１２、１３）、リポタンパク質リパーゼの活性化（１４）、及びコレステロースエステルのＨＤＬからＬＤＬへのＣＥＴＰ−介在転移（１５）を調節する。これは、アポＡ−ＩＶが抗アテローム発生性因子を代表するかもしれないことを示唆している。このことは、動物及びヒトにおける研究により支持されている。ヒト（１６）又はマウスのアポＡ−ＩＶ（１７）を過剰発現している、脂肪食を与えたマウスは、対照マウスよりも、大動脈における粥状硬化性病変の発生が著しく少ない。これは、高レベルで動脈にアテロームを形成する背景（１６）を有するアポＥ−欠失マウスにおいてアポＡ−ＩＶが過剰発現した場合でさえも観察された。

腎患者におけるアポＡ−ＩＶについていくつか研究が行われ、アポＡ−ＩＶの増加が観察された。Ｎｅｓｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１８）、並びにＳｅｉｓｈｉｍａ及びＭｕｔｏ（１９）は、血液透析患者及びＣＡＰＤ患者の小群においてアポＡ−ＩＶ濃度が顕著に上昇していたことを記載している。このことは、対照と比較して高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）中へアポＡ−ＩＶが蓄積していることと共に、アポＡ−ＩＶの血漿内分布に著しい差を発見したＤｉｅｐｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．により裏付けられた（２０）。彼らは、この変化した分布が、これらの患者におけるコレステロール逆輸送の障害を反映するかもしれないことを示唆した（２１）。５３４人の血液透析患者及び１６８人のＣＡＰＤ患者についての大きな多センター研究において、対照と比較して、およそ２倍のアポＡ−ＩＶ濃度上昇が観察された（２２）。腎疾患が末期に至るや否や、２つの透析処置様式間、又は糖尿病患者及び非糖尿病患者（２２）のあいだで、アポＡ−ＩＶ濃度に差がなくなるように見える。しかしながら、腎機能障害のどの段階でアポＡ−ＩＶが上昇し始めるのか、及びこの疾患集団においても粥状硬化性合併症と関連があるか否かについては知られていない。

Ｓｅｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １６７（１９８７），３０３−３１１）は、血液透析を受けている末期腎不全患者、即ち末期腎疾患（腎置換療法）におけるアポＡ−ＩＶについて調査した。

Ｓｅｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３３（１９９２），１４４１−１４４７）では、５／６の腎切除を受けた７匹のラットが ７匹の対照ラットと比較された。この介入により、実験腎機能制限が作製され、ＢＵＮ（１５．２対５６．１ｍｇ／ｄｌ）及び血清クレアチニン（０．６９対１．４６ｍｇ／ｄｌ）の顕著な増加を示した。絶対濃度はないが単に任意単位が表示されており、アポＡ−ＩＶは５／６腎切除ラットの２倍も高かった。

しかし、ラットは典型的なＨＤＬ動物（そしてアポＡ−ＩＶが主にＨＤＬに結合している）であり、したがって、結果は、主にＬＤＬ−含有リポタンパク質が見られるヒトに適用できないことが知られている。

Ｍａｓｓｙ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ．５５（２００１），１５６−１５８）では、３６人の腎移植患者及び２０人の対照人のアポＡ−ＩＶ濃度をアッセイした。クレアチニンクリアランスは計算され、直接測定されなかった。その上、患者は、いずれもヒトのリポタンパク質代謝に顕著で確定された影響がある３つの強力な免疫抑制剤（シクロスポリン、アザチオプリン及びコルチコステロイド）の影響下にあった。更に、シクロスポリンを受けた患者は、シクロスポリンを受けていない患者よりもアポＡ−ＩＶレベルがより高かった。この効果がシクロスポリン自体によるものか又は腎機能に対するシクロスポリンの影響によるものかは示されていない。

先行技術に開示されているこれら２つのモデル（腎移植及び５／６腎摘ラットのもの）は、制限された腎機能の初期パラメーターとしてアポＡ−ＩＶを表すのには適していないことが示されている。末期腎機能に関し、これはどのみち定義により予測できない。

初期診断、特に腎疾患の初期診断は常に重要である。したがって、本発明の１つの目的は、初期、即ち腎疾患の進行において腎機能障害が依然としてわずかであり、療法を開始することでより好結果が見込まれる時期における腎障害の診断方法を開発することである。

この目的は、以下の工程：
−ヒトの体液又は組織サンプル中のアポＡ−ＩＶ量を測定し、そして
−アポＡ−ＩＶの測定値とリファレンス値とを測定する、
ことを特徴とするヒトの初期の腎機能障害を診断する方法により達成される。

驚くべきことに、本発明において、種々の腎疾患の極初期にアポＡ−ＩＶ濃度の上昇が起こることが示されるであろう。他の多くの疾患のように、患者は、後期には複数の生理的に正常でないレベルのタンパク質（中でもアポＡ−ＩＶ）を発現するが、初期腎機能障害における重要なマーカーであることを証明するものはない。実際、透析を受けている末期腎疾患患者において、アポＡ−ＩＶ濃度上昇が、糖尿病性合併症及び透析治療に関わるプロセスに関連することも疑われている。

初期の腎機能障害にアポＡ−ＩＶは上昇するが、ＨＤＬコレステロール、アポＡ−Ｉ又はアポＢのような他の（脂肪）代謝マーカーはこのような初期に有意なマーカー機能を示さないことは非常に興味深い。実際、ＨＤＬ及びＬＤＬコレステロールのレベルは変化しないが、患者のアポＡ−Ｉ及びアポＢの濃度は減少する。しかしながら、初期腎疾患における最も有意な変化はアポＡ−ＩＶ濃度の上昇であり、患者の濃度は対照に比べておよそ７０％も高い。

したがって、腎疾患によるわずかな障害でさえ、アポＡ−ＩＶ濃度の有意な上昇を伴い、これによりアポＡ−ＩＶを初期腎機能障害に関連する有意なマーカーにする。初期腎機能障害は９０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２より高いＧＦＲ範囲により定義することができる。例えば、平均ＧＦＲ１２０ｍｌは、初期腎機能障害の状況とみなすこともできる。

本発明の範囲内で、最も初期の段階から進行した段階まで腎機能が制限された患者について調べた。部分的に、この制限された機能は従来の測定法では全く測定されない（例えばこれらの段階の血清クレアチニンは依然として正常であることが多く、糸球体ろ過速度でさえ依然として正常であることが多い）。これ自体がすでに本研究の特異性の証明である。腎機能は「黄金の基準」（イオヘキソールクリアランス）で測定した。これらの段階の腎不全について他のパラメータが測定されたリファレンスの主要部分は、クレアチニン及び年齢のようなパラメータを含む腎機能の測定に主に数学的方法を用いた。しかし、腎機能が５０％以上制限されている場合にのみ、クレアチニンが上昇し始めることは十分に知られている。しかしながら、本発明の範囲では、このクレアチニンに関知しない範囲がクリアランス法により十分に認識される。さらに、本発明により実施される試験によれば、多くの患者における疾患の診断は、生検又は超音波手段により明確に証明されている。したがって、本発明によれば、受容された有効な方法により腎機能及び基本的な腎疾患が測定された研究が初めて提供された。

サンプル中のアポＡ−ＩＶ量と比較するリファレンス値は、好ましくは腎機能障害のないヒト（健常人）から得られる。次に検査すべきヒト、例えば腎機能障害に罹患していると思われるヒトの体液又は組織サンプル中のアポＡ−ＩＶレベルの上昇により、腎機能障害を診断することができる。

本発明の方法は、健常人の日常の分析、すなわち、非常に初期つまり治療処置によりヒトが治癒する蓋然性が通常非常に高い時期に腎機能障害を診断するために毎年行われる分析に特に好適である。

上昇したアポＡ−ＩＶレベルは、健常な対照人よりも高いレベルとして判別される。好ましくは、この上昇したレベルは、腎機能障害のないヒトから採取したリファレンスレベルよりも、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、特に少なくとも７０％高い。最適な「健常」リファレンス値は、同一のヒトから得た健常期の、即ちこのヒトに全く腎機能障害がなかった極初期のリファレンス値である。また、上昇したレベルの関連性の証明は、アポＡ−ＩＶレベルが測定される方法にも依存するであろう。即ち、関連性アッセイの感受性、再現性など、診断の結果を定義するための重要な因子による。

本発明の方法で診断されるヒトの測定値とリファレンス値との比較は、それらの値が誘導され測定される体液又は組織にも依存するであろう。当然、アポＡ−ＩＶ ＥＬＩＳＡを用いて試験した場合、（健常）リファレンス値が、通常１０〜１８ｍｇのアポＡ−ＩＶ／ｄｌ血清の範囲である血清を試験することが好ましい。このようなシステムでは、１８ｍｇ、好ましくは２２ｍｇ、特に２８ｍｇのアポＡ−ＩＶ／ｄｌ血清よりも高い値により、初期の腎機能障害を測定することができる。しかしながら、先に説明したように、これらの絶対値は、それぞれ非常に特異的なアポＡ−ＩＶ量の測定様式及びアポＡ−ＩＶ量が測定される体液又は組織に常に依存するであろう。

血清について測定されるアポＡ−ＩＶ濃度は、血漿について測定される値と非常に高い相関がある。数％の差は、血清について測定される値は通常血漿について測定されるものよりも数％高いという一般的な観察により説明することができる。したがって、結果を、同一の「媒体」で測定しているリファレンス集団と比較する限り、測定を血漿で行っても血清で行っても差はない。

血液由来体液以外で、本発明にしたがい試験される好ましい材料源には、腎組織、特に腎組織から得た生検材料、及びリンパを含めることができる。
本発明の方法を用いて、普通の腎疾患の特定の病理に関わりなく、初期のいかなる腎機能障害も診断することができる。好ましくは、この初期の腎機能障害は、初期糸球体腎炎、初期腎嚢胞、初期慢性「腎盂腎炎」又は初期糖尿病性腎症である。

さらに、初期の腎機能障害において、冠動脈疾患に罹患するヒト又は粥状硬化性合併症のあるヒトは、健常人と比較して、そのように有意なアポＡ−ＩＶ濃度の上昇はないことが本発明により解析されている。これは、そのような冠動脈疾患に罹患するヒト又は粥状硬化性合併症に罹患するヒトにおいて、腎機能障害がない場合はアポＡ−ＩＶが減少するという事実によるものでもある。したがって、そのようなヒトにおける初期腎機能障害の診断は、それらの状態に対応して適合させなければならず、そして冠動脈疾患又は粥状硬化性合併症に罹患するが腎機能障害のないヒトのリファレンスレベル（アポＡ−ＩＶに関するそのようなリファレンスレベルは健常人よりも低いであろう）を考慮することによりなされる必要がある。したがって、冠動脈疾患又は粥状硬化性合併症に罹患するヒトにおいて本発明が実施される場合は、好ましくは、腎機能障害がないことを示すリファレンス値であって、腎機能障害がなく、そして冠動脈疾患にも粥状硬化性合併症にも罹患していないヒトよりも低いリファレンス値が提供される必要がある。そのような場合、初期腎機能障害がないことを示す、より低いリファレンス値は、腎機能障害に罹患しておらず、そして冠動脈疾患にも粥状硬化性合併症にも罹患していないヒトのリファレンス値よりも、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、特に少なくとも６０％低い。この場合、初期腎機能障害の欠如は、先に定義したように、６〜１４ｍｇのアポＡ−ＩＶ／ｄｌ血清という低いリファレンス値により特徴づけられる。そのような冠動脈疾患又は粥状硬化性合併症に罹患するヒトにおいて、初期の腎機能障害は、１４ｍｇ、好ましくは１８ｍｇ、特に２２ｍｇのアポＡ−ＩＶ／ｄｌ血清よりも高い値により診断されることができる。

他の態様において、本発明は、初期に腎機能障害の進行を観察するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法の使用に関する。したがって、本発明は、初期腎機能障害を診断するために、アポＡ−ＩＶ又はアポＡ−ＩＶの分析剤若しくは測定剤を使用するためにも使用される。

更なる態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットにも関するものであり、前記キットは：
−腎機能障害に罹患するか又は腎機能障害の危険性を有するヒトから得た体液若しくは組織のサンプルを含有する容器、又はこのサンプルが満たされていると仮定した容器、
−体液又は組織サンプル中のアポＡ−ＩＶ量測定手段、そして
−このヒトの初期腎機能障害の診断を可能にするリファレンス値手段、
を含む。

アポＡ−ＩＶ量を測定する手段は、アポＡ−ＩＶを分析／定量するための好適な手段、例えば、抗アポＡ−ＩＶ抗体、特にポリクローナル抗体、２次抗体、特に酵素標識又は化学標識された２次抗体、アポＡ−ＩＶ−ＲＮＡ−特異的核酸、アポＡ−ＩＶ−特異的酵素アッセイ、アポＡ−ＩＶ−特異的ＥＬＩＳＡ又はそれらの組合せから選択することができる。

このヒトの初期腎機能障害の診断を可能にするリファレンスレベルの手段は、好ましくは、予め決められた量のアポＡ−ＩＶを有する容器、健常人から得た体液又は組織サンプルを有する容器、腎機能障害のあるヒトから得た体液又は組織サンプルを有する容器、これらはそれぞれ好ましくは凍結乾燥された形態である、検量線、キットの使用説明書、又はそれらの組合せから選択される。キットと共に、好ましくは、初期腎機能障害の診断に関する特異的情報を与える好適な指示（例えば書面で）も提供される必要がある。

更なる態様において、本発明は、（初期）腎機能障害に罹患するヒトにおける冠動脈性心疾患の診断方法にも関するものであり、以下の工程：
−ヒトの体液又は組織サンプル中のアポＡ−ＩＶ量を測定し、そして
−アポＡ−ＩＶの測定値とリファレンス値とを比較する、
ことにより特徴づけられる。

アポＡ−ＩＶが、（健常）正常集団における関連マーカーであることが示されていても、コレステロール又はＨＤＬコレステロールのような冠動脈性心疾患の他のマーカーは、腎疾患のある患者、特に透析患者においてＣＨＤマーカーとして役に立たなかったため、このタンパク質が腎疾患に罹患するヒトにおける冠動脈性心疾患に対する信頼できるマーカーであることを証明したことは驚きである。したがって、本発明の方法論により、冠動脈性心疾患（またはその危険性）を解析することも可能である。

多くの場合、制限された腎機能についての予測変数として及び粥状動脈硬化症の存在についての予測変数として共通する場合のみ、アポＡ−ＩＶの評価が可能なことが多い。即ち、患者のアポＡ−ＩＶが高い場合、その腎機能が制限されるおそれがあるかどうかを決定しなければならない。値が低い場合は、これは粥状動脈硬化症が起こり得ることを示しているかもしれない。アポＡ−ＩＶが「正常範囲」にある場合、当然、制限された腎機能と粥状動脈硬化症が同時にあるかもしれない。例えば、腎機能が制限されていることが知られている患者が、「健常」人に関し比較的正常なアポＡ−ＩＶを有する場合、粥状硬化性変化の存在についても調査される必要性がある。

本発明を以下の実施例及び図面により更に特徴づけるが、それらに限定されるものではない。

方法：
患者:
１９９７年に、ドイツ（Ｇoｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｒｅｉｆｓｗａｌｄ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｈｏｍｂｕｒｇ／Ｓａａｒ、Ｍｕｎｉｃｈ）、オーストリア（Ｆｅｌｄｋｉｒｃｈ、Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ）及び南チロル（Ｂｏｚｅｎ）の８カ所の腎臓病部門から患者を召集した。患者の約３分の２は２つの部門（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ及びＩｎｎｓｂｒｕｃｋ）から来ていた（２３）。前年に少なくとも１回外来を訪れた１９〜６５歳の白人患者がこの研究に関与した。排除基準は、血清クレアチニンが＞６ｍｇ／ｄｌ、召集時に糖尿病、悪性疾患、肝疾患、甲状腺疾患又は感染症であること、１日蛋白尿＞３．５ｇ／１．７３ｍ^２として定義されるネフローゼ症候群、臓器移植、イオン性造影剤に対するアレルギー、及び妊娠であった。３４０人の患者が基準を満たし、そのうちの２８人には連絡をとれず、８５人が研究への参加を拒否した。残りの２２７人の患者がこの研究に関与した。彼らの特徴を表１に示す。本研究は倫理委員会組織により承認され、被験者は同意書面を提出している。

観察者間の差を避けるため、参加センターを訪れた１人の医者により全腎疾患患者を召集した。インタビューにより粥状硬化性事象を含む患者履歴を記録し、患者記録と比較した。各患者は健康診断を受けた。腎疾患の主な原因は、９７人の患者（９０例において生検により確認した）が糸球体腎炎（ＧＮ）、３７人の患者が腎嚢胞（ＰＣＫＤ）、２４人の患者が慢性「腎盂腎炎」（ＰＮ）、４３人の患者が他のタイプの腎疾患、２６人の患者が不明であった。

患者を、１９９７年にＰＲＯＣＡＭ研究センターの１つから召集された、腎機能障害も肝疾患もない同一人種の２２７人の年齢及び性別の一致する白人対照と比較した（２４）。

実験方法：
１２時間の一晩絶食後、血清及びＥＤＴＡ血漿を採取した。低速遠心後、サンプルを凍結させ、解析前に−８０℃で保存した（２５）。同一の外来訪問時、血清クレアチニンレベルに応じて、イオヘキソールの注入後２〜３の血液サンプルを得、イオヘキソール法によりＧＦＲを測定した（２６）。大部分腎機能障害が進行した１８人の患者について、コッククロフトとゴールトの式を用いてＧＦＲを計算した（２７）。蛋白尿を測定するための２４時間尿サンプルの採取に関し、患者は注意深く指示された。

アポＡ−ＩＶ、Ｌｐ（ａ）、血清アルブミン、ＧＦＲ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の測定、及びアポ（ａ）表現型判別は、実験室間の測定誤差を避けるために集中して、即ち単一実験室でそれぞれ行った。この時点で、本研究に協力する実験室スタッフは、患者の腎機能及び医学的履歴について、又は測定サンプルの分類が患者であるか対照であるかについて何も知らなかった。

アフィニティ精製したウサギ抗ヒトアポＡ−ＩＶポリクローナル抗血清を捕捉抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した同一抗体を検出抗体として用いる固相酵素イムノアッセイにより、血漿アポＡ−ＩＶ濃度を測定した（２５、２８）。アポＡ−ＩＶ含量が既知の血漿（高圧液体クロマトグラフィによるフェニルアラニンの定量後、精製アポＡ−ＩＶで標準化したもの）は、較正標準として役立つ。このアッセイの、イントラアッセイ及びインターアッセイの変動係数は、それぞれ４．５％及び６．６％であった（２５）。患者及び対照からのサンプルを、−７０℃での同様のサンプル保存期間後に盲検様式で、１シリーズ２重で解析した。最近詳細に記載されたようにして（２３）、Ｌｐ（ａ）定量及びアポ（ａ）表現型判別を行った。ロシュ（バーゼル、スイス）から入手したキットで血清アルブミン（ブロムクレゾールグリーン法）を測定した。先に記載されるように（２５）、測定にはマイクロタイタープレートを用いた。Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｎ Ｌａｔｅｘ ＣＲＰ Ｍｏｎｏ；Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した試薬を用いてベーリングＢＮＡ比濁計でＣＲＰを測定した。この試験の検出下限は０．０２ｍｇ／ｄｌであった。

統計学的方法：
社会科学のための統計パッケージ（ＳＰＳＳ）、ウインドウズ１０．０用を用いて統計解析を行った。変数が正常に分散していない場合は、対応のないｔ検定又はノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定により、対照と腎疾患患者とのあいだの連続変数の１変量比較を行った。２元変数はピアソンのχ^２検定を用いて比較した。対照と、ＧＦＲの三分位値によりサブグループに分けられた腎疾患患者とのあいだの連続変数を、ＡＮＯＶＡを用いて比較した。正常に分散していない変数は、解析前に対数に変換した。スピアマンの相関検定を用いてアポＡ−ＩＶと他の連続変数とを相関させた。患者の年齢及び蛋白尿についての血清アポＡ−ＩＶ濃度の補正を、直線回帰分析で行った。多重回帰分析を用いてそれぞれの変数と血清アポＡ−ＩＶ濃度との関連性を調査した。過去に発生した一般的な粥状硬化性事象についての予測変数を同定するためにロジスチック回帰分析を行った。

結果：
アポＡ−ＩＶ濃度に対する腎機能の影響：
腎疾患患者は、対照と比較して、全コレステロール濃度、トリグリセリド濃度及びＬｐ（ａ）濃度が有意に高かったが、ＨＤＬ及びＬＤＬコレステロールレベルに変化はなかった（表２）。アポＡ−Ｉ及びアポＢの濃度は、患者において有意に低かった。最も際立った変化の１つはアポＡ−ＩＶ濃度であり、患者では対照よりも約７０％も高かった（２４．６±８．６対１４．６±４．２ｍｇ／ｄｌ、Ｐ＜０．００１）。

患者におけるアポＡ−ＩＶといくつかの変数とのあいだの相関係数の計算により、腎機能パラメータと腎機能低下とともに起こるより高濃度のアポＡ−ＩＶとのあいだに最も高い相関が得られた（血清クレアチニン ｒ＝０．７３、血清尿素 ｒ＝０．６６、及びＧＦＲ ｒ＝−０．６２、１日蛋白尿 ｒ＝０．３７）（表３及び図１）。年齢（ｒ＝０．２０）、全コレステロール（ｒ＝０．１３）、アポＡ−Ｉ（ｒ＝０．１４）及びＬｐ（ａ）（ｒ＝０．１４）との相関は非常に低かった。年齢及び蛋白尿についてアポＡ−ＩＶ濃度を補正後も、依然として腎機能との相関が有意であることが判明した。しかし、リポタンパク質代謝の変数との相関は見られなかった。

どの段階の腎機能障害でアポＡ−ＩＶ濃度が増加し始めるかを調査するために、腎機能の３つの段階においてアポＡ−ＩＶ濃度を計算した（表４）。このため、腎疾患患者をＧＦＲの三分位値、即ち、＞９０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２、４５〜９０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２、及び＜４５ｍｌ／分／１．７３ｍ^２にしたがい分類した。アポＡ−ＩＶ濃度は腎機能低下とともに有意に増加し（ＡＮＯＶＡでＰ＜０．００１）、初期腎疾患患者群ですでにアポＡ−ＩＶは増加しているが、対照と比較すると彼らのＧＲＦ値は依然としてほとんど正常であった（＞９０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２）（１７．７±６．２対１４．６±４．２ｍｇ／ｄｌ、Ｐ＜０．００１）。これらの発見は、患者のアポＡ−ＩＶ濃度を年齢及び蛋白尿について補正したときも変化しなかった。腎疾患の主な原因がアポＡ−ＩＶ濃度に影響を及ぼすかどうかについても調べた。腎嚢胞の患者は、糸球体腎炎と比較した場合、アポＡ−ＩＶ濃度がわずかに高い傾向を示した（２５．６±８．８対２３．０±８．１ｍｇ／ｄｌ、Ｐ＝０．１１）。しかしながら、ＧＦＲ及び蛋白尿の差についてアポＡ−ＩＶ濃度を補正したとき、これら２つの患者群でアポＡ−ＩＶレベルにもはや差はなかった（２４．５±６．７対２３．５±７．１ｍｇ／ｄｌ、Ｐ＝０．４８）。

次の段階で、どの変数が腎疾患患者のアポＡ−ＩＶ濃度に有意に関連するか、多重回帰分析により解析した。ＧＦＲ、血清クレアチニン、及び血清尿素は非常に相関しているため、３つの異なるモデルについて計算したところ、非常に類似した結果を得た。アポＡ−ＩＶは腎機能のパラメータと最も強い関連性を示し（ＧＦＲ又は血清クレアチニン又は血清尿素）、約３５％のアポＡ−ＩＶ濃度について説明した。さらに、非常に小さなものであるが、蛋白尿及びアポＡ−ＩがアポＡ−ＩＶ濃度に対して寄与した（表５）。

多重回帰モデルに有意に寄与しなかった変数及び相互作用関係：全コレステロール、ＨＤＬ及びＬＤＬコレステロール、トリグリセリド、アポリポタンパク質Ｂ、リポタンパク質（ａ）、血清アルブミン、喫煙、肥満指数、年齢、性別、並びに相互作用関係ＧＦＲ＊蛋白尿、クレアチニン＊蛋白尿、及び尿素＊蛋白尿。
「ｌｎ蛋白尿」は変数が対数に変換されていることを意味する。

ＧＦＲ、クレアチニン及び尿素に対する係数及びＳＥは、よりよい解釈のための自然な尺度を提供する。対数に変換された値を使用しても、モデルに対するこれらの変数の寄与は同様であった。

アポＡ−ＩＶ及び粥状硬化性合併症：
最後に、アポＡ−ＩＶ濃度と存在する粥状硬化性合併症との関連性について解析した。２６人の患者は、３６の粥状硬化性事象を体験しており、その中には１７の冠事象（多くは心筋梗塞及び大動脈冠動脈バイパス）、９の卒中、及び末梢動脈系に影響する１０の事象が含まれる。粥状硬化性合併症を有する患者は、ＧＦＲの３つの範囲全てにおいて、合併症のない患者と比較して、少なくともアポＡ−ＩＶ濃度が低下する傾向を示した（表６）。十中八九各範囲のサンプルサイズが小さいために、全ての群で差が有意なわけではなかった。この解析において、全患者群に対し、ＧＦＲを含むロジスチック回帰分析も行った。最も貧弱なモデルが、粥状硬化性合併症に関連する３つの変数を同定した：年齢、アポＡ−ＩＶ、及び性別である（表７）。アポＡ−ＩＶがそれぞれ１ｍｇ／ｄｌ増加すると、粥状硬化性合併症に対するオッズ比が８％減少した（Ｐ＝０．０１１）。低分子アポ（ａ）表現型及びＧＦＲは粥状硬化性合併症との関連性が標準に満たなかった（表７）。

モデル内にない変数：低分子アポ（ａ）表現型（Ｐ＝０．１１）及び対数変換ＧＦＲ（Ｐ＝０．１６）
議論:
アポＡ−ＩＶ濃度に対する腎機能の影響：
ここで提示する研究は血清アポＡ−ＩＶ濃度に対する腎機能の強力な影響を証明している。初期の研究は、末期腎疾患患者アポＡ−ＩＶ濃度が顕著に増加することを示していた（１８〜２０、２２）。しかしながら、ほとんどＧＦＲ値が正常な腎疾患によるわずかな障害でさえアポＡ−ＩＶ濃度の有意な増加を伴うことは全く知られていなかった。したがって、アポＡ−ＩＶは腎機能障害の初期マーカーであると思われる。これはまたＳｕｎ ｅｔ ａｌ．による中高年の男性及び女性における最も最近の研究が、アポＡ−ＩＶ濃度の主要な決定要素として糖尿病を同定したことの理由であるかもしれない（２９）。多くの糖尿病患者が腎機能障害を有しているため、そして腎機能の非常に軽度な障害がすでにアポＡ−ＩＶの増加と関連しているため、糖尿病自体というよりも腎機能がアポＡ−ＩＶの増加の原因であると考えられる。これは、糖尿病はアポＡ−ＩＶの増加が生じていたにも関わらず本研究において排除基準であったため、本データによりさらに支持される。さらに、末期腎疾患患者における初期の研究において、１８９人の糖尿病患者と５１３人の非糖尿病患者を比較して、アポＡ−ＩＶレベルに差は観察されなかった（２２）。しかしながら、糖尿病患者における他の研究は、これらの患者のアポＡ−ＩＶ上昇について報告しているが、腎機能について注意深く評価していない（３０、３１）。Ｖｅｒｇeｓ ｅｔ ａｌ．は腎不全患者のみを排除したが、彼らは排除基準についての詳細な情報を提供しなかった（３０、３１）。しかしながら、およそ４０％の患者はミクロアルブミン尿症であり（３１）、少なくとも、アポＡ−ＩＶ濃度に有意に影響することが予想される腎疾患の併発を示している。

Ｓｕｎ及び同僚による研究は、糖尿病の他に、腎機能により主に説明することができる、年齢とアポＡ−ＩＶ濃度とのあいだの有意な相関についても報告している（２９）。加齢がネフロン及び糸球体ろか速度の非常に大きな欠失に関連していることは周知である。年齢が７０歳の人は、ＧＦＲが若い成年のわずかに約６０〜７０％である。したがって、多くの例において、すでにアポＡ−ＩＶレベルの顕著な増加を示している我々の患者の平均ＧＦＲ三分位値内にあるような範囲内に、ＧＦＲがすでにある。ＰＲＯＣＡＭ研究により召集された対照群のアポＡ−ＩＶを年齢と相関させたとき、有意な相関は観察されなかった（ｒ＝０．０５７、Ｐ＝０．３９）。これは、腎機能障害を有する多くの対照が、血清クレアチニンが＞１．５ｍｇ／ｄｌ及び／又はマクロアルブミン尿症を排除基準として採用することにより、解析から排除されたという事実により単純に説明することができる。これは、ケースコントロール研究における腎機能に関し、アポＡ−ＩＶ濃度を徹底的に制御する必要性を明確に示している。腎機能が考慮されない場合は、試験される人と対照とのあいだで腎機能に差が存在する場合に結果の解釈が誤った方向に導かれる可能性がある。結果は、試験される人及び対照における腎機能の分類により、関連性が偽陽性又は偽陰性のいずれかとなるであろう。腎臓問題においてアポＡ−ＩＶが完全に機能的であるかどうかについて回答すべき疑問が残されている。尿毒症が、例えばアポＡ−ＩＶの酵素活性化及び抗酸化特性に対して影響することが考えられるであろう。しかしながら、機能不全を補償するためのアポＡ−ＩＶの増加は起こりそうにない。アポＡ−ＩＶの増加は２次的であり、腎臓における代謝障害により生ずるということも非常にありそうに見える。これはアポＡ−ＩＶが腎臓及び肝臓により代謝されるというラットにおける観察により支持される。組織学的解析により、アポＡ−ＩＶが近位尿細管細胞内及び尿細管腔に局在することが示された（３２）。およそ４６ｋＤａの分子量により、アポＡ−ＩＶは、少なくともそのリポタンパク質非結合（遊離）型で糸球体によりろ過されることができる。次に、近位尿細管による取り込み後、分解されるであろう。しかしながら、依然として、ヒトにおける代謝経路がラットと同じであるか決定される必要がある。

アポＡ−ＩＶ及び粥状硬化性合併症：
最近、血管造影的に明示されたＣＡＤを有する１１４人の白人試験男性において、年齢を調整した１１４人の男性対照と比較して、有意に低いアポＡ−ＩＶレベルが初めて報告された。（１０．２±３．８ｍｇ／ｄｌ対１５．１±４．０ｍｇ／ｄｌ、Ｐ＜０．００１）。これはアポＡ−ＩＶレベル間の関係を反対にし、血管造影的に示されたＣＡＤを有する６８人のアジアのインド人男性及び年齢が一致する６８人の対照の独立サンプルにおいてＣＡＤの存在が確認された。この知見と一致して、事象のない対象と比較し、より低濃度のアポＡ−ＩＶがすでに粥状硬化性事象を体験している患者において観察された。これは３つの範囲のＧＦＲ全てにおいて観察されたが、最も低いＧＦＲの範囲においてのみ、通常の有意レベルに達した。これは、１つの個別範囲における事象を有する少人数の患者により説明されるであろう（表６）。統計モデルに対してＧＦＲが提示されているロジスチック回帰分析において全群が検討されたとき、ＧＦＲにかかわらず、アポＡ−ＩＶは事象に対する信頼できる予測変数であることを証明した（表７）。この関係が非常に起こり得る証拠は強力である：コレステロール逆輸送のいくつかの工程へのアポＡ−ＩＶの関与を示す細胞培養研究（９〜１４）、並びに抗酸化特性（３３）；粥状動脈硬化症を減少させたマウスにおけるヒト及びマウスアポＡ−ＩＶの過剰発現（１６、１７）；そして最後に、血管造影的に証明されたＣＡＤを有する男性におけるより低濃度のアポＡ−ＩＶについての最初の結果（３４）。

本研究及び他の研究の結果（３４）は、大血管合併症のない患者と比較して有意に高濃度の患者のアポＡ−ＩＶについて記載する、インスリン非依存性糖尿病患者における調査とは対照的である（３１）。この食い違いの説明は、大血管合併症を有する糖尿病患者におけるミクロアルブミン尿症及び随伴する腎機能障害の罹患率の上昇により説明されるであろう。したがって、大血管合併症を有する糖尿病患者におけるより高いアポＡ−ＩＶレベルは、単純に腎機能障害を反映するかもしれない。

現在、治療的介入の開発に使用され得る血清アポＡ−ＩＶ濃度の調節についてはほとんど知られていない。アポＡ−ＩＶ濃度を上昇させる治療剤が開発されるや否や、アポＡ−ＩＶの病原性を調査するための最も説得力のある実験の１つとして使用されるであろう。

腎疾患患者は、彼らがそのように高濃度のアポＡ−ＩＶを有するとき、粥状硬化性合併症に関し、何故そのように高い危険性を有するのかと尋ねるであろう（３５）。アポＡ−ＩＶが実際に抗アテローム発生性特性を有する場合、これらの患者は非腎疾患患者よりもより保護される必要がある。この議論は一変量の点で非常に興味をそそる。しかしながら、これらの患者において、いくつかの粥状動脈硬化症危険因子は好ましくないプロフィールに向かって実質的にシフトすることを念頭に置くべきである（３５）。伝統的な粥状動脈硬化症危険因子の変化の他に、最近、Ｌｐ（ａ）及びホモシステインについての顕著な変化が、腎疾患がＧＦＲのほんのわずかな変化に関与する段階においてさえ（２３、３８、３９）示されている（概説として（３６、３７）を参照されたい）。いくつかの研究は、ホモシステイン及びＬｐ（ａ）そして特に低分子アポ（ａ）表現型のＬｐ（ａ）が、これらの患者において、粥状動脈硬化症の重要な危険因子であることを証明した（４０〜４８）。アポＡ−ＩＶがこの負担を打ち消すか否かは未だに解決されていないが、この仮定は粥状硬化性問題を有する患者のより低いアポＡ−ＩＶレベルにより支持される。

本研究の患者はＨＤＬコレステロール値が正常であるが、アポＡ−Ｉレベルは顕著に低下していることは興味深い知見である。他の研究は、通常、より低いＧＦＲ濃度を有するより進行した段階にある腎機能障害患者について調査し、ＨＤＬコレステロール濃度の減少について記載している（４９〜５１）。これらの調査とは対照的に、本研究における患者は、より高い平均ＧＦＲであるおよそ７０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２を示し、ＨＤＬコレステロールの減少が、コレステロール逆輸送経路の障害の徴候であり得るアポＡ−Ｉ枯渇又はＨＤＬコレステロールの脂質粒子蓄積に先行されることを示唆している。アポＡ−Ｉ及びアポＡ−ＩＶは実質的な機能の重複を示すため（例えばＬＣＡＴ活性化）、アポＡ−ＩＶの増加はアポＡ−Ｉの減少を補償するためのものであるのか否かを決定するべきである。

要するに、初期腎不全でアポＡ−ＩＶが上昇し始めることを本データは明確に示しており、アポＡ−ＩＶを腎機能障害の初期マーカーにする。さらに、軽度及び中程度の腎不全患者において、アポＡ−ＩＶは粥状硬化性合併症に関連しているようにみえる。

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アポＡ−ＩＶと腎機能パラメータ（血清クレアチニン、血清尿素、糸球体ろ過速度（ＧＦＲ）及び１日蛋白尿、ｒ＝０．３７）との相関を示す。

Claims (18)

1. ヒトにおいて初期の腎機能障害を検査する方法であって、以下の行程：
   −ヒトの体液又は組織サンプル中のアポＡ−ＩＶの量を測定し、そして
   −アポＡ−ＩＶの測定値とリファレンス値とを比較する、
   ことを特徴とし、初期腎機能障害が、初期糸球体腎炎、初期腎嚢胞、又は初期慢性腎盂腎炎である、前記方法。
2. このリファレンス値が腎機能障害のないヒトから得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 初期の腎機能障害が、体液又は組織サンプル中のアポＡ−ＩＶの増加レベルとして検査されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. この増加値が、リファレンス値よりも少なくとも５０％高いことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. このリファレンス値が、１０〜１８ｍｇのアポＡ−ＩＶ／ｄｌ血清であることを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
6. 初期の腎機能障害が、２２ｍｇのアポＡ−ＩＶ／ｄｌ血清よりも高値として検査されることを特徴とする、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 初期の腎機能障害が、２８ｍｇのアポＡ−ＩＶ／ｄｌ血清よりも高値として検査されることを特徴とする、請求項６項に記載の方法。
8. 冠動脈疾患に罹患するヒト又は粥状硬化性合併症に罹患するヒトに対し、腎機能障害がなく且つ冠動脈疾患も粥状硬化性合併症もないヒトよりも低い、腎機能障害の欠如を示すリファレンス値が提供されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 初期腎機能障害の欠如を示すこのより低いリファレンス値が、腎機能障害がなく且つ冠動脈疾患も粥状硬化性合併症もないヒトのリファレンス値よりも少なくとも２０％低いことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 初期腎機能障害の欠如を示すこのより低いリファレンス値が、腎機能障害がなく且つ冠動脈疾患も粥状硬化性合併症もないヒトのリファレンス値よりも少なくとも４０％低いことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
11. このより低いリファレンス値が、６〜１４ｍｇのアポＡ−ＩＶ／ｄｌ血清であることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 冠動脈疾患又は粥状硬化性合併症に罹患するこのヒトの初期腎機能障害が、１４ｍｇのアポＡ−ＩＶ／ｄｌ血清よりも高いレベルとして検査されることを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 初期腎機能障害の進行を観察するための、請求項１〜１２に記載の方法の使用。
14. 冠動脈疾患に罹患するヒト又は粥状硬化性合併症に罹患するヒトの鑑別検査のための、請求項１３に記載の使用。
15. −腎機能障害に罹患するか若しくは腎機能障害の危険性を有するヒトから得た体液若しくは組織サンプルを含有する容器、又はこのサンプルが満たされていると仮定した容器、
    −体液又は組織サンプル中のアポＡ−ＩＶ量測定手段、そして
    −このヒトの初期腎機能障害の検査を可能にするリファレンス値手段、
    を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットの使用。
16. このアポＡ−ＩＶ量測定手段が、抗アポＡ−ＩＶ抗体、２次抗体、アポＡ−ＩＶ−ＲＮＡ特異的核酸、アポＡ−ＩＶ特異的酵素試験、アポＡ−ＩＶ特異的ＥＬＩＳＡ又はそれらの組合せから選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
17. このリファレンス値が、予め決められた量のアポＡ−ＩＶを含有する容器、健常人の体液若しくは組織サンプルを含有する容器、腎機能障害に罹患するヒトの体液若しくは組織サンプルを含有する容器、検量線、キットの使用説明書、又はそれらの組合せから選択されることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の使用。
18. 初期腎機能障害に罹患するヒトにおいて冠動脈性心疾患を検査する方法であって、以下の工程：
    −ヒトの体液又は組織サンプル中のアポＡ−ＩＶ量を測定し、そして
    −アポＡ−ＩＶの測定値をリファレンス値と比較する、
    ことを特徴とし、初期腎機能障害が、初期糸球体腎炎、初期腎嚢胞、又は初期慢性腎盂腎炎である、前記方法。

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